BRPI0517967B1 - Anticorpo isolado que liga-se a tenascina-c humana - Google Patents

Abstract

membro de ligação específico, uso do mesmo, ácido nucléico isolado, bem como método para produzir um membro de ligação específico ou um domínio vh ou vl de anticorpo contra tenascina-c. membros de ligação específicos contra proteína de matriz extracelular tenascina-c, especialmente moléculas de anticorpo de scfv contra domínio al, domínio c e domínio d de tenascina-c. membros de ligação específicos de antitenascina-c conjugados com marcações, moléculas citotóxicas ou citocinas. uso dos membros de ligação específicos de antitenascina-c em diagnose e tratamento, especialmente de câncer.

Description

[001] A presente refere-se aos membros de ligação específicos direcionados à tenascina-C, em particular anticorpos humanos contra tenascina-C humana. Estes membros de ligação específicos têm uma faixa de aplicações terapêuticas, por exemplo na diagnose e tratamento de câncer.

[002] Tenascina-C é uma glicoproteína hexamérica grande da matriz extracelular que modula adesão celular. Ela está envolvida em processos como proliferação de células e migração de células e está associada às alterações na arquitetura de tecido como ocorrendo durante a morfogenia e embriogênese como também sob tumorigênese ou angiogênese.

[003] A estrutura de domínio esquemática de tenascina-C é descrita na Figura 1. Várias isoformas de tenascina-C podem ser geradas como resultado de encaixe alternativo que pode levar à inclusão de domínios (múltiplos) na parte central desta proteína, variando do domínio A1 ao domínio D [Borsi L et al Int J Cancer 1992; 52:688-692, Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567], Previamente tinha sido assumido que os domínios A1 - D poderiam ser inseridos ou omitidos “em bloco” na molécula de tenascina-C por um mecanismo de encaixe alternativo, levando às moléculas de “tenascina-C grande” e “tenascina-C pequena” [Borsi L et al J Biol Chem 1995; 270:6243-6245], Uma sobre-expressão forte da isoforma grande de tenascina-C foi relatada para vários tumores [Borsi 1992 supra], e dois anticorpos monoclonais específicos para os domínios A1 e D, respectivamente, foram caracterizados extensivamente na clínica [Riva P et al. Int J Cancer 1992; 51:7-13, Riva P et al. Cancer Res 1995; 55:5952s-5956s, Paganelli G et al EurJ Nucl Med 1994; 21:314-321, Reardon DA et al. J Clin Oncol 2002; 20:1389- 1397, Bigner DD et al. J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212.

[004] Porém, ficou recentemente claro que uma regulação mais complexa do mecanismo de encaixe alternativo ocorre, levando a uma heterogeneidade molecular aumentada entre as isoformas grandes detenas- cina-C. Por exemplo, foi relatado que o domínio extra C de tenascina-C exibe um padrão mais restrito de expressão comparado com os outros domínios alternativamente encaixados de tenascina-C [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352], com um tingimento predominantemente perivascular como descrito com imuno-histoquímica. O domínio C de tenascina-C é indetectável na maioria dos tecidos adultos normais, mas é sobre-expressado em astrocitomas do tipo alto [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352] e outros tipos de tumor. Outro suporte para a heterogeneidade entre as isoformas de tenascina-C grande vem das análises transcripcionais, que confirmaram que transcrições de tenascina- C grandes caracterizam uma composição heterogênea [Katenkamp K et al. J Pathol 2004; 203:771-779], Um nível adicional de complexidade é fornecido pela presença ou ausência de modificações pós-translacionais (por exemplo glicosilação), que podem modificar certos epítopos na superfície dos domínios de proteína individuais e torná-los indisponíveis para um reconhecimento molecular específico in vitro ou in vivo para anticorpos mo- noclonais específicos.

[005] Embora o isolamento rápido de anticorpos específicos para virtualmente qualquer proteína de interesse possa ser realizado com metodologias existentes in vitro, não é óbvio que tais anticorpos reconhecem o epítopo em espécimes biológicos ou em modelos animais de doença. Possíveis razões pela falta de ligação in vivo incluem modificações pós-trans- lacionais do epítopo, mascaramento do epítopo e especificidade ou esta- bilidade do anticorpo insuficiente. É, portanto difícil de avaliar a conveniência dos anticorpos monoclonais somente por aplicações práticas com base em sua reatividade com antígenos recombinantes (ou fragmentos de antí- geno) em ensaios de fase sólida típicos, como ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA), que são habitualmente usados para a triagem de anticorpos monoclonais.

[006] Anticorpos monoclonais para os domínios individuais das isoformas grandes de tenascina-C necessitam, portanto ser analisadas individualmente para avaliar sua conveniência para aplicações de diagnóstico e terapêuticas.

[007] Os inventores presentes isolaram fragmentos de anticorpos monoclonais humanos específicos para epítopos diferentes dentro da região alternativamente encaixada de tenascina-C. Estes anticorpos são caracterizados por sua habilidade para reconhecer isoformas grandes de tenascina-C em espécimes biológicos, como também por uma ligação altamente específica em ensaios de ELISA, com uma diferenciação notável entre os antígenos estritamente relacionados.

[008] Um aspecto da invenção fornece um membro de ligação específico que liga tenascina-C humana, em particular isoforma grande de te- nascina-C.

[009] Membros de ligação específicos preferidos são tumor-específicos e ligam preferencialmente ao tecido tumoral com relação ao tecido normal. Membros de ligação específicos podem, por exemplo, ligar às estruturas estroma e/ou neo- e peri-vasculares do tecido de tumor preferencialmente ao tecido normal.

[0010] Um membro de ligação específico pode ligar preferencialmente à isoforma grande de tenascina-C com relação à isoforma pequena de tenascina-C.

[0011] Em algumas modalidades, o membro de ligação específico pode ligar ao domínio A1 da tenascina-C. Um membro de ligação específico adequado pode compreender; um domínio de VH de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VH de 4A1-F16 da SEQ ID N° 2, o domínio de VH de 3A1-D5 da SEQ ID N° 12 e um domínio de VH compreendendo uma ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 e SEQ ID N°: 13; e/ou um domínio de VL de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VL da SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N°: 50, e um domínio de VL compreendendo uma ou mais CDRs de VL com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10. 4A1-F16 é também referido aqui como F16.

[0012] Por exemplo, um membro de ligação específico adequado pode compreender o domínio de VL de 4A1-F16/3A1-D5 da SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N°: 50 e/ou o domínio de VH de 4A1-F16 da SEQ ID N° 2 ou o domínio de VH de 3A1-D5 da SEQ ID N°: 12.

[0013] Em outras modalidades, o membro de ligação específico pode ligar ao domínio de C da tenascina-C. Um membro de ligação específico adequado pode compreender; um domínio de VH de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VH de E10 (SEQ ID N° 15 ou SEQ ID N°: 48), o domínio de VH de A12 (SEQ ID N°: 25), o domínio de VH de F4 e G11 (SEQ ID N°: 29 ou SEQ ID N°: 45) e um domínio de VH compreendendo uma ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26 e SEQ ID N° 27; e/ou um domínio de VL de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VL da SEQ ID N° 17 ou SEQ ID N° 81, o domínio de VL de F4 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 31 ou SEQ ID N°: 83, o domínio de VL de G11 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 35 ou SEQ ID N°: 47, e um domínio de VL compreendendo uma ou mais CDRs de VL com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 32 e SEQ ID N°: 33.

[0014] Desse modo em um exemplo, o membro de ligação específico pode compreender; um domínio de VH de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VH de E10 (SEQ ID N° 15 ou SEQ ID N°: 48), o domínio de VH de A12 (SEQ ID N°: 25) e um domínio de VH compreendendo uma ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26 e SEQ ID N° 27; e/ou um domínio de VL de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VL da SEQ ID N° 17 ou SEQ ID N°: 81, e um domínio de VL compreendendo uma ou mais CDRs de VL com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 23.

[0015] Por exemplo, um membro de ligação específico adequado pode compreender o domínio de VL de E10/A12 da SEQ ID N° 17 ou SEQ ID N°: 81 e/ou o domínio de VH de E10 da SEQ ID N° 15 ou SEQ ID N°: 48, ou o domínio de VH de A12 da SEQ ID N° 25.

[0016] Em outro exemplo, o membro de ligação específico pode compreender: um domínio de VH de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VH de F4 e G11 (SEQ ID N°: 29 ou SEQ ID N°: 45) e um domínio de VH compreendendo uma ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20; e/ou um domínio de VL de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VL de F4 (SEQ ID N°: 31 ou SEQ ID N°: 83), o domínio de VL de G11 (SEQ ID N°: 35 ou SEQ ID N°: 47) e um domínio de VL compreendendo uma ou mais CDRs de VL com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 23.

[0017] Por exemplo, um membro de ligação específico adequado pode compreender o domínio de VH de F4/G11 da SEQ ID N°: 29 ou SEQ ID N°: 45 e/ou o domínio de VL de F4 da SEQ ID N°: 31 ou SEQ ID N°: 83 ou o domínio de VL de G11 da SEQ ID N°: 35 ou SEQ ID N°: 47.

[0018] Em outra modalidade, o membro de ligação específico liga ao domínio D da tenascina C. Preferivelmente o membro de ligação específico liga ao domínio humano D. Ele pode reagir cruzado com a isoforma de camundongo. As moléculas de anticorpo específicas foram isoladas para domínio D. O clone original é designado F4S. Também desenvolvemos uma variante amadurecida em afinidade de F4S, designada D11. Também foi desenvolvida uma variante amadurecida em afinidade de D11, designada P12.

[0019] Conseqüentemente, um membro de ligação específico adequado pode compreender: um domínio de VH de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VH de F4S da SEQ ID N° 58, o domínio de VH de D11 da SEQ ID N° 55, o domínio de VH de P12 da SEQ ID N°: 52 e um domínio de VH compreendendo uma ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 65 e SEQ ID N°: 66; e/ou um domínio de VL de anticorpo selecionado do grupo que consiste no domínio de VL de P12 e D11 da SEQ ID N° 53, o domínio de VL de F4S da SEQ ID N°: 60, e um domínio de VL compreendendo uma ou mais CDRs de VL com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70 e SEQ ID N°71.

