CN114206355A - 用靶向癌症的佐剂治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

在此，发明人描述将TLR激动剂靶向肿瘤细胞或基质的方法和组合物。本公开的方面涉及包含可操作地连接到p(Man‑TLR)的肿瘤靶向剂的多肽。还公开了用于治疗对象的癌症的组合物和方法，所述方法包括向对象施用包含与p(Man‑TLR)连接的肿瘤靶向剂的多肽。

Description

用靶向癌症的佐剂治疗癌症的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月3日提交的美国临时专利申请第62/856375号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
II.发明领域
本发明一般涉及医学领域。更特别地，其涉及关于用于治疗癌症的核苷酸构建体、蛋白质和药物载体的组合物和方法。
III.背景
产生针对癌症特异性抗原的强大适应性免疫应答在肿瘤根除中起着重要作用。检查点阻断抗体通过重振T细胞的功效来帮助T细胞克服免疫抑制的肿瘤环境，其的出现已成为延长转移性黑色素瘤患者生存时间的突破性癌症治疗方法。尽管其取得成功，但免疫疗法仅在少数患者中仅针对一部分癌症提供持久的临床结果。众所周知，T细胞浸润到肿瘤中的程度可高度预测患者对免疫疗法的反应。许多患者缺乏预先存在的用以重振的抗肿瘤免疫力，或者患有占支配地位的的免疫抑制性肿瘤。对于这些人群，几乎没有有效的疗法来启动T细胞应答、扩增肿瘤反应性细胞或使肿瘤微环境更具炎症性。
癌症疫苗是免疫疗法的一种形式，通过该疗法，肿瘤蛋白或抗原被用于激活针对癌症的细胞和体液免疫应答。通常，疫苗由特定抗原连同称为佐剂的免疫刺激分子组成。佐剂激活抗原呈递细胞(APC)，允许它们激活识别癌症的T细胞。
为了克服癌细胞用来避免攻击的多种免疫逃避机制，癌症疫苗必须激活对多种肿瘤抗原的足够大的免疫应答。缺乏强有力的临床批准的佐剂，加上难以识别癌症特异性抗原，成为成功的癌症疫苗接种的主要障碍。尽管各种治疗性癌症疫苗方法在临床前鼠类模型中取得成功，但很少有人能够达到肿瘤控制所需的细胞和体液反应的必要广度和程度。在转化为癌症的临床治疗时，许多疫苗最终无法激活治疗功效所需的细胞毒性CD8+ T细胞反应的足够程度和功能。仍然迫切需要其他方法来诱导针对肿瘤控制所需的癌细胞的细胞免疫应答。
发明内容
在此，发明人描述了将TLR激动剂靶向肿瘤细胞或基质的方法和组合物。因此，本公开的方面涉及包含与p(Man-TLR7)可操作地连接的肿瘤靶向剂的多肽。
p(Man-TLR7)是具有以下结构的共聚物：
Figure BDA0003496477400000021
其中波浪线表示与分子例如本文所述的肿瘤靶向剂的连接。
本公开的其他方面涉及包含与TLR激动剂可操作地连接的肿瘤靶向剂的多肽。其他方面涉及包含本公开的多肽的组合物。其他方面涉及用于治疗对象的癌症的方法，其包括施用本公开的多肽或组合物。其他方面涉及将TLR激动剂靶向对象的肿瘤的方法，其包括施用本公开的多肽或组合物。其他方面涉及用于增加对象的肿瘤中TLR激动剂的积累的方法，所述方法包括向对象施用本公开的多肽或组合物。更进一步的方面涉及用于治疗肿瘤例如对象的肿瘤的方法，所述方法包括向肿瘤或对象施用本公开的多肽或组合物。在一些方面，所述方法用于抑制肿瘤生长或肿瘤进展。抑制可以是至少、至多或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)。
术语“可操作地连接”是指共价或非共价连接。在一些实施方案中，连接是共价的。在一些实施例中，连接是非共价的。在一些实施方案中，TLR激动剂和/或白蛋白与肿瘤靶向剂共价连接。在一些实施方案中，TLR激动剂与肿瘤靶向剂非共价连接。
在一些实施方案中，TLR激动剂包含共聚物，其中共聚物包含结构(I)：
Figure BDA0003496477400000031
其中A不存在或包含至少一种结合抗原呈递细胞(APC)甘露糖受体的基团；Z包含至少一种Toll样受体(TLR)激动剂；W和Y各自独立地是聚合物的单体单元；m是10至150(或其中可衍生的任何整数)；p是1至20(或其中可衍生的任何整数)。
在一些实施方案中，TLR激动剂包括具有一般结构(VI)的TLR激动剂：
Figure BDA0003496477400000032
其中R1和R2各自独立地是氢原子、卤素、烷基、经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、芳基或经取代的芳基；R3是包含可聚合基团Y′的配体。具体地预想在实施方案中可排除这些种类中的一种或多于一种。
在一些实施方案中，TLR激动剂包括TLR7激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR7/8激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂是如本文所述的TLR激动剂。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂靶向肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂特异性结合表达于或位于肿瘤细胞表面的蛋白质或肽。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂靶向基质。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂对肿瘤细胞是非特异性的，表明试剂不与肿瘤细胞特异性结合。
在一些实施方案中，肿瘤靶向剂结合胶原。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括基质靶向抗体或其基质结合片段。在一些实施方案中，抗体或结合片段特异性结合纤连蛋白，纤连蛋白的选择性剪接结构域、胶原、腱生蛋白、骨膜蛋白、黏结蛋白聚糖、蛋白聚糖或肿瘤基质细胞特异性抗原。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂包含与包含额外结构域A(EDA)的纤连蛋白的选择性剪接结构域特异性结合的Fab或抗体。下表提供了在本公开的方法和组合物中有用的示例性EDA Fab和抗体的实施方案。
Figure BDA0003496477400000041
Figure BDA0003496477400000051
在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包含重链可变区，其包含与SEQ ID NO:17-19分别具有至少80％同一性的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，和轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:22-24分别具有至少80％同一性的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包含重链可变区，其包含与SEQ ID NO:17-19分别具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，和轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:22-24分别具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。在一些实施方案中，EDA抗体、EDAFab或EDA抗原结合片段包含重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:17-19的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，和轻链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:22-24的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。
在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和/或包含与SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包含重链可变区，其包含与SEQ ID NO:16具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列，和/或轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:21具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:26具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列的重链恒定区和/或包含与SEQ ID NO:27具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:20具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的重链恒定区和/或包含与SEQ ID NO:25具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包含重链恒定区，其包含与SEQID NO:26具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列，和/或轻链恒定区，其包含与SEQ IDNO:27具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:20具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列，和/或轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:25具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链恒定区，和/或包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，EDA抗体、EDA Fab或EDA抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链恒定区，和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链恒定区。
CDR还可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、18、19、20、21、22、23个或多于23个连续的氨基酸残基(或其中可衍生的任何范围)，位于特定CDR序列的一侧或两侧；因此，在特定CDR序列的N端或C端末端可以有一个或多于一个另外的氨基酸，例如如SEQ IDNO:17-19和22-24中所示。在一些实施方案中，CDR可包含SEQ ID NO:17-19和22-24中所示的氨基酸序列的片段。在一些实施方案中，CDR可包含SEQ ID NO:16或21的片段，例如包含SEQ ID NO:16和21的从氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117(或其中任何可衍生的范围)至氨基酸2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或118的片段。
在一些实施方案中，肿瘤靶向剂包括特异性结合肿瘤相关抗原或癌抗原的抗体或其抗原结合片段。癌抗原可以是本文所述的任何癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原包括对对象呈特异性的癌抗原。在一些实施方案中，对象已确定具有表达癌抗原的癌细胞。在一些实施方案中，方法还包括确定来自对象的生物样品中的细胞是否表达癌抗原。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂特异性结合CD47或TRP1。
在一些实施方案中，肿瘤靶向剂包含胶原结合域。在一些实施方案中，多肽包含来自饰胶蛋白聚糖或血管性血友病因子(vWF)的胶原结合域。在一些实施方案中，胶原结合域包含与SEQ ID NO:1或其片段具有至少80％同一性的多肽。在一些实施方案中，胶原结合域包含与SEQ ID NO:1-8或其片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(或其中可衍生的任何范围)的同一性的多肽。在一些实施方案中，胶原结合域位于白蛋白多肽和/或TLR激动剂的氨基末端。在一些实施方案中，胶原结合域位于白蛋白多肽和/或TLR激动剂的羧基末端。短语“位于氨基末端”或“位于羧基末端”是指一个多肽与另一个多肽的相对位置。例如，当一个多肽“位于氨基末端”时，它连接到另一个多肽的N-端氨基。然而，两个多肽、试剂或结构域之间可存在插入序列。类似地，多肽“位于羧基末端”是指多肽与另一个多肽或结构域的羧基末端连接。在一些实施方案中，TLR激动剂与胶原结合域或肿瘤靶向剂的氨基末端连接。在一些实施方案中，TLR激动剂与胶原结合域或肿瘤靶向剂的羧基末端连接。
在一些实施方案中，多肽包含白蛋白多肽与胶原结合域或肿瘤靶向剂之间的连接子。在一些实施方案中，连接子包括甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，连接子包括GGGS、(GGGS)n或(GGGS)2，并且n可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30(或其中可衍生的任何范围)。在一些实施方案中，连接子包括本文所述的连接子。
在一些实施方案中，多肽不与颗粒、纳米囊泡或脂质体可操作地连接。在一些实施方案中，多肽不与纳米颗粒或固体载体例如微板或微珠可操作地连接。在一些实施方案中，组合物不包含脂质体、颗粒或纳米囊泡。在一些实施方案中，组合物不包含纳米颗粒或固体载体例如微板或微珠。在一些实施方案中，多肽和/或组合物不进一步包含抗原，例如癌抗原。
在一些实施方案中，多肽包含至少两个胶原结合域。在一些实施方案中，多肽包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个胶原结合域(或其中可衍生的任何范围)。胶原结合域可串联，或位于白蛋白多肽的氨基和羧基末端。
在一些实施方案中，多肽与白蛋白多肽共价连接。在一些实施方案中，白蛋白多肽包含与SEQ ID No:11-14中的一个具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可衍生的范围)的同一性的多肽。
在一些实施方案中，TLR激动剂与肿瘤靶向剂的比率是3:1。在一些实施方案中，TLR激动剂与肿瘤靶向剂的比率是至少、至多或恰好0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，白蛋白多肽与肿瘤靶向剂的比率是1:1、2:1、3:1、4:1、1:2、1:3、1:4、4:1、3:1或2:1(或其中可衍生的任何范围)。
在一些实施方案中，肿瘤靶向剂与TLR7激动剂的摩尔比是1:5。在一些实施方案中，肿瘤靶向剂与TLR7激动剂的摩尔比是至少、至多或恰好0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1(或其中任何可衍生的范围)。
在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，癌症包括黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、乳腺上皮癌或结肠癌。在一些实施方案中，癌症包括黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症包括乳腺上皮癌。在一些实施方案中，癌症包括乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是本文所述的癌症。
