WO2011078250A1 - 生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用 - Google Patents

生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用 Download PDF

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amino acid
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acid region
radioactive metal
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恭良 渡辺
功紀 長谷川
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独立行政法人理化学研究所
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    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Definitions

  • the present invention relates to a radiolabeled compound directed to a target tissue in a living body and use thereof.
  • Radiation therapy is a treatment method in which radiation is mainly used to treat cancer (malignant tumor), and is used alone or in combination with chemotherapy, hormone therapy or the like.
  • cancer malignant tumor
  • various radioligands for use in in vivo treatment and diagnosis have been studied.
  • radiopharmaceuticals using radiolabeled antibodies zevalin ( Registered trademark)
  • zevalin Registered trademark
  • PET positron emission tomography
  • PET PET using fluorodeoxyglucose labeled with [ 18 F] is used for cancer screening.
  • PET is an excellent molecular imaging technique used for drug development and clinical diagnosis.
  • the technique using the radiolabeled compound administered in vivo is very promising.
  • Zevalin is a compound labeled with a radioactive metal nuclide that emits ⁇ -rays through a chelator covalently bonded to an antibody against a target protein.
  • a chelator eg, DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid
  • DOTA 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid
  • Non-Patent Document 1 since the chelator reacts nonspecifically with the biopolymer, the activity of the biopolymer is reduced by introducing the chelator into the active site of the biopolymer. Moreover, in such a technique, it is necessary to perform chemical modification of a chelator on a biopolymer, which is troublesome. Furthermore, the chelator used is a substance that is not originally present in the living body, and it is necessary to evaluate the safety of the chelator itself in the living body in order to use the radiolabeled biopolymer as a drug or the like.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a radiolabeled compound that can be clinically used in vivo without chemical modification by a chelator.
  • the present inventors have conducted intensive studies from a unique point of view, and a specific region of a protein that is one of the biomolecules directs a radioactive metal nuclide to a target tissue in vivo.
  • the present invention has been completed based on the finding that it has suitable binding ability.
  • the compound according to the present invention is a compound in which a second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, and the first polypeptide is specific to the protein expressed in the target tissue.
  • the second polypeptide includes an amino acid region having a high affinity for the radioactive metal nuclide, and the radioactive metal nuclide having a high affinity for the amino acid region comprises the amino acid region It is characterized by being retained in the amino acid region.
  • the compound according to the present invention can be delivered to a target site in vivo while carrying a radioactive metal nuclide.
  • the amino acid region is preferably a fragment of a protein that exists naturally in a living body to which the compound is applied.
  • the protein expressed in the target tissue is preferably a receptor protein of the first polypeptide.
  • the amino acid region preferably contains X1-His (X1 represents any amino acid other than Pro), and X2-X1-His or X2-X1-His-Lys ( X1 represents any amino acid other than Pro, and X2 preferably represents Met, Asp, or Glu.
  • the amino acid region is Met-X3-Cys-X4-X5-Cys (X3 represents Thr, Ser, His or Asn, X4 represents Ala, Asn, Gln, Ser, Asp, Gly or X5 may include Gly, Ser, Ala, His, Thr, Asn, Gln, or Glu.
  • the amino acid region may include His-Gly-Asp-His-Met-His-Asn-His-Asp-Thr-Lys.
  • the second polypeptide DAH, DAHK, DTH, DTHK, EAH, EAHK, MTCANC, DAHKMTCAGC, DAHKGMTCANC, DAHKMTCAGCMTCANC, DAHKGMTCAGCMTCANC, DTHKMTCAGC, DTHKGMTCANC, DTHKMTCAGCMTCANC, DTHKGMTCAGCMTCANC, EAHKMTCAGC, EAHKGMTCANC, EAHKMTCAGCMTCANC, It can be EAHKGMTCAGCMMTCANC, HGDHMHNHDTK.
  • the amino acid region preferably constitutes the N-terminal portion of the second polypeptide.
  • the second polypeptide may be composed of 3 to 15 amino acids.
  • the method for producing a compound according to the present invention includes the step of adding a second polypeptide to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, wherein the first polypeptide is expressed in the target tissue.
  • the second polypeptide includes an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide, and a radioactive metal having a high affinity for the amino acid region.
  • the method further includes the step of retaining the nuclide in the amino acid region.
  • the step of adding the second polypeptide includes synthesizing the second polypeptide at the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof using a peptide solid phase synthesis method. It may be performed, or may be performed by genetically generating a fusion protein of the first polypeptide and the second polypeptide.
  • the target amino acid region can be added in advance to the N-terminus of the first polypeptide, so that the labor of chemically modifying the chelator after preparing the protein is saved. be able to.
  • the labeling of the membrane protein on the cell surface becomes easy, and the labeling of the cell can be easily performed.
  • the composition according to the present invention contains a compound in which a second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof in order to direct a radioactive metal nuclide to a target tissue in vivo.
  • the first polypeptide is a polypeptide that specifically binds to a protein expressed in the target tissue
  • the second polypeptide has an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide. It is characterized by including.
  • the composition according to the present invention may further contain a radioactive metal nuclide having high affinity with the amino acid region.
  • composition according to the present invention may be used for diagnosis by positron emission tomography or for radiotherapy.
  • the imaging method includes a step of detecting from a living body a gamma dose generated based on a positron emitted from a compound administered into the living body in order to take a positron emission tomographic image in the living body,
  • the compound is a compound in which a second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, in which the first polypeptide is expressed in the target tissue to be measured.
  • a second polypeptide comprising an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide and having a high affinity for the amino acid region. A metal nuclide is retained in the amino acid region.
  • the screening method includes a step of detecting from a living body a gamma dose generated based on a positron emitted from a compound administered in vivo to screen for a compound used for radiation therapy, and the candidate
  • the compound is a compound in which a second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, and in the candidate compound, the first polypeptide is expressed in the target tissue to be measured.
  • a second polypeptide comprising an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide and having a high affinity for the amino acid region. A metal nuclide is retained in the amino acid region.
  • the detection method includes a step of incubating a sample with a compound to detect a protein of interest in the sample, and a step of detecting a gamma dose generated based on the positron emitted by the compound.
  • the compound is a compound obtained by adding a second polypeptide to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, in which the first polypeptide specifically binds to the target membrane protein.
  • the second polypeptide includes an amino acid region having a high affinity for the radioactive metal nuclide, and the radioactive metal nuclide having a high affinity for the amino acid region is included in the amino acid region. It is characterized by being held in.
  • the labeling method includes a step of incubating a cell with a compound to label the cell, and a step of detecting a cell generating a gamma dose based on a positron emitted by the compound,
  • the compound is a compound in which a second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, in which the first polypeptide is expressed in the cell to be labeled.
  • a polypeptide that specifically binds to a membrane protein, the second polypeptide includes an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide, and a radioactive metal having a high affinity for the amino acid region The nuclide is retained in the amino acid region.
  • a further labeling method includes a step of transforming a cell using a polynucleotide encoding a fusion protein of a membrane protein and a second polypeptide added to the N-terminus thereof, in order to label the cell. And a step of allowing the second polynucleotide to retain a radioactive metal nuclide, wherein the second polypeptide includes an amino acid region having a high affinity for the radioactive metal nuclide.
  • the present invention when a protein that is a biopolymer is radiolabeled, conventional chemical modification such as a low molecular compound (chelator) whose toxicity is unknown is unnecessary.
  • a radiolabel using a chelator such as DOTA
  • the N-terminus of a protein is specifically emitted. It has become possible to label, and it has become possible to limit the number of metal nuclides that label proteins.
  • the present invention provides a compound having a constitution in which a second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof.
  • polypeptides and polynucleotides As used herein, the term “polypeptide” is used interchangeably with “peptide” or “protein”. In addition, “fragment” of a polypeptide is intended to be a partial fragment of the polypeptide. Polypeptides may also be isolated from natural sources, chemically synthesized, or genetically engineered.
  • isolated polypeptide is intended to be a polypeptide removed from its natural environment.
  • a recombinant polypeptide expressed in a host cell is isolated, as is a natural or recombinant polypeptide that has been substantially purified by any suitable technique. It is regarded.
  • the produced polypeptide can be easily purified by affinity chromatography using an antibody that can specifically bind to the polypeptide.
  • the polypeptide of interest can be obtained from a wide range of known protein purification techniques (eg, ammonium sulfate fractionation, solvent precipitation, immunoprecipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, etc. (Electric point precipitation, electrofocusing, electrophoresis, etc.) may be used alone or in combination.
  • the antibody used for affinity chromatography may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a method well known in the art (for example, a peptide antibody).
  • the polypeptide may contain an additional polypeptide for the purpose of simplifying the purification procedure.
  • additional polypeptide include tag-labeled polypeptides such as His, Myc, and Flag, and GST.
  • tag-labeled polypeptides such as His, Myc, and Flag, and GST.
  • nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the target polypeptide based on the amino acid sequence of the target polypeptide.
  • polynucleotide is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • a “polynucleotide” in which several to several tens of nucleotides are bonded is used interchangeably with “oligonucleotide”.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence” and refers to the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T). As shown.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: X or a fragment thereof means a polynucleotide comprising a sequence represented by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: X or a fragment thereof. Is intended.
  • a polynucleotide may be present in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or RNA (eg, mRNA).
  • DNA can be double-stranded or single-stranded.
  • Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • a polynucleotide may include sequences such as untranslated region sequences or vector sequences.
  • the polynucleotide is linked in-frame with the polynucleotide encoding the tag label on its 5 ′ side or 3 ′ side. May be.
