KR20100016094A - 종양 전이암의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ｅｄ―ａ 항원 - Google Patents

종양 전이암의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ｅｄ―ａ 항원 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 전이암을 치료하기 위한, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형에 결합하는 결합원에 관한 것이다.
종양 전이, 피브로넥틴, ED-A, 신생 혈관

Description

종양 전이암의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ＥＤ―Ａ 항원 {THE ED-A ANTIGEN OF FIBRINOGEN IS ASSOCIATED WITH THE NEOVASCULATURE OF TUMOUR METASTASES}
본 발명은 전이암의 검출 및 치료, 즉 1차 종양 부위에서 떨어진 부위에서 발생한 2차 종양의 검출 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원(binding member), 특히 피브로넥틴의 도메인 ED-A에 결합하는 결합원의 용도를 포함한다.
암 관련 사망의 대부분은 질병의 전이 분포와 관계가 있고 (문헌 [Hanahan and Weinberg 2000]), 왕성한 신생혈관은 공격적인 종양 전이암의 특징적인 특성이다.
종양은 양성 또는 악성으로 분류된다. 악성 종양은 1차 부위 (1차 종양)로부터 신체의 다른 부분으로 전파될 수 있는 반면에, 양성 종양은 전파되지 않는다. 악성 종양은 침투 및 전이에 의해 그의 1차 부위로부터 전파될 수 있다. 전이의 결과로 형성된 종양은, 예를 들어 전이암, 2차 종양, 전이적 병변 또는 전이적 병소로 알려져 있다.
혈관신생은 존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장되는 것을 말한다. 종양은 다양한 성장 인자 (예를 들어, 혈관 내피 성장 인자)의 분비를 통해 혈관신생을 유도할 수 있다. 종양 혈관신생은 종양이 직경 수 밀리미터를 넘어 성장가능하게 하며, 또한 이는 종양 전이를 위한 필수 조건이다. 혈관신생의 결과로 형성된 신규한 혈관들은 종양 또는 종양 전이암의 신생혈관을 형성한다.
피브로넥틴 (FN)은 당단백질로, 다양한 정상 조직 및 체액에서 널리 발현된다. 이는 세포외 기질 (ECM) 성분으로, 세포 부착, 세포 이동, 지혈, 혈전증, 상처 치유, 조직 분화 및 암으로의 형질전환을 비롯한 많은 생물학적 과정에서 소정의 역할을 한다.
상이한 FN 이소형은 1차 전사체인 FN 전-mRNA의 3군데 영역 (ED-A, ED-B, IIICS)에서의 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다 (이 과정은 시토카인 및 세포외 pH에 의해 조정됨) (문헌 [Balza 1988]; [Carnemolla 1989]; [Borsi 1990]; [Borsi 1995]). 피브로넥틴은 선택적 스플라이싱을 겪을 수 있는 2종의 유형-III 구형 엑스트라-도메인: ED-A 및 ED-B을 함유한다 (문헌 [ffrench-Constant 1995, Hynes 1990, Kaspar et al. 2006]). 마우스 피브로넥틴 및 인간 피브로넥틴의 ED-A는 96.7％ 동일하다 (두 개의 90 아미노산 서열 중 3개의 아미노산 만이 상이함, 도 5 참조).
피브로넥틴의 ED-A의 발현은 종양 세포 및 고형 종양에서 mRNA 수준 (예를 들어, 문헌 [Jacobs et al. 2002], [Matsumoto et al. 1999], [Oyama et al. 1989], [Tavian et al. 1994] 참조), 단리된 단백질 수준 (문헌 [Borsi et al. 1987]) 및 면역조직화학적 수준 (문헌 [Borsi et al, 1998], [Heikmheimo et al. 1991], [Koukoulis et al. 1993], [Koukoulis et al. 1995], [Lohi et al. 1995], [Scarpino et al. 1999])으로 보고되어 있다. 또한 문헌 [Borsi et al., 1998, Exp Cell Res, 240, 244-251]에서는 ED-A가 1차 종양의 신생-혈관에 존재하고 있음이 보고되어 있다. 그러나, 이전에는 ED-A가 종양 전이암의 신생-혈관과 관련이 있다는 어떤 징후도 드러난 바가 없었다.
본 발명자들은 본원에서, 피브로넥틴의 ED-A가 종양 전이암의 신생혈관에서 선택적으로 발현됨을 보여준다. 종양 혈관은 정맥내로 투여되는 치료제에 매우 접근하기 쉬우므로 (문헌 [Neri and Bicknell 2005, Rybak et al. 2006, Thorpe 2004, Trachsel and Neri 2006]), A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체 분자와 같은 결합 분자는 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 치료용 약제를 제조하는데 사용할 수 있는 신규한 작용제를 대표한다. 종양 신생-혈관의 치료 (종양 혈관 표적화)는 종양 전이암을 치료하기 위한 유망한 접근법이다. 종양 혈관 표적화는 종양 그 자체 내의 혈관을 파괴하고 혈류를 감소시켜 종양으로부터 산소 및 영양소를 박탈함으로써, 종양 세포사를 유발하는 것을 목표로 한다.
본원에서는, 종양 전이암의 새롭게 형성된 혈관을 선택적으로 인식하는 항-ED-A 항체를 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 치료용 약제를 제조하기 위한 피브로넥틴 (A-FN)의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자의 용도에 관한 것이다. 다른 측면에서 본 발명은 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 치료용 약제를 제조하기 위한 피브로넥틴의 ED-A에 결 합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자의 용도에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 결합원에 접합된 분자를 종양 전이암의 신생혈관으로 전달하기 위한 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자의 용도에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 결합원에 접합된 분자를 종양 전이암의 신생혈관으로 전달하기 위한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자의 용도에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 결합원은 분자 전달용 약제를 제조하는데 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 종양 전이암을 진단하는데 사용되는 진단 제품을 제조하기 위한 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자의 용도에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 종양 전이암을 진단하는데 사용되는 진단 제품을 제조하기 위한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자의 용도에 관한 것이다.
또한, 일 측면에서 본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자를 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에서 결합원의 존부를 판단하는 단계를 포함하고,
인간 또는 동물에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에 결합원이 위치한다는 것은 종양 전이암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 종양 전이암을 검출 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서 본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자를 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에서 결합원의 존부를 판단하는 단계를 포함하고,
인간 또는 동물에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에 결합원이 위치한다는 것은 종양 전이암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 종양 전이암을 검출 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 일 측면에서, 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자를 포함하는 약제를 치료상 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 종양 전이암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자를 포함하는 약제를 치료상 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 종양 전이암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 분자에 접합된, 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자를 인간 또는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서 종양 전이암의 신생혈관에 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 분자에 접합된, 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들어 항체 분자를 인간 또는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서 종양 전이암의 신생혈관에 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 결합원은 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9, 또는 그의 변이체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는, 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 또는 G9, 또는 그의 변이체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는, 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 항체 F8 또는 그의 변이체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체이다.
본 발명의 결합원은 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트, 또는 상기 개시한 H 및/또는 L CDR 세트 내에 10개 이하, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트 내에 10개 이하, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 항체 F8의 H 및/또는 L CDR 세트 내에 10개 이하, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 항체 F8의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함한다.
치환은 잠재적으로 CDR 세트 내의 임의의 잔기에서 있을 수 있고, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합원은 상기한 바 와 같은 CDR, 예를 들어 CDR3, 또한 임의로는 CDR1 및 CDR2를 하나 이상 포함하여 CDR 세트를 형성할 수 있다.
본 발명의 결합원은 또한 항체 분자, 예를 들어 인간 항체 분자를 포함할 수 있다. 결합원은 정상적으로는 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 결합원의 VH 도메인은 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. 각각의 VH 및 VL 도메인 내에는 상보성 결정 영역 ("CDR"), 및 프레임워크 영역 ("FR")이 존재한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. 이와 달리, 또는 이와 함께 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수도 있다. 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 VH 및 VL 도메인 및 CDR을 본원에 기재한다. 본원에서 개시하는 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트, HCDR 세트, 및 LCDR 세트는 본 발명에 사용되는 결합원의 측면 및 실시양태들을 대표한다. 본원에서 기재하는 바와 같은 "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 말하고, LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 말한다. 달리 언급이 없으면, "CDR 세트"에는 HCDR 및 LCDR이 포함된다.
본 발명의 결합원은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113이며, 임의로 HCDR2는 서열 4이고/이거나 HCDR3은 서열 5이다. 바람직하게는, HCDR1은 서열 23, 33, 43, 53, 73, 83 또는 103이다. 가장 바람직하게는, HCDR1은 서열 83이다.
이하에서 추가로 논의하는 바와 같이 VH 또는 VL 도메인은 단독으로도 항원과 결합하는데 사용될 수 있지만, 전형적으로 VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원-결합 부위를 제공한다. 따라서, 본 발명의 결합원은 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116이고, 임의로 LCDR2는 서열 7이고/이거나 LCDR3은 서열 8이다. 바람직하게는, LCDR1은 서열 26, 36, 46, 56, 76, 86 또는 106이다. 가장 바람직하게는, LCDR1은 서열 86이다.
일 측면에서, 본 발명의 결합원은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 단리된 항체 분자로, 여기서 VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 세트를 포함하고, VL 도메인은 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 프레임워크를 포함하며, 여기서
HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고,
HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고,
HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고,
LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고,
LCDR2는 서열 7의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR3은 서열 8의 아미노산 서열을 갖는다.
항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트는 프레임워크 (예를 들어, 인간 프레임워크)와 합체되어 본 발명에서 사용하기 위한 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 영역은 인간 생식세포계열(germline) 유전자 분절 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 프레임워크는 생식세포계열일 수 있으며, 이로 인해 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포계열 프레임워크 내의 동등한 위치의 잔기와 일치되도록 바뀐다. 본 발명의 결합원은 인간 생식세포계열 프레임워크, 예를 들어 DP47 내에 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 항체 분자일 수 있다. 정상적으로, 결합원은 또한, 예를 들어 인간 생식세포계열 프레임워크 내에 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. VL 도메인의 인간 생식세포계열 프레임워크는 DPK22일 수 있다.
본 발명의 VH 도메인은 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 VH 도메인은 서열 21, 31, 41, 51, 71, 81 또는 101의 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 VH 도메인은 서열 81의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 VL 도메인은 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 VL 도메인은 서열 22, 32, 42, 52, 72, 82 또는 102의 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 VL 도메인은 서열 82의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 결합원은 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)일 수 있다. 당업자는 링커의 적절한 길이 및 서열을 선택할 수 있고, 예를 들어 길이상 적어도 5개 또는 10개의 아미노산, 최대 약 15개, 20개 또는 25개의 아미노산을 선택할 수 있다. scFv는 서열 9의 아미노산 서열로 이루어질 수 있거나, 또는 서열 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합원은 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자인 디아바디일 수 있고 (WO94/13804; Holliger 1993a), 여기서 제1 폴리펩티드의 VH 도메인 및 VL 도메인은 각각 제2 폴리펩티드의 VL 도메인 및 VH 도메인과 쌍을 이룬다. 제1 및 제2 폴리펩티드는 같거나 (이에 의해 쌍을 이룰 경우 2가 분자가 됨) 또는 상이할 수 있다 (이에 의해 쌍을 이룰 경우 이중특이성 분자가 됨). 당업자는 링커의 적절한 길이 및 서열을 선택할 수 있고, 예를 들어 길이상 아미노산이 5개 이하일 수 있다. 링커는 서열 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 결합원은 정상적으로는 하나 이상의 CDR에 의해 제공되는 항원-결합 부위를 비-항체 분자, 예를 들어 비-항체 단백질 골격 내의 CDR 세트 내에 포함할 수 있다. 비-항체 및 항체 분자를 포함하는 결합원을 본원의 다른 항목에서 보다 상세하게 기재한다.
본 발명의 결합원은 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 분자에 접합될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 결합원은 방사성동위원소에 접합될 수 있다. 또다른 대안으로, 본 발명의 결합원은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 이와 같은 측면 및 기타 측면들을 이하에서 보다 상세하게 설명한다.
도 1A는 건강한 마우스의 간 및 마우스의 F9 간 전이암에서 이용가능한 단백질의 비교 분석에 사용된 프로테오믹 방법에 기초한 관류의 도식화된 대표도를 보여준다. 도 1B는 F9 간 전이암에 의해 발생된 큰 전이 부위를 보여준다. 도 1C는 강력한 혈관 염색 및 정상 간 (간)에서의 일부 동모양혈관(sinusoids)의 표지화 뿐만 아니라, F9 간 전이암 (전이) 혈관의 선택적이고 효과적인 염색을 보여준다. 염색은 진한 선에 해당하고, 이는 종양-보유 마우스를 종결 마취 하에 혈장 증량제로서 10％ 덱스트란-40이 보충된, PBS (pH 7.4) 중의 술포숙신이미딜-6-[비오틴-아미도]헥사노에이트의 1.8 mM 용액 15 ml (1 mg/ml)를 이용하여 관류시킨 다음, 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 접합체를 이용하여 조직화학적으로 염색한 후에 얻어진다.
도 2A는 피브로넥틴 도메인 구조 상에 정상 마우스 간 (정상) 및 마우스의 F9 간 전이암 (종양)의 프로테오믹 분석에서 동정된 피브로넥틴 펩티드의 위치를 나타낸다. 도 2B는 정상 마우스 간 샘플 및 마우스의 F9 간 전이암의 프로테오믹 분석에서 동정된 펩티드를 LC-MS/MS 실험한 것을 보여준다. 펩티드를 먼저 HPLC로 분리한 다음 192개의 분획으로 용출시켰다. 각 분획을 MALDI 표적 플레이트 상에 개별 지점으로서 스팟팅하고, 각 분획에서 MALDI TOF MS 스펙트럼을 취득하였다. 세 개의 F9 마우스 간 전이암 샘플의 복제물 ("간 전이"로 표지된 패널 참조) 및 세 개의 정상 마우스 간 샘플의 복제물 ("정상 간"으로 표지된 패널 참조)에 대해 두 개의 상이한 특정 HPLC 분획의 질량 스펙트럼 (각각 윗 줄 및 가운데 줄)을 나타내었다. 이온 피크 높이를 내부 표준으로 정상화한 다음 (물질 및 방법란 참조), 상이한 샘플 중에서 상응하는 펩티드를 반-정량 비교하였다. 윗 줄에서, 화살표로 나타낸 피크 (첫 번째 샘플에서 "FN"으로 표지함)는 피브로넥틴 (피브로넥틴 -유형-III 도메인 16)의 불변 영역으로부터 유래된 펩티드 FLTTTPNSLLVSWQAPR (서열 15)에 해당한다. 이 펩티드의 이온 피크는 F9 마우스 간 전이암 샘플 (간 전이)에서 보다 높지만, 또한 정상 마우스 간 샘플 (정상 간)에도 존재하며, 이는 피브로넥틴 분자가 본래 F9 마우스 간 전이암 및 정상 마우스 간 모두에 존재하지만 F9 마우스 간 전이암 샘플에서 보다 풍부한 것으로 보임을 나타낸다. 가운데 줄에서, 오른쪽 화살표로 나타낸 피크 ("EDA"로 표지)는 피브로넥틴의 선택적으로 스플라이싱된 엑스트라-도메인 A 유래의 펩티드 IAWESPQGQVSR (서열 16)에 해당한다. 이 ED-A 펩티드는 F9 마우스 간 전이암 샘플 (간 전이)에서만 검출가능하고, 정상 마우스 간 샘플 (정상 간)에서는 그렇지 않다. 왼쪽 화살표로 나타낸 참고 펩티드 ("ref"로 표지)는 ED-A 펩티드를 용출한 HPLC 분획을 동정하기 위해 사용하였다. 이는, 정상 마우스 간 샘플 (정상 간)에 대해 나타낸 스펙트럼에 참고 펩티드의 피크가 존재한다는 것은 ED-A 펩티드가 정상 마우스 간 샘플에 존재할 경우 ED-A 펩티드가 검출될 수 있을 분획의 질량 스펙트럼이 나타난다는 증거가 됨을 의미한다. 맨 아래줄은 ED-A 펩티드 이온 피크 (화살표로 표시)의 위치에서의 질량 스펙트럼의 확대도를 보여주며, 이는 정상 간 샘플에는 ED-A 펩티드가 존재하지 않음을 증 명한다.
