KR100998803B1 - 피브로넥틴의 ｅｄｂ 도메인 특이적 항체를 포함하는콘쥬게이트 및 종양의 감지 및 치료를 위한 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 방사성핵종을 결합하는 펩티드를 이용한 종양의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 펩티드는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)를 위한 항원-결합 부위를 포함한다.
방사성핵종, 피브로넥틴, 도메인 B (ED-B)
Description
본 발명은 방사성핵종에 결합하는 신규한 펩티드를 사용한 종양의 진단 및 치료를 위한 새로운 방법에 관한 것이다.
종양은 새로운 혈관의 생성 (혈관신생) 없이 소정의 중량 보다 무거워질 수 없고, 미세관 밀도 및 종양 침투성 사이의 관련성이 다수의 종양에 대해 보고되어 있다 (Folkman (1995), Nature Med., 1, 27-31). 더욱이, 혈관신생은 대다수의 안과 질환과 관련되어 시력의 손실을 초래한다 (Lee et al., Surv. Ophthalmol. 43, 245-269 (1998); Friedlander, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 9764-9769 (1996)). 혈관신생의 표지를 선택적으로 표적할 수 있는 분자는 종양 및 혈관 증식으로 특징되는 다른 질병, 예를 들면 당뇨병성 망막증 및 노화-관련 황반변성의 진단 및 치료를 위한 임상적 기회를 제공할 것이다. 혈관신생의 표지는 종양 혈관과 관련된 대다수의 공격적 고형 종양에 발현되고 따라서 정맥 내로 주사되는 특이한 결합체에 쉽게 접근될 것이다 (Pasqualini et al., (1997), Nature Biotechnol., 15, 542-546; Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1275). 신생혈관구조의 표적 폐색은 종양 경색 및 붕괴를 초래할 수 있다 (O'Reilly et al. (1996), Nature Med., 2, 689-692; Huang et al. (1997), Science, 275, 547-550).
피브로넥틴 분자로 별법적 스프라이싱에 의해 삽입되는, 생쥐, 쥐 및 인간에서 동일한 91개 아미노산 서열인 피브로넥틴의 ED-B 도메인은 신생혈관구조 주위에 특이적으로 축적되고 (Castellani et al. (1994), Int. J. Cancer 59, 612-618) 분자적 중재를 위한 표적이 될 수 있다. 실로, 항-ED-B 단쇄 Fv 항체 단편 (scFv)이 종양 가진 생쥐의 종양 혈관 주위에 선택적으로 축적되고, 항체 친화도가 표적 성능을 아마도 결정한다는 것을 형광 기술로 최근 밝혔다 (Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1275; WO 97/45544).
추가로, 나노몰 이하의 해리 상수를 가진 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편 뿐만 아니라 그의 방사성동위원소 표지된 유도체는 WO 99/58570에 기재되어 있다. 고-친화도 인간 항체 단편 중의 하나인 L19로 불리는 125I로 표지된 항체 단편의 생체분포는 종양 가진 생쥐에서 이미 연구되었다 (Tarli et al., Blood, Vol. 94, No. 1 (1999), p. 192-198). L19-항체를 포함하는 방사성동위원소 표지된 콘쥬게이트 및 혈관신생의 감지 및 치료를 위한 그의 용도는 WO 01/62800에 개시되어 있다.
피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 피브로넥틴의 B-동종체의 ED-B 도메 인에 결합하는 기능화된 단쇄 Fv 항체 단편의 재조합 제조는 이미 기술되어 있다 (Marty et al., Protein Expression and Purification 21, 156-164 (2001)).
추가로, scFv 항체 단편과 99mTc와의 C-말단 시스테인 펩티드를 통한 방사성동위원소 표지는 문헌 [George et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92 pp. 8358-8362, 1995, 및 Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp. 868-872, 1996]에 기재되어 있다.
그러나, 방사성핵종이 방사성의 약품에 특히 적절하기 때문에, 향상된 약동학 성질을 가지고, 방사성동위원소, 예를 들면 테크네튬 또는 레늄으로 쉽게 표지될 수 있는 항체 단편의 제공에 대한 임상적 필요성은 아직 존재한다.
<발명의 목적>
그러므로, 향상된 약동학 성질, 특히 표적 특이성 및(또는) 생체내 안정도를 가지고, 테크네튬 또는 레늄 같은 방사성동위원소에 쉽게 결합할 수 있는 항체 단편을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
<발명의 요약>
본 발명은
aa) 표 1에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR3 및(또는) LCDR3을 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위의 서열 또는 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 HCDR3 지역의 5개 이하의 아미노산 및 LCDR3 지역의 6개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 그의 변이체;
ab) 표 1에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위의 서열 또는 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 HCDR1 지역의 3개 이하의 아미노산, HCDR2 지역의 8개 이하의 아미노산, HCDR3 지역의 5개 이하의 아미노산, LCDR1 지역의 6개 이하의 아미노산, LCDR2 지역의 4개 이하의 아미노산 및 LCDR3 지역의 6개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 그의 변이체;
ac) 서열번호 1 (L19)에 따른 서열 또는 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 30개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 서열번호 1의 변이체, 및
ba) 아미노산 서열 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys (서열번호 2) (여기서, Xaa1
, Xaa2, 및 Xaa3은 각각 임의의 자연 발생의 아미노산을 독립적으로 나타냄) 또는
bb) 아미노산 서열 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4 (서열번호 3) (여기서, Xaa1, Xaa2, Xaa3, 및 Xaa4는 각각 임의의 자연 발생의 아미노산을 독립적으로 나타냄) 또는
bc) 아미노산 서열 (His)n (서열번호 4) (여기서 n은 4 내지 6의 정수를 나타냄)
을 포함하고, 여기서 aa), ab) 또는 ac)의 C-말단이 펩티드 결합을 통해 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 서열들 중의 하나의 N-말단에 결합되는 펩티드 를 포함하는 화합물을 기술한다.
화합물은 바람직하게 단쇄 항체 단편, 특히 scFv 단편이다. 추가로, 화합물은 방사성동위원소, 예를 들면 테크네튬, 예를 들면 94mTc, 99mTc, 레늄, 예를 들면 186Re, 188Re, 또는 다른 동위원소, 예를 들면 203Pb, 67Ga,
68Ga, 43Sc, 44Sc, 47Sc, 110mIn, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 67Cu,
68Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb,
153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 72As 및 18F의 방사성동위원소로 바람직하게 콘쥬게이션된다.
