TW202308698A - 經放出β射線之核種標記之人源化抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明課題為提供一種經放射性核種標記之抗MUC5AC人源化抗體，其對於黏蛋白亞型5AC(MUC5AC)特異性與在腫瘤的聚積性優異。本發明提供一種複合體，其係放射性核種與抗體之複合體，並且前述放射性核種為放出β射線之核種，前述抗體為特異性地結合於黏蛋白亞型5AC之人源化抗體，且為具有由序列識別號1～4之任一者表示的胺基酸序列所形成的重鏈可變區及由序列識別號5～8之任一者表示的胺基酸序列所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。

Description

經放出β射線之核種標記之人源化抗體
本發明關於一種放射性核種或螯合放射性核種的螯合劑與黏蛋白亞型5AC特異性人源化抗體的複合體、包含其之放射性醫藥及其用途。
黏蛋白是從動物的上皮細胞等分泌出來的黏液的主成分，是大量包含分子量100萬～1000萬的糖的糖蛋白質。黏蛋白有上皮細胞等產生的分泌型黏蛋白，以及以結合於具有疏水性的膜貫通部位的細胞膜的狀態存在的膜結合型黏蛋白。黏蛋白的核心蛋白被總稱為MUC，已知編碼核心蛋白的基因至少有20種。其中一種的黏蛋白亞型5AC(MUC5AC)是屬於分泌型黏蛋白。
MUC5AC在正常組織會表現在胃或氣管，然而曾經有文獻報告出在胰臟癌的過度表現，其他還有文獻報告在甲狀腺癌、肝臟癌、大腸癌、胃癌、尿路上皮癌、乳癌、子宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、膽管癌也會過度表現。關於對於MUC5AC的抗體，已有文獻報告以從人類胰臟癌細胞株SW1990的xenograft純化收集到的胰臟癌黏蛋白分液作為抗原所製作出的小鼠抗體(非專利文獻1)、或以其為基礎所製作出的嵌合抗體(專利文獻1、2、非專利文獻2、3)、人源化抗體(專利文獻3、4)。
抗體，利用其所具有的對標的分子的特異性，可作為用來偵測標的分子的試藥、診斷藥，或用來治療疾病的醫藥品來使用。為了進一步提升偵測性能及治療效果，正在進行關於結合了放射性核種或藥劑的抗體的檢討。非專利文獻1報告了使用經放出β射線的核種 131I標記的小鼠抗體之胰臟癌模型小鼠的放射免疫治療。非專利文獻3報告了關於使用經放出γ射線的核種 111In標記的嵌合抗體之胰臟癌患者的SPECT造影。專利文獻3及4中有關於特定MUC5AC特異性人源化抗體的記載，還記載了可包含經 90Y或 111In等標記的抗體，然而在實施例中僅揭示了該MUC5AC特異性人源化抗體的ADCC(抗體依存性細胞障礙)活性。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 日本特開平7-203974號公報 [專利文獻2] 日本特開平11-5749號公報 [專利文獻3] 國際公開第2013/157102號 [專利文獻4] 國際公開第2013/157105號 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Japanese Journal of Cancer Research, 87, 977-984, 1996 [非專利文獻2] 日本臨牀64卷, 增刊號1, 2006, 274-278 [非專利文獻3] Japanese Journal of Cancer Research, 90, 1179-1186, 1999
本發明目的為提供一種經放射性核種標記的抗MUC5AC人源化抗體，其對於黏蛋白亞型5AC (MUC5AC)的特異性與在腫瘤的聚積性優異。
本發明人等鑑於上述課題進行鑽研檢討，結果成功製造出放出β射線的核種(β核種)與由特定胺基酸序列所構成的抗MUC5AC人源化抗體的複合體，並發現該複合體對於MUC5AC的特異性及在腫瘤的聚積性優異，確認其效果，而完成了本發明。
依據本發明，可提供一種經放出β射線之核種標記的抗MUC5AC人源化抗體，其對於MUC5AC的特異性與在腫瘤的聚積性優異，及提供該抗體的用途。
本說明書所使用的用語，只要沒有特別提及，可使用該技術領域通常使用的意思。
(1)複合體 本發明提供一種複合體(以下亦稱為本發明之複合體)，其係放射性核種與抗體的複合體，並且前述放射性核種為放出β射線之核種，前述抗體為特異性地結合於MUC5AC之人源化抗體。 另外，本發明另一個實施形態，提供一種複合體(以下亦稱為本發明之螯合複合體)，其係螯合放射性核種的螯合劑(以下亦稱為本發明之螯合劑)與抗體的複合體，並且前述放射性核種為放出β射線之核種，前述抗體為特異性地結合於MUC5AC之人源化抗體。
(1-1)放射性核種 本發明之複合體或螯合複合體中所含的放射性核種為放出β射線的核種。該核種只要是在放射性核種的衰變過程會放出β射線的核種即可，詳細而言，適合使用 67Cu(銅-67)、 131I(碘-131)、 89Sr(鍶-89)、 90Y(釔-90)、或 177Lu(鎦-177)等，較佳為 177Lu、 131I或 90Y，更佳為 177Lu或 90Y。 本發明之放出β射線的核種可藉由周知的方法來製造或取得。例如 90Y，可藉由使 90Sr(鍶-90)β衰變，產生子核種 90Y。 177Lu，可在原子爐中利用 176Lu(n,γ) 177Lu的中子捕捉反應來產生。 131I，可在原子爐中， 130Te(n,γ) 131Te經過中子捕捉反應產生 131Te，藉由β衰變可產生子核種 131I。另外，這些β核種還可由Eckert ＆ Ziegler公司、Thermo Fisher Scientific公司、Institute of Isotopes公司、POLATOM等在市面販售的製品來取得。以這樣的方式製造或取得的β核種，可因應必要實施化學處理，成為適合於抗體的結合的化學形態，可使用於形成抗體的複合體。
(1-2)抗體 本發明之複合體或螯合複合體中所含的抗體，是特異性地結合於MUC5AC的人源化抗體(以下亦稱為本發明所使用的人源化抗體)。該抗體是具有特異性地結合於MUC5AC的能力的人源化抗體，具有安定的物性且腫瘤聚積性優異。該抗體也能夠以其抗原結合片段的形式來使用，這樣的態樣也被包括在本發明。具體而言，包含後述特定重鏈可變區與輕鏈可變區，依照希望，具有適當的重鏈恆定區與輕鏈恆定區。在本說明書之中，「抗原結合片段」，意指由本發明所使用的人源化抗體的一部分所形成的抗體片段，且具有MUC5AC的結合能力。只要具有MUC5AC的結合能力，則構成抗原結合片段的多肽中所含的胺基酸的數目並未受到特別限定。
以下揭示作為本發明所使用的人源化抗體的重鏈可變區合適的胺基酸序列。重鏈可變區1(H01)、重鏈可變區2(H02)、重鏈可變區3(H03)及重鏈可變區4(H04)，分別相當於本說明書所附的序列表的序列識別號1～4。附加底線的部位為CDR部位。
Figure 02_image001
以下揭示作為本發明中人源化抗體的輕鏈可變區適合的胺基酸序列。輕鏈可變區1(L01)、輕鏈可變區2(L02)、輕鏈可變區3(L03)及輕鏈可變區4(L04)，分別相當於本說明書所附的序列表的序列識別號5～8。附加底線的部位為CDR部位。
Figure 02_image003
換言之，在本發明中，合適的人源化抗體的重鏈可變區是由序列識別號1至序列識別號4之任一者表示的胺基酸序列所形成，輕鏈可變區是由序列識別號5至序列識別號8之任一者表示的胺基酸序列所形成。亦即本發明所使用的人源化抗體，是由以上敘述的4個重鏈可變區(H01～H04)之任一者與4個輕鏈可變區(L01～L04)之任一者的組合所形成。
在本發明中適合的人源化抗體，為重鏈可變區為H01、H03或H04，且輕鏈可變區為L01～L04之任一者的人源化抗體。
在本發明中最適合的人源化抗體，為重鏈可變區為H01，且輕鏈可變區為L03的抗體。
在本發明中人源化抗體的重鏈可變區，並不受限於序列識別號1至序列識別號4表示的胺基酸序列所規定的重鏈可變區，還包括保持著機能的變異體。亦即，由與序列識別號1至序列識別號4表示的胺基酸序列有90%以上，宜為95%以上、96%以上或97%以上，更佳為98%以上，最佳為99%以上的序列相同性之胺基酸序列所形成的變異的重鏈可變區，只要與本發明之輕鏈可變區組合時具有MUC5AC的結合能力，則也可作為本發明所使用的人源化抗體的重鏈可變區使用。
在本說明書之中，胺基酸序列的相同性，是指作為對象的兩個蛋白質之間的胺基酸序列的相同性，是以 使用該技術領域之中周知的數學演算法所作出的胺基酸序列最適合的比對之中一致的胺基酸殘基的比例(%)來表示。胺基酸序列的相同性，可藉由視覺檢查及數學計算來決定，可使用業界人士周知的同源性搜尋程式(例如BLAST、FASTA)或序列整列程式(例如ClustalW))或遺傳資訊處理軟體(例如GENETYX[註冊商標])等來計算。本說明書中的胺基酸序列的相同性，具體而言，可使用DDBJ(DNA DataBank of Japan)網站所公開的系統解析程式ClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja)，初始設定的條件(Version2.1、Alignment type:slow、DNA Weight Matrix: Gonnet、GAP OPEN: 10、GAP EXTENSION: 0.1)來求得。
而且，由在序列識別號1至序列識別號4表示的胺基酸序列之中，10個以下，宜為8個以下，更佳為5個以下，最佳為三個以下(三個、兩個或一個)的胺基酸缺損、替換、或附加之胺基酸序列所形成的變異的重鏈可變區作為本發明所使用的人源化抗體的重鏈可變區，只要與本發明之輕鏈可變區組合時具有MUC5AC的結合能力，則也可作為本發明所使用的人源化抗體的重鏈可變區來使用。
本發明所使用的人源化抗體之輕鏈可變區，並不受由序列識別號5至序列識別號8表示的胺基酸序列所限定，還包括保持著機能的變異體。亦即，由在與序列識別號5至序列識別號8表示的胺基酸序列有90%以上，宜為95%以上、96%以上或97%以上，更佳為98%以上，最佳為99%以上的序列相同性之胺基酸序列所形成的變異的輕鏈可變區，只要與本發明之重鏈可變區組合時具有MUC5AC的結合能力，則也可作為本發明所使用的人源化抗體之輕鏈可變區來使用。
而且，由在序列識別號5至序列識別號8表示的胺基酸序列之中，10個以下，宜為8個以下，更佳為5個以下，最佳為三個以下(三個、兩個或一個)的胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列所形成的變異的輕鏈可變區作為本發明所使用的人源化抗體的輕鏈可變區，只要與本發明之重鏈可變區組合時具有MUC5AC的結合能力，則也可作為本發明所使用的人源化抗體之輕鏈可變區來使用。
本發明所使用的人源化抗體，可藉由本技術領域一般實施的方法或以其為準的方法來製造。具體而言，可依照以下的程序來進行。 本發明所使用的人源化抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區的胺基酸序列被揭示於序列識別號1至序列識別號8，因此根據這些胺基酸序列資訊，構築出編碼該抗體的核酸，並插入適當的表現載體。表現載體，除了包含編碼本發明所使用的人源化抗體的核酸之外，還可任意包含用來提高轉譯效率的科扎克序列、導入宿主時，促進本發明所使用的人源化抗體分泌至培養基中的訊息序列及啟動子序列等。本發明所可使用的載體，可由本技術領域一般使用的載體來選擇，以質體載體pcDNA3.4為佳。表現載體往宿主細胞的導入也並未受到特別限定，將基因導入細胞內的方法，可使用本技術領域過去以來使用的方法，例如磷酸鈣法、電穿孔法、脂質體轉染法、DEAE-聚葡萄糖法等業界人士周知的方法。如下述實施例所實行般，使用脂質體轉染法的導入方法為特別適合。另外，此目的所使用的宿主細胞，也可使用本技術領域過去以來使用的細胞。這樣的宿主細胞的例子，可列舉CHO細胞、293細胞、大腸菌、畢赤酵母、Sf9細胞等。另外，目前也有用來使目標蛋白質表現的表現系統的套組在市面上販售，下述實施例使用的ExpiCHO System(Thermo Fisher Scientific公司製)，由於能迅速且確實地表現目標蛋白質，故為特佳。
將編碼本發明所使用的人源化抗體的核酸插入表現載體，藉由包含該核酸的表現載體，將該核酸導入宿主細胞，培養導入了核酸的宿主細胞，由其培養上清液藉由層析等的純化手段可得到本發明所使用的人源化抗體。在本方法之中，藉由培養宿主細胞，可讓本發明所使用的人源化抗體分泌至培養上清液。由培養上清液，使用層析等的純化手段，可得到本發明所使用的人源化抗體或其抗原結合片段。層析的手段，可使用親和層析、離子交換層析、粒徑篩析層析等本技術領域周知的各種手段。以使用下述實施例所使用的蛋白質A管柱的親和層析為特佳。
另外，上述人源化抗體可為多株抗體或單株抗體。
(1-3螯合劑) 在本發明中，螯合劑只要是構造中具有放射性核種配位的部位，則並未受到特別限定，宜具有放射性核種配位部位的螯合部及可與抗體複合化的取代基。螯合部可列舉例如CB-TE2A(1,4,8,11-四氮雜雙環[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(反-1,2-環己烷二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷基硫代)側硫基甲基]硫代]-戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)、DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTA-GA-NHS、DOTP(((1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)肆(亞甲基))四膦酸)、DOTPA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四丙酸)、1,4,7,10-肆(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(L py)、p-SCN-Bn-DOTA(S-2-(4-異硫氰基苄基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷四乙酸)、MeO-DOTA-NCS (1-[(2-甲氧基-5-異硫氰基苯基)-羧甲基]-4,7,10-三羧甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)、EuK-106、DOTMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(亞甲基膦酸))、DOTA-4AMP (1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(乙醯胺基亞甲基膦酸)、D02P(四氮雜環十二烷二甲烷膦酸)、去鐵胺(DFO)、DTPA(N,N-雙[2-[雙(羧甲基)胺基]乙基]甘胺酸)、DTPA-BMA(5,8-雙(羧甲基)-11-[2-(甲胺基)-2-側氧乙基]-3-側氧-2,5,8,11-四氮雜十三烷-13-酸)、EDTA(2,2’,2”,2’”-(乙烷-1,2-二基雙(氮三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三基參(亞甲基膦酸)、TETPA(1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮雜環十四烷-N,N’,N”,N’”-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-肆(羧甲基)-3,6,9,12-四氮雜十四烷二酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮雜環十八烷-1,4,7,10,13, 16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N’,N”,N’”-四(1,2-二氫-1-羥基-2-側氧吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮雜十四烷)、PEPA (1,4,7,10,13-五氮雜環十五烷-N,N’,N”,N’”,N””-五乙酸)、H4octapa(N,N’-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-乙二胺-N,N’-二乙酸)、H2bispa2(6,6’-({9-羥基-1,5-雙(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮雜雙環[3.3.1]壬烷-3,7-二基}雙(亞甲基))二吡啶甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲胺基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧雜-7,16-二氮雜環十八烷-N,N’-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N”-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-二乙三胺-N,N’,N”-三乙酸)、H6phospa (N,N’-(亞甲基膦酸酯)-N,N’-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二胺基乙烷)、HP-D03A(羥丙基四氮雜環十二烷三乙酸)、卟啉、DO3A(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸三鈉鹽)、DO3A-NHS(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸單-N-羥基琥珀醯亞胺酯)，以具有來自由下述式(A)表示的化合物的構造為佳。