도 3A는 F9 간 전이암 및 이웃한 정상 마우스 간 조직을 Flag-태그된 모 (parent) 항-ED-A 항체 (항-ED-A)로 면역조직화학적으로 염색하였을때 (진한 선) 전이암에서는 강력한 관형 염색 패턴이 나타난 반면, 이웃한 정상 간 조직에서는 어떤 특이적 염색도 검출되지 않았음을 보여준다. 음성 대조군 (대조군)에서는 Flag-태그된 모 항-ED-A 항체를 생략하였다. Flag-태그된 모 항-ED-A 항체에 의해 관찰되는 염색 패턴은 널리 확립된 신생혈관 구조물의 마커인 피브로넥틴 엑스트라 도메인 B를 인식하는 Flag-태그된 항-ED-B scFv(L19) 항체 (항-EDB)에 의해 관찰되는 염색 패턴과 유사하다. 도 3B는 F9DR 종양 세포를 주사하고, 3주 후에 추가로 (200 ㎕/마우스, 즉 60 ㎍ 항체/마우스로) 알렉사(Alexa) 750-표지된 모 항-ED-A 항체 (최종 농도는 0.3 mg/ml)를 꼬리 정맥을 통해 주사한 Sv190 마우스의 장기 (비장, 심장, 폐 및 두 개의 전이암을 갖는 간 부분)를 보여준다. 알렉사 750-표지된 모 항-ED-A 항체를 주입하고 6시간 후에 마우스의 장기를 떼어내었다. 알렉사 750-표지된 모 항-ED-A 항체 염색은 텅스텐 할로겐 램프, 알렉사 750에 대해 특이적인 여기 및 방출 필터, 및 단색 CCD 카메라가 장착된 자가 제작 적외선 형광 영상기 (home-built infrared fluorescent imager) (문헌 [Birchler et al. 1999])에 의해 가시화되었다.
도 4는 인간 전이암에서의 ED-A 발현을 보여준다. Flag-태그된 모 항-ED-A 항체를 이용하여 면역조직화학에 의해 인간 전이암에서 ED-A의 발현을 평가하였다. Flag-태그된 모 항-ED-A 항체를 생략한 음성 대조군 (대조군)에서 어떤 양성 염색 도 검출되지 않았고, 인간 정상 폐 조직 절편 (정상 인간 폐)에서는 Flag-태그된 모 항-ED-A 항체에 의해 단지 매우 약한 배경 염색이 관찰된 반면, 인간 폐 전이암 (RCC [신세포 암종]의 인간 폐 전이)은 진한 선 및 음영으로 표시된 바와 같이 Flag-태그된 모 항-ED-A 항체 (항-EDA)에 의해 강력하게 양성으로 염색되었다. Flag-태그된 모 항-ED-A 항체의 염색 패턴은 주로 관형이며, 널리 확립된 신생혈관 구조물의 마커인 피브로넥틴 엑스트라 도메인 B를 인식하는 Flag-태그된 항-ED-B scFv(L19) 항체 (항-EDB)에 의해 관찰되는 염색 패턴과 유사하다. 유사한 결과가 Flag-태그된 모 항-ED-A 항체를 이용한 결장직장 암종의 인간 간 전이암 (CRC의 인간 간 전이)의 면역조직화학적 분석에 의해 얻어졌다. Flag-태그된 모 항-ED-A 항체는 강력한 관형 및 기질 염색 패턴으로 결장직장 암종의 인간 간 전이암을 밝혀냈다.
도 5는 인간 ED-A (위쪽 서열) 및 마우스 ED-A (아래쪽 서열)를 서로 정렬시킨 것을 보여준다. 별표는 인간 ED-A 및 마우스 ED-A의 아미노산이 동일한 아미노산 위치를 나타낸다.
도 6A는 항-ED-A 항체 H1 중쇄 (VH)의 뉴클레오티드 서열 (서열 12)을 보여준다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR1의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR2의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 이탤릭체 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR3의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 볼드체 부분이다. 도 6B는 항-ED-A 항체 H1 링커 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 14)을 보여준다. 도 6C는 항-ED-A 항체 H1 경쇄 (VL)의 뉴클레오티드 서열 (서열 13)을 보여준다. 항- ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR1의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR2의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 이탤릭체 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR3의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 볼드체 부분이다.
도 7A는 항-ED-A 항체 H1 중쇄 (VH)의 아미노산 서열 (서열 1)을 보여준다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 (서열 3)은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 (서열 4)은 밑줄친 이탤릭체 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 (서열 5)은 밑줄친 볼드체 부분이다. 도 7B는 항-ED-A 항체 H1 링커 서열의 아미노산 서열 (서열 11)을 보여준다. 도 7C는 항-ED-A 항체 H1 경쇄 (VL)의 아미노산 서열 (서열 2)을 보여준다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 (서열 6)은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 (서열 7)은 밑줄친 이탤릭체 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열 (서열 8)은 밑줄친 볼드체 부분이다.
도 8은 F9 종양 보유 마우스에서의 F8 디아바디의 생체분포를 보여준다. 네 마리의 F9 종양 보유 마우스에 I125 표지된 F8 디아바디를 정맥내로 주사하였다. 24시간 후에 상기 마우스를 희생시키고, 종양, 간, 폐, 비장, 심장, 신장, 장, 꼬리 및 혈액을 떼내었다. 이어서 종양, 간, 폐, 비장, 심장, 신장, 장, 꼬리 및 혈액을 방사능적으로 계수하였다. 종양, 간, 폐, 비장, 심장, 신장, 장, 꼬리 및 혈액의 그램 (g) 당 검출된 I125 표지된 F8 디아바디의 주사된 투여량 (ID) 백분률 (％)을 도 8에 나타낸다. F9 종양 (종양)은 분석한 다른 임의의 마우스 조직에 비 해 약 4배 더 많은 ID를 함유하였다.
용어설명
피브로넥틴
피브로넥틴은 선택적 스플라이싱의 대상이 되는 항원으로, 본원의 다른 항목에서 기재하고 있는 바와 같이 피브로넥틴의 다수의 대안적 이소형이 공지되어 있다. 엑스트라 도메인-A (EDA 또는 ED-A)는 ED, 엑스트라 유형 III 반복 A (EIIIA) 또는 EDI로도 알려져 있다. 인간 ED-A의 서열은 문헌 [Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868] 및 [Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557]에 의해 공개되어 있다. 또한, 인간 ED-A의 서열은 접근 번호 P02751 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1631-1720 (피브로넥틴 유형-III 12; 엑스트라 도메인 2)로서 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 이용가능하다. 마우스 ED-A의 서열은 접근 번호 P11276 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1721-1810 (피브로넥틴 유형-III 13; 엑스트라 도메인 2)로서 스위스프롯 데이터베이스에서 이용가능하다.
피브로넥틴 (A-FN)의 ED-A 이소형은 엑스트라 도메인-A (ED-A)를 함유한다. 인간 A-FN의 서열은 상응하는 인간 피브로넥틴 전구체 서열로부터 추론가능하고, 이는 접근 번호 P02751로 스위스프롯 데이터베이스에서 이용가능하다. 마우스 A-FN의 서열은 상응하는 마우스 피브로넥틴 전구체 서열로부터 추론가능하고, 이는 접근 번호 P11276로 스위스프롯 데이터베이스에서 이용가능하다. A-FN은 인간의 피브로넥틴 ED-A 이소형일 수 있다. ED-A는 인간 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A일 수 있다.
ED-A는 선택적 스플라이싱에 의해 피브로넥틴 (FN)에 삽입된 90개의 아미노산 서열로, FN의 도메인 11 및 12 사이에 위치한다 (문헌 [Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). ED-A는 주로 FN의 혈장 형태로는 존재하지 않지만, 배발생, 조직 재형성, 섬유화, 심장 이식 및 고형 종양 성장 동안 풍부해진다.
선택적 스플라이싱
선택적 스플라이싱이란 DNA의 1차 RNA 전사체에서 상이한 스플라이싱 패턴이 일어나 상이한 mRNA가 생성되는 것을 말한다. 인트론의 절단 이후에 선택은 어떤 엑손들이 함께 스플라이싱되어 mRNA를 형성할 것인지를 결정할 수 있다. 선택적 스플라이싱은 상이한 엑손 및/또는 상이한 수의 엑손을 함유하는 상이한 이소형이 생성되도록 한다. 예를 들어, 어떤 이소형은 하나 이상의 엑손에 상응하는 부가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이것은 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
결합원
이것은 서로 결합하는 한 쌍의 분자 중의 한 멤버를 말한다. 결합 쌍의 멤버는 자연 유래일 수 있거나, 또는 전체 또는 일부가 합성에 의해 생성될 수 있다. 분자의 쌍 중 한 멤버는 그의 표면 상에 소정의 영역 또는 공동을 갖고, 그곳은 분자의 쌍 중 다른 멤버의 특정한 공간적 및 극성 구성에 결합되며, 따라서 그에 상보적이다. 결합쌍 유형의 예로는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이 있다. 본 발명은 항원-항체 유형 반응에 관한 것이다.
결합원은 정상적으로는 항원-결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 결합원은 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비-항체 단백질일 수 있다.
항원 결합 부위는 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등과 같은 비-항체 단백질 골격 상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 배열에 의해 (문헌 [Haan & Maggos, 2004; Koide 1998; tlygren 1997]), 또는 목적하는 표적에 대해 결합 특이성을 부여하기 위한 단백질 골격 내 루프의 아미노산 잔기의 무작위화 또는 돌연변이화에 의해 제공될 수 있다. 단백질 내에 신규한 결합 부위를 조작하기 위한 골격은 니그렌 등 (Nygren et al. (1997))이 상세하게 검토한 바 있다. 항체 모방체에 대한 단백질 골격은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO/0034784에 개시되어 있고, 여기서 그 발명자들은 적어도 하나의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 유형 III 도메인을 포함하는 단백질 (항체 모방체)를 기재하고 있다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어 HCDR 세트와 합체되기에 적합한 골격은 면역글로불린 유전자 상과(superfamily)의 임의의 도메인 멤버에 의해 제공될 수 있다. 그 골격은 인간 단백질이거나 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 골격의 장점은 그것이 적어도 일부의 항체 분자에 비해 보다 작고/작거나 보다 쉽게 골격 분자 내에 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 크기가 작은 결합원은 세포로의 진입, 조직으로의 깊은 침투 또는 다른 구조물 내의 표적에 이르는 능력, 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에의 결합 능력과 같은 유용한 생리적 특성을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 골격 내의 항원 결합 부위의 용도는 웨스 (Wess, 2004)가 검토하였다. 전형적인 것으로는 안정한 뼈대와 하나 이상의 가변 루프를 갖는 단백질이 있고, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열은 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이화되어 표적 항원에 결합하는 항원-결합 부위로 된다. 그러한 단백질로는 에스. 아우레우스 (S. aureus) 유래의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어, 10 번째 피브로넥틴 유형 III 도메인) 및 리포칼린이 있다. 다른 접근법으로는 합성 "마이크로바디(Microbodies)" (셀레코어 게엠베하(Selecore GmbH))가 있으며, 이는 분자내 2황화 결합을 갖는 작은 단백질인 시클로타이드를 기초로 한다.
항체 서열 및/또는 항원-결합 부위에 더하여, 본 발명에 따른 결합원은, 예를 들어 접힌 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는 다른 아미노산, 또는 분자에 항원에 결합하는 능력에 더하여 또다른 기능적 특성을 부여하기 위한 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합원은 검출가능한 표지를 운반할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 펩티드 결합 또는 링커를 통해) 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 접합될 수 있다. 예를 들어, 결합원은 항원 결합 부위 뿐만 아니라, (예를 들어 효소 도메인 내에) 촉매 부위를 포함할 수 있고, 상기 항원 결합 부위는 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원으로 표적화한다. 촉매 부위는, 예를 들어 절단에 의해 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.
주지되어 있는 바와 같이, CDR은 비-항체 골격에 의해 운반될 수 있지만, 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트를 운반하는 구조물은 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열이거나, 또는 CDR 또는 CDR 세트가 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 영역의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 위치하는 그의 실질적인 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat 1987] 및 그의 개정판을 참조하여 판단할 수 있고, 현재 인터넷으로 이용가능하다 (immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진에서 "Kabat"을 쳐서 찾을 것) .
CDR 영역 또는 CDR로, 카벳(Kabat) 등 (1987) (문헌 [Kabat 1991a], 및 이후 개정판)이 정의한 바와 같은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 과가변영역을 나타내는 것이 의도되어 진다. 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR과 3개의 경쇄 CDR을 함유한다. 용어 CDR은 본원에서 경우에 따라, 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 친화성에 의한 결합을 담당하는 대부분의 아미노산 잔기를 함유하는 영역 중에서 어느 하나, 또는 수 개, 또는 그 전체를 나타내기 위해 사용된다.
여섯 개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 세 번째 CDR (HCDR3)은 보다 큰 크기 변이성 (본질적으로 유전자의 배열을 초래하는 유전자 배열 메커니즘으로 인해 보다 큰 다양성)을 갖는다. 이는 2개의 아미노산 만큼 짧을 수도 있지만, 알려져 있는 가장 긴 크기는 26이다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성 결정에 있어서 일부 소정의 역할을 한다 (문헌 [Segal 1974; Amit 1986; Chothia 1987; Chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabat et al., 1991b]).
항체 분자
이는 자연 발생의, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성되어 생성된 면역글로불린을 말한다. 또한 이 용어는 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 본원에서 본 발명은 자연 형태의 항체에 관한 것이 아니고, 다시 말하면 항체는 자연 환경 내에 존재하는 것은 아니지만, 자연적인 공급원으로부터 정제에 의해 단리 또는 수득될 수 있거나, 유전자 재조합 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있는 것이며, 따라서 이하에서 설명하는 바와 같은 자연적이지 않은 아미노산을 함유할 수 있는 것임이 이해되어야 한다. 항체 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편으로는 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd와 같은 항체 분자 및 디아바디가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
단클론 및 기타 항체를 수득하고 재조합 DNA 공학 기술을 이용하여 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성할 수 있다. 그러한 기술은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 역역에 더하여 프레임워크 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 광범위한 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화의 대상이 될 수 있고, 생산되는 항체의 결합 특이성을 변화시키거나 그렇지 않을 수 있다.
항체는 다양한 방식으로 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 항원에 대해 요구되는 특이성을 갖고/갖거나 항원에 결합하는 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 결합원 또는 물질을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 이 용어는 자연적이거나 그 전체 또는 부분이 합성된 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 비롯한 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 따라서, 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 다른 종 유래 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 것)에 융합된, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 분자 또는 그의 등가물도 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 광범위한 후속 문헌에 기재되어 있다.
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가의 기술은 인간 항체 및 인간화된 항체의 단리를 가능하게 하였다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 [Kontermann & Dubel (2001)]에 기재되어 있는 바와 같이 제조할 수 있다. 결합원을 생성하는 또다른 확립된 기술인 파지 디스플레이는 WO92/01047 (이하에서 추가로 논의함) 및 US 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 및 문헌 [Kontermann S Dubel (2001)]과 같은 많은 공개문헌들에 상세하게 기재되어 있다. 마우스 면역계의 다른 성분들은 손상없이 남기고 마우스 항체 유전자를 불활성화시키고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체한 트렌스제닉 마우스를 인간 항체를 단리하는데 사용할 수 있다 (문헌 [Mendez 1997]).
합성 항체 분자는, 예를 들어 문헌 [Knappik et al. (2000)] 또는 [Krebs et al, (2001)]에 기재되어 있는 바와 같이, 적합한 발현 벡터 내에서 합성되고 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성되는 유전자로부터의 발현에 의해 제조될 수 있다.
전체 항체의 단편은 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있음이 알려져 있다. 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward 1989]; [McCafferty 1990]; [Holt 2003]); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 두 개의 도메인을 회합시켜 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv 분자 (scFv) (문헌 [Bird 1988]; [Huston 1988]); (viii) 이중특이성 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합체로 구성된 다가 또는 다중특이성 단편인 "디아바디" (WO94/13804; Holliger 1993a)가 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 2황화 가교의 도입에 의해 안정화될 수 있다 (문헌 [Peiter 1996]). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디를 또한 제조할 수 있다 (문헌 [Hu 1996]). 결합 단편의 다른 예로는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 수 개의 잔기가 첨가된 것으로 인해 Fab 단편과 상이하고 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH가 있다.