  • the first polypeptide has a function of directing the compound of the present invention to a target tissue in vivo.
  • the compound of the present invention can be delivered to a desired site in vivo. That is, the first polypeptide is characterized in that it is a polypeptide that specifically binds to a protein expressed in the target tissue.
  • the protein that specifically binds to the first polypeptide includes, but is not limited to, the receptor for the first polypeptide.
  • a protein that is specifically expressed at the target site may be selected as the protein.
  • Such a protein is preferably a membrane protein, but may be an extracellular matrix protein expressed in a tissue-specific manner.
  • a protein specifically expressed in the tissue can be easily selected based on the common general technical knowledge in the field.
  • Polypeptides that specifically bind to different proteins can be readily selected. That is, those skilled in the art can easily select the first polypeptide according to the target tissue based on the common general technical knowledge in the field.
  • an analog of a first polypeptide has a specific binding ability to a receptor of the first polypeptide, but has a different chemical structure than the first polypeptide.
  • the compound which has. That is, the protein that specifically binds to the first polypeptide can also be a protein that specifically binds to the analog of the first polypeptide.
  • octreotide which is one of somatostatin analogs
  • the somatostatin analog may be a compound having specific binding ability to at least one of the five subtypes of the somatostatin receptor (SSTR1-5).
  • examples of the somatostatin analog include octreotide.
  • octreotide analogs such as [Tyr 3 ] -octreotide, vapreotide, lanreotide, [Tyr 3 ] -octreotate, [Tyr 3 , Tyr 3 , Tyr 8 -Octreotide, etc.
  • a compound obtained by chemically modifying such a compound is also included in the “analog” in the present invention.
  • PEG polyethylene glycol
  • first polypeptide examples include exenatide which directly binds to the receptor of glucagon-like peptide 1 (GLP-1), spantide which is a substance P receptor antagonist, epidermal growth factor ( EGF), interferon (IFN) and the like.
  • GLP-1 glucagon-like peptide 1
  • spantide which is a substance P receptor antagonist
  • EGF epidermal growth factor
  • IFN interferon
  • Amino acid sequences such as EGF and IFN are well known in the art and can be easily obtained by those skilled in the art.
  • the second polypeptide has a function of supporting a radioactive metal nuclide until the compound of the present invention reaches the target tissue. Since the second polypeptide has an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide, the second polypeptide can successfully exhibit such a function. That is, the second polypeptide is characterized by including an amino acid region having a high affinity for the radioactive metal nuclide.
  • the second polypeptide is preferably a fragment of a biomolecule (ie a naturally occurring protein) in order to reduce the risk that the compound of the present invention to be administered in vivo is toxic in vivo. .
  • the compound of the present invention is a radiolabeled compound directed to a target tissue in vivo.
  • radioactive metal nuclides are retained in the amino acid region.
  • the compound of the present invention can deliver a radioactive metal nuclide to a target tissue, and thus is very useful as a drug for radiotherapy.
  • the compound of the present invention can provide information based on gamma dose generated by radioactive metal nuclides (for example, information on the dynamics of a substance in a living body), a molecular probe for positron emission tomographic imaging (so-called so-called molecular probe) It is very useful for PET diagnostic imaging by using it as a PET probe.
  • the compound of the present invention has a configuration in which the second polypeptide is added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof.
  • the first polypeptide is expressed in the target tissue because the radioactive metal nuclide retained in the second polypeptide may be delivered to the target tissue.
  • the polypeptide is not particularly limited as long as it is a polypeptide that specifically binds to a protein. It is important that the second polypeptide is added to a site that does not inhibit the binding between the first polypeptide and the protein, and the second polypeptide is the N-terminal of the first polypeptide. Has been added.
  • the second polypeptide includes an amino acid region having a high affinity for a radioactive metal nuclide.
  • Such an amino acid region is preferably a fragment of a protein that exists naturally in a living body to which the compound of the present invention is applied.
  • the risk that the present invention is toxic to a living body can be greatly reduced.
  • the second polypeptide having such a configuration may be a protein that naturally exists in a living body to which the compound of the present invention is applied.
  • a plurality of amino acid regions having high affinity for radioactive metal nuclides may be contained in the second polypeptide.
  • the plurality of amino acid regions may be the same as or different from each other.
  • the amino acid region preferably contains X1-His (X1 represents any amino acid other than Pro), and X2-X1-His or X2-X1-His-Lys (X1 Represents any amino acid other than Pro, and X2 represents Met, Asp or Glu.
  • X1-His represents any amino acid other than Pro
  • X2-X1-His or X2-X1-His-Lys X1 Represents any amino acid other than Pro
  • X2 represents Met, Asp or Glu.
  • the amino acid region having such a structure is particularly preferably used for binding a divalent metal ion
  • radioactive metal nuclides having high affinity with the amino acid region having such a structure are 64 Cu, 65 Zn, 72 Zn, 56 Co, 57 Co, 58 Co, 60 Co, 109 Cd, 113 Cd, 56 Ni, 59 Ni, and 63 Ni can be mentioned, and any of them can be suitably used.
  • examples of the amino acid region that can be used for binding a divalent metal ion include a configuration including His-Gly-Asp-His-Met-His-Asn-His-Asp-Thr-Lys.
  • radioactive metal nuclides having high affinity for the amino acid region having such a structure include 64 Cu, 65 Zn, 72 Zn, 56 Ni, 59 Ni, and 63 Ni, and any of them can be suitably used.
  • the amino acid region includes Met-X3-Cys-X4-X5-Cys (X3 represents Thr, Ser, His or Asn, and X4 represents Ala, Asn, Gln, Ser, Asp, Gly or Glu X5 preferably represents Gly, Ser, Ala, His, Thr, Asn, Gln or Glu.), And more preferably contains Met-Thr-Cys-Ala-Asn-Cys. preferable.
  • the amino acid region having such a configuration is particularly preferably used when binding a monovalent metal ion, and is suitable for use as a PET probe.
  • radioactive metal nuclide having high affinity with the amino acid region having such a structure examples include 64 Cu, 65 Zn, 72 Zn, 56 Co, 57 Co, 58 Co, 60 Co, 109 Cd, 113 Cd, and 194 Hg. Any of these can be suitably used.
  • the length of the second polypeptide is preferably short from the viewpoint of the ability to cross the blood brain barrier. More preferably, it consists of amino acids.
  • the second polypeptide may be a peptide composed of the amino acid region.
  • the amino acid region may be contained in the second polypeptide, but constitutes the N-terminal part of the second polypeptide (that is, the amino acid region is the second polypeptide).
  • the amino acid region preferably used in the compound of the present invention and having high affinity with a radioactive metal nuclide includes DAH, DAHK, DTH, DTHK, EAH, EAHK, MTCANC, DAHKMTCAGC, DAHKGMTCANC, DAHKMTCAGCMTCANC, DAHKGMTCAGCMTCAG, C DTHKMTCANC, DTHKMTCAGCMTCANC, DTHKMTCAGCMTCANC, EAHKMTCAGC, EAHKGMTCANC, EAHKMTCAGCMTCANC, EAHKGMTCGCMTCANC, HGDHMHNHDTK.
  • the second polypeptide may be composed of these amino acid regions.
  • somatostatin as a first polypeptide, a compound obtained by adding a second polypeptide composed of Asp-Ala-His-Lys to the N-terminus of octreotide, which is one of its analogs, Illustrates the invention.
  • the accumulation of the compound of the present invention in the pancreas and pituitary gland where the somatostatin receptor is specifically expressed indicates that radiotherapy for these sites is possible.
  • the present invention is illustrated using a compound in which a second polypeptide consisting of Asp-Ala-His-Lys is added to the N-terminus of exenatide.
  • the compound of the present invention is accumulated in the pancreas where the GLP-1 receptor is highly expressed. Further, a compound (Asp-Ala-His-Lys-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-) in which a second polypeptide comprising Asp-Ala-His-Lys is added to the N-terminus of spantide. Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu) can be used as well.
  • the first polypeptide may have a function as a drug. In this case, a synergistic effect by the function of the first polypeptide and the function of the metal nuclide can be expected.
  • the present inventors produced a compound in which a second polypeptide composed of Asp-Ala-His-Lys-Met-Thr-Cys-Ala-Gly-Cys was added to the N-terminus of octreotide or exenatide. Yes.
  • the amino acid sequence of Asp-Ala-His-Lys is present in human albumin and this region is known to bind divalent metal ions (for reference, Malgorzata Rozga et al., J. Biol Inorg. Chem. (2007), 12: 913-918, David Bar-Or et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2001), 284 (3): 856-862, Leonard TR et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2007), 357: 543-548, Catherine Harford and Bibudhendra Sarkar, Acc. Chem. Res. (1997), 30: 123-130, Peter J. Sadler et al., Eur. J. Biochem.
  • a chelator such as DOTA is used for a radiolabeled compound used as a molecular probe for PET or a radiopharmaceutical. This indicates that the chelator is extremely excellent for the binding of radioactive metals.
  • the results illustrated in the examples described below are comparable to the results obtained using a compound prepared using DOTA, and it is understood by those skilled in the art that such excellent effects can be realized without using a chelator. It is not predictable.
  • the amount of radionuclide used in radiolabeling a compound is small, so that the concentration of radionuclide in the reaction solution is very low (for example, 64 Cu, 7 ng at 1000 MBq).
  • the concentration is about 0.3 ⁇ M.
