JP2011502137A - 関節リウマチと関連する抗原 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図8
Description
(a)該ヒト又は動物に、フィブロネクチンのED-Aに結合する結合メンバー、例えば抗体分子を投与するステップ、及び
(b)該ヒト又は動物の体の関節リウマチ部位における該結合メンバーの存在又は非存在を決定するステップ、
を含み、関節リウマチ部位への該結合メンバーの局在化が、関節リウマチの存在を示す方法を提供する。
HCDR1は配列番号3、23、33、43、53、63、73、83、93、103若しくは113のアミノ酸配列を有し、
HCDR2は配列番号4のアミノ酸配列を有し、
HCDR3は配列番号5のアミノ酸配列を有し、
LCDR1は配列番号6、26、36、46、56、66、76、86、96、106若しくは116のアミノ酸配列を有し、
LCDR2は配列番号7のアミノ酸配列を有し、
LCDR3は配列番号8のアミノ酸配列を有する。
フィブロネクチン
フィブロネクチンは、選択的スプライシングを受ける抗原であり、本明細書の他の箇所に記載されるように、フィブロネクチンのいくつかの代替的アイソフォームが公知である。エキストラドメインA(EDA又はED-A)はまた、ED、エキストラIII型リピートA(EIIIA)又はEDIとしても公知である。ヒトED-Aの配列は、Kornblihttら(1984)、Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868及びPaolellaら(1988)、Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557により公開されている。ヒトED-Aの配列は、アクセッション番号P02751で登録されたアミノ酸配列のアミノ酸1631〜1720(フィブロネクチンIII型12;エキストラドメイン2)としてSwissProtデータベース上でも入手可能である。マウスED-Aの配列は、アクセッション番号P11276で登録されたアミノ酸配列のアミノ酸1721〜1810(フィブロネクチンIII型13;エキストラドメイン2)としてSwissProtデータベース上で入手可能である。
選択的スプライシングとは、異なるmRNAを産生するDNAの一次RNA転写物のスプライシングの異なるパターンの出現を指す。イントロンの切り出し後、選択は、どのエクソンが一緒にスプライシングされてmRNAを形成するかを決定することができる。選択的スプライシングは、異なるエクソン及び/又は異なる数のエクソンを含む異なるアイソフォームの産生を誘導する。例えば、1個のアイソフォームは、1個以上のドメインを含んでもよい、1個以上のエクソンに対応する追加のアミノ酸配列を含んでもよい。
これは、互いに結合する一対の分子の一方のメンバーを説明するものである。結合対のメンバーは、天然由来であっても、又は全体的若しくは部分的に合成により作製されたものであってもよい。前記対の分子の一方のメンバーは、その表面上、又は空洞上に、前記対の分子の他方のメンバーの特定の空間構造及び極性構造に結合し、従ってそれと相補的である領域を有する。結合対の型の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本発明は、抗原−抗体型反応に関する。
これは、天然に産生された、又は部分的若しくは全体的に合成により作製された免疫グロブリンを説明する。この用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質に関する。本発明は天然形態の抗体に関するものではない、すなわち、それらはその天然の環境にはないが、それらを天然の起源からの精製により単離若しくは取得するか、又は他に遺伝子組換え、若しくは化学的合成により取得することができたものであること、並びにその後、それらが、後に記載するように非天然アミノ酸を含んでもよいことを理解すべきである。抗体抗原結合部位を含む抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fdなどの抗体分子;並びにダイアボディが挙げられる。
これは標的抗原の全部又は一部に結合し、かつこれと相補的である分子の部分を説明する。抗体分子中では、これを抗体抗原結合部位と呼び、標的抗原の全部又は一部に結合し、かつこれと相補的である抗体の部分を含む。抗原が大きい場合、抗体は該抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分をエピトープと呼ぶ。抗体抗原結合部位を、1個以上の抗体可変ドメインにより提供することができる。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域(VL)と抗体重鎖可変領域(VH)を含んでもよい。
