BRPI0809989B1 - Usos de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma extradomínio-a (ed-a) de fibronectina e/ou ao ed-a de fibronectina - Google Patents

Usos de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma extradomínio-a (ed-a) de fibronectina e/ou ao ed-a de fibronectina Download PDF

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Abstract

usos de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma extradomínio- a (ed-a) de fibronectina e/ou ao ed-a de fibro- nectina a presente invenção refere-se aos usos de uma molécula de anticorpo que compreende um domínio vh e um domínio vl e que se liga à isoforma extradomínio-a (ed-a) de fibronectina na (i) preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais, em que o anticorpo está conjugado a uma molécula com atividade biocida ou citotóxica, ou a um radioisótopo; (ii) fabricação de um produto de diagnóstico para diagnosticar metástases tumorais; ou (iii) preparação de um medicamento para entrega, à neovascularização de metástases tumorais, de uma molécula conjugada ao anticorpo, em que a molécula apresenta atividade biocida ou citotóxica, ou é um radioisótopo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USOS DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO QUE SE LIGA A ISOFORMA EXTRADOMÍNIO-A (ED-A) DE FIBRONECTINA E/OU AO ED-A DE FIBRONECTINA.
A presente invenção refere-se à detecção e tratamento de metástases, isto é, detecção e tratamento de tumores secundários surgindo em um sítio que é distinto de um sítio de um tumor primário. A invenção envolve uso de um membro de ligação que se liga à isoforma ED-A da fibronectina, especialmente um membro de ligação que se liga ao domínio ED-A da fibronectina.
A maioria das mortes relacionadas ao câncer está relacionada à extensão metastática da doença (Hanahan and Weinberg 2000) e a neovasculatura vigorosa é uma característica de metástases tumorais agressivas.
Tumores são classificados como benignos ou malignos. Tumores malignos são capazes de espalhar-se a partir do sítio primário (o tumor primário) a outras partes do corpo enquanto os tumores benignos não podem espalhar-se. Tumores malignos podem espalhar-se a partir do seu sítio primário por invasão e metástase. Tumores formados como um resultado de metástase são conhecidos, por exemplo, como metástases, tumores secundários, lesões metastáticas ou focos metastáticos.
Angiogênese descreve o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes. Tumores podem induzir angiogênese através da secreção de vários fatores de crescimento (por exemplo, Fator de Crescimento Endotelial Vascular). Angiogênese tumoral permite a tumores crescerem além de alguns milímetros em diâmetro e é também um pré-requisito para metástase tumoral. Novos vasos sanguíneos formados como resultado de angiogênese formam a neovasculatura do tumor ou das metástases tumorais.
Fibronectina (FN) é uma glicoproteína e é largamente expressa em vários tecidos normais e fluidos corporais. É um componente da matriz extracelular (ECM), e desempenha um papel em muitos processos biológicos, incluindo adesão celular, migração celular, hemostasia, trombose, cicatrização, diferenciação tecidual e transformação oncogênica.
Petição 870190049682, de 28/05/2019, pág. 6/19
Isoformas de FN diferentes são geradas pelo splicing alternativo de três regiões (ED-A, ED-B, IIICS) do pré-mRNA do transcrito primário de FN, um processo que é modulado por citocinas e pH extracelular (Balza 1988; Camemolla 1989; Borsi 1990; Borsi 1995). Fibronectina contém dois extradomínios globulares tipo III que podem sofrer splicing alternativo: ED-A e ED-B (ffrench-Constant 1995, Hynes 1990, Kaspar et al. 2006). Os ED-As da fibronectina de camundongo e fibronectina humana são 96,7% idênticos (somente 3 aminoácidos diferenciam-se entre duas sequências de 90 aminoácidos, vide figura 5).
Expressão do ED-A da fibronectina foi relatada em células tumorais e em tumores sólidos no nível de mRNA [vide, por exemplo, (Jacobs et al. 2002, Matsumoto et al. 1999, Oyama et al. 1989, Tavian et al. 1994), no nível de proteína isolada (Borsi et al. 1987) e no nível de imuno-histoquímica (Borsi et al, 1998, Heiknheimo et al. 1991, Koukoulis et al. 1993, Koukoulis et al. 1995, Lohi et al. 1995, Scarpino et al. 1999). Também foi relatado por Borsi et al., 1998, Exp Cell Res, 240, 244-251, que ED-A está presente na neovasculatura de tumores primários. Entretanto nenhuma indicação que ED-A associado com a neovasculatura de metástases tumorais foi anteriormente feita.
Mostra-se neste pedido que ED-A da fibronectina é seletivamente expresso na neovasculatura de metástases tumorais. Como vasos sanguíneos tumorais são prontamente acessíveis para reagentes terapêuticos intravenosamente administrados (Neri and Bicknell 2005, Rybak et al. 2006, Thorpe 2004, Trachsel and Neri 2006), moléculas de ligação, tais como moléculas de anticorpo que se ligam ao A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina representam novos agentes que podem ser usados para a preparação de um medicamento para o tratamento das metástases tumorais e/ou metástase tumoral. A terapia da neovasculatura tumoral (dirigido à vascularização tumoral) é uma abordagem promissora para tratamento de metástases tumorais. Objetivos dirigidos à vascularização tumoral na interrupção da vasculatura dentro do próprio tumor, reduzindo o fluxo sanguíneo para privar o tumor de oxigênio e nutrientes, causando morte da célula tumoral.
São fornecidos neste pedido, anticorpos anti-ED-A que seletivamente reconhecem os novos vasos sanguíneos formados de metástases tumorais.
Esta invenção em um aspecto refere-se ao uso de um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga à isoforma Extradomínio-A (ED-A) da fibronectina (A-FN), para a preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais e/ou metástase tumoral. Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga ao ED-A da fibronectina para a preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais e/ou metástase tumoral.
Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga à isoforma ED-A da fibronectina para entrega, à neovasculatura de metástases tumorais, de uma molécula conjugada ao membro de ligação. Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga ao ED-A da fibronectina para entrega, à neovasculatura de metástases tumorais, de uma molécula conjugada ao membro de ligação. Em aspectos adicionais, o membro de ligação pode ser usado para a produção de um medicamento para entrega de tal molécula.
Ainda em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga à isoforma ED-A da fibronectina para a produção de um produto diagnóstico para uso no diagnóstico de metástases tumorais. Ainda em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga ao ED-A da fibronectina para a produção de um produto diagnóstico para uso no diagnóstico de metástases tumorais.
A invenção, em um aspecto, também refere-se a um método de detecção ou diagnóstico de metástases tumorais em um ser humano ou animal compreendendo as etapas de:
(a) administração de um membro de ligação ao ser humano ou animal, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga à isoforma EDA da fibronectina, e (b) determinação da presença ou ausência do membro de ligação em um sítio distante de um sítio atualmente ou anteriormente ocupado por um tumor primário no corpo humano ou animal;
em que a localização do membro de ligação em um sítio distante do sítio atualmente ou anteriormente ocupado pelo tumor primário em ser humano ou animal indica a presença de metástases tumorais.
A invenção, em outro aspecto, refere-se a um método de detecção ou diagnóstico de metástases tumorais em um ser humano ou animal compreendendo as etapas de:
(a) administração de um membro de ligação ao ser humano ou animal, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga ao ED-A da fibronectina, e (b) determinação da presença ou ausência do membro de ligação em um sítio distante de um sítio atualmente ou anteriormente ocupado por um tumor primário no corpo humano ou animal;
em que a localização do membro de ligação em um sítio distante do sítio atualmente ou anteriormente ocupado pelo tumor primário em ser humano ou animal indica a presença de metástases tumorais.
A presente invenção, em outro aspecto, também refere-se a um método para tratamento de metástases tumorais em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um medicamento compreendendo um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga à isoforma ED-A da fibronectina. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de metástases tumorais em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um medicamento compreendendo um membro de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga ao ED-A da fibronectina.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de entrega de uma molécula à neovasculatura de metástases tumorais em um ser humano ou animal compreendendo administração de um membro de ligação ao ser humano ou animal, por exemplo, uma molécula de anticorpo, que se liga à isoforma ED-A da fibronectina, em que o membro de ligação está conjugado à molécula. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método de entrega de uma molécula à neovasculatura de metástases tumorais em um ser humano ou animal compreendendo administração de um membro de ligação ao ser humano ou animal, por exemplo, uma molécula de anticorpo que se liga ao ED-A da fibronectina, em que o membro de ligação está conjugado à molécula.
O membro de ligação da invenção pode ser um anticorpo que se liga à isoforma ED-A da fibronectina e/ou ao ED-A da fibronectina, compreendendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do anticorpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9, ou variantes dos mesmos. Preferencialmente, um membro de ligação da invenção é um anticorpo que se liga à isoforma ED-A da fibronectina e/ou ao ED-A da fibronectina, compreendendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do anticorpo B2, C5, D5, C8, F8, B7 ou G9, ou variantes dos mesmos. Ainda mais preferencialmente, um membro de ligação da invenção é um anticorpo que se liga à isoforma ED-A da fibronectina e/ou ao ED-A da fibronectina, compreendendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do anticorpo F8 ou variantes do mesmo.
O membro de ligação da invenção pode compreender um conjunto de CDRs H e/ou L do anticorpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9, ou um conjunto de CDRs H e/ou L do anticorpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9 com dez ou menos, por exemplo, uma, duas, três, quatro, ou cinco substituições de aminoácidos no conjunto descrito de CDRs H e/ou L. Preferencialmente, o membro de ligação da invenção compreende um conjunto de CDRs H e/ou L do anticorpo B2, C5, D5, C8, F8, B7 ou G9 com dez ou menos, por exemplo, uma, duas, três, quatro, ou cinco substituições de aminoácido no conjunto descrito de CDRs H e/ou L. Preferencialmente, o membro de ligação da invenção compreende um conjunto de CDRs H e/ou L do anticorpo F8 com dez ou menos, por exemplo, uma, duas, três, quatro, ou cinco substituições de aminoácidos no conjunto descrito de CDRs H e/ou L.
Substituições podem ser potencialmente feitas em qualquer resíduo no conjunto de CDRs, e podem estar dentro de CDR1, CDR2 e/ou CDR3. Por exemplo, um membro de ligação da invenção pode compreender uma ou mais CDRs como descrito neste pedido, por exemplo, uma CDR3, e opcionalmente também uma CDR1 e CDR2 para formar o conjunto de CDRs.
Um membro de ligação da invenção também pode compreender uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de anticorpo humano. O membro de ligação normalmente compreende um domínio VH do anticorpo e/ou VL. Domínios VH dos membros de ligação também são fornecidos como parte da invenção. Dentro de cada um dos domínios VH e VL estão regiões de determinação de complementaridade, (CDRs), e regiões conservadas, (FRs). Um domínio VH compreende um conjunto de HCDRs, e um domínio VL compreende um conjunto de LCDRs. Uma molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH do anticorpo compreendendo um CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e uma região conservada. Pode alternativamente ou também compreender um domínio VL do anticorpo compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VL e uma região conservada. Os domínios VH e VL e CDRs de anticorpos H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 são descritos neste pedido. Todas as sequências VH e VL, sequências de CDR, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e conjuntos de LCDRs descitos neste pedido representam aspectos e modalidades de um membro de ligação para uso na invenção. Como descrito neste pedido, um conjunto de CDRs compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Dessa maneira, um conjunto de HCDRs refere-se à HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e um conjunto de LCDRs refere-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3. A menos que de outra maneira afirmado, um conjunto de CDRs inclui HCDRs e LCDRs.
Um membro de ligação da invenção pode compreender um domínio VH do anticorpo compreendendo regiões de determinação de complementaridade HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e uma região conservada, em que HCDR1 é SEQ ID NO: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 ou 113, e em que opcionalmente HCDR2 é SEQ ID NO: 4 e/ou HCDR3 é SEQ ID NO:
5. Preferencialmente, HCDR1 é SEQ ID NO: 23, 33, 43, 53, 73, 83 ou 103. Ainda mais preferencialmente, HCDR1 é SEQ ID NO: 83.
Tipicamente, um domínio VH é pareado com um domínio VL para fornecer um sítio de ligação ao antígeno no anticorpo, embora como discutido ainda sob um domínio VH ou VL sozinho pode ser usado para ligar-se ao antígeno. Dessa maneira, um membro de ligação da invenção pode compreender ainda um domínio VL do anticorpo compreendendo regiões de determinação de complementaridade LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e uma região conservada, em que LCDR1 é SEQ ID NO: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 ou 116 e em que opcionalmente LCDR2 é SEQ ID NO: 7 e/ou LCDR3 é SEQ ID NO: 8. Preferencialmente, a LCDR1 é SEQ ID NO: 26, 36, 46, 56, 76, 86 ou 106. Ainda mais preferencialmente, a LCDR1 é SEQ ID NO: 86.
Em um aspecto, o membro de ligação da invenção é uma molécula de anticorpo isolada para o ED-A da fibronectina, compreendendo um domínio VH e um domínio VL, em que o domínio VH compreende uma região conservada e um conjunto de regiões de determinação de complementaridade HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e em que o domínio VL compreende regiões de determinação de complementaridade LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e uma região conservada, e em que
HCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 ou 113,
HCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, HCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5,
LCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 ou 116;
LCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7; e LCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
Uma ou mais CDRs ou um conjunto de CDRs de um anticorpo podem ser enxertadas em uma região conservada (por exemplo, região conservada humana) para fornecer uma molécula de anticorpo para uso na in venção. Regiões conservadas podem compreender sequências de segmento gênico de linhagem germinativa humana. Dessa maneira, a região conservada pode ser de linhagem germinativa, de acordo com o qual um ou mais resíduos na região conservada são modificados para combinar com os resíduos na posição equivalente na região conservada de linhagem germinativa humana mais similar, um membro de ligação da invenção pode ser uma molécula de anticorpo isolada que tem um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs em uma região conservada de linhagem germinativa humana, por exemplo, DP47. Normalmente o membro de ligação também tem um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs, por exemplo, em uma região conservada de linhagem germinativa humana. A região conservada de linhagem germinativa humana do domínio VL pode ser DPK22.
Um domínio VH da invenção pode ter sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1,21,31, 41, 51, 61, 71,81,91,101 ou 111. Preferencialmente, um domínio VH da invenção tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 21, 31, 41, 51, 71, 81 ou 101. Ainda mais preferencialmente, um domínio VH da invenção tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 81. Um domínio VL da invenção pode ter os aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 ou 112. Preferencialmente, um domínio VL da invenção tem aminoácidos da SEQ ID NO: 22, 32, 42, 52, 72, 82 ou 102. Ainda mais preferencialmente, um domínio VL da invenção tem aminoácido da SEQ ID NO: 82.
Um membro de ligação da invenção pode ser uma cadeia única Fv (scFv), compreendendo um domínio VH e um domínio VL unidos através de um ligador peptídico. O versado pode selecionar um tamanho e sequência ligadora apropriados, por exemplo, pelo menos 5 ou 10 aminoácidos em tamanho, até aproximadamente 15, 20 ou 25 aminoácidos em tamanho. A scFv pode consistir em ou compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
Um membro de ligação da invenção pode ser um diacorpo (WO94/13804; Holliger 1993a), que é uma molécula compreendendo um primeiro polipeptídeo com um domínio VH e um domínio VL unidos através de um ligador peptídico e um segundo polipeptídeo com um domínio VH e um domínio VL unidos através de um ligador peptídico em que o domínio VH e o domínio VL do primeiro par de polipeptídeos com o domínio VL e o domínio VH do segundo polipeptídeo, respectivamente. Os primeiro e segundo polipeptídeos podem ser o mesmo (pelo qual o pareamento resulta em uma molécula bivalente) ou diferente (pelo qual o pareamento resulta em uma molécula bispecífica). O versado pode selecionar um comprimento apropriado e sequência do ligador, por exemplo, 5 ou menos aminoácidos em tamanho. O ligador pode ter sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 28.
Um membro de ligação da invenção pode compreender um sítio de ligação a antígeno em uma molécula não-anticorpo, normalmente fornecida por uma ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de CDRs em uma estrutura proteica não-anticorpo. Membros de ligação, incluindo moléculas de anticorpo e não-anticorpo, são descritos em mais detalhes em outro lugar neste pedido.
Um membro de ligação da invenção pode estar conjugado a uma molécula que tem atividade biocida ou citotóxica. Altemativamente, um membro de ligação da invenção pode estar conjugado a um radioisótopo. Como uma alternativa adicional, um membro de ligação da invenção pode estar marcado com um marcador detectável.
