KR20070085892A - 테나신-ｃ에 대한 항체 - Google Patents

테나신-ｃ에 대한 항체 Download PDF

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필로겐 에스.피.에이.
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Abstract

본 발명은 세포외 기질 단백질 테나신-C에 대한 특이적 결합 요소, 특히 테나신-C의 도메인 A1, 도메인 C 및 도메인 D에 대한 scFv 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표지, 세포독성 분자 또는 사이토킨과 접합된 항-테나신-C 특이적 결합 요소에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 특히 암의 진단 및 치료에 있어서 항-테나신-C 특이적 결합 요소의 용도에 관한 것이다.
테나신-C, 세포외 기질 단백질, 특이적 결합 요소.

Description

테나신-Ｃ에 대한 항체 {Antibodies against Tenascin-C}
본 발명은 테나신(tenascin)-C에 대해 지시되는 특이적 결합 요소, 특히 인간 테나신-C에 대한 인간 항체에 관한 것이다. 이들 특이적 결합 요소는 소정의 치료 용도, 예를 들면 암의 진단 및 치료에서의 용도를 갖는다.
테나신-C는 세포 부착을 조절하는 세포외 기질의 거대 육량체 당단백질이다. 테나신-C는 세포 증식 및 세포 이동과 같은 과정에 관여하며, 형태형성 및 배발생 동안뿐만 아니라 종양발생 또는 혈관신생 하에 일어나는 조직 구조에서의 변화와 관련된다.
테나신-C의 개략적 도메인 구조는 도 1에 나타나 있다. 테나신-C의 여러 이소폼은 선택적 스플라이싱의 결과로서 생성될 수 있으며, 이로써 이 단백질의 중심부에서는 도메인 A1에서 도메인 D에 이르기까지의 (여러) 도메인들이 포함될 수 있다 [Borsi L et al Int J Cancer 1992; 52:688-692, Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567]. 종래에는 도메인 A1 내지 D가 선택적 스플라이싱의 기전에 의해 테나신-C 분자에서 ("블록으로") 누락되거나 삽입되어 "테나신-C 대형" 및 "테나신-C 소형" 분자를 형성시키는 것으로 추정되어 왔다 [Borsi L et al J Biol Chem 1995; 270:6243-6245]. 테나신-C의 대형 이소폼의 강력한 과발현은 다수의 종양들에서 보고되어 왔으며 [Borsi 1992 supra], 각각 도메인 A1 및 D에 대해 특이적인 두 가지 모노클로날 항체가 임상에서 널리 특성화되어 왔다 [Riva P et al. Int J Cancer 1992; 51:7-13, Riva P et al. Cancer Res 1995; 55: 5952s-5956s, Paganelli G et al Eur J Nucl Med 1994; 21:314-321, Reardon DA et al. J Clin Oncol 2002; 20:1389-1397, Bigner DD et al. J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212].
그러나 최근에는 이러한 선택적 스플라이싱 기전이 더 복잡하게 조절됨으로써 테나신-C의 대형 이소폼들 사이의 분자 이질성이 증가한다는 것이 명확해지게 되었다. 예를 들어, 면역조직화학적 방법에 의해 나타내는 바와 같이 주로 말초혈관 염색에 따라, 테나신-C의 엑스트라 도메인 C는 테나신-C의 선택적으로 스플라이싱된 다른 도메인들에 비해 더 한정된 발현 패턴을 나타내는 것으로 보고되어 왔다 [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352]. 테나신-C의 C 도메인은 대부분의 정상 성인 조직에서 검출가능하지 않지만, 고등 성상세포종 [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345- 1352] 및 다른 유형의 종양에서 과발현된다. 대형 테나신-C 이소폼들 사이의 이질성에 대한 다른 근거는 전사 분석으로부터 유래하며, 이로써 대형 테나신-C 전사체는 이질적 조성을 특징으로 한다는 것이 확인되었다 [Katenkamp K et al. J Pathol 2004; 203:771-779]. 추가의 복잡성 수준은 번역 후 변형 (예, 글리코실화)의 존재 또는 부재에 의해 제공되는데, 이러한 변형은 개별 단백질 도메인의 표면상의 특정 에피토프를 변형시킬 수 있어서 시험관내 또는 생체내에서 특정 모노클로날 항체에 대해 특이적인 분자 인식을 할 수 없게 만든다.
기존의 시험관내 방법을 이용해서 사실상 임의의 대상 단백질에 대해 특이적인 항체를 빠르게 단리할 수 있다 하더라도, 이러한 항체가 생물 표본 또는 동물 질환 모델에서 에피토프를 인식한다는 것은 분명하지 않다. 생체내 결합 결여에 대한 가능한 이유로는 에피토프의 번역 후 변형, 에피토프의 차폐 및 불충분한 항체 특이성 또는 안정성을 들 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체의 스크리닝에 통상적으로 사용되는 효소-연결 면역흡착 분석법 (ELISA)과 같은 전형적인 고상 분석법에서 재조합 항원 (또는 항원 단편)과의 반응성만을 기초로 하여 실제적인 사용에 있어서의 모노클로날 항체의 적합성을 평가하기란 곤란하다.
따라서, 테나신-C의 대형 이소폼의 개별 도메인에 대한 모노클로날 항체를 개별적으로 분석함으로써 진단 및 치료에 있어서 이들의 적합성을 평가할 필요가 있다.
본 발명자들은 테나신-C의 선택적으로 스플라이싱된 영역 내의 여러 에피토프들에 대해 특이적인 인간 모노클로날 항체 단편을 단리했다. 이들 항체는 생물 표본 내의 대형 테나신-C 이소폼을 인식하는 능력, 및 ELISA 분석에서 밀접하게 관련된 항원들 사이에서 두드러진 차이가 있는 고도의 특이적 결합을 특징으로 한다.
본 발명의 한 측면은 인간 테나신-C, 특히 테나신-C의 대형 이소폼와 결합하는 특이적 결합 요소를 제공한다.
바람직한 특이적 결합 요소는 종양 특이적이며, 정상 조직에 비해 종양 조직에 주로 결합한다. 특이적 결합 요소는 예를 들면 정상 조직에 비해 주로 종양 조직의 기질 및/또는 신생- 및 말초-혈관 구조에 결합할 수 있다.
특이적 결합 요소는 테나신-C의 소형 이소폼에 비해 테나신-C의 대형 이소폼에 주로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 특이적 결합 요소는 테나신-C의 A1 도메인에 결합할 수 있다. 적합한 특이적 결합 요소는 서열 2의 4A1-F16 VH 도메인, 서열 12의 3A1-D5 VH 도메인, 및 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인, 및 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
4A1-F16은 본원에서 F16이라 칭하기도 한다.
예를 들면, 적합한 특이적 결합 요소는 서열 4 또는 서열 49의 4A1-F16/3A1-D5 VL 도메인 및/또는 서열 2의 4A1-F16 VH 도메인 또는 서열 12의 3A1-D5 VH 도메인을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 특이적 결합 요소는 테나신-C의 C 도메인에 결합할 수 있다. 적합한 특이적 결합 요소는 E1O VH 도메인 (서열 15 또는 서열 48), A12 VH 도메인 (서열 25), F4 및 G11 VH 도메인 (서열 29 또는 서열 45), 및 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 26 및 서열 27로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인, 및/또는 서열 17 또는 서열 81의 VL 도메인, 서열 31 또는 서열 83의 아미노산 서열을 갖는 F4 VL 도메인, 서열 35 또는 서열 47의 아미노산 서열을 갖는 G11 VL 도메인 및 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 32 및 서열 33으로부터 선택되 는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다.
따라서, 한 예에서, 특이적 결합 요소는 E1O VH 도메인 (서열 15 또는 서열 48), A12 VH 도메인 (서열 25) 및 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 26 및 서열 27로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인; 및/또는 서열 17 또는 서열 81의 VL 도메인, 및 서열 21, 서열 22 및 서열 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들면, 적합한 특이적 결합 요소는 서열 17 또는 서열 81의 E1O/A12 VL 도메인 및/또는 서열 15 또는 서열 48의 E1O VH 도메인 또는 서열 25의 A12 VH 도메인을 포함할 수 있다.
다른 예에서, 특이적 결합 요소는
F4 및 G11 VH 도메인 (서열 29 또는 서열 45) 및 서열 18, 서열 19 및 서열 20으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인; 및/또는 F4 VL 도메인 (서열 31 또는 서열 83), G11 VL 도메인 (서열 35 또는 서열 47), 및 서열 32, 서열 33, 서열 22 및 서열 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들면, 적합한 특이적 결합 요소는 서열 29 또는 서열 45의 F4/G11 VH 도메인 및/또는 서열 31 또는 서열 83의 F4 VL 도메인 또는 서열 35 또는 서열 47의 G11 VL 도메인을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 특이적 결합 요소는 테나신 C의 도메인 D에 결합한다. 바람직하게는 특이적 결합 요소는 인간 도메인 D에 결합한다. 특이적 결합 요소는 마우스 이소폼과 교차반응할 수 있다. 본 발명자들은 도메인 D에 특이적인 항체 분자를 단리했다. 최초의 클론은 F4S라고 칭하였다. 또한, 본 발명자들은 DII로 명명된 F4S의 친화성 성숙된 변이체를 개발했다. 추가로, 본 발명자들은 P12로 명명된 DII의 친화성 성숙된 변이체를 개발했다.
따라서, 적합한 특이적 결합 요소는 서열 58의 F4S VH 도메인, 서열 55의 D11 VH 도메인, 서열 52의 P12 VH 도메인, 및 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65 및 서열 66으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인; 및/또는 서열 53의 P12 및 D11 VL 도메인, 서열 60의 F4S VL 도메인, 및 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 70 및 서열 71로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이룸으로써 항체 항원-결합 부위를 제공하지만, 이하에 추가로 논의된 바와 같이, VH 도메인은 단독으로 항원에 결합할 수 있다. 바람직한 한 실시양태에서, 본원에 개시된 VH 도메인 (즉, 서열 2, 12, 15, 25, 29, 45, 48, 52, 56, 또는 58)은 상응하는 VL 도메인 (즉, 서열 4 또는 서열 50 (4A1-F16 및 3A1-D5의 경우), 서열 17 또는 서열 81 (A12 및 E1O의 경우), 서열 31, 서열 83, 서열 35 또는 서열 47 (F4 및 G11의 경우), 서열 54 (P12 및 D11의 경우), 또는 서열 60 (F4S의 경우)과 쌍을 이룬 결과, VH 및 VL 도메인을 둘 다 포함하는 항체 항원-결합 부위 (예, 4A1-F16 VH 및 VL 도메인, 3A1-D5 VH 및 VL 도메인, E1O VH 및 VL 도메인, A12 VH 및 VL 도메인, F4 VH 및 VL 도메인, G11 VH 및 VL 도메인, P12 VH 및 VL 도메인, D11 VH 및 VL 도메인 또는 F4S VH 및 VL 도메인을 포함하는 부위)가 형성된다. 다른 실시양태에서, VH 도메인은 상응하는 VL 도메인 이외의 VL 도메인, 바람직하게는 테나신-C의 동일 도메인과 결합하는 특이적 결합 요소로부터의 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 경쇄 혼란(promiscuity)은 당업계에서 충분히 확립된 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인으로부터 하나 이상의 CDR을 취하여 적합한 프레임워크에 혼입시킬 수 있다. 이에 대해서는 아래에서 추가로 논의하기로 한다. CDR은 일반적으로 Kabat에 따라 정의된다. 바람직하게는 VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 4A1-F16 VH CDR1은 서열 5에 나타낸다. 3A1-D5 VH CDR1은 서열 13에 나타낸다. 4A1-F16 및 3A1-D5 VH CDR 2 및 3은 각각 서열 6 및 7에 나타낸다. 4A1-F16 및 3A1-D5 VL CDR 1, 2 및 3은 각각 서열 8, 9 및 10에 나타낸다. E1O VH CDR 1 및 2는 서열 18 및 19에 나타낸다. A12 VH CDR 1 및 2는 서열 26 및 27에 나타낸다. E1O 및 A12 VH CDR3은 서열 23에 나타낸다. E1O 및 Al2 VL CDR 1, 2 및 3은 각각 서열 21, 22 및 23에 나타낸 다. F4 및 G11 VH CDR 1, 2 및 3은 각각 서열 18, 19 및 20에 나타낸다. F4 VL CDR 1, 2 및 3은 각각 서열 32, 33 및 23에 나타낸다. G11 VL CDR 1, 2 및 3은 각각 서열 32, 22 및 23에 나타낸다. P12 VH CDR은 각각 서열 61, 63 및 66에 나타낸다. P12 VL CDR은 각각 서열 67, 69 및 71에 나타낸다. D11 VH CDR은 각각 서열 62, 64 및 66에 나타낸다. D11 VL CDR은 각각 서열 67, 69 및 71에 나타낸다. F4S VH CDR은 각각 서열 62, 65 및 66에 나타낸다. F4S VL CDR은 각각 서열 68, 70 및 71에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 특이적 결합 요소는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 5 또는 더 바람직하게는 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 중 하나 이상을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 특이적 결합 요소는 서열 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 서열 27 또는 더 바람직하게는 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 26 또는 더 바람직하게는 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 중 하나 이상을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다.