これは、本発明において使用する結合メンバー又はそのような結合メンバーをコードする核酸が、一般的には本発明に係るものである状態を指す。かくして、本発明の結合メンバー、VH及び/又はVLドメインを、例えば、その天然の環境から、実質的に純粋な、若しくは均質な形態で、又は核酸の場合、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸若しくは遺伝子を含まないか若しくは実質的に含まない状態で、単離及び/又は精製して提供することができる。単離されたメンバー及び単離された核酸は、それらがその天然の環境中に、又は調製がin vitro若しくはin vivoで実行される組換えDNA技術による場合、それらが調製される環境(例えば、細胞培養物)中に、見とめられる他のポリペプチド若しくは核酸などの、それらが天然に結合する材料を含まないか、又は実質的に含まないであろう。メンバー及び核酸を、希釈剤若しくはアジュバントと共に製剤化し、さらなる実用的な目的のために、単離することができる。例えば、前記メンバーを、イムノアッセイにおける使用のためにマイクロタイタープレートをコーティングするのに用いる場合には、通常はゼラチン若しくは他の担体と混合し、あるいは診断若しくは治療において用いる場合には、製薬上許容し得る担体若しくは希釈剤と混合することができる。結合メンバーを、天然に、若しくは異種真核細胞の系(例えば、CHO若しくはNS0(ECACC 85110503)細胞)によりグリコシル化するか、又はそれらを非グリコシル化(例えば、原核細胞中での発現により製造する場合)することができる。
(a)該ヒト又は動物に、例えば、フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム及び/若しくはフィブロネクチンのED-Aに結合する、検出可能な標識で標識された、本発明の結合メンバーを投与するステップ、並びに
(b)該ヒト又は動物の体の新生血管における該結合メンバーの存在又は非存在を決定するステップ、
を含み、ヒト又は動物の新生血管への該結合メンバーの局在化が、関節リウマチの存在を示す、前記方法を提供する。
結果
ヒト関節炎標本の組織化学的分析
フィブロネクチンドメインEDA及びEDB、並びにテネイシン-CドメインA1及びCの発現を、それぞれF8、L19、F16及びG11抗体を用いたヒト関節炎標本の免疫組織化学により調べた。
CIAマウスモデル(Courtneyら 1980)におけるミニ抗体形態(SIP)(Borsiら 2002)のF8のin vivoターゲティング能を、抗体検出に関して蛍光及び放射能の両方を用いて試験した。SIP形態は、80kDaサイズのホモダイマータンパク質を生じる、ヒトIgEのCH4ドメインと結合したscFv抗体フラグメントからなる。
scFv形態の抗体分子F8を、インターロイキン-10(IL-10)と融合タンパク質内でコンジュゲートした。融合タンパク質の生物活性を、MC/9細胞のIL-4依存性増殖を誘導する能力を決定するアッセイ(Thompsonら, 1991)において、ヒトIL-10の活性を比較した。結果を図8(d)に示す。
ヒト関節炎標本における免疫組織化学的分析
ヒト関節炎標本の凍結切片を氷冷アセトン中で10分かけて固定し、ウシ胎仔血清を用いて30分間ブロッキングし、新生血管のマーカー(フィブロネクチンED-A及びED-B、テネイシン-CドメインA1及びC)について染色した。F8、L19、F16及びG11抗体は、10μg/mlの濃度でmycタグ付加scFvとして使用し、1時間インキュベートした。一次抗体を7μg/mlの濃度の抗myc抗体9E10と共にインキュベートした。三次検出抗体として、ウサギ抗マウスIgG抗体(Dako, Denmark)及びAPAAPマウスモノクローナル(Dako, Denmark)をそれぞれ5及び50μg/mlの濃度で1時間使用した。ファストレッド錠(Sigma, Switzerland)を使用して、15分間インキュベートして、染色を発色させた。スライドをヘマトキリシンで2分かけて対比染色し、水で洗浄し、Glycergelマウント培地(Dako, Denmark)にのせ、Axiovert S100 TV顕微鏡(Zeiss, Switzerland)を用いて分析した。
ヒト関節炎標本の凍結切片を氷冷アセトン中で10分かけて固定し、ウシ胎仔血清を用いて30分間ブロッキングし、フィブロネクチンのED-Aドメインについて染色した。F8抗体は、10μg/mlの濃度でmycタグ付加scFvとして使用し、1時間インキュベートした。一次抗体を7μg/mlの濃度の抗myc抗体9E10と共にインキュベートした。三次検出抗体として、蛍光抗マウスAlexa 596抗体(Molecular Probes, Denmark)を10μg/mlの濃度で1時間使用した。スライドをHoechst 33342で対比染色し、Glycergelマウント培地(Dako, Denmark)にのせ、AxioScop 2MOT+顕微鏡(Zeiss, Switzerland)を用いて分析した。
