CN117377696A - 用放射β射线的核素标记的人源化抗体 - Google Patents

用放射β射线的核素标记的人源化抗体 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于，提供对于粘蛋白亚型5AC(MUC5AC)的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异的用放射性核素标记的抗MUC5AC人源化抗体。本发明提供复合体，其为放射性核素与抗体的复合体，前述放射性核素是放射β射线的核素，前述抗体是与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体，并且，该人源化抗体具有由SEQ ID NO:1～4中任一者所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由SEQ ID NO:5～8中任一者所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。

Description

用放射β射线的核素标记的人源化抗体
技术领域
本发明涉及放射性核素或螯合有放射性核素的螯合剂与粘蛋白亚型5AC特异性人源化抗体的复合体、包含其的放射性药物和它们的用途。
背景技术
粘蛋白是由动物上皮细胞等分泌的粘液的主成分，其是大量包含分子量100万～1000万的糖的糖蛋白。粘蛋白有上皮细胞等产生的分泌型粘蛋白、以及具有疏水性的跨膜部位且以结合于细胞膜的状态存在的膜结合型粘蛋白。粘蛋白的核心蛋白统称为MUC，已知编码核心蛋白的基因至少存在20个种类。作为其中一种的粘蛋白亚型5AC(MUC5AC)属于分泌型粘蛋白。
MUC5AC在正常组织中在胃、气管中进行表达，有报告称其会在胰腺癌中过表达，除此之外，有报告称其在甲状腺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌中也会过表达。关于针对MUC5AC的抗体，存在下述报告：以从人胰腺癌细胞株SW1990的xenograft中纯化出的胰腺癌粘蛋白级分作为抗原而制作的小鼠抗体(非专利文献1)；以其为基础而制作的嵌合抗体(专利文献1、2、非专利文献2、3)；人源化抗体(专利文献3、4)。
抗体利用抗体所具备的对于靶分子的特异性而用作用于检测靶分子的试剂、诊断药或用于治疗疾病的药品。出于进一步提高检测性能和治疗效果的目的，进行了与放射性核素、药剂结合的抗体的相关研究。非专利文献1中报告了：使用被作为β射线放射核素的131I标记的小鼠抗体进行的胰腺癌模型小鼠的放射免疫治疗。非专利文献3中报告了：使用被作为γ射线放射核素的111In标记的嵌合抗体进行的胰腺癌患者的SPECT造影。专利文献3和4中存在特定的MUC5AC特异性人源化抗体的相关记载，也记载了可以包含用90Y、111In等标记的物质，但实施例中仅示出该MUC5AC特异性人源化抗体的ADCC(抗体依赖性细胞毒)活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平7-203974号公报
专利文献2：日本特开平11-5749号公报
专利文献3：国际公开第2013/157102号
专利文献4：国际公开第2013/157105号
非专利文献
非专利文献1：Japanese Journal of Cancer Research,87,977-984,1996
非专利文献2：日本临床64卷,增刊号1,2006,274-278
非专利文献3：Japanese Journal ofCancer Research,90,1179-1186,1999
发明内容
本发明的目的在于，提供对于粘蛋白亚型5AC(MUC5AC)的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异的用放射性核素标记的抗MUC5AC人源化抗体。
本发明人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果成功地制造出放射β射线的核素(β核素)与由特定氨基酸序列构成的抗MUC5AC人源化抗体的复合体，并发现：该复合体对于MUC5AC的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异，并确认其效果，从而完成了本发明。
根据本发明，可提供对于MUC5AC的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异的用放射β射线的核素标记的抗MUC5AC人源化抗体，并且，可提供该抗体的用途。
附图说明
图1是表示使用MUC5AC高表达肿瘤的切片得到的体外ARG的结果的图。针对各条件，示出下述图像：准备滴加有将各β核素标记抗体用含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水稀释至小鼠给药时的100倍而得到的溶液5μL的滤纸，将对滤纸整体设定的ROI的平均强度设为对比度的上限(上限值为15000～20000左右)，并进行标准化而得到的图像。
图2是表示各β核素标记抗体对MUC5AC高表达肿瘤切片的结合相对于各β核素标记抗体对MUC5AC低表达肿瘤切片的结合之比的图。误差棒为标准偏差、n＝3，实施基于Tukey法的检验。
图3是表示给药各β核素标记抗体后的荷瘤小鼠中的经时性的肿瘤体积变化的确认结果的图。误差棒为标准偏差、n＝6(131I标记抗体的给药放射能14.8MBq组在给药后的第13、21、23天分别各对2只实施剖检)，实施基于Tukey法的检验。
图4是表示给药各β核素标记抗体后的荷瘤小鼠中的经时性的体重变化的图。
图5是表示给药各β核素标记抗体后的荷瘤小鼠中的甲状腺毒性的调查结果的图。作为甲状腺毒性，评价血浆中的甲状腺素浓度。误差棒为标准偏差、n＝6(131I标记抗体的给药放射能7.4MBq组、14.8MBq组分别为n＝3、n＝5)，实施基于Steel法的检验。
图6表示对给药各β核素标记抗体后的荷瘤小鼠实施病理组织学评价而得到的结果的示意图(大腿骨的代表性的苏木精-曙红染色图像)。各图的左下的黑线为比例尺(200μm)。
图7表示对给药各β核素标记抗体后的荷瘤小鼠实施病理组织学评价而得到的结果的示意图(甲状腺的代表性的苏木精-曙红染色图像)。各图的左下的黑线为比例尺(200μm)。
图8是表示实施给药各89Zr标记抗体后48小时的PET-CT拍摄而得到的结果的图像。
图9是表示根据使用89Zr标记DOTA-Bn-DBCO(-■-)和89Zr标记DOTAGA-DBCO(…●…)而制作的89Zr标记的各抗体的SPECT图像，对各时间点(12、48、84、168和252小时)的肿瘤(上段图)、心脏(中段图)和肝脏(下段图)进行VOI(volume of interest、三维ROI)分析而得到的结果的图。
图10是表示在给药使用89Zr标记DOTA-Bn-DBCO(-●-)和89Zr标记DOTAGA-DBCO(…●…)而制作的89Zr标记的各抗体后，根据各时间点(12、48、84、168和252小时)的在肿瘤和肝脏中的蓄积计算肿瘤肝脏比而得到的结果的图。
图11是表示使用111In标记的各抗体实施SPECT-CT成像而得到的结果的图。其表示111In标记的各抗体的SPECT图像。
图12是表示根据111In标记的各抗体的SPECT图像对各时间点的肿瘤和肝脏进行VOI(volume of interest、三维ROI)分析而得到的结果的图。
图13是表示给药111In标记的各抗体并确认168小时后的体内分布和排泄路径而得到的结果的图。
图14是表示111In标记的各抗体的基于体外ARG的结合能的对比结果的图像。
图15是表示对111In标记的各抗体的基于体外ARG的结合能进行定量化并加以对比的结果的图。
图16是表示使用MUC5AC高表达肿瘤(SW1990)的切片得到的体外ARG的结果的图。示出下述图像：准备滴加有将177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体用含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水稀释至小鼠给药时的100倍而得到的溶液5μL的滤纸，将对滤纸整体设定的ROI的平均强度设为对比度的上限(上限值为7000～10000左右)，并进行标准化而得到的图像。
图17是表示177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体对MUC5AC高表达肿瘤切片的结合相对于177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体对MUC5AC低表达肿瘤切片的结合之比的图。误差棒为标准偏差。
图18是表示给药177Lu标记抗体后的荷瘤小鼠中的经时性的肿瘤体积变化的确认结果的图。误差棒为标准偏差、n＝6(给药放射能7.4MBq组为n＝5。给药放射能16.7MBq组之中的1只在给药后第19日实施剖检)，实施基于Steel法的检验。
图19是表示给药177Lu标记抗体后的荷瘤小鼠中的经时性的体重变化的图。
图20是表示给药177Lu标记抗体后的荷瘤小鼠中的甲状腺毒性的调查结果的图。作为甲状腺毒性，评价血浆中的甲状腺素浓度。误差棒为标准偏差、n＝6(给药放射能7.4MBq组为n＝5)。
图21表示对给药177Lu标记抗体后的荷瘤小鼠实施病理组织学评价而得到的结果的示意图(大腿骨的代表性的苏木精-曙红染色图像)。各图的左下的黑线为比例尺(200μm)。实施例8-3的图中示出的箭头表示骨髓造血细胞的减少部位。
图22表示对给药177Lu标记抗体后的荷瘤小鼠实施病理组织学评价而得到的结果的示意图(甲状腺的代表性的苏木精-曙红染色图像)。各图的左下的黑线为比例尺(200μm)。
具体实施方式
本说明书中使用的术语只要没有特别提及，就可以以在该技术领域中通常使用的含义来使用。
(1)复合体
本发明提供复合体(以下也称为本发明的复合体)，其为放射性核素与抗体的复合体，前述放射性核素为放射β射线的核素，前述抗体为与MUC5AC特异性结合的人源化抗体。
另外，作为另一实施方式，本发明提供复合体(以下也称为本发明的螯合复合体)，其为螯合有放射性核素的螯合剂(以下也称为本发明的螯合剂)与抗体的复合体，前述放射性核素为放射β射线的核素，前述抗体为与MUC5AC特异性结合的人源化抗体。
(1-1)放射性核素
本发明的复合体或螯合复合体中包含的放射性核素为放射β射线的核素。该核素只要是在放射性核素的裂变过程中放射β射线的核素即可，详细而言，优选使用67Cu(铜-67)、131I(碘-131)、89Sr(锶-89)、90Y(钇-90)或177Lu(镥-177)等，更优选为177Lu、131I或90Y，进一步优选为177Lu或90Y。
本发明的放射β射线的核素可通过公知方法来制造或获取。例如，关于90Y，通过使90Sr(锶-90)发生β裂变，从而能够生成作为子体核素的90Y。177Lu可以在原子炉中利用176Lu(n,γ)177Lu的中子捕捉反应来生成。关于131I，通过在原子炉中历经130Te(n,γ)131Te的中子捕捉反应而生成的131Te的β裂变，从而能够生成作为子体核素的131I。另外，这些β核素也可以获取由Eckert&Ziegler公司、Thermo Fisher Scientific公司、InstituteofIsotopes公司、POLATOM等销售的制品。通过对如此操作而制造或获取的β核素根据需要施加化学处理，制成适合于与抗体结合的化学形态，由此能够用于与抗体形成复合体。
(1-2)抗体
本发明的复合体或螯合复合体中包含的抗体是与MUC5AC特异性结合的人源化抗体(以下也称为本发明中使用的人源化抗体)。该抗体是具有与MUC5AC特异性结合这一能力的人源化抗体，具有稳定的物性且肿瘤蓄积性优异。该抗体可以以其抗原结合片段的形式使用，该方式也包括在本申请发明中。具体而言，包含后述特定的重链可变区和轻链可变区，根据期望具有适当的重链恒定区和轻链恒定区。本说明书中，“抗原结合片段”是指由本发明中使用的人源化抗体的一部分构成的抗体片段，且具有与MUC5AC结合的能力。只要具有与MUC5AC结合的能力即可，构成抗原结合片段的多肽中包含的氨基酸数就没有特别限定。
以下示出作为本发明中使用的人源化抗体的重链可变区而优选的氨基酸序列。重链可变区1(H01)、重链可变区2(H02)、重链可变区3(H03)和重链可变区4(H04)分别相当于本说明书中后附的序列表的SEQ ID NO：1～4。标注下划线的部位为CDR部位。
[化1]
【重链可变区1(H01)】
【重链可变区2(H02)】
【重链可变区3(H03)】
【重链可变区4(H04)】
以下示出在本发明中作为人源化抗体的轻链可变区而优选的氨基酸序列。轻链可变区1(L01)、轻链可变区2(L02)、轻链可变区3(L03)和轻链可变区4(L04)分别相当于本说明书中后附的序列表的SEQ ID NO：5～8。标注下划线的部位为CDR部位。
[化2]
【轻链可变区1(L01)】
【轻链可变区2(L02)】
【轻链可变区3(L03)】
【轻链可变区4(L04)】
换言之，本发明中优选的人源化抗体的重链可变区由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4中任一者所示的氨基酸序列构成，轻链可变区由SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8中任一者所示的氨基酸序列构成。即，本发明中使用的人源化抗体包含上述说明的4个重链可变区(H01～H04)中的任一者与4个轻链可变区(L01～L04)中的任一者的组合。
本发明中适合的人源化抗体是重链可变区为H01、H03或H04，且轻链可变区为L01～L04中任一者的人源化抗体。
本发明中最适合的人源化抗体是重链可变区为H01且轻链可变区为L03的抗体。
本发明中，人源化抗体的重链可变区不限定于利用SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列进行规定的可变区，还包括保持功能的变异体。即，由与SEQ ID NO：1～SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有90％以上、优选具有95％以上、96％以上或97％以上、进一步优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的变异的重链可变区只要在与本发明的轻链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的重链可变区。
本说明书中，氨基酸序列的同一性是指作为对象的两种蛋白质之间的氨基酸序列的同一性，用在使用本技术领域中公知的数学算法而制作的氨基酸序列的最佳对比中保持一致的氨基酸残基的比例(％)来表示。氨基酸序列的同一性可通过视觉检查和数学计算来确定，可使用本领域技术人员公知的同源性检索程序(例如BLAST、FASTA)、序列比对程序(例如ClustalW))或遗传信息处理软件(例如GENETYX[注册商标])等来计算。具体而言，本说明书中的氨基酸序列的同一性可使用DDBJ(DNA DataBank of Japan)的网站公开的系统分析程序ClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php？lang＝ja)，利用初始设定条件(Version2.1、Alignment type:slow、DNA Weight Matrix:Gonnet、GAP OPEN:10、GAP EXTENSION:0.1)来求出。
并且，作为本发明中使用的人源化抗体的重链可变区，由在SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加10个以下、优选8个以下、进一步优选5个以下、最优选3个以下(3个、2个或1个)氨基酸的氨基酸序列构成的变异的重链可变区只要在与本发明的轻链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的重链可变区。
本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区不限定于SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，还包括保持功能的变异体。即，由与SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90％以上、优选具有95％以上、96％以上或97％以上、进一步优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的变异的轻链可变区只要在与本发明的重链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区。
并且，作为本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区，由在SEQ ID NO:5～SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加10个以下、优选8个以下、进一步优选5个以下、最优选3个以下(3个、2个或1个)氨基酸的氨基酸序列构成的变异的轻链可变区只要在与本发明的重链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区。
本发明中使用的人源化抗体可通过在本技术领域中通常实施的方法或基于其的方法来制造。具体而言，可按照以下的步骤来进行。
