PT1461360E - Conjugados compreendendo um anticorpo específico para o domínio ed-b de fibronectina e suas utilizações para a detecção e tratamento de tumores - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Conjugados compreendendo um anticorpo específico para o domínio ED-B de fibronectina e suas utilizações para a detecção e tratamento de tumores" 0 presente invento refere-se ao diagnóstico e tratamento de tumores, utilizando novos péptidos para ligação de radionuclídeos.
Descrição sucinta da arte anterior
Os tumores não podem ganhar mais do que um determinado peso sem a formação de novos vasos sanguíneos (angiogénese) e a correlação entre a densidade de microvasos e a capacidade de invasão do tumor foi relatada em vários tumores (Folkman (1995), Nature Med., 1, 27-31). Além disso, a angiogénese está envolvida na maioria das doenças oculares que resultam em perda de visão (Lee et al.r Surv. Ophthalmol. 43, 245-269 (1998); Friedlander, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93, 9764-9769 (1996)). As moléculas capazes de ter como alvos selectivamente marcadores de angiogénese criariam oportunidades clinicas para o diagnóstico e terapia de tumores e outras doenças caracterizadas por proliferação vascular, tais como retinopatia diabética e degenerescência da mácula relacionada com a idade. Os marcadores de angiogénese são expressos na maioria dos tumores sólidos agressivos em associação com vasos tumorais e seriam assim facilmente acessíveis a ligantes específicos injectados intravenosamente (Pasqualini et al., (1997), Nature Biotechnol., 15, 542-546; Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1275). Ter como alvo a oclusão de neovasculatura pode resultar em enfarte e colapso do tumor (0'Reilly et al. (1996), Nature Med., 2, 689-692; Huang et al. (1997), Science, 275, 547-550). O dominio ED-B de fibronectina, uma sequência de 91 aminoácidos idêntica em ratinhos, ratos e humanos, que é inserido por "spllclng" alternativo na molécula de fibronectina, acumula-se especificamente em torno de estruturas neovasculares (Castellani et al. (1994), Int. J. Câncer 59, 612-618) e poderia representar um alvo para intervenção molecular. De facto, foi recentemente demonstrado 2 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ com técnicas de fluorescência que fragmentos de anticorpo Fv em cadeia simples (scFv) anti-ED-B acumulam-se selectivamente em torno de vasos sanguíneos tumorais de ratinhos com tumor e que a afinidade do anticorpo parece ditar o desempenho de direcção ao alvo (Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1275; WO 97/45544).
Além disso, descrevem-se em WO 99/58570 anticorpos e fragmentos de anticorpo específicos para ligação do domínio ED-B de fibronectina com uma constante de dissociação sub-nanomolar, bem como seus derivados marcados radioquimicamente. A biodistribuição de um destes fragmentos de anticorpo humano de elevada afinidade, o fragmento de anticorpo marcado com 125I denominado L19, foi já investigada em ratinhos com tumor (Tarli et al., Blood, Vol. 94, N.° 1 (1999), p. 192-198).
Revelam-se em WO 01/62800 conjugados marcados radioquimicamente compreendendo anticorpos L19 e sua utilização para a detecção e tratamento de angiogénese. A produção recombinante de fragmentos de anticorpo Fv em cadeia simples funcionalizados que se ligam ao domínio ED-B da isoforma B de fibronectina em Pichia pastoris foi já descrita (Marty et al., Protein Expression and Purification 21, 156-164 (2001)) .
Além disso, a marcação radioquímica de fragmentos de anticorpo scFv com Tc através do peptido cisteinilo C-terminal foi descrita por George et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 92 p. 8358-8362, 1995 e por Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), p. 868-872, 1996.
No entanto, existe ainda uma necessidade clínica para proporcionar fragmentos de anticorpo com propriedades farmacocinéticas melhoradas e que possam ser facilmente marcados com radioisótopos de e.g. Tecnécio ou Rénio, dado que estes radionuclídeos são particularmente adequados como radiofármacos.
Objecto do invento É assim um objecto do invento proporcionar fragmentos de anticorpo com propriedades farmacocinéticas melhoradas, 3 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ particularmente especificidade para o alvo e/ou estabilidade in vivo, e que podem ligar facilmente radioisótopos e.g. de
Tecnécio ou Rénio.
Sumário do invento 0 presente invento é definido nas reivindicações 1-18
Os compostos são de preferência fragmentos de anticorpo em cadeia simples, em particular fragmentos scFv. Além disso, os compostos são de preferência conjugados com um radioisótopo, e.g. um radioisótopo de Tecnécio, tal como 94mTc, 99mTc, Rénio, tal como 68Ga, 43Sc, 88 186
Re, 44 188
Sc,121,
Re 47
Sc, 161. llOm Y, 00Y, JUY, Sn, 1D±Tb,
In, 153 111
In, 166. 97
Sm, ±DDHo,
Ru, 105 Rh, tais como 203Pb, 62Cu, 64Cu, 67Cu, , 177Lu, 72As e 18: 67 68 Ga, Cu, O presente invento também descreve uma composição farmacêutica compreendendo o composto anterior como agente activo conjuntamente com adjuvantes, diluentes e/ou transportadores fisiologicamente aceitáveis. O presente invento também descreve a utilização de um péptido tal como definido nas reivindicações 11-13. O fragmento de anticorpo L19 é definido pela seguinte sequência (Seq. Id. No.l):
SCAASGFTFS ISGSSGTTYY LQMNSLRAED LVTV SS (VH)
EVQLLESGGG
SFSMSWVRQA
ADSVKGRFTI
TAVYYCAKPF (Ligante)
GDGSSGGSGG (VL)
EI VLTQSPGT
SSFLAWYQQK DRFSGSGSGT QTGRIPPTFG
LVQPGGSLRL
PGKGLEWVSS
SRDNSKNTLY
PYFDYWGQGT
ASTG
LSLSPGERAT
PG QAPRLLI Y DFTLTISRLE Q GTKV E I K
LSCRASQSVS
YASSRATGIP PEDFAVYYCQ 4 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Uma deleção, inserção e/ou substituição de até 30 aminoácidos é uma deleção, inserção e/ou substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de Seq. Id. No.l. No entanto, no interior das regiões determinantes da complementaridade (CDR) do péptido reivindicado, e.g. o péptido de Seq. Id. No. 1, uma variação que é uma deleção, inserção e/ou substituição de aminoácidos (aa) não deve exceder as variações máximas definidas na tabela 1 seguinte (HCDR: CDR da cadeia pesada; LCDR: CDR da cadeia leve).