200μgのウシII型コラーゲン(MD Biosciences)を等量のフロイント完全アジュバント(MD Biosciences)で乳化し、尾付け根における皮内注射によりDBA/1雄マウス(8〜12週齢)を免疫した。初回免疫の2週間後に、コラーゲンの乳化に不完全フロイントアジュバント(MD Biosciences)を使用して上記手順を繰り返した。マウスを毎日観察し、1又はそれ以上の肢に紅斑及び/又は肢の腫れを示した各マウスを画像化又は処置試験のために登録した。
関節炎マウスにおけるSIP(F8)の選択的蓄積を、Birchlerら(1999)に記載されているように近赤外イメージング分析により試験した。簡単に説明すると、精製SIP(F8)をAlexa750(MolecularProbes, Leiden, The Netherlands)で製造業者の推奨に従って標識し、100μgの標識タンパク質を関節炎マウスの尾静脈に注射した。注射の24時間後にマウスをケタミン80mg/kg及びメデトミジン0.2mg/kgで麻酔し、近赤外マウスイメージャーにおいて画像化した(Trachselら 2007; Birchlerら 1999)。
関節炎マウスにおけるSIP(F8)のin vivoターゲティング能を、以前に記載されているように生体分布分析により評価した(Borsiら 2002; Tarliら, 1999)。簡単に説明すると、精製SIP(F8)を放射性ヨウ素化し、10μgのタンパク質(11uCi 125Iに相当)を関節炎マウスの尾静脈に注射した。注射の24時間後にマウスを犠牲にし、以前に記載されているように(Trachselら 2007)、肢を1時間露光し、ホルホルイメージャー(Fujifilm BAS-5000)において読み取った。
抗ED-B抗体フラグメントscFv(L19)の単離は、以前に記載されている(Piniら、1998)。親抗ED-A抗体を、公開された手順(Giovannoni, Nucleic. Acid Research, 2001, 29(5):E27)を用いてETH-2ライブラリーから単離した。高親和性抗ED-A抗体をもたらす、親抗ED-A抗体の親和性成熟は、以下の節に記載する。
親抗ED-A抗体(ETH-2由来抗体)を、親和性成熟ライブラリーの構築のための鋳型として用いた。ライブラリーのVH CDR1(DP47生殖系列)及びVL CDR1(DPK22生殖系列)における配列可変性を、VH CDR1の31、32及び33位とVL CDR1の31、31a及び32位で無作為突然変異を作製するプロセスにおいて、部分的縮重プライマー5'-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3'(配列番号17)(VH用)及び5'-CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3'(配列番号18)(VL用) (全てのオリゴヌクレオチドを、Operon Biotechnologies, Cologne, Germanyから購入した)を用いるPCRにより導入した。VHVLの組合せを、鋳型としてゲル精製されたVH及びVL断片を用いる、プライマーLMB3long(5'-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3')(配列番号19)及びfdseqlong(5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3')(配列番号20)を用いるPCR集合(assembly)によりscFv形態に集合させた。集合させたVH-VL断片を、NcoI/NotIで二重消化し、NcoI/NotI消化されたpHEN1ファージミドベクター(Hoogenboomら、1991)中にクローニングした。得られる連結産物を、Vitiら、2000に従ってエレクトロコンピテント大腸菌TG-1細胞中にエレクトロポレーションし、1.5×107個の抗体クローンを含有するライブラリーを生じさせ、改善された親和性でED-Aに結合する抗体についてスクリーニングした。
上記の抗体ライブラリーを、BIAcore分析を用いて、親抗ED-A抗体よりも高い親和性でED-Aに結合する抗体についてスクリーニングした。BIAcore分析において用いた抗原(11A12)は、ヒトフィブロネクチンのED-Aドメインを含み、以下のアミノ酸配列(配列番号120)を有する:
MRSYRTEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQ
TEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWES
PQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPL
IGTQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDS
SSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH
atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaacagcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaaaaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattgaaggcttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctctggttcagactgcagtaaccaacattgatcgccctaaaggactggcattcactgatgtggatgtcgattccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgacctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacactgcagagctgcaaggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgacagctcatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctcttaaggacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaccatcaccatcactaa
10 mlの2TY、Amp、1%グルコース中のTG1エレクトロコンピテント前培養物を、11A12のDNAミニプレップ1μlの存在下でエレクトロポレーションした。次いで、前培養物を1:100に希釈し(800 mlの2TY、Amp、0.1%グルコース中に8 ml)、OD600が0.4〜0.6になるまで増殖させた後、IPTGで一晩誘導した。次の日、細胞を遠心分離し、上清を濾過した(Millipore 0.22μm)。培養培地の遠心分離及び清澄化後、11A12をFPLC上のHitrapカラムを用いて精製した。Ni/カラムを以下のように再生した:カラムを、カラムの5倍量(CV)のH2Oで洗浄した後、3CVの0.5 M EDTA/0.2 M Tris pH 8を適用して、カラムから古いニッケルを洗浄除去した。次いで、カラムを5CVのH2Oで洗浄した。次いで、カラムに2CVの100 mM NiSO4を再度導入した後、カラムを数CVのH2Oで洗浄した。次いで、カラムを5CVの溶解バッファー(20 mMイミダゾール/250 mM NaCl/PBS pH 7.4)で平衡化させた。細胞溶解物を濾過し(Millipore 0.45μm)、カラムに導入した(手動で)。次いで、カラムをFPLC上に戻し、UVシグナルが安定するまで(一定)、約3CVの溶解バッファーを流出させた。次いで、溶出プログラムを開始した:5CVの溶出バッファー(400 mMイミダゾール/250 mM NaCl/PBS pH 7.4)の0%〜100%の勾配。溶出された抗原を含む画分をプールし、PBSで一晩透析させた。
抗ED-A抗体を以下のように発現させ、精製した:10 mlの2TY、Amp、1%グルコース中のTG1エレクトロコンピテント前培養物を、抗ED-A抗体の1つのDNAミニプレップ1μlの存在下でエレクトロポレーションした。次いで、前培養物を1:100に希釈し(800 mlの2TY、Amp、0.1%グルコース中の8 ml)、OD600が0.4〜0.6になるまで増殖させた後、IPTGで一晩かけて誘導した。次の日、細胞を遠心分離し、上清を濾過した(Millipore 0.22μm)。scFvをプロテインA−セファロースカラム上で精製し、トリエチルアミン(Triethylemmine)を用いて、カラムからscFvを溶出させた。溶出したscFvを含む画分を、PBS中、4℃で一晩透析した。次いで、scFv画分を、PBSと共にSuperdex 75カラムに入れ、0.5 ml/分で流出させ、0.25 mlの画分を回収した。モノマー画分をBIAcore分析に用いた。
BIAcoreTM Chipを、HBS-EPバッファーBIACORETM、0.01 M Hepes pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性剤P20(アッセイに用いたのと同じバッファー)を用いて、5μl/分の流速で一晩フラッシュした。抗原(11A12)を、酢酸バッファー(pH 4.0)中に50μg/mlの濃度に希釈し、チップ上のCOOH基を、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及びエチル-N-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)の混合物50μlの注入により活性化した。40μlの11A12抗原をチップに注入し、残留した遊離COOH基を30μlのエタノールアミンでブロッキングした。0.22μmの濾過後、20μlの各細菌上清をチップ上に注入し、抗原との相互作用をリアルタイムでモニターした。
