JP2005523887A - 腫瘍の新しい診断および治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
フィブロネクチンのBイソ型のED−Bドメインに結合する機能化一本鎖Fv抗体フラグメントの組換え体が、ピキア・パストリス (Pichia pastoris) において産生されることは既に記載された (Marty他、Protein Expression and Purification 21、156−164 (2001))。
しかしながら、改良された薬物速度論的性質を有し、かつ放射性同位体、例えば、テクネチウムまたはレニウムで容易に標識化することができる抗体フラグメントを提供することが臨床的に要求されている。なぜなら、これらのラジオヌクレオチドは放射性薬品に十分に適しているからである。
したがって、本発明の他の目的は、改良された性質、特にターゲット特異性および/またはin vivo安定性を有し、かつ例えばテクネチウムまたはレニウムの放射性同位体に容易に結合することができる抗体フラグメントを提供することである。
本発明は、ペプチドを含んでなり、前記ペプチドが下記の部位および配列を含んでなる化合物を記載する:
aa) 表1に示す相補性決定領域HCDR3および/またはLCDR3、またはHCDR3領域について5アミノ酸までおよびLCDR3領域について6アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインBの抗原結合部位の配列 (ED−B);前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;
ab) 表1に示す相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3、またはHCDR1領域について3アミノ酸まで、HCDR2領域について8アミノ酸まで、HCDR3領域について5アミノ酸まで、LCDR1領域について6アミノ酸まで、LCDR2領域について4アミノ酸までおよびLCDR3領域について6アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインBの抗原結合部位の配列 (ED−B);前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;または
ba) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys (配列番号2)、式中 Xaa1、Xaa2およびXaa3の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bb) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa4 (配列番号3)、式中Xaa1、Xaa2、Xaa3、およびXaa4の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bc) アミノ酸配列 (His)n (配列番号4)、式中nは4〜6の整数である;
ここでaa)、ab) またはac) のC末端は配列番号2、配列番号3または配列番号4の配列の1つのN末端にペプチド結合を介して結合している。
また、本発明は、放射性同位体、例えば、テクネチウムまたはレニウムの放射性同位体を結合するための下記の部位および配列を含んでなるペプチドの使用を記載する:
aa) 表1に示す相補性決定領域HCDR3および/またはLCDR3、またはHCDR3領域について5アミノ酸までおよびLCDR3領域について6アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインBの抗原結合部位の配列 (ED−B);前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;
ac) 配列番号1に従う配列 (L19) または30アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;および
bb) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa4 (配列番号3)、式中Xaa1、Xaa2、Xaa3、およびXaa4の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bc) アミノ酸配列 (His)n (配列番号4)、式中nは4〜6の整数である;
ここでaa)、ab) またはac) のC末端は配列番号2、配列番号3または配列番号4の配列の1つのN末端にペプチド結合を介して結合している。
(VH)
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS
(リンカー)
GDGSSGGSGG ASTG
(VL)
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS
SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP
DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ
QTGRIPPTFG QGTKVEIK
配列番号1に従う配列 (L19) または20アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換である配列番号1の変異型を含んでなるペプチドは好ましい。
好ましいアミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa4 (配列番号3) は、配列Gly−Gly−Gly−Cys−Ala (配列番号7) およびGly−Cys−Gly−Cys−Ala (配列番号8) である。配列Gly−Gly−Gly−Cys−Ala (配列番号7) は最も好ましい。
テクネチウムまたはレニウムの好ましい放射性同位体は、94mTc、99mTc、186Reおよび188Reである。放射性同位体99mTcは最も好ましい。
L19 (配列番号1)
L19His:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKAAAL EHHHHHH