本发明中使用的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列已经被SEQID NO:1～SEQ ID NO:8公开，因此，构建对根据这些氨基酸序列信息而得到的该抗体进行编码的核酸，并插入至适当的表达载体中。表达载体在包含对本发明中使用的人源化抗体进行编码的核酸的基础上，还可任选包含用于提高翻译效率的科扎克(Kozak)序列、向宿主导入时促进本发明中使用的人源化抗体向培养基中分泌的信号序列和启动子序列等。本发明中可使用的载体可以从本技术领域中通常使用的载体中选择，优选为作为质粒载体的pcDNA3.4。表达载体向宿主细胞中的导入也没有特别限定，作为向细胞内导入基因的方法，可使用在本技术领域中一直以来使用的方法、例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、DEAE-葡聚糖法的本领域技术人员公知的方法。如在下述实施例中进行的那样，特别适合为使用脂质转染法进行的导入方法。需要说明的是，出于该目的而使用的宿主细胞也可以使用在本技术领域中一直以来使用的宿主细胞。作为这样的宿主细胞的例子，可列举出CHO细胞、293细胞、大肠杆菌、毕赤氏酵母、Sf9细胞等。需要说明的是，当今用于表达目标蛋白质的表达系统的试剂盒已有市售，下述实施例中使用的ExpiCHO System(Thermo FisherScientific公司制)对于迅速且可靠地表达目标蛋白质而言特别优选。
将对本发明中使用的人源化抗体进行编码的核酸插入至表达载体中，利用包含该核酸的表达载体向宿主细胞中导入该核酸，并对导入有核酸的宿主细胞进行培养，利用色谱法等纯化手段，能够从该培养上清得到本发明中使用的人源化抗体。通过对本方法中宿主细胞进行培养，从而使培养上清分泌出本发明中使用的人源化抗体。使用色谱法等纯化手段，能够由培养上清得到本发明中使用的人源化抗体或其抗原结合片段。作为色谱法的手段，可以使用亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法等本技术领域中已知的各种手段。使用在下述实施例中使用的蛋白A柱进行的亲和色谱法是特别优选的。
另外，上述人源化抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
(1-3)螯合剂
本发明中，螯合剂只要在结构中具有放射性核素进行配位的部位即可，没有特别限定，优选具有放射性核素发生配位的部位即螯合部和用于能够与抗体复合化的取代基。作为螯合部，可列举出例如CB-TE2A(1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(环己烷-反式-1,2-二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫代甲酰基]硫基]-戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTA-GA-NHS、DOTP(((1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四(亚甲基))四膦酸)、DOTPA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四丙酸)、1,4,7,10-四(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Lpy)、p-SCN-Bn-DOTA(S-2-(4-异硫氰酸根合苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)、MeO-DOTA-NCS(1-[(2-甲氧基-5-异硫氰酸根合苯基)-羧甲基]-4,7,10-三羧基-5-甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、EuK-106、DOTMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(乙酰氨基亚甲基膦酸)、D02P(四氮杂环十二烷二甲烷膦酸)、去铁胺(DFO)、DTPA(甘氨酸,N,N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]-)、DTPA-BMA(5,8-双(羧甲基)-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸)、EDTA(2,2’,2”,2’”-(乙烷-1,2-二基双(氮烷三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基三(亚甲基膦酸)、TETPA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N’”-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-四(羧甲基)-3,6,9,12-四氮杂十四烷二酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮杂环十八烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N’,N”,N’”-四(1,2-二氢-1-羟基-2-氧代吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮杂十四烷)、PEPA(1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-N,N’,N”,N’”,N””-五乙酸)、H4octapa(N,N’-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N’-二乙酸)、H2bispa2(6,6’-({9-羟基-1,5-双(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基}双(亚甲基))二吡啶甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲基氨基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-N,N’-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N”-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)二亚乙基三胺-N,N’,N”-三乙酸)、H6phospa(N,N’-(亚甲基膦酸酯)-N,N’-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二氨基乙烷)、HP-D03A(羟基丙基四氮杂环十二烷三乙酸)、卟啉、DO3A(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸三钠盐)、DO3A-NHS(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单-N-羟基琥珀酰亚胺酯)之类的物质，优选具有源自下述式(A)所示化合物的结构。
[化3]
(A)
(式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与前述抗体复合化的取代基，p为0以上且3以下的整数，R12为用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子，R12不是用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为用于与前述抗体复合化的取代基。)
作为式(A)所示的具体结构，可列举出来自以下的式(A-1)～(A-12)所示化合物的结构。
[化4]
[化5]
[化6]
螯合部与用于能够与抗体复合化的取代基的连接部位优选为酰胺键或硫脲键，从稳定性的观点出发，更优选为酰胺键。
酰胺键通过例如上述式(A-10)、(A-11)的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基或上述(A-12)的2,6-二氧代四氢-2H-吡喃基与伯胺的反应来形成。另外，硫脲键通过上述式(A-2)、(A-3)所示的化合物的异硫氰酸酯基与伯胺或马来酰亚胺基的反应来形成。
本发明的螯合复合物中，螯合剂只要相对于抗体1分子具备至少1分子以上即可，优选具备1分子以上且8分子以下。其中，从维持抗体自身的活性(抗原识别作用、中和作用、补体活化作用和/或调理素作用)的观点出发，优选向抗体的Fc区域(恒定区)位点特异性地导入螯合剂，在本发明中，螯合剂更优选相对于抗体1分子具备1分子或2分子。
本发明的螯合复合物中，螯合剂可以借助接头与抗体连接。作为接头，可列举出取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、聚乙二醇(PEG)基、肽、糖链、二硫醚基和它们的组合等。
螯合剂优选借助接头位点特异性地修饰抗体，更优选修饰Fc区域。在该情况下，接头可以使用包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的肽(以下也称为“抗体修饰肽”)并且通过用交联剂修饰的抗体修饰肽与抗体的交联反应而形成的接头。需要说明的是，在式(i)中，以氨基酸序列的纸面左侧表示N末端侧、氨基酸序列的纸面右侧表示C末端侧的形式进行说明。在螯合剂借助作为接头的抗体修饰肽而与抗体连接的情况下，螯合剂与抗体修饰肽发生连接的位置没有特别限定，例如可以直接或间接连接于抗体修饰肽的N末端或C末端，优选为N末端。另外，抗体修饰肽的C末端为了提高其稳定性等而可以受到酰胺化等的修饰。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，或者
一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1与Xaa3连接，
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用交联剂进行了修饰。
作为上述式(i)中的X可包含的氨基酸残基，可列举出例如来自甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等氨基酸的氨基酸残基，X可以为由同一种类的氨基酸构成的氨基酸残基，也可以为由彼此不同种类的氨基酸构成的氨基酸残基。
式(i)中的a、b、c和d只要是上述范围的数即可，没有特别限定，从肽与抗体的结合稳定性的观点出发，以a+b+c+d≤14为条件，a优选为1以上且3以下的整数，b优选为1以上且3以下的整数，c优选为3以上且5以下的整数，并且，d优选为1以上且3以下的整数。
Xaa1和Xaa3为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，该氨基酸彼此可以相同也可以不同。作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸，可列举出例如半胱氨酸、高半胱氨酸。这种氨基酸残基优选通过二硫醚键进行键合、或者经由下述式(4)所示的接头而键合有硫醚基。式(4)中，波浪线部分表示与硫醚基的键合部分。
[化7]
(4)
关于Xaa1和Xaa3，代替上述组合，可以是Xaa1和Xaa3之中的一者为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者为来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基。它们借助硫醚键而进行键合。卤代乙酰基的末端被碘等卤素取代，通过与另一个侧链中的硫醇基的反应而使卤素脱离，形成硫醚键。
式(i)所示的抗体修饰肽的具体氨基酸序列可列举出例如国际公开2016/186206号单行本、国际公开2017/217347号单行本和国际公开2018/230257号单行本中记载的肽，也可以使用它们。
这些之中，作为抗体修饰肽的氨基酸序列，优选具有下述序列(1)～(14)中的任一者，进一步优选具有下述序列(1)、(2)、(13)或(14)。在以下的氨基酸序列(1)～(14)中，(Xaa2)表示赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，(Xaa1)和(Xaa3)均表示高半胱氨酸残基。另外，在以下的氨基酸序列(1)～(14)中，除(Xaa1)、(Xaa2)和(Xaa3)之外的氨基酸用单文字简写来表述。
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(SEQ ID NO:9)
(2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:10)
(3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS(SEQ ID NO:11)
(4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:12)
(5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:13)
(6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:14)
(7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:15)
(8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:16)
(9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(SEQ ID NO:17)
(10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:18)
(11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:19)
(12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:20)
(13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:21)
(14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(SEQ ID NO:22)
(1-4A)复合体的制造方法
本发明的复合体的制造方法可通过使放射性核素与抗体发生复合化来制造。从提高复合体的形成效率的观点出发，此处使用的放射性核素优选以可电离的方式来使用，更优选以离子的方式来使用。只要放射性核素与抗体能够复合化，放射性核素和抗体的添加顺序就是任意的。例如，可以将在以水为主体的溶剂中溶解有放射性核素离子的溶液用作放射性核素。
在形成复合体后，可以使用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等，对所得复合体进行纯化。如此操作而得到的复合体是相对于1分子抗体在随机位置修饰有1分子或2分子以上放射性核素的复合体。
(1-4B)螯合复合体的制造方法
本发明的螯合复合体的制造方法中，可以由下述的两个工序进行制造：缀合工序，将螯合剂与抗体进行缀合；以及络合物形成工序，形成放射性核素与螯合剂的络合物。缀合工序可以在络合物形成工序之前，也可以在络合物形成工序之后。
在缀合工序中，可以使用各种抗体的化学修饰法。具体而言，可列举出(a)～(f)的方法。
(a)胺偶联法(使用具有用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基进行了活化的羧基的螯合剂或螯合物，对抗体的赖氨酸残基的氨基进行修饰的方法)；
(b)利用具有对SH基具有反应性的马来酰亚胺基的螯合剂或接头，对通过将位于抗体的关键部位的多肽链之间的二硫醚键(SS键)进行部分还原而产生的巯(SH)基进行修饰的方法；
(c)对于通过基于基因工程学的氨基酸突变而向抗体中新导入的半胱氨酸，修饰具有马来酰亚胺基的螯合剂或接头的方法；
(d)对于通过基于基因工程学的氨基酸突变而向抗体中新导入的叠氮化赖氨酸的叠氮基，利用点击反应来修饰具有炔烃(例如二苯并环辛炔：DBCO)的螯合剂或接头的方法；
(e)对于利用转谷氨酰胺酶向抗体的特定位置导入的谷氨酰胺，修饰具有赖氨酸的侧链的螯合剂或接头的方法；
(f)利用具有前述(i)所示的抗体修饰肽的螯合剂或接头，位点特异性地修饰抗体的Fc区域的方法。
在络合物形成工序中，使放射性核素螯合于螯合剂(形成络合物)。从提高络合物形成效率的观点出发，此处使用的放射性核素优选以能够电离的方式来使用，进一步优选以离子方式来使用。络合物形成工序只要能够与放射性核素形成络合物即可，向螯合剂中添加放射性核素的顺序没有限定。例如，可以将在以水为主体的溶剂中溶解有放射性核素离子的溶液用作放射性核素。
在形成络合物后，可以使用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等对所得络合物进行纯化。
本发明的螯合复合物的制造方法中，优选在络合物形成工序之后实施缀合工序。
在更优选的方式中，在络合物形成工序(A)中，在放射性核素与螯合剂之间形成络合物，所述螯合剂具有能够发生点击反应的第一原子团作为用于能够与抗体复合化的取代基。接着，在缀合工序(B)中，在肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物形成的螯合剂之间实施点击反应，得到本发明的螯合复合物，所述肽修饰抗体是使用具有前述(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头位点特异性地修饰Fc区域而得到的。
以下，针对工序(A)和(B)进行详述。