본 발명은 또한 활성 약제로서 상기 화합물과 함께 생리적으로 허용가능한 보조제, 희석제 및(또는) 담체를 포함하는 제약 조성물을 기술한다.
본 발명은 또한
aa) 표 1에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR3 및(또는) LCDR3을 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위의 서열 또는 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 HCDR3 지역의 5개 이하의 아미노산 및 LCDR3 지역의 6개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 그의 변이체;
ab) 표 1에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위의 서열 또는 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 HCDR1 지역의 3개 이하의 아미노산, HCDR2 지역의 8개 이하의 아미노산, HCDR3 지역의 5개 이하의 아미노산, LCDR1 지역의 6개 이하의 아미노산, LCDR2 지역의 4개 이하의 아미노산 및 LCDR3 지역의 6개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 그의 변이체;
ac) 서열번호 1 (L19)에 따른 서열 또는 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 30개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 서열번호 1의 변이체, 및
ba) 아미노산 서열 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys (서열번호 2) (여기서, Xaa1
, Xaa2, 및 Xaa3은 각각 임의의 자연 발생의 아미노산을 독립적으로 나타냄) 또는
bb) 아미노산 서열 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4 (서열번호 3) (여기서, Xaa1, Xaa2, Xaa3, 및 Xaa4는 각각 임의의 자연 발생의 아미노산을 독립적으로 나타냄) 또는
bc) 아미노산 서열 (His)n (서열번호 4) (여기서 n은 4 내지 6의 정수를 나타냄)
을 포함하고, 여기서 aa), ab) 또는 ac)의 C-말단이 펩티드 결합을 통해 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 서열들 중의 하나의 N-말단에 결합되는 펩티드의 방사성동위원소, 예를 들면 테크네튬 또는 레늄의 방사성동위원소를 결합하기 위한 용도를 기술한다.
항체 단편 L19는 하기의 서열에 의해 정의된다 (서열번호 1):
(VH)
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS
(링커)
GDGSSGGSGG AS
(VL)
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS
SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP
DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ
QTGRIPPTFG QGTKVEIK
30개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환은 서열번호 1의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환이다. 그러나, 상보성-결정 지역 (CDR) 내에서 청구된 펩티드, 예를 들면 서열번호 1의 펩티드, 아미노산 (aa)의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 변이체는 하기 표 1에 정의된 최대 변이를 초과해서는 안된다 (HCDR: 중쇄의 CDR; LCDR: 경쇄의 CDR).
| 지역 | CDR 길이 (aa) | 서열 | 서열 위치에서의 최대 (바람직한) 변이 |
| HCDR1 | 5 | SFSMS | 3 (2,1) |
| HCDR2 | 17 | SISGSSGT TYYADSV KG |
8 (7,6,5,4,3,2,1) |
| HCDR3 | 7 | PFPYFDY | 5 (4,3,2,1) |
| LCDR1 | 12 | RASQSVS SSFLA |
6 (5,4,3,2,1) |
| LCDR2 | 7 | YASSRAT | 4 (3,2,1) |
| LCDR3 | 10 | CQQTGRIP PT |
6 (5,4,3,2,1) |
CDR들은 문헌 [E. A. Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes for Health, Bethesda, MD, 5th Edition, 1991]에 따라 정의되었다.
바람직한 것은 서열번호 1 (L19)에 따른 서열 또는 20개 이하의 아미노산의 결실, 삽입 및(또는) 치환인 서열번호 1의 변이체를 포함하는 펩티드이다.
표 1에 보여진 CDR 서열의 변이 및 특히 서열번호 1에 따른 펩티드와 동일한 기능을 가진 결실, 삽입 및(또는) 치환인 서열번호 1의 변이를 포함하는 펩티드는 비아코아 (BIAcore)에 의해 측정된 나노몰 이하 범위의 (즉, 10-9보다 낮은) 해리 상수 Kd로 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 결합하는 펩티드로서 정의된다 (W099/58570, 실시예 2 및 표 2 참조).
바람직한 아미노산 서열 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys (서열번호 2)은 서열 Gly-Gly-Gly-Cys (서열번호 5) 및 Gly-Cys-Gly-Cys (서열번호 6)이다. 가장 바람직한 것은 서열 Gly-Gly-Gly-Cys (서열번호 5)이다.
바람직한 아미노산 서열 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4 (서열번호 3)은 서열 Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (서열번호 7) 및 Gly-Cys-Gly-Cys-Ala (서열번호 8)이다. 가장 바람직한 것은 서열 Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (서열번호 7)이다.
아미노산 서열 (His)n (서열번호 4)을 포함하는 화합물에서, n이 정수 6인 화합물이 바람직하다.
테크네튬 또는 레늄의 바람직한 방사성동위원소는 동위원소 94mTc,99mTc, 186
Re 및 188Re이다. 가장 바람직한 것은 방사성동위원소 99mTc이다.
단쇄 항체 단편 L19 (서열번호 1)는 이전에 종양 가진 생쥐에서 이 화합물의 생체분포를 조사하기 위해 125I으로 표지되었다 (Tarli et al., Blood, Vol. 94, No. 1 (1999), p. 192-198). 결과는 생체내에서의 종양 혈관의 선택적 표적이 달성될 수 있음을 보여준다. 그러나, 놀랍게도 단쇄 항체 단편 L19의 약동학적 성질은 펩티드 ba), bb) 또는 bc)로 콘쥬게이션되고 테크네튬 또는 레늄의 방사성동위원소로 표지될 때 상당히 향상될 수 있음이 발견되었다. 동위원소 99mTc가 방사화학적 성질 (99Mo/99mTc 생성기를 통해 쉽게 얻을 수 있고, 140KeV의 단일 감마-광자를 방출하며, 고도의 광자 선속을 가지며, 6시간의 반감기로 붕괴됨) 및 비용-효용 때문에 일상의 임상적 SPECT를 위해 선택되는 방사성동위원소 표지이다. 치료적 용도를 위해, 화학적으로 동종인 동위원소 186Re 및 188Re로의 표지가 특히 바람직하다 (Hsieh, B.T., et al., Nucl. Med. Biol., 1999, 26(8), 967-972; 973-976, Zamora, P.O., et al., Anticancer Res., 1997, 17(3B), 1803-1838).