  • the radiolabeling reaction is carried out in a very low concentration environment. Nevertheless, the successful progress of the labeling reaction of the compound of the present invention cannot be easily predicted by those skilled in the art. Of course, those skilled in the art cannot easily conceive of a configuration (that is, the configuration of the present invention) for allowing the labeling reaction to proceed successfully.
  • an object of the present invention is to provide a radiolabeled compound directed to a target tissue in vivo, and is not limited to the specifically described polypeptide.
  • a radiolabeled compound obtained by a method other than the following method also belongs to the technical scope of the present invention.
  • the present invention also provides a method for producing the compound described above.
  • the production method of the present invention includes a step of adding a second polypeptide to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof, and a step of retaining a radioactive metal nuclide in the second polypeptide.
  • the first polypeptide is a polypeptide that specifically binds to the protein expressed in the target tissue, and the second polypeptide has a high affinity for the radioactive metal nuclide. Contains the amino acid region.
  • the step of retaining the radioactive metal nuclide in the second polypeptide can be said to be a step of retaining the radioactive metal nuclide having high affinity with the amino acid region in the amino acid region.
  • the step of adding the second polypeptide is performed by synthesizing the second polypeptide at the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof using a peptide solid phase synthesis method. In another embodiment, the step of adding the second polypeptide is performed by genetically generating a fusion protein of the first polypeptide and the second polypeptide.
  • the compound of the present invention is produced by genetic engineering as a fusion protein of the first polypeptide and the second polypeptide.
  • the first polypeptide is a synthetic peptide (eg, a synthetic product obtained by modifying a naturally occurring protein)
  • it is preferably synthesized using a peptide solid phase synthesis method.
  • the length of the second polypeptide is preferably short.
  • the peptide solid phase synthesis method may be used even if the first polypeptide is a naturally occurring protein (or a fragment thereof).
  • Genetically engineered polypeptide production may be performed using transformants or using in vitro translation, and transformants (eg, prokaryotic and eukaryotic cells)
  • the polypeptide may be transiently expressed or may be stably expressed. If the target polypeptide is transiently expressed, the target polypeptide can be rapidly prepared, and if it is stably expressed, the target polypeptide can be prepared in large quantities.
  • Genetic engineering generation can be performed using a vector into which a polynucleotide encoding a target polypeptide is functionally inserted.
  • “functionally inserted” is intended to be inserted into a vector according to the appropriate open reading frame and orientation.
  • the vector used for genetic engineering generation may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression. Examples of the method for producing such a vector include, but are not limited to, a method using a plasmid, phage, or cosmid.
  • vectors to be used for recombinant expression are not particularly limited, and vectors that can be expressed in host cells can be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, an appropriate promoter sequence is selected in order to reliably express the target gene (polynucleotide), and a vector in which the selected promoter sequence and the target gene are incorporated into various plasmids is expressed. What is necessary is just to use as a vector.
  • transformation of a host with an expression vector can also be performed according to a conventional technique.
  • the expression vector preferably contains a conventionally known selection marker. Further, a method for introducing an expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be suitably used.
  • those skilled in the art can easily obtain information on the target amino acid sequence and nucleotide sequence from any sequence database. Moreover, those skilled in the art can easily construct a necessary gene library based on the common general technical knowledge in the field and easily prepare a gene having a desired nucleotide sequence therefrom. Furthermore, those skilled in the art can easily prepare a gene in which a polynucleotide encoding a target amino acid region is inserted into a desired site of the obtained gene based on the common general technical knowledge in the field.
  • the amino acid region constitutes the N-terminal portion of the second polypeptide (that is, the amino acid region is exposed at the N-terminus of the second polypeptide).
  • the amino acid region is preferred.
  • a person skilled in the art can construct the amino acid region at the N-terminal portion of the second polypeptide by using common technical knowledge in the art. For example, when the peptide solid phase synthesis method is used, the target amino acid may be synthesized sequentially at the N-terminus of the second polypeptide.
  • the amino acid region may be constituted subsequent to the initiation methionine, and a second polypeptide having an enzymatic cleavage site on the N-terminal side of the amino acid region and the second polypeptide
  • a cleavage treatment may be performed using a predetermined enzyme. Such a cutting process is well known in the art.
  • composition of the present invention As described above, if the compound of the present invention is used, a radioactive metal nuclide can be directed to a target tissue in a living body. Therefore, diagnosis and radiotherapy by positron emission tomography Is particularly useful.
  • the present invention provides a composition for directing a radioactive metal nuclide to a target tissue in vivo.
  • the compositions of the present invention may be prepared in either solution or suspension form, or as a solid form suitable for dissolving or suspending in a liquid (eg, buffer). Good.
  • the composition of the present invention comprises a second polypeptide added to the N-terminus of the first polypeptide or an analog thereof as a configuration necessary for directing a radioactive metal nuclide to a target tissue in vivo.
  • the first polypeptide is a polypeptide that specifically binds to a protein expressed in the target tissue, and the second polypeptide has a high affinity for the radioactive metal nuclide. Contains the amino acid region. For the first polypeptide and the second polypeptide, see [1-2] and [1-3] above.
  • the composition of the present invention may contain a compound before holding the radioactive metal nuclide or a compound holding the radioactive metal nuclide.
  • the composition of the present invention may be a composition for preparing a radiolabeled compound directed to a target tissue in vivo.
  • composition of the present invention may be provided as a kit.
  • kit is a form in which at least one of various components is contained in another substance.
  • a composition containing an active ingredient includes “a kit comprising an active ingredient”.
  • a kit form it is only necessary to include a compound described later as an active ingredient, and may further include a component that can be included as a composition. That is, the composition of the present invention can be a kit provided separately with “the compound before retaining the radionuclide” and “the radionuclide”.
  • kit is intended to include packaging with containers (eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.) containing specific materials. Preferably, instructions for using each material are provided.
  • container eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.
  • instructions for using each material are provided.
  • “comprising” is intended to mean being contained in any of the individual containers that make up the kit.
  • the kit may also be a package in which a plurality of different compositions are packed together.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc.
  • the kit may also comprise a container containing a diluent, solvent, washing solution or other reagent.
  • the kit may be equipped with necessary instruments according to the application.
  • the compounds and compositions of the present invention are used for diagnosis by positron emission tomography based on the ability to direct radioactive metal nuclides to target tissues in vivo.
  • the present invention provides a method for taking a positron emission tomographic image in a living body.
  • This method includes a step of detecting from a living body a gamma dose generated based on a positron emitted from a compound administered into a living body, and the compound may be the compound of the present invention.
  • the said compound may be provided as a composition of this invention.
  • imaging (imaging) using a positron tomography apparatus is usually used, there is an advantage that it is less invasive to a living body.
  • Such a method may be a data collection method for assisting diagnosis by a doctor.
  • this method when applied to a human, the method includes a step performed by a doctor (for example, a step of administering a compound into a living body, a step of determination by a doctor). Not intended.
  • this method when applied to a non-human mammal, it may include a step performed by a veterinarian. In this case, administration by various routes is preferable, but not limited thereto.
  • the dose can be appropriately designed as necessary.
  • the compounds and compositions of the present invention can be used for radiotherapy based on the ability to direct radioactive metal nuclides to target tissues in vivo.
  • the present invention provides a method for screening a compound used for radiation therapy. This method includes the step of detecting from the living body the gamma dose generated based on the positrons emitted from the compound administered into the living body, similar to the above-described method for taking a positron emission tomographic image in the living body.
  • the above compound may be a compound of the present invention.
  • the said compound may be provided as a composition of this invention.
  • a plurality of first polypeptides are prepared according to the above-described method for producing a compound, and the ability to direct radioactive metal nuclides to a target tissue in vivo is compared with each other. By selecting, the desired screening is achieved. In this case, the accuracy of screening is further improved by using a known radiotherapeutic agent as a positive control. In the method, it is more preferable to detect the generated gamma dose from a tissue targeted for radiotherapy.
  • the present invention provides a method for detecting a protein of interest in a sample.
  • this method by incubating a sample containing (or possibly containing) a protein of interest with a compound or composition of the invention, the protein of interest (if present) is successfully radiolabeled.
  • the This method can be used, for example, instead of the primary antibody in immunoblotting.
  • Various fluorescent labeling techniques are known as methods for detecting a protein of interest in a sample. Since the compound of the present invention retains a radioactive metal nuclide, the present method can detect a lower concentration of the target protein as compared with the fluorescent labeling technique.
  • the present invention provides a method for labeling cells.
  • this method by incubating cells expressing (or possibly expressing) a membrane protein of interest with a compound or composition of the invention (if present) Membrane proteins are successfully radiolabeled.
  • This method can be used, for example, instead of primary antibodies in immunohistochemistry.
  • the present invention provides a further method in terms of labeling cells.
  • the method comprises the steps of transforming a cell with a polynucleotide encoding a fusion protein of a membrane protein and a second polypeptide added to the N-terminus thereof, and a radioactive metal nuclide in the second polynucleotide.
  • the step of holding for the second polypeptide, see [1-3] above.
  • an amino acid region to which the radioactive metal nuclide binds exists outside the cell. Since those skilled in the art can easily obtain the sequence information of the membrane protein, it is possible to easily construct a membrane protein in which a target amino acid region is inserted at a desired site. Further, when the N-terminal part of the membrane protein is constituted by the target amino acid region, the target amino acid region may be constituted subsequent to the signal peptide present at the N-terminus of the immature membrane protein. Procedures for performing these are known in the art and can be performed by those skilled in the art without the need for trial and error.