특이적 결합 요소는 서열 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 서열 22 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 21 또는 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 중 하나 이상을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다.
바람직하게는 특이적 결합 요소는 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같은 scFv이다. VH 및 VL 도메인은 펩티드 링커, 예를 들면 서열 37에 기재된 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 연결시킬 수 있다. 통상적으로, 링커는 모티프의 하나 이상의 직렬 반복부를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 전형적으로 모티프는 5개의 잔기로 이루어진 서열이며, 바람직하게는 잔기의 4개 이상이 Gly 또는 Ser이다. 5개의 잔기들 중 4개가 Gly 또는 Ser인 경우, 다른 잔기는 Ala일 수 있다. 더 바람직하게는 5개의 잔기의 각각이 Gly 또는 Ser이다. 바람직한 모티프는 GGGGS, SSSSG, GSGSA 및 GGSGG (각각 서열 76, 77, 78 및 79)이다. 바람직하게는, 이들 모티프는 서열 내에서 인접해 있으며, 반복부들 사이에 개재된 뉴클레오티드는 없다. 링커 서열은 1개 내지 5개, 바람직하게는 3개 또는 4개의 모티프 반복부를 포함할 수 있거나 또는 이러한 모티프 반복부로 구성될 수 있다. 예를 들면, 3개의 직렬 반복부를 갖는 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS - 서열 39, SSSSGSSSSGSSSSG - 서열 41, GSGSAGSGSAGSGSA - 서열 42, GGSGGGGSGGGGSGG - 서열 43의 아미노산 서열 중 하나를 가질 수 있다.
서열들이 본원에 기재되어 있으며 테나신-C에 대한 특이적 결합 요소에서 사용될 수 있는 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변화 또는 돌연변이 및 스크리닝 방법에 의해 얻을 수 있다. 이러한 방법들이 또한 본 발명에 의해 제공된다.
서열이 본원에 구체적으로 개시되어 있는 VH 및 VL 도메인 중 어떤 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체는 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변화 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)를 포함할 수 있는데, 서열 변화는 약 20개 미만, 약 15개 미만, 약 10개 미만 또는 약 5개 미만, 4, 3, 2 또는 1개일 수 있다. 변화는 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 행해질 수 있다. 특히, 변화는 VH CDR1, VH CDR2 및/또는 VH CDR3, 특히 VH CDR3에서 행해질 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 요소는 항원에 결합하는 데 있어서, 테나신-C의 대형 이소폼, 특히 그의 A1 또는 C 도메인과 결합하면서 특이적 결합 요소, 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인 또는 본원에 개시된 VH CDR 또는 이들 중 임의의 것의 변이체도 포함하는 임의의 특이적 결합 요소와 경쟁하는 요소일 수 있다. 결합 요소들 사이의 경쟁은, 예를 들면 ELISA를 이용하고/하거나 태그되지 않은(untagged) 다른 결합 요소의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합 요소에 특정 수용체 분자를 태그하여 동일 에피토프 또는 중복 에피토프와 결합하는 특이적 결합 요소를 확인함으로써 시험관내에서 용이하게 분석할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 테나신-C에 결합하는 데 있어서 4A1-F16, 3A1-D5, E1O, A12, F4, G11, P12, D11 및 F4S 중 하나 이상과 경쟁하는 인간 항체 항원- 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 요소를 제공한다.
4A1-F16, 3A1-D5, E1O, A12, F4 G11, P12, D11 또는 F4S와 경쟁할 수 있는 테나신-C의 대형 이소폼에 대한 항체를 얻기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체는 테나신-C의 소형 이소폼에 비해 테나신-C의 대형 이소폼에 주로 결합한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 특이적 결합 요소의 라이브러리를 상기 항원과 접촉시키고 상기 항원과 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 특이적 결합 요소를 선별하는 것을 포함하는, 항원과 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합 요소를 얻는 방법을 제공한다.
라이브러리는 표면에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 임의로는 디스플레이된 VL 도메인 (존재하는 경우)을 코딩하는 핵산을 함유하는 박테리오파지 입자의 표면에 디스플레이될 수 있다.
항원과 결합할 수 있으며 박테리오파지 입자상에 디스플레이된 특이적 결합 요소의 선별 후, 핵산은 상기 선별된 특이적 결합 요소를 디스플레이하는 박테리오파지 입자로부터 취할 수 있다. 이러한 핵산은 추후에 상기 선별된 특이적 결합 요소를 디스플레이하는 박테리오파지 입자로부터 취해진 핵산의 서열을 갖는 핵산으로부터의 발현에 의해 특이적 결합 요소 또는 항체 VH 가변 도메인 (임의로 항체 VL 가변 도메인)을 제조하는데 사용될 수 있다.
상기 선별된 특이적 결합 요소의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인은 이러한 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소와 같이 단리된 형태로 제공될 수 있다.
테나신-C와 결합하는 능력, 또한 테나신-C에 결합하는데 있어서 4A1-F16, 3A1-D5, E1O, A12, F4, G11, P12, D11 또는 F4S와 경쟁하는 능력은 추가로 시험할 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 요소는 4A1-F16, 3A1-D5, E1O, A12, F4, G11, P12, D11 또는 F4S 중 하나 이상의 친화성으로 또는 그보다 더 크거나 더 적은 친화성으로 테나신-C와 결합할 수 있다. 적절한 조건하에 상이한 특이적 결합 요소들의 결합 친화성을 비교할 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 요소는 항체 서열 이외에도 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들면 폴딩된 도메인을 형성하거나 또는 분자에 대해 항원과 결합하는 능력 이외에도 다른 기능적 특징을 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 요소는 검출가능한 표지, 예를 들면 종양 검출을 용이하게 하는 물질, 예를 들어 방사성핵종 또는 형광단을 보유할 수 있거나 또는 살균 작용을 개시할 수 있는 물질, 예를 들어 치료 방법에 사용하기 위한 방사성핵종, 감광제(photosensitiser), 약물, 사이토킨, 응고유발 인자, 독소 또는 효소 (예, 펩티딜 결합 또는 링커를 통함)에 접합될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 특이적 결합 요소, VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 상기 특이적 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 조건하에 상기 핵산을 발현시키고 이를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 특이적 결합 요소, VH 도메인 및/또는 a VL 도메인을 제조하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 특이적 결합 요소는 인간 환자에게 유효량의 특이적 결합 요소를 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 신체의 치료 또는 진단 방법, 예를 들면 인간 환자에서 질환 또는 장애, 특히 증식성 장애, 예컨대 암의 치료 방법 (예방적 치료 포함할 수 있음)에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 항체 VH 가변 도메인 및/또는 VL 가변 도메인을 코딩하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열, 특히 서열 5, 6, 7, 13, 18, 19, 20, 26 및 27로부터 선택되는 VH CDR 및 서열 8, 9, 10, 21, 22, 23, 32 및 33으로부터 선택되는 VL CDR을 코딩하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다.
다른 측면은 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면은 코딩 핵산으로부터 발현을 유발하는 것을 포함하는, 항체 VH 가변 도메인의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 제조를 위한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면으로, VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소 및 VL 가변 도메인의 제조를 위한 유사한 방법이 제공된다.
제조 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제의 단계를 포함할 수 있다.
제조 방법은 생성물을 하나 이상의 추가의 성분, 예를 들어 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면을 더 상세히 기술한다.
용어
특이적 결합 요소
이것은 서로에 대해 결합 특이성을 갖는 한 쌍의 분자로 된 요소를 말한다. 특이적 결합 쌍의 요소들은 자연에서 유래되거나, 완전한 또는 부분적인 합성에 의해 생성될 수 있다. 분자 쌍들 중 하나의 요소는 그 표면 위에 소정의 부위 또는 공동 (cavity)을 갖는데, 이는 분자 쌍의 다른 요소와 특이적으로 결합하며, 따라서 분자 쌍의 다른 요소의 특정한 공간적 및 극성 구조에 대해 상보적이다. 따라서, 쌍의 요소들은 서로 특이적으로 결합하는 성질을 갖고 있다. 특이적 결합 쌍 의 유형에 대한 예로는 항원-항체, 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이 있다. 본 출원은 항원-항체 유형의 반응에 관한 것이다.
항체
이것은 천연 이뮤노글로불린 또는 부분적 또는 전체적으로 합성에 의해 생성된 이뮤노글로불린을 나타낸다. 이 용어는 또한 항체 결합 도메인이거나 또는 실질적으로 그와 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 항체의 예로는 이뮤노글로불린 이소타입 및 그의 이소타입 하위군; 항원 결합 도메인을 포함하는 단편, 예를 들면 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; 및 디아바디가 있다. 모노클로날 및 다른 항체를 취하고 재조합 DNA 기술을 사용해서 본래의 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 제조할 수 있다. 이러한 기술은 항체의 이뮤노글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 DNA를 다른 이뮤노글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역 및 프레임워크 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포를 유전적 돌연변이 또는 다른 변화로 처리할 수 있으며, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시킬 수도 있고 변경시키지 않을 수도 있다.
항체는 다수의 방식으로 변경시킬 수 있기 때문에, "항체"라는 용어는 필요한 특이성을 보유하는 결합 도메인을 갖는 임의의 특이적 결합 요소 또는 물질을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 상기 용어는 천연의 것이든지 또는 전체 또는 일부가 합성된 것이든지 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리 펩티드를 비롯하여 항체의 항체 단편, 유도체, 기능적 등가물 및 상동체를 포함한다. 따라서, 다른 폴리펩티드에 융합된 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 등가물이 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 개시되어 있다.