본 발명의 항체 단편은 본원에서 기재하는 임의의 항체 분자, 예를 들어 본원에서 기재하는 임의의 항체의 VH 및/또는 VL 도메인 또는 CDR을 포함하는 항체 분자로부터 출발하여, 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 소화 및/또는 화학적 환원에 의한 2황 가교의 절단과 같은 방법에 의해 수득할 수 있다. 다른 방식으로, 본 발명의 항체 단편은 당업자들에게 널리 알려져 있는 것과 같은 유전자 재조합 기술에 의해, 또는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 사 등에 의해 공급되는 것과 같은 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성에 의해, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 항체 단편은 화학적 변형, 특히 페길화에 의해, 또는 리포좀으로의 도입에 의해 그의 반감기가 증가된 임의의 기능성 단편을 포함한다.
dAb (도메인 항체)는 항체, 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역의 작은 단량체 항원-결합 단편이다 (문헌 [Holt 2003]). VH dAb는 반추동물과 (camelid, 예를 들어, 낙타, 라마)에서 자연적으로 발생되며, 반추동물의 표적 항원으로의 면역화, 항원-특이적 B 세포의 단리 및 개별 B 세포로부터 dAb 유전자의 직접 클로닝에 의해 생성될 수 있다. dAb는 또한 세포 배양으로도 생산가능하다. 그들의 작은 크기, 양호한 안정성 및 온도 안정성은 그들을 특히 생리적으로 유용하게 하고 선택 및 친화성 성숙에 적합하게 한다. 본 발명의 결합원은 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb이거나, 또는 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.
본원에서 사용되는 문구 "실질적으로 설명한 바와 같은" 이란 본원에서 기재한 결합원의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특징(들)이 본원에서 설명한 서열의 구체화된 영역과 동일하거나 매우 유사할 것임을 말한다. 본원에서 하나 이상의 가변 도메인의 구체화된 영역(들)과 관련하여 기재하는 문구 "매우 유사한" 이란 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에 1 내지 약 5개, 예를 들어 1 내지 3개, 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 비롯하여 1 내지 4개의 아미노산 치환이 있을 수 있음을 의도한다.
이중특이성 또는 이관능성 항체는 두 개의 상이한 가변 영역이 동일한 분자 내에서 합쳐진 제2 세대 단클론 항체를 형성한다 (문헌 [Holliger 1999]). 새로운 효과기 기능이 보강되거나 종양 세포의 표면 상의 수 개의 분자를 표적화하는 그들의 능력으로 인해 진단 분야 및 치료 분야 모두에서 이들의 용도가 증명되었다. 이중특이성 항체를 사용하고자 할 경우, 이는 예를 들어 화학적으로 제조되거나 잡종 하이브리도마로부터 다양한 방식으로 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체일 수 있거나 (문헌 [Holliger 1993b]), 또는 상기에서 언급한 바와 같은 임의의 이중특이성 항체 단편일 수 있다. 이들 항체는 화학적 방법 (문헌 [Glennie 1987; Repp 1995]) 또는 체세포적 방법 (문헌 [Staerz 1986; Suresh 1986]), 또는 이형이량체화(heterodimenzation)가 일어나게 하여 목적하는 항체의 정제 과정을 용이하게 하는 유전자 조작 기술 (문헌 [Merchand 1998])을 이용하여 수득할 수 있다. 이중특이성 항체의 예로는, 서로 다른 특이성을 갖는 2 개의 항체의 결합 도메인을 사용하고 이들을 짧은 연성 펩티드를 통해 직접 연결시킬 수 있는 바이트 테크놀로지 (BiTe™ technology) 사의 항체가 있다. 이것은 짧은 단일의 폴리펩티드 사슬에 두 개의 항체를 합한 것이다. 디아바디 및 scFv는 오직 가변 영역만을 이용하여 Fc 영역없이 구축할 수 있고, 이는 항-개체특이적 반응 효과를 잠재적으로 감소시킨다.
이중특이성 항체는 전체 IgG로서, 이중특이성 Fab'2로서, Fab'PEG로서, 디아바디로서, 또는 이중특이성 scFv로서 구축될 수 있다. 추가로, 당업계 공지의 통상적인 방법을 이용하여 두 개의 이중특이성 항체를 연결하여 4가 항체를 형성할 수 있다.
이중특이성 전체 항체와 대조적으로 이중특이성 디아바디는 이. 콜라이 (E. Coli)에서 쉽게 구축되고 발현될 수 있기 때문에 역시 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 항체 단편과 같은 많은 그 밖의 폴리펩티드)는 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 이용하여 쉽게 선택할 수 있다. 디아바디의 한쪽 팔이, 예를 들어 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 불변적인 것으로 유지될 경우, 나머지 팔이 가변적이고 선택된 적절한 특이성을 갖는 항체인 라이브러리를 제조할 수 있다. 이중특이성 전체 항체는 문헌 [Ridgeway 1996]에 기재되어 있는 바와 같은 대체 조작 (alternative engineering) 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
표적 항원에 대한 항체를 얻기 위해 당업계의 다양한 방법들을 이용할 수 있다. 항체는 특히 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화된 기원의 단클론 항체일 수 있고, 이는 당업자에게 널리 알려진 표준 방법에 따라 얻을 수 있다.
일반적으로, 특히 뮤린 기원의 단클론 항체 또는 그의 기능성 단편을 제조하기 위해, 특히 매뉴얼 "Antibodies" (Harlow and Lane 1988)에 기재되어 있는 기술이나 문헌 [Kohler and Milstem, 1975]에 기재된 하이브리도마로부터의 제조 기술을 참고하는 것이 가능하다.
단클론 항체는, 예를 들어 A-FN, 또는 상기 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편 중 하나, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 그것으로 이루어진 단편 또는 ED-A의 펩티드 단편에 대해 면역화된 동물 세포로부터 얻을 수 있다. A-FN 또는 그의 단편 중 하나는 특히 통상적인 제조 방법에 따라, A-FN 또는 그의 단편을 코딩하는 cDNA 서열에 함유되어 있는 핵산 서열로부터 출발하는 유전자 재조합, 또는 A-FN 및/또는 그의 단편의 펩티드 서열을 구성하는 아미노산 서열로부터 출발하는 펩티드 합성에 의해 생성할 수 있다.
단클론 항체는, 예를 들어 상기 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 A-FN 또는 그의 단편 중 하나, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 그것으로 이루어진 단편 또는 ED-A의 펩티드 단편이 미리 고정되어 있는 친화성 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 단클론 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, 후속하거나 또는 후속하지 않고 그 자체 내에 존재하는 잔여 단백질 오염물 뿐만 아니라 DNA 및 LPS를 제거하는데 도움이 되는 이온-교환 크로마토그래피를 행하고, 후속하거나 또는 후속하지 않고 이량체 또는 기타 다량체의 존재로 인한 잠재적인 응집을 제거하기 위해 세파로스 겔 상에서 배제 크로마토그래피를 행할 수 있다. 이러한 기술은 전부 동시에 사용하거나 연속적으로 사용할 수 있다.
항원-결합 부위
이는 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 그에 상보적인 분자의 부분을 말한다. 항체 분자에서 이는 항체 항원-결합 부위라 불리고, 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 그에 상보적인 항체의 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우에 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있고, 그 부분을 에피토프라 부른다. 항체 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다.
단리된
이는 본 발명의 결합원 또는 그러한 결합원을 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따른 것과 일치하게 되는 상태를 말한다. 즉, 본 발명의 결합원, VH 및/또는 VL 도메인은, 예를 들어 그들의 자연 환경으로부터 단리되고/되거나 정제되어 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 제공될 수 있거나, 또는 핵산의 경우에는, 유리되거나 실질적으로 유리된 핵산 또는 요구되는 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 기원의 유전자로 제공될 수 있다. 단리된 멤버 및 단리된 핵산은 그들이 자연적으로는 회합되는, 예컨대 다른 폴리펩티드들과, 또는 그들의 자연 환경 또는 그들이 제조되는 환경 (예를 들어 세포 배양) (그러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 행해지는 재조합 DNA 기술에 의한 것일 경우) 내에서 발견되는 핵산들과 유리되거나 실질적으로 유리된 물질일 것이다. 멤버 및 핵산은 희석제 또는 보조제 (역시 단리의 목적이 됨)와 함께 제형화될 수 있고, 예를 들어 면역검정법에 사용하기 위한 미세역가 플레이트를 코팅하는데 사용되는 경우 멤버는 젤라틴 또는 기타 담체와 함께 정상적으로 혼합될 것이고, 또는 진단 또는 치료에 사용되는 경우 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 혼합될 것이다. 결합원은 자연적으로 또는 이종 진핵 세포 (예를 들어, CHO 또는 NSO (ECACC 85110503) 세포) 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들어 원핵 세포에서의 발현에 의해 생산되는 경우에는) 비글리코실화될 수 있다.
또한, 항체 분자를 포함하는 불균질 제제도 본 발명의 일부를 구성한다. 예를 들어, 그러한 제제는 전장 중쇄 및 C-말단 리신이 결여된 중쇄를 갖는 항체, 글리코실화의 정도가 다양한 항체, 및/또는 유도체화된 아미노산을 갖는 항체, 예를 들어 피로글루탐산 잔기를 형성하도록 N-말단 글루탐산이 고리화된 항체의 혼합물일 수 있다.
항원, 예를 들어 A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 하나 이상의 결합원은 본 발명에 따른 결합원의 라이브러리를 항원 또는 그의 단편, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 그것으로 이루어진 단편 또는 ED-A의 펩티드 단편과 접촉시키고, 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 결합원을 선택함으로써 수득할 수 있다.
항체 라이브러리는 반복 콜로니 필터 스크리닝(Iterative Colony Filter Screening, ICFS)을 이용하여 스크리닝할 수 있다. ICFS에서는, 수 개의 결합 특이성을 코딩하는 DNA를 함유하는 박테리아를 액체 배지에서 성장시키고, 지수 성장 단계에 이르면, 수 십억 마리의 박테리아를 완전히 융합된 박테리아 콜로니가 출현할 때까지 인큐베이션된 적합하게 전처리된 멤브레인 필터로 이루어진 성장 지지체 상에 분포시킨다. 제2 트랩 기질은 목적하는 항원이 미리 가해져서 그것으로 도포된 다른 멤브레인 필터로 이루어진다.
이어서, 트랩 멤브레인 필터를 적합한 배양 배지를 함유하는 플레이트 상에 놓고, 표면이 박테리아 콜로니가 위로 향하도록 한 성장 필터로 덮는다. 이어서, 얻어진 샌드위치를 실온에서 약 16 시간 동안 인큐베이션한다. 이로서, 분포 작용을 갖는 항체 단편 scFv를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있고, 트랩 멤브레인 상에 존재하는 항원과 특이적으로 결합하는 단편들이 트랩핑된다. 이어서 결합된 항체 단편 scFv를 표출시키기 위한 목적으로 일반적으로 사용되는 비색정량 기술 (colorimetric technique)을 이용하여 트랩 멤브레인에 대해 결합된 항체 단편 scFv를 표출시키는 처리를 행한다.
트랩 필터 상의 발색 지점은 성장 멤브레인 상에 존재하는, 트랩핑된 항체 단편을 생산하는 상응하는 박테리아 콜로니를 추적할 수 있게 한다. 그러한 콜로니들을 모아서 성장시키고 그들 중 수 백만 마리의 박테리아를 새로운 배양 멤브레인 상에 분포시켜 상기한 과정을 반복한다. 이어서 트랩 멤브레인 상의 양성 신호가 단일의 양성 콜로니와 상응하게 될 때까지 동일한 사이클을 수행하고, 단일의 양성 콜로니 각각은 선택에 사용되는 항원에 대한 단클론성 항체 단편의 잠재적인 공급원을 나타낸다. ICFS는, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 WO0246455에 기재되어 있다. 라이브러리는 또한 입자 또는 분자 복합체, 예를 들어 박테리오파지 (예를 들어, T7) 입자와 같은 복제가능한 유전자 패키지, 또는 기타 시험관내 디스플레이 시스템 상에서 디스플레이될 수 있고, 각 입자 또는 분자 복합체는 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 임의로는 디스플레이된 VL 도메인이 존재할 경우 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유하는 것이다. 파지 디스플레이는 WO92/01047 및, 예를 들어 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 및 US6521404에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 기타 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에서 디스플레이된 결합원의 선택에 이어서, 상기 선택된 결합원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 수득할 수 있다. 그러한 핵산은 상기 선택된 결합원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 수득한 핵산 서열을 이용한 핵산으로부터의 발현에 의해, 후속하여 결합원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 생성하는데 사용할 수 있다.
상기 선택된 결합원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인을 단리된 형태로 제공할 수 있고, 그러한 VH 도메인을 포함하는 결합원으로서도 제공할 수 있다.
A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A 또는 그 밖의 표적 항원 또는 이소형에 결합하는 능력, 예를 들어 A-FN 또는 A-FN의 단편, 예를 들어 피브로넥틴의 ED-A에의 결합에 대한 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9 중 어느 하나와 경쟁하는 능력을 추가로 시험할 수 있다.
본 발명의 결합원은 구체적으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 본 발명의 결합원은, 예를 들어 scFv 형식으로 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9와 동일한 친화성으로 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 본 발명의 결합원은 3 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 2 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 1.7 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 1.4 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 결합원은 3 x 10-9 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다.
본 발명의 결합원은 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9로서 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A 이외의 분자에 대해 임의의 현저한 결합을 나타낼 수 없다. 특히, 결합원은 피브로넥틴의 다른 이소형, 예를 들어 피브로넥틴의 ED-B 이소형 및/또는 IIICS 이소형에 결합할 수 없다.
본원에서 개시하는 항체 분자의 변이체를 생성할 수 있으며 본 발명에서 사용할 수 있다. CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합원의 아미노산 서열을 치환시키는데 필요한 기술은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 변이체 서열은 활성에 대해 최소한의 효과 또는 유익한 효과를 갖는지 예상가능하거나 그렇지 않은 치환체에 의해 치환될 수 있으며, A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력 및/또는 그 밖에 임의의 목적하는 특성에 대해 시험될 수 있다.
본 발명에 따르면, 논의한 바와 같이 그 서열이 본원에 구체적으로 개시되어 있는 임의의 VH 및 VL 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체를 사용할 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있고, 그러한 변경은 약 20 미만, 약 15 미만, 약 10 미만 또는 약 5 미만, 아마도 5, 4, 3, 2, 1일 수 있다. 변경은 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 있을 수 있다. 정상적으로 변경은 기능상의 손실을 야기하지 않고, 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들어, 이는 본원에서 기재하는 검정법으로 측정하였을때, 변경되지 않은 결합원과 동일한 결합력을 보유할 수 있다. 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대해 개선된 결합능을 가질 수 있다.
전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 일으키기 위해 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자에 무작위로 돌연변이를 유발시켜 본 발명의 CDR-유래 서열을 운반하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에서 1개 또는 2개의 아미노산을 치환시킨다. 사용가능한 다른 방법으로는 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 직접 돌연변이를 유발시키는 것이 있다.
상기한 바와 같이, 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 CDR로서 운반될 수 있다. 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 HCDR3 서열은 본 발명의 실시양태를 나타내고, 예를 들어 이들 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 HCDR3으로서 운반될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포계열 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻을 수 있거나 그로부터 유래될 수 있고, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 공통 서열 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비-인간 항체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 CDR 서열 (예를 들어 CDR3)은 재조합 DNA 기술에 의해 CDR (예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인 레퍼토리에 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al. (1992)]에는 가변 도메인 영역의 5' 말단에 접하거나 이웃한 공통 프라이머를 인간 VH 유전자의 세 번째 프레임워크 영역에 대한 공통 프라이머와 함께 사용하여 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인 레퍼토리를 제공하는, 항체 가변 도메인 레퍼토리의 생성 방법이 기재되어 있다. 문헌 [Marks et al. (1992)]에는 또한 이러한 레퍼토리를 어떻게 특정 항체의 CDR3과 조합할 수 있는지에 대해서도 기재되어 있다. 유사한 기술을 이용하여 본 발명의 CDR3-유래 서열을 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인 레퍼토리와 혼합할 수 있고, 그러한 혼합은 VH 또는 VL 도메인이 같은 기원의 VL 또는 VH 도메인과 조합되는 것을 완성하여 본 발명의 결합원을 제공한다. 이어서, 레퍼토리를 WO92/01047 (본 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨) 또는 문헌 [Kay, Winter & McCafferty (1996)]을 비롯한 임의의 광범위한 후속 문헌에 기재된 파지 디스플레이 시스템과 같은 적합한 숙주 시스템에서 디스플레이되게 하여, 적합한 결합원을 선택할 수 있다. 레퍼토리는 104를 초과하는 개별 멤버, 예를 들어 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상 또는 1010 멤버 이상으로 이루어질 수 있다.