  • the dried resin was treated with a solution containing 10 ⁇ L of triisopropylsilane, 25 ⁇ L of ethanedithiol, 25 ⁇ L of water, and 940 ⁇ L of trifluoroacetic acid at room temperature for 2 hours to perform deprotection and cut out from the resin.
  • the crude peptide was precipitated using 5 mL of cold ether, and this precipitate was dissolved in an aqueous acetonitrile solution and subjected to reverse phase HPLC. The desired fraction was stirred overnight in PBS buffer supplemented with 5% DMSO to form disulfide bonds.
  • the crude product was subjected to reverse phase HPLC, and 2 mg of the target DAHK-Octreotide (H-Asp-Ala-His-Lys-D-Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol) was added. Obtained.
  • 64 Ni was irradiated with protons using a cyclotron to obtain 64 CuCl 2 .
  • DACu-Octreotide (0.86 nmol) was reacted with 64 CuCl 2 (160 MBq) in 200 ⁇ L of 10 mM acetate buffer (pH 6.5) at 40 ° C. for 1 hour.
  • the solution after the reaction was applied to a C18 solid-phase extraction column, and 64 Cu-DAHK-Octreotide, which was the target product, was eluted with ethanol.
  • the specific activity of the obtained 64 Cu-DAHK-Octreotide was about 16 GBq / ⁇ mol.
  • the obtained 64 Cu-DAHK-Octreotide (0.2 nmol; approximately 3 MBq) was dissolved in 200 ⁇ L of physiological saline and intravenously administered to 10-week-old male Spraque Dawley rats under isoflurane anesthesia.
  • the whole body of the rat was imaged with a continuous bed flow motion using a positron tomography device (trade name: microPET Focus220 (manufactured by SIEMENS)). Imaging was performed between 90 minutes and 120 minutes after administration, and images were reconstructed from the obtained signals using the OSEM method.
  • FIG. 1 shows a whole body PET image of a rat.
  • the arrows in the figure indicate the pituitary, liver and kidney from the top.
  • FIG. 2 shows a PET image of the abdomen of the rat. The arrow in the figure indicates the pancreas. From these images, it was confirmed that 64 Cu-DAHK-Octreotide was accumulated in the pituitary and pancreas where the somatostatin receptor was highly expressed. Moreover, this accumulation level was comparable to the result using a compound prepared using DOTA (results not shown). These indicate that 64 Cu-DAHK-Octreotide can be used as a radiopharmaceutical.
  • the specific radioactivity could be improved to about 50 GBq / ⁇ mol by using Hepes buffer as the buffer used to obtain 64 Cu-DAHK-Octreotide. This indicates that the compound of the present invention can be effectively used even in a very small amount.
  • 50 mg of the dried resin was treated with a solution containing 10 ⁇ L of triisopropylsilane, 25 ⁇ L of ethanedithiol, 25 ⁇ L of water, and 940 ⁇ L of trifluoroacetic acid at room temperature for 2 hours to perform deprotection and cut out from the resin.
  • the crude peptide was precipitated using 5 mL of cold ether, this precipitate was dissolved in acetonitrile aqueous solution, subjected to reverse phase HPLC, and the target product DAHK-Exenatide (Asp-Ala-His-Lys-His-Gly- Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys- Asn-Gly-Gly-Pro- Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2) was obtained 4 mg.
  • 64 Ni was irradiated with protons using a cyclotron to obtain 64 CuCl 2 .
  • DAHK-Exenatide (0.75 nmol) was reacted with 64 CuCl 2 (174 MBq) in 100 ⁇ L of 10 mM acetate buffer (pH 6.5) at 40 ° C. for 1 hour.
  • the solution after the reaction was applied to a C18 solid-phase extraction column, and 64 Cu-DAHK-Exenatide which was the target product was eluted with ethanol.
  • the specific radioactivity of the obtained 64 Cu-DAHK-Exenatide was about 80 GBq / ⁇ mol.
  • the obtained 64 Cu-DAHK-Exenatide (0.1 nmol; approximately 14 MBq) was dissolved in 200 ⁇ L of physiological saline and administered into 36-week-old male Bulb / c nude mice via the tail vein under isoflurane anesthesia. .
  • the whole body of the mouse was imaged with a positron tomography device (trade name: microPET Focus220 (manufactured by SIEMENS)). Imaging was performed immediately after administration to 90 minutes after administration, and images were reconstructed from the obtained signals using the FBP method.
  • FIG. 3 shows a whole body PET image of the mouse.
  • the arrows in the figure indicate the pancreas (1), kidney (2), liver (3), and bladder (4). From these images, it was confirmed that 64 Cu-DAHK-Exenatide was accumulated in the pancreas where the GLP-1 receptor was highly expressed.
  • the present invention is useful for diagnosis, determination and treatment of diseases, and greatly contributes to the pharmaceutical field.

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Abstract

　本発明は、生体内にて標的組織へ精度よく指向される、臨床的に利用可能な放射標識化合物を提供する。本発明の化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる。上記化合物において、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されている。

Description

生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用
　本発明は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物およびその利用に関するものである。
　放射線療法は、主に、癌（悪性腫瘍）を治療するために放射線を照射する治療法であり、単独で、あるいは化学療法、ホルモン療法などと組み合わされて用いられている。近年、インビボでの治療および診断に用いるための種々の放射性リガンドが研究されており、例えば、放射線治療の対象である癌の治療を目的として、放射標識された抗体を用いた放射性薬剤（ゼヴァリン（登録商標））が開発されている。
　また、生体内に投与された放射標識化合物を用いる技術として、陽電子放射断層画像撮影法（ＰＥＴ）が知られている。ＰＥＴは、目的の分子の挙動を調べることができる「分子イメージング」技術の１つであり、種々の疾患の早期発見や、有効かつ副作用の少ない医薬の短期間での開発に有用であると考えられている。ＰＥＴは、陽電子が電子と衝突することによって放射されるγ線を用いて断層画像を撮影する技術であり、標識した目的の分子（いわゆる、分子プローブ）を生体に投与し、標識されている放射性核種が別の原子核に崩壊していく際に放出する陽電子と、その近傍に存在する電子との衝突によって放出されるγ線を検出する。これによって、目的の分子の存在部位を定量的に調べることができる。このようなＰＥＴは、臨床的な分子イメージング技術として広く利用されている。例えば、［１８Ｆ］で標識したフルオロデオキシグルコースを用いたＰＥＴががん検診に利用されている。
　放射性薬剤は、生体内に投与することによって、放射線を標的腫瘍細胞に直接照射することができるので、新たな抗腫瘍効果を提供し得る。また、ＰＥＴは、医薬品開発および臨床診断に用いられている、優れた分子イメージング技術である。このように、生体内に投与された放射標識化合物を用いる技術は非常に有望である。
Lewis et al., Bioconjugate Chemistry (1994), 5(6): 565-576
　ゼヴァリンは、標的タンパク質に対する抗体に共有結合させたキレーターを介して、β線を放出する放射性の金属核種を標識した化合物である。ＰＥＴに適用するために抗体、タンパク質などの生体高分子を放射標識する場合もまた、リンカーを介してキレーター（例えば、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸））を生体高分子に導入し、キレーター部分に金属核種を結合させる方法が採用されている（例えば、非特許文献１参照）。
　しかし、非特許文献１記載の技術では、キレーターが生体高分子と非特異的に反応するので、生体高分子の活性部位にキレーターが導入されたことによって生体高分子の活性の低下が生じる。また、このような技術では、生体高分子にキレーターの化学的修飾を施す必要があり、手間がかかる。さらに、用いられるキレーターは、元々生体内に存在しない物質であり、放射標識した生体高分子を薬剤等に利用するためには、キレーター自体の生体での安全性を評価することが必要となる。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内にて臨床的に利用可能な放射標識化合物をキレーターによって化学修飾することなく提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために独自の観点から鋭意検討を重ね、生体分子の１つであるタンパク質の特定領域が、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるに好適な結合能を有していることを見出したことに基づいて、本発明を完成するに至った。