온전한 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 알려져 있다. 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인 bf로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 [Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)]; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 두 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결된 단일 쇄 Fv 분자 (scFv) (두 개의 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성함 [Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]; (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디", 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다중특이적 단편 [WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993]가 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 가교결합의 도입에 의해 안정화될 수 있다 [Y. Reiter et al. Nature Biotech 14 1239-1245 1996]. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디를 제조할 수도 있다 [S. Hu et al, Cancer Res. 56 3055-3061 1996].
디아바디는 폴리펩티드의 다량체인데, 각 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 경쇄 의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 이뮤노글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하며, 두 개의 도메인은 (예를 들어, 펩티드 링커에 의해) 연결되지만 서로 회합하여 항원 결합 부위를 형성시킬 수 없다: 항원 결합 부위는 다량체 내의 하나의 폴리펩티드의 제1 도메인과 상기 다량체 내의 다른 폴리펩티드의 제2 도메인과의 회합에 의해 형성된다 (WO 94/13804).
이중특이적 항체를 사용하는 경우, 이들은 다양한 방법 [Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)]으로 제조될 수 있거나 (예, 화학적 방법으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조됨) 또는 상기 언급한 바와 같은 이주특이적 항체 단편들 중 임의의 것일 수 있다. 디아바디 및 scFv는 Fc 영역 없이, 가변 도메인만을 사용해서 잠재적으로는 항-이디오타입 반응의 효과를 감소시킴으로서 구성해낼 수 있다.
이중특이적인 온전한 항체와 대립되는 이중특이적 디아바디는 그가 이 콜라이에서 쉽게 구성되고 발현되기 때문에 특히 유용할 수도 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 다수의 다른 폴리펩티드, 예를 들면 항체 단편)는 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 (WO 94/13804)를 이용해서 쉽게 선별할 수 있다. 디아바디의 하나의 암(arm)이 변하지 않고 유지되는 경우, 예를 들면 항원 X에 대해 지시된 특이성으로 유지되는 경우, 다른 암이 변화되고 적절한 특이성의 항체가 선별되는 경우에 라이브러리를 만들 수 있다. 이중특이적인 온전한 항체는 매듭-대-개구 조작 (knob-into-hole) [J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng. 9 616-621, 1996]으로 만들 수 있다 .
항원 결합 도메인
이것은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 부위를 포함하는 항체의 부분을 말한다. 항원이 대형인 경우, 항체는 항원의 특정한 부분에만 결합할 수 있고, 이 부분은 에피토프라고 불리운다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인 (예를 들면, 이른바 VH 도메인으로 구성된 Fd 항체 단편)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
특이적
이는 특이적 결합 쌍 중 하나의 요소가 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자에 대해서는 유의한 결합을 나타내지 않는 상황을 일컫기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 테나신-C에 특이적인 항체는 세포외 기질의 다른 성분, 예컨대, 피브로넥틴에 대해 결합하지 않거나 또는 거의 결합하지 않음을 나타낼 수 있다. 유사하게, 테나신-C의 대형 이소폼에 특이적인 항체는 테나신-C의 소형 이소폼에 결합하지 않거나 또는 거의 결합하지 않음을 나타낼 수 있다. 상기 용어는 또한 예를 들면 항원 결합 도메인이 다수의 항원이 보유하는 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에 적용될 수 있고, 이 경우에 항원 결합 도메인을 보유하는 특이적 결합 요소는 당해 에피토프를 보유한 각종 항원에 결합할 수 있을 것이다.
포함한다( comprise )
이는 일반적으로 포함한다 (include)의 의미로 사용되고, 다시 말해서 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 가능하게 한다.
단리된
이는 본 발명의 특이적 결합 요소, 또는 이러한 결합 요소를 코딩하는 핵산이 본 발명에 따르는 것인 상태를 가리킨다. 요소 및 핵산은 자연 환경, 또는 시험관내 또는 생체내에서 실행되는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 때 이들의 제조 환경 (예를 들면, 세포 배양물)에서 이들과 함께 발견되는 자연적으로 결합된 물질, 예컨대, 기타 폴리펩티드 또는 핵산을 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않을 것이다. 요소 및 핵산은 희석제 또는 보조제와 함께 제제화될 수도 있고, 실행상의 목적을 위해 단리될 수도 있다 - 예를 들면, 요소들은 면역분석법에서 사용되는 마이크로타이터 플레이트를 코팅하기 위해 사용되는 경우에 통상적으로 다른 담체 또는 젤라틴과 혼합되거나, 또는 진단 또는 치료법에서 사용될 때 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 특이적 결합 요소들은 자연적으로 또는 이종 진핵 세포 (예를 들면, CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의하여 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들면, 원핵 세포에서의 발현에 의해 제조되는 경우에) 글리코실화되지 않을 수 있다.
"실질적으로 기재된 것과 같은"이란, 본 발명의 관련된 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인이 본원에 기재된 서열의 특정한 영역과 동일하거나 매우 유사함을 의미한다. "매우 유사한"이란, CDR 및(또는) VH 또는 VL 도메인에서 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 예컨대, 1 내지 3개, 1 또는 2개, 또는 3개 또는 4개의 치환이 이루어질 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 CDR을 보유하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서 열 또는 그의 실질적인 부분이고, 여기에서 CDR은 재배열된 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR에 상응하는 위치에 위치한다. 이뮤노글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition. US Department of Health and Human Services, 1987] 및 인터넷에서 얻을 수 있는 그의 최신정보 (http://immuno.bme.nwu.edu)를 참조하여 결정될 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기재된 것과 실질적으로 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분에서 CDR로서 보유된다.
본 발명에 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포주 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻을 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열을 기초로 하는 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열 (예컨대, CDR1, CDR2 또는 CDR3)은 재조합 DNA 기술로 CDR (예컨대, 상응하는 CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 결실한 가변 도메인의 레퍼토리 내에 도입할 수 있다.
예를 들면, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10:779-783]은 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 기재하고 있으며, 여기서 가변 도메인 영역의 5' 말단 또는 그에 인접한 곳에 결합하는 컨센서스 프라이머를 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용하여 CDR3을 결실한 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공한다. 마크스 (Marks) 등은 추가로 이 레퍼토리를 특정 항체의 CDR3과 조합할 수 있는 방법을 기재하고 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR-유래 서열은 CDR을 결실한 VH 또는 VL 도메인의 레퍼 토리와 셔플링(shuffling)할 수 있고, 셔플링된 완전 VH 또는 VL 도메인을 동족체 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 본 발명의 특이적 결합 요소를 제공하였다. 이어서, 레퍼토리는 적합한 숙주계, 예컨대 WO92/01047의 파지 디스플레이 시스템에 디스플레이될 수 있어 적합한 특이적 결합 요소를 선택할 수 있다. 레퍼토리는 많게는 104개 개체 요소, 예를 들면 106 내지 108 또는 1010개 요소로부터의 임의의 것으로부터 이루어질 수 있다.
유사한 셔플링 또는 조합 기술은 문헌 [Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391]에 개시되어 있으며, 여기서 상기 문헌은 β-락타마제 유전자에 관한 기술을 기재하지만, 상기 접근법은 항체 생산에 사용될 수 있음을 진술하고 있다.
추가의 별법은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 유발하는 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 랜덤 돌연변이유발로 본 발명의 CDR-유래 서열을 갖는 신규 VH 또는 VL 영역의 생산에 관한 것이다. 이러한 기술은 문헌 [Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580]에 기재되어 있으며, 여기서 상기 문헌은 실수-유발(error-prone) PCR을 사용하였다.
사용될 수 있는 또다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 직접 돌연변이유발에 관한 것이다. 이러한 기술은 문헌 [Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813] 및 [Schier et al., 1996, J. MoI. Biol. 263:551-567]에 개시되어 있다.
모든 상기 기술은 이와 같이 당업계에 공지되어 있지만, 그 자체로 본 발명 의 부분을 형성하지는 않는다. 당업자는 이러한 기술을 사용하여 당업계에 일상적 방법으로 본 발명의 특이적 결합 요소를 제공할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 측면은 테나신-C에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 얻는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본원에 설명된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하고, 임의로는 VH 도메인과 조합하여 하나 이상의 VL 도메인을 제공하는 단계, 및 테나신-C에 특이적인 특이적 결합 요소 또는 항체 항원 결합 도메인을 확인하기 위해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하는 단계를 포함한다. 상기 VL 도메인은 본원에 실질적으로 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서에서, 하나 이상의 아미노산을 VH 도메인의 하나 이상의 CDR, 예를 들면 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 부가, 결실, 치환 또는 삽입할 수 있다.
본원에 설명된 VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VL 도메인을 제공하고, VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH 도메인을 제공하는 단계, 및 테나신-C에 특이적인 특이적 결합 요소 또는 항체 항원 결합 도메인을 확인하기 위해 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하는 단계를 포함하는 유사한 방법을 사용할 수 있다. 상기 VH 도메인은 본원에 실질적으로 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 가질 수 있거나 또는 상기 기재한 바와 같이 얻는, 본원에 실질적으로 기재된 것과 같은 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산을 VL 도메인의 하나 이상의 CDR에 부가, 결실, 치환 또는 삽입할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 테나신-C에 특이적인 특이적 결합 요소를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은
(a) 치환될 CDR을 포함하거나 또는 CDR 코딩 영역을 결실한 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 개시 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) VH CDR에 대해 본원에 실질적으로 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 코딩하는 공여자 핵산과 상기 레퍼토리를 상기 공여자 핵산이 레퍼토리 중의 CDR 영역 내로 삽입되도록 조합하여 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성 레퍼토리를 제공하는 단계;
(c) 상기 생성 레퍼토리의 핵산을 발현하는 단계;
(d) 테나신-C 항원에 특이적인 특이적 결합 요소를 선별하는 단계; 및
(e) 그를 코딩하는 상기 특이적 결합 요소 또는 핵산을 회수하는 단계
를 포함한다.
CDR은 VH CDR1, CDR2 또는 CDR3일 수 있다.
또한, 치환될 CDR을 포함하거나 또는 CDR 코딩 영역을 결실한 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 본 발명의 VL CDR을 조합하는 유사한 방법을 사용할 수 있다.
CDR은 VL CDR1, CDR2 또는 CDR3일 수 있다.
유사하게는, 하나 이상의, 또는 모든 3개의 CDR을 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 그래프팅하고, 이어서 이를 테나신-C, 특히 테나신-C의 대형 이소폼에 특이적인 특이적 결합 요소 또는 특이적 결합 요소들에 대해 스크리닝할 수 있다.
이뮤노글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 그들의 개재 프레임워크 영역과 함께 적어도 3개의 CDR 영역을 포함할 것이다. 바람직하게는, 그 부분은 제1 및 제4 프레임워크 영역의 어느 하나 또는 양쪽 모두를 적어도 약 50％ 포함할 것이고, 상기 50％는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50％ 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단에 있는 추가의 잔기는 자연 발생 가변 도메인 영역과 정상적으로는 관련성이 없는 것일 수도 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 특이적 결합 요소가 작제되면, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 수월하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 코딩된 N- 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 다른 조작 단계로는 하기에 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 가변 도메인을 이뮤노글로불린 중쇄, 기타 가변 도메인 (예를 들면, 디아바디의 생산에서) 또는 단백질 표지를 비롯한 추가의 단백질 서열에 결합시키기 위해 링커를 도입하는 것이 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서 VH 및 VL 도메인의 한 쌍을 포함하는 특이적 결합 요소가 바람직하지만, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인은 본 발명의 다른 측면을 형성한다. 단일 이뮤노글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특정 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것은 공지되어 있다.