[0020] Em geral, um domínio de VH é emparelhado com um domínio de VL para fornecer um sítio de ligação de antígeno de anticorpo, embora como debatido também abaixo, um domínio de VH pode ser usado para ligar o antígeno sozinho. Em uma modalidade preferida, um domínio de VH descrito aqui (isto é SEQ ID NOS. 2, 12, 15, 25, 29, 45, 48, 52, 56 ou 58) é emparelhado com o domínio de VL correspondente (isto é SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 50 (para 4A1-F16 e 3A1-D5), SEQ ID N°: 17 ou SEQ ID N°: 81 (para A12 e E10), SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 35 ou SEQ ID N°: 47 (para F4 e G11), SEQ ID N°: 54 para P12 e D11, ou SEQ ID N°: 60 para F4S, de forma que um sítio de ligação de antígeno de anticorpo é formado compreendendo os domínios de VH e VL (por exemplo um sítio compreendendo os domínios de VH e VL de 4A1-F16, domínios de VH e VL de 3A1-D5, domínios de VH e VL de E10, domínios de VH e VL de A12, domínios de VH e VL de F4, domínios de VH e VL de G11, domínios de VH e VL de P12, domínios de VH e VL de D11 ou domínios de VH e VL de F4S). Em outras modalidades, um domínio de VH pode ser emparelhado com um domínio de VL diferente do domínio de VL correspondente, preferivelmente um domínio de VL de um membro de ligação específico que liga o mesmo domínio de tenascina-C. Promiscuidade de cadeia leve é bem estabelecida na técnica.

[0021] Uma ou mais CDRs podem ser tiradas de um domínio de VH ou de VL como revelado aqui e incorporadas em uma estrutura adequada. Isto é debatido também abaixo. CDRs são em geral definidas como por Kabat. Preferivelmente um domínio de VH e/ou um domínio de VL compreende(m) uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3. CDR1 de VH de 4A1-F16 é mostrada na SEQ ID N°: 5. CDR1 de VH 3A1-D5 é mostrada na SEQ ID N°: 13. CDRs 2 e 3 de VH de 4A1-F16 e 3A1-D5 são mostradas nas SEQ ID NOS. 6 e 7, respectivamente. CDRs 1, 2 e 3 de VL de 4A1-F16 e 3A1-D5 são mostradas nas SEQ ID NOS. 8, 9 e 10, respectivamente. CDRs 1 e 2 de VH de E10 são mostradas nas SEQ ID NOS. 18 e 19. CDRs de VH 1 e 2 de A12 são mostradas nas SEQ ID NOS. 26 e 27. CDR3 de VH de E10 e A12 é mostrada na SEQ ID N°: 23. CDRs 1,2 e 3 de VL de E10 e A12 são mostradas nas SEQ ID NOS.: 21, 22 e 23, respectivamente. CDRs 1, 2 e 3 de VH de F4 e G11 são mostradas nas SEQ ID NOS.: 18, 19 e 20, respectivamente. CDRs 1,2 e 3 de VL de F4 são mostradas nas SEQ ID NOS.: 32, 33 e 23, respectivamente. CDRs 1, 2 e 3 de VL de G11 são mostradas nas SEQ ID NOS.: 32, 22 e 23, respectivamente. CDRs de VH de P12 são mostradas nas SEQ ID NOS.: 61, 63 e 66, respectivamente. CDRs de VL de P12 são mostradas nas SEQ ID NOS.: 67, 69 e 71, respectivamente. CDRs de VH de D11 são SEQ ID NOS.: 62, 64 e 66, respectivamente. CDRs de VL de D11 são SEQ ID NOS.: 67, 69 e 71, respectivamente. CDRs de VH de F4S são SEQ ID NOS.: 62, 65 e 66, respectivamente. CDRs de VL de F4S são SEQ ID NOS.: 68, 70 e 71, respectivamente.

[0022] Em algumas modalidades, um membro de ligação específico pode compreender um domínio de VH de anticorpo compreendendo um ou mais de uma CDR3 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 7, uma CDR2 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 6 e uma CDR1 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 5 ou, mais preferivelmente, SEQ ID N° 13.

[0023] Em outras modalidades, um membro de ligação específico pode compreender um domínio de VH de anticorpo compreendendo um ou mais de uma CDR3 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 20, uma CDR2 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 27 ou, mais preferivelmente, SEQ ID N°: 19, e uma CDR1 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 26 ou, mais preferivelmente, SEQ ID N°: 18.

[0024] Um membro de ligação específico pode compreender um domínio de VL de anticorpo compreendendo um ou mais de uma CDR3 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 23, uma CDR2 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 22 ou SEQ ID N°: 33, e uma CDR1 com a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 21 ou SEQ ID N°: 32.

[0025] Preferivelmente o membro de ligação específico é um scFv, como descrito em mais detalhe em outro lugar aqui. Os domínios de VH e VL podem ser unidos através de um ligante de peptídeo, por exemplo um ligante tendo uma sequência de aminoácido como exposta em SEQ ID N°: 37. Normalmente, o ligante tem uma sequência de aminoácido compreendendo uma ou mais repetições em tandem de um motivo. Tipicamente o motivo é uma sequência de cinco resíduos, e preferivelmente pelo menos 4 dos resíduos são Gly ou Ser. Onde quatro dos cinco resíduos são Gly ou Ser, o outro resíduo pode ser Ala. Mais preferivelmente cada um dos cinco resíduos são Gly ou Ser. Motivos preferidos são GGGGS, SSSSG, GSGSA e GGSGG (SEQ ID NOS.: 76, 77, 78 e 79, respectivamente). Preferivelmente, os motivos são adjacentes na sequência, sem nucleotídeos intervenientes entre as repetições. A sequência de ligante pode compreender ou consistir de entre um e cinco, preferivelmente três ou quatro, repetições do motivo. Por exemplo, um ligante com três repetições em tandem pode ter uma das sequências de aminoácido a seguir: GGGGSGGGGSGGGGS - SEQ ID N°: 39 SSSSGSSSSGSSSSG - SEQ ID N°: 41 GSGSAGSGSAGSGSA - SEQ ID N°: 42 GGSGGGGSGGGGSGG - SEQ ID N°: 43.

[0026] Variantes dos domínios de VH e VL e CDRs das quais as sequências estão expostas aqui e que podem ser empregadas nos membros de ligação específicos para tenascina-C podem ser obtidas por meio de métodos de alteração de sequência ou mutação e triagem. Tais métodos são também fornecidos pela presente invenção.

[0027] Variantes de sequência de aminoácido de domínios variáveis de quaisquer dos domínios de VH e VL cujas sequências são especificamente reveladas aqui podem ser empregadas de acordo com a presente invenção, como debatido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações de sequência de aminoácido (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), talvez menos que cerca de 20 alterações, menos que cerca de 15 alterações, menos que cerca de 10 alterações ou menos que cerca de 5 alterações, 4, 3, 2 ou 1. Alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões de estrutura e/ou uma ou mais CDRs. Em particular, alterações podem ser feitas na CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH, especialmente CDR3 de VH.

[0028] Um membro de ligação específico de acordo com a invenção pode ser um que compete para ligar o antígeno com qualquer membro de ligação específico que ambos ligam à isoforma grande de Tenescina- C, em particular os domínios de A1 ou C desta, e compreende um membro de ligação específico, domínio de VH e/ou VL revelado aqui, ou CDR de VH revelada aqui, ou variante de qualquer um destes. Competição entre os membros de ligação pode ser facilmente ensaiada in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou marcando uma molécula repórter específica para um membro de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não-marcado(s), para permitir identificação dos membros de ligação específicos que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição.

[0029] Desse modo, um outro aspecto da presente invenção fornece um membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação de antígeno de anticorpo humano que compete com um ou mais de 4A1-F16, 3A1-D5, E10, A12, F4, G11, P12, D11 e F4S para ligar à tenascina-C.

[0030] Vários métodos estão disponíveis na técnica para obter anticorpos contra isoforma grande de tenascina-C que pode competir com 4A1-F16, 3A1-D5, E10, A12, F4 G11, P12, D11 ou F4S. Preferivelmente, tais anticorpos ligam preferencialmente à isoforma grande de tenascina- C com relação à isoforma pequena de tenascina-C.

[0031] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de obter um ou mais membros de ligação específicos capazes de ligar o antígeno, o método incluindo colocar em contato uma biblioteca de membros de ligação específicos de acordo com a invenção e o dito antígeno, e selecionar um ou mais membros de ligação específicos da biblioteca capazes de ligar o dito antígeno.

[0032] A biblioteca pode ser exibida na superfície das partículas de bacteriófago, cada partícula contendo ácido nucléico que codifica o domínio variável de VH de anticorpo exibido em sua superfície, e opcionalmente também um domínio de VL exibido se presente.

[0033] Seguindo a seleção dos membros de ligação específicos capazes de ligar o antígeno e exibidos nas partículas de bacteriófago, o ácido nucléico pode ser tirado de uma partícula de bacteriófago que exibe um dito membro de ligação específico selecionado. Tal ácido nucléico pode ser usado na produção subseqüente de um membro de ligação específico ou um domínio variável de VH de anticorpo (opcionalmente um domínio variável de VL de anticorpo) por expressão de ácido nucléico com a sequência de ácido nucléico tirada de uma partícula de bacteriófago que exibe um dito membro de ligação específico selecionado.

[0034] Um domínio variável de VH de anticorpo com a sequência de aminoácido de um domínio variável de VH de anticorpo de um dito membro de ligação específico selecionado pode ser fornecido na forma isolada, como também um membro de ligação específico compreendendo um tal domínio de VH.

[0035] Habilidade para ligar tenascina-C pode ser também testada, também habilidade para competir com 4A1-F16, 3A1-D5, E10, A12, F4, G11, P12, D11 ou F4S para ligar à tenascina-C.

[0036] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode ligar tenascina-C com a afinidade de um ou mais de 4A1- F16, 3A1-D5, E10, A12, F4, G11, P12, D11 ou F4S ou com uma maior ou menor afinidade.