(配列番号9)
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC
(配列番号10)
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC A
(配列番号11)
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC
(配列番号12)
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC A
(配列番号13)
抗体フラグメントL19は最初に大腸菌 (E. coli) 中の発現により製造された (WO 99/58570参照)。しかしながら、scFv抗体フラグメントの大規模生産のために、この発現系は不満足であることが発見された。他の発現系、酵母発現系、特にピキア・パストリス (Pichia pastoris) 発現系が試験された。
下記の実施例において、本発明の化合物を製造し、標識化する方法を詳細に説明する。これらの実施例は例示であり、本発明を限定しない。
実施例1.L19誘導体の製造
フィブロネクチンのスプライス変異型のエキストラドメインB (ED−B) に対する組換え抗体 (scFv L19、短縮名称L19) は出発物質であった。scFv L19は、合成ヒト抗体レパートリーからファージ展示選択により単離された (Neri他、1997、Nature Biotechnol. 15:1271;Pinl他、1998、J. Biol. Chem. 273:21769)。この組換え抗体フラグメントはいわゆる一本鎖抗体フラグメント (scFv) の形態であり、そしてリンカー配列により接続されたVHおよびVL領域から成る (配列番号1参照)。このscFv L19はED Bに対して例外的に高いアフィニティーを有する (Kd:5.4×10-11 M)。
L19: 追加の末端の修飾をもたない。
L19 HisNiキレートクロマトグラフィーおよび放射性同位体の結合のための、C末端のHis6ドメイン (His tag)。
AP38: 治療および診断において使用できる物質 (例えば、放射性同位体) を結合 (Cysを介して) するための C末端のGlyGlyGlyCysドメイン。
AP39: 治療および診断において使用できる物質 (例えば、放射性同位体) を結合 (Cysを介して) するためのC末端のGlyGlyGlyCysAlaドメイン。
L19−GlyCysGlyCys:治療および診断において使用できる物質 (例えば、放射性同位体) を結合 (Cysを介して) するためのC末端のGlyCysGlyCysドメイン。
L19−GlyCysGlyCysAla:治療および診断において使用できる物質 (例えば、放射性同位体) を結合 (Cysを介して) するためのC末端のGlyCysGlyCysAlaドメイン。
記載したL19誘導体を原核生物および真核生物の発現系において生産した。
a) 大腸菌 (E. coli) 中のL19の生産
IPTG誘導可能なプロモーターおよびアンピシリン耐性マーカーを使用して、種々のL19誘導体 (AP38、AP39、L19−GlyCysGlyCys、L19−GlyCysGlyCysAla、L19、L19 His) をコードするDNA配列を原核生物の発現ベクター (pDN5、Pini他、1997、J. Immunol. Methods 206:171、Pini他、1998、J. Biol. Chem. 273:21769;pET、Novagen)中にクローニングした。
L19 His、AP38、AP39、L19−GlyCysGlyCysおよびL19−GlyCysGlyCysAlaをコードするDNA配列をPCRにより増幅し、大腸菌 (E. coli) 中に、そして酵母ピキア・パストリス (Pichia pastoris) 中の生産のために発現ベクターpPIC9KおよびpGAP (Invitrogen) 中にクローニングした。異種遺伝子を発現させるために、pPIC9Kはメタノール誘導可能なプロモーター (AOX1) を含有し、そしてpGAPはGAPDH酵素の構成的プロモーターを含有する。さらに、組換え産物を発現させ、分泌させるために、これらのベクターは、外来遺伝子およびシグナル配列 (酵母α因子からの) の選択/増幅のために、それぞれジェネティシン耐性遺伝子およびゼオシン耐性遺伝子を含有する。
156 μlのPBS (リン酸塩緩衝液)/10%グリセリン中の240 μg (4.29 nmol) のS−S二量体AP38の溶液に、50 μlのTCEP溶液 (14.34 mgのTCEP×HCl/5 mlの水性Na2HPO4、0.1 M、pH=7.4) を添加した。反応混合物を室温において1時間おだやかに震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、SHモノマーAP38を精製した。単離された産物のSDS−PAGE分析により、S−S二量体AP38がSHモノマーAP38に定量的に形質転換されたことが証明された。
収量:79.4 μg/220 μlのPBS (33.1%)。
2.37 mgのL−酒石酸二ナトリウムをバイアル中に入れ、次いで220 μlのPBS中の79.4 μgの還元されたAP38を添加し、そしてこの溶液を100 μlの水性Na2HPO4緩衝液 (1 M、pH=10.5) で希釈した。50 μlのTc−99m生成物質溶出液 (24時間) および10 μlのSnCl2溶液 (5 mgのSnCl2/1 mlの0.1MのHCl) を添加した。反応混合物を37℃において0.5時間震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、Tc−99m標識化AP38を精製した。
放射化学的収率: 39.7%
放射化学的純度: 92.5% (SDS−PAGE)
比活性: 17.7 MBq/nmol
免疫反応性: 88.7%
135 μlのPBS/10%グリセリン中の240 μg (4.29 nmol) のS−S二量体AP39の溶液に、50 μlのTCEP溶液 (14.34 mgのTCEP×HCl/5 mlの水性Na2HPO4、0.1 M、pH=7.4) を添加した。反応混合物を室温において1時間おだやかに震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、SHモノマーAP39を精製した。単離された産物のSDS−PAGE分析により、S−S二量体AP39がSHモノマーAP39に定量的に形質転換されたことが証明された。