在一些实施方案中，方法还包括施用一种或多于一种另外的癌症疗法。在一些实施方案中，癌症疗法包括免疫疗法。在一些实施方案中，癌症疗法包括本文所述的另外的疗法。在一些实施方案中，对象已经或将接受免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法在多肽之前、之后或与多肽同时施用。在一些实施方案中，免疫疗法包括检查点抑制剂疗法。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包含PD-1抗体、CTLA4抗体或两者。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包含PD-L1抗体。
在一些实施方案中，将多肽或组合物全身施用。在一些实施方案中，多肽或组合物通过静脉注射施用。在一些实施方案中，多肽或组合物通过腹膜内注射施用。在一些实施方案中，多肽和另外的疗法在相同组合物中施用。在一些实施方案中，多肽和另外的疗法在单独组合物中施用。在一些实施方案中，本公开的组合物还包含一种或多于一种免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，本公开的组合物包含PD1抗体。在一些实施方案中，本公开的组合物包含CTLA4抗体。在一些实施方案中，本公开的组合物包含PD-1和CTLA4抗体。在一些实施方案中，将多肽或组合物瘤内或瘤周施用。在一些实施方案中，多肽或组合物通过本文所述的施用途径施用。
在一些实施方案中，方法还包括施用另外的癌症疗法。在一些实施方案中，对象已经或将接受免疫疗法。在一些实施方案中，对象已确定对免疫疗法无反应。在一些实施方案中，对象患有难治性癌症。在一些实施方案中，对象是经受与先前疗法或先前免疫疗法相关的毒性的对象。在一些实施方案中，方法还包括施用免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法在多肽之前、之后或与多肽同时施用。在一些实施方案中，免疫疗法包括检查点抑制剂疗法。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包括单一检查点抑制剂疗法，其表明施用仅一种检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包括组合检查点抑制剂疗法，其表明施用至少两种检查点抑制剂，例如施用PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包含PD-1抗体。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包含一种或多于一种本文所述的检查点抑制剂。
在一些实施方案中，TLR激动剂的施用剂量小于未与肿瘤靶向剂连接的TLR激动剂的最小有效剂量。在一些实施方案中，TLR激动剂的施用剂量比未与肿瘤靶向剂连接的TLR激动剂的最小有效剂量小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，TLR激动剂的施用剂量小于未与肿瘤靶向剂和白蛋白多肽连接的TLR激动剂的最小有效剂量。在一些实施方案中，TLR激动剂的施用剂量比未与肿瘤靶向剂和白蛋白多肽连接的TLR激动剂的最小有效剂量小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，对象先前已经用接受佐剂治疗。在一些实施方案中，已确定对象对先前治疗无反应，或其中对象对先前治疗经受非特异性毒性。在一些实施方案中，对象响应在先疗法经受超过2次、3次、4次或5次免疫相关不良事件。
当提及基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。
术语“对象”、“哺乳动物”和“患者”互换使用。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是小鼠、大鼠、兔、狗、驴或实验室测试动物例如果蝇、斑马鱼等。在一些实施方案中，对象是非人灵长类动物。
在一些实施方案中，患者先前已接受过癌症治疗。在一些实施方案中，对象对先前癌症治疗具有抗性。在一些实施方案中，对象确定为对先前癌症治疗的低反应者。
预想方法和组合物包括排除本文所述的任何实施方案。
如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述相互组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预想x、y或z可从实施方案具体地排除。
整个本申请中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的简单和普通含义来使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。
术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”是同义的，其是包括性或开放式的，并且不排除另外未列举的要素或方法步骤。短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由……组成”将所述主题的范围限制为指定的材料或步骤，以及不会对其基本和新颖特性产生实质性影响的材料或步骤。预想在术语“包含”的上下文中描述的实施方案也可在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的上下文中实施。
具体预想到，关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限定都可适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于制备或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的一个实施方案的方面也是可在不同实施例中别处或申请中别处例如在发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并且结合本文中呈现的具体实施方案的详述，可更好地理解本发明。
图1A-E。选择单克隆肿瘤结合抗体成分(抗TRP1和抗CD47)用于各种可移植和自体鼠类肿瘤模型的原位疫苗接种。a.B16F10细胞与Cy7标记的抗TRP1、抗CD47、小鼠IgG2a同种型对照抗体以30μg/mL或与5μg/mL抗体作为pManTLR7缀合物在4℃下孵育20分钟。细胞在通过流式细胞术分析之前经过洗涤。b.EMT6或c.PyMT细胞与Cy7标记的抗CD47或小鼠IgG2a同种型对照抗体以30μg/mL在4℃下孵育20分钟，洗涤，并通过流式细胞术分析荧光信号。d.将B16F10肿瘤或BP肿瘤的冷冻组织切片用抗TRP1-Cy7、抗CD47和生物素化抗IV型胶原抗体染色。通过Alexa Fluor 647抗大鼠抗体(Invitrogen)和750缀合的链霉亲和素(BioLegend)检测抗体的初步染色。然后在共聚焦显微镜上对使用带有DAPI(Invitrogen)的ProLong金抗褪色封固剂封固的载玻片进行成像。比例尺显示70μm。e.将携带80mm3 B16F10肿瘤的小鼠用Cy7标记的抗TRP1、抗CD47、小鼠IgG2a同种型对照抗体进行瘤内治疗，并且在治疗后的不同时间点成像。肿瘤通过IVIS Spectrum荧光成像系统来成像。使用辐射效率对用荧光标记的缀合物处理的肿瘤的荧光信号进行定量分析来计算蛋白质含量。数据表示为n＝5只小鼠的平均值±SEM。配对t检验、Bonferroni-Dunn事后检验校正。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，#表示抗Trp1和同种型对照抗体之间的显著性。
图2A-D。将pManTLR7与肿瘤结合抗体缀合。a.由甘露糖和TLR7单体组成的抗体-pManTLR7聚合物的代表性示意图。b.凝胶电泳分析：i.游离抗体，ii.抗TRP1-连接子，iii.抗TRP1-pManTLR7。实验重复至少两次，结果相似。c.单独TRP1抗体(左)和其与2kDa二巯基吡啶基-PEG-BCN连接子缀合后的MALDI-TOF-MS分析。分子量变化用于计算每个抗体分子的连接子数量和随后估算最终产物每个抗体的pManTLR7聚合物数量。d.将B16F10细胞用Alexa Fluor-647标记的小鼠IgG2a同种型对照抗体、抗TRP1或抗TRP1-pManTLR7缀合物染色，洗涤，并且通过流式细胞术分析细胞荧光。
图3A-D。抗体-pmanTLR7缀合物以抗原特异性方式延长肿瘤保留。(a)将EMT6肿瘤细胞用荧光标记的抗CD47647-pManTLR7缀合物或单独的抗CD47647抗体及等量的荧光标记抗体染色。通过流式细胞术评估针对EMT6肿瘤细胞的结合抗体的荧光。(b)荷瘤小鼠在注射后4小时用荧光染料标记的aCD47647-pManTLR7或aTRP1647-pManTLR7缀合物或IgG2a同种型对照647-pManTLR7缀合物进行成像，并且通过IVIS成像以测量荧光信号随时间变化的损失。在肿瘤周围绘制ROI，并且计算相对于初始(4小时)荧光信号％的肿瘤荧光的损失。在B16F10(c)和EMT6(d)荷瘤小鼠中，使用随时间变化的辐射效率损失的相位衰减曲线拟合来计算肿瘤内半衰期。实验重复两次，汇总结果显示为(c,d)。
图4A-G。抗TRP1-pManTLR7治疗降低B16F10黑色素瘤的生长速度和对TLR7的系统暴露。a.将小鼠在第0天接种B16F10细胞，每4天接种一次，从第5天开始，接种30μg TLR7，形式为抗TRP1-pManTLR7、等量的抗TRP1和pManTLR7的未缀合混合物、30μg CpG或盐水(载体)。b、c、f和g来自其中小鼠接种300000个细胞的实验设置。d和e来自相同的治疗方案和剂量，不同之处在于小鼠接种400000个细胞并且在第14天处死。所有治疗均为瘤内施用。b.肿瘤体积随着时间变化直至第一只小鼠死亡[n＝8，平均值±SD]。c.直到终点的存活百分比。用gp100肿瘤肽重新刺激来自d.肿瘤引流淋巴结和e.脾脏的细胞3天后上清液中的IFNγ分泌浓度，通过ELISA测定[n＝5，平均值±SD]。收集接种疫苗后24小时的血浆，并且通过ELISA测定全身f.IL-6和g.IL-12p70的浓度[n＝8，平均值±SD]。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。使用ANOVA和Bonferroni事后检验校正进行统计分析。由于非参数数据，在b中使用Kruskal-Wallis检验，然后是邓恩多重比较。*P<0.05，**P<0.01。
图5A-D。抗TRP1-pManTLR7疫苗接种不与抗CTLA4和抗PD1检查点阻断疗法协同作用。a.小鼠在第0天接种B16F10细胞，每4天接种一次，从第5天开始，使用30μg TLR7，形式为单独的抗TRP1-pManTLR7或与抗PD1+抗CTLA4抗体的组合(每种100μg，腹膜内施用)、单独的抗PD1+抗CTLA4，或盐水(载体)。b.肿瘤体积随着时间变化直至第一只小鼠死亡[n＝8，平均值±SD]。c.存活百分比。用gp100肿瘤肽重新刺激来自d.肿瘤引流淋巴结的细胞3天后上清液中的IFNγ分泌浓度，通过ELISA测定[n＝5，平均值±SD]。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。使用ANOVA和Bonferroni事后检验校正进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01。
图6A-F。在免疫学排除的肿瘤模型EMT6中的疫苗接种效力。(a)EMT6荷瘤小鼠的治疗方案。如图所示，将小鼠用疫苗或对照治疗剂以4天间隔给药3次，而不是在8天后施用1次。对于与检查点抑制剂抗体(抗CTLA4+抗PD1，每种100μg)的组合，小鼠进行腹膜内治疗。对于单独的抗CD47，将小鼠施用与全部抗CD47-pManTLR7缀合物中所含的等同剂量的抗CD47抗体进行瘤内治疗。将BALB/C小鼠(n＝8)接种5x105EMT6鼠源乳腺癌细胞，然后用20μgTLR7处理，形式为aCD47-p(Man-TLR7)、混合的aCD47+pManTLR7、或盐水，如图所示。检查点阻断抗体抗PD1和抗CTLA4，各自100ug，腹膜内施用。跟踪小鼠随着时间变化的肿瘤生长。显示了(b)平均肿瘤体积±SEM和(c)Kaplan-Meier存活曲线。(g)在肿瘤清除后30天(初次肿瘤接种后第90天)，将存活的小鼠在远侧乳腺脂肪垫中用5x105EMT6细胞再次激发，以评估循环记忆应答。(e)将EMT6荷瘤小鼠按照(a)中所示的相同时间表接种疫苗，并且在第一次接种疫苗前一天开始另外地用同种型对照Ab(无细胞耗竭)、抗CSF1R或抗CD8a耗竭抗体进行腹膜内治疗。显示了(e)平均肿瘤体积±SEM和(f)Kaplan-Meier存活曲线。
图7A-C。tAb-pManTLR7被多个APC亚群内吞并且激活肿瘤和引流淋巴结中的DC和巨噬细胞。(a)瘤内注射后24小时，肿瘤和肿瘤引流淋巴结中DC群体和巨噬细胞的抗CD47647-pManTLR+细胞的百分比。APC亚群定义为CD11c+全部：CD11c+CD11b-，CD103+ DC：CD11c+CD11b-CD103+，CD8+DC：CD11c+CD11b-CD8a+、CD11c+CD11b+ DC，巨噬细胞：CD11b+F480+，M1巨噬细胞：CD11b+F480+CD80+，M2巨噬细胞：CD11b+F480+CD206+。(n＝5，平均值±SD)。接种抗CD47-pManTLR7、抗CD47+pManTLR7或生理盐水24小时后，肿瘤引流淋巴结中(b)活巨噬细胞、(c)炎性单核细胞(CD11b+Ly6Chi)、CD11c+DC和CD103+ DC的百分比。(n＝7，平均值±SD)。(c)肿瘤(左)和肿瘤引流淋巴结中细胞群的激活。细胞群由与(a)中相同的标记定义，包括浆细胞样DC：CD11c+B220+。对于(b,c)，统计差异通过双尾t检验确定。实验重复两次，结果相似。
图8A-D。用于接种各种可移植和自体鼠类肿瘤模型的肿瘤基质结合抗体片段(抗EDA)的产生。a.在(i.)非还原和(ii.)还原条件下纯化后，HEK293细胞中产生的抗EDA Fab的凝胶电泳。预期大小是47kDa。还出现略低于75kDa的另外的条带，该条带在还原条件下消除。该实验重复至少两次，结果相似。b.使用抗人IgG抗体检测抗EDA Fab的蛋白质印迹。c.ELISA测试抗EDA Fab与EDA的结合，如材料和方法部分所述。测量的Kd是50.9nM。d.将B16F10肿瘤的冷冻组织切片用大鼠抗小鼠CD31(板1-8)和生物素化小鼠抗EDA(仅板1-4)抗体染色。通过Alexa Fluor 647缀合的抗大鼠IgG(板1-8)和Alexa Fluor 488缀合的链霉亲和素(板1-8)检测抗体的初步染色。将载玻片用带有DAPI(Invitrogen)的ProLong金抗褪色封固剂封固，然后在IX83显微镜(Olympus)上成像。图像使用ImageJ软件(NIH)处理。
图9A-B。将p(Man-TLR7)与抗EDA Fab缀合。a.与由甘露糖和TLR7单体组成的p(Man-TLR7)聚合物缀合的抗EDA Fab的代表性示意图。b.凝胶电泳分析i.游离抗EDA Fab、ii.抗EDA Fab连接子、iii.抗EDA Fab-p(Man-TLR7)。实验重复至少两次，结果相似。
图10A-C。抗EDA Fab-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗CTLA-4和抗PD-1检查点阻断疗法协同作用，以降低B16F10黑色素瘤的生长速度。a.将小鼠在第0天接种500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4天和第9天接种10μg TLR7，形式为单独的人抗EDA Fab-p(Man-TLR7)(n＝4)或其与抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组合(每种100μg，静脉内施用)，等同量的人抗EDA Fab和p(Man-TLR7)的未缀合混合物，或单独的抗PD-1+抗CTLA-4。此外，一组小鼠未经处理作为对照(n＝3)。所有治疗剂均通过尾静脉静脉内施用。除非另有说明，否则所有组的n＝5。b.肿瘤体积随着时间变化直到第一只小鼠死亡[平均值±SD]。c.直到终点的存活百分比。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。在第12天使用单因素ANOVA，然后Tukey多重比较检验对肿瘤生长曲线进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01。