Figure 02_image005
(式(A)中，R 11、R 13及R 14各自獨立地為由 -(CH 2) pCOOH、-(CH 2) pC 5H 5N、-(CH 2) pPO 3H 2、 -(CH 2) pCONH 2、或-(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所形成的基團，R 12或R 15的一者為氫原子、羧基，或碳數2或3之羧烷基，另一者為用來與前述抗體複合化的取代基，p為0以上3以下的整數，在R 12為用來與前述抗體複合化的取代基時，R 15為氫原子，在R 12並非用來與前述抗體複合化的取代基時，R 15為用來與前述抗體複合化的取代基)。
由式(A)所表示的具體的構造，可列舉來自以下的式(A-1)～(A-12)表示的化合物的構造。
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
螯合部和用來與抗體複合化的取代基的連結部位，以醯胺鍵或硫脲鍵為佳，從安定性的觀點看來，以醯胺鍵為較佳。
醯胺鍵，例如可藉由上述式(A-10)或(A-11)之N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)基或上述(A-12)之2,6-二氧雜四氫-2H-吡喃基與一級胺的反應形成。另外，硫脲鍵是藉由上述式(A-2)、(A-3)表示的化合物的異硫氰酸酯基與一級胺或馬來醯亞胺基的反應形成。
在本發明之螯合複合體之中，只要相對於抗體一分子，具備螯合劑至少一分子以上即可，以具備一分子以上8分子以下為佳。但是，從維持抗體本身的活性(抗原辨識作用、中和作用、補體活性化作用及/或調理素作用)的觀點看來，以在抗體的Fc區(恆定區)部位特異性地導入螯合劑為佳，在本發明中，以相對於抗體一分子，具備螯合劑一分子或兩分子為較佳。
在本發明之螯合複合體之中，螯合劑可透過連接子與抗體連接。連接子，可列舉經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、聚乙二醇(PEG)基、胜肽、糖鏈、雙硫基及其組合等。 理想的情況，螯合劑會透過連接子部位特異性地修飾抗體，較佳為修飾Fc區。此情況下，連接子可使用由下述式(i)表示之包含由13個以上17個以下的胺基酸殘基所形成的胜肽(以下亦稱為「抗體修飾胜肽」)，且藉由經交聯劑修飾的抗體修飾胜肽與抗體的交聯反應所形成的連接子。此外，在式(i)之中，是以紙面左側代表胺基酸序列的N末端側，紙面右側代表胺基酸序列的C末端側來作說明。在螯合劑透過作為連接子的抗體修飾胜肽與抗體連接的情況，螯合劑與抗體修飾胜肽連結位置並無特別限定，例如可直接或間接地連結於抗體修飾胜肽的N末端或C末端，宜為N末端。另外，抗體修飾胜肽的C末端，為了提升其安定性的等，亦可接受醯胺化等的修飾。
Figure 02_image013
式(i)中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續的a個X、連續的b個X、連續的c個X及連續的d個X， X為側鏈不具有硫醇基及鹵乙醯基之任一者之胺基酸殘基， a、b、c及d各自獨立地為1以上5以下的整數，且滿足a+b+c+d≦14， Xaa1及Xaa3各自獨立地表示來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基， 或一者表示來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基，另一者表示來自側鏈具有鹵乙醯基的胺基酸之胺基酸殘基，且Xaa1與Xaa3連結， Xaa2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基栓酸、或二胺基丙酸，且經交聯劑修飾。
上述式(i)中X所可包含的胺基酸殘基，可列舉例如來自甘胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、天門冬醯胺、天門冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸等的胺基酸的胺基酸殘基，X可為由相同種類的胺基酸所形成的胺基酸殘基，或分別由不同種類的胺基酸所形成的胺基酸殘基。
式(i)中的a、b、c及d，只要是在上述範圍的數目，則並無特別限制，從胜肽與抗體的結合安定性的觀點看來，以a+b+c+d≦14為條件，a宜為1以上3以下的整數、b宜為1以上3以下的整數、c宜為3以上5以下的整數及d宜為1以上3以下的整數。
Xaa1及Xaa3為來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基，該胺基酸分別可相同或相異。側鏈具有硫醇基的胺基酸，可列舉例如半胱胺酸、同半胱胺酸。這樣的胺基酸殘基可藉由雙硫鍵來結合，或硫醚基透過由以下的式(4)所表示的連接子來結合為佳。式(4)中，波浪線部分表示硫醚基的結合部分。
Figure 02_image015
Xaa1及Xaa3可將上述組合改為Xaa1及Xaa3之中一者為來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基，另一者為來自側鏈具有鹵乙醯基的胺基酸之胺基酸殘基。其透過硫醚鍵來結合。鹵乙醯基，其末端經碘等的鹵素取代，藉由與另一個側鏈中的硫醇基反應，使鹵素脫離，會形成硫醚鍵。
由式(i)表示的抗體修飾胜肽，具體的胺基酸序列，可列舉例如國際公開2016/186206號小冊子、國際公開2017/217347號小冊子及國際公開2018/230257號小冊子所記載的胜肽，亦可使用這些胜肽。
這些之中，抗體修飾胜肽的胺基酸序列，以具有以下的序列(1)～(14)之任一者為佳，具有以下的序列(1)、(2)、(13)或(14)為更佳。以下的胺基酸序列(1)～(14)之中，(Xaa2)表示離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基栓酸或二胺基丙酸，(Xaa1)及(Xaa3)皆表示同半胱胺酸殘基。另外，以下的胺基酸序列(1)～(14)之中，(Xaa1)、(Xaa2)及(Xaa3)以外的胺基酸是以一個字母的簡寫來表記。
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT (序列識別號9) (2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH (序列識別號10) (3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS (序列識別號11) (4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH (序列識別號12) (5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH (序列識別號13) (6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH (序列識別號14) (7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH (序列識別號15) (8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH (序列識別號16) (9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH (序列識別號17) (10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY (序列識別號18) (11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY (序列識別號19) (12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY (序列識別號20) (13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH (序列識別號21) (14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H (序列識別號22)
(1-4A)複合體的製造方法 本發明之複合體的製造方法，可藉由使放射性核種與抗體複合化來製造。此處使用的放射性核種，從提高複合體的形成效率的觀點看來，以使用可電離的態樣為佳，使用離子的態樣為更佳。只要放射性核種與抗體可複合化，則不論放射性核種與抗體的添加順序。例如可使用放射性核種離子溶解在以水為主體的溶劑中而成的溶液作為放射性核種。 複合體形成後，可使用過濾器、濾膜、填充各種填充劑的管柱、層析等來純化所得到的複合體。以這樣的方式得到的複合體，是抗體一分子在隨機的位置上被放射性核種一分子或兩分子以上修飾的複合體。
(1-4B)螯合複合體的製造方法 本發明之螯合複合體的製造方法，可由將螯合劑與抗體共軛之共軛步驟，以及形成放射性核種與螯合劑的錯合物之錯合物形成步驟的兩個步驟來製造。共軛步驟，可在錯合物形成步驟之前，或可在錯合物形成步驟之後。
在共軛步驟之中，可使用各種抗體的化學修飾法。具體而言，可列舉(a)～(f)的方法。 (a)胺偶合法(使用具有經N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)基活性化的羧基的螯合劑或螯合物來修飾抗體的離胺酸殘基的胺基的方法) (b)使在抗體的鉸鏈部位的多肽鏈間的雙硫鍵(SS鍵)部分還原，對於所產生的巰基(SH)，以具有對SH基有反應性的馬來醯亞胺基的螯合劑或連接子來修飾的方法 (c)利用基因工程產生胺基酸變異，對於新導入到抗體中的半胱胺酸以具有馬來醯亞胺基的螯合劑或連接子來修飾的方法 (d)利用基因工程產生胺基酸變異，對於新導入到抗體中的疊氮基化離胺酸的疊氮基，利用點擊反應，以具有炔(例如二苄基環辛炔(DBCO))的螯合劑或連接子來修飾的方法 (e)利用轉麩醯胺酸酶，在抗體的特定位置導入麩醯胺酸，並以具有離胺酸側鏈的螯合劑或連接子來修飾的方法 (f)以具有由前述(i)表示的抗體修飾胜肽的螯合劑或連接子部位特異性地修飾抗體的Fc區的方法
在錯合物形成步驟中，使放射性核種螯合於螯合劑(錯合物形成)。此處使用的放射性核種，從提高錯合物形成效率的觀點看來，以可電離的態樣來使用的為佳，以離子的態樣來使用為更佳。錯合物形成步驟，只要可形成放射性核種的錯合物，則不論放射性核種添加至螯合劑的添加順序。例如可使用放射性核種離子溶解在以水為主體的溶劑而成的溶液作為放射性核種。 錯合物形成後，可使用過濾器、濾膜、填充各種填充劑的管柱、層析等來純化所得到的錯合物。
本發明之螯合複合體的製造方法，以在錯合物形成步驟之後實行共軛步驟為佳。 在較合適的態樣之中，在錯合物形成步驟(A)中，讓放射性核種與具有可發生點擊反應的第1原子團作為用來與抗體複合化的取代基的螯合劑形成錯合物。接下來，在共軛步驟(B)中，讓使用由前述(i)表示的抗體修飾胜肽與具有可發生點擊反應的第2原子團的抗體修飾連接子部位特異性地修飾Fc區的胜肽修飾抗體與步驟(A)所得到的形成錯合物的螯合劑之間進行點擊反應，而得到本發明之螯合複合體。 以下針對步驟(A)及(B)詳細敘述。
可發生點擊反應的第1原子團與第2原子團的組合，可因應點擊反應的種類選擇適當的組合，可列舉例如炔與疊氮化物的組合、1,2,4,5-四嗪與烯的組合等。這些原子團，只要第1原子團具有上述原子團的組合的中一種，第2原子團具有上述原子團的組合之中與第1原子團不同的一種的原子團即可。從兼顧螯合劑及抗體的安定性與提升其結合效率的觀點看來，以螯合連接子為炔且抗體修飾連接子為疊氮化物，或螯合連接子為1,2,4,5-四嗪且抗體修飾連接子為烯的組合為佳。利用這樣的原子團的組合進行的點擊反應的具體例子，可列舉Huisgen環加成反應、或逆電子需求型Diels-Alder反應等。
可發生點擊反應的原子團的組合的具體例子，如以下的式所表示般，可列舉含有二苄基環辛炔(DBCO)作為第1原子團炔的原子團(式(1a))與含有疊氮基作為第2原子團疊氮化物的原子團(式(2a))的組合，或含有1,2,4,5-四嗪作為第1原子團的原子團(式(1b))與含有反環辛烯(TCO)作為第2原子團烯的原子團(式(2b))的組合。宜為式(1a)與式(2a)的組合。
Figure 02_image017
(式中，R 1表示與螯合劑的連結部位，R 2表示與抗體中的抗體修飾胜肽的連結部位)。
Figure 02_image019
(式中，R 3及R 4之中，一者表示與螯合劑或抗體中的抗體修飾胜肽之任一者的連結部位，另一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，R 5對應於R 3或R 4表示與螯合劑或抗體中的抗體修飾胜肽之任一者的連結部位)。
在第1原子團炔使用包含上述式(1a)表示的二苄基環辛炔(DBCO)的原子團的情況，可列舉市售的各種DBCO試藥。具體而言，可選擇例如DBCO-C6-酸、二苄基環辛炔胺、二苄基環辛炔馬來醯亞胺、DBCO-PEG酸、DBCO-PEG-NHS酯、DBCO-PEG-醇、DBCO-PEG-胺、DBCO-PEG-NH-Boc、羧基羅丹明-PEG-DBCO、磺醯羅丹明-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-生物素、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-馬來醯亞胺、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，宜使用二苄基環辛炔馬來醯亞胺。
在步驟(A)中，較佳為使用具有由以下的式(ii)表示的構造的螯合劑。
Figure 02_image021
式(ii)中，A為由以下的式(iia)表示的螯合部。
Figure 02_image023
式(iia)中，Ra、Rb及Rc獨立地為由 -(CH 2) pCOOH、-(CH 2) pC 5H 5N、-(CH 2) pPO 3H 2、 -(CH 2) pCONH 2、或-(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所形成的基團，p為0以上3以下的整數，Rd或Re之任一者為B的鍵結部位(＊)，另一者為氫原子，或由-(CH 2) pCOOH、 -(CH 2) pC 5H 5N、-(CH 2)pPO 3H 2、-(CH 2) pCONH 2、或 -(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所形成的基團，p為0以上3以下的整數。 式(ii)中，B是由以下的式(iib)表示。
Figure 02_image025
式(iib)中，La及Lb獨立地為至少包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，t為0以上30以下的整數，s為0或1，＊為A的鍵結部位，＊＊為C的鍵結部位。 式(ii)中，C為由以下的式(iic)表示的炔衍生物或由式(iid)表示的四嗪衍生物的任一者。
Figure 02_image027
(式(iic)中，X為CHRk-＊＊或N-＊＊，Y為CHRk或C=O，Rk獨立地為氫原子或碳數1以上5以下的烷基，在X為CHRk-＊＊且Y為CHRk的情況，Rk部分可一起形成環烷基，Rf、Rg、Rh及Ri獨立地為氫原子、鹵素原子、碳數1以上5以下的烷基，Rf與Rg可一起形成烴環，或Rh與Ri可一起形成烴環，＊＊表示B的鍵結部位，式(iid)中，＊＊表示B的鍵結部位，Rj表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基)。
步驟(A)所使用的螯合劑，以上述式(iia)中，Ra至Rd為-(CH 2) pCOOH，p為1，Re為B的鍵結部位之DOTA衍生物；或Ra至Rc為-(CH 2) pCOOH，p為1，Rd為B的鍵結部位，Re為氫原子之DO3A衍生物或DOTAGA衍生物的任一者為較佳。
式(ii)中，在A為上述DOTA衍生物的情況，以B為DOTA-PEGt-DBCO衍生物，其中La為包含硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，在s為0或1，s為1的情況，t為0以上30以下的整數，Lb為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，C為由式(iic)表示的炔衍生物，式(iic)中，X為N-＊＊，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf與Rg一起形成苯環，Rh與Ri一起形成苯環，＊＊為B的鍵結部位；或B為DOTA-PEGt-Tz衍生物，其中La為包含硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，在s為0或1，s為1的情況，t為0以上30以下的整數，Lb為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，C為由式(iid)表示的四嗪衍生物為更佳。