収量:135.9 μg/180 μlのPBS (56.2%)。
4.2 mgのL−酒石酸二ナトリウムをバイアル中に入れ、次いで180 μlのPBS中の135.9 μgの還元されたAP39を添加し、そしてこの溶液を100 μlの水性Na2HPO4緩衝液 (1 M、pH=10.5) を添加した。100 μlのTc−99m生成物質溶出液 (24時間) および10 μlのSnCl2溶液 (5 mgのSnCl2/1 mlの0.1MのHCl) を添加した。反応混合物を37℃において0.5時間震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、Tc−99m標識化AP39を精製した。
放射化学的収率: 50.1%
放射化学的純度: 91.5% (SDS−PAGE)
比活性: 21.4 MBq/nmol
免疫反応性: 96.4%
2.37 mgのL−酒石酸二ナトリウムをバイアル中に入れ、次いで310 μlのPBS中の112 μgの還元されたAP38を添加し、そしてこの溶液を100 μlの水性Na2HPO4緩衝液 (1 M、pH=10.5) で希釈した。100 μlのRe−188生成物質溶出液および50 μlのSnCl2溶液 (5 mgのSnCl2/1 mlの0.1MのHCl) を添加した。反応混合物を37℃において1.5時間震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、Re−188標識化AP38を精製した。
放射化学的収率: 28.3%
放射化学的純度: 91.1% (SDS−PAGE)
比活性: 15.3 MBq/nmol
免疫反応性: 89.9%
2.37 mgのL−酒石酸二ナトリウムをバイアル中に入れ、次いで303 μlのPBS中の112 μgの還元されたAP39を添加し、そしてこの溶液を100 μlの水性Na2HPO4緩衝液 (1 M、pH=10.5) を添加した。100 μlのRe−188生成物質溶出液および50 μlのSnCl2溶液 (5 mgのSnCl2/1 mlの0.1MのHCl) を添加した。反応混合物を37℃において1.5時間震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、Re−188標識化AP39を精製した。
放射化学的収率: 33.5%
放射化学的純度: 92.3% (SDS−PAGE)
比活性: 18.5 MBq/nmol
免疫反応性: 92.5%
160 μlのPBS/10%グリセリン中の240 μg (4.29 nmol) のS−S二量体L19−Gly−Cys−Gly−Cys−OHの溶液に、75 μlのTCEP溶液 (14.34 mgのTCEP×HCl/5 mlの水性Na2HPO4、0.1 M、pH=7.4) を添加した。反応混合物を室温において1時間おだやかに震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、SHモノマーL19−Gly−Cys−Gly−Cys−OHを精製した。単離された産物のSDS−PAGE分析により、S−S二量体L19−Gly−Cys−Gly−Cys−OHがSHモノマーL19−Gly−Cys−Gly−Cys−OHに定量的に形質転換されたことが証明された。
収量:80.4 μg/210 μlのPBS (33.5%)。
2.37 mgのL−酒石酸二ナトリウムをバイアル中に入れ、次いで210 μlのPBS中の80.4 μgの還元されたL19−Gly−Cys−Gly−Cys−OHを添加し、そしてこの溶液を100 μlの水性Na2HPO4緩衝液 (1 M、pH=10.5) で希釈した。50 μlのTc−99m生成物質溶出液 (24時間) および10 μlのSnCl2溶液 (5 mgのSnCl2/1 mlの0.1MのHCl) を添加した。反応混合物を37℃において0.5時間震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、Tc−99m標識化L19−Gly−Cys−Gly−Cys−OHを精製した。
放射化学的収率: 37.7%
放射化学的純度: 91.5% (SDS−PAGE)
比活性: 19.7 MBq/nmol
免疫反応性: 89.7%
155 μlのPBS/10%グリセリン中の240 μg (4.29 nmol) のS−S二量体L19−Gly−Cys−Gly−Cys−Ala−OHの溶液に、75 μlのTCEP溶液 (14.34 mgのTCEP×HCl/5 mlの水性Na2HPO4、0.1 M、pH=7.4) を添加した。反応混合物を室温において1時間おだやかに震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、SHモノマーL19−Gly−Cys−Gly−Cys−Ala−OHを精製した。単離された産物のSDS−PAGE分析により、S−S二量体L19−Gly−Cys−Gly−Cys−Ala−OHがSHモノマーL19−Gly−Cys−Gly−Cys−Ala−OHに定量的に形質転換されたことが証明された。
収量:81.2 μg/215 μlのPBS (33.8%)。
2.37 mgのL−酒石酸二ナトリウムをバイアル中に入れ、次いで215 μlのPBS中の81.2 μgの還元されたL19−Gly−Cys−Gly−Cys−Ala−OHを添加し、そしてこの溶液を100 μlの水性Na2HPO4緩衝液 (1 M、pH=10.5) で希釈した。50 μlのTc−99m生成物質溶出液 (24時間) および10 μlのSnCl2溶液 (5 mgのSnCl2/1 mlの0.1MのHCl) を添加した。反応混合物を37℃において0.5時間震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:PBS) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、Tc−99m標識化L19−Gly−Cys−Gly−Cys−Ala−OHを精製した。