图11A-G。抗EDA Fab-p(Man-TLR7)疫苗接种后的免疫细胞分析。a.小鼠(n＝6)在第0天接种有500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4天和第8天接种有30μg TLR7，形式为单独的人抗EDA Fab-p(Man-TLR7)或其与抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组合(每种100μg)、等同量的人抗EDA Fab和p(Man-TLR7)的未缀合混合物(含或不含检查点抗体)、单独的抗PD-1+抗CTLA-4，或PBS。检查点抗体于腹膜内施用。所有其他治疗剂均静脉内施用。小鼠然后在第10天处死，收获肿瘤。b.肿瘤体积随着时间变化[平均值±SD]。c-g.对收获的肿瘤进行流式细胞术分析。细胞类型定义如下：(c)CD8+ T细胞：CD45+CD3+CD8+；(d)CD4+ T细胞：CD45+CD3+CD4+；(e)Treg：CD45+CD3+CD4+CD25+Foxp3+；(f)NK细胞：CD45+CD3-NK1.1+；(g)巨噬细胞：CD45+CD19-Gr1-F4/80+。所有统计分析均使用ANOVA与Tukey检验完成。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图12A-C。用鼠源化抗EDA Fab-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗CTLA-4和抗PD-1检查点阻断疗法协同作用，以降低B16F10黑色素瘤的生长速度。a.小鼠(n＝10)在第0天接种有500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4、8和12天接种有30μg TLR7，形式为鼠源化抗EDA Fab-p(Man-TLR7)与抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组合(每种100μg)、单独的抗PD-1+抗CTLA-4，或PBS。检查点抗体腹膜内施用。所有其他治疗剂均静脉内施用。b.肿瘤体积随时间变化直到第一只小鼠死亡[平均值±SD]。c.直到终点的存活百分比。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。在第12天使用ANOVA分析然后进行Tukey多重比较检验完成对肿瘤生长曲线的统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图13A-H。与静脉内施用相比，EDA靶向p(Man-TLR7)疫苗的瘤内施用导致抗肿瘤功效提高。a.小鼠(n＝5-6)在第0天接种有500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4天和第9天接种有10μg或30μg TLR7，形式为鼠源化抗EDA Fab-p(Man-TLR7)与抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组合(每种100μg)、单独的抗PD-1+抗CTLA-4，或PBS。检查点抗体腹膜内施用。如所示的，其他治疗剂通过静脉内或瘤内施用。b.肿瘤体积随时间变化直至每组中的第一只小鼠死亡[平均值±SD]。c.直到终点的存活百分比。d.在肿瘤接种后11天收集血液，并且通过ELISA评估血浆中针对抗EDA Fab的IgG滴度。e-h.在肿瘤接种后11天收集血液，并且通过ELISA评估血清中(e)IL-6、(f)IL-12p70、(g)TNFα和(h)IFNγ的水平。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。在第12天使用单向ANOVA然后进行Tukey多重比较检验对肿瘤生长曲线进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图14A-D。p(Man-TLR7)与CBD-SA缀合。a.与由甘露糖和TLR7单体组成的p(Man-TLR7)聚合物缀合的CBD-SA的代表性示意图。b.游离CBD-SA和CBD-SA-连接子在还原和非还原条件下的凝胶电泳分析。实验重复至少两次，结果相似。c.游离CBD-SA和CBD-SA-p(Man-TLR7)的凝胶电泳分析。实验至少重复两次，结果相似。d.ELISA测试CBD-SA和CBD-SA-p(Man-TLR7)与胶原I和胶原III的结合，如材料和方法部分所述。使用单向ANOVA然后Tukey多重比较检验进行统计分析。显示的显著性是将背景吸光度与来自CBD-SA或CBD-SA-p(Man-TLR7)的吸光度进行比较。*P<0.05，**P<0.01，***P≤0.001，N.S.＝不显著。
图15A-C。CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗CTLA-4和抗PD-1检查点阻断疗法协同作用，以降低B16F10黑色素瘤的生长速度。a.小鼠在第0天接种有500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4天和第9天接种有10μg TLR7，形式为单独的CBD-SA-p(Man-TLR7)(n＝3)或其与抗PD-1+抗CTLA-4抗体组合(每种100μg，静脉内施用，n＝3)、等同量的CBD-SA和p(Man-TLR7)的未缀合混合物(n＝4)，或单独的抗PD-1+抗CTLA-4(n＝5)。此外，一组小鼠未经处理作为对照(n＝3)。所有治疗剂均通过尾静脉静脉内施用。所有组的n均已指出。b.肿瘤体积随时间变化直至第一只小鼠死亡[平均值±SEM]。c.直到终点的存活百分比。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。在第12天使用单向ANOVA然后进行Tukey多重比较检验完成对肿瘤生长曲线的统计分析。
图16A-C。小鼠CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗CTLA-4和抗PD-1检查点阻断疗法协同作用，以降低B16F10黑色素瘤的生长速度。a.小鼠(n＝10)在第0天接种有500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4、8和12天接种有30μg TLR7，形式为鼠源性CBD-SA-p(Man-TLR7)与抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组合(每种100μg)、单独的抗PD-1+抗CTLA-4，或PBS。检查点抗体腹膜内施用。所有其他治疗剂均静脉内施用。b.肿瘤体积随着时间变化直到第一只小鼠死亡[平均值±SD]。c.直到终点的存活百分比。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。在第12天使用单向ANOVA然后进行Tukey多重比较检验对肿瘤生长曲线进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图17A-H。与静脉内施用相比，瘤内施用胶原靶向p(Man-TLR7)疫苗导致抗肿瘤功效提高。a.小鼠(n＝5-6)在第0天接种有500000个B16F10细胞，并且在肿瘤接种后第4天和第9天接种有10μg或30μg TLR7，形式为鼠源性CBD-SA-p(Man-TLR7)与抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组合(每种100μg)、单独的抗PD-1+抗CTLA-4，或PBS。检查点抗体腹膜内施用。如所示的，其他治疗剂通过静脉内或瘤内施用。b.肿瘤体积随时间变化直至每组中的第一只小鼠死亡[平均值±SD]。c.直到终点的存活百分比。d.在肿瘤接种后11天收集血液，并且通过ELISA评估血浆中针对CBD-SA的IgG滴度。e-h.在肿瘤接种后11天收集血液，并且通过ELISA评估血清中(e)IL-6、(f)IL-12p70、(g)TNFα和(h)IFNγ的水平。对存活曲线进行对数秩(Mantel-Cox)检验。在第12天使用单向ANOVA然后Tukey多重比较检验完成对肿瘤生长曲线的统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
在此，发明人证明使用与肿瘤或基质结合部分缀合的TLR7激动剂佐剂产生治疗性癌症疫苗，优化佐剂作为原位疫苗，其中肿瘤本身用作产生免疫应答的抗原来源。本公开的组合物和方法可用于将佐剂递送至肿瘤并且延长佐剂的肿瘤保留以增加肿瘤微环境内的APC激活和促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。通过增加瘤内APC激活，发明人的疫苗接种会将肿瘤免疫环境从抑制性的转变为炎症性的。由激活的APC产生的细胞因子将产生促炎细胞因子环境，其将增强肿瘤内的T细胞功能，以及促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。引流淋巴结的炎症性状况的持续时间和程度更接近于自然感染，先前研究已报告，延长的抗原可用性和向免疫细胞的递送可通过滤泡辅助T细胞分化、适当的T细胞极化和体液应答提高疫苗接种效力。此外，佐剂和抗原的延长的炎症反应已显示改善T细胞记忆分化和克隆扩增。总之，发明人的疫苗接种策略旨在为初始T细胞针对癌抗原的启动提供最佳的免疫刺激环境，并且改善肿瘤微环境中T细胞的功能。
I.定义
术语“各自独立地”在本文中用于表示选择可相同或不同，即，对于R基团，例如，术语“各自独立地”表示R基团(例如，R1、R2)可相同(例如，R1和R2都可以是经取代的烷基)或不同(例如，R1可以是烷基，R2可以是烷氧基)。除非另有说明，命名的R基团将具有对应于具有该名称的R基团的本领域公认的结构。为了说明的目的，代表性的R基团在本文中定义。这些定义旨在补充和说明而非排除本领域技术人员已知的定义。
术语“脂族基团”表示不包括芳族化合物的无环或环状、饱和或不饱和烃基团。“经取代的脂族基团”是指如上所述的脂族基团，其中一个或多于一个与脂族基团的碳相连的氢原子由任何其他基团取代，例如卤素、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、酯、酰胺、醇及其组合。
术语“烷基”表示具有1个至12个碳原子的一价直链或带支链的饱和烃基。在某些实施方案中，烷基具有1个至7个碳原子，在更特定的实施方案中具有1个至4个碳原子。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基和仲丁基。特别的烷基包括甲基、乙基、丙基和异丙基。更特别的烷基是甲基、乙基和丙基。
术语“经取代的烷基”是指如上所述的烷基，其中与烷基的至少一个碳相连的一个或多于一个氢原子由任何其他基团取代，例如卤素、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、酯、酰胺、醇及其组合。
术语“环烷基”表示环状的烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“经取代的环烷基”是指如上所述的环烷基，其中与环烷基的至少一个碳相连的一个或多于一个氢原子由其他基团取代，例如卤素、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、硼基、膦基、氨基、巯基、酯、酰胺、醇及其组合。
术语“杂烷基”是指如上所述的烷基或经取代的烷基，其中一个或多于一个碳原子被选自N、O、P、B、S、Si、Se和Ge的杂原子取代。碳原子和杂原子之间的键可以是饱和或不饱和的。实例包括烷氧基例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基或叔丁氧基，烷氧基烷基例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-甲氧基乙基、1-乙氧基乙基、2-甲氧基乙基或2-乙氧基乙基，烷基氨基基团例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、二甲基氨基或二乙基氨基，烷硫基例如甲硫基、乙硫基或异丙硫基，或氰基。因此，由例如杂环烷基、经取代的杂环烷基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、硼基、膦基、氨基、亚氨基或巯基基团取代的烷基在术语杂烷基的范围内。
术语“杂环烷基”是指如所述的环烷基，但其中不饱和基团的一个或多于一个或所有碳原子由选自N、O、P、B、S、Si、Se和Ge的杂原子取代。合适的杂环烷基包括例如哌嗪基、吗啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、哌啶基和吡咯烷基。
术语“经取代的杂环烷基”是指如上所述的杂环烷基，但其中杂环烷基的任何原子上的一个或多于一个氢原子被其他基团替代，例如卤素、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、硼基、膦基、氨基、巯基及其组合。
术语“芳基”是指芳族取代基，其可以是单个芳环或稠合在一起、共价连接的或连接到共同基团例如亚甲基或亚乙基部分的多个芳环。连接的共同基团也可以是二苯甲酮中的羰基，或杂原子，例如二苯醚中的氧或二苯胺中的氮。芳环可包括苯基、萘基、联苯、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮等。在某些实施方案中，芳基具有1个至50个碳原子、1个至9个碳原子或1个至6个碳原子。
术语“经取代的芳基”是指如上所述的芳基，其中连接到任何碳原子的一个或多于一个氢原子由一个或多于一个官能团取代，例如烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、卤素、卤代烷基(例如，CF3)、羟基、氨基、膦基、烷氧基、氨基、巯基以及与芳环稠合的、共价连接的或连接到共同基团例如亚甲基或亚乙基部分的饱和和不饱和环状烃。连接基团也可以是环己基苯基酮中的羰基。经取代芳基的具体实例包括全氟苯基、氯苯基、3,5-二甲基苯基、2,6-二异丙基苯基等。
术语“杂芳基”是指一个或多于一个芳环，其中芳环的一个或多于一个碳原子由杂原子例如氮、氧、硼、硒、磷、硅或硫取代。杂芳基指可以是单个芳环、多个芳环或与一个或多于一个非芳环连接的一个或多于一个芳环的结构。在具有多个环的结构中，这些环可稠合在一起、共价连接，或连接到共同的基团，例如亚甲基或亚乙基部分。共同连接基团也可以是苯基吡啶基酮中的羰基。诸如噻吩、吡啶、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、邻苯二甲酰亚胺、吡唑、吲哚、吡啶、嘧啶、吡嗪、呋喃等或这些环的苯并稠合类似物由术语“杂芳基”定义。
术语“经取代的杂芳基”是指如上所述的杂芳基，其中杂芳基部分的任何原子上的一个或多于一个氢原子由其他基团替代，例如卤素、烷基、取代的烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、硼基、膦基、氨基、甲硅烷基、巯基、硒基及其组合。合适的经取代的杂芳基包括例如4-N,N-二甲氨基吡啶。
术语“烷氧基”是指-OZ'基团，其中Z'选自本文所述的烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、甲硅烷基及其组合。合适的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、苄氧基、叔丁氧基等。相关术语是“芳氧基”，其中Z'选自芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基及其组合。合适的芳氧基的实例包括苯氧基、经取代的苯氧基、2-吡啶氧基、8-喹啉氧基(8-quinalinoxy)等。
术语“烷氧基烷基”表示其中烷基的至少一个氢原子已由烷氧基取代的烷基。示例性的烷氧基烷基包括甲氧基甲基、乙氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基丙基和异丙氧基甲基。特定的烷氧基烷基包括甲氧基甲基、甲氧基乙基和乙氧基甲基。
