ES2609813T3

ES2609813T3 - Antígeno nuevo asociado con la neovasculatura de metástasis tumorales

Info

Publication number: ES2609813T3
Application number: ES12195343.4T
Authority: ES
Inventors: Dario Neri; Jascha Rybak; Christoph Rösli; Alessandra Villa; Giovanni Neri
Original assignee: Philogen SpA
Current assignee: Philogen SpA
Priority date: 2007-04-02
Filing date: 2008-03-31
Publication date: 2017-04-24
Anticipated expiration: 2028-03-31
Also published as: EA200970909A1; US8263041B2; BRPI0809989B8; MX2009010639A; CA2682851A1; EP2142567B1; EA018985B1; EA036322B1; EA201301224A1; KR101515243B1; US20130266511A1; US20130280759A1; CA2682851C; EP2653478B1; US20160083461A1; US9181347B2; CN103275220A; JP5221641B2; CN101687923A; BRPI0809989A2

Abstract

Molécula de anticuerpo que se une al Dominio Extra A (ED-A) de la fibronectina, que comprende un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH comprende una región estructural y un conjunto de regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 83, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, y HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, y en el que el dominio VL comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y una región estructural, en el que LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 86, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, en el que la molécula de anticuerpo se une al ED-A de la fibronectina con una KD inferior a 1,4 x 10-8 M.

Description

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Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, Fv, dAb, Fd y diacuerpos.

[00034] Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unan al antígeno diana. Tales técnicas pueden

5 suponer la incorporación del ADN codificante de la región variable de una inmunoglobulina o las CDR de un anticuerpo a las regiones constantes o las regiones constantes más las regiones estructurales de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400 y una extensa colección de bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo puede someterse a mutación genética o a otros cambios que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

[00035] Dado que los anticuerpos pueden modificarse de muchas maneras, el término “molécula de anticuerpo” debe interpretarse como que abarca cualquier miembro de unión o sustancia que tiene un sitio de unión antígenoanticuerpo de la especificidad requerida y/o que se une a un antígeno. Por lo tanto, este término abarca fragmentos

15 y derivados de anticuerpos, incluido cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión antígeno-anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por consiguiente, se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión antígeno-anticuerpo o equivalente fusionado con otro polipéptido (por ejemplo, derivado de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos). La clonación y la expresión de anticuerpos quiméricos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en una extensa colección de bibliografía posterior.

[00036] Otras técnicas disponibles en la tecnología de la construcción de anticuerpos han hecho posible el aislamiento de anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, pueden preparase hibridomas humanos según describen Kontermann y Dubel (2001). La expresión en fagos, otra técnica establecida para generar miembros de

25 unión ha sido descrita en detalle en numerosas publicaciones, como el documento WO92/01047 (discutido más adelante), las patentes de los EE. UU. US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 y Kontermann y Dubel (2001). Para el aislamiento de anticuerpos humanos pueden usarse ratones transgénicos en los que los genes de anticuerpos del ratón se inactivan y se sustituyen con genes de anticuerpos humanos, mientras se dejan intactos otros componentes del sistema inmunitario del ratón (Mendez 1997).

[00037] Es posible crear moléculas de anticuerpo sintéticas mediante la expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados e incorporados en vectores de expresión adecuados, por ejemplo, según describen Knappik y col. (2000) o Krebs y col. (2001).

35 [00038] Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden desempeñar la función de unirse a antígenos. Algunos ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward 1989, McCafferty 1990, Holt 2003) que consta de un dominio VH o un dominio VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL están enlazados mediante un enlazante peptídico que permite a los dos dominios asociarse para formar un sitio de unión a un antígeno (Bird 1988, Huston 1988); (viii) dímeros Fv de cadena sencilla biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión

45 génica (documento WO94/13804, Holliger 1993a). Los fragmentos Fv, scFv o las moléculas de diacuerpos pueden estabilizarse por la incorporación de puentes disulfuro que enlacen los dominios VH y VL (Reiter 1996). También pueden prepararse minicuerpos que comprenden un fragmento scFv unido a un dominio CH3 (Hu 1996). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab’, que difiere de los fragmentos Fab por la adición de algunos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluidas una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo y Fab’-SH que es un fragmento Fab’ en el que el(los) resto(s) de cisteína de los dominios constantes tiene(n) un grupo tiol libre.

