PT1817345E - Anticorpos contra a tenascina c - Google Patents

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PT1817345E
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Michela Silacci
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Description

ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Anticorpos contra a tenascina C" 0 presente invento refere-se a elementos de ligação especifica dirigidos contra a tenascina C, em particular anticorpos humanos contra a tenascina C humana. Estes elementos de ligação especifica possuem uma variedade de aplicações terapêuticas, por exemplo, no diagnóstico e no tratamento do cancro. A tenascina C é uma glicoproteína hexamérica grande da matriz extracelular que modula a adesão celular. Está envolvida em processos como a proliferação celular e a migração celular e está associada a alterações na arquitectura dos tecidos, como as que ocorrem durante a morfogénese e a embriogénese, assim como na tumorigénese ou na angiogénese. A estrutura esquemática dos domínios da tenascina C está representada na Figura 1. É possível gerar várias isoformas de tenascina C em resultado da excisão alternativa ("splicing" alternativo), a qual poderá conduzir à inclusão de (múltiplos) domínios na parte central desta proteína, estendendo-se do domínio AI ao domínio D [Borsi L et al Int J Câncer 1992; 52:688-692, Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567] . Havia-se previamente assumido que os domínios Al - D podiam ser inseridos ou omitidos "em bloco" na molécula de tenascina C por meio de um mecanismo de excisão alternativa, originando moléculas de "tenascina C grande" e "tenascina C pequena" [Borsi L et al J Biol Chem 1995; 270:6243-6245]. Uma sobre-expressão forte da isoforma grande da tenascina C tem sido referida para um certo número de tumores [Borsi 1992 supra], e dois anticorpos monoclonais específicos para os domínios Al e D, respectivamente, têm sido extensamente caracterizados em clínica [Riva P et al. Int J Câncer 1992; 51:7-13, Riva P et al. Câncer Res 1995; 55: 5952s-5956s,
Paganelli G et al Eur J Nucl Med 1994; 21:314-321, Reardon DA et al. J Clin Oncol 2002; 20:1389-1397, Bigner DD et al. J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212].
Contudo, recentemente tornou-se claro que existe uma regulação mais complexa do mecanismo de excisão alternativa, 2 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ conduzindo a uma maior heterogeneidade molecular entre as isoformas grandes da tenascina C. Por exemplo, tem sido referido que o dominio C adicional da tenascina C apresenta um padrão de expressão mais restrito em comparação com os outros dominios da tenascina C que sofreram excisão alternativa [Carnemolla B et ai. Aui J Pathol 1999; 154:1345-1352], com uma coloração predominantemente perivascular como visualizado por imuno-histoquimica. 0 dominio C da tenascina C é indetectável na maioria dos tecidos adultos normais, mas é sobre-expresso em astrocitomas de alto grau [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352] e em outros tipos de tumores. Um suporte adicional para a heterogeneidade entre as isoformas grandes da tenascina C advém das análises da transcrição, que confirmaram que os transcritos da tenascina C grande apresentam uma composição heterogénea [Katenkamp K et al. J Pathol 2004; 203:771-779]. Um nivel adicional de complexidade é fornecido pela presença ou ausência de modificações pós-tradução (por exemplo, glicosilação), que poderão modificar determinados epitopos na superfície dos domínios individuais da proteína e torná-los indisponíveis para um reconhecimento molecular especifico in vítro ou in vivo por anticorpos monoclonais específicos.
Apesar do isolamento rápido de anticorpos específicos para virtualmente qualquer proteína de interesse poder ser realizado com as metodologias existentes in vítro, não é óbvio que estes anticorpos reconheçam o epítopo em espécimes biológicos ou em modelos animais da doença. Possíveis razões para a ausência de ligação in vivo incluem modificações pós-tradução do epitopo, a dissimulação do epítopo e uma especificidade ou estabilidade insuficientes do anticorpo. É, por conseguinte, difícil avaliar a adequação de anticorpos monoclonais para aplicações práticas, com base unicamente na sua reactividade com antigénios (ou fragmentos de antigénios) recombinantes em ensaios em fase sólida típicos, como sejam os ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA), que são utilizados rotineiramente para o rastreio de anticorpos monoclonais.
Assim, os anticorpos monoclonais para os dominios individuais das isoformas grandes da tenascina C necessitam 3 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ ser analisados individualmente, de modo a avaliar a sua adequação para aplicações terapêuticas e de diagnóstico.
Os presentes inventores isolaram fragmentos de anticorpos monoclonais humanos específicos para o domínio Al, na região da tenascina C que sofreu excisão alternativa. Estes anticorpos são caracterizados pela sua capacidade de reconhecer as isoformas grandes da tenascina C em espécimes biológicos, assim como por uma ligação grandemente específica em ensaios ELISA, com uma diferenciação surpreendente entre antigénios intimamente relacionados.
Um aspecto do invento proporciona um elemento de ligação específica que se liga à tenascina C humana, em particular à isoforma grande da tenascina C.
Os elementos de ligação específica preferidos são específicos para tumores e ligam-se preferencialmente ao tecido tumoral relativamente ao tecido normal. Os elementos de ligação específica poderão, por exemplo, ligar-se ao estroma e/ou às estruturas neovasculares e perivasculares do tecido tumoral relativamente ao tecido normal.
Um elemento de ligação específica poderá ligar-se preferencialmente à isoforma grande da tenascina C em relação à isoforma pequena da tenascina C. 0 invento proporciona elementos de ligação específica tal como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
Por exemplo, um elemento de ligação específica adequado poderá compreender o domínio VL de 4A1-F16/3A1-D5 da SEQ ID NO:4 ou da SEQ ID NO:50 e/ou o domínio VH de 4A1-F16 da SEQ ID NO:2 ou o domínio VH de 3A1-D5 da SEQ ID NO:12. 4A1-F16 é aqui também designado por F16.
Geralmente, um domínio VH é emparelhado com um domínio VL para fornecer um local de ligação ao antigénio do anticorpo. Em uma concretização preferida, um domínio VH aqui descrito (isto é, SEQ ID NOS. 2 ou 12) é emparelhado com o domínio VL correspondente (isto é, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:50), pelo que é formado um local de ligação ao antigénio do anticorpo compreendendo ambos os domínios VH e VL. 4 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
As regiões CDR são geralmente definidas segundo Kabat. Preferencialmente, um domínio VH e/ou um domínio VL compreende uma CDRl, uma CDR2 e uma CDR3. A CDRl de VH de 4A1-F16 está ilustrada na SEQ ID NO: 5. A CDRl de VH de 3A1-D5 está representada na SEQ ID NO: 13. As CDR 2 e 3 de VH de 4A1-F16 e 3A1-D5 estão ilustradas nas SEQ ID NO: 6 e 7, respectivamente. As CDR' 1, 2 e 3 de VL de 4A1-F16 e 3A1-D5 estão representadas nas SEQ ID NOS: 8, 9 e 10, respectivamente.
Em algumas concretizações, um elemento de ligação específica poderá compreender um domínio VH de anticorpo compreendendo uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e uma CDRl com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5 ou, mais preferencialmente, SEQ ID NO:13.
Preferencialmente, o elemento de ligação específica é um fragmento scFv, tal como descrito em maior detalhe em outro local. Os domínios VH e VL poderão ser unidos através de um ligante peptídico, por exemplo, um ligante que possui uma sequência de aminoácidos tal como descrita na SEQ ID NO:37. Normalmente, o ligante possui uma sequência de aminoácidos compreendendo uma ou mais repetições em tandem de um motivo. Tipicamente, o motivo é uma sequência com cinco resíduos e, preferencialmente, pelo menos 4 dos resíduos são Gly ou Ser. Quando quatro dos cinco resíduos são Gly ou Ser, o outro resíduo poderá ser Ala. Mais preferencialmente, cada um dos cinco resíduos é Gly ou Ser. Os motivos preferidos são GGGGS, SSSSG, GSGSA e GGSGG (SEQ ID NO: 76, 77, 78 e 79, respectivamente). Preferencialmente, os motivos são adjacentes na sequência, sem nucleótidos intermédios entre as repetições. A sequência do ligante poderá compreender, ou consistir em, entre um e cinco, preferencialmente três ou quatro, repetições do motivo. Por exemplo, um ligante com três repetições em tandem poderá ter uma das seguintes sequências de aminoácidos: GGGGSGGGGSGGGGS - SEQ ID NO:39 SSSSGSSSSGSSSSG - SEQ ID NO:41 GSGSAGSGSAGSGSA - SEQ ID NO:42 GGSGGGGSGGGGSGG - SEQ ID NO:43. 5 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ É possível obter variantes dos domínios VH e VL e das regiões CDR, cujas sequências estão aqui descritas e que podem ser empregues em elementos de ligação específica para a tenascina C, por meio de métodos de alteração da sequência ou por mutação e rastreio. Estes métodos também são proporcionados pelo presente invento.
Variantes da sequência de aminoácidos do domínio variável de qualquer um dos domínios VH e VL cujas sequências estão aqui especificamente descritas poderão ser empregues de acordo com o presente invento, tal como discutido. As variantes particulares poderão incluir uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), em que há menos de 5 alterações, 4, 3, 2 ou 1. As alterações poderão ser efectuadas em uma ou mais regiões de estrutura e/ou em uma ou mais regiões CDR. Em particular, as alterações poderão ser efectuadas em CDRl de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH, especialmente CDR3 de VH.