术语“烷氧基烷氧基”表示其中烷氧基的至少一个氢原子已由另一烷氧基取代的烷氧基。烷氧基烷氧基的实例包括甲氧基甲氧基、乙氧基甲氧基、甲氧基乙氧基、乙氧基乙氧基、甲氧基丙氧基和乙氧基丙氧基。特定的烷氧基烷氧基包括甲氧基甲氧基和甲氧基乙氧基。
术语“烷氧基烷氧基烷基”表示其中烷基的至少一个氢原子已由烷氧基烷氧基取代的烷基。烷氧基烷氧基烷基的实例包括甲氧基甲氧基甲基、乙氧基甲氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、乙氧基乙氧基甲基、甲氧基丙氧基甲基、乙氧基丙氧基甲基、甲氧基甲氧基乙基、乙氧基甲氧基乙基、甲氧基乙氧基乙基、乙氧基乙氧基乙基、甲氧基丙氧基乙基和乙氧基丙氧基乙基。
术语“氨基”是指基团-NZ'Z”，其中Z'和Z”各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、烷氧基烷基、芳氧基及其组合。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。
术语“羰基”表示
Figure BDA0003496477400000221
或-C(O)-基团。
术语“羟基”或“醇”表示-OH基团。
术语“氰基”表示-C≡N基团。
术语“叠氮化物”表示-N3基团。
本发明的化合物和聚合物可具有不对称中心。本发明的含有不对称取代原子的化合物和聚合物可以以光学活性或外消旋形式分离。根据Cahn-Ingold-Prelog规则，不对称碳原子可以是“R”或“S”构型。本领域熟知如何制备光学活性形式，例如通过物质的拆分制备。所有手性、非对映、内消旋、外消旋形式都在本发明的范围内，除非具体的立体化学或异构形式被指出。
另外，如本文所用，术语C1-C6烷基和由其衍生的术语包括所述C1-C6烷基的所有可能的异构形式。此外，杂芳基包括所有位置异构体。此外，单体(VI)、共聚物(I)、(IV)、(VII)或聚合物(VIII)的所有多晶型物和水合物均在本发明的范围内。
术语“化合物”和“本发明的一种化合物”和“本发明的化合物”等，以及它们的复数形式包括式(III)和(VI)的实施方案以及本文所述的共聚物(I)、(IV)、(VII)或聚合物(VIII)和本文所述的示例性化合物所涵盖的其他更特定的实施方案或这些实施方案各自的药学上可接受的盐。对化合物的所有引用，包括其中所含原子的所有同位素，包括同位素标记的化合物。
术语“聚合物”和“本发明的一种聚合物”和“本发明的聚合物”等及其复数形式包括式(VIII)的实施方案和本文所述的单体(VI)、共聚物(I)、(IV)和(VII)以及本文所述的示例性化合物和聚合物所涵盖的其他更特定的实施方案或这些实施方案各自的药学上可接受的盐。对聚合物的所有引用，包括其中所含原子的所有同位素，包括同位素标记的聚合物。
本发明的化合物和聚合物可以互变异构体存在。本发明化合物的所有互变异构形式都预想在本发明的范围内。
组合物还包括单体(VI)、共聚物(I)、(IV)、(VII)或聚合物(VIII)的前药。术语前药旨在代表共价键合的载体，当向哺乳动物对象施用前药时，其能够分别释放单体(VI)、共聚物(I)、(IV)、(VII)或聚合物(VIII)的活性成分。活性成分的释放发生在体内。前药可通过本领域技术人员已知的技术制备。这些技术通常修饰给定化合物中的适当官能团。然而，这些修饰的官能团在体内或通过常规操作再生原始的官能团。单体(VI)、共聚物(I)、(IV)、(VII)或聚合物(VIII)的前药包括其中羟基、氨基、羧基或类似基团经过修饰的化合物。前药的实例包括但不限于酯(例如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、羟基或氨基官能团的氨基甲酸酯(例如N,N-二甲氨基羰基)、酰胺(例如三氟乙酰氨基、乙酰氨基等)等。
化合物的“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的盐。此类盐的非限制性实例包括酸加成盐，其与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡萄糖庚酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时形成的盐；或与例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等有机碱配位时形成的盐。应该理解药学上可接受的盐是无毒的。关于合适的药学上可接受的盐的另外信息可得自Remington's Pharmaceutical Sciences,17thed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985，其通过引用并入本文。
“抗原”包括可由抗体分子特异性结合的任何物质。因此，术语“抗原”包括生物分子，其包括但不限于简单的中间代谢物、糖类、脂质、氨基酸和激素，以及大分子例如复合糖类、磷脂、核酸、肽和蛋白质，例如卵清蛋白(OVA)。在某些实施方案中，抗原是与待治疗的感染或疾病相关的抗原。在具体的实施方案中，抗原来自感染原或来自肿瘤或癌细胞。抗原可以是来自感染原或肿瘤/癌细胞的分子的全部或部分。在特定的实施方案中，抗原是其中期望或旨在产生免疫应答的抗原。
术语“聚合物”是指由通过共价化学键连接的重复结构单元组成的分子，其特征通常在于大量重复单元(例如，等于或大于10个重复单元，通常等于或大于50个重复单元，通常等于或大于100个重复单元)和高分子量(例如，大于或等于50000Da)。聚合物通常是一种或多于一种单体前体的聚合产物。术语聚合物包括均聚物或基本上由单个重复单体亚单元组成的聚合物。术语聚合物还包括当两种或多于两种不同类型的单体连接在同一聚合物中时形成的共聚物。共聚物可包含两个或多于两个单体亚单元，并且包括无规、嵌段、交替、链段、接枝、锥形和其他共聚物。有用的聚合物包括可与水混溶以用于疫苗施用的有机聚合物。
“低聚物”是指由通过共价化学键连接的重复结构单元组成的分子，其特征通常在于重复单元的数量少于聚合物中重复单元的数量(例如，等于或小于10个重复单元)和比聚合物低的分子量(例如，小于或等于约50000Da)。低聚物可以是一种或多于一种单体前体的聚合产物。
具体预想到m、o、p、p’中的任一个或单体数量是整数，并且可以是、至少是或至多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或多于90000，或其中可衍生的任何范围。
术语“可操作地连接”是指其中在结合靶位点之前将两种组分组合以形成活性复合物的情况。例如，与生物素-链霉亲和素复合物的一半缀合的分子和与生物素-链霉亲和素复合物的另一半复合的抗原通过生物素和链霉亲和素分子的复合而可操作地连接。术语可操作地连接还旨在指将两个分子缀合在一起的共价或化学连接。
II.多肽
A.靶向剂
1.胶原结合域
在一些实施方案中，肿瘤靶向剂包含胶原结合肽。在一些实施方案中，多肽包含来自饰胶蛋白聚糖的胶原结合域。在一些实施方案中，胶原结合域包含饰胶蛋白聚糖肽，例如源自牛的LRELHLNNNC(SEQ ID NO:5)或源自人的LRELHLDNNC(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，胶原结合域包含来自人饰胶蛋白聚糖的肽片段，其由以下氨基酸序列表示：
Figure BDA0003496477400000271
在一些实施方案中，胶原结合肽是来自血管性血友病因子(vWF)的肽。人vWF的序列包括以下序列：
Figure BDA0003496477400000272
Figure BDA0003496477400000281
Figure BDA0003496477400000291
在一些实施方案中，肽来自vWF A3结构域。VWF A3结构域源自人序列，残基1670-1874(成熟VWF的907-1111)，并且具有以下序列：
Figure BDA0003496477400000292
在一些实施方案中，ECM-肽包含vWF A3的全部或片段，其由以下氨基酸序列表示：
Figure BDA0003496477400000293
在一些实施方案中，胶原结合域包含具有以下序列的多肽：
Figure BDA0003496477400000294
在一些实施方案中，多肽包含具有以下序列的胶原结合域白蛋白多肽：
Figure BDA0003496477400000301
示例性肽包括SEQ ID NO:1-4或11-14中任一个的全部或部分。胶原结合域可以是与本公开的多肽例如SEQ ID NO:1-8具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性(或其中任何可衍生的范围)的多肽。
2.抗体和抗原结合片段
本公开的方面涉及抗体或其片段作为结合肿瘤基质或癌抗原/肿瘤相关抗原的肿瘤靶向剂。术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其可与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的片段，并且包括嵌合、人源化、完全人源化和双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是小鼠抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆或多克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，是指作为动物免疫应答的一部分起作用的任意几类结构相关蛋白质，包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白质，以及包含抗体CDR结构域的保留抗原结合活性的多肽。
术语“抗原”是指能够通过选择性结合剂例如抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多于一个能够与不同抗体相互作用的表位。
术语“表位”包括能够通过与免疫球蛋白或T细胞受体结合而引发免疫应答的分子的任何区域或部分。表位决定簇可包括化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特征。通常，对特定靶抗原特异的抗体将优先识别复杂混合物中靶抗原上的表位。
可使用本领域众所周知的许多不同表位像分析技术来识别给定多肽的表位区，包括：X射线晶体学、核磁共振波谱、定点诱变像分析、蛋白质展示阵列，参见例如EpitopeMapping Protocols,(Johan Rockberg and Johan Nilvebrant,Ed.,2018)Humana Press,New York,N.Y。这种技术在本领域是已知的，并且描述于例如：美国专利第4708871号；Geysen等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002(1984)；Geysen等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178-182(1985)；Geysen等人Molec.Immunol.23:709-715(1986)，参见例如Epitope Mapping Protocols,同上。另外，还可使用标准抗原性和亲水性图来预测和识别蛋白质的抗原性区域。
完整抗体通常由两条全长重链和两条全长轻链组成，但在某些情况下可包括较少的链，例如天然存在于骆驼科动物中的抗体可仅包含重链。本文公开的抗体可仅源自单一来源或可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可源自两种不同抗体。例如，可变区或CDR区可源自大鼠或鼠源，而恒定区源自不同的动物源，例如人。抗体或结合片段可在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。除非另有说明，否则术语“抗体”包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，实例如下所述(Sela-Culang等人Front Immunol.2013；4:302；2013)。
术语“轻链”包括全长轻链及其片段，其具有足够可变区序列以赋予结合特异性。全长轻链具有约25000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VL)和恒定区结构域(本文缩写为CL)。轻链分为两类，指认为kappa(κ)和lambda(λ)。术语“VL片段”是指单克隆抗体的轻链片段，其包括全部或部分轻链可变区，包括CDR。VL片段还可包括轻链恒定区序列。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。
术语“重链”包括全长重链及其片段，具有足够可变区序列以赋予结合特异性。全长重链具有约50000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VH)和三个恒定区结构域(本文缩写为CH1、CH2和CH3)。术语“VH片段”是指单克隆抗体的重链片段，包括全部或部分重链可变区，包括CDR。VH片段还可包括重链恒定区序列。重链恒定区结构域的数量将取决于同种型。VH结构域位于多肽的氨基末端，CH结构域位于羧基末端，CH3最靠近-COOH末端。抗体的同种型可以是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE，并且由存在的重链定义，分为五类：μ、δ、γ、α或ε链。IgG有多种亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM1和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。
抗体可以是任何同种型或分类的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对两种或多于两种抗原具有特异性的杂交抗体。它们也可以是片段(例如，F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括杂交片段。免疫球蛋白还包括天然、合成或基因工程蛋白，它们通过与特定抗原结合形成复合物而起到类似抗体的作用。术语抗体包括基因工程或其他修饰形式的免疫球蛋白。
术语“单体”是指仅包含一个Ig单位的抗体。单体是抗体的基本功能单位。术语“二聚体”是指含有通过抗体重链恒定区(Fc，或可结晶片段区域)相互连接的两个Ig单元的抗体。复合物可通过连接(J)链蛋白来稳定。术语“多聚体”是指含有通过抗体重链恒定区(Fc区)相互连接的大于两个Ig单位的抗体。复合物可通过连接(J)链蛋白来稳定。
术语“二价抗体”是指包含两个抗原结合位点的抗体。两个结合位点可具有相同的抗原特异性，或它们可以是双特异性的，这意味着两个抗原结合位点具有不同的抗原特异性。
双特异性抗体是一类具有两个互补位的抗体，具有针对两个或多于两个不同表位的不同结合位点。在一些实施方案中，双特异性抗体可以是双互补位的，其中双特异性抗体可以特异性识别来自同一抗原的不同表位。在一些实施方案中，双特异性抗体可由称为“纳米抗体”的一对不同单域抗体构建。单域抗体来源和修饰于软骨鱼类和骆驼科动物。可使用本领域技术人员常用的技术通过连接子将纳米抗体连接在一起；这种选择和连接抗体的方法描述于：PCT公开号WO2015044386A1、WO2010037838A2和Bever等人,Anal Chem.86:7875–7882(2014)，其各自具体通过引用整体并入本文。
双特异性抗体可构建为：完整的IgG、Fab'2、Fab'PEG、双抗体或为scFv。双抗体和scFv可在不用Fc区下仅使用可变结构域构建，潜在地降低了抗独特型反应的影响。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)，其各自具体通过引用整体并入。
在某些方面，通过与结合不同抗原的VH和VL区对进行多聚化，抗原结合结构域可以是多特异性或异种特异性的。例如，抗体可以与(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面上的Fc受体，或(c)至少一种其他成分结合或相互作用。因此，方面可包括但不限于双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性抗体或其抗原结合片段，其针对表位和其他靶标，例如效应细胞上的Fc受体。