[00039] Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener a partir de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en este documento, por ejemplo, moléculas de anticuerpo que comprenden los

55 dominios VH y/o VL o regiones CDR de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, por procedimientos, tales como la digestión con enzimas, tal como pepsina o papaína y/o mediante la rotura de los puentes disulfuro por reducción química. De otra manera, los fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse por técnicas de recombinación genética igualmente bien conocidas por el experto en la técnica o además por síntesis peptídica, por ejemplo, por medio de sintetizadores de péptidos automáticos, tales como los proporcionados por la empresa Applied Biosystems, etc. o por síntesis y expresión de ácidos nucleicos.

[00040] Los fragmentos de anticuerpo funcionales según la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida se aumenta mediante una modificación química, especialmente una PEGilación, o mediante incorporación en un liposoma.

65 [00041] Según se usa en este documento, la frase “sustancialmente según se expone” se refiere a que la(s)

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cebadores consenso a la tercera región estructural de los genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de CDR3. Marks y col. describen además cómo puede combinarse este repertorio con una CDR3 de un anticuerpo concreto. Mediante técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 descritas en este documento pueden mezclarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una

5 CDR13 y los dominios VH y VL completos mezclados pueden combinarse con un dominio VL o VH afín para proporcionar miembros de unión. El repertorio puede expresarse a continuación en un sistema huésped adecuado, tal como el sistema de expresión en fagos del documento WO92/01047 o de cualquier documento de una extensa bibliografía posterior, incluyendo Kay, Winter y McCafferty (1996), de modo que puedan seleccionarse los miembros de unión adecuados. Un repertorio puede consistir en cualquier cantidad a partir de 104 miembros individuales, por ejemplo, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al menos 1010 miembros.

[00067] De manera similar, una o más o las tres CDR pueden injertarse en un repertorio de dominios VH o VL que a continuación se criban para identificar un miembro de unión o miembros de unión para el ED-A de la fibronectina.

15 [00068] Pueden emplearse HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del anticuerpo F8 y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo F8.

[00069] La A-FN y/o el ED-A de la fibronectina pueden usarse en un cribado para identificar moléculas de anticuerpo. El cribado puede ser un cribado de un repertorio según se describe en otra parte de este documento.

[00070] Una porción sustancial de un dominio variable de una inmunoglobulina puede comprender al menos las tres regiones CDR junto con sus regiones estructurales intercaladas. La porción puede incluir también al menos aproximadamente el 50% de una o dos de las regiones estructurales primera y cuarta, siendo el 50% el 50% C25 terminal de la primera región estructural y el 50% N-terminal de la cuarta región estructural. Los restos adicionales en los extremos N-terminal y C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que no se asocian normalmente con regiones de dominios variables naturales. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión por técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de restos N o C-terminales codificados por enlazantes introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de enlazantes para unir dominios variables de la invención con otras secuencias proteínicas, incluyendo las regiones constantes de un anticuerpo, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcadores detectables/funcionales según se discute en más detalle en otra parte de este documento.

[00071] Los miembros de unión de la presente invención pueden comprender además regiones constantes de

35 un anticuerpo o partes de las mismas, por ejemplo regiones constantes de un anticuerpo humano o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede unirse en su extremo C-terminal con dominios constantes de la cadena ligera de un anticuerpo, incluidas las cadenas Cκ yCλ humanas, por ejemplo Cλ. De manera similar, un miembro de unión basado en un dominio VH puede unirse en su extremo C-terminal con la totalidad o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipos, en particular IgG1 e IgG4. Cualquier variante sintética

o de otra región constante que tiene estas propiedades y estabiliza las regiones variables también es útil en las realizaciones de la presente invención.