단일 쇄 특이적 결합 도메인 중 하나의 경우에, 이들 도메인을 사용하여 테 나신-C에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 결합 요소를 형성할 수 있는 상보성 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다.
이는 WO92/01047에 개시된 소위 계통적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 H 또는 L 쇄 클론 함유 개체 콜로니를 사용하여 다른 쇄 (L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-쇄 특이적 결합 요소를 파지 디스플레이 기술, 예컨대 참조문헌에 기재된 것에 따라 선별한다. 이 기술도 문헌 [Marks et al, 상기 문헌]에 개시되어 있다.
본 발명의 특이적 결합 요소는 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, VL 도메인은 그의 C-말단 끝에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄, 바람직하게는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게는, VH 도메인에 기초한 특이적 결합 요소가 그의 C-말단 끝에서 임의의 항체 이소타입, 예컨대, IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 이소타입 서브-클래스, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유래된 모든 또는 일부 이뮤노글로불린 중쇄에 부착될 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 요소는 검출가능하거나 또는 기능적인 표지로 표지될 수 있다.
검출가능한 표지에는 항체 영상화 업계에 공지된 통상적인 화학을 사용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 방사성핵종, 예컨대, 요오드-131, 이트륨-90, 인듐-111 및 테크니슘-99가 포함될 수 있다. 방사성 동위원소로 표지된 특이적 결합 요소를 사용하여 특이적 표적, 예컨대 종양에 방사선을 선택적으로 전달할 수 있다. 이는 하기 기재하는 바와 같이 종양의 영상화 또는 방사선의 세포독성 투여량의 전달에 유용할 수 있다.
기타 검출가능한 표지에는 효소 표지, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 화학 잔기, 예컨대 특이적 동족체 검출가능한 잔기, 예컨대 표지된 아비딘으로의 결합을 통해 검출될 수 있는 바이오틴, 플루오로크롬, 예컨대 플루오레신, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드(Texas Red) 및 근적외 형광단(near infrared fluorophore), 그에 포함되는 시아닌 염료 유도체, 예컨대, Cy7 (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)) 및 Alexa750 (분자 프로브)이 포함될 수 있다.
다른 실시양태에서, 검출가능한 표지는 초음파 [Joseph S et al Pharm Res. 2004 Jun;21(6): 920-6] 또는 자기 입자 [Schellenberger EA et al. Bioconjug. Chem. 2004 Sep-Oct; 15(5): 1062-7]에 의해 검출가능한 미소기포 유도체를 포함할 수 있다.
기능적 표지에는 살균 현상을 유발할 수 있는 제제가 포함될 수 있거나 또는 항암 효과를 가진다. 적합한 표지에는 방사성핵종, 감광제, 독소 폴리펩티드, 독성 소분자 및 기타 약물, 사이토킨 (예컨대, IL2, IL12, TNF), 케모킨, 전-응고 인자 (예컨대, 조직 인자), 효소, 리포솜, 및 면역 반응 인자 (예를 들면, 문헌 [D. Neri (2004) CHIMIA "Tumor Targeting" vol. 58, pages 723-726] 참조)가 포함된다.
방사성핵종에는 요오드-131, 이트륨-90, 인듐-111 및 테크니슘-99가 포함되 고, 상기에 더 상세히 기재되어 있다.
독소 폴리펩티드 또는 펩티드는 세포독성 또는 아폽토시스 활성을 가지고, 미생물, 식물, 동물 또는 인간 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 독소 폴리펩티드는 특이적 결합 요소의 불변 영역 내에 직접 삽입될 수 있다. 독소 폴리펩티드의 예에는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 리신 α-쇄 및 안지오제닌이 포함된다.
독성 소분자에는 예를 들면 DNA-착화제 또는 세포 주기 억제제를 비롯한 세포독성 활성을 갖는 화학적 화합물이 포함된다. 일부 실시양태에서, 독성 분자는 pH- 또는 효소-민감 링커 (예컨대, 이민 결합을 포함하는 링커)의 절단에 의해 표적 세포의 주변에서 유리될 수 있다. 독성 소분자의 예에는 마이탄신, 칼리케아미신, 에포틸론 및 투불리신, 및 이들의 유도체가 포함된다.
면역 반응 인자에는 면역 이펙터 세포에 결합하는 특이적 결합 요소가 포함될 수 있다. 특이적 결합 요소의 결합은 표적 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 유발할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 특이적 결합 요소는 사이토킨과 접합된다. 특이적 결합 요소 또는 그의 폴리펩티드 성분 (예컨대, 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 다중-쇄 항체 단편, 예컨대 Fab) 및 사이토킨을 포함하는 융합 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 특이적 결합 요소의 VH 도메인 또는 VL 도메인은 사이토킨에 융합될 수 있다. 전형적으로, 특이적 결합 요소, 또는 그의 성분, 및 사이토킨은 펩티드 링커, 예컨대 약 5 내지 25개 잔기, 예컨대 10 내지 20개 잔기, 바람직하게는 약 15개 잔기의 펩티드를 통해 연결된다. 펩티드 링커의 적합한 예는 본원에 기재되어 있다. 바람직하게는, 사이토킨은 IL2, 더 바람직하게는 인간 IL2이다. 사이토킨은 특이적 결합 요소 또는 그의 폴리펩티드 성분의 상류 (N-말단) 또는 하류 (C-말단)에 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태는 본 발명의 특이적 결합 요소 (특히, 항체 분자, 예컨대 scFv 분자) 및 IL2를 포함하는 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열 및 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 본 발명의 일부를 형성한다.
본 발명의 특이적 결합 요소는 진단 방법, 예컨대 종양 영상화, 또는 예를 들면 암 증상에 대한 인간 또는 동물 대상체의 치료에 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 제공된 특이적 결합 요소의 투여를 포함하는 치료 방법, 그러한 특이적 결합 요소를 포함하는 제약 조성물, 및 투여용 약제의 제조, 예를 들면 특이적 결합 요소를 제약상 허용되는 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함하는 제약 조성물 또는 약제의 제조 방법에 있어서 상기 특이적 결합 요소의 용도를 제공한다.
치료 방법에 사용하기 위한 특이적 결합 요소는 바람직하게는 항-종양 효과를 유도하는 기능적 표지와 접합되거나 또는 그에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 기재한 바와 같이, 특이적 결합 요소는 사이토킨, 예컨대 IL2와 접합되거나 또는 그에 연결된다.
치료적 이점을 제공하기 위하여 본원에 기재된 특이적 결합 요소가 사용될 수 있는 임상적 징후에는 증식성 장애, 예컨대 전-악성 및 악성 신생물 및 종양, ( 예컨대, 조직구종, 신경아교종, 성상세포종, 골종), 암 (예컨대, 폐암, 소세포 폐암, 위장관암, 창자암, 결장암, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 육종, 흑색종), 백혈병 및 혈관신생 질환이 포함된다.
전-악성 또는 악성 상태는 폐, 결장, 유방, 난소, 전립선, 간, 췌장, 뇌, 및 피부를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 세포 유형에서 발생될 수 있다.
본원에 기재된 치료에 적합한 증식성 장애는 테나신-C의 대형 이소폼, 특히 A1 또는 C 도메인을 포함하는 대형 이소폼의 발현이 증가 또는 또는 상승되는 세포 또는 조직의 존재에 의해 특성화될 수 있다.
본 발명에 따르면, 제공된 조성물을 개체에게 투여할 수도 있다. 바람직하게는 "치료 유효량"으로 투여되고, 이것은 환자에게 이점을 나타내기에 충분한 양이다. 이러한 이점은 적어도 하나의 증상을 적어도 개선시키는 것일 수 있다. 투여된 실제량, 및 투여 속도와 시간-경과는 치료되는 대상의 성질 및 중증도에 의존하여 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들면 용량 등의 결정은 일반 담당의사 및 기타 의료인의 권한내에 있다. 항체의 적절한 용량은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Ledermann J.A. et al., (1991) Int J. Cancer 47:659-664; Bagshawe K.D. et al., (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922]을 참조한다.
정확한 용량은 항체가 진단용인지 또는 치료용인지, 치료되는 부위의 크기 및 위치, 항체의 정확한 성질 (예컨대, 온전한 항체, 단편 또는 디아바디) 및 항체 에 부착된 임의의 검출가능한 표지 또는 기타 분자의 성질을 포함하는 다수 요인에 따라 달라질 것이다. 전형적인 항체 용량은 전신 투여의 경우에 0.5 mg 내지 100 g 및 국소적 투여의 경우에 10 μg 내지 1 mg의 범위일 것이다. 전형적으로, 항체는 온전한 항체, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 것이다. 이것은 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량이고, 어린이 및 유아를 위해서는 이것을 비례적으로 조절할 수 있으며, 다른 항체 형태에 대해서도 분자량에 비례하여 조절할 수 있다. 의사의 판단에 따라 치료를 매일, 1주 2회, 매주 또는 매월 간격으로 반복할 수도 있다.
본 발명의 특이적 결합 요소는 보통 제약 조성물의 형태로 투여될 것이고, 이것은 특이적 결합 요소에 더하여 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 제약 조성물 및 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은, 활성 성분에 더하여 제약상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제, 또는 당업자에게 공지된 다른 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 경구 투여 또는 주사 투여 (예컨대, 정맥내 주사)와 같은 투여 경로에 의존하여 달라질 것이다.
경구 투여용 제약 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고상 담체, 예컨대 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액상 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 고통을 받는 부위로의 주사의 경우에, 활성 성분은 발열원을 함유하지 않고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가진 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 것이다. 당업자라면, 예를 들면 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 완충제, 산화방지제 및(또는) 기타 첨가제가 포함될 수 있다.
조성물은 치료되는 증상에 따라 단독으로 투여되거나, 또는 다른 치료법과 함께 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 다른 치료법으로는 적합한 용량의 통증 완화 약물, 예컨대 비-스테로이드성 소염 약물 (예를 들면, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 모르핀과 같은 마취제 또는 항-구토제를 투여하는 것이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기재된 항체를 개체에 투여하는 것 및 상기 개체 중에서 종양 세포에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 것을 포함하는 종양 세포의 검출 및/또는 영상화 방법을 제공한다.
이러한 방법에 사용하기 위한 바람직한 항체는 검출가능한 표지, 예컨대 방사성핵종 또는 형광단에 접합 또는 연결될 수 있다.
본 발명의 방법은 본원에 제공된 특이적 결합 요소를 테나신-C에 결합시키거나 결합을 가능하게 하는 것을 포함할 수 있다. 언급한 바와 같이, 이러한 결합은 예를 들면 특이적 결합 요소 또는 특이적 결합 요소를 코딩하는 핵산의 투여 후에 생체내에서 일어날 수도 있다.
테나신-C에 대한 특이적 결합 요소의 결합량을 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체로부터 얻은 샘플에 대한 특이적 결합 요소의 결합을 측정할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원에 대한 특이적 결합 요소의 결합을 생체내에서, 예를 들면 개체의 신체 중의 종양을 영상화 또는 검출하는 것으로 측정할 수 있다.
정량화는 항원의 양과 연관성이 있을 수 있고, 이것은 진단에서 중요할 수 있다.
항체의 결합을 임의의 적절한 수단에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 항체는 리포터 분자 또는 검출가능한 표지에 연결 또는 접합될 수 있고, 샘플 상의 표지 또는 리포터의 존재, 양 또는 위치가 측정될 수 있다.