[0037] Afinidade de ligação dos membros de ligação específicos diferentes pode ser comparada sob condições apropriadas.

[0038] Além das sequências de anticorpo, um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo formando um peptídeo ou polipeptídeo, como um domínio dobrado, ou para dar à molécula outra característica funcional além de habilidade para ligar antígeno.

[0039] Membros de ligação específicos da invenção podem carregar uma marcação detectável, por exemplo um agente que facilita a detecção do tumor como um radionuclídeo ou fluoróforo, ou pode ser conjugado com um agente capaz de desencadear um evento biocida, como um radionuclídeo, fotossensibilizador, droga, citocina, fator pró-coágulo, toxina ou enzima (por exemplo por meio de uma ligação ou ligante de peptidila), para uso em um método de terapia.

[0040] Em outros aspectos, a invenção fornece um ácido nucléico isolado compreendendo uma sequência que codifica um membro de ligação específico, domínios de VH ou VL de acordo com a presente invenção, e métodos de preparar um membro de ligação específico, um domínio de VH e/ou um domínio de VL da invenção, que compreende expressar o dito ácido nucléico sob condições para provocar produção do dito membro de ligação específico, domínio de VH e/ou domínio de VL, e o restabelecer.

[0041] Membros de ligação específicos descritos aqui podem ser usados em um método de tratamento ou diagnose do corpo humano ou animal, como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profiláctico) de uma doença ou distúrbio, em particular um distúrbio proliferative como câncer, em um paciente humano que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade eficaz de um membro de ligação específico.

[0042] Um outro aspecto da presente invenção fornece ácido nu- cléico, em geral isolado, codificando um domínio variável de VH de anticorpo e/ou domínio variável de VL revelados aqui.

[0043] Outro aspecto da presente invenção fornece ácido nucléico, em geral isolado, codificando uma sequência de CDR de VH ou de CDR de VL revelada aqui, especialmente uma CDR de VH selecionada das SEQ ID NOS 5, 6, 7, 13, 18, 19, 20, 26 e 27 ou uma CDR de VL selecionada das SEQ ID NOS. 8, 9, 10, 21,22, 23, 32 e 33.

[0044] Um outro aspecto fornece uma célula hospedeira transformada com ácido nucléico da invenção.

[0045] Ainda um outro aspecto fornece um método de produção de um domínio variável de VH de anticorpo, o método incluindo causar a expressão de ácido nucléico de codificação. Um tal método pode compreender cultivar células hospedeiras sob condições para a produção do dito domínio variável de VH de anticorpo.

[0046] Métodos análogos para a produção de domínios variáveis de VL e os membros de ligação específicos compreendendo um domínio de VH e/ou VL são fornecidos como aspectos adicionais da presente invenção.

[0047] Um método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto.

[0048] Um método de produção pode compreender formular o pro- duto em uma composição incluindo pelo menos um componente adicional, como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0049] Estes e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhe abaixo.

Terminologia Membro de Ligação Específico

[0050] Este descreve um membro de um par de moléculas que têm especificidade de ligação entre si. Os membros de um par de ligação específico podem ser naturalmente derivados ou completa ou parcialmente de forma sintética produzidos. Um membro do par de moléculas tem uma área em sua superfície, ou uma cavidade que especificamente liga e é portanto complementar a uma organização espacial particular e polar do outro membro do par de moléculas. Desse modo os membros do par têm a propriedade de especificamente ligar um ao outro. Exemplos de tipos de pares de ligação específicos são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, receptor de hormônio-hormônio, receptor-ligando, enzima-substrato. Esta aplicação está relacionada às reações do tipo de antígeno-anticorpo.

Anticorpo

[0051] Este descreve uma imunoglobulina quer natural ou em parte ou completamente de forma sintética produzida. O termo também abrange qualquer polipeptídeo ou proteína que tem um domínio de ligação que é, ou é substancialmente homólogo a, um domínio de ligação de anticorpo. Exemplos de anticorpos são os isótipos de imunoglobulina e suas subclasses isotípicas; fragmentos compreendendo um domínio de ligação de antígeno como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos. É possível tomar anticorpos monoclonais e outros e técnicas de uso de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver introduzir DNA que codifica a região variável da imunoglobulina, ou as regiões de determinação de complementaridade (CDRs), de um anticorpo para as regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Por exemplo, ver EP-A-184187, GB2188638Aou EP-A-239400. Um hi- bridoma ou outra célula que produz um anticorpo podem estar sujeita à mutação genética ou outras alterações que podem ou não alterar a es-pecificidade de ligação dos anticorpos produzidas.

[0052] Como os anticorpos podem ser modificados de vários modos, o termo “anticorpo” deveria ser interpretado como abrangendo qualquer membro de ligação específico ou substância que tem um domínio de ligação com a especificidade requerida. Desse modo, este termo abrange fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação da imunoglobulina, quer natural ou completa ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação da imunoglobulina, ou equivalente, fundido com outro polipeptídeo está portanto incluído. Clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023.

[0053] Para isto foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem executar a função de ligar antígenos. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento de Fab que consiste nos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento de Fd que consiste nos domínios de VH e CH1; (iii) o fragmento de Fv que consiste nos domínios de VL e VH de um anticorpo simples; (iv) o fragmento de dAb (Ward, E. S. et al., Nature 341,544-546 (1989)) que consiste em um domínio de VH; (v) regiões de CDR isoladas; (vi) os fragmentos de F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos de Fab ligados (vii) moléculas de Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio de VH e um domínio de VL são ligados por um ligante de peptídeo que permite os dois domínios associarem-se para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv bi-específicos de cadeia simples (PCT/US92/09965) e (ix) “diacorpos”, fragmentos multiespecíficos multivalentes ou construídos através de fusão de gene (W094/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 6444-6448, 1993). Moléculas de Fv, scFv ou de diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfeto que ligam os domínios de VH e VL (Y. Reiter et al. Nature Biotech 14 1239-1245 1996). Minicorpos compreendendo um scFv unido a um domínio de CH3 podem também ser feitos (S. Hu et al, Cancer Res. 56 3055-3061 1996).

[0054] Diacorpos são multímeros de polipeptídeos, cada polipeptí- deo compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um segundo domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, os dois domínios sendo ligados (por exemplo por um li- gante de peptídeo) mas incapazes de associarem-se entre si para formar um sítio de ligação de antígeno: sítios de ligação de antígeno são formados pela associação do primeiro domínio de um polipeptídeo dentro do multímero com o segundo domínio de outro polipeptídeo dentro do multímero (WO94/13804).

[0055] Onde anticorpos biespecíficos forem para ser usados, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais que podem ser fabricados em uma variedade de modos (Holliger, P., e Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por exemplo preparado quimicamente ou de hibridomas híbridos, ou pode ser quaisquer dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região de Fc, usando apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reação antiidi- otípica.

[0056] Diacorpos biespecíficos, ao invés de anticorpos biespecífi- cos inteiros, podem também ser particularmente úteis porque eles podem ser facilmente construídos e podem expressar em E. coli. Diacorpos (e muitos outros polipeptídeos como fragmentos de anticorpo) de especificidades de ligação apropriadas podem ser facilmente selecionados usando exibição defago (WO94/13804) de bibliotecas. Se um braço do diacorpo for para ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra antígeno X, depois uma biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Anticorpos biespecíficos inteiros podem ser feitos por engenharia de botões-dentro de-buracos (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng. 9 616-621, 1996).

Domínio de Ligação de Antígeno

[0057] Este descreve a parte de um anticorpo compreendendo a área que especificamente liga e é complementar à parte ou todo de um antígeno. Onde um antígeno for grande, um anticorpo pode apenas ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é denominada um epítopo. Um domínio de ligação de antígeno pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (por exemplo um assim-chamado fragmento de anticorpo de Fd que consiste em um domínio de VH). Preferivelmente, um domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

Específico

[0058] Este pode ser usado para referir-se à situação em que um membro de um par de ligação específico não mostrará qualquer ligação significativa às moléculas diferentes de seu(s) par(es) de ligação espe- cífico(s). Por exemplo, um anticorpo específico para Tenascina-C pode mostrar pequena ou nenhuma ligação para outros componentes da matriz extracelular como fibronectina. Similarmente, um anticorpo específico para isoforma grande de tenascina-C pode mostrar pequena ou nenhuma ligação para a isoforma pequena de tenascina-C. O termo é também aplicável onde por exemplo um domínio de ligação de antígeno for específico para um epítopo particular que é carregado por vários antí- genos, em cujo caso o membro de ligação específico que carrega o domínio de ligação de antígeno poderá ligar aos vários antígenos que carregam o epítopo.

Compreende

[0059] Este é em geral usado no sentido de incluir, quer dizer permitir a presença de uma ou mais características ou componentes.

Isolado

[0060] Este se refere ao estado em que os membros de ligação específicos da invenção, ou ácido nucléico que codifica tais membros de ligação, estarão de acordo com a presente invenção. Os membros e ácido nucléico serão livres ou substancialmente livres de material com os quais eles estão naturalmente associados como outros polipeptídeos ou ácidos nucléicos com os quais eles são encontrados em seu ambiente natural, ou o ambiente em que eles são preparados (por exemplo cultura de células) quando tal preparação for através de tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os membros e ácido nucléico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para propósitos práticos podem ser isolados - por exemplo os membros normalmente serão misturados com gelatina ou outros veículos se usados para revestir placas de microtitulação para o uso em imunoensaios, ou serão misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando usados em diagnose ou terapia. Os membros de ligação específicos podem ser glicosilados, ou naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo células de CHO ou NS0 (ECACC 85110503), ou eles podem ser (por exemplo, se produzidos através de expressão em uma célula procariótica) não-glicosilados.

[0061] Por “substancialmente como exposto” é significado que a CDR relevante ou domínio de VH ou VL da invenção será idêntica ou altamente similar às regiões especificadas das quais a sequência é aqui exposta. Por “altamente similar” é contemplado que de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4 como 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições podem ser feitas na CDR e/ou domínio de VH ou VL.