親抗ED-A抗体と抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7及びG9のkon、koff及びKDを、表面プラスモン共鳴を用いて評価した。チップを、5μl/分のバッファー流速で、アッセイの間に用いたのと同じバッファーを用いて一晩平衡化した。コーティング手順全体をこの流速で実施した。抗原11A12を、酢酸バッファーpH 4.00(BIACORETMにより提供)で1:25に希釈して、20μg/mlの最終濃度を得た。次いで、NHS及びEDCを混合し、50μlを注入して、CM5チップ上のCOOH基を活性化した。次いで、40μlの抗原を注入した(これは約40秒(40'')続く)。次いで、30μlのエタノールアミンを注入して、最終的な遊離COOHの反応性をブロッキングした。
BIAcore TM 分析1
BIAcoreTM分析によって、以下のように抗原に対する抗体の親和性を推定するために分析したそれぞれの抗ED-A抗体に関するグラフが得られた:それぞれのグラフのx軸は時間に対応し、y軸は共鳴単位(BIAcoreTMチップ上にコーティングされた抗原に対する試験抗体の結合親和性を示す尺度)に対応する。それぞれのグラフは、3個のピークと、バッファーの交換に対応し、従って、結果の解釈について無関係である1個の落ち込みとを示す。
各抗ED-A抗体のkon、koff及びKD値を、BIAevaluationソフトウェアを用いて評価した。抗原11A12に対する親抗ED-A抗体、並びに抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7及びG9のkon、koff及びKD値を、表2に詳細に記載する。抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7及びG9は全て、それらが誘導された親抗ED-A抗体よりも良好な抗原11A12に対するKD値を有し、これは、それらが親抗ED-A抗体よりも高い親和性でED-Aに結合し、従ってA-FNにも結合することを示している。
抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8及びG9は全てscFv抗体であり、従来の方法を用いてこれらを配列決定した。抗ED-A抗体H1のヌクレオチド配列を図3に示す。抗ED-A抗体H1のアミノ酸配列を図4に示す。
ヒトIL-10遺伝子を以下のプライマー配列を用いてPCRにより増幅した:
バックワードアンチセンスプライマー
5'-TCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCAGCGGCAGCCCAGGCCAGGGCACC-3'、及び
フォワードセンスプライマー
5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCtcattaGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTA-3'
これは、そのN末端に15アミノ酸リンカー(SSSSG)3の付属部分があり、そのC末端に停止コドン及びNotI制限部位がある。
バックワードアンチセンスプライマー
5'-CCCAAGCTTGTCGACCATGGGCTGGAGCC-3'、及び
フォワードセンスプライマー
5'-GAGCCGGAAGAGCTACTACCCGATGAGGAAGAGAATTCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG-3'。
hIL10の生物活性は、比色MTT色素還元アッセイを用いて、MC/9細胞のIL-4依存性増殖を誘導する能力により決定した(Thompsonら, 1991)。5pg(0.05単位)のマウスIL4/ml(eBiosciences)を含む200μlの培地中の10000個のMC/9細胞(ATCC, Manassas, USA)を1ウエル当たりで96ウエルマイクロタイタープレートに入れ、種々の量のヒトIL10で48時間処理した。hIL10標準及びF8-IL10融合タンパク質を最大100ng/mlのIL10等量で使用して、連続希釈した。10μlの5mg/ml MTT(Sigma)を添加し、3〜5時間インキュベートした。続いて、細胞を遠心し、DMSOで溶解し、570nmにおける吸光を読み取った。