Estes e outros aspectos da invenção são descritos em detalhes adicionais abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1A: Mostra uma representação esquemática da perfusão com base na metodologia proteômica usada para análise comparativa das proteínas acessíveis em fígado a partir de camundongos saudáveis e metástases hepáticas F9 de camundongos. B: Mostra os grandes focos metastáticos desenvolvidos por metástases hepáticas F9. C: Mostra a marcação seletiva e eficiente dos vasos sanguíneos de metástases hepáticas F9 (Metástase) bem como a forte marcação dos vasos sanguíneos e marcações de alguns sinusoides no fígado normal (Fígado). A marcação corresponde a linhas mais escuras e é obtida após os camundongos carregando tumor serem per fundidos com 15 ml de uma solução de sulfossuccinimidil-6-[biotinaamido]hexanoato a 1,8 mM (1mg/ml) em PBS, pH 7,4, suplementado com Dextrana-40 a 10% como dilatador plasmático sob anestesia terminal seguida por marcação histoquímica com uma estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina.
Figura 2A: Mostra a localização dos peptídeos de fibronectina identificados na análise proteômica do fígado normal de camundongo (Normal) e metástases hepáticas F9 de camundongos (Tumor) na estrutura do domínio de fibronectina. B: Os peptídeos identificados na análise proteômica de amostras normais de fígado de camundongo e metástases hepáticas F9 de camundongos foram submetidos a um experimento de LC-MS/MS. Os peptídeos foram primeiro separados por HPLC e posteriormente eluídos em 192 frações. Cada fração foi identificada como um ponto separado em uma placa-alvo MALDI e espectros MALDI TOF MS foram adquiridos de cada fração. Espectros de massa de duas frações diferentes determinadas por HPLC (linha superior e linha média, respectivamente) são mostrados para três replicatas de amostras de metástases hepáticas F9 de camundongo (vide painel marcado: Metástase hepática) e três replicatas de amostras de fígado normal de camundongo (vide painel marcado: fígado normal). As alturas dos picos tônicos são normalizadas ao padrão interno (vide Materiais e Métodos) e dessa forma permitir uma comparação semiquantitativa de peptídeos correspondentes nas diferentes amostras. Na linha superior, o pico indicado com uma flecha (FN marcado na primeira amostra mostrada) corresponde ao peptídeo FLTTTPNSLLVSWQAPR (SEQ ID NO: 15) que deriva de uma região constante da fibronectina (domínio 16 da fibronectina tipo III). O pico iônico deste peptídeo é mais alto nas amostras de metástases hepáticas de camundongo F9 (Metástase hepática) mas está presente também nas amostras de fígado normal de camundongo (Fígado normal), indicando que a molécula de fibronectina está, em princípio, presente em ambos metástases hepáticas de camundongo F9 e fígado normal de camundongo mas parece ser mais abundante nas amostras de metástases hepáticas F9 de camundongo. Na linha média, o pico indicado com a flecha à direita (EDA marcada) corresponde ao peptídeo IAWESPQGQVSR (SEQ ID NO: 16) que deriva do extradomínio A de splicing alternativo da fibronectina. Este peptídeo ED-A somente é detectável em amostras de metástases hepáticas de camundongo F9 (Metástase hepática) e não nas amostras de fígado normal de camundongo (Fígado normal). O peptídeo de referência indicado com a flecha à esquerda (ref marcado) foi usado para identificar a fração de HPLC na qual o peptídeo de ED-A elui. Isto significa que a presença do pico do peptídeo de referência nos espectros mostrados para as amostras de fígado normal de camundongo (Fígado normal) é prova que os espectros de massa das frações nas quais o peptídeo de ED-A seria detectável, se estivesse presente nas amostras de fígado normal de camundongo, são mostrados. A linha inferior mostra uma visão próxima dos espectros de massa na posição do pico iônico do peptídeo de ED-A (indicado pela flecha) provando a ausência deste peptídeo das amostras a partir de fígado normal.
Figura 3 A: marcação imuno-histoquímica (linhas mais escuras) de metástases hepáticas F9 e tecido adjacente de fígado normal de camundongo marcado com anticorpo anti-ED-A parental (anti-ED-A) revelou um padrão vascular forte de marcação nas metástases, enquanto marcação não-específica foi detectável no tecido adjacente de fígado normal. Nos controles negativos (Controle), a marcação com anticorpo anti-ED-A parental foi omitida. O padrão de marcação observado com o anticorpo anti-ED-A parental marcado é similar ao padrão de marcação observado com anticorpo marcado anti-ED-B scFv (L19) (anti-EDB) que reconhece o extradomínio-B da fibronectina, um marcador bem-estabelecido de estruturas neovasculares. B: Mostra os órgãos (baço, coração, pulmão e uma porção hepática com duas metástases) de camundongos Sv190 que foram injetados com células tumorais F9DR, e três semanas após foram ainda injetados na veia da cauda (com 200 μΙ/camundongo, isto é, 60 pg de anticorpo/camundongo) com anticorpo antiED-A parental marcado com Alexa 750 (em uma concentração final de 0,3 mg/ml). Os órgãos de camundongo foram extirpados seis horas após injeção do anticorpo anti-ED-A parental marcado com Alexa 750. A marcação com anticorpo anti-ED-A parental marcado com Alexa 750 foi visualizada usando um dispositivo de imagem fluorescente infravermelho construído no laboratório (Birchler et al. 1999) equipado com uma lâmpada halógena de tungstênio, filtros de excitação e emissão específicos para Alexa 750 e uma câmera CCD monocromática.
Figura 4: Mostra expressão de ED-A em metástases humanas. O anticorpo anti-ED-A parental marcado foi usado para avaliar a expressão de ED-A em metástases humanas por imuno-histoquímica. Enquanto marcação nãopositiva foi detectável em controles negativos (Controle) omitindo o anticorpo anti-ED-A parental marcado e somente uma muito fraca marcação de fundo foi observada em seções de tecido de pulmão normal humano (Pulmão normal humano) com o anticorpo anti-ED-A parental marcado, metástases pulmonares humanas (Metástase pulmonar humana de RCC [carcinoma de célula renal]) foram fortemente positivamente marcadas com o anticorpo anti-ED-A parental marcado (anti-EDA) como mostrado pelas linhas mais escuras e sombras. O padrão de marcação do anticorpo anti-ED-A parental marcado é principalmente vascular e é similar ao padrão de marcação observado com o anticorpo anti-ED-B marcado scFv (L19) (anti-EDB) que reconhece o extradomínio B da fibronectina, um marcador bem-estabelecido de estruturas neovasculares. Resultados similares foram obtidos pela análise imunohistoquímica de metástases hepáticas humanas de carcinoma colorretal (metástase hepática humana de CRC) com o anticorpo anti-ED-A parental marcado. O anticorpo anti-ED-A parental marcado revela um forte padrão de marcação vascular e de estroma em metástases hepáticas humanas de carcinoma colorretal.
Figura 5: Mostra um alinhamento entre o ED-A humano (sequência superior) e o ED-A de camundongo (sequência inferior). Os asteriscos indicam as posições de aminoácido onde os aminoácidos do ED-A humano e do ED-A de camundongo são idênticas.
Figura 6 A: Mostra a sequência nucleotídica da cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-ED-A H1 (SEQ ID NO: 12). A sequência nucleotídica da CDR1 da cadeia pesada do anticorpo anti-ED-A H1 está sublinhada. A sequência nucleotídica da CDR2 da cadeia pesada do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em itálico e sublinhada. A sequência nucleotídica da CDR3 da cadeia pesada do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em negrito e sublinhada. B: Mostra a sequência nucleotídica da sequência ligadora do anticorpo anti-ED-A H1 (SEQ ID NO: 14). C: Mostra a sequência nucleotídica da cadeia leve (VL) do anticorpo anti-ED-A H1 (SEQ ID NO: 13). A sequência nucleotídica da CDR1 da cadeia leve do anticorpo anti-ED-A H1 está sublinhada. A sequência nucleotídica da CDR2 da cadeia leve do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em itálico e sublinhada. A sequência nucleotídica da CDR3 da cadeia leve do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em negrito e sublinhada.
Figura 7 A: Mostra a sequência de aminoácidos da cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-ED-A H1 (SEQ ID NO: 1). A sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDR1 (SEQ ID NO: 3) do anticorpo anti-ED-A H1 está sublinhada. A sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 4) do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em itálico e sublinhada. A sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrado em negrito e sublinhada. B: Mostra a sequência de aminoácidos da sequência ligadora do anticorpo anti-ED-A H1 (SEQ ID NO: 11). C: Mostra a sequência de aminoácidos da cadeia leve (VL) do anticorpo anti-ED-A H1 (SEQ ID NO: 2). A sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve (SEQ ID NO: 6) do anticorpo anti-ED-A H1 está sublinhada, a sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve (SEQ ID NO: 7) do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em itálico e sublinhada. A sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve (SEQ ID NO: 8) do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada em negrito e sublinhada.
Figura 8: Mostra a biodistribuição do diacorpo F8 nos camundongos F9 carregando tumor. Quatro camundongos F9 carregando tumor foram injetados intravenosamente com o diacorpo F8 marcado com I125. Os camundongos foram sacrificados após vinte e quatro horas e tumor, fígado, pulmão, baço, coração, rim, intestino, cauda e sangue removidos. O tumor, fígado, pulmão, baço, coração, rim, intestino, cauda e sangue então foram radioativamente contados. A percentagem (%) da dose injetada (ID) de diacorpo F8 marcado com I125 detectado por grama (g) de tumor, fígado, pulmão, baço, coração, rim, intestino, cauda e sangue é mostrada na Figura 8. Os tumores F9 (tumores) continham aproximadamente quatro vezes mais da ID do que qualquer um dos outros tecidos de camundongo analisados.
TERMINOLOGIA
Fibronectina
Fibronectina é um antígeno sujeito a splicing alternativo, e diversas isoformas alternativas da fibronectina são conhecidas, como descrito em outro lugar neste pedido. Extradomínio-A (EDA ou ED-A) também é conhecido como ED, repetição A extratipo III (EIIIA) ou EDI. A sequência de ED-A humano foi publicada por Komblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 e Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. A sequência de ED-A humano está também disponível no banco de dados SwissProt como aminoácidos 1631 a 1720 (Fibronectina 12 tipo III; extradomínio 2) da sequência de aminoácidos depositada sob número de acesso P02751. A sequência do ED-A de camundongo está disponível no banco de dados SwissProt como aminoácidos 1721 a 1810 (Fibronectina 13 tipo III; extradomínio 2) da sequência de aminoácidos depositada sob número de acesso P11276.
A isoforma ED-A da fibronectina (A-FN) contém o ExtradomínioA (ED-A). A sequência da A-FN humana pode ser deduzida a partir da sequência precursora de fibronectina humana correspondente a qual está disponível no banco de dados SwissProt sob número de acesso P02751. A sequência da A-FN de camundongo pode ser deduzida a partir da sequência precursora de fibronectina de camundongo correspondente a qual está disponível no banco de dados SwissProt sob número de acesso P11276. A AFN pode ser a isoforma ED-A humana da fibronectina. O ED-A pode ser o Extradomínio-A da fibronectina humana.
ED-A é uma sequência de 90 aminoácidos que está inserida na fibronectina (FN) pelo splicing alternativo e está localizada entre o domínio 11 e 12 da FN (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). ED-A está principalmente ausente na forma plasmática de FN mas é abundante durante a embríogênese, remodelamento de tecido, fibrose, transplante cardíaco e crescimento de tumor sólido.
Splicinq Alternativo
Splicing alternativo refere-se à ocorrência de padrões diferentes de splicing de um transcrito de RNA primário de DNA para produzir diferentes mRNAs. Após excisão de íntrons, a seleção pode determinar quais éxons são reunidos para formar o mRNA. Splicing alternativo leva à produção de isoformas diferentes contendo éxons diferentes e/ou números diferentes de éxons. Por exemplo, uma isoforma pode compreender uma sequência de aminoácidos adicional correspondente a um ou mais éxons, que podem compreender um ou mais domínios.
Membro de Ligação
Isto descreve um membro de um par de moléculas que se ligam uma à outra. Os membros de um par de ligação podem ser naturalmente derivados ou sinteticamente produzidos inteiramente ou parcialmente. Um membro do par de moléculas tem uma área em sua superfície, ou uma cavidade, que se liga e é, por isso, complementar a uma determinada organização espacial e polar de outro membro do par de moléculas. Exemplos de tipos de pares de ligação são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônioreceptor hormonal, receptor-ligante, enzima-substrato. A presente invenção está relacionada com reações do tipo de antígeno-anticorpo.
Um membro de ligação normalmente compreende uma molécula tendo um sítio de ligação a antígeno. Por exemplo, um membro de ligação pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteína não-anticorpo que compreende um sítio de ligação a antígeno.
Um sítio de ligação a antígeno pode ser fornecido por meio de arranjo de regiões de determinação de complementaridade (CDRs) em estruturas proteicas não-anticorpo, tais como fibronectina ou citocromo B etc. (Haan & Maggos, 2004; Koide 1998; Nygren 1997), ou por randomização ou mutação dos resíduos de aminoácido de uma alça em uma estrutura proteica para conferir especificidade de ligação para um alvo desejado. Estruturas para projeção de novos sítios de ligação em proteínas foram revistas em detalhes por Nygren et al. (1997). Estruturas proteicas para mimetizar anti corpo são descritas em WO/0034784, que é neste pedido incorporado por referência em sua totalidade, no qual os inventores descrevem proteínas (que mimetiza anticorpo) que incluem um domínio tipo III de fibronectina que tem pelo menos uma alça randomizada. Uma estrutura adequada na qual enxerta-se uma ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de HCDRs, pode ser fornecida por qualquer membro do domínio da superfamília genética de imunoglobulina. A estrutura pode ser uma proteína humana ou não-humana. Uma vantagem de uma estrutura proteica não-anticorpo é que pode fornecer um sítio de ligação a antígeno em uma molécula estrutural que é menor e/ou mais fácil de produzir do que pelo menos algumas moléculas de anticorpo. O pequeno tamanho de um membro de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis, tais como uma capacidade de entrar em células, penetrar profundamente em tecidos ou alvos de alcance em outras estruturas, ou ligar-se dentro de cavidades proteicas do antígeno-alvo. O uso de sítios de ligação a antígeno em estruturas proteicas não-anticorpo é revisto em Wess, 2004. Típicas são proteínas que têm um esqueleto estável e uma ou mais alças variáveis, nas quais a sequência de aminoácidos da alça ou alças é especificamente ou randomicamente mutada para criar um sítio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno-alvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação a IgG da proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por exemplo, 10° domínio da fibronectina tipo III) e lipocalinas. Outras abordagens incluem Microcorpos sintéticos (Selecore GmbH), que são baseados em ciclotídeos - pequenas proteínas tendo ligações dissulfeto intramoleculares.
Além de sequências de anticorpo e/ou um sítio de ligação a antígeno, um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptídeo, tais como um domínio dobrado, ou transmitir à molécula outra característica funcional além da capacidade de ligar-se ao antígeno. Membros de ligação da invenção podem transportar um marcador detectável, ou podem ser conjugados a uma toxina ou uma porção dirigida ou enzima (por exemplo, através de uma ligação ou ligador peptidila). Por exemplo, um
I ι membro de ligação pode compreender um sítio catalítico (por exemplo, em um domínio enzimático) bem como um sítio de ligação a antígeno, em que o sítio de ligação a antígeno se liga ao antígeno e dessa forma dirige-se ao sítio catalítico do antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo, pela divagem.
Embora, como observado, CDRs possam ser transportadas por estruturas não-anticorpo, a estrutura para transportar uma CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será geralmente uma sequência da cadeia pesada ou leve do anticorpo ou porção substandal do mesmo no qual a CDR ou conjunto de CDRs estão localizados em uma posição correspondente a CDR ou conjunto de CDRs de domínios variáveis de VL e VH de anticorpo que ocorrem naturalmente codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e posições de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas por referência a Kabat 1987, e atualizações do mesmo, agora disponível na Internet (em immuno.bme.nwu.edu ou procurar Kabat usando qualquer motor de busca).
Por região de CDR ou CDR, pretende-se indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina como definido por Kabat et al. (1987), (Kabat 1991a, e edições posteriores). Um anticorpo tipicamente contém 3 cadeias pesadas de CDRs e 3 cadeias leves de CDRs. O termo CDR ou CDRs é usado aqui para indicar, de acordo com o caso, uma ou mais destas regiões, ou até o conjunto destas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo ao antígeno ou ao epitopo que reconhece.
Entre as seis sequências de CDR curtas, a terceira CDR da cadeia pesada (HCDR3) tem uma maior variabilidade de tamanho (maior diversidade essencialmente emvido aos mecanismos de arranjo dos genes que lhe dão origem), pode ser tão curta como 2 aminoácidos embora o maior tamanho conhecido seja 26. Funcionalmente, HCDR3 desempenha um papel em parte na determinação da especificidade do anticorpo (Segai 1974; Amit 1986; Chothia 1987; Chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabat et al., 1991b).
Molécula de Anticorpo
Isto descreve uma imunoglobulina natural ou parcialmente ou inteiramente ou sinteticamente produzida. O termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno do anticorpo. Deve ser entendido aqui que a invenção não refere-se aos anticorpos na forma natural, isto é, não estão em seu ambiente natural mas que foram capazes de ser isolados ou obtidos pela purificação a partir de fontes naturais, ou obtidos pela recombinação genética, ou pela síntese química, e que então podem conter aminoácidos não naturais como será descrito a seguir. Fragmentos de anticorpo que compreendem um sítio de ligação a antígeno no anticorpo incluem, mas não são limitados a, moléculas de anticorpo, tais como Fab, Fab', Fab’-SH, scFv, Fv, dAB, Fd; e diacorpos.