Região Comprimento da CDR (aa) Sequência Variações máximas (preferidas) nas posições da sequência HCDR1 5 SFSMS 3 (2,1) HCDR2 17 SISGSSGTTYYADSVKG 8(7,6,5,4,3,2,1) HCDR3 7 PFPYFDY 5(4,3,2,1) LCDR1 12 RASQSVSSSFLA 6(5,4,3,2,1) LCDR2 7 YASSRAT 4(3,2,1) LCDR3 10 CQQTGRIPPT 6(5,4,3,2,1)
Tabela 1
As CDR foram definidas de acordo com E.A. Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes for Health, Bethesda, MD, 5a Edição, 1991. São preferidos os péptidos compreendendo uma sequência de acordo com Seq. Id. No. 1 (L19) ou uma variação de Seq. Id. No. 1 que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 20 aminoácidos.
Um péptido compreendendo uma variação das sequências CDR tal como apresentado na tabela 1 e, particularmente, uma variação de Seq. Id. No. 1 que é uma deleção, inserção e/ou substituição, e que tem a mesma função do péptido de acordo com Seq. Id. No. 1, e é definido como um péptido que se liga ao domínio ED-B de fibronectina com uma constante de dissociação Kd que está na gama de subnanomolar (i.e. inferior 5 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ a 1CT9), medida com um BlAcore (consultar WO99/58570, exemplo 2 e tabela 2).
As sequências de aminoácidos preferidas Xaai-Xaa2-Xaa3-Cys (Seq. Id. No. 2) são as sequências Gly-Gly-Gly-Cys (Seq. Id. No. 5) e Gly-Cys-Gly-Cys (Seq. Id. No. 6). É mais preferida a sequência Gly-Gly-Gly-Cys (Seq. Id. No. 5) .
As sequências de aminoácidos preferidas Xaai-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4 (Seq. Id. No. 3) são as sequências Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No. 7) e Gly-Cys-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No. 8). É mais preferida a sequência Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No. 7) .
Em compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos (His)n (Seq. Id. No. 4), são preferidos os compostos em que n é o número inteiro 6.
Os radioisótopos preferidos de Tecnécio ou Rénio são os isótopos 94mTc, 99mTc, 186Re e 188Re. O mais preferido é o radioisótopo 99mTc.
Descrição detalhada do invento 0 fragmento de anticorpo em cadeia simples L19 (Seq. Id. No. 1) foi previamente marcado com 125I para investigar a biodistribuição deste composto em ratinhos com tumor (Tarli et al., Blood, Vol. 94, No. 1 (1999), p. 192-198). Os resultados demonstram que pode conseguir-se um direccionamento selectivo ao alvo de vasos sanguíneos tumorais in vivo. Contudo, surpreendentemente, verificou-se que as propriedades farmacocinéticas do fragmento de anticorpo em cadeia simples L19 podem ser melhoradas substancialmente quando se conjuga a um péptido ba), bb) ou bc) e se marca com radioisótopos de
Tecnécio ou Rénio. 0 isótopo 99mTc é a marcação radioquimica de escolha para Spect clinico de rotina devido às suas propriedades radioquímicas (facilmente disponível através de um gerador de 99Mo/99mTc, emite fotões gama simples de 140 KeV, tem um elevado fluxo de fotões e decai com uma semivida de 6 horas) e devido à sua eficácia de custo. Para aplicações terapêuticas, a marcação com os isótopos quimicamente análogos 186 188
Re e Re e especialmente preferida (Hsieh, B.T., et al., 6 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Nucl. Med. Biol., 1999, 26(8), 967-972; 973-976, Zamora, P.O., et al., Anticancer Res., 1997, 17(3B), 1803-1838). Os péptidos são derivados do anticorpo recombinante (Seq. Id. No. 1) contra o domínio ED-B extracelular de fibronectina e foram produzidos através de engenharia genética de acordo com a figura 1. Produziram-se os seguintes péptidos: L19 (Seq. Id. No. 1)
Ll9His:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKAAAL EHHHHHH (Seq. Id. No. 9) AP38 :
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC 7 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ (Seq. Id. No. 10) AP39 :
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVFtQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF 101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS .......................
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC A (Seq. Id. No. 11)
Ll9-GlyCysGlyCys: 1
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF 101
PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC 8 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ (Seq. Id. No. 12)
Ll9-GlyCysGlyCysAla:
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC A (Seq. Id. No. 13) A produção dos péptidos é descrita detalhadamente nos seguintes exemplos (consultar "Parte Experimental"). O fragmento de anticorpo L19 foi originalmente produzido por expressão em E. coli (consultar WO 99/58570). No entanto, para a produção de fragmentos de anticorpo scFv em larga escala, verificou-se que este sistema de expressão não é satisfatório. Foi ensaiado outro sistema de expressão, um sistema de expressão de levedura, em particular um sistema de expressão em Pichia pastoris. Os presentes inventores verificaram que a levedura, e.g. Pichia pastoris, é geralmente capaz para expressão de um fragmento de anticorpo altamente bioactivo, e.g. o fragmento AP39, mas só se conseguiu atingir um elevado rendimento de expressão de até 250 mg de fragmento de anticorpo por litro de cultura, que é necessário para uma produção económica de um biofármaco, para um vector de expressão constitutivo (e.g. pGAP) e não com um vector indutivel com metanol (e.g. pPIC9K). Uma vantagem adicional deste sistema de expressão constitutivo é o facto dos procedimentos de fermentação serem simplificados e robustos comparativamente a uma expressão em levedura indutivel. Inesperadamente, os presentes inventores verificaram que se observou apenas um processamento da sequência de sinal adequado do fragmento de anticorpo, e.g. o fragmento AP39, 9 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ quando se utilizou uma cassete de expressão na qual o terminal N do fragmento foi fundido directamente ao local de clivagem Kex2 da sequência de sinal alfa.
Os péptidos são adequados para aplicações em diagnóstico e terapêuticas, nomeadamente para o diagnóstico e terapia de tumores invasivos e metástases de tumor. As aplicações em diagnóstico preferidas são SPECT (Tomografia computorizada de emissão de fotão único) e pet (Tomografia de emissão de positrão).