Um elemento de ligação específica de acordo com o invento poderá ser um elemento que compete pela ligação ao antigénio com qualquer elemento de ligação específica, em que ambos se ligam à isoforma grande da tenascina C, em particular aos seus domínios Al ou C, e compreende um elemento de ligação específica, um domínio VH e/ou VL aqui descrito, uma CDR de VH aqui descrita, ou uma variante de qualquer uma destas espécies. A competição entre os elementos de ligação poderá ser testada facilmente in vitro, por exemplo, utilizando um ensaio ELISA e/ou marcando um elemento de ligação com uma molécula repórter específica, o qual pode ser detectado na presença de outro(s) elemento(s) de ligação não marcado(s), para permitir a identificação de elementos de ligação específica que se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo de sobreposição.
Assim, um aspecto adicional do presente invento proporciona um elemento de ligação específica compreendendo um local de ligação ao antigénio de um anticorpo humano, que compete com 4A1-F16 ou 3A1-D5 pela ligação à tenascina C. 6 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Estão disponíveis na especialidade vários métodos para obter anticorpos contra a isoforma grande da tenascina C, que poderão competir com 4A1-F16 ou 3A1-D5. Preferencialmente, estes anticorpos ligam-se à isoforma grande da tenascina C relativamente à isoforma pequena da tenascina C.
Um método de obtenção de um ou mais elementos de ligação específica capazes de se ligar ao antigénio poderá compreender a colocação de uma biblioteca de elementos de ligação específica de acordo com o invento em contacto com o referido antigénio, e a selecção de um ou mais elementos de ligação específica da biblioteca capazes de se ligar ao referido antigénio. A biblioteca poderá ser apresentada na superfície de partículas bacteriofágicas, em que cada partícula contém um ácido nucleico que codifica o domínio variável VH do anticorpo à sua superfície e, opcionalmente, também um domínio VL caso este esteja presente.
Após a selecção dos elementos de ligação específica capazes de se ligar ao antigénio e que estão apresentados em partículas bacteriofágicas, o ácido nucleico poderá ser recolhido de uma partícula bacteriofágica que apresenta um referido elemento de ligação específica seleccionado. Este ácido nucleico poderá ser utilizado para a produção subsequente de um elemento de ligação específica ou de um domínio variável VH de anticorpo (opcionalmente, de um domínio variável VL de anticorpo) através de expressão a partir da sequência de ácido nucleico que foi recuperada de uma partícula bacteriofágica que apresenta um referido elemento de ligação específica seleccionado.
Um domínio variável VH de anticorpo com a sequência de aminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo de um referido elemento de ligação específica seleccionado poderá ser proporcionado sob uma forma isolada, da mesma forma que um elemento de ligação específica compreendendo um domínio VH destes também poderá ser proporcionado. 7 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ A capacidade de ligar a tenascina C poderá ser adicionalmente testada, assim como a capacidade para competir com 4A1-F16 ou 3A1-D5 pela ligação à tenascina C.
Um elemento de ligação especifica de acordo com o presente invento poderá ligar-se à tenascina C com a afinidade de 4A1-F16 ou de 3A1-D5, ou com uma afinidade superior ou inferior. A afinidade de ligação de diferentes elementos de ligação especifica pode ser comparada sob condições apropriadas.
Além das sequências de anticorpo, um elemento de ligação especifica de acordo com o presente invento poderá compreender outros aminoácidos, por exemplo, que formam um péptido ou um polipéptido, tal como um dominio enrolado, ou para conferir à molécula outra caracteristica funcional além da capacidade de se ligar ao antigénio.
Os elementos de ligação específica do invento poderão transportar um marcador detectável, por exemplo, um agente que facilita a detecção de tumores, como seja um radionuclido ou um fluoróforo, ou poderão ser conjugados com um agente capaz de desencadear um evento biocida, tal como um radionuclido, um fotossensibilizador, um fármaco, uma citoquina, um factor pró-coagulante, uma toxina ou uma enzima (por exemplo, via uma ligação peptidilo ou um ligante), para utilização num método de terapia.
Em aspectos adicionais, o invento proporciona um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica um elemento de ligação específica, os domínios VH ou VL de acordo com o presente invento, bem como métodos de preparação de um elemento de ligação específica, de um domínio VH e/ou de um domínio VL do invento, que compreendem a expressão do referido ácido nucleico em condições que conduzem à produção do referido elemento de ligação específica, do domínio VH e/ou do domínio VL, e a sua recuperação.
Os elementos de ligação específica aqui descritos poderão ser utilizados num método de tratamento ou de diagnóstico do corpo humano ou animal, como seja um método de tratamento (que 8 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ poderá incluir ο tratamento profiláctico) de uma doença ou perturbação, em particular de uma perturbação proliferativa como um cancro, num doente humano, que compreende a administração ao referido doente de uma quantidade eficaz de um elemento de ligação especifica.
Um aspecto adicional do presente invento fornece um ácido nucleico, geralmente isolado, que codifica um dominio variável vh e/ou um domínio variável VL de anticorpo aqui descrito.
Um aspecto adicional proporciona uma célula hospedeira transformada com o ácido nucleico do invento.
Um outro aspecto adicional proporciona um método de produção de um domínio variável VH de anticorpo, em que o método inclui provocar a expressão do ácido nucleico codificante. Este método poderá compreender o crescimento de células hospedeiras sob condições conducentes à produção do referido domínio variável VH de anticorpo. Métodos análogos para a produção de domínios variáveis VL e de elementos de ligação específica compreendendo um domínio VH e/ou VL são fornecidos como aspectos adicionais do presente invento.
Um método de produção poderá compreender um passo de isolamento e/ou purificação do produto.
Um método de produção poderá compreender a formulação do produto numa composição que inclui pelo menos um componente adicional, como seja um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Estes e outros aspectos do invento estão descritos em maior detalhe abaixo.
TERMINOLOGIA
Elemento de ligação especifica
Este termo descreve um elemento de um par de moléculas que possuem especificidade de ligação uma para com a outra. Os elementos de um par de ligação específica poderão ser 9 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ derivados naturalmente ou poderão ser produzidos, total ou parcialmente, de forma sintética. Um elemento do par de moléculas possui uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que se liga especificamente a uma organização espacial e polar particular do outro elemento do par de moléculas, sendo por conseguinte complementar dela. Assim, os elementos do par possuem a propriedade de se ligarem especificamente um ao outro. Exemplos de tipos de pares de ligação especifica são antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando e enzima-substrato. Este pedido refere-se a reacções do tipo antigénio-anticorpo.
Anticorpo
Este termo descreve uma imunoglobulina, quer natural quer produzida total ou parcialmente de forma sintética. 0 termo também abrange qualquer polipéptido ou proteína possuindo um domínio de ligação que é um domínio de ligação de um anticorpo, ou é substancialmente homólogo de um domínio de ligação de um anticorpo. Os exemplos de anticorpos consistem nos isotipos das imunoglobulinas e respectivas subclasses isotípicas; fragmentos que compreendem um domínio de ligação ao antigénio como Fab, scFv, Fv, dAc, Fd; e diacorpos ("diabodies"). É possível pegar em anticorpos monoclonais e outros anticorpos e utilizar técnicas da tecnologia de ADN recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas, que conservam a especificidade do anticorpo original. Estas técnicas poderão envolver a introdução de ADN que codifica a região variável de uma imunoglobulina, ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo, nas regiões constantes, ou nas regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Consultar, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400. Um hibridoma ou outra célula produtora de anticorpos poderá ser submetido a mutação genética ou a outras alterações, que poderão ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.
Como os anticorpos podem ser modificados de uma variedade de formas, o termo "anticorpo" deve ser interpretado como abrangendo qualquer elemento de ligação específica ou substância que possui um domínio de ligação com a especificidade requerida. Assim, este termo abrange fragmentos 10 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ de anticorpos, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipéptido que compreende um domínio de ligação de uma imunoglobulina, seja ela natural ou total ou parcialmente sintética. As moléculas quiméricas que compreendem um domínio de ligação de uma imunoglobulina, ou equivalente, fundido com outro polipéptido estão por conseguinte incluídas. A clonagem e a expressão de anticorpos quiméricos estão descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023.
Tem sido demonstrado que os fragmentos de um anticorpo completo podem desempenhar a função de ligação aos antigénios. Os exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAc (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste num domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados; (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antigénio (Bird et al., Science 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv de cadeia simples biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) diacorpos, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por meio de fusão génica (WO94/13804; p. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 6444-6448, 1993). As moléculas Fv, scFv ou diacorpos poderão ser estabilizadas através da incorporação de pontes de dissulfureto unindo os domínios VH e VL (Y. Reiter et al., Nature Biotech 14, 1239-1245, 1996). Também é possível produzir minicorpos ("minibodies") compreendendo um fragmento scFv unido a um domínio CH3 (S. Hu et al., Câncer Res. 56, 3055-3061, 1996) .
Os diacorpos são multímeros de polipéptidos, em que cada polipéptido compreende um primeiro domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia leve de uma imunoglobulina e um segundo domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina, onde os dois domínios estão ligados (por exemplo, por meio de um ligante peptídico), mas são incapazes de se associar um ao outro para formar um 11 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ local de ligação ao antigénio: os locais de ligação ao antigénio são formados pela associação do primeiro domínio de um polipéptido no multímero com o segundo domínio de outro polipéptido no multímero (WO94/13804).
Quando se pretende utilizar anticorpos biespecíficos, estes poderão ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser produzidos de uma variedade de formas (Holliger, P. & Winter, G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou poderão ser quaisquer uns dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Os diacorpos e os fragmentos scFv podem ser construídos sem uma região Fc, utilizando apenas os domínios variáveis, reduzindo, assim, potencialmente os efeitos da reacção anti-idiotípica.