É possível tomar anticorpos monoclonais e outros e técnicas de uso da tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que se ligam ao antígeno-alvo. Tais técnicas podem envolver introdução de DNA que codifica a região variável de imunoglobulina, ou as CDRs, de um anticorpo às regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de região conservada, de uma imunoglobulina diferente. Vide, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e um grande corpo de literatura subsequente. Um hibridoma ou outra célula produtora de um anticorpo podem estar sujeitas à mutação genética ou outras modificações, que podem ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.
Como anticorpos podem ser modificados de diversos modos, o termo molécula de anticorpo deve ser interpretado como cobrindo qualquer membro de ligação ou substância que tem um sítio de ligação a antígeno no anticorpo com a especificidade e/ou ligação a antígeno necessária. Dessa maneira, este termo cobre fragmentos de anticorpo e derivados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação a antígeno do anticorpo, natural ou inteiramente ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas compreendendo um sítio de ligação a antígeno no anticorpo, ou equivalente, fusionado a outro polipeptídeo (por exemplo, derivado de outras espé cies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo), por isso, estão incluídas. Clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritos em EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e um grande corpo de literatura subsequente.
Técnicas adicionais disponíveis na técnica de engenharia de anticorpo tomam possível isolar anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, hibridomas humanos podem ser feitos como descrito por Kontermann & Dubel (2001). Exposição de fago, outra técnica estabelecida para gerar membros de ligação foi descrita detalhadamente em muitas publicações, tais como W092/01047 (discutido ainda abaixo) e Patentes US US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 e Kontermann & Dubel (2001). Camundongos transgênicos nos quais os genes de anticorpo de camundongo são inativados e funcionalmente substituídos com genes de anticorpo humano enquanto deixam intactos outros componentes do sistema imune do camundongo, podem ser usados para isolar anticorpos humanos (Mendez 1997).
Moléculas de anticorpo sintéticas podem ser criadas pela expressão de genes gerados por meio de oligonucleotídeos sintetizados e montados dentro de vetores de expressão adequados, por exemplo, como descrito por Knappik et al. (2000) ou Krebs et al, (2001).
Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um anticorpo único; (iv) o fragmento dAB (Ward 1989; McCafferty 1990; Holt 2003), que consiste em um domínio VH ou VL; (v) regiões isoladas CDR; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas de cadeia única Fv (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligador peptídico que permite aos dois domínios se associarem para for mar um sítio de ligação a antígeno (Bird 1988; Huston 1988); (viii) dímeros de cadeia única Fv bispecífica (PCT/US92/09965) e (ix) diacorpos, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão gênica (WO94/13804; Holliger 1993a). Fv, scFv ou moléculas de diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação da ligação de pontes dissulfeto dos domínios VH e VL (Reiter 1996). Minicorpos compreendendo uma scFv ligada a um domínio CH3 também podem ser feitos (Hu 1996). Outros exemplos de fragmentos de ligação são Fab', que se diferenciam de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo, e Fab'-SH, que é um fragmento Fab' no qual o resíduo(s) cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre.
Fragmentos de anticorpo da invenção podem ser obtidos iniciando a partir de quaisquer uma das moléculas de anticorpo descritas neste pedido, por exemplo, moléculas de anticorpo compreendendo domínios VH e/ou VL ou CDRs de quaisquer um dos anticorpos descritos neste pedido, por métodos, tais como digestão por enzimas, tais como pepsina ou papaína e/ou pela divagem das pontes dissulfeto por redução química. De outra maneira, os fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser obtidos por técnicas de recombinação genética do mesmo modo bem-conhecidas ao versado na técnica ou pela síntese peptídica por meio de, por exemplo, sintetizadores peptídicos automáticos, tais como aqueles fornecidos pela companhia Applied Biosystems, etc., ou por síntese e expressão de ácidos nucleicos.
Fragmentos de anticorpo funcionais de acordo com a presente invenção incluem qualquer fragmento funcional cuja meia-vida é aumentada pela modificação química, especialmente por PEGilação, ou por incorporação em um lipossoma.
Um dAB (anticorpo de domínio) é um pequeno fragmento monomérico de ligação a antígeno de um anticorpo, ou seja, a região variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo (Holt 2003). dABs de VH ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo, camelo, lhama) e podem ser produzidos pela imunização de um camelídeo com um antígeno-alvo, isolando células B específicas para o antígeno e diretamente clonando genes de dAB de células B do indivíduo. dABs são também produtíveis em cultura celular. Seu pequeno tamanho, boa solubilidade e estabilidade à temperatura os fazem particularmente úteis fisiologicamente e adequados para seleção e maturação por afinidade. Um membro de ligação da presente invenção pode ser um dAB compreendendo um domínio VH ou VL substancialmente como preparado neste pedido, ou um domínio VH ou VL compreendendo um conjunto de CDRs substancialmente como preparado neste pedido.
Como usado neste pedido, a frase substancialmente como preparado refere-se à característica(s) das CDRs relevantes do domínio VH ou VL de membros de ligação descritos neste pedido será idêntica ou altamente similar às regiões especificadas das quais a sequência é preparada neste pedido. Como descrito neste pedido, a frase altamente similar com respeito à região(ões) especificada de um ou mais domínios variáveis, é contemplado que de 1 a aproximadamente 5, por exemplo, de 1 a 4, incluindo 1 a 3, ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácido podem ser feitas na CDR e/ou no domínio VH ou VL.
Anticorpos bispecíficos ou bifuncionais formam uma segunda geração de anticorpos monoclonais nos quais duas regiões variáveis diferentes são combinadas na mesma molécula (Holliger 1999). Seu uso foi demonstrado em ambos no campo diagnóstico e no campo da terapia a partir de sua capacidade de recrutar novas funções efetoras ou dirigir-se a várias moléculas na superfície de células tumorais. Onde anticorpos bispecíficos devem ser usados, estes podem ser anticorpos bispecíficos convencionais, que podem ser produzidos em uma variedade de modos (Holliger 1993b), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpo bispecífico acima mencionados. Estes anticorpos podem ser obtidos por métodos químicos (Glennie 1987; Repp 1995) ou métodos somáticos (Staerz 1986; Suresh 1986) mas do mesmo modo por técnicas de engenharia genética que permitem a heterodimerização ser forçada e dessa forma facilitar o processo de purificação do anticorpo buscado (Merchand 1998). Exemplos de anticorpos bispecíficos incluem aqueles da tecnologia BiTE® na qual os domínios de ligação de dois anticorpos com especificidade diferente podem ser usados e diretamente ligados através de peptídeos flexíveis curtos. Isto combina dois anticorpos em uma cadeia polipeptídica curta única. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando somente domínios variáveis, potencialmente reduzindo os efeitos da reação anti-idiotípica.
Anticorpos bispecíficos podem ser construídos como IgG inteira, como Fab'2 bispecífico, como Fab'PEG, como diacorpos ou como scFv bispecíficas. Além disso, dois anticorpos bispecíficos podem ser ligados usando métodos regulares conhecidos na técnica para formar anticorpos tetravalentes.
Diacorpos bispecíficos, ao contrário de anticorpos inteiros bispecíficos, também podem ser particularmente úteis porque podem ser prontamente construídos e expressos em E.coli. Diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, tais como fragmentos de anticorpo) de especificidade de ligação apropriada podem ser prontamente selecionados usando exposição de bibliotecas de fago (WO94/13804). Se um braço do diacorpo deve ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra um antígeno-alvo, então uma biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Anticorpos inteiros bispecíficos podem ser feitos por métodos de engenharia alternativos como descrito em Ridgeway 1996.
Vários métodos estão disponíveis na técnica para obter anticorpos contra um antígeno-alvo. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais, especialmente de origem humana, murina, quimérica ou humanizada, que podem ser obtidos de acordo com os métodos padrão bem-conhecidos ao versado na técnica.
Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem murina, é possível referir-se a técnicas que são descritas em particular no manual Antibodies (Harlow and Lane 1988) ou à técnica de preparação de hibridomas descrita por Ko23 hlerand Milstem, 1975.
Anticorpos monoclonais podem ser obtidos, por exemplo, a partir de uma célula animal imunizada contra A-FN, ou um de seus fragmentos contendo o epitopo reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais, por exemplo, um fragmento compreendendo ou consistindo em ED-A, ou um fragmento peptídico de ED-A. A A-FN, ou um de seus fragmentos, pode ser especialmente produzida de acordo com os métodos de trabalho habituais, pela recombinação genética que inicia com uma sequência de ácidos nucleicos contida na sequência do cDNA de codificação da A-FN ou fragmento da mesma, pela síntese peptídica iniciando de uma sequência de aminoácidos compreendidos na sequência peptídica da A-FN e/ou fragmento da mesma.
Anticorpos monoclonais, por exemplo, podem ser purificados em uma coluna de afinidade na qual A-FN ou um de seus fragmentos contendo o epitopo reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais, por exemplo, um fragmento compreendendo ou consistindo em ED-A ou um fragmento de peptídeo de ED-A, foram previamente imobilizados. Anticorpos monoclonais podem ser purificados por cromatografía em proteína A e/ou G, seguido ou não seguido por cromatografía de troca iônica direcionada para a eliminação dos contaminantes proteicos residuais bem como o DNA e o LPS, em si mesmo, seguido ou não seguido pela cromatografía por exclusão em gel de Sefarose a fim de eliminar os agregados potenciais devido à presença de dímeros ou de outros multímeros. O conjunto destas técnicas pode ser usado simultaneamente ou sucessivamente.
Sítio de Ligação a Antígeno
Isto descreve a parte de uma molécula que se liga e é complementar a todo ou parte do antígeno-alvo. Em uma molécula de anticorpo é referido como o sítio de ligação a antígeno no anticorpo, e compreende a parte do anticorpo que se liga e é complementar a todo ou parte do antígeno-alvo. Onde um antígeno é grande, um anticorpo pode somente ligar-se a uma determinada parte do antígeno, parte a qual é denominada um epitopo. Um sítio de ligação a antígeno do anticorpo pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Um sítio de ligação a antígeno do an ticorpo pode compreender uma região variável da cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).
Isolado
Isto se refere ao estado em que membros de ligação da invenção ou ácido nucleico que codifica tais membros de ligação, será geralmente conforme a presente invenção. Dessa maneira, membros de ligação, domínios VH e/ou VL da presente invenção podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, por exemplo, de seu ambiente natural, em forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso do ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de outra origem exceto a sequência que codifica um polipeptídeo com a função requerida. Membros isolados e ácido nucleico isolado serão livres ou substancialmente livres de material com o qual estão naturalmente associados, tais como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com os quais são encontrados em seu ambiente natural, ou ambiente no qual são preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal preparação é por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Membros e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para objetivos práticos ser isolados - por exemplo, os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se usados para recobrir placas de microtítulo para uso em imunoensaios, ou serão misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando usados em diagnóstico ou terapia. Membros de ligação podem ser glicosilados, naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo, células CHO ou NSO (ECACC 85110503), ou podem ser (por exemplo, se produzidas pela expressão em uma célula procariótica) não glicosilados.
Preparações heterogêneas compreendendo moléculas de anticorpo também são parte da invenção. Por exemplo, tais preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de tamanho inteiro e cadeias pesadas sem lisina C-terminal, com vários graus da glicosilação e/ou com aminoácidos derivatizados, tais como ciclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um resíduo ácido piroglutâmico.
Um ou mais membros de ligação a um antígeno, por exemplo, a A-FN ou o ED-A da fibronectina, podem ser obtidos pela indução de contato com uma biblioteca de membros de ligação de acordo com a invenção e o antígeno ou um fragmento do mesmo, por exemplo, um fragmento compreendendo ou consistindo em ED-A ou um fragmento de peptídeo de ED-A e seleção de um ou mais membros de ligação da biblioteca capaz de ligar-se ao antígeno.
Uma biblioteca de anticorpo pode ser classificada usando Classificação de Filtro de Colônia Iterativo (ICFS). Em ICFS, bactérias contendo o DNA que codifica várias especificidades de ligação são cultivadas em um meio líquido e, uma vez que a etapa do crescimento exponencial foi alcançada, alguns bilhões delas são distribuídos em um suporte de crescimento consistindo em um filtro de membrana apropriadamente pré-tratado que é incubado até aparecem completamente colônias de bactérias confluentes. Um segundo substrato coletor consiste em outro filtro de membrana, préumedecido e recoberto com o antígeno desejado.
O filtro de membrana coletor então é colocado em uma placa contendo um meio de cultura adequado e recoberto com filtro de crescimento com a superfície recoberta com colônias bacterianas que despontam para o alto. O sanduíche dessa forma obtido é incubado à temperatura ambiente por aproximadamente 16 h. É possível dessa maneira obter a expressão dos genes que codificam fragmentos de anticorpo scFv tendo uma ação de espaIhamento, para que aqueles fragmentos que se ligam especificamente com o antígeno que está presente na membrana coletora sejam colhidos. A membrana coletora então é tratada para indicar fragmentos de anticorpo ligados ao scFv com técnicas colorimétricas comumente usadas com este objetivo.
A posição dos pontos coloridos no filtro coletor permite voltar às colônias bacterianas correspondentes que estão presentes na membrana de crescimento e produziram os fragmentos de anticorpo coletados. Tais colônias são coletadas e cultivadas e alguns milhões de bactérias são distribuídos para uma nova membrana de cultura repetindo os procedimentos descritos acima. Ciclos análogos então são realizados até que os sinais positivos na membrana coletora correspondam a colônias positivas únicas, cada uma das quais representa uma fonte potencial de fragmentos de anticorpo monoclonal direcionados contra o antígeno usado na seleção. ICFS é descrito em, por exemplo, WO0246455, que é incorporado neste pedido por referência. Uma biblioteca também pode ser exposta em partículas ou complexos moleculares, por exemplo, partículas de pacotes replicáveis genéticos como bacteriófagos (por exemplo, T7), ou outros sistemas de exposição in vitro, cada partícula ou complexo molecular contendo ácido nucleico que codifica o domínio variável VH do anticorpo exposto nele, e opcionalmente também um domínio VL exposto se presente. A exposição de fago é descrita em W092/01047 e, por exemplo, Patentes US US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 e US6521404, cada uma das quais está incorporada neste pedido por referência em sua totalidade.
A seguinte seleção de membros de ligação capazes de ligar-se ao antígeno e expostos em bacteriófago ou outras bibliotecas de partículas ou complexos moleculares, o ácido nucleico pode ser tomado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que expõe um dito membro de ligação selecionado. Tal ácido nucleico pode ser usado na produção subsequente de um membro de ligação ou um domínio variável de anticorpo VH ou VL pela expressão do ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico tomado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que expõe um dito membro de ligação selecionado.
Um domínio variável VH de anticorpo com a sequência de aminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo de um dito membro de ligação selecionado pode ser fornecido em forma isolada, como pode um membro de ligação compreendendo tal domínio VH.
Capacidade de ligar-se à A-FN ou ao ED-A da fibronectina ou outro antígeno-alvo ou isoforma pode ser ainda testada, por exemplo, capacidade de competir com, por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9 para ligação à A-FN ou um fragmento de A-FN, por exemplo, o ED-A da fibronectina.
Um membro de ligação da invenção pode ligar-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina especificamente. Um membro de ligação da presente invenção pode ligar-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com a mesma afinidade que anticorpo anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9, por exemplo, no formato de scFv, ou com uma afinidade que é melhor. Um membro de ligação da invenção pode ligar-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com um Kd de 3 x 10’8 M ou uma afinidade que é melhor. Preferencialmente, um membro de ligação da invenção liga-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com um KD de 2 x 10'6 M ou uma afinidade que é melhor. Mais preferencialmente, um membro de ligação da invenção ligase à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com um Kd de 1,7 x 10'8 M ou uma afinidade que é melhor. Ainda mais preferencialmente, um membro de ligação da invenção se liga à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com um Kd de 1,4 x 10’8 M ou uma afinidade que é melhor. Ainda mais preferencialmente, um membro de ligação da invenção liga-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com um KD de 3 x 10’9 M ou uma afinidade que é melhor.
Um membro de ligação da presente invenção pode ligar-se ao mesmo epitopo na A-FN e/ou no ED-A da fibronectina como anticorpo antiED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9.
Um membro de ligação da invenção pode não mostrar nenhuma ligação significante a outras moléculas exceto a A-FN e/ou o ED-A da fibronectina. Em particular, o membro de ligação pode não se ligar a outras isoformas da fibronectina, por exemplo, a isoforma ED-B e/ou a isoforma IIICS da fibronectina.