在一些实施方案中，可以使用多特异性抗体并且使用本领域已知的常规方法通过短的柔性多肽链直接连接。一个这样的实例是双抗体，其是二价的双特异性的抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，并且利用太短以致不能在同一链上的结构域之间配对的连接子，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。连接子功能适用于三抗体、四抗体和更高抗体多聚体的实施方案。(参见例如，Hollinger等人,ProcNatl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Polijak等人,Structure 2:1121-1123(1994)；Todorovska等人,J.Immunol.Methods 248:47-66(2001))。
与双特异性全抗体相反，双特异性双抗体也可以是有利的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用噬菌体展示(WO94/13804)从文库中容易地选择具有适当结合特异性的双抗体(和其他多肽，例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持不变，例如，具有针对蛋白质的特异性，则可制作文库，其中另一臂发生变化并且选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可通过如Ridgeway等人(Protein Eng.,9:616-621、1996)和Krah等人(N Biotechnol.39:167-173、2017)中所述的替代工程方法制备，其各自通过引用整体并入本文。
异缀合抗体由两种具有不同特异性的共价连接的单克隆抗体组成。参见例如，美国专利第6010902号，其通过引用整体并入本文。
以高特异性结合抗原表位的抗体分子的Fv片段部分在本文中称为“互补位”。互补位由与抗原表位接触以促进抗原识别的氨基酸残基组成。抗体的两个Fv片段中的每一个都由二聚化构型的两个可变结构域VH和VL组成。每个可变结构域的一级结构包括三个高变环(hypervariable loop)，由框架区(FR)分隔并且在其两侧。高变环是来自任何哺乳动物的抗体分子中一级序列变异性最高的区域。术语高变环有时与术语“互补决定区(CDR)”互换使用。高变环(或CDR)的长度因抗体分子而异。来自给定哺乳动物的所有抗体分子的框架区具有高度的一级序列相似性/一致性。本领域技术人员可使用框架区的共有物来识别框架区和散布在框架区之间的高变环(或CDR)。高变环被赋予识别名称，其区分它们在多肽中的位置以及它们出现在哪个结构域上。VL域中的CDR标识为L1、L2和L3，其中L1出现在最远端，L3出现在最靠近CL结构域的位置。CDR也可命名为CDR-1、CDR-2和CDR-3。L3(CDR-3)通常是给定生物体产生的所有抗体分子中变异性最高的区域。CDR是在一级结构中线性排列的多肽链的区域，并且由框架区彼此隔开。VL链的氨基末端(N-末端)称为FR1。出现在L1和L2高变环之间的区域识别为FR2。FR3出现在L2和L3高变环之间，FR4区域最靠近CL结构域。VH链重复这种结构和命名法，其包括三个标识为H1、H2和H3的CDR。可变结构域或Fv片段(VH和VL)中的大部分氨基酸残基是框架区的一部分(约85％)。抗体分子的三维或三级结构使得框架区更位于分子内部并且提供大部分结构，CDR位于分子的外表面上。
已开发几种方法并且本领域技术人员可使用这些方法来识别构成这些区域中的每一个的确切氨基酸。这可使用多种多序列比对方法和算法中的任一种来完成，这些方法和算法识别构成框架区的保守氨基酸残基，因此识别长度可以不同但位于框架区之间的CDR。已开发三种常用的方法来识别抗体的CDR：Kabat(如下所述：T.T.Wu and E.A.Kabat,“AN ANALYSIS OF THE SEQUENCES OF THE VARIABLE REGIONS OF BENCE JONES PROTEINSAND MYELOMA LIGHT CHAINS AND THEIR IMPLICATIONS FOR ANTIBODYCOMPLEMENTARITY,”J Exp Med,vol.132、no.2、pp.211–250、Aug.1970)；Chothia(如下所述：C.Chothia等人,“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions,”Nature,vol.342、no.6252、pp.877–883、Dec.1989)；和IMGT(如下所述：M.-P.Lefranc等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains,”Developmental&ComparativeImmunology,vol.27、no.1、pp.55–77、Jan.2003)。这些方法各自包括用于识别构成可变区的氨基酸残基的独特编号系统。在大多数抗体分子中，实际接触抗原表位的氨基酸残基出现在CDR中，尽管在某些情况下，框架区内的残基有助于抗原结合。
本领域技术人员可使用多种方法中的任一种来确定抗体的互补位。这些方法包括：1)基于抗体可变区氨基酸序列的化学性质和表位组成的抗体/表位结合相互作用的三级结构的计算预测；2)氢-氘交换和质谱；3)多肽片段化和肽像分析方法，其中从多肽的全长生成多个重叠的肽片段，并且评估这些肽对表位的结合亲和力；4)抗体噬菌体展示文库分析，其中编码哺乳动物基因的抗体Fab片段由噬菌体以掺入噬菌体外壳的方式表达。然后允许该表达Fab的噬菌体群与已固定的抗原相互作用，或可通过不同的外源表达系统在其中表达。将未结合的Fab片段洗掉，从而仅留下附着在抗原上的特异性结合Fab片段。可容易地分离结合的Fab片段并且确定编码它们的基因。这种方法也可视情况用于包括Fv片段或特定的VH和VL结构域的Fab片段的较小区域。
在某些方面，亲和力成熟的抗体通过其一个或多于一个CDR中的一个或多于一个修饰增强，导致与不具有改变的亲本抗体相比，抗体对靶抗原的亲和力提高。某些亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的方案产生，例如Marks等人,Bio/Technology10:779(1992)描述通过VH和VL结构域混编的亲和力成熟，在噬菌体展示中采用的CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Rajpal等人,PNAS.24:8466-8471(2005)和Thie等人,Methods Mol Biol.525:309-22(2009)，结合Tiller等人,Front.Immunol.8:986(2017)中说明的计算方法。
嵌合免疫球蛋白是来自不同物种的融合基因的产物；“人源化”嵌合体通常具有来自人免疫球蛋白的框架区(FR)和来自一个或多于一个来自非人源的CDR。
在某些方面，重链和/或轻链的部分与来自另一特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可。美国专利第4816567号；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)。对于与嵌合抗体相关的方法，参见例如，美国专利第4816567号；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1985)，其各自通过引用具体地整体并入本文。CDR移植描述于例如美国专利第6180370号、第5693762号、第5693761号、第5585089号和第5530101号，其所有目的均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使来自非人类物种的抗体多肽序列最小化以优化嵌合抗体功能并且降低免疫原性。来自非人抗体的非抗原识别区的特定氨基酸残基被修饰为与人抗体或同种型中的相应残基同源。一个实例是“CDR移植”抗体，其中抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多于一个CDR，而抗体链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。用于人类时，由来自非人类免疫球蛋白的轻链和重链可变区的CDR1、CDR2和部分CDR3组成的V区用人类抗体框架区移植，用非人CDR取代天然存在的人抗体的抗原受体。在一些情况下，用相应的非人残基替代人免疫球蛋白的框架区残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基以进一步改进性能。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。参见例如，Jones等人,Nature 321:522(1986)；Riechmann等人,Nature332:323(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593(1992)；Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.1:105(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23；1035(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428(1994)；Verhoeyen等人,Science239:1534-36(1988)。
胞内抗体是细胞内定位的免疫球蛋白，其与细胞内抗原结合，而与在细胞外空间结合抗原的分泌抗体不同。
多克隆抗体制剂通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。为了产生多克隆抗体，宿主例如兔或山羊用抗原或抗原片段免疫，通常使用佐剂，如果需要则连接到载体上。随后从宿主的血清中收集针对抗原的抗体。多克隆抗体可针对抗原进行亲和纯化，使其具有单特异性。
单克隆抗体或“mAb”是指从来自排他的亲本细胞的同质抗体群体中获得的抗体，例如，群体除了可以少量存在的天然发生的突变以外是相同的。每个单克隆抗体针对单个抗原决定簇。
a.抗原结合片段
某些方面涉及抗体片段，例如结合肿瘤细胞或肿瘤基质的抗体片段。术语功能性抗体片段包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体的抗原结合片段。这些片段由可变区重链(VH)和/或轻链(VL)的各种排列构成；并且在一些实施方案中，包括恒定区重链1(CHl)和轻链(CL)。在一些实施方案中，它们缺少由重链2(CH2)和重链3(CH3)结构域构成的Fc区。抗原结合片段及其修饰的实施方案可包括：(i)由VL、VH、CL和CHl结构域构成的Fab片段类型；(ii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段类型；(iii)由VH和VL结构域构成的Fv片段类型；(iv)单结构域片段类型dAb，由单个VH或VL结构域构成(Ward,1989；McCafferty等人,1990；Holt等人,2003)；(v)分离的互补决定区(CDR)区域。这些术语例如描述于：Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY(1989)；Molec.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers,R.A.(ed.),New York:VCH Publisher,Inc.)；Huston等人,Cell Biophysics,22:189-224(1993)；Pluckthun and Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)，和Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,2d ed.,Wiley-Liss,Inc.New York,N.Y.(1990)；Antibodies,4:259-277(2015)。本段落中的引文均以引用方式并入。
抗原结合片段还包括从轻链可变区精确地保留至少或至多1个、2个或3个互补决定区(CDR)的抗体片段。包含CDR的序列与Fc区(或其CH2或CH3区)的融合包括在该定义的范围内，包括例如直接或间接与Fc区融合的scFv。
术语Fab片段是指含有VL、VH、CL和CH1结构域的抗体的单价抗原结合片段。术语Fab'片段是指比Fab片段大的单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab'片段包括VL、VH、CL和CH1结构域以及全部或部分铰链区。术语F(ab')2片段是指单克隆抗体的二价抗原结合片段，其包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab'片段。F(ab')2片段包括例如两个VH和VL结构域的全部或部分，并且可进一步包括两个CL和CH1结构域的全部或部分。
术语Fd片段是指单克隆抗体的重链的片段，其包括全部或部分VH，包括CDR。Fd片段还可包括CH1区序列。
术语Fv片段是指单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括VL和VH的全部或部分，并且不存在CL和CH1结构域。VL和VH包括例如CDR。单链抗体(sFv或scFv)是Fv分子，其中VL和VH区已通过柔性连接子连接形成单一多肽链，从而形成抗原结合片段。单链抗体在国际专利申请公开第WO88/01649号和美国专利第4946778号和第5260203号中详细讨论，其公开内容通过引用并入本文。术语(scFv)2是指二价或双特异性sFv多肽链，其在其C-末端包括低聚化结构域，通过铰链区与sFv分开(Pack等人，1992)。低聚化结构域包含自缔合α-螺旋，例如亮氨酸拉链，其可以通过另外的二硫键进一步稳定。(scFv)2片段也称为“微型抗体”或“微抗体”。
单结构域抗体是仅包含VH或VL结构域的抗原结合片段。在一些情况下，两个或多于两个VH区与肽连接子共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
b.片段结晶区，Fc
Fc区包含两个重链片段，包括抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或多于两个二硫键和CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。如本文所用，术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白质形式。包含促进二聚化的铰链区的这种多肽的截短形式也包括在内。
c.具有抗体CDR和展示CDR的支架结构域的多肽
根据实施方案，使用抗原结合肽支架，例如互补决定区(CDR)来产生蛋白质结合分子。通常，本领域技术人员可确定在其上移植至少一个CDR的蛋白质支架的类型。众所周知，最佳的支架必须满足许多标准，例如：良好的系统发育保守性；已知的三维结构；小尺寸；很少或没有转录后修饰；和/或易于生产、表达和纯化。Skerra,J Mol Recognit,13:167-87(2000)。
蛋白质支架可来自但不限于：纤连蛋白III型FN3结构域(称为“单体”)、纤连蛋白III型结构域10、脂质运载蛋白、抗运载蛋白(anticalin)、金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z-结构域、硫氧还蛋白A或具有重复基序的蛋白质，例如“锚蛋白重复序列”、“犰狳重复序列”、“富亮氨酸重复序列”和“三角形四肽重复序列”。这种蛋白质描述于美国专利公开第2010/0285564号、第2006/0058510号、第2006/0088908号、第2005/0106660号和PCT公开第WO2006/056464号，其各自具体通过引用整体并入本文。也可使用源自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素的支架，以及神经元一氧化氮合酶(PIN)的蛋白质抑制剂。
d.肿瘤相关抗原