[00072] Los miembros de unión de la presente invención pueden estar marcados con un marcador detectable o

45 funcional. Un marcador puede ser cualquier molécula que produce o que puede ser inducida para producir una señal, incluidos, pero sin limitarse a, sustancias fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sustancias quimioluminiscentes o fotosensibilizantes. Por lo tanto, la unión puede detectarse y/o medirse mediante la detección de fluorescencia o luminiscencia, radiactividad, actividad enzimática o absorbancia de luz. Los marcadores detectables pueden unirse a los anticuerpos mediante procedimientos químicos convencionales conocidos en la técnica.

[00073] Existen numerosos procedimientos por los que el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, por examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador puede unirse también a otro miembro de unión que se une al anticuerpo de la presente invención, o a un

55 soporte.

[00074] Los anticuerpos marcados, por ejemplo, scFv marcado con un marcador detectable, pueden usarse para diagnóstico in vivo, ex vivo o in vitro y/o para tratamiento.

[00075] Por ejemplo, los anticuerpos radiomarcados (por ejemplo, anticuerpos conjugados con un radioisótopo) pueden usarse en radiodiagnóstico y en radioterapia. Los radioisótopos que pueden conjugarse con un miembro de unión de la invención incluyen isótopos como 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh y 177Lu.

65 [00076] Un miembro de unión según se describe en este documento puede usarse también para medir los niveles de antígeno en un ensayo de competición, es decir, un procedimiento para la medición del nivel de antígeno

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mediante DOUBLE-REAGENTSTM, Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce).

[0083] Cuando se desea una liberación lenta, por ejemplo, cuando la molécula biocida o citotóxica es doxorrubicina u otra molécula que perturba el potencial electroquímico de la membrana celular, la conjugación

5 química puede tener lugar mediante la formación de una base de Schiff (imina) entre un grupo amino primario del miembro de unión específico (un polipéptido, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) y una fracción de azúcar oxidada (daunosamina) de la molécula biocida o citotóxica, tal como doxorrubicina.

[0084] La presente invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión

10 de la presente invención tal como se expone en las reivindicaciones. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo, por ejemplo scFv o IgG, por ejemplo IgG1, de la presente invención, tal como se define anteriormente. Las secuencias de nucleótidos preferidas son las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios VH y VL descritas en este documento.

15 [0085] La presente invención también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido según se describe anteriormente.

[0086] La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende una o

20 más construcciones según se describen anteriormente, tal como se expone en las reivindicaciones. Un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG1 o IgG4, tal como se proporcionan, forma por sí mismo un aspecto de la presente invención, al igual que un procedimiento para la producción del producto codificado, tal como se expone en las reivindicaciones, en el que el procedimiento comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante. La expresión puede conseguirse convenientemente mediante el cultivo en las

25 condiciones apropiadas de células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, puede aislarse un dominio VH o VL o un miembro de unión y/o purificarse mediante cualquier técnica adecuada y, a continuación, usarse según sea apropiado.

[0087] Un ácido nucleico, según la presente invención, puede comprender ADN o ARN y puede ser total o

30 parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos, según se expone en este documento, abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada, en la que T se sustituye por U, a menos que el contexto requiera lo contrario.

[0088] Además se describe un procedimiento para la producción de un dominio variable de anticuerpo VH, en

35 el que el procedimiento incluye inducir la expresión a partir del ácido nucleico codificante. Dicho procedimiento puede comprender el cultivo de las células huésped en las condiciones para la producción de dicho dominio variable de anticuerpo VH.

[0089] También se proporcionan procedimientos análogos para la producción de dominios variables VL y 40 miembros de unión que comprenden un dominio VH y VL.

[0090] Un procedimiento de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un procedimiento de producción puede comprender la formulación del producto en una composición que incluye al menos un componente adicional, como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

45 [0091] Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una diversidad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células vegetales, hongos filamentosos, levaduras y sistemas de baculovirus y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpo en células procariotas está bien establecida en la técnica.