[0062] A estrutura para carregar uma CDR da invenção em geral será de uma sequência de cadeia pesada ou leve de anticorpo ou porção substancial desta em que a CDR está localizado em uma localização que corresponde à CDR de VH de ocorrência natural e domínios variáveis de anticorpo de VL codificados pelos genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações dos domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas em referência a (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edição. US Department of Health and Human Services. 1987, e suas atualizações, agora disponível na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)).

[0063] Preferivelmente, uma sequência de aminoácido de CDR substancialmente como exposta aqui é carregada como uma CDR em um domínio variável humano ou uma porção substancial deste.

[0064] Domínios variáveis empregados na invenção podem ser obtidos de qualquer linha germinal ou domínio variável humano rearran- jado, ou podem ser um domínio variável sintético com base nas sequências de consenso de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma sequência de CDR da invenção (por exemplo CDR1, CDR2 ou CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis que carecem de uma CDR (por exemplo a CDR1, CDR2 ou CDR3 correspondente), usando tecnologia de DNA recombinante.

[0065] Por exemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) descreve métodos de produzir repertórios de domínios variáveis de anticorpo em que os iniciadores de consenso direcionados ou adjacentes à extremidade 5’ da área de domínio variável são usados juntos com os iniciadores de consenso para a terceira região de estrutura de genes de VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis de VH que carecem de uma CDR3. Marks et al também descreve como este repertório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR da presente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios de VH ou VL que carecem de uma CDR, e os domínios de VH ou VL completos embaralhados ou combinados com um cognato domínio de VL ou VH para fornecer os membros de ligação específicos da invenção. O repertório pode depois ser exibido em um sistema hospedeiro adequado como o sistema de exibição de fago de W092/01047 de forma que os membros de ligação específicos adequados podem ser selecionados. Um repertório pode consistir em qualquer um dos 104 membros individuais para cima, por exemplo de 106 a 108 ou 1010 membros.

[0066] Técnicas de embaralhamento ou combinatórias análogas são também reveladas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), que descreve a técnica em relação a um gene de β-lactamase mas observa que o método pode ser usado para a geração de anticorpos.

[0067] Uma outra alternativa é gerar novas regiões de VH ou VL que carregam sequências derivadas de CDR da invenção usando mutagê- nese aleatória de um ou mais genes de VH e/ou VL selecionados para gerar mutações dentro do domínio variável inteiro. Uma tal técnica é descrita através de Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:3576-3580), que usou PCR propensa a erro.

[0068] Outro método que pode ser usado é direcionar mutagênese para regiões de CDR de genes de VH ou VL. Tais técnicas são reveladas por Barbas et al, (1994, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 91:3809-3813) e Schier et al (1996, J., Mol. Biol. 263:551-567).

[0069] Todas as técnicas acima descritas são conhecidas como tal na técnica e em si próprias não fazem parte da presente invenção. A pessoa versada poderá usar tais técnicas para fornecer os membros de ligação específicos da invenção usando metodologia rotineira na técnica.

[0070] Um outro aspecto da invenção provê um método para obter um domínio de ligação de antígeno de anticorpo específico para tenas- cina-C, o método compreendendo fornecer, por via de adição, deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido de um domínio de VH exposto aqui, um domínio de VH que é uma variante de sequência de aminoácido do domínio de VH, opcionalmente combinar o domínio de VH desse modo fornecido com um ou mais domínios de VL, e testar o domínio de VH ou combinação de VH/VL ou combinações para identificar um membro de ligação específico ou um domínio de ligação de antígeno de anticorpo específico para tenascina-C. O dito domínio de VL pode ter uma sequência de aminoácido que é substancialmente como exposta aqui.

[0071] Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos podem ser adicionados, deletados, substituídos ou inseridos em uma ou mais CDRs do domínio de VH, por exemplo CDR1, CDR2 e/ou CDR3.

[0072] Um método análogo pode ser empregado compreendendo fornecer, por via de adição, deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido de um domínio de VL exposto aqui, um domínio de VL que é uma variante de sequência de aminoácido do domínio de VL, combinar o domínio de VL desse modo fornecido com um ou mais domínios de VH e testar a combinação de VH/VL ou combinações para identificar um membro de ligação específico ou um domínio de ligação de antígeno de anticorpo específico para tenascina-C. O dito domínio de VH pode ter uma sequência de aminoá- eido que é substancialmente como exposta aqui ou pode ser uma variante de sequência de aminoácido de um domínio de VH que é substancialmente como exposta aqui obtida como descrito acima.

[0073] Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos podem adicionados, deletados, substituídos ou inseridos em uma ou mais CDRs do domínio de VL.

[0074] Um outro aspecto da invenção fornece um método de preparar um membro de ligação específico específico para tenascina-C, cujo método compreende: (a) fornecer um repertório de partida de ácidos nucléicos que codificam um domínio de VH ou que inclui uma CDR a ser substituída ou carece de uma região de codificação de CDR; (b) combinar o dito repertório com um ácido nucléico doador que codifica uma sequência de aminoácido substancialmente como exposta aqui para uma CDR de VH de modo que o dito ácido nucléico doador é inserido na região de CDR no repertório, para fornecer um repertório de produto de ácidos nucléicos que codificam um domínio de VH; (c) expressar os ácidos nucléicos do dito repertório de produto; (d) selecionar um membro de ligação específico específico para um antígeno de tenascina-C; e (e) restabelecer o dito membro de ligação específico ou ácido nucléico que o codifica.

[0075] A CDR pode ser uma CDR1, CDR2 ou CDR3 de VH.

[0076] Novamente, um método análogo pode ser empregado em que uma CDR de VL da invenção é combinada com um repertório de ácidos nucléicos que codificam um domínio de VL ou que inclui uma CDR a ser substituída ou carece uma região de codificação de CDR.

[0077] A CDR pode ser uma CDR1 de VL, CDR2 ou CDR3.

[0078] Similarmente, uma ou mais, ou todas as três CDRs podem ser enxertadas em um repertório de domínios de VH ou VL que são depois triados para um membro de ligação específico ou membros de ligação específicos específicos para tenascina-C, em particular isoformas grandes de tenascina-C.

[0079] Uma porção substancial de um domínio variável de imuno- globulina compreenderá pelo menos as três regiões de CDR, junto com suas regiões de estrutura intervenientes. Preferivelmente, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50 % de qualquer uma ou ambas das primeira e quarta regiões de estrutura, os 50 % sendo os 50 % do término C da primeira região de estrutura e os 50 % do término N da quarta região de estrutura. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados às regiões de domínio de variável de ocorrência natural. Por exemplo, construção de membros de ligação específicos da presente invenção feitos por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos de NB ou C-terminais codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir domínios variáveis da invenção às sequências de proteína também incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcações de proteína como debatidas em mais detalhes abaixo.

[0080] Embora em um aspecto preferido da invenção membros de ligação específicos compreendendo um par de domínios de VH e VL sejam preferidos, os domínios de ligação simples com base nas sequências de domínio de VH ou VL formam aspectos adicionais da invenção. É conhecido que os domínios de imunoglobulina simples, especialmente domínios de VH, são capazes de ligar antígenos alvos de uma maneira específica.

[0081] No caso de qualquer um dos domínios de ligação específicos de cadeia simples, estes domínios podem ser usados para triar para complementar os domínios capazes de formar um membro de ligação específico de dois domínios capaz de ligar tenascina-C.

[0082] Isto pode ser alcançado através de métodos de triagem de exibição de fago usando o assim-chamado método combinatório dual hierárquico como revelado em W092/01047 em que uma colônia individual que ou contém um clone de cadeia H ou L é usada para infetar uma biblioteca completa de clones que codificam a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação específico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de exibição de fago como aquelas descritas naquela referência. Esta técnica é também revelada em Marks et al, ibid.

[0083] Membros de ligação específicos da presente invenção podem também compreender regiões constantes de anticorpo ou partes destas. Por exemplo, um domínio de VL pode ser ligado em sua extremidade C-terminal aos domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias CK OU CÀ humanas, preferivelmente cadeias de CÀ. Similarmente, um membro de ligação específico com base em um domínio de VH pode ser ligado em sua extremidade C-terminal a toda ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isótipo de anticorpo, por exemplo IgG, IgA, IgE e IgM e quaisquer das subclasses de isótipo, particularmente IgG 1 e lgG4.

[0084] Membros de ligação específicos da invenção podem ser marcados com uma marcação detectável ou funcional.

[0085] Marcações detectáveis podem incluir radionuclídeos, como iodo-131, ítrio-90, índio-111 e tecnécio-99, que podem ser ligados aos anticorpos da invenção usando química convencional conhecida na técnica de imageamento de anticorpo. Um membro de ligação específico marcado com um isótopo radioativo pode ser usado seletivamente para liberar radiação a um alvo específico, como um tumor. Isto pode ser útil em imagear o tumor ou liberando uma dose citóxica de radiação, como descrito abaixo.

[0086] Outras marcações detectáveis podem incluir marcações de enzima como peroxidase de raiz-forte, metades químicas como biotina que pode ser detectada por meio da ligação a uma metade detectável de cognato específico, por exemplo avidina marcada, fluorocromos como fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Texas Red e fluoróforos quase infravermelhos, incluindo derivados de tintura de cianina como Cy7 (Amersham Pharmacia) e Alexa750 (Molecular Probes).

[0087] Em outras modalidades, uma marcação detectável pode compreender um derivado de microbolha que é detectável através de ultra-som (Joseph S et al Pharm Res. 2004 jun;21(6):920-6), ou uma partícula magnética (Schellenberger EA et al. Bioconjug. Chem. 2004 set-out; 15(5): 1062-7).

[0088] Uma marcação funcional pode incluir um agente que é capaz de desencadear um evento biocida ou tem um efeito anticâncer. Marcações adequadas incluem radionuclídeos, fotossensibilizadores, polipep- tídeos de toxina, moléculas pequenas tóxicas e outras drogas, citocinas (por exemplo IL2, IL12, TNF), quimiocinas, fatores de pró-coágulo (por exemplo fator de tecido), enzimas, lipossomas e fatores de resposta imunes (ver, por exemplo, D. Neri (2004)CHIMIA “Tumor Targeting” vol. 58, páginas 723-726).