본 발명의 펩티드는 피브로넥틴의 세포외 ED-B 도메인에 대한 재조합 scFv 항체 L19 (서열번호 1)의 유도체이고, 도 1에 따른 유전 공학을 통해 제조되었다. 하기의 펩티드들이 제조되었다:
L19 (서열번호 1)
L19His:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA
PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR
FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKAAAL
EHHHHHH
(서열번호 9)
AP38:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA
PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR
FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC
(서열번호 10)
AP39:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA
PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR
FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC A
(서열번호 11)
L19-GlyCysGlyCys:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA
PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR
FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC
(서열번호 12)
L19-GlyCysGlyCysAla:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA
PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR
FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC A
(서열번호 13)
펩티드의 제조는 하기의 실시예에 자세히 기술한다 ("실시예" 참조).
항체 단편 L19는 이. 콜라이에서의 발현으로 원래 제조되었다 (WO 99/58570 참조). 그러나, scFv 항체 단편의 대규모 제조의 경우, 이 발현계는 불만족스러운 것으로 발견되었다. 또다른 발현계인 효모 발현계, 특히 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 발현계가 시험되었다. 본 출원인들은 효모, 예를 들면 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)가 고도로 생활성인 항체 단편, 예를 들면 단편 AP39의 발현을 일반적으로 할 수 있으나, 생체약물의 경제적 제조를 위해 필요한 리터 배양 당 250mg 항체 단편까지의 고수율 발현은 항상 발현 벡터 (예를 들면, pGAP)에 의해서만 얻을 수 있고, 메탄올 유도성 벡터 (예를 들면, pPIC9K)에 의해서는 얻을 수 없음을 발견하였다. 이 항상 발현계의 추가 이점은 유도성 효모 발현과 비교하여 단순화되고 강한 발효 과정이다. 예상과 달리, 본 출원인들은 단편의 N-말단이 알파-신호 서열의 Kex2-절단 부위에 직접 융합된 발현 카세트가 사용될 때만 항체 단편, 예를 들면 단편 AP39의 적절한 신호 서열 프로세싱이 관찰됨을 발견하였다.
펩티드들은 진단 및 치료 용도, 특히 침투성 종양 및 종양 전이의 진단 및 치료에 적절하다. 바람직한 진단 용도는 SPECT (단일 광자 방출 전산화 단층촬영, Single Photon Emission Computed Tomography) 및 PET (양전자 방출 단층촬영, Positron Emission Tomography)이다.
상기의 펩티드들은 상기의 방사성동위원소, 예를 들면 테크네튬 및 레늄의 방사성동위원소, 바람직하게는 방사성핵종 94mTc, 99mTc, 186Re, 및 188
Re의 표지에 특히 적절하다. 펩티드의 표지를 위해, 펩티드는 적절한 환원제, 예를 들면 염화 주석 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 먼저 환원된다. 결과의 환원된 펩티드는 99mTc 생성기 용리액 또는 188Re 생성기 용리액 및 염화 주석과 반응하여 본 발명의 화합물로 될 수 있는 SH-기를 제시한다 (자세한 것은 하기의 실시예 참조). 간접적 표지는 킬레이팅 리간드의 예비-콘쥬게이션 및 후속하는 인듐, 이트륨, 란탄족 등과 같은 방사성동위원소의 복합화에 의해 실시된다. 킬레이팅 리간드는 바람직하게 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 시클로헥실 1,2-디아민테트라아세트산 (CDTA), 에틸렌글리콜-O,0'-비스(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-디아세트산 (HBED), 트리에틸렌 테트라아민 헥사아세트산 (TTHA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N"'-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산 (NOTA), 및 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (TETA)으로부터 펩티드 화합물의 아민 또는 티올기로 유도된다. 킬레이팅 리간드는 적절한 커플링기, 예를 들면 활성 에스테르, 말레이미드, 티오카르바메이트 또는 α-할로겐화 아세트아미드 잔기를 보유한다. 킬레이팅 리간드를 아민기, 예를 들면 라이신 잔기의 ε-NH2-기에 콘쥬 게이션하기 위해, 펩티드 화합물의 사전 환원은 필요로 하지 않는다. 방사성동위원소 표지된 펩티드는 방사선-진단 및 방사선-치료 용도에 적절하다.
결과의 방사성동위원소 표지된 펩티드는 동물 실험에서 예상치 못한 이점을 보인다. 예를 들면, 누드 생쥐에서의 표지된 펩티드, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39 (서열번호 11)의 배출은 신장을 통해 24시간내 70% 이상, 예를 들면 80.63%가 일어나는 반면, 125I으로 표지된 L19 (서열번호 1)는 누드 생쥐에서의 배출이 신장을 통해 24시간내 67.79%만이 일어났다. 표지된 펩티드, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39의 종양 대 혈액 비가 5시간 후 5:1 이상, 바람직하게 8:1 이상, 예를 들면 약 10:1인 반면, 125I으로 표지된 L19에서는 이 비가 단지 약 3:1이다. 이는 또한 종종 덜 선호적인 생체분포 특징을 보이는 다른 99mTc-표지된 scFv 항체와 비교해 예상치 못한 반응이다. 예를 들면, 문헌 [Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp. 868-872, 1996]은 본 발명에 기재된 펩티드의 값, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39의 경우 1.3%와 비교해 매우 높은, 24시간 후 단지 4:1의 종양 대 혈액 비, 및 24시간 후 9%의 신장 축적을 보이는 99mTc-표지된 scFv 항체를 보고한다 (하기 실시예 13 참조).
더욱이, 본 발명의 표지된 펩티드, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39의 생체내 안 정도는 125I으로 표지된 L19의 생체내 안정도에 비해 매우 높다. 본 발명자들은 펩티드, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39의 주사 2시간 후 혈청 내 단지 10% 이하, 예를 들면 3%의 방사능이 대사물에 기인한 반면, 125I으로 표지된 L19의 주사 2시간 후 혈청 내 49%의 방사능이 유리 요오드일 수 있는 대사물에 기인했음을 발견했다. 펩티드, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39의 향상된 생체내 안정도는 또한 표적 ED-B에의 결합 능력의 계속된 보존을 반영한다. 본 발명자들은 펩티드, 예를 들면 99mTc-표지된 AP39의 주사 2시간 후 혈청내 50% 이상, 예를 들면 74%의 방사능이 ED-B에 결합할 수 있는 반면, 125I으로 표지된 L19의 주사 2시간 후 혈청 내 단지 27%의 방사능이 ED-B에 결합할 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 화합물은 또한 고도의 종양 축적을 보인다. 예를 들면, Tc-99m-AP39 및 In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39는 주사후 (post injection, p.i.) 1시간에 10.7 (Tc-99m) 또는 12.9 (In-111) % 그람당 주사량 (ID/g)의 고도 종양 축적을 보였다. 그러므로, 종양 흡수는 다른 공지의 In-111 또는 Tc-99m 표지된 항체 단편에 비해 상당히 높다 (예를 들면, Kobayashi et al., J. Nuc. Med., Vol. 41(4), pp. 755-762, 2000; Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp. 868-872, 1996).
