CN103396483A - 一种与类风湿性关节炎相关的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与类风湿性关节炎相关的抗体。本发明涉及一种结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体分子，包含VH结构域和VL结构域，其中VH结构域包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的组，并且其中VL结构域包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的组；其中抗体结合于具有抗炎活性的分子。本发明涉及类风湿性关节炎(RA)的检测和治疗。

Description

一种与类风湿性关节炎相关的抗体
本发明是申请日2008年10月27日、标题为“一种与类风湿性关节炎相关的抗原”申请号200880123186.2的分案申请。
技术领域
本发明涉及类风湿性关节炎(RA)的检测和治疗。本发明涉及结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员(binding member)，尤其是结合纤连蛋白的结构域ED-A的结合成员的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎性和破坏性关节病，在工业化世界，其影响0.5-1％的人群，并且常常导致明显的残疾从而降低生活质量。
患有RA的患者滑膜中的血管形成被认为是发病机制和疾病永存中一个重要的早期步骤(Taylor、2002)。如在肿瘤性疾病中，血管形成促进扩张滑膜(Walsh et al.，1998)。血管生长很可能有助于炎性滑膜血管翳的增生，并有助于炎性白细胞进入滑膜组织内。患有RA的患者的滑膜包含增加量的成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)(Koch，2003)。血清VEGF浓度与疾病活性相关并且当滑膜炎可通过治疗而成功抑制时血清VEGF浓度下降(Taylor，2002)。
纤连蛋白(FN)是一种糖蛋白，并且在各种正常组织和体液中广泛表达。其是细胞外基质(ECM)的组分，并且在许多生物学过程中发挥作用，包括细胞粘附、细胞迁移、止血、血栓形成、创伤愈合、组织分化和恶性转化(致癌转化)。
不同的FN同种型通过初级转录本FN pre-mRNA的三个区域(ED-A、ED-B，IIICS)的选择性剪接而生成，该过程受到细胞因子和细胞外pH的调节(Balza1988；Carnemolla1989；Borsi1990；Borsi1995)。纤连蛋白包含两个III型球形额外结构域(extra-domains)，该结构域可以进行选择性剪接：ED-A和ED-B(ffrench-Constant1995，Hynes1990，Kaspar et al.2006)。小鼠纤连蛋白和人纤连蛋白的ED-A是96.7％相同的(在二者90个氨基酸序列之间仅3个氨基酸不同，参见图2)。
在乳腺癌(Jacobs et al.2002，Matsumoto et al.1999)和肝癌(Oyama et al.1989，Tavian et al.1994)中的mRNA水平以及在纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和黑色素瘤(Borsi et al.1987)中的分离蛋白水平，已报道了纤连蛋白的ED-A在肿瘤细胞和实体瘤中的表达。
在免疫组织化学水平，已经在牙源性肿瘤(Heikinheimo et al.1991)和肝细胞癌(Koukoulis et al.1995)的细胞外基质(ECM)中检测到了ED-A的存在。相反，已经在恶性乳腺肿瘤的间质(Koukoulis et al.1993)和良好分化的肾细胞癌的血管和基底膜(Lohi et al.1995)中检测到了ED-A。然而，在较少分化的肾细胞癌(Lohi et al.1995)和甲状腺乳头瘤(Scarpino et al.1999)中，已在血管、基底膜和肿瘤间质中检测到了ED-A。还报道了ED-A存在于胶质瘤脉管系统中(Borsi et al.1998)。因此，针对不同类型的肿瘤报道的ED-A表达的模式是高度不同的。
对于癌症治疗而言，生物活性剂基于抗体靶向递送至血管形成部位是一种有吸引力的治疗策略，但对于慢性炎性疾病而言，在很大程度上尚未进行探索。我们先前已经证实了纤连蛋白的ED-B结构域(一种血管生成的标志物)在患者的银屑病病变和牛皮癣的小鼠模型以及胶原引起的类风湿性关节炎小鼠模型的关节炎脚爪中表达。利用放射性和荧光技术，发现在静脉内给予之后，特异于EDB的人单克隆抗体L19选择性定位于体内炎症部位。这些结果表明一种治疗潜能，即基于L19的生物活性化合物选择性递送至炎症部位(Trachsel、2007；PCT/EP2007/004044)。
之前已通过原位杂交证实除了ED-B之外，纤连蛋白的ED-A结构域也存在于人关节炎样本中(Berndt et al.，1998；Kriegsmann etal.，2004)。
发明内容
这里我们证实，与抗ED-B抗体L19以及抗结合腕蛋白(粘蛋白，tenascin)-C抗体F16和G11相比，抗ED-A抗体如本文中披露的F8抗体能够在人关节炎样本中给出较强的染色模式。
此外，利用放射性和荧光技术，发现在静脉内给予后特异于ED-A的人单克隆抗体F8选择性地定位于体内炎症部位。
因此，表明纤连蛋白的ED-A能作为一种类风湿性关节炎的血管标志物。
结合分子如结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的抗体分子代表可用于制备治疗类风湿性关节炎(RA)的药物的新型试剂。
本发明提供了结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型(A-FN)的结合成员例如抗体分子在用于制备治疗类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员如抗体分子在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
本发明进一步提供结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子在用于将结合至该结合成员的分子递送至类风湿性关节炎部位中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子在用于将结合至该结合成员的分子递送至类风湿性关节炎部位中的应用。该结合分子可用于制备用于递送这样的分子的药物。
本发明提供了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员如抗体分子在用于制备用于诊断类风湿性关节炎的诊断性产品中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员如抗体分子在用于制备用于诊断类风湿性关节炎的诊断性产品中的应用。
本发明进一步提供一种检测或诊断人或动物体内的类风湿性关节炎的方法，包括：
(a)向人或动物给予结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，如抗体分子，以及
(b)确定在人或动物体内的类风湿性关节炎部位是否存在该结合成员；
其中，该结合成员定位于类风湿性关节炎的部位表明存在类风湿性关节炎。
本发明提供了一种治疗个体中的类风湿性关节炎的方法，包括给予该个体治疗有效量的包括结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员如抗体分子的药物。本发明还提供了一种治疗个体中的类风湿性关节炎的方法，包括给予该个体治疗有效量的包括结合纤连蛋白的ED-A的结合成员如抗体分子的药物。
本发明提供了一种包括结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员如抗体分子的组合物，其用于治疗个体中的类风湿性关节炎的方法中，该方法包括给予该个体治疗有效量的包括结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员如抗体分子的药物。本发明还提供一种包括结合纤连蛋白的ED-A的结合成员如抗体分子的组合物，其用于治疗个体中的类风湿性关节炎的方法中，该方法包括给予该个体治疗有效量的包括结合纤连蛋白的ED-A的结合成员如抗体分子的药物。
本发明提供了一种将分子递送至人或动物体内类风湿性关节炎部位的新血管系统的方法，包括向人或动物给予结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员如抗体分子，其中该结合成员结合至所述分子。本发明还提供了一种将分子递送至人或动物体内类风湿性关节炎部位的新血管系统的方法，包括向人或动物给予结合纤连蛋白的ED-A的结合成员如抗体分子，其中该结合成员结合至所述分子。
用于本发明的结合成员可以为一种结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包括抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9或者其变异体中的一种或多种互补决定区(CDR)。优选的，用于本发明的结合成员是一种结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包括抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9或者其变异体中的一种或多种互补决定区(CDR)。最优选地，用于本发明中的结合成员是一种结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包括抗体F8或者其变异体中的一种或多种互补决定区(CDR)。
用于本发明中的结合成员可包括抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9中的H和/或L CDR的组，或者抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9中的H和/或L CDR的组，其中在所披露的H和/或L CDR组内含10个或较少，如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。优选地，用于本发明中的结合成员包括抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9中的H和/或L CDR的组，其中在所披露的H和/或L CDR组内含10个或较少，如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。优选地，用于本发明中的结合成员包括抗体F8中的H和/或L CDR组，其中在所披露的H和/或L CDR组内含10个或较少，如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。
取代可能在CDR组内的任何残基处或者可以在CDR1、CDR2和/或CDR3内实现。
例如，用于本发明中的结合成员可包括如本文中描述的一个或多个CDR，例如，CDR3，并且可选地，还包括CDR1和CDR2以构成CDR组。
用于本发明中的结合成员还可包含抗体分子，例如人抗体分子。该结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。结合成员的VH结构域也适用于本发明。在VH和VL结构域中的每一种内，均存在互补决定区(“CDR”)和框架区(FR)。VH结构域包含HCDR组，而VL结构域包含LCDR组。抗体分子可包含抗体VH结构域，其包括VH CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。其可以可替换地或者还可包含抗体VL结构域，其包括VL CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9中的VH和VL结构域以及CDR在本文中描述。本文中披露的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR组以及HCDR组和LCDR组均代表用于本发明中的结合成员的实施方式。如本文所述，“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDR组是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，而LCDR组是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有指明，否则“CDR组”包括HCDR和LCDR。