[0089] Radionuclídeos incluem iodo-131, ítrio-90, índio-111 e tecné- cio-99 e são descritos acima em mais detalhe.

[0090] Um polipeptídeo ou peptídeo de toxina tem atividade citotó- xica ou apoptótica e pode ser derivado de uma fonte microbiana, vegetal, animal ou humana. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de toxina pode ser inserido diretamente nas regiões constantes de um membro de ligação específico. Exemplos de polipeptídeos de toxina incluem exotoxina de Pseudomonas, cadeia α de ricina e angiogenina.

[0091] Moléculas pequenas tóxicas incluem compostos químicos com atividade citotóxica, incluindo, por exemplo, agentes de complexa- ção de DNA ou inibidores do ciclo celular. Em algumas modalidades, a molécula tóxica pode ser liberada na redondeza da célula alvo por clivagem de um ligante sensível ao pH ou enzima (por exemplo ligantes que contêm ligações de imina). Exemplos de moléculas pequenas tóxicas incluem maitansina, caliqueamicina, epotilona e tubulisina e derivados destes.

[0092] Fatores de resposta imunes podem incluir membros de ligação específicos que ligam às células efetoras imunes. A ligação do membro de ligação específico pode invocar uma resposta imune mediada por célula contra a célula alvo.

[0093] Em modalidades preferidas, um membro de ligação específico da invenção é conjugado com uma citocina. Uma proteína de fusão compreendendo o membro de ligação específico ou um componente de polipeptídeo deste (por exemplo uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de multicadeias, como um Fab) e a citocina pode ser produzida. Desse modo, por exemplo, um domínio de domínio de VH ou VL de um membro de ligação específico da invenção pode ser fundido com a citocina. Tipicamente o membro de ligação específico, ou componente deste, e citocina são unidos por meio de um ligante de peptídeo, por exemplo um peptídeo de cerca de 5-25 resíduos, por exemplo 10-20 resíduos, preferivelmente cerca de 15 resíduos. Exemplos adequados de ligantes de peptídeo são dados aqui. Preferivelmente a citocina é IL2, mais preferivelmente IL2 humana. A citocina pode ser fundida a montante (N-terminal) ou a jusante (C-termi- nal) do membro de ligação específico ou componente de polipeptídeo deste. Uma modalidade preferida é uma proteína de fusão compreendendo o membro de ligação específico (especialmente uma molécula de anticorpo, por exemplo molécula de scFv) da invenção e IL2. Se-quências de aminoácido de tais proteínas de fusão, e ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que os codificam, fazem parte da invenção.

[0094] Membros de ligação específicos da presente invenção podem ser úteis em métodos de diagnose, como imageamento de tumor, ou no tratamento em indivíduos humanos ou animais, por exemplo para condições de câncer.

[0095] Conseqüentemente, outros aspectos da invenção fornecem métodos de tratamento compreendendo administração de um membro de ligação específico como fornecido, composições farmacêuticas compreendendo um tal membro de ligação específico e uso de tal um membro de ligação específico na manufatura de um medicamento para administração, por exemplo em um método de fazer um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo formular o membro de ligação específico com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0096] Um membro de ligação específico para o uso em um método de tratamento é preferivelmente conjugado ou ligado a uma marcação funcional que suscita um efeito antitumor. Em modalidades preferidas, como observado acima, o membro de ligação específico é conjugado ou ligado a uma citocina por exemplo IL2.

[0097] Indicações clínicas em que um membro de ligação específico como descrito aqui pode ser usado para fornecer benefício terapêutico incluem distúrbios proliferativos como neoplasmas e tumores pré-malig- nos e malignos, (por exemplo, histocitoma, glioma, astrocioma, osteoma), cânceres (por exemplo, câncer do pulmão, câncer do pulmão de célula pequena, câncer gastrointestinal, câncer do intestino, câncer do cólon, carcinoma de mama, carcinoma ovariano, câncer de próstata, câncer testicular, câncer do fígado, câncer renal, câncer de bexiga, câncer do pâncreas, câncer do cérebro, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), leucemias e doenças angiogênicas.

[0098] Uma condição pré-maligna ou maligna pode ocorrer em qualquer tipo de célula, incluindo mas não limitado a, pulmão, cólon, peito, ovariano, próstata, fígado, pâncreas, cérebro e pele.

[0099] Um distúrbio proliferative adequado para o tratamento como descrito aqui pode ser caracterizado pela presença de células ou tecido em que expressão de isoformas tenascina-C grandes, em particular isoformas grandes compreendendo os domínios de A1 ou C, é aumentada ou elevada.

[00100] De acordo com a presente invenção, as composições fornecidas podem ser administradas aos indivíduos. Administração é preferivelmente em uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, esta sendo suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, e taxa e curso de tempo de administração, dependerá da natureza e severidade de que está sendo tratado. Prescrição de tratamento, por exemplo decisões sobre dosagem etc, está dentro da responsabilidade dos médicos clínicos gerais e outros médicos. Doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na técnica; ver Leder- mann J. A. et al. (1991) Int J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K. D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates e Radiopharmaceuticals 4: 915- 922.

[00101] A dose precisa dependerá de vários fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnose ou para tratamento, o tamanho e localização da área a ser tratada, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo anticorpo inteiro, fragmento ou diacorpo), e a natureza de qualquer marcação detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica será na faixa de 0,5 mg a 100 g para aplicações sistêmicas, e 10 pg a 1 mg para aplicações locais. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo inteiro, preferivelmente o isótipo de lgG1 ou lgG4. Esta é uma dose para um tratamento simples de um paciente adulto que pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e lactantes, e também ajustada para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanais ou mensais, na discrição do médico.

[00102] Usualmente os membros de ligação específicos da presente invenção serão administrados na forma de uma composição farmacêutica que pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação específico.

[00103] Desse modo as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para o uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, além de ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais bem conhecidos àqueles versados na técnica. Tais materiais deveriam ser não-tóxicos e não deveriam interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material dependerá da rota de administração que pode ser oral ou através de injeção, por exemplo intravenoso.

[00104] Composições farmacêuticas para administração oral podem ser em forma de comprimido, cápsula, pó ou líquida. Um comprimido pode compreender um veículo sólido como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas em geral compreendem um veículo líquido como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis como etileno glicol, propileno glicol ou poli- etileno glicol, podem ser incluídas.

[00105] Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio de aflição, o ingrediente ativo será na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirógeno e tem pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Aqueles versados na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactada. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, quando requeridos.

[00106] Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, ou simultânea ou seqüencialmente dependendo da condição a ser tratada. Outros tratamentos podem incluir a administração de doses adequadas de drogas de alívio de dor como drogas antiinflamatórias não-esteróides (por exemplo aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno) ou opiáceos como morfina, ou antie- méticos.

[00107] Um outro aspecto da invenção fornece um método de detectar e/ou imagear células tumorais compreender administrar um anticorpo como descrito aqui a um indivíduo e detectar a ligação do dito anticorpo às células de tumor no dito indivíduo.

[00108] Anticorpos preferidos para o uso em tais métodos podem ser conjugados ou ligados a uma marcação detectável como um radionuclídeo ou fluoróforo.

[00109] Um método da invenção pode compreender causar ou permitir ligação de um membro de ligação específico como fornecido aqui para tenascina-C. Como observado, tal ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo seguindo administração de um membro de ligação específico, ou ácido nucléico que codifica um membro de ligação específico.

[00110] A quantidade de ligação do membro de ligação específico à tenascina-C pode ser determinada. Em algumas modalidades, a ligação do membro de ligação específico pode ser determinada para uma amostra obtida de um indivíduo. Em outras modalidades, ligação do membro de ligação específico a um antígeno pode ser determinada in vivo, por exemplo no imageamento ou detecção de tumores no corpo de um indivíduo.

[00111] Quantificação pode estar relacionada à quantidade do antígeno que pode ser de interesse diagnóstico.

[00112] A ligação de anticorpos pode ser determinada por quaisquer meios apropriados. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado ou conjugado com uma molécula repórter ou marcação detectável e a presença, quantidade ou localização da marcação ou repórter na amostra determinada.

[00113] Ligação de um anticorpo in vivo, por exemplo em um método de imageamento molecular, pode ser determinada por detecção radioativa (por exemplo PET, SPECT), imageamento de fluorescência quase infravermelho (por exemplo tomografia óptica difusa, endoscopia), ultra- som (por exemplo com derivados de microbolha alvejados) e MRI (com partículas magnéticas alvejadas).

[00114] Em outras modalidades, ligação do anticorpo pode ocorrer in vitro, por exemplo em ELISA, western blot, imunocitoquímica, imunopre- cipitação ou cromatografia de afinidade.

[00115] Um método de detectar e/ou imagear células tumorais pode desse modo compreender contatar um anticorpo como descrito aqui com uma amostra obtida de um indivíduo e detectar a ligação do dito anticorpo às células de tumor na dita amostra.

[00116] Anticorpos preferidos para o uso em tais métodos in vitro podem ser conjugados ou ligados a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um radionuclídeo, fluorocromo, fósforo ou tintura de laser com características de absorção ou de emissão espectralmente isoladas. Fluorocromos adequados incluem fluoresceína, rodamina, fi- coeritrina e Texas Red. Tinturas cromogênicas adequadas incluem dia- minobenzidina. Para imageamento in vivo, radionuclídeos ou fluoróforos são preferidos.

[00117] Outros repórteres incluem partículas coloidais macromolecu- lares ou material particulado como contas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biológica ou quimicamente ativos que podem causar direta ou indiretamente sinais detectáveis a ser observados visualmente, eletronicamente detectados ou do contrário registrados. Estas moléculas podem ser enzimas que catalisam reações que desenvolvem ou alteram as cores ou causa alterações nas propriedades elétricas, por exemplo. Elas podem ser molecularmente excitáveis, de modo que transições eletrônicas entre os estados de energia resultam em características de absorções ou emissões espectrais. Elas podem incluir entidades químicas usadas juntas com bios- sensores. Sistemas de detecção de biotina/avidina ou biotina/estrepta- vidina e fosfatase alcalina podem ser empregados.