　本発明にかかる化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
　上記構成を有していることにより、本発明にかかる化合物は、放射性の金属核種を担持した状態で生体内にて目的の部位に送達され得る。
　本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、該化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質のフラグメントであることが好ましい。また、標的組織に発現している上記タンパク質は、第１のポリペプチドのレセプタータンパク質であることが好ましい。このような構成を有していることにより、本発明にかかる化合物は、投与された生体に対して毒性を示す危険性が低い。
　本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、Ｘ１－Ｈｉｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表す。）を含んでいることが好ましく、Ｘ２－Ｘ１－ＨｉｓまたはＸ２－Ｘ１－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表し、Ｘ２はＭｅｔ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表す。）を含んでいることがより好ましい。このような構成のアミノ酸領域を含んでいることによって、放射性金属６４Ｃｕとの錯形成が首尾よく行われるので、半減期が比較的長い６４Ｃｕを放射性の金属核種として用いることができる。
　本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、Ｍｅｔ－Ｘ３－Ｃｙｓ－Ｘ４－Ｘ５－Ｃｙｓ（Ｘ３はＴｈｒ，Ｓｅｒ，ＨｉｓまたはＡｓｎを表し、Ｘ４はＡｌａ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＧｌｕを表し、Ｘ５はＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，ＧｌｎまたはＧｌｕを表す。）を含んでいてもよい。また、本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓを含んでいてもよい。
　本発明にかかる化合物において、第２のポリペプチドは、ＤＡＨ、ＤＡＨＫ、ＤＴＨ、ＤＴＨＫ、ＥＡＨ、ＥＡＨＫ、ＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＨＧＤＨＭＨＮＨＤＴＫであり得る。
　本発明にかかる化合物において、上記アミノ酸領域は、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成していることが好ましい。また、本発明にかかる化合物において、第２のポリペプチドは３～１５個のアミノ酸からなってもよい。このような構成を有していることにより、本発明にかかる化合物は、血液脳関門を通過しやすくなり、送達すべき部位が頭部であっても適用可能となる。
　本発明にかかる化合物を製造する方法は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に、第２のポリペプチドを付加する工程を包含し、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、該アミノ酸領域に保持させる工程をさらに包含することを特徴としている。
　本発明にかかる製造方法において、第２のポリペプチドを付加する上記工程は、ペプチド固相合成法を用いて第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドを合成することによって行われてもよく、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質を遺伝子工学的に生成することによって行われてもよい。遺伝子工学的な手法を採用した場合、第１のポリペプチドのＮ末端に目的のアミノ酸領域を予め付加しておくことができるので、タンパク質を調製した後にキレーターを化学的に修飾するという手間を省くことができる。また、目的のアミノ酸領域を付加する部位を特定の箇所に限定することが非常に容易である。さらに、このような方法を用いれば、細胞表面の膜タンパク質の標識が容易になり、細胞の標識を容易に行い得る。
　本発明にかかる組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるために、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物を含有しており、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいることを特徴としている。本発明にかかる組成物は、上記アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、さらに含有していてもよい。
　本発明にかかる組成物は、陽電子放射断層画像撮影による診断に用いられても、放射線治療に用いられてもよい。
　本発明にかかる撮影方法は、生体内における陽電子放射断層画像を撮影するために、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含し、該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該化合物において、第１のポリペプチドは、測定されるべき標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
　本発明にかかるスクリーニング方法は、放射線治療に用いる化合物をスクリーニングするために、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含し、該候補化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該候補化合物において、第１のポリペプチドは、測定されるべき標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
　本発明にかかる検出方法は、サンプル中の目的のタンパク質を検出するために、サンプルを化合物とともにインキュベートする工程、および該化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を検出する工程を包含し、該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該化合物において、第１のポリペプチドは、目的の膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
　本発明にかかる標識方法は、細胞を標識するために、細胞を化合物とともにインキュベートする工程、および該化合物が放出する陽電子に基づいてガンマ線量を生成している細胞を検出する工程を包含し、該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、該化合物において、第１のポリペプチドは、標識されるべき細胞に発現している膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されていることを特徴としている。
　本発明にかかるさらなる標識方法は、細胞を標識するために、膜タンパク質とそのＮ末端に付加された第２のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程、および第２のポリヌクレオチドに放射性の金属核種を保持させる工程を包含し、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいることを特徴としている。
　本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
　本発明によれば、生体高分子であるタンパク質を放射標識する際に、従来のような毒性が不明である低分子化合物（キレーター）などの化学修飾が不要である。また、ＤＯＴＡ等のキレーターを用いた放射標識では、所望の部位に所望の数の放射標識を導入することが極めて困難であったが、本発明を用いれば、タンパク質のＮ末端を特異的に放射標識することが可能になり、タンパク質を標識する金属核種の個数を限定することが可能になった。
本発明の化合物を投与したラットにおける、全身のＰＥＴ画像を示す図である。 本発明の化合物を投与したラットにおける、腹部のＰＥＴ画像を示す図である。 本発明の化合物を投与したヌードマウスにおける、全身のＰＥＴ画像を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　〔１〕本発明の化合物
　本発明は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されている構成を有している化合物を提供する。
　〔１－１〕ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。ポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよく、遺伝子工学的に生成されてもよい。
　用語「単離された」ポリペプチドは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドが意図される。例えば、宿主細胞（形質転換体）中で発現された組換えポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されているとみなされる。
　生成されたポリペプチドは、当該ポリペプチドと特異的に結合し得る抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。抗体アフィニティークロマトグラフィーの使用に加えて、目的のポリペプチドは、広範な公知のタンパク質精製技術（例えば、硫安分画、溶媒沈殿、免疫沈降法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点沈殿、エレクトロフォーカシング、電気泳動法など）を単独または組み合わせて用いて精製され得る。なお、アフィニティークロマトグラフィーに用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、当該分野に周知の方法によって作製され得る（例えば、ペプチド抗体）。
　また、本発明において、精製手順を簡便化する目的で、ポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含んでいてもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のタグ標識ポリペプチド、およびＧＳＴなどが挙げられる。このような付加的なポリペプチドは、当該分野に周知の方法によって、ポリペプチドの精製後に首尾よく切断され得る。
　当業者は、目的のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を容易に取得し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合した「ポリヌクレオチド」は「オリゴヌクレオチド」と交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号Ｘに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号Ｘの各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
　本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
　本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、非翻訳領域の配列またはベクター配列などの配列を含むものであってもよい。また、コードされるポリペプチドに、上述したような付加的なポリペプチドを含ませるために、ポリヌクレオチドは、その５’側または３’側において、タグ標識をコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結されていてもよい。
　〔１－２〕第１のポリペプチド
本発明の化合物において、第１のポリペプチドは、本発明の化合物を生体内にて標的組織に指向させる機能を担っている。第１のポリペプチドと特異的に結合するタンパク質が発現している組織を標的とすることによって、本発明の化合物は生体内にて所望の部位に送達され得る。すなわち、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであることを特徴としている。
　第１のポリペプチドと特異的に結合するタンパク質としては、第１のポリペプチドのレセプターが挙げられるが、これに限定されない。本発明の化合物の送達が生体内の特定部位に限定されることが所望される場合、上記タンパク質として、目的の部位において特異的に発現しているタンパク質が選択されればよい。このようなタンパク質としては、膜タンパク質が好ましいが、組織特異的に発現している細胞外マトリクスタンパク質であってもよい。当業者は、本発明の化合物が指向されるべき組織を選択した際に、その組織に特異的に発現しているタンパク質を、当該分野の技術常識に基づいて容易に選択し得、この選択されたタンパク質に特異的に結合するポリペプチドを容易に選択し得る。すなわち、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、標的組織に応じて第１のポリペプチドを容易に選択し得る。
　本明細書中で使用される場合、第１のポリペプチドのアナログは、第１のポリペプチドのレセプターとの特異的な結合能力を有しているが、第１のポリペプチドと異なる化学構造を有する化合物をいう。すなわち、第１のポリペプチドと特異的に結合するタンパク質は、第１のポリペプチドのアナログと特異的に結合するタンパク質でもあり得る。