Os péptidos descritos anteriormente são particularmente adequados para marcação com radioisótopos, tal como descrito anteriormente, e.g. radioisótopos de Tecnécio e Rénio, de preferência os radionuclideos 94mTc, 99mTc, 186Re e 188Re. Para a marcação dos péptidos, os péptidos são primeiramente reduzidos com um agente redutor adequado, tal como e.g. cloreto de estanho (II) ou tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Os péptidos reduzidos resultantes apresentam grupos SH que podem reagir com o eluido do gerador de 99mTc ou com o eluido do gerador de 1 oo
Re e cloreto de estanho (II) para os compostos do presente invento (para detalhes, consultar os exemplos experimentais seguintes). A marcação indirecta é efectuada por pré-conjugação de um ligando quelante e subsequente complexação de radioisótopos, tais como índio, ítrio, lantanideos etc. 0 ligando quelante é de preferência derivado de ácido etilenodiaminotetra-acético (edta), ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA), ácido ciclo-hexil-1,2-diaminotetra-acético (CDTA), ácido etilenoglicol-0,0'-bis(2-aminoetil)-N,N,Ν',Ν'-diacético (HBED), ácido trietilenotetramino-hexa-acético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,Ν',Ν'''-tetra-acético (DOTA), ácido 1, 4, 7-triazaciclononano-N,Ν',Ν''-triacético (NOTA) e ácido 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano-N,Ν',Ν'',Ν'''-tetra-acético (TETA), quer a grupos amino, quer tióis dos compostos de péptido. Os ligandos quelantes apresentam um grupo de acoplamento adequado, e.g. partes de ésteres activos, maleimidas, tiocarbamatos ou acetamidas α-halogenadas. Para conjugar ligandos quelantes a grupos amino e.g. grupos ε-ΝΗ2 de resíduos de lisina, não é necessária a redução prévia dos compostos de péptido. Os péptidos marcados radioquimicamente são adequados para aplicações em radiodiagnóstico e radioterapia. 10 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Os péptidos marcados radioquimicamente resultantes apresentam vantagens inesperadas em experiências com animais. Por exemplo, a excreção de um péptido marcado, e.g. AP39 (Seq. Id. No. 11) marcado com 99mTc em ratinhos nus ocorre a 70% ou mais, e.g. 80,63%, no intervalo de 24 horas através dos rins, enquanto para L19 (Seq. Id. No. 1) marcado com 125I, a excreção em ratinhos nus ocorreu apenas a 67,79% através dos rins no intervalo de 24 horas. A razão tumor para sangue de um péptido marcado, e.g. AP39 marcado com 99mTc é 5:1 ou mais, de preferência 8:1 ou mais, e.g. cerca de 10:1 após 5 horas, enquanto para L19 marcado com 125I, esta razão é apenas cerca de 3:1. Este comportamento é inesperado também comparativamente a outros anticorpos scFv marcados com 99mTc que apresentam frequentemente caracteristicas de biodistribuição menos favoráveis. Por exemplo, Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), p. 868-872, 1996, relatam um anticorpo scFv marcado com 99mTc que apresenta uma razão tumor para sangue de apenas 4:1 após 24 horas e uma acumulação renal de 9% após 24 horas, o que é muito elevado em comparação com os valores dos péptidos descritos no presente invento, e.g. 1,3% para AP39 marcado com 99mTc (consultar exemplo 13, seguidamente).
Adicionalmente, a estabilidade in vivo dos péptidos marcados do invento, e.g. AP39 marcado com 99mTc, é muito elevada comparativamente à estabilidade in vivo de L19 marcado com 125I. Os presentes inventores verificaram que 2 horas após injecção de um péptido, e.g. AP39 marcado com 99mTc, apenas 10% ou menos, e.g. 3% da radioactividade no soro era devida a um metabolito, enquanto 2 horas após injecção de L19 marcado com 125I, 49% da radioactividade no soro era devida a metabolitos, que podem ser iodo livre. A estabilidade in vivo melhorada dos péptidos, e.g. AP39 marcado com 99mTc, também se reflecte por uma conservação prolongada da sua capacidade de ligação ao alvo ED-B. Os presentes inventores verificaram que 2 horas após injecção do péptido, e.g. AP39 marcado com 99mTc, 50% ou mais, e.g. 74% da radioactividade no soro foi capaz de ligar ED-B, enquanto 2 horas após injecção de L19 marcado com 1-125, somente 27% da radioactividade no soro podia ligar ED-B. Os compostos deste invento também apresentam elevada acumulação em tumor. Por exemplo, Tc-99m-AP39 e In-lll-MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)- 11 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ ΑΡ39 apresentaram uma elevada acumulação em tumor de 10,7% (Tc-99m) ou 12,9% (ln-111) da dose injectada por grama (ID/g) 1 hora após injecção (p.i.). Assim, a absorção pelo tumor é significativamente mais alta comparativamente a outros fragmentos de anticorpos conhecidos marcados quer com ln-111, quer com Tc-99m (e.g. Kobayashi et al., J. Nuc. Med., Vol. 41 (4), p. 755-762, 2000; Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), p. 868-872, 1996) .
Os compostos são adequados para aplicações em diagnóstico e terapêuticas. São aplicados ao doente de preferência por administração parentérica, com maior preferência por injecção intravenosa. A dose humana é de preferência na gama de 0,1 a 1 mg por doente para aplicações em radiodiagnóstico e 0,1 a 100 mg por doente para aplicações radioterapêuticas.
Os métodos para preparar e marcar os compostos do presente invento são ilustrados mais completamente nos seguintes exemplos. Estes exemplos apresentam-se apenas a título ilustrativo e não devem ser limitativos.
Parte experimental
Exemplo 1: Produção de derivados de L19 O material de partida era formado por um anticorpo recombinante (scFv L19, abreviado para L19) contra o domínio B extracelular (ED-B) de uma variante de "splícíng" de fibronectina. Isolou-se scFv L19 através de selecção por disposição de fagos a partir de um reportório de anticorpos humanos sintético (Neri et al., 1997, Nature Biotechnol. 15: 1271; Pini et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 21769). Este fragmento de anticorpo recombinante está na forma de um denominado fragmento de anticorpo em cadeia simples (scFv) e consiste de uma região VH e VL ligadas por uma sequência ligante (consultar Seq. Id. No. 1). Este scFv L19 tem uma afinidade excepcionalmente elevada para ed b (Kd: 5, 4 x 1CT11 M) .