本公开的某些方面包括涉及与肿瘤相关抗原特异性结合的靶向分子的方法和组合物，所述靶向分子包括多肽、肽、核酸、糖类、脂质和其他激发或诱导抗原反应的分子的区段、片段或表位，通常称为抗原、肿瘤相关抗原或癌抗原。在一个实施方案中，抗原是肽。在一个实施方案中，抗原是蛋白质。特别地，通过免疫应答导致细胞破坏的抗原或所述抗原的抗原性区段或片段可被识别并用于本文所述的方法和组合物中。在一些实施方案中，抗原是癌细胞表面上的抗原。
靶向剂可以是特异性结合癌抗原的抗体或抗原结合片段。癌抗原可以是本领域已知的任何类型的癌抗原。癌抗原可以是上皮癌抗原(例如，乳腺、胃肠道、肺)、前列腺特异性癌抗原(PSA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)、膀胱癌抗原、肺(例如，小细胞肺)癌抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原、黑色素瘤特异性抗原或结直肠癌抗原。
在一个实施方案中，癌抗原是黑色素瘤癌抗原。黑色素瘤癌抗原可用于治疗黑色素瘤。非限制性的示例性的黑色素瘤癌抗原包括MART-1(例如，MART-1 26-35肽、MART-127-35肽)；MART-1/Melan A；pMel17；pMel17/gp100；gp100(例如，gp 100肽280-288、gp 100肽154-162、gp 100肽457-467)；TRP-1；TRP-2；NY-ESO-1；p16；β-连环蛋白；mum-1；等。
癌抗原的其他实例包括例如，5T4、707-AP(707丙氨酸脯氨酸)、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP HPG1、α5β1-整合素、α5β6-整合素、α-甲基酰基-辅酶A消旋酶、ART-4(T细胞4识别的腺癌抗原)、B7H4、BAGE-1(B抗原)、BCL-2、BING-4、CA 15-3/CA 27-29、CA 19-9、CA 72-4、CA125、钙网蛋白、CAMEL(黑色素瘤的CTL识别抗原)、CASP-8(半胱天冬酶-8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD40、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原)、CLCA2(钙激活氯通道-2)、CML28、毛状样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2、CT-9/BRD6(含溴结构域睾丸特异性蛋白)、Cten(c端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白Bl、细胞周期蛋白D1、cyp-B(亲环蛋白B)、CYPB1(细胞色素P450 1B1)、DAM-10/MAGE-B1(分化抗原黑色素瘤10)、DAM-6/MAGE-B2(分化抗原黑色素瘤6)、EGFR/Her1、EMMPRIN(肿瘤细胞相关细胞外基质金属蛋白酶诱导剂/)、EpCam(上皮细胞粘附分子)、EphA2(肝配蛋白A型受体2)、EphA3(肝配蛋白A型受体3)、ErbB3、EZH2(Zeste同源物增强子2)、FGF-5(成纤维细胞生长因子-5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原1)、G250/CALX(糖蛋白250)、GAGE-1(G抗原1)、GAGE-2(G抗原2)、GAGE-3(G抗原3)、GAGE-4(G抗原4)、GAGE-5(G抗原5)、GAGE-6(G抗原6)、GAGE-7b(G抗原7b)、GAGE-8(G抗原8)、GDEP(前列腺中差异表达基因)、GnT-V(N-乙酰葡萄糖氨基转移酶V)、gp100(糖蛋白100kDa)、GPC3(蛋白多糖3)、HAGE(解旋酶抗原)、HAST-2(人类印戒肿瘤2)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(人表皮受体-2/神经系统)、HERV-K-MEL、HNE(人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶)、同源框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPV-E7、HST-2、hTERT(人端粒酶逆转录酶)、iCE(肠羧基酯酶)、IGF-1R、IL-13Ra2(白细胞介素13受体α2链)、IL-2R、IL-5、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205、KK-LC-1(北九州肺癌抗原1)、KM-FIN-1、LAGE-1(L抗原)、活素(livin)、MAGE-A1(黑色素瘤抗原-A1)、MAGE-A10(黑色素瘤抗原-A10)、MAGE-A12(黑色素瘤抗原-A12)、MAGE-A2(黑色素瘤抗原-A2)、MAGE-A3(黑色素瘤抗原-A3)、MAGE-A4(黑色素瘤抗原-A4)、MAGE-A6(黑色素瘤抗原-A6)、MAGE-A9(黑色素瘤-抗原-A9)、MAGE-B1(黑色素瘤-抗原-B1)、MAGE-B10(黑色素瘤-抗原-B10)、MAGE-B16(黑色素瘤-抗原-B16)、MAGE-B17(黑色素瘤-抗原-B17)、MAGE-B2(黑色素瘤-抗原-B2)、MAGE-B3(黑色素瘤-抗原-B3)、MAGE-B4(黑色素瘤-抗原-B4)、MAGE-B5(黑色素瘤-抗原-B5)、MAGE-B6(黑色素瘤-抗原-B6)、MAGE-C1(黑色素瘤-抗原-C1)、MAGE-C2(黑色素瘤-抗原-C2)、MAGE-C3(黑色素瘤-抗原)-C3)、MAGE-D1(黑色素瘤-抗原-D1)、MAGE-D2(黑色素瘤-抗原-D2)、MAGE-D4(黑色素瘤-抗原-D4)、MAGE-E1(黑色素瘤-抗原-E1)、MAGE-E2(黑色素瘤-抗原-E2)、MAGE-F1(黑色素瘤-抗原-F1)、MAGE-H1(黑色素瘤-抗原-H1)、MAGEL2(MAGE样2)、乳腺球蛋白A、MART-1/Melan-A(T细胞-1识别的黑色素瘤抗原/黑色素瘤抗原A)、MART-2(T细胞-2识别的黑色素瘤抗原)、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子基因)、间皮素、MG50/PXDN、MMP 11(M期磷蛋白11)、MN/CA IX-抗原、MRP-3(多药耐药相关蛋白3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2(粘蛋白2)、NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)、N-乙酰葡糖-氨基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP、NMP22、NPM/ALK(核仁磷蛋白/间变性淋巴瘤激酶融合蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1(纽约食管1)、NY-ESO-B、OA1(眼白化病1型蛋白)、OFA-iLRP(癌胎抗原-未成熟层粘连蛋白受体)、OGT(O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因)、OS-9、骨钙素、骨桥蛋白、p15(蛋白15)、p15、p190小bcr-abl、p53、PAGE-4(前列腺GAGE样蛋白-4)、PAI-1(纤溶酶原激活剂抑制剂1)、PAI-2(纤溶酶原激活剂抑制剂剂2)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1、PATE、PDEF、Pim-1激酶、Pin1(丙基异构酶)、POTE、PRAME(黑色素瘤的优先表达抗原)、prostein、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA、PSGR、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾抗原)、RHAMM/CD168(透明质酸介导运动受体)、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2(肾遍在蛋白1)、S-100、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(鳞状抗原排斥肿瘤1)、SART-2(鳞状抗原排斥肿瘤1)、SART-3(鳞状抗原排斥肿瘤1)、SCC(鳞状细胞癌抗原)、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(滑膜肉瘤X断点1)、SSX-2/HOM-MEL-40(滑膜肉瘤X断点)、SSX-4(滑膜肉瘤X断点4)、STAMP-1、STEAP(前列腺六段跨膜上皮抗原)、生存素g、生存素-2B(内含子2-保留的生存素)、TA-90、TAG-72、TARP、TGFb(TGFβ)、TGFbRII(TGFβ受体II)、TGM-4(前列腺特异性转谷氨酰胺酶)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关蛋白3)、TRG(testin相关基因)、TRP-1(酪氨酸相关蛋白1)、TRP-2/6b(TRP-2/新外显子6b)、TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子)、VEGFR-2/FLK-1(血管内皮生长因子受体-2)、WT1(Wilm氏肿瘤基因)，或可包含例如在癌症疾病中表达的突变抗原，其选自但不限于α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl(断点簇区-Abelson融合蛋白)、β-连环蛋白/m(β-连环蛋白)、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m(细胞周期分裂27)、CDK4/m(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN(融合蛋白)、EFTUD2/m、ELF2/m(延伸因子2)、ETV6-AML1(Ets变异基因6/急性髓系白血病1基因融合蛋白)、FN1/m(纤连蛋白1)、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I(HLA-A2基因中α2结构域的α螺旋的残基170处精氨酸与异亮氨酸交换)、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M(2-突变的热休克蛋白70)、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT(LDR-岩藻糖基转移酶融合蛋白)、MART2/m、MEl/m、MUM-1/m(黑色素瘤普遍突变1)、MUM-2/m(黑色素瘤普遍突变2)、MUM-3/m(黑色素瘤普遍突变3)、肌球蛋白I类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa(早幼粒细胞白血病/维甲酸受体α)、PRDXS/m、PTPRK/m(受体型蛋白酪氨酸磷酸酶κ)、RBAF600/m、SIRT2/m、SYT-SSX-1(突触结合蛋白I/滑膜肉瘤X融合蛋白)、SYT-SSX-2(突触结合蛋白I/滑膜肉瘤X融合蛋白)、TEL-AML1(易位Ets家族白血病/急性髓系白血病1融合蛋白)、TGFbRII(TGFβ受体II)和TPI/m(丙糖磷酸异构酶)。
B.连接子
连接子序列可包括在多肽中。例如，具有至少、至多或恰好3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或多于100个氨基酸(或其中任何可衍生的范围)的连接子可分隔肿瘤靶向剂、TLR激动剂、共聚物和/或白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白多肽和肿瘤靶向剂之间存在连接子。
在一些实施方案中，白蛋白多肽、TLR激动剂、共聚物、胶原结合域、肿瘤靶向剂和/或抗体共价连接。例如，TLR激动剂可与胶原结合域或抗体或抗原结合片段共价连接。在一些实施方案中，胶原结合域与白蛋白多肽共价连接。在一些实施方案中，连接子位于TLR激动剂和靶向剂和/或白蛋白多肽之间。在一些实施方案中，白蛋白多肽与靶向剂共价连接。在一些实施方案中，连接子位于白蛋白多肽和靶向剂之间。在一些实施方案中，连接子包括双官能连接子。可在肽和/或抗体或抗体片段序列之间插入连接子，例如氨基酸或拟肽序列。连接子可具有一种或多于一种特性，包括灵活的构象、无法形成有序的二级结构或疏水或带电的特性，这些特性可促进任一结构域或与任一结构域相互作用。通常在柔性蛋白质区域中发现的氨基酸的实例可包括Gly、Asn和Ser。例如，合适的肽连接子可以是或包含GGGS(SEQ ID NO:15)、GGGSGGGS(SEQ ID NO:9)或(GGGS)n(SEQ ID NO:10)，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可衍生的任何范围)。其他接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala，也可用于连接子序列中。连接子序列的长度可变化而不显著影响融合蛋白的功能或活性(参见例如，美国专利第6087329号)。在一个特定方面，连接子可以是至少、至多或恰好4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸残基(或其中可衍生的任何范围)。连接子的实例还可包括化学部分和缀合剂，例如磺基-琥珀酰亚胺衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)和酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)。连接子的实例还包括线性碳链，例如CN(其中N＝1个至100个碳原子)。在一些实施方案中，连接子可以是二肽连接子，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)连接子，或马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(vc)连接子。在一些实施方案中，连接子是磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸盐/酯(smcc)。磺基-smcc缀合通过与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生，而其磺基-NHS酯对伯胺(如在赖氨酸和蛋白质或肽的N-末端发现的)有反应性。此外，连接子可以是马来酰亚胺基己酰(mc)。在一些实施方案中，共价连接可通过使用Traut试剂实现。
C.白蛋白
在一些实施方案中，白蛋白多肽来自小鼠。在一些实施方案中，白蛋白多肽来自人类。
在一些实施方案中，白蛋白多肽可包含与具有以下序列的多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性(或其中任何可衍生的范围)的多肽或片段：
Figure BDA0003496477400000441
在一些实施方案中，白蛋白多肽可包含与具有以下序列的多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性(或其中任何可衍生的范围)的多肽或片段：
Figure BDA0003496477400000442
在一些实施方案中，白蛋白多肽可包含与具有以下序列的多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性(或其中任何可衍生的范围)的多肽或片段：
Figure BDA0003496477400000451
在一些实施方案中，白蛋白多肽可包含与具有以下序列的多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中任何可衍生的范围)的多肽或片段：
Figure BDA0003496477400000452
D.TLR激动剂
1.包含TLR激动剂的共聚物
在一个实施方案中，公开具有结构(I)的共聚物：
Figure BDA0003496477400000461