式(ii)中，在A為上述DO3A衍生物的情況，以B為DO3A-PEGt-DBCO衍生物，其中La為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，在s為0或1，s為1的情況，t為0以上30以下的整數，Lb為包含醯胺鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，C為由式(iic)表示的炔衍生物，式(iic)中，X為N-＊＊，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf與Rg一起形成苯環，Rh與Ri一起形成苯環，＊＊為B的鍵結部位為更佳。
式(ii)中，在A為上述DOTAGA衍生物的情況，以B為DOTAGA-PEGt-DBCO衍生物，其中La為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，在s為0或1，s為1的情況，t為0以上30以下的整數，Lb為包含醯胺鍵或包含硫脲鍵之碳數1以上50以下的結合連接子，C為由式(iic)表示的炔衍生物，式(iic)中，X為N-＊＊，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf與Rg一起形成苯環，Rh與Ri一起形成苯環，＊＊為B的鍵結部位為更佳。
螯合劑與放射性核種的莫耳比率，以螯合部/放射性核種計，下限以10/1以上為佳，100/1以上為較佳，500/1以上為更佳，上限以10000/1以下為佳，8000/1以下為較佳，7000/1以下為更佳，例如100/1以上7000/1以下的範圍為佳，較佳為500/1以上7000/1以下的範圍。
錯合物形成反應，以在溶劑中進行為佳。溶劑可使用例如水、生理食鹽水、或醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、三羥甲基胺基甲烷緩衝液(Tris緩衝液)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸緩衝液(HEPES緩衝液)或四甲基銨醋酸緩衝液等的緩衝液等。
溶劑的液量並未受到特別限定，從製造步驟中的實用性的觀點看來，在步驟(A)的開始時，下限為0.01mL以上，宜為0.1mL以上，較佳為1.0mL以上，更佳為10mL以上，再更佳為100mL以上，上限宜為1000mL以下，較佳為100mL以下，更佳為10mL以下，再更佳為1.0mL以下，例如0.01mL以上100mL以下的範圍。
錯合物形成反應的反應液中的螯合劑的濃度，從目標螯合劑的產率的觀點看來，各自獨立地，在步驟(A)開始時，下限宜為0.001μmol/L以上，較佳為0.01μmol/L以上，更佳為0.1μmol/L以上，較佳為1μmol/L以上，上限宜為1000μmol/L以下，較佳為100μmol/L以下，更佳為10μmol/L以下，可列舉例如1μmol/L以上100μmol/L以下的範圍。
錯合物形成反應的溫度，例如可為室溫(25℃)，或可在加熱條件下，從兼顧抑制螯合劑的分解與提升錯合物的形成效率的觀點看來，下限宜為20℃以上，較佳為30℃以上，更佳為35℃以上，再更佳為37℃以上，特佳為45℃以上，上限宜為150℃以下，較佳為120℃以下，更佳為100℃以下，再更佳為90℃以下，例如30℃以上100℃以下的範圍為佳，較佳為35℃以上90℃以下的範圍。
以上述反應溫度為條件，反應時間下限宜為5分鐘以上，較佳為10分鐘以上，更佳為20分鐘以上，再更佳為30分鐘以上，特佳為45分鐘以上，上限宜為180分鐘以下，較佳為150分鐘以下，更佳為120分鐘以下，再更佳為90分鐘以下，特佳為60分鐘以下，例如10分鐘以上150分鐘以下的範圍為佳，較佳為10分鐘以上60分鐘以下的範圍。
步驟(B)所使用的抗體，是使用具有由前述(i)表示的抗體修飾胜肽與可發生點擊反應的第2原子團之抗體修飾連接子來部位特異性地修飾在上述「(1-2)抗體」的項目詳細敘述的人源化抗體的Fc區(恆定區)之胜肽修飾抗體。
抗體修飾胜肽，可藉由將不論天然還是非天然的胺基酸組合使用，供給至例如液相合成法、固相合成法、自動胜肽合成法、基因轉殖法及噬菌體展示法等的胜肽合成法來製造。在胜肽的合成時，可因應必要對所使用的胺基酸的官能基實行保護。這樣的保護，可依據例如國際公開2017/217347號小冊子及國際公開2018/230257號小冊子所記載的方法來進行。
抗體修飾連接子，可為抗體修飾胜肽與由以下的式(S1)表示的連接子結合而成。
Figure 02_image029
(式中，＊表示胜肽的N末端或C末端的鍵結部位， L 1為聚乙二醇(PEG)連接子部， m為1以上50以下的整數， Z為將(L 1) m與L 2結合的第2連接子部， k為0或1， L 2為第2PEG連接子部， AG 2為第2原子團)。
在前述式(S1)之中，Z的構造，只要是將(L 1) m與L 2互相結合的連接子構造，則並未受到特別限定，例如可包含由1個以上5個以下的胺基酸殘基所形成的胺基酸序列。此情況下，Z中所含的胺基酸序列，以包含半胱胺酸殘基為佳，以透過由半胱胺酸殘基的硫醇基與馬來醯亞胺基的結合所形成的硫醚基與L 2結合為較佳。
在本發明中，構成L 2的PEG連接子部以具有由以下的式(P2)表示的構造為佳。在式(P2)中，n為整數，宜為1以上50以下，較佳為1以上20以下，更佳為2以上10以下，再更佳2以上6以下。
Figure 02_image031
PEG連接子部的構造的一端，可藉由來自市售的PEG化試藥的構造或來自PEG化時通常使用的試藥的構造來修飾，並未受到特別限定，可例示例如來自縮二羥乙酸或其衍生物、馬來醯亞胺或其衍生物的構造。
在抗體修飾連接子導入前述第2原子團的導入方法，可列舉藉由上述方法得到具有所希望的胺基酸序列的抗體修飾胜肽，然後使該胜肽溶解於溶解輔助劑及還原劑，且因應必要添加酸的溶液，在該溶液中添加包含疊氮基或反環辛烯(TCO)的原子團的有機溶劑溶液，並在室溫下攪拌來導入第2原子團的方法。
在導入含疊氮基的原子團作為第2原子團的情況，可使用市售的用來導入疊氮基的試藥，依照常法在胜肽的N末端或C末端直接導入疊氮基，或可透過上述連接子構造導入含疊氮基的原子團。所使用的用來導入疊氮基的試藥，可列舉例如甲矽烷基疊氮化物、磷酸疊氮化物、烷基銨疊氮化物、無機疊氮化物、磺醯基疊氮化物、或PEG疊氮化物等。
另外，在導入含TCO的原子團作為第2原子團的情況，可使用含TCO的市售的點擊化學用試藥，依照常法在胜肽的N末端或C末端直接導入TCO，或可透過上述連接子構造導入含TCO的原子團。
使抗體修飾胜肽與抗體結合，而得到胜肽修飾抗體的方法，例如可使用交聯劑來進行。交聯劑，是指藉由共價鍵用來連結抗體修飾胜肽與抗體的化學物質，其例子可列舉二琥珀醯亞胺戊二酸酯(DSG)、二琥珀醯亞胺辛二酸酯(DSS)等的宜包含2個以上琥珀醯亞胺基的交聯劑、由己二醯亞胺酸二甲酯等的宜包含2個以上醯亞胺酸部分的化合物或其鹽所形成的交聯劑，以及由3,3’-二硫代雙丙醯亞胺酸二甲酯、二硫代雙琥珀醯亞胺丙酸等的具有雙硫鍵的化合物或其鹽所形成的交聯劑等。藉由使用這樣的交聯劑，可在抗體修飾胜肽中的Xaa2的胺基酸殘基與抗體之間發生交聯反應。抗體的交聯反應，例如在抗體使用本發明的人源化抗體的情況，會在Xaa2的胺基酸殘基與本發明的人源化抗體中以Eu編號表示的Lys252殘基之間部位特異性地發生。這些Lys殘基存在於本發明的人源化抗體的Fc區。
抗體修飾胜肽與抗體的結合方法，例如可使上述抗體修飾胜肽、抗體、交聯劑、因應必要加上觸媒，在適當的緩衝液中並在10℃以上30℃以下環境下分散來進行。反應時間可定為10分鐘以上2小時左右以下。胜肽與抗體反應時的莫耳比率，以抗體/胜肽計，下限宜為1/5以上，較佳為1/3以上，更佳為1/1.5以上，上限宜為20/1以下，較佳為10/1以下，更佳為5/1以下，再更佳為1/1以下，特佳為1/1.7以下，例如1/5以上20/1以下的範圍為佳，較佳為1/1.5以上1/1.7以下。
經過以上的步驟所得到的胜肽修飾抗體，是以任意比例含有相對於抗體一分子結合了抗體修飾胜肽一分子而成的抗體(以下稱為「一價抗體」與相對於抗體一分子結合了抗體修飾胜肽兩分子而成的抗體(以下稱為「二價抗體」)的混合物，可將其直接提供後續步驟，或可藉由過濾器、濾膜、填充各種填充劑的管柱、各種層析等的方法將未修飾抗體、一價抗體及二價抗體分離純化之後，將僅任一價數的抗體提供後續步驟。在純化的結果，未修飾抗體與其他價數的抗體無法分離的情況，亦可將含有這些抗體的混合物提供後續步驟。 在將未修飾抗體、一價抗體及二價抗體分離純化的情況，可藉由上述任一種純化方法來分離純化，以使用填充各種填充劑的管柱為佳，以使用填充適合於抗體等的蛋白質的分離純化的填充劑的管柱為較佳。
適合於抗體等的蛋白質的分離純化的填充劑，只要是與抗體特異性地結合的免疫球蛋白結合性蛋白質被固定化於由水不溶性的基材所形成的擔體而成的填充劑，則並未受到特別限定。免疫球蛋白結合性蛋白質，可列舉例如蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L等。這些免疫球蛋白結合性蛋白質可為基因操作的重組型，重組型免疫球蛋白結合性蛋白質，可列舉基因改變型蛋白質A、基因改變型蛋白質G，或蛋白質A的結構域與蛋白質G的結構域的融合型。在本發明中，適合於至少一價抗體與二價抗體的分離純化的填充劑，以蛋白質A為較佳，基因改變型蛋白質A為更佳。此處，蛋白質A及蛋白質G，是指可與抗體分子的IgG特異性地結合的蛋白質分子，依照分離的微生物來源的不同，可分類成蛋白質A(金黃色葡萄球菌：Staphylococcus aureus)或蛋白質G(鏈球菌：Streptococcus屬)。基因改變型蛋白質A，是指在蛋白質A的IgG結合結構域(E、D、A、B及C結構域)當中任一種結構域的胺基酸殘基導入了至少一個胺基酸變異的蛋白質A，在本發明中，以導入了至少一個胺基酸變異的結構域多聚體化而成的基因改變型蛋白質A為佳，導入了至少一個胺基酸變異的蛋白質A的A、B或C結構域多聚體化為較佳，多聚體化成為二聚體以上五聚體以下為更佳。胺基酸變異，可來自基因的轉錄轉譯步驟中的胺基酸序列或編碼胺基酸的鹼基序列的替換、缺損、插入等的任一種變異。舉個例子，可列舉國際公開2003/080655號小冊子、國際公開2011/118699號小冊子所記載的基因改變型蛋白質A等，然而並不受到特別限定。
固定化了免疫球蛋白結合性蛋白質的水不溶性基材，可列舉玻璃珠、二氧化矽凝膠等的無機擔體、交聯聚乙烯醇、交聯聚丙烯酸酯、交聯聚丙烯醯胺、交聯聚苯乙烯等的合成高分子、或結晶性纖維素、交聯纖維素、交聯瓊脂糖、交聯聚葡萄糖等的由多糖類所形成的有機擔體，甚至藉由其組合所得到的有機-有機、有機-無機等的複合擔體等。
填充上述基因改變型蛋白質A作為填充劑的管柱，例如到KANEKA股份有限公司的KanCap(註冊商標)系列(KANEKA KanCapA prepacked column)、GE Healthcar公司的HiTrap(註冊商標)系列(HiTrap Mabselect、HiTrap Mabselect SuRe、HiTrap Mabselect Xtra)、GE Healthcar公司的HiScreen系列(HiScreen MabselectSuRe)、或東曹股份有限公司的TOYOPEARL(註冊商標)系列(TOYOPEARL AF-rProtein A-650F)等在市面販售。
以將步驟(B)中的點擊反應所使用的胜肽修飾抗體分離純化的情況為例，在以下作說明。 胜肽修飾抗體，經過藉由具備抗體修飾胜肽的連接子(抗體修飾連接子)部位特異性地修飾抗體的Fc區，而得到修飾抗體之抗體修飾步驟；及使用固定化了上述免疫球蛋白結合性蛋白質的擔體來純化修飾抗體之抗體純化步驟，然後供給至步驟(B)中的點擊反應。另外，抗體純化步驟，進一步包含：使被保持在擔體的修飾抗體保持於擔體之保持步驟；將並未被保持於擔體的修飾抗體洗淨之洗淨步驟；將在保持步驟中被保持於擔體的修飾抗體溶離之溶離步驟。 較具體而言，在抗體修飾步驟之中，以包含抗體修飾連接子並未被修飾的未修飾抗體、一價抗體及二價抗體的混合物的形式取得修飾抗體，在抗體純化步驟之中，利用未修飾抗體、一價抗體及二價抗體對於免疫球蛋白結合性蛋白質的各交互作用的不同，分別溶離出包含相對較多的未修飾抗體及一價抗體的第一抗體組成物與包含相對較多的二價抗體的第二抗體組成物。亦即，在抗體純化步驟之中，在保持步驟及洗淨步驟中，包含相對較多的免疫球蛋白結合性蛋白質的交互作用的程度低的胜肽修飾抗體(二價抗體)的第二抗體組成物會被溶離出來，在抗體純化步驟之中，在溶離步驟中，包含相對較多的免疫球蛋白結合性蛋白質的交互作用的程度高的胜肽修飾抗體(未修飾抗體及一價抗體)的第一抗體組成物會被溶離出來。此處，「包含相對較多的未修飾抗體及一價抗體」，意指第一抗體組成物中所含的未修飾抗體及一價抗體的合計量高於該抗體組成物中所含的的二價抗體，宜為意指相對於該抗體組成物中所含的未修飾抗體及修飾抗體的總量(100%)而言，未修飾抗體及一價抗體的合計量為55%以上、63%以上、70%以上、80%以上或90%以上，「包含相對較多的二價抗體」，意指第二抗體組成物中所含的二價抗體的量高於該抗體組成物中所含的一價抗體，宜為意指相對於該抗體組成物中所含的未修飾抗體及修飾抗體的總量(100%)而言，二價抗體的量為55%以上、63%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
在保持步驟中，將含有抗體修飾步驟所得到的未修飾抗體、一價抗體及二價抗體的混合物的溶液添加至管柱，使被保持於擔體的未修飾抗體及一價抗體保持於管柱中，並讓並未被保持於擔體的二價抗體通過。此處，在保持步驟通過的溶液為構成第二抗體組成物的一部分。為了使未修飾抗體及一價抗體容易保持於管柱，並且為了防止其凝集或變性，以將胜肽修飾抗體的混合溶液以適當的稀釋溶劑稀釋然後添加至管柱為佳。稀釋溶劑，只要是能讓胜肽修飾抗體溶解，在溶劑中不易凝集或變性的溶劑，則並未受到特別限定，可使用水、生理食鹽水、或醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、2-胺基-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)緩衝液、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-乙烷磺酸(HEPES)緩衝液等的緩衝液等，以使用上述任一種緩衝液為佳，以使用醋酸鈉緩衝液為較佳。在稀釋溶劑使用緩衝液的情況，緩衝劑的濃度下限為10mmol/L以上，宜為15mmol/L以上，較佳為20mmol/L以上，上限為1000mmol/L以下，宜為500mmol/L以下，較佳為100mmol/L以下。另外，從降低二價抗體或抗體修飾胜肽在管柱擔體上非特異性結合的觀點看來，溶離溶劑亦可含有氯化鈉、氯化鉀等的添加劑。溶離溶劑所含有的添加劑的濃度並未受到特別限定，可使用例如0.15mol/L。
在洗淨步驟中，使用洗淨溶劑將殘存於管柱內的修飾抗體由管柱溶離。在上述保持步驟通過管柱的溶液及在洗淨步驟由管柱溶離出來的溶液，包含了相對較多的二價抗體，因此可將這些溶液合在一起作為第二抗體組成物使用。 洗淨溶劑，只要是讓胜肽修飾抗體溶解，在溶劑中不易凝集或變性、具有適當的pH緩衝能的緩衝液，則並未受到特別限定，可使用醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、2-胺基-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)緩衝液、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-乙烷磺酸(HEPES)緩衝液等的緩衝液等，以使用上述任一種緩衝液為佳，使用醋酸鈉緩衝液為較佳。洗淨溶劑所使用的緩衝劑的濃度下限為20mmol/L以上，宜為30mmol/L以上，上限為200mmol/L以下，宜為70mmol/L以下。另外，洗淨溶劑的pH下限為4.0以上，宜為4.5以上，較佳為4.8以上，上限為7.4以下，宜為6.0以下，較佳為5.2以下。此外，從降低二價抗體或抗體修飾胜肽在管柱擔體上非特異性結合的觀點看來，溶離溶劑亦可含有氯化鈉、氯化鉀等的添加劑。溶離溶劑所含有的添加劑的濃度並未受到特別限定，可使用例如0.15mol/L。
在溶離步驟中，將被保持於擔體的修飾抗體使用溶離溶劑由管柱溶離。亦即，將包含相對較多的未修飾抗體及一價抗體的第一抗體組成物使用溶離溶劑由管柱溶離。 溶離溶劑，可使用醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、檸檬酸緩衝液等的緩衝液等。另外，從減少抗體修飾連接子、未修飾抗體及修飾抗體在管柱擔體上非特異性結合的觀點看來，溶離溶劑亦可含有氯化鈉、氯化鉀等的添加劑。溶離溶劑所含有的添加劑的濃度並未受到特別限定，可使用例如0.15mol/L。 在溶離溶劑含有緩衝劑的情況，緩衝劑的濃度下限為20mmol/L以上，宜為30mmol/L以上，上限為200mmol/L以下，宜為70mmol/L以下。另外，從為了使未修飾抗體及一價抗體與免疫球蛋白結合性蛋白質的交互作用減弱，還有從防止抗體變性及凝集的觀點看來，溶離溶劑的pH以下限為pH3.0以上，上限為pH4.2以下為佳。
抗體純化步驟所取得的第一抗體組成物或第二抗體組成物，可直接使用於後續步驟(B)中的點擊反應，或可調節所含的胜肽修飾抗體的蛋白質濃度然後使用於後續步驟(B)中的點擊反應。