Os diacorpos biespecíficos, em oposição aos anticorpos completos biespecíficos, também poderão ser particularmente úteis, uma vez que podem ser facilmente construídos e expressos em E. coli. Os diacorpos (e muitos outros polipéptidos, tais como os fragmentos de anticorpos) com especificidades de ligação apropriadas podem ser facilmente seleccionados utilizando bibliotecas de apresentação em fagos (WO94/13804). Se um braço do diacorpo for mantido constante, por exemplo, com uma especificidade dirigida contra o antigénio X, então é possível construir uma biblioteca em que o outro braço é variado, e um anticorpo com a especificidade apropriada é seleccionado. Os anticorpos completos biespecíficos poderão ser preparados através de engenharia "knobs-into-holes" (J.B.B. Ridgeway et al., Protein Eng. 9, 616-621, 1996) .
Domínio de ligação ao antigénio
Este termo descreve a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a parte ou à totalidade de um antigénio, e que é complementar de parte ou da totalidade dele. Quando um antigénio é grande, um anticorpo poderá ligar-se apenas a uma parte particular do antigénio, parte esta que é designada por epítopo. Um domínio de ligação ao antigénio poderá ser fornecido por um ou mais domínios variáveis do anticorpo (por exemplo, um fragmento de anticorpo Fd consistindo num domínio VH) . Preferencialmente, um domínio 12 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ de ligação ao antigénio compreende a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo e a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo.
Específico
Este termo poderá ser utilizado para se referir à situação em que um elemento de um par de ligação especifica não apresenta qualquer ligação significativa a moléculas que não sejam o(s) seu(s) parceiro(s) de ligação especifica. Por exemplo, um anticorpo especifico para a tenascina C poderá mostrar pouca ou nenhuma ligação a outros componentes da matriz extracelular como a fibronectina. De forma similar, um anticorpo especifico para a isoforma grande da tenascina C poderá apresentar pouca ou nenhuma ligação à isoforma pequena da tenascina C. 0 termo também é aplicável quando, por exemplo, um domínio de ligação ao antigénio é específico para um epítopo particular que é transportado por um determinado número de antigénios, caso em que o elemento de ligação específica que transporta o domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar aos vários antigénios que transportam o epítopo.
Compreende 0 termo é genericamente utilizado no sentido de incluir, quer dizer, permitir a presença de uma ou mais características ou componentes.
Isolado
Este termo refere-se ao estado em que os elementos de ligação específica do invento, ou o ácido nucleico que codifica estes elementos de ligação, estarão de acordo com o presente invento. Os elementos e o ácido nucleico estarão isentos ou substancialmente isentos do material com o qual estão naturalmente associados, tal como outros polipéptidos ou ácidos nucleicos com os quais são encontrados no seu ambiente natural, ou do ambiente no qual são preparados (por exemplo, a cultura de células) quando esta preparação é efectuada por meio de tecnologia de adn recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os elementos e o ácido nucleico poderão ser formulados com diluentes ou adjuvantes e, ainda para fins práticos, ser isolados - por exemplo, os elementos serão 13 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ normalmente misturados com gelatina ou outros veículos caso sejam utilizados para revestir placas de microtitulação para uso em imunoensaios, ou serão misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando são utilizados em aplicações de diagnóstico ou de terapia. Os elementos de ligação específica poderão ser glicosilados, quer naturalmente quer por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo, células CHO ou NSO (ECACC 85110503)), ou poderão ser (por exemplo, se forem produzidos por expressão numa célula procariótica) não glicosilados. A expressão "substancialmente como apresentado" significa que o domínio CDR ou VH ou VL relevante do invento será idêntico ou grandemente similar às regiões especificadas cuja sequência é aqui apresentada. Por "grandemente similar" está contemplado o facto de poderem ser efectuadas 1 a 5, preferencialmente 1 a 4, por exemplo, 1 a 3 ou 1 ou 2 ou 3 ou 4 substituições no domínio CDR e/ou VH ou VL. A estrutura para transportar uma CDR do invento terá geralmente uma sequência da cadeia leve ou pesada de um anticorpo, ou uma sua porção substancial, em que a CDR está localizada numa posição correspondente à CDR de domínios variáveis VH e VL de anticorpos naturais, codificados por genes de imunoglobulinas rearranjados. As estruturas e localizações dos domínios variáveis das imunoglobulinas poderão ser determinadas por referência a Kabat, e.a. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987 e suas actualizações, agora disponível na Internet (http://immuno. bme.nwu.edu).
Preferencialmente, uma sequência de aminoácidos de CDR, substancialmente como aqui apresentada, é transportada como uma CDR num domínio variável humano, ou numa sua porção substancial.
Os domínios variáveis empregues no invento poderão ser obtidos a partir de qualquer linha germinal ou domínio variável humano rearranjado, ou poderão ser um domínio variável sintético baseado em sequências consenso de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma sequência CDR do invento 14 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ (por exemplo, CDRl, CDR2 ou CDR3) poderá ser introduzida num repertório de domínios variáveis que não possuem uma CDR (por exemplo, a correspondente CDRl, CDR2 ou CDR3), utilizando tecnologia de ADN recombinante.
Por exemplo, Marks et al. (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) descrevem métodos de produção de repertórios de domínios variáveis de anticorpos, nos quais iniciadores consenso dirigidos para ou adjacentes à extremidade 5' da área do domínio variável são utilizados em conjunto com iniciadores consenso para a terceira região de estrutura de genes VH humanos, para fornecer um repertório de domínios variáveis VH sem uma região CDR3. Marks et al. descrevem adicionalmente como este repertório poderá ser combinado com uma região CDR3 de um anticorpo particular. Utilizando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR do presente invento poderão ser misturadas com repertórios de domínios VH ou VL que não possuem uma região CDR, e os domínios VH ou VL completos misturados poderão ser combinados com um domínio VL ou VH cognato para fornecer elementos de ligação específica do invento. O repertório poderá depois ser apresentado num sistema hospedeiro adequado, tal como o sistema de apresentação em fago de W092/01047, para que os elementos de ligação específica apropriados possam ser seleccionados. Um repertório poderá consistir em qualquer coisa como 104 elementos individuais e mais, por exemplo, entre 106 a 108 ou IO10 elementos. Técnicas combinatórias ou de mistura análogas também são referidas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), que descreve a técnica em relação a um gene da β-lactamase, mas observa que a abordagem poderá ser utilizada para a geração de anticorpos.
Uma outra alternativa consiste em gerar novas regiões VH ou VL que transportam sequências derivadas de regiões CDR do invento, utilizando a mutagénese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL seleccionados, para gerar mutações em todo o domínio variável. Esta técnica é descrita por Gram et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 89:3576-3580), que utilizaram PCR propenso a erros. 15 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Outro método que poderá ser utilizado é a mutagénese dirigida nas regiões CDR de genes VH ou VL. Estas técnicas são descritas por Barbas et ai. (1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:3809-3813) e Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567) .
Todas as técnicas acima descritas são conhecidas como tal na especialidade, e elas próprias não fazem parte do presente invento. O perito será capaz de utilizar estas técnicas para proporcionar elementos de ligação especifica do invento, utilizando metodologia de rotina na especialidade.
Uma porção substancial de um domínio variável de uma imunoglobulina compreenderá pelo menos as três regiões CDR, juntamente com as suas regiões de estrutura intermédias. Preferencialmente, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou de ambas as primeira e quarta regiões de estrutura, em que os 50% correspondem aos 50% C-terminais da primeira região de estrutura e aos 50% N-terminais da quarta região de estrutura. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da porção substancial do domínio variável poderão ser aqueles normalmente não associados às regiões dos domínios variáveis naturais. Por exemplo, a construção de elementos de ligação específica do presente invento, por meio de técnicas de ADN recombinante, poderá resultar na introdução de resíduos NB ou C-terminais codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir os domínios variáveis do invento a sequências de proteínas adicionais, que incluem cadeias pesadas de imunoglobulinas, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteínas como discutido em maior detalhe abaixo.
Os elementos de ligação específica do presente invento poderão ainda compreender regiões constantes de anticorpos ou partes delas. Por exemplo, um domínio VL poderá ser ligado, ao nível da sua extremidade C-terminal, a domínios constantes da cadeia leve de anticorpos, incluindo as cadeias Ck ou CX humanas, preferencialmente as cadeias CX. De forma similar, um elemento de ligação específica baseado num domínio VH poderá 16 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ ser ligado, ao nível da sua extremidade C-terminal, à totalidade ou a parte de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, igG, igA, igE e igM e de qualquer uma das subclasses dos isotipos, particularmente IgGl e IgG4.
Os elementos de ligação específica do invento poderão ser marcados com um marcador detectável ou funcional.
Os marcadores detectáveis poderão incluir radionuclidos, tais como o iodo 131, o ítrio 90, o índio 111 e o tecnécio 99, que poderão ser ligados aos anticorpos do invento utilizando meios químicos convencionais conhecidos na especialidade das técnicas de visualização de anticorpos. Um elemento de ligação específica marcado com um isótopo radioactivo poderá ser utilizado para distribuir selectivamente radiação a um alvo específico, tal como um tumor. Isto poderá ser útil na visualização do tumor ou na administração de uma dose citotóxica de radiação, como descrito abaixo.
Outros marcadores detectáveis poderão incluir marcadores enzimáticos como a peroxidase de rábano, grupos químicos como a biotina, que poderá ser detectada via ligação a um grupo cognato detectável específico, por exemplo, a avidina marcada, fluorócromos como a fluoresceína, a rodamina, a ficoeritrina e o Texas Red; e fluoróforos no infravermelho próximo, incluindo os derivados do corante cianina como Cy7 (Amersham Pharmacia) e Alexa750 (Molecular probes).