上記のいずれかで引用されたものなどの本明細書で引用される全ての参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
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Claims (52)
- 関節リウマチを患う患者の治療のための医薬の製造におけるフィブロネクチンのエキストラドメイン-A(ED-A)アイソフォームに結合する結合メンバーの使用。
- 前記結合メンバーがフィブロネクチンのED-Aに結合する、請求項1に記載の使用。
- 前記結合メンバーが検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記結合メンバーが、抗炎症活性を有する分子にコンジュゲートされている、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記結合メンバーが、インターロイキン-10(IL-10)にコンジュゲートされている、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記結合メンバーが放射性同位体にコンジュゲートされている、請求項1又は2に記載の使用。
- フィブロネクチンのED-Aアイソフォームに結合する結合メンバーにコンジュゲートされている分子を患者における関節リウマチ部位の新生血管へ送達するための医薬の製造における該結合メンバーの使用。
- 前記結合メンバーがフィブロネクチンのED-Aに結合する、請求項7に記載の使用。
- 前記分子が検出可能な標識である、請求項7又は8に記載の使用。
- 前記分子が抗炎症活性を有する、請求項7又は8に記載の使用。
- 前記結合メンバーが、インターロイキン-10(IL-10)にコンジュゲートされている、請求項7又は8に記載の使用。
- 前記コンジュゲートされている分子が放射性同位体である、請求項7又は8に記載の使用。
- 前記結合メンバーがVHドメインを含み、
該VHドメインがフレームワークと、相補性決定領域HCDR1、HCDR2及びHCDR3のセットとを含み、
ここでHCDR1が配列番号3、23、33、43、53、63、73、83、93、103若しくは113のアミノ酸配列を有し、
HCDR2が配列番号4のアミノ酸配列を有し、
HCDR3が配列番号5のアミノ酸配列を有するか、又は、
該VHドメインが、相補性決定領域HCDR1、HCDR2及びHCDR3内に10個以下のアミノ酸置換を有する相補性決定領域のセットを含む、
請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用。 - 前記VHドメインフレームワークがヒト生殖系列フレームワークである、請求項13に記載の使用。
- 前記VHドメインが、配列番号1、21、31、41、51、61、71、81、91、101又は111のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の使用。
- 前記結合メンバーが、相補性決定領域LCDR1、LCDR2及びLCDR3のセットと、フレームワークとを含むVLドメインをさらに含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の使用。
- LCDR1が配列番号6、26、36、46、56、66、76、86、96、106若しくは116のアミノ酸配列を有し、
LCDR2が配列番号7のアミノ酸配列を有し、
LCDR3が配列番号8のアミノ酸配列を有するか、又は、
前記VLドメインが、相補性決定領域LCDR1、LCDR2及びLCDR3内に10個以下のアミノ酸置換を有する相補性決定領域のセットを含む、
請求項16に記載の使用。 - 前記VLドメインフレームワークがヒト生殖系列フレームワークである、請求項16又は17に記載の使用。
- 前記VLドメインが配列番号2、22、32、42、52、62、72、82、92、102又は112のアミノ酸配列を有する、請求項18に記載の使用。
- 前記結合メンバーが一本鎖Fvである、請求項16〜19のいずれか1項に記載の使用。
- 前記結合メンバーが小免疫タンパク質(SIP)である、請求項20に記載の使用。
- 前記結合メンバーがダイアボディである、請求項16〜19のいずれか1項に記載の使用。
- 患者において関節リウマチを診断するための診断用製品の製造におけるフィブロネクチンのED-Aアイソフォームに結合する結合メンバーの使用。
- 前記結合メンバーがフィブロネクチンのED-Aに結合する、請求項23に記載の使用。
- 前記患者が関節リウマチを有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の使用。
- ヒト又は動物患者において関節リウマチを検出又は診断する方法であって、
(a)該ヒト又は動物に、フィブロネクチンのED-Aアイソフォームに結合する結合メンバーを投与するステップ、及び