[00118] O modo de determinar ligação não é uma característica da presente invenção e aqueles versados na técnica podem selecionar um modo adequado de acordo com sua preferência e conhecimento geral.

[00119] A presente invenção também se estende a um membro de ligação específico que compete para ligar à tenascina-C com qualquer membro de ligação específico que tanto liga à tenascina-C e compreende um domínio de V incluindo uma CDR com aminoácido substancialmente como exposto aqui ou um domínio de V com sequência de aminoácido substancialmente como exposta aqui (por exemplo um membro de ligação específico como exposto aqui). Competição entre ligar os membros pode ser facilmente ensaiada in vitro, por exemplo através de marcação de uma molécula repórter específica para um membro de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não-marcado(s), para permitir identificação dos membros de ligação específicos que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. Competição pode ser determinada usando técnicas padrão como ELISA.

[00120] No teste para competição um fragmento de peptideo do antígeno pode ser empregado, especialmente um peptídeo incluindo um epítopo de interesse. Um peptídeo que tem a sequência de epítopo mais um ou mais aminoácidos em qualquer extremidade pode ser usado. Um tal peptídeo pode ser dito “consistir essencialmente” na sequência especificada. Membros de ligação específicos de acordo com a presente invenção podem ser de modo que seu ligando para o antígeno é inibido por um peptídeo com ou incluindo a sequência dada. No teste para isto, um peptídeo com qualquer sequência pode ser usado mais um ou mais aminoácidos. Peptídeos adequados das sequências dos domínios de D, C e/ou A1 de tenascina-C podem ser obtidos.

[00121] Membros de ligação específicos que ligam um peptídeo específico podem ser isolados por exemplo de uma biblioteca de exibição de fago mediante seleção do(s) peptídeo(s).

[00122] A presente invenção também fornece um ácido nucléico isolado que codifica um membro de ligação específico da presente invenção. Ácido nucléico inclui DNA e RNA. Em um aspecto preferido, a invenção fornece um ácido nucléico como o que codifica para uma CDR ou domínio de VH ou VL da invenção definido acima.

[00123] A presente invenção também fornece construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou de expressão com-preendendo pelo menos um polinucleotídeo como acima.

[00124] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante compreendendo um ou mais construtos como acima. Um ácido nucléico que codifica qualquer CDR, domínio de VH ou VL, ou o membro de ligação específico como fornecido formam um aspecto da presente invenção, como também um método de produção do produto codificado, cujo método compreende expressão de ácido nucléico de codificação deste. Expressão pode ser convenientemente alcançada cultivando sob condições apropriadas células hospedeiras recombinan- tes contendo o ácido nucléico. Seguindo a produção através de expressão de um domínio de VH ou VL, ou o membro de ligação específico pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica adequada, depois usado conforme apropriado.

[00125] Membros de ligação específicos, domínios de VH e/ou VL e moléculas de ácido nucléico de codificação e vetores de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, por exemplo de seu ambiente natural, em forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso de ácido nucléico, livre ou substancialmente livre de ácido nucléico ou origem de genes diferentes da sequência que codifica um polipeptídeo com a função requerida. Ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser completa ou parcialmente sintético. Referência a uma sequên-cia de nucleotídeo como exposta aqui abrange uma molécula de DNA com a sequência especificada, e abrange uma molécula de RNA com a sequência especificada em que U é substituído por T, a menos que contexto requeira do contrário.

[00126] Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células mamíferas, sistemas de levedura e baculovírus. Linhagens celulares mamíferas disponíveis na técnica para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês, células de HeLa, células de rim de hamster filhote, células de melanoma de camundongo de NSO e muitos outras. Um hospedeiro bacteriano comum preferido é E. coli.

[00127] A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procarióticas como E. coli é bem estabelecida na técnica. Para uma revisão, ver por exemplo Plückthun, A., Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível àqueles versados na técnica como uma opção para produção de um membro de ligação específico, ver revisões recentes, por exemplo Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

[00128] Vetores adequados podem ser selecionados ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Vetores podem ser plasmídeos, virais por exemplo fago, ou fagemídeo, como apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning, a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucléico, por exemplo em preparação de construtos de ácido nucléico, mutagênese, se- qüenciação, introdução de DNA em células e expressão de gene, e análise de proteínas, são descritas em detalhes em Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. As revelações de Sambrook et al. e Ausubel et al. são incorporadas aqui por referência.

[00129] Desse modo, um outro aspecto da presente invenção fornece uma célula hospedeira contendo ácido nucléico como revelado aqui. Ainda um outro aspecto fornece um método compreendendo introduzir tal ácido nucléico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE- dextrana, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdu- ção usando retrovirus ou outro vírus, por exemplo vacínia ou, para células de inseto, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófago.

[00130] A introdução pode ser seguida causando ou permitindo expressão do ácido nucléico, por exemplo cultivando células hospedeiras sob condições para expressão do gene.

[00131] Em uma modalidade, o ácido nucléico da invenção é integrado no genoma (por exemplo cromossomo) da célula hospedeira. Integração pode ser promovida por inclusão das sequências que promovem recombinação com o genoma, de acordo com as técnicas padrão.

[00132] A presente invenção também fornece um método compreendendo usar um construto como declarada acima em um sistema de expressão para expressar um membro de ligação específico ou polipeptídeo como acima.

[00133] Outros métodos da invenção compreendem conjugar ou ligar um membro de ligação específico como descrito aqui com uma marcação detectável ou agente de anticâncer.

[00134] Marcações adequadas e agentes são descritos acima. Marcações e agentes podem ser conjugados com um membro de ligação específico usando meios químicos padrão.

[00135] Aspectos e modalidades da presente invenção serão agora ilustrados por via de exemplo com referência à experimentação a seguir.

[00136] Vários aspectos e modalidades adicionais da presente invenção serão evidentes àqueles versados na técnica em vista da revelação presente. Todos os documentos mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

[00137] A invenção abrange cada e toda combinação e subcombina- ção das características que são descritas acima.

[00138] Certos aspectos e modalidades da invenção serão agora ilustrados por via de exemplo e com referência às figuras descritas acima e tabelas descritas abaixo.

[00139] Figura 1 representação Esquemática da isoforma pequena (A) e grande (B) de tenascina-C. Vários domínios como fibronectina do tipo III estão sujeitos ao encaixe alternativo, ou sendo incluídos (B) ou omitidos (A) na molécula.

[00140] Figura 2 mostra a biodistribuição de anticorpo de 4A1-F16- SIP em camundongos desprotegidos portando xenoenxerto de tumor de U87. (A) Valores representam a média percentual de dose injetada por grama de tecido dentro de um grupo de três camundongos, três (superior) e seis (inferior) horas após a injeção. Barras de erro representam desvio-padrão.

[00141] Figura 3 mostra a biodistribuição de anticorpo de 4A1-F16- SIP em camundongos desprotegidos portando xenoenxerto de tumor de U87. (A) Valores representam a dose percentual média injetada por grama de tecido dentro de um grupo de três camundongos, 24 (superior) e 48 horas (inferior) horas após injeção. Barras de erro representam desvio-padrão.

[00142] Figura 4 mostra uma apresentação alternativa dos dados de biodistribuição mostrados nas Figuras 2 e 3.

[00143] Figura 5 mostra biodistribuição de SIP(P12). 3,5 pg de SIP(P12) foram injetados em camundongos portando um tumor de glioblastoma humano de U87 subcutâneo. Cada ponto de tempo é representado por quatro animais.

Exemplo 1

[00144] O domínio de codificação de gene A1 de tenascina-C humana foi clonado por RT-PCR de mRNA isolado de fibroblastos dérmi- cos humanos normais (NHDF) cultivados a pH 7,5 na ausência de soro usando oligos de PCR TnC-A1 BamHI ba (cgggatcctccactgaacaag- cccctgag) e TnC-A1 Bglll para (ggagatctttcccctgtggaggcctcagc)[16], O gene foi depois clonado em vetor de expressão bacteriana pQE12 (Qiagen) e expresso em TG-1 de E. coli. Purificação foi executada por meio do marcador de His usando resina de sefarose de Ni-NTA carregada com Níquel (Qiagen).

[00145] O domínio purificado A1 foi biotinilado antes das seleções, usando sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce). Biosseleção foi executada como descrito em (Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505). Brevemente, a proteína biotinilada (concentração final 10-7M) foi incubada com 600 pl de fago de biblioteca de ETH-2 pré-bloqueada durante 30 minutos. Fagos ligados foram capturados por adição de 5,3x107 contas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal). Após lavagem extensiva, o fago selecionado foi eluído reduzindo a ligação de dissulfeto no ligante de biotina. Fago isolado foi amplificado em TG-1 e concentrado do sobrenadante através de precipitação de polietileno glicol. Após três ciclos de seleção, 144 clones de anticorpo isolados foram triados por ELISA executada como descrito em Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505. Placas de ELISA revestidas com estreptavidina (Strepta- Well High Ligam, Roche) foram incubadas com antígeno biotinilado, sobrenadante de culturas de TG-1 de E. coli monoclonal induzido expressando fragmentos de anticorpo de scFv foi adicionado e o anticorpo ligado foi detectado com anticorpo monoclonal M2, seguido por conjugado de G - HRP de Imunoglobulina de anticamundongo. Os clones de anticorpo com o sinal mais alto foram analisados por análise de interação de tempo real usando um instrumento de BIAcore 3000. Os três melhores clones foram purificados em uma coluna de A-sepharose de proteína e testados através de imuno-histoquímica em várias crio-se- ções de tumor.

[00146] Um dos clones que exibiram um padrão de tingimento seletivo em imuno-histoquímica, scFv (3A1-D5), foi escolhido para maturação de afinidade. Uma biblioteca de maturação de afinidade foi construída em um vetor de fagemídeo, pDN322 (Pini UM et al. J Biol Chem 1998; 273:21769-21776), inserindo mutações aleatórias nas posições 31-33 dentro da região de determinação de complementaridade 1 da cadeia pesada variável (CDR1 de VH) usando oligonucleotídeos de PCR LMB3 long ba (caggaaacagctatgaccatgattac, preparando a montante da extremidade 5’ do gene de anticorpo) e DP47CDR1mut para (agcctggcggacccagctcgcmnnmn nmnngctaaaggtgaatccagaggctgc). A extremidade 3’ do gene de anticorpo foi amplificada usando iniciadores DP47CDR1 ba (gagctgggtccgccaggctcc) e fdseq long for (gacgttagtaa- atgaattttctgtatgagg). O dois fragmentos foram montados por PCR usando iniciadores LMB3 long ba e fdseq long for.