步驟(B)中的點擊反應，是在螯合劑所具有的可發生點擊反應的第一原子團與胜肽修飾抗體所具有的可發生點擊反應的第二原子團之間進行的反應。藉由這樣的點擊反應，可形成將螯合劑與抗體連結的結合基(可達成抗體的複合化的取代基)。
胜肽修飾抗體與步驟(A)所得到的錯合物只要可發生點擊反應，則不論其添加順序，例如可在裝有溶劑的反應容器中添加該錯合物及該胜肽修飾抗體的其中一者，然後添加另一者，使其反應，或在使該螯合劑及該抗體的其中一者在溶劑中分散，在分散液中添加另一者使其反應。或者，同時這些添加至裝有溶劑的反應容器中，使其反應。
步驟(B)的點擊反應所使用的溶劑，可使用含水的溶劑，例如可使用水、生理食鹽水、或醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、或四甲基銨醋酸緩衝液等的緩衝液等。在使用緩衝液的情況，從兼顧錯合物及抗體的安定性與其結合效率的觀點看來，宜將25℃下的pH定為4.0以上10.0以下，更佳為5.5以上8.5以下。
反應液量並未受到特別限定，從製造步驟中的實用性的觀點看來，在步驟(B)開始時，下限以0.001mL以上為佳，0.01mL以上為較佳，0.1mL以上為更佳，1mL以上又更佳，上限以，1000mL以下為佳，100mL以下為較佳，10mL以下為更佳，1mL以下又更佳，例如0.001mL以上1000mL以下的範圍為佳，0.1mL以上10mL以下的範圍為較佳。
另外，螯合劑及抗體的反應液中的濃度，各自獨立地，在步驟(B)開始時，下限以0.001μmol/L以上為佳，0.01μmol/L以上為較佳，0.1μmol/L以上為更佳，1.0 μmol/L以上又更佳，上限以1000μmol/L以下為佳，100 μmol/L以下為較佳，例如0.1μmol/L以上1000μmol/L以下的範圍為佳，從目標螯合複合體的產量的觀點看來，在1μmol/L以上100μmol/L以下的範圍為較佳。
從防止抗體非刻意的變性，同時提高反應效率的觀點看來，步驟(B)中的點擊反應，反應溫度的上限以50℃以下為佳，40℃以下為較佳。另外，反應溫度的下限，只要是反應會進行的溫度，則並無特別限制，以15℃以上為佳。以上述反應溫度為條件，點擊反應的反應時間宜為5分鐘以上，較佳為10分鐘以上，24小時以下為佳，較佳為20小時以下，例如5分鐘以上24小時以下的範圍為佳，較佳為10分鐘以上20小時以下的範圍。
所得到的螯合複合體，可將其直接使用，或可使用過濾器、濾膜、填充各種填充劑的管柱、層析等來純化。
由步驟(A)及(B)所製造出的螯合複合體，是特異性地結合於MUC5AC的人源化抗體的特定部位(例如抗體的Fc區的離胺酸殘基)被螯合劑特異性地修飾的複合體。該螯合複合體，相對於該抗體一分子具備前述螯合劑一分子或兩分子。螯合劑會透過連接子部位特異性地修飾本發明之抗體的Fc區。該連接子是由連接於螯合劑的螯合連接子、連接於該連接子的第1原子團、可與第1原子團發生點擊反應的第2原子團、連接於第2原子團的抗體修飾連接子(包含由上述式(i)表示的抗體修飾胜肽)所構成。所以，該連接子具有來自第1原子團與第2原子團的化學構造。這樣的化學構造，可考慮由下述式(10a)或(10b)表示之含三唑骨架的構造，或由下述式(10c)表示之含噠嗪骨架的構造。式(10a)與式(10b)由於是異構物的關係，因此能夠以任意比例含有。
Figure 02_image033
式(10a)及式(10b)中，R 1A表示螯合連接子的鍵結部位，R 2A表示抗體修飾連接子的鍵結部位。式(10c)中，R 3A及R 4A其中一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示螯合連接子的鍵結部位，R 5A表示抗體修飾連接子的鍵結部位。
(1-5)放射性醫藥 以上述(1-4A)所揭示的方法製造出的複合體及以上述(1-4B)所揭示的方法製造出的螯合複合體，可直接或者將其純化之後，調製出包含該複合體或該螯合複合體作為有效成分的放射性醫藥。放射性醫藥，是指包含本發明之複合體或本發明之螯合複合體，亦即經放射性核種(放出β射線的核種)標記的抗MUC5AC人源化抗體或其衍生物，製成適合於投予至對象生物體內的形態的組成物。放射性醫藥，例如可使上述方法所製造出的本發明之複合體或本發明之螯合複合體溶解於以水為主體且與生物體大略等張壓的溶劑來製造。此情況下，放射性醫藥以水溶液的形態為佳，亦可因應必要包含藥學所容許的其他成分。放射性醫藥，可將其有效量以口服的方式或以靜脈內、皮下，腹腔內或肌肉內等的非口服的方式投予至生物體，使用於疾病的治療、疾病的診斷或病灶的偵測等。 此處的投予對象為人類或小鼠、大鼠、猴子、天竺鼠、黑猩猩、綿羊、山羊、犬、貓、豬、牛或馬等的動物，然而並未受到特別限定。宜為人類。 合適的對象疾病可列舉癌症。在本發明中治療、診斷的癌症，可列舉胰臟癌、甲狀腺癌、肝臟癌、大腸癌、胃癌、尿路上皮癌、乳癌、子宮頸癌、卵巢癌、或子宮內膜癌，尤其以適用於胰臟癌為佳。
本發明所治療、診斷的癌症的例子，還可列舉膽管癌。
另外，有多個文獻報告出MUC5AC為CA19-9的抗原載體(PLoS ONE(December2011, Volume6, Issue12, e29180, p1-10))。所以，本發明所治療的癌症，還可列舉過度表現CA19-9的膽道癌、子宮體癌、肺癌或食道癌，可效率良好地治療。
此處的「有效量」是指投予對象的治療上可得到有效的效果的量。應投予至對象的有效量，會依照對象的種類、對象的體重、投予的劑形(錠劑、注射劑等)及途徑(口服投予、非口服投予等)及疾病(例如癌症)的嚴重度等而有所不同。醫師或獸醫師可考慮這些因素來決定適當的有效量。
藉由選擇具有治療效果的物質作為放射性核種，本發明之複合體或本發明之螯合複合體可使用於放射性核種體內療法(RI體內療法)。RI體內療法，是以靜脈注射或口服來投予放射性醫藥，讓該放射性藥劑聚積在如癌原發病灶或轉移病灶般的病灶部位，藉由從放射性藥劑放出的放射線來破壞病灶部位的癌細胞。所以，本發明之複合體或本發明之螯合複合體適合使用於癌的RI體內療法。此情況下，該醫藥的投予量、用量，可因應放射性核種的種類、有效成分的有效性、投予的形態･途徑、疾病(特別是癌)的發展階段、患者的體型･體重･年齡、併用的其他疾病治療藥的種類或量而適當地選擇。 另外，該醫藥的投予量、用量，亦可使用將小鼠的投予量以人類體表面積來換算的人類等效劑量(HED；Human Equivalent dose)。HED可藉由下述式求得。 HED=animal dose in MBq/kg × (animal weight in kg/human weight in kg) 0.33
例如若使用體重20g的小鼠的投予量來計算體重60kg的人類的HED，則在放射性核種為碘-131的情況，通常能夠以每次100MBq/kg以下來投予。每次50MBq/kg以下的用量也可發揮出效果。例如在放射性核種為釔-90的情況，通常能夠以每次50MBq/kg以下來投予。每次30kBq/kg以下的用量也可發揮出效果。例如在放射性核種為鎦-177的情況，通常能夠以每次50MBq/kg以下來投予。每次40MBq/kg以下的用量也可發揮出效果。這樣的投予量是本發明其中一個實施形態的例示，業界人士可依照小鼠及人類的體重適當地以上述式來換算。 另外，在放射性核種為碘-131的情況，藉由事先投予非放射性碘製劑(安定碘劑)，可降低碘生理性地聚積而對甲狀腺造成的毒性。安定碘劑可使用碘化鉀、碘酸鉀等。
另外，本發明的其他態樣，可準備前述複合體或螯合複合體之中，以僅將放射性核種由放出β射線的核種置換成放出正子或γ射線的放射性核種( 68Ga、 64Cu、 86Y、 89Zr、 111In、 123I、 125I、Al 18F)的複合體或螯合複合體作為有效成分的放射性醫藥，並將其使用於上述癌的RI體內療法中的癌症診斷。本發明之癌症診斷用放射性醫藥，可使用於進行癌的RI體內療法之前的診斷，或使用於進行癌的RI體內療法之後的診斷。藉由使用於進行癌的RI體內療法前的診斷，可用來作治療選擇，判斷是否要使用具備放出β射線的放射性核種的本發明之複合體或螯合複合體來實行癌的RI體內療法。另外，藉由使用於進行癌的RI體內療法之後的診斷，可用來判定使用具備放出β射線的放射性核種的本發明之複合體或螯合複合體的癌的RI體內療法是否有效果或增減投予量等，以使治療計畫適當化。
根據以上敘述的本發明之實施形態，可提供一種經對MUC5AC的特異性與在腫瘤的聚積性優異的放射性核種標記，具體而言經放出β射線的核種標記之抗MUC5AC抗體，尤其是人源化抗體。 另外，根據本發明之實施形態，可提供一種為了達成治療同時診斷之癌症診斷用及/或癌症治療用的經RI標記之抗MUC5AC抗體。
本發明的上述實施形態包含以下的技術思想。 [1]　一種複合體，其係放射性核種與抗體之複合體，並且前述放射性核種為放出β射線之核種，前述抗體為特異性地結合於黏蛋白亞型5AC(MUC5AC)之人源化抗體(抗MUC5AC抗體)，且為具有 由在(1)序列識別號1表示的胺基酸序列(H01)、與序列識別號1表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號1表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列、 在(2)序列識別號2表示的胺基酸序列(H02)、與序列識別號2表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號2表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列、 在(3)序列識別號3表示的胺基酸序列(H03)、與序列識別號3表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號3表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列、或 在(4)序列識別號4表示的胺基酸序列(H04)、與序列識別號4表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號4表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列 所形成的重鏈可變區，及 由在(5)序列識別號5表示的胺基酸序列(L01)、與序列識別號5表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號5表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列、 在(6)序列識別號6表示的胺基酸序列(L02)、與序列識別號6表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號6表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列、 在(7)序列識別號7表示的胺基酸序列(L03)、與序列識別號7表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號7表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列、或 在(8)序列識別號8表示的胺基酸序列(L04)、與序列識別號8表示的胺基酸序列有90%以上或95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或序列識別號8表示的胺基酸序列之中，三個、兩個或一個胺基酸缺損、替換或附加之胺基酸序列 所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。 [2]　如上述[1]之複合體，其中前述抗體係具有 由(1)序列識別號1表示的胺基酸序列(H01)、 (2)序列識別號2表示的胺基酸序列(H02)、 (3)序列識別號3表示的胺基酸序列(H03)、或 (4)序列識別號4表示的胺基酸序列(H04) 所形成的重鏈可變區，及 由(5)序列識別號5表示的胺基酸序列(L01)、 (6)序列識別號6表示的胺基酸序列(L02)、 (7)序列識別號7表示的胺基酸序列(L03)、或 (8)序列識別號8表示的胺基酸序列(L04) 所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。 [3]　如上述[1]或[2]之複合體，其中前述抗體係具有 由(1)序列識別號1表示的胺基酸序列(H01)所形成的重鏈可變區，及 由(7)序列識別號7表示的胺基酸序列(L03)所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。 [4]　如上述[1]～[3]中任一項之複合體，其中放出β射線的前述核種為碘-131、釔-90或鎦-177。 [5]　如上述[1]～[4]中任一項之複合體，其中前述複合體包含螯合放射性核種的螯合劑， 前述放射性核種為放出β射線的金屬核種。 [6]　如上述[5]之複合體，其中前述放出β射線的金屬核種為釔-90或鎦-177。 [7]　如上述[5]或[6]之複合體，其中相對於前述抗體一分子，具備前述螯合劑一分子以上8分子以下。 [8]　如上述[5]～[7]中任一項之複合體，其中前述螯合劑透過連接子部位特異性地修飾前述抗體的Fc區。 [9]　如上述[8]之複合體，其中前述連接子係由下述式(i)表示，包含由13個以上17個以下的胺基酸殘基所形成的抗體修飾胜肽，並且藉由經交聯劑修飾的前述胜肽與前述抗體之交聯反應所形成，
Figure 02_image035
(式中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續的a個X、連續的b個X、連續的c個X及連續的d個X， X為側鏈不具有硫醇基及鹵乙醯基之任一者之胺基酸殘基， a、b、c及d各自獨立地為1以上5以下的整數，且滿足a+b+c+d≦14， Xaa1及Xaa3各自獨立地表示來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基，且透過雙硫鍵來結合，或硫醚基透過連接子來結合，或 一者表示來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基，另一者表示來自側鏈具有鹵乙醯基的胺基酸之胺基酸殘基，且透過硫醚鍵結合， Xaa2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基栓酸、或二胺基丙酸，前述經交聯劑修飾)。 [10]　如上述[9]之複合體，其中前述抗體修飾胜肽係前述式(i)中，Xaa2為離胺酸殘基。 [11]　如上述[9]或[10]之複合體，其中前述抗體修飾胜肽包含由序列識別號10(但是Xaa2為離胺酸殘基)表示的胺基酸序列所形成的抗體修飾胜肽。 [12]　如上述[5]～[11]中任一項之複合體，其中前述螯合劑具有來自下述式(A)表示的化合物或其鹽之構造。
Figure 02_image037
(式(A)中，R 11、R 13及R 14各自獨立地為由 -(CH 2) pCOOH、-(CH 2) pC 5H 5N、-(CH 2) pPO 3H 2、 -(CH 2) pCONH 2、或-(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所形成的基團，R 12或R 15的一者為氫原子、羧基或碳數2或3之羧烷基，另一者為用來與前述抗體複合化的取代基，p為0以上3以下的整數，R 12為用來與前述抗體複合化的取代基時，R 15為氫原子，R 12並非用來與前述抗體複合化的取代基時，R 15為用來與前述抗體複合化的取代基)。 [13]　如上述[5]～[12]中任一項之複合體，其中前述螯合劑透過連接子部位特異性地修飾前述抗體的Fc區，前述連接子具有藉由點擊反應所形成的結合基。 [14]　如上述[13]之複合體，其中前述連接子具有連接前述螯合劑與前述藉由點擊反應所形成的結合基的螯合連接子以及連接前述抗體與前述藉由點擊反應所形成的結合基的抗體修飾連接子，前述藉由點擊反應所形成的前述結合基具備由下述式(10a)表示的含三唑骨架的構造，或含噠嗪骨架的構造。
Figure 02_image039