예를 들면, 분자 영상화 방법에서 항체의 생체내 결합은 방사성 검출 (예컨대, PET, SPECT), 근적외 형광 영상화 (예컨대, 확산 광학 토모그래피, 내시경술), 초음파 (예컨대, 표적된 미소기포 유도체 사용) 및 MRI (표적된 자기 입자 사용)에 의해 측정될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체의 결합은 시험관내, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블로팅, 면역세포화학, 면역침전 또는 친화성 크로마토그래피에서 수행될 수 있다.
따라서, 종양 세포의 검출 및/또는 영상화 방법은 본원에 기재된 항체를 개체로부터 얻은 샘플과 접촉시키는 것 및 상기 샘플에서 종양 세포에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
이러한 시험관내 방법에 사용하기에 바람직한 항체는 리포터 분자에 접합 또는 연결될 수 있다. 리포터 분자는 방사성핵종, 플루오로크롬, 인광체 또는 레이저 색소 (스펙트럼으로 단리된 흡광 또는 발광 특성을 가짐)일 수 있다. 적합한 플루오로크롬에는 플루오레신, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 포함된다. 적합한 발색성 색소에는 디아미노벤지딘이 포함된다. 생체내 영상화의 경우에, 방사성핵종 또는 형광단이 바람직하다.
다른 리포터로는 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자 물질, 예컨대 착색된 자성 또는 상자성의 라텍스 비드, 및 검출가능한 신호가 직접적 또는 간접적으로 육안 관찰, 전자적 검출 또는 다른 방법으로 기록될 수 있도록 하는 생물학적 또는 화학적 활성제가 있다. 이러한 분자들은 색을 발색시키거나 변화시키는 반응을 촉매하거나, 또는 예를 들면 전기적 성질의 변화를 일으키는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기가능하고, 그 결과 에너지 상태 사이의 전자 전이가 특징적인 스펙트럼의 흡광 또는 발광을 일으킬 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 사용되는 화학 물질을 포함할 수도 있다. 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템이 이용될 수도 있다.
결합을 측정하는 방식은 본 발명의 특징이 아니고, 당업자는 그의 선호성 및 일반 지식에 따라 적합한 방식을 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 테나신-C와의 결합에 대해 임의의 특이적 결합 요소와 경쟁하는 특이적 결합 요소까지 확장되며, 여기서 상기 특이적 결합 요소는 모두 테나신-C에 결합하고, 실질적으로 본원에 기재된 아미노산을 가진 CDR을 포함한 V 도메 인 또는 실질적으로 본원에 기재된 아미노산 서열을 가진 V 도메인 (예컨대, 본원에 기재된 특이적 결합 요소)을 포함한다. 예를 들면, 다른 태그되지 않은 결합 요소(들)의 존재하에서 검출될 수 있는 하나의 결합 요소에 특이적 리포터 분자를 태그함으로써 결합 요소들 사이의 경쟁을 시험관내에서 쉽게 분석하여, 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 특이적 결합 요소를 확인할 수 있다. 경쟁은 표준 기술, 예컨대 ELISA를 이용하여 측정될 수 있다.
경쟁에 대한 시험에서, 항원의 펩티드 단편, 특히 목적하는 에피토프를 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다. 에피토프 서열 및 하나 이상의 아미노산을 양쪽 중 하나의 말단에서 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 이러한 펩티드는 특이적 서열을 "주성분으로 하는" 것일 수 있다. 본 발명에 따른 특이적 결합 요소는 항원에 대한 그의 결합이 주어진 서열을 가지거나 또는 포함하는 펩티드에 의해 억제되는 것일 수 있다. 이에 대한 시험에서, 서열 또는 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 적합한 펩티드는 테나신-C의 D, C 및/또는 A1 도메인의 서열로부터 얻을 수 있다.
특이적 펩티드와 결합하는 특이적 결합 요소는 예를 들면 펩티드(들)를 패닝함으로써 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 특이적 결합 요소를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같이 본 발명의 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태로 작제물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 임의의 CDR, VH 또는 VL 도메인, 또는 특이적 결합 요소를 코딩하는 핵산은 제공되는 그 자체로 그에 대한 코딩 핵산으로부터의 발현을 포함하는, 코딩된 생산물의 생산 방법과 같이 본 발명의 측면을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현 생산 후에, VH 또는 VL 도메인, 또는 특이적 결합 요소는 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제하고, 이어서 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 요소, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 예를 들면 자연 환경으로부터 단리 및(또는) 정제된 상태로 제공될 수 있고, 핵산의 경우에는 필요한 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 다른 핵산 또는 유전자 기원을 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 형태로 단리 및(또는) 정제된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 합성될 수도 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 관한 언급은 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, 달리 필요하지 않는 한, T가 U로 치환된 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.
각종 상이한 숙주 세포에서 클로닝하고 폴리펩티드를 발현시키기 위한 시스템이 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 배 큘로바이러스 시스템이 있다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 입수가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 기타 다수의 세포가 있다. 일반적으로 바람직한 박테리아 숙주는 이. 콜라이 (E. coli)이다.
이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 확립되어 있다. 리뷰를 위하여, 예를 들면 문헌 [Plueckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991)]을 참조한다. 배양물 중의 진핵 세포내에서의 발현은 또한 특이적 결합 요소의 생산을 위한 선택사양으로서 당업자에게 이용될 수 있으며, 최근의 리뷰를 위하여 예를 들면 문헌 [M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4:573-576; Trill J. J. et al., (1995) Curr. Opinion Biotech 6:553-560]을 참조한다.
프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 경우 기타 서열을 비롯한 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터들을 선택하거나 작제할 수 있다. 벡터는 적절한 경우 플라스미드, 바이러스성, 예를 들면 '파지' 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 상세한 내용을 위하여, 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들면 핵산 작제물의 제조, 돌연변이유발, 서열분석, 세포내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산의 조작을 위한 많은 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기재되어 있다. 샘브룩 (Sambrook) 등 및 오스벨 (Ausubel) 등의 개시 내용은 본원에 참조로 인용된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 핵산을 함유한 숙주 세포를 제공한다. 여전히 다른 측면은 이러한 핵산을 숙주 세포 내에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 도입시 이용가능한 임의의 기술을 채용할 수 있다. 진핵 세포에 대해 적절한 기술로는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들면 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우 배큘로바이러스를 이용한 형질도입이 있다. 박테리아 세포에 대해 적합한 기술로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 이용한 형질감염이 있다.
도입에 이어서, 예를 들면 유전자의 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현을 일으키거나 가능하게 할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들면, 염색체)내에 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라서 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 특이적 결합 요소 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 발현 시스템에서 상기 기재한 작제물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 방법은 본원에 기재된 특이적 결합 요소를 검출가능한 표지 또는 항암제와 접합 또는 연결시키는 것을 포함한다.
적합한 표지 및 제제는 상기 기재되어 있다. 표지 및 제제는 표준 화학적 수단으로 특이적 결합 요소와 접합될 수 있다.
본 발명의 측면 및 실시양태는 하기 실험예를 예로서 참조하여 설명한다.
본 발명의 각종 다른 측면 및 실시양태는 본원의 개시내용 면에서 보아 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 상기 기재된 특징의 각각 및 모든 조합물 및 하위-조합물을 포함한다.
본 발명의 특정 측면 및 실시양태는 상기 도면 및 하기 표를 예로서 참조하여 설명한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1 - 소형 (A) 및 대형 (B) 테나신-C 이소폼의 개략도. 몇몇 피브로넥틴 타입 III 유사 도메인을 선택적 스플라이싱 처리하며, 이는 분자에 포함되거나 (B) 또는 결실 (A)되어 있다.
도 2는 U87 종양 이종이식 보유 누드 마우스에서의 4A1-F16-SIP 항체의 생체내분포를 나타낸다. (A) 값은 주사 3시간 (상부) 및 6시간 (하부) 후에 1군의 3마리 마우스 내에서 조직 (g)당 평균 주사 투여량(％)을 나타낸다. 오차 그래프는 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 U87 종양 이종이식 보유 누드 마우스에서의 4A1-F16-SIP 항체의 생체내분포를 나타낸다. (A) 값은 주사 24시간 (상부) 및 48시간 (하부) 후에 1군의 3마리 마우스 내에서 조직 (g)당 평균 주사 투여량(％)을 나타낸다. 오차 그래프는 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 도 2 및 3에 나타낸 생체내분포 데이타를 다르게 나타낸 것이다.
도 5는 SIP(P12)의 생체내분포를 나타낸다. SIP(P12) 3.5 μg을 피하 U87 인간 교모세포종 종양을 보유한 마우스 내에 주사하였다. 각 시점을 4마리의 동물에 의해 나타낸다.
실시예 1
인간 테나신-C의 도메인 A1을 코딩하는 유전자는 혈청의 부재하에 pH 7.5에서 배양한 정상 인간 피부 섬유모세포 (NHDF)로부터 단리된 mRNA로부터 PCR 올리고 TnC-A1 BamHI ba (cgggatcctccactgaacaagcccctgag) 및 TnC-A1 BG11I for (ggagatctttcccctgtggaggcctcagc) [16]을 사용하는 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 유전자를 이어서 pQE12 박테리아 발현 벡터 (퀴아젠(Qiagen)) 내에 클로닝하고, 이. 콜라이 TG-1에서 발현시켰다. 니켈(Nickel) (퀴아젠)과 적하되는 Ni-NTA 세파로즈 수지를 사용하는 His-태그에 의해 정제하였다.
정제된 도메인 A1을 술포-NHS-SS-바이오틴 (피어스(Pierce))로 선별 전에 바이오틴화하였다. 문헌 [Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505]에 기재된 바와 같이 바이오패닝하였다. 간략하게는, 바이오틴화된 단백질 (최종 농도 10-7 M)을 예비블로킹한 ETH-2 라이브러리 파지 600 μl와 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 파지를 5.3 x 107 스트렙타비딘-코팅 자기 비드 (디날(Dynal))의 첨가에 의해 포획하였다. 광범위한 세척 후에, 바이오틴 링커 중의 디술피드 결합을 환원시켜 선별된 파지를 용출시켰다. 단리된 파지를 TG-1에서 증폭시키고, 폴리에틸렌 글리콜 침전에 의해 상등액으로부터 농축하였다. 3회 패닝 후에, 144개 단리된 항체 클론을 문헌 [Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505]에 기재된 바와 같이 ELISA하여 스크리닝하였다. 스트렙타비딘-코팅 ELISA 플레이트 (스트렙타웰 하이 바인드(StreptaWell High Bind), 로체(Roche))를 바이오틴화된 항원과 인큐베이션하고, scFv 항체 단편을 발현하는 유도된 모노클로날 이. 콜라이 TG-1 배양물의 상등액을 첨가하고, 결합된 항체를 M2 모노클로날 항체, 이어서 항-마우스 이뮤노글로불린 G-HRP 컨쥬게이트로 검출하였다. 최고 신호를 갖는 항체 클론을 BIAcore 3000 장치로 실시간 상호작용 분석에 의해 분석하였다. 3개의 최고 클론을 단백질 A-세파로즈 칼럼 상에서 정제하고, 각종 종양 냉동절편 상의 면역조직화학에 의해 시험하였다.