화합물들은 진단 및 치료의 용도에 적절하다. 이들은 바람직하게는 비경구 투여, 더 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 환자에 적용된다. 인간 투여량은 바람 직하게는 방사선진단 용도를 위해서는 환자 당 0.1 내지 1mg의 범위, 및 방사선치료 용도를 위해서는 환자 당 0.1 내지 100mg의 범위이다.
본 발명의 화합물의 제조 및 표지 방법은 하기 실시예에서 더 완전히 예시된다. 이들 실시예들은 예시를 위해 보여진 것이지 한정을 위해서가 아니다.
실시예 1: L19 유도체의 제조
피브로넥틴의 스플라이스 변이체의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 재조합 항체 (scFv L19, 약칭 L19)가 출발 물질을 형성했다. scFv L19를 합성 인간 항체 레퍼토리로부터 파지 디스플레이 선별법에 의해 단리하였다 (Neri et al., 1997, Nature Biotechnol. 15: 1271; Pini et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 21769). 이 재조합 항체 단편은 소위 단쇄 항체 단편 (scFv)의 형태이고 링커 서열에 의해 연결된 VH 및 VL 지역으로 구성되어 있다 (서열번호 1 참조). scFv L19는 ED B에 대해 극히 고도의 친화도를 가진다 (Kd: 5.4x10-11M).
다양한 L19의 유도체를 유전 조작에 의해 제조하였다 (도 1 참조). L19를 변형시키기 위해, scFv 코딩 DNA를 추가 서열을 코딩하는 프라이머들을 이용해 PCR (중합효소 연쇄 반응, polymerase chain reaction)에 의해 증폭하고, 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
L19의 유도체:
L19: 추가의 말단 변형 없음
L19 His: Ni 킬레이트 크로마토그래피 및 방사성동위원소 결합을 위한 C-말단 His6 도메인 (His 태그)
AP38: 치료 및 진단에 사용될 수 있는 물질 (예를 들면, 방사성 동위원소)의 결합 (Cys를 통해)을 위한 C-말단 GlyGlyGlyCys 도메인
AP39: 치료 및 진단에 사용될 수 있는 물질 (예를 들면, 방사성 동위원소)의 결합 (Cys를 통해)을 위한 C-말단 GlyGlyGlyCysAla 도메인
L19-GlyCysGlyCys: 치료 및 진단에 사용될 수 있는 물질 (예를 들면, 방사성 동위원소)의 결합 (Cys를 통해)을 위한 C-말단 GlyCysGlyCys 도메인
L19-GlyCysGlyCysAla: 치료 및 진단에 사용될 수 있는 물질 (예를 들면, 방사성 동위원소)의 결합 (Cys를 통해)을 위한 C-말단 GlyCysGlyCysAla 도메인
L19 유도체의 재조합 제조:
기술된 L19 유도체를 원핵 및 진핵 발현계에서 제조하였다.
a) 이. 콜라이에서의 L19 제조
다양한 L19 유도체 (AP38, AP39, L19-GlyCysGlyCys, L19-GlyCysGlyCysAla, L19, L19His)를 코딩하는 DNA 서열을 IPTG-유도성 프로모터 및 엠피실린 내성 표지 와 함께 원핵 발현 벡터 (pDN5, Pini et al., 1997, J. Immunol. Methods 206: 171, Pini et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 21769; pET, 노바젠 (Novagen)) 내로 클로닝했다. 재조합 단백질의 주변세포질로의 분비를 가능하게 하기 위해, scFv의 N-말단에 Pel B 신호 서열을 융합한 발현 카세트를 제조하는데 이 벡터를 사용했다. 이. 콜라이 (TG1, BL21DE3 및 HB2151)를 이 발현 벡터로 형질전환 후 엠피실린 선별로 안정한 생산 균주를 얻을 수 있었다. scFv를 제조하기 위해, 프로모터를 억제하기 위해 성장기 (37℃)에서 1%의 포도당의 존재하에 이 균주들을 배양하였다. 배양액에서의 scFv 발현을 IPTG 첨가 및 30℃에서 16시간까지의 인큐베이팅에 의해 유도했다. 가용성 및 항원-결합 scFv 물질을 이. 콜라이 균주의 완전한 추출액으로부터, 주변세포질 분획으로부터 또는 정제 및 수율면에서 특히 효율적인 것으로 증명된 배양 상층액으로부터 단리할 수 있었다. 제조를 10리터까지의 배양 부피로 진탕 플라스크 및 발효기에서 실시했다.
b) 피치아 파스토리스 (
Pichia pastoris
)에서의 L19 유도체 제조
효모 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서의 제조를 위해 L19His, AP38, AP39, L19-GlyCysGlyCys 및 L19-GlyCysGlyCysAla-코딩 DNA 서열을 PCR로 증폭하고 이. 콜라이 및 발현 벡터 pPIC9K 및 pGAP (인비트로젠 (Invitrogen)) 내로 클로닝하였다. 이종 유전자의 발현을 위해, pPIC9K는 메탄올-유도성 프로모터 (AOX1)를 함유하고, pGAP는 GAPDH 효소의 항상성 프로모터를 함유한다. 추가로, 이들 벡터들은 각각 외래 유전자의 선별/증폭을 위한 제네티신 내성 유전자 및 제오신 내성 유전자 및 재조합 산물의 발현 및 분비를 위한 신호 서열 (효모 α인자 에서)을 함유한다. 사용된 AP39 발현 카세트는 신호 서열 제거를 위해 자연 α인자 프로세싱의 다른 절단 부위가 아닌 단지 Kex2 절단 부위만을 함유하는 융합 단백질 (α인자 신호+ L19 유도체)을 코딩한다. 안정한 트랜스펙션된 PP 클론들은 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로의 선형화된 벡터의 전기천공 (예를 들면, 균주 GS115내로의 pPIC9K-AP39, 균주 X33내로의 pGAP-AP39) 및 후속하는 제네티신 또는 제오신 선별로 얻어졌다. 상기 L19 유도체를 가용성 분비 단백질로서 제조하기 위해 이들 클론을 사용하는 것이 가능했다. 클론들을 BMGY 배지 또는 기초 미네랄 배지에서 30℃에서 배양했다. pPIC 기재 클론들에 발현기 동안 프로모터 유도를 위해 메탄올을 첨가했다. 재조합 산물은 정확히 프로세싱된 말단 및 고도 항원-결합 활성을 가졌다. 얻을 수 있는 수율 (비정제된 생활성 산물/배양 상층액 리터)은 배양 조건 및 방법 조절에 따라 하기와 같았다: 예를 들면, pPIC9K-AP39/GS115 (진탕 플라스크 5mg/l, 발효기 10-15mg/l); pGAP-AP39/X33 (진탕 플라스크 30-40mg/l, 발효기 100-250mg/1).