(b)該ヒト又は動物の体の新生血管における該結合メンバーの存在又は非存在を決定するステップ
を含み、該ヒト又は動物における新生血管への該結合メンバーの局在化が関節リウマチの存在を示す、前記方法。 - 前記結合メンバーがフィブロネクチンのED-Aに結合する、請求項26に記載の方法。
- 前記結合メンバーが検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項26又は27に記載の方法。
- 前記結合メンバーが放射性同位体にコンジュゲートされている、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 患者において関節リウマチを治療する方法であって、フィブロネクチンのED-Aアイソフォームに結合する結合メンバーを含む治療上有効量の医薬を患者に投与することを含む方法。
- 前記結合メンバーがフィブロネクチンのED-Aに結合する、請求項30に記載の方法。
- 前記結合メンバーが検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項30又は31に記載の方法。
- 前記結合メンバーが抗炎症活性を有する分子にコンジュゲートされている、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合メンバーがインターロイキン-10(IL-10)にコンジュゲートされている、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合メンバーが放射性同位体にコンジュゲートされている、請求項30又は31に記載の方法。
- フィブロネクチンのED-Aアイソフォームに結合する結合メンバーをヒト又は動物に投与することを含む、該ヒト又は動物において関節リウマチ部位の新生血管に分子を送達する方法であって、該結合メンバーが該分子にコンジュゲートされている、前記方法。
- 前記結合メンバーがフィブロネクチンのED-Aに結合する、請求項36に記載の方法。
- 前記分子が検出可能な標識である、請求項36又は37に記載の方法。
- 前記分子が抗炎症活性を有する、請求項36又は37に記載の方法。
- 前記結合メンバーがインターロイキン-10(IL-10)にコンジュゲートされている、請求項36又は37に記載の方法。
- 前記分子が放射性同位体である、請求項36又は37に記載の方法。
- 前記結合メンバーがVHドメインを含み、
該VHドメインがフレームワークと、相補性決定領域HCDR1、HCDR2及びHCDR3のセットとを含み、
ここでHCDR1が配列番号3、23、33、43、53、63、73、83、93、103若しくは113のアミノ酸配列を有し、
HCDR2が配列番号4のアミノ酸配列を有し、
HCDR3が配列番号5のアミノ酸配列を有するか、又は、
該VHドメインが、相補性決定領域HCDR1、HCDR2及びHCDR3内に10個以下のアミノ酸置換を有する相補性決定領域のセットを含む、
請求項26〜41のいずれか1項に記載の方法。 - 前記VHドメインフレームワークがヒト生殖系列フレームワークである、請求項42に記載の方法。
- 前記VHドメインが配列番号1、21、31、41、51、61、71、81、91、101又は111のアミノ酸配列を有する、請求項43に記載の方法。
- 前記結合メンバーが、相補性決定領域LCDR1、LCDR2及びLCDR3のセットと、フレームワークとを含むVLドメインをさらに含む、請求項42〜44のいずれか1項に記載の方法。
- LCDR1が配列番号6、26、36、46、56、66、76、86、96、106若しくは116のアミノ酸配列を有し、
LCDR2が配列番号7のアミノ酸配列を有し、
LCDR3が配列番号8のアミノ酸配列を有するか、又は、
前記VLドメインが、相補性決定領域LCDR1、LCDR2及びLCDR3内に10個以下のアミノ酸置換を有する相補性決定領域のセットを含む、
請求項45に記載の方法。 - 前記VLドメインフレームワークがヒト生殖系列フレームワークである、請求項46に記載の方法。
- 前記VLドメインが配列番号2、22、32、42、52、62、72、82、92、102又は112のアミノ酸配列を有する、請求項47に記載の方法。
- 前記結合メンバーが一本鎖Fvを含む、請求項26〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合メンバーが小免疫タンパク質(SIP)である、請求項49に記載の方法。
- 前記結合メンバーがダイアボディである、請求項26〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記患者が関節リウマチを有する、請求項26〜51のいずれか1項に記載の方法。
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