유사하게, 하나 이상, 또는 모든 세 개의 CDR을 VH 또는 VL 도메인 레퍼토리와 합체시킬 수 있으며, 이어서 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합원(들)을 스크리닝한다.
항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 하나 이상의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 HCDR 세트를 사용할 수 있고/있거나, 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E3 또는 G9의 하나 이상의 X LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 또는 항체 H1, B2, C5, D5, E5, CB, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 LCDR 세트를 사용할 수 있다.
유사하게, 본원에서 개시하는 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트를 사용할 수도 있다.
A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A는 종양 전이암의 치료용 약제를 제조하는데 사용하기 위한 결합원, 예를 들어 항체 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 스크리닝은 본원의 다른 항목에서 개시한 바와 같은 레퍼토리의 스크리닝일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 개재 프레임워크 영역에 더하여 적어도 세 개의 CDR 영역을 포함할 것이다. 상기 부분은 또한 적어도 약 50％의 첫 번째 및 네 번째 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있고, 이때 50％는 첫 번째 프레임워크 영역의 C-말단이 50％이고, 네 번째 프레임워크 영역의 N-말단이 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 일부인 N-말단 또는 C-말단의 부가적인 잔기들은 자연 발생 가변 도메인 영역과 정상적으로는 관련이 없는 것들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의한 본 발명의 결합원의 구축은 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 코딩된 N- 또는 C-말단의 잔기의 도입을 야기할 수 있다. 그 밖의 조작 단계는 링커를 도입하여 본 발명의 가변 도메인을 항체 불변 영역을 포함하는 추가의 단백질 서열, (예를 들어 디아바디의 생성에 있어서의) 기타 가변 도메인, 또는 본원의 다른 항목에서 보다 상세하게 논의한 검출가능한/기능성 표지에 연결시키는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서는 결합원이 한 쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하지만, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일의 결합 도메인도 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 단일의 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특정 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 예를 들어, 상기의 dAb에 관한 내용을 참조한다.
단일의 결합 도메인의 경우, 이들 도메인은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합가능한 두 개의 도메인 결합원을 형성할 수 있는 상보적인 도메인을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 WO92/01047에 개시되어 있는 소위 계층적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 이용한 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있고, 여기서는 H 또는 L 사슬 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 사슬 (L 또는 H)을 코딩하는 클론의 완성된 라이브러리를 감염시키고, 생성된 두 개의 사슬 결합원은 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다. 이 기술은 또한 문헌 [Marks 1992]에도 개시되어 있다.
본 발명의 결합원은 추가로 항체 불변 영역 또는 그의 일부, 예를 들어 인간 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C-말단에서 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬, 예를 들어 Cλ를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 결합원은 그의 C-말단에서 임의의 항체 이소형, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 이소형 서브클래스, 특히 IgG1 및 IgG4 유래의 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부 (예를 들어, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. 이와 같은 특성을 갖고 가변 영역이 안정화된 임의의 합성 또는 기타 불변 영역 변이체가 또한 본 발명의 실시양태에 유용하다.
본 발명의 결합원은 검출가능한 또는 기능성 표지로 표지화될 수 있다. 표지는 신호를 생성하거나 신호의 생성을 유도할 수 있는 임의의 분자일 수 있으며, 형광물질, 방사능표지, 효소, 화학발광물질 또는 광과민물질이 포함되나 이들로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 결합은 형광 또는 발광, 방사능, 효소 활성 또는 흡광을 검출하는 것에 의해 검출 및/또는 측정할 수 있다. 검출가능한 표지는 당업계 공지의 통상적인 화학을 이용하여 본 발명의 항체에 부착시킬 수 있다.
예를 들어 육안 검사, 전자기 방사선, 열, 및 화학 시약에 의한 것과 같은 외적인 방식에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지에 의한 수 많은 방법들이 존재한다. 표지는 또한 본 발명의 항체에 결합하는 다른 결합원, 또는 지지체에 결합될 수 있다.
표지된 결합원, 예를 들어 검출가능한 표지에 의해 표지된 scFv는 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 진단용으로 및/또는 치료용으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 방사능표지된 결합원 (예를 들어, 방사성동위원소에 접합된 결합원)은 방사선진단법 및 방사선치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 결합원에 접합될 수 있는 방사성동위원소로는 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh 및 177Lu와 같은 동위원소가 있다.
예를 들어, 검출가능한 표지에 의해 표지된 본 발명의 결합원은 인간 또는 동물에서 종양 전이암 및/또는 종양 전이를 검출, 진단 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다. 결합원을 인간 또는 동물, 일반적으로는 인간 환자에 투여할 수 있고, 인간 또는 동물 신체에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에서 항체의 존부를 판단할 수 있으며; 인간 또는 동물에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에 항체 분자가 위치한다는 것은 종양 전이암 및/또는 종양 전이가 존재한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 결합원은 종양 전이암을 진단하는데 사용하기 위한 진단 제품을 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 본 발명의 결합원, 예를 들어 검출가능한 표지로 표지된 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원을 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에서 결합원의 존부를 판단하는 단계를 포함하고,
인간 또는 동물에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에 결합원이 위치한다는 것은 종양 전이암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 종양 전이암을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다. 결합원이 검출가능한 표지로 표지된 경우, 검출가능한 표지의 존부는 표지를 검출하는 것에 의해 판단할 수 있다.
본원에서 기재하는 결합원은 또한, 경쟁 검정법에서 항원 수준을 측정하는데 사용할 수 있고, 다시 말하면 본 발명에 의해 제공되는 결합원을 이용하여 경쟁 검정법에서 샘플 중의 항원의 수준을 측정하는 방법에 사용할 수 있다. 여기서는 결합되지 않은 항원으로부터 결합된 항원을 물리적으로 분리하는 것이 요구되지 않을 수 있다. 결합에 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 리포터 분자를 결합원에 연결시키는 것이 가능하다. 리포터 분자는 정량적일 수 있는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 산출할 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접적이거나 간접적, 예를 들어 펩티드 결합을 통한 공유결합적, 또는 비공유결합적일 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합체의 재조합 발현의 결과일 수 있다.
또한, 경쟁 검정법은 에피토프를 맵핑하는데 사용할 수 있다. 일례로, 에피토프 맵핑은 결합원에 의해 결합된 에피토프를 동정하는데 사용될 수 있다. 그러한 에피토프는 선형 또는 입체형일 수 있다. 입체형 에피토프는 A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A의 2 이상의 상이한 단편을 포함할 수 있고, 상기 단편은 A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A가 3차 또는 4차 구조로 접힐 경우 서로 근접하게 위치하여 A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A 결합원에 의해 인식되는 입체형 에피토프를 형성한다. 경쟁 시험에서, 항원의 펩티드 단편, 특히 관심 에피토프를 포함하거나 관심 에피토프로 본질적으로 이루어진 펩티드를 이용할 수 있다. 에피토프 서열에 더하여 어느 한 쪽의 말단에 하나 이상의 아미노산이 더해진 펩티드를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 결합원은 항원에 대한 그의 결합이 주어진 서열을 갖거나 포함하는 펩티드에 의해 억제되도록 된 것일 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서는 본 발명의 결합원 및 병변 내 표적 세포에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자의 접합체 또는 융합체, 및 그러한 병변 내에 존재하는 세포외 기질 성분에 대한 항체를 사용한다. 예를 들어, 살생 또는 세포독성 분자는 인터루킨-2 (IL-2), 독소루비신, 인터루킨-12 (IL-12), 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 α (TMFα) 또는 조직 인자 (바람직하게는 불완전한 것)일 수 있다. 그러한 접합체는, 예를 들어 본원에서 언급하는 바와 같은 종양 전이암 및/또는 종양을 치료하는데 치료적으로 사용될 수 있다. 결합원의 살생 또는 세포독성 분자와의 융합체 또는 접합체의 제조 및 용도는, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 WO01/62298에 기재되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결합원을 포함하는 약제를 치료상 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 종양 전이 및/또는 종양 전이암의 치료 방법을 제공한다. 결합원은 (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합원의 접합체일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명의 결합원의 용도를 제공한다. 결합원은 본원에서 기재하는 바와 같은 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자에 접합되거나 융합될 수 있다. 결합원은 (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 본 발명에 따른 인간 피브로넥틴에 대한 결합원의 접합체일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료방법에 사용하기 위한, (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 대한 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자와 (ii) 본 발명에 따른 인간 피브로넥틴에 대한 결합원의 접합체를 제공한다. 이러한 치료는 종양 전이암 및/또는 종양 전이에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 추가의 측면은 (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 대한 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자와 (ii) 본 발명에 따른 인간 피브로넥틴에 대한 결합원의 접합체를 제공한다. 이러한 접합체는 바람직하게는 살생 또는 세포독성 분자 및 상기 결합원을 포함하는 융합 단백질, 또는 결합원이 2쇄 또는 다중쇄인 경우 살생 또는 세포독성 분자 및 상기 결합원의 폴리펩티드 쇄 성분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 결합원은 단일쇄 폴리펩티드, 예를 들어 scFv와 같은 단일쇄 항체 분자이다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 살생 또는 세포독성 분자 및 본 발명의 단일쇄 Fv 항체 분자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
세포 상호작용에 의해 표적 세포에 대한 효과를 발휘하는 살생 또는 세포독성 분자는 표적 세포와 직접적으로 상호작용할 수 있거나, 표적 세포 상의 막-결합 수용체와 상호작용할 수 있거나, 세포막의 전기화학 전위를 교란시킬 수 있다. 막-결합 수용체와 상호작용하는 분자로는 케모카인, 시토카인 및 호르몬이 포함된다. 세포막의 전기화학 전위를 교란시키는 화합물로는 헤모리신, 이오노포어, 이온 채널에 대해 작용하는 약물이 포함된다. 예시적인 바람직한 실시양태에서, 분자는 인터루킨-2, (바람직하게는 절단된) 조직 인자 또는 독소루비신이다. 다른 실시양태는 인터루킨-12, 인터페론-감마, IP-10 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)를 이용할 수 있다.
하기에서 추가로 논의된 바와 같이, 특정 결합원은 바람직하게는 항체이거나 또는 항체 항원-결합 부위를 포함한다. 편리하게는, 특정 결합원은 단일쇄 폴리펩티드, 예컨대 단일쇄 항체일 수 있다. 이는 단일쇄 항체 및 살생 또는 세포독성 분자 (예를 들어 인터루킨-2 또는 조직 인자)를 포함하는 융합 단백질의 편리한 제조를 가능하게 한다. 다른 실시양태에서, 항체 항원-결합 부위는 별개의 폴리펩티드에서, 예를 들어 완전한 항체 또는 Fab나 디아바디와 같은 항체 단편에서 항체 VH 도메인과 항체 VL 도메인의 회합에 의해 제공된다. 특정 결합원이 2쇄 또는 다중쇄 분자 (예를 들어 각각 Fab 또는 전체 항체)인 경우, 살생 또는 세포독성 분자는 특정 결합원에서 하나 이상의 폴리펩티드 쇄와 융합 폴리펩티드로서 접합될 수 있다.
결합원은 살생 또는 세포독성 분자와 펩티드 결합에 의해 접합될 수 있으며, 즉 상기 분자 및 특정 결합원을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 이의 폴리펩티드 쇄 성분 내에 존재할 수 있다. IL-2를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조에 유용한 IL-2 서열 정보에 대해서는 문헌 [Taniguchi et al. (1983) Nature 302, 305-310]; [MaED-A et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040-1047]; [Devos et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323]을 참조한다. 절단된 조직 인자에 대한 서열 정보는 문헌 [Scarpati et al. (1987) Biochemistry 26: 5234-5238] 및 [Ruf et al . (1991) J. Biol. Chem. 226: 15719-15725]에서 제공된다. 다른 접합 수단으로는 화학 접합, 특히 이관능성 시약을 사용한 (예를 들어 더블-리에이전츠(DOUBLE-REAGENTS)™ 가교결합 시약 선택 지침 (피어스(Pierce))을 사용한) 가교결합이 포함된다.
느린 방출이 바람직한 경우, 예를 들어 살생 또는 세포독성 분자가 독소루비신이거나 또는 세포막의 전기화학 전위를 교란시키는 다른 분자인 경우, 화학 접합은 특정 결합원 (항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드)의 1급 아미노기와 독소루비신과 같은 살생 또는 세포독성 분자의 산화된 당 모이어티 (다우노스아민) 사이의 시프(Schiff) 염기 (이민) 형성에 의해 일어날 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 결합원을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG, 예를 들어 IgG1을 코딩하는 핵산을 제공한다. 바람직한 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명은 또한 상기와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 하나 이상의 구조물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 제공된 바와 같은 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1 또는 IgG4를 코딩하는 핵산은 그 자체로 본 발명의 한 측면을 형성하며, 코딩 핵산으로부터 발현시키는 것을 포함하는, 코딩된 생성물의 생산 방법도 그러하다. 발현은 편리하게는 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 달성할 수 있다. 발현에 의한 생성 후, VH 또는 VL 도메인, 또는 결합원을 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제한 다음, 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 본원에서 설명하는 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 구체화된 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하며, 구체화된 서열을 갖는 RNA 분자 (여기서는 U가 T 대신 사용됨)를 포함한다.
또다른 추가의 측면은 코딩 핵산으로부터 발현시키는 것을 포함하는, 항체 VH 가변 도메인의 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합원의 유사한 제조 방법이 본 발명의 추가의 측면으로서 제공된다.
제조 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을 하나 이상의 부가적인 성분, 예컨대 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함할 수 있다.
각종 상이한 숙주 세포에서의 클로닝 및 폴리펩티드 발현을 위한 시스템이 널리 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 섬유상 진균, 효모 및 바큘로바이러스(baculovirus) 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물이 포함된다. 원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에서 널리 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Plueckthun 1991]을 참조한다. 통상적인 박테리아 숙주는 이. 콜라이이다.
배양물 중 진핵 세포에서의 발현이 또한 결합원의 제조를 위한 선택사항으로서 당업자에게 이용가능하다 (예를 들어 문헌 [Chadd ＆ Chamow (2001)], [Andersen ＆ Krummen (2002)], [Larrick ＆ Thomas (2001)] 참조). 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 헬라(HeLa) 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 그외 다수가 포함된다.
프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 비롯한 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택 또는 제작할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 예를 들어 파지미드(phagemid)이거나 또는 적절한 경우 바이러스, 예를 들어 파지일 수 있다. 추가의 상세설명에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Sambrook ＆ Russell (2001)]을 참조한다. 예를 들어 핵산 구조물의 제조에서 핵산 조작, 돌연변이유발, 서열분석, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석을 위한 다수의 공지 기술 및 프로토콜이 문헌 [Ausubel 1999]에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 시험관내 또는 배양물내 존재할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체내 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 "인트라바디(intrabody)" 또는 세포내 항체로서 본 발명의 결합원의 세포내 발현을 허용할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법에 사용될 수 있다.
또다른 추가의 측면은 본 발명의 핵산을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 도입은 임의의 이용가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술으로는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 우두를 사용한 형질도입이 포함될 수 있거나, 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스가 포함될 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포에의 핵산 도입은 바이러스 또는 플라스미드에 기초한 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 또는 인공 염색체에 혼입될 수 있다. 혼입은 단일 또는 다수 위치에서 하나 이상의 복제물의 무작위 또는 표적화 통합에 의할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술으로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 사용한 형질감염이 포함될 수 있다.
도입에 이어서, 예를 들어 숙주 세포를 유전자 발현을 위한 조건 하에 배양하여 핵산으로부터의 발현을 야기 또는 허용할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 재조합을 촉진하는 서열을 게놈으로 포함시켜 촉진시킬 수 있다.
본 발명은 또한 상기와 같은 결합원 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급한 바와 같은 구조물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 결합원은 인간 또는 동물 대상체, 예를 들어 인간에서의 진단 또는 치료 방법에 사용되도록 디자인된다. 결합원은 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 제공된 바와 같은 결합원의 투여를 포함하는 치료 방법, 상기 결합원을 포함하는 제약 조성물, 및 투여용 약제의 제조에 있어서, 예를 들어 결합원을 제약상 허용되는 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함하는 약제 또는 제약 조성물의 제조 방법에 있어서 상기 결합원의 용도를 제공한다. 제약상 허용되는 비히클은 널리 공지되어 있으며, 선택된 활성 화합물(들)의 속성 및 투여 방식의 함수에 따라 당업자에 의해 변형될 것이다.
본 발명의 결합원은 통상적으로, 결합원 이외에 하나 이상의 성분을 포함할 수 있는 제약 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 제약 조성물 및 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 활성 성분 이외에, 당업자에게 널리 공지된 제약상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질을 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 속성은 경구, 흡입 또는 주사, 예를 들어 정맥내 주사일 수 있는 투여 경로에 좌우될 것이다.