用于本发明中的结合成员可包含抗体VH结构域，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3以及框架，其中HCDR1是SEQID NO：3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，并且其中可选地，HCDR2是SEQ ID NO：4和/或HCDR3是SEQ ID NO：5。优选地，该HCDR1是SEQ ID NO：23、33、43、53、73、83或103。最优选地，该HCDR1是SEQ ID NO：83。
典型地，VH结构域与VL结构域配对从而为抗体提供抗原结合位点，尽管如在下面进一步讨论的，VH或VL结构域可单独用来结合抗原。因此，用于本发明中的结合成员可进一步包含抗体VL结构域，其包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3以及框架，其中LCDR1是SEQ ID NO：6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，并且其中可选地，LCDR2是SEQ ID NO：7，和/或LCDR3是SEQ ID NO：8。优选地，该LCDR1是SEQ ID NO：26、36、46、56、76、86或106。最优选地，该LCDR1是SEQ ID NO：86。
用于本发明中的结合成员可以是用于纤连蛋白的ED-A的分离的抗体分子，包括VH结构域和VL结构域，其中该VH结构域包括框架以及互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的组，并且其中该VL结构域包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3以及框架，并且其中
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4，
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5，
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116；
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：7；以及
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：8。
可将抗体的一个或多个CDR或者CDR的组移植入框架(例如，人框架)内，以提供用于本发明中的抗体分子。框架区可包括人种系基因节段序列。因此，可将框架种系化，借此改变框架内的一个或多个残基以与最相似的人种系框架内对应位置的残基相匹配。用于本发明中的结合成员可为分离的抗体分子，其具有在人种系框架如DP47内含有HCDR组的VH结构域。通常，该结合成员还具有在例如人种系框架内含有LCDR组的VL结构域。该VL结构域的人种系框架可以为DPK22。
用于本发明中的VH结构域可具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。优选地，用于本发明中的VH结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：21、31、41、51、71、81或101。最优选地，用于本发明中的VH结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：81。用于本发明中的VL结构域可具有氨基酸SEQID NO：2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。优选地，用于本发明中的VL结构域可具有氨基酸SEQ ID NO：22、32、42、52、72、82或102。最优选地，用于本发明中的VL结构域具有氨基酸SEQ ID NO：82。
用于本发明中的结合成员可为单链Fv(scFv)或包含单链Fv(scFv)，包括借助于肽连接物连接的VH结构域和VL结构域。普通技术人员可选择连接物的适当长度和序列，例如，长度至少5或10个氨基酸，长度多达约15、20或25个氨基酸。该连接物可具有氨基酸序列GSSGG(SEQ ID NO：28)。所述scFv可由氨基酸序列SEQ ID NO：9构成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。
单链Fv(scFv)可包含在小免疫球蛋白或小免疫蛋白(SIP)中，例如，如在(Li et al.，1997)中所描述的。sip可以包含scFv分子，该分子融合于人IgE分泌性同种型IgE-S2的CH4结构域(εS2-CH4；Batista et al.，1996)，其形成同源二聚体型小免疫球蛋白抗体分子。
可替换地，用于本发明中的结合成员可在非抗体分子内包含抗原结合位点，通常由一个或多个CDR，例如非抗体蛋白支架中的CDR组提供。包括非抗体和抗体分子的结合成员在本文的其他部分更详细地描述。
用于本发明中的结合成员可结合至具有杀生物性、细胞毒性免疫抑制活性或抗炎活性的分子。白介素-10是一种与根据本发明的结合成员结合的有益分子，并且可用于治疗类风湿性性关节炎。此外，用于本发明中的结合成员可结合至放射性同位素、可检测性标记物或光敏剂。
本发明的这些以及其他方面在下文中更详细地描述。
附图说明
图1示出了利用针对血管形成的标志物的抗体在人关节炎样本上进行免疫组织化学的结果。较深的染色表示抗原的强表达，用白色箭头指出。F8是本文中所披露的结合ED-A的抗体分子，L19是结合ED-B的抗体分子(例如，Pini et al.1998)，F16和G11分别是结合于结合腕蛋白(Tenascin)-C结构域A1和C的抗体分子(WO2006/050834)。
图2示出了利用针对纤连蛋白的ED-A结构域的F8抗体分子在人关节炎样本上进行免疫荧光分析的结果。白色染色表示抗原的强表达。
图3示出了A：人ED-A(上面的序列)与B：小鼠ED-A(下面的序列)之间的比对。星号表示其中人ED-A与小鼠ED-A的氨基酸相同的氨基酸位置。
图4A示出了抗ED-A抗体H1重链(VH)的核苷酸序列(SEQID NO：12)。抗ED-A抗体H1的重链CDR1的核苷酸序列加下划 线。抗ED-A抗体H1的重链CDR2的核苷酸序列
Figure BDA00003342012400081
Figure BDA00003342012400082
。抗ED-A抗体H1的重链CDR3的核苷酸序列
Figure BDA00003342012400083
Figure BDA00003342012400084
。
图4B示出了抗ED-A抗体H1连接物(连接子)序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
图4C示出了抗ED-A抗体H1轻链(VL)的核苷酸序列(SEQID NO：13)。抗ED-A抗体H1的轻链CDR1的核苷酸序列加下划 线。抗ED-A抗体H1的轻链CDR2的核苷酸序列
Figure BDA00003342012400085
Figure BDA00003342012400086
。抗ED-A抗体H1的轻链CDR3的核苷酸序列
Figure BDA00003342012400087
Figure BDA00003342012400088
。
图5A示出了抗ED-A抗体H1重链(VH)的氨基酸序列(SEQID NO：1)。抗ED-A抗体H1的重链CDR1的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)加下划线。抗ED-A抗体H1的重链CDR2的氨基酸序列(SEQID NO：4)
Figure BDA00003342012400091
。抗ED-A抗体H1的重链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
Figure BDA00003342012400092
。图5B示出了抗ED-A抗体H1连接物序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。图5C示出了抗ED-A抗体H1轻链(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。轻链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)加下划线。抗ED-A抗体H1的轻链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)
Figure BDA00003342012400093
Figure BDA00003342012400094
。抗ED-A抗体H1的轻链CDR3的氨基酸序列(SEQ IDNO：8)
Figure BDA00003342012400095
。
图6示出了包含F8-IL10的编码序列的核酸构建体的序列。该结构为HINDIII分泌序列F8(14aa连接物)连接物(SSSSG)3-IL10-终止子(stop)-NotI，如下：HINDIII限制性酶切位点加下划线，编码分泌信号的序列以
Figure BDA00003342012400096
，F8VH编码序列位于分泌信号序列之后，为
Figure BDA00003342012400097
，编码14氨基酸连接物的序列以小写字母表示，F8VL编码序列在14氨基酸连接物序列之后，为
Figure BDA00003342012400098
，连接物(SSSSG)3序列位于F8编码序列之后，
Figure BDA00003342012400099
，IL-10编码序列加双下划线；然后终止子以小写字母表示，其后的NOTI限制性酶切位点加下划线。
图7示出了包含连接物的抗体scFv(F8)IL-10结合物的氨基酸序列，结构为：VH-连接物-VL-连接物-IL-10。VH和VL结构域以
Figure BDA000033420124000911
表示，scFv连接物以小写字母表示，scFv与IL10之间的连接物以小写字母和
Figure BDA000033420124000910
，IL-10序列加下划线。
图8示出了F8-IL10和HyHe110-IL10的克隆、表达和纯化：
图8a示出了包含F8-IL10融合蛋白元件的pcDNA3.1载体的示意图。人IL10部分通过15氨基酸连接物(SSSSG)3融合于ScFv抗体片段的C末端。N末端的分泌序列是重组蛋白的分泌所必需的。
图8b示出了纯化的融合蛋白的SDS-PAGE分析结果：泳道1，分子量标志物；泳道2和3，在非还原和还原条件下的F8-IL10。期望单体融合蛋白具有46kDa的分子量。图8c示出了已纯化的F8-IL10的尺寸排阻色谱曲线(Superdex200)。以13ml保留体积洗脱时的峰对应于F8-IL10的非共价同源二聚体形式，以14ml保留体积洗脱时的较小峰对应于单体部分。
图8d示出了F8-IL10的活性分析结果。将F8-IL10的活性与MC/9细胞上的重组人IL10活性进行比较。
具体实施方式
命名
纤连蛋白
纤连蛋白是一种可进行选择性剪接的抗原，并且纤连蛋白的许多可选的同种型是已知的，如本文中其他部分所描述的。额外结构域-A(EDA或ED-A)也称为ED、额外III型重复A(EIIIA)或EDI。Kornblihtt et al.(1984)，Nucleic Acids Res.12，5853-5868和Paolella et al.(1988)，Nucleic Acids Res.16，3545-3557已发表了人ED-A的序列。人ED-A的序列还可在SwissProt数据库上作为以登录号P02751存入(deposit)的氨基酸序列中的氨基酸1631-1720(III型纤连蛋白12；额外结构域2)获得。小鼠ED-A的序列还可在SwissProt数据库上作为以登录号P11276存入的氨基酸序列中的氨基酸1721-1810(III型纤连蛋白13；额外结构域2)获得。
纤连蛋白的ED-A同种型(A-FN)包含额外结构域-A(ED-A)。人A-FN的序列可从相应的人纤连蛋白前体序列推导出来，该人纤连蛋白前体序列可在SwissProt数据库上以登录号P02751获得。小鼠A-FN的序列可从相应的小鼠纤连蛋白前体序列推导出来，小鼠纤连蛋白前体序列可在SwissProt数据库上以登录号P11276获得。所述A-FN可以为纤连蛋白的人ED-A同种型。所述ED-A可以为人纤连蛋白的额外结构域-A。
ED-A是90氨基酸序列，其可通过选择性剪接(可变剪接)插入纤连蛋白(FN)内，并且定位在FN的结构域11和12之间(Borsiet al.，1987，J.Cell Biol.，104，595-600)。ED-A在血浆形式的FN中大部分缺失，但在胚胎发生、组织重构、纤维化、心脏移植和实体瘤生长过程中则大量存在。
选择性剪接
选择性剪接是指DNA的初级RNA转录本发生不同模式的剪接以产生不同的mRNA。切除内含子后，可决定选择哪些外显子一起剪接以形成mRNA。选择性剪接导致生成包含不同外显子和/或不同数目外显子的不同同种型。例如，一种同种型可包含对应于一个或多个外显子的额外氨基酸序列，其可包含一个或多个结构域。
结合成员