　後述する実施例において、ソマトスタチンのアナログの１つであるオクトレオチドを用いて本発明を例証しているが、第１のポリペプチドのアナログとしてはこれに限定されない。また、ソマトスタチンのアナログは、ソマトスタチン受容体の５つのサブタイプ（ＳＳＴＲ１～５）の少なくとも１つに対する特異的な結合能力を有している化合物であればよく、ソマトスタチンのアナログとしては、例えば、オクトレオチドおよびオクトレオチド類縁体が挙げられ、オクトレオチド類縁体として、例えば、〔Ｔｙｒ３〕－オクトレオチド、バプレオチド（Vapreotide）、ランレオチド（Lanreotide）、〔Ｔｙｒ３〕－オクトレオテート（Octreotate）、〔Ｔｙｒ３,Ｔｙｒ8〕－オクトレオチド、等が挙げられる（参考文献として、Storch et al., The Journal of Nuclear Medicine, Vol.46, No.9, 2005、Reubi et al., European Journal of Nuclear Medicine, Vol.27, No.3, 2000参照）。なお、このような化合物に対して化学修飾（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の修飾）を施した化合物もまた、本発明における「アナログ」に含まれる。上述したように、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、標的組織に応じて第１のポリペプチドを容易に選択し得、その上で、比較的長時間にわたって生体内情報を観察することを目的とする場合には、当該分野の技術常識に基づいて、生理学的半減期がより長い（すなわち、生体内での代謝または排出の速度が比較的緩やかである）アナログを容易に選択し得る。
　また、第１のポリペプチドのさらなる例としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）の受容体に直接結合するエクセナチド（exenatide）、サブスタンスＰ受容体アンタゴニストであるスパンタイド（spantide）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）等が挙げられる。ＥＧＦ、ＩＦＮ等のアミノ酸配列は当該分野において周知であり、当業者は容易に入手し得る。
　〔１－３〕第２のポリペプチド
　本発明の化合物において、第２のポリペプチドは、本発明の化合物が標的組織に到達するまでの間、放射性の金属核種を担持する機能を担っている。第２のポリペプチドが放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を有していることによって、第２のポリペプチドはこのような機能を首尾よく発揮することができる。すなわち、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいることを特徴としている。生体内に投与されるべき本発明の化合物が生体内にて毒性を示す危険性を低減させるために、第２のポリペプチドは生体分子（すなわち天然に存在するタンパク質）のフラグメントであることが好ましい。
　一実施形態において、本発明の化合物は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物である。本実施形態において、放射性の金属核種が、上記アミノ酸領域に保持されている。このような構成を有していることによって、本発明の化合物は、放射性の金属核種を標的組織へ送達することができるので、放射線治療用の薬剤として非常に有用である。また、本発明の化合物は、放射性の金属核種によって生成されるガンマ線量に基づく情報（例えば生体内での物質の動態に関する情報）を提供し得るので、陽電子放射断層画像撮影用の分子プローブ（いわゆるＰＥＴプローブ）として用いることによってＰＥＴ画像診断に非常に有用である。
　上述したように、本発明の化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されている構成を有している。本発明の化合物が放射線治療に用いられる場合、第２のポリペプチドに保持されている放射性の金属核種が標的組織へ送達されればよいので、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであれば特に限定されない。なお、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと上記タンパク質との結合を阻害しない部位に付加されていることが重要であり、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドのＮ末端に付加されている。
　上述したように、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる。このようなアミノ酸領域は、本発明の化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質のフラグメントであることが好ましい。このような構成を有することによって、本発明が生体に対して毒性を示す危険性を大いに低減し得る。また、このような構成を有する第２のポリペプチドは、本発明の化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質そのものであってもよいといえる。
　また、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域は、第２のポリペプチド中に複数含まれていてもよい。この場合、複数の上記アミノ酸領域は、互いに同一であっても異なってもよい。
　１つの局面において、上記アミノ酸領域としては、Ｘ１－Ｈｉｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表す。）を含んでいることが好ましく、Ｘ２－Ｘ１－ＨｉｓまたはＸ２－Ｘ１－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表し、Ｘ２はＭｅｔ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表す。）を含んでいることがより好ましい。このような構成のアミノ酸領域を含んでいることによって、半減期が比較的長い６４Ｃｕを放射性の金属核種として用いることができ、ＰＥＴプローブとしての用途に好適である。なお、このような構成のアミノ酸領域は２価の金属イオンを結合させる際に特に好適に利用され、このような構成のアミノ酸領域と親和性が高い放射性の金属核種は、６４Ｃｕ、６５Ｚｎ、７２Ｚｎ、５６Ｃｏ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、１０９Ｃｄ、１１３Ｃｄ、５６Ｎｉ、５９Ｎｉ、６３Ｎｉが挙げられ、いずれも好適に利用され得る。また、２価の金属イオンを結合させる際に利用され得るアミノ酸領域として、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓを含んでいる構成が挙げられる。このような構成のアミノ酸領域と親和性が高い放射性の金属核種は、６４Ｃｕ、６５Ｚｎ、７２Ｚｎ、５６Ｎｉ、５９Ｎｉ、６３Ｎｉが挙げられ、いずれも好適に利用され得る。
　他の局面において、上記アミノ酸領域としては、Ｍｅｔ－Ｘ３－Ｃｙｓ－Ｘ４－Ｘ５－Ｃｙｓ（Ｘ３はＴｈｒ，Ｓｅｒ，ＨｉｓまたはＡｓｎを表し、Ｘ４はＡｌａ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＧｌｕを表し、Ｘ５はＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，ＧｌｎまたはＧｌｕを表す。）を含んでいることが好ましく、Ｍｅｔ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｃｙｓを含んでいることがより好ましい。このような構成のアミノ酸領域は１価の金属イオンを結合させる際に特に好適に利用され、ＰＥＴプローブとしての用途に好適である。このような構成のアミノ酸領域と親和性が高い放射性の金属核種は、６４Ｃｕ、６５Ｚｎ、７２Ｚｎ、５６Ｃｏ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、１０９Ｃｄ、１１３Ｃｄ、１９４Ｈｇが挙げられ、いずれも好適に利用され得る。
　また、本発明の化合物を送達すべき部位が頭部（特に脳内）の場合、血液脳関門を通過する能力の観点から、第２のポリペプチドの長さは短いことが好ましく、３～１５個のアミノ酸からなることがより好ましい。この場合、第２のポリペプチドが上記アミノ酸領域からなるペプチドであってもよい。
　本発明の化合物において、上記アミノ酸領域は、第２のポリペプチド中に含まれていればよいが、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成している（すなわち、上記アミノ酸領域が第２のポリペプチドのＮ末端に露出している）ことによって、放射性の金属核種をより強く保持することができ、品質安定性を高めることができる。
　本発明の化合物において好適に利用される、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域としては、ＤＡＨ、ＤＡＨＫ、ＤＴＨ、ＤＴＨＫ、ＥＡＨ、ＥＡＨＫ、ＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＤＴＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＥＡＨＫＧＭＴＣＡＧＣＭＴＣＡＮＣ、ＨＧＤＨＭＨＮＨＤＴＫが挙げられるがこれらに限定されない。また、第２のポリペプチドがこれらのアミノ酸領域からなってもよい。
　後述する実施例において、ソマトスタチンを第１のポリペプチドとして、そのアナログの１つであるオクトレオチドのＮ末端に、Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物を用いて、本発明を例証している。ソマトスタチンのレセプターが特異的に発現している膵臓および下垂体へ本発明の化合物が集積していることより、これらの部位に対する放射線治療が可能であることがわかる。別の実施例において、エクセナチドのＮ末端に、Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物を用いて、本発明を例証している。オクトレオチドを用いた実施例と同様に、ＧＬＰ－１受容体が高発現している膵臓へ本発明の化合物が集積している。また、スパンタイドのＮ末端にＡｓｐ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物（Asp-Ala-His-Lys-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu）も同様に用いられ得る。もちろん、第１のポリペプチドが薬剤としての機能を有していてもよく、この場合は、第１のポリペプチドの機能と金属核種の機能とによる相乗効果が期待され得る。さらに、本発明者らは、オクトレオチドまたはエクセナチドのＮ末端に、Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓからなる第２のポリペプチドを付加した化合物を生成している。
　Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓのアミノ酸配列は、ヒトアルブミンに存在し、この領域が、２価の金属イオンを結合することが知られている（参考文献として、Malgorzata Rozga et al., J. Biol. Inorg. Chem. (2007), 12: 913-918、David Bar-Or et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2001), 284(3): 856-862、Leonard T.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2007), 357: 543-548、Catherine Harford and Bibudhendra Sarkar, Acc. Chem. Res. (1997), 30: 123-130、Peter J. Sadler et al., Eur. J. Biochem. (1994), 220: 193-200参照）。また、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓのアミノ酸配列は、Cu, Zn superoxide dismutase（Ｃｕ，ＺｎＳＯＤ）に存在し、この領域が、２価の金属イオンを結合することが知られている（参考文献として、J Inorg Biochem. (2008) 102(9): 1700-10、J. Mol. Biol. (2009) 386: 406-418等参照）。さらに、上記Ｍｅｔ－Ｘ３－Ｃｙｓ－Ｘ４－Ｘ５－Ｃｙｓのアミノ酸配列は、P-type ATPase （ＣｏｐＡ）に存在し、この領域が、１価の金属イオンを結合することが知られている（参考文献として、Biochemistry (2005) 44: 13144-13150、J Biol Chem. (2001) 276: 30315-30325、Biochem. Biophys. Res. Comm. (2007) 357: 543-548、Genome Res. (2002) 12: 255-271、J Biol Chem. (2007) 282: 8622-8631、Biochem. J. (2008) 411: 571-579等参照）。
　しかし、これらの文献には、放射性の金属核種との結合が記載も示唆もされていないばかりか、放射標識化合物が教示も示唆もされていない。また、結合した２価の金属イオンを容易に解離することも記載されている。よって、これらの知見に基づいて、当業者は、生体内にて臨床的に利用可能な放射標識化合物に容易に想到し得ない。特に、生体内に存在する領域を用いる以上、その生体内にて天然に存在しているタンパク質と競合して互いに機能を阻害しかねないことを考慮すると、当業者は、本発明の化合物の構成に容易に想到し得ない。このように、当業者は、従来知られている知見から、放射性の金属核種を担持した状態で生体内にて目的の部位に送達され得る化合物を容易に構成し得ない。
　なお、上述したように、ＰＥＴ用の分子プローブまたは放射性薬剤として用いられている放射標識化合物では、ＤＯＴＡ等のキレーターが用いられている。このことは、放射性金属の結合にキレーターが極めて優れていることを示している。後述する実施例において例証した結果は、ＤＯＴＡを用いて作製した化合物を用いた結果に匹敵するものであり、このような優れた効果を、キレーターを用いることなく実現し得ることは、当業者が予測し得るものではない。
　そもそも、化合物を放射標識する際に用いられる放射金属核種の量は少量であり、そのために反応液中の放射金属核種の濃度は極めて低濃度になる（例えば、６４Ｃｕの場合、１０００ＭＢｑで７ｎｇであり、３００ＭＢｑを１００μＬに溶解して反応させるとその濃度は０．３μＭ程度である。）。そこに１～１０ｎｍｏｌｅ程度のペプチドを添加して反応させるので、放射標識の反応は非常に低濃度の環境下で行われる。これにも関わらず、本発明の化合物の標識反応が首尾よく進行することは、当業者に容易に予測し得るものではない。もちろん、当業者は、標識反応が首尾よく進行させるための構成（すなわち、本発明の構成）に容易に想到し得ない。