作为能够发生点击反应的第一原子团与第二原子团的组合，根据点击反应的种类来选择适当的组合，可列举出例如炔烃与叠氮的组合、1,2,4,5-四嗪与烯烃的组合等。这些原子团只要第一原子团具有上述原子团的组合之中的一者且第二原子团具有上述原子团的组合之中的与第一原子团不同的一种原子团即可。从兼顾螯合剂和抗体的稳定性和它们的结合效率的提高的观点出发，优选的是：螯合接头为炔烃且抗体修饰接头为叠氮，或者，螯合接头为1,2,4,5-四嗪且抗体修饰接头为烯烃。作为基于这种原子团的组合的点击反应的具体例，可列举出Huisgen环化加成反应或反电子需求型Diels-Alder反应等。
能够能够发生点击反应的原子团的组合的具体例，如下式所示那样，可列举出：包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团(式(1a))与包含叠氮基作为第二原子团的叠氮的原子团(式(2a))的组合、或者、第一原子团包含1,2,4,5-四嗪的原子团(式(1b))与包含反式环辛烯(TCO)作为第二原子团的烯烃的原子团(式(2b))的组合。优选为式(1a)与式(2a)的组合。
[化8]
(式中，R1表示与螯合剂的连接部位，R2表示与抗体中的抗体修饰肽的连接部位。)
[化9]
(式中，R3和R4之中的一者表示与螯合剂或抗体中的抗体修饰肽中任一者的连接部位，另一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基；R5表示根据R3或R4而与螯合剂或抗体中的抗体修饰肽中任一者的连接部位。)
使用上述式(1a)所示的包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团时，可列举出市售的各种DBCO试剂。具体而言，可以选择例如DBCO-C6-酸、二苄基环辛炔-胺、二苄基环辛炔马来酰亚胺、DBCO-PEG-酸、DBCO-PEG-NHS酯、DBCO-PEG-醇、DBCO-PEG-胺、DBCO-PEG-NH-Boc、羧基罗丹明-PEG-DBCO、磺基罗丹明-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-生物素、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-马来酰亚胺、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，优选使用二苄基环辛炔马来酰亚胺。
在工序(A)中，更优选使用具有下述式(ii)所示结构的螯合剂。
A-B-C…(ii)
式(ii)中，A为下述式(iia)所示的螯合部。
[化10]
(iia)
式(iia)中，Ra、Rb和Rc独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，p为0以上且3以下的整数，Rd或Re中的任一者为与B的结合部位(*)，另一者为氢原子或者包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，p为0以上且3以下的整数。
式(ii)中，B用下述式(iib)表示。
[化11]
(iib)
式(iib)中，La和Lb独立地是至少包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，t为0以上且30以下的整数，s为0或1，*为与A的结合部位，**为与C的结合部位。
式(ii)中，C为下述式(iic)所示的炔烃衍生物或式(iid)所示的四嗪衍生物中的任一者。
[化12]
(式(iic)中，X为CHRk-**或N-**，Y为CHRk或C＝O，Rk独立地为氢原子或者碳原子数1以上且5以下的烷基，在X为CHRk-**且Y为CHRk的情况下，Rk部分任选一同形成环烷基，Rf、Rg、Rh和Ri独立地为氢原子、卤素原子、碳原子数1以上且5以下的烷基，Rf与Rg任选一同形成烃环，或者，Rh与Ri任选一同形成烃环，**表示与B的结合部位，式(iid)中，**表示与B的结合部位，Rj表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基。)
作为工序(A)中使用的螯合剂，更优选为上述式(iia)中的Ra～Rd为-(CH2)pCOOH、p为1、Re为与B的结合部位的DOTA衍生物；或者，Ra～Rc为-(CH2)pCOOH、p为1、Rd为与B的结合部位、Re为氢原子的DO3A衍生物；或者DOTAGA衍生物中的任一者。
式(ii)中，在A为上述DOTA衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DOTA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位；或者，B更进一步优选为下述DOTA-PEGt-Tz衍生物，其中，La为包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iid)所示的四嗪衍生物。
式(ii)中，在A为上述DO3A衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DO3A-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
式(ii)中，在A为上述DOTAGA衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DOTAGA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
螯合剂与放射性核素的摩尔比率以螯合部/放射性核素计，下限优选为10/1以上，更优选为100/1以上，进一步优选为500/1以上，上限优选为10000/1以下，更优选为8000/1以下，进一步优选为7000/1以下，例如，优选为100/1以上且7000/1以下的范围，更优选为500/1以上且7000/1以下的范围。
络合物形成反应优选在溶剂中进行。作为溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES缓冲液)或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。
溶剂的液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点出发，在工序(A)开始时，下限为0.01mL以上、优选为0.1mL以上、更优选为1.0mL以上、进一步优选为10mL以上、更进一步优选为100mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1.0mL以下，例如为0.01mL以上且100mL以下的范围。
关于络合物形成反应的反应液中的螯合剂的浓度，从作为目标的螯合剂的收率的观点出发，在工序(A)开始时，下限各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更优选为1μmol/L以上，上限各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下、进一步优选为10μmol/L以下，可列举出例如1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
作为络合物形成反应的温度，例如可以为室温(25℃)，也可以为在加热条件下，从兼顾螯合剂的分解抑制和络合物的形成效率提高的观点出发，下限优选为20℃以上、更优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上、更进一步优选为37℃以上、特别优选为45℃以上，上限优选为150℃以下、更优选为120℃以下、进一步优选为100℃以下、更进一步优选为90℃以下，例如优选为30℃以上且100℃以下的范围，更优选为35℃以上且90℃以下的范围。
以上述反应温度为条件，反应时间的下限优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上、进一步优选为20分钟以上、更进一步优选为30分钟以上、特别优选为45分钟以上，上限优选为180分钟以下、更优选为150分钟以下、进一步优选为120分钟以下、更进一步优选为90分钟以下、特别优选为60分钟以下，例如，优选为10分钟以上且150分钟以下的范围，更优选为10分钟以上且60分钟以下的范围。
工序(B)中使用的抗体是使用具有前述(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头，位点特异性地修饰在上述“(1-2)抗体”一项中详述的人源化抗体的Fc区域(恒定区)而得到的肽修饰抗体。
抗体修饰肽可通过组合使用氨基酸(天然氨基酸和非天然氨基酸均可)，并供于例如液相合成法、固相合成法、自动肽合成法、基因重组法和噬菌体展示法等肽合成法来制造。在肽的合成中，根据需要可以进行所使用的氨基酸的官能团的保护。它们可按照例如国际公开2017/217347号单行本和国际公开2018/230257号单行本中记载的方法来进行。
抗体修饰接头可以为抗体修饰肽与下述式(S1)所示的接头结合而成的接头。
*-((L1)m-Z)k-L2-AG2…(S1)
(式中，*表示与肽的N末端或C末端的结合部位，
L1为聚乙二醇(PEG)接头部，
m为1以上且50以下的整数，
Z为将(L1)m与L2键合的第二接头部，
k为0或1，
L2为第二PEG接头部，
AG2为第二原子团。)
在前述式(S1)中，Z的结构只要是将(L1)m与L2彼此键合的接头结构即可，没有特别限定，可以包含例如由1个以上且5个以下的氨基酸残基构成的氨基酸序列。在该情况下，Z中包含的氨基酸序列优选包含半胱氨酸残基，更优选为借助通过半胱氨酸残基的硫醇基与马来酰亚胺基的键合而形成的硫醚基，与L2进行键合。
本发明中，构成L2的PEG接头部优选具有下述式(P2)所示的结构。式(P2)中，n为整数，优选为1以上且50以下，更优选为1以上且20以下，进一步优选为2以上且10以下，更进一步优选为2以上且6以下。
[化13]
(P2)
PEG接头部的结构的一端可以用来自市售的PEG化试剂的结构或者来自在PEG化时通常使用的试剂的结构进行修饰，没有特别限定，可例示出例如来自二甘醇酸或其衍生物、马来酰亚胺或其衍生物的结构。
向抗体修饰接头中导入前述第二原子团的方法可列举出下述方法：通过上述方法而得到具有期望的氨基酸序列的抗体修饰肽后，将该肽溶解于添加有溶解辅助剂和还原剂、以及根据需要的酸的溶液中，向该溶液中添加作为第二原子团的包含叠氮基或反式-环辛烯(TCO)的原子团的有机溶剂溶液，并在室温下进行搅拌来导入。
在导入包含叠氮基的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用市售的叠氮基导入试剂，并按照常规方法向肽的N末端或C末端直接导入叠氮基；或者，借助上述接头结构来导入包含叠氮基的原子团。作为所使用的叠氮基导入试剂，可列举出例如甲硅烷基叠氮化物、磷酸叠氮化物、烷基铵叠氮化物、无机叠氮化物、磺酰基叠氮化物或PEG叠氮化物等。
另外，在导入包含TCO的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用包含TCO的市售的点击化学用试剂，并按照常规方法，向肽的N末端或C末端直接导入TCO；或者，经由上述接头结构来导入包含TCO的原子团。
使抗体修饰肽与抗体结合而得到肽修饰抗体的方法可使用例如交联剂来进行。交联剂是指用于使抗体修饰肽与抗体借助共价键进行连接的化学物质，作为其例子，可列举出：双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)等有限包含2个以上琥珀酰亚胺基的交联剂；包含己二亚氨酸二甲酯等优选包含2个以上亚胺酸部分的化合物或其盐的交联剂；以及包含3,3’-二硫代双丙亚胺酸二甲酯、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸等具有二硫醚键的化合物或其盐的交联剂等。通过使用这种交联剂，从而能够在抗体修饰肽中的Xaa2的氨基酸残基与抗体之间发生交联反应。在使用例如本发明的人源化抗体作为抗体的情况下，抗体中的交联反应在Xaa2的氨基酸残基与本发明的人源化抗体中的基于Eu编号的Lys252残基之间位点特异性地发生。这些Lys残基存在于本发明的人源化抗体中的Fc区域。
抗体修饰肽与抗体的结合方法可通过使例如上述抗体修饰肽、抗体、交联剂和根据需要的催化剂在10℃以上且30℃以下的环境下分散在适当的缓冲液中来进行。反应时间可以设为10分钟以上且2小时左右以下。肽与抗体的反应时的摩尔比率以抗体/肽计，下限优选为1/5以上、更优选为1/3以上、进一步优选为1/1.5以上，上限优选为20/1以下、更优选为10/1以下、进一步优选为5/1以下、更进一步优选为1/1以下、特别优选为1/1.7以下，例如优选为1/5以上且20/1以下的范围，更优选为1/1.5以上且1/1.7以下。
历经上述工序而得到的肽修饰抗体是以任意比例含有相对于1分子抗体结合有1分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“一价抗体”)和相对于1分子抗体结合有2分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“二价抗体”)的混合物，可以将其直接供于后续工序，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、各种色谱等方法对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化后，仅将任意价数的抗体供于后续工序。经纯化的结果，在未修饰抗体与其它价数的抗体无法分离的情况下，可以以含有它们的混合物的形式供于之后的工序。
在对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化的情况下，可以利用上述的任意纯化方法进行分离纯化，优选使用填充有各种填充剂的柱，更优选使用填充有适于抗体等蛋白质的分离纯化的填充剂的柱。
作为适于抗体等蛋白质的分离纯化的填充剂，只要是与抗体特异性结合的免疫球蛋白结合性蛋白质固定于由水不溶性基材形成的载体而得到的填充剂即可，没有特别限定。作为免疫球蛋白结合性蛋白质，可列举出例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L等。这些免疫球蛋白结合性蛋白质可以为经基因操作的重组型，作为重组型的免疫球蛋白结合性蛋白质，可列举出基因改变型蛋白质A、基因改变型蛋白质G、或者蛋白质A的域与蛋白质G的域的融合型。本发明中，作为至少适于一价抗体与二价抗体的分离纯化的填充剂，更优选为蛋白质A，进一步优选为基因改变型蛋白质A。此处，蛋白质A和蛋白质G是指能够与作为抗体分子的IgG特异性结合的蛋白质分子，根据被分离的微生物来源的差异而分类为蛋白质A(金黄色葡萄球菌：Staphylococcus aureus)或蛋白质G(链球菌：Streptococcus属)。基因改变型蛋白质A是指对蛋白质A的IgG结合域(E、D、A、B和C域)中的任意域的氨基酸残基导入有至少1个氨基酸突变的蛋白质A，在本发明中，优选为使导入有至少1个氨基酸突变的域发生多聚化而得到的基因改变型蛋白质A，更优选为使蛋白质A的导入有至少1个氨基酸突变的A、B或C域发生多聚化而得到的蛋白质，更进一步优选为多聚化至二聚物以上且五聚物以下而得到的蛋白质。氨基酸突变可以来自基因转录翻译工序中的氨基酸序列或者编码氨基酸的碱基序列的替换、缺失、插入等任意突变。没有特别限定，作为一例，可列举出国际公开2003/080655号单行本、国际公开2011/118699号单行本中记载的基因改变型蛋白质A等。
作为对免疫球蛋白结合性蛋白质加以固定化的水不溶性基材，可列举出玻璃珠、硅胶等无机载体；交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子；包含结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类的有机载体；进而，通过它们的组合而得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。
作为填充上述基因改变型蛋白质A作为填充剂而得到的柱，以例如カネカ公司的KanCap(注册商标)系列(KANEKA KanCapA prepacked column)、GEヘルスケア公司的HiTrap(注册商标)系列(HiTrap Mabselect、HiTrap Mabselect SuRe、HiTrapMabselectXtra)、GEヘルスケア公司的HiScreen系列(HiScreen MabselectSuRe)或东曹公司的TOYOPEARL(注册商标)系列(TOYOPEARL AF-rProtein A-650F)等的形式上市销售。
以下，以对工序(B)中的点击反应所使用的肽修饰抗体进行分离纯化的情况为例进行说明。
肽修饰抗体历经抗体修饰工序和抗体纯化工序而供于工序(B)中的点击反应，所述抗体修饰工序利用具备抗体修饰肽的接头(抗体修饰接头)位点特异性地修饰抗体的Fc区域而得到修饰抗体，所述抗体纯化工序使用固定有上述免疫球蛋白结合性蛋白质的载体对修饰抗体进行纯化。另外，抗体纯化工序还包括：保持工序，将要被载体保持的修饰抗体保持于载体；清洗工序，对未被载体保持的修饰抗体进行清洗；以及洗脱工序，对在保持工序中被载体保持的修饰抗体进行洗脱。