其描述了彼此结合的一对分子中的一个成员。结合对的成员可为天然来源或者完全或部分通过合成而生成的。所述分子对的一个成员在其表面上具有一个区域或者一个腔，其结合至并因此互补于该分子对的另一成员的特定空间和极性构成(polar organization)。
结合对类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体类型的反应。
结合成员通常包含具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以为包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白。
抗原结合位点可通过互补决定区(CDR)在非抗体蛋白支架如纤连蛋白或细胞色素B等上排列(Haan&Maggos，2004；Koide1998；Nygren1997)或通过随机化或诱变蛋白支架内环的氨基酸残基以赋予对预期靶的结合特异性而提供。用于设计蛋白内新型结合位点的支架已由Nygren等人(1997)进行了详细综述。在WO/0034784中披露了用于抗体模拟物的蛋白支架，将其全部内容以引用方式结合于本文，其中发明人描述了包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白(抗体模拟物)。其中移植了一个或多个CDR例如一组HCDR的合适支架可由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。该支架可以为人或非人蛋白。非抗体蛋白支架的优势在于其在支架分子内提供抗原结合位点，与至少某些抗体分子相比，该支架分子较小和/或易于制备。较小尺寸的结合成员可赋予有用的生理特性如进入细胞、透入组织深处或到达其他结构内的靶的能力，或者结合靶抗原的蛋白腔内的能力。非抗体蛋白支架内抗原结合位点的使用在Wess，2004中进行综述。典型的是具有稳定骨架以及一个或多个可变环的蛋白，其中所述环的氨基酸序列被特异性地或随机性地突变以产生结合靶抗原的抗原结合位点。这样的蛋白包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白A、转铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(例如，第10纤连蛋白III型结构域)和抑铁素(lipocalins)的IgG结合结构域。其他途径包括合成的“微体”(Selecore GmbH)，其基于环肽(cyclotides)-具有分子内二硫键的小蛋白。
除了抗体序列和/或抗原结合位点以外，用于本发明中的结合成员还可包括其他氨基酸，例如形成肽或多肽例如折叠域，或者赋予该分子除结合抗原能力之外的另一功能特征。用于本发明中的结合成员可携带可检测标记，或者可结合于毒素或靶向部分或酶(例如，借助于肽键或连接物)。例如，结合成员可包含催化位点(例如，在酶结构域内)以及抗原结合位点，其中所述抗原结合位点结合于该抗原，因此使催化位点靶向该抗原。所述催化位点可通过例如切割而抑制抗原的生物学功能。
如已指出的，尽管CDR可由非抗体支架所携带，但用于携带CDR或CDR组的结构通常将为抗体重链或轻链序列或其基本部分，其中所述CDR或CDR组定位于与天然存在的VH和VL抗体可变域(由重排的免疫球蛋白基因编码)的CDR或CDR组合相对应的位置。免疫球蛋白可变域的结构和定位可参照Kabat1987及其最新资料而确定，现在可在因特网上查到(在immuno.bme.nwu.edu或利用任何搜索引擎查找“Kabat”)。
通过CDR区或CDR，用于表示免疫球蛋白重链和轻链中的超变区，如由Kabat等人(1987)所定义的(Kabat1991a，以及后来的版本)。抗体通常包含3个重链CDR和3个轻链CDR。根据情况，本文中使用了术语CDR，以便表示这些区域中的一个或几个，或者甚至全部，其包含大部分氨基酸残基，该氨基酸残基负责通过抗体的亲合力结合所识别的抗原或表位。
在这6个较短的CDR序列中，重链的第3个CDR(HCDR3)具有较大的尺寸可变性(较大的差异性主要是由于生成其的基因重排的机制)。其可短至2个氨基酸，尽管已知最长的尺寸为26个氨基酸。功能上，HCDR3在决定抗体的特异性方面部分发挥作用(Segal1974；Amit1986；Chothia1987；Chothia1989；Caton1990；Sharon1990a；Sharon1990b；Kabat et al.，1991b)。
抗体分子
其描述了免疫球蛋白，无论是天然还是部分或全部通过合成而生成的。该术语还涉及包含抗体的抗原结合位点的任何多肽或蛋白。这里必须理解，本发明并不涉及天然形式的抗体，也就是说抗体不是处于其天然环境中而是它们已能够通过纯化而从天然来源中分离或得到，或者通过遗传重组或通过化学合成而获得，并且它们于是包含非天然氨基酸，如其后将描述的。包含抗体的抗原结合位点的抗体片段包括但不限于诸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd的抗体分子；以及双体抗体(双特异抗体，diabodies)。
可能采用单克隆抗体和其他抗体并采用重组DNA方法的技术来生产其他结合靶抗原的抗体或嵌合分子。这样的技术可涉及将编码免疫球蛋白可变区或抗体的CDR的DNA引入至不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区中。参见例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400，以及大量的后续文献。杂交瘤或其他产生抗体的细胞可进行遗传突变或其他改变，其可能改变或可能不改变所产生的抗体的结合特异性。
由于抗体可以以多种方式进行修饰，因此术语“抗体分子”应该理解为涵盖任何具有抗体的抗原结合位点(具有对抗原的必需特异性和/或结合)的结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段及衍生物，包括含有抗体的抗原结合位点的任何多肽，无论其是天然的还是全部或部分合成的。因此，包括融合于另一种多肽(例如，来自另一物种或者属于另一抗体类别或亚类)的包括抗体的抗原结合位点的嵌合分子或等价物。嵌合抗体的克隆和表达描述在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量的后续文献中。
抗体工程领域中可采用的另外的技术使得可以分离人和人源化抗体。例如，人杂交瘤可如Kontermann&Dubel(2001)所描述的来制备。噬菌体展示，另一种已建立的用于生成结合成员的技术，已经详细地描述在许多出版物WO92/01047(下文进一步讨论)和美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404以及Kontermann&Dubel(2001)中。其中小鼠抗体基因被灭活并用人抗体基因进行功能性替代，同时保持小鼠免疫系统的其他元件完整的转基因小鼠可用于分离人抗体(Mendez1997)。
合成的抗体分子可通过借助于从合适表达载体内合成和组装的寡核苷酸产生的基因表达而生成，例如，如由Knappik等人(2000)或Krebs等人(2001)所描述的。
已证实整个抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward1989；McCaffertV1990；Holt2003)，其由VH或VL结构域构成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，包括两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接物而连接，该连接物使所述两个结构域结合以形成抗原结合位点(Bird1988；Huston1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双体抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger1993a)。Fv、scFv或双体抗体分子可通过整合连接VH和VL结构域的二硫桥而稳定(Reiter1996)。还可制备包含结合于CH3结构域的ScFv的微型抗体(minibodies)(Hu1996)。结合片段的其他实例是Fab’，其通过在重链CH1结构域的羧基末端加入若干残基而不同于Fab片段，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，以及Fab’-SH，其是其中恒定域的(一个或多个)半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab’片段。
用于本发明中的抗体片段可从本文描述的任何抗体分子，例如包含VH和/或VL结构域的抗体分子或者本文描述的任何抗体的CDR开始，通过诸如借助于酶如胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶进行消化和/或通过借助于化学还原切割二硫桥的方法而获得。在另一种方式中，本发明的抗体片段可通过同样对于本领域普通技术人员来说熟知的基因重组技术或借助于例如自动肽合成仪(诸如AppliedBiosystems等公司供应的那些合成仪)通过肽合成或者通过核酸合成和表达而获得。
根据本发明的功能性抗体片段包括其半衰期通过化学修饰特别是通过聚乙二醇化或者通过整合入脂质体内而延长的任何功能片段。
dAb(结构域抗体)是抗体的较小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区(Holt2003)。VH dAb天然存在于骆驼科(例如骆驼、骆马)中，并且可通过用靶抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞以及直接克隆来自单个B细胞的dAb基因而生成。dAb还可在细胞培养中得到。它们的小尺寸、良好的溶解性以及温度稳定性使得它们在生理上特别有用，并且适合于进行选择和亲和力成熟。本发明的结合成员可以是包含VH或VL结构域的dAb，如本文中基本上列出的，或者可以为包含一组CDR的VH或VL结构域，如本文中基本上列出的。
如本文中所使用的，术语“基本上列出的”是指本文描述的结合成员VH或VL结构域的相关CDR的(一个或多个)特征将与本文中已列出其序列的特定区域相同或高度类似。如本文所描述的，相对于一个或多个可变域的(一个或多个)特定区域，术语“高度类似”期待可在该CDR和/或VH或VL结构域中进行从1至约5例如从1至4，包括1至3，或者1或2，或者3或4个氨基酸取代。
双特异性或双功能性抗体构成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区结合在相同分子中(Holliger1999)。通过其补充新效应子功能或者将几个分子靶向在肿瘤细胞表面的能力，已经证实了它们在诊断领域和在治疗领域中的用途。在将采用双特异性抗体的情况下，这些可以为常规的双特异性抗体，其可通过各种途径进行制备(Holliger1993b)，例如通过化学或通过二次杂交瘤(杂交的杂交瘤，hybrid hybridoma)而制备，或者可以为上文提到的双特异性抗体片段中的任何一种。这些抗体可通过化学方法(Glennie1987；Repp1995)或体细胞法(Staerz1986；Suresh1986)，但同样可通过基因工程技术而获得，后者可实现异源二聚化从而有利于所寻找抗体的纯化过程(Merchand1998)。双特异性抗体的实例包括BiTETM方法学(BiTETMtechnology)的那些，其中可采用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域并通过短的柔性肽(柔性连接肽，flexiblepeptides)直接连接在一起。这样可将两种抗体结合在单个短多肽链上。双体抗体和scFv可构建为不含Fc区，仅利用可变域，有可能降低抗个体基因型反应的效应。
双特异性抗体可构建为整个IgG、双特异性Fab′2、Fab′PEG、双体抗体或双特异性scFv。此外，两种双特异性抗体可利用本领域中已知的常规方法进行连接，以形成四价抗体。
与双特异性全抗体不同，双特异性双体抗体还特别有用，因为它们可以容易地构建且易于在大肠杆菌中表达。具有适当结合特异性的双体抗体(以及许多其他多肽如抗体片段)可以利用噬菌体展示(WO94/13804)从文库中容易地进行选择。如果双体抗体的一个臂(arm)将保持恒定，例如具有针对靶抗原的特异性，则可制备一个文库，其中另一个臂是变化的，且可选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可通过可替代的工程方法而制备，如在Ridgeway1996中描述的。
在本领域中各种方法可用于获得针对靶抗原的抗体。所述抗体可以为单克隆抗体，特别是人源、鼠源、嵌合或人源化来源，其可按照本领域中普通技术人员熟知的标准方法而获得。
通常，为了制备单克隆抗体或它们的功能片段，特别是鼠源的，可以参考特别是在手册"Antibodies”(Harlow and Lane1988)中描述的技术或者参考Kohler and Milstein，1975描述的从杂交瘤进行制备的技术。