50 Como revisión, véase, por ejemplo, Pluckthun 1991. Un huésped bacteriano común es E. coli.

[0092] La expresión en un cultivo de células eucariotas también es una opción disponible para los expertos en la técnica para la producción de un miembro de unión, por ejemplo Chadd y Chamow (2001), Andersen y Krummen (2002), Larrick y Thomas (2001). Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un

55 polipéptido heterólogo incluyen células ováricas de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de cría de hámster, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células embrionarias humanas de riñón, células embrionarias humanas de retina y muchas otras.

[0093] Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que contengan las secuencias reguladoras

60 apropiadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, fagémidos, o víricos, por ejemplo, fagos, según sea apropiado. Para más detalles, véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001). Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, para la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de

65 ADN en células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen en detalle en Ausubel 1999.

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para la preparación de homogenados de los órganos o se incorporaron en un compuesto para crioincorporación (Microm, Walldorf, Alemania) y se congelaron en isopentano en nitrógeno líquido para la preparación de criosecciones para el análisis histoquímico. Como controles negativos para el análisis proteómico se usaron ratones sin perfundir.

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Preparación de extractos proteínicos para el análisis proteómico

[00102] Las muestras se resuspendieron en 40 µl por mg de tejido de tampón de lisis (SDS al 2%, Tris 50 mM, EDTA 10 mM, cóctel de inhibidores de proteinasas Complete E (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) en PBS, pH 7,4) y se homogeneizaron mediante un aparato dispersador Ultra-Turrax T8 (IKA-Werke, Staufen, Alemania). Los homogenados se sometieron a ultrasonidos mediante un aparato Vibra-cell (Sonics, New Town, CT, EE. UU.), a lo que siguió una incubación de 15 min a 99°C y 20 min de centrifugación a 15.000 x g. El sobrenadante se usó como extracto de proteína total. La concentración de proteína se determinó mediante el kit de reactivos para análisis de proteínas BCA (Pierce).

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Purificación de proteínas biotiniladas

[00103] Para cada muestra, 960 µl de una lechada de estreptavidina-sefarosa (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) se lavaron tres veces en tampón A (NP40 al 1%, SDS al 0,1% en PBS), se sedimentaron y se mezclaron con 15 mg de extracto de proteína total. La captura de las proteínas biotiniladas se dejó proceder durante 2 h a temperatura ambiente en un mezclador agitador. Se eliminó el sobrenadante y la resina se lavó tres veces con tampón A, dos veces con tampón B (NP40 al 0,1%, NaCl 1 M en PBS) y una vez con bicarbonato de amonio 50 mM. Finalmente, la resina se suspendió en 400 µl de una disolución de bicarbonato de amonio 50 mM y se le añadieron 20 µl de tripsina porcina modificada de calidad de secuenciación (disolución madre de 40 ng/µl en bicarbonato de

25 amonio 50 mM) (Promega, Madison, WI, EE. UU.). La digestión con proteasa se llevó a cabo durante la noche a 37°C en agitación constante. Los péptidos se desalaron, purificaron y concentraron con microcolumnas C18 (ZipTip C18, Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Después de su liofilización, los péptidos se almacenaron a -20°C.

HPLC nanocapilar con aplicación automática de fracciones en línea sobre placas diana de MALDI

[00104] Los péptidos trípticos se separaron por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) mediante el sistema de CL en nanoescala UltiMate y un microcargador de muestras automático FAMOS (LC Packings, Ámsterdam, Países Bajos) controlado por el software Chromeleon (Dionex, Sunnyvale, CA, EE. UU.). La fase móvil A constó de acetonitrilo al 2% y ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, la fase móvil B fue acetonitrilo al 80% 35 y TFA al 0,1% en agua. La tasa de flujo fue de 300 nl/min. Los péptidos liofilizados derivados de la digestión de las proteínas biotiniladas, purificados por afinidad a partir de 1,5 mg de proteína total se disolvieron en 5 µl de tampón A y se cargaron en la columna (diámetro interno: 75 µm, longitud: 15 cm, rellena con C18 PepMap 100, 3 µm y microesferas de 100 Å; LC Packings). Los péptidos se eluyeron con un gradiente del 0-30% de B durante 7 min, del 30-80% de B durante 67 min, del 80-100% de B durante 3 min y B al 100% durante 5 min; la columna se equilibró con A al 100% durante 20 min antes de analizar la muestra siguiente. Las fracciones de elución se mezclaron con una disolución de 3 mg/ml de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico, 277 pmol/ml de neurotensina (estándar interno), TFA al 0,1% y acetonitrilo al 70% en agua y se depositaron en una placa diana de MALDI de 192 pocillos mediante un sistema Probot en línea (Dionex). El flujo de la disolución matriz de MALDI se fijó en 1,083 µl/min. Por lo tanto, cada fracción recogida durante 20 s contenía 361 nl de la disolución matriz de MALDI y 100 nl de la muestra. La