更具体而言，在抗体修饰工序中，以包含未修饰有抗体修饰接头的未修饰抗体、一价抗体和二价抗体的混合物的形式获得修饰抗体，在抗体纯化工序中，利用未修饰抗体、一价抗体和二价抗体分别相对于免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的差异，分别洗脱包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物和包含相对较多的二价抗体的第二抗体组合物。即，在抗体纯化工序之中，在保持工序和清洗工序中，包含相对较多的与免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的程度低的肽修饰抗体(二价抗体)的第二抗体组合物发生洗脱，在抗体纯化工序之中，在洗脱工序中，包含相对较多的与免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的程度高的肽修饰抗体(未修饰抗体和一价抗体)的第一抗体组合物发生洗脱。此处，“包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体”是指：第一抗体组合物中包含的未修饰抗体与一价抗体的总量多于该抗体组合物中包含的二价抗体，意味着：相对于该抗体组合物中包含的未修饰抗体与修饰抗体的总量(100％)，未修饰抗体与一价抗体的总量优选为55％以上、63％以上、70％以上、80％以上或90％以上，“包含相对较多的二价抗体”是指：第二抗体组合物中包含的二价抗体的量多于该抗体组合物中包含的一价抗体，意味着：相对于该抗体组合物中包含的未修饰抗体与修饰抗体的总量(100％)，二价抗体的量优选为55％以上、63％以上、70％以上、80％以上或90％以上。
在保持工序中，将通过抗体修饰工序而得到的含有未修饰抗体、一价抗体和二价抗体的混合物的溶液添加至柱中，使要被载体保持的未修饰抗体和一价抗体保持于柱，使未被载体保持的二价抗体通过。此处，在保持工序中通过的溶液构成第二抗体组合物的一部分。为了使未修饰抗体和一价抗体易于保持于柱，另外，为了防止它们的蓄积或改性，优选将肽修饰抗体的混合溶液用适当的稀释溶剂稀释并添加至柱中。作为稀释溶剂，只要是肽修饰抗体发生溶解而不易在溶剂中发生蓄积或改性的溶剂即可，没有特别限定，可以使用水、生理盐水或乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(TRIS)缓冲液、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲液等缓冲液等，优选使用上述任意的缓冲液，更优选使用乙酸钠缓冲液。在稀释溶剂中使用缓冲液的情况下，作为缓冲剂的浓度下限，为10mmol/L以上、优选为15mmol/L以上、更优选为20mmol/L以上，作为上限，为1000mmol/L以下、优选为500mmol/L以下、更优选为100mmol/L以下。另外，从降低二价抗体、抗体修饰肽对于柱载体的非特异性结合的观点出发，洗脱溶剂可以含有氯化钠、氯化钾等添加剂。洗脱溶剂所含有的添加剂的浓度没有特别限定，可以使用例如0.15mol/L。
在清洗工序中，使用清洗溶剂将残留在柱内的修饰抗体从柱中洗脱。在上述保持工序中通过柱后的溶液和在清洗工序中从柱洗脱的溶液中包含相对较多的二价抗体，因此，可以将它们一并用作第二抗体组合物。
作为清洗溶剂，只要是肽修饰抗体发生溶解且不易在溶剂中发生蓄积或改性、具备适当的pH缓冲能力的缓冲液即可，没有特别限定，可以使用乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(TRIS)缓冲液、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲液等缓冲液等，优选使用上述任意的缓冲液，更优选使用乙酸钠缓冲液。关于清洗溶剂中使用的缓冲剂的浓度，作为下限，为20mmol/L以上、优选为30mmol/L以上，作为上限，为200mmol/L以下、优选为70mmol/L以下。另外，关于清洗溶剂的pH，作为下限，为4.0以上、优选为4.5以上、更优选为4.8以上，作为上限，为7.4以下、优选为6.0以下、更优选为5.2以下。进而，从降低二价抗体、抗体修饰肽对于柱载体的非特异性结合的观点出发，洗脱溶剂可以含有氯化钠、氯化钾等添加剂。洗脱溶剂所含有的添加剂的浓度没有特别限定，可以使用例如0.15mol/L。
在洗脱工序中，使用洗脱溶剂，将被载体保持的修饰抗体从柱中洗脱。即，使用洗脱溶剂，将包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物从柱中洗脱。
作为洗脱溶剂，可以使用乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、柠檬酸缓冲液等缓冲液等。另外，从降低抗体修饰接头、未修饰抗体和修饰抗体对于柱载体的非特异性结合的观点出发，洗脱溶剂可以含有氯化钠、氯化钾等添加剂。洗脱溶剂所含有的添加剂的浓度没有特别限定，可以使用例如0.15mol/L。
在洗脱溶剂包含缓冲剂的情况下，关于缓冲剂的浓度，作为下限，为20mmol/L以上、优选为30mmol/L以上，作为上限，为200mmol/L以下、优选为70mmol/L以下。另外，关于洗脱溶剂的pH，由于会减弱未修饰抗体和一价抗体与免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用，另外，从防止抗体的改性和蓄积的观点出发，作为下限，pH优选为3.0以上，作为上限，pH优选为4.2以下。
在抗体纯化工序中获取的第一抗体组合物或第二抗体组合物可以直接用于随后的工序(B)中的点击反应，也可以在调节所含有的肽修饰抗体的蛋白质浓度后，再用于工序(B)中的点击反应。
工序(B)中的点击反应是在螯合剂所具有的能够进行点击反应的第一原子团与肽修饰抗体所具有的能够进行点击反应的第二原子团之间实施的。通过该点击反应，形成将螯合剂与抗体连接的键合基团(能够与抗体复合化的取代基)。
只要肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物能够进行点击反应即可，对它们的添加顺序没有限定，例如，可以向收纳有溶剂的反应容器内添加该络合物和该肽修饰抗体中的一者，接着添加另一者并使其反应，也可以在将该螯合剂和该抗体中的一者分散于溶剂而得到的分散液中添加另一者并使其反应。或者，可以向收纳有溶剂的反应容器内同时添加它们并使其反应。
作为在工序(B)的点击反应中使用的溶剂，可以使用包括水在内的溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。在使用缓冲液的情况下，从兼顾络合物和抗体的稳定性以及它们的结合效率的观点来看，将25℃下的pH优选设为4.0以上且10.0以下、进一步优选设为5.5以上且8.5以下。
反应液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点来看，在工序(B)开始时，下限优选为0.001mL以上、更优选为0.01mL以上、进一步优选为0.1mL以上、更进一步优选为1mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1mL以下，例如优选为0.001mL以上且1000mL以下的范围、更优选为0.1mL以上且10mL以下的范围。
另外，关于螯合剂和抗体在反应液中的浓度，在工序(B)开始时，作为下限，各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更进一步优选为1.0μmol/L以上，作为上限，各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下，例如优选为0.1μmol/L以上且1000μmol/L以下的范围，从作为目标的螯合复合物的收量的观点出发，更优选为1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
从防止抗体的不希望的变性且提高反应效率的观点来看，关于工序(B)中的点击反应，反应温度的上限优选为50℃以下、更优选为40℃以下。另外，反应温度的下限只要是发生反应的温度即可，没有特别限定，优选为15℃以上。点击反应的反应时间以上述反应温度为条件，优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上，且优选为24小时以下、更优选为20小时以下，例如优选为5分钟以上且24小时以下的范围、更优选为10分钟以上且20小时以下的范围。
所得到的螯合复合物可以直接使用，或者，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等进行纯化。
通过工序(A)和(B)而制造的螯合复合物是与MUC5AC特异性结合的人源化抗体的特定部位(例如抗体的Fc区域的赖氨酸残基)用螯合剂特异性修饰而得到的复合物。该螯合复合物中，相对于1分子的该抗体，具备1分子或2分子的前述螯合剂。螯合剂经由接头位点特异性地修饰本发明的抗体的Fc区。该接头由与螯合剂连接的螯合接头、与该接头连接的第一原子团、能够与第一原子团进行点击反应的第二原子团、与第二原子团连接的抗体修饰接头(包含上述式(i)所示的抗体修饰肽)构成。因此，该接头具有来自第一原子团和第二原子团的化学结构。作为这种化学结构，可以考虑下述式(10a)或(10b)所示的含有三唑骨架的结构或下述式(10c)所示的含有哒嗪骨架的结构。由于式(10a)与式(10b)处于异构体的关系，因此，可以以任意的比例来包含。
[化14]
式(10a)和式(10b)中，R1A表示与螯合接头的结合部位，R2A表示与抗体修饰接头的结合部位。式(10c)中，R3A和R4A之中的一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示与螯合接头的结合部位，R5A表示与抗体修饰接头的结合部位。
(1-5)放射性药物
利用上述(1-4A)所示的方法而制造的复合体和利用上述(1-4B)所示的方法而制造的螯合复合体也可以将其以原有状态或者在将其纯化后，制备包含该复合体或该螯合复合体作为有效成分的放射性药物。放射性药物是指：包括本发明的复合体或本发明的螯合复合体、即、用放射性核素(放射β射线的核素)标记的抗MUC5AC人源化抗体或其衍生物在内，且呈现适合于向对象生物体内给药的形态的组合物。放射性药物可通过例如使利用上述方法而制造的本发明的复合体或本发明的螯合复合体溶解于以水为主体且与生物体大致等张的溶剂来制造。在该情况下，放射性药物优选为水溶液的形态，根据需要可以包含药学上可接受的其它成分。放射性药物通过口服或静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内等非口服地对生物体给药其有效量，而用于疾病的治疗、疾病的诊断或病灶的检测等。
此处，作为给药对象，为人或小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、绵羊、山羊、狗、猫、猪、牛或马等动物，没有特别限定。优选为人。
作为优选的对象疾病，可列举出癌症。利用本发明进行治疗、诊断的癌症可列举出胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌或子宫内膜癌，特别优选应用于胰腺癌。
作为利用本发明进行治疗、诊断的癌症的例子，也可列举出胆管癌。
另外，有多个报告称MUC5AC为CA19-9的抗原载体(PLοSONE(December2011,Volume6,Issue12,e29180,p1-10))。因此，作为本发明中要治疗的癌症，也可列举出过表达CA19-9的胆管癌、子宫癌、肺癌或食道癌，能够高效地进行治疗。
此处的“有效量”是指对于给药对象的治疗而言能够获得有效效果的量。应该对对象给药的有效量因对象种类、对象体重、给药剂型(片剂、注射剂等)和路径(口服给药、非口服给药等)和疾病(例如癌症)的严重程度等而异。医生、兽医可考虑这些因素来决定适当的有效量。
通过选择具有治疗效果的物质作为放射性核素，从而本发明的复合体或本发明的螯合复合体能够用于放射性核素内服疗法(RI内服疗法)。RI内服疗法是指：通过静脉注射、口服给药放射性药物，使该放射性药剂蓄积于癌原发性病灶、迁徙性病灶之类的病灶部位，利用从放射性药剂放射出的辐射线来破坏病灶部位的癌细胞的方法。因此，本发明的复合体或本发明的螯合复合体可优选地用于癌的RI内服疗法。在该情况下，该药物的给药量、用量根据放射性核素的种类、有效成分的有效性、给药的形态/路径、疾病(尤其是癌)的进展阶段、患者的体型/体重/年龄、并用的其它疾病的治疗药的种类、量来进行适当选择。
另外，关于该药物的给药量、用量，也可以使用将小鼠的给药量向人进行体表面积换算而得到的人体等效剂量(HED；Human Equivalent dose)。HED利用下述式来求出。
HED＝animal dose in MBq/kg×(animal weight in kg/human weight in kg)0.33
例如，若使用体重20g的小鼠的给药量来计算体重60kg的人的HED，则在放射性核素为碘-131的情况下，通常以每次100MBq/kg以下进行给药。即便是每次50MBq/kg以下的用量也能够发挥效果。例如，在放射性核素为钇-90的情况下，通常以每次50MBq/kg以下进行给药。即便是每次30kBq/kg以下的用量也能够发挥效果。例如，在放射性核素为镥-177的情况下，通常以每次50MBq/kg以下进行给药。即便是每次40MBq/kg以下的用量也能够发挥效果。这种给药量是本发明的一个实施方式的例示，本领域技术人员可以根据小鼠和人的体重，适当利用上述式进行换算。
另外，在放射性核素为碘-131的情况下，通过事先给药非放射性碘制剂(稳定碘剂)，从而能够降低对碘发生生理性蓄积的甲状腺造成的毒性。作为稳定碘剂，可以使用碘化钾、碘酸钾等。
另外，作为本发明的其它方式，可以准备以仅将前述复合体或螯合复合体中的放射性核素替换成从β射线放射核素放射出正电子、γ射线的放射性核素(68Ga、64Cu、86Y、89Zr、111In、123I、125I、Al18F)而得到的复合体或螯合复合体作为有效成分的放射性药物，并将其用于上述癌症的RI内服疗法中的癌症诊断。本发明的癌症的诊断用放射性药物可以用于进行癌症的RI内服疗法之前的诊断，也可以用于进行癌症的RI内服疗法之后的诊断。通过用于进行癌症的RI内服疗法之前的诊断，从而能够用于是否实施使用具备放射β射线的放射性核素的本发明的复合体或螯合复合体进行的癌症的RI内服疗法的治疗选择的判断。另外，通过用于进行癌症的RI内服疗法之后的诊断，从而能够用于使用具备放射β射线的放射性核素的本发明的复合体或螯合复合体进行的癌症的RI内服疗法是否具有效果的判定、给药量的增减等治疗计划的优化。
根据以上说明的本发明的实施方式，提供对于MUC5AC的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异的用放射性核素、具体用β射线释放核素标记的抗MUC5AC抗体、尤其是人源化抗体。
另外，根据本发明的实施方式，提供用于达成治疗诊断学的癌症诊断用和/或癌症治疗用的RI标记抗MUC5AC抗体。
本发明的上述实施方式包括以下的技术思想。
[1]复合体，其为放射性核素与抗体的复合体，前述放射性核素为放射β射线的核素，前述抗体为与粘蛋白亚型5AC(MUC5AC)特异性结合的人源化抗体(抗MUC5AC抗体)，且是具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体。
所述重链可变区由下述氨基酸序列构成：
(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)、与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(H02)、与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(H03)、与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；或者
(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(H04)、与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列，
所述轻链可变区由下述氨基酸序列构成：
(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(L01)、与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(L02)、与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)、与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；或者
(8)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(L04)、与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中欠缺、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列。
[2]根据上述[1]所述的复合体，其中，前述抗体为具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，
所述重链可变区由(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)、(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(H02)、(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(H03)或(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(H04)构成，