Em outras concretizações, um marcador detectável poderá compreender um derivado de microbolhas, que é detectável por meio de ultra-sons (Joseph S et al., Pharm Res. 2004 Jun; 21(6):920-6), ou uma partícula magnética (Schellenberger EA et al., Bioconjug. Chem 2004 Sep-Oct; 15(5):1062-7).
Um marcador funcional poderá incluir um agente que é capaz de desencadear um evento biocida ou que possui um efeito anticanceroso. Os marcadores apropriados incluem radionuclidos, fotossensibilizadores, polipéptidos que são toxinas, pequenas moléculas tóxicas e outras drogas, citoquinas (por exemplo, IL2, IL12, TNF), quimioquinas, factores pró-coagulantes (por exemplo, factor tecidual), 17 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ enzimas, lipossomas e factores de resposta imunitária (ver, por exemplo, D. Neri (2004) CHIMIA "Tumor Targeting" vol. 58, pp. 723-726).
Os radionuclidos incluem o iodo 131, o itrio 90, o indio 111 e o tecnécio 99 e estão descritos em maior detalhe acima.
Um polipéptido ou péptido que é uma toxina possui actividade citotóxica ou apoptótica e poderá ser derivado de uma fonte microbiana, vegetal, animal ou humana. Em algumas concretizações, um polipéptido que é uma toxina poderá ser introduzido directamente nas regiões constantes de um elemento de ligação específica. Os exemplos de polipéptidos que são uma toxina incluem a exotoxina de Pseudomonas, a cadeia (X da ricina e a angiogenina.
As pequenas moléculas tóxicas incluem compostos químicos com actividade citotóxica, incluindo, por exemplo, agentes de complexação do ADN ou inibidores do ciclo celular. Em algumas concretizações, a molécula tóxica poderá ser libertada nas proximidades da célula alvo por clivagem de um ligante sensível ao pH ou a uma enzima (por exemplo, ligantes contendo ligações imina). Os exemplos de pequenas moléculas tóxicas incluem a maitansina, a caliqueamicina, a epotilona, a tubulisina e seus derivados.
Os factores de resposta imunitária poderão incluir elementos de ligação específica que se ligam a células efectoras imunitárias. A ligação do elemento de ligação especifica poderá invocar uma resposta imunitária mediada por células contra a célula alvo.
Em concretizações preferidas, um elemento de ligação especifica do invento é conjugado com uma citoquina. É possível produzir uma proteína de fusão que compreende o elemento de ligação específica ou um seu componente polipeptídico (por exemplo, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo com múltiplas cadeias, como seja um fragmento Fab) e a citoquina.
Assim, por exemplo, um domínio VH ou um domínio VL de um elemento de ligação específica do invento poderá ser fundido 18 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ com a citoquina. Tipicamente, o elemento de ligação especifica, ou um seu componente, e a citoquina são unidos por via de um ligante peptidico, por exemplo, um péptido com cerca de 5-25 residuos, por exemplo, 10-20 residuos, preferencialmente cerca de 15 residuos. Os exemplos adequados de ligantes peptidicos são aqui fornecidos. Preferencialmente, a citoquina é a IL2, mais preferencialmente a IL2 humana. A citoquina poderá ser fundida a montante (N-terminal) ou a jusante (C-terminal) do elemento de ligação especifica ou do seu componente polipeptidico. Uma concretização preferida é uma proteína de fusão compreendendo um elemento de ligação específica (especialmente uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de scFv) do invento e a IL2. As sequências de aminoácidos destas proteínas de fusão, e os ácidos nucleicos compreendendo as sequências nucleotídicas que as codificam, fazem parte do invento.
Os elementos de ligação específica do presente invento poderão ser úteis em métodos de diagnóstico, como as técnicas de visualização de tumores, ou no tratamento de indivíduos humanos ou animais, por exemplo, devido a condições cancerosas.
Por conseguinte, aspectos adicionais do invento proporcionam composições farmacêuticas compreendendo um elemento de ligação específica, e a utilização deste elemento de ligação específica no fabrico de um medicamento para administração; por exemplo, num método de produção de um medicamento ou de uma composição farmacêutica que compreende formular o elemento de ligação específica juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Um elemento de ligação específica para utilizar num método de tratamento é preferencialmente conjugado ou ligado a um marcador funcional que produz um efeito antitumoral. Em concretizações preferidas, como salientado acima, o elemento de ligação específica é conjugado ou ligado a uma citoquina, por exemplo, IL2.
As indicações clínicas nas quais um elemento de ligação específica, como aqui descrito, poderá ser utilizado para proporcionar um benefício terapêutico incluem perturbações 19 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ proliferativas como os neoplasmas e os tumores pré-malignos e malignos (por exemplo, histiocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), os cancros (por exemplo, cancro do pulmão, cancro do pulmão de pequenas células, cancro gastrintestinal, cancro do intestino, cancro do cólon, carcinoma da mama, carcinoma dos ovários, cancro da próstata, cancro dos testículos, cancro do figado, cancro do rim, cancro da bexiga, cancro do pâncreas, cancro do cérebro, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), as leucemias e as doenças angiogénicas.
Uma condição pré-maligna ou maligna poderá ocorrer em qualquer tipo de células, incluindo, embora não exclusivamente, os pulmões, o cólon, a mama, os ovários, a próstata, o fígado, o pâncreas, o cérebro e a pele.
Uma perturbação proliferativa adequada para tratamento como aqui descrito poderá ser caracterizada pela presença de células ou de tecido onde a expressão das isoformas grandes da tenascina C, em particular das isoformas grandes compreendendo os domínios AI ou C, é aumentada ou elevada.
As composições proporcionadas pelo invento poderão ser administradas a indivíduos. A administração dá-se preferencialmente numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para fornecer benefícios a um doente. Estes benefícios poderão ser pelo menos uma melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade efectiva administrada, assim como a velocidade e o decurso temporal da administração dependerão da natureza e da gravidade da condição em tratamento. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a posologia, etc., é da responsabilidade dos médicos de clínica geral e de outros médicos. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na especialidade; ver Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Câncer 47:659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922. A dose precisa dependerá de um certo número de factores, incluindo se o anticorpo se destina ao diagnóstico ou a tratamento, o tamanho e a localização da área a tratar, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo, anticorpo completo, fragmento ou diacorpo) e a natureza de qualquer 20 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ marcador detectável ou de outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose típica de anticorpo encontrar-se-á no intervalo compreendido entre 0,5 mg e 100 g para aplicações sistémicas, e entre 10 μρ e 1 mg para aplicações locais. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo completo, preferencialmente o isotipo igGl ou IgG4. Esta é uma dose para um único tratamento de um doente adulto, que poderá ser ajustada proporcionalmente para crianças e bebés, e também para outros formatos de anticorpos proporcionalmente ao peso molecular. Os tratamentos poderão ser repetidos a intervalos diários, bissemanais, semanais ou mensais, ao critério do médico.
Os elementos de ligação especifica do presente invento serão geralmente administrados sob a forma de uma composição farmacêutica, que poderá compreender pelo menos um componente além do elemento de ligação especifica.
Assim, as composições farmacêuticas de acordo com o presente invento, e para utilização de acordo com o presente invento, poderão compreender, além do ingrediente activo, um excipiente, veiculo, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Estes materiais deverão ser não tóxicos e não deverão interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza precisa do veiculo ou outro material dependerá da via de administração, que poderá ser oral ou por meio de injecção, por exemplo, intravenosa.
As composições farmacêuticas para administração oral poderão encontrar-se sob a forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido poderá compreender um veículo sólido, como a gelatina, ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um veículo líquido como a água, o petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. A solução salina fisiológica, a dextrose ou uma solução de outro sacárido, ou glicóis como o etilenoglicol, o propilenoglicol ou o polietilenoglicol poderão ser incluídos.
Para injecção intravenosa ou injecção no local do problema, o ingrediente activo encontrar-se-á sob a forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável, que está isenta 21 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ de substâncias pirogénicas e possui um pH, uma isotonicidade e uma estabilidade adequados. Os peritos na especialidade são capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos, como seja a injecção de cloreto de sódio, a injecção de Ringer e a injecção de lactato de Ringer. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos poderão ser incluídos, conforme necessário.
Uma composição poderá ser administrada isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultânea quer sequencialmente, dependendo da condição em tratamento. Outros tratamentos poderão incluir a administração de doses adequadas de analgésicos, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteróides (por exemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno), opiatos como a morfina ou antieméticos.
Os elementos de ligação específica do invento poderão ser úteis num método de detecção e/ou visualização de células tumorais, que compreende a administração de um anticorpo, como aqui descrito, a um indivíduo e a detecção da ligação do referido anticorpo a células tumorais no referido indivíduo.
Os anticorpos preferidos para utilização nestes métodos poderão ser conjugados ou ligados a um marcador detectável, como seja um radionuclido ou um fluoróforo.
Um método do invento poderá compreender provocar ou permitir a ligação de um elemento de ligação específica, tal como aqui proporcionado, à tenascina C in vitro. A quantidade de ligação do elemento de ligação específica à tenascina C poderá ser determinada. Em algumas concretizações, a ligação do elemento de ligação específica a uma amostra obtida de um indivíduo poderá ser determinada. A quantificação poderá ser relacionada com a quantidade do antigénio, o que poderá ter um interesse diagnóstico. A ligação dos anticorpos poderá ser determinada por qualquer meio apropriado. Por exemplo, o anticorpo poderá ser ligado ou conjugado com uma molécula repórter ou um marcador 22 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ detectável, e a presença, a quantidade ou a localização do marcador ou do repórter na amostra determinada. A ligação de um anticorpo in vivo, por exemplo, num método de visualização molecular, poderá ser determinada por detecção radioactiva (por exemplo, PET, SPECT), imagens de fluorescência no infravermelho próximo (por exemplo, tomografia óptica difusa, endoscopia), ultra-sons (por exemplo, com derivados de microbolhas direccionados) e MRI (com partículas magnéticas direccionadas).