45 concentración final de neurotensina fue de 100 fmol por pocillo.

Espectrofotometría de masas MALDI-TOF/TOF

[00105] El análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF se llevó a cabo con el analizador proteómico 4700 (Applied Biosystems, Framingham. MA, EE. UU.). Para la selección de iones precursores se midieron todas las fracciones en el modo EM, antes de realizar la EM/EM. Se seleccionaron un máximo de 15 precursores por punto de muestra para una fragmentación posterior por disociación inducida por colisión. Los espectros se procesaron y analizaron mediante la Global Protein Server Workstation (Applied Biosystems), que usa el software interno MASCOT (Matrix Science, London, Reino Unido) para comparar los datos de EM y EM/EM con bases de datos de

55 proteínas digeridas por medios informáticos. Los datos obtenidos se cribaron por comparación con una base de datos de ratón descargada de la página de internet del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las identificaciones de proteínas realizadas por medio del software MASCOT se consideraron como resultados positivos dentro del intervalo de confianza del 95% para el mejor ión peptídico.

[00106] Los análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF se llevaron a cabo mediante el analizador proteómico 4700 (Applied Biosystems). Las masas peptídicas se obtuvieron en un intervalo de 750 a

4.000 m/z, con una masa foco de 2.000 m/z. Se sumaron los espectros de EM de 2.000 disparos de un láser de Nd:YAG que operaba a 335 nm y 200 Hz. Se llevó a cabo una calibración automática de las placas mediante cinco estándares peptídicos (masas de 900-2.400 m/z; Applied Biosystems) en seis pocillos de calibración. Esta

65 calibración de placas se usó para actualizar la calibración de masas por defecto del instrumento que se aplicó a todos los espectros de EN y EM/EM. Además se llevó a cabo una calibración interna de cada espectro de EM

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grupos COOH del chip se activaron por la inyección de 50 µl de una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y etil-N(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Un volumen de 40 µl del antígeno 11A12 se inyectó sobre el chip y los grupos COOH libres residuales se bloquearon con 30 µl de etanolamina. Después de una filtración a través de un filtro de 0,22 µm, se inyectaron sobre el chip 20 µl de cada sobrenadante bacteriano individual y la interacción con el

5 antígeno se monitorizó en tiempo real.

Análisis BIAcore 2

[00116] Las constantes kon, koff y KD del anticuerpo parental dirigido contra ED-A y los anticuerpos B2, C5, D5, C8, F8, B7 y G9 dirigidos contra ED-A se evaluaron mediante resonancia de plasma superficial. El chip se equilibró durante la noche con el mismo tampón usado durante el ensayo con una tasa de flujo de dicho tampón de 5 µl/min. Todo el procedimiento de recubrimiento se llevó a cabo con esta tasa de flujo. El antígeno 11A12 se diluyó 1:25 con tampón de acetato pH 4,00 (proporcionado por BIACORE) hasta una concentración final de 20 µg/ml. Después se mezclaron NHS y EDC y se inyectaron 50 µl para activar los grupos COOH en el chip CM5. A continuación se

15 inyectaron 40 µl del antígeno (esto dura aproximadamente 40 s). Después se inyectaron 30 µl de etanolamina para bloquear la reactividad del los posibles grupos COOH libres.