所述轻链可变区由(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(L01)、(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(L02)、(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)或(8)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(L04)构成。
[3]根据上述[1]或[2]所述的复合体，其中，前述抗体为具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，
所述重链可变区由(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)构成，
所述轻链可变区由(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)构成。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的复合体，其中，放射β射线的前述核素为碘-131、钇-90或镥-177。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的复合体，其中，前述复合体包含螯合有放射性核素的螯合剂，
前述放射性核素为放射β射线的金属核素。
[6]根据上述[5]所述的复合体，其中，前述放射β射线的金属核素为钇-90或镥-177。
[7]根据上述[5]或[6]所述的复合体，其中，相对于前述抗体1分子，具备1分子以上且8分子以下的前述螯合剂。
[8]根据上述[5]～[7]中任一项所述的复合体，其中，前述螯合剂借助接头位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域。
[9]根据上述[8]所述的复合体，其中，前述接头包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的抗体修饰肽，所述接头通过用交联剂修饰的前述肽与前述抗体的交联反应来形成。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
(式中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，并且，借助二硫醚键进行键合或者硫醚基借助接头进行键合；或者
一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，并且，借助硫醚键进行键合；
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用前述交联剂进行了修饰。)
[10]根据上述[9]所述的复合体，其中，前述抗体修饰肽中，前述式(i)中，Xaa2为赖氨酸残基。
[11]根据上述[9]或[10]所述的复合体，其中，前述抗体修饰肽包含由SEQ ID NO:10(其中，Xaa2为赖氨酸残基)所示的氨基酸序列构成的抗体修饰肽。
[12]根据上述[5]～[11]中任一项所述的复合体，其中，前述螯合剂具有来自下述式(A)所示的化合物或其盐的结构。
[化15]
(A)
(式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团；R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与前述抗体复合化的取代基；p为0以上且3以下的整数；R12为用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子；R12不是用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为用于与前述抗体复合化的取代基。)
[13]根据上述[5]～[12]中任一项所述的复合体，其中，前述螯合剂借助接头位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域，前述接头具有通过点击反应而形成的键合基团。
[14]根据上述[13]所述的复合体，其中，前述接头具有将前述螯合剂与通过前述点击反应而形成的键合基团连接的螯合接头、以及将前述抗体与通过前述点击反应而形成的键合基团连接的抗体修饰接头，通过前述点击反应而形成的前述键合基团具备下述式(10a)所示的含有三唑骨架的结构或含有哒嗪骨架的结构。
[化16]
(10a)
(式中，R1A表示与前述螯合接头的结合部位，R2A表示与前述抗体修饰接头的结合部位。)
[15]放射性药物，其含有上述[1]～[14]中任一项所述的复合体作为有效成分。
[16]根据上述[15]所述的放射性药物，其用于癌症的RI内服疗法。
[17]根据上述[16]所述的放射性药物，其中，前述放射性核素为碘-131，
所述放射性药物用于在前述RI内服疗法中以每次100MBq/kg以下的给药量对对象进行给药。
[18]根据上述[16]所述的放射性药物，其中，前述放射性核素为钇-90，
所述放射性药物用于在前述RI内服疗法中以每次50MBq/kg以下的给药量对对象进行给药。
[19]根据上述[16]所述的放射性药物，其中，前述放射性核素为镥-177，
所述放射性药物用于在前述RI内服疗法中以每次50MBq/kg以下的给药量对对象进行给药。
[20]RI内服疗法中的癌症的诊断用放射性药物，其含有放射性核素或螯合有放射性核素的螯合剂与抗体的复合体，前述抗体为与MUC5AC特异性结合的人源化抗体，
所述RI内服疗法中的癌症的诊断用放射性药物使用上述[16]～[19]中任一项所述的放射性药物。
[21]根据上述[1]～[4]中任一项所述的复合体的制造方法，其包括：将放射性核素与抗MUC5AC抗体进行复合化，生成前述放射性核素与前述抗MUC5AC抗体的复合体的复合化工序。
[22]根据上述[5]～[14]中任一项所述的复合体的制造方法，其包括：将螯合有放射性核素的螯合剂与抗MUC5AC抗体进行复合化，生成前述螯合剂与前述抗MUC5AC抗体的复合体的复合化工序。
[23]根据上述[22]所述的复合体的制造方法，其中，前述螯合剂连接于螯合接头，前述抗MUC5AC抗体利用具备抗体修饰肽的抗体修饰接头特异性地修饰Fc区域，通过在前述复合化工序中实施点击反应，从而将前述螯合接头与前述抗体修饰接头进行连接。
[24]修饰抗体，其利用具备抗体修饰肽的抗体修饰接头特异性地修饰抗体的Fc区域，前述抗体为上述[1]所述的与MUC5AC特异性结合的人源化抗体，
前述抗体修饰接头具有用于通过点击反应与螯合有放射β射线的核素的螯合剂所具备的螯合接头连接的原子团。
[25]修饰抗体的制造方法，其中，利用具备抗体修饰肽的抗体修饰接头，特异性地修饰抗体的Fc区域，所述制造方法包括如下工序：
抗体修饰工序，借助具备抗体修饰肽的接头，位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域，得到修饰抗体；以及
抗体纯化工序，使用固定有免疫球蛋白结合性蛋白质的载体，将前述抗体纯化，
前述抗体是与上述[1]所述的MUC5AC特异性结合的人源化抗体，
前述抗体修饰接头具有用于通过点击反应与螯合有放射β射线的核素的螯合剂所具备的螯合接头进行连接的原子团。
[26]根据上述[25]所述的修饰抗体的制造方法，其中，前述免疫球蛋白结合性蛋白质为蛋白质A或基因突变型蛋白质A。
[27]根据上述[25]或[26]所述的修饰抗体的制造方法，其中，使用填充有前述载体的柱来实施前述抗体纯化工序。
[28]根据上述[27]所述的修饰抗体的制造方法，其中，前述抗体纯化工序包括：保持工序，其使前述修饰抗体保持于前述载体；以及洗脱工序，将前述载体所保持的前述修饰抗体洗脱。
[29]根据上述[28]所述的修饰抗体的制造方法，其中，在前述抗体修饰工序中，以包含未修饰抗体、一价抗体和二价抗体的混合物的形式获得前述修饰抗体，所述未修饰抗体未修饰有前述抗体修饰接头，所述一价抗体相对于1分子前述抗体修饰有1分子前述抗体修饰接头，所述二价抗体相对于1分子前述抗体修饰有2分子前述抗体修饰接头，
前述抗体纯化工序中，包括下述工序：利用前述未修饰抗体、前述一价抗体和前述二价抗体各自相对于前述免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的差异，分别获得包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物以及包含相对较多的二价抗体的第二抗体组合物。
[30]复合体的制造方法，其包括：
修饰抗体制造工序，实施上述[25]～[29]中任一项所述的修饰抗体的制造方法，得到修饰抗体；以及
复合化工序，将前述修饰抗体与螯合有放射β射线的核素的螯合剂进行复合化，生成前述螯合剂与前述修饰抗体的复合体。
[31]根据上述[30]所述的复合体的制造方法，其中，在前述修饰抗体制造工序中，获得第一抗体组合物，所述第一抗体组合物中，与相对于1分子前述抗体修饰有2分子前述抗体修饰接头的二价抗体相比，未修饰有前述抗体修饰接头的未修饰抗体和相对于1分子前述抗体修饰有1分子前述抗体修饰接头的一价抗体的总比例多，
在前述复合化工序中，形成前述螯合剂与前述一价抗体的复合体。
[32]根据上述[31]所述的复合体的制造方法，其中，在前述修饰抗体制造工序中，获得第二抗体组合物，所述第二抗体组合物中，与未修饰有前述抗体修饰接头的未修饰抗体和相对于1分子前述抗体修饰有1分子前述抗体修饰接头的一价抗体的合计相比，相对于1分子前述抗体修饰有2分子前述抗体修饰接头的二价抗体的比例多，
在前述复合化工序中，形成前述螯合剂与前述二价抗体的复合体。
[33]根据上述[30]～[32]中任一项所述的复合体的制造方法，其中，前述螯合剂连接于螯合接头，通过在前述复合化工序中实施点击反应，从而将前述螯合接头与前述抗体修饰接头进行连接。
[34]试剂盒，其为用于制造放射性核素与抗体的复合体的试剂盒，包含(1)放射性核素和(2)抗MUC5AC抗体，前述复合体为上述[1]～[4]中任一项所述的复合体。
[35]试剂盒，其为用于制造螯合有放射性核素的螯合剂与抗体的复合体的试剂盒，包含(1)能够螯合放射性核素的螯合剂和(2)抗MUC5AC抗体，前述复合体为上述[5]～[13]中任一项所述的复合体。
[36]根据[34]或[35]所述的试剂盒，其还包含(1)能够发生点击反应的第一原子团和(2)能够发生点击反应的第二原子团。
[37]根据[35]或[36]所述的试剂盒，其还包含能够螯合于螯合剂的放射性核素。
根据上述[15]的放射性药物，由于含有具备与MUC5AC特异性结合的人源化抗体和放射β射线的核素的复合体作为有效成分，因此，通过用于癌症的RI内服疗法，从而相对于表达MUC5AC的肿瘤发生特异性蓄积，能够对肿瘤细胞照射β射线，能够得到更高的治疗效果。
根据上述[21]的复合体的制造方法，由于包括使放射性核素与抗MUC5AC抗体发生复合化的复合化工序，因此，能够通过更简便的操作有效地获得该复合体。
根据上述[22]的复合体的制造方法，由于包括使螯合有放射性核素的螯合剂与抗MUC5AC抗体发生复合化的复合化工序，因此，在对于抗体而言是更严苛的螯合物工序中不会施加抗MUC5AC抗体，能够防止抗体的改性，有效地获得该复合体。
根据上述[23]的复合体的制造方法，由于在复合化工序中包括点击反应，因此，在缓冲溶液中在常温这一极其温和的条件下能够发生复合化，不会使抗MUC5AC抗体改性，能够有效地获得该复合体。
根据上述[24]的修饰抗体，由于利用抗体修饰接头特异性地修饰抗MUC5AC抗体的Fc区域，因此，不会损害抗MUC5AC抗体的抗原结合能力，对于螯合有放射性核素的螯合剂所具备的螯合接头，能够将该修饰抗体用于点击反应。
根据上述[25]的修饰抗体的制造方法，由于具备抗体修饰工序和抗体纯化工序，所述抗体修饰工序借助具备抗体修饰肽的接头位点特异性地修饰抗MUC5AC抗体的Fc区域，得到修饰抗体，所述抗体纯化工序使用固定有免疫球蛋白结合性蛋白质的载体，将前述抗体进行纯化，因此，能够进一步提高该修饰抗体的纯度。
根据上述[31]或[32]的复合体的制造方法，由于使用一价抗体或二价抗体中的任一者的比例多于另一者的比例的抗体组合物来进行复合化工序，因此，能够根据目的来调节与抗MUC5AC抗体结合的螯合剂的数量，能够以更高纯度获得期望价数的复合体。
根据上述[34]的试剂盒，在必要的时机使放射性核素与抗体发生反应，能够在使用时制备[1]～[4]中任一项所述的复合体，不会损害放射性核素的半衰期和抗体活性这两者，能够进行有效的治疗。
根据上述[35]的试剂盒，使能够螯合放射性核素的螯合剂与抗体的复合体在必要的时机与放射性核素发生反应，能够在使用时制备[5]～[13]中任一项所述的复合体，不会损害放射性核素的半衰期和抗体活性这两者，能够进行有效的治疗。
根据上述[36]的试剂盒，由于分别具备包含能够螯合放射性核素的螯合剂和点击反应原子团的复合体以及包含抗体和点击反应原子团的复合体，因此，能够在必要的时机将放射性核素螯合于螯合剂，并使它们发生点击反应，在使用时制备[5]～[14]中任一项所述的复合体，不会损害放射性核素的半衰期和抗体活性这两者，能够进行有效的治疗。
以下，通过实施例等来详细说明本发明，但本发明不限定于它们。
实施例
制造例1：抗MUC5AC人源化抗体的制作
边考虑呈现适合于CHO细胞中的表达的密码子用法，边将添加有信号序列的各种可变区的氨基酸序列和各种恒定区的氨基酸序列转换成碱基序列。在信号序列的起始密码子部位添加科扎克序列，在恒定区的C末端侧添加终止密码子。进而，在科扎克序列的上游和终止密码子的下游添加限制酶位点，使得其能够导入至哺乳类细胞表达用质粒(pcDNA3.4)的表达用基因导入位点。这样设计的各DNA片段通过化学合成来制作。使用融合PCR将包含形成目标H链和目标L链那样的可变区的DNA片段与包含恒定区的DNA片段进行连接。
对制作的各种抗体基因进行限制处理后再进行纯化。同样地，哺乳类细胞瞬时表达用质粒(pcDNA3.4)也利用相同的限制酶进行处理后再进行纯化。将两种片段以适当的混合比混合并进行连接。将连接反应液与大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，进行转化。对生成的转化物进行菌落PCR、单菌落分离、来自小批量培养液的质粒提取、插入部分的碱基序列测序，选出所设计的抗体基因全长以所设计的序列朝着设想方向正确插入的质粒(大肠杆菌克隆)。针对选出的大肠杆菌克隆体，实施大批量培养，进行包括内毒素去除工序在内的质粒提取/纯化。针对纯化的质粒测定260nm的吸光度，计算浓度。
使用ExpiCHO System(Thermo Fisher Scientific公司制)，实施基于CHO细胞的瞬时表达。从所制作的各H链表达用质粒和各L链表达用质粒中，以呈现目标组合的方式选择1种H链、1种L链，利用脂质转染法进行转染，并进行培养、进料。在自转染起7天～13天后，回收培养液。将经离心分离和过滤器过滤的培养上清添加至ProteinA柱中，利用通常的亲和柱色谱(吸附后清洗、基于酸性缓冲液的洗脱、洗脱液的中和)对抗体进行纯化。针对纯化的抗体测定280nm的吸光度，计算浓度。
使用上述说明的方法，制作下述抗MUC5AC人源化抗体。以下，示出对重链可变区与轻链可变区的组合标注的抗体的编号。
抗体1：H01L03
抗体2：H01L04
抗体3：H02L04
抗体4：H04L04
此处，H01、H02和H04分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的重链可变区，L03和L04分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。以下的实施例中使用的抗体包括重链恒定区1(SEQ ID NO:25)与轻链恒定区1(SEQ ID NO:26)的组合以及上述抗体1～抗体4的重链可变区与轻链可变区的组合。
制造例2：基于肽接头的位点特异性抗体修饰
(1)抗体修饰工序
按照国际公开2017/217347号单行本中记载的方法来制造抗体修饰肽，得到下述式(P3)所示的包含17个氨基酸残基的肽。该肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的Xaa2为赖氨酸残基的序列相同，赖氨酸残基的侧链末端氨基用R1所示的结构修饰。另外，两个半胱氨酸残基彼此形成二硫醚键，肽的N末端经由具有二甘醇酸和8个PEG的接头结构而键合有乙基叠氮来作为原子团，所述原子团包含作为第二原子团的叠氮基。
[化17]
(式(P3)中，Gly表示甘氨酸，Pro表示脯氨酸，Asp表示天冬氨酸，Cys表示半胱氨酸，Ala表示丙氨酸，Tyr表示酪氨酸，His表示组氨酸，Lys表示赖氨酸，Glu表示谷氨酸，Leu表示亮氨酸，Val表示缬氨酸，Trp表示色氨酸，Thr表示苏氨酸，Phe表示苯丙氨酸。)
使将该肽和制造例1中制作的抗MUC5AC人源化抗体(抗体1)混合至乙酸钠缓冲液(pH6.0)而得到的混合液在室温下反应30分钟，得到包含肽修饰抗体的溶液。该肽修饰抗体利用上述肽位点特异性地修饰抗体的Fc区域。
(2)肽修饰抗体分离工序
将该肽修饰抗体用1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)稀释，添加至ProteinA柱(GEヘルスケア公司制、HiTrap MabSelect SuRe)中，流通含有0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.7)，回收修饰有2分子肽的肽修饰抗体(二价抗体)，以回收的级分中包含的二价抗体的浓度成为15mg/mL的方式调整浓度。其后，向ProteinA柱中流通含有0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH3.5)，回收修饰有1分子肽的肽修饰抗体(一价抗体)，以回收的级分中包含的一价抗体的浓度成为15mg/mL的方式调整浓度。