경구 투여용 제약 조성물, 예를 들어 나노바디(nanobody) 등이 또한 본 발명에서 예견된다. 이러한 경구 제제는 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 고통 부위에의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원-무함유이며 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락트산 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요한 경우 사용될 수 있다. 제약 제제의 제조를 위한 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Robinson, 1978]을 참조한다.
조성물은 치료될 상태에 따라 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 동시에 또는 순차적으로, 또는 또다른 치료제(들)과의 조합 제제로서 투여될 수 있다.
A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합원은 부가적인 의약 성분과 함께 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 치료, 특히 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원과 하나 이상의 다른 약물의 조합이 사용되어 유의한 상승 효과를 제공할 수 있다. A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합원은 본원에 열거된 하나 이상의 상태의 치료를 위해 동시에 또는 순차적으로 또는 또다른 치료제(들)과의 조합 제제로서 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 결합원은 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 치료를 위한 기존 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 종양 전이암 및/또는 종양 전이의 치료를 위한 기존 치료제로는 독소루비신, 탁솔, 젬시타빈, 소라페닙, 멜팔란 및 아바스틴이 포함된다.
본 발명의 결합원 및 하나 이상의 상기 부가적인 의약 성분이 약제의 제조에 사용될 수 있다. 약제는 개체에 대한 별개 또는 조합 투여용일 수 있으며, 따라서 별개 제제 또는 조합 제제로서 결합원 및 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 별개 제제가 사용되어 별개 투여 및 순차 또는 동시 투여를 촉진할 수 있으며, 상이한 경로에 의한 성분의 투여, 예를 들어 경구 및 비경구 투여를 허용할 수 있다.
본 발명에 따라, 제공된 조성물은 포유동물에 투여될 수 있다. 투여는 "치료상 유효량"으로 할 수 있으며, 이는 환자에게 이익을 나타내기에 충분한 양이다. 이러한 이익은 적어도 하나 이상의 증상의 개선일 수 있다. 투여된 실제 양, 및 투여 속도 및 시간-경과는 치료될 증상의 속성 및 중증도, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 결합원의 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료 전문가에게 알려진 다른 인자에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량에 대한 결정 등은 일반 전문가 및 기타 의사의 책임 범위 내에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료될 질환의 진행에 좌우될 수 있다.
항체의 적절한 투여는 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌 [Ledermann 1991 and Bagshawe 1991] 참조). 투여될 약제의 유형에 대해 적절한 경우, 본원 또는 문헌 [Physician's Desk Peference (2003)]가 지시하는 특정 투여량이 사용될 수 있다. 본 발명의 결합원의 치료상 유효량 또는 적합한 투여량은 동물 모델에서 시험관내 활성과 생체내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 또는 다른 시험 동물에서의 유효 투여량을 인간에 외삽하는 방법이 공지되어 있다. 정확한 투여량은 항체가 진단용인지, 예방용인지 또는 치료용인지 여부, 치료될 영역의 크기 및 위치, 항체의 정확한 속성 (예를 들어 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 및 임의의 검출가능한 표지 또는 항체에 부착된 다른 분자의 속성을 비롯한 다수의 인자에 좌우될 것이다. 전형적인 항체 투여량은 전신 적용의 경우 100 μg 내지 1 g, 국소 적용의 경우 1 μg 내지 1 mg의 범위일 것이다. 초기의 보다 많은 로딩 투여량에 이어서 하나 이상 적은 투여량을 투여할 수 있다. 항체는 전체 항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 이소형일 수 있다. 이는 성인 환자의 단일 치료를 위한 투여량으로, 소아 및 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있으며, 또한 다른 항체 형식에 대해 분자량에 비례하여 조정될 수 있다. 치료는 의사의 판단하에 매일, 주당 2회, 주 또는 월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여의 경우 2주 내지 4주 마다, 정맥내 투여의 경우 4주 내지 8주 마다 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료는 주기적이며, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어 약 3주 이상, 약 4주 이상, 또는 한달에 약 한번이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 치료는 수술 전 및/또는 후에 제공될 수 있으며, 수술 처치의 해부학상 부위에 직접 투여 또는 적용될 수 있다.
하기 실험 예시를 비롯한 본 개시에 의해 본 발명의 추가의 측면 및 실시양태는 당업자에게 분명할 것이다.
물질 및 방법
동물 모델
동물 실험을 스위스 연방 수의 사무국(Swiss Federal Veterinary Office)에 의해 승인받았으며, 스위스 동물 보호 법령(Swiss Animal Protection Ordinance)에 따라 수행하였다. 마우스를 정기적으로 모니터링하였다. 통증 또는 고통의 임의의 징후가 보일때, 또는 15％ 초과의 체중 손실의 경우에, 동물을 안락사시켰다. 수컷 sv129 마우스 (RCC, 스위스 퓔링스도르프 소재)에 약 106개의 돌연변이 F9 뮤린 기형암종 세포를 정맥내 주사하였으며 (문헌 [Terrana et al. 1987] 참조), 이는 다리오 루시아노(Dario Rusciano) (SIFI, 이탈리아 카타니아 소재)에 의해 친절하게 제공받은 것이다. 마우스를 종양 세포 주사 3주 후 생체내 비오티닐화, 표적화 실험 또는 면역조직화학용 기관 절제를 위해 사용하였다.
생체내 비오티닐화
생체내 비오티닐화 실험을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Roesli et al. 2006, Pybak et al. 2005] 참조). 요컨대, 마취된 마우스의 가슴을 정중 흉골절개를 통해 개방하였다. 왼쪽 심실을 관류 바늘로 구멍내고, 오른쪽 심방을 조그맣게 절단하여 관류 용액이 유출되도록 하였다. 그 직후, 1.5 ml/분의 유속 및 100 mm Hg의 압력으로 전신 순환의 관류를 수행하였다. 제1 단계에서, 혈장 증량제로서 10％ (w/v) 덱스트란-40 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), 스웨덴 우프살라 소재)이 보충된, PBS (pH 7.4) 중 1 mg/ml 술포-NHS-LC-비오틴 (피어스, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 함유하는 15 ml 비오티닐화 용액 (38℃로 사전가온됨)을 이용하여 관류를 수행하였다. 이로써, 비오티닐화 반응과 경쟁할 수 있는 혈액 성분이 관류의 처음 몇분 이내에 순환으로부터 제거되었고, 상이한 조직에서 이용가능한 1급 아민-함유 단백질 (및 특정 당지질 및 인지질)이 비오틴에 의해 공유결합적으로 변형될 수 있었다. 미반응 비오티닐화 시약을 중화시키기 위해, 생체내 비오티닐화에 이어, 38℃로 사전가온된 PBS (pH 7.4) 중 50 mM Tris, 10％ (w/v) 덱스트란-40을 이용하여 10분 세척 단계를 수행하였다. 비오티닐화 시약을 이용한 관류 동안 (및 켄칭 용액을 이용한 후속 관류 처음 3분 동안), 심장 주위 영역을 PBS (pH 7.4, 38℃) 중 50 mM Tris로 세척하여 유출되는 미반응 비오티닐화 시약을 켄칭하고, 기관 표면에서 분자의 목적하지 않은 표지화를 방지하였다. 관류 후, 기관 및 종양을 잘라내고, 시편을 기관 균질현탁액(homogenate)의 제조를 위해 새롭게 급속-냉동시키거나 냉동삽입 화합물 (마이크롬(Microm), 독일 발도르프 소재)에 삽입하고, 조직화학 분석용 냉동단면의 제조를 위해 액체 질소 중의 이소펜탄 중에서 냉동시켰다. 비관류 마우스를 단백질 분석을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다.
프로테오믹(proteomic) 분석을 위한 단백질 추출물의 제조
시편을 조직 mg 당 40 μl의 용해 완충액 (PBS (pH 7.4) 중 2％ SDS, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 완전한 E 프로테이나제 억제제 칵테일 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임 소재) 중에 재현탁시키고, 울트라-투락 스(Ultra-Turrax) T8 분산기 (이카-베르케(IKA-Werke), 독일 스타우펜 소재)를 사용하여 균질화하였다. 균질현탁액을 비브라(Vibra)-세포 (소닉스(Sonics), 미국 코네티컷주 뉴 타운 소재)를 사용하여 초음파처리하고, 이어서 99℃에서 15분 인큐베이션하고, 15000×g에서 20분 원심분리하였다. 상청액을 전체 단백질 추출물로서 사용하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 시약 키트 (피어스)를 사용하여 측정하였다.
비오티닐화 단백질의 정제
각각의 샘플에 대해, 960 μl 스트렙타비딘-세파로스 (아머샴 바이오사이언시즈, 스웨덴 우프살라 소재) 슬러리를 완충액 A (PBS 중 NP40 1％, SDS 0.1％)에서 3회 세척하고, 펠렛화하고, 15 mg의 전체 단백질 추출물과 혼합하였다. 비오티닐화 단백질의 포획을 회전 혼합기에서 실온에서 2시간 동안 진행시켰다. 상청액을 제거하고, 수지를 완충액 A로 3회 세척하고, 완충액 B (PBS 중 NP40 0.1％, NaCl 1 M)로 2회 세척하고, 50 mM 중탄산암모늄으로 1회 세척하였다. 최종적으로, 수지를 400 μl의 50 mM 중탄산암모늄 용액에 재현탁시키고, 20 μl의 서열분석 등급 변형된 돼지유래 트립신 (50 mM 중탄산암모늄 중 40 ng/μl의 원액) (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 첨가하였다. 일정한 교반 하에 37℃에서 밤새 프로테아제 소화를 수행하였다. 펩티드를 탈염하고, 정제하고, C18 마이크로컬럼 (집팁(ZipTip) C18, 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)으로 농축시켰다. 동결건조 후, 펩티드를 -20℃에서 저장하였다.
MALDI 표적 플레이트 상에 스팟팅하는 자동화 온라인 분별을 이용한 나노 모 세관-HPLC
얼티메이트(UltiMate) 나노스케일 LC 시스템 및 FAMOS 마이크로오토샘플러 (LC 팩킹스(LC Packings), 네덜란드 암스테르담 소재)를 사용하며 크로멜론(Chromeleon) 소프트웨어 (디오넥스(Dionex), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에 의해 제어되는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 트립신 펩티드를 분리하였다. 이동상 A는 물 중 2％ 아세토니트릴 및 0.1％ 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어졌고, 이동상 B는 물 중 80％ 아세토니트릴 및 0.1％ TFA이었다. 유속은 300 nl/분이었다. 1.5 mg의 전체 단백질로부터 정제된 비오티닐화 단백질 친화성의 소화로부터 유래된 동결건조 펩티드를 5 μl의 완충액 A에 용해시키고, 컬럼 (내경: 75 μm, 길이 15 cm, C18 PepMap 100으로 채워짐, 3 μm, 100 Å 비드; LC 팩킹스) 상에 로딩하였다. 펩티드를 7분 동안 0 - 30％ B, 67분 동안 30 - 80％ B, 3분 동안 80 - 100％ B, 및 5분 동안 100％ B의 구배로 용출시키고, 컬럼을 20분 동안 100％ A로 평형화시킨 후, 다음 샘플을 분석하였다. 용출된 분획을 물 중 3 mg/ml α-시아노-4-히드록시 신남산, 277 pmol/ml 뉴로텐신 (내부 표준), 0.1％ TFA 및 70％ 아세토니트릴의 용액과 혼합하고, 온라인 프로보트(Probot) 시스템 (디오넥스)을 사용하여 192-웰 MALDI 표적 플레이트 상에 배치하였다. MALDI-매트릭스 용액의 유속을 1.083 μl/분으로 설정하였다. 따라서, 20초 동안 수집된 각각의 분획은 361 nl MALDI-매트릭스 용액 및 100 nl 샘플을 함유하였다. 뉴로텐신의 종말-농도는 웰 당 100 fmol이었다.
MALDI-TOF/TOF 질량 분광법
MALDI-TOF/TOF 질량 분광법 분석을 4700 프로테오믹스 애널라이저(Proteomics Analyzer) (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 매사추세츠주 프라밍함 소재)를 이용하여 수행하였다. 전구체 이온 선택을 위해, 모든 분획을 MS 모드에서 측정한 후, MS/MS를 수행하였다. 샘플 스팟 당 최대 15개의 전구체를 이후 충돌 유도 해리에 의한 단편화를 위해 선택하였다. 스펙트럼을 진행시키고, 인 실리코(in silico) 소화된 단백질의 데이타베이스에 대해 MS 및 MS/MS 데이타를 매칭시키기 위한 내부 MASCOT (매트릭스 사이언스(Matrix Science), 영국 런던 소재) 소프트웨어를 사용하는 글로벌 프로테인 서버 워크스테이션(Global Protein Server Workstation) (어플라이드 바이오시스템즈)에 의해 분석하였다. 획득한 데이타를 NCBI 홈페이지 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 다운로드한 마우스 데이타베이스에 대해 스크리닝하였다. MASCOT 소프트웨어로 수행한 단백질 동정은 최상의 펩티드 이온에 대한 95％ 신뢰 구간 내에 드는 정확한 것으로 여겨졌다.
MALDI-TOF 및 MALDI-TOF/TOF 질량 분광법 분석을 4700 프로테오믹스 애널라이저 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 수행하였다. 펩티드 질량을 2000 m/z의 초점 질량으로 750 내지 4000 m/z의 범위에 걸쳐서 얻었다. MS 스펙트럼을 355 nm 및 200 Hz에서 작동하는 Nd:YAG 레이저에서 2000 레이저 샷으로부터 총합하였다. 자동화 플레이트 교정을 6개의 교정 웰에서 5개의 펩티드 표준 (질량 900 내지 2400 m/z; 어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 수행하였다. 이러한 플레이트 교정을 사용하여 기구 초기 질량 교정을 업데이트하였으며, 이는 모든 MS 및 MS/MS 스펙트럼에 적용되었다. 또한, MALDI 매트릭스에 첨가된 내부 표준 펩티드 를 사용하여 각각의 MS 스펙트럼의 내부 교정을 수행하였다. 시그널 대 노이즈 비가 100 초과인 샘플 웰 당 최대 15개의 전구체를 이후 충돌 유도 해리에 의한 단편화를 위해 자동적으로 선택하였다. MS/MS 스펙트럼을 2500 내지 5000 레이저 샷으로부터 총합하였다. 스펙트럼을 진행시키고, 인 실리코 소화된 단백질의 데이타베이스에 대해 MS 및 MS/MS 데이타를 매칭시키기 위한 내부 MASCOT (매트릭스 사이언스) 소프트웨어를 사용하는 글로벌 프로테인 서버 워크스테이션 (어플라이드 바이오시스템즈)에 의해 분석하였다. MASCOT 조사 파라미터는 (i) 2006년 9월 9일에 유러피안 바이오인포매틱스 인스티튜트(European Bioinformatics Institute (EBI)) 홈페이지(ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/SPproteomes/fasta/proteomes/59.M_musculus.fasta.gz)로부터 다운로드한 마우스 데이타베이스; (ii) 효소: 트립신 및 세미-트립신; (iii) 간과된 절단의 허용된 수: 1; (iv) 가변성 번역후 변형: 메티오닌 산화; (v) 펩티드 부하: ±30 ppm; (vi) MS/MS 부하: ±0.2 Da; (vii) 펩티드 전하: +1; (viii) 펩티드에 대한 최소 이온 스코어 C.I.％: 95 및 (ix) 최대 팹티드 등급: 1 이었다. 또한, 하기 파라미터를 이용한 MS/MS 피크 필터링을 사용하였다: (i) 질량 범위: 60 Da 내지 20 Da 미만의 전구체 질량; (ii) 최소 시그널 대 노이즈 비: 6; (iii) 피크 밀도 필터: 200 Da 당 최대 30 피크 및 (iv) 스펙트럼 당 피크의 최대수: 65.
항체
항-ED-B 항체 단편 scFv (L19)의 단리는 이전에 기재되었다 (문헌 [Pini et al. 1998] 참조). 모 항-ED-A 항체를 공개된 절차를 사용하여 ETH-2 라이브러리로 부터 단리하였다 (문헌 [Giovannoni, Nucleic. Acid Research, 2001, 29(5):E27] 참조). 고친화성 항-ED-A 항체를 생성하는 모 항-ED-A 항체의 친화성 성숙은 하기 단락에서 설명한다.