[00117] Todos los ejemplos se ensayaron con una tasa de flujo de 20 µl/min. Se inyectaron 20 µl de la proteína monomérica sin diluir (según se obtiene de la filtración en gel). La disociación se dejó proceder durante aproximadamente 200 s. Después se inyectaron 10 µl de HCl 10 mM para regenerar el chip. La inyección de la proteína monomérica se repitió con diluciones diferentes, es decir, dilución 1:2 (en PBS), seguida de la regeneración con HCl. A continuación se llevó a cabo una tercera inyección de la proteína, a una dilución 1:4, seguida de nuevo por una regeneración con HCl. Los valores de kon, koff y KD para cada anticuerpo dirigido contra ED-A se evaluaron con el software de evaluación BIAevaluation.

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Histoquímica

[00118] Con el fin de verificar una satisfactoria biotinilación in vivo, se llevó a cabo una tinción posterior de las estructuras biotiniladas según se describe en Rybak y col. 2005. Se cortaron secciones (10 µm) de muestras congeladas en fresco, se fijaron con acetona, se incubaron sucesivamente con un complejo de estreptavidina y fosfatasa alcalina biotinilada (Biospa, Milán, Italia) y con Fast-Red TR (Sigma) (en presencia de levamisol 1mM para inhibir la fosfatasa alcalina endógena) y se tiñeron con una disolución de hematoxilina (Sigma) como contraste.

[00119] La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos scFv, que contenían un marcador FLAG, se llevó a

35 cabo según se ha descrito previamente (véase, por ejemplo, Brack y col. 2006). Brevemente, se incubaron las secciones con los fragmentos scFv (concentración final 2-10 µg/ml) y con el anticuerpo monoclonal M2 dirigido contra FLAG. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo de conejo dirigido contra inmunoglobulina de ratón (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) seguido del complejo de anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra fosfatasa alcalina y fosfatasa alcalina (DakoCytomation). Como sustrato de la fosfatasa se usó Fast Red (Sigma) y las secciones se tiñeron con hematoxilina (Sigma) como contraste.

[00120] Todas las secciones se montaron con Glycergel (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) y se analizaron con un microscopio Axiovert S100 TV (Carl Zeiss, Feldbach, Suiza) mediante el software Axiovision (Carl Zeiss).

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Reconocimiento específico in vivo con un anticuerpo dirigido contra ED-A

[00121] El anticuerpo parental scFv dirigido contra ED-A se marcó con el derivado fluoróforo infrarrojo éster de succinimidilo de ácido carboxílico, Alexa Fluor 750, disponible comercialmente (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del proveedor. El anticuerpo marcado se separó del colorante sin reaccionar por filtración en gel mediante una columna PD-10 (GE Healthcare). El grado de marcado, estimado de acuerdo con el protocolo de marcado de Invitrogen, fue de cinco moléculas de colorante por molécula de anticuerpo. El anticuerpo parental scFv dirigido contra ED-A marcado con Alexa 750 (en una concentración final de 0,3 mg/ml) se inyectó (200 µl/ratón, es decir, 60 µg de anticuerpo por ratón) en la vena de la cola de ratones Sv190, tres semanas después de la inyección de células

55 tumorales F9DR. Los órganos de los ratones se extirparon seis horas después de la inyección del anticuerpo marcado y se obtuvieron imágenes con un aparato de obtención de imágenes de fluorescencia infrarroja de fabricación propia (Birchler y col. 1999) equipado con una lámpara halógena de tungsteno, filtros de excitación y emisión específicos para Alexa 750 y una cámara CCD monocroma.

Biodistribución del diacuerpo F8

[00122] El diacuerpo F8 comprende los mismos dominios VH y VL que el anticuerpo F8 dirigido contra ED-A, por ejemplo, según se emplea en formato scFv. El diacuerpo F8 y el anticuerpo scFv F8 dirigido contra ED-A tienen diferentes secuencias enlazantes entre los dominios VH y VL. La secuencia de aminoácidos del enlazante del 65 diacuerpo F8 es GSSGG (SEQ ID NO: 28) (secuencia de nucleótidos: gggtccagtagcggt (SEQ ID NO: 29)). Por lo tanto, la secuencia enlazante del diacuerpo F8 tiene una longitud de cinco aminoácidos, mientras que en el scFv F8

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