实施例1：90Y标记抗MUC5AC人源化抗体的制作
(1)抗体修饰工序
另行利用国际公开2017/217347号单行本中记载的方法来制造抗体修饰肽，得到下述式(P3)所示的包含17个氨基酸残基的肽。该肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的Xaa2为赖氨酸残基的序列相同，赖氨酸残基的侧链末端氨基用R1所示的结构修饰。另外，两个半胱氨酸残基彼此形成二硫醚键，肽的N末端经由具有二甘醇酸和8个PEG的接头结构而键合有乙基叠氮来作为原子团，所述原子团包含作为第二原子团的叠氮基。
[化18]
/>
使将该肽和制造例1中制作的抗MUC5AC人源化抗体(抗体1)混合至乙酸钠缓冲液(pH6.0)而得到的混合液在室温下反应60分钟，得到包含肽修饰抗体的溶液。该肽修饰抗体利用上述肽位点特异性地修饰抗体的Fc区域。
(2)肽修饰抗体分离工序
将该肽修饰抗体用20mmol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)稀释，添加至ProteinA柱(GEヘルスケア公司制、HiTrap MabSelect SuRe)中，流通含有0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.7)，回收修饰有2分子肽的肽修饰抗体。其后，流通含有0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH4.2)，向预先添加有1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)的容器中回收修饰有1分子肽的肽修饰抗体(一价抗体)。使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC903096)，将所回收的各级分缓冲液置换成含有0.1mol/L精氨酸的50mmol/L组氨酸缓冲液(pH6.1)。
(3)螯合修饰工序
将本实施例中使用的螯合部的结构示于以下的式(L1-5)。使该螯合部溶解于作为溶剂的含有0.1mol/L精氨酸的50mmol/L组氨酸缓冲液(pH6.1)，制成包含螯合部0.13mmol/L的分散液。
将该分散液与包含肽修饰抗体的溶液混合，在37℃下使其发生90分钟的点击反应，得到螯合修饰抗体。螯合部和肽修饰抗体的浓度分别为56μmol/L和83μmol/L，第一原子团(DBCO)与第二原子团(叠氮)的摩尔比分别为1:1.3。使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC903096)将螯合修饰抗体的溶液纯化，置换成含有0.1mol/L精氨酸的50mmol/L组氨酸缓冲液(pH6.1)。
[化19]
L1-5
(4)标记工序
使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC803008)，将历经上述各工序而得到的螯合修饰抗体溶液置换成156mmol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)，将浓度设为19.48mg/mL。使将该溶液0.2mL与含有90Y离子作为放射性金属源的溶液(0.04mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为8440MBq/mL、Eckert&Ziegler公司制)0.01mL混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到90Y标记抗MUC5AC人源化抗体溶液。螯合部与放射性金属离子的摩尔比率为螯合部:90Y离子＝28:1，反应液的加热温度设为37℃，加热时间设为30分钟。
使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC803008)，将所得90Y标记抗体的溶液纯化，并供于之后的实验。纯化后的90Y标记抗体的放射化学纯度为97.9％，放射化学收率为75.9％。此处，90Y标记抗体的放射化学纯度是利用薄层色谱进行分析时的与90Y标记抗体相当的峰的放射能计数相对于薄层板的总放射能计数的比例(％)，90Y标记抗体的放射化学收率是90Y标记抗体的放射能(无衰减校正)相对于标记反应开始时的放射能的比例(％)。
实施例2：131I标记抗MUC5AC人源化抗体的制作
使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC803008)，将制造例1中制作的抗MUC5AC人源化抗体置换成Dulbecco磷酸缓冲生理盐水，将浓度设为5.07mg/mL。向利用1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲涂覆的管(Thermo Fisher Scientific公司制、型号：28601)中添加Dulbecco磷酸缓冲生理盐水0.648mL和含有131I离子的溶液(碳酸钠缓冲液、放射能浓度为2400MBq/mL、Institute of Isotopes公司制)0.185mL。使向该管中添加抗体溶液0.092mL并混合而得到的反应液在室温下反应9分钟，得到131I标记抗MUC5AC人源化抗体溶液。
借助用含有0.1mol/L精氨酸的0.05mol/L组氨酸缓冲液(pH6.1)进行了平衡化的PD-10柱(GE Healthcare公司制、型号：17-0851-01)，将所得131I标记抗体的溶液纯化，并供于之后的实验。纯化后的131I标记抗体的放射化学纯度为98.5％，放射化学收率为86.5％。此处，131I标记抗体的放射化学纯度是利用薄层色谱进行分析时的与131I标记抗体相当的峰的放射能计数相对于薄层板的总放射能计数的比例(％)，131I标记抗体的放射化学收率是131I标记抗体的放射能(无衰减校正)相对于标记反应开始时的放射能的比例(％)。
实施例3：β核素标记抗MUC5AC人源化抗体相对于MUC5AC的结合性和特异性
按照实施例1来制造90Y标记抗MUC5AC人源化抗体。另外，按照实施例2来制造131I标记抗MUC5AC人源化抗体。使用这些β核素标记抗MUC5AC人源化抗体，利用体外ARG来评价各β核素标记抗体相对于MUC5AC的结合性和特异性。
使用クリオスタット(Leica公司制)，由将MUC5AC高表达肿瘤(SW1990移植肿瘤组织)或MUC5AC低表达肿瘤(MIA PaCa-2移植肿瘤组织)在液态氮中冻结得到的冻结块制作厚度7μm的切片，并用于体外ARG。
将至使用时为止在-80℃下保存的切片恢复至室温，使其干燥30分钟以上后，在磷酸缓冲生理盐水中浸渍30分钟，接着，在含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中浸渍30分钟，由此进行切片的亲水化。
针对亲水化的冻结切片，滴加将各β核素标记抗体用含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水稀释至在后述实施例4-1～4-5中对荷瘤小鼠给药时的100倍而得到的溶液约100μL，并静置30分钟。接着，分别在含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中浸渍10分钟，在磷酸缓冲生理盐水中浸渍5分钟，在磷酸缓冲生理盐水中浸渍5分钟，进行切片的清洗。将清洗后的切片风干，用成像板(BAS-SR2040、富士胶片和光纯药公司制)使其曝光约30分钟～2小时的时间，使用多功能荧光分析仪(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア公司制)，得到放射自显影图。
将结果的图像示于图1和图2。对MUC5AC高表达肿瘤切片和低表达肿瘤切片的各切片整体设定ROI，使用所算出的各肿瘤切片的ROI中的平均强度，计算其对于MUC5AC高表达肿瘤和低表达肿瘤的结合比。针对高表达和低表达，分别求出其相对于标准射线源的强度比后，通过高表达的值除以低表达的值来计算结合比。其结果，90Y标记抗MUC5AC人源化抗体对于MUC5AC高表达肿瘤的结合显示出对于低表达肿瘤的结合的约570倍的结合比。131I标记抗MUC5AC人源化抗体对于MUC5AC高表达肿瘤的结合显示出对于低表达肿瘤的结合的约140倍的结合比，得到不依赖于所施加的放射能量的结果。需要说明的是，关于对于MUC5AC低表达肿瘤的切片的结合，无法在与MUC5AC高表达肿瘤的切片相同的标度下确认到结合，为了确认结合，需要将对比度的上限从15000～20000左右降低至100～300左右。可确认：90Y标记抗MUC5AC人源化抗体和131I标记抗MUC5AC人源化抗体均保持了对于MUC5AC的结合性和特异性。
实施例4-1～4-5和比较例1：90Y标记抗MUC5AC人源化抗体和131I标记抗MUC5AC人源 化抗体的药效评价
实施对荷瘤小鼠给药90Y标记抗MUC5AC人源化抗体和131I标记抗MUC5AC人源化抗体并确认肿瘤生长抑制效果的研究。需要说明的是，90Y标记抗MUC5AC人源化抗体和131I标记抗MUC5AC人源化抗体分别按照实施例1和2进行制造。
从BALB/c-nu/nu小鼠(雄性、日本エスエルシー公司制)的侧腹～背部，在异氟烷麻醉下，以5×106个的细胞数皮下给药与人胰腺癌细胞株SW1990的悬浮液等量的基质胶(Matrigel)(Corning公司制)混合液。在移植SW19909天后的肿瘤尺寸约达到150-300mm3的时间点，从小鼠尾静脉给药各β核素标记抗体。将给药90Y标记或131I标记抗MUC5AC人源化抗体时的肿瘤体积和体重示于表1。另外，肿瘤的体积利用下述计算式进行计算。
肿瘤的体积＝((肿瘤的短径)2×肿瘤的长径)/2
在给药放射能为3.7MBq/只(实施例4-1)或7.4MBq/只(实施例4-2)的条件下，对荷瘤小鼠给药90Y标记抗MUC5AC人源化抗体，评价90Y标记抗MUC5AC人源化抗体的性能。在给药放射能为3.7MBq/只(实施例4-3)或7.4MBq/只(实施例4-4)或14.8MBq/只(实施例4-5)的条件下，对荷瘤小鼠给药131I标记抗MUC5AC人源化抗体，评价131I标记抗MUC5AC人源化抗体的性能。另外，设置在含有0.07％聚山梨坦80且含有100mmol/L精氨酸的50mmol/L组氨酸缓冲液(pH6.1)中仅包含抗MUC5AC人源化抗体的溶液的给药组(抗体对照组)(比较例1)。需要说明的是，各标记抗MUC5AC人源化抗体给药组以对荷瘤小鼠给药与抗体对照组相同的抗体量的方式调整放射能浓度。将各组设为6只，在给药后的7星期内实施一般状态的观察、体重和肿瘤体积的测定。
[表1]
肿瘤体积(mm3) 体重(g)
比较例1 271±83 21.2±1.1
实施例4-1 260±72 21.8±1.1
实施例4-2 248±65 21.6±1.0
实施例4-3 214±76 22.4±1.3
实施例4-4 198±56 22.5±1.3
实施例4-5 191±23 22.2±1.1
平均±标准偏差、n＝6
[评价1]肿瘤体积和重量的变化
将经时性的肿瘤体积的变化的确认结果示于图3。在给药后5星期内与抗体对照组加以对比的结果，在90Y标记抗体的3.7MBq给药组(实施例4-1)、7.4MBq给药组(实施例4-2)和131I标记抗体的3.7MBq给药组(实施例4-3)、7.4MBq给药组(实施例4-4)中，确认到肿瘤体积在统计学方面显著低，确认到通过给药β核素标记抗体来抑制肿瘤生长的效果。另外，在131I标记抗体的给药放射能14.8MBq组(实施例4-5)中，在给药后确认到显著的体重减少，在达到人道终点的时刻依次使其安乐死。
各β核素标记抗体给药组在观察期间的最终日实施剖检。抗体对照组在肿瘤的平均体积超过2000mm3的时刻实施剖检。131I标记抗体的给药放射能14.8MBq组在出现以与给药时的体重相比的比值计小于0.80的个体的时刻依次实施剖检。采取肿瘤并去除血液等液体贮留，实施肿瘤的实际组织的重量测定。将与肿瘤重量加以对比的结果示于表2。
[表2]
肿瘤重量(g)
比较例1 1.43±0.49※1
实施例4-1 1.38±0.66
实施例4-2 0.26±0.09
实施例4-3 0.73±0.39
实施例4-4 0.11±0.04
实施例4-5 0.15±0.03※2
平均±标准偏差、n＝6(131I标记抗体的给药放射能3.7MBq组、7.4MBq组、14.8MBq组分别为n＝5、n＝3、n＝5)
*1：比较例1在给药后经过4星期的时间点实施剖检，采取肿瘤。
*2：实施例4-5在给药后第13、21、23天分别各对2只实施剖检，采取肿瘤。
[评价2]体重变化
将经时性的体重变化的确认结果示于图4，并将与各给药放射能组中的体重相对比的最低值及其时间点示于表3。在各β核素标记抗体给药组中，给药后约10天内确认到给药放射能的用量依赖性的体重减少，但在除实施例4-5之外的组中，以与给药时的平均体重相比的比值计未低于0.85，未确认到达到人道终点的毒性。另外，在给药后第13天～第36天的期间内，体重恢复至给药前的体重以上。另一方面，在实施例4-5中，在给药后的10天之后也持续减少，出现多个以与给药时的体重相比的比值计低于0.80的个体，因此，判断为确认到达到人道终点的毒性，依次实施剖检。
[表3]
体重的相对比的最低值与其时间点
实施例4-1 0.93(8天)
实施例4-2 0.86(8天)
实施例4-3 0.94(9天)
实施例4-4 0.87(15天)
实施例4-5 0.78(20天)
[评价3]甲状腺毒性
使用在观察期间结束时采取的血浆样品来评价甲状腺毒性(使用甲状腺素(T4)(Mouse/Rat)ELISA Kit(BioVision公司制)来测定血浆中的甲状腺素)。需要说明的是，在实施例4-5中，使用在达到人道终点的时刻采取的血浆样品。
将甲状腺毒性的相关结果示于图5。在实施例4-3(n＝6)、实施例4-5(n＝5)中，与抗体对照组(n＝6)相比，确认到血浆中的甲状腺素浓度在统计学方面显著低。在实施例4-4(n＝3)中，确认到血浆中的甲状腺素浓度的减少倾向。根据上述结果启示出：因给药131I标记抗体而诱发甲状腺毒性。另一方面，在90Y标记抗体给药组(均为n＝6)中，未确认到在131I标记抗体给药组中确认到的血浆中的甲状腺素浓度降低，启示出由90Y标记抗体给药导致甲状腺毒性的可能性低。
[评价4]病理学的评价
在观察期间结束时采取甲状腺、大腿骨(包含大腿骨骨髓)。甲状腺一并采取包括咽喉～气管上部的甲状腺在内的部位。大腿骨采取左侧大腿骨。甲状腺用20％中性缓冲福尔马林固定1星期以上。大腿骨用鲍音液固定1星期以上，进行脱灰。未切出甲状腺，而是直接包埋。大腿骨以膝关节面进入的方式进行纵切并包埋。其后，按照常规方法进行薄切，制作苏木精-曙红染色标本，实施病理组织学评价。将结果示于图6和图7。
针对大腿骨，将各β核素标记抗体给药组与抗体对照组(比较例1)加以对比(图6)。在实施例4-3中确认到骨骺板下的松质骨的减少，其程度按照实施例4-4、实施例4-5的顺序变强。即，在131I标记抗体给药组中，确认到给药放射能依赖性的对骨造成的毒性。另一方面，在90Y标记抗体给药组(实施例4-1和4-2)和抗体对照组(比较例1)中，未确认到骨的变化。另外，在实施例4-4中，确认到轻微的骨髓造血细胞的减少，在实施例4-5中，骨髓造血细胞显著减少或消失。即，在131I标记抗体给药组中，确认到给药放射能依赖性的对骨髓造成的毒性。另一方面，在90Y标记抗体给药组(实施例4-1和4-2)和抗体对照组(比较例1)中，未确认到骨髓的变化。
针对甲状腺，将各β核素标记抗体给药组与抗体对照组(比较例1)加以对比(图7)。在实施例4-3中，确认到甲状腺滤泡的萎缩，但明显的炎症性细胞浸润、滤胞上皮坏死是随处可见的程度。在实施例4-4和实施例4-5中，以各种程度确认到甲状腺滤泡的显著萎缩、坏死/消失、甲状腺组织的纤维性置换、炎症性细胞浸润，关于其程度，实施例4-5更强。即，在131I标记抗体给药组中，确认到给药放射能依赖性的甲状腺毒性。另一方面，在90Y标记抗体给药组(实施例4-1和4-2)和抗体对照组(比较例1)中，未确认到甲状腺的变化。
实施例5：177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的制作
(1)螯合剂合成工序
本实施例中使用的螯合部的结构与上述式(L1-5)相同。使该螯合剂分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.45mmol/L的分散液。将该分散液0.004mL、溶解有0.225mmol/L的龙胆酸的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)0.004mL、含有177Lu离子作为放射性金属源的溶液(0.04mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为3.4GBq/mL、由POLATOM制制备、液体量为0.01mL、放射能量为3.73MBq)混合，在加热条件下使其反应，得到177Lu络合物溶液。螯合部与放射性金属离子的摩尔比率为螯合部:177Lu离子＝约350:1，反应液的加热温度设为70℃，加热时间设为5分钟。
与实施例1的放射性复合体的放射化学纯度测定同样地进行所得177Lu络合物的放射化学纯度。其结果，177Lu络合物的放射化学纯度为47.4％。将所得177Lu络合物溶液直接用于标记工序。
(2)标记工序