Foram produzidos vários derivados de L19 por manipulação genética (consultar a figura 1). Para modificar L19, amplificou-se o ADN que codifica scFv por PCR (reacção de 12 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ polimerização em cadeia) utilizando iniciadores que codificavam para as sequências adicionais e clonaram-se para vectores de expressão.
Derivados de LI9: L19: sem modificações terminais adicionais Ll9 His: domínio His6 (marcador His) C-terminal, para cromatografia com quelante de Ni e para ligação a radioisótopos AP 3 8: domínio GlyGlyGlyCys C-terminal para ligação (através de Cys) de substâncias que podem ser utilizadas em terapia e diagnóstico (e.g. radioisótopos) AP 3 9 : domínio GlyGlyGlyCysAla C-terminal para ligação (através de Cys) de substâncias que podem ser utilizadas em terapia e diagnóstico (e.g. radioisótopos) Ll9-GlyCysGlyCys: domínio GlyCysGlyCys C-terminal para ligação (através de Cys) de substâncias que podem ser utilizadas em terapia e diagnóstico (e.g. radioisótopos) Ll9-GlyCysGlyCysAla: domínio GlyCysGlyCysAla C-terminal para ligação (através de Cys) de substâncias que podem ser utilizadas em terapia e diagnóstico (e.g. radioisótopos)
Produção recombinante de derivados de LI9
Os derivados de L19 descritos foram produzidos em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos. a) Produção de L19 em E. coli
As sequências de ADN que codificam vários derivados de L19 (AP38, AP39, Ll9-GlyCysGlyCys, L19-GlyCysGlyCysAla, L19,
Ll9His) foram clonadas para um vector de expressão procariótico (pDN5, Pini et al., 1997, J. Immunol. Methods 13 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ 206: 171, Pini et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 21769; pET, Novagen) com promotor indutível por IPTG e marcador de resistência à ampicilina. De modo a tornar possível a excreção da proteína recombinante para o periplasma, utilizou-se este vector para produzir uma cassete de expressão na qual o terminal N de scFv está fundido com uma sequência de sinal Pel B. Foi possível estabelecer estirpes produtoras estáveis por transformação de E. coli (TG 1, BL21 DE3 e HB2151) com este vector de expressão, seguido por selecção com ampicilina. Para produzir scFv, estas estirpes foram cultivadas na presença de glicose a 1% na fase de crescimento (37°C) de modo a reprimir o promotor. A expressão de scFv nas culturas foi induzida por adição de IPTG e incubação a 30°C durante até 16 h. Foi possível isolar material scFv solúvel e que se liga a antigénio a partir do extracto completo das estirpes de E. coli, a partir da fracção periplasmática ou a partir do sobrenadante de cultura, tendo esta último provado ser particularmente eficaz relativamente à purificação e rendimento. A produção ocorreu em balões com agitação e em fermentadores com um volume de cultura até 10 litros. b) Produção de derivados de L19 em Pichia pastoris
As sequências de ADN que codificam L19His, AP38, AP39, Ll9-GlyCysGlyCys e Ll9-GlyCysGlyCysAla foram amplificadas por PCR e clonadas para E. coli e para os vectores de expressão PPIC9K e pGAP (invitrogen) para produção na levedura Pichia pastoris. Para expressão de genes heterólogos, pPIC9K contém um promotor indutível por metanol (AOXl) e pGAP contém o promotor constitutivo da enzima GAPDH. Além disso, estes vectores contêm, respectivamente, um gene de resistência a geneticina e um gene de resistência a zeocina para selecção/amplificação do gene heterólogo e uma sequência de sinal (de factor α de levedura) para expressão e excreção do produto recombinante. A cassete de expressão de AP39 utilizada codifica para uma proteína de fusão (factor de sinalização α + derivados de L19) que contém para eliminação da sequência de sinal apenas um local de clivagem Kex2 e nenhum dos outros locais de clivagem do processamento de factor α natural. Estabeleceram-se clones de PP transfectados estavelmente por electroporação dos vectores linearizados para estirpes de Pichia pastoris (e.g. pP!C9K-AP39 para a estirpe GS115, pGAP- 14 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ ΑΡ39 para a estirpe X33) e subsequente selecção com geneticina ou zeocina. Foi possível utilizar estes clones para produzir os referidos derivados de L19 como proteina excretada solúvel. Os clones foram cultivados a 30°C em meio BMGY ou meio mineral basal. Com os clones baseados em pPIC, adicionou-se metanol para indução do promotor durante a fase de expressão. 0 produto recombinante tem o terminal processado correctamente e elevada actividade de ligação ao antigénio. Os rendimentos que se conseguiram atingir (produto bioactivo não purificado/litro de sobrenadante de cultura) foram, dependendo das condições de cultura e do controlo do processo: e.g. pPIC9K-AP39/GS115 (balão com agitação 5 mg/1, fermentador 10-15 mg/1); pGAP-AP39/X33 (balão com agitação 30-40 mg/1, fermentador 100-250 mg/1).
Os derivados de L19 foram purificados do sobrenadante de cultura de Pichia pastoris ou E. coli por utilização de cromatografia de afinidade (rProtein A, Streamline Pharmacia ou coluna de antigénio ED B) com subsequente cromatografia de exclusão por tamanho. A fracção AP39 purificada que foi utilizada para processamento adicional tinha uma estrutura homodimérica (na maioria com subunidades ligadas covalentemente) e elevada actividade de ligação ao antigénio.
Exemplo 2a Síntese de AP38 reduzido [L19-(Gly) 3-Cys-OH reduzido]
Adicionou-se 50 μΐ de solução de TCEP (14,34 mg de TCEP x HC1/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4) a uma solução de 240 pg (4,29 nmol) de AP38 dimérico S-S em 156 μΐ de PBS (solução salina tamponada de fosfato)/glicerina a 10%. Agitou-se suavemente a mistura reaccional durante 1 h à temperatura ambiente. Purificou-se AP38 monomérico SH por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). A análise por SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação quantitativa de AP38 dimérico S-S em AP38 monomérico SH.
Rendimento: 79,4 pg/220 μΐ de PBS (33,1%). 15 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 2b Síntese de Tc-99m-AP38 [Tc-99m-Ll9-(Gly)3-Cys-OH]
Colocou-se 2,37 mg de L-tartarato de dissódio num frasco seguido por adição de 79,4 pg de AP38 reduzido em 220 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HP04 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionou-se 50 μΐ de eluído de gerador de Tc-99m (24 h) e 10 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg de
SnCl2/l ml de HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 0,5 h a 37°C. Purificou-se AP38 marcado com Tc-99m por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquímico: 39,7%.
Pureza radioquímica: 92,5% (SDS-PAGE).
Actividade especifica: 17,7 MBq/nmol.
Imunorreactividade: 88,7%
Exemplo 3a Síntese de AP39 reduzido [L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH reduzido]
Adicionou-se 50 μΐ de solução de TCEP (14,34 mg de TCEP x HC1/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4) a uma solução de 240 pg (4,29 nmol) de AP39 dimérico S-S em 135 μΐ de PBS/glicerina a 10%. A mistura reaccional foi agitada suavemente durante 1 h à temperatura ambiente. Purificou-se AP39 monomérico SH por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). A análise por SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação quantitativa de AP39 dimérico S-S em AP39 monomérico SH.
Rendimento: 135,9 pg/180 μΐ de PBS (56,2%).
Exemplo 3b Síntese de Tc-99m-AP39 [Tc-99m-L19-(Gly) 3-Cys-Ala-OH]
Colocou-se 4,2 mg de L-tartarato de dissódio num frasco seguido por adição de 135,9 pg de AP39 reduzido em 180 pl de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HP04 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionou-se 100 μΐ de eluído de gerador de Tc-99m (24 h) e 10 pl de solução de SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml de HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional 16 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ durante 0,5 h a 37°C. Purificou-se AP39 marcado com Tc-99m por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioguimico: 50,1%.
Pureza radioguimica: 91,5% (SDS-PAGE).
Actividade especifica: 21,4 MBq/nmol.
Imunorreactividade: 96,4%
Exemplo 4 Síntese de Re-188-AP38 [Re-188-Ll9-(Gly) 3-Cys-OH]
Colocou-se 2,37 mg de L-tartarato de dissódio num frasco seguido por adição de 112 pg de AP38 reduzido em 310 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HPC>4 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionou-se 100 μΐ de eluído de gerador de Re-188 e 50 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml de HC1 0,1 M). Agitou-se a mistura reaccional durante 1,5 h a 37°C. Purificou-se AP38 marcado com Re-188 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 28,3%.
Pureza radioquimica: 91,1% (SDS-PAGE).
Actividade especifica: 15,3 MBq/nmol.
Imunorreactividade 89,9%
Exemplo 5 Síntese de Re-188-AP39 [Re-188-Ll9-(Gly) 3-Cys-Ala-OH]
Colocou-se 2,37 mg de L-tartarato de dissódio num frasco seguido por adição de 112 pg de AP39 reduzido em 303 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HP04 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionou-se 100 μΐ de eluído de gerador de Re-188 e 50 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml de HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 1,5 h a 37°C. Purificou-se AP39 marcado com Re-188 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 33,5%.
Pureza radioquimica: 92,3% (SDS-PAGE).
Actividade específica: 18,5 MBq/nmol. imunorreactividade 92,5% 17 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 6a Síntese de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH reduzido
Adicionou-se 75 μΐ de solução de TCEP (14,34 mg de TCEP x HC1/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4) a uma solução de 240 pg (4,29 nmol) de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH dimérico S-S em 160 μΐ de PBS/glicerina a 10%. A mistura reaccional foi agitada suavemente durante 1 h à temperatura ambiente. Purificou-se Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH monomérico SH por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). A análise por SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação quantitativa de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH dimérico S-S em Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH monomérico SH.
Rendimento: 80,4 pg/210 μΐ de PBS (33,5%).
Exemplo 6b
Síntese de Tc-99m-Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH
Colocou-se 2,37 mg de L-tartarato de dissódio num frasco seguido por adição de 80,4 pg de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH reduzido em 210 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HP04 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionou-se 50 μΐ de eluido de gerador de Tc-99m (24 h) e 10 μΐ de solução de
SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml de HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 0,5 h a 37°C. Purificou-se Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-OH marcado com Tc-99m por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 37,7%.
Pureza radioquimica: 91,5% (SDS-PAGE).
Actividade específica: 19,7 MBq/nmol.
Imunorreactividade 89,7%
Exemplo 7a Síntese de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH reduzido
Adicionou-se 75 μΐ de solução de TCEP (14,34 mg de TCEP x HC1/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4) a uma solução de 240 pg (4,29 nmol) de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH dimérico S-S em 155 pl de PBS/glicerina a 10%. A mistura reaccional foi agitada suavemente durante 1 h à temperatura ambiente. 18 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Purificou-se L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-0H monomérico SH por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). A análise por SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação quantitativa de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH dimérico S-S em L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-0H monomérico SH.
Rendimento: 81,2 pg/215 μΐ de PBS (33,8%).
Exemplo 7b
Síntese de Tc-99m-Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
Colocou-se 2,37 mg de L-tartarato de dissódio num frasco seguido por adição de 81,2 pg de Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-0H reduzido em 215 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HP04 aquoso (1 M, pH = 10,5) . Adicionou-se 50 μΐ de eluido de gerador de Tc-99m (24 h) e 10 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml de HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 0,5 h a 37°C. Purificou-se Ll9-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH marcado com Tc-99m por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 35,6%.
Pureza radioquimica: 93,5% (SDS-PAGE).
Actividade específica: 19,1 MBq/nmol.
Imunorreactividade 88, 7%
Exemplo 8a Síntese de AP39 reduzido para conjugação específica de quelantes do tipo EDTA, CDTA, TETA, DTPA, TTHA, HBED, DOTA, NOTA, e D03A ao grupo SH da cisteína
Adicionou-se 50 μΐ de solução de TCEP (14,34 mg de TCEPxHCl/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4) a uma
solução de 400 pg (7,1 nmol) de AP39 em 450 μΐ de PBS. A mistura reaccional foi agitada suavemente durante lha 37°C. Purificou-se AP39 reduzido por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: tampão de acetato de sódio, 0,1 M, pH 5,0). A análise por SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação completa de AP39 em AP39 reduzido.
Rendimento: 140 pg/200 pl (35%). 19 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 8b Síntese de MX-DTPA-Maleimida (l,4,7-triaza-2-(N-maleimidoetileno-p-amino)benzil-l,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano)
Dissolveu-se 512 mg (1 mmol) de ácido { [3-(4-aminofenil)-2-(bis-carboximetilamino)propil]-[2-(bis-carboximetilamino)-propil]amino}acético (Macrocyclics Inc. Dallas, TX, EUA) e 707 mg (7 mmol) de trietilamina em 3 ml de DMF seco.
Adicionou-se gota a gota 400 mg (1,5 mmol) de éster 2,5- dioxopirrolidin-l-ilo de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidropirrol-1-il)propiónico (Aldrich) em 1 ml de DMF seco. Agitou-se a solução durante 5 h a 50°C. Adicionou-se lentamente 30 ml de dietiléter. Agitou-se a mistura reaccional 30 min adicionais. Recolheu-se o precipitado por filtração. Purificou-se o produto impuro por RP-HPLC (acetonitrilo:água:ácido trifluoroacético/ 3:96,9:0,1^99,9:0:0,1). Rendimento: 61% (405 mg, 0,61 mmol). MS-ESI: 664 = M+ + 1.
Exemplo 8c
Síntese de In-lll-MX-DTPA-Maleimida-S(Cys)-AP39-R (R = reduzido)
Fez-se reagir 140 pg (5 nmol) de AP39-R em 200 μΐ de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 5) com 50 μΐ de 1,4,7-triaza-2-(N-maleimidoetileno-p-amino)benzil-1,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano dissolvido (0,25 mg de DTPA-Maleimida em 500 μΐ de tampão de acetato de sódio 0,1 M, pH 5) durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2 x 1 h com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6) utilizando Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA).
Adicionou-se 80 μΐ de solução de [In-111] InCl3 (HC1, 1 N, 40 MBq, Amersham Inc.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se DTPA-Maleimida-S(Cys)-AP39-R marcado com In-111 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 54%.
Pureza radioquímica: 94% (SDS-PAGE).
Actividade específica: 6,2 MBq/nmol.
Imunorreactividade: 86% 20 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 9 Síntese de In-lll-MX-DTPA-s-HN(Lys)-AP39
Diluiu-se 200 pg (3,6 nmol) de AP39 não reduzido em 111 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 x 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) utilizando um Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA). Adicionou-se 50 μΐ de solução de 1,4,7-triaza-2-(p-isotiocianato)benzil-1,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano (MX-DTPA)
(0,33 mg de MX-DTPA dissolvido em 500 μΐ de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2 x 1 h e 1 x 17 h (durante a noite) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) cada, utilizando o Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA).
Adicionou-se 80 μΐ de solução de [In-111] InCl3 (HC1, 1 N, 40 MBq, Amersham Inc.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39 marcado com In-111 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 70%.
Pureza radioquimica: 85% (SDS-PAGE).
Actividade especifica: 7,6 MBq/nmol.
Imunorreactividade: 74%
Exemplo 10 Síntese de In-lll-DOTA-C-Benzil-p-NCS-s-HN(Lys)-AP39
Diluiu-se 200 pg (3,6 nmol) de AP39 não reduzido em 114 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 x 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) utilizando um Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA). Adicionou-se à solução 50 μΐ de solução de ácido 1, 4,7,10-tetra-aza-2-(p-isotiocianato)-benzilciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (benzil-p-SCN-DOTA, Macrocyclics Inc., Dallas TX, EUA) (1,5 mg de benzil-p-SCN-DOTA dissolvido em 5 ml de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. 21 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (durante a noite) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) cada, utilizando o Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA).
Adicionou-se 80 μΐ de solução de [ln-111] lnCl3 (HC1, 1 N, 40 MBq, Amersham Inc.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se DOTA-C-Benzil-p-NCS-ε-HN(Lys)-AP39 marcado com ln-111 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 74%.
Pureza radioquimica: 94% (SDS-PAGE).
Actividade especifica: 12,3 MBq/nmol.
Imunorreactividade: 73%
Exemplo 11 Síntese de Y-88-MX-DTPA-s-HN(Lys)-AP39
Diluiu-se 200 pg (3,6 nmol) de AP39 não reduzido em 115 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 x 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) utilizando um Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA). Adicionou-se 50 μΐ de solução de MX-DTPA (0,33 mg de MX-DTPA dissolvido em 500 μΐ de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (durante a noite) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) cada, utilizando o Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA).
Adicionou-se 100 μΐ de solução de [Y-88JYC13 (HC1, 1 N, 75 MBq, Oak Ridge National Lab.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39 marcado com Y-88 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 65%.
Pureza radioquimica: 93% (SDS-PAGE).
Actividade específica: 10,2 MBq/nmol.
Imunorreactividade: 72% 22 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 12 Síntese de Lu-177-DOTA-C-Benzil-p-NCS-e-HN(Lys)-AP3
Diluiu-se 200 pg (3,6 nmol) de AP39 não reduzido em 110 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 x 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) utilizando um Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA). Adicionou-se 50 μΐ de solução de benzil-p-SCN-DOTA (1,5 mg dissolvido em 5 ml de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (durante a noite) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) cada, utilizando o Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, EUA).
Adicionou-se 200 μΐ de solução de [Lu-177]LUCI3 (HC1, 1 N, 80 MBq, NRH-Petten, Holanda) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se DOTA-C-Benzil-p-NCS-ε-HN(Lys)-AP39 marcado com Lu-177 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS).
Rendimento radioquimico: 74%.
Pureza radioquimica: 95% (SDS-PAGE).
Actividade específica: 19 MBq/nmol. imunorreactividade: 71%
Exemplo 13
Distribuição nos órgãos e excreção de Tc-99m-AP39, expresso em Pichia pastoris, após uma única injecção i.v. em ratinhos nus com tumor A substância é injectada intravenosamente numa dose de cerca de 74 kBq em animais com F9 (teratocarcinoma) (peso corporal de cerca de 25 g) . Mede-se a concentração de radioactividade em vários órgãos e a radioactividade nas excreções utilizando um contador γ a vários pontos temporais após a administração da substância. Além disso, determina-se a razão de tumor para sangue a vários pontos temporais com base na concentração da substância do invento no tumor e no sangue. 23 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ A biodistribuição de Tc-99m-AP39 em ratinhos nus com F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n= 3) apresenta-se na tabela 2: % de dose/g de tecido % de dose/g de tecido % de dose/g de tecido 1 h p. i . 5 h p. i. 24 h p.i. Baço 1,97 ± 0,018 0,53 ± 0,07 0,31 ± 0,08 Fígado 1,91 ± 0,046 0,77 ± 0,07 0,26 ± 0,01 Rim 19,21 ± 0,70 4,35 ± 0,082 1,32 ± 0,10 Pulmão 3,43 ± 1,01 1,41 ± 0,032 0,96 ± 0,23 Estômago sem conteúdo 1,55 ± 0,043 1,35 ± 0,22 0,48 ± 0,10 Intestino com conteúdo 1,42 ± 0,10 1,26 ± 0,34 0,29 ± 0,05 Tumor 10,72 ± 3,21 5,13 ± 1,45 3,48 ± 1,28 Sangue 3,03 ± 0,32 0,57 ± 0,11 0,11 ± 0,01
Tabela 2 A excreção de Tc-99m-AP39 em ratinhos nus com F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n = 3) apresenta-se na tabela 3: % de dose 24 h após injecção Urina 80,63 ± 3,33 Fezes 3,94 ± 0,17
Tabela 3 A razão de tumor para sangue de Tc-99m-AP39 em ratinhos nus com F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n = 3) apresenta-se na figura 2.
Os resultados desta investigação demonstram o excelente potencial da substância para acumulação em tumores sólidos e, ao mesmo tempo, com excelente excreção. 24 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 14
Distribuição de In-lll-MX-DTPA-s-HN(Lys)-AP39 nos órgãos após uma única injecção i.v. em ratinhos nus com tumor A substância é injectada intravenosamente numa dose de cerca de 48 kBq em animais com F9 (teratocarcinoma) (peso corporal de cerca de 25 g). Mede-se a concentração de radioactividade em vários órgãos e a radioactividade nas excreções utilizando um contador γ a vários pontos temporais após a administração da substância. A biodistribuição de ln-lll-MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)-AP39 em ratinhos nus com F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n = 3) apresenta-se na tabela 4: % de dose/g de tecido 1 h P . i • 3 h P . i 24 1 p. i Baço 1, 94 + 0, 49 1,28 + 0, 13 1,18 + 0, 24 Fígado 2, 61 ± 1, 32 2,59 ± 0, 36 2,26 ± 0, 75 Pulmão 1, 52 ± 1, 57 2,36 ± 0, 30 0, 76 ± 0, 21 Estômago sem conteúdo 1, 44 + 0, 81 1, 40 + 0, 31 0,65 + 0, 28 Intestino com conteúdo 5, 05 + 5, 26 1, 07 + 0, 34 0,67 + 0, 11 Tumor 12 90 ± 4 ,81 7, 44 + 1, 34 4,33 ± 0, 84 Sangue 5, 55 ± 1, 89 1, 80 ± 0, 20 0, 11 ± 0, 02
Tabela 4 A razão de tumor para sangue de In-lll-MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)-AP39 em ratinhos nus com F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n= 3) apresenta-se na tabela 5. 1 h p. i . 3 h p . i . 24 h p.i. Razão de tumor para sangue 2,76 ± 2,00 4,16 ± 0,75 36,36 ± 3,78
Tabela 5
Os resultados desta investigação demonstram o excelente potencial da substância para acumulação em tumores sólidos conjuntamente com uma excelente biodistribuição e razão tumor para sangue. 25 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Exemplo 15
Imagem de Tc-99m-AP39, expresso em Pichia pastoris, após uma única injecção i.v. em ratinhos nus com tumor A substância é injectada intravenosamente numa dose de cerca de 9,25 MBq em animais com F9 (teratocarcinoma) (peso corporal de cerca de 25 g). Obtêm-se imagens com câmara gama a vários pontos temporais após administração da substância.
Apresenta-se cintigrafia planar de Tc-99m-AP39 em ratinhos nus com F9 (teratocarcinoma) nas figuras 3 e 4. A figura 3 apresenta o cintigrama 5 horas após injecção da substância e a figura 4 apresenta o cintigrama 24 horas após injecção da substância. 0 resultado demonstra o excelente potencial da substância para imagem de tumores sólidos. 26 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> Schering AG <120> Novos métodos para o diagnóstico e o tratamento de tumores
<130> 27041P_WOAS <140> <141> <150> EP02 000 315.8 <151> 2002-01-03 <150> US60/358702 <151> 2002-02-25 <16 0 > 13 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>
<221> LOCAL <222> (1) . . (116)
<223> VH <220> <221> LOCAL <222> (117) . . (130) <223> Ligante <220> <221> LOCAL <222> (131) . . (238)
<223> VL <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . (238) <223> deleção, inserção e/ou substituição de até 30 aminoácidos <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante 27 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ < 4 Ο Ο > 1
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe' 20 25 30
Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 100 105 110
Thr Vai Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 115 120 125
Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser '130........... 135”....... '140· ......
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser 145 150 155 160
Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 195 200 205
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg 210 215 220
Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 225 230 235
<210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante 28 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. (3) <223> Xaa representam, cada um independentemente, qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 2 Xaa Xaa Xaa Cys 1
<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. (3) <223> Xaa representam, cada um independentemente, qualquer aminoácido de ocorrência natural <220> <221> VARIANTE <222> (5) <223> Xaa representa qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 3
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5
<210> 4 <211> 1 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <220> <221> REPETIÇÃO <222> (1) <223> His=(His)n, em que n representa um número inteiro de 4 a 6 < 4 0 0 > 4 His 1 29 29 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ < 210 > 5
< 211 > 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante < 4 0 0 > 5
Gly Gly Gly Cys 1
<210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <400> 6
Gly Cys Gly Cys 1
<210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante < 4 0 0 > 7
Gly Gly Gly Cys Ala 1 5
<210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante < 4 0 0 > 8
Gly Cys Gly Cys Ala 1 5
<210> 9 <211> 247 <212> PRT <213> Sequência Artificial 30 30 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <400> 9
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr LeU Vai 100 105 110
Thr Vai Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 115 120 125
Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro 210 215 220
Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Ala Ala Ala Leu 225 230 235 240
Glu His His His His His His 245 31 31 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
<210> 10 <211> 240 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <400> 10
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 100 105 110
Thr Vai Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 115 120 125
Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 195 200 205 32 32 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro 210 215 220 Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Cys 225 230 235 240 < 210 > 11 <211> 241
< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante < 4 0 0 > 11
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 115 120 125
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 130 135 140 33 33 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro 210 215 220
Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Gly Gly Gly Cys 225 230 235 240
Ala
<210> 12 <211> 240 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <400> 12
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 , Lys Gly Arg Phe Thr Ile' Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 34 34 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 100 105 110
Thr Vai Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 115 120 125
Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro 210 215 220
Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Gly Cys Gly Cys 225 230 235 240
<210> 13 <211> 241 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: fragmento de anticorpo recombinante <400> 13
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 35 35 ΕΡ 1 461 360/ΡΤ
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 100 105 110
Thr Vai Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 115 120 125
Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 145 150 155 160
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 165 170 175
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro 210 215 220
Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Gly Cys Gly Cys 225 230 235 240
Ala
Lisboa, 2010-11-16
Claims (18)
- ΕΡ 1 461 360/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Composto compreendendo um péptido compreendendo aa) um local de ligação ao antigénio para o domínio B extracelular (ED-B) de fibronectina compreendendo regiões determinantes da complementaridade HCDR3 e/ou LCDR3 tal como apresentadas na tabela 1 ou uma sua variação que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 5 aminoácidos para a região HCDR3 e de até 6 aminoácidos para a região LCDR3, que tem a mesma função que um péptido de acordo com Seq. Id. No. 1, ab) um local de ligação ao antigénio para o domínio B extracelular (ED-B) de fibronectina compreendendo regiões determinantes da complementaridade HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 e LCDR3 tal como apresentadas na tabela 1 ou uma sua variação que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 3 aminoácidos para a região HCDRl, de até 8 aminoácidos para a região HCDR2, de até 5 aminoácidos para a região HCDR3, de até 6 aminoácidos para a região LCDRl, de até 4 aminoácidos para a região LCDR2 e de até 6 aminoácidos para a região LCDR3 que tem a mesma função que um péptido de acordo com Seq. Id. No. 1; ou ac) uma sequência de acordo com Seq. Id. No. 1 (L19) ou uma variação de Seq. Id. No. 1 que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 30 aminoácidos, e que tem a mesma função que um péptido de acordo com Seq. Id. No. 1, e a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No. 7), em que o terminal C de aa), ab) ou ac) está ligado ao terminal N da sequência de aminoácidos Seq. Id. No. 7 através de uma ligação peptídica.
- 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 que está conjugado com um radioisótopo.
- 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que está conjugado com um radioisótopo seleccionado de entre um radioisotopo de Tecnecio, tais como Tc, Tc, Remo, tais ΕΡ 1 461 360/ΡΤ 2/4 como 186 Re, 188Re ou outros isótopos, tais como ZUbPb, b/Ga, b8Ga, 203T 67, 68, 43Sc, 44Sc, 47Sc, 110mIn, 411In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 10SRh, 177Lu, 72As e 18F.
- 4. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que o radioisótopo é 99mTc ou 188Re.
- 5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o péptido está na forma reduzida.
- 6. Composição farmacêutica compreendendo como um agente activo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 conjuntamente com adjuvantes, transportadores e/ou diluentes fisiologicamente aceitáveis.
- 7. Composição da reivindicação 6, que é excretada a 70% ou mais através dos rins num intervalo de 24 horas em ratinhos.
- 8. Composição da reivindicação 6 ou 7 com uma razão de tumor para sangue de 5:1 ou mais 5 h após administração em ratinhos.
- 9. Composição de qualquer uma das reivindicações 6-8 para aplicações em diagnóstico.
- 10. Composição de qualquer uma das reivindicações 6-8 para aplicações terapêuticas.
- 11. Utilização de um péptido compreendendo aa) um local de ligação ao antigénio para o domínio B extracelular (ED-B) de fibronectina compreendendo regiões determinantes da complementaridade HCDR3 e/ou LCDR3 tal como apresentadas na tabela 1 ou uma sua variação que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 5 aminoácidos para a região HCDR3 e de até 6 aminoácidos para a região LCDR3, que tem a mesma função que um péptido de acordo com Seq. Id. No. 1, ab) um local de ligação ao antigénio para o domínio B extracelular (ED-B) de fibronectina compreendendo regiões ΕΡ 1 461 360/ΡΤ 3/4 determinantes da complementaridade HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 e LCDR3 tal como apresentadas na tabela 1 ou uma sua variação que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 3 aminoácidos para a região HCDRl, de até 8 aminoácidos para a região HCDR2, de até 5 aminoácidos para a região HCDR3, de até 6 aminoácidos para a região LCDRl, de até 4 aminoácidos para a região LCDR2 e de até 6 aminoácidos para a região LCDR3 que tem a mesma função que um péptido de acordo com Seq. Id. No. 1; ou ac) uma sequência de acordo com Seq. Id. No. 1 (L19) ou uma variação de Seq. Id. No. 1 que é uma deleção, inserção e/ou substituição de até 30 aminoácidos, e que tem a mesma função que um péptido de acordo com Seq. Id. No. 1, e a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No. 7), em que o terminal C de aa), ab) ou ac) está ligado ao terminal N de Seq. id. No. 7 através de uma ligação peptídica, para ligação de um radioisótopo.
- 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o radioisótopo é seleccionado de entre um radioisótopo de Tecnécio, tais como 94mTc, 99mTc, Rénio, tais como 186Re, 188Re ou outros isótopos, tais como 203Pb, 67Ga, 68Ga, 43Sc, 44Sc, 47Sc, 110mIn, mIn, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 72As e 18f.
- 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o radioisótopo é 99mTc ou 188Re.
- 14. Processo para a produção de um péptido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por o péptido ser expresso em células eucarióticas, nomeadamente em células de levedura.
- 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que as células eucarióticas são células de Pichia pastoris.
- 16. Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que o péptido é expresso constitutivamente. ΕΡ 1 461 360/ΡΤ 4/4
- 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, em que o terminal N do péptido está fundido directamente com o local de clivagem Kex2 da sequência de sinal a.
- 18. Kit para a produção de radiofármacos compreendendo um péptido tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-5, opcionalmente em conjunto com adjuvantes fisiologicamente aceitáveis. Lisboa, 2010-11-16
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