其中A不存在或包括至少一个结合抗原呈递细胞(APC)甘露糖受体的基团或包括结合甘露糖的C型凝集素；Z包括至少一种Toll样受体(TLR)激动剂；W和Y各自独立地是聚合物的单体单元；m是1至100000、5至50000、5至10000、5至1000、10至500。在一些实施方案中，m是10至150，p是1至100000、1至50000、1至10000、1至1000、1至100、1至50、1至20。应该理解，m和p是整数。一方面，A是可衍生自甘露糖和N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺的含甘露糖的化合物。在共聚物(I)的另一方面，Z具有一般结构(II)：
Figure BDA0003496477400000462
其中X是与TLR激动剂和Y键合的连接子。X可以是杂原子、脂族基团、经取代的脂族基团、烷氧基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、苄基、经取代的苄基、杂芳基、经取代的杂芳基、它们的任意组合，或是共价键。在一个特定方面，TLR激动剂是TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂或其任何组合，并且TLR激动剂具有一般结构(III)：
Figure BDA0003496477400000463
其中R1和R2各自独立地是氢原子、卤素、烷基、经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基和烷氧基烷氧基烷基、氨基或羟基。一方面，R2是游离胺(-NH2)，R1是烷基或烷氧基，优选地烷氧基烷基是乙氧基甲基(-CH2OCH2CH3)。在一个实例中，X(结构(II))是经取代的基，Z是：
Figure BDA0003496477400000471
在另一个实例中，X是经取代的苄基，Z是：
Figure BDA0003496477400000472
在结构(III)的TLR激动剂的另一方面，R2是游离胺(-NH2)，R1是C1-C6烷基，优选正丁基。在一个实例中，X是经取代的杂烷基，Z是：
Figure BDA0003496477400000473
其中q是约1至100、约1至50、约2至20，优选约2至9。
在另一个实施方案中，共聚物包括末端单元，其中末端单元各自独立地是聚合物的残基、连接子、免疫调节剂或其组合，并且共聚物具有一般结构(IV)：
Figure BDA0003496477400000474
其中E和Q是末端单元，其中E和Q各自独立地是聚合物的残基、连接子、免疫调节剂或其任意组合。一方面，E或Q中的至少一个是至少一个连接子。连接子可以是包含叠氮化物的连接子。包含叠氮化物的连接子可以是：
Figure BDA0003496477400000481
在另一方面，E或Q是免疫调节剂并且免疫调节剂是抗原、TLR或其任何组合。在某些方面，免疫调节剂是通过连接子与聚合物共价连接的抗原，其中连接子是自牺牲连接子并且连接子是：
Figure BDA0003496477400000482
在又一方面，W和Y各自独立地是聚丙烯酸酯的单体单元，例如聚(丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚丙烯酰胺、饱和聚烯烃、聚酰胺例如聚(丙烯酰胺)或聚(甲基丙烯酰胺)、肽、多肽、通过开环易位聚合形成的不饱和烯烃、硅氧烷、聚硅氧烷、聚醚、多糖、聚噁唑啉例如聚(乙基噁唑啉)、聚亚胺例如聚(乙烯亚胺)、聚乙烯基衍生物例如聚(乙烯基醇)和聚(乙烯基吡咯烷酮)，或其任何组合，并且共聚物(I)是：
Figure BDA0003496477400000483
其中m是1至100000，p是1至100000，g是1至100。
在一个实例中，R1是乙氧基甲基(-CH2OCH2CH3)，R2是游离胺(-NH2)。在另一个实例中，共聚物(I)是：
Figure BDA0003496477400000491
其中q是1至100、1至50、2至20、2至9。在一个实例中，R1是正丁基或乙氧基甲基(-CH2OCH2CH3)，R2是游离胺(-NH2)。如本文所述的共聚物(I)的p:m比率是约10:90至约20:80及其间的任何范围，包括11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82和19:81，优选约16:84。平均分子量是约30kDa至约80kDa及其间的任何重量，包括约31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79(以及其中可衍生的任何范围)；在一个实施方案中，平均分子量是约34kDa。
在一些实施方案中，共聚物(I)还可包含重复单元(V)：
Figure BDA0003496477400000492
其中Y″是与W或Y连接的聚合物的单体单元；Z′包含至少一种TLR激动剂；p′是1至100000、1至50000、1至10000、1至1000、1至100、1至50，在具体实施方案中，p′是1至20。Y′可为如下物质的单体单元：聚丙烯酸酯例如聚(丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚丙烯酰胺、饱和聚烯烃、聚酰胺例如聚(丙烯酰胺)或聚(甲基丙烯酰胺)、肽、多肽、通过开环易位聚合形成的不饱和烯烃、硅氧烷、聚硅氧烷、聚醚、多糖、聚噁唑啉例如聚(乙基噁唑啉)、聚亚胺例如聚(乙烯亚胺)、聚乙烯衍生物例如聚(乙烯基醇)和聚(乙烯基吡咯烷酮)，或其任何组合。
本文还公开包括上述共聚物的组合物。在一个实施方案中，组合物还包括抗原并且抗原可以与共聚物(I)、(IV)或(V)可操作地连接。或者，抗原可通过连接子共价连接至化合物或非共价连接至聚合物。在组合物的一些方面，使用具有选自胺、叠氮化物、炔烃和N-琥珀酰亚胺碳酸酯的官能团的双官能连接子将抗原共价连接至共聚物。在一个特定方面，连接子是自牺牲连接子并且可以是：
Figure BDA0003496477400000501
在其他实施方案中，公开具有一般结构(VI)的单体：
Figure BDA0003496477400000502
其中R1和R2各自独立地是氢原子、卤素、烷基、经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基，芳基、经取代的芳基；R3是包含可聚合基团Y′的配体。在一个实例中，R2是游离胺(-NH2)，R1是烷基或烷氧基，优选R1是C1至C6烷基或正丁基，或者R1是乙氧基甲基(-CH2OCH2CH3)。在另一个实例中，单体的R3配体还含有杂原子、脂族基团、经取代的脂族基团、烷氧基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、苄基、经取代的苄基、杂芳基、经取代的杂芳基。在一个实施方案中，R3配体是经取代的苄基并且R3具有以下的一般结构：
Figure BDA0003496477400000503
在一方面，Y′包括烯烃并且单体(VI)是：
Figure BDA0003496477400000511
在另一个实施方案中，R3配体是OR5，其中R5是包括Y′的经取代的脂族基团，并且单体(VI)具有以下的一般结构：
Figure BDA0003496477400000512
其中q是1至100、1至50、2至20或2至9。在一方面，Y′包括烯烃且单体(VI)是：
Figure BDA0003496477400000513
在一些实施方案中，公开包含单体(VI)的共聚物。共聚物还可包括第二单体单元，其中第二单体基团包括至少一个与APC甘露糖受体连接的基团，所述APC甘露糖受体与可聚合基团连接。在这种情况下，共聚物具有一般结构(VII)：
Figure BDA0003496477400000521
其中W是聚合物的单体单元；Y是可聚合基团Y′的单体单元；m是1至100000、5至50000、5至10000、5至1000、10至500、10至150，p是1至100000、1至50000、1至10000、1至1000、1至100、1至50、1至20。在一个特定方面，W是N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺衍生物的衍生物。共聚物(VII)还可包含抗原并且抗原可共价结合至共聚物。
在其他实施方案中，公开含有单体(VI)的聚合物。聚合物是通过Y′聚合形成的，聚合物具有一般结构(VIII)：
Figure BDA0003496477400000522
其中o是2至100000、2至50000、2至10000、2至1000、2至100、2至50或2至20，Y是Y′聚合的产物。在一种情况下，聚合物(VIII)是：
Figure BDA0003496477400000523
在另一种情况下，聚合物(VIII)是：
Figure BDA0003496477400000531
其中q是1至100、1至50、2至20或2至9。一方面，聚合物(VIII)可与APC靶向分子可操作地连接，并且APC靶向分子可以是含甘露糖化合物。在特定方面，聚合物(VIII)与含甘露糖化合物共价连接，并且含甘露糖化合物衍生自甘露糖和N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺。聚合物(VIII)也可与含甘露糖化合物共价连接形成共聚物，所述共聚物具有一般结构(VII)：
Figure BDA0003496477400000532
其中W是可聚合单元；m是1至100000、5至50000、5至10000、5至1000、10至500或10至150。聚合物(VII)还可进一步包括抗原并且抗原可共价连接。在另一方面，上述任何共聚物可以是嵌段共聚物、交替共聚物或无规共聚物。
在一种应用中，连接子包括用于分子缀合反应的化合物，从而在蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽、蛋白质-聚合物、聚合物-小分子、肽/蛋白质-小分子相互作用、用于测定或纯化的固定以及各种肽-核酸和核酸-核酸缀合物等中提供结构稳定性或帮助。通常，连接子包含官能团，例如伯胺、巯基、酸、醇、叠氮化物、炔烃和卤化物。具体地，与胺反应的马来酰亚胺(巯基反应性)和琥珀酰亚胺酯(NHS)或异硫氰酸酯(ITC)基团可用于本实施方案中。
在一个实施方案中，双官能连接子可用作治疗或诊断部分与聚合物之间的潜在间隔区。在一个方面，选择潜在间隔区(latency)使得双官能连接子的第一连接基团(官能团)可在第二连接基团的存在下选择性地缀合。在另一方面，可选择潜在间隔区使得在双官能连接子上的两个连接基团缀合之后，一个基团可选择性地裂解。例如，间隔区-聚合物键的水解可以限制治疗或诊断部分从聚合物前药中释放的速率。治疗或诊断部分从聚合物前药的裂解和释放可在体内发生，例如通过酶促或非酶促水解机制，使用连接基团例如酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺(腙)、酰胺、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯基砜、缀合C＝C双键、环氧基、醛、酮、硅烷或硅氧烷官能团。在本领域技术人员的能力范围内，理解使用含水水解从聚合物前药中释放治疗或诊断部分取决于多种因素，例如键的水合、离去基团的性质和键周围的空间拥塞。底物特异性、亲水性和空间拥塞都会影响酶敏感键的释放，并且对本文公开的具体实施方案进行的细微改变仍然可获得相同结果而不背离本发明的精神和范围。在某些方面，双官能连接子可首先通过双官能连接子上的第一官能团与本发明的共聚物和聚合物缀合，然后产物可通过双官能连接子上的第二官能团进一步缀合。一旦双官能连接子的两个官能团缀合，衍生自双官能连接子的部分可称为连接基团或连接子。在本发明的聚合缀合疫苗的制备中用作双官能连接子的包含任何上述官能团的示例性化合物可包括炔-PEG5-酸、N-烯丙氧羰基-1,4-丁二胺盐酸盐、N-烯丙氧羰基-1,6-己二胺盐酸盐、烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基硅烷、6-(烯丙氧基羰基氨基)-1-己醇、3-(烯丙氧基羰基氨基)-1-丙醇、4-氨基丁醛二乙基乙缩醛、(E)-N-(2-氨基乙基)-4-{2-[4-(3-叠氮基丙氧基)苯基]二氮烯基}苯甲酰胺盐酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐、氨基-PEG4-炔烃、N-(3-羟丙基)氨基甲酸苄酯、4-(Boc-氨基)-1-丁醇、4-(Boc-氨基)丁基溴、2-(Boc-氨基)乙硫醇、2-[2-(Boc-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸、(二环己基铵)盐、2-(Boc-氨基)乙基溴、6-(Boc-氨基)-1-己醇、21-(Boc-氨基)-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷酸、6-(Boc-氨基)己基溴、5-(Boc-氨基)-1-戊醇、3-(Boc-氨基)-1-丙醇、3-(Boc-氨基)丙基溴、15-(Boc-氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷酸、N-Boc-1,4-丁二胺、N-Boc-尸胺、N-Boc-乙醇胺、N-Boc-乙二胺、N-Boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺、N-Boc-1,6-己二胺、N-Boc-1,6-己二胺盐酸盐、N-Boc-4-异硫氰酰基苯胺、N-Boc-4-异硫氰酰基丁胺、N-Boc-2-异硫氰酰基乙胺、N-Boc-3-异硫氰酰基丙胺、N-Boc-N-甲基乙二胺、N-Boc-间苯二胺、N-Boc-对苯二胺、2-(4-Boc-1-哌嗪基)乙酸、N-Boc-1,3-丙二胺、N-Boc-1,3-丙二胺、N-Boc-N'-琥珀酰-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺、N-Boc-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺、N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、4-溴丁酸、4-溴丁酰氯、4-溴丁酰氯、N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺、6-溴-1-己醇、3-(溴甲基)苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、4-(溴甲基)苯基异硫氰酸酯、8-溴辛酸、8-溴-1-辛醇、4-(2-溴丙酰基)苯氧基乙酸、N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺、4-(叔丁氧基甲基)苯甲酸、2-(4-{[4-(3-叠氮基丙氧基)苯基]偶氮}苯甲酰氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯、2-[2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)乙氧基]乙胺、4-羟基丁酸叔丁酯、水合三氯乙醛、4-(2-氯丙酰基)苯乙酸、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷、二-Boc-胱胺、二乙二醇单烯丙基醚、3,4-二氢-2H-吡喃-2-甲醇、4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸、4-(二苯基羟甲基)苯甲酸、4-(Fmoc-氨基)-1-丁醇、2-(Fmoc-氨基)乙醇、2-[2-(Fmoc-氨基)乙氧基]乙胺盐酸盐、2-(Fmoc-氨基)乙基溴、6-(Fmoc-氨基)-1-己醇、5-(Fmoc-氨基)-1-戊醇、3-(Fmoc-氨基)-1-丙醇、3-(Fmoc-氨基)丙基溴、N-Fmoc-2-溴乙胺、N-Fmoc-1,4-丁二胺氢溴酸盐、N-Fmoc-尸胺氢溴酸盐、N-Fmoc-乙二胺氢溴酸盐、N-Fmoc-1,6-己二胺氢溴酸盐、N-Fmoc-1,3-丙二胺氢溴酸盐、N-Fmoc-N″-琥珀酰-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺、(3-甲酰-1-吲哚基)乙酸、6-胍基己酸、4-羟基苄醇、N-(4-羟基丁基)三氟乙酰胺、4'-羟基-2,4-二甲氧基二苯甲酮、N-(2-羟乙基)马来酰亚胺、4-[4-(1-羟乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸、N-(2-羟乙基)三氟乙酰胺、N-(6-羟基己基)三氟乙酰胺、4-羟基-2-甲氧基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苄基醇、4-(羟甲基)苯甲酸、4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基乙酸、4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸、4-(羟甲基)苯氧基乙酸、3-(4-羟甲基苯氧基)丙酸、N-(5-羟基戊基)三氟乙酰胺、4-(4'-羟基苯基偶氮)苯甲酸、N-(3-羟丙基)三氟乙酰胺、2-马来酰亚胺乙基甲磺酸酯、4-巯基-1-丁醇、6-巯基-1-己醇、4-(溴甲基)苯乙酸苯甲酰甲酯、4-(溴甲基)苯乙酸苯甲酰甲酯、4-胺磺酰苯甲酸、4-胺磺酰基丁酸、N-三苯甲基-1,2-乙二胺氢溴酸盐、4-(Z-氨基)-1-丁醇、6-(Z-氨基)-1-己醇、5-(Z-氨基)-1-戊醇、N-Z-1,4-丁二胺盐酸盐、N-Z-乙醇胺、N-Z-乙二胺盐酸盐、N-Z-乙二胺盐酸盐、N-Z-1,6-己二胺盐酸盐、N-Z-1,5-戊二胺盐酸盐和N-Z-1,3-丙二胺盐酸盐。用于将三个单独分子连接在一起的三官能连接子的非限制性实例包括N1,N4-双-Boc-亚精胺、N1,N5-双-Boc-亚精胺、N-Boc-二乙醇胺、N1-Boc-2,2'-亚氨基二乙胺、N-Boc-亚氨基二丙酸、N1-Boc-3,3'-亚氨基二丙胺、N,N"-Di-Z-二亚乙基三胺。在特定方面，双官能连接子包含自由基缀合官能团，例如在2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸酯中发现的，其可首先在聚合反应(即可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合)中与单体缀合以提供叠氮化物官能化试剂。然后可在随后的缀合反应中使用叠氮化物试剂以制备聚合物缀合疫苗或聚合物缀合疫苗前体。上述双官能和三官能连接子的商业来源的非限制性实例是Sigma