L19 유도체를 친화성 크로마토그래피 (r단백질 A, 스트림라인 파마시아 (Streamline Pharmacia) 또는 ED B 항원 칼럼) 및 후속하는 크기 배제 크로마토그래피를 사용해 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 이. 콜라이 배양 상층액으로부터 정제했다. 추가 프로세싱에 사용된 정제된 AP39 분획은 동종이량체 구조 (서브유니트의 거의 모든 부분이 공유적으로 연결된) 및 고도 항원-결합 활성을 가졌다.
실시예 2a
환원된 AP38의 합성 [환원된 L19-(Gly)
3
-Cys-OH]
156㎕ PBS (인산염 완충 식염수)/10% 글리세린 내의 240㎍ (4.29nmol) S-S-이량체 AP38 용액에 50㎕ TCEP-용액 (14.34mg TCEPxHCl/5ml 수성 Na2HPO4, 0.1M, pH=7.4)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 서서히 진탕하였다. SH-단량체 AP38을 NAP-5 칼럼 (아메르샴 (Amersham), 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다. 단리된 산물의 SDS-PAGE 분석은 S-S-이량체 AP38에서 SH-단량체 AP38로의 정량적 전환을 증명했다.
수율: 79.4㎍/220㎕ PBS (33.1%).
실시예 2b
Tc-99m-AP38 [Tc-99m-L19-(Gly)
3
-Cys-OH]의 합성
2.37mg 디소듐-L-타르트레이트를 작은 병에 넣은 후 220㎕ PBS 내의 79.4㎍ 환원된 AP38을 첨가하고, 용액을 100㎕ 수성 Na2HPO4-완충제 (1M, pH=10.5)로 희석했다. 50㎕ Tc-99m 생성기 용리액 (24h) 및 10㎕ SnCl2-용액 (5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 반시간 동안 진탕하였다. Tc-99m-표지된 AP38을 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 39.7%.
방사화학적 순도: 92.5% (SDS-PAGE).
비활성도 (Specific activity): 17.7MBq/nmol.
면역반응성: 88.7%
실시예 3a
환원된 AP39 [환원된 L19-(Gly)
3
-Cys-Ala-OH]의 합성
135㎕ PBS/10% 글리세린 내의 240㎍ (4.29nmol) S-S-이량체 AP39 용액에 50㎕ TCEP-용액 (14.34mg TCEPxHCl/5ml 수성 Na2HPO4, 0.1M, pH=7.4)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 서서히 진탕하였다. SH-단량체 AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다. 단리된 산물의 SDS-PAGE 분석은 S-S-이량체 AP39에서 SH-단량체 AP39로의 정량적 전환을 증명했다.
수율: 135.9㎍/180㎕ PBS (56.2%).
실시예 3b
Tc-99m-AP39 [Tc-99m-L19-(Gly)
3
-Cys-Ala-OH]의 합성
4.2mg 디소듐-L-타르트레이트를 작은 병에 넣은 후 180㎕ PBS 내의 135.9㎍ 환원된 AP39를 첨가하고, 용액을 100㎕ 수성 Na2HPO4-완충제 (1M, pH=10.5)로 희석했다. 100㎕ Tc-99m 생성기 용리액 (24h) 및 10㎕ SnCl2-용액 (5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 반시간 동안 진탕하였다. Tc-99m-표지된 AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정 제했다.
방사화학적 수율: 50.1%.
방사화학적 순도: 91.5% (SDS-PAGE).
비활성도: 21.4MBq/nmol.
면역반응성: 96.4%
실시예 4
Re-188-AP38 [Re-188-L19-(Gly)
3
-Cys-OH]의 합성
2.37mg 디소듐-L-타르트레이트를 작은 병에 넣은 후 310㎕ PBS 내의 112㎍ 환원된 AP38을 첨가하고, 용액을 100㎕ 수성 Na2HPO4-완충제 (1M, pH=10.5)로 희석했다. 100㎕ Re-188 생성기 용리액 및 50㎕ SnCl2-용액 (5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 한시간반 동안 진탕하였다. Re-188-표지된 AP38을 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 28.3%.
방사화학적 순도: 91.1% (SDS-PAGE).
비활성도: 15.3MBq/nmol.
면역반응성: 89.9%
실시예 5
Re-188-AP39 [Re-188-L19-(Gly)
3
-Cys-Ala-OH]의 합성
2.37mg 디소듐-L-타르트레이트를 작은 병에 넣은 후 303㎕ PBS 내의 112㎍ 환원된 AP39를 첨가하고, 용액을 100㎕ 수성 Na2HPO4-완충제 (1M, pH=10.5)로 희석했다. 100㎕ Re-188 생성기 용리액 및 50㎕ SnCl2-용액 (5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 한시간반 동안 진탕하였다. Re-188-표지된 AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 33.5%.
방사화학적 순도: 92.3% (SDS-PAGE).
비활성도: 18.5MBq/nmol.
면역반응성: 92.5%
실시예 6a
환원된 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH의 합성
160㎕ PBS/10% 글리세린 내의 240㎍ (4.29nmol) S-S-이량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH 용액에 75㎕ TCEP-용액 (14.34mg TCEPxHCl/5ml 수성 Na2HPO4, 0.1M, pH=7.4)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 서서히 진탕하였다. SH-단량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다. 단리된 산물의 SDS-PAGE 분석은 S-S-이량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH에서 SH-단량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH로의 정량적 전환을 증명했다.
수율: 80.4㎍/210㎕ PBS (33.5%).