使历经上述工序(1)而得到的未纯化状态的177Lu络合物的溶液以及与实施例1同样操作而得到的包含抗MUC5AC人源化抗体的肽修饰抗体(一价抗体)的溶液在37℃下进行2小时的点击反应，得到177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体。177Lu络合物的量和肽修饰抗体(一价抗体)的量分别为1.8nmol和2.6nmol，DBCO基与叠氮基的摩尔比分别约为1:1.4。将未纯化时的177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的反应率(％)示于以下的表4。
另外，将与实施例1同样地使用超滤过滤器进行纯化后的177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的放射化学纯度(RCP)和放射化学收率(RCY)示于以下的表4。
与实施例1同样地实施177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的放射化学纯度和放射化学收率的测定方法。
[表4]
实施例6.制剂化工序
向实施例5中得到的177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体溶液33μL中添加用于调整放射能浓度的缓冲液(含有0.7质量％聚山梨坦80且含有100mmol/L精氨酸的50mmol/L组氨酸缓冲液、pH6.1)，进行稀释而制成37MBq/mL。
[评价5]稳定性评价
将实施例6中得到的177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体在室温下保存4星期，在各时间点(0天、1天、7天、14天、20天、27天)评价放射化学纯度。需要说明的是，自制造结束起的7天相当于177Lu的约1个半衰期，自制造结束起的14天相当于177Lu的约2个半衰期，自制造结束起的20天相当于177Lu的约3个半衰期，自制造结束起的27天相当于177Lu的约4个半衰期。
[评价5-1]
利用薄层色谱(TLC)对放射化学纯度进行分析。TLC的条件设为与实施例1中使用的条件相同。将结果示于表5。
[表5]
实施例7：177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体相对于MUC5AC的结合性和特异性的评价
与实施例3同样地评价177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体相对于MUC5AC的结合性和特异性。需要说明的是，按照实施例5来制造177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体。
将结果的图像和图示于图16和图17。利用与实施例3相同的方法计算MUC5AC高表达肿瘤与低表达肿瘤的结合比的结果，177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体对于MUC5AC高表达肿瘤的结合与其对于低表达肿瘤的结合相比，显示出约200倍的结合比，得到不依赖于所施加的放射能的结果。需要说明的是，在与高表达肿瘤的切片相同的标度下，无法确认到对于MUC5AC低表达肿瘤的切片的结合，为了确认结合，需要将对比度的上限从7000～10000左右降低至300左右。根据这些结果可确认：177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体保持了相对于MUC5AC的结合性和特异性。
实施例8-1～8-3和比较例2：177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的药效评价
实施对荷瘤小鼠给药177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体并确认肿瘤生长抑制效果的研究。需要说明的是，177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体按照实施例5进行制造。
荷瘤小鼠与实施例4-1～4-5同样地制作。在给药放射能为7.4MBq/只(实施例8-1)、11.1MBq/只(实施例8-2)或16.7MBq/只(实施例8-3)的条件下，对荷瘤小鼠给药177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体，评价177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的性能。另外，设置在含有0.07％聚山梨坦80且含有100mmol/L精氨酸的50mmol/L组氨酸缓冲液(pH6.1)中仅包含抗MUC5AC人源化抗体的溶液的给药组(抗体对照组)(比较例2)。需要说明的是，177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组以对荷瘤小鼠给药与抗体对照组相同的抗体量的方式调整放射能浓度。7.4MBq给药组(实施例8-1)设为5只，除此之外的组设为6只，与实施例4-1～4-5同样地，在给药后的7星期内实施一般状态的观察、体重和肿瘤体积的测定。将给药177Lu标记标记抗MUC5AC人源化抗体时的肿瘤体积和体重示于表6。
[表6]
肿瘤体积(mm3) 体重(g)
比较例2 188±24 21.3±1.1
实施例8-1 187±32 21.1±1.4
实施例8-2 196±43 21.1±1.2
实施例8-3 181±28 20.7±1.5
平均±标准偏差、n＝6(实施例8-1为n＝5)
[评价1]肿瘤体积和重量的变化
将经时性的肿瘤体积的变化的确认结果示于图18。在观察期间的最终日与抗体对照组加以对比的结果，在177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的给药组中，确认到全部组的肿瘤体积在统计学方面显著低，确认到通过给药177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体来抑制肿瘤生长的效果。在观察期间的最终日实施全部组的剖检，采取肿瘤并去除血液等液体贮留，测定肿瘤的实际组织的重量。将肿瘤重量的对比结果示于表7。在177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的给药组中，确认到全部组与抗体对照组相比肿瘤的实际组织的重量在统计学方面显著低，确认到通过给药177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体来抑制肿瘤生长的效果。另外，16.7MBq给药组(实施例8-3)之中的1个个体在给药后确认到显著的体重减少，因此，在给药后的第19天使其安乐死，并实施剖检。
[表7]
肿瘤重量(g)
比较例2 1.48±0.54
实施例8-1 0.62±0.19*
实施例8-2 0.31±0.06*
实施例8-3 0.18±0.05*
平均±标准偏差、n＝6(实施例8-1和8-3为n＝5)
*p＜0.05vs比较例2、实施基于Steel法的检验。
[评价2]体重变化
将经时性的体重变化的确认结果示于图19，并将与各给药放射能组中的给药时的体重相比的最低值及其时间点示于表8。在各177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组中，在给药后的约8天内确认到给药放射能的用量依赖性的体重减少，以其与各组的给药时的平均体重相比的比值计未低于0.85。因而，在作为人道终点的一个基准的7天内未确认到显示出25％以上的体重减少的毒性。
[表8]
[评价3]甲状腺毒性
使用在观察期间结束时或观察期间中途的安乐死时采取的血浆样品，评价甲状腺毒性。甲状腺毒性通过使用甲状腺素(T4)(Mouse/Rat)ELISA Kit(BioVision公司制)测定血浆中的甲状腺素来评价。将甲状腺毒性的相关结果示于图20。在177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组中，未确认到在实施例4-3～4-5的131I标记抗MUC5AC人源化抗体给药组中确认到的血浆中的甲状腺素浓度的降低，启示出由给药177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体导致的甲状腺毒性的可能性低。
[评价4]病理学的评价
在观察期间结束时或观察期间中途的安乐死时采取甲状腺、大腿骨(包含大腿骨骨髓)。与“实施例4-1～4-5、比较例1”同样地操作，实施病理组织学评价。将结果示于图21和图22。针对大腿骨，将各177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组与抗体对照组(比较例2)加以对比(图21)。在177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组(实施例8-1～8-3)和抗体对照组(比较例2)中，未确认到在实施例4-3～4-5的131I标记抗体给药组中确认到的给药放射能依赖性的对骨造成的毒性。在177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体的7.4MBq(实施例8-1)、11.1MBq(实施例8-2)给药组和抗体对照组(比较例2)中，未确认到骨髓的变化。在16.7MBq给药组(实施例8-3)中，在观察期间结束时进行剖检的5例之中的1例中，确认到轻微的骨髓造血细胞的减少。在观察期间中途使其安乐死的1例中，确认到骨髓造血细胞的显著减少。
关于甲状腺，将各177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组与抗体对照组加以对比(图22)。在177Lu标记抗MUC5AC人源化抗体给药组(实施例8-1～8-3)和抗体对照组(比较例2)中，未确认到在实施例4-3～4-5的131I标记抗MUC5AC人源化抗体给药组中确认到的给药放射能依赖性的甲状腺毒性。
实施例9：使用89Zr标记DOTAGA-DBCO进行的89Zr标记抗MUC5AC人源化抗体的制造 (HPLC纯化)
(1-1.螯合剂合成工序)
在本实施例中，使用与上述式(L1-5)所示的螯合部相同的螯合部。使该螯合部分散于DMSO溶液，制成包含螯合部2.0mmol/L的分散液。使将该分散液0.150mL、含有89Zr离子作为放射性金属源的溶液(0.1mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为1335MBq/mL、由日本メジフィジックス公司制制备、液体量为0.100mL)134MBq和含有300mmol/L龙胆酸的780mmol/L乙酸缓冲液0.050mL混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到89Zr络合物溶液。螯合部与放射性金属离子的摩尔比率为螯合部:89Zr离子＝约3333:1，反应液的加热温度设为70℃，加热时间设为60分钟。
利用下述方法来测定所得89Zr络合物的放射化学纯度。即，将89Zr络合物溶液的一部分用薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂：乙腈/水混合液(体积比为1:1))展开，其后，利用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star PS)进行测定。将在原点附近检测出的峰的放射能(计数)相对于检测出的总放射能(计数)的百分率设为89Zr络合物的放射化学纯度(％)。其结果，89Zr络合物的放射化学纯度为98％。
(1-2.89Zr络合物纯化工序)
使用高效液相色谱法(HPLC)来分取上述(1-1.螯合剂合成工序)中得到的89Zr络合物溶液，去除未反应的DOTAGA-DBCO。对所得分取液进行溶剂馏去，直至约30μL为止，并用于标记工序。89Zr络合物标记抗体的未反应物去除工序中的放射化学收率(HPLC回收率)的测定方法如下所示。即，将分取液的放射能相对于本工序开始时的投入放射能量的百分率设为未反应物去除工序中的HPLC回收率(％)。
HPLC条件如下所示，分取出保留时间为27分钟附近的级分。
<HPLC条件>
检测器：紫外吸光光度计(测定波长：220nm、254nm)/闪烁检测器柱：XBridgeC183.5μm、4.6x 100mm、Waters公司制
流量：每分钟0.5mL
面积测定范围：试样注入后45分钟
流动相A：10mmol/L组氨酸缓冲液、pH6.5
流动相B：液相色谱用乙腈
流动相C：乙腈/水混合液(1:1)
流动相的送液：如下那样地变更流动相A、流动相B和流动相C的混合比，控制浓度梯度。
[表9]
(2.标记工序)
将历经上述各工序而得到的89Zr络合物的溶液以及与制造例2同样操作而制造的包含肽修饰抗体(一价抗体；H01L03)的溶液混合，在37℃下使其进行1.5小时的点击反应，得到89Zr络合物标记抗体。包含89Zr标记络合物的螯合部和肽修饰抗体(一价抗体)的量分别为73pmol和50nmol，第一原子团(DBCO)与第二原子团(叠氮)的摩尔比分别约为1:685。
进而，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)，将在37℃下使其反应1.5小时而得到的89Zr络合物标记抗体的溶液纯化。纯化后的89Zr络合物标记抗体的放射化学纯度为95％，放射化学收率为50％。89Zr络合物标记抗体的放射化学纯度和放射化学收率的测定方法如下所示。即，利用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODELGITA Star PS)，对薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂为乙腈:0.1mmol/L EDTA溶液的混合液(体积比为1:1))进行测定，将在原点附近检测到的峰的放射能(计数)相对于检测到的总放射能(计数)的百分率设为放射化学纯度(％)。另外，将在超滤纯化后回收的放射能相对于在标记工序开始时添加的总放射能的百分率作为放射化学收率(％)。
实施例10：使用89Zr标记DOTAGA-DBCO而制作的89Zr标记抗MUC5AC人源化抗体的 PET-CT成像
使用89Zr标记DOTA-Bn-DBCO和DOTAGA-DBCO，按照实施例8来制造89Zr标记抗体，将其分别给药至荷瘤小鼠，使用PET-CT成像来实施评价。
从BALB/c-nu/nu小鼠(雄性、日本エスエルシー公司制)的侧腹～背部皮下给药0.7×107个人胰腺癌源且属于MUC5AC高表达肿瘤细胞株的SW1990。在移植后的肿瘤体积约达到150-300mm3的时刻，从小鼠尾静脉给药各种89Zr标记抗MUC5AC人源化抗体。需要说明的是，肿瘤的体积利用以下的计算式进行计算。
肿瘤的体积＝((肿瘤的短径)2×肿瘤的长径)/2
将给药的各种89Zr标记抗MUC5AC人源化抗体的放射化学纯度和动物信息示于表7。
[表10]
给药放射能量和动物信息(给药各种89Zr标记抗体时)
(平均±标准偏差、n＝4)
PET-CT成像(小动物用PET-CT装置：Si78、Bruker公司制)利用下表的条件来实施。拍摄PET和CT的时间点是给药后的12、48、84、168、252小时。图像重建中，利用MLEM法来实施PET，利用FBP法来实施CT。实施各时间点的肿瘤和心脏(血液)、肝脏的SUV(standardizeduptake value)的VOI分析，根据时间放射能曲线来比较SUV的推移。
[表11]
PET拍摄和重建条件
[表12]
CT拍摄条件
采集模式 静态
扫描模式 连续(7deg/s)
X射线源过滤器 AL-1.0mm
像素尺寸 50um
X射线管电流 771uA
X射线管电压 65kV
将实施给药各89Zr标记抗体后48小时的PET-CT拍摄而得到的结果示于图8。将实施各时间点的肿瘤和心脏(血液)、肝脏的VOI分析而得到的结果示于图9。并且，将各时间点的肿瘤肝脏比的结果示于图10。
在肿瘤中的蓄积的最大值均以SUV计为2.8以上，关于给药后84小时的肿瘤肝脏比的最大值，在使用89Zr标记DOTA-Bn-DBCO而制作的89Zr标记抗体中为3.6，在使用89Zr标记DOTAGA-DBCO而制作的89Zr标记抗体中为3.4。各值未确认到统计学方面的明显差异。确认到各种89Zr标记抗体在心脏(血液)中的蓄积会经时性减少，确认其在给药后252小时时几乎从血液中消失。并且，关于各种89Zr标记抗体之间的各时间点的在心脏(血液)中的蓄积，未确认到统计学方面的显著差异。同样地，确认到各种89Zr标记抗体在肝脏和肌肉内的蓄积也会经时性地减少，关于各种89Zr标记抗体之间的各时间点的在各组织中的蓄积，未确认到统计学方面的显著差异。
实施例11：使用In-111(111In)标记抗体进行的人源化抗体的筛选
实施例11-1：111In标记抗体的制备
为了找出肿瘤蓄积能力高且最大耐受量高的抗MUC5AC抗体，对各种抗体进行111In标记，对荷瘤小鼠进行给药，并进行SPECT-CT拍摄，根据所得图像来计算肿瘤和肝脏的累积放射能量和吸收剂量，并进行对比。
抗体使用4种制造例1中制作的抗MUC5AC人源化抗体和1种专利文献1中公开的抗MUC5AC嵌合抗体，进行111In标记。
专利文献1中公开的嵌合抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:23和24)如下所示。
针对具有下述式所示结构的标记前体与各种抗体的复合物进行111In标记。
[化20]
【重链可变区】
【轻链可变区】
[化21]
上述标记前体具有下述结构：作为螯合部的DOTA借助8个聚乙二醇而连接于抗体修饰肽(包含与SEQ ID NO:10的Xaa2为赖氨酸残基的序列具有相同序列的17个氨基酸残基的肽)的N末端，并且，借助该结构中的N-羟基琥珀酰亚胺酯基而连接于各种抗体中的Eu编号为第252号的赖氨酸残基。