单克隆抗体可例如从通过针对A-FN或其包含由所述单克隆抗体识别的表位的片段(例如，包含ED-A或由ED-A构成的片段，或者ED-A的肽片段)之一进行免疫的动物细胞获得。A-FN或者其片段之一可按照通常的操作方法通过从cDNA序列中所包含的编码A-FN或其片段的核酸序列开始进行基因重组，从A-FN或其片段的肽序列中包括的氨基酸序列开始进行肽合成来特别生成。
例如，单克隆抗体可在亲和柱上进行纯化，该亲和柱上已经预先固定了A-FN或其包含由所述单克隆抗体识别的表位的片段之一，例如包含ED-A或ED-A的肽片段或由ED-A或ED-A的肽片段构成的片段。单克隆抗体可通过在蛋白A和/或G上进行层析而纯化，接着进行或不进行离子交换层析，这种层析的目的在于清除残留的蛋白污染物以及DNA和本身的LPS，接着在琼脂糖凝胶上进行或不进行排阻层析，以便消除由于存在二聚体或其他多聚体引起的潜在聚集体。全部这些技术可同时或顺序使用。
抗原结合位点
其描述了结合于并互补于全部或部分靶抗原的分子的部分。在抗体分子中，其称为抗体的抗原结合位点，并且包括结合于并互补于全部或部分该靶抗原的抗体的部分。当抗原较大时，该抗体可以仅结合于抗原的特定部分，该部分命名为表位。抗体的抗原结合位点可以通过一个或多个抗体可变域来提供。抗体的抗原结合位点可包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
分离的
该术语是指其中用于本发明的结合成员或编码这样的结合成员的核酸通常按照本发明的状态。因此，本发明的结合成员、VH和/或VL结构域可以以基本纯化或同质的形式例如从它们的天然环境分离和/或纯化而提供，或者，在核酸的情况下，则为游离或基本游离于不同于编码具有所需功能的多肽的序列来源的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸将游离于或基本游离于它们天然结合的物质诸如在它们的天然环境中与它们一起存在的其他多肽或核酸，或者当通过体外或体内实施的重组DNA技术进行这样的制备时，则游离于或基本游离于制备它们的环境(例如，细胞培养)。成员和核酸可通过稀释剂或佐剂进行配制，并且还可分离用于实际目的-例如如果用来包覆用于免疫分析的微滴定板，则所述成员将通常与明胶或其他载体进行混合，或者当用于诊断或治疗时，将与药用载体或稀释剂进行混合。结合成员可天然或通过异源真核细胞(例如，CHO或NS0(ECACC85110503)细胞进行糖基化，或者它们(例如，如果通过在原核细胞中表达而生成)可为非糖基化的。
包含抗体分子的异质制剂也可用于本发明中。例如，这样的制剂可为含全长重链和缺失C末端赖氨酸重链的抗体混合物，具有不同程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸，例如N末端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基。
用于抗原例如A-FN或纤连蛋白的ED-A的一种或多种结合成员可通过使根据本发明的结合成员的文库与抗原或它们的片段例如包含ED-A或ED-A的肽片段或由ED-A或ED-A的肽片段构成的片段相接触并筛选所述文库中能够结合该抗原的一种或多种结合成员来获得。
抗体文库可利用重复克隆过滤筛选(ICFS)进行筛选。在ICFS中，将包含编码几种结合特异性的DNA的细菌在液体培养基中生长，并且一旦达到指数生长期，则将数十亿的细菌分散在由适当预处理的膜滤器(membrane filter)构成的生长支持物上，并将其孵育直至出现完全融合(汇合)的细菌集落。另外一种捕获基质由另一种膜滤器构成，该膜滤器已经预增湿并覆盖有期望的抗原。
随后将该捕获膜滤器置于包含合适培养基的板上，并用表面已覆盖有朝上的细菌集落的生长滤器(growth filter)进行覆盖。由此获得的夹层在室温下孵育约16h。从而可以实现编码具有扩散作用的抗体片段ScFv的基因的表达，使得捕获那些与在捕获膜上存在的抗原特异性结合的片段。然后该捕获膜经处理以通过通常用于该目的的比色技术来展示已结合的抗体片段ScFv。
捕获滤器上色斑的位置可追溯至存在于生长膜上并生成捕获的抗体片段的相应细菌集落。收集这样的集落并进行培养，细菌-几百万个细菌分散在新的培养膜上，重复上述步骤。随后进行类似循环直至捕获膜上的阳性信号对应于单个阳性集落(菌落)，其中每一个均代表针对该选择中所用的抗原的单克隆抗体片段的潜在起源。ICFS描述在例如WO0246455中，将其结合于此供参考。文库也可以在颗粒或分子复合物，例如可复制的遗传包装如噬菌体(例如，T7)颗粒，或者其他体外展示系统上展示，每一种颗粒或分子复合物均包含编码在其上展示的抗体VH可变域的核酸，并且可选地还包含展示的VL结构域(如果存在)。噬菌体展示描述在WO92/01047以及例如美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404中，将其每一个的全部内容均结合于此供参考。
选择能够结合所述抗原并在噬菌体或者其他文库颗粒或分子复合物上展示的结合成员后，可从展示所述选择的结合成员的噬菌体或者其他颗粒或分子复合物提取核酸。通过从具有从展示所述选择的结合成员的噬菌体或者其他颗粒或分子复合物中提取的核酸序列的核酸进行表达，这样的核酸可用于随后生成结合成员或者抗体VH或VL可变域。
具有所述选择的结合成员的抗体VH可变域的氨基酸序列的抗体VH可变域可以以分离形式提供，如可为包含这样的VH结构域的结合成员。
可进一步测定结合A-FN或纤连蛋白的ED-A或者其他靶抗原或同种型的能力，例如，与抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9中的任何一种竞争与A-FN或A-FN的片段，例如纤连蛋白的ED-A结合的能力。
用于本发明中的结合成员可特异性结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。本发明的结合成员可以与抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9，例如以scFv形式相同的亲和力或者以更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。用于本发明中的结合成员以3×10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。优选地，用于本发明中的结合成员以2×10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。更优选地，用于本发明中的结合成员以1.7×10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。还更优选地，用于本发明中的结合成员以1.4×10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。最优选地，用于本发明中的结合成员以3×10-9M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。
本发明的结合成员可结合于A-FN和/或纤连蛋白的ED-A上与抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9相同的表位。
用于本发明中的结合成员可不表现出任何对除A-FN和/或纤连蛋白的ED-A外的分子的显著结合。特别地，该结合成员可不结合纤连蛋白的其他同种型，例如纤连蛋白的ED-B同种型和/或IIICS同种型。
本文中所披露的抗体分子的变异体可在本发明中生产并使用。通常在CDR、抗体VH或VL结构域以及结合成员的氨基酸序列内部进行取代所需的技术在本领域中是可获得的。可制备包含取代的变异体序列，所述取代可以(或不可以)预测对活性具有微小或有益的影响，并测定其结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力和/或测定任何其他期望特性。
如所讨论的，可根据本发明采用本文中已特别披露其序列的任何VH和VL结构域的可变域的氨基酸序列变异体。特定变异体可包括一个或多个氨基酸序列改变(添加、缺失、取代和/或插入氨基酸残基)，可少于约20个改变，少于约15个改变，少于约10个改变或少于约5个改变，可能为5、4、3、2、1个改变。改变可在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中进行。所述改变通常并不导致功能丧失，因此包含由此改变的氨基酸序列的结合成员可保留结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力。例如，其可保留与其中不进行改变的结合成员相同的定量结合，例如，如在本文中描述的分析中测量的。包含由此改变的氨基酸序列的结合成员可以具有改善的结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力。
携带用于本发明中的来自CDR序列的新型VH或VL区可利用随机诱变一个或多个选择的VH和/或VL基因以在整个可变域内产生突变而产生。在一些实施方式中，在整个可变区或CDR组内进行一个或两个氨基酸取代。另一种可使用的方法是直接诱变VH或VL基因的CDR区。
如上文指出的，如本文中基本上列出的CDR氨基酸序列可作为人抗体可变域中的CDR或者其基本部分而被携带。如本文中基本上列出的HCDR3序列代表本发明的实施方式，并且例如，这些序列中的每一种均可作为人重链可变域中的HCDR3或其基本部分而被携带。
本发明中采用的可变域可获自或来自任何种系或重排的人可变域，或者可为基于已知人可变域共有或实际序列的合成可变域。可变域可来自非人抗体。用于本发明中的CDR序列(例如，CDR3)可利用重组DNA技术引入到缺乏CDR(例如，CDR3)的可变域的库(repertoire)中。例如，Marks等人(1992)描述了生成抗体可变域的文库的方法，其中定位于或邻近可变域的5’末端的通用引物与人VH基因的第三框架区的通用引物联用，以提供缺乏CDR3的VH可变域的文库。Marks等人进一步描述了如何将该文库与特定抗体的CDR3进行结合。利用类似技术，本发明的来自CDR3的序列可与缺乏CDR3的VH或VL结构域的文库混合(shuffle)，且所混合的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域结合，以提供用于本发明中的结合成员。然后可在合适的宿主系统如WO92/01047(将其全部内容结合于此供参考)或后续大量文献中的任一个，包括Kay，Winter&McCafferty(1996)的噬菌体展示系统内展示该库，使得可以选择合适的结合成员。文库可由任何来自104个以上的个体成员例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员组成。
类似地，一个或多个，或者所有三个CDR均可移植入VH或VL结构域的文库内，随后筛选用于A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的一个或多个结合成员。
可以采用抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个或多个或者HCDR组，和/或可以采用抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的X LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个或多个或者抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的LCDR组。
类似地，还可以采用本文中披露的其他VH和VL结构域、CDR组和HCDR组和/或LCDR组。
A-FN和/或纤连蛋白的ED-A均可用于筛选用于制备治疗类风湿性关节炎的药物的结合成员例如抗体分子。该筛选可为本文其他部分所披露的库筛选。
免疫球蛋白可变域的基本部分可包括至少所述三个CDR区，连同它们插入的框架区。该部分还可包括第一和第四框架区中的任一个或两者的至少约50％，该50％为第一框架区的C末端50％和第四框架区的N末端50％。该可变域的基本部分的N末端或C末端处的其他残基可为那些通常不与天然存在的可变域域结合的残基。例如，通过重组DNA技术进行的构建本发明的结合成员可导致引入由连接物编码的N末端或C末端残基，以促进克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括引入连接物以将本文其他部分披露的可变域连接于另外的蛋白序列，包括抗体恒定区、其他可变域(例如在生成双体抗体时)或可检测/功能标记物，如本文其他部分更详细地讨论的。
尽管结合成员可包括VH和VL结构域对，但基于VH或VL结构域序列中的任一个的单结合结构域也可用于本发明中。已知单个免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域，能够以特异性方式结合靶抗原。例如，参见上文对dAb的讨论。