(式中，R 1A表示前述螯合連接子的鍵結部位，R 2A表示前述抗體修飾連接子的鍵結部位)。 [15]　一種放射性醫藥，其係含有如上述[1]～[14]中任一項之複合體作為有效成分。 [16]　如上述[15]之放射性醫藥，其係使用於癌的RI體內療法。 [17]　如上述[16]之放射性醫藥，其中前述放射性核種為碘-131， 在前述RI體內療法之中，用來對於對象以每次100MBq/kg以下的投予量投予。 [18]　如上述[16]之放射性醫藥，其中前述放射性核種為釔-90， 在前述RI體內療法之中，用來對於對象以每次50MBq/kg以下的投予量投予。 [19]　如上述[16]之放射性醫藥，其中前述放射性核種為鎦-177， 在前述RI體內療法之中，用來對於對象以每次50MBq/kg以下的投予量投予。 [20]　一種使用如上述[16]～[19]中任一項之放射性醫藥之RI體內療法中的癌症診斷用放射性醫藥，其係含有放射性核種或螯合放射性核種的螯合劑與抗體的複合體之放射性醫藥，並且前述抗體為特異性地結合於MUC5AC之人源化抗體。 [21]　如上述[1]～[4]中任一項之複合體的製造方法，其係包含使放射性核種與抗MUC5AC抗體複合化，產生前述放射性核種與前述抗MUC5AC抗體的複合體之複合化步驟。 [22]　如上述[5]～[14]中任一項之複合體的製造方法，其係包含使螯合放射性核種的螯合劑與抗MUC5AC抗體複合化，產生前述螯合劑與前述抗MUC5AC抗體的複合體之複合化步驟。 [23]　如上述[22]之複合體的製造方法，其中前述螯合劑連接於螯合連接子，前述抗MUC5AC抗體的Fc區被具備抗體修飾胜肽的抗體修飾連接子特異性地修飾，在前述複合化步驟之中，藉由實行點擊反應，將前述螯合連接子與前述抗體修飾連接子連接。 [24]　一種修飾抗體，其係藉由具備抗體修飾胜肽的抗體修飾連接子特異性地修飾抗體的Fc區之修飾抗體，並且前述抗體為如上述[1]之特異性地結合於MUC5AC之人源化抗體 前述抗體修飾連接子具有用來與螯合了放出β射線之核種的螯合劑所具備的螯合連接子發生點擊反應而連接的原子團。 [25]　一種修飾抗體的製造方法，其係藉由具備抗體修飾胜肽的抗體修飾連接子特異性地修飾抗體的Fc區之修飾抗體的製造方法，並且包含： 以具備抗體修飾胜肽的連接子部位特異性地修飾前述抗體的Fc區，而得到修飾抗體之抗體修飾步驟；及 使用固定化有免疫球蛋白結合性蛋白質的擔體，將前述抗體純化之抗體純化步驟， 前述抗體為如上述[1]之特異性地結合於MUC5AC之人源化抗體， 前述抗體修飾連接子具有用來與螯合了放出β射線之核種的螯合劑所具備的螯合連接子發生點擊反應而連接的原子團。 [26]　如上述[25]之修飾抗體的製造方法，其中前述免疫球蛋白結合性蛋白質為蛋白質A或基因改變型蛋白質A。 [27]　如上述[25]或[26]之修飾抗體的製造方法，其中使用填充前述擔體的管柱來實行前述抗體純化步驟。 [28]　如上述[27]之修飾抗體的製造方法，其中前述抗體純化步驟包含：讓前述修飾抗體保持在前述擔體之保持步驟；及將被保持在前述擔體的前述修飾抗體溶離之溶離步驟。 [29]　如上述[28]之修飾抗體的製造方法，其中在前述抗體修飾步驟之中，以包含前述抗體修飾連接子並未被修飾的未修飾抗體、相對於前述抗體一分子，有一分子的前述抗體修飾連接子被修飾的一價抗體、及相對於前述抗體一分子，有兩分子的前述抗體修飾連接子被修飾的二價抗體的混合物的形式取得前述修飾抗體， 在前述抗體純化步驟之中，包含利用前述未修飾抗體、前述一價抗體及前述二價抗體對於前述免疫球蛋白結合性蛋白質的各交互作用的不同，分別取得包含相對較多的未修飾抗體及一價抗體的第一抗體組成物與包含相對較多的二價抗體的第二抗體組成物的步驟。 [30]　一種複合體的製造方法，其係包含：實行如上述[25]～[29]中任一項之修飾抗體的製造方法，而得到修飾抗體之修飾抗體製造步驟；及使前述修飾抗體與螯合了放出β射線之核種的螯合劑複合化，產生前述螯合劑與前述修飾抗體的複合體之複合化步驟。 [31]　如上述[30]之複合體的製造方法，其中在前述修飾抗體製造步驟之中，取得相較於相對於前述抗體一分子有兩分子的前述抗體修飾連接子被修飾的二價抗體，前述抗體修飾連接子並未被修飾的未修飾抗體及相對於前述抗體一分子有一分子的前述抗體修飾連接子被修飾的一價抗體的合計的比例較高的第一抗體組成物， 在前述複合化步驟之中，形成前述螯合劑與前述一價抗體的複合體。 [32]　如上述[31]之複合體的製造方法，其中在前述修飾抗體製造步驟之中，取得相較於前述抗體修飾連接子並未被修飾的未修飾抗體及相對於前述抗體一分子有一分子的前述抗體修飾連接子被修飾的一價抗體的合計，相對於前述抗體一分子有兩分子的前述抗體修飾連接子被修飾的二價抗體的比例較高的第二抗體組成物， 在前述複合化步驟之中，形成前述螯合劑與前述二價抗體的複合體。 [33]　如上述[30]～[32]中任一項之複合體的製造方法，其中前述螯合劑連接於螯合連接子，在前述複合化步驟之中，藉由實行點擊反應，將前述螯合連接子與前述抗體修飾連接子連接。 [34]　一種套組，其係用來製造放射性核種與抗體的複合體的套組，並且包含(1)放射性核種及(2)抗MUC5AC抗體，前述複合體為如上述[1]～[4]中任一項之複合體。 [35]　一種套組，其係用來製造螯合放射性核種的螯合劑與抗體的複合體之套組，並且包含(1)可螯合放射性核種的螯合劑及(2)抗MUC5AC抗體，前述複合體為如上述[5]～[13]中任一項之複合體。 [36]　如[34]或[35]之套組，其中進一步包含(1)可發生點擊反應的第一原子團及(2)可發生點擊反應的第二原子團。 [37]　如[35]或[36]之套組，其中進一步包含可螯合於螯合劑的放射性核種。
根據如上述[15]之放射性醫藥，由於含有具備特異性地結合於MUC5AC的人源化抗體與放出β射線的核種之複合體作為有效成分，因此藉由使用於癌的RI體內療法，可特異性地聚積表現MUC5AC的腫瘤，對腫瘤細胞照射β射線，能夠得到較高的治療效果。 根據如上述[21]之複合體的製造方法，包含了使放射性核種與抗MUC5AC抗體複合化的複合化步驟，因此能夠以較簡便的操作有效率地得到該複合體。 根據如上述[22]之複合體的製造方法，由於包含了使螯合放射性核種的螯合劑與抗MUC5AC抗體複合化之的複合化步驟，因此不需在對於抗體而言條件較嚴苛的螯合步驟中加入抗MUC5AC抗體，可防止抗體的變性，有效率地得到該複合體。 根據如上述[23]之複合體的製造方法，由於在複合化步驟中包含了點擊反應，因此可在緩衝溶液中、常溫這樣的極溫和條件下複合化，不會使抗MUC5AC抗體變性，可有效率地得到該複合體。 根據如上述[24]之修飾抗體，由揭示藉由抗體修飾連接子特異性地修飾抗MUC5AC抗體的Fc區，因此不會損害抗MUC5AC抗體的抗原結合能力，可將該修飾抗體使用於與螯合放射性核種的螯合劑所具備的螯合連接子發生點擊反應。 根據如上述[25]之修飾抗體的製造方法，由於具備：以具備抗體修飾胜肽的連接子部位特異性地修飾抗MUC5AC抗體的Fc區，而得到修飾抗體之抗體修飾步驟；及使用固定化了免疫球蛋白結合性蛋白質的擔體使前述抗體純化的抗體純化步驟，因此可更加提高該修飾抗體的純度。 根據如上述[31]或[32]之複合體的製造方法，由於使用一價抗體或二價抗體之任一者的比例高於另一者的比例的抗體組成物來進行複合化步驟，因此可因應目的調節與抗MUC5AC抗體結合的螯合劑的數目，能夠以較高純度的得到所希望價數的複合體。 根據如上述[34]之套組，在必要的時機使放射性核種與抗體反應，可在使用時調製出如[1]～[4]中任一項之複合體，不會損害放射性核種的半衰期及抗體活性這兩者，能夠有效率地治療。 根據上述[35]之套組，可在必要的時機使可螯合放射性核種的螯合劑與抗體的複合體與放射性核種反應，可在使用時調製出如[5]～[13]中任一項之複合體，不會損害放射性核種的半衰期及抗體活性這兩者，能夠有效率地治療。 根據如上述[36]之套組，由於分別具備包含與可螯合放射性核種的螯合劑發生點擊反應原子團之複合體以及包含與抗體發生點擊反應原子團之複合體，因此可在必要的時機使放射性核種螯合於螯合劑，使其發生點擊反應，可在使用時調製出如[5]～[14]中任一項之複合體，不會損害放射性核種的半衰期及抗體活性這兩者，能夠有效率地治療。
以下藉由實施例等來詳細說明本發明，而本發明並不受其限定。 [實施例]
製造例1：抗MUC5AC人源化抗體的製作 以成為適合在CHO細胞中表現的密碼子使用頻率來考慮附加了訊息序列的各種可變區的胺基酸序列及各種恆定區的胺基酸序列，同時轉換成鹼基序列。在訊息序列的開始密碼子部位附加科扎克序列，並在恆定區的C末端側附加停止密碼子。進一步在科扎克序列的上游與停止密碼子的下游附加限制酵素位點，使其可導入到哺乳類細胞表現用質體(pcDNA3.4)的表現用基因導入位點。以這種方式設計出來的各DNA片段，是藉由化學合成來製作。使用融合PCR來連結包含成為目標H鏈與目標L鏈的可變區的DNA片段與包含恆定區的DNA片段。
將所製作出的各種抗體基因限制處理然後純化。同樣地，哺乳類細胞暫時性表現用質體(pcDNA3.4)也以相同的限制酵素處理然後純化。將兩片段以適當的混合比混合，進行連接。將連接反應液與大腸菌DH5α勝任細胞混合，進行轉形。由所產生的轉形體進行菌落PCR，分離出單一菌落，由小規模培養液取出質體，決定插入部分的鹼基序列，選出所設計的抗體基因全長如所設計的序列並且往期望的方向正確插入的質體(大腸菌殖株)。對於所選出的大腸菌殖株實施大規模培養，進行包含內毒素除去步驟的質體萃取･純化。對於純化後的質體測定260nm的吸光度，計算出濃度。
使用ExpiCHO System(Thermo Fisher Scientific公司製)，實施CHO細胞的暫時性表現。由所製作出的各H鏈表現用質體與各L鏈表現用質體選擇一種H鏈、一種L鏈成為目標組合，藉由脂質體轉染法來轉染，進行培養、給料。轉染的7天～13天後，回收培養液。將離心分離及過濾器過濾後的培養上清液添加至ProteinA管柱，藉由通常的親和管柱層析(吸附後洗淨、利用酸性緩衝液來溶離、溶離液的中和)將抗體純化。對於純化後的抗體測定280nm的吸光度來計算濃度。
使用上述敘述的方法，製作出下述抗 MUC5AC人源化抗體。以下揭示對於重鏈可變區與輕鏈可變區的組合賦予的抗體編號。 抗體1：H01L03 抗體2：H01L04 抗體3：H02L04 抗體4：H04L04 此處H01、H02及H04分別為序列識別號1、序列識別號2及序列識別號4所表示的重鏈可變區，L03及L04分別為序列識別號7及序列識別號8所表示的輕鏈可變區。以下的實施例所使用的抗體是由重鏈恆定區1(序列識別號25)與輕鏈恆定區1(序列識別號26)及上述抗體1至抗體4的重鏈可變區與輕鏈可變區的組合所形成。
製造例2：利用胜肽連接子部位特異性地進行抗體修飾 (1)抗體修飾步驟 以國際公開2017/217347號小冊子所記載的方法來製造抗體修飾胜肽，而得到由下述式(P3)表示之包含17個胺基酸殘基的胜肽。該胜肽的胺基酸序列，與序列識別號10的Xaa2為離胺酸殘基的序列相同，離胺酸殘基的側鏈末端胺基經過由R 1所表示的構造修飾。另外，兩個半胱胺酸殘基互相形成雙硫鍵，胜肽的N末端透過具有縮二羥乙酸及8個PEG的連接子構造結合了乙基疊氮基作為第2原子團的含疊氮基的原子團。
Figure 02_image041
(式(P3)中，Gly表示甘胺酸，Pro表示脯胺酸，Asp表示天門冬胺酸，Cys表示半胱胺酸，Ala表示丙胺酸，Tyr表示酪胺酸，His表示組胺酸，Lys表示離胺酸，Glu表示麩胺酸，Leu表示白胺酸，Val表示纈胺酸，Trp表示色胺酸，Thr表示蘇胺酸，Phe表示苯丙胺酸)。
將該胜肽與製造例1所製作出的抗MUC5AC人源化抗體(抗體1)混合至醋酸鈉緩衝液(pH6.0)，使混合液在室溫下反應30分鐘，而得到含有胜肽修飾抗體的溶液。該胜肽修飾抗體，是抗體的Fc區被上述胜肽部位特異性地修飾而成。
(2)胜肽修飾抗體分離步驟 將該胜肽修飾抗體以1mol/L醋酸鈉緩衝液(pH6.0)稀釋，添加至ProteinA管柱(GE Healthcar公司製，HiTrap MabSelect SuRe)，讓含0.15mol/L氯化鈉的0.05mol/L醋酸鈉緩衝液(pH5.7)流過，回收兩分子胜肽被修飾的胜肽修飾抗體(二價抗體)，調整濃度以使所回收的部分中所含的二價抗體的濃度成為15mg/mL。然後，讓含0.15mol/L氯化鈉的0.05mol/L醋酸鈉緩衝液(pH3.5)流過ProteinA管柱，回收一分子胜肽被修飾的胜肽修飾抗體(一價抗體)，調整濃度以使所回收的部分中所含的一價抗體的濃度成為15mg/mL。
實施例1：經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體的製作 (1)抗體修飾步驟 另外，依照國際公開2017/217347號小冊子所記載的方法來製造抗體修飾胜肽，而得到含有由下述式(P3)表示的17個胺基酸殘基的胜肽。該胜肽的胺基酸序列，與序列識別號10的Xaa2為離胺酸殘基的序列相同，離胺酸殘基的側鏈末端胺基被由R 1所表示的構造修飾。另外，兩個半胱胺酸殘基互相形成雙硫鍵，胜肽的N末端透過具有縮二羥乙酸及8個PEG的連接子構造結合了乙基疊氮基作為第2原子團的含疊氮基的原子團。
Figure 02_image043
將該胜肽與製造例1所製作出的抗MUC5AC人源化抗體(抗體1)混合至醋酸鈉緩衝液(pH6.0)，使混合液在室溫下反應60分鐘，而得到含有胜肽修飾抗體的溶液。該胜肽修飾抗體，抗體的Fc區部位特異性地被上述胜肽修飾。
(2)胜肽修飾抗體分離步驟 將該胜肽修飾抗體以20mmol/L醋酸鈉緩衝液(pH6.0)稀釋，添加至ProteinA管柱(GE Healthcar公司製，HiTrap MabSelect SuRe)，讓含0.15mol/L氯化鈉的0.05mol/L醋酸鈉緩衝液(pH5.7)流過，回收兩分子胜肽被修飾的胜肽修飾抗體。然後，讓含0.15mol/L氯化鈉的0.05mol/L醋酸鈉緩衝液(pH4.2)流過，將一分子胜肽被修飾的胜肽修飾抗體(一價抗體)回收至預先加入1mol/L醋酸鈉緩衝液(pH6.0)的容器中。所回收的各部分，使用超過濾離心管(Merck公司製，型號：UFC903096)，將緩衝液置換成含0.1mol/L精胺酸的50mmol/L組胺酸緩衝液(pH6.1)。
(3)螯合修飾步驟 將本實施例所使用的螯合部的構造揭示於以下的式(L1-5)。使該螯合部溶解於作為溶劑且含0.1mol/L精胺酸的50mmol/L組胺酸緩衝液(pH6.1)，製作成含螯合部0.13mmol/L的分散液。 將該分散液與含胜肽修飾抗體的溶液混合，使其在37℃下進行點擊反應90分鐘，而得到螯合修飾抗體。螯合部及胜肽修飾抗體的濃度分別為56μmol/L及83μmol/L，第1原子團(DBCO)與第2原子團(疊氮化物)的莫耳比分別為1：1.3。將螯合修飾抗體的溶液使用超過濾離心管(Merck公司製，型號：UFC903096)來純化，並置換成含0.1mol/L精胺酸的50mmol/L組胺酸緩衝液(pH6.1)。
Figure 02_image045
(4)標記步驟 將經過上述各步驟所得到的螯合修飾抗體溶液，使用超過濾離心管(Merck公司製，型號：UFC803008)，置換成156mmol/L醋酸鈉緩衝液(pH6.0)，並將濃度調成19.48 mg/mL。將該溶液0.2mL、含 90Y離子作為放射性金屬源的溶液(0.04mol/L鹽酸水溶液、放射活性濃度8440MBq/mL、Eckert＆Ziegler製)0.01mL混合成反應液，使其在加熱條件下反應，而得到經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體溶液。螯合部與放射性金屬離子的莫耳比率為螯合部： 90Y離子=28：1，反應液的加熱溫度定為37℃，加熱時間定為30分鐘。
將所得到的經 90Y標記的抗體的溶液使用超過濾離心管(Merck公司製，型號：UFC803008)純化，以供後續實驗。純化後的經 90Y標記的抗體，放射化學純度為97.9%，放射化學產率為75.9%。此處，在以薄層層析來分析的情況，經 90Y標記的抗體的放射化學純度為相當於經 90Y標記的抗體的峰的放射活性計數相對於薄層板的總放射活性計數的比例(%)，經 90Y標記的抗體的放射化學產率為經 90Y標記的抗體的放射活性(無衰減修正)相對於標記反應開始時的放射活性的比例(%)。
實施例2：經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體的製作 將製造例1所製作出的抗MUC5AC人源化抗體，使用超過濾離心管(Merck公司製，型號：UFC803008)，置換成杜氏磷酸緩衝生理食鹽水，並使濃度成為5.07mg/mL。在塗佈了1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲的試管(Thermo Fisher Scientific公司製，型號：28601)中加入杜氏磷酸緩衝生理食鹽水0.648mL，及含 131I離子的溶液(碳酸鈉緩衝液、放射活性濃度2400MBq/mL、Institute of Isotopes公司製)0.185mL。在該試管中加入抗體溶液0.092mL，混合成反應液，使其在室溫下反應9分鐘，而得到經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體溶液。
將所得到的經 131I標記的抗體的溶液，藉由以含0.1mol/L精胺酸的0.05mol/L組胺酸緩衝液(pH6.1)平衡化的PD-10管柱(GE Healthcare公司製，型號：17-0851-01)來純化，以供後續實驗。純化後的經 131I標記的抗體，放射化學純度為98.5%，放射化學產率為86.5%。此處，在以薄層層析來分析的情況，經 131I標記的抗體的放射化學純度為相當於經 131I標記的抗體的峰的放射活性計數的相對於薄層板的總放射活性計數的比例(%)，經 131I標記的抗體的放射化學產率為經 131I標記的抗體的放射活性(無衰減修正)相對於標記反應開始時的放射活性的比例(%)。
實施例3：經β核種標記的抗MUC5AC人源化抗體對MUC5AC的結合性及特異性 依據實施例1製造出經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體。另外，依據實施例2製造出經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體。使用這些經β核種標記的抗MUC5AC人源化抗體，利用in vitro ARG來評估各經β核種標記的抗體對MUC5AC的結合性及特異性。
使MUC5AC高表現腫瘤(SW1990移植腫瘤組織)或MUC5AC低表現腫瘤(MIA PaCa-2移植腫瘤組織)在液態氮中冷凍，使用冷凍切片機(Leica公司製)，由冷凍塊製作出厚度7μm的切片，使用於in vitro ARG。