　なお、本発明の目的は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物を提供することにあるのであって、具体的に記載したポリペプチドに限定されるものではない。また、このような化合物の作製方法については、下記方法以外によって取得される放射標識化合物もまた本発明の技術的範囲に属することに留意すべきである。
　〔２〕本発明の化合物の製造方法
　本発明はまた、上述した化合物を製造する方法を提供する。本発明の製造方法は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に、第２のポリペプチドを付加する工程と、第２のポリペプチド中に放射性の金属核種を保持させる工程を包含していればよい。化合物について上述したように、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる。すなわち、第２のポリペプチド中に放射性の金属核種を保持させる工程は、上記アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、該アミノ酸領域に保持させる工程といえる。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドについては、上記〔１－２〕および〔１－３〕を参照のこと。
　一実施形態において、第２のポリペプチドを付加する工程は、ペプチド固相合成法を用いて第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドを合成することによって行われる。他の実施形態において、第２のポリペプチドを付加する工程は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質を遺伝子工学的に生成することによって行われる。
　第１のポリペプチドが天然に存在するタンパク質（またはそのフラグメント）である場合、本発明の化合物は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質として遺伝子工学的に生成されることが好ましく、第１のポリペプチドが合成ペプチド（例えば天然に存在するタンパク質を改変した合成物）である場合、ペプチド固相合成法を用いて合成されることが好ましい。
　送達すべき部位が頭部（特に脳内）である化合物を製造する場合、上述したように、第２のポリペプチドの長さは短いことが好ましい。このような短いペプチドを第２のポリペプチドとして用いる場合は、第１のポリペプチドが天然に存在するタンパク質（またはそのフラグメント）であっても、ペプチド固相合成法が用いられてもよい。
　遺伝子工学的なポリペプチド生成は、形質転換体を用いるものであっても、インビトロ翻訳を用いるものであってもよく、形質転換体（例えば、原核生物細胞および真核生物細胞）は、目的のポリペプチドを一過性に発現するものであっても安定的に発現するものであってもよい。目的のポリペプチドを一過性に発現させれば、目的のポリペプチドを迅速に調製し得、安定的に発現させれば、目的のポリペプチドを大量に調製し得る。
　遺伝子工学的な生成は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが機能的に挿入されたベクターを用いて行われ得る。本明細書中において使用される場合、「機能的に挿入される」は、適切なオープンリーディングフレームおよび方向に従ってベクター中に挿入されることが意図される。遺伝子工学的な生成に用いられるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。このようなベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　組換え発現に用いられるべきベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、選択したプロモーター配列と目的の遺伝子とを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
　上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養した後にその培養物または培養上清から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）を用いて、目的タンパク質を回収／精製することができる。
　発現ベクターは、従来公知の選択マーカーを含むことが好ましい。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されず、従来公知の方法が好適に用いられ得る。
　なお、遺伝子工学的なポリペプチド生成を行うために、当業者は、目的のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関する情報を、任意の配列データベースから容易に取得し得る。また、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、必要な遺伝子ライブラリーを容易に構築し、そこから所望のヌクレオチド配列を有する遺伝子を容易に調製し得る。さらに、当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、得られた遺伝子の所望の部位に、目的のアミノ酸領域をコードするポリヌクレオチドを挿入した遺伝子を容易に調製することができる。
　上述したように、本発明の化合物において、上記アミノ酸領域は、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成している（すなわち、上記アミノ酸領域が第２のポリペプチドのＮ末端に露出している）ことが好ましい。当業者は、当該分野における技術常識を用いて、上記アミノ酸領域を第２のポリペプチドのＮ末端部分に構成することができる。例えば、ペプチド固相合成法が用いられる場合は、目的のアミノ酸を第２のポリペプチドのＮ末端に順次合成すればよい。また、遺伝子工学的なポリペプチド生成の場合は、開始メチオニンに続いて上記アミノ酸領域を構成してもよく、上記アミノ酸領域のＮ末端側に酵素による切断部位を設けた第２のポリペプチドと第１のポリペプチドとの融合タンパク質を生成した後に、所定の酵素を用いて切断処理を行ってもよい。このような切断処理は当該分野において周知である。
　〔３〕本発明の組成物
　上述したように、本発明の化合物を用いれば、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させることができるので、陽電子放射断層画像撮影による診断や放射線治療に特に有用である。
　すなわち、本発明は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるための組成物を提供する。本発明の組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの形態にて調製されていても、液体（例えば、緩衝液）に溶解もしくは懸濁するために適切な固体形態として調製されていてもよい。
　本発明の組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるために必要な構成として、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物を含有しており、第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドについては、上記〔１－２〕および〔１－３〕を参照のこと。
　このように、本発明の組成物は、放射性の金属核種を保持する前の化合物を含有していても、放射性の金属核種を保持した化合物を含有していてもよい。前者の場合、本発明の組成物は、生体内にて標的組織に指向する放射標識化合物を調製するための組成物であり得る。
　なお、本発明の組成物は、キットとして提供されてもよい。「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であり、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であるが、本明細書中で使用される場合、「有効成分を含有している組成物」は「有効成分を備えているキット」を包含する。キット形態の場合、後述する化合物を有効成分として備えていればよく、組成物として含まれ得る成分をさらに備えていてもよい。すなわち、本発明の組成物は、「放射性の金属核種を保持する前の化合物」と「放射性の金属核種」とを別々に備えたキットであり得る。
　本明細書中で使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、キットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得る。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。キットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、キットは、用途に応じて必要な器具をあわせて備えていてもよい。
　〔４〕本発明のさらなる利用
　上述したように、本発明の化合物および組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させる能力に基づいて、陽電子放射断層画像撮影による診断に用いられ得る。すなわち、本発明は、生体内における陽電子放射断層画像を撮影する方法を提供する。本方法は、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含することを特徴としており、上記化合物が本発明の化合物であればよい。また、上記化合物は、本発明の組成物として提供されてもよい。上記検出する工程においては、通常、陽電子断層撮像装置を用いたイメージング（画像化）が用いられるので、生体に対して低侵襲であるという利点がある。このような方法は、医師による診断を補助するためのデータ収集方法であり得る。
　なお、本方法は診断方法としても利用可能であるが、ヒトに適用される場合は、医師が行う工程（例えば、生体内に化合物を投与する工程、医師が判断する工程）を包含することが意図されない。本方法が非ヒト哺乳動物に適用される場合は、獣医師が行う工程を包含してもよく、この場合の投与は、種々の経路による注入が好ましいが、これに限定されない。また、投与量も、必要に応じて適宜設計され得る。
　さらに、本発明の化合物および組成物は、放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させる能力に基づいて、放射線治療に用いられ得る。このことは、放射線治療に用いられ得る物質のスクリーニングが可能であることを示す。すなわち、本発明は、放射線治療に用いる化合物をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、上述した生体内における陽電子放射断層画像を撮影する方法と同様に、生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程を包含することを特徴としており、上記化合物が本発明の化合物であればよい。また、上記化合物は、本発明の組成物として提供されてもよい。本方法において、上述した化合物の製造方法に従って第１のポリペプチドを複数種調製し、それぞれ放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させる能力を相互に比較して、より優れたものを選択することによって、目的のスクリーニングが達成される。この場合、既に知られている放射線治療剤を陽性コントロールとして用いることにより、スクリーニングの精度がより向上する。また、本方法は、生成されるガンマ線量を、放射線治療の標的となる組織から検出することがより好ましい。
　さらに、本明細書を読んだ当業者であれば、生体内であっても放射性の金属核種を標的組織に指向させることができる本発明の化合物および組成物を用いれば、タンパク質および細胞を首尾よく標識し得るということを、容易に理解する。
　１つの局面において、本発明は、サンプル中の目的のタンパク質を検出する方法を提供する。本方法において、目的のタンパク質を含む（あるいは、含む可能性がある）サンプルを、本発明の化合物または組成物とともにインキュベートすることによって、（存在するのであれば）目的のタンパク質が首尾よく放射標識される。本方法は、例えば、イムノブロット法における一次抗体の代りに用いられ得る。サンプル中の目的のタンパク質を検出する方法として、種々の蛍光標識技術が知られている。本発明の化合物が放射性の金属核種を保持していることによって、本方法は、蛍光標識技術と比較して、より低濃度の目的タンパク質を検出し得る。
　他の局面において、本発明は、細胞を標識する方法を提供する。本方法において、目的の膜タンパク質を発現している（あるいは、発現している可能性がある）細胞を、本発明の化合物または組成物とともにインキュベートすることによって、（存在するのであれば）目的の膜タンパク質が首尾よく放射標識される。本方法は、例えば、免疫組織化学における一次抗体の代りに用いられ得る。
　なお、細胞を標識するという観点において、本発明はさらなる方法を提供する。本方法は、膜タンパク質とそのＮ末端に付加された第２のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程、および第２のポリヌクレオチドに放射性の金属核種を保持させる工程、を包含することを特徴としている。第２のポリペプチドについては、上記〔１－３〕を参照のこと。本方法を用いれば、上記ポリペプチドを、形質転換における選択マーカーとして利用することができるだけでなく、放射性の金属核種を送達することが望まれる細胞に対して、所望の性質を付与することができる。本方法を用いて放射性の金属核種を結合させるためには、放射性の金属核種が結合するアミノ酸領域が細胞外に存在することが好ましい。当業者は、膜タンパク質の配列情報を容易に取得することができるので、所望の部位に目的のアミノ酸領域が挿入された膜タンパク質を容易に構築し得る。また、目的のアミノ酸領域によって膜タンパク質のＮ末端部分を構成する場合は、未成熟な膜タンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドに続いて目的のアミノ酸領域が構成すればよい。これらを実行するための手順は、当該分野において公知であり、当業者であれば試行錯誤を必要とすることなく行い得る。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　本発明について、以下の実施例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