在单个结合结构域中的任一个的情况下，这些结构域均可用来筛选能够形成双结构域结合成员(能够结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A)的互补结构域。这可通过利用如在WO92/01047中披露的称为分级双重组法的噬菌体展示筛选法而实现，将全部内容结合于此供参考，其中包含H链或L链克隆中的任一个的单个集落用来感染编码另一条链(L或H)的完整克隆文库，并且所得到的双链结合成员按照噬菌体展示技术例如该文献中披露的那些技术进行筛选。该技术还披露在Marks1992中。
用于本发明中的结合成员可进一步包括抗体恒定区或其一部分，例如人抗体恒定区或其一部分。例如，VL结构域可在其C末端连接于包含人Cκ或Cλ链，例如Cλ的抗体轻链恒定域。类似地，基于VH结构域的结合成员在其C末端结合于免疫球蛋白重链的全部或部分(例如，CH1结构域)，所述重链源自任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM以及同种型亚类中的任何一种，特别是IgG1和IgG4。具有这些特征并使可变区稳定的任何合成的或其他恒定区变异体也可以用于本发明的实施方式中。
用于本发明中的结合成员可标记有可检测或功能性标记物。标记物可以为任何产生或可以经诱导产生信号的分子，包括但不限于荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或光吸收度来检测和/或测量结合。可利用本领域中已知的常规化学方法将可检测标记物连接于用于本发明中的抗体。
存在多种方法，借助这些方法该标记物可以生成利用外在方法例如通过肉眼观察、电磁辐射、加热和化学试剂可检测的信号。所述标记物还可结合于另一种结合成员，其结合用于本发明中的抗体，或结合于支持物。
已标记的结合成员例如标记有可检测标记物的scFv，可用于体内、离体或体外诊断和/或治疗。
例如，放射标记的结合成员(例如，结合于同位素的结合成员)可用于放射诊断和放射治疗中。可结合于本发明中所用结合成员的放射性同位素包括诸如94mTc、99mTc、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47Sc、111In、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、123I、124I、125I和131I的同位素。
例如，用于本发明中的标记有可检测标记物的结合成员可用来检测、诊断或监测人或动物体内的类风湿性关节炎。
本发明的结合成员可用于制备用于诊断类风湿性关节炎的诊断性产品。
本发明提供了一种检测或诊断人或动物体内的类风湿性关节炎的方法，包括：
(a)向人或动物给予本发明的结合成员，例如标记有可检测标记物的结合成员，该标记物结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A，以及
(b)确定在人或动物体的新血管系统内是否存在结合成员；其中该结合成员定位于人或动物体内的新血管系统(neovasculature)表示存在类风湿性关节炎。
在该结合成员标记有可检测标记物的情况下，该可检测标记物的存在与否可通过检测该标记物来确定。
本发明中使用的结合成员与可对损伤内靶细胞发挥杀生物、细胞毒性免疫抑制或抗炎效应的分子以及针对这些损伤中所存在的细胞外基质组分的抗体之间的结合物或融合物可应用于本发明中。例如，结合的分子尤其可以为白介素-10、抗炎或其他药物、光敏剂或放射性核素。这样的结合物治疗上可用于例如治疗如本文中提到的类风湿性关节炎。
结合成员与杀生物性或细胞毒性分子的融合物或结合物的生成和用途例如描述在WO01/62298中，其结合于此供参考。
本发明提供了一种治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的包含用于本发明中的结合成员的药物。
该结合成员可以为(i)通过细胞相互作用对靶细胞发挥抗炎效应的分子、抗炎性分子、IL-10、TGFβ或其他药物，与(ii)用于纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员的结合物。
该结合成员可以为(i)发挥免疫抑制或抗炎效应的分子，与(ii)用于纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员的结合物。
该结合成员可以为(i)白介素-10(IL10)或TGFβ，与(ii)用于纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员的结合物。这样的结合成员在本文所披露的本发明与治疗类风湿性关节炎相关的方面中非常有用。
本发明提供了用于本发明中的结合成员在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
该结合成员可结合或融合于如本文所述的发挥杀生物性、细胞毒性、免疫抑制性或抗炎效应的分子。该结合成员可以为(i)通过细胞相互作用对靶细胞发挥杀生物性或细胞毒性效应或者具有免疫抑制或抗炎效应的分子，与(ii)用于根据本发明的人纤连蛋白的结合成员的结合物。
本文中还描述了(i)通过细胞相互作用、或免疫抑制或抗炎效应对靶细胞发挥杀生物性或细胞毒性效应的分子，与(ii)用于本发明所用的人纤连蛋白的结合成员的结合物。这样的结合物优选包括融合蛋白，其包含该杀生物性、细胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及所述结合成员，或者，在该结合成员为双链或多链的情况下，融合蛋白包含该杀生物性、细胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及所述结合成员的多肽链组分。优选地，该结合成员是单链多肽，例如单链抗体分子，如ScFv。
包括免疫抑制性或抗炎性分子和单链Fv抗体分子的融合蛋白可以用于本发明中。
通过细胞相互作用对靶细胞发挥其效应的免疫抑制性或抗炎性分子可与靶细胞直接相互作用，可与靶细胞上的膜结合受体相互作用，或者干扰细胞膜的电化学电位。在一个示例性的优选实施方式中，该分子是IL-10。
如下文进一步讨论的，该特异性结合成员优选为抗体，或包含抗体的抗原结合位点。方便地，该特异性结合成员可以为单链多肽，如单链抗体。这样可允许方便生产包含单链抗体以及免疫抑制性或抗炎性分子(例如白介素-10或者TGFβ)的融合蛋白。抗体的抗原结合位点可借助于独立多肽中，例如全抗体中或抗体片段如Fab或双体抗体中的抗体VH结构域与抗体VL结构域的结合来提供。在该特异性结合成员是双链或多链分子(例如，分别为Fab或全抗体)的情况下，免疫抑制性或抗炎性分子可结合为在特异性结合成员中含一种或多种多肽链的融合多肽。
该结合成员可通过肽键与免疫抑制性或抗炎性分子结合，即在融合多肽内包含所述分子以及该特异性结合成员或其多肽链组分(参见例如，Trachsel et al.)。其他用于结合的方式包括化学结合，特别是利用双功能试剂的交联(例如，采用DOUBLE-REAGENTSTMCross-linking Reagents Selection Guide，Pierce)。
本文中还描述了编码用于本发明中的结合成员的分离核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。核酸可编码CDR或CDR组或者VH结构域或VL结构域或者抗体的抗原结合位点或者抗体分子，例如scFv或IgG，例如IgG1，如上文所定义的。该核苷酸序列可编码本文披露的VH和/或VL结构域。
本文进一步描述了质粒、载体、转录盒或表达盒(框)形式的构建体，其包含至少一个如上文所述的多核苷酸。
还描述了包含如上所述的一个或多个构建体的重组宿主细胞。描述了编码任何CDR或CDR组或者VH结构域或VL结构域或者抗体的抗原结合位点或者抗体分子，如所提供的scFv或IgG1或IgG4的核酸，这是一种生成编码产物的方法，该方法包括从编码核酸进行表达。可通过在适当的条件下培养包含该核酸的重组宿主细胞来方便地实现表达。通过表达而生成后，VH或VL结构域或者结合成员可利用任何合适的技术进行分离和/或纯化，然后适当时进行应用。
核酸可包括DNA或RNA，并且可全部或部分为合成的。提到如本文所列出的核苷酸序列时，涵盖具有特定序列的DNA分子，并且涵盖具有特定序列的RNA分子，其中U代替T，除非上下文中以其它方式要求。
还描述了一种生成抗体VH可变域的方法，该方法包括从编码核酸进行表达。这样的方法可包括在用于生产所述抗体VH可变域的条件下培养宿主细胞。
生产方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。生产方法可包括将该产物配制成包含至少一种另外的组分如药用赋形剂的组合物。
用于在多种不同宿主细胞中克隆并表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母菌和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。本领域中已经很好的建立了抗体和抗体片段在原核细胞内的表达。对于综述，参见例如Plückthun1991。常见的细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。
对于本领域中的技术人员而言，在培养的真核细胞中表达也可作为一种用于生产结合成员的选择，例如Chadd&Chamow(2001)，Andersen&Krummen(2002)，Larrick&Thomas(2001)。本领域中可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞等。
可选择或构建合适的载体，包含适当的调节序列(包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸序列、增强子序列)、标志物基因以及适当时的其他序列。载体可以为质粒，例如噬菌粒或病毒，例如适当时的噬菌体。进一步的细节参见例如Sambrook&Russell(2001)。许多已知的用于操作核酸的技术和流程，例如在制备核酸构建体时，诱变、测序、将DNA引入到细胞内和基因表达以及蛋白分析详细地描述在Ausubel1999中。
宿主细胞可包含如本文所述的核酸。这样的宿主细胞可处于体外且可为培养细胞。这样的宿主细胞可处于体内。体内存在宿主细胞可实现用于本发明中的结合成员在细胞内表达为“内抗体(intrabodies)”或细胞内抗体。内抗体可用于基因治疗。
还描述了一种包括将本文所披露的核酸引入到宿主细胞内的方法。该引入可采用任何可获得的技术。对于真核细胞而言，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran(葡聚糖)、电穿孔术、脂质体介导的转染以及利用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘苗(或者，对于昆虫细胞则为杆状病毒)进行转导。将核酸引入到所述宿主细胞内，特别是真核细胞内可采用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以以附加体形式保持或者可掺入宿主细胞内或掺入人工染色体内。掺入可以为在单个或多个基因座随机或定向整合一个或多个拷贝。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化法、电穿孔法以及利用噬菌体的转染。
引入后可以是通过例如在用于基因的表达的条件下培养宿主细胞而引起或允许从该核酸表达。表达的产物的纯化可通过本领域中普通技术人员已知的方法来实现。
所述核酸可整合入该宿主细胞的基因组(例如，染色体)内。可按照标准技术通过包括促进与基因组重组的序列而促进整合。
还描述了一种方法，其包括在表达系统中利用如上文所述的构建体以便表达如上所述的结合成员或多肽。
用于本发明中的结合成员被设计成用于人或动物对象，例如人体内的诊断或治疗方法中。用于本发明中的结合成员可用于诊断或治疗类风湿性关节炎。
因此，本发明提供了包括给予如所提供的结合成员的治疗方法、包含这样的结合成员的药物组合物以及这样的结合成员在制备用于给予的药物中的应用，例如，在制备药物或药物组合物的方法中，包括将结合成员与药用赋形剂一起配制。药用载体是众所周知的，并且作为所选的(一种或多种)活性化合物的性质和给予模式的函数，将由本领域中的技术人员进行调整。
用于本发明中的结合成员通常将以药物组合物的形式给予，药物组合物可包含至少一种除该结合成员之外的组分。因此，除了活性成分之外，根据本发明的并按照本发明使用的药物组合物还可包括药用赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或者其他为本领域技术人员所熟知的材料。这样的材料应该是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。所述载体或其他材料的具体性质将依赖于给予途径，其可以为口服、吸入或通过注射，例如静脉内注射。