讓到使用前都保存在-80℃下的切片回到室溫，使其乾燥30分鐘以上，然後在磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘，接下來，在含1%(w/v)牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘，進行切片的親水化。 將各經β核種標記的抗體以含1%(w/v)牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成後述實施例4-1～4-5投予至荷瘤小鼠時的100倍的溶液，將此溶液約100μL滴在親水化的冷凍切片，靜置30分鐘。接下來，分別在含1%(w/v)牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬10分鐘，在磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬5分鐘，在磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬5分鐘，進行切片的洗淨。將洗淨後的切片風乾，以影像板(BAS-SR2040，富士軟片和光純藥公司製)使其曝光約30分鐘到2小時之間，使用氟影像分析儀(Typhoon FLA 7000，GE Healthcar公司製)，而得到自動放射顯影圖。
將結果的影像揭示於圖1及圖2。將MUC5AC高表現腫瘤切片及低表現腫瘤切片的各切片全體設定成ROI，使用所計算出的各腫瘤切片的ROI中的平均強度，計算出MUC5AC高表現腫瘤與低表現腫瘤的結合比。分別對高表現與低表現求得相對於標準射線源的強度比，然後將高表現之值除以低表現之值，計算出結合比。結果顯示，經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體在MUC5AC高表現腫瘤的結合與在低表現腫瘤的結合的結合比約為570倍。經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體在MUC5AC高表現腫瘤的結合與在低表現腫瘤的結合的結合比約為140倍，而得到不依存於添加的放射活性劑量的結果。此外，關於在MUC5AC低表現腫瘤的切片的結合，在與MUC5AC高表現腫瘤的切片相同尺度時無法確認結合，為了確認結合，必須使對比的上限由15000～20000左右降低至100～300左右。確認了經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體及經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體任一者皆保持對於MUC5AC的結合性及特異性。
實施例4-1～4-5及比較例1：經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體及經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體的藥效評估 將經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體及經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體投予至荷瘤小鼠，確認腫瘤成長抑制效果，並作檢討。此外，經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體及經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體分別依據實施例1及2來製造。
將人類胰臟癌細胞株SW1990的懸浮液與等量的基質膠(Corning公司製)混合液，以細胞數5×10 6個，在異氟醚麻醉下從側腹到背部皮下投予至BALB/c-nu/nu小鼠(雄性，日本SLC公司製)。SW1990移植9天後，腫瘤大小大概成為150～300mm 3的時間點，由小鼠尾靜脈投予各經β核種標記的抗體。將投予經 90Y標記或經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體時的腫瘤體積及體重揭示於表1。另外，腫瘤體積是由以下的計算式來計算。 腫瘤體積=((腫瘤的短徑) 2×腫瘤的長徑)/2
將經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體，以投予放射活性3.7MBq/隻(實施例4-1)或7.4MBq/隻(實施例4-2)投予至荷瘤小鼠，評估經 90Y標記的抗MUC5AC人源化抗體的性能。將經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體以投予放射活性3.7MBq/隻(實施例4-3)或7.4MBq/隻(實施例4-4)或14.8MBq/隻(實施例4-5)投予至荷瘤小鼠，評估經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體的性能。另外還設置投予含0.07%聚山梨醇酯80且含100mmol/L精胺酸的50mmol/L組胺酸緩衝液(pH6.1)中僅包含抗MUC5AC人源化抗體的溶液的組(抗體對照組)(比較例1)。此外，各經標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組是以與抗體對照組等量的抗體量投予至荷瘤小鼠的方式來調整放射活性濃度。各組為6隻，投予後7週、實施一般狀態的觀察、體重及腫瘤體積的測定。
Figure 02_image047
[評估1]腫瘤體積及重量的變化 將確認腫瘤體積的逐時變化的結果揭示於圖3。在投予後5週，與抗體對照組比較，結果觀察到在經 90Y標記的抗體的3.7MBq投予組(實施例4-1)、7.4MBq投予組(實施例4-2)及經 131I標記的抗體的3.7MBq投予組(實施例4-3)、7.4MBq投予組(實施例4-4)，腫瘤體積在統計學上明顯較低，確認了投予經β核種標記的抗體所產生的腫瘤成長抑制效果。另外，在經 131I標記的抗體的投予放射活性為14.8MBq的組(實施例4-5)，觀察到投予後體重顯著減少，在到達人道終點的時間點依序使其安樂死。
各經β核種標記的抗體投予組是在觀察期間最終日實施剖檢。抗體對照組是在腫瘤的平均體積超過2000mm 3的時間點實施剖檢。經 131I標記的抗體的投予放射活性為14.8MBq的組，在相對於投予時的體重的比例低於0.80的個體出現的時間點依序實施剖檢。採取腫瘤，除去血液等的滯留液體，實施實際腫瘤組織重量的測定。將比較腫瘤重量的結果揭示於表2。
Figure 02_image049
[評估2]體重變化 將確認體重的逐時變化的結果揭示於圖4，以及將各投予放射活性組的體重相對比例的最低值與其時間點揭示於表3。各經β核種標記的抗體投予組，在投予後約10天觀察到體重依存於投予放射活性的用量而減少，然而在實施例4-5以外的組，相對相投予時的平均體重的比例不低於0.85，沒有觀察到到達人道終點的毒性。另外，在投予後13天到36天之間，體重恢復至投予前以上。另一方面，實施例4-5出現多個個體投予後10天以後體重仍持續減少，相對於投予時的體重的比例低於0.80，因此判斷為觀察到到達人道終點的毒性，依序實施剖檢。
Figure 02_image051
[評估3]甲狀腺毒性 使用觀察期間結束時所採取的血漿樣品來評估甲狀腺毒性(使用Thyroxine (T4)(Mouse/Rat)ELISA Kit(BioVision公司製)測定血漿中的Thyroxine)。此外，實施例4-5使用了在到達人道終點的時間點採取的血漿樣品。 將關於甲狀腺毒性的結果揭示於圖5。實施例4-3(n=6)、實施例4-5(n=5)，觀察到與抗體對照組(n=6)相比，血漿中Thyroxine濃度統計學上明顯較低。實施例4-4(n=3)觀察到血漿中Thyroxine濃度減少的傾向。以上的結果說明投予經 131I標記的抗體誘發了甲狀腺毒性。另一方面，在經 90Y標記的抗體投予組(任一者皆為n=6)沒有觀察到在經 131I標記的抗體投予組觀察到的血漿中Thyroxine濃度降低，說明了投予經 90Y標記的抗體產生甲狀腺毒性的可能性低。
[評估4]病理學的評估 在觀察期間結束時，採取甲狀腺、大腿骨(包含大腿骨骨髓)。甲狀腺是將從咽喉頭到氣管上部包含甲狀腺的部位一起採取。大腿骨是採取左側大腿骨。甲狀腺是以20%中性緩衝福馬林固定1週以上。大腿骨是以布安液(bouin’s fluid)進行固定、脫鈣1週以上。甲狀腺不切出而直接包埋。大腿骨是以讓膝關節面出現的方式縱切然後包埋。然後，依據通用方法來薄切，製作出蘇木精-伊紅染色標本，實施病理組織學的評估。將結果揭示於圖6及圖7。 關於大腿骨，將各經β核種標記的抗體投予組與抗體對照組(比較例1)作比較(圖6)。實施例4-3觀察到骨端軟骨板下的海綿骨的減少，其程度是依照實施例4-4、實施例4-5的順序變強。亦即，在經 131I標記的抗體投予組，觀察到依存於投予放射活性的對骨骼的毒性。另一方面，在經 90Y標記的抗體投予組(實施例4-1及4-2)及抗體對照組(比較例1)沒有觀察到骨骼的變化。另外，在實施例4-4觀察到輕微的骨髓造血細胞減少，在實施例4-5，骨髓造血細胞顯著減少或消失。亦即，在經 131I標記的抗體投予組觀察到依存於投予放射活性的對骨髓的毒性。另一方面，在經 90Y標記的抗體投予組(實施例4-1及4-2)及抗體對照組(比較例1)沒有觀察到骨髓的變化。 關於甲狀腺，將各經β核種標記的抗體投予組與抗體對照組(比較例1)作比較(圖7)。在實施例4-3觀察到甲狀腺濾泡萎縮，而明顯的發炎性細胞浸潤或濾泡上皮壞死是到處可見的程度。在實施例4-4及實施例4-5觀察到各種程度的甲狀腺濾泡顯著萎縮或壞死･消失、甲狀腺組織纖維化、發炎性細胞浸潤，而其程度以實施例4-5為較嚴重。亦即，在經 131I標記的抗體投予組，觀察到依存於投予放射活性的甲狀腺毒性。另一方面，在經 90Y標記的抗體投予組(實施例4-1及4-2)及抗體對照組(比較例1)沒有觀察到甲狀腺的變化。
實施例5：經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的製作 (1)螯合劑合成步驟 本實施例所使用的螯合部的構造，與上述式(L1-5)相同。使該螯合劑分散於作為溶劑的0.156mol/L醋酸鈉緩衝液(pH5.5)中，製作成含螯合劑0.45mmol/L的分散液。將該分散液0.004mL、溶有0.225mmol/L龍膽酸的0.156mol/L醋酸鈉緩衝液(pH5.5)0.004mL及含 177Lu離子作為放射性金屬源的溶液(0.04mol/L鹽酸水溶液，放射活性濃度3.4GBq/mL，POLATOM公司調製，液量0.01mL，放射活性劑量3.73MBq)混合，在加熱條件下使其反應，而得到 177Lu錯合物溶液。螯合部與放射性金屬離子的莫耳比率為螯合部： 177Lu離子=約350：1，反應液的加熱溫度定為70℃，加熱時間定為5分鐘。
與實施例1的放射性複合體的放射化學純度測定同樣地，對於所得到的 177Lu錯合物進行放射化學純度測定。結果， 177Lu錯合物的放射化學純度為47.4%。所得到的 177Lu錯合物溶液直接使用於標記步驟。
(2)標記步驟 使經過上述步驟(1)所得到的未純化 177Lu錯合物的溶液以及以與實施例1同樣的方式所得到的包含抗MUC5AC人源化抗體的胜肽修飾抗體(一價抗體)的溶液，在37℃下進行點擊反應2小時，而得到經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體。 177Lu錯合物的量及胜肽修飾抗體(一價抗體)的量分別為1.8nmol及2.6nmol，DBCO基與疊氮基的莫耳比分別為約1：1.4。將未純化時的經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的反應率(%)揭示於以下的表4。 另外，將與實施例1同樣地使用超過濾離心管純化後的經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的放射化學純度(RCP)及放射化學產率(RCY)揭示於以下的表4。 經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的放射化學純度及放射化學產率的測定方法是與與實施例1同樣地實施。
Figure 02_image053
實施例6：製劑化步驟 對實施例5所得到的經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體溶液33μL添加放射活性濃度調整用的緩衝液(含0.7質量%聚山梨醇酯80且含100mmol/L精胺酸的50mmol/L組胺酸緩衝液、pH6.1)作稀釋，調成37MBq/mL。
[評估5]安定性評估 將實施例6所得到的經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體在室溫下保存4週，在各時間點(0天、1天、7天、14天、20天、27天)之中，評估放射化學純度。此外，製造結束後7天相當於約1個 177Lu半衰期，製造結束後14天相當於約2個 177Lu半衰期，製造結束後20天相當於約3個 177Lu半衰期，製造結束後27天相當於約4個 177Lu半衰期。
[評估5-1] 以薄層層析(TLC)來分析放射化學純度。TLC的條件與實施例1所使用的的條件同樣。將結果揭示於表5。
Figure 02_image055
實施例7：經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體對MUC5AC的結合性及特異性的評估 與實施例3同樣地評估經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體對MUC5AC的結合性及特異性。此外，經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體是依據實施例5來製造。
將結果的影像及圖形揭示於圖16及圖17。以與實施例3同樣的方法計算MUC5AC高表現腫瘤與低表現腫瘤的結合比的結果，經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體在MUC5AC高表現腫瘤的結合與在低表現腫瘤的結合相比，呈現約200倍的結合比，而得到不依存於添加的放射活性的結果。此外，在MUC5AC低表現腫瘤的切片的結合，在與高表現腫瘤的切片相同尺度時無法確認，為了確認結合，必須使對比的上限由7000～10000左右降低至300左右。由這些結果，確認了經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體保持著對於MUC5AC的結合性及特異性。
實施例8-1～8-3及比較例2：經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的藥效評估 將經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予至荷瘤小鼠，確認腫瘤成長抑制效果，並作檢討。此外，經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體是依據實施例5來製造。
荷瘤小鼠是以與實施例4-1～4-5同樣方式來製作。將經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體以投予放射活性7.4MBq/隻(實施例8-1)、11.1MBq/隻(實施例8-2)或16.7MBq/隻(實施例8-3)投予至荷瘤小鼠，評估經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的性能。另外還設置了投予在含0.07%聚山梨醇酯80且含100mmol/L精胺酸的50mmol/L組胺酸緩衝液(pH6.1)中僅包含抗MUC5AC人源化抗體的溶液的組(抗體對照組)(比較例2)。此外，經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組是以與抗體對照組等量的抗體量投予至荷瘤小鼠的方式來調整放射活性濃度。7.4MBq投予組(實施例8-1)為5隻，其他的組為6隻，與實施例4-1～4-5同樣地，在投予後7週實施一般狀態的觀察、體重及腫瘤體積的測定。將投予經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體時的腫瘤體積及體重揭示於表6。
Figure 02_image057
[評估1]腫瘤體積及重量的變化 將確認腫瘤體積逐時變化的結果揭示於圖18。在觀察期間的最終日與抗體對照組比較的結果，經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的投予組，全部的組皆觀察到腫瘤體積在統計學上明顯較低，確認了經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的投予產生腫瘤成長抑制效果。在觀察期間的最終日全組實施剖檢，採取腫瘤，除去血液等的滯留液體，測定實際腫瘤組織重量。將比較腫瘤重量的結果揭示於表7。經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的投予組，全部的組皆觀察到與抗體對照組相比，實際腫瘤組織重量在統計學上明顯較低，確認了經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的投予產生腫瘤成長抑制效果。另外，16.7MBq投予組(實施例8-3)之中的一個個體在投予後觀察到體重顯著減少，因此在投予後19天的時間點使其安樂死，實施剖檢。