Em outras concretizações, a ligação do anticorpo poderá ter lugar in vitro, por exemplo, em ensaios ELISA, transferências de Western, imunocitoquímica, imunoprecipitação ou cromatografia de afinidade.
Um método de detecção e/ou visualização de células tumorais poderá, deste modo, compreender o contacto de um anticorpo, como aqui descrito, com uma amostra obtida de um indivíduo e a detecção da ligação do referido anticorpo a células tumorais na referida amostra.
Os anticorpos preferidos para utilização nestes métodos in vitro poderão ser conjugados ou ligados a uma molécula repórter. A molécula repórter poderá ser um radionuclido, um fluorócromo, uma substância fosforescente ou um corante laser com características de absorção ou emissão espectralmente isoladas. Os fluorócromos apropriados incluem a fluoresceína, a rodamina, a ficoeritrina e o Texas Red. Os corantes cromogénicos adequados incluem a diaminobenzidina. Para a visualização in vivo, os radionuclidos ou os fluoróforos são preferidos.
Outros repórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou materiais particulados, tais como esferas de látex, que são coloridos, magnéticos ou paramagnéticos, e agentes biológica ou quimicamente activos que podem fazer, directa ou indirectamente, com que sinais detectáveis sejam visualmente observados, electronicamente detectados ou registados de outra forma. Estas moléculas poderão ser enzimas que catalisam reacções que desenvolvem ou mudam de cor ou que provocam alterações nas propriedades eléctricas, por exemplo. 23 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Elas poderão ser molecularmente excitáveis, de modo que as transições electrónicas entre os estados energéticos resultam em absorções ou emissões espectrais caracteristicas. Elas poderão incluir entidades quimicas utilizadas em conjunção com biossensores. Os sistemas de detecção à base de biotina/avidina ou de biotina/ estreptavidina e de fosfatase alcalina poderão ser empregues. 0 modo de determinação da ligação não é uma caracteristica do presente invento, e os peritos na especialidade são capazes de seleccionar um modo adequado de acordo com as suas preferências e conhecimento geral. A competição entre os elementos de ligação poderá ser facilmente analisada in vitro, por exemplo, marcando um elemento de ligação com uma molécula repórter especifica, o qual pode ser detectado na presença de outro(s) elemento(s) de ligação não marcados, para permitir a identificação de elementos de ligação especifica que se ligam ao mesmo epitopo ou a um epitopo de sobreposição. A competição poderá ser determinada utilizando técnicas Standard, como sejam os ensaios ELISA.
Ao testar a existência de competição, é possível utilizar um fragmento peptídico do antigénio, especialmente um péptido que inclui um epitopo de interesse. Um péptido possuindo a sequência do epitopo acrescida de um ou mais aminoácidos em qualquer uma das extremidades poderá ser utilizado. Poderá dizer-se que este péptido "consiste essencialmente" na sequência especificada. Os elementos de ligação específica de acordo com o presente invento poderão ser tais, que a sua ligação ao antigénio é inibida por um péptido contendo ou incluindo a sequência dada. Ao testar esta caracteristica, um péptido com uma das sequências acrescida de um ou mais aminoácidos poderá ser utilizado. Os péptidos adequados poderão ser obtidos a partir das sequências dos domínios D, C e/ou Al da tenascina C.
Os elementos de ligação específica que se ligam a um péptido específico poderão ser isolados, por exemplo a partir de uma biblioteca de apresentação em fagos, por "panning" (procedimento de selecção) com o(s) péptido(s). 24 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ Ο presente invento proporciona ainda um ácido nucleico isolado que codifica um elemento de ligação especifica do presente invento. 0 ácido nucleico inclui ADN e ARN. Num aspecto preferido, o invento proporciona um ácido nucleico que codifica uma região CDR ou um dominio VH ou VL do invento tal como definidos acima. 0 presente invento também fornece construções sob a forma de plasmideos, vectores e cassetes de transcrição ou de expressão, que compreendem pelo menos um polinucleótido como descrito acima. 0 presente invento também proporciona uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como descritas acima. Um ácido nucleico que codifica qualquer domínio CDR, VH ou VL, ou um elemento de ligação específica tal como proporcionado, constitui ele próprio um aspecto do presente invento, tal como o constitui um método de produção do produto codificado, método este que compreende a expressão a partir do ácido nucleico que o codifica. A expressão poderá ser convenientemente obtida através da cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. Após a produção por expressão, um domínio VH ou VL ou um elemento de ligação especifica poderá ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada e depois utilizado conforme apropriado.
Os elementos de ligação específica, os domínios VH e/ou VL, as moléculas de ácido nucleico codificante e os vectores de acordo com o presente invento poderão ser proporcionados isolados e/ou purificados, por exemplo, a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogénea, ou, no caso do ácido nucleico, isento ou substancialmente isento de ácidos nucleicos ou de genes com origem diferente da sequência que codifica um polipéptido com a função requerida. 0 ácido nucleico de acordo com o presente invento poderá compreender ADN ou ARN e poderá ser total ou parcialmente sintético. A referência a uma sequência nucleotídica tal como aqui apresentada engloba uma molécula de ADN com a sequência especificada e engloba uma molécula de ARN com a sequência 25 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ especificada, na qual T está substituído por u, excepto se o contexto indicar outra coisa.
Os sistemas para a clonagem e a expressão de um polipéptido numa variedade de diferentes células hospedeiras são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, leveduras e sistemas de baculovírus. As linhas de células de mamíferos disponíveis na especialidade para a expressão de um polipéptido heterólogo incluem as células de ovário de hamster chinês, as células HeLa, as células de rim de hamster bebé, as células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano preferido comum é E. coli. A expressão de anticorpos e de fragmentos de anticorpos em células procarióticas como E. coli está bem estabelecida na especialidade. Para um artigo de revisão, ver, por exemplo,
Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura também está disponível para os peritos na especialidade como uma opção para a produção de um elemento de ligação específica. Consultar, por exemplo, os artigos de revisão recentes: Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion
Biotech. 4:573-576; Trill, J.J. et al. (1995) Curr. Opinion
Biotech 6:553-560.
Os vectores adequados contendo as sequências reguladoras apropriadas, que incluem sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências de amplificação, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado, podem ser seleccionados ou construídos. Os vectores poderão ser plasmídeos, vectores virais, por exemplo, fagos, ou fagemídeos, consoante apropriado. Para pormenores adicionais, ver, por exemplo, Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo, preparação de construções de ácidos nucleicos, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão de genes, e a análise de proteínas estão descritas em detalhe em Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992. As descrições de Sambrook et al. e de Ausubel et al. estão aqui incorporadas através de referência. 26 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Assim, um aspecto adicional do presente invento proporciona uma célula hospedeira contendo um ácido nucleico como aqui descrito. Um outro aspecto adicional proporciona um método que compreende a introdução deste ácido nucleico numa célula hospedeira. A introdução poderá utilizar qualquer técnica disponível. Para as células eucarióticas, as técnicas adequadas poderão incluir a transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, a electroporação, a transfecção mediada por lipossomas e a transdução utilizando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, o vírus vaccinia ou, para as células de insectos, os baculovírus. Para as células bacterianas, as técnicas adequadas poderão incluir a transformação com cloreto de cálcio, a electroporação e a transfecção utilizando um bacteriófago. A introdução poderá ser seguida por provocar ou permitir a expressão a partir do ácido nucleico, por exemplo, cultivando as células hospedeiras sob condições apropriadas para a expressão do gene.
Numa concretização, o ácido nucleico do invento é integrado no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. A integração poderá ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. 0 presente invento também proporciona um método que compreende a utilização de uma construção, como apresentada acima, num sistema de expressão, de modo a expressar um elemento de ligação específica ou um polipéptido como referido acima.
Outros métodos do invento compreendem a conjugação ou a ligação de um elemento de ligação específica, como aqui descrito, a um marcador ou um agente anticanceroso detectável.
Os marcadores e agentes adequados estão descritos acima. Os marcadores e os agentes poderão ser conjugados com um elemento de ligação específica, utilizando meios químicos padrão. 27 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Aspectos e concretizações do presente invento serão agora ilustrados como exemplo, fazendo referência à experimentação que se segue. Vários aspectos e concretizações adicionais do presente invento serão evidentes para os peritos na especialidade face à presente descrição.
Determinados aspectos e concretizações do invento serão agora ilustrados como exemplo, fazendo referência às figuras descritas acima e às tabelas descritas abaixo.
Figura 1 - Representação esquemática da isoforma pequena (A) e grande (B) da tenascina C. Vários domínios similares à fibronectina tipo III são submetidos a excisão ("splicing") alternativa, sendo incluídos (B) ou omitidos (A) da molécula. A Figura 2 ilustra a biodistribuição do anticorpo 4A1-F16-SIP em ratinhos nus com um xenoenxerto de tumor U87. (A) os valores representam a percentagem média da dose injectada por grama de tecido num grupo de três ratinhos, três (superior) e seis (inferior) horas após a injecção. As barras de erro representam o desvio padrão. A Figura 3 ilustra a biodistribuição do anticorpo 4A1-F16-SIP em ratinhos nus com um xenoenxerto de tumor U87. (A) os valores representam a percentagem média da dose injectada por grama de tecido num grupo de três ratinhos, 24 (superior) e 48 (inferior) horas após a injecção. As barras de erro representam o desvio padrão. A Figura 4 ilustra uma apresentação alternativa dos dados de biodistribuição apresentados nas Figuras 2 e 3.