用于口服给予的药物组合物，例如纳米抗体等也设想在本发明之内。这样的口服制剂可以为片剂、胶囊、粉末、液态或半固态形式。片剂可包含固态载体如明胶或佐剂。液态药物组合物通常包含液态载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。还可包含生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或者二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射，或在痛苦部位进行注射，活性成分将为肠外可接受的水溶液的形式，其不含热原并且具有合适的pH、等张性和稳定性。本领域中的相关技术人员能够利用例如等张载体，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来很好地制备合适的溶液。如有必要，可采用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。许多用于制备药物制剂的方法对于本领域技术人员来说是已知的，参见例如Robinson，1978。
组合物可单独给予或者与其他治疗同时或依次联合给予，或者作为与另一种治疗剂或多种其他治疗剂的联合制剂而给予，取决于待治疗的病症。
用于本发明中的结合成员可用作与另外的药物组分结合的联合治疗的一部分。联合治疗可用来提供显著的协同效应，特别是用于本发明中的结合成员与一种或多种药物的联合。用于本发明中的结合成员可与另一种治疗剂或多种其他治疗剂同时或依次给予，或者作为与另一种治疗剂或多种其他治疗剂的联合制剂而给予，用于治疗本文所列出的一种或多种病症。
例如，用于本发明中的结合成员可与现存治疗剂组合使用来治疗类风湿性关节炎。
用于治疗类风湿性关节炎的现存治疗剂包括IL-10、TGFβ、光敏剂和细胞毒性药物。
用于本发明中的结合成员以及上述另外的药物组分中的一种或多种可用于制备药物。该药物可用于单独或联合给予个体，因此可包括所述结合成员以及所述另外的组分，作为联合制剂或者作为单独的制剂。使用单独的制剂可以有助于单独并依次或同时给予，并且允许通过不同的途径，例如口服和肠外给予，而给予所述组分。
按照本发明，所提供的组合物可给予哺乳动物。可以以“治疗有效量”给予，该量足以显示对患者的益处。这样的益处可为至少缓解至少一种症状。因此，“治疗类风湿性关节炎”是指缓解至少一种症状。所给予的实际量以及给予速率和时程将依赖于正在治疗疾病的性质和严重程度、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾病的起因、组合物的递送部位、结合成员的类型、给予方法、给予时间安排以及药物医师已知的其他因素。治疗的处方，例如剂量决定等，在全科医师和其他医师的负责范围内，并且可以依赖于症状的严重程度和/或正治疗疾病的进展。适当的抗体剂量在本领域中是熟知的(Ledermann1991和Bagshawe1991)。可以使用本文或Physician′s Desk Reference(2003)中指出适于所给予药物类型的特定剂量。可通过比较其体外活性和动物模型中的体内活性来确定用于本发明中的结合成员的治疗有效量或合适的剂量。用于将小鼠和其他测试动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。具体的剂量将依赖于多个因素，包括该抗体用于诊断、预防还是用于治疗，待治疗区域的大小和位置，抗体(例如，全抗体、片段或双体抗体)的具体性质以及任何可检测标记物或其他连接于抗体的分子的性质。典型的抗体剂量对于全身性应用来说将在100μg至1g的范围内，对于局部应用来说在1μg至1mg的范围内。初始可给予较高的负荷量，随后是一次或多次较低的剂量。抗体可以为全抗体，例如IgG1或IgG4同种型。这是用于成年患者的单次治疗的剂量，对于儿童和婴儿可以按比例调整，并且对于其他抗体形式还可按照分子量成比例调整。治疗可以以每天一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复，由医师决定。对于皮下给予，治疗可以为每两周至四周一次，而对于静脉内给予，可为每四周至八周一次。在本发明的一些实施方式中，治疗是周期性的，并且给予之间的周期为约2周或更长，例如约3周或更长，约4周或更长，或约每月一次。在本发明的其他实施方式中，治疗可以在手术之前和/或手术之后给予，并且可直接在手术治疗的解剖部位给予或施加。
鉴于本披露内容包括下列实验范例，本发明的其他方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的，
实验
结果
人关节炎样本的组织化学分析
纤连蛋白结构域EDA和EDB以及结合腕蛋白-C(tenascin-C)结构域A1和C的表达分别利用F8、L19、F16和G11抗体通过免疫组织化学在人关节炎样本上进行研究。
在图1中，较深的染色表示各个抗原的表达(用白色箭头指出)。抗EDA抗体F8导致最强的染色，因此利用该抗体进行所有进一步的实验。
利用F8抗体进行的免疫荧光实验表明一种满意的血管周围染色(图2中可见为白色结构)。
人单克隆抗体F8选择性积累在小鼠体内的关节炎部位
利用用于抗体检测的荧光和放射性，我们研究了小抗体形式(SIP)(Borsi et al.2002)的F8在CIA小鼠模型(Courtney et al.1980)中的体内靶向性能。该SIP形式由scFv抗体片段而构成，该片段连接于人IgE的CH4结构域，从而产生一种大小为80kDa的同源二聚体蛋白。
关节炎小鼠注射标记有近红外染料Alexa750的SIP(F8)。静脉内注射后24小时，动物利用红外荧光成像仪(Birchler et al.，1999)进行成像，揭示抗体较强且选择性地积累在关节炎肢体中存在的损伤内，可见为白色发光的脚爪，在小鼠前爪中存在一些2级肿胀。
静脉内注射放射性标记有125I的SIP(F8)后24小时，处死小鼠，并利用放射自显影(感光成像)对脚爪进行成像。在注射SIP(F8)小鼠的发炎肢体内观察到了放射性的优先积累，在放射自显影内可见为黑色染色。一只脚爪表现出关节炎评分为2(整个脚爪肿胀)。另一只脚爪分类为1级关节炎(单个指头肿胀)。
抗ED-A抗体-白介素-10融合体的活性
将scFv形式的抗体分子F8与白介素-10(IL-10)结合在融合蛋白内。在测定诱导MC/9细胞的IL-4依赖性增殖的能力的分析(Thompson et al.，1991)中，比较该融合蛋白与人IL-10的生物学活性。结果示于图8(d)中。
材料和方法
在人关节炎样本上进行免疫组织化学分析
将人关节炎样本的冰冻切片在冰冷丙酮中固定10’，用胎牛血清封闭30’，并对新血管系统的标志物(纤连蛋白ED-A和ED-B，结合腕蛋白(Tenascin)-C结构域A1和C)进行染色。以10μg/ml的浓度使用F8、L19、F16和G11抗体作为myc标记的scFv并孵育1h。将第一抗体与浓度为7μg/ml的抗myc抗体9E10共孵育。作为第三检测抗体，兔抗小鼠IgG抗体(Dako，丹麦)和APAAP小鼠单克隆(Dako，丹麦)分别以5和50μg/ml的浓度使用，每一种均达1h。使用固红片剂(Sigma，瑞士)来进行染色孵育15’。切片用苏木素复染2’，用水清洗，用甘油胶(glycergel)封固剂(Dako，丹麦)封片，并利用Axiovert S100TV显微镜(Zeiss，瑞士)进行分析。
人关节炎样本上的免疫荧光分析
将人关节炎样本的冰冻切片在冰冷丙酮中固定10’，用胎牛血清封闭30’，并对纤连蛋白的EDA结构域进行染色。F8抗体作为myc标记的scFv以10μg/ml的浓度使用并孵育1h。将第一抗体与浓度为7μg/ml的抗myc抗体9E10共孵育。作为第三检测抗体，荧光抗小鼠Alexa596抗体(Molecular Probes，丹麦)以10μg/ml的浓度均使用1h。切片用Hoechst33342复染，用甘油胶(glycergel)封固剂(Dako，丹麦)封片，并利用AxioScop2MOT+显微镜(Zeiss，瑞士)进行分析。
动物模型
通过在尾巴根部皮内注射用相等体积的弗氏完全佐剂(MDBiosciences)乳化的200μg II型牛胶原(MD Biosciences)来免疫雄性DBA/1小鼠(8-12周龄)。首次免疫后2周，重复该步骤，但采用不完全弗氏佐剂(MD Biosciences)来乳化胶原。每天观察小鼠，并且指定1个或多个肢体中表现出红斑和/或脚爪肿胀的每只小鼠进行成像或治疗研究。
利用2个疾病指数(临床评分和脚爪肿胀)监测关节炎。对于临床评分，每天一次以非盲方式对每个肢体进行分级(0＝正常，1＝同一肢体的1个或多个指头肿胀，2＝整个脚爪肿胀)，每只动物得到的最大可能评分是8。在异氟烷麻醉下，每隔一天利用测径器测量每一个肢体的厚度来评价脚爪肿胀。全部4只脚爪的平均值指定为每一只动物的脚爪厚度。
关节炎脚爪的近红外成像
通过近红外图像分析来测试SIP(F8)在关节炎小鼠内的选择性积累，如Birchler et al.(1999)所描述的。简单而言，按照生产商的建议，用Alexa750(MolecularProbes，Leiden，荷兰)标记纯化的SIP(F8)，并将100μg已标记的蛋白注射入关节炎小鼠的尾静脉内。注射后24小时，用氯胺酮(ketamin)80mg/kg和美托咪定0.2mg/kg麻醉小鼠，并在近红外小鼠成像系统中成像(Trachsel et al.2007；Birchler et al.1999)。
生物分布实验
如前面所描述的，通过生物分布分析来评估SIP(F8)在关节炎小鼠体内的体内靶向性能(Borsi et al.2002；Tarli et al.，1999)。简单而言，将纯化的SIP(F8)进行放射性碘标记，并将10μg的蛋白(相对于11uCi125I)注射入关节炎小鼠的尾静脉内。注射后24小时处死小鼠，并将脚爪暴露1小时，并如前所述(Trachsel et al.2007)在磷光成像仪(phosphorimager)(Fujifilm BAS-5000)中读取。
抗体
抗ED-B抗体片段scFv(L19)的分离先前已经描述过(Pini etal.1998)。利用已公开的步骤(Giovannoni，Nucleic.Acid Research，2001，29(5)：E27)，从ETH-2文库中分离母本抗ED-A抗体。在以下部分将描述母本抗ED-A抗体的亲和力成熟，其可产生高亲和力的抗ED-A抗体。
母本抗ED-A抗体的亲和力成熟
母本抗ED-A抗体(一种来自ETH-2的抗体)用作用于构建亲和力成熟文库的模板。利用部分简并的引物5′-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3′(SEQ ID NO：17)(用于VH)和5′-CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3′(SEQ ID NO：18)(用于VL)(所有寡核苷酸均购自Operon Biotechnologies，Cologne，德国)，在一个可在VH CDR1的位置31、32和33以及VL CDR1的位置31、31a和32产生随机突变的过程中通过PCR引入文库的VH CDR1(DP47种系)和VL CDR1(DPK22种系)中的序列变异性。利用引物LMB3long(5′-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3′)(SEQID NO：19)和fdseqlong(5′-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3′)(SEQ ID NO：20)，并利用凝胶纯化的VH和VL节段作为模板，通过PCR组装将VHVL组合装配成ScFv形式。将组装的VH-VL片段用NcoI/NotI进行双重消化，并克隆入NcoI/NotI消化的pHEN1噬菌粒载体中(Hoogenboom et al.，1991)。按照(Viti et al.，2000)，将所得到的连接产物电穿孔进入电感受态大肠杆菌(E.coli)TG-1细胞中，得到一个包含1.5×107个独立抗体克隆的文库，筛选以改善的亲和力结合ED-A的抗体。
抗ED-A抗体的选择
利用BIAcore分析，筛选上文所述的抗体文库中以比母本抗ED-A抗体较高的亲和力结合ED-A的抗体。BIAcore分析中应用的抗原(11A12)包含人纤连蛋白的ED-A结构域，并且具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：120)：
MRSYRTEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQTEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH
抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQ ID NO：121)如下：
atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaaCagcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcCcaaaaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattGaaggcttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagTcagcctctggttcagactgcagtaaccaacattgatcgccctaaaggactggcattcactgatgTggatgtcgattccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgAcctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacac
TgcagagctgcaaggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgAtatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagTtcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggAtatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgAcagctcatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctCttaaggacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaccatcaccatcactaa
利用5’和3’处分别含BamHI和BglII限制性酶切位点的引物通过PCR扩增抗原的核苷酸序列。将所得到的PCR产物和载体pQE12(QIAGEN)用BamHI和BglII限制性内切酶进行消化，随后在插入片段：载体的比率为3∶1的反应中进行连接。将得到的载体进行测序以核实序列是否正确。
抗原制备
将10ml2TY，Amp，1％葡萄糖中的TG1电感受态预培养物在存在1μl的11A12的DNA小量制备物的情况下进行电穿孔。随后将该预培养物稀释1∶100(8ml稀释入800ml2TY，Amp，0.1％葡萄糖)并生长至0.4-0.6的OD600，随后用IPTG诱导过夜。第二天，将细胞旋转下来并过滤上清(Millipore0.22μm)。将培养液离心并澄清后，利用Hitrap柱在FPLC上纯化11A12。Ni/柱如下进行再生：用5倍柱体积(CV)的H2O清洗柱，接着施加3CV0.5M EDTA/0.2MTris pH8以将旧镍从柱中洗出。接着用5CV H2O清洗柱。随后用2CV100mM NiSO4重新装载柱，接着用几CV的H2O清洗柱。随后用5CV裂解缓冲液(20mM咪唑/250mM NaCl/PBS pH7.4)平衡柱。过滤(Millipore0.45μm)细胞裂解物并装载到柱上(手工)。随后将柱装回FPLC上，并使裂解缓冲液保持流动直至UV信号稳定(恒定)，约3CV。然后启动洗脱程序：5CV中的0％-100％的梯度洗脱缓冲液(400mM咪唑/250mM NaCl/PBS pH7.4)。收集包含洗脱的抗原的流分，并在PBS中透析过夜。
抗ED-A抗体的表达和纯化
抗ED-A抗体如下进行表达和纯化：将10ml2TY，Amp，1％葡萄糖中的TG1电感受态预培养物在存在1μl的抗ED-A抗体之一的DNA小量制备物的情况下进行电穿孔。随后将该预培养物稀释1∶100(8ml稀释入800ml2TY，Amp，0.1％葡萄糖)并生长至0.4-0.6的OD600，随后用IPTG诱导过夜。第二天，将细胞旋转下来并过滤上清(Millipore0.22μm)。该ScFv在Protein A-Sepharose柱上纯化，并用三乙胺从柱上洗脱ScFv。将包含洗脱出的ScFv的流分在PBS中在4℃下透析过夜。然后将该ScFv流分置于Superdex75柱上，PBS以0.5ml/min的速度流动，并收集0.25ml流分。该单体流分用于BIAcore分析。
BIAcoreTM分析1
BIAcoreTM芯片用HBS-EP缓冲液BIACORETM、0.01M HepespH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20(用于该分析的相同缓冲液)以5μl/min的流速冲洗过夜。将抗原(11A12)在醋酸盐缓冲液(pH4.0)中稀释至50μμg/ml的浓度，并通过注射50μl的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与乙基-N-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)的混合物激活芯片上的COOH基团。将40μl的11A12抗原注射在芯片上，并用30μl的乙醇胺封闭残留的游离COOH基团。在0.22μm过滤后，将20μl的每一种细菌上清注射在芯片上，并实时监测与抗原的相互作用。
BIAcoreTM分析2
利用表面等离子体共振来评估母本抗ED-A抗体以及抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9的kon、koff和KD。该芯片用这种分析中所用的同一缓冲液以5μl/min的缓冲液流速平衡过夜。整个涂布过程也以该流速进行。用醋酸盐缓冲液pH4.00(由BIACORETM提供)将抗原11A12稀释1∶25至20μg/ml的最终浓度。然后混合NHS和EDC，并注射50μl以激活CM5芯片上的COOH基团。其后注射40μl的抗原(这持续约40”)。然后注射30μl的乙醇胺以便封闭最终游离的COOH的反应性。
每一个样品均以20μl/min的流速进行分析。注射20μl的未稀释的单体蛋白(因为其来自凝胶过滤)。解离时间持续约200”。然后注射10μl的HCl 10mM以再生该芯片。以不同稀释度即1∶2稀释(在PBS中)重复单体蛋白的注射，然后用HCl进行再生。这之后以1∶4的稀释度第三次注射该蛋白，并再次用HCl进行再生。利用BIA评估软件来评价每一抗ED-A抗体的kon、koff和KD值。
抗ED-A抗体的选择
BIAcoreTM分析1
BIAcoreTM分析针对每种抗ED-A抗体均生成一个曲线图，分析该曲线图以如下推导抗体对该抗原的亲和力：每一个曲线图的x轴对应于时间，而y轴对应于共振单位(一种表示所测抗体对涂布在BIAcoreTM芯片上的抗原的结合亲和力的度量)。每一个曲线图均展示出3个峰和1个谷，这对应于缓冲液的变化，因此与结果的解释无关。
每一个曲线图的上升部分均表示结合期。在该部分曲线图中曲线越陡，则抗体与抗原的结合越快。每一个曲线图的下降部分均表示抗体从抗原的解离期。在该部分曲线图中曲线越平坦，则抗体从抗原的解离越慢。
与其所起源的母本抗ED-A抗体相比，抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9都表现出为较平坦的解离曲线，表明它们以比母本抗ED-A抗体更大的亲和力结合ED-A，因此也结合A-FN。在所测试的全部抗ED-A抗体中，抗体E5、F1、F8和H1的曲线图表现出最平坦的解离曲线。抗体H1、C5、D5、E5、C8、F8和F1的结合曲线比针对母本抗ED-A抗体所观察到的结合曲线较平坦，但针对抗体B2、B7、E8和G9观察到的结合曲线与针对母本抗ED-A抗体所观察到的结合曲线一样陡。然而，由于IPTG诱导的大肠杆菌(E.coli)TG-1细胞的细菌上清液用于抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的BIAcoreTM分析，因此虽然所测试的抗体样品的浓度未知，但最有可能低于用于比较的母本抗ED-A抗体样品的浓度。因此，由于用于BIAcoreTM分析的样品中的抗体浓度较低，因此抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的结合曲线可能人为地较低。然而，由于在BIAcoreTM分析中，浓度不会显著影响抗体从其靶抗原中解离，因此针对抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9所观察到的平坦解离曲线表明这些抗体以至少与母本抗ED-A抗体相等且可能较高的亲和力结合ED-A。
BIAcore分析2
利用BIA评估(BIAevaluation)软件来评估每一种抗ED-A抗体的kon、koff和KD值。用于抗原11A12的母本抗ED-A抗体和抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9的kon、koff和KD值详细列于表2中。与它们所起源的母本抗ED-A抗体相比，抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9都具有更好的KD值，表明它们以比母本抗ED-A抗体更大的亲和力结合ED-A，因此也结合A-FN。
序列
抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9是所有ScFv抗体，并且均利用常规方法进行测序。抗ED-A抗体H1的核苷酸序列示于图3中。抗ED-A抗体H1的氨基酸序列示于图4中。
优选的编码抗ED-A抗体B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的VH和/或VL的核苷酸序列等同于编码抗ED-A抗体H1的VH和/或VL的核苷酸序列，只是编码轻链(VL)和重链(VH)的H1CDR1的核苷酸序列用表1中列出的编码各个抗体的轻链(VL)和重链(VH)CDR1的核苷酸序列代替。
优选的编码抗ED-A抗体scFv F8双体抗体的VH和/或VL的核苷酸序列等同于编码抗ED-A抗体H1的VH和/或VL的核苷酸序列，只是编码轻链(VL)和重链(VH)的H1CDR1的核苷酸序列用表1中列出的编码抗ED-A抗体F8的轻链(VL)和重链(VH)CDR1的核苷酸序列代替。优选的编码连接抗ED-A scFv F8双体抗体的VH和VL的连接物的核苷酸序列是gggtccagtggcggt(SEQ IDNO：29)。
抗ED-A抗体B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9具有与抗ED-A抗体H1相同的氨基酸序列，只是轻链(VL)和重链(VH)的H1CDR1的氨基酸序列用表1中列出的各个抗体的轻链(VL)和重链(VH)CDR1的氨基酸序列代替。抗ED-A scFv F8双体抗体的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的氨基酸序列相同，只是轻链(VL)和重链(VH)的H1CDR1的氨基酸序列用表1中列出的抗ED-A抗体F8的轻链(VL)和重链(VH)CDR1的氨基酸序列代替，并且H1中连接物的氨基酸序列用连接物氨基酸序列GSSGG(SEQ ID NO：28)代替。
抗ED-A抗体B2VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：23代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体C5VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：43代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体D5VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：53代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体E5VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：63代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体C8VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：71)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：73代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体F8VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：83代替H1的VH CDR1。抗ED-A F8双体抗体的VH结构域具有与抗ED-A抗体F8的VH结构域相同的氨基酸序列(即，SEQID NO：81)。