Figure 02_image059
[評估2]體重變化 將確認體重逐時變化的結果揭示於圖19，以及將各投予放射活性組投予時體重的相對比例的最低值與其時間點揭示於表8。在各經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組，投予後約8天觀察到體重依存於投予放射活性的用量而減少，然而各組的相對於投予時的平均體重的比例並不低於0.85。所以，沒有觀察到7天呈現25%以上的體重減少的人道終點的一個指標的毒性。
Figure 02_image061
[評估3]甲狀腺毒性 使用在觀察期間結束時或觀察期間途中安樂死時採取到的血漿樣品，評估甲狀腺毒性。甲狀腺毒性是藉由使用Thyroxine (T4)(Mouse/Rat)ELISA Kit(BioVision公司製)測定血漿中Thyroxine來作評估。將關於甲狀腺毒性的結果揭示於圖20。在經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組沒有觀察到在實施例4-3～4-5經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組觀察到的血漿中Thyroxine濃度降低，說明了經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予產生甲狀腺毒性的可能性低。
[評估4]病理學的評估 在觀察期間結束時或觀察期間途中安樂死時採取甲狀腺、大腿骨(包含大腿骨骨髓)。與「實施例4-1～4-5、比較例1」同樣地操作，實施病理組織學的評估。將結果揭示於圖21及圖22。關於大腿骨，將各經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組與抗體對照組(比較例2)作比較(圖21)。在經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組(實施例8-1～8-3)及抗體對照組(比較例2)沒有觀察到實施例4-3～4-5經 131I標記的抗體投予組觀察到的依存於投予放射活性的骨毒性。在經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體的7.4MBq(實施例8-1)、11.1MBq(實施例8-2)投予組及抗體對照組(比較例2)沒有觀察到骨髓的變化。在16.7MBq投予組(實施例8-3)觀察期間結束時剖檢的5例中的1例觀察到骨髓造血細胞輕微減少。在觀察期間途中安樂死的1例觀察到骨髓造血細胞顯著減少。 關於甲狀腺，將各經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組與抗體對照組作比較(圖22)。在經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組(實施例8-1～8-3)及抗體對照組(比較例2)，沒有觀察到在實施例4-3～4-5經 131I標記的抗MUC5AC人源化抗體投予組觀察到的投予放射活性依存的甲狀腺毒性。
實施例9：使用經 89Zr標記的DOTAGA-DBCO製造經 89Zr標記的抗MUC5AC人源化抗體(HPLC純化) (1-1.螯合劑合成步驟) 在本實施例中，使用了與由上述式(L1-5)表示的螯合部相同的螯合部。使該螯合部在DMSO溶液中分散，製作成含螯合部2.0mmol/L的分散液。將該分散液0.150mL、含 89Zr離子作為放射性金屬源的溶液(0.1mol/L鹽酸水溶液，放射活性濃度1335MBq/mL，由日本Medi-Physics股份有限公司調製，液量0.100mL)134MBq與含300mmol/L龍膽酸的780mmol/L醋酸緩衝液0.050mL混合成反應液，使其在加熱條件下反應，而得到 89Zr錯合物溶液。螯合部與放射性金屬離子的莫耳比率，螯合部： 89Zr離子=約3333：1，反應液的加熱溫度為70℃、加熱時間為60分鐘。
對於所得到的 89Zr錯合物，藉由以下的方法來測定放射化學純度。亦即，將一部分 89Zr錯合物溶液以薄層層析(Agilent公司製，型號：SGI0001，展開溶劑：乙腈/水混合液(體積比1：1))展開，然後，以放射γ-TLC分析儀(raytest製，MODEL GITA Star PS)作測定。將原點附近偵測到的峰的放射活性(count)相對於所偵測到的總放射活性(count)的百分率定為 89Zr錯合物的放射化學純度(%)。結果， 89Zr錯合物的放射化學純度為98%。
(1-2. 89Zr錯合物純化步驟) 使用高效液相層析(HPLC)來分離上述(1-1.螯合劑合成步驟)所得到的 89Zr錯合物溶液，除去未反應的DOTAGA -DBCO。將所得到的分離液溶劑餾除至約30μL，使用於標記步驟。經 89Zr錯合物標記的抗體在未反應物除去步驟中的放射化學產率(HPLC回收率)的測定方法如以下所述。亦即，相對於本步驟開始時的進料放射活性劑量，將分離液的放射活性的百分率定為未反應物除去步驟的HPLC回收率(%)。
HPLC條件如以下所述，分離出保持時間27分鐘附近的部分。 ＜HPLC條件＞ 偵測器：紫外吸光光度計(測定波長：220nm、254nm)/閃爍偵測器 管柱：XBridge C18 3.5μm，4.6×100mm，Waters製 流量：每分鐘0.5mL 面積測定範圍：試樣注入後45分鐘 移動相A：10mmol/L組胺酸緩衝液pH6.5 移動相B：液相層析用乙腈 移動相C：乙腈/水混液(1：1) 移動相的送液：如以下的方式改變移動相A、移動相B及移動相C混合比，進行濃度梯度控制。
Figure 02_image063
(2.標記步驟) 將經過上述各步驟所得到的 89Zr錯合物的溶液以及以與製造例2同樣的方式製造出的含胜肽修飾抗體(一價抗體；H01L03)的溶液混合，使其在37℃下進行點擊反應1.5小時，而得到經 89Zr錯合物標記的抗體。含 89Zr標記錯合物之螯合部及胜肽修飾抗體(一價抗體)的量分別為73pmol及50nmol，第1原子團(DBCO)與第2原子團(疊氮化物)的莫耳比分別約為1：685。 進一步使其在37℃下反應1.5小時，將所得到的經 89Zr錯合物標記的抗體的溶液使用超過濾離心管(Merck公司製，型號：UFC505096)來純化。純化後的經 89Zr錯合物標記的抗體，放射化學純度為95%，放射化學產率為50%。經 89Zr錯合物標記的抗體的放射化學純度及放射化學產率的測定方法如以下所述。亦即，進行薄層層析(Agilent公司製，型號：SGI0001，展開溶劑為乙腈與0.1mmol/L EDTA溶液的混合液(體積比1：1))，並以放射γ-TLC分析儀(raytest製，MODELGITA Star PS)來測定，將原點附近偵測到的峰的放射活性(count)相對於所偵測到的總放射活性(count)的百分率定為放射化學純度(%)。另外，將超過濾離心純化後回收的放射活性相對於標記步驟開始時加算的總放射活性的百分率定為放射化學產率(%)。
實施例10：使用經 89Zr標記的DOTAGA-DBCO製作出的經 89Zr標記的抗MUC5AC人源化抗體的PET-CT造影 使用經 89Zr標記的DOTA-Bn-DBCO及DOTAGA-DBCO，依據實施例8製造出經 89Zr標記的抗體，分別投予至荷瘤小鼠，使用PET-CT造影來實施評估。 將來自人類胰臟癌且為MUC5AC高表現腫瘤細胞株的SW1990 0.7×10 7個，從側腹到背部皮下投予至BALB/c-nu/nu小鼠(雄性、日本SLC公司製)。在移植後的腫瘤體積成為大概150～300mm 3的時間點，由小鼠尾靜脈投予各種經 89Zr標記的抗MUC5AC人源化抗體。此外，腫瘤體積是由以下的計算式來計算。 腫瘤體積=((腫瘤的短徑) 2×腫瘤的長徑)/2 將所投予的各種經 89Zr標記的抗MUC5AC人源化抗體的放射化學純度及動物資訊揭示於表7。
Figure 02_image065
PET-CT造影(小動物用PET-CT裝置：Si78，Bruker公司製)，是依照下表的條件來實施。拍攝PET及CT的時間點為投予後12、48、84、168、252小時。關於影像的重構，PET是藉由MLEM法，CT是藉由FBP法來實施。實施各時間點的腫瘤及心臟(血液)、肝臟的SUV (standardized uptake value)的VOI解析，並由time activity curve比較SUV的變遷。
Figure 02_image067
Figure 02_image069
將投予各經 89Zr標記的抗體後48小時實施PET-CT攝影的結果揭示於圖8。將各時間點的腫瘤及心臟(血液)、肝臟實施VOI解析的結果揭示於圖9。並且將各時間點的腫瘤肝臟比的結果揭示於圖10。 在腫瘤的聚積的最大值，以SUV計，任一者皆在2.8以上，投予後84小時的腫瘤肝臟比的最大值，使用經 89Zr標記的DOTA-Bn-DBCO所製作出的經 89Zr標記的抗體為3.6，使用經 89Zr標記的DOTAGA-DBCO所製作出的經 89Zr標記的抗體為3.4。各值沒有觀察到統計學上的顯著差異。觀察到各種經 89Zr標記的抗體在心臟(血液)的聚積逐時減少，確認投予後252小時大致從血液中消失。並且，關於各種經 89Zr標記的抗體各時間點在心臟(血液)的聚積，各種抗體之間沒有觀察到統計學的顯著差異。同樣地，觀察到各種經 89Zr標記的抗體在肝臟及肌肉的聚積也逐時地減少，關於各種經 89Zr標記的抗體在各時間點在各組織的聚積，各種抗體之間沒有觀察到統計學上的顯著差異。
實施例11：使用經In-111( 111In)標記的抗體篩選人源化抗體 實施例11-1：經 111In標記的抗體的調製 為了找到腫瘤聚積能力高且最大耐用量高的抗MUC5AC抗體，將各種抗體以 111In來標記，投予至荷瘤小鼠，進行SPECT-CT攝影，由所得到的影像計算出腫瘤及肝臟的累積放射活性及吸收劑量，進行比較。 抗體是使用製造例1所製作出的4種抗MUC5AC人源化抗體與專利文獻1所揭示的1種抗MUC5AC嵌合抗體，並以 111In來標記。 專利文獻1所揭示的嵌合抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的胺基酸序列(分別為序列識別號23及24)如以下所述。 111In標記，是對於具有由下述式所表示的構造之標記前驅物與各種抗體的複合體來進行。
Figure 02_image071
Figure 02_image073
上述標記前驅物，具有作為螯合部的DOTA透過8個聚乙二醇來連結於抗體修飾胜肽(具有與序列識別號10的Xaa2為離胺酸殘基的序列相同的序列且包含17個胺基酸殘基的胜肽)的N末端，且透過該構造中的N-羥基琥珀醯亞胺酯基連結於各種抗體中Eu編號第252位的離胺酸殘基的構造。 使該標記前驅物450μg溶解於作為溶劑的100mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸緩衝液(pH5.5)。將該溶液與含有 111In離子作為放射性金屬源的溶液(氯化銦( 111In)注射液，日本Medi-Physics公司製)以放射活性劑量10MBq混合，在45℃下進行標記反應2小時。
將各種經 111In標記的抗體的放射化學產率、放射化學純度、投予至動物的放射活性揭示於表13。此處所謂的放射化學產率，是經 111In標記的抗體的放射活性相對於所使用的 111In的放射活性。放射活性測定是使用放射性同位素劑量校正器(CAPINTEC公司製，型號：CRC-15R)。放射化學純度，在以濾紙層析來分析的情況，是指相當於經 111In標記的抗體的峰的放射活性計數相對於濾紙的總放射活性計數的比例(%)。濾紙層析的濾紙為ADVANTEC公司製，型號：No.590，展開溶劑：以0.01% EDTA、50mM檸檬酸-檸檬酸鈉水溶液來展開，放射活性計數的偵測是使用放射γ-TLC分析儀(raytest製，MODEL GITA Star)。
Figure 02_image075
實施例11-2：使用荷瘤小鼠的體內分佈
(荷瘤小鼠的製作方法) 將人類胰臟癌細胞株SW1990 0.7×10 7個，從側腹到背部皮下投予至BALB/c‐nu/nu小鼠(雄性，日本SLC公司製)。 在移植SW1990 14天後的腫瘤大小成為大概150～300mm 3的時間點，由小鼠尾靜脈投予實施例10-1所調製出的各種經 111In標記的抗體。另外，腫瘤體積是由以下的計算式來計算。 腫瘤體積=((腫瘤的短徑) 2×腫瘤的長徑)/2
Figure 02_image077
(評估方法) SPECT-CT造影(小動物用SPECT-CT裝置：FX-3000，Trifoil公司製)是依照下表的條件來實施。攝影的時間點是在投予後1、6、24、48、72、168小時後。關於影像的重構，SPECT是以OSEM法，CT是以FBP法來實施。對各時間點的腫瘤及肝臟實施VOI(volume of interest，3維ROI)解析。將每單位臟器體積的計數修正成%ID/g，並將物理半衰期由 111In換算為 225Ac以修正物理學半衰期的差，進一步考量生物學半衰期，而得到time activity curve。由該time activity curve的積分值計算出累積放射活性，以球體模型(OLINDA/EXM ver2.0)計算出吸收劑量，對各抗體作比較檢討。但是，H01L03在投予後168小時沒有觀察到time activity curve的減少，因此不考慮生物學半衰期，只考量物理半衰期。
Figure 02_image079
Figure 02_image081
(結果) 將實施SPECT-CT攝影的結果揭示於圖11。將各時間點的腫瘤及肝臟實施VOI解析的結果揭示於圖12。將表示投予後168小時後的SPECT-CT攝影結束後的體內分佈･排出途徑的確認結果之圖形揭示於圖13。 在腫瘤的聚積，在使用人源化抗體(H01L03)的情況最高，另一方面，使用嵌合抗體的情況最低。在肝臟的聚積是使用嵌合抗體的情況最高，在使用人源化抗體的情況，任一者與嵌合抗體相比皆較低。在使用人源化抗體(H01L03)的情況，排出最慢，血液滯留性高。在使用任一種抗體的情況，在正常臟器的肝臟及脾臟的聚積高，然後是在肺及腎臟的聚積高。
在將肝臟的閾值劑量設定為30Gy的情況，最大耐用量，在使用人源化抗體(H01L03)的情況為高達3.90MBq之值，另一方面，在使用嵌合抗體的情況為低達0.43MBq之值。最大耐用量(MBq)是以閾值劑量(Gy)/吸收劑量(Gy/MBq)來計算。
實施例11-3：in vitro 自動放射攝影術 將使用實施例11-1所調製出的各種經 111In標記的抗體，利用in vitro 自動放射攝影術(ARG)評估各種抗體對MUC5AC的結合性及特異性的影像結果揭示於圖14。另外，將整個切片設定成感興趣區域(ROI)，將所計算出的ROI中的放射活性密度(Bq/mm 2)的數值的圖形揭示於圖15。 使MUC5AC高表現腫瘤(SW1990移植腫瘤組織)或MUC5AC低表現腫瘤(MIAPaCa2移植腫瘤組織)在液態氮中冷凍，使用冷凍切片機(Leica公司製)由冷凍塊製作出厚度10μm的切片，使用於in vitro ARG。 使到使用時為止都保存在-80℃下的切片回到室溫，乾燥30分鐘以上，然後在磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘，接下來在含有1體積%牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘，進行切片的親水化。 將親水化後的冷凍切片分別在含有各種經 111In標記的抗體5kBq/mL且含有1體積%牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘。接下來，依照含有1體積%牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水的順序，在各溶液中浸漬各5分鐘，進行切片的洗淨。將洗淨後的切片風乾，以影像板(BAS-SR2040、富士軟片和光純藥公司製)曝光約15小時，使用氟影像分析儀(Typhoon FLA 7000，GE Healthcar公司製)，而得到自動放射顯影圖。將所得到的自動放射顯影圖，使用氟影像分析儀附屬的解析軟體「Image Quant TL」，將整個切片設定成感興趣區域(ROI)，計算出ROI中的放射活性密度(Bq/mm 2)。 確認了經 111In標記的所有人源化抗體保持著對於MUC5AC的結合性及特異性(參考圖15、MUC5AC高表現腫瘤的數據)。確認了與嵌合抗體相比，各種人源化抗體的非特異性鍵結較少(參考圖15、MUC5AC低或未表現腫瘤的數據)。 由實施例11-2、11-3的結果判明了，人源化抗體，與嵌合抗體相比，對MUC5AC的特異性較高，而且具有在腫瘤的高聚積性與在肝臟等的正常臟器的低聚積性，因此可提供經RI標記的抗體更優異的遞輸技術。
將本實施例的結果統整於下表。表中，SPECT的吸收劑量，是假設腫瘤體積為150mm 3來計算。另外，肝臟的吸收劑量，是根據本實施例所使用的小鼠肝臟重量的平均值(1.15±0.14g、n=19)來計算。體內分佈的數值是以n=4的平均±標準差來表示(但是，H02L04為n=3)。
Figure 02_image083
以上參考實施形態對本發明作了說明，然而本發明並不受上述實施形態限定。本發明的構成或細節，在本發明的觀點內，可作業界人士能理解的各種變更。 包括此處敘述的專利及專利申請說明書的所有刊行物所記載的內容，藉由引用於此，其全部內容以與明示相同的程度被收錄於本說明書中。 [產業上的可利用性]