Exemplo 1 0 gene que codifica o domínio Al da tenascina C humana foi clonado por RT-PCR a partir de ARNm isolado de fibroblastos dérmicos humanos normais cultivados a pH 7,5, na ausência de soro, utilizando os oligonucleótidos para PCR TnC-Al BamHI ba (cgggatcctccactgaacaagcccctgag) e 28 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
TnC-Al Bglll for (ggagatctttcccctgtggaggcctcagc) [16] . 0 gene foi depois clonado no vector de expressão bacteriano pQEl2 (Qiagen) e expresso em E. coli TG-1. A purificação foi efectuada por meio da marca His, utilizando resina de Sepharose Ni-NTA carregada com niquel (Qiagen). 0 domínio Al purificado foi biotinilado antes das selecções, utilizando sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce) . As experiências de "biopanning" foram efectuadas como descrito em Viti F. et al. Methods Enzymol 2000; 326:480-505.
Resumidamente, a proteína biotinilada (concentração final de 1CT7 M) foi incubada com 600 μΐ da biblioteca fágica ETH-2 pré-bloqueada durante 30 minutos. Os fagos ligados foram capturados por adição de 5,3 x 107 esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal). Após lavagem extensa, o fago seleccionado foi eluído através de redução da ligação dissulfureto no ligante biotina. O fago isolado foi amplificado em TG-1 e concentrado a partir do sobrenadante por precipitação com polietilenoglicol. Após três ciclos de "panning", 144 clones isolados de anticorpo foram rastreados por ensaio ELISA efectuado como descrito em Viti F. et al. Methods Enzymol 2000; 326:480-505. As placas de ELISA revestidas com estreptavidina (StreptaWell High Bind, Roche) foram incubadas com antigénio biotinilado, os sobrenadantes das culturas de E. coli TG-1 monoclonais induzidas expressando fragmentos de anticorpo scFv foram adicionados e os anticorpos ligados foram detectados com o anticorpo monoclonal M2, seguido pelo conjugado anti-imunoglobulina G de ratinho com HRP. Os clones de anticorpo com o sinal mais elevado foram analisados através de análise de interacção em tempo real, utilizando um instrumento BIAcore 3000. Os três melhores clones foram purificados numa coluna de Sepharose-proteína A e testados por imuno-histoquímica em várias criossecções de tumores.
Um dos clones que apresentou um padrão de coloração selectivo em imuno-histoquímica, scFv (3A1-D5), foi seleccionado para maturação da afinidade. Uma biblioteca de maturação da afinidade foi construída num vector fagemídeo, pDN322 (Pini A et al. J Biol Chem 1998; 273:21769-21776), por inserção de mutações aleatórias nas posições 31-33 que se encontram na região determinante de complementaridade 1 da 29 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ cadeia pesada variável (CDRl VH), utilizando os oligonucleótidos de PCR, LMB3 long ba (caggaaacagctatgaccatgat tac, iniciação a montante da extremidade 5' do gene do anticorpo) e DP47CDRlmut for (agcctggcggacccagctcgcmnnmnnmnngc taaaggtgaatccagaggctgc). A extremidade 3' do gene do anticorpo foi amplificada utilizando os iniciadores DP47CDR1 ba (gagctgggtccgccaggctcc) e fdseq long for (gacgttagtaaatgaatttt ctgtatgagg). Os dois fragmentos foram montados por PCR, utilizando os iniciadores LMB3 long ba e fdseq long for.
Os ensaios de "biopanning" da biblioteca de maturação da afinidade foram efectuados com antigénio biotinilado. Após dois ciclos de "panning" (como descrito acima, mas utilizando antigénio biotinilado 1(Γ8 M), um total de 382 clones de anticorpo foram rastreados por ELISA. 69 clones que se mostraram positivos em ELISA foram adicionalmente caracterizados por M2-ELISA (Scheuermann J. et al., J Immunol Methods 2003; 276:129-134) para avaliar os valores kQff dos clones individuais de anticorpo. Resumidamente, os sobrenadantes contendo anticorpos scFv foram adicionados a uma superfície revestida com anticorpo monoclonal M2 anti-Flag (SIGMA). Após a adição de antigénio biotinilado e incubação até ao equilíbrio, adicionou-se um excesso de antigénio não biotinilado como competidor Após tempos de competição de 0, 30, 60, 90 e 120 minutos, respectivamente, a restante fracção de antigénio biotinilado foi detectada utilizando conjugado estreptavidina-HRP.
Utilizou-se um instrumento BIAcore para classificar os diferentes clones positivos em ELISA com base no seu perfil de dissociação. Os cinco melhores clones foram seleccionados para purificação numa coluna de Sepharose revestida com antigénio. Os anticorpos purificados foram submetidos a cromatografia de exclusão por tamanho, e as fracções resultantes contendo o fragmento de anticorpo scFv monomérico foram utilizadas para determinar as constantes de afinidade e os parâmetros cinéticos, utilizando um instrumento BIAcore 3000. O anticorpo com a melhor constante de dissociação (KD), 4A1-F16, foi clonado num formato de minicorpo bivalente, por meio de fusão genética da sequência scFv(4A1-F16) à frente da extremidade 5' do gene que codifica o domínio CH4 da 30 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ imunoglobulina Ε humana, originando uma proteína imunitária pequena (SIP) (Borsi L. et al., Int J Câncer 2002; 102:75-85), denominada 4A1-F16-SIP. O domínio CH4 promove a homodimerização, aumentando a afinidade funcional do anticorpo devido à avidez superior. A imuno-histoquímica foi efectuada com o fragmento de anticorpo scFv(3Al-D5) anti-domínio Al da tenascina C, em tecidos humanos de cancro da cabeça e pescoço. O anticorpo primário foi detectado por meio da marca FLAG peptídica, que foi apensa à extremidade C-terminal do anticorpo scFv, utilizando o anticorpo monoclonal M2 anti-FLAG (SIGMA), seguido pelo sistema APAAP (DAKO). Verificou-se que os fragmentos scFv(3Al-D5) e scFv(4A1-F16) coravam fortemente o estroma e as estruturas neovasculares do tumor em criossecções de vários cancros da cabeça e pescoço, ao passo que não reagiram com a mucosa normal da boca de um dador saudável. A capacidade de direccionamento para o tumor de 4A1-F16-SIP foi avaliada da forma que se segue.
Induziram-se tumores em ratinhos nu/nu Balb/C por injecção subcutânea de 3 x 106 células de glioblastoma humano U87 por ratinho (ATCC) . 20 a 25 dias após a injecção, quando os tumores atingiram um tamanho de 300-1500 mm3, injectou-se anticorpo radiomarcado. A preparação do anticorpo incluiu uma purificação adicional do anticorpo 4A1-F16-SIP previamente purificado por afinidade por meio de cromatografia de exclusão por tamanho em Superdex 75. A fracção que representa a forma homodimérica (75 kDa) foi recolhida e subsequentemente marcada com iodo 125 (Amersham), utilizando o método do iodogénio (Pierce) .