抗ED-A抗体F1VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：93代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体B7VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：103代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体E8VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：111)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：113代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体G9VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)等同于抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：33代替H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体B2VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：26代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体C5VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：42)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：46代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体D5VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：56代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体E5VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：66代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体C8VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：72)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：76代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体F8VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：86代替H1的VL CDR1。抗ED-A F8双体抗体的VL结构域具有与抗ED-A抗体F8的VL结构域相同的氨基酸序列(即，SEQ IDNO：82)。
抗ED-A抗体F1VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：92)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：96代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体B7VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：106代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体E8VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：112)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：116代替H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体G9VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)等同于抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列，只是用SEQ IDNO：36代替H1的VL CDR1。
可选地，抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和scFv F8双体抗体的VH结构域的第5位的氨基酸可以是亮氨酸残基(L)而非缬氨酸残基(V)，如图4A中所示。此外，或者可替换地，抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和scFv F8双体抗体的VL结构域的第18位的氨基酸可以是精氨酸残基(R)而非赖氨酸残基(K)，如图4C中所示。
F8-IL10的克隆、生产和鉴定
人IL-10基因利用下列引物序列通过PCR进行扩增：
反向的反义引物，
5′-TCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCAGCGGCAGCCCAGGCCAGGGCACC-3′，
以及正向的正义引物，
5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCtcattaGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTA-3′，
在其N末端悬挂15个氨基酸的连接物(SSSSG)3的一部分，而在其C末端则悬挂终止密码子和NotI限制性酶切位点。
编码单链可变片段(F8)的DNA利用下列引物对应用信号肽进行扩增：
反向的反义引物，
5′-CCCAAGCTTGTCGACCATGGGCTGGAGCC-3′
以及正向的正义引物，
5′-GAGCCGGAAGAGCTACTACCCGATGAGGAAGAGAATTCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG-3′。
利用该策略，在N末端插入HindIII限制性酶切位点，并且在C末端插入连接物序列的互补部分。
随后利用PCR组装单链Fv和IL-10片段，并克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)的HindIII和NotI限制性酶切位点内。
CHO-S细胞用前述质粒进行稳定转染，并在G418(0.5g/l)存在的情况下进行选择。
利用人纤连蛋白的重组EDA作为抗原以及用于检测的ProteinA(蛋白A)，针对融合蛋白表达，通过ELISA筛选G418抗性细胞克隆。
在Protein A柱通过亲和层析从细胞培养基中纯化该融合蛋白。
在还原和非还原条件下在SDS-PAGE上以及在天然条件下通过FPLC凝胶过滤在Superdex S-200排阻柱上分析该融合蛋白的大小(Amersham Pharmacia Biotech，Dübendorf，瑞士)。
活性分析
利用比色法MTT染料还原分析通过其诱导MC/9细胞的IL-4依赖性增殖(Thompson-et al.，1991)的能力来确定hIL10的生物学活性。将96孔微滴定板中每孔10.000MC/9(ATCC，Manassas，USA)细胞用不同量的人IL10处理48小时，其中每孔为200μl的含5pg(0.05单位)的鼠IL4/ml(eBiosciences)培养基。hIL10标准和F8-IL10融合蛋白以最大100ng/ml的IL10当量应用，并连续稀释。加入10μl的5mg/ml MTT(Sigma)并孵育3-5小时。随后将细胞离心、用DMSO裂解并读取在570nm处的吸光度。
参考文献
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表1
亲和力成熟的抗ED-A抗体的重链(VH)和轻链(VL)CDRl的核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA00003342012400471
表2
BIAcore评估数据
抗体 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(M)
母本抗ED-A抗体 2.5x105 0.02 ～1x10-7
B2 3.8x105 7.54x10-3 ～2x10-8
C5 3.04x105 9.23x10-3 ～3x10-8
D5 4.53x105 7.6x10-3 ～1.7x10-8
C8 3.8x105 5.3x10-3 ～1.4x10-8
F8 4.65x105 1.4x10-3 ～3.1x10-9
B7 2.67x105 4.5x10-3 ～1.68x10-8
G9 3.6x105 7.54x10-3 ～2.09x10-8
                            。
Figure IDA00003342013000011
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Claims (15)

1.一种结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体分子，包含VH结构域和VL结构域，其中，所述VH结构域包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的组，其中 
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：83， 
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4，以及 
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5，并且 
其中所述VL结构域包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的组， 
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：86， 
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：7，以及 
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：8； 
进一步其中所述抗体结合于具有抗炎活性的分子。 
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述所述VH结构域包括框架区和/或所述VL结构域包括框架区，并且其中所述框架区是人种系框架区。 
3.根据权利要求1或2所述的抗体分子，其中，所述抗体分子包括SEQ ID NO：81中所示的VH结构域；或者包括SEQ ID NO：81中所示的VH结构域，只不过所述VH结构域的第5位的氨基酸是亮氨酸残基(L)而非缬氨酸残基(V)。 
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体分子包括SEQ ID NO：82中所示的VL结构域；或者包括SEQID NO：82中所示的VL结构域，只不过所述VL结构域的第18位的氨基酸是精氨酸残基(R)而非赖氨酸残基(K)。 
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包括SEQ ID NO：81中所示的VH结构域，只不过所述VH结构域的第5位的氨基酸是亮氨酸残基(L)而非缬氨酸残基(V)，并且进一步包括SEQ ID NO：82中所示的VL结构域，只不过所述VL结构域的第18位的氨基酸是精氨酸残基(R)而非赖氨酸残基(K)。 
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体分子是单链Fv或双体抗体。 
7.根据权利要求1至6任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体结合于细胞因子。 
8.根据权利要求7所述的抗体分子，其中，所述细胞因子是白介素-10(IL-10)。 
9.根据权利要求7或8所述的抗体分子，其中，所述所述抗体分子通过肽键结合于所述细胞因子。 
10.根据权利要求9所述的抗体分子，其中，所述抗体分子是双体抗体，其中所述VL结构域和VH结构域之间的连接物为5个氨基酸长度。 
11.根据权利要求7至10任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体分子为包括所述细胞因子和所述抗体分子的融合蛋白形式。 
12.编码根据权利要求1至11中任一项所述的抗体分子的分离核酸。 
13.一种宿主细胞，包括权利要求12所述的核酸。 
14.一种生成根据权利要求1至11中任一项所述的抗体分子的方法，所述方法包括在生成条件下培养权利要求13的宿主细胞。 
15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括分离所述抗体分子。 
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