면역조직화학에서 선별적 염색 패턴을 나타내는 클론 중 하나인 scFv (3A1-D5)를 친화성 성숙을 위해 선택하였다. 가변 중쇄의 상보성-결정 영역 1(VH CDR1) 내의 위치 31 내지 33에 PCR 올리고뉴클레오티드 LMB3 장쇄 ba (caggaaacagctatgaccatgattac, 항체 유전자의 5' 말단의 프라이밍 상류) 및 DP47CDR1mut for (agcctggcggacccagctcgcmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc)를 사용하여 랜덤 돌연변이를 삽입함으로써 친화성 성숙 라이브러리를 파지미드 벡터 pDN322 [Pini A et al. J Biol Chem 1998; 273:21769-21776]에서 제작하였다. 항체 유전자의 3' 말단을 프라이머 DP47CDR1 ba (gagctgggtccgccaggctcc) 및 fdseq 장쇄 for (gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg)로 증폭하였다. 2개의 단편을 프라이 머 LMB3 장쇄 ba 및 fdseq 장쇄 for로 PCR하여 어셈블리하였다.
친화성 성숙 라이브러리의 바이오패닝을 바이오틴화된 항원으로 수행하였다. 2회 패닝 후에 (상기 기재된 바와 같이 수행하지만, 10-8M 바이오틴화된 항원을 사용함), 총 382개 항체 클론을 ELISA로 클로닝하였다. ELISA에서 양성인 69개 클론을 M2-ELISA [Scheuermann J et al J Immunol Methods 2003; 276:129-134]로 추가로 특성화하여 개체 항체 클론의 koff 값을 평가하였다. 간략하게는, scFv 항체를 함유한 상등액을 항-Flag M2 모노클로날 항체 (SIGMA)로 코팅된 표면 상에 첨가하였다. 바이오틴화된 항원의 첨가 및 평형으로의 인큐베이션 후에, 과잉의 비-바이오틴화된 항원을 경쟁자로서 첨가하였다. 경쟁 시간 0, 30, 60, 90 및 120분 후에, 각각 바이오틴화된 항원의 잔존 분획을 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트로 검출하였다.
BIAcore를 사용하여 그의 분리 프로파일에 기초하여 상이한 ELISA-양성 클론을 분류하였다. 5개의 최고 클론을 항원-코팅 세파로즈 칼럼 상의 정제를 위해 선택하였다. 정제한 항체를 크기별 배제 크로마토그래피하고, 생성된 단량체 scFv 항체 단편 분획을 사용하여 BIAcore 3000으로 친화도 상수 및 역학 상수를 측정하였다.
scFv(4A1-F16) 서열을 인간 이뮤노글로불린 E의 CH4 도메인을 코딩하는 유전자의 5'-말단 앞에 유전적으로 융합시켜 작은 면역 단백질 (SIP) [Borsi L et al Int J Cancer 2002/ 102:75-85] (4A1-F16-SIP라 칭함)을 생산함으로써 최고 분리 상수 (KD)를 갖는 항체 4A1-F16를 2가 미니바디 포맷 내로 클로닝하였다. CH4 도메인은 동종이량체화를 촉진시켜 항체의 기능적 친화성을 증가시키는데, 이는 더 높은 결합성 때문이다.
면역조직화학을 인간 두경부 암 조직 상의 테나신-C 항체 단편 scFv(3A1-D5)의 항-A1 도메인으로 수행하였다. 모노클로날 항-FLAG 항체 M2 (SIGMA), 이어서 APAAP 시스템 (DAKO)을 사용하여 scFv 항체의 C-말단에 첨부된 펩티드성 FLAG-태그로 제1 항체를 검출하였다. scFv(3A1-D5) 및 scFv(4A1-F16)를 각종 두경부 암의 냉동절편 상의 종양 스트로마 및 신생혈관 구조를 강하게 염색하여 관찰하였지만, 이들은 건강한 공여자의 정상 구강 점막과는 반응하지 않았다.
4A1-F16-SIP의 종양 표적화 능력을 하기와 같이 평가하였다:
마우스 (ATCC) 1마리 당 3 x 106개 U87 인간 교모세포종 세포를 피하 주사함으로써 Balb/C nu/nu 마우스에서 종양을 유도하였다. 종양의 크기가 300 내지 1500 mm3에 도달한 주사 20 내지 25일 후에, 방사성 표지된 항체를 주사하였다. 항체의 제조는 수퍼덱스 75 상의 크기별 배제 크로마토그래피에 의한 친화성-정제 4A1-F16-SIP 항체의 추가 정제를 포함하였다. 동종이량체성 형태 (75k Da)를 나타내는 분획을 수집하고, 이어서 요오도젠 (피어스)을 사용하여 요오드-125 (아머샴(Amersham))로 표지하였다.
대략 5 μg의 항체를 종양 보유 마우스의 미부 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 3, 6, 24 및 48시간 후에, 각각 3마리의 마우스를 도살하고, 기관을 절단하 고, I-125의 축적을 γ-카운터에서 측정하였다.
실시예 2
인간 테나신-C의 도메인 C를 코딩하는 유전자를 pQE12 (퀴아젠) [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352, Balza E et al. FEBS Lett 1993; 332:39-43] 내에 클로닝하고, 이. 콜라이 TG-1에서 발현시켰다. 니켈 (퀴아젠)과 적하되는 Ni-NTA 세파로즈 수지를 사용하는 His-태그에 의해 정제하였다.
정제된 도메인 C를 술포-NHS-SS-바이오틴 (피어스)로 선별 전에 바이오틴화하였다. 문헌 [Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505]에 기재된 바와 같이 바이오패닝하였지만, 스트렙타비딘- 및 아비딘-코팅 플레이트 상에서 다른 패닝 방법을 이용하였다. 간략하게는, 바이오틴화된 단백질 (최종 농도 10-7 M)을 예비블로킹한 ETH-2 라이브러리 파지 600 μl와 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 파지를 아비딘 (패닝 제1회 및 제3회) 또는 스트렙타비딘 (패닝 제2회)으로 코팅한 플라스틱 미세역가 플레이트 상에서 포획하였다. 광범위한 세척 후에, 바이오틴 링커 중의 디술피드 결합을 환원시켜 선별된 파지를 용출시켰다. 단리된 파지를 TG-1에서 증폭시키고, 폴리에틸렌 글리콜 침전에 의해 상등액으로부터 농축하였다. 3회 패닝 후에, 몇몇 다스(12개)의 항체 클론을 문헌 [Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505]에 기재된 바와 같이 ELISA하여 스크리닝하였다.
스트렙타비딘-코팅 ELISA 플레이트 (스트렙타웰 하이 바인드, 로체)를 바이 오틴화된 항원과 인큐베이션하고, scFv 항체 단편을 발현하는 유도된 모노클로날 이. 콜라이 TG-1 배양물의 상등액을 첨가하고, 결합된 항체를 항-펩티드 태그 항체, 이어서 항-마우스 이뮤노글로불린 G-HRP 컨쥬게이트로 검출하였다. 최고 신호를 갖는 항체 클론을 BIAcore 3000 장치로 실시간 상호작용 분석에 의해 분석하였다. 3개의 최고 클론을 단백질 A-세파로즈 칼럼 상에서 정제하고, 각종 종양 냉동절편 상의 면역조직화학에 의해 시험하였다. 면역조직화학에서 선별적 염색 패턴을 나타내는 클론 중 하나인 scFv (A12)를 친화성 성숙을 위해 선택하였다. VH CDR1 내의 위치 31 내지 33 및 VH CDR2 내의 위치 52, 52a, 53 및 56에 PCR 올리고뉴클레오티드 LMB3 장쇄 ba (caggaaacagctatgaccatgattac, 항체 유전자의 5' 말단의 프라이밍 상류), DP47CDR1 for (ctggagcctggcggacccagctcatmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc), DP47CDR1 ba (tgggtccgccaggctccag), DP47CDR2 for (gcccttcacggagtctgcgtagtatgtmnnaccaccmnnmnnmnnaatagctgagacccactcc), DP47CDR2 ba (acatactacgcagactccgtgaagggc) 및 fdseq 장쇄 for (gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg)를 사용하여 랜덤 돌연변이를 삽입함으로써 친화성 성숙 라이브러리를 파지미드 벡터 pHEN1 [Hoogenboom HR et al. Nucleic Acids Res 1991; 19:4133-4137]에서 제작하였다.
친화성 성숙 라이브러리의 바이오패닝을 바이오틴화된 항원으로 수행하였다. 2회 패닝 후에 (상기 기재된 바와 같이 수행함), 총 382개 항체 클론을 ELISA로 스크리닝하였다. ELISA에서 양성인 클론은 BIAcore로 추가로 특성화하여 그의 분리 프로파일에 기초한 상이한 ELISA-양성 클론을 분류하였다. 시험한 클론 중에서, scFv(E10)가 최고 프라이밍 수행능을 보였다.
면역조직화학을 인간 교모세포종 다중형태 조직 상의 테나신-C 항체 단편 scFv(A12)의 항-C 도메인으로 수행하였다. 모노클로날 항-myc 태그 항체 E10, 이어서 APAAP 시스템 (DAKO)을 사용하여 scFv 항체의 C-말단에 첨부된 펩티드성 myc-태그로 제1 항체를 검출하였다. 이들 항체는 교모세포종 냉동절편 상의 면역조직화학에 의해 도시되는 바와 같이 혈관주위 구조와 특이적으로 반응하는 것으로 관찰되었다.
실시예 3
실시예 2에 기재된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 테나신-C의 C 도메인에 대한 추가 scFv를 단리하고, F4 및 G11로 각각 지정하였다. F4 및 G11은 2개의 아미노산이 상이한 VL 도메인과 동일한 VH 도메인을 가진다. VH 및 VL 도메인은 서열 36 또는 서열 38을 각각 코딩하는 서열 37 또는 서열 39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커를 통해 연결되었다.
실시예 4
테나신 C의 인간 도메인 D (TnC-D)를 코딩하는 유전자를 인간 흑색종 세포주 SKMel-28로부터 단리된 총 RNA로부터 PCR 올리고 TnC-D BamHI ba (cgggatccgttacagaagccgaaccggaa - 서열 72) 및 TnC-D BG11I for (cgggatccgttacagaagccgaaccggaa - 서열 73) [16]을 사용하는 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 증폭된 단편은 His-태그를 단백질의 C-말단에 도입한 박테리아 발현 벡 터 pQE12 내로 서브클로닝하였다. TnC-A1의 마우스 이소폼을 코딩한 유전자를 침윤 관상 암종 조직으로부터 유래된 발현된 서열 태그 (EST) 클론으로부터 프라이머 mmTnC-A1 EcoBa (agaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttc - 서열 74) 및 mmTnC-A1 BglFo (tgagatcttgtccctgtggaggtctcggc - 서열 75)를 사용하는 PCR에 의해 단리하고, 벡터 pQE12 (퀴아젠) 내로 클로닝하였다.
ETH-2 라이브러리 [26]를 10O nM 바이오틴화된 인간 TnC-D로 패닝하고, 결합된 파지를 스트렙타비딘-코팅 자기 비드로 포획하였다. 3회 패닝 후에, 188개 개체 클론으로부터 얻은 상등액을 바이오틴화된 인간 TnC-D 및 바이오틴화된 마우스 TnC-D 상의 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 인간 이소폼을 인식하는 대부분의 클론은 또한 TnC-D의 마우스 이소폼과 반응하였다.