Aproximadamente 5 μρ de anticorpo foram injectados intravenosamente na veia da cauda de ratinhos com tumores. Após 3, 6, 24 e 48 horas, respectivamente, três ratinhos foram sacrificados, os órgãos foram excisados e a acumulação de 125I foi determinada num contador γ. 31 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Referências 1. Bosslet Κ et al. Câncer Res 1998; 58:1195-1201 2. Jain RK. Adv Drug Deliv Rev 2001; 46:149-168 3. Kohler G, Milstein C Nature 1975; 256:495-497 4. Winter G et al Annu Rev Immunol 1994; 12:433-455 5. Halin C et al. Câncer Res 2003; 63:3202-3210 6. Halin C et al. Nat Biotechnol 2002; 20:264-269 7. Nilsson F et al Câncer Res 2001; 61:711-716 8. Borsi L et al. Blood 2003; 102:4384-4392 9. Carnemolla B et al. Blood 2002; 99:1659-1665 10. Zardi L et al. Embo J 1987; 6:2337-2342 11. Castellani P et al. Am J Pathol 2002; 161:1695-1700 12. Castellani P et al Int J Câncer 1994; 59:612-618 13. Carnemolla B et al . Int J Câncer 1996; 68:397-405 14. Borsi L et al Int J Câncer 1992; 52:688-692 15. Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567 16. Borsi L et al J Biol Chem 1995; 270:6243-6245 17. Riva P et al. Int J Câncer 1992; 51:7-13 18. Riva P et al. Câncer Res 1995; 55:5952s-5956s 19. Paganelli G et al Eur J Nucl Med 1994; 21:314-321 20. Reardon DA et al. J Clin Oncol 2002; 20:1389-1397 21. Bigner DD et al. J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212 22. Carnemolla B et al. Am j Pathol 1999; 154:1345-1352 23. Katenkamp K et al. J Pathol 2004; 203:771-779 24. Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505 25. Borsi L et al. Int J Câncer 2002; 102:75-85 26. Pini A et al. J Biol Chem 1998; 273:21769-21776 27. Scheuermann J et al J Immunol Methods 2003; 276:129-134 28. Balza E et al. FEBS Lett 1993; 332:39-43 29. Hoogenboom HR et al. Nucleic Acids Res 1991; 19:4133-4137 30. Ignatovich, O., et al. (1997). J Mol Biol 268(1): 69-77. 31. Hoogenboom & Winter (1992). J Mol Biol 227(2): 381-8. 32. Tomlinson, et al. (1992). J Mol Biol 227(3): 776-98. 32 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
Sequências SEQ ID NO: 1. Sequência nudeotídica do domínio VH de 4A1-F16
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC CGG TAT GGT GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos do domínio VH de 4A1-F16 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGASWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH NAFDYWGQGT LVTVSR
SEQ ID NO: 3 Sequência nudeotídica do domínio VL de 4A1-F16 TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT ΆΆΆ AAG AAC “CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CiiA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCC GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácidos do domínio VL de 4A1-F16 & 3A1-D5 SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS VYTMPPWFG GGTKLTVLG
SEQ ID NO:5 Sequência de aminoácidos de CDR1 de VH de 4A1-F16 RYGAS
SEQ ID NO:6 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de 4A1-F16 & 3A1-D5 AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO:7 Sequência de aminoácidos de CDR3 de VH de 4A1-F16 & 3A1-D5 AHNAFDY 33 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID Ν0:8 Sequência de aminoácidos de CDR1 de VL de 4A1-F16 & 3A1-D5 QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO:9 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VL de 4A1-F16 & 3A1-D5 GKNNRPS
SEQ ID NO:10 Sequência de aminoácidos de CDR3 de VL de 4A1-F16 & 3A1-D5 NSSVYTMPPW
SEQ ID NO: 11 Sequência nucleotídica do domínio VH de 3A1-D5 GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG
GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC
AGC TAT GCC GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG
GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC
ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC
TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO: 12 Sequência de aminoácidos do domínio VH de 3A1-D5 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAASWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ÀDSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH NAFDYWGQGT LVTVSR
SEQ ID NO:13 Sequência de aminoácidos de CDR1 de VH de 3A1-D5 SYAAS
SEQ ID NO: 14 Sequência nucleotídica do domínio VH de E10 GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG
GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC
GGT AGT CGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG
GAG TGG GTC TCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC
GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC
ACG GCC GTA TÁT TAC TGT GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT
GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA 34 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID ΝΟ: 15 Sequência de aminoácidos do domínio VH de Ξ10 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GSRMGWVRQA PGKGLEWVSA INEEGGQTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHP PHRPFDYWGQ GTLVTVSR SEQ ID NO: 16. Sequência nucleotídica do domínio VL de E10 & A12
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA
CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT
TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT
GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA
TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT
GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT
CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG
ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO: 17 Sequência de aminoácidos do domínio VL de E10 & AI2 SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDRFSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS HGPRRPWFG GGTKLTVLG
SEQ ID NO:18 Sequência de aminoácidos de CDRl de VH de E10, F4 & Gll GSRMG
SEQ ID NO:19 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de E10, F4 & Gll AINEEGGQTYYADSVKG
SEQ ID NO:20 Sequência de aminoácidos de CDR3 de VH de E10, A12, F4 & Gll HPPHRPFDY
SEQ ID NO:21 Sequência de aminoácidos de CDRl de VL de E10 & A12 QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO:22 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VL de E10, A12 & Gll GKNNRPS
SEQ ID NO:23 Sequência de aminoácidos de CDR3 de VL de E10 & A12 NSSHGPRRPW 35 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID NO: 24 Sequência nucleotídica do domínio VH de A12 GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID ΝΟ 25 Sequência de aminoácidos do domínio VH de A12 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHP PHRPFDYWGQ GTLVTVSR
SEQ ID NO:26 Sequência de aminoácidos de CDR1 de VH de A12 SYAMS
SEQ ID NO:27 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de A12 AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 28 Sequência de ácido nucleico do domínio VH de F GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGT CGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGA SEQ ID NO: 29 Sequência de aminoácidos do domínio VH de F4 & Gll evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsgsrmgwvrqapgkglewvsaineeggqtyy adsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakhpphrpfdywgqgtlvtvsr 36 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID NO: 30 Sequência de ácido nucleico do domínio VL de F4 TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA TCT AGT CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID ΝΟ: 31 Sequência de aminoácidos do domínio VL de F4 SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKSSRPSGIPDR FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPWFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:32 Sequência de aminoácidos de CDR1 de VL de F4 & Gll QGDSLRLYYAS
SEQ ID NO:33 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VL de F4 GKSSRPS
SEQ ID NO: 34 Sequência de ácido nucleico do domínio VL de Gll TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC SEQ ID NO: 35 Sequência de aminoácidos do domínio VL de Gll
SSELTQDPAVSVAtGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPWFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:36 Sequência de ácido nucleico do ligante peptídico GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA
SEQ ID NO:37 Sequência de aminoácidos do ligante peptídico GGGGSGGGGSGGGG
SEQ ID NO:38 Sequência de ácido nucleico do ligante peptídico GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGT TCT GGC GGT GGC GGA TCG 37 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID ΝΟ:39 Sequência de aminoácidos do ligante peptídico GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:40 Sequência de ácido nucleico do ligante peptídico TCT TCC TCA TCG GGT AGT AGC TCT TCC GGC TCA TCG TCC AGC GGC
SEQ ID NO:41 Sequência de aminoácidos do ligante peptídico SSSSGSSSSGSSSSG
SEQ ID NO:42 Sequência de aminoácidos do ligante peptídico GSGSAGSGSAGSGSA
SEQ ID NO:43 Sequência de aminoácidos do ligante peptídico GGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO: 44 Nova sequência de ácido nucleico do domínio VH GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGT CGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GGT CAR ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAA GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGT SEQ ID NO: 45 Nova sequência de aminoácidos do domínio VH de F4 & Gll
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTYYAD
SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 46 Nova seauência de ácido nucleico do domínio VL de Gll
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT
GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC
ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC
TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG
GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT
GGG CCC CGT AGG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC
GTC CTA GGC SEQ ID NO: 47 Nova sequência de aminoácidos do domínio VL de Gll
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPWFGGGTKLTVLG 38 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID ΝΟ: 48 Nova sequência de aminoácidos do dominio VH de E10 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GSRMGWVRQA PGKGLEWVSA INEEGGQTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHP PHRPFDYWGQ GTLVTVSS SEQ ID NO: 49 Nova sequência nucleotídica do domínio VL de 4A1-F16 & 3A1-D5
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT TAT ACT ATG CCG CCC GTG GTA GTC CTA GGC
GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC SEQ ID NO: 50 Nova sequência de aminoácidos do domínio VL de 4A1-F16 & 3A1-D5
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 51 Sequência de ácido nucleico do domínio VH de P12
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC
CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGCCAGTATTCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG
GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTACGGGGACTGGTGGTGAGACATACTACGCAGAC
TCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT
GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGCGGCGGATTTTTG
ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGA SEQ ID NO: 52 Sequência de aminoácidos do domínio VH de P12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYSMSWVRQAPGKGLEWVSAITGTGGETYY
ADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSR 39 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 53 Sequência de ácido nucleico do domínio VL de P12 e Dll
TCGAGTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCAC
ATGCCAAGGAGACAGCCTCAGACGGCAGCCTGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGG
CCCCTGTACTTGTCATCTATTATAAAAAGCTGCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCT
GGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGC
TGACTATTACTGTAACTCCTTTTCGCCCAAGCCGAAGCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCA
AGCTGACCGTCCTAGGC SEQ 1D NO: 54 Sequência de aminoácidos do domínio VL de P12 e Dll
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRRQPASWYQQKPGQAPVLVIYYKKLRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSFSPKPKPWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 55 Sequência de ácido nucleico do domínio VH de Dll
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC
CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG
GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGAC
TCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT
GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGCGGCGGATTTTTG
ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGA SEQ ID NO: 56 Sequência de aminoácidos do domínio VH de Dll
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY
ADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSR
SEQ ID NO: 57 Sequência de ácido nucleico do domínio VH de F4S GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG ΑΑΆ GGG CGG CGG ATT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO: 58 Sequência de aminoácidos do domínio VH de F4S
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSR 40 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ
SEQ ID ΝΟ: 59 Sequência de ácido nucleico do domínio VL de F4S TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA
CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT
TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT ΑΛΑ AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA—
TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT
GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TTT
TCG CCC AAG CCG AAG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG
ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO: 60 Sequência de aminoácidos do domínio VL de F4S
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDBADYYCNSFSPKPKPWFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:61 Sequência de aminoácidos de CDRl de VH de P12 QYSMS
SEQ ID NO: 62 Sequência de aminoácidos de CDRl de VH de Dll e F4S SYAMS
SEQ ID NO: 63 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de P12 AITGTGGETYYADSVEG
SEQ ID NO: 64 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de Dll AISGSGGSTYYADSVEG
SEQ ID NO: 65 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de F4S AISGSGGSTYYADSVEG
SEQ ID NO: 66 Sequência de aminoácidos de CDR3 de VH de P12, Dll e F4S GRRIFDY
SEQ ID NO: 67 Sequência de aminoácidos de CDRl de VL de P12 e Dll QGDSLRRQPAS
SEQ ID NO:68 Sequência de aminoácidos de CDRl de VL de F4S QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO:69 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VL de P12 e Dll YKKLRPS
SEQ ID NO:70 Sequência de aminoácidos de CDR2 de VL de F4S GKNNRPS
SEQ ID NO:71 Sequência de aminoácidos de CDR3 de VL de P12, Dll e F4S NSFSPKPKPW 41 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:72 Iniciador oligonucleotidico de PCR TnC-D BamHI ba cgggatccgttacagaagccgaaccggaa SEQ ID NO:73 Iniciador oligonucleotidico de PCR TnC-D BglII for cgggatccgttacagaagccgaaccggaa SEQ ID NO:74 Iniciador oligonucleotidico de PCR imnTnC-Al EcoBa agaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttc SEQ ID NO:75 Iniciador oligonucleotidico de PCR mmTnC-Al BglFo tgagatcttgtccctgtggaggtctcggc
SEQ ID NO:76 Motivo de ligante peptidico GGGGS
SEQ ID NO:77 Motivo de ligante peptidico SSSSG
SEQ ID NO:78 Motivo de ligante peptidico GSGSA
SEQ ID NO:79 Motivo de ligante peptidico GGSGG
SEQ ID NO: 80. Nova sequência nucleotidica do domínio VL de E10 & AI2 TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT
GGA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CG6 CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC-
TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG
GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT
GGG CCC CGT AGG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC
GTC CTA GGC SEQ ID NO: 81 Nova sequência aminoácidos do domínio VL de E10 & A12
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPWFGGGTKLTVLG 42 ΕΡ 1 817 345/ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 82 Nova sequência ácido nucleico do domínio VL de F4
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT
GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC
ATC TAT GGT AAA TCT AGT CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC
TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG
GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT
GGG CCC CGT AGG CCT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC
GTC CTA GGC SEQ ID NO: 83 Nova sequência aminoácidos do domínio VL de F4
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKSSRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPWFGGGTKLTVLG
Lisboa, 2009-08-13

Claims (28)

  1. ΕΡ 1 817 345/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Elemento de ligação específica isolado que se liga à tenascina C humana e que compreende: um domínio VH de anticorpo compreendendo as CDR 1, 2 e 3 de vh em que: CDR1 de VH CDR2 de VH CDR3 de VH é SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:13; é SEQ ID NO:6; e é SEQ ID NO:7; e um domínio VL de anticorpo compreendendo as CDR 1, 2 e 3 de VL em que: CDRl de VL CDR2 de VL CDR3 de VL é SEQ ID NO:8; é SEQ ID NO:9; e é SEQ ID NO:10.