모 항-ED-A 항체의 친화성 성숙
모 항-ED-A 항체 (ETH-2-유래 항체)를 친화성 성숙 라이브러리의 제작을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 라이브러리의 VH CDR1 (DP47 생식세포계열) 및 VL CDR1 (DPK22 생식세포계열)에서의 서열 가변성은, VH CDR1의 위치 31, 32 및 33 및 VL CDR1의 위치 31, 31a 및 32에서 무작위 돌연변이를 생성하는 방법에서 VH에 대해서는 부분적 퇴행성 프라이머 5'-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3' (서열 17) 및 VL에 대해서는 5'-CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3' (서열 18) (모든 올리고뉴클레오티드는 오페론 바이오테크놀로지스(Operon Biotechnologies; 독일 쾰른 소재)로부터 구입함)을 사용하여 PCR에 의해 도입하였다. VHVL 조합은, 템플레이트로서 겔-정제된 VH 및 VL 분절을 사용하며 프라이머 LMB3long (5'-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3') (서열 19) 및 fdseqlong (5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3') (서열 20)을 사용하여 PCR 조립에 의해 scFv 형식으로 조립하였다. 조립된 VH-VL 단편을 NcoI/NotI로 이중 소화시키고, NcoI/NotI-소화된 pHEN1 파지미드 벡터 내로 클로닝하였다 (문헌 [Hoogenboom et al., 1991] 참조). 생성된 라이게이션 생성물을 문헌 [Viti et al., 2000]에 따라 전기감응(electrocompetent) 이. 콜라이 TG-1 세포 내로 전기천공하여, 1.5×107 개별 항체 클론을 함유하는 라이브러리를 생성하고, 이를 향상된 친화성으로 ED-A에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하였다.
항-ED-A 항체의 선택
상기 기재된 항체 라이브러리를 BIAcore 분석을 사용하여 모 항-ED-A 항체보다 더 큰 친화성으로 ED-A에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하였다. BIAcore 분석에 사용된 항원 (11A12)은 인간 피브로넥틴의 ED-A 도메인을 함유하였으며, 하기 아미노산 서열 (서열 120)을 가졌다:
Figure 112009066749982-PCT00001
항원 (11A12)의 뉴클레오티드 서열 (서열 121)은 하기와 같다:
Figure 112009066749982-PCT00002
항원의 뉴클레오티드 서열을 각각 5' 및 3'에서 BamHI 및 BglII 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물 및 벡 터 pQE12 (QIAGEN)를 BamHI 및 BglII 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킨 후, 삽입물 대 벡터를 3:1의 비로 함유하는 반응에서 라이게이션하였다. 생성된 벡터를 서열분석하여 서열이 정확한지 검사하였다.
항원을 하기와 같이 제조하였다:
10 ml 2TY, Amp, 1％ 글루코스 중 TG1 전기감응 사전배양물을 11A12의 DNA 미니프렙 1 μl의 존재 하에 전기천공하였다. 이어서, 사전배양물을 1:100으로 희석하고 (2TY, Amp, 0.1％ 글루코스 800 ml 중 8 ml), 0.4 내지 0.6의 OD600으로 성장시킨 다음, 밤새 IPTG로 유도하였다. 다음날, 세포를 회전 침강시키고, 상청액을 여과하였다 (밀리포어 0.22 μm). 배양물의 원심분리 및 정화 후, FPLC 상에서 힛트랩(Hitrap) 컬럼을 사용하여 11A12를 정제하였다. Ni/컬럼을 하기와 같이 재생하였다: 컬럼을 5 컬럼 부피 (CV) H2O로 헹군 후, 3CV 0.5 M EDTA/0.2 M Tris (pH 8)를 적용하여 컬럼으로부터 오래된 니켈을 세척 제거하였다. 이어서, 5CV H2O로 컬럼을 헹구었다. 이어서, 컬럼을 2CV 100 mM NiSO4로 재로딩한 후, 여러 CV H2O로 컬럼을 헹구었다. 이어서, 컬럼을 5CV 용해 완충액 (20 mM 이미다졸/250 mM NaCl/PBS (pH 7.4))으로 평형화하였다. 세포 용해물을 여과하고 (밀리포어 0.45 μm), 컬럼 상에 (수동으로) 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 다시 FPLC 상에 놓고, UV 시그널이 안정할 (일정할) 때까지 용해 완충액이 흐르도록 하였다 (약 3CV). 이어서, 용출 프로그램을 시작하였다: 5CV로 용출 완충액 (400 mM 이미다졸/250 mM NaCl/PBS (pH 7.4)) 0％ 내지 100％의 구배. 용출된 항원을 함유하는 분획을 모으 고, 밤새 PBS에서 투석하였다.
항-ED-A 항체의 발현 및 정제
항-ED-A 항체를 하기와 같이 발현시키고 정제하였다: 10 ml 2TY, Amp, 1％ 글루코스 중 TG1 전기감응 사전배양물을 항-ED-A 항체 중 하나의 DNA 미니프렙 1 μl의 존재 하에 전기천공하였다. 이어서, 사전배양물을 1:100으로 희석하고 (2TY, Amp, 0.1％ 글루코스 800 ml 중 8 ml), 0.4 내지 0.6의 OD600으로 성장시킨 다음, 밤새 IPTG로 유도하였다. 다음날, 세포를 회전 침강시키고, 상청액을 여과하였다 (밀리포어 0.22 μm). scFv를 단백질 A-세파로스 컬럼 상에서 정제하고, 트리에틸아민을 사용하여 컬럼으로부터 scFv를 용출시켰다. 용출된 scFv를 함유하는 분획을 4℃에서 밤새 PBS에서 투석하였다. 이어서, scFv 분획을 0.5 ml/분으로 흐르는 PBS를 함유하는 슈퍼덱스(Superdex) 75 컬럼 상에 놓고, 0.25 ml 분획을 수집하였다. 단량체 분획을 BIAcore 분석에 사용하였다.
BIAcore 분석 1
BIAcore 칩을 HBS-EP 완충액 BIACORE, 0.01 M Hepes (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ 계면활성제 P20 (분석에 사용된 동일한 완충액)을 이용하여 5 μl/분의 유속으로 밤새 플러슁하였다. 항원 (11A12)을 아세테이트 완충액 (pH 4.0) 중 50 μg/ml의 농도로 희석하고, 칩 상의 COOH기를 N-히드록시 숙신이미드 (MHS)와 에틸-N-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC)의 혼합물 50 μl를 주입하여 활성화하였다. 11A12 항원 40 μl를 칩 상에 주입하고, 잔류 유리 COOH기를 에탄올아민 30μl로 차단하였다. 0.22 μm 여과 후, 각각의 개별 박테리아 상 청액 20 μl를 칩 상에 주입하고, 항원과의 상호작용을 실시간 모니터링하였다.
BIAcore 분석 2
모 항-ED-A 항체의 kon, kOff 및 KD, 및 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9를 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance)을 사용하여 평가하였다. 칩을 분석 동안 사용된 동일한 완충액을 이용하여 5 μl/분의 완충액 유속으로 밤새 평형화하였다. 이 유속으로 전체 코팅 절차를 수행하였다. 항원 11A12를 아세테이트 완충액 (pH 4.00) (BIACORE에서 제공)에 의해 1:25로 희석하여 20 μg/ml의 최종 농도가 되게 하였다. 이어서, NHS 및 EDC를 혼합하고, 50 μl를 주입하여 CM5 칩 상의 COOH기를 활성화하였다. 이어서, 항원 40 μl를 주입하였다 (이를 약 40'' 지속하였다). 이어서, 에탄올아민 30 μl를 주입하여 최후 유리 COOH의 반응성을 차단하였다.
각각의 샘플을 유속 20 μl/분에서 분석하였다. 20 μl의 비희석 단량체 단백질 (겔 여과로부터 유래됨)을 주입하였다. 해리 시간을 약 200'' 동안 진행하도록 두었다. 이어서, 10 mM HCl 10 μl를 주입하여 칩을 재생하였다. 단량체 단백질의 주입을 상이한 희석, 즉 1:2 희석 (PBS 중)으로 반복한 다음, HCl로 재생하였다. 이어서, 1:4 희석으로 단백질의 세번째 주입 후, 다시 HCl로 재생하였다. 각각의 항-ED-A 항체에 대한 kon, kOff 및 KD 값을 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
조직화학
성공적인 생체내 비오티닐화를 증명하기 위해, 이후 비오티닐화 구조물의 염색을 문헌 [Rybak et al. 2005]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단면 (10 μm)을 새롭게 냉동된 시편으로부터 절단하고, 아세톤으로 고정시키고, 스트렙타비딘:비오티닐화 알칼리성 포스파타제 착체 (바이오스파(Biospa), 이탈리 밀라노 소재) 및 패스트-레드(Fast-Red) TP (시그마(Sigma))로 [내인성 알칼리성 포스파타제를 억제하기 위한 1 mM 레바미솔의 존재 하에] 연속 인큐베이션하고, 헤마톡실린 용액 (시그마)으로 대비염색하였다.
FLAG-태그를 운반하는 scFv-항체에 의한 면역조직화학 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어 문헌 [Brack et al. 20O6] 참조). 요컨대, 단면을 scFv 단편 (최종 농도 2-10 μg/mL) 및 단클론 항-Flag 항체 M2와 동시에 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체 (다코사이토메이션(Dakocytomation), 덴마크 글로스트룹 소재)로 검출한 다음, 마우스 단클론 알칼리성 포스파타제-항-알칼리성 포스파타제 착체 (다코사이토메이션)로 검출하였다. 패스트-레드 (시그마)를 포스파타제 기질로서 사용하고, 단면을 헤마톡실린 (시그마)으로 대비염색하였다.
모든 단면을 글리세르겔(Glycergel) (다코사이토메이션, 덴마크 글로스트룹 소재)에 탑재하고, 악시오비젼(Axiovision) 소프트웨어 (칼 자이스(Carl Zeiss), 스위스 펠드바흐 소재)를 사용하는 악시오버트(Axiovert) S1OO TV 현미경 (칼 자이스)으로 분석하였다.
항-ED-A 항체를 이용한 생체내 표적화
모 항-ED-A 항체 scFv를 시판용 적외선 형광물질 유도체 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 750 카르복실산 숙시니딜 에스테르 (인비트로겐(Invitrogen))를 이용하여 공급자 프로토콜에 따라 표지하였다. 표지된 항체를 PD-10 컬럼 (쥐이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하는 겔 여과에 의해 미반응 염료로부터 분리하였다. 인비트로겐 표지화 프로토콜에 따라 측정된 표지화 정도는 항체 분자 당 5 염료 분자였다. 알렉사 750-표지된 모 항-ED-A scFv 항체 (최종 농도 0.3 mg/ml)를 F9DR 종양 세포 주입 3주 후 Sv190 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다 (200 μl/마우스, 즉 60 μg 항체/마우스). 표지된 항체의 주입 6시간 후 마우스 기관을 잘라내고, 텅스텐 할로겐 램프, 알렉사 750에 특이적인 여기 및 방출 필터 및 단색 CCD 카메라가 장착된 자가제작 적외선 형광 영상화기 (문헌 [(Birchler et al. 1999] 참조)를 이용하여 영상화하였다.
F8 디아바디의 생체분포
F8 디아바디는 예를 들어 scFv 형식에서 사용된 바와 같은 항-ED-A 항체 F8과 동일한 VH 및 VL 도메인을 포함한다. F8 디아바디 및 항-ED-A scFv F8은 VH와 VL 도메인 사이에 상이한 링커 서열을 갖는다. F8 디아바디 링커의 아미노산 서열은 GSSGG (서열 28) (뉴클레오티드 서열: gggtccagtggcggt [서열 29])이다. 따라서, F8 디아바디 링커 서열은 5개의 아미노산 길이인 반면, 항-ED-A scFv F8에서 링커는 20개의 아미노산 길이이다 (서열 11 참조). VL과 VH 도메인 사이의 링커 길이의 감소는 VL 및 VH 도메인이 분자내에서 쌍을 이루기보다는 분자간에 쌍을 이루는 것이 바람직하다는 것을 의미한다. 결과적으로, 한 F8 폴리펩티드의 VL 도메 인은 동일한 F8 폴리펩티드의 VH 도메인과 쌍을 이루기보다는 또다른 F8 폴리펩티드의 VH 도메인과 더 쌍을 이루는 것 같다.
F8 디아바디를 이. 콜라이 TG1 세포에서 하기와 같이 발현시켰다: F8 디아바디를 코딩하는 DNA를 전기천공법을 사용하여 전기감응 이. 콜라이 TG1 세포에 도입하였다. 전기천공된 이. 콜라이 세포를 10 ml 2YT 배지, Amp, 1％ 글루코스에서 사전배양하였다. 사전배양물을 2YT 배지, Amp, 0.1％ 글루코스 800 ml 중에 1:100으로 희석하고, 배양물을 0.6의 밀도 (OD600 nm)로 성장시켰다. 이어서, 1 mM의 IPTG를 사용하여 F8 디아바디의 발현을 유도하였다.
발현된 F8 디아바디를 하기와 같이 125I로 표지하였다: 10 μl의 멸균 PBS를 요오도겐 튜브 (클로로포름 중 0.1 mg/ml 요오도겐 50 μl로 코팅됨) 내에 첨가하고, 이어서 2 μl의 125I 요오드화나트륨 (약 200 μCi)을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, OD 0.2의 F8 디아바디 400 μl (약 60μg)를 요오도겐 튜브에 첨가하고, 실온에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 이 혼합물의 1/100을 수집하여 혼합물에 함유된 방사능을 측정하였다 ('INPUT'으로 지칭). 이어서, 표지된 F8 디아바디를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 (PD1O: 세파덱스(Sephadex) G-25 M, 쥐이 헬쓰게어) 상에 로딩하여 유리 요오드로부터 요오드화 F8 디아바디를 분리하였다. 수집된 요오드화 F8 디아바디의 방사능을 측정하고, F8 디아바디에 혼입된 요오드의 백분률 (요오드화 F8 디아바디의 CPM [분 당 계수]/INPUT의 CPM)을 30 내지 40 ％로 계산하였다.
4개의 F9 종양-보유 마우스를 루골(Lugol) 상에 2일 동안 놓아 (600 μl를 300 ml 내로) 갑상선을 차단하고, 각각의 마우스에 요오드화 F8 디아바디 200 μl를 정맥내 주사하였다 (마우스 당 약 5 내지 8 μg의 요오드화 F8 디아바디 [18 μCi]). 24시간 후, 마우스를 희생시키고, 종양, 간, 폐, 비장, 심장, 신장, 장, 꼬리 및 혈액을 제거하고 (이와 관련하여 본원에서 집합적으로 마우스 '조직'으로 지칭), 방사능 계수에 사용하였다. 각각의 조직 샘플에서의 방사능 수준을 퍼킨(Perkin) 감마-계수기를 사용하여 측정하였다. '결과(output)'는 주입된 투여량의 백분률 (CPM)을 조직의 중량 (g)으로 나누어 계산하였다 (％ID/g).
결과
차별적으로 발현된 단백질 및 스플라이스 변이체의 동정
간 및 F9 간 전이암에서 이용가능한 단백질의 비교 분석에 사용된 관류-기재 화학적 프로테오믹 방법 (문헌 [Terrana et al, 1987] 참조)이 도 1A에 도시되어 있다. 이들 종양은 마우스 간의 표면 및 내부에 많은 전이 병소를 발생시킨다 (도 1B). 종결 마취 하에, 종양-보유 마우스를 혈장 증량제로서 10％ 덱스트란-40이 보충된 PBS (pH 7.4) 중 술포숙시미딜-6-[비오틴-아미도] 헥사노에이트 (1 mg/ml)의 1.8 mM 용액 15 ml로 관류하였다. 전형적으로 10분 지속되는 이 절차는 주요 순환 기관 모두로부터 혈액을 제거하고, 혈관의 관강(luminal) 및 관강에서 떨어진(abluminal) 측면 상에서 이용가능한 단백질의 선택적 비오티닐화를 가능하게 하였다. 사실상 F9 간 전이암의 모든 혈관은, 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 접 합체를 이용한 조직화학 염색에 의해 확인된 바와 같이, 상기 절차에 의해 효율적으로 및 선택적으로 표지된다 (도 1C). 정상 간에서, 혈관은 강하게 염색되지만, 일부 동모양혈관이 표지된 것도 간의 생리적 여과 기능에 적합하게 검출되었다 (도 1C). 생체내 비오티닐화를 1급 아민 함유 용액을 이용한 관류에 의해 켄칭하였다. 이후, 간 전이암의 시편을 간으로부터 잘라내고, 균질화하고, 스트렙타비딘 수지 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 강력 세제 SDS의 존재 하에서 비오티닐화 단백질을 회수하는데 사용하였다 (도 1A). 숙주 간에서 전이 단백질 확산의 위험을 최소화하기 위해, 생체내 비오티닐화된 건강한 마우스로부터의 간을 정상 간 혈관계의 연구에 사용하였다. F9 종양 마우스로부터의 숙주 간을 사용하는 것은 또한, 잔류하는 건강한 조직이 거의 없고 미세전이암의 부재를 거시적으로 제외하는 것이 어렵기 때문에 문제가 있었다. 전체적으로, 생체내 비오티닐화된 건강한 마우스 7 마리 및 생체내 비오티닐화된, F9 종양-보유 마우스 9 마리로부터의 샘플을 프로테오믹 분석에 사용하였다. 또한, 2 마리의 건강하고 3 마리의 전이암-보유 비-비오티닐화 마우스로부터의 시편을 음성 대조군으로서 사용하였다. F9 전이암 및 정상 간으로부터 스트렙타비딘 포획된 단백질의 엄격한 세척 절차 및 수지상 트립신 소화 (병행 처리됨)는 펩티드 수집물을 생성하였고, 이를 나노-HPLC 및 MALDI-TOF/TOF 질량 분광법 절차를 사용하여 분리, 동정 및 비교하였다 (문헌 [Roesli et al., 2006] 참조).
전체적으로, 1291개의 상이한 펩티드를 동정하여 (95％ 초과의 Mascot 신뢰수준), Mascot 소프트웨어에 의해 480개의 상이한 펩티드 세트로 군을 나누었다. 이들 펩티드 세트 중 몇몇은 또한 비-비오티닐화 마우스로부터의 음성 대조군 샘플에서 발견되었다 (예를 들어 보조인자로서 내인성 비오틴을 운반하는 카르복실라제, 오염물질로서 케라틴, 또는 혈청 알부민과 같이 매우 풍부한 단백질). 나머지 435개의 동정된 펩티드 세트 중, 331개는 Mascot 소프트웨어에 의해 명백하게 단일 단백질로 주해할 있는 반면, 104개의 펩티드 세트는 다수 (총 358개) 단백질로 주해하였다. 대부분의 경우에서, 동일한 펩티드 세트로 주해된 다수 단백질은 관련 단백질 과 (예를 들어 면역글로불린)에 속하거나 또는 심지어 상이한 데이타베이스 엔트리(entry)를 갖는 동일한 단백질일 수 있다. 435개의 상이한 펩티드 세트 중, 117개는 전이 시편에서만 배타적으로 발견되었고, 단지 193개는 건강한 간 시편에서, 125개는 두 유형의 조직 모두에서 발견되었다. 예를 들어, 피브로넥틴 (생물공학 정보를 위한 국립 센터 [NCBI] 접근 번호 P11276)에 매칭되는 펩티드가 4개의 건강한 간 시편 및 8개의 전이 시편에서 발견되었다.
건강한 간 및 전이 시편 모두에서 발견된 단백질 (예를 들어 피브로넥틴)은 두 샘플에서 실질적으로 상이한 수준으로 존재할 수 있다. 이 경우, 단백질이 검출된 시편의 수, 및/또는 간 및 전이 샘플에서 관찰된 펩티드의 수 (및 표준화된 펩티드 시그널 강도; 문헌 [Scheurer et al. 2005, Scheurer et al. 2005] 참조)에 반영되어야 한다. 예를 들어, 피브로넥틴 (NCBI 접근 번호 P11276)으로부터의 38개 트립신 펩티드는 전이 시편에서만 발견된 반면, 한 펩티드는 건강한 간 시편에서만 발견되었다. 11개의 펩티드는 두 유형의 시편 모두에서 발견되었다.
현저히 풍부한 피브로넥틴-유래 펩티드가, 간이 피브로넥틴 생합성 부위라는 사실에도 불구하고 간 전이암에서 검출되었으며, 본 발명자들로 하여금 비교적 풍부한 피브로넥틴-유래 펩티드에서의 차이점 및 다르게 스플라이싱된 도메인의 과발현을 조사하도록 하였다. 하기 표 1은 프로테오믹 분석에서 동정된 모든 피브로넥틴 펩티드를 열거한다. 마우스 피브로넥틴은 선택적 스플라이싱될 수 있는 2 유형-III 원형 엑스트라-도메인 ED-A 및 ED-B를 함유한다 (문헌 [ffrench-Constant 1995, Hynes 1990, Kaspar et al. 2006] 참조). 또한, IIICS 분절은 마우스 및 인간에서 상이한 스플라이싱 패턴을 겪는다. 흥미롭게도, 모든 3 ED-A-유래 펩티드 및 IIICS-유래 펩티드가 단지 종양 샘플에서만 관찰되었다.
ED-B-유래 펩티드는, ED-B가 리신 잔기를 함유하지 않으며 2개의 아르기닌이 검출되기에 크기가 너무 큰 펩티드를 생성한다는 사실로 인해, 본 분석에서 관찰되지 않을 것이다. 도 2A는 피브로넥틴 도메인 구조 상에 종양 시편 (종양) 및 건강한 간 시편 (정상)에서 동정된 펩티드의 위치를 도시한다. 도 2B는 2개의 피브로넥틴-유래 펩티드, 즉 ED-A 도메인 내에 위치하는 IAWESPQGQVSR (서열 16) 및 도메인 14에 위치하는 FLTTTPNSLLVSWQAPR (서열 15)에 대한 표준화된 MS 시그널의 상대적 강도를 도시한다. 후자의 펩티드는 전이 시편에서 보다 풍부하였지만, 정상 간 대응부에서도 분명히 검출가능하였다. 반대로, ED-A-유래 펩티드는 전이 샘플에서 강한 시그널을 제공하였지만, 정상 간에서는 완전히 검출가능하지 않았다 (즉 100배 초과의 낮은 시그널).
면역조직화학
간 구조물과 전이 신생 혈관 사이의 가장 현저한 차이점은 피브로넥틴의 ED- A 및 ED-B 도메인에 대해 관찰되었다. 두 경우에서, 전이 혈관의 강하고 특이적인 염색이 관찰되었지만, 정상 간 및 사실상 모든 정상 기관 (증식 단계에 있는 자궁내막 및 난소의 일부 관 제외)은 본 면역조직화학 분석에서 음성으로 기록되었다 (도 3A). 중요하게는, ED-A는 또한 인간 폐 전이암 및 간 전이암의 신생 혈관계에서 강하게 발현되는 것으로 밝혀졌다 (도 4).
생체내 표적화
전이암의 리간드-기재 관 표적화를 위한 표적으로서 ED-A의 유용성을 시험하기 위해, 근적외선 형광 영상화를 사용하여 생체내 표적화 실험을 수행하였다. 모 항-ED-A scFv 항체를 알렉사 플루오르 750으로 표지하고, F9 전이암-보유 마우스에 정맥내 주사하였다. 잘라낸 기관의 근적외선 형광 영상화는 전이 병변에서 표적화제의 현저한 축적을 드러냈다 (도 3B).
항-ED-A 항체의 선택
BIAcore 분석 1
BIAcore 분석은 하기와 같이 항원에 대한 항체의 친화성을 추론하기 위해 분석된 각각의 항-ED-A 항체에 대한 그래프를 생성하였다: 각 그래프의 x 축은 시간에 해당하고, y 축은 공명 단위 (BIAcore 칩 상에 코팅된 항원에 대해 시험된 항체의 결합 친화성을 나타내는 척도)에 해당한다. 각 그래프는, 완충액의 변화에 상응하므로 결과의 해석에는 무관한 3 피크 및 1 하락(dip)을 나타내었다.
각 그래프의 상승부는 회합 단계를 나타낸다. 그래프의 이 부분에서 곡선이 가파를수록, 항체와 항원의 회합은 보다 빠르다. 각 그래프의 하강부는 항원으로 부터 항체의 해리 단계를 나타낸다. 그래프의 이 부분에서 곡선이 편평할수록, 항원으로부터 항체의 해리는 보다 느리다.
항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9 모두는 이들이 유래된 모 항-ED-A 항체보다 더 편평한 해리 곡선을 나타내었으며, 이는 이들이 모 항-ED-A 항체보다 더 큰 친화성으로 ED-A 및 그에 따라 또한 A-FN에 결합함을 나타낸다. 항체 E5, F1, F8 및 H1에 대한 그래프는 시험된 모든 항-ED-A 항체 중 가장 편평한 해리 곡선을 나타내었다. 항체 H1, C5, D5, E5, C8, F8 및 F1의 회합 곡선은 모 항-ED-A 항체에 대해 관찰된 경우보다 더 편평하였으며, 항체 B2, B7, E8 및 G9에 대해 관찰된 회합 곡선은 모 항-ED-A 항체에 대해 관찰된 회합 곡선만큼 가파랐다. 그러나, IPTG-유도 이. 콜라이 TG-1 세포의 박테리아 상청액을 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 BIAcore 분석에 사용하였기 때문에, 시험된 항체 샘플의 농도는 알려지지 않았으나, 아마도 비교를 위해 사용된 모 항-ED-A 항체 샘플의 농도보다 낮았을 것이다. 결과적으로, 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 회합 곡선은 BIAcore 분석에 사용된 샘플에서 항체의 낮은 농도로 인해 인공적으로 낮을 수 있다. 그러나, 농도는 BIAcore 분석에서 표적 항원으로부터 항체의 해리에 유의한 영향을 미치지 않기 때문에, 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9에 대해 관찰된 편평한 해리 곡선은 이들 항체가 모 항-ED-A 항체와 적어도 동일한 친화성 및 아마도 보다 높은 친화성으로 ED-A에 결합한다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9는, 본원에 기재된 바와 같이 모 항-ED-A 항체를 사 용하여 수행된 생체내 및 면역조직화학 연구를 동일하게 사용할 경우, 동일하거나 그보다 우수한 결과를 초래할 것이다. 따라서, 모 항-ED-A 항체를 사용하여 수득한 생체내 및 면역조직화학 데이타는 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9가 종양 전이암의 치료에 사용될 수 있다는 증거를 제공한다.
BIAcore 분석 2
각각의 항-ED-A 항체에 대한 kon, koff 및 KD 값을 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 항원 11A12에 대한 모 항-ED-A 항체 및 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9의 kon, koff 및 KD 값을 하기 표 3에서 상세히 설명한다. 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9 모두는 이들이 유래된 모 항-ED-A 항체보다 항원 11A12에 대해 더 우수한 KD 값을 가지며, 이는 모 항-ED-A 항체보다 더 큰 친화성으로 ED-A 및 그에 따라 또한 A-FN에 결합함을 나타낸다. 결과적으로, 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9는 본원에 기재된 바와 같이 모 항-ED-A 항체를 사용하여 수행된 생체내 및 면역조직화학 연구를 동일하게 수행할 경우, 동일하거나 그보다 우수한 결과를 초래할 것이다. 따라서, 모 항-ED-A 항체를 사용하여 수득한 생체내 및 면역조직화학 데이타는 항-ED-A B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9가 종양 전이암의 치료에 사용될 수 있다는 증거를 제공한다.
F8 디아바디의 생체분포
마우스 조직 그램 (g) 당 검출된 I125 표지화 (요오드화) F8 디아바디의 주입량 (ID)의 백분률 (％)은 간, 폐, 비장, 심장, 신장, 장, 꼬리 및 혈액에 대해 매 우 유사하였으며, 신장을 제외한 모두는 2％ 미만의 ID/g를 나타내었다 (도 8). 반대로, F9 종양은 분석된 임의의 다른 마우스 조직보다 평균 약 4배 많은 ID를 함유하였다 (도 8). 이는 F8 디아바디가 F9 마우스 종양에 선택적으로 표적화되었음을 입증한다. 다른 조직에서 검출된 ID의 백분률은 마우스에 존재하는 F8 디아바디의 배경 로드 또는 다른 마우스 조직의 비특이적 표지화를 나타내는 것 같다. 본원에 기재된 바와 같이, 4마리의 마우스를 사용하여 생체분포 실험을 수행하였으며, 마우스 조직 당 검출된 ID의 백분률이 변하더라도 (도 8 중 에러 막대 참조) F9 종양에서 검출된 F8 디아바디의 백분률은 시험된 임의의 다른 마우스 조직에서보다 일관되게 더 높았다.
F9 1차 종양에 대해 생체분포 연구를 수행하였으며, 그 결과는 본 발명에 따른 항-ED-A 항체가 생체내 종양 조직에 선택적으로 표적화됨을 나타낸다. 그 결과는 또한 본 발명의 항-ED-A 항체가 사용됨으로써 본원에 기재된 바와 같이 모 항-ED-A 항체를 사용하여 수행된 생체내 및 면역조직화학 연구를 동일하게 수행할 경우 동일하거나 그보다 우수한 결과를 달성할 수 있음을 나타낸다.
서열분석
항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9는 모두 scFv 항체이며, 전형적인 방법을 사용하여 서열분석하였다. 항-ED-A 항체 H1의 뉴클레오티드 서열은 도 6에 도시되어 있다. 항-ED-A 항체 H1의 아미노산 서열은 도 7에 도시되어 있다.
항-ED-A 항체 B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 VH 및/또는 VL을 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 항-ED-A 항체 H1의 VH 및/또는 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일하되, 단 H1 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각 항체에 대해 하기 표 2에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환된 것이다.
항-ED-A F8 디아바디의 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 일부 바람직한 뉴클레오티드 서열은 항-ED-A 항체 H1의 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일하되, 단 H1 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 항-ED-A 항체 F8에 대해 하기 표 2에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환된 것이다. 항-ED-A F8 디아바디의 VH와 VL 도메인을 연결하는 링커를 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 gggtccagtggcggt (서열 29)이다.
항-ED-A 항체 B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9는 항-ED-A 항체 H1과 동일한 아미노산 서열을 갖되, 단 H1 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열이 각 항체에 대해 하기 표 2에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1의 아미노산 서열로 치환된다. 항-ED-A F8 디아바디의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열은 항-ED-A 항체 H1의 아미노산 서열과 동일하되, 단 H1 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열이 항-ED-A 항체 F8에 대해 하기 표 2에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1의 아미노산 서열로 치환되고, H1에서 링커의 아미노산 서열이 링커 아미노산 서열 GSSGG (서열 28)로 치환된다. 항-ED-A 항체 B2 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 21)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일 하되, 단 서열 23이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C5 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 41)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 43이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 D5 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 51)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 53이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E5 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 61)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 63이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C8 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 71)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 73이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 F8 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 81)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 83이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다. 항-ED-A F8 디아바디의 VH 도메인은 항-ED-A scFv 항체 F8의 VH 도메인과 동일한 아미노산 서열 (즉 서열 81)을 갖는다.
항-ED-A 항체 F1 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 91)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 93이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 B7 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 101)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 103이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E8 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 111)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 113이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 G9 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 31)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 33이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 B2 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 22)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 26이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C5 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 42)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 46이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 D5 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 52)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 56이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E5 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 62)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 66이 H1의 VL CDR1 대신 사용된 다.
항-ED-A 항체 C8 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 72)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 76이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 F8 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 82)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 86이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다다. 항-ED-A F8 디아바디의 VL 도메인은 항-ED-A 항체 F8의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열 (즉 서열 82)을 갖는다.
항-ED-A 항체 F1 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 92)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 96이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 B7 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 102)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 106이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E8 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 112)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 116이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 G9 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 32)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 36이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
임의로, 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9의 VH 도메인의 위치 5 아미노산은 도 7A에 도시된 바와 같이 발린 잔기 (V)라기 보다는 류신 잔기 (L)일 수 있다. 게다가 또는 다르게는, 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9의 VL 도메인의 위치 18 아미노산은 도 7C에 도시된 바와 같이 리신 잔기 (K)라기 보다는 아르기닌 잔기 (R)일 수 있다.
참조문헌
상기 인용된 참조문헌을 비롯한, 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
Figure 112009066749982-PCT00003
Figure 112009066749982-PCT00004
Figure 112009066749982-PCT00005
Figure 112009066749982-PCT00006
Figure 112009066749982-PCT00007
1숫자는 6 마리의 건강한 생체내 비오티닐화 마우스 또는 8 마리의 전이암-보유 생체내 비오티닐화 마우스 중 얼마나 많은 마우스에서 펩티드가 상응하는 조직 샘플 중에 동정되었는지를 나타낸다. Mascot 소프트웨어에 의해 피브로넥틴 데이타베이스 엔트리 P11276, Q3UHL6 또는 Q3TCF1로 주해된 모든 펩티드를 여기에 열거한다.