放射化学的収率: 35.6%
放射化学的純度: 93.5% (SDS−PAGE)
比活性: 19.1 MBq/nmol
免疫反応性: 88.7%
50 μlのTCEP溶液 (14.3 mgのTCEP×HCl/5 mlの水性Na2HPO4、0.1 M、pH=7.4) を、450 μlのPBS中の400 μg (7.1 nmol) のAP39の溶液に添加した。反応混合物を37℃において1時間おだやかに震蘯した。NAP−5カラム(Amersham、溶離液:酢酸ナトリウム緩衝液、0.1 M、pH=5.0) を使用するゲルクロマトグラフィーにより、還元されたAP39を精製した。単離された産物のSDS−PAGE分析により、AP39が還元されたAP39に完全に形質転換されたことが証明された。
収量:140 μg/200 μlのPBS (35%)。
512 mg (1 mmol) の{[3−(4−アミノ−フェニル)−2−(ビス−カルボキシメチル−アミノ)−プロピル]−[2−(ビス−カルボキシメチル−アミノ)−プロピル]−アミノ}−酢酸 (Macrocyclics Inc.、米国テキサス州ダラス) および707 mg (7 mmol) のトリエチルアミンを3 mlの乾燥DMF中に溶解した。1 mlの乾燥DMF中の400 mg (1.5 mmol) の3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−ピロール−1−イル)−プロピオン酸2,5−ジオキソ−ピロリジン−1−イルエステル (Aldrich) を滴下した。この溶液を50℃において5時間の間攪拌した。30 mlのジエチルエーテルをゆっくり添加した。反応混合物をさらに30分間攪拌した。濾過により、沈殿物を集めた。粗生成物をRP−HPLC (アセトニトリル:水:トリフルオロ酢酸/3:96.9:0.1 → 99.9:0:0.1)。収率:61% (405 mg、0.61 mmol) により精製した。MS−ESI:664=M++1。
200 μlの酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 5) 中の140 μg (5 nmol) のAP39−Rを、50 μlの溶解した1,4,7−トリアザ−2−(N−マレイミドエチレンp−アミノ)ベンジル−1,7−ビス(カルボキシメチル)−4−カルボキシメチル6−メチルヘプタン (500 μlの酢酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH 5中の0.25 mgのDTPA−マレイミド) と37℃において3時間反応させた。Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、反応混合物を200 mlの酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 6) で2×1時間透析した。
放射化学的収率: 54%
放射化学的純度: 94% (SDS−PAGE)
比活性: 6.2 MBq/nmol
免疫反応性: 86%
111 μlのPBS中の200 μg (3.6 nmol) の非還元AP39を300 μlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で希釈し、Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、200 mlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で2×1時間透析した。50 μlの1,4,7−トリアザ−2−(p−イソチオシアナト)ベンジル−1,7−ビス(カルボキシメチル)−4−カルボキシメチル−6−メチルヘプタン (MX−DTPA) 溶液 (500 μlのホウ酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH 8.5中に溶解した0.33 mgのMX−DTPA) を添加し、反応混合物を37℃に3時間加熱した。Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、反応混合物を200 mlの酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 6.0) で2×1時間透析した。
放射化学的収率: 70%
放射化学的純度: 85% (SDS−PAGE)
比活性: 7.6 MBq/nmol
免疫反応性: 74%
114 μlのPBS中の200 μg (3.6 nmol) の非還元AP39を300 μlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で希釈し、Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、200 mlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で2×1時間透析した。50 μlの1,4,7,10−テトラアザ−2−(p−イソチオシアナト)ベンジルシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸(ベンジル−p−SCN−DOTA、Macrocyclics Inc.、米国テキサス州ダラス) 溶液 (5 mlのホウ酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH 8.5中に溶解した1.5 mgのベンジル−p−SCN−DOTA) を添加し、反応混合物を37℃に3時間加熱した。Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、反応混合物を各回200 mlの酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 6.0) で2×1時間および1×17時間 (一夜) 透析した。
放射化学的収率: 74%
放射化学的純度: 94% (SDS−PAGE)
比活性: 12.3 MBq/nmol
免疫反応性: 73%