Variantes de moléculas de anticorpo reveladas neste pedido podem ser produzidas e usadas na presente invenção. As técnicas necessárias para fazer substituições nas sequências de aminoácidos de CDRs, domínios VH ou VL do anticorpo e membros de ligação geralmente estão disponíveis na técnica. Sequências de variantes podem ser feitas, com substituições que podem ou não ser preditas para ter um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade, e testadas para a capacidade de ligar-se â A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina e/ou para qualquer outra propriedade desejada.
Variantes de sequência de aminoácidos de domínio variável de qualquer um dos domínios VH e VL cujas sequências são especificamente reveladas neste pedido podem ser empregadas conforme a presente invenção, como discutido. Determinadas variantes podem incluir uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), pode ser menos de aproximadamente 20 alterações, menos de aproximadamente 15 alterações, menos de aproximadamente 10 alterações ou menos de aproximadamente 5 alterações, talvez 5, 4, 3, 2 ou 1. Alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões da região conservada e/ou uma ou mais CDRs. As alterações normalmente não resultam em perda da função, portanto um membro de ligação compreendendo uma sequência de aminoácidos alterada dessa forma pode conservar uma capacidade de ligar-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina. Por exemplo, pode conservar a mesma ligação quantitativa que um membro de ligação no qual a alteração não é feita, por exemplo, como medido em um ensaio descrito neste pedido. O membro de ligação compreendendo uma sequência de aminoácidos alterada dessa forma pode ter uma capacidade melhorada de ligar-se à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina.
Novas regiões VH ou VL carregando as sequências derivadas de CDR da invenção podem ser geradas usando mutagênese randômica de um ou mais genes selecionados VH e/ou VL para gerar mutações no domínio variável inteiro. Em algumas modalidades, uma ou duas substituições de aminoácidos são feitas em um domínio variável inteiro ou conjunto de CDRs. Outro método que pode ser usado é direcionar a mutagênese a regiões CDR de genes de VH ou VL.
Como observado acima, uma sequência de aminoácidos de CDR substancialmente como preparada neste pedido pode ser carregada como uma CDR em um domínio variável de anticorpo humano ou uma porção substancial do mesmo. As sequências HCDR3 substancialmente como preparadas neste pedido representam modalidades da presente invenção e, por exemplo, cada uma destas pode ser carregada como uma HCDR3 em um domínio variável da cadeia pesada humana ou uma porção substancial da mesma.
Domínios variáveis empregados na invenção podem ser obtidos ou derivados de qualquer linhagem germinativa ou domínio variável humano rearranjado, ou podem ser um domínio variável sintético baseado em sequências consenso ou autênticas de domínios variáveis humanos conhecidos. Um domínio variável pode ser derivado de um anticorpo não-humano. Uma sequência de CDR da invenção (por exemplo, CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis que necessitam de uma CDR (por exemplo, CDR3), usando tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, Marks et al. (1992) descrevem métodos de produção de repertórios de domínios variáveis de anticorpo nos quais iniciadores consenso direcionados para ou adjacentes à extremidade 5' da área de domínio variável são usados em conjunto com iniciadores consenso à terceira região da região conservada de genes VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis VH que necessitam de uma CDR3. Marks et al. descrevem ainda como este repertório pode ser combinado com uma CDR3 dc um dstc”i I lii lãdu aníiuurpo. Usando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser misturadas com repertórios de domínios VH ou VL que necessitam de uma CDR3, e os domínios VH ou VL completos misturados combinados com um domínio VL ou VH cognato para fornecer membros de ligação da invenção. O repertório então pode ser exposto em um sistema hospedeiro adequado, tal como sistema de exposição a fago de W092/01047, que é neste pedido incorporado por referência em sua totalidade, ou qualquer um de um grande corpo subsequente da literatura, incluindo Kay, Winter & McCafferty (1996), para que membros de ligação adequados possam ser selecionados. Um repertório pode consistir em algo de 104 membros individuais acima, por exemplo, pelo menos 105, pelo menos 106, pelo menos 107, pelo menos 108, pelo menos 109 ou pelo menos 101° membros.
Similarmente uma ou mais, ou todas as três CDRs podem ser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL que então são classifi cados para um membro de ligação ou membros de ligação da A-FN e/ou do ED-A da fibronectina.
Uma ou mais das HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do anticorpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9, ou o conjunto de HCDRs podem ser empregados, e/ou uma ou mais dos X LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do anticorpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E3 ou G9 ou o conjunto de LCDRs do anticorpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 ou G9 podem ser empregados.
Similarmente outros domínios VH e VL, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e/ou conjuntos de LCDRs descitos neste pedido podem ser empregados.
A A-FN e/ou o ED-A da fibronectina podem ser usados em uma classificação de membros de ligação, por exemplo, moléculas de anticorpo, para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais. A classificação pode ser uma classificação de um repertório como descrito em outro lugar neste pedido.
Em algumas modalidades, uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina compreenderá pelo menos as três regiões de CDR, em conjunto com suas regiões da região conservada interveniente. A porção também pode incluir pelo menos aproximadamente 50% de uma ou ambas regiões das primeira e quarta da região conservada, 50% sendo 50% C-terminal da primeira região de região conservada e 50% N-terminal da quarta região de região conservada. Resíduos adicionais na extremidade Nterminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados que ocorrem naturalmente em regiões de domínio variável. Por exemplo, construção de membros de ligação da presente invenção feita por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais codificados por ligadores introduzidos para facilitar clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligadores para unir domínios variáveis da invenção a sequências proteicas adicionais incluindo regiões constantes do anticorpo, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores detectáveis/funcionais como discutido em mais detalhes em outro lugar neste pedido.
Embora em alguns aspectos da invenção, membros de ligação compreendem um par de domínios VH e VL, domínios de ligação únicos com base em sequências de domínio VH ou VL formam aspectos adicionais da invenção. É conhecido que os domínios de imunoglobulina únicos, especialmente domínios VH, são capazes de ligação a antígenos alvo de uma maneira específica. Por exemplo, vide a discussão de dABs acima.
No caso de qualquer dos domínios de ligação únicos, estes domínios podem ser usados para classificação de domínios complementares capazes de formar um membro de ligação de dois domínios capazes de se ligar à A-FH e/ou ao ED-A da fibronectina. Isto pode ser realizado pelos métodos de classificação de exposição de fago usando a chamada abordagem combinatória dual hierárquica como descrito em W092/01047, neste pedido incorporado por referência em sua totalidade, em que uma colônia individual contendo um clone de cadeia H ou L é usado para infectar uma biblioteca completa de clones que codificam outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação de duas cadeias resultantes são selecionados de acordo com técnicas de exposição de fago, tais como aqueles descritos naquela referência. Esta técnica também é descrita em Marks 1992.
Membros de ligação da presente invenção podem compreender ainda regiões constantes do anticorpo ou partes do mesmo, por exemplo, regiões constantes de anticorpo humano ou partes das mesmas. Por exemplo, um domínio VL pode ser ligado em sua extremidade C-terminal à cadeia leve de domínios constantes de anticorpo incluindo cadeias humanas ÇD ou CD, por exemplo, CD. Similarmente um membro de ligação com base em um domínio VH pode ser ligado em sua extremidade C-terminal a toda ou parte (por exemplo, um domínio CH1) de uma cadeia pesada da imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das subclasses isotípicas, particularmente lgG1 e lgG4. Qualquer variante de região constante sintética ou outra que tenha estas propriedades e estabilize regiões variáveis é também útil em modali32 dades da presente invenção.
Membros de ligação da invenção podem ser marcados com um marcador detectável ou funcional. Um marcador pode ser qualquer molécula que produz ou pode ser induzida a produzir um sinal, incluindo, mas não limitada a fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, quimioluminescentes ou fotossensibilizantes. Dessa maneira, a ligação pode ser detectada e/ou medida pela detecção de fluorescência ou luminescência, radioatividade, atividade enzimática ou absorvância de luz. Marcadores detectáveis podem ser ligados a anticorpos da invenção usando química convencional conhecida na técnica.
Há métodos numerosos pelos quais o marcador pode produzir um sinal detectável por meios externos, por exemplo, por exame visual, radiação eletromagnética, calor e reagentes químicos. O marcador também pode estar ligado a outro membro de ligação que se liga ao anticorpo da invenção, ou a um suporte.
Membros de ligação marcados, por exemplo, scFv marcada com . um marcador detectável, podem ser usados diagnosticamente in vivo, ex vivo ou in vitro, e/ou terapeuticamente.
Por exemplo, membros de ligação radiomarcados (por exemplo, membros de ligação conjugados a um radioisótopo) podem ser usados em radiodiagnóstico e radioterapia. Radioisótopos que podem ser conjugados a um membro de ligação da invenção incluem isótopos tais como 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111ln, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh e 177Lu.
Por exemplo, um membro de ligação da invenção marcado com um marcador detectável pode ser usado para detectar, diagnosticar ou monitorar metástases tumorais e/ou metástase tumoral em um ser humano ou animal. O membro de ligação pode ser administrado a um ser humano ou animal, normalmente um paciente humano, e a presença ou ausência do anticorpo em um sítio distante de um sítio atualmente ou anteriormente ocupado por um tumor primário no corpo humano ou animal pode ser determinada; a localização da molécula de anticorpo em um sítio distante do sítio atualmente ou anteriormente ocupado pelo tumor primário no ser humano ou animal indica a presença de metástases tumorais e/ou metástase tumoral.
Um membro de ligação da presente invenção pode ser usado para a produção de um produto diagnóstico para uso no diagnóstico em metástases tumorais.
A presente invenção também fornece um método de detecção ou diagnóstico de metástases tumorais em um ser humano ou animal compreendendo as etapas de:
(a) administração de um membro de ligação da presente invenção ao ser humano ou animal, por exemplo, marcado com um marcador detectável, que se liga à isoforma de ED-A da fibronectina e/ou do ED-A da fibronectina, e (b) determinação da presença ou ausência do membro de ligação em um sítio distante de um sítio atualmente ou anteriormente ocupado por um tumor primário no corpo humano ou animal;
em que a localização do membro de ligação em um sítio distante do sítio atualmente ou anteriormente ocupado pelo tumor primário no ser humano ou animal indica a presença de metástases tumorais. Onde o membro de ligação é marcado com um marcador detectável, a presença ou ausência do marcador detectável pode ser determinada pela detecção do marcador.
Um membro de ligação como descrito neste pedido também pode ser usado para medir níveis de antígeno em um ensaio de competição, isto é, um método de mensuração do nível de antígeno em uma amostra empregando um membro de ligação como fornecido pela presente invenção em um ensaio de competição. Isto pode ser onde a separação física da ligação do antígeno não ligado não é necessária. Ligar uma molécula repórter ao membro de ligação para que uma modificação física ou ótica ocorra na ligação é uma possibilidade. A molécula repórteres pode gerar diretamente ou indiretamente sinais detectáveis, que podem ser quantificáveis. A ligação de moléculas repórter pode ser diretamente ou indiretamente, covalentemente, por exemplo, através de uma ligação peptídica ou não-covalente. A ligação de peptídeo através da ligação peptídica pode ser em consequência da expressão recombinante de um anticorpo de codificação de fusão genética e molécula repórter.
Ensaios de competição também podem ser usados no mapeamento de epitopo. Em um exemplo, mapeamento de epitopo pode ser usado para identificar o epitopo ligado por um membro de ligação. Tal epitopo pode ser linear ou conformacional. Um epitopo conformacional pode compreender pelo menos dois fragmentos diferentes da A-FN ou do ED-A da fibronectina, em que os ditos fragmentos são posicionados em proximidade um ao outro quando A-FN ou ED-A da fibronectina são dobrados em sua estrutura terciária ou quaternária para formar um epitopo conformacional que é reconhecido por um membro de ligação de A-FN ou ED-A da fibronectina. No teste para competição, um fragmento peptídico do antígeno pode ser empregado, especialmente um peptídeo incluindo ou consistindo essencialmente em um epitopo de interesse. Um peptídeo tendo sequência de epitopo mais um ou mais aminoácidos em qualquer extremidade pode ser usado, membros de ligação de acordo com a presente invenção podem ser tais que suas ligações ao antígeno são inibidas por um peptídeo ou incluindo a dada sequência.
Aspectos adicionais da presente invenção empregam um conjugado ou fusão entre um membro de ligação da invenção e uma molécula que exerce um efeito biocida ou citotóxico sobre células-alvo nas lesões e um anticorpo direcionado contra um componente da matriz extracelular que está presente em tais lesões, por exemplo, a molécula biocida ou citotóxica pode ser interleucina-2 (IL-2), doxorrubicina, interleucina-12 (IL-12), Interferon-D (IFN-D), Fator de Necrose Tumoral □ (TNF □) ou fator tecidual (preferencialmente truncado). Tais conjugados podem ser usados terapeuticamente, por exemplo, para o tratamento de metástases tumorais e/ou tumor como mencionado neste pedido. Produção e uso de fusões ou conjugados de membros de ligação com moléculas biocidas ou citotóxicas são descritos, por exemplo, em WO01/62298, que é incorporado por referência neste pedido.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de metástase tumoral e/ou metástases tumorais, o método compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um medicamento compreendendo um membro de ligação da invenção. O membro de ligação pode ser um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito biocida ou citotóxico sobre células-alvo pela interação celular e (ii) um membro de ligação da isoforma de ED-A da fibronectina e/ou do ED-A da fibronectina.
Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um membro de ligação da invenção para preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais e/ou metástase tumoral. O membro de ligação pode ser um conjugado ou fusionado a uma molécula que exerce um efeito biocida ou citotóxico como descrito neste pedido. O membro de ligação pode ser um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito biocida ou citotóxico sobre células-alvo pela interação celular e (ii) um membro de ligação da fibronectina humana de acordo com a presente invenção.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito biocida ou citotóxico sobre célulasalvo pela interação celular e (ii) um membro de ligação da fibronectina humana de acordo com a presente invenção, para uso em um método para tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Tal tratamento pode ser de metástases tumorais e/ou metástase tumoral.
Um aspecto ainda adicional da invenção fornece um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito biocida ou citotóxico sobre célulasalvo pela interação celular e (ii) um membro de ligação da fibronectina humana de acordo com a presente invenção. Tal conjugado preferencialmente compreende uma proteína de fusão compreendendo a molécula biocida ou citotóxica e um dito membro de ligação, ou, onde o membro de ligação é de duas cadeias ou multi-cadeia, uma proteína de fusão compreendendo a molécula biocida ou citotóxica e um componente de cadeia polipeptídica do dito membro de ligação. Preferencialmente, o membro de ligação é um polipeptídeo de cadeia única, por exemplo, uma molécula de anticorpo de cadeia única, tal como scFv. Dessa forma, um aspecto adicional da presente inven ção fornece uma proteína de fusão compreendendo a molécula biocida ou citotóxica e uma molécula de cadeia única do anticorpo Fv da invenção.
A molécula biocida ou citotóxica que exerce seu efeito sobre células-alvo pela interação celular, pode interagir diretamente com células-alvo, pode interagir com um receptor ligado à membrana na célula alvo ou perturbar o potencial eletroquímico da membrana celular. Moléculas que interagem com um receptor ligado à membrana incluem quimiocinas, citocinas e hormônios. Compostos que perturbam o potencial eletroquímico da membrana celular incluem hemolisina, ionóforos, fármacos que atuam sobre canais tônicos. Em modalidades preferenciais exemplares, a molécula é interleucina2, fator tecidual (preferencialmente truncado) ou doxorrubicina. Outras modalidades podem empregar interleucina 12, interferon gama, IP-10 e Fator de NecroseTumoral-D (TNF-D).
Como discutido ainda abaixo, o membro de ligação específico é preferencialmente um anticorpo ou compreende um sítio de ligação a antígeno no anticorpo. Convenientemente, o membro de ligação específico pode ser um polipeptídeo de cadeia única, tal como um anticorpo de cadeia única. Isto leva em conta a produção adequada de uma proteína de fusão compreendendo anticorpo de cadeia única e a molécula biocida ou citotóxica (por exemplo, interleucina-2 ou fator tecidual), em outras modalidades, um sítio de ligação a antígeno no anticorpo é fornecido por meio da associação de um domínio VH do anticorpo e um domínio VL do anticorpo em polipeptídeos separados, por exemplo, em um anticorpo completo ou em um fragmento de anticorpo, tal como Fab ou diacorpo. Onde o membro de ligação específico é uma molécula de duas cadeias ou molécula multicadeia (por exemplo, Fab ou anticorpo inteiro, respectivamente), a molécula biocida ou citotóxica pode ser conjugada como um polipeptídeo de fusão com uma ou mais cadeias polipeptidicas no membro de ligação específico.
O membro de ligação pode ser conjugado com a molécula biocida ou citotóxica por meio de uma ligação peptídica, isto é, em um polipeptídeo de fusão compreendendo a dita molécula e o membro de ligação específico ou um componente de cadeia polipeptídica da mesma. Vide Taniguchi et al. (1983) Nature 302, 305-310; MaED-A et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040-1047; Devos et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 43074323 para informação sobre sequência IL-2 útil para preparação de um polipeptídeo de fusão compreendendo IL-2. Informação sobre sequência do fator tecidual truncado é fornecida por Scarpati et al. (1987) Biochemistry 26: 5234-5238, e Ruf et al. (1991) J. Biol. Chem. 226: 15719-15725. Outros meios de conjugação incluem a conjugação química, especialmente ligação cruzada usando um reagente bifuncional (por exemplo, empregando Guia de Seleção de Reagentes de Ligação Cruzada DOUBLE-REAGENTS®, Pierce).
Onde a liberação lenta é desejável, por exemplo, onde a molécula biocida ou citotóxica é doxorrubicina ou outra molécula que perturba o potencial eletroquímico da membrana celular, a conjugação química pode ser por melo da formação de uma base de Schiff (imina) entre um grupo amino primário do membro de ligação específico (um polipeptídeo, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo) e uma porção de açúcar oxidado (daunosamina) da molécula biocida ou citotóxica, tal como doxorrubicina.
A presente invenção fornece ainda um ácido nucleico isolado que codifica um membro de ligação da presente invenção. Ácido nucleico pode incluir DNA e/ou RNA. Em um aspecto, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica para uma CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou sítio de ligação a antígeno do anticorpo ou molécula de anticorpo, por exemplo, scFv ou IgG, por exemplo, lgG1, da invenção como definido acima. Sequências nucleotídicas preferenciais são as sequências nucleotídicas que codificam domínios VH e/ou VL descitos neste pedido.
A presente invenção também fornece construtos na forma de plasmídeos, vetores, transcrição ou cassetes de expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.
A presente invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante compreendendo um ou mais construtos como acima. Um ácido nucleico que codifica qualquer CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou sítio de ligação a antígeno no anticorpo ou molécula de anticorpo, por exemplo, scFv ou lgG1 ou lgG4 como fornecida, por si mesmo forma um aspecto da presente invenção, como faz um método de produção do produto codificado, método o qual compreende a expressão de ácido nucleico de codificação. Expressão pode ser convenientemente realizada pelo cultivo sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. Seguinte à produção pela expressão de um domínio VH ou VL, ou membro de ligação pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica adequada, então usada como apropriado.
Ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser inteiramente ou parcialmente sintético. Referência a uma sequência nucleotídica como estabelecida neste pedido engloba uma molécula de DNA com a sequência especificada, e engloba uma molécula de RNA com a sequência especificada na qual L) é substituído por T, a menos que o contexto requeira de outra maneira.
Um aspecto ainda adicional fornece um método de produção de um domínio variável VH do anticorpo, o método incluindo causar expressão do ácido nucleico de codificação. Tal método pode compreender cultivo de células sob condições de produção do dito domínio variável VH do anticorpo.
Métodos análogos para produção de domínios variáveis VL e membros de ligação compreendendo um domínio VH e/ou VL são fornecidos como aspectos adicionais da presente invenção.
Um método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto. Um método de produção pode compreender a formulação do produto em uma composição incluindo pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em várias células hospedeiras diferentes são bem-conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células mamíferas, células vegetais, fungos filamentosos, levedura e sistemas baculovírus e plantas e animais transgênicos. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procarióticas é bem-estabelecida na técnica. Para uma revisão, vide, por exemplo, Pluckthun 1991. Um hospedeiro bacteriano comum é E. coli.
Expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível para aqueles versados na técnica como uma opção para produção de um membro de ligação, por exemplo, Chadd & Chamow (2001), Andersen & Krummen (2002), Larrick & Thomas (2001). Linhagens celulares de mamíferos disponíveis na técnica para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de filhote de hamster, células de melanoma de camundongo NS0, células de mieloma de rato YB2/0, células renais embrionárias humanas, células de retina embrionárias humanas e muitas outras.
Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências potencializadoras, genes marcadores e outras sequências como apropriado. Vetores podem ser plasmídeos, por exemplo, fagemídeo, ou virais, por exemplo, fago, como apropriado. Para detalhes adicionais vide, por exemplo, Sambrook & Russell (2001). Muitas técnicas conhecidas e protocolos de manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construtos de ácidos nucleicos, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Ausubel 1999.
Um aspecto adicional da presente invenção fornece uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como descrito neste pedido. Tal célula hospedeira pode estar in vitro e pode estar em cultura. Tal célula hospedeira pode estar in vivo. Presença in vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos membros de ligação da presente invenção como intracorpos ou anticorpos intracelulares. Intracorpos podem ser usados para terapia gênica.
Um aspecto ainda adicional fornece um método compreendendo introdução do ácido nucleico da invenção em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir a transfecção por fosfato de cálcio,
Dextrana DEAE, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdução usando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, varíola ou, para células de inseto, baculovírus. Introdução de ácido nucleico na célula hospedeira, em particular em uma célula eucariótica, pode usar um sistema com base viral ou um plasmídeo. O sistema de plasmídeo pode ser mantido epissomalmente ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou em um cromossomo artificial. Incorporação pode ser pela integração randômica ou dirigida de uma ou mais cópias em loci únicos ou múltiplos. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir a transformação por cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófago.
A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão do ácido nucleico, por exemplo, pelo cultivo de células hospedeiras sob condições para expressão do gene. A purificação do produto expresso pode ser realizada por métodos conhecidos a um versado na técnica.
Conforme a invenção, o ácido nucleico da invenção pode estar integrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, conforme técnicas padrão.
A presente invenção também fornece um método que compreende usar um construto como afirmado acima em um sistema de expressão a fim de expressar um membro de ligação ou polipeptídeo como acima.
Membros de ligação da presente invenção são desenhados para serem usados em métodos de diagnóstico ou tratamento em indivíduos humanos ou animais, por exemplo, ser humano. Membros de ligação podem ser usados em diagnóstico ou tratamento de metástases tumorais e/ou metástase tumoral.
Consequentemente, aspectos adicionais da invenção fornecem métodos de tratamento compreendendo administração de um membro de ligação como fornecido, composições farmacêuticas compreendendo tal membro de ligação, e uso de tal membro de ligação na produção de um medicamento para administração, por exemplo, em um método de produção de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo formulação do membro de ligação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem-conhecidos e serão adaptados pelo versado na técnica como uma função da natureza e do modo de administração do composto(s) ativo escolhido.
Membros de ligação da presente invenção serão normalmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação. Dessa forma, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso conforme a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente, veículo, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais materiais devem ser não-tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. A natureza exata do veículo ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, inalada ou por injeção, por exemplo, intravenosa.
Composições farmacêuticas para administração oral tais como, por exemplo, nanocorpos etc. também são contempladas na presente invenção. Tais formulações orais podem estar em pastilha, cápsula, pó, forma líquida ou semissólida. Uma pastilha pode compreender um veículo sólido, tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um veículo líquido, tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol podem ser incluídos.
Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio de aflição, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirógeno e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles de habilidade relevante na técnica são bem capazes de preparar usando soluções adequadas, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactato. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser empregados, como necessário. Muitos métodos para a prepara ção de formulações farmacêuticas são conhecidos por aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Robinson, 1978.
Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, concorrentemente ou sequencialmente ou como uma preparação combinada com outro agente ou agentes terapêuticos, dependendo da condição a ser tratada.
Um membro de ligação de A-FN e/ou de ED-A da fibronectina pode ser usado como parte de uma terapia de combinação em conjunto com um componente medicinal adicional. Tratamentos de combinação podem ser usados para fornecer efeitos sinérgicos significantes, particularmente a combinação de um membro de ligação que se liga à A-FN e/ou ao ED-A da fibronectina com um ou mais outros fármacos. Um membro de ligação para a A-FN e/ou o ED-A da fibronectina podem ser administrados concorrentemente ou sequencialmente ou como uma preparação combinada com outro agente ou agentes terapêuticos, para o tratamento de uma ou mais das condições enumeradas neste pedido.
Por exemplo, um membro de ligação da invenção pode ser usado em combinação com um agente terapêutico existente para o tratamento de metástases tumorais e/ou metástase tumoral. Agentes terapêuticos existentes para o tratamento de metástases tumorais e/ou metástase tumoral incluem: doxorrubicina, taxol, gencitabina, sorafenibe, melfalan e avastina.
Um membro de ligação da invenção e um ou mais dos componentes medicinais adicionais acima podem ser usados na produção de um medicamento. O medicamento pode ser para a administração separada ou combinada a um indivíduo, e consequentemente pode compreender o membro de ligação e o componente adicional como uma preparação combinada ou como preparações separadas. Preparações separadas podem ser usadas para facilitar a administração separada e sequencial ou simultânea, e permitir administração dos componentes por vias diferentes, por exemplo, administração oral e parenteral.
Conforme a presente invenção, as composições fornecidas podem ser administradas a mamíferos. Administração pode ser em uma quan tidade terapeuticamente eficaz, esta que é suficiente para mostrar o benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, e taxa e curso do tempo da administração, dependerão na natureza e severidade do que está sendo tratado, o determinado mamífero que é tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de entrega da composição, o tipo do membro de ligação, o método de administração, o planejamento da administração e outros fatores conhecidos a profissionais médicos. Prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre dosagem etc., está dentro da responsabilidade de profissionais em geral e outros médicos, e pode depender da severidade dos sintomas e/ou a progressão de uma doença sendo tratada.
Doses apropriadas de anticorpo são bem-conhecidas na técnica (Ledermann 1991 e Bagshawe 1991. Dosagens específicas indicadas neste pedido, ou em Physician's Desk Reference (2003) como apropriado para o tipo de medicamento sendo administrado, podem ser usadas. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose adequada de um membro de ligação da invenção podem ser determinadas pela comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivo em um modelo animal. Métodos de extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais de teste para seres humanos são conhecidos. A dose exata dependerá de diversos fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico, prevenção ou para tratamento, o tamanho e posição da área a ser tratada, a natureza exata do anticorpo (por exemplo, anticorpo inteiro, fragmento ou diacorpo), e a natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica estará na faixa 100 pg a 1 g para aplicações sistêmicas, e 1 pg a 1 mg para aplicações tópicas. Uma dose inicial de carga mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode ser administrada. Um anticorpo pode ser um anticorpo inteiro, por exemplo, o isotipo lgG1 ou lgG4. Esta é uma dose para um tratamento único de um paciente adulto, que pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e bebês, e também ajustada para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular. Trata mentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanais ou mensais, à discrição do médico. Tratamentos podem ser a cada duas a quatro semanas para administração subcutânea e a cada quatro a oito semanas para administração intravenosa. Em algumas modalidades da presente invenção, o tratamento é periódico, e o período entre administrações é aproximadamente duas semanas ou mais, por exemplo, aproximadamente três semanas ou mais, aproximadamente quatro semanas ou mais, ou aproximadamente uma vez por mês. Em outras modalidades da invenção, tratamento pode ser dado antes, e/ou após cirurgia, e pode ser administrado ou aplicado diretamente no sítio anatômico do tratamento cirúrgico.
Aspectos e modalidades adicionais da invenção serão evidentes àqueles versados na técnica dada a presente descrição incluindo a seguinte exemplificação experimental.
EXPERIMENTAL
MATERIAIS E MÉTODOS
Modelo Animal
Experimentos animais foram aprovados pelo Escritório Veterinário Federal Suíço e realizados conforme a Ordem de Proteção Animal da Suíça. Camundongos foram monitorados regularmente. Quando mostrando qualquer sinal de dor ou sofrimento, ou em caso de uma perda de peso corporal animal > 15% foram eutanizados. Camundongos machos Svl29 (RCC, Fullingsdorf, Suíça) receberam injeção intravenosa de -106 células de teratocarcinoma murino F9 mutantes (Terrana et al. 1987), que foram gentilmente fornecidas por Dario Rusciano (SIFI, Catania, Itália). Camundongos foram usados 3 semanas após injeção de célula tumoral para biotinilação in vivo, experimentos dirigidos ou excisão de órgão para imuno-histoquímica. Biotinilação in vivo
Experimentos de biotinilação in vivo foram realizados como descrito anteriormente (Roesli et al. 2006, Rybak et al. 2005). Em sumário, o peito do camundongo anestesiado foi aberto através de uma esternotomia mediana. O ventrículo cardíaco esquerdo foi perfurado com uma agulha de perfusão e um pequeno corte foi feito no átrio direito para permitir o fluxo das soluções de perfusão. Imediatamente após, perfusão da circulação sistêmica foi realizada com uma pressão de 100 mm de Hg em uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min. Em uma primeira etapa, a perfusão foi realizada com 15 ml de solução de biotinilação (preaquecida a 38°C), contendo 1 mg/ml de sulfoNHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL, EUA) em PBS, pH 7,4, suplementado com dextrana-40 a 10% (p/v) (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) como dilatador plasmático. Por meio disso, os componentes sanguíneos, que poderíam competir com a reação de biotinilação, foram eliminados da circulação nos primeiros minutos de perfusão e proteínas contendo amina primária acessível (e certos glicolipídeos e fosfolipídeos) nos tecidos diferentes podem ser covalentemente modificados com biotina. Para neutralizar reagente de biotinilação não reagido, a biotinilação in vivo foi seguida por uma etapa de lavagem de 10 min com Tris a 50 mM, dextrana-40 a 10% (p/v), em PBS, pH 7,4, preaquecido a 38°C. Durante a perfusão com o reagente de biotinilação (e durante os três primeiros minutos da perfusão seguinte com solução de extinção) a região em volta do coração foi lavada com Tris a 50 mM em PBS, pH 7,4 (38°C), para extinguir reagente de biotinilação não reagido da corrente e evitar marcação indesejada de moléculas nas superfícies do órgão. Após perfusão, órgãos e tumores foram extirpados e espécimes foram imediatamente congelados para preparação de homogenatos do órgão ou introduzidos no composto crioembutido (Microm, Walldorf, Alemanha) e congelados em isopentano em nitrogênio líquido para preparação de criosseções para análise histoquímica. Camundongos não perfundidos foram usados como controles negativos para a análise proteômica. Preparação de Extratos Proteicos para Análise Proteômica
Espécimes foram ressuspensos em 4Q Dl por mg de tecido do tampão de lise (SDS a 2%, Tris a 50 mM, EDTA a 10 mM e coquetel de inibidor proteinase Complete E (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) em PBS, pH 7,4) e homogeneizados usando um dispersador Ultra-Turrax T8 (IKA-Werke, Staufen, Alemanha). Homogenatos foram sonicados usando um Vibra-cell (Somes, New Town, CT, EUA), seguido por incubação por 15 minutos a 99°C e centrifugação por 20 minutos em 15000 x g. O sobrenadante foi usado como extrato de proteína total. Concentração de proteína foi determinada usando o Kit de Reagente de Ensaio de Proteína BCA (Pierce). Purificação de Proteínas Biotiniladas
Para cada amostra, 960 □! de pasta fluida de estreptavidinasefarose (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) foram lavados três vezes no tampão A (NP40 a 1%, SDS a 0,1% em PBS), precipitados e misturados com 15 miligramas do extrato de proteína total. Captura de proteínas biotiniladas foi prosseguida por 2 h em RT em um misturador giratório. O sobrenadante foi removido e a resina lavada três vezes com tampão A, duas vezes com tampão B (NP40 a 0,1%, NaCI a 1 M em PBS), e uma vez com bicarbonato de amônio a 50 mM. Finalmente, a resina foi ressuspensa em 400 Dl de uma solução de bicarbonato de amônio a 50 mM e 20 Dl de tripsina porcina modificada de grau de sequenciamento (solução estoque de 40 ng/DI em bicarbonato de amônio a 50 mM) (Promega, Madison, Wl, EUA) foram adicionados. Digestão por protease foi realizada durante a noite a 37°C sob agitação constante. Peptídeos foram dessalinizados, purificados e concentrados com microcolunas C18 (ZipTip C18, Millipore, Billerica, MA, EUA). Após liofilização dos peptídeos foram estocados a -20°C.
HPLC Nanocapilar com Reconhecimento de Fração em Tempo Real Automatizadas em Placas MALDI Alvo
Peptídeos trípticos foram separados em fase reversa por cromatografia líquida de alta performance (RP-HPLC) usando um sistema UltiMate nanoscale LC e um microautoamostrador FAMOS (LC Packings, Amsterdam, Holanda) controlado pelo programa Chromeleon (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA). Fase móvel A consistiu em acetonitrila a 2% e ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA) em água, a fase móvel B foi acetonitrila a 80% e TFA a 0,1% em água. A taxa de fluxo foi 300 nl/min. Peptídeos liofilizados derivados a partir da digestão por afinidade de proteínas biotiniladas purificadas a partir de 1,5 mg de proteína total foram dissolvidos em 5 ΠΙ do tampão A e carregados na coluna (diâmetro interno: 75 Dm, comprimento de 15 cm, preenchida com C18 PepMap 100, 3 Dm, contas de 100Â; LC Packings). Os peptídeos foram eluídos com um gradiente de 0 a 30% de B por 7 min, 30 a
80% de B por 67 min, 80 a 100% de B por 3 min e 100% de B por 5 min; a coluna foi equilibrada com 100% de A por 20 min antes de analisar a amostra seguinte. Frações do eluído foram misturadas com uma solução de 3 mg/ml de ácido □-ciano-4-hidroxicinâmico, 277 pmol/ml de neurotensina (padrão interno), TFA a 0,1%, e acetonitrila a 70% em água e dispostos em uma placa MALDI-alvo de 192 poços usando um sistema Probot em tempo real (Dionex). O fluxo da solução MALDI-matriz foi estabelecido em 1,083 □l/min. Dessa maneira, cada fração coletada durante 20 s continha 361 nl de solução MALDI-matriz e 100 nl de amostra. A concentração final de neurotensina foi 100 fmol por poço.
Espectrofotometria de Massa de MALDI-TOF/TOF
Análise espectrométrica de massa MALDI-TOF/TOF foi realizada com o Analisador 4700 Proteomics (Applied Biosystems, Framingham, MA, EUA). Para seleção iônica precursora, todas as frações foram medidas no modo de MS antes que MS/MS fosse realizado. Um máximo de 15 precursores por ponto de amostra foi selecionado para fragmentação subsequente pela dissociação induzida por colisão. Espectros foram processados e analisados pela Estação de trabalho de Servidor de Proteína Global (Applied Biosystems), que usa o programa MASCOT interno (Matrix Science, Londres, Reino Unido) para combinar dados de MS e MS/MS contra bancos de dados de proteínas digeridas in silico. Os dados obtidos foram classificados contra um banco de dados de camundongo baixado da página da NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Identificações de proteína, realizadas por meio do programa MASCOT, foram consideradas ser chamadas corretas dentro do intervalo de confiança de 95% do melhor íon peptídico.
Análises espectrométricas de massa MALDI-TOF e MALDITOF/TOF foram realizadas usando o Analisador 4700 Proteomics (Applied Biosystems). Massas peptídicas foram adquiridas em uma faixa de 750 a 4000 m/z, com uma massa de foco de 2000 m/z. Espectros de MS foram somados a partir de 2000 pulsos de laser de um laser Nd:YAG operando em 355 nm e 200 Hz. Uma calibração de placa automatizada foi realizada usando cinco padrões de peptídeo (massas 900 a 2400 m/z; Applied Biosystems) em seis poços de calibração. Esta calibração de placa foi usada para atualizar a calibração de massa de valor predeterminado do instrumento, que foi aplicada a todos os espectros de MS e MS/MS. Além disso, uma calibração interna de cada espectro de MS usando o peptídeo padrão interno adicionado à matriz MALDI foi realizada. Um máximo de 15 precursores por amostra bem com uma relação sinal/ruído >100 foi automaticamente selecionada para fragmentação subsequente por dissociação induzida por colisão. Espectros de MS/MS foram somados a partir de 2500 a 5000 pulsos de laser. Espectros foram processados e analisados pela Estação de trabalho de Servidor de Proteína Global (Applied Biosystems), que usa o programa MASCOT interno (Matrix Science) para combinar dados de MS e MS/MS contra bancos de dados de proteínas digeridas in-silico. Os parâmetros de busca de MASCOT foram (i) um banco de dados de camundongo baixado a partir da página do Instituto de Bioinformática Europeu (EBI) em 9 de setembro de 2006 (ftp. ebi.ac.uk/pub/databases/SPproteomes/fasta/proteomes/59.M_musculus.fasta. gz:); (ii) enzima: tripsina e semitripsina; número permitido de clivagens perdidas: 1; (iv) modificações pós-traducionais variáveis: oxidação de metionina;
(v) tolerância a peptídeo: ±30 ppm; (vi) tolerância MS/MS: ± 0,2 Da; (vii) carga de peptídeo: + 1; (viii) escore de íon mínimo C.l.% de peptídeos: 95 e (ix) graduação de peptídeo máxima: 1. Além disso, um pico de flltração MS/MS com os seguintes parâmetros foi usado: (i) faixa de massa: 60 Da a 20 Da abaixo de massa precursora; (ii) proporção de sinal/mínima: 6; em filtro de densidade máximo: máximo de 30 picos por 200 Da e (iv) número máximo de picos por espectro: 65.
Anticorpos
O isolamento do fragmento de anticorpo anti-ED-B scFv (L19) foi anteriormente descrito (Pini et al. 1998). O anticorpo anti-ED-A parental foi isolado a partir da biblioteca ETH-2 usando procedimentos publicados (Giovannom, Nucleic. Acid Research, 2001, 29(5):E27). A maturação por afinidade do anticorpo anti-ED-A parental, produzindo anticorpos anti-ED-A de alta afinidade, é descrita na seção seguinte.
Maturação por Afinidade do Anticorpo Anti-ED-A Parental
O anticorpo anti-ED-A parental (um anticorpo derivado de ETH2) foi usado como padrão para a construção de uma biblioteca de maturação por afinidade. Variabilidade de sequência na CDR1 VH (linhagem germinativa DP47) e CDR1 VL (linhagem germinativa DPK22) da biblioteca foi introduzida por PCR usando iniciadores parcialmente degenerados 5'-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3' (SEQ ID NO: 17) para VH e
S-CCAGGTTTCTGCTGGTA(DCAGGCTAA MNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3' (SEQ ID NO: 18) para VL (todos os oligonucleotideos foram adquiridos de Operon Biotechnologies, Colônia, Alemanha), em um processo que gera mutações randômicas nas posições 31, 32 e 33 das CDR1 de VH e nas posições 31, 31a e 32 das CDR1 de VL. Combinações de VHVL foram reunidas no formato de scFv pela montagem de PCR usando os iniciadores LMB3longo (5CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3') (SEQ ID NO: 19) e fdseqlongo (5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3') (SEQ ID NO: 20), usando segmentos VH e VL purificados em gel como moldes. Os fragmentos VH-VL montados foram duplamente digeridos com Ncol/Notl e clonados em vetor fagemideo pHEN1 digerido por Ncol/Notl (Hoogenboom et al., 1991). O produto de ligação resultante foi eletroporado em células E. coli TG-I eletrocompetentes de acordo com (Viti et al., 2000), dando origem a uma biblioteca contendo 1,5 x 107 clones de anticorpo individuais, que foi classificada para anticorpos que se ligam ED-A com afinidade melhorada.
Seleção de Anticorpos Anti-ED-A
A biblioteca de anticorpo descrita acima foi classificada para anticorpos que se ligaram ao ED-A com uma maior afinidade do que o anticorpo anti-ED-A parental usando análise por BIAcore. O antígeno (11A12) usado na análise por BIAcore continha o domínio ED-A da fibronectina humana e tem a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 120):
MRSYRTEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQ
TEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWES
PQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPL
IGTQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDS SSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH
A sequência nucleotídica de antígeno (11A12) (SEQ ID NO: 121) é como se segue:
atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaaca gcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaa aaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattgaaggc ttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctc ttccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttcvaggtacaggg tgaccüactvgagv cctgaggatggaatccatgagctattccvtgcacctgatggtgaagaagacactgcagag^tgcaag
- gcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcc cctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacaccc
- acaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgaccc ccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgacagctca tccg tgg t: tg t a t c aggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctcttaaggacactttgacaagcaga ccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaccatcaccatcactaa
A sequência nucleotídica do antígeno foi amplificada pelo uso de iniciadores de PCR contendo sítios de restrição BamHI e Bglll em 5’ e 3' 5 respectivamente. O produto de PCR resultante e o vetor pQEI2 (QIAGEN) foram digeridos com endonuclease de restrição BamHI e Bglll e posteriormente ligadas em uma reação contendo uma taxa de inserção no vetor de 3:1. O vetor resultante foi sequenciado para verificar que a sequência estava correta.
O Antígeno foi preparado como se seque:
Uma pré-cultura de TG1 eletrocompetente em 10 ml de 2TY, Amp, Glicose a 1% foi eletroporada na presença de 1 μΙ de um miniprep de DNA de 11A12. A pré-cultura então foi diluída 1:100 (8ml em 800ml de 2TY, Amp, Glicose 0,1%) e cultivada para um DO600 de 0,4 a 0,6 e então induzi15 da com IPTG durante a noite. No dia seguinte, as células foram centrifugadas e o sobrenadante filtrado (Millipore 0,22 pm). Após centrifugação e clarificação do caldo de cultura, 11A12 foi purificado usando uma coluna Hitrap em FPLC. A coluna Ni/ foi regenerada como se segue: a coluna foi enxaguada com 5 volumes de coluna (CV) de H2O seguida pela aplicação de
3CV de EDTA a 0,5 Μ/Tris a 0,2 mM pH 8 para lavar o Níquel velho da coluna. Isto foi seguido enxaguando a coluna com 5CV de H2O. A coluna então foi recarregada com 2CV de NiSO4 a 100 mM seguido por enxágue da coluna com vários CVs de H2O. A coluna foi então equilibrada com 5CV de tampão de lise (imidazol a 20 mM/NaCI a 250 mM/ PBS pH 7,4). O lisado celular foi filtrado (Millipore 0,45 pm) e carregado na coluna (manualmente). A coluna então foi reposta em FPLC e o tampão de lise deixado fluir até que o sinal de UV estivesse estável (constante), aproximadamente 3 CV. O programa de eluição então foi iniciado: Gradiente a partir de 0% a 100% de Tampão de Eluição (imidazol a 400 mM/NaCI a 250 mM/PBS pH 7,4) em 5CV. As frações contendo o antígeno eluído foram reunidas e dialisadas em PBS durante a noite.
Expressão e Purificação dos Anticorpos anti-ED-A
Os anticorpos anti-ED-A foram expressos e purificados como se segue: uma pré-cultura TG1 eletrocompetente em 10 ml de 2TY, Amp, Glicose a 1 % foi eletroporada na presença de 1 pl de um miniprep de DNA de um dos anticorpos anti-ED-A. A pré-cultura então foi diluída 1:100 (8ml em 800ml de 2TY, Amp, Glicose 0,1%) e cultivada a um DO600 de 0,4 a 0,6 e então induzida com IPTG durante a noite. No dia seguinte, as células foram centrifugadas e o sobrenadante filtrado (Millipore 0,22 pm). As scFv foram purificadas em uma coluna Proteína A-Sefarose e Trietilamina foi usada para eluir scFvs da coluna. As frações contendo as scFvs eluídas foram dialisadas em PBS durante a noite a 4°C. As frações de scFv então foram postas em uma coluna Superdex 75 com PBS fluindo em 0,5 ml/min e frações de 0,25 ml coletadas. As frações monoméricas foram usadas para análise por BIAcore.
Análise por BIAcore 1
O Chip BIAcore foi lavado com água durante a noite em uma taxa de fluxo de 5 pl/min com tampão BIACORE HBS-EP, Hepes a 0,01 M pH 7,4, NaCI a 0,15 M, EDTA a 3 mM, tensoativo P20 a 0,005% (o mesmo tampão usado para o ensaio). O antígeno (11A12) foi diluído a uma concentração de 50 pg/ml no tampão acetato (pH 4,0) e os grupos COOH do chip foram ativados pela injeção de 50 pl de uma mistura de NHidroxissuccinimida (MHS) e etil-N-(dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC). 40 μΙ do antígeno 11A12 foram injetados no chip e os grupos COOH livres residuais foram bloqueados com 30 μΙ de etanolamina. Após uma filtração 0,22 pm, 20 μΙ de cada sobrenadante bacteriano individual foram injetados no chip e interação com o antígeno foi monitorada em tempo real.
Análise por BIAcore 2
O Kon. koff θ KD do anticorpo anti-ED-A parental e anticorpos antiED-A B2, C5, D5, C8, F8, B7 e G9 foram avaliados usando Ressonância de Plasmônio de Superfície. O chip foi equilibrado durante a noite com o mesmo tampão usado durante o ensaio em uma taxa de fluxo de tampão de 5 □l/min. O procedimento de revestimento inteiro foi realizado nesta taxa de fluxo. O antígeno 11A12 foi diluído 1:25 com tampão acetato pH 4,00 (fornecido por BIACORE) a uma concentração final de 20 ng/ml. O NHS e EDC então foram misturados e 50QI injetados para ativar os grupos COOH do chip CMS. Isto foi seguido pela injeção de 40 Dl do antígeno (isto dura aproximadamente 40). Então 30 Dl de Etanolamina foram injetados a fim de bloquear a reatividade de COOH livre eventual.
Cada amostra foi analisada em uma razão de fluxo de 20 μΙ/min. 20 μΙ da proteína monomérica não diluída (como sai da filtração em gel) foram injetados. O tempo de dissociação foi deixado correr aproximadamente 200. Então 10 μΙ de HCI a 10 mM foram injetados para regenerar o chip. A injeção da proteína monomérica foi repetida em diluições diferentes, isto é diluição 1:2 (em PBS) seguida pela regeneração com HCI. Isto foi seguido por uma terceira injeção da proteína, em uma diluição de 1:4 seguida novamente por regeneração com HCI. Os valores de kon, koff θ Kd de cada anticorpo anti-ED-A foram avaliados usando o programa BIAevaluation. Histoquímica
A fim de verificar a biotinilação in vivo bem-sucedida, marcação de estruturas biotiniladas então foi realizada como descrito em (Rybak et al. 2005). Seções (10 pm) foram cortadas de espécimes recentemente congelados, fixados com acetona, incubados sucessiva mente com complexo es treptavidina:fosfatase alcalina biotinilada (Biospa, Milão, Itália) e com Fast Red TR (Sigma) [na presença de Levamisol a 1 mM para inibir a fosfatase alcalina endógena] e contracorada com solução Hematoxilina (Sigma).
Marcação imuno-histoquímica com scFv-anticorpos, que carregam uma etiqueta FLAG, foi realizada como descrito anteriormente (vide, por exemplo, (Brack et al. 2006)). Em sumário, seções foram incubadas com os fragmentos scFv (concentração final, 2 a 10 pg/mL) e com o anticorpo M2 anti-FLAG monoclonal simultaneamente. Anticorpos ligados foram detectados com o anticorpo de imunoglobulina de coelho anticamundongo (Dakocytomatíon, Glostrup, Dinamarca) seguido por complexo de antifosfatase alcalina de fosfatase alcalina monoclonal de camundongo (Dakocytomation). Fast Red (Sigma) foi usado como substrato de fosfatase. e as seções foram contracoradas com hematoxilina (Sigma).
Todas as seções foram montadas com Glycergel (Dakocytomation, Glostrup, Dinamarca) e analisadas com um microscópio Axiovert S100 TV (Carl Zeiss, Feldbach, Suíça) usando o programa Axiovision (Carl Zeiss). Direcionamento in vivo com Anticorpo Anti-ED-A
O anticorpo anti-ED-A parental scFv foi marcado com o derivado fluoróforo infravermelho comercialmente disponível succinididil éster de ácido carboxílico Alexa Fluor 750 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fornecedor. O anticorpo marcado foi separado a partir do corante não reagido pela filtração em gel usando uma coluna PD-10 (GE Healthcare). O grau de marcação, estimado de acordo com o protocolo de marcação da Invitrogen, foi 5 moléculas de corante por molécula de anticorpo. O anticorpo scFv anti-ED-A parental marcado com Alexa 750 (em uma concentração final de 0,3 mg/ml) foi injetado (200 μΙ/camundongo, isto é 60 pg de anticorpo/camundongo) na veia da cauda de camundongos Sv190 de 3 semanas após injeção de células tumorais F9DR. Órgãos de camundongos foram extirpados 6 horas após injeção do anticorpo marcado e visualizados com um visualizador de fluorescência infravermelha construído laboratório (Birchler et al. 1999) equipado de uma lâmpada halógena de tungstênio, filtros de excitação e emissão específicos para Alexa 750, e uma câmera CCD monocro54 mática.
Biodistribuição de Diacorpo F8
O diacorpo F8 compreende os mesmos domínios VH e VL que anticorpo anti-ED-A F8, por exemplo, como empregado no formato de scFv. O diacorpo F8 e o anti-ED-A scFv F8 têm sequências ligadoras diferentes entre os domínios VH e VL. A sequência de aminoácidos do ligador de diacorpo F8 é GSSGG (SEQ ID NO: 28) (sequência nucleotídica: gggtccagtggcggt [SEQ ID NO: 29]). Por isso, a sequência ligadora de diacorpo F8 é cinco aminoácidos em tamanho, enquanto no anti-ED-A scFv F8 o ligador é 20 aminoácidos em tamanho (vide SEQ ID NO: 11). A redução do tamanho do ligador entre domínios VL e VH, significa que até certo ponto o pareamento intramolecular-intermolecular de domínios VL e VH é favorecido. Consequentemente, o domínio VL de um polipeptídeo F8 com maior probabilidade vai se parear com o domínio VH de outro polipeptídeo F8 do que deve parear-se com o domínio VH do mesmo polipeptídeo F8.