Figure BDA0003496477400000561
(U.S.A)。
在其他实施方案中，公开了使用抗原的位点特异性控制释放的方法的聚合物组合物。所述聚合物和方法为涉及药物输送、生物和化学传感器以及诊断的各种应用提供了动力。可用于本实施方案的一种此类新型底物-聚合物连接部分包括自牺牲连接子。自牺牲连接子利用保护基团和离去基团之间的稳定键的聚合物释放，其在活化后变得不稳定，导致母体聚合物通过电子级联、树枝状聚合物或聚合物分解或者化学增幅性释放(chemicalamplified release)快速分解。化学增幅剂是将单个键断裂事件转化为大量化学输出的释放的结构。通过这种方式，单键裂解输入反应(例如，由分析物、光子或酶触发的反应)可转化为大量输出化学物质的释放。输出可采用报告分子(例如荧光染料)、生物分子、抗原或药物的形式。本实施方案包括自牺牲连接子技术，其包含触发单元、连接子单元和效应器单元，例如用于无毒前药中以增强癌症化学疗法的选择性，即，使用单克隆抗体来特异性递送高效的缀合小分子疗法至癌细胞。在另一个方面，自牺牲连接子如PABC或PAB(对氨基苄氧羰基)和衍生物是通过连接羧基末端和PAB或衍生物的对氨基苄基形成的自牺牲电子级联连接子，并且在酶促、水解、或其他代谢情况下可裂解。芳族对位胺成为电子供体并且引发电子级联，导致离去基团通过1,6-消除和片段化而排出，其在消除二氧化碳后可成为游离胺抗原。在一个实例中，组织蛋白酶B是细胞内普遍存在的半胱氨酸蛋白酶，但病理状况下除外，例如转移性肿瘤或类风湿性关节炎。用组织蛋白酶B可裂解连接子产生的PABC和衍生缀合物在血液循环中是稳定的。在与PABC相邻的肽键裂解后，即通过细胞内酶作用后，游离胺抗原被释放。另一方面，与顺式乌头酸酐形成的顺式乌头酰胺也可通过受邻甲酰胺苯甲酸保护的酰胺在酸性条件下(pH 5)的水解影响的电子机制释放游离胺抗原。2-硝基咪唑-5-基甲基基团也可在本实施方案中用作片段化抗原单元。
在某些实施方案中，自牺牲连接子通过连接的二硫键的还原裂解起作用，其激活连接子上的触发单元，从而导致1,4-分子内环化的弹回(snapback)、二氧化碳的消除和游离抗原的释放。一个实例包括用于美登木素生物碱(DM1和DM4)的抗体-美登木素生物碱缀合物的携带二硫化物的4-巯基戊酸酯连接子。预期其他自牺牲连接子利用二硫化物的裂解与使用酯或乙烷-1,1-二醇4-氧甲基-苯氧基连接的衍生物的1,6-消除机制的组合，如下所示：
Figure BDA0003496477400000571
在特定方面，本发明的自牺牲连接子包含允许通过逐步反应缀合以将叠氮化物官能团连接至抗原的胺的官能团。
不受理论的限制，本发明还包括化学生物学中使用的所有可裂解连接子，根据它们通过酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光辐射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化试剂的裂解条件来分类。
2.式(VI)化合物
在一些实施方案中，TLR激动剂包含如下所述的式VI化合物。在一个实施方案中，提供低毒性、小分子Toll样受体(TLR)-7和/或TLR-8咪唑并喹啉配体作为具有降低的疏水性(cLogP)和增加的活性的疫苗佐剂用于疫苗制剂中。在一个实施方案中，TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR7/8激动剂单体具有一般结构(VI)：
Figure BDA0003496477400000572
其中R1和R2各自独立地是氢原子、卤素、烷基、经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、芳基或经取代的芳基；R3是包含可聚合基团Y′的配体。
用于本实施方案的一般结构(VI)的咪唑并喹啉化合物的非限制性实例使用各种商购可得酸性氯化物容易得出(例如，替代本文图2步骤vi中描述的合成方案中的(14))，包括2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-异丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-环丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-仲丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-环丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(氧杂环丁烷-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(氧杂环丁烷-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-环戊基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(四氢呋喃-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯(TLR-7-乙氧基-甲基丙烯酰胺(TLR-MA,3))、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-羧酸、4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-羧酸甲酯、4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-羧酸乙酯、2-(4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)乙酸、2-(4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)乙酸甲酯、2-(4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)乙酸乙酯、3-(4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)丙酸、3-(4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)丙酸甲酯、3-(4-氨基-1-(4-(((2-甲基丙烯酰胺基乙氧基)羰基氨基)甲基)苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)丙酸乙酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噻唑-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噻唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(异噻唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(异噻唑-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(异噻唑-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噻唑-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噁唑-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(异噁唑-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(异噁唑-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(呋喃-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(呋喃-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噻吩-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噻吩-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噁唑-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(噁唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(异噁唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(吡啶-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(吡啶-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(嘧啶-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(吡嗪-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(哒嗪-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(哒嗪-4-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯、2-甲基丙烯酰胺基乙基4-((4-氨基-2-(嘧啶-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基氨基甲酸酯及其衍生物。还公开了式(1)的化合物，其中R3＝OR5。示例性咪唑并喹啉衍生物还包括：N-(3-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)丙基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)丁基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)戊基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)己基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)庚基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)辛基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)壬基)甲基丙烯酰胺、N-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基氧基)癸基)甲基丙烯酰胺以及含有上述4位和2位咪唑并喹啉取代基的含有N-O键的结构及其衍生物。与图2(步骤vii)中安装的上述各种2-取代的咪唑并喹啉衍生物共有的4-氨基，可以是能够与4-取代的杂芳基氯化物进行亲核芳族取代(SNAr)反应的任何其他亲核试剂，例如氢氧化物、甲胺、二甲胺、乙胺、甲基乙胺、丙胺、氮杂环丁烷、环丙胺、吡咯烷等。或者，4-取代的杂芳基氯化物可通过氢或自由基脱卤反应由氢替代或作为连接配偶体参与过渡金属催化的碳-碳键形成反应。
在本公开的选择的实施方案中，任何公开的TLR激动剂单体可与包含至少一个结合抗原呈递细胞(APC)甘露糖受体的基团的另一种单体连接，作为聚合物、均聚物、共聚物、共聚共混物、三元共聚物、四元共聚物或低聚物等，并且可存在于组合物中，并缀合至例如抗原。任何共聚物可以是嵌段共聚物、交替共聚物或无规共聚物。优选地，本发明的化合物、共聚物和聚合物是亲水的。可用于本文实施方案的水溶性聚合物的非限制性实例包括聚丙烯酸酯例如聚(丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚酰胺例如聚(丙烯酰胺)或聚(甲基丙烯酰胺)、多糖、聚噁唑啉例如聚(乙基噁唑啉)、聚亚胺例如聚(乙烯亚胺)，以及聚乙烯基衍生物例如聚(乙烯基醇)或聚(乙烯基吡咯烷酮)。连接单体形成聚合物、均聚物、共聚物、聚合共混物、三元共聚物、四元共聚物或低聚物以及与例如本实施方案中公开的抗原的缀合，可利用合成有机技术使用可聚合和可连接基团来实现，基于本公开内容，这对于本领域技术人员来说是明显的。在实施例部分中提供了制备本发明的化合物、共聚物和聚合物的非限制性实例。
3.其他TLR激动剂
在一些实施方案中，式I的共聚物与TLR激动剂可操作地连接。在一些实施方案中，TLR激动剂是如本文所述的通式(VI)的化合物。在一些实施方案中，TLR激动剂是本领域已知的和/或本文所述的一种。TLR激动剂可包括针对以下的激动剂：TLR1(例如，肽聚糖或三酰基脂蛋白)、TLR2(例如，脂磷壁酸；来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌0111:B4、大肠杆菌K12或金黄色葡萄球菌的肽聚糖；非典型脂多糖(LPS)，例如钩端螺旋体病LPS和牙龈卟啉单胞菌LPS；合成的二酰化脂蛋白，例如FSL-1或Pam2CSK4；来自耻垢分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖或脂甘露聚糖；三酰化脂蛋白例如Pam3CSK4；脂蛋白，例如来自支原体的MALP-2和MALP-40；伯氏疏螺旋体OspA；来自脑膜炎奈瑟菌或流感嗜血杆菌的孔蛋白；痤疮丙酸杆菌抗原混合物；耶尔森氏菌LcrV；来自分枝杆菌或结核分枝杆菌的脂甘露聚糖；克氏锥虫GPI锚定点；曼氏血吸虫溶血磷脂酰丝氨酸；利什曼原虫主要脂磷酸聚糖(LPG)；恶性疟原虫糖基磷脂酰肌醇(GPI)；酵母聚糖；来自烟曲霉或白色念珠菌的抗原混合物；和麻疹血细胞凝集素)、TLR3(例如，双链RNA、聚腺苷酸-聚尿苷酸(Poly(A:U))；聚肌苷-聚胞苷酸(Poly(I:C))；高分子量聚肌苷-聚胞苷酸(Poly(I:C)HMW)；和低分子量聚肌苷-聚胞苷酸(Poly(I:C)LMW))、TLR4(例如，来自大肠杆菌和沙门氏菌属的LPS)；TLