ES2346750T3 - Conjugados que comprenden un anticuerpo especifico para el dominio ed-b de fibronectina y su uso para la deteccion y tratamiento de tumores. - Google Patents
Conjugados que comprenden un anticuerpo especifico para el dominio ed-b de fibronectina y su uso para la deteccion y tratamiento de tumores. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto que comprende un péptido que comprende aa) un sitio de fijación de antígeno para el dominio extra B (ED-B) de fibronectina que comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR3 y/o LCDR3 como se muestran en la Tabla 1 o una variación de las mismas que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 5 aminoácidos para la región HCDR3 y hasta 6 aminoácidos para la región LCDR3, que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1, ab) un sitio de fijación de antígeno para el dominio extra B (ED-B) de fibronectina que comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestran en la Tabla 1 o una variación de las mismas que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 3 aminoácidos para la región HCDR1, hasta 8 aminoácidos para la región HCDR2, hasta 5 aminoácidos para la región HCDR3, hasta 6 aminoácidos para la región LCDR1, hasta 4 aminoácidos para la región LCDR2 y hasta 6 aminoácidos para la región LCDR3 que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1; o ac) una secuencia de acuerdo con Seq. Id. No. 1 (L19) o una variación de Seq. Id. No. 1 que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 30 aminoácidos, y que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1, y la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No. 7), en donde el término C de aa), ab) o ac) está fijado al término N de la secuencia de aminoácidos Seq. Id. No. 7 por un enlace peptídico.
Description
Conjugados que comprenden un anticuerpo
específico para el dominio ED-B de fibronectina y su
uso para la detección y tratamiento de tumores.
La presente invención se refiere a la diagnosis
y el tratamiento de tumores, utilizando nuevos péptidos para
fijación de radionucleidos.
Los tumores no pueden alcanzar más de cierto
peso sin la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) y
se ha consignado una correlación entre la densidad de microvasos y
la invasividad tumoral para varios tumores (Folkman (1995), Nature
Med., 1, 27-31). Además, la angiogénesis está
involucrada en la mayoría de los trastornos oculares que dan como
resultado pérdida de visión (Lee et al., Surv. Ophthalmol.
43, 245 - 269 (1998); Friedlander, M. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93, 9764 - 9769 (1996)). Las moléculas capaces de
direccionar selectivamente marcadores de angiogénesis podrían crear
oportunidades clínicas para la diagnosis y terapia de los tumores y
otras enfermedades caracterizadas por proliferación vascular, tales
como la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada
con el envejecimiento. Los marcadores de angiogénesis se expresan en
la mayoría de los tumores sólidos agresivos en asociación con vasos
tumorales y deberían ser por consiguiente fácilmente accesibles a
ligantes específicos inyectados por vía intravenosa (Pasqualini
et al., (1997), Nature Biotechnol., 15, 542 - 546; Neri
et al. (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271 - 1275). La
oclusión direccionada de la neovasculatura puede dar como resultado
el infarto y el colapso del tumor (O'Reilly et al. (1996),
Nature Med., 2, 689 - 692; Huang et al. (1997), Science, 275,
547 - 550.
El dominio ED-B de fibronectina,
una secuencia de 91 aminoácidos idéntica en ratón, rata y humanos,
que se inserta por corte y empalme alternativos en la molécula de
fibronectina, se acumula específicamente alrededor de estructuras
neo-vasculares (Castellani et al. (1994),
Int. J. Cancer 59, 611-618) y podría representar
una diana para la intervención molecular. De hecho, se ha demostrado
recientemente con técnicas fluorescentes que fragmentos de
anticuerpos Fv anti-ED-B
monocatenarios (scFv) se acumulan selectivamente alrededor de los
vasos sanguíneos tumorales de ratones portadores de tumores, y que
la afinidad de anticuerpos parece dictar la eficiencia de
direccionamiento (Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15,
1271-1275; WO 97/45544).
Adicionalmente, los anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos específicos para fijación del dominio
ED-B de la fibronectina con una constante de
disociación sub-nanomolar, así como derivados
radiomarcados de los mismos se describen en WO 99/58570. La
biodistribución de uno de estos fragmentos de anticuerpos humanos de
afinidad alta, el fragmento de anticuerpo marcado con ^{125}I
denominado L19, fue investigada ya en ratones portadores de tumores
(Tarli et al., Blood, Vol. 94, No. 1 (1999), p.
192-198). Conjugados radiomarcados que comprenden
anticuerpos L19 y su uso para la detección y el tratamiento de la
angiogénesis se describen en WO 01/62800.
La producción recombinante de fragmentos de
anticuerpos F_{v} monocatenarios funcionalizados que se fijan al
dominio ED-B de la isoforma B de fibronectina en
Pichia pastoris ha sido ya descrita (Marty et al.,
Protein Expression and Purification 21, 156-164
(2001)).
Adicionalmente, la radiomarcación de fragmentos
de anticuerpo scFv con ^{99m}Tc por un péptido cisteinilo
C-terminal fue descrita por George et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92 pp. 8358 - 8362, 1995, and por
Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp. 868 -
872, 1996.
Sin embargo, existe todavía necesidad clínica de
proporcionar fragmentos de anticuerpo que tengan propiedades
farmacocinéticas mejoradas, y que puedan marcarse fácilmente con
radioisótopos de v.g. tecnecio o renio, dado que estos
radionucleidos son particularmente adecuados para productos
radiofarmacéuticos.
Es por consiguiente un objeto de la invención
proporcionar fragmentos de anticuerpo que tienen propiedades
farmacocinéticas mejoradas, particularmente especificidad de diana
y/o estabilidad in vivo, y que pueden fijar fácilmente
radioisótopos, v.g. de tecnecio o renio.
La presente invención se define en las
reivindicaciones 1-18.
Los compuestos son preferiblemente fragmentos de
anticuerpo monocatenarios, particularmente fragmentos scFv.
Adicionalmente, los compuestos están conjugados preferiblemente a un
radioisótopo, v.g. un radioisótopo de tecnecio, tal como
^{94m}Tc, ^{99m}Tc, renio, tales como ^{186}Re, ^{188}Re, u
otros isótopos, tales como ^{203}Pb, ^{67}Ga, ^{68}Ga,
^{43}Sc, ^{44}Sc, ^{47}Sc, ^{110m}In, ^{111}In,
^{97}Ru, ^{62}Cu, ^{64}Cu, ^{67}Cu, ^{68}Cu, ^{86}Y,
^{88}Y, ^{90}Y, ^{121}Sn, ^{161}Tb, ^{153}Sm,
^{166}Ho, ^{105}Rh, ^{177}Lu, ^{72}As y ^{18}F.
La presente invención describe también una
composición farmacéutica que comprende el compuesto anterior como
agente activo junto con adyuvantes, diluyentes y/o vehículos
fisiológicamente aceptables.
La presente invención describe también el uso de
un péptido como se define en las reivindicaciones
11-13.
El fragmento de anticuerpo L19 se define por la
secuencia siguiente (Seq. Id. No. 1):
Una deleción, inserción y/o sustitución de hasta
30 aminoácidos es una deleción, inserción y/o sustitución de 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos de Seq. Id. No. 1.
Sin embargo, dentro de las regiones determinantes de
complementariedad (CDRs) el péptido reivindicado, v.g. el péptido
de Seq. Id. No. 1, una variación que es una deleción, inserción y/o
sustitución de aminoácidos (aa) no debería exceder de las
variaciones máximas definidas a continuación en la Tabla 1 (HCDR:
CDR de la cadena pesada; LCDR: CDR de la cadena ligera).
Las CDRs se definieron de acuerdo con E. A.
Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological
Interest", U.S. Department of Health and Human Services,
National Institutes for Health, Bethesda, MD, 5ª edición, 1991.
Se prefieren péptidos que comprenden una
secuencia de acuerdo con Seq. Id. No. 1 (L19) o una variación de
Seq. Id. No. 1 que es una deleción, inserción y/o sustitución de
hasta 20 aminoácidos.
Un péptido que comprende una variación de las
secuencias CDR como se muestran en la Tabla 1 y particularmente una
variación de Seq. Id. No. 1 que es una deleción, inserción y/o
sustitución, y que tiene la misma función que el péptido de acuerdo
con Seq. Id. No. 1, se define como un péptido que se fija al dominio
ED-B de fibronectina con una constante de
disociación K_{d} que está comprendida en el intervalo
subnanomolar (es decir < 10^{-9}), medida con un instrumento
BIAcore (véase WO 99/58570, Ejemplo 2 y Tabla 2).
Secuencias de aminoácidos preferidas
Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Cys
(Seq. Id. No. 2) son las secuencias
Gly-Gly-Gly-Cys
(Seq. Id. No. 5) y
Gly-Cys-Gly-Cys
(Seq. Id. No. 6). Es muy preferida la secuencia
Gly-Gly-Gly-Cys
(Seq. Id. No. 5).
Secuencias de aminoácidos preferidas
Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Cys-Xaa_{4}
(Seq. Id. No. 3) son las secuencias
Gly-Gly-Gly-Cys-Ala
(Seq. Id. No. 7) y
Gly-Cys-Gly-Cys-Ala
(Seq. Id. No. 8). Es muy preferida la secuencia
Gly-Gly-Gly-Cys-Ala
(Seq. Id. No. 7).
En los compuestos que comprenden una secuencia
de aminoácidos (His)_{n} (Seq. Id. No. 4), se prefieren
aquellos compuestos en los cuales n representa el número entero
6.
Radioisótopos preferidos de tecnecio o renio son
los isótopos ^{94m}Tc, ^{99m}Tc, ^{186}Re y ^{188}Re. El
más preferido es el radioisótopo ^{99m}Tc.
El fragmento de anticuerpo monocatenario L19
(Seq. Id. No. 1) se marcó previamente con ^{125}I para investigar
la biodistribución de este compuesto en ratones portadores de
tumores (Tarli et al., Blood, Vol. 94, No. 1 (1999), p.
192-198). Los resultados demuestran que puede
lograrse un direccionamiento selectivo de vasos sanguíneos
tumorales in vivo. Sin embargo, se encontró sorprendentemente
que las propiedades farmacocinéticas del fragmento de anticuerpo
monocatenario L19 pueden mejorarse sustancialmente cuando el mismo
está conjugado a un péptido ba), bb) o bc) y marcado con
radioisótopos de tecnecio o renio. El isótopo ^{99m}Tc es el
radiomarcador de elección para SPECT clínica de rutina debido a sus
propiedades radioquímicas (disponible fácilmente mediante un
generador ^{99}Mo/^{99m}Tc, emite fotones gamma simples de 140
KeV, tiene flujo de fotones alto, y se desintegra con una semivida
de 6 horas) y debido a su efectividad en coste. Para aplicaciones
terapéuticas, es especialmente preferida la marcación con los
isótopos químicamente análogos ^{186}Re y ^{188}Re (Hsieh,
B.T., et al., Nucl. Med. Biol., 1999, 26(8),
967-972; 973-976, Zamora, P.O.,
et al., Anticancer Res., 1997, 17(3B),
1803-1838).
Los péptidos son derivados del anticuerpo
recombinante scFv L19 (Seq. Id. No. 1) contra el dominio
extracelular ED-B de fibronectina y se produjeron
por ingeniería genética de acuerdo con Fig. 1. Se produjeron los
péptidos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de los péptidos se describe en
detalle en los ejemplos siguientes (véase "Experimental").
El fragmento de anticuerpo L19 fue producido
originalmente por expresión en E. coli (véase WO 99/58570).
Sin embargo, para la producción en gran escala de fragmentos de
anticuerpo scFv, se encontró que este sistema de expresión era
insatisfactorio. Se testó otro sistema de expresión, un sistema de
expresión de levadura, particularmente un sistema de expresión de
Pichia pastoris. Los presentes inventores encontraron que la
levadura, v.g., Pichia pastoris es capaz por regla general de
expresión de un fragmento de anticuerpo fuertemente bioactivo, v.g.
el fragmento AP39, pero una expresión de alto rendimiento con hasta
200 mg de fragmento de anticuerpo por litro de cultivo, que es
necesaria para una producción económica de un producto
biofarmacéutico, podía alcanzarse únicamente por un vector de
expresión constitutivo (v.g. pGAP), y no con un vector inducible
por metanol (v.g. pPIC9K). Una ventaja adicional de este sistema de
expresión constitutivo estriba en sus procedimientos de
fermentación simplificados y robustos comparados con una expresión
inducible en levadura. Inesperadamente, los presentes inventores
encontraron que un procesamiento de la secuencia señal apropiada
del fragmento de anticuerpo, v.g. el fragmento AP39, se observaba
únicamente cuando se utilizaba una casete de expresión en la cual
el término N del fragmento estaba fusionado directamente al sitio de
escisión Kex2 de la secuencia señal alfa.
Los péptidos son adecuados para aplicaciones
diagnósticas y terapéuticas, particularmente para la diagnosis y
terapia de tumores invasivos y metástasis de tumores. Aplicaciones
diagnósticas preferidas son SPECT (Topografía Computerizada de
Emisión de Fotones Simples y PET (Topografía de Emisión de
Positrones).
Los péptidos arriba descritos son
particularmente adecuados para marcación de radioisótopos como se ha
descrito arriba, v.g. radioisótopos de tecnecio y renio,
preferiblemente los radionucleidos ^{94m}Tc, ^{99m}Tc,
^{186}Re, y ^{188}Re. Para marcación de los péptidos, los
péptidos se reducen primeramente con un agente reductor apropiado
como v.g. cloruro estannoso o
tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Los
péptidos reducidos resultantes exhiben grupos SH que pueden
reaccionar con el eluato del generador ^{99m}Tc o el eluato del
generador ^{188}Re y cloruro estannoso para dar los compuestos de
la presente invención (para detalles, véanse los ejemplos
experimentales más adelante). La marcación indirecta se realiza por
preconjugación de un ligando quelante y complejación subsiguiente
de radioisótopos, tales como indio, itrio, lantánidos, etc. El
ligando quelante se deriva preferiblemente de ácido
etileno-diamina-tetraacético (EDTA),
ácido
dietileno-triamina-pentaacético
(DTPA), ácido
ciclohexil-1,2-diaminatetraacético
(CDTA), ácido
etilenglicol-O,O'-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-diacético
(HBED), ácido
trietileno-tetraamina-hexaacético
(TTHA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'''-tetraacético
(DOTA), ácido
1,4,7-triazaciclononano-N,N',N''-triacético
(NOTA), y ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TETA), a los grupos amina o tiol de los compuestos peptídicos. Los
ligandos quelantes poseen un grupo de acoplamiento adecuado, v.g.
ésteres activos, maleimidas, tiocarbamatos o restos acetamida
\alpha-halogenados. Para conjugación de ligandos
quelantes a grupos amina, v.g. grupos
\varepsilon-NH_{2} de residuos lisina, no se
requiere la reducción previa de los compuestos peptídicos. Los
péptidos radiomarcados son adecuados para aplicaciones de
radio-diagnóstico y
radio-terapéuticas.
Los péptidos radiomarcados resultantes exhiben
ventajas inesperadas en experimentos con animales. Por ejemplo, la
excreción de un péptido marcado, v.g. AP39 marcado con ^{99m}Tc
(Seq. Id. No. 11) en ratones atímicos ocurre en un 70% o más, v.g.
80, 63% dentro de 24 horas por la vía renal, mientras que para L19
(Seq. Id. No. 1) marcado con ^{125}I, la excreción en ratones
atímicos ocurría sólo en un 67,79% por la vía renal en 24 horas. La
relación de tumor a sangre de un péptido marcado, v.g. AP39 marcado
con ^{99m}Tc es 5:1 o mayor, preferiblemente 8:1 o mayor, v.g.
aproximadamente 10:1 después de 5 horas, mientras que para L19
marcado con ^{125}I, esta relación es sólo aproximadamente 3:1.
Éste es un comportamiento inesperado comparado también con otros
anticuerpos scFv marcados con ^{99m}Tc que exhiben a menudo
características de biodistribución menos favorables. Por ejemplo,
Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp.
868-872, 1996, consignan un anticuerpo scFv marcado
con ^{99m}Tc que exhibe una relación de tumor a sangre de sólo 4:1
después de 24 horas, y una acumulación en riñón de 9% después de 24
horas, que es muy alta comparada con los valores de los péptidos
descritos en la presente invención, v.g. 1,3% para AP39 marcado con
^{99m}Tc (véase el e13 más adelante).
Adicionalmente, la estabilidad in vivo de
los péptidos marcados de la invención, v.g. AP39 marcado con
^{99m}Tc es mucho mayor comparada con la estabilidad in
vivo de L19 marcado con ^{125}I. Los presentes inventores
encontraron que dos horas después de la inyección de un péptido,
v.g. AP39 marcado con ^{99m}Tc únicamente 10% o menos, v.g., 3%
de radiactividad en el suero era debida a un metabolito, mientras
que 2 horas después de la inyección de L19 marcado con ^{125}I,
49% de la radiactividad en el suero era debida a metabolitos, que
pueden ser yodo libre. La estabilidad in vivo mejorada
de los péptidos, v.g. AP39 marcado con ^{99m}Tc se refleja
también por una conservación prolongada de su capacidad de fijación
a la diana ED-B. Los presentes inventores
encontraron que dos horas después de la inyección del péptido, v.g.
AP39 marcado con ^{99m}Tc, 50% o más, v.g. 74% de la
radiactividad en el suero era capaz de fijar ED-B,
mientras que dos horas después de la inyección de L19 marcado con
I-125, únicamente 27% de la radiactividad en el
suero podaría fijarse a ED-B. Los compuestos de
esta invención exhiben también acumulación alta en los tumores. Por
ejemplo, Tc-99m-AP39 y
In-111-MX-DTPA-\varepsilon-HN(Lys)-AP39
exhibían acumulación tumoral alta de 10,7 (Tc-99m) o
12,9 (In-111) % de la dosis inyectada por gramo
(DI/g) al cabo de una hora de la inyección (p.i.). Así pues, la
absorción tumoral es significativamente mayor comparada con otros
fragmentos de anticuerpos conocidos marcados con
In-111 o Tc-99m (v.g. Kobayashi
et al., J. Nuc. Med., Vol. 41(4), pp. 755 - 762, 2000;
Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp. 868 -
872, 1996).
Los compuestos son adecuados para aplicaciones
diagnósticas y terapéuticas. Los mismos se aplican preferiblemente
al paciente por administración parenteral, más preferiblemente por
inyección intravenosa. La dosis en humanos se encuentra
preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 1 mg por paciente para
aplicaciones radiodiagnósticas, y 0,1 a 100 mg por paciente para
aplicaciones radioterapéuticas.
Los métodos para fabricación y marcación de los
compuestos de la presente invención se ilustran más detalladamente
en los ejemplos que siguen. Estos ejemplos se muestran a modo de
ilustración y no como limitación.
El material de partida fue un anticuerpo
recombinante (scFv L19, nombre abreviado L19) contra el dominio
extra B (ED-B) de una variante de corte y empalme
de fibronectina. scFv L19 había sido aislado por medio de selección
de presentación de fago a partir de un repertorio de anticuerpos
humanos sintéticos (Neri et al., 1997, Nature Biotechnol.
15: 1271; Pini et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 21769). Este
fragmento de anticuerpo recombinante se encuentra en la forma de un
denominado fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) y está
constituido por una región VH y una región VL conectadas por una
secuencia enlazadora (véase Seq. Id. No. 1). Este scFv L19 tiene
afinidad excepcionalmente alta para ED-B (K_{d}:
5,4 x 10^{-11} M).
Se produjeron diversos derivados de L19 por
manipulación genética (véase Fig. 1). Para modificar L19, el DNA
codificante de scFv se amplificó por PCR (reacción en cadena de
polimerasa) utilizando iniciadores que codificaban las secuencias
adicionales, y se clonó en vectores de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
- L19:
- Sin modificaciones terminales adicionales
- L19 His:
- Dominio His_{6} C-terminal (identificador His), para cromatografía de quelatos de Ni y para fijación de radioisótopos
- AP38:
- Dominio C-terminal GlyGlyGlyCys para fijación (vía Cys) sustancias que pueden emplearse en terapia y diagnosis (v.g. radioisótopos)
- AP39:
- Dominio C-terminal GlyGlyGlyCysAla para fijación (vía Cys) de sustancias que pueden emplearse en terapia y diagnosis (v.g. radioisótopos)
- L19-GlyCysGlyCys:
- Dominio C-terminal GlyCysGlyCys para fijación (vía Cys) de sustancias que pueden emplearse en terapia y diagnosis (v.g. radioisótopos)
- L19-GlyCysGlyCysAla:
- Dominio C-terminal GlyCysGlyCysAla para fijación (vía Cys) de sustancias que pueden emplearse en terapia y diagnosis (v.g. radioisótopos)
\vskip1.000000\baselineskip
Los derivados de L19 descritos se produjeron en
sistemas de expresión procariotas y eucariotas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de DNA codificantes de diversos
derivados de L19 (AP38, AP39, L19-GlyCysGlyCys,
L19-GlyCysGlyCysAla, L19, L19His) se clonaron en un
vector de expresión procariota (pDN5, Pini et al., 1997, J.
Immunol. Methods 206: 171, Pini et al., 1998, J. Biol. Chem.
273: 21769; pET, Novagen) con promotor inducible por IPTG y marcador
de resistencia a ampicilina. Con objeto de hacer posible la
secreción de la proteína recombinante en el periplasma, se utilizó
este vector para producir una casete de expresión en la cual el
término N de scFv está fusionado a la secuencia señal Pel B. Con
este vector de expresión fue posible establecer cepas productoras
estables por transformación de E. coli (TG1, BL21DE3 y
HB2151), seguido por selección con ampicilina. Para producir scFv,
se cultivaron estas cepas en presencia de 1% de glucosa en la fase
de crecimiento (37ºC) a fin de reprimir el promotor. La expresión
de scFv en los cultivos se indujo por adición de IPTG e incubación a
30ºC durante hasta 16 horas. El material scFv soluble y de fijación
de antígeno pudo aislarse a partir del extracto completo de las
cepas de E. coli, de la fracción periplásmica, o, lo que
resultó ser particularmente eficiente en relación con purificación
y rendimiento, del sobrenadante de cultivo. La producción tuvo lugar
en matraces de sacudidas y en fermentadores con un volumen de
cultivo de hasta 10 litros.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de DNA codificantes de L19His,
AP38, AP39, L19-GlyCysGlyCys and
L19-GlyCysGlyCysAla se amplificaron por PCR y se
clonaron en E. coli y en los vectores de expresión pPIC9K y
pGAP (Invitrogen) para producción en la levadura Pichia
pastoris. Para expresión de genes heterólogos, pPIC9K contiene
un promotor inducible por metanol (AOX1), y pGAP contiene el
promotor constitutivo de la enzima GAPDH. Además, estos vectores
contienen respectivamente un gen de resistencia a la geneticina y
un gen de resistencia a la zeocina para selección/amplificación del
gen extraño y una secuencia señal (del factor \alpha de levadura)
para expresión y secreción del producto recombinante. La casete de
expresión AP39 utilizada codifica una proteína de fusión (señal del
factor \alpha + derivados de L19) que contiene para eliminación
de la secuencia señal únicamente un sitio de escisión Kex2 y no los
otros sitios de escisión del procesamiento natural del factor
\alpha. Se establecieron clones PP transfectados estables por
electroporación de los vectores linealizados en cepas de Pichia
pastoris (v.g. pPIC9K-AP39 en la cepa GS115,
pGAP-AP39 en la cepa X33) y selección subsiguiente
con geneticina o zeocina. Fue posible utilizar estos clones para
producir dichos derivados de L19 como proteína secretora soluble.
Los clones se cultivaron a 30ºC en medio BMGY o medio basal
mineral. Con los clones basados en pPIC, se añadió metanol para
inducción del promotor durante la fase de expresión. El producto
recombinante tenía un término procesado correctamente y actividad
elevada de fijación de antígeno. Los rendimientos que pudieron
alcanzarse (producto impurificado bioactivo/litro de sobrenadante
de cultivo) eran, dependiendo de las condiciones de cultivo y del
control del proceso: v.g. pPIC9K-AP39/GS115 (matraz
de sacudidas 5 mg/l, fermentador 10-15 mg/l);
pGAP-AP39/X33 (matraz de sacudidas
30-40 mg/l, fermentador 100-250
mg/l).
\newpage
Los derivados de L19 se purificaron a partir del
sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris o E. coli
mediante el uso de cromatografía de afinidad (rProteína A,
Streamline Pharmacia o columna de antígeno ED B) con cromatografía
subsiguiente de exclusión por tamaños. La fracción AP39 purificada,
que se empleó para procesamiento ulterior, tenía una estructura de
homodímero (con subunidades enlazadas covalentemente en su mayor
parte) y actividad elevada de fijación de antígeno.
A una solución de 240 \mug (4,29 nmol) de AP38
S-S-dímero en 156 \mul de PBS
(solución salina tamponada con fosfato)/10% glicerina se añadieron
50 \mul de solución de TCEP (14,34 mg TCEP x HCl/5 ml
Na_{2}HPO_{4} acuoso, 0,1M, pH = 7,4). La mezcla de reacción se
agitó cuidadosamente durante una hora a la temperatura ambiente. Se
purificó AP38 SH-monómero por cromatografía en gel
utilizando una columna NAP-5 (Amersham, eluyente:
PBS). El análisis por SDS-PAGE del producto aislado
demostró la transformación cuantitativa de AP38
S-S-dímero en AP38
SH-monómero.
Rendimiento: 79,4 \mug/220 \mul PBS
(33,1%).
Se pusieron 2,37 mg de
L-tartrato disódico en un vial seguido por adición
de 79,4 \mug de AP38 reducido en 220 \mul de PBS y la solución
se diluyó con 100 \mul de tampón de Na_{2}HPO_{4} acuoso (1M,
pH = 10,5). Se añadieron 50 \mul de producto eluido del generador
de Tc-99m (24 h) y 10 \mul de solución de
SnCl_{2} (5 mg SnCl_{2}/1 ml HCl 0,1M). La mezcla de reacción se
agitó mediante sacudidas durante 0,5 h a 37ºC. Se purificó por
cromatografía en gel AP38 marcada con Tc-99m
utilizando una columna NAP-5 (Amersham, eluyente:
PBS).
Rendimiento radioquímico: 39,7%.
Pureza radioquímica: 92,5%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 17,7 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 88,7%.
A una solución de 240 \mug (4,29 nmoles) de
AP39 S-S-dímero en 135 \mul de
PBS/10% glicerina se añadieron 50 \mul de solución de TCEP (14,34
mg de TCEP x HCl/5 ml de Na_{2}HPO_{4} acuoso, 0,1M, pH = 7,4).
La mezcla de reacción se agitó cuidadosamente durante 1 hora a la
temperatura ambiente. Se purificó AP39 SH-monómero
por cromatografía en gel utilizando una columna
NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS). El análisis por
SDS-PAGE del producto aislado demostró la
transformación cuantitativa de AP39
S-S-dímero en AP39
SH-monómero.
Rendimiento: 135,9 \mug/180 \mul PBS
(56,2%).
Se pusieron 4,2 mg de L-tartrato
disódico en un vial seguidos por adición de 135,9 \mug de AP39
reducido en 180 \mul de PBS y la solución se diluyó con 100
\mul de tampón acuoso de Na_{2}HPO_{4} (1M, pH = 10,5). Se
añadieron 100 \mul de producto eluido del generador de
Tc-99m (24 h) y 10 \mul de solución de SnCl_{2}
(5 mg SnCl_{2}/1 ml HCl 0,1M). La mezcla de reacción se agitó
mediante sacudidas durante 0,5 h a 37ºC. la AP39 marcada con
Tc-99m se purificó por cromatografía en gel
utilizando una columna NAP-5 (Amersham, eluyente:
PBS).
Rendimiento radioquímico: 50,1%.
Pureza radioquímica: 91,5%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 21,4 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 96,4%.
Se pusieron 2,37 mg de
L-tartrato disódico en un vial seguido por adición
de 112 \mug de AP38 reducido en 310 \mul de PBS y la solución
se diluyó con 100 \mul de tampón acuoso de Na_{2}HPO_{4} (1M,
pH = 10,5). Se añadieron 100 \mul del producto eluido del
generador de Re-188 y 50 \mul de solución de
SnCl_{2} (5 mg SnCl_{2}/1 ml de HCl 0,1M). La mezcla de
reacción se agitó mediante sacudidas durante 1,5 h a 37ºC. Se
purificó por cromatografía en gel AP38 marcada con
Re-188 utilizando una columna NAP-5
(Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 28,3%.
Pureza radioquímica: 91,1%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 15,3 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 89,9%.
Se pusieron 2,37 mg de
L-tartrato disódico en un vial seguido por adición
de 112 \mug de AP39 reducido en 300 \mul de PBS y la solución
se diluyó con 100 \mul de tampón acuoso de Na_{2}HPO_{4} (1M,
pH = 2,5). Se añadieron 100 \mul de producto eluido del generador
de Re-188 y 50 \mul de solución de SnCl_{2} (5
mg SnCl_{2}/1 ml HCl 0,1M). La mezcla de reacción se agitó
mediante sacudidas durante 1,5 h a 37ºC. Se purificó AP39 marcada
con Re-188 por cromatografía en gel utilizando una
columna NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 33,5%.
Pureza radioquímica: 92,3%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 18,5 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 92,5%.
A una solución de 240 \mug (4,29 nmoles) de
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH
S-S-dímera en 160 \mul de PBS/10%
de glicerina se añadieron 75 \mul de solución de TCEP (14,44 mg
de TCEP x HCl/5 ml de Na_{2}HPO_{4} acuoso, 0,1M, pH = 7,4). La
mezcla de reacción se agitó cuidadosamente durante 1 hora a la
temperatura ambiente. Se purificó
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH
SH-monómera por cromatografía en gel utilizando una
columna NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS). El
análisis SDS-PAGE del producto aislado demostró la
transformación cuantitativa de
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH
S-S-dímera en
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH
SH-monómera.
Rendimiento: 80,4 \mug/210 \mul PBS
(33,5%).
Se pusieron 2,37 mg de
L-tartrato disódico en un vial seguido por adición
de 80,4 \mug de
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH
reducido en 210 \mul de PBS y la solución se diluyó con 100
\mul de tampón acuoso de Na_{2}HPO_{4} (1M, pH = 10,5). Se
añadieron 50 \mul de producto eluido del generador de
Tc-99m (24 h) y 10 \mul de solución de SnCl_{2}
(5 mg SnCl_{2}/1 ml HCl 0,1M). La mezcla de reacción se agitó
mediante sacudidas durante 0,5 h a 37ºC. La
L19-Gly-Cys-GLy-Cys-OH
marcada con Tc-99m se purificó por cromatografía en
gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham,
eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 37,7%.
Pureza radioquímica: 91,5%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 19,7 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 89,7%.
A una solución de 240 \mug (4,29 nmoles) de
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
S-S-dímero en 155 \mul de PBS/10%
glicerina se añadieron 75 \mul de solución de TCEP (14,34 mg TCEP
x HCl/5 ml de Na_{2}HPO_{4} acuoso, 0,1M, pH = 7,4). La mezcla
de reacción se agitó cuidadosamente mediante sacudidas durante 1 h a
la temperatura ambiente. El
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
SH-monómero se purificó por cromatografía en gel
utilizando una columna NAP-5 (Amersham, eluyente:
PBS). El análisis SDS-PAGE del producto aislado
demostró la transformación cuantitativa de
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
S-S-dímero en
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
SH-monómero.
Rendimiento: 81,2 \mug/215 \mul PBS
(33,8%).
Se pusieron 2,37 mg de
L-tartrato disódico en un vial seguido por adición
de 81,2 \mug de
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
reducido en 215 \mul de PBS y la solución se diluyó con 100
\mul de tampón acuoso de Na_{2}HPO_{4} (1M, pH = 10,5). Se
añadieron 50 \mul de producto eluido del generador de
Tc-99m (24 h) y 10 \mul de solución de SnCl_{2}
(5 mg SnCl_{2}/1 ml HCl 0,1M). La mezcla de reacción se agitó
mediante sacudidas durante 0,5 h a 37ºC. Se purificó por
cromatografía en gel
L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH
marcada con Tc-99m utilizando una columna
NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 35,6%.
Pureza radioquímica: 93,5%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 19,1 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 88,7%.
Se añadieron 50 \mul de solución de TCEP
(14,34 mg TCEP x HCl/5 ml de Na_{2}HPO_{4} acuoso, 0,1M, pH =
7,4) a una solución de 400 \mug (7,1 nmoles) de AP39 en 450 \mul
de PBS. La mezcla de reacción se agitó cuidadosamente mediante
sacudidas durante 1 h a 37ºC. Se purificó por cromatografía en gel
AP39 reducido utilizando una columna NAP-5
(Amersham, eluyente: tampón de acetato de sodio, 0,1M, pH 5,0). El
análisis SDS-PAGE del producto aislado demostró la
transformación completa de AP39 en AP39 reducido.
Rendimiento: 140 \mug/200 \mul (35%).
Se disolvieron 512 mg (1 mmol) de ácido
{[3-(4-amino-fenil)-2-(bis(carboximetil-amino)-propil]-[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-amino}-acético
(Macrocyclics Inc. Dallas, TX, EE.UU.) y 707 mg (7 mmoles) de
trietilamina en 3 ml de DMF seca. Se añadieron gota a gota 400 mg
(1,5 mmoles) de éster
2,5-dioxo-pirrolidin-1-ílico
de ácido
3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-propiónico
(Aldrich) en 1 ml de DMF seco. La solución se agitó durante 5 h a
50ºC. Se añadieron lentamente 30 ml de dietiléter. La mezcla de
reacción se agitó durante 30 min más. El precipitado se recogió por
filtración. El producto bruto se purificó por
RP-HPLC (acetonitrilo-:agua-:ácido
trifluoroacético/3:96,9:0,1 \rightarrow 99,9:0:0,1). Rendimiento:
61% (405 mg, 0,61 mmoles). MS-ESI: 664 = M^{+} +
1.
Se hicieron reaccionar 140 \mug (5 nmoles) de
AP39-R en 200 \mul de tampón de acetato de sodio
(0,1M, pH 5) con 50 \mul de
1,4,7-triaza-2-(N-maleimido-etileno-p-amino)bencil-1,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metilheptano
disuelto (0,25 mg de DTPA-maleimida en 500 \mul
de tampón de acetato de sodio 0,1M, pH 5) durante 3 h a 37ºC. La
mezcla de reacción se dializó 2 x 1 h con 200 ml de tampón de
acetato de sodio (0,1M, pH 6) empleando un equipo
Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO (Pierce
Inc., Rockford, IL, EE.UU.).
\newpage
Se añadieron 80 \mul de solución de
[In-111]InCl_{3} (HCl, 1N, 40 MBq, Amersham
Inc.) y la mezcla de reacción se calentó a 37ºC durante 30 min. Se
purificó por cromatografía en gel
DTPA-maleimida-S(Cys)-AP39-R
marcada con In-111 utilizando una columna
NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 54%.
Pureza radioquímica: 94%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 6,2 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 86%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron 200 \mug (3,6 nmoles) de
AP-39 no reducido en 111 \mul de PBS con 300
\mul de tampón de borato de sodio (0,1M, pH 8,5) y se dializaron
2 x 1 h con 200 \mul de tampón de borato de sodio (0,1M, pH 8,5)
empleando un equipo Slide-A-Lyzer
10.000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, EE.UU.). Se añadieron 50
\mul de solución de
1,4,7-triaza-2-(p-isotiocianato)bencil-1,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano
(MX-DTPA) (0,33 mg de MX-DTPA
disueltos en 500 \mul de tampón de borato de sodio, 0,1M, pH 8,5)
y la mezcla de reacción se calentó durante 3 h a 37ºC. La mezcla de
reacción se dializó 2 x 1 h y 1 x 17 h (durante una noche) con 200
ml de tampón de acetato de sodio (0,1M, pH 6,0) cada vez, empleando
el equipo Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO
(Pierce Inc., Rockford, IL,
EE.UU.).
EE.UU.).
Se añadieron 80 \mul de solución de
[In-111]InCl_{3} (HCl, 1M, 40 MBq, Amersham
Inc.) y la mezcla de reacción se calentó a 37ºC durante 30 min. Se
purificó por cromatografía en gel
MX-DTPA-\varepsilon-HN(Lys)-AP39
marcada con In-111 utilizando una columna
NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 70%.
Pureza radioquímica: 85%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 7,6 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 74%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron 200 \mug (3,6 nmoles) de AP39 no
reducido en 114 \mul de PBS con 300 \mul de tampón de borato de
sodio (0,1M, pH 8,5) y se dializaron 2 x 1 h con 200 ml de tampón de
borato de sodio (0,1M, pH 8,5) empleando un equipo
Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO (Pierce
Inc., Rockford, IL, EE.UU.). Se añadieron a la solución 50 \mul
de solución de ácido
1,4,7,10-tetraaza-2-p-isotiocianato)bencil-ciclododecano-1,4,7,10-tetraacético(bencil-p-SCN-DOTA,
Macrocyclics Inc., Dallas, TX, EE.UU.) (1,5 mg de
bencil-p-SCN-DOTA
disueltos en 5 ml de tampón de borato de sodio, 0,1M, pH 8,5), y la
mezcla de reacción se calentó durante 3 h a 37ºC. La mezcla de
reacción se dializó 2 x 1 h y 1 x 17 h (durante una noche) con 200
ml de tampón de acetato de sodio (0,1M, pH 6,0) cada vez, empleando
el equipo Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO
(Pierce Inc., Rockford, IL, EE.UU.).
Se añadieron 80 \mul de solución de
[In-111]InCl_{3} (HCl, 1N, 40 MBq,
Amersham, Inc.) y la mezcla de reacción se calentó a 37ºC durante
30 min. Se purificó por cromatografía en gel
DOTA-C-bencil-p-NCS-\varepsilon-HCN(Lys)AP39
marcada con In-111 utilizando una columna
NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 74%.
Pureza radioquímica: 94%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 12,3 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 73%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron 200 \mug (3,6 nmoles) de AP39 no
reducido en 115 \mul de PBS con 300 \mul de tampón de borato de
sodio (0,1M, pH 8,5) y se dializaron 2 x 1 h con 200 ml de tampón de
borato de sodio (0,1M, pH 8,5) empleando un equipo
Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO (Pierce
Inc., Rockford, IL, EE.UU.). Se añadieron 50 \mul de solución de
MX-DTPA (0,33 mg de MX-DTPA
disueltos en 500 \mul de tampón de borato de sodio, 0,1M, pH
8,5), y la mezcla de reacción se calentó durante 3 h a 37ºC. La
mezcla de reacción se dializó 2 x 1 h y 1 x 17 h (durante una
noche) con 200 ml de tampón de acetato de sodio (0,1M, pH 6,0) cada
vez, empleando el equipo
Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO (Pierce
Inc., Rockford, IL, EE.UU.).
Se añadieron 100 \mul de solución de
[Y-88]YCl_{3} (HCl, 1N, 75 MBq, Oak Ridge
National Lab.) y la mezcla de reacción se calentó a 37ºC durante 30
min. Se purificó por cromatografía en gel
MX-DTPA-\varepsilon-HN(Lys)AP39
marcada con Y-88 utilizando una columna
NAP-5 (Amersham, eluyente: PBS).
Rendimiento radioquímico: 65%.
Pureza radioquímica: 93%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 10,2 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 72%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron 200 \mug (3,6 nmoles) de AP39 no
reducido en 110 \mul de PBS con 300 \mul de tampón de borato de
sodio (0,1M, pH 8,5) y se dializaron 2 x 1 h con 200 ml de tampón de
borato de sodio (0,1M, pH 8,5) empleando un instrumento
Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO (Pierce
Inc., Rockford, IL, EE.UU.). Se añadieron 50 \mul de solución de
bencil-p-SCN-DOTA
(1,5 mg disueltos en 5 ml de tampón de borato de sodio, 0,1M, pH
8,5) y la mezcla de reacción se calentó durante 3 h a 37ºC. La
mezcla de reacción se dializó 2 x 1 h y 1 x 17 h (durante una
noche) con 200 ml de tampón de acetato de sodio (0,1M, pH 6,0) cada
vez, empleando el equipo
Slide-A-Lyzer 10.000 MWCO (Pierce
Inc., Rockford, IL, EE.UU.).
Se añadieron 200 \mul de solución de
[Lu-177]LuCl3 (HCl, 1N, 80 MBq,
NRH-Petten, Países Bajos) y la mezcla de reacción
se calentó a 37ºC durante 30 min. Se purificó
DOTA-C-bencil-p-NCS-\varepsilon-HN(Lys)AP39
marcada con Lu-177 por cromatografía en gel
utilizando una columna NAP-5 (Amersham, eluyente:
PBS).
Rendimiento radioquímico: 74%.
Pureza radioquímica: 95%
(SDS-PAGE).
Actividad específica: 19 MBq/nmol.
Inmunorreactividad: 71%.
\vskip1.000000\baselineskip
La sustancia se inyecta por vía intravenosa en
una dosis de aproximadamente 74 kBq en animales portadores de F9
(teratocarcinoma) (peso corporal aproximadamente 25 g). Se miden la
concentración de radiactividad en diversos órganos, y la
radiactividad en la excreta utilizando un contador \gamma en
diversos momentos después de la administración de la sustancia.
Adicionalmente, se encuentra la relación de tumor a sangre en
diversos momentos sobre la base de la concentración de la sustancia
de la invención en el tumor y en la sangre.
La biodistribución de
Tc-99m-AP39 en los ratones atímicos
portadores de F9 (teratocarcinoma) (valor medio \pm SD, n = 3) se
muestra en la Tabla 2:
La excreción de
Tc-99m-AP39 en ratones atímicos
portadores de F9 (teratocarcinoma) (valor medio \pmSD, n = 3) se
muestra en la Tabla 3:
La relación de tumor a sangre de
Tc-99m-AP39 en ratones atímicos
portadores de F9 (teratocarcinoma) (valor medio \pmSD, n = 3) se
muestra en Fig. 2.
Los resultados de esta investigación demuestran
el excelente potencial de la sustancia para acumulación en tumores
sólidos con excreción simultánea excelente.
\vskip1.000000\baselineskip
La sustancia se inyecta por vía intravenosa en
una dosis de aproximadamente 48 kBq en animales portadores de F9
(teratocarcinoma) (peso corporal aproximadamente 25 g). Se miden la
concentración de radiactividad en diversos órganos, y la
radiactividad en la excreta utilizando un contador gamma en diversos
momentos después de la administración de la sustancia.
La biodistribución de
In-111-MX-DTPA-\varepsilon-HN(Lys)-AP39
en los ratones atímicos portadores de F9 (teratocarcinoma) (valor
medio \pm SD, n = 3) se muestra en la Tabla 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La relación de tumor a sangre de
In-111-MX-DTPA-\varepsilon-HN(Lys)-AP39
en los ratones atímicos portadores de F9 (teratocarcinoma) (valor
medio \pm SD, n = 3) se muestra en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de esta investigación denotan el
excelente potencial de la sustancia para acumulación en tumores
sólidos emparejada con una excelente biodistribución y relación de
tumor a sangre.
La sustancia se inyecta por vía intravenosa en
una dosis de aproximadamente 9,25 MBq en animales portadores de F9
(teratocarcinoma) (peso corporal aproximadamente 25 g). La
producción de las imágenes con la cámara gamma se lleva a cabo en
diversos momentos después de la administración de la sustancia.
La escintigrafía plana de
Tc-99m-AP39 en ratones atímicos
portadores de F9 (teratocarcinoma) se muestra en las Figuras 3 y 4.
Fig. 3 muestra el escintigrama 5 horas después de la inyección de la
sustancia, y Fig. 4 muestra el escintigrama 24 horas después de la
inyección de la sustancia.
Este resultado demuestra el excelente potencial
de la sustancia para producción de imágenes de tumores sólidos.
<110> Schering AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos métodos para diagnosis y
tratamiento de tumores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 27041P_WOAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP02 000 315.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-01-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/358702
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-02-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(116)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (117)..(130)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (131)..(238)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<22i> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Deleción, inserción y/o sustitución
de hasta 30 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representan independientemente
cada uno cualquier aminoácido existente naturalmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representan independientemente
cada uno cualquier aminoácido existente naturalmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa cualquier aminoácido
existente naturalmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His=(His)n, donde n significa
un número entero de 4 a 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
Claims (18)
1. Un compuesto que comprende un péptido que
comprende
- aa)
- un sitio de fijación de antígeno para el dominio extra B (ED-B) de fibronectina que comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR3 y/o LCDR3 como se muestran en la Tabla 1 o una variación de las mismas que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 5 aminoácidos para la región HCDR3 y hasta 6 aminoácidos para la región LCDR3, que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1,
- ab)
- un sitio de fijación de antígeno para el dominio extra B (ED-B) de fibronectina que comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestran en la Tabla 1 o una variación de las mismas que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 3 aminoácidos para la región HCDR1, hasta 8 aminoácidos para la región HCDR2, hasta 5 aminoácidos para la región HCDR3, hasta 6 aminoácidos para la región LCDR1, hasta 4 aminoácidos para la región LCDR2 y hasta 6 aminoácidos para la región LCDR3 que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1; o
- ac)
- una secuencia de acuerdo con Seq. Id. No. 1 (L19) o una variación de Seq. Id. No. 1 que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 30 aminoácidos, y que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1,
y la secuencia de aminoácidos
Gly-Gly-Gly-Cys-Ala
(Seq. Id. No. 7), en donde el término C de aa), ab) o ac) está
fijado al término N de la secuencia de aminoácidos Seq. Id. No. 7
por un enlace peptídico.
2. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 que está conjugado a un radioisótopo.
3. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que está conjugado a un radioisótopo
seleccionado de un radioisótopo de tecnecio, tal como ^{94m}Tc,
^{99m}Tc, renio, tal como ^{186}Re, ^{188}Re u otros isótopos
tales como ^{203}Pb, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{43}Sc, ^{44}Sc,
^{47}Sc, ^{110m}In, ^{111}In, ^{97}Ru, ^{62}Cu,
^{64}Cu, ^{67}Cu, ^{68}Cu, ^{86}Y, ^{88}Y, ^{90}Y,
^{121}Sn, ^{161}Tb, ^{153}Sm, ^{166}Ho, ^{105}Rh,
^{177}Lu, ^{72}As y ^{18}F.
4. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 3, en donde el radioisótopo es ^{99m}Tc o
^{188}Re.
5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, en donde el péptido
está en forma reducido.
6. Una composición farmacéutica que comprende
como agente activo un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5 junto con adyuvantes,
vehículos y/o diluyentes fisiológicamente aceptables.
7. La composición de la reivindicación 6, que
se excreta hasta un 70% o más a través de los riñones en 24 horas
en los ratones.
8. La composición de la reivindicación 6 ó 7
que tiene una relación de tumor a sangre de 5:1 o más 5 h después
de la administración en los ratones.
9. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 6-8 para aplicaciones
diagnósticas.
10. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 6-8 para aplicaciones
terapéuticas.
11. Uso de un péptido que comprende
- aa)
- un sitio de fijación de antígeno para el dominio extra B (ED-B) de fibronectina que comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR3 y/o LCDR3 como se muestran en la Tabla 1 o una variación de las mismas que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 5 aminoácidos para la región HCDR3 y hasta 6 aminoácidos para la región LCDR3, que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1,
- ab)
- un sitio de fijación de antígeno para el dominio extra B (ED-B) de fibronectina que comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestran en la Tabla 1 o una variación de las mismas que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 3 aminoácidos para la región HCDR1, hasta 8 aminoácidos para la región HCDR2, hasta 5 aminoácidos para la región HCDR3, hasta 6 aminoácidos para la región LCDR1, hasta 4 aminoácidos para la región LCDR2 y hasta 6 aminoácidos para la región LCDR3 que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1; o
\newpage
- ac)
- una secuencia de acuerdo con Seq. Id. No. 1 (L19) o una variación de Seq. Id. No. 1 que es una deleción, inserción y/o sustitución de hasta 30 aminoácidos, y que tiene la misma función que un péptido de acuerdo con Seq. Id. No. 1,
y la secuencia de aminoácidos
Gly-Gly-Gly-Cys-Ala
(Seq. Id. No. 7), en donde el término C de aa), ab) o ac) está
fijado al término N de Seq. Id. No. 7 por un enlace peptídico, para
fijación de un radioisótopo.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación
11, en donde el radioisótopo se selecciona de un radioisótopo de
tecnecio, tal como ^{94m}Tc, ^{99m}Tc, renio, tal como
^{186}Re, ^{188}Re, u otros isótopos, tales como ^{203}Pb,
^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{43}Sc, ^{44}Sc, ^{47}Sc,
^{110m}In, ^{111}In, ^{97}Ru, ^{62}Cu, ^{64}Cu,
^{67}Cu, ^{68}Cu, ^{86}Y, ^{88}Y, ^{90}Y, ^{121}Sn,
^{161}Tb, ^{153}Sm, ^{166}Ho, ^{105}Rh, ^{177}Lu,
^{72}As y ^{18}F.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación
12, en donde el radioisótopo es ^{99m}Tc o ^{188}Re.
14. Un proceso para la producción de un
péptido como se define en la reivindicación 1, caracterizado
porque el péptido se expresa en células eucariotas, particularmente
en células de levadura.
15. El proceso de acuerdo con la
reivindicación 14, en donde las células eucariotas son células de
Pichia pastoris.
16. El proceso de acuerdo con la
reivindicación 14 ó 15, en donde el péptido se expresa
constitutivamente.
17. El proceso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 14-16, en donde el término N
del péptido está fusionado directamente al sitio de escisión Kex2
de la secuencia señal \alpha.
18. Un kit para la producción de productos
radiofarmacéuticos que comprenden un péptido como se define en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5,
opcionalmente junto con adyuvantes fisiológicamente aceptables.
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