[00147] Biosseleção da biblioteca de maturação de afinidade foi executada com antígeno biotinilado. Após dois ciclos de seleção (como descritos acima, mas usando 10-8 M de antígeno biotinilado), um total de 382 clones de anticorpo foi triado por ELISA. 69 clones que foram positivos em ELISA foram também caracterizados por M2-ELISA (Scheuermann J et al J Immunol Methods 2003; 276:129-134) para avaliar valores de koff dos clones de anticorpo individuais. Brevemente, anticorpos de scFv contendo sobrenadante foram adicionados sobre uma superfície revestida com anticorpo monoclonal M2 de anti-flag (SIGMA). Após adição de antígeno biotinilado e incubação para o equilíbrio, um excesso de antígeno não-biotinilado foi adicionado como competidor. Após tempos de competição de 0, 30, 60, 90 e 120 minutos, respectivamente, a fração restante de antígeno biotinilado foi detectada usando conjugado de Estreptavidina-HRP.

[00148] BIAcore foi usado para classificar clones positivos em ELISA diferentes com base em seu perfil de dissociação. Os cinco melhores clones foram escolhidos para purificação em uma coluna de sefarose revestida com antígeno. Anticorpos purificados foram submetidos à cromatografia de exclusão de tamanho e frações monoméricas de fragmento de anticorpo de scFv resultantes foram usadas para determinar as constantes de afinidade e os parâmetros cinéticos usando BIAcore 3000.

[00149] O anticorpo com a melhor constante de dissociação (KD), 4A1-F16, foi clonado em um formato de minicorpo bivalente, geneticamente fundindo a sequência de scFv(4A1-F16) em frente da extremidade 5’ do gene que codifica o domínio de CH4 da imunoglobulina humana E, rendendo uma proteína imune pequena (SIP) (Borsi L et al Int J Cancer 2002; 102:75-85), denominada 4A1-F16-SIP. O domínio de CH4 promove homodimerização, aumentando a afinidade funcional do anticorpo devido à avidez mais alta.

[00150] Imuno-histoquímica foi executada com o domínio de anti-A1 de fragmento de anticorpo de tenascina-C scFv(3A1-D5) em tecidos de câncer da cabeça-e-pescoço humanos. Anticorpo primário foi detectado por meio do marcador peptídico FLAG com foi anexado ao término C do anticorpo de scFv, usando o anticorpo de anti-flag monoclonal M2 (SIGMA) seguido pelo sistema de APAAP (DAKO). scFv(3A1-D5) e scFv(4A1-F16) foram observados tingir o estroma de tumor e as estruturas neovascu lares fortemente em crio-seções de vários cânceres de cabeça-e-pescoço, enquanto que eles não reagiram com a mucosa da boca normal de um doador saudável.

[00151] A habilidade de alvejamento de tumor de 4A1-F16-SIP foi avaliada como segue:

[00152] Tumores foram induzidos em camundongos nu/nu de Balb/C por injeção subcutânea de 3x106 células de glioblastoma humanas de U87 por camundongo (ATCC). 20 a 25 dias pós-injeção, quando os tumores alcançaram um tamanho de 300-1500 mm3, o anticorpo radio- marcado foi injetado.

[00153] A preparação do anticorpo incluiu purificação adicional de anticorpo de 4A1-F16-SIP purificado por afinidade através de cromatografia de exclusão de tamanho em superdex 75. A fração que representa a forma homodimérica (75 kDa) foi colhida e subseqüentemente marcada com iodo-125 (Amersham) usando iodogen (Pierce).

[00154] Aproximadamente 5 pg de anticorpo foram intravenosamente injetados na veia da cauda de camundongos portando tumor. Após 3, 6, 24 e 48 horas, respectivamente, três camundongos foram sacrificados, os órgãos excisados e acumulação de 1-125 determinada em um y-contador.

Exemplo 2

[00155] O domínio de codificação de gene C de tenascina-C humana foi clonado em vetor pQE12 (Qiagen) [Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352, Balza E et al. FEBS Lett 1993; 332:39-43], e expresso em TG-1 de E. coli. Purificação foi executada por meio do marcador de His usando resina de sefarose de Ni-NTA carregada com Níquel (Qiagen).

[00156] O domínio purificado C foi biotinilado antes das seleções, usando sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce). Biosseleção foi executada como descrito em [Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505], mas usando um procedimento de seleção alternado em placas revestidas com estreptavidina e avidina. Brevemente, proteína biotinilada (concentração final de 10-7 M) foi incubada com 600 pl de fago de biblioteca de ETH-2 pré-bloqueada durante 30 minutos. Fago ligado foi capturado em placas de microtitulação de plástico revestidas com avidina (15° e 3o ciclo de seleção) ou estreptavidina (2o ciclo de seleção). Após lavagem extensiva, o fago selecionado foi eluído reduzindo a ligação de dissul- feto no ligante de biotina. O fago isolado foi amplificado em TG-1 e concentrado do sobrenadante através de precipitação de polietileno glicol. Após três ciclos de seleção, várias dúzias de clones de anticorpo foram triadas por ELISA executada como descrito em [Viti F, et al Methods Enzymol 2000; 326:480-505],

[00157] Placas de ELISA revestidas com estreptavidina (StreptaWelI High Bind, Roche) foram incubadas com antígeno biotinilado, sobrenadante de culturas de TG-1 de E. coll monoclonal induzido expressando fragmentos de anticorpo de scFv foi adicionado e o anticorpo ligado foi detectado com um anticorpo marcador de antipeptídeo, seguido por de conjugado de Imunoglobulina G - HRP de anticamundongo. Os clones de anticorpo com o sinal mais alto foram analisados por análise de interação de tempo real usando um instrumento de BIAcore 3000. Os três melhores clones foram purificados em uma coluna de sefarose A de proteína e testados através de imuno-histoquímica em várias crio-seções de tumor. Um dos clones que exibiram um padrão de tingimento seletivo em imuno-histoquímica, scFv(A12), foi escolhido para a maturação de afinidade. Uma biblioteca de maturação de afinidade foi construída em vetor de fagemídeo pHEN1 [Hoogenboom H et al. Nucleic Acids Res 1991; 19:4133-4137], inserindo mutações aleatórias nas posições 31- 33 dentro da CDR1 de VH e nas posições 52,52a, 53 e 56 dentro da CDR2 de VH, usando oligonucleotídeos de PCR LMB3 long ba (cagga- aacagctatgaccatgattac, preparando a montante da extremidade 5’ do gene de anticorpo), DP47CDR1 fbr(ctggagcctggcggacccagctcatmnnmn nmnngctaaaggtgaatccagaggctgc), DP47CDR1 ba (tgggtccgccagg- ctccag), DP47CDR2 for (gcccttcacggagtctgcgtagtatgtmnnaccaccmnn- mnnmnnaat agctgagacccactcc), DP47CDR2 ba (acatactacgcagactccg- tgaagggc) e fdseq long fbr(gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg).

[00158] Biosseleção da biblioteca de maturação de afinidade foi executada com antígeno biotinilado. Após dois ciclos de seleção (como descritos acima), um total de 382 clones de anticorpo foi triado por ELISA. Os clones que foram positivos em ELISA foram também caracterizados por BIAcore para classificar os diferentes clones positivos em ELISA com base em seu perfil de dissociação. Entre os clones testados, scFv(E10) mostrou o desempenho mais promissor.

[00159] Imuno-histoquímica foi executada com o domínio de anti-C de fragmento de anticorpo de tenascina-C scFv(A12) em tecido multiforme de glioblastoma humano. Anticorpo primário foi detectado por meio do marcador peptídico de myc que foi ligado ao término C do anticorpo de scFv, usando anticorpo de marcador de anti-myc monoclonal E10, seguido pelo sistema de APAAP (DAKO). Estes anticorpos foram observados especificamente reagir com as estruturas perivasculares, como descrito por imuno-histoquímica em crio-seções de glioblastoma.

Exemplo 3

[00160] Usando um protocolo similar àquele descrito no Exemplo 2, também scFv junto com o domínio de C de tenascina-C foram isolados, e designados F4 e G11, respectivamente. F4 e G11 têm domínios de VL que diferem em dois aminoácidos, e tem o mesmo domínio de VH. Os domínios de VH e VL foram unidos através de um ligante de peptídeo tendo a sequência de aminoácido exposta em SEQ ID N°: 37 ou SEQ ID N°: 39, como codificado por SEQ ID N°: 36 ou SEQ ID N°: 38, respectivamente.

Exemplo 4

[00161] O domínio de codificação de gene humano D de tenascina C (TnC-D) foi clonado por RT-PCR de RNA total isolado da linhagem celular de melanoma humana SKMe1-28 usando oligos de PCR TnC-D BamHI ba (cgggatccgttacagaagccgaaccggaa - SEQ ID N°: 72) e TnC-D Bglll for (cgggatccgttacagaagccgaaccggaa - SEQ ID N°: 73)[16], O fragmento amplificado foi subclonado no vetor de expressão bacteriano pQE12 que introduziu um marcador de His ao término C da proteína. O gene que codifica a isoforma de camundongo de TnC-A1 foi isolado por PCR de um clone de marcador de sequência expresso (EST) derivando de tecido de carcinoma ductal infiltrante, usando os iniciadores mmTnC-A1 EcoBa (agaattcattaaagaggagaaattaactatgagag- gatcctccacgga agaagtgccttc - SEQ ID N°: 74) e mmTnC-A1 Bg1Fo (tga- gatcttgtccctgt ggaggtctcggc - SEQ ID N°: 75), e clonado no vetor pQE12 (Qiagen).