O diacorpo F8 foi expresso em células TG1 de E. coli como se segue: o DNA que codifica o diacorpo F8 foi introduzido em células TGI de E. coli eletrocompetentes usando eletroporação. As células de E. coli eletroporadas foram pré-cultivadas em 10 ml de meio 2YT, Amp, Glicose a 1 %. A pré-cultura foi diluída a 1:100 em 800 ml de meio 2YT, Amp, Glicose 0,1% e a cultura cultivada a uma densidade (DO 600 nm) de 0,6. Expressão do diacorpo F8 então foi induzida usando 1 mM de IPTG.
O diacorpo F8 expresso foi marcado com 125l como se segue: 10 pl de PBS estéril foram adicionados em um tubo iodogen (recoberto de 50 μΙ de iodogen 0,1 mg/ml em Clorofórmio) seguido pela adição de 2 μΙ de iodeto de sódio 125l (~200pCi) e incubação à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
400 μΙ do diacorpo F8 em uma DO 0,2 (~60 pg) então foram adicionados ao tubo de iodogen e incubados à temperatura ambiente por 25 minutos. 1/100 desta mistura foi coletado a fim de medir a radioatividade contida na mistura (tratada como 'ENTRADA’). O diacorpo F8 marcado então foi carregado em uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanho (PD10: Sephadex G-25 M, GE Healthcare) a fim de separar o diacorpo ioda do F8 do iodo livre. A radioatividade do diacorpo iodado coletado FS foi medida e a percentagem de iodo incorporada no diacorpo F8 calculada (CPM [contagens por minuto] de diacorpo iodado F8/CPM ENTRADA) para estar entre 30 e 40%.
Quatro camundongos carregando tumor F9 foram postos em Lugol por 2 dias (600 pl em 300 ml) a fim de bloquear a tireoide e cada camundongo injetado intravenosamente com 200 μΙ de diacorpo iodado F8 (aproximadamente 5 a 8 pg de diacorpo iodado F8 [18 pCi] por camundongo). Após 24 horas, os camundongos foram sacrificados e tumor, fígado, pulmão, baço, coração, rim, intestino, cauda e sangue foram removidos (mencionados coletivamente neste pedido neste contexto como 'tecidos' de camundongo) e usados para contagem radioativa. O nível de radioatividade em cada amostra de tecido foi medido usando um contador-gama Perkin. A 'SAÍDA' foi calculada dividindo a percentagem da dose injetada (em CPM) por peso de tecido (em gramas) (% de ID/g).
RESULTADOS
Identificação de Proteínas Diferencialmente Expressas e Variantes de Splice A metodologia proteômica química baseada em perfusão usada para a análise comparativa das proteínas acessíveis no fígado e em metástases hepáticas F9 (Terrana et al, 1987) é representada na Figura 1A. Estes tumores desenvolvem grandes focos metastáticos na superfície e dentro do fígado de camundongo (Figura 1B). Sob anestesia terminal, camundongos carregando tumor foram perfundidos com 15 ml de uma solução a 1,8 mM de sulfossuccinimidil-6-[biotina-amido] hexanoato (1 mg/ml) em PBS, pH 7,4, suplementado com Dextrana-40 a 10% como dilatador plasmático. O procedimento, que tipicamente durava 10 minutos, permitiu a remoção do sangue de todos os órgãos da circulação principal e biotinilação seletiva da proteína acessível, ambos nos aspectos luminal e abluminal dos vasos sanguíneos. Praticamente todos os vasos sanguíneos de metástases hepáticas F9 foram eficientemente e seletivamente marcados com este procedimento, como confirmado por marcação histoquímica com uma estreptavidina conjugada à fosfatase alcalina (Figura 1C). No fígado normal, os vasos sanguíneos foram fortemente marcados, mas marcação de alguns sinusoides também foi detectada, compativelmente com a função de filtro fisiológica do fígado (Figura 1C). A biotinilação in vivo foi extinta pela perfusão com uma solução contendo aminas primárias. Posteriormente, espécimes de metástases hepáticas foram extirpados do fígado, homogeneizados e usados para a recuperação de proteínas biotiniladas na presença do detergente forte SDS pela cromatografia por afinidade na resina estreptavidina (Figura 1A). A fim de minimizar o risco de difusão de proteínas metastáticas no fígado hospedeiro, o fígado in vivo biotinilado de camundongos saudáveis foi usado para o estudo da vasculatura de fígado normal. O uso do fígado hospedeiro do tumor F9 de camundongos também teria sido problemático por causa do pequeno tecido residual saudável e porque teria sido difícil excluir macroscopicamente a ausência de micrometástases. No total, amostras de 7 camundongos biotinilados saudáveis in vivo e 9 camundongos carregando tumor F9 biotinilados in vivo foram usadas para análise proteômica. Além disso, espécimes de 2 saudáveis e 3 camundongos carregando metástases não-biotiniladas foram usados como controles negativos. Procedimentos de lavagem estringentes e em digestão tríptica em resina de estreptavidina capturaram proteínas de metástases F9 e fígado normal (processado em paralelo) produziram uma coleção de peptídeos, que podem ser separados, identificados e comparados usando nano-HPLC e procedimentos espectrométricos de massa MALDI-TOF/TOF (Roesli et al., 2006).
No total, 1291 peptídeos diferentes foram identificados (>95% de nível de confiança em Mascot) que foram agrupados pelo programa Mascot em 480 conjuntos de peptídeos diferentes. Alguns destes conjuntos de peptídeos também foram encontrados em amostras de controle negativo de camundongos não-biotinilados (como carboxilases que carregam biotina endógena como um cofator, queratinas como contaminantes, ou proteínas muito abundantes como albumina sérica). De 435 conjuntos de peptídeos residuais identificados, 331 podem ser anotados pelo programa Mascot inequivocamente a uma proteína única, enquanto 104 conjuntos de peptídeos foram anotados a múltiplas proteínas (no total de 358). Na maioria dos casos, múl tiplas proteínas anotadas para mesmo conjunto peptídico pertencem a uma família proteica relacionada (por exemplo, imunoglobulinas) ou podem até ser as mesmas proteínas com entradas de banco de dados diferentes. De 435 conjuntos peptídicos diferentes, 117 foram exclusivamente encontrados em espécimes de metástase, 193 somente em espécimes de fígado saudáveis e 125 em ambos os tipos de tecidos. Por exemplo, os peptídeos que se combinam à fibronectina (Centro Nacional para Informação em Biotecnologia [NCBI] número de acesso P11276) foram encontrados em quatro espécimes de fígado saudáveis e oito espécimes de metástase.
Proteínas encontradas em ambos os espécimes de fígado saudável e metástase (por exemplo, fibronectina) podem estar presentes em níveis substancialmente diferentes nas duas amostras. Se este foi o caso, isto deve ser refletido no número de espécimes nos quais as proteínas foram detectadas, e/ou no número de peptídeos (bem como intensidade de sinal de peptídeo normalizada; (Scheurer et al. 2005, Scheurer et al. 2005)) observado em amostras de fígado e metástase. Por exemplo, 38 peptídeos trípticos de fibronectina (número de acesso NCBI P11276) foram encontrados somente em espécimes de metástase, enquanto um peptídeo foi encontrado somente em espécimes de fígado saudável. Onze peptídeos foram encontrados em ambos os tipos de espécimes.
A abundância notável de peptídeos derivados de fibronectina detectados em metástases hepáticas, apesar do fato que fígado é o sítio de biossíntese de fibronectina, incitou-se a investigar diferenças na abundância relativa de peptídeos e a superexpressão de domínios alternativamente de splicing. A tabela 1 lista todos os peptídeos de fibronectina identificados na análise proteômica.
Fibronectina de camundongo, contém dois extradomínios globulares Tipo III que podem sofrer splicing alternativo: ED-A e ED-B (ffrenchConstant 1995, Hynes 1990, Kaspar et al. 2006). Além disso, o segmento de IIICS sofrem diferentes padrões de splicing em camundongos e seres humanos. De maneira interessante, três peptídeos derivados de ED-A bem como o peptídeo derivado de IIICS foram somente observados nas amostras turno rais.
Os peptídeos derivados de ED-B não seriam visíveis nesta análise devido ao fato que ED-B não contém resíduo de lisina e duas argininas dando origem a peptídeos que são demasiado grandes no tamanho para detecção. A Figura 2A mostra a posição dos peptídeos identificados nos espécimes tumorais (Tumor) e espécimes de fígado saudável (Normal) na estrutura de domínio de fibronectina. A figura 2B mostra a intensidade relativa de sinais de MS normalizados para dois peptídeos derivados de fibronectina: IAWESPQGQVSR (SEQ ID NO: 16) que está localizado no domínio ED-A e FLTTTPNSLLVSWQAPR (SEQ ID NO: 15), que está localizado no domínio 14. O último peptídeo foi mais abundante nos espécimes de metástase, mas foi claramente detectável também no equivalente de fígado normal. Pelo contraste, peptídeos derivados de ED-A deram sinais fortes nas amostras de metástase, mas foram completamente indetectáveis (isto é, > 100 vezes sinal menor) no fígado normal.
Imuno-histoquímica
A discriminação mais notável entre estruturas hepáticas e neovasculatura metastática foi observada nos domínios ED-A e ED-B da fibronectina, em ambos os casos, uma forte e específica marcação dos vasos sanguíneos metastáticos foi observada, enquanto o fígado normal e praticamente todos os órgãos normais (exceção feita para o endométrio na fase proliferativa e alguns vasos dos ovários) classificados negativos em sua análise imuno-histoquímica (Figura 3A). Importantemente, ED-A também foi encontrado sendo fortemente expresso na neovasculatura de metástases pulmonares e metástases hepáticas humanas (Figura 4).
Direcionamente in vivo
A fim de testar a utilidade de ED-A como um alvo para ligante com base no direcionamento vascular de metástases, um experimento de direcionamente in vivo usando visualização por fluorescência próxima ao infravermelho foi realizado. O anticorpo scFv anti-ED-A parental foi marcado com Alexa Fluor 750 e injetado intravenosamente em camundongos carregando metástases F9. Visualização por imagem de fluorescência próxima ao infravermelho dos órgãos extirpados revelou um notável acúmulo do agente de direcionamento nas lesões metastáticas (Figura 3B).
Seleção de Anticorpos anti-ED-A
Análise por BIAcore 1
A análise por BIAcore produziu um gráfico para cada anticorpo anti-ED-A que foi analisado para deduzir a afinidade de um anticorpo para um antígeno como se segue: O eixo x de cada gráfico corresponde ao tempo e o eixo y corresponde a Unidades de Ressonância (uma medida que indica afinidade de ligação do anticorpo testado para o antígeno recoberto no chip BIAcore). Cada gráfico mostrou 3 picos e 1 vale que correspondem a modificações de tampão e são, por isso, irrelevantes para interpretação dos resultados.
A parte ascendente de cada gráfico representa a fase de associação. Curva mais íngreme nesta parte do gráfico, mais rápida a associação do anticorpo com o antígeno. A parte descedente de cada gráfico representa a fase de dissociação do anticorpo do antígeno. Curva mais plana nesta parte do gráfico, mais lenta a dissociação do anticorpo do antígeno.
Anticorpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 todos mostraram uma curva de dissociação mais plana do que o anticorpo anti-ED-A parental do qual foram derivados, indicando que se ligam a EDA, e portanto também a A-FN, com uma maior afinidade que o anticorpo antiED-A parental. Os gráficos para anticorpos E5, F1, F8 e H1 mostraram as curvas de dissociação mais planas de todos os anticorpos anti-ED-A testados. As curvas de associação de anticorpos H1, C5, D5, E5, C8, F8 e F1 foram mais planas do que aquelas observadas para o anticorpo anti-ED-A parental enquanto a curva de associação observada para anticorpos B2, B7, E8 e G9 foi tão íngreme como a curva de associação observada para o anticorpo anti-ED-A parental. Entretanto, como os sobrenadantes bacterianos de células TG-1 de E. coli induzidas por IPTG foram usados para análise por BIAcore de anticorpos H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9, a concentração das amostras de anticorpo testadas foi desconhecida mas ainda mais provavelmente menor que a concentração da amostra de anticorpo an ti-ED-A parental usada para comparação. Consequentemente, a curva de associação de anticorpos H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 pode ser artificialmente baixa devido à baixa concentração de anticorpo nas amostras usadas para a análise por BIAcore. Entretanto, como a concentração não afeta significativamente a dissociação de um anticorpo do seu antígenoalvo na análise por BIAcore, as curvas de dissociação planas observadas para anticorpos H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 mostram que estes anticorpos se ligam a ED-A com pelo menos um igual, e provavelmente uma afinidade mais alta, do que o anticorpo anti-ED-A parental. Consequentemente, os anticorpos anti ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 são extremamente prováveis para dar origem aos mesmos ou melhores resultados quando usados nos mesmos estudos in vivo e de imunohistoquímica conduzidos usando o anticorpo anti-ED-A parental como descrito em outro lugar neste pedido. Os dados in vivo e imuno-histoquímicos obtidos usando o anticorpo anti-ED-A parental, por isso, fornece evidência que os anticorpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 podem ser usados para o tratamento de metástases tumorais.
Análise por BIAcore 2
Os valores de kon, koff e KD de cada anticorpo anti-ED-A foram avaliados usando o programa BIAevaluation. Os valores kon, koff θ de KD para o anticorpo anti-ED-A parental e anticorpos anti-ED-A B2, C5, D5, C8, F8, B7 e G9 para o antígeno 11A12 são detalhados na Tabela 3. Anticorpos antiED-A de B2, C5, D5, C8, F8, B7 e G9 todos têm valores melhores de KD para o antígeno 11A12 do que o anticorpo anti-ED-A parental do qual foram derivados, indicando que se ligam a ED-A, e, portanto também a A-FN, com uma maior afinidade do que o anticorpo anti-ED-A parental. Consequentemente, anticorpos anti-ED-A B2, C5, D5, C8, F8, B7 e G9 são extremamente prováveis de dar origem aos mesmos ou melhores resultados quando usados no mesmo in vivo e os estudos de imuno-histoquímica conduzidos usando o anticorpo anti-ED-A parental como descrito em outro lugar neste pedido. Os dados in vivo e imuno-histoquímicos obtidos usando o anticorpo anti-ED-A parental, portanto, fornecem evidência que anti-ED-A B2, C5, D5,
C8, F8, B7 e G9 podem ser usados para o tratamento de metástases tumorais.
Biodistribuição de Diacorpo F8
A percentagem (%) da dose injetada (ID) de diacorpo F8 marcado com I125 (iodado) detectado por grama (g) de tecido de camundongo foi muito similar para fígado, pulmão, baço, coração, rim, intestino, cauda e sangue e todos, com a exceção do rim, mostraram ID/g de menos de 2% (Figura 8). Ao contrário, os tumores F9 contiveram em média aproximadamente quatro vezes mais de ID do que qualquer um dos outros tecidos de camundongo analisados (Figura 8). Isto demonstra que diacorpo F8 foi seletivamente dirigido aos tumores de camundongo F9. A percentagem de ID detectada em outros tecidos representa mais provavelmente a carga de fundo de diacorpo F8 presente nos camundongos ou marcação não-específica de outros tecidos de camundongo. Como descrito em outro lugar neste pedido, o experimento de biodistribuição foi realizado usando quatro camundongos e embora a percentagem de ID detectada por tecido de camundongo tenha variado (vide barras de erro na Figura 8) a percentagem do diacorpo F8 detectado nos tumores F9 foi constantemente mais alta do que em qualquer um dos outros tecidos de camundongo testados.
O estudo de biodistribuição foi conduzido em tumores primários F9, e os resultados indicam que os anticorpos anti-ED-A conforme a presente invenção são seletivamente dirigidos ao tecido tumoral in vivo. Os resultados fornecem indicação adicional que os anticorpos anti-ED-A da presente invenção podem ser usados para alcançar os mesmos ou melhores resultados quando usados nos mesmos in vivo e os estudos imuno-histoquímicos conduzidos usando um anticorpo anti-ED-A parental como descrito em outro lugar neste pedido.
Sequenciamento
Anticorpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 são todos anticorpos scFv e foram sequenciados usando métodos convencionais. A sequência nucleotídica do anticorpo anti-ED-A H1 é mostrada na Figura 6. A sequência de aminoácidos do anticorpo anti-ED-A H1 é mos trada na Figura 7.
Sequências nucleotídicas preferenciais que codificam VH e/ou VL de anticorpos anti-ED-A B2, C5, D5, E5, CS, F8, F1, B7, E8 e G9 são idênticas a sequências nucleotídicas que codificam VH e/ou VL do anticorpo anti-ED-A H1, exceto aquelas sequências nucleotídicas que codificam CDR1s de cadeia leve (VL) e pesada (VH) de H1 são substituídas com as sequências nucleotídicas que codificam as CDR1s de cadeia leve (VL) e pesada (VH) listadas na Tabela 2 para o respectivo anticorpo.