2이 펩티드는 ED-A 도메인 전 및 후의 피브로넥틴 서열 부분을 포함하며, (EDA-)-피브로넥틴 이소형의 존재를 나타낸다.
3이들 펩티드는 ED-A 도메인의 서열에 매칭된다 (서열 위치 1721 - 1810).
4이 펩티드 IIICS 연장부의 서열에 매칭된다 (서열 위치 2082 - 2201).
Figure 112009066749982-PCT00008
Figure 112009066749982-PCT00009
SEQUENCE LISTING <110> Philogen S.p.A. Neri, Dario Rybak, Jascha Roesli, Christoph Villa, Alessandra Neri, Giovanni <120> A Novel Antigen Associated with the Neovasculature of Tumour Metastases <130> SMWFP6530604 <150> US 60/909,580 <151> 2007-04-02 <150> US 60/948,564 <151> 2007-07-09 <160> 193 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody H1 heavy chain (VH) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Arg 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody H1 light chain (VL) <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR1 of anti-ED-A antibody H1 <400> 3 Pro Arg Arg 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR2 of anti-ED-A antibody H1 <400> 4 Ser Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR3 of anti-ED-A antibody H1 <400> 5 Ser Thr His Leu Tyr Leu 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR1 of anti-ED-A antibody H1 <400> 6 Ser Ala Trp 1 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR2 of anti-ED-A antibody H1 <400> 7 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR3 of anti-ED-A antibody H1 <400> 8 Met Arg Gly Arg Pro Pro 1 5 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody H1 linker sequence <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 12 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the anti-ED-A antibody H1 heavy chain (VH) <400> 12 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccgcggagga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaagtact 300 catttgtatc tttttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 13 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the anti-ED-A antibody H1 light chain (VL) <400> 13 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aaaagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc tctgcgtggt tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagatgcgtg gtcggccgcc gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaagcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 360 ctgaatgggg ccgcatagac tgtgaaa 387 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the anti-ED-A antibody H1 linker sequence <400> 14 ggcggtggag gttctggcgg cggtggcagt ggcggtggag gttccggggg tggaggatct 60 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Phe Leu Thr Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Ala Pro 1 5 10 15 Arg <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Partially degenerate primer <220> <221> misc_feature <222> 27, 28, 30, 31, 33, 34 <223> n is a or g or c or t <400> 17 ctggagcctg gcggacccag ctcatmnnmn nmnngctaaa ggtgaatcca ga 52 <210> 18 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Partially degenerate primer <220> <221> misc_feature <222> 28, 29, 31, 32, 34, 35 <223> n is a or g or c or t <400> 18 ccaggtttct gctggtacca ggctaamnnm nnmnngctaa cactctgact ggccctgc 58 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer LMB3long <400> 19 caggaaacag ctatgaccat gattac 26 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer fdseqlong <400> 20 gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody B2 VH domain <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ala 20 25 30 Lys Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody B2 VL domain <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 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Amino acid sequence of the light chain CDR1 of anti-ED-A antibody E8 <400> 116 Ser Ser Phe 1 <210> 117 <211> 350 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Asn Gly Leu Gly Pro Ser Lys Thr Lys Thr Ala Ser Pro Asp Gln Thr 1 5 10 15 Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu Gln Pro Thr Val Glu Tyr Val Val Ser 20 25 30 Val Tyr Ala Gln Asn Arg Asn Gly Glu Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr 35 40 45 Ala Val Thr Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val 50 55 60 Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu 85 90 95 Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly 100 105 110 Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp 115 120 125 Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr Ala Ile Pro 130 135 140 Ala Pro Thr Asn Leu Lys Leu Ser Gln Val Thr Pro Thr Ser Phe Thr 145 150 155 160 Ala Gln Trp Ile Ala Pro Ser Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg 165 170 175 Val Asn Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ser 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Ser Val Ile Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 195 200 205 Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro 210 215 220 Ala Gln Gly Val Ile Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg 225 230 235 240 Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg 245 250 255 Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Ile Pro Ala 260 265 270 Asn Gly Gln Thr Pro Val Gln Arg Ser Ile Ser Pro Asp Val Arg Ser 275 280 285 Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile His Leu 290 295 300 Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Ile Ile Asp Ala 305 310 315 320 Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Thr Thr Thr 325 330 335 Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Ala Pro Arg Ala Arg 340 345 350 <210> 118 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp 1 5 10 15 Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro 35 40 45 Ala Pro Asp Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro 50 55 60 Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu 65 70 75 80 Ser Gln Pro Leu Ile Gly Thr Gln Ser Thr 85 90 <210> 119 <211> 90 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp 1 5 10 15 Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro 35 40 45 Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro 50 55 60 Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu 65 70 75 80 Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr 85 90 <210> 120 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Antigen (11A12) containing the ED-A domain of human fibronectin <400> 120 Met Arg Ser Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met Gln Val 1 5 10 15 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Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser 225 230 235 240 Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val 245 250 255 Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly 260 265 270 Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Arg Ser His His His His His His 275 280 285 <210> 121 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of antigen (11A12) <400> 121 atgagatcct accgaacaga aattgacaaa ccatcccaga tgcaagtgac cgatgttcag 60 gacaacagca ttagtgtcaa gtggctgcct tcaagttccc ctgttactgg ttacagagta 120 accaccactc ccaaaaatgg accaggacca acaaaaacta aaactgcagg tccagatcaa 180 acagaaatga ctattgaagg cttgcagccc acagtggagt atgtggttag tgtctatgct 240 cagaatccaa gcggagagag tcagcctctg gttcagactg cagtaaccaa cattgatcgc 300 cctaaaggac tggcattcac tgatgtggat gtcgattcca tcaaaattgc ttgggaaagc 360 ccacaggggc aagtttccag gtacagggtg acctactcga gccctgagga tggaatccat 420 gagctattcc ctgcacctga tggtgaagaa gacactgcag agctgcaagg cctcagaccg 480 ggttctgagt acacagtcag tgtggttgcc ttgcacgatg atatggagag ccagcccctg 540 attggaaccc agtccacagc tattcctgca ccaactgacc tgaagttcac tcaggtcaca 600 cccacaagcc tgagcgccca gtggacacca cccaatgttc agctcactgg atatcgagtg 660 cgggtgaccc ccaaggagaa gaccggacca atgaaagaaa tcaaccttgc tcctgacagc 720 tcatccgtgg ttgtatcagg acttatggtg gccaccaaat atgaagtgag tgtctatgct 780 cttaaggaca ctttgacaag cagaccagct cagggagttg tcaccactct ggagaatgtc 840 agatctcatc accatcacca tcactaa 867 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 His Tyr Gln Ile Asn Gln Gln Trp Glu Arg 1 5 10 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Val Gly Asp Thr Tyr Glu Arg Pro Lys 1 5 <210> 124 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 124 His Ala Leu Gln Ser Ala Ser Ala Gly Ser Gly Ser Phe Thr Asp Val 1 5 10 15 Arg <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Ile Gly Asp Gln Trp Asp Lys 1 5 <210> 126 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 126 Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu Lys 1 5 10 <210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Trp Lys Glu Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys 1 5 10 15 <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 128 Glu Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys 1 5 10 <210> 129 <211> 21 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 129 Gly Leu Thr Pro Gly Val Ile Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln 1 5 10 15 Gln Tyr Gly His Arg 20 <210> 130 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 130 Trp Ser Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 131 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 131 Ser Asp Asn Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Gln Phe Val Glu Leu Thr 1 5 10 15 Asp Val Lys <210> 132 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 132 Val Thr Ile Met Trp Thr Pro Pro Asp Ser Val Val Ser Gly Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 133 Val Glu Val Leu Pro Val Ser Leu Pro Gly Glu His Gly Gln Arg 1 5 10 15 <210> 134 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 134 Asn Thr Phe Ala Glu Ile Thr Gly Leu Ser Pro Gly Val Thr Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Lys <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 135 Val Phe Ala Val His Gln Gly Arg 1 5 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 136 Thr Val Leu Val Thr Trp Thr Pro Pro Arg 1 5 10 <210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 137 Gln Tyr Asn Val Gly Pro Leu Ala Ser Lys 1 5 10 <210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 138 Asn Leu Gln Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Thr Leu Val Ala Val Lys 1 5 10 15 <210> 139 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 139 Ala Thr Gly Val Phe Thr Thr Leu Gln Pro Leu Arg 1 5 10 <210> 140 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 140 Leu Gly Val Arg Pro Ser Gln Gly Gly Glu Ala Pro Arg 1 5 10 <210> 141 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141 Val Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asp Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg 20 25 <210> 142 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 142 Ser Thr Thr Pro Asp Ile Thr Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 143 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 143 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Glu Leu Thr Asn Leu Leu Val 1 5 10 15 Arg <210> 144 <211> 27 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 144 Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Phe Asp Ser Ser Asp Ile Thr Ala 1 5 10 15 Asn Ser Phe Thr Val His Trp Val Ala Pro Arg 20 25 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 145 Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Arg 1 5 <210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 146 His His Ala Glu His Ser Val Gly Arg Pro Arg 1 5 10 <210> 147 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 147 Glu Glu Ser Pro Pro Leu Ile Gly Gln Gln Ala Thr Val Ser Asp Ile 1 5 10 15 Pro Arg <210> 148 <211> 21 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 148 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 1 5 10 15 Val Pro Gly Ser Lys 20 <210> 149 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 149 Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys 1 5 10 <210> 150 <211> 24 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 150 Ser Thr Ala Thr Ile Asn Asn Ile Lys Pro Gly Ala Asp Tyr Thr Ile 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Ala Val Thr Gly Arg 20 <210> 151 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 151 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Val Ser Ile Asn Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 152 <211> 22 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 152 Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met Gln Val Thr Asp Val Gln Asp 1 5 10 15 Asn Ser Ile Ser Val Arg 20 <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 153 Trp Leu Pro Ser Thr Ser Pro Val Thr Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 154 <211> 29 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 154 Thr Ala Ser Pro Asp Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu Gln Pro 1 5 10 15 Thr Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Arg 20 25 <210> 155 <211> 22 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 155 Asn Gly Glu Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Thr Ile Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Asn Leu Lys 20 <210> 156 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 156 Asn Gly Glu Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile Asp 1 5 10 15 Arg Pro Lys <210> 157 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 157 Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg 1 5 10 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 158 Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg 1 5 10 <210> 159 <211> 24 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 159 Phe Ser Gln Val Thr Pro Thr Ser Phe Thr Ala Gln Trp Ile Ala Pro 1 5 10 15 Ser Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg 20 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 160 Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys 1 5 <210> 161 <211> 24 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 161 Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Ile Pro Ala 1 5 10 15 Asn Gly Gln Thr Pro Val Gln Arg 20 <210> 162 <211> 22 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 162 Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Ile Pro Ala Asn Gly 1 5 10 15 Gln Thr Pro Val Gln Arg 20 <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 163 Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys 1 5 10 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 164 Ile His Leu Tyr 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Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody H1 <400> 172 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Arg 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 173 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody B2 <400> 173 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ala 20 25 30 Lys Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser 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<213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody D5 <400> 175 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Met 20 25 30 Lys Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 176 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody E5 <400> 176 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 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Ser 115 <210> 178 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody F8 <400> 178 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 179 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody F1 <400> 179 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Ala 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 180 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody B7 <400> 180 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Phe 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 181 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody E8 <400> 181 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Met 20 25 30 His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 182 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH domain of anti-ED-A antibody G9 <400> 182 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Met 20 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Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 184 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody B2 <400> 184 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 185 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody C5 <400> 185 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 187 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody E5 <400> 187 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Ala 20 25 30 His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 188 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody C8 <400> 188 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Pro 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 189 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody F8 <400> 189 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 190 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody F1 <400> 190 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Pro 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 191 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody B7 <400> 191 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 192 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody E8 <400> 192 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 193 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody G9 <400> 193 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125

Claims (57)

  1. 종양 전이암의 치료용 약제를 제조하기 위한, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형에 결합하는 결합원(binding member)의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 결합원이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합원이 검출가능한 표지에 접합된 것인 용도.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합원이 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 분자에 접합된 것인 용도.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합원이 방사성동위원소에 접합된 것인 용도.
  6. 결합원에 접합된 분자를 종양 전이암의 신생혈관으로 전달하는 약제를 제조하기 위한, 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원의 용도.
  7. 제6항에 있어서, 결합원이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 용도.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 분자가 검출가능한 표지인 용도.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 분자가 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 것인 용도.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 접합된 분자가 방사성동위원소인 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 VH 도메인을 포함하고, VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 VH 도메인은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 내에 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상보성 결정 영역의 세트를 포함하는 것인 용도.
  12. 제11항에 있어서, VH 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열(germline) 프레임워크인 용도.
  13. 제12항에 있어서, VH 도메인이 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 갖는 것인 용도.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 추가로, 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트 및 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인 용도.
  15. 제14항에 있어서, LCDR1이 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 8의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 VL 도메인이 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 내에 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상보성 결정 영역의 세트를 포함하는 것인 용도.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, VL 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 용도.
  17. 제16항에 있어서, VL 도메인이 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 갖는 것인 용도.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 단일쇄 Fv인 용도.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 디아바디(diabody)인 용도.
  20. VH 도메인을 포함하며 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원이며, VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 VH 도메인은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 내에 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상보성 결정 영역의 세트를 포함하는 것인 결합원.
  21. 제19항에 있어서, VH 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 결합원.
  22. 제20항에 있어서, VH 도메인이 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 갖는 것인 결합원.
  23. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트 및 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 추가로 포함하는 결합원.
  24. 제22항에 있어서, LCDR1이 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또 는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 8의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 VL 도메인이 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 내에 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상보성 결정 영역의 세트를 포함하는 것인 결합원.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, VL 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 결합원.
  26. 제24항에 있어서, VL 도메인이 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 갖는 것인 결합원.
  27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fv인 결합원.
  28. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 디아바디인 결합원.
  29. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지에 접합된 결합원.
  30. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 분자에 접합된 결합원.
  31. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소에 접합된 결합원.
  32. 종양 전이암의 진단용 진단 제품을 제조하기 위한, 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원의 용도.
  33. 제30항에 있어서, 결합원이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 용도.
  34. 종양 전이암의 진단용 진단 제품을 제조하기 위한, 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 결합원의 용도.
  35. (a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원을 투여하는 단계, 및
    (b) 인간 또는 동물 신체에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에서 결합원의 존부를 판단하는 단계를 포함하고,
    인간 또는 동물에서 1차 종양이 현재 점거하고 있거나 또는 이전에 점거했던 부위에서 떨어진 부위에 결합원이 위치한다는 것은 종양 전이암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 종양 전이암을 검출 또는 진단하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 결합원이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 방법.
  37. 제33항 또는 제34항에 있어서, 결합원이 검출가능한 표지에 접합된 것인 방법.
  38. 제33항 또는 제34항에 있어서, 결합원이 방사성동위원소에 접합된 것인 방법.
  39. 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원을 포함하는 약제를 치료상 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 종양 전이암을 치료하는 방법.
  40. 제37항에 있어서, 결합원이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 방법.
  41. 제37항 또는 제38항에 있어서, 결합원이 검출가능한 표지에 접합된 것인 방법.
  42. 제37항 또는 제38항에 있어서, 결합원이 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 분자에 접합된 것인 방법.
  43. 제37항 또는 제38항에 있어서, 결합원이 방사성동위원소에 접합된 것인 방 법.
  44. 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하며, 분자에 접합된 결합원을 인간 또는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물의 종양 전이암의 신생혈관에 상기 분자를 전달하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 결합원이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 방법.
  46. 제42항 또는 제43항에 있어서, 분자가 검출가능한 표지인 방법.
  47. 제42항 또는 제43항에 있어서, 분자가 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 것인 방법.
  48. 제42항 또는 제43항에 있어서, 분자가 방사성동위원소인 방법.
  49. 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 VH 도메인을 포함하고, VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖거나; VH 도메인은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 내에 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상보성 결정 영역의 세트를 포함하는 것인 방법.
  50. 제47항에 있어서, VH 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 방법.
  51. 제48항에 있어서, VH 도메인이 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  52. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 추가로, 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트 및 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, LCDR1이 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 8의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 VL 도메인이 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 내에 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 상보성 결정 영역의 세트를 포함하는 것인 방법.
  54. 제51항에 있어서, VL 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 방법.
  55. 제52항에 있어서, VL 도메인이 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  56. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 단일쇄 Fv인 방법.
  57. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 결합원이 디아바디인 방법.
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