[00162] A biblioteca de ETH-2 [26] foi selecionada com 100 nM de TnC-D humano biotinilado, e o fago ligado foi capturado com contas magnéticas revestidas com estreptavidina. Após três ciclos de seleção, os sobrenadantes obtidos de 188 clones individuais foram triados por ELISA em TnC-D humano biotinilado e em TnC-D biotinilado de camundongo. A maioria dos clones que reconheceram a isoforma humana também reagiu com a isoforma de camundongo de TnC-D.

[00163] Sobrenadantes de clones positivos em ELISA foram testados em um segundo ELISA e triados por BIAcore. Os seis melhores clones foram caracterizados extensivamente, e scFv(F4) foi identificado ser os melhores clones. scFv(F4) ligou tanto a TnC-D humano como de camundongo com a mesma afinidade.

[00164] scFv(F4) exclusivamente reconheceu proteínas que continham domínio D em ELISA, e não reagiu com as proteínas que eram estruturalmente relacionadas ao domínio D. Porém, este apenas reagiu muito fraco com as estruturas de tumor em imuno-histoquímica, levando a sinais que foram difíceis de discriminar dos anteriores. Isto é presumivelmente devido à baixa afinidade de scFv(F4).

[00165] ScFv(F4) foi usado como modelo para maturação de afinidade através de mutagênese de alça de CDR [26], Os resíduos selecionados para randomização foram VLCDR1 de VL posições 30, 31,32 e CDR2 de VH posições 50, 52 e 53 (numeração de acordo com Kabat; [30], A biblioteca foi clonada em vetor de fagemídeo pHEN que anexou um marcador de myc ao término C da VL [31],

[00166] A primeira rodada de seleção com fago de biblioteca de maturação de afinidade foi executada com TnC-D humano biotinilado, o segundo ciclo com TnC-D biotinilado de camundongo. 750 clones foram triados por ELISA em TnC-D biotinilado humano, aproximadamente 5 % eram positivos. Após caracterização adicional dos anticorpos por BIAcore e ELISA, scFv(D11) foi identificado como melhor clone, ScFv (D11). Medições de afinidade com frações monoméricas por BIAcore mostraram que scFv(D11) teve uma afinidade melhorada de duas a quatro vezes comparada ao clone parental scFv(F4). A isoforma de camundongo foi ligada com afinidade ligeiramente mais alta que a isoforma humana. scFv(D11) deu resultados bons em imuno-histoquímica em tecidos de tumor diferentes. Carcinoma humano de célula escamosa oral, carcinoma de bexiga humano, melanoma humano de A375 crescido em camundongos desprotegidos e teratocarcinoma de F9 murino de F9 crescido em camundongos de SvEv 129 foram todos tingidos com scFv(D11). O anticorpo reagiu fortemente com o estroma de tumores humanos como câncer de cabeça e de pescoço ou carcinoma de bexiga, como também em vários modelos de tumor humanos e murinos.

[00167] Em seguida foram randomizados os resíduos dentro da CDR1 e CDR1 de VH de scFv(D11). Foram selecionados os resíduos 31,32, 33 na CDR1 de VH e os resíduos 52, 52a, 53 e 56 na CDR2 de VH para randomização (numeração de Kabat; [32]). Os dois ciclos de seleção foram executados através de exibição de fago, usando 10-8 M de TnC-D humano como antígeno. Para aumentar a severidade das seleções, 10 nM de scFv(D11) purificado solúvel foram misturados com o fago antes da adição do antígeno no primeiro ciclo, e um excesso de 1000 vezes de antígeno não-biotinilado foi acrescentado à mistura de antígeno-fago pré-incubada no segundo ciclo de seleção.

[00168] 25 % dos 384 clones triados após dois ciclos foram positivos em TnC-D biotinilado humano em ELISA. Após caracterização adicional, foi scFv(P12) que foi identificado como melhor clone. Sua afinidade em TnC-D humano foi melhorada por fator 4,8, comparado a scFv(D11).

[00169] scFv(P12) foi clonado em formato de SIP (imunoproteína pequena) [25], O desempenho de alvejamento in vivo de SIP (P12) foi avaliado através de experimentos de biodistribuição em camundongos desprotegidos portando xenoenxerto de glioblastoma humano de U87. Anticorpos de SIP marcados com 125l foram injetados i.v. e 3, 6, 24 e 48 h depois, os animais foram sacrificados, os órgãos excisados, ponderados e a radioatividade foi contada. SIP(P12) foi clarificados dentro de 24 horas após injeção da maioria dos órgãos, e uma acumulação específica no sítio de tumor foi observada após 24 e 48 horas, com razões de tumor-para-sangue de até 15 (Figura 5 e Tabela 1).

Resultados são expressos como percentual de dose de anticorpo injetada por grama de tecido ( % ID/g) ± SD Tabela 1 Referências 1. Bosslet K et al. Cancer Res 1998; 58:1195-1201 2. Jain RK. Adv Drug Deliv Rev 2001; 46:149-168 3. Kohler G, Milstein C Nature 1975; 256:495-497 4. Winter G et al. Annu Rev Immunol 1994; 12:433-455 5. Halin C et al. Cancer Res 2003; 63:3202-3210 6. Halin C et al. Nat Biotechnol 2002; 20:264-269 7. Nilsson F et al. Cancer Res 2001; 61:711 -716 8. Borsi L et al. Blood 2003; 102:4384-4392 9. Carnemolla B et al. Blood 2002; 99:1659-1665 10. Zardi L et al. Embo J 1987; 6:2337-2342 11. Castellani P et al. Am J Pathol 2002; 161:1695-1700 12. Castellani P et al. Int J Cancer 1994; 59:612-618 13. Carnemolla B et al. Int J Cancer 1996; 68:397-405 14. Borsi L et al. Int J Cancer 1992; 52:688-692 15. Carnemolla B et al. EurJ Biochem 1992; 205:561-567 16. Borsi L et al. J Biol Chem 1995; 270:6243-6245 17. Riva P et al. Int J Cancer 1992; 51:7-13 18. Riva P et al. Cancer Res 1995; 55:5952s-5956s 19. Paganelli G et al. EurJ Nucl Med 1994; 21:314-321 20. Reardon DA et al. J Clin Oncol 2002; 20:1389-1397 21. Bigner DD et al. J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212 22. Carnemolla B et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352 23. Katenkamp K et al. J Pathol 2004; 203:771-779 24. Viti F, et al. Methods Enzymol 2000; 326:480-505 25. Borsi L et al. Int J Cancer 2002; 102:75-85 26. Pini A et al. J Biol Chem 1998; 273:21769-21776 27. Scheuermann J et al. J Immunol Methods 2003; 276:129-134 28. Balza E et al. FEBS Lett 1993; 332:39-43 29. Hoogenboom HR et al. Nucleic Acids Res 1991; 19:4133-4137 30. Ignatovich, O., etal. (1997). J Mol Biol 268(1): 69- 77.31. 31. Hoogenboom & Winter (1992). J Mol Biol 227(2): 381-8. 32. Tomlinson, et al. (1992). J Mol Biol 227(3): 776-98. Sequências

Claims (17)

1. Anticorpo isolado que liga-se a tenascina-C humana, ca-racterizado pelo fato de que compreende: um domínio VH do anticorpo compreendendo VH CDRs 1, 2 e 3 em que: VH CDR1 é SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 13; V H CDR2 é SEQ ID NO: 6; e V H CDR3 é SEQ ID NO: 7; e um domínio VL do anticorpo compreendendo VL CDRs 1, 2 e 3 em que: V L CDR1 é SEQ ID NO: 8; V L CDR2 é SEQ ID NO: 9; e V L CDR3 é SEQ ID NO: 10.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que VH CDR1 é a SEQ ID NO: 5.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte-rizado pelo fato de que compreende o domínio VH do anticorpo de SEQ ID NO: 2, ou um domínio VH apresentando menos do que 5 alterações de aminoácidos em SEQ ID NO: 2, em que as alterações de aminoácidos se dão na região estrutural da região variável pesada.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH de sequência SEQ ID NO: 12, ou um domínio VH apresentando menos do que 5 alterações de aminoácidos em SEQ ID NO: 12, em que as alterações de aminoácidos se dão na região estrutural da região variável pesada.

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VL de sequência SEQ ID NO: 50, ou um domínio VL apresentando menos do que 5 alterações de aminoácidos em SEQ ID NO: 4 ou da SEQ ID NO: 50, em que as alterações de aminoácidos se dão na região estrutural da região variável leve.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH de sequência SEQ ID NO: 2 e um domínio VL de sequência SEQ ID NO: 50.

7. Anticorpo isolado que liga-se à tenascina-C humana, ca-racterizado pelo fato de que compreende um domínio VH do anticorpo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos apresentando menos do que 5 alterações na sequência de aminoácidos em SEQ ID NO: 2, em que as alterações de aminoácidos se dão na região estrutural da região variável pesada, e um domínio VL do anticorpo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma sequência de aminoácidos apresentando menos do que 5 alterações na sequência de aminoácidos em SEQ ID NO: 50, em que as alterações de aminoácidos se dão na região estrutural da região variável leve, em que o anticorpo liga-se à tenascina-C com a afinidade igual ou superior que a afinidade do anticorpo que compreende o domínio D5 VH de SEQ ID NO: 12 e domínio VL de SEQ ID NO: 50.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracte-rizado pelo fato de que compreende uma proteína imune pequena (SIP), em que SIP compreende uma molécula scFv compreendendo a sequência do domínio VH de SEQ ID NO: 2 e a sequência do domínio VL de SEQ ID NO: 50, fusionado ao domínio CH4 da imunoglobulina E humana.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o SIP é homodimérico.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo scFv.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de um anticorpo.

12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo inteiro.

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é conjugado a um marcação detectável ou a uma citocina.

14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracteri-zado pelo fato de que o domínio VH ou o domínio VL de um anticorpo é conjugado à uma citocina através de um ligante peptídico como uma proteína de fusão.

15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, ca-racterizado pelo fato de que a citocina é IL2.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é conjugado a um agente citotóxico.

17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que é para o uso em um método de tratamento ou diagnose.

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