115 μlのPBS中の200 μg (3.6 nmol) の非還元AP39を300 μlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で希釈し、Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、200 mlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で2×1時間透析した。50 μlのMX−DTPA溶液 (500 μlのホウ酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH 8.5中に溶解した0.33 mgのMX−DTPA) を添加し、反応混合物を37℃に3時間加熱した。Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、反応混合物を各回200 mlの酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 6.0) で2×1時間および1×17時間 (一夜) 透析した。
放射化学的収率: 65%
放射化学的純度: 93% (SDS−PAGE)
比活性: 10.2 MBq/nmol
免疫反応性: 72%
110 μlのPBS中の200 μg (3.6 nmol) の非還元AP39を300 μlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で希釈し、Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、200 mlのホウ酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 8.5) で2×1時間透析した。50 μlのベンジル−p−SCN−DOTA溶液 (5 mlのホウ酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH 8.5中に溶解した1.5 mg) を添加し、反応混合物を37℃に3時間加熱した。Slide−A−Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc.、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して、反応混合物を各回200 mlの酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1M、pH 6.0) で2×1時間および1×17時間 (一夜) 透析した。
放射化学的収率: 74%
放射化学的純度: 95% (SDS−PAGE)
比活性: 19 MBq/nmol
免疫反応性: 71%
本発明の物質を約74 kBqの投与量でF9 (奇形癌腫) 担持動物(体重約25 g) に静脈内注射した。物質の投与後、種々の時間においてγカウンターを使用して、種々の器官における放射能濃度、および排出物中の放射能を測定した。さらに、種々の時間において腫瘍および血液中の本発明の物質の濃度に基づいて、腫瘍/血液比を見出す。
F9 (奇形癌腫) 担持ヌードマウスにおけるTc−99m−AP39の生物分布 (平均±SD、n=3) を表2に示す:
この研究の結果は、充実腫瘍における蓄積について本発明の物質のきわめてすぐれた可能性と同時にきわめてすぐれた排出を示す。
本発明の物質を約48 kBqの投与量でF9 (奇形癌腫) 担持動物(体重約25 g) に静脈内注射した。物質の注射後、種々の時間においてγカウンターを使用して、種々の器官における放射能濃度、および排出物中の放射能を測定する。
F9 (奇形癌腫) 担持ヌードマウスにおけるIn−111−MX−DTPA−ε−HN(Lys)−AP39の生物分布 (平均±SD、n=3) を表4に示す:
本発明の物質を約9.25 kBqの投与量でF9 (奇形癌腫) 担持動物(体重約25 g) に静脈内注射した。物質の注射後、種々の時間においてガンマカメラで造影を実施する。
F9 (奇形癌腫) 担持ヌードマウスの平面状シンチグラフィーを第3図および第4図に示す。第3図は物質注射後5時間におけるシンチグラムを示し、そして第4図は物質注射後24時間におけるシンチグラムを示す。
この研究の結果は、充実腫瘍の造影について本発明の物質のきわめてすぐれた可能性を示す。
Claims (21)
- ペプチドを含んでなり、前記ペプチドが下記の部位および配列を含んでなる化合物:
aa) 表1に示す相補性決定領域HCDR3および/またはLCDR3、またはHCDR3領域について5アミノ酸までおよびLCDR3領域について6アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインB (ED−B) の抗原結合部位;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;
ab) 表1に示す相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3、またはHCDR1領域について3アミノ酸まで、HCDR2領域について8アミノ酸まで、HCDR3領域について5アミノ酸まで、LCDR1領域について6アミノ酸まで、LCDR2領域について4アミノ酸までおよびLCDR3領域について6アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインB (ED−B) の抗原結合部位;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;または
ac) 配列番号1に従う配列 (L19) または30アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;および
ba) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys (配列番号2)、式中 Xaa1、Xaa2およびXaa3の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bb) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa4 (配列番号3)、式中Xaa1、Xaa2、Xaa3、およびXaa4の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bc) アミノ酸配列 (His)n (配列番号4)、式中nは4〜6の整数である;