ELISA 양성 클론의 상등액을 제2 ELISA로 시험하고, BIAcore에 의해 스크리닝하였다. 6개의 최고 클론을 광범위하게 특성화하고, scFv(F4)를 최고 클론으로 확인하였다. scFv(F4)는 인간 및 마우스 TnC-D 모두에 동일한 친화성으로 결합하였다.
scFv(F4)는 ELISA에서 도메인 D를 함유한 단백질을 독점적으로 인식하였고, 도메인 D와 구조적으로 관련된 단백질과는 반응하지 않았다. 그러나, 이는 면역조직화학에서 종양 구조와 단지 매우 약하게 반응하며, 이는 배경과 식별하기 어려운 신호를 유발하였다. 이는 아마도 scFv(F4)의 낮은 친화성 때문인 것으로 여겨진다.
ScFv(F4)를 CDR 루프 돌연변이유발 [26]에 의한 친화성 성숙에 주형으로서 사용하였다. 랜덤하게 선택된 잔기는 VL CDR1 위치 30, 31, 32 및 VH CDR2 위치 50, 52 및 53 (카바트(Kabat)에 따라 번호를 부여함; [30])이었다. 라이브러리는 VL의 C-말단의 myc 태그를 첨부한 파지미드 벡터 pHEN 내로 클로닝하였다 [31].
친화성 성숙 라이브러리 파지를 사용하는 제1회 패닝을 바이오틴화된 인간 TnC-D로 수행하고, 제2회 패닝을 바이오틴화된 마우스 TnC-D로 수행하였다. 750개 클론을 바이오틴화된 인간 TnC-D 상의 ELISA로 스크리닝하였으며, 대략 5％가 양성이었다. BIAcore 및 ELISA에 의한 항체의 추가 특성화 후에, scFv(D11)를 최고 클론으로서 확인하였다. ScFv (D11). BIAcore에 의한 단량체 분획의 친화성 조사는 scFv(D11)가 모 클론 scFv(F4)에 비해 2 내지 4배 개선된 친화성을 가진다는 것을 나타냈다. 마우스 이소폼은 인간 이소폼보다 약간 더 높은 친화성으로 결합하였다.
scFv(D11)는 상이한 종양 조직 상의 면역조직화학에서 양호한 결과를 가졌다. 인간 경구 편평 세포 암종, 인간 방광암종, 누드 마우스에서 성장한 A375 인간 흑색종, 및 SvEv 129 마우스에서 성장한 F9 뮤린 F9 기형암종을 모두 scFv(D11)로 염색하였다. 항체는 두경부암 또는 방광암종과 같은 인간 종양의 스트로마와, 뿐만 아니라 각종 인간 및 뮤린 종양 모델 상에서 강하게 반응하였다.
다음으로, 본 발명자들은 scFv(D11)의 VH의 CDR1 및 CDR2 내의 잔기를 랜덤화하였다. 본 발명자들은 VH CDR1 중에서 잔기 31, 32, 33 및 VH CDR2 중에서 잔기 52, 52a, 53 및 56을 랜덤하게 선택하였다 (카바트 번호 부여; [32]). 10-8 M 인간 TnC-D를 항원으로서 사용하여 파지 디스플레이에 의한 선별을 2회 수행하였다. 선별의 엄격도를 증가시키기 위해, 10 nM 정제된 가용성 scFv(D11)를 제1회에서 항원 부가 전에 파지와 혼합하고, 1000배 과잉의 비-바이오틴화 항원을 제2회 패닝에서 예비-인큐베이션 항원-파지 혼합물에 첨가하였다.
2회 후에 스크리닝한 384개 클론 중 25％가 ELISA에서 인간 바이오틴화된 TnC-D에 대해 양성이었다. 추가 특성화 후에, SCFV(P12)를 최고 클론으로 확인하였다. 인간 TnC-D에 대한 그의 친화성은 scFv(D11)에 비해 계수 4.8까지 증가하였다.
scFv(P12)를 SIP (작은 면역단백질) 포맷 내로 클로닝하였다 [25]. SIP (P12)의 생체내 표적화 수행능을 U87 인간 교모세포종 이종이식 보유 누드 마우스에서의 생체내분포 실험에 의해 평가하였다. 125I-표지 SIP 항체를 i.v.로 3, 6, 24 및 48시간 후에 주사하고, 동물을 도살하고, 기관을 절단하여 칭량하고, 방사선 활성을 계수하였다. SIP(P12)가 주사 24시간 내에 대부분의 기관으로부터 제거되었고, 종양 부위에서의 특이적 축적이 24 및 48시간 후에 관찰되었으며, 종양-대-혈관 비율이 15 이하이었다 (도 5 및 표 1).
Figure 112007041605209-PCT00001
<참고문헌>
Figure 112007041605209-PCT00002
SEQUENCE LISTING <110> Philogen SpA Brack, Simon Silacci, Michela Neri, Dario <120> Antibodies Against Tenascin-C <130> SMWFP6332068 <140> PCT/EP2005/011624 <141> 2005-10-31 <150> US 60/626,173 <151> 2004-11-09 <150> US 60/677,376 <151> 2005-05-03 <160> 93 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 4A1-F16 VH domain nucleotide sequence <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cggtatggtg cgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagcgcat 300 aatgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgaga 348 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 4A1-F16 VH domain amino acid sequence <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Arg Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 115 120 125 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 130 135 140 Phe Ser Arg Tyr Gly Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 145 150 155 160 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 180 185 190 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg 225 230 <210> 3 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 4A1-F16 & 3A1-D5 VL domain nucleotide sequence <400> 3 tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcctct gtttatacta tgccgcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggc 327 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 4A1-F16 & 3A1-D5 VL domain amino acid sequence <400> 4 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr 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Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val 1 5 10 <210> 11 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3A1-D5 VH domain nucleotide sequence <400> 11 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgccg cgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagcgcat 300 aatgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgaga 348 <210> 12 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3A1-D5 VH domain amino acid sequence <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Arg 115 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3A1-D5 VH CDR1 amino acid sequence <400> 13 Ser Tyr Ala Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> E10 VH domain nucleotide sequence <400> 14 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggtagtcgta tgggctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attaatgagg agggtggtca gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaacatccg 300 ccgcatcggc cgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtgtc gaga 354 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E10 VH domain amino acid sequence <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Glu Glu Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Pro Pro His Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Arg 115 <210> 16 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> E10 & A12 VL domain nucleotide sequence <400> 16 tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcctct catgggcccc gtaggcctgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggc 327 <210> 17 <211> 109 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ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtgtc gaga 354 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> A12 VH domain amino acid sequence <400> 25 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Pro Pro His Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Arg 115 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> A12 VH CDR1 amino acid sequence <400> 26 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> A12 VH CDR2 amino acid sequence <400> 27 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> F4 & G11 VH domain nucleic acid sequence <400> 28 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggtagtcgta tgggctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attaatgagg agggtggtca gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaacatccg 300 ccgcatcggc cgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gaga 354 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4 & G11 VH domain amino acid sequence <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Glu Glu Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Pro Pro His Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Arg 115 <210> 30 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> F4 VL domain nucleic acid sequence <400> 30 tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagactttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa tctagtcggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcctct catgggcccc gtaggcctgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggc 327 <210> 31 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4 VL domain amino acid sequence <400> 31 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Leu Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser His Gly Pro Arg Arg Pro 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4 & G11 VL CDR1 amino acid sequence <400> 32 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Leu Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4 VL CDR2 amino acid sequence <400> 33 Gly Lys Ser Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G11 VL domain nucleic acid sequence <400> 34 tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagactttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcctct catgggcccc gtaggcctgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggc 327 <210> 35 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G11 VL domain amino acid sequence <400> 35 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Leu Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser His Gly Pro Arg Arg Pro 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker nucleic acid sequence <400> 36 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg ga 42 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker amino acid sequence <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 45 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Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> New F4 & G11 VH domain nucleic acid sequence <400> 44 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggtagtcgta tgggctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attaatgagg agggtggtca gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gaaacatccg 300 ccgcatcggc cgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New F4 & G11 VH domain amino acid sequence <400> 45 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Glu Glu Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 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Tyr Thr Met Pro Pro Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 51 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> P12 VH domain nucleic acid sequence <400> 51 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttggc cagtattcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attacgggga ctggtggtga gacatactac 180 gcagactccg tggagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggcgg 300 cggatttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgaga 348 <210> 52 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12 VH domain amino acid sequence <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gln Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Gly Thr Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Arg 115 <210> 53 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> P12 and D11 VL domain nucleic acid sequence <400> 53 tcgagtgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagacggcag cctgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg tacttgtcat ctattataaa aagctgcggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactccttt tcgcccaagc cgaagcctgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggc 327 <210> 54 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12 and D11 VL domain amino acid sequence <400> 54 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Arg Gln Pro Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Lys Lys Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Ser Pro Lys Pro Lys Pro 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 55 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> D11 VH domain nucleic acid sequence <400> 55 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttggc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tggagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggcgg 300 cggatttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgaga 348 <210> 56 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> D11 VH domain amino acid sequence <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Arg 115 <210> 57 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VH domain nucleic acid sequence <400> 57 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggcgg 300 cggatttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgaga 348 <210> 58 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VH domain amino acid sequence <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Arg 115 <210> 59 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VL domain nucleic acid sequence <400> 59 tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactccttt tcgcccaagc cgaagcctgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggc 327 <210> 60 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VL domain amino acid sequence <400> 60 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Ser Pro Lys Pro Lys Pro 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12 VH CDR1 amino acid sequence <400> 61 Gln Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> D11 and F4S VH CDR1 amino acid sequence <400> 62 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12 VH CDR2 amino acid sequence <400> 63 Ala Ile Thr Gly Thr Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> D11 VH CDR2 amino acid sequence <400> 64 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VH CDR2 amino acid sequence <400> 65 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12, D11 and F4S VH CDR3 amino acid sequence <400> 66 Gly Arg Arg Ile Phe Asp Tyr 1 5 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12 and D11 VL CDR1 amino acid sequence <400> 67 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Arg Gln Pro Ala Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VL CDR1 amino acid sequence <400> 68 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12 and D11 VL CDR2 amino acid sequence <400> 69 Tyr Lys Lys Leu Arg Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F4S VL CDR2 amino acid sequence <400> 70 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> P12, D11 and F4S VL CDR3 amino acid sequence <400> 71 Asn Ser Phe Ser Pro Lys Pro Lys Pro Val Val 1 5 10 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide primer TnC-D BamHI ba <400> 72 cgggatccgt tacagaagcc gaaccggaa 29 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide primer TnC-D BglII for <400> 73 cgggatccgt tacagaagcc gaaccggaa 29 <210> 74 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide primer mmTnC-A1 EcoBa <400> 74 agaattcatt aaagaggaga aattaactat gagaggatcc tccacggaag aagtgccttc 60 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide primer mmTnC-A1 BglFo <400> 75 tgagatcttg tccctgtgga ggtctcggc 29 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker motif <400> 76 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker motif <400> 77 Ser Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker motif <400> 78 Gly Ser Gly Ser Ala 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker motif <400> 79 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 80 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> New E10 & A12 VL domain nucleotide sequence <400> 80 tctgagctga ctcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagacagt caggatcaca 60 tgccaaggag acagcctcag aagctattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag 120 gcccctgtac ttgtcatcta tggtaaaaac aaccggccct cagggatccc agaccgattc 180 tctggctcca gctcaggaaa cacagcttcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat 240 gaggctgact attactgtaa ctcctctcat gggccccgta ggcctgtggt attcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct aggc 324 <210> 81 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New E10 & A12 VL domain amino acid sequence <400> 81 Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 35 40 45 Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser His Gly Pro Arg Arg Pro Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 82 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> New F4 VL domain nucleic acid sequence <400> 82 tctgagctga ctcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagacagt caggatcaca 60 tgccaaggag acagcctcag actttattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag 120 gcccctgtac ttgtcatcta tggtaaatct agtcggccct cagggatccc agaccgattc 180 tctggctcca gctcaggaaa cacagcttcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat 240 gaggctgact attactgtaa ctcctctcat gggccccgta ggcctgtggt attcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct aggc 324 <210> 83 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New F4 VL domain amino acid sequence <400> 83 Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Leu Tyr Tyr Ala Ser 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser His Gly Pro Arg Arg Pro Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 84 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide TnC-A1 BamHI ba <400> 84 cgggatcctc cactgaacaa gcccctgag 29 <210> 85 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide TnC-A1 BglII for <400> 85 ggagatcttt cccctgtgga ggcctcagc 29 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide LMB3 long ba <400> 86 caggaaacag ctatgaccat gattac 26 <210> 87 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide DP47CDR1mut for <220> <221> misc_feature <222> 23, 24, 26, 27, 29, 30 <223> n is a or g or c or t <400> 87 agcctggcgg acccagctcg cmnnmnnmnn gctaaaggtg aatccagagg ctgc 54 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer DP47CDR1 ba <400> 88 gagctgggtc cgccaggctc c 21 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer fdseq long for <400> 89 gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30 <210> 90 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide DP47CDR1 for <220> <221> misc_feature <222> 27, 28, 30, 31, 33, 34 <223> n is a or g or c or t <400> 90 ctggagcctg gcggacccag ctcatmnnmn nmnngctaaa ggtgaatcca gaggctgc 58 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide DP47CDR1 ba <400> 91 tgggtccgcc aggctccag 19 <210> 92 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide DP47CDR2 for <220> <221> misc_feature <222> 29, 30, 38, 39, 41, 42, 44, 45 <223> n is a or g or c or t <400> 92 gcccttcacg gagtctgcgt agtatgtmnn accaccmnnm nnmnnaatag ctgagaccca 60 ctcc 64 <210> 93 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR oligonucleotide DPR47CDR2 ba <400> 93 acatactacg cagactccgt gaagggc 27

Claims (69)

  1. 서열 2의 4A1-F16 VH 도메인, 서열 12의 3A1-D5 VH 도메인, 및 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인; 및/또는
    서열 4의 VL 도메인, 및 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인
    을 포함하는, 인간 테나신(tenascin)-C와 결합하는 특이적 결합 요소.