使该标记前体溶解于450μg作为溶剂的100mmol/L的4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(pH5.5)。将该溶液与含有111In离子作为放射性金属源的溶液(氯化铟(111In)注射液、日本メジフィジックス公司制)(以放射能量计为10MBq)混合，在45℃下进行2小时的标记反应。
将各种111In标记抗体的放射化学的收率、放射化学的纯度、对动物给药的放射能量示于表13。此处提及的放射化学的收率是指111In标记抗体的放射能量相对于所使用的111In的放射能量。放射能测定使用放射性同位素剂量校准器(CAPINTEC公司制、型号：CRC-15R)。放射化学的纯度是指利用滤纸色谱进行分析时的与111In标记抗体相当的峰的放射能计数相对于滤纸的总放射能计数的比例(％)。滤纸色谱利用滤纸：ADVANTEC公司制、型号：No.590、展开溶剂：0.01％EDTA、50mM柠檬酸-柠檬酸钠水溶液进行展开，放射能计数的检测使用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star)。
[表13]
111In标记信息
(平均±标准偏差、n＝4)
实施例11-2：使用荷瘤小鼠进行的体内分布
(荷瘤小鼠的制作方法)
在BALB/c-nu/nu小鼠(雄性、日本エスエルシー公司制)的侧腹～背部，皮下给药0.7×107个人胰腺癌细胞株SW1990。
在移植SW199014天后的肿瘤大小约为150-300mm3的时刻，从小鼠尾静脉给药实施例10-1中制备的各种111In标记抗体。另外，肿瘤的体积利用以下的计算式来计算。
肿瘤的体积＝((肿瘤的短径)2×肿瘤的长径)/2
[表14]
动物信息(给药各111In标记抗体时)
(平均±标准偏差、n＝4)
(评价方法)
SPECT-CT造影(小动物用SPECT-CT装置：FX-3000、Trifoil公司制)利用下表的条件来实施。拍摄时间点为给药后的1、6、24、48、72、168小时后。关于图像重建，SPECT利用OSEM法来实施，CT利用FBP法来实施。实施各时间点的肿瘤和肝脏的VOI(volume ofinterest、三维ROI)分析。将每单位体积脏器的计数值校正为％ID/g，将物理半衰期从111In换算成225Ac，校正物理学半衰期的差异，进一步加上生物学半衰期而得到时间放射能曲线。根据该时间放射能曲线的积分值来计算累积放射能量，利用球体模型(OLINDA/EXMver2.0)来计算吸收剂量，利用各抗体对其进行比较研究。其中，针对H01L03，在给药后的168小时未确认到时间放射能曲线的减少，因此，未考虑生物学半衰期，仅加上物理半衰期。
[表15]
SPECT拍摄条件
同位素 铟-111介质+高能量
准直器 MMP952
旋转半径 50mm
放射限制 150sec
放射计数 16
旋转角度 90度
[表16]
CT拍摄条件
放射计数 207个视场
帧平均值 1帧
检测器bining 2×2
X射线管电流 270μA
X射线管电压 60kV
曝光时间 230ms
放大倍数 2.0
(结果)
将实施SPECT-CT拍摄的结果示于图11。将实施各时间点的肿瘤和肝脏的VOI分析的结果示于图12。将表示对给药后168小时后的SPECT-CT拍摄结束后的体内分布/排泄路径进行确认而得到的结果的图示于图13。
关于在肿瘤中的蓄积，使用人源化抗体(H01L03)时最高，另一方面，使用嵌合抗体时最低。关于在肝脏中的蓄积，使用嵌合抗体时最高，使用人源化抗体时，与嵌合抗体相比均低。使用人源化抗体(H01L03)时的排泄最慢，血液滞留性高。在使用任意抗体的情况下，在正常脏器中，均是在肝脏和脾脏中的蓄积高，接着，在肺和肾脏中的蓄积高。
关于将肝脏的阈值剂量设定为30Gy时的最大耐受量，在使用人源化抗体(H01L03)时为高达3.90MBq的值，另一方面，在使用嵌合抗体时为低至0.43MBq的值。最大耐受量(MBq)通过阈值剂量(Gy)/吸收剂量(Gy/MBq)进行计算。
实施例11-3：体外自动射线照相术
使用实施例11-1中制备的各种111In标记抗体，利用体外自动射线照相术(ARG)评价各种抗体对于MUC5AC的结合性和特异性，将由此得到的图像结果示于图14。另外，将对切片整体设定关注区域(ROI)而算出的ROI中的放射能密度(Bq/mm2)的数值的图示于图15。
使用クリオスタツト(Leica公司制)，由将MUC5AC高表达肿瘤(SW1990移植肿瘤组织)或MUC5AC低表达肿瘤(MIAPaCa2移植肿瘤组织)在液态氮中冻结得到的冻结块制作厚度10μm的切片，并用于体外ARG。
将至使用时为止在-80℃下保存的切片恢复至室温，使其干燥30分钟以上后，在磷酸缓冲生理盐水中浸渍30分钟，接着，在含有1体积％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中浸渍30分钟，由此进行切片的亲水化。
将亲水化的冻结切片在含有各种111In标记抗体5kBq/mL且含有1体积％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中分别浸渍30分钟。接着，按照含有1体积％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水的顺序，在各溶液中各浸渍5分钟来进行切片的清洗。将清洗后的切片风干，利用造影板(BAS-SR2040、富士胶片和光纯药公司制)使其曝光约15小时，使用多功能荧光分析仪(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア公司制)，得到放射自显影图。针对所得放射自显影图，使用多功能荧光分析仪附带的分析软件“Image QuantTL”，对切片整体设定关注区域(ROI)，计算ROI中的放射能密度(Bq/mm2)。
确认到111In标记的全部人源化抗体保持了对于MUC5AC的结合性和特异性(参照图15、MUC5AC高表达肿瘤的数据)。可确认：与嵌合抗体相比，各种人源化抗体的非特异性结合少(参照图15、MUC5AC低/未表达肿瘤的数据)。
根据实施例11-2、11-3的结果可以明确：人源化抗体与嵌合抗体相比，对于MUC5AC的特异性高，且具有在肿瘤中的高蓄积性和在肝脏等正常脏器中的低蓄积性，因此，提供与RI标记抗体的相关技术相比更优异的传递技术。
将本实施例的结果总结于下表。表中，关于SPECT的吸收剂量，肿瘤体积设为150mm3来进行计算。另外，关于肝脏的吸收剂量，根据本实施例中使用的小鼠肝脏重量的平均值(1.15±0.14g、n＝19)来进行计算。体内分布的数值用n＝4的平均±标准偏差来表示(其中，H02L04为n＝3)。
[表17]
以上，参照实施方式对本发明进行了说明，但本发明不受上述实施方式的限定。本发明的构成、详情可以在本发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
包括此处记载的专利和专利申请说明书在内的全部刊物中记载的内容通过援引至此而以与将其全部明确示出同等程度地组入至本说明书中。
产业利用性
本发明的RI标记的抗MUC5AC人源化抗体的特异性和其在肿瘤中的蓄积性优异，因此，在MUC5AC过表达的疾病、尤其是癌症的治疗和/或诊断中极其有用。
本申请基于在日本申请的特愿2021-072201(申请日：2021年4月21日)，将其内容全部援引至本说明书中。
序列表
<110> 日本医事物理股份有限公司
<120> 用放射β射线的核素标记的粘蛋白亚型5AC特异性人源化抗体
<130> 093250
<150> JP2021-072201
<151> 2021-04-21
<160> 26
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 1 (H01)
<400> 1
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 2 (H02)
<400> 2
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Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
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<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 3 (H03)
<400> 3
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 4 (H04)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人源化抗体轻链可变区 2 (L02)
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区 4 (L04)
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<400> 19
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗体结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 20
Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗体结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 21
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗体结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是高半胱氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是高半胱氨酸
<400> 22
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体重链可变区 7 (H07)
<400> 23
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Pro Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体轻链可变区 8 (L08)
<400> 24
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Tyr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定区
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链恒定区
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (16)

1.复合体，其为放射性核素与抗体的复合体，
所述放射性核素是放射β射线的核素，
所述抗体是与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体，并且，
所述人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区由下述氨基酸序列构成：
(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)、或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(H02)、或者与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(H03)、或者与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；或者
(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(H04)、或者与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，
所述轻链可变区由下述氨基酸序列构成：
(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(L01)、或者与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(L02)、或者与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)、或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；或者
(8)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(L04)、或者与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中，所述抗体为具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，
所述重链可变区由下述氨基酸序列构成：
(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)、
(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(H02)、
(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(H03)、或者
(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(H04)，
所述轻链可变区由下述氨基酸序列构成：
(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(L01)、
(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(L02)、
(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)、或者
(8)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(L04)。
3.根据权利要求1所述的复合体，其中，所述抗体为具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，
所述重链可变区由(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)构成，
所述轻链可变区由(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)构成。
4.根据权利要求1所述的复合体，其中，放射β射线的所述核素为碘-131、钇-90或镥-177。
5.根据权利要求1所述的复合体，其中，所述复合体包含螯合有放射性核素的螯合剂，
所述放射性核素为放射β射线的金属核素。
6.根据权利要求5所述的复合体，其中，所述放射β射线的金属核素为钇-90。
7.根据权利要求5所述的复合体，其中，所述放射β射线的金属核素为镥-177。
8.根据权利要求5所述的复合体，其中，相对于所述抗体1分子，具备1分子以上且8分子以下的所述螯合剂。
9.根据权利要求5所述的复合体，其中，所述螯合剂借助接头位点特异性地修饰所述抗体的Fc区域。
10.根据权利要求9所述的复合体，其中，所述接头包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的肽，所述接头通过用交联剂修饰的所述肽与所述抗体的交联反应来形成，
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，或者
一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1与Xaa3连接；
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用所述交联剂进行了修饰。
11.根据权利要求5所述的复合体，其中，所述螯合剂具有来自下述式(A)所示的化合物或其盐的结构，
[化1]
(A)
式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团；R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与所述抗体复合化的取代基；p为0以上且3以下的整数；R12为用于与所述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子；R12不是用于与所述抗体复合化的取代基时，R15为用于与所述抗体复合化的取代基。
12.放射性药物，其含有权利要求1～11中任一项所述的复合体作为有效成分。
13.根据权利要求12所述的放射性药物，其用于癌症的RI内服疗法。
14.根据权利要求13所述的放射性药物，其中，所述核素为碘-131，
所述放射性药物用于在所述RI内服疗法中以每次100MBq/kg以下的给药量对对象进行给药。
15.根据权利要求13所述的放射性药物，其中，所述核素为钇-90，
所述放射性药物用于在所述RI内服疗法中以每次50MBq/kg以下的给药量对对象进行给药。
16.根据权利要求13所述的放射性药物，其中，所述核素为镥-177，
所述放射性药物用于在所述RI内服疗法中以每次50MBq/kg以下的给药量对对象进行给药。
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