실시예 6b
Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH의 합성
2.37mg 디소듐-L-타르트레이트를 작은 병에 넣은 후 210㎕ PBS 내의 80.4㎍ 환원된 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH를 첨가하고, 용액을 100㎕ 수성 Na2HPO4-완충제 (1M, pH=10.5)로 희석했다. 50㎕ Tc-99m 생성기 용리액 (24h) 및 10㎕ SnCl2-용액 (5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 반시간 동안 진탕하였다. Tc-99m-표지된 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 37.7%.
방사화학적 순도: 91.5% (SDS-PAGE).
비활성도: 19.7MBq/nmol.
면역반응성: 89.7%
실시예 7a
환원된 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH의 합성
155㎕ PBS/10% 글리세린 내의 240㎍ (4.29nmol) S-S-이량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH 용액에 75㎕ TCEP-용액 (14.34mg TCEPxHCl/5ml 수성 Na2HPO4, 0.1M, pH=7.4)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 서서히 진탕하였다. SH-단량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다. 단리된 산물의 SDS-PAGE 분석은 S-S-이량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH에서 SH-단량체 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH로의 정량적 전환을 증명했다.
수율: 81.2㎍/215㎕ PBS (33.8%).
실시예 7b
Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH의 합성
2.37mg 디소듐-L-타르트레이트를 작은 병에 넣은 후 215㎕ PBS 내의 81.2㎍ 환원된 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH를 첨가하고, 용액을 100㎕ 수성 Na2HPO4-완충제 (1M, pH=10.5)로 희석했다. 50㎕ Tc-99m 생성기 용리액 (24h) 및 10㎕ SnCl2-용액 (5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 반시간 동안 진탕하였다. Tc-99m-표지된 L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 35.6%.
방사화학적 순도: 93.5% (SDS-PAGE).
비활성도: 19.1MBq/nmol.
면역반응성: 88.7%
실시예 8a
시스테인-SH 기에의 EDTA, CDTA, TETA, DTPA, TTHA, HBED, DOTA, NOTA, 및 D03A형 킬레이트제의 특이적 콘쥬게이션을 위한 환원된 AP39의 합성
50㎕ TCEP-용액 (14.34mg TCEPxHCl/5ml 수성 Na2HPO4, 0.1M, pH=7.4)을 450㎕ PBS 내의 400㎍ (7.1nmol) AP39 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 서서히 진탕하였다. 환원된 AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: 아세트산 나트륨 완충제, 0.1M, pH 5.0)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다. 단리된 산물의 SDS-PAGE 분석은 AP39에서 환원된 AP39로의 완전한 전환을 증명했다.
수율: 140㎍/200㎕ (35%).
실시예 8b
MX-DTPA-말레이미드 (1,4,7-트리아자-2-(N-말레이미도 에틸렌
p
-아미노)벤질-1,7-비스(카르복시메틸)-4-카르복시메틸 6-메틸 헵탄)의 합성
512mg (1mmol) {[3-(4-아미노-페닐)-2-(비스-카르복시메틸-아미노)-프로필]-[2-(비스-카르복시메틸-아미노)-프로필]-아미노}-아세트산 (마크로시클릭스 인크. (Macrocyclics Inc.), 미국 텍사스주 달라스 소재) 및 707mg (7mmol) 트리에틸아민을 3ml 건조 DMF에 용해했다. 1ml 건조 DMF 내의 400mg (1.5mmol) 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피온산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (알드리치 (Aldrich))를 적가했다. 용액을 50℃에서 5시간 교반했다. 30ml 디에틸에테르를 천천히 첨가했다. 반응 혼합물을 추가로 30분간 교반했다. 침전물을 여과에 의해 수집했다. 조생성물을 RP-HPLC (아세토니트릴-:물-:트리플루오르아세트산/3:96.9:0.1→99.9:0:0.1)에 의해 정제했다. 수율: 61% (405mg, 0.61mmol). MS-ESI: 664=M++1.
실시예 8c
In-111-MX-DTPA-말레이미드-S(Cys)-AP39-R의 합성
(R = 환원된)
200㎕ 아세트산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 5) 내의 140㎍ (5nmol) AP39-R을 50㎕ 용해된 1,4,7-트리아자-2-(N-말레이미도 에틸렌 p-아미노)벤질-1,7-비스(카르복시메틸)-4-카르복시메틸 6-메틸헵탄 (500㎕ 아세트산 나트륨 완충제 0.1M pH 5 내의 0.25mg DTPA-말레이미드)과 37℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 200ml 아세트산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 6)로 2x1h로 슬라이드-어-라이저 (Slide-A-Lyzer) 10,000 MWCO (피어스 인크. (Pierce Inc.), 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 투석했다.
80㎕ [In-111]InCl3 용액 (HCl, 1N, 40MBq, 아메르샴 인크.)을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 가열했다. In-111 표지된 DTPA-말레이미드-S(Cys)-AP39-R을 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 54%.
방사화학적 순도: 94% (SDS-PAGE).
비활성도: 6.2MBq/nmol.
면역반응성: 86%
실시예 9
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39의 합성
111㎕ PBS 내의 200㎍ (3.6nmol) 비환원된 AP39를 300㎕ 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 희석하고 200ml 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 2x1h로 투석했다. 50㎕ 1,4,7-트리아자-2-(p-이소티오시아나토)벤질-1,7-비스(카르복시메틸)-4-카르복시메틸-6-메틸헵탄 (MX-DTPA) 용액 (500㎕ 붕산 나트륨 완충제 0.1M pH 8.5 내 용해된 0.33mg MX-DTPA)을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 가열했다. 반응 혼합물을 200ml 아세트산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 6.0)로 각각 2x1h 및 1x17h (밤샘)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 투석했다.
80㎕ [In-111]InCl3 용액 (HCl, 1N, 40MBq, 아메르샴 인크.)을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 가열했다. In-111 표지된 MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 70%.
방사화학적 순도: 85% (SDS-PAGE).
비활성도: 7.6MBq/nmol.
면역반응성: 74%
실시예 10
In-111-DOTA-C-벤질-p-NCS-ε-HN(Lys)-AP39의 합성
114㎕ PBS 내의 200㎍ (3.6nmol) 비환원된 AP39를 300㎕ 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 희석하고 200ml 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 2x1h로 투석했다. 50㎕ 1,4,7,10-테트라아자-2-(p-이소티오시아나토)벤질 시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (벤질-p-SCN-DOTA, 마크로시클릭스 인크., 미국 텍사스주 달라스 소재) 용액 (5ml 붕산 나트륨 완충제 0.1M pH 8.5 내 용해된 1.5mg 벤질-p-SCN-DOTA)을 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 가열했다. 반응 혼합물을 200ml 아세트산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 6.0)로 각각 2x1h 및 1x17h (밤샘)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 투석했다.
80㎕ [In-111]InCl3 용액 (HCl, 1N, 40MBq, 아메르샴 인크.)을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 가열했다. In-111 표지된 DOTA-C-벤질-p-NCS-ε-HN(Lys)-AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 74%.
방사화학적 순도: 94% (SDS-PAGE).
비활성도: 12.3MBq/nmol.
면역반응성: 73%
실시예 11
Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39의 합성
115㎕ PBS 내의 200㎍ (3.6nmol) 비환원된 AP39를 300㎕ 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 희석하고 200ml 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 2x1h로 투석했다. 50㎕ MX-DTPA 용액 (500㎕ 붕산 나트륨 완충제 0.1M pH 8.5 내 용해된 0.33mg MX-DTPA)을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 가열했다. 반응 혼합물을 200ml 아세트산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 6.0)로 각각 2x1h 및 1x17h (밤샘)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 투석했다.
100㎕ [Y-88]YCl3 용액 (HCl, 1N, 75MBq, 오크 리찌 내셔널 랩. (Oak Ridge National Lab.))을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 가열했다. Y-88 표지된 MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 65%.
방사화학적 순도: 93% (SDS-PAGE).
비활성도: 10.2MBq/nmol.
면역반응성: 72%
실시예 12
Lu-177-DOTA-C-벤질-p-NCS-ε-HN(Lys)-AP3의 합성
110㎕ PBS 내의 200㎍ (3.6nmol) 비환원된 AP39를 300㎕ 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 희석하고 200ml 붕산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 8.5)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 2 x 1h로 투석했다. 50㎕ 벤질-p-SCN-DOTA 용액 (5ml 붕산 나트륨 완충제 0.1M pH 8.5 내 용해된 1.5mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 가열했다. 반응 혼합물을 200ml 아세트산 나트륨 완충제 (0.1M, pH 6.0)로 각각 2x1h 및 1x17h (밤샘)로 슬라이드-어-라이저 10,000 MWCO (피어스 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용해 투석했다.
200㎕ [Lu-177]LuCl3 용액 (HCl, 1N, 80MBq, NRH-페텐 (NRH-Petten, 네덜란드))을 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 가열했다. Lu-177 표지된 DOTA-C-벤질-p-NCS-ε-HN(Lys)-AP39를 NAP-5 칼럼 (아메르샴, 용리액: PBS)을 이용해 젤-크로마토그래피로 정제했다.
방사화학적 수율: 74%.
방사화학적 순도: 95% (SDS-PAGE).
비활성도: 19MBq/nmol.
면역반응성: 71%
실시예 13
종양 가진 누드 생쥐 내로 1회 정맥 주사 후 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 발현된 Tc-99m-AP39의 기관 분포 및 배출
본 발명의 물질을 F9 (기형암)-가진 동물 (체중 약 25g) 내로 약 74kBq의 투여량으로 정맥 내 주사하였다. 다양한 기관에서의 방사능 농도 및 분뇨의 방사능을 물질의 투여 후 다양한 시간에 γ계수기를 이용해 측정했다. 추가로, 종양 대 혈액 비를 종양 및 혈액에서의 본 발명의 물질의 농도를 기초로 다양한 시간에 측정했다.
F9 (기형암)-가진 누드 생쥐의 Tc-99m-AP39의 생체분포 (평균±SD, n=3)는 표 2에 보여진다:
| 투여량 %/조직 g | 투여량 %/조직 g | 투여량 %/조직 g | |
| 1h p.i. | 5h p.i. | 24h p.i. | |
| 췌장 | 1.97±0.018 | 0.53±0.07 | 0.31±0.08 |
| 간 | 1.91±0.046 | 0.77±0.07 | 0.26±0.01 |
| 신장 | 19.21±0.70 | 4.35±0.082 | 1.32±0.10 |
| 폐 | 3.43±1.01 | 1.41±0.032 | 0.96±0.23 |
| 내용물 없는 위 | 1.55±0.043 | 1.35±0.22 | 0.48±0.10 |
| 내용물 있는 장 | 1.42±0.10 | 1.26±0.34 | 0.29±0.05 |
| 종양 | 10.72±3.21 | 5.13±1.45 | 3.48±1.28 |
| 혈액 | 3.03±0.32 | 0.57±0.11 | 0.11±0.01 |
F9 (기형암)-가진 누드 생쥐의 Tc-99m-AP39의 배출 (평균±SD, n=3)은 표 3에 보여진다:
| 투여량 % | |
| 24h p.i. | |
| 요 | 80.63±3.33 |
| 대변 | 3.94±0.17 |
F9 (기형암)-가진 누드 생쥐의 Tc-99m-AP39의 종양 대 혈액 비 (평균±SD, n=3)는 도 2에 보여진다.
본 발명의 결과는 고형 종양에서의 축적에 대한 본 발명의 물질의 우수한 잠 재성과 함께 동시에 우수한 배출을 보여준다.
실시예 14
종양 가진 누드 생쥐 내로 1회 정맥 주사 후 In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39의 기관 분포
본 발명의 물질을 F9 (기형암)-가진 동물 (체중 약 25g) 내로 약 48kBq의 투여량으로 정맥 내 주사하였다. 다양한 기관에서의 방사능 농도 및 분뇨의 방사능을 물질의 투여 후 다양한 시간에 γ계수기를 사용해 측정했다.
F9 (기형암)-가진 누드 생쥐의 In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39의 생체분포 (평균±SD, n=3)는 표 4에 보여진다:
| 투여량 %/조직 g | |||
| 1h p.i. | 3h p.i. | 24h p.i. | |
| 췌장 | 1.94±0.49 | 1.28±0.13 | 1.18±0.24 |
| 간 | 2.61±1.32 | 2.59±0.36 | 2.26±0.75 |
| 폐 | 1.52±1.57 | 2.36±0.30 | 0.76±0.21 |
| 내용물 없는 위 | 1.44±0.81 | 1.40±0.31 | 0.65±0.28 |
| 내용물 있는 장 | 5.05±5.26 | 1.07±0.34 | 0.67±0.11 |
| 종양 | 12.90±4.81 | 7.44±1.34 | 4.33±0.84 |
| 혈액 | 5.55±1.89 | 1.80±0.20 | 0.11±0.02 |
F9 (기형암)-가진 누드 생쥐의 In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39의 종양 대 혈액 비 (평균±SD, n=3)는 표 5에 보여진다.
| 1h p.i. | 3h p.i. | 24h p.i. | |
| 종양 대 혈액 비 | 2.76±2.00 | 4.16±0.75 | 36.36±3.78 |
본 발명의 결과는 고형 종양에서의 축적에 대한 본 발명의 물질의 우수한 잠재성과 함께 우수한 생체분포 및 종양 대 혈액 비를 보여준다.