  2. 제1항에 있어서, 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  3. 제2항에 있어서, 항체 VH 도메인이 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 테나신-C에 결합하는 데 있어서 4A1-F16 VH 도메인 (서열 2) 및 4A1-F16 VL 도메인 (서열 4 또는 서열 50)을 포함하는 항체의 테나신-C-결합 도메인과 경쟁하는 특이적 결합 요소.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 4A1-F16 VH 도메인 (서열 2)을 포함하는 특이적 결합 요소.
  9. 제8항에 있어서, 4A1-F16 VL 도메인 (서열 4 또는 서열 50)을 포함하는 특이적 결합 요소.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소의 친화성과 항원-결합 부위의 친화성을 동일 조건하에 측정했을 때, 4A1-F16 VH 도메인 (서열 2) 및 4A1-F16 VL 도메인 (서열 4 또는 서열 50)에 의해 형성된 테나신-C 항원-결합 부위의 친화성과 동등하거나 그보다 높은 친화성으로 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소.
  11. E1O VH 도메인 (서열 15 또는 서열 48), A12 VH 도메인 (서열 25), F4 및 G11 VH 도메인 (서열 29 또는 서열 45), 및 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 26 및 서열 27로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인; 및/또는
    서열 17 또는 서열 81의 VL 도메인, 서열 31 또는 서열 83의 아미노산 서열을 갖는 F4 VL 도메인, 서열 35 또는 서열 47의 아미노산 서열을 갖는 G11 VL 도메인, 및 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 32 및 서열 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인
    을 포함하는, 인간 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소.
  12. 제11항에 있어서, 서열 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  13. 제12항에 있어서, 항체 VH 도메인이 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  15. 제14항에 있어서, VH 도메인이 서열 29 또는 서열 45에 기재된 아미노산 서열을 갖는 F4 및 G11 VH 도메인인 특이적 결합 요소.
  16. 제12항에 있어서, 서열 27의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  17. 제12항 또는 제16항에 있어서, 서열 26의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  19. 제18항에 있어서, VL 도메인이 서열 21 또는 서열 32에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1을 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, VL 도메인이 서열 22 또는 서열 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  22. 제21항에 있어서, VL 도메인이 서열 31 또는 서열 83에 기재된 아미노산 서열을 갖는 F4 VL 도메인인 특이적 결합 요소.
  23. 제21항에 있어서, VL 도메인이 서열 35 또는 서열 47에 기재된 아미노산 서열을 갖는 G11 VL 도메인인 특이적 결합 요소.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 테나신-C에 결합하는 데 있어서 E1O VH 도메인 (서열 15 또는 서열 48) 및 E1O VL 도메인 (서열 17 또는 서열 81)을 포함하는 항체의 테나신-C-결합 도메인과 경쟁하는 특이적 결합 요소.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소의 친화성과 항원-결합 부위의 친화성을 동일 조건하에 측정했을 때, E1O VH 도메인 (서열 15 또는 서열 48) 및 E1O VL 도메인 (서열 17 또는 서열 81)에 의해 형성된 테나신-C 항원-결합 부위의 친화성과 동등하거나 그보다 높은 친화성으로 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, E1O VH 도메인 (서열 15 또는 서열 48)을 포함하는 특이적 결합 요소.
  27. 제25항에 있어서, E1O VL 도메인 (서열 17 또는 서열 81)을 포함하는 특이적 결합 요소.
  28. 서열 58의 F4S VH 도메인, 서열 55의 D11 VH 도메인, 서열 52의 P12 VH 도메인, 및 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65 및 서열 66으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VH 도메인; 및/또는
    서열 54의 P12 및 D11 VL 도메인, 서열 60의 F4S VL 도메인, 및 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 70 및 서열 71로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 VL 도메인
    을 포함하는, 인간 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소.
  29. 제28항에 있어서, 서열 66에 나타낸 P12, D11 및 F4S의 CDR3 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  30. 제29항에 있어서, 서열 61, 서열 63 및 서열 66에 나타낸 P12의 CDR 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  31. 제29항에 있어서, 서열 62, 서열 64 및 서열 66에 나타낸 D11의 CDR 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  32. 제29항에 있어서, 서열 62, 서열 65 및 서열 66에 나타낸 F4S의 CDR 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 요소.
  34. 제33항에 있어서, VL 도메인이 서열 71에 나타낸 P12, D11 및 F4S의 CDR3 서열을 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  35. 제34항에 있어서, VL 도메인이 서열 67, 서열 69 및 서열 71에 나타낸 P12의 CDR 서열을 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  36. 제34항에 있어서, VL 도메인이 서열 67, 서열 69 및 서열 71에 나타낸 D11의 CDR 서열을 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  37. 제34항에 있어서, VL 도메인이 서열 68, 서열 70 및 서열 71에 나타낸 F4S의 CDR 서열을 포함하는 것인 특이적 결합 요소.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 항체 분자를 포함하는 특이적 결합 요소.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는 특이적 결합 요소.
  40. 제39항에 있어서, 온전한 항체를 포함하는 특이적 결합 요소.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지 또는 사이토킨에 접합된 특이적 결합 요소.
  42. 제42항에 있어서, 특이적 결합 요소의 VH 도메인 또는 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 또는 융합 단백질로서 사이토킨에 접합된 것인 특이적 결합 요소.
  43. 제42항 또는 제43항에 있어서, 사이토킨이 IL2인 특이적 결합 요소.
  44. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제에 접합된 특이적 결합 요소.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 요소 또는 특이적 결합 요소의 항체 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  46. 제45항에 따른 핵산으로 형질전환된 숙주 세포.
  47. 제46항에 따른 숙주 세포를, 특이적 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생산을 위한 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 상기 특이적 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생산 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 특이적 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 특이적 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 검출가능한 표지 또는 세포독성제와 접합시키는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 표지가 방사성핵종 또는 형광단인 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 4A1-F16 VH 도메인, 3A1-D5 VH 도메인, E1O VH 도메인, A12 VH 도메인, F4 및 G11 VH 도메인, P12 VH 도메인, D11 VH 도메인 및 F4S VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모(parent) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여 각각 상기 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VH 도메인을 제공하고, 임의로는 이에 따라 제공된 하나 이상의 VH 도메인 아미노산 서열 변이체를 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 조합물을 제공하는 단계; 및/또는
    4A1-F16/3A1-D5 VL 도메인, E10/A12 VL 도메인, F4 VL 도메인, G11 VL 도메인, P12/D11 VL 도메인 및 F4S VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모 VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여 모 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VL 도메인을 제공하고, 이에 따라 제공된 하나 이상의 VL 도메인 아미노산 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 도메인 조합물을 제공하는 단계; 및
    VH 도메인 아미노산 서열 변이체 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하여 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소를 확인하는 단계
    를 포함하는, 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소를 얻는 방법.
  53. 치환될 CDR을 포함하거나 또는 CDR 코딩 영역이 결여된 하나 이상의 VH 도메인을 코딩하는 출발 핵산을 제공하고, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 13, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 26, 서열 27, 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65 및 서열 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH CDR 아미노산 서열을 코딩하는 공여자 핵산과 상기 출발 핵산을 상기 공여자 핵산이 출발 핵산 내의 CDR 영역으로 삽입되도록 조합함으로써 VH 도메인을 코딩하는 생성물 핵산을 제공하는 단계;
    VH 도메인을 코딩하는 상기 생성물 핵산의 핵산을 발현시키고 임의로는 이에 따라 생성된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 VH/VL 조합물을 제공하고/하거나 VL 도메인을 코딩하는 상기 생성물 핵산의 핵산을 발현시키고 이에 따라 생성된 VL 도메인을 하나 이상의 VH 도메인과 조합하여 VH/VL 조합물을 제공하는 단계;
    테나신-C와 결합하는 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물을 포함하는 특이적 결합 요소를 선별하는 단계; 및
    테나신-C와 결합하는 상기 특이적 결합 요소 및/또는 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계
    를 포함하는, 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소를 얻는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소가 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 항체 단편이 scFv 항체 분자인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 항체 단편이 Fab 항체 분자인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 항체 단편의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 온전한 항체로 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소를 검출가능한 표지에 접합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소를 항암제에 접합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  60. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소 또는 테나신-C와 결합하는 특이적 결합 요소의 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을, 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  61. 제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소를 테나신-C 또는 테나신-C의 단편과 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  62. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 요소를 테나신-C 또는 테나신-C의 단편에 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 결합을 시험관내에서 수행하는 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 요소의 결합량을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  65. 치료 또는 진단 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 요소.
  66. 증식성 장애의 치료 또는 생체내 진단 방법에 사용하기 위한 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 요소의 용도.
  67. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 요소를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 증식성 장애의 치료 방법.
  68. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 요소를 개체에게 투여 하는 단계 및 상기 개체에서 상기 항체와 종양 세포의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 종양 세포를 검출 및/또는 영상화하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 특이적 결합 요소가 검출가능한 표지와 접합된 것인 방법.
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