ここでaa)、ab) またはac) のC末端は配列番号2、配列番号3または配列番号4の配列の1つのN末端にペプチド結合を介して結合している。 - アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys (配列番号2) が配列Gly−Gly−Gly−Cys (配列番号5) またはGly−Cys−Gly−Cys (配列番号6) である、請求項1に記載の化合物。
- アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa4 (配列番号3) が配列Gly−Gly−Gly−Cys−Ala (配列番号7) またはGly−Cys−Gly−Cys−Ala (配列番号8) である、請求項1に記載の化合物。
- アミノ酸配列 (His)n (配列番号4) 中のnが6である、請求項1に記載の化合物。
- 放射性同位体に結合している、請求項1〜4のいずれかに記載の化合物。
- テクネチウムの放射性同位体、例えば、94mTc、99mTc、レニウムの放射性同位体、例えば、186Re、188Re、または他のアイソトープ、例えば、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、44Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、72Asおよび18Fから選択される放射性同位体に結合している、請求項6に記載の化合物。
- 放射性同位体が99mTcまたは186Reである、請求項6に記載の化合物。
- ペプチドが還元された形態である、請求項1〜7のいずれかに記載の化合物。
- 活性剤として請求項1〜8のいずれかに記載の化合物と、生理学上許容されるアジュバント、担体および/または希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
- マウスにおいて24時間以内に腎臓を介して40%またはそれより多く排出される請求項9に記載の組成物。
- マウスにおいて投与後5時間に5:1またはそれ以上の腫瘍/血液の比を有する、請求項9または10に記載の組成物。
- 診断適用のための請求項9〜11のいずれかに記載の組成物。
- 治療適用のための請求項9〜11のいずれかに記載の組成物。
- 放射性同位体を結合するための下記の部位および配列を含んでなるペプチドの使用:
aa) 表1に示す相補性決定領域HCDR3および/またはLCDR3、またはHCDR3領域について5アミノ酸までおよびLCDR3領域について6アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインB (ED−B) の抗原結合部位;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;
ab) 表1に示す相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3、またはHCDR1領域について3アミノ酸まで、HCDR2領域について8アミノ酸まで、HCDR3領域について5アミノ酸まで、LCDR1領域について6アミノ酸まで、LCDR2領域について4アミノ酸までおよびLCDR3領域について6 アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型を含んでなるフィブロネクチンのエキストラドメインB (ED−B) の抗原結合部位;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;または
ac) 配列番号1に従う配列 (L19) または30アミノ酸までの欠失、挿入および/または置換であるその変異型;前記変異型は配列番号1に従うペプチドと同一の機能を有する;および
ba) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys (配列番号2)、式中 Xaa1、Xaa2およびXaa3の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bb) アミノ酸配列Xaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa4 (配列番号3)、式中Xaa1、Xaa2、Xaa3、およびXaa4の各々は独立に任意の天然に存在するアミノ酸を表す;または
bc) アミノ酸配列 (His)n (配列番号4)、式中nは4〜6の整数である;
ここでaa)、ab) またはac) のC末端は配列番号2、配列番号3または配列番号4の配列の1つのN末端にペプチド結合を介して結合している。 - 放射性同位体がテクネチウムの放射性同位体、例えば、94mTc、99mTc、レニウムの放射性同位体、例えば、186Re、188Re、または他のアイソトープ、例えば、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、44Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、72Asおよび18F体から選択される、請求項14に記載の使用。
- 放射性同位体が99mTcまたは186Reである、請求項15に記載の使用。
- ペプチドを真核細胞、特に酵母細胞において発現させることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のペプチドを生産する方法。
- 真核細胞がピキア・パストリス (Pichia pastoris) 細胞である、請求項17に記載の方法。
- ペプチドを構成的に発現させる、請求項17または18に記載の方法。
- ペプチドのN末端がα−シグナル配列からのKex2切断部位に直接融合されている、請求項17〜19のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のペプチドと、必要に応じて生理学上許容されるアジュバントとを含んでなる、放射性薬品の製造用キット。
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