本發明之經RI標記的抗MUC5AC人源化抗體，特異性與在腫瘤的聚積性優異，因此對於MUC5AC過度表現的疾病，尤其是癌症的治療及/或診斷極為有用。
本申請是以在日本申請的特願2021-072201 (申請日：2021年4月21日)為基礎，其全部內容被包含於本說明書中。
[圖1]為表示使用MUC5AC高表現腫瘤的切片得到的in vitro ARG的結果之圖。對於各條件，將各經β核種標記的抗體以含1%(w/v)牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成投予至小鼠時的100倍的溶液，準備滴入該溶液5μL的濾紙，將整個濾紙設定成ROI，以其平均強度為對比的上限(上限值15000～20000左右)來正規化，所得到的影像以表示於圖。 [圖2]為表示各經β核種標記的抗體之MUC5AC高表現腫瘤切片相對於MUC5AC低表現腫瘤切片的結合比之圖。誤差線為標準差，n=3，以Tukey法實施檢定。 [圖3]為表示確認投予各經β核種標記的抗體之後荷瘤小鼠的腫瘤體積逐時變化的結果之圖。誤差線為標準差，n=6(經 131I標記的抗體的投予放射活性為14.8MBq的組，在投予後13、21、23天各對兩隻實施剖檢)，以Tukey法實施檢定。 [圖4]為表示投予各經β核種標記的抗體之後荷瘤小鼠的體重逐時變化之圖。 [圖5]為表示調查投予各經β核種標記的抗體之後荷瘤小鼠的甲狀腺毒性的結果之圖。甲狀腺毒性是評估血漿中的Thyroxine濃度。誤差線為標準差，n=6(經 131I標記的抗體的投予放射活性為7.4MBq的組、14.8MBq的組分別為n=3、n=5)，以Steel法實施檢定。 [圖6]為表示對於投予各經β核種標記的抗體之後的荷瘤小鼠實施病理組織學評估的結果之圖(大腿骨代表性的蘇木精-伊紅染色像)。各圖左下的黑線為比例尺(200 μm)。 [圖7]為表示對於投予各經β核種標記的抗體之後的荷瘤小鼠實施病理組織學評估的結果之圖(甲狀腺的代表性蘇木精-伊紅染色像)。各圖左下的黑線為比例尺(200 μm)。 [圖8]為表示在投予各經 89Zr標記的抗體之後48小時實施PET-CT攝影的結果的影像。 [圖9]為表示由使用經 89Zr標記的DOTA-Bn-DBCO  (－■－)及經 89Zr標記的DOTAGA-DBCO(⋯●⋯)所製作出的經 89Zr標記的各抗體的SPECT影像得到的各時間點(12、48、84、168及252小時)的腫瘤(上段圖)、心臟(中段圖)及肝臟(下段圖)的VOI(volume of interest、三維ROI)解析結果之圖。 [圖10]為表示投予使用經 89Zr標記的DOTA-Bn-DBCO(－●－)及經 89Zr標記的DOTAGA-DBCO(⋯●⋯)所製作出的經 89Zr標記的各抗體後的各時間點(12、48、84、168及252小時)，由在腫瘤及肝臟的聚積計算出腫瘤肝臟比的結果之圖。 [圖11]為表示使用經 111In標記的各抗體實施SPECT-CT造影的結果之圖。表示經 111In標記的各抗體的SPECT影像。 [圖12]為表示由經 111In標記的各抗體的SPECT影像得到的各時間點的腫瘤及肝臟的VOI(volume of interest、三維ROI)解析結果之圖。 [圖13]為表示投予經 111In標記的各抗體，確認168小時後的體內分佈及排出途徑的結果之圖。 [圖14]為表示比較經 111In標記的各抗體利用in vitro ARG進行的結合能力的結果的影像。 [圖15]為表示將經 111In標記的各抗體利用in vitro ARG進行的結合能力定量化並且作比較的結果之圖。 [圖16]為表示使用MUC5AC高表現腫瘤(SW1990)的切片的in vitro ARG的結果之圖。將經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體以含1%(w/v)牛血清蛋白素的磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成投予至小鼠時的100倍的溶液，準備滴入該溶液5μL的濾紙，將整個濾紙設定成ROI，以其平均強度為對比的上限(上限值7000～10000左右)來正規化，將所得到影像表示於圖。 [圖17]表示經 177Lu標記的抗MUC5AC人源化抗體之MUC5AC高表現腫瘤切片相對於MUC5AC低表現腫瘤切片的結合比之圖。誤差線為標準差。 [圖18]為表示確認投予經 177Lu標記的抗體之後，荷瘤小鼠的腫瘤體積逐時變化的結果之圖。誤差線為標準差，n=6(投予放射活性為7.4MBq的組為n=5。投予放射活性為16.7MBq的組其中有1隻在投予後19天實施剖檢)，以Steel法實施檢定。 [圖19]為表示經 177Lu標記的抗體投予之後，荷瘤小鼠的體重逐時變化之圖形。 [圖20]為表示投予經 177Lu標記的抗體之後調查荷瘤小鼠的甲狀腺毒性的結果之圖。甲狀腺毒性是評估血漿中的Thyroxine濃度。誤差線為標準差，n=6(投予放射活性為7.4MBq的組為n=5)。 [圖21]為表示對於投予經 177Lu標記的抗體之後的荷瘤小鼠實施病理組織學評估的結果之圖(大腿骨之代表性的蘇木精-伊紅染色像)。各圖左下的黑線為比例尺(200 μm)。實施例8-3的圖中所示的箭號表示骨髓造血細胞的減少處。 [圖22]為表示對於投予經 177Lu標記的抗體之後的荷瘤小鼠實施病理組織學評估的結果之圖(甲狀腺之代表性的蘇木精-伊紅染色像)。各圖左下的黑線為比例尺(200 μm)。 

          <![CDATA[<110>  日本醫事物理股份有限公司 (NIHON MEDI-PHYSICS CO., LTD.)]]>
                 住友製藥股份有限公司 (Sumitomo Pharma Co., Ltd.)
          <![CDATA[<120>  經放出β射線之核種標記之人源化抗體]]>
          <![CDATA[<130>  093250]]>
          <![CDATA[<150>  JP2021-072201]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-21]]>
          <![CDATA[<160>  26    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化抗體重鏈可變區 1 (H01) ]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列   ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化]]>抗體重鏈可變區 2 (H02)
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化抗體重鏈可變區 3  (H03)]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化抗體重鏈可變區 4 (H04)]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化抗體輕鏈可變區1 (L01)]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
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          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列    ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化抗體輕鏈可變區2 (L02)]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人源化抗體輕鏈可變區3 (L03)]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列    ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人源化抗體輕鏈可變區4 (L04)]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Phe Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特]]>性
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半]]>胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  ]]>(8)..(8)
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗體修飾胜肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為同半胱胺酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  其他特性]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、]]>
                 2-胺基栓酸或二胺基丙酸
          <![CDATA[<220]]>>]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  其他特性]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (16)..(16)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  Xaa為同半胱胺酸]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  22]]&gt;
          <br/>
          <br/><![CDATA[Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 
          1               5                   10                  15      
          His 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  嵌合抗體重鏈可變區7 (H07)]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Pro Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  嵌合抗體輕鏈可變區8 (L08)]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Tyr Leu Asn Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈恆定區]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈恆定區]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018

Claims (16)

  1. 一種複合體，其係放射性核種與抗體之複合體，並且 前述放射性核種為放出β射線之核種， 前述抗體為特異性地結合於黏蛋白亞型5AC之人源化抗體，且為具有 由(1)序列識別號1表示的胺基酸序列(H01)或與序列識別號1表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列、 (2)序列識別號2表示的胺基酸序列(H02)或與序列識別號2表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列、 (3)序列識別號3表示的胺基酸序列(H03)或與序列識別號3表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或 (4)序列識別號4表示的胺基酸序列(H04)或與序列識別號4表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列 所形成的重鏈可變區，及 由(5)序列識別號5表示的胺基酸序列(L01)或與序列識別號5表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列、 (6)序列識別號6表示的胺基酸序列(L02)或與序列識別號6表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列、 (7)序列識別號7表示的胺基酸序列(L03)或與序列識別號7表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列、或 (8)序列識別號8表示的胺基酸序列(L04)或與序列識別號8表示的胺基酸序列有95%以上的序列相同性之胺基酸序列 所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。
  2. 如請求項1之複合體，其中前述抗體係具有 由(1)序列識別號1表示的胺基酸序列(H01)、 (2)序列識別號2表示的胺基酸序列(H02)、 (3)序列識別號3表示的胺基酸序列(H03)、或 (4)序列識別號4表示的胺基酸序列(H04)所形成的重鏈可變區，及 由(5)序列識別號5表示的胺基酸序列(L01)、 (6)序列識別號6表示的胺基酸序列(L02)、 (7)序列識別號7表示的胺基酸序列(L03)、或 (8)序列識別號8表示的胺基酸序列(L04)所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。
  3. 如請求項1之複合體，其中前述抗體係具有 由(1)序列識別號1表示的胺基酸序列(H01)所形成的重鏈可變區，及 由(7)序列識別號7表示的胺基酸序列(L03)所形成的輕鏈可變區之人源化抗體。
  4. 如請求項1之複合體，其中放出β射線的前述核種為碘-131、釔-90或鎦-177。
  5. 如請求項1之複合體，其中前述複合體包含螯合放射性核種的螯合劑， 前述放射性核種為放出β射線的金屬核種。
  6. 如請求項5之複合體，其中前述放出β射線的金屬核種為釔-90。
  7. 如請求項5之複合體，其中前述放出β射線的金屬核種為鎦-177。
  8. 如請求項5之複合體，其中相對於前述抗體一分子，具備前述螯合劑一分子以上8分子以下。
  9. 如請求項5之複合體，其中前述螯合劑透過連接子部位特異性地修飾前述抗體的Fc區。
  10. 如請求項9之複合體，其中前述連接子係由下述式(i)表示，包含由13個以上17個以下的胺基酸殘基所形成的胜肽，並且藉由經交聯劑修飾的前述胜肽與前述抗體的交聯反應所形成，
    Figure 03_image001
    (式中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續的a個X、連續的b個X、連續的c個X及連續的d個X， X為側鏈不具有硫醇基及鹵乙醯基之任一者之胺基酸殘基， a、b、c及d各自獨立地為1以上5以下的整數，且滿足a+b+c+d≦14， Xaa1及Xaa3各自獨立地表示來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基、 或一者表示來自側鏈具有硫醇基的胺基酸之胺基酸殘基，另一者表示來自側鏈具有鹵乙醯基的胺基酸之胺基酸殘基，且Xaa1與Xaa3連結， Xaa2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基栓酸或二胺基丙酸，且經前述交聯劑修飾)。
  11. 如請求項5之複合體，其中前述螯合劑具有來自下述式(A)表示的化合物或其鹽之構造，
    Figure 03_image003
    (式(A)中，R 11、R 13及R 14各自獨立地為由 -(CH 2) pCOOH、-(CH 2) pC 5H 5N、-(CH 2) pPO 3H 2、 -(CH 2) pCONH 2、或-(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所形成的基團，R 12或R 15的一者為氫原子、羧基，或碳數2或3之羧烷基，另一者為用來與前述抗體複合體化的取代基，p為0以上3以下的整數，在R 12為用來與前述抗體複合化的取代基時，R 15為氫原子，在R 12並非用來與前述抗體複合化的取代基時，R 15為用來與前述抗體複合化的取代基)。
  12. 一種放射性醫藥，其係含有如請求項1～11中任一項之複合體作為有效成分。
  13. 如請求項12之放射性醫藥，其係使用於癌的RI體內療法。
  14. 如請求項13之放射性醫藥，其中前述核種為碘-131， 在前述RI體內療法之中，用來對於對象以每次100MBq/kg以下的投予量投予。
  15. 如請求項13之放射性醫藥，其中前述核種為釔-90， 在前述RI體內療法之中，用來對於對象以每次50MBq/kg以下的投予量投予。
  16. 如請求項13之放射性醫藥，其中前述核種為鎦-177， 在前述RI體內療法之中，用來對於對象以每次50MBq/kg以下的投予量投予。
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