  2. 2. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, em que a CDRl de VH é SEQ ID NO:5.
  3. 3. Elemento de ligação especifica de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, compreendendo o domínio VH de anticorpo da SEQ ID NO:2, ou um domínio VH possuindo menos de 5 alterações de aminoácidos na SEQ ID NO:2.
  4. 4. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a sequência do domínio VH da SEQ ID NO:12, ou um domínio VH possuindo menos de 5 alterações de aminoácidos na SEQ ID NO:12.
  5. 5. Elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo a sequência do domínio VL da SEQ ID NO:50, ou um domínio VL possuindo menos de 5 alterações de aminoácidos na SEQ ID NO:4 ou na SEQ ID NO:50.
  6. 6. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 3, compreendendo a sequência do domínio VH da SEQ ID NO:2 e a sequência do domínio VL da SEQ ID NO:50.
  7. 7. Elemento de ligação específica isolado que se liga à tenascina C humana, que compreende: ΕΡ 1 817 345/ΡΤ 2/4 um domínio VH de anticorpo com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:2 ou uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 5 alterações da sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:2 e um domínio vl de anticorpo com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:50 ou uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 5 alterações da sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:50, em que o elemento de ligação se liga à tenascina C com uma afinidade igual ou superior à afinidade de um anticorpo compreendendo um domínio VH D5 de SEQ ID NO:12 e um domínio VL de SEQ ID NO:50.
  8. 8. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, compreendendo uma proteína imunitária pequena (SIP), em que a SIP compreende uma molécula de scFv compreendendo a sequência do domínio VH da SEQ ID NO:2 e a sequência do domínio VL da SEQ ID NO:50, fundida com o domínio CH4 de imunoglobulina E humana.
  9. 9. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 8, em que a SIP é homodimérica.
  10. 10. Elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende uma molécula de anticorpo scFv.
  11. 11. Elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende uma região constante de anticorpo.
  12. 12. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 11, que compreende um anticorpo completo.
  13. 13. Elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, conjugado com um marcador detectável ou com uma citoquina.
  14. 14. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 13, em que um domínio VH ou um domínio VL do elemento de ligação específica está conjugado com uma ΕΡ 1 817 345/ΡΤ 3/4 citoquina, por meio de um ligante peptídico, na forma de uma proteína de fusão.
  15. 15. Elemento de ligação específica de acordo com a reivindicação 13 ou a reivindicação 14, em que a citoquina é a IL2.
  16. 16. Elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, conjugado com um agente citotóxico.
  17. 17. Ácido nucleico isolado que compreende uma sequência nucleotídica que codifica um elemento de ligação específica ou um domínio VH ou VL de anticorpo de um elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
  18. 18. Célula hospedeira transformada com ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17.
  19. 19. Método de produção de um elemento de ligação específica ou de um domínio VH ou VL de anticorpo, em que o método compreende a cultura de células hospedeiras de acordo com a reivindicação 18, em condições conducentes à produção do referido elemento de ligação específica ou domínio VH ou VL de anticorpo.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, compreendendo adicionalmente o isolamento e/ou a purificação do referido elemento de ligação específica ou domínio variável VH ou VL de anticorpo.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, compreendendo a conjugação do elemento de ligação específica ou do domínio variável VH ou VL de anticorpo com um marcador detectável ou um agente citotóxico.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o marcador é um radionuclido ou um fluoróforo.
  23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, compreendendo adicionalmente a ΕΡ 1 817 345/ΡΤ 4/4 formulação do elemento de ligação específica ou do domínio variável VH ou VL de anticorpo numa composição que inclui pelo menos uma componente adicional.
  24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, compreendendo adicionalmente a ligação do elemento de ligação específica à tenascina C ou a um fragmento da tenascina C in vítro.
  25. 25. Método compreendendo a ligação de um elemento de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, à tenascina C ou a um fragmento da tenascina C in vítro.
  26. 26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou a reivindicação 25, que compreende a determinação da quantidade de ligação do elemento de ligação específica.
  27. 27. Elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, para utilização num método de tratamento ou de diagnóstico.
  28. 28. Utilização do elemento de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, no fabrico de um medicamento para utilização num método de tratamento ou de diagnóstico in vivo de uma perturbação proliferativa. Lisboa, 2009-08-13
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WO (1) WO2006050834A2 (pt)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257317A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-16 Duke University Combination therapy in the treatment of cancer
WO2007056441A2 (en) * 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
JP5221641B2 (ja) 2007-04-02 2013-06-26 フィロゲン エスピーエー 腫瘍転移の血管新生と関連するフィブロネクチンのｅｄ−ａ抗原
MX2009013752A (es) * 2007-06-28 2010-02-01 Philogen Spa Inmunocitocinas para el tratamiento del cancer en combinacion con agentes quimioterapeuticos.
US10202442B2 (en) 2007-07-25 2019-02-12 Philogen S.P.A. Antigen associated with lung cancers and lymphomas
WO2009056268A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Philogen S.P.A. An antigen associated with rheumatoid arthritis
WO2009089998A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Philochem Ag Binding members for tenascin-c domain a2
US8580267B2 (en) 2008-12-19 2013-11-12 Philogen S.P.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
CA2748401C (en) 2009-01-07 2017-09-12 Philogen S.P.A. Antigens associated with endometriosis
EP2448599A1 (en) 2009-06-30 2012-05-09 Philogen S.p.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
EP2461832B1 (en) 2009-08-05 2017-06-28 Philogen S.p.A. Targeting of bone marrow neovasculature
WO2011107586A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research, Smoc1, tenascin-c and brain cancers
RU2584597C2 (ru) 2010-08-13 2016-05-20 Рош Гликарт Аг Антитела против а2 тенасцина с и способы их применения
WO2013010749A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Philogen S.P.A Sequential anti - ctla4 and targeted il-2 therapy
EP2736535B1 (en) 2011-07-27 2018-10-17 Philogen S.p.A. Il-12 immunoconjugate
JP6241912B2 (ja) * 2012-04-27 2017-12-06 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、および診断剤キット
DK2903629T3 (da) 2012-10-03 2019-08-05 Philogen Spa Antistofkonjugat til anvendelse ved behandling af inflammatorisk tarmsygdom
CN104837502B (zh) 2012-10-12 2018-08-10 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
WO2015114166A2 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Philochem Ag Targeted drug conjugates
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3387016A1 (en) 2015-12-11 2018-10-17 Philogen S.p.A. Antibodies for treatment and diagnosis of inflammatory bowel disease
ES2864095T3 (es) 2016-04-15 2021-10-13 Philogen Spa Anticuerpo anti-tenascina no glicosilado
CN109071652B (zh) 2016-05-11 2022-09-23 豪夫迈·罗氏有限公司 包含tnf家族配体三聚体和生腱蛋白结合模块的抗原结合分子
WO2017194441A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
EP3525829A1 (en) 2016-10-11 2019-08-21 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
AU2017358578B2 (en) 2016-11-09 2022-12-08 Philogen S.P.A IL2 and TNF mutant immunoconjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
WO2018224550A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Philogen S.P.A Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
CN113286616A (zh) 2018-05-23 2021-08-20 Adc治疗有限公司 分子佐剂
TW202016144A (zh) * 2018-06-21 2020-05-01 日商第一三共股份有限公司 包括cd3抗原結合片段之組成物及其用途
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
US20220119450A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 University Of Tartu Bi-specific extracellular matrix binding peptides and methods of use thereof
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
WO2022073038A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Abbvie Inc. Interleukin-22 (il-22) fusion proteins and uses thereof
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
IT1307864B1 (it) * 1999-04-20 2001-11-19 Istituto Naz Per La Ricerca Su Metodo diagnostico per il riconoscimento di neoplasie umane attraversola determinazione dell'isoforma ctn-c della tn-c, frammenti di
WO2001062800A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

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