　〔実施例１〕
　Fmoc-Thr(tBu)-ol-(2-Cl)トリチル樹脂（０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）を出発原料とし、標準的なFmoc固相合成法を用いて、Ｎ末端に金属結合配列を付加したOctreotideを合成し、H-Asp(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-D-Phe-Cys(trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-ol-(2-Cl)Trt樹脂を得た。この樹脂をメタノールで洗浄した後に、減圧乾燥に供した。
　乾燥した樹脂５０ｍｇを、トリイソプロピルシラン１０μＬ、エタンジチオール２５μＬ、水２５μＬ、トリフルオロ酢酸９４０μＬを含む溶液を用いて、室温で２時間処理し、脱保護、および樹脂からの切り出しを行った。反応後、冷エーテル５ｍＬを用いて粗ペプチドを沈殿させ、この沈殿をアセトニトリル水溶液に溶解し、逆相ＨＰＬＣに供した。目的の画分を、５％ＤＭＳＯを添加したＰＢＳ緩衝液中にて一晩撹拌し、ジスルフィド結合を形成させた。粗生成物を逆相ＨＰＬＣに供し、目的物であるDAHK－Octreotide（H-Asp-Ala-His-Lys-D-Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol）２ｍｇを得た。
　次いで、公知の方法を用いて、６４Ｎｉにサイクロトロンでプロトンを照射し、６４ＣｕＣｌ２を得た。DAHK－Octreotide（０．８６ｎｍｏｌ）に６４ＣｕＣｌ２（１６０ＭＢｑ）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）２００μＬ中にて、４０℃で１時間反応させた。反応後の溶液を、Ｃ１８固相抽出カラムに供し、目的物である６４Ｃｕ－DAHK－Octreotideをエタノールで溶出した。得られた６４Ｃｕ－DAHK－Octreotideの比放射能は約１６ＧＢｑ／μｍｏｌであった。
　得られた６４Ｃｕ－DAHK－Octreotide（０．２ｎｍｏｌ；約３ＭＢｑ）を、２００μＬの生理食塩水に溶解し、１０週齢の雄Spraque Dawley種ラットに、イソフルラン麻酔下にて静脈内投与した。次いで、陽電子断層撮像装置（商品名microPET Focus220 （SIEMENS社製））でこのラットの全身をコンティニュアウスベッドフローモーションにて撮像した。撮像を、投与後９０分後～１２０分後の間で行い、得られた信号からＯＳＥＭ法を用いて画像を再構成した。
　図１には、ラットの全身のＰＥＴ画像を示す。図中の矢印は、上から、下垂体、肝臓、腎臓を示す。図２には、ラットの腹部のＰＥＴ画像を示す。図中の矢印は膵臓を示す。これらの画像から、ソマトスタチン受容体が高発現している下垂体および膵臓へ６４Ｃｕ－DAHK－Octreotideが集積していることが確認された。また、この集積レベルは、ＤＯＴＡを用いて作製した化合物を用いた結果に匹敵するものであった（結果は示さず）。これらのことは、６４Ｃｕ－DAHK－Octreotideが放射性薬剤として利用可能であることを示す。
　また、６４Ｃｕ－DAHK－Octreotideを得る際に用いる緩衝液にＨｅｐｅｓ緩衝液を用いることによって、比放射能を約５０ＧＢｑ／μｍｏｌにまで向上させることができた。このことは、本発明の化合物は、極少量であっても有効に利用され得ることを示す。
　〔実施例２〕
　NovaSyn TGR樹脂（０．２０ｍｍｏｌ／ｇ）を出発原料とし、標準的なFmoc固相合成法を用いて、Ｎ末端に金属結合配列を付加したExenatideを合成し、Asp(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NovaSyn TGR樹脂を得た。この樹脂をメタノールで洗浄した後に、減圧乾燥に供した。
　乾燥した樹脂５０ｍｇを、トリイソプロピルシラン１０μＬ、エタンジチオール２５μＬ、水２５μＬ、トリフルオロ酢酸９４０μＬを含む溶液を用いて、室温で２時間処理し、脱保護、および樹脂からの切り出しを行った。反応後、冷エーテル５ｍＬを用いて粗ペプチドを沈殿させ、この沈殿をアセトニトリル水溶液に溶解し、逆相ＨＰＬＣに供し、目的物であるDAHK－Exenatide（Asp-Ala-His-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2）４ｍｇを得た。
　次いで、公知の方法を用いて、６４Ｎｉにサイクロトロンでプロトンを照射し、６４ＣｕＣｌ２を得た。DAHK－Exenatide（０．７５ｎｍｏｌ）に６４ＣｕＣｌ２（１７４ＭＢｑ）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μＬ中にて、４０℃で１時間反応させた。反応後の溶液を、Ｃ１８固相抽出カラムに供し、目的物である６４Ｃｕ－DAHK－Exenatideをエタノールで溶出した。得られた６４Ｃｕ－DAHK－Exenatideの比放射能は約８０ＧＢｑ／μｍｏｌであった。
　得られた６４Ｃｕ－DAHK－Exenatide（０．１ｎｍｏｌ；約１４ＭＢｑ）を、２００μＬの生理食塩水に溶解し、３６週齢の雄Bulb/c ヌードマウスに、イソフルラン麻酔下にて尾静脈内投与した。次いで、陽電子断層撮像装置（商品名microPET Focus220 （SIEMENS社製））でこのマウスの全身を撮像した。撮像を、投与後直後～９０分後の間で行い、得られた信号からＦＢＰ法を用いて画像を再構成した。
　図３には、マウスの全身のＰＥＴ画像を示す。図中の矢印は、膵臓（１）、腎臓（２）、肝臓（３）、膀胱（４）を示す。これらの画像から、ＧＬＰ－１受容体が高発現している膵臓へ６４Ｃｕ－DAHK－Exenatideが集積していることが確認された。
　本発明は、疾患の診断、判定および治療に有用であり、医薬分野に大いに貢献する。

Claims (22)

  1. 　第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であって、
    　第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、
    　第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、
    該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されている、化合物。
  2. 　請求項１に記載の化合物であって、上記アミノ酸領域は、該化合物が適用される生体において天然に存在するタンパク質のフラグメントである、化合物。
  3. 　上記アミノ酸領域が、Ｘ１－Ｈｉｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表す。）を含んでいる、請求項１または２に記載の化合物。
  4. 　上記アミノ酸領域が、Ｘ２－Ｘ１－ＨｉｓまたはＸ２－Ｘ１－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ（Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸を表し、Ｘ２はＭｅｔ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表す。）を含んでいる、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 　上記アミノ酸領域が、Ｍｅｔ－Ｘ３－Ｃｙｓ－Ｘ４－Ｘ５－Ｃｙｓ（Ｘ３はＴｈｒ，Ｓｅｒ，ＨｉｓまたはＡｓｎを表し、Ｘ４はＡｌａ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＧｌｕを表し、Ｘ５はＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，ＧｌｎまたはＧｌｕを表す。）を含んでいる、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
  6. 　上記アミノ酸領域が、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓを含んでいる、請求項１または２に記載の化合物。
  7. 　上記アミノ酸領域が、第２のポリペプチドのＮ末端部分を構成している、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。
  8. 　第２のポリペプチドが３～１５個のアミノ酸からなる、請求項１～７のいずれか１項の化合物。
  9. 　上記アミノ酸領域に保持されている上記金属核種が６４Ｃｕである、請求項１～８のいずれか１項の化合物。
  10. 　上記タンパク質が、第１のポリペプチドのレセプタータンパク質である、請求項１～９のいずれか１項の化合物。
  11. 　化合物を製造する方法であって、
    　第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に、第２のポリペプチドを付加する工程を包含し、
    　　第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、
    　　第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、
    　　該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、該アミノ酸領域に保持させる工程をさらに包含する、製造方法。
  12. 　第２のポリペプチドを付加する上記工程が、ペプチド固相合成法を用いて第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドを合成することによって行われる、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　第２のポリペプチドを付加する上記工程が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの融合タンパク質を遺伝子工学的に生成することによって行われる、請求項１１に記載の製造方法。
  14. 　放射性の金属核種を生体内にて標的組織に指向させるための組成物であって、
    第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物を含有しており、
    　　第１のポリペプチドは、標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、
    　　第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる、組成物。
  15. 　陽電子放射断層画像撮影による診断に用いられる、請求項１４に記載の組成物。
  16. 　放射線治療に用いられる、請求項１４に記載の組成物。
  17. 　上記アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種を、さらに含有している、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 　生体内における陽電子放射断層画像を撮影する方法であって、
    生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程
    を包含し、
    　　該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、
    　　該化合物において、第１のポリペプチドは、測定されるべき標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されている、方法。
  19. 　放射線治療に用いる化合物をスクリーニングする方法であって、
    生体内に投与された化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を生体から検出する工程
    を包含し、
    　　該候補化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、
    　　該候補化合物において、第１のポリペプチドは、測定されるべき標的組織に発現しているタンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されている、方法。
  20. 　サンプル中の目的のタンパク質を検出する方法であって、
    　サンプルを化合物とともにインキュベートする工程、および
    　該化合物が放出する陽電子に基づいて生成されるガンマ線量を検出する工程
    を包含し、
    　　該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、
    　　該化合物において、第１のポリペプチドは、目的の膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されている、方法。
  21. 　細胞を標識する方法であって、
    　細胞を化合物とともにインキュベートする工程、および
    　該化合物が放出する陽電子に基づいてガンマ線量を生成している細胞を検出する工程
    を包含し、
    　　該化合物は、第１のポリペプチドまたはそのアナログのＮ末端に第２のポリペプチドが付加されてなる化合物であり、
    　　該化合物において、第１のポリペプチドは、標識されるべき細胞に発現している膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでおり、該アミノ酸領域との親和性が高い、放射性の金属核種が、該アミノ酸領域に保持されている、方法。
  22. 　細胞を標識する方法であって、
    　膜タンパク質とそのＮ末端に付加された第２のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程、および
    　第２のポリヌクレオチドに放射性の金属核種を保持させる工程
    を包含し、
    　第２のポリペプチドは、放射性の金属核種との親和性が高いアミノ酸領域を含んでいる、方法。
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