Algumas sequências nucleotídicas preferenciais que codificam os domínios VH e/ou VL do diacorpo anti-ED-A F8 são idênticas às sequências nucleotídicas que codificam domínios VH e/ou VL do anticorpo anti-EDA H1, exceto aquelas sequências nucleotídicas que codificam CDRIs da cadeia leve (VL) e pesada (VH) de H1 são substituídas com as sequências nucleotídicas que codificam CDRIs da cadeia leve (VL) e pesada (VH) listadas na Tabela 2 para o anticorpo anti-ED-A F8. Uma sequência nucleotídica preferencial que codifica a ligação do ligador aos domínios VH e VL do diacorpo anti-ED-A F8 é gggtccagtggcggt (SEQ ID NO: 29).
Anticorpos anti-ED-A B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 e G9 têm sequências de aminoácidos idênticas ao anticorpo anti-ED-A H1, exceto aquelas sequências de aminoácidos de CDRIs de H1 da cadeia leve (VL) e pesada (VH) são substituídas com as sequências de aminoácidos de CDRIs da cadeia leve (VL) e pesada (VH) listadas na Tabela 2 para o respectivo anticorpo. As sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de diacorpo anti-ED-A F8 são idênticas às sequências de aminoácidos do anticorpo antiED-A H1, exceto aquelas sequências de aminoácidos de CDRIs de H1 da cadeia leve (VL) e pesada (VH) são substituídas com as sequências de aminoácidos de CDRIs da cadeia leve (VL) e pesada (VH) listadas na Tabela 2 para o anticorpo anti-ED-A F8, e a sequência de aminoácidos do ligador em H1 é substituída com a sequência de aminoácidos ligadora GSSGG (SEQ ID NO: 28). A sequência de aminoácidos do domínio VH de anticorpo antiED-A B2 (SEQ ID NO: 21) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 23 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH de anticorpo antiED-A C5 (SEQ ID NO: 41) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 43 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo antiED-A D5 (SEQ ID NO: 51) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 53 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo antiED-A E5 (SEQ ID NO: 61) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 63 é substituída pela CDR1 de VH deH1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH de anticorpo antiED-A C8 (SEQ ID NO: 71) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 73 é substituída pela CDR1 de VH deH1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo antiED-A F8 (SEQ ID NO: 81) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 83 é substituída pela CDR1 de VH de H1. Os domínios VH do diacorpo anti-ED-A F8 têm a mesma sequência de aminoácidos que o domínio VH do anticorpo anti-ED-A scFv F8 (isto é, SEQ ID NO: 81).
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo antiED-A F1 (SEQ ID NO: 91) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 93 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo antiED-A B7 (SEQ ID NO: 101) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 103 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti
ED-A E8 (SEQ ID NO: 111) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 113 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo antiED-A G9 (SEQ ID NO: 31) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 33 é substituída pela CDR1 de VH de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A B2 (SEQ ID NO: 22) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 26 é substituída pela CDR1 deVLdeHI.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A C5 (SEQ ID NO: 42) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 46 é substituída pela CDR1 deVL deH1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A D5 (SEQ ID NO: 52) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 56 é substituída pela CDR1 de VL deH1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A E5 (SEQ ID NO: 62) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 66 é substituída pela CDR1 deVLdeHI.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A C8 (SEQ ID NO: 72) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 76 é substituída pela CDR1 de VL deH1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A F8 (SEQ ID NO: 82) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 86 é substituída pela CDR1 de VL de H1. Os domínios VL do diacorpo anti-ED-A F8 têm a mesma sequência de aminoácidos que o domínio VL do anticorpo anti-ED-A
F8 (isto é, SEQ ID NO: 82).
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A F1 (SEQ ID NO: 92) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 96 é substituída pela CDR1 de VL de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A B7 (SEQ ID NO: 102) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 106 é substituída pela CDR1 de VL de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A E8 (SEQ ID NO: 112) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 116 é substituída pela CDR1 de VL de H1.
A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo antiED-A G9 (SEQ ID NO: 32) é idêntica à sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-ED-A H1 exceto que SEQ ID NO: 36 é substituída pela CDR1 de VL de H1.
Opcionalmente, o aminoácido na posição 5 do domínio VH de anticorpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9 pode ser um resíduo leucina (L) em vez de um resíduo valina (V) como mostrado na Figura 7A. Além disso, ou alternativamente, o aminoácido na posição 18 do domínio VL de anticorpos anti-ED-A H1, B2, 05, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9 pode ser um resíduo arginina (R) em vez de um resíduo lisina (K) como mostrado na Figura 70.
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Tabela 1
Peptídeos de Fibronectina Identificados em Fígado Normal e/ou Metástase
Posição na Seq.
Sequência peptídica --------------Início Final
HYQINQQWER 59 68 6
VGDTYERPK 109 117 4
HALQSASAGSGS FTDVR 274 290 7
IGDQWDK 480 486 1
TFYQIGDSWEK 568 573 1
WKEATIPGHLNSYTIK 654 669 2
EATIPGHLMSYTIK 656 669 1
GLTPGVIYEGQLISIQQYGHR 670 690 7
WSRPQAPITGYR 830 841 2 3
SDNVPPPTDLQFVELTDVK 903 921 3
VTIMWTPPDSWSGYR 922 937 8
VEVLPVSLPGEHGQR 938 952 8
NTFAEITGLS PGVTYLFK 958 975 7
VFAVHQGR 976 983 7
TVLVTWTPPR 1011 1020 2 3
QYNVGPLASK 1040 1049 4
MLQPGSEYTVTLVAVK 1054 1069 6
ATGVFTTLQPLR 1077 1038 1 8
LGVRPSQGGEAPR 1116 1128 7
WTPLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWER 1169 1196 3
STTPDITGYR 1197 1206 7
VTWAPPPSIELTNLLVR 1375 1391 2 7
TGLDS PTGFDSS DITANSFTVHWVAPR 1446 1472 4
APITGYIIR 1473 1481 1 8
HHAEHSVGRPR 1482 1492 1
EESPPLIGQQATVSDIPR 1525 1542 8
ITYGETGGNSPVQEFTVPGSK 1570 1590 2 8
SPVQEFTVPGSK 1579 1590 6
STATINNIKPGADYTITLYAVTGR 1591 1614 5
Posição na Seq.
Sequência peptídica ---------------Início Final
GDSPASSKPVSIMYK 1615 1629 4
TEIDKPSQMQVTDVQDNSISVR 1630 1651 8
WLPSTSPVTGYR 1652 1663 7
TASPDQTEMTIEGLQPTVEYWSVYAQNR 1679 1707 7
2MGESQPLVQTAVTTIPAPTNLK 1708 1819 3
3ngesqplvqtavtmidrpk 1708 1726 1
3iawespqgqvsr 1740 1751 8
3vtysspedgir 1754 1764 1
FSQVTPTSFTAQWIAPSVQLTGYR 1820 1843 1 5
YEVSVYALK 1878 1836 2
TKTETITGFQVDAIPANGQTPVQR 1926 1949 1 2
TETITGFQVDAIPANGQTPVQR 1928 1949 3
sytitglqpgtdyk 1957 1970 7
IHLYTLNDNAR 1971 1981 7
SSPVIIDASTAIDAPSNLR 1982 2000 3 8
FLTTTPNSLLVSWQAPR 2001 2017 4 5
ITGYIIK 2020 2026 5
YEKPGSPPR 2027 2035 6
4PYLPNVDEEVQIGHVPR 2165 2181 7
GVTYNIIVEALQMQR 2255 2269 4 7
RPGAAEPSPDGTTGHTYMQYTQR 2425 2447 2
1 Números indicam em quantos dos 6 camundongos saudáveis biotinilados in vivo ou os 8 camundongos carregando metástases biotinilados in vivo o peptídeo foi identificado nas amostras de tecido correspondentes. Todos os peptídeos os quais são listados aqui foram anotados pelo programa Mascot para entradas P11276 no banco de dados de fibronectina, Q3UHL6 ou Q3TCF1.
2 Esse peptídeo cobre uma porção da sequência de fibronectina antes E após o domínio ED-A, indicando a presença de uma isoforma da fibronectina (EDA’).
3 Esses peptídeos combinam-se com a sequência do domínio de ED-A (po sições de Seq. 1721 a 1810).
4 Esse peptídeo combina-se com o intervalo da sequência de IIICS (posições de Seq. 2082 a 2201).
Tabela 2
Sequências nucleotídicas e de aminoácidos de CDRIs da cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) dos anticorpos maduros por afinidade à anti-ED-A
Anticorpo CDRI (VH) CDRI (VL)
Hl CCG CGG AGG P R R (SEQ ID MO: 3) TCT GCG TGG SAW (SEQ ID NO: 6)
B2 GCG GCT AAG A A K (SEQ ID NO: 23) GTG GCT TTT V A F (SEQ ID NO: 26)
C5 CCG ATT ACT pit /.ςρη ιη νη· TTG CAT TTT L H F (SEQ ID NO: 46)
D5 GTG ATG AAG V Μ K (SEQ ID NO: 53) AAT GCT TTT N A F (SEQ ID NO: 56)
E5 ACT GGT TCT T G S (SEQ ID NO: 63) CTT GCG CAT L A H (SEQ ID NO: 66)
C8 CTT CAG ACT LQT(SEQIDNO: 73) CTT CCT TTT L P F (SEQ ID NO: 76)
F8 CTG TTT ACG L F T (SEQ ID NO: 83) ATG CCG TTT Μ P F (SEQ ID NO: 86)
Fl TAG GCG CGT Q(Amber) A R (SEQ ID NO: 93) GCG CCT TTT A P F (SEQ ID NO: 96)
B7 CAT TTT GAT HFD(SEQ ID NO: 103) CTG GCT TTT LAF(SEQIDNO: 106)
E8 GAT ATG CAT D Μ H (SEQ IDNO: 113) TCG TCT I I I SS F (SEQ ID NO: 116)
G9 CAT ATG CAG Η M Q (SEQ ID NO: 33) ACT GCT TTT T A F (SEQ ID NO: 36)
Tabela 3
Dados de Avaliação por BIAcore
Anticorpo kon(1/Ms) 2,5x105 kOff (1/s) KD(M)
Anticorpo Anti-ED-A Parental 0,02 ~1 x 10’7
Anticorpo kon (1/Ms) 2,5 x 105 koff (1/s) Kd(M)
B2 3,8x105 7,54 x 10'3 ~2x 10'8
C5 3,04 x 105 9,23 x 10 3 ~3x 10'8
D5 4,53 x 105 7,6x10’3 -1,7 x 10‘8
08 3,8x105 5,3x10’3 -1,4x10’8
F8 4,65 x 105 1,4x10’3 -3,1 x 10’9
B7 2,67 x 105 4,5x10'3 -1,68x10’8
G9 3,6x105 7,54x10’3 -2,09 x 10‘9

Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma Extradomínio-A (ED-A) de fibronectina e/ou ao ED-A de fibronectina, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais, em que o anticorpo é conjugado a uma molécula que apresenta atividade biocida ou citotóxica, ou a um radioisótopo, e em que o anticorpo compreende um domínio VH e um domínio VL, em que o domínio VH compreende uma estrutura e um grupo de regiões de determinação de complementaridade HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que:
    HCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:83,
    HCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4, e
    HCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5; e em que o domínio VL compreende uma estrutura e um grupo de regiões de determinação de complementaridade LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que:
    LCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:86,
    LCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:7, e
    LCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:8.
  2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura de domínio VH e a estrutura de domínio VL são estruturas de linhagem germinativa humana.
  3. 3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o domínio VH mostrado na SEQ ID NO: 81, ou compreende o domínio VH mostrado na SEQ ID NO: 81, com exceção de que o aminoácido na posição 5 do domínio VH de SEQ ID NO: 81 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo leucina (L) ao invés de um resíduo valina (V).
  4. 4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antíge
    Petição 870190049682, de 28/05/2019, pág. 7/19 no do mesmo (i) compreende o domínio VL mostrado na SEQ ID NO: 82;
    (ii) compreende o domínio VL mostrado na SEQ ID NO: 82, com exceção de que o aminoácido na posição 18 do domínio VL de SEQ ID NO: 82 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo arginina (R) ao invés de um resíduo lisina (K), ou (iii) compreende um domínio VL compreendendo aminoácidos 1 a 108 de SEQ ID NO: 82, em que o aminoácido na posição 18 de SEQ ID NO: 82 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo arginina (R) ao invés de um resíduo lisina (K).
  5. 5. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma Extradomínio-A (ED-A) de fibronectina e/ou ao ED-A de fibronectina, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais, em que o anticorpo é conjugado a uma molécula que apresenta atividade biocida ou citotóxica, ou a um radioisótopo, em que o referido anticorpo compreende:
    (i) um domínio VH compreendendo sequência de aminoácidos SEQ ID NO:81, em que o aminoácido na posição 5 da SEQ ID NO:81 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo leucina (L) ao invés de um resíduo valina (V); e (ii) um domínio VL compreendendo aminoácidos 1 a 108 de SEQ ID NO: 82, em que o aminoácido na posição 18 de SEQ ID NO: 82 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo arginina (R) ao invés de um resíduo lisina (K).
  6. 6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia única Fv ou é um diacorpo.
  7. 7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio VH é conjugado ao domínio VL através de um ligante de peptídeo.
  8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido ligante de peptídeo compreende 5 a 25 aminoácidos.
    Petição 870190049682, de 28/05/2019, pág. 8/19
  9. 9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido ligante de peptídeo compreende 5 aminoácidos.
  10. 10. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma Extradomínio-A (ED-A) de fibronectina e/ou ao ED-A de fibronectina, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um produto de diagnóstico para diagnosticar metástases tumorais, em que o anticorpo compreende um domínio VH e um domínio VL, em que o domínio VH compreende uma estrutura e um grupo de regiões de determinação de complementaridade HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que:
    HCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:83,
    HCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4, e
    HCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5; e em que o domínio VL compreende uma estrutura e um grupo de regiões de determinação de complementaridade LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que:
    LCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:86,
    LCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:7, e
    LCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:8.
  11. 11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fa- to de que a estrutura de domínio VH e a estrutura de domínio VL são estruturas de linhagem germinativa humana.
  12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o domínio VH mostrado na SEQ ID NO: 81, ou compreende o domínio VH mostrado na SEQ ID NO: 81, com exceção de que o aminoácido na posição 5 do domínio VH de SEQ ID NO: 81 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo leucina (L) ao invés de um resíduo valina (V).
  13. 13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo
    Petição 870190049682, de 28/05/2019, pág. 9/19 (i) compreende o domínio VL mostrado na SEQ ID NO: 82;
    (ii) compreende o domínio VL mostrado na SEQ ID NO: 82, com exceção de que o aminoácido na posição 18 do domínio VL de SEQ ID NO: 82 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo arginina (R) ao invés de um resíduo lisina (K), ou (iii) compreende um domínio VL compreendendo aminoácidos 1 a 108 de SEQ ID NO: 82, em que o aminoácido na posição 18 de SEQ ID NO: 82 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo arginina (R) ao invés de um resíduo lisina (K).
  14. 14. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma Extradomínio-A (ED-A) de fibronectina e/ou ao ED-A de fibronectina, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um produto de diagnóstico para diagnosticar metástases tumorais, em que o referido anticorpo compreende:
    (i) um domínio VH compreendendo sequência de aminoácidos SEQ ID NO:81, em que o aminoácido na posição 5 da SEQ ID NO:81 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo leucina (L) ao invés de um resíduo valina (V); e (ii) um domínio VL compreendendo aminoácidos 1 a 108 de SEQ ID NO: 82, em que o aminoácido na posição 18 de SEQ ID NO: 82 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo arginina (R) ao invés de um resíduo lisina (K).
  15. 15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a
    14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia única Fv ou é um diacorpo.
  16. 16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a
    15, caracterizado pelo fato de que o domínio VH é conjugado ao domínio VL através de um ligante de peptídeo.
  17. 17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido ligante de peptídeo compreende 5 a 25 aminoácidos.
  18. 18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido ligante de peptídeo compreende 5 aminoácidos.
    Petição 870190049682, de 28/05/2019, pág. 10/19
  19. 19. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma Extradomínio-A (ED-A) de fibronectina e/ou ao ED-A de fibronectina, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para entrega, à neovasculatura de metástases tumorais, de uma molécula conjugada ao anticorpo, em que a molécula apresenta atividade biocida ou citotóxica, ou é um radioisótopo, e em que o anticorpo compreende um domínio VH e um domínio VL, em que o domínio VH compreende uma estrutura e um grupo de regiões de determinação de complementaridade HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que:
    HCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:83,
    HCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4, e
    HCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5; e em que o domínio VL compreende uma estrutura e um grupo de regiões de determinação de complementaridade LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que:
    LCDR1 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:86,
    LCDR2 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:7, e
    LCDR3 tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:8.
  20. 20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fa- to de que a estrutura de domínio VH e a estrutura de domínio VL são estruturas de linhagem germinativa humana.
  21. 21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o domínio VH mostrado na SEQ ID NO: 81, ou compreende o domínio VH mostrado na SEQ ID NO: 81, com exceção de que o aminoácido na posição 5 do domínio VH de SEQ ID NO: 81 de acordo com o sistema de Kabat é um resíduo leucina (L) ao invés de um resíduo valina (V).
  22. 22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo
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