실시예 15
종양 가진 누드 생쥐 내로 1회 정맥 주사 후 피치아 파스토리스에서 발현된 Tc-99m-AP39의 영상 촬영
본 발명의 물질을 F9 (기형암)-가진 동물 (체중 약 25g) 내로 약 9.25MBq의 투여량으로 정맥 내 주사하였다. 물질의 투여 후 다양한 시간에 감마-카메라 영상 촬영을 실시했다.
F9 (기형암)-가진 누드 생쥐에서의 Tc-99m-AP39의 섬광조영술은 도 3 및 도 4에 보여진다. 도 3은 물질 주사 5시간 후의 신티그램을 보여주고 도 4는 물질 주사 24시간 후의 신티그램을 보여준다.
본 발명의 결과는 고형 종양의 영상 촬영에 대한 본 발명의 물질의 우수한 잠재성을 보여준다.
SEQUENCE LISTING
<110> Schering AG
<120> New methods for diagnosis and treatment of tumours
<130> 27041P_WOAS
<140>
<141>
<150> EP02 000 315.8
<151> 2002-01-03
<150> US60/358702
<151> 2002-02-25
<160> 13
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(116)
<223> VH
<220>
<221> SITE
<222> (117)..(130)
<223> Linker
<220>
<221> SITE
<222> (131)..(238)
<223> VL
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(238)
<223> deletion, insertion and/or substitution of up to
30 amino acids
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser
115 120 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> xaa each independently represent any naturally
occuring amino acid
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Cys
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> Xaa each independently represent any naturally
occuring amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)
<223> Xaa represents any naturally occuring amino acid
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 4
<211> 1
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)
<223> His=(His)n, wherein n stands for an integer from 4
to 6
<400> 4
His
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<400> 5
Gly Gly Gly Cys
1
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<400> 6
Gly Cys Gly Cys
1
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<400> 7
Gly Gly Gly Cys Ala
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<400> 8
Gly Cys Gly Cys Ala
1 5
<210> 9
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
antibody fragment
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: recombinant
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antibody fragment
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225 230 235 240
Ala
Claims (24)
- aa) 이하의 표에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR3, LCDR3, 또는 이들 둘 모두를 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위; 또는ab) 이하의 표에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위; 또는ac) 서열번호 1 (L19)에 따른 서열, 및b) 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (서열번호 7)을 포함하고, 여기서 aa), ab) 또는 ac)의 C-말단이 펩티드 결합을 통해 서열번호 7의 N-말단에 결합되는 것인 펩티드를 포함하는 화합물.<표>
지역 서열 HCDR1 SFSMS HCDR2 SISGSSGT
TYYADSV
KGHCDR3 PFPYFDY LCDR1 RASQSVS
SSFLALCDR2 YASSRAT LCDR3 CQQTGRIP
PT - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 화합물이 방사성동위원소에 콘쥬게이션된 것인 화합물.
- 제5항에 있어서, 화합물이 테크네튬의 방사성동위원소, 레늄의 방사성동위원소, 또는 다른 동위원소로부터 선택된 방사성동위원소에 콘쥬게이션된 것인 화합물.
- 제6항에 있어서, 상기 방사성동위원소가 99mTc 또는 188Re인 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 환원된 형태인 화합물.
- 활성 약제로서 제1항에 따른 화합물과 함께 생리적으로 허용가능한 보조제, 담체, 희석제 또는 이들의 조합을 포함하는 제약 조성물.
- 제9항에 있어서, 조성물이 생쥐에서 24시간 내에 신장을 통해 70% 이상이 배출되는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 조성물이 생쥐에 투여된 지 5시간 후에 종양 대 혈액비가 5:1 이상이 되는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 조성물이 진단 용도인 조성물.
- 제9항에 있어서, 조성물이 치료 용도인 조성물.
- aa) 이하의 표에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR3, LCDR3, 또는 이들 둘 모두를 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위; 또는ab) 이하의 표에 보여진 상보성-결정 지역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 피브로넥틴의 세포외 도메인 B (ED-B)에 대한 항원-결합 부위; 또는ac) 서열번호 1 (L19)에 따른 서열, 및b) 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (서열번호 7)을 포함하고, 여기서 aa), ab) 또는 ac)의 C-말단이 펩티드 결합을 통해 서열번호 7의 N-말단에 결합되는 것인 펩티드를 방사성동위원소에 결합시키는 방법.<표>
지역 서열 HCDR1 SFSMS HCDR2 SISGSSGT
TYYADSV
KGHCDR3 PFPYFDY LCDR1 RASQSVS
SSFLALCDR2 YASSRAT LCDR3 CQQTGRIP
PT - 제14항에 있어서, 상기 방사성동위원소가 테크네튬의 방사성동위원소, 레늄의 방사성동위원소, 또는 다른 동위원소로부터 선택된 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 방사성동위원소가 99mTc 또는 188Re인 방법.
- 펩티드가 진핵 세포에서 발현됨을 특징으로 하는, 제1항에 정의된 펩티드의 제조 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 진핵 세포가 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 세포인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 펩티드가 항상적으로 발현되는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 펩티드의 N-말단이 α-신호 서열의 Kex2-절단 부위에 직접 융합되는 것인 방법.
- 제1항에 정의된 펩티드를 임의적으로 생리적으로 허용가능한 보조제와 함께 포함하는 방사성의약품의 제조용 키트.
- 제6항에 있어서, 방사성동위원소가 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 43Sc, 44Sc, 47Sc, 110mIn, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 72As 및 18F로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성동위원소인 화합물.
- 제15항에 있어서, 방사성동위원소가 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 43Sc, 44Sc, 47Sc, 110mIn, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 72As 및 18F로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성동위원소인 방법.
- 제17항에 있어서, 펩티드가 효모 세포에서 발현됨을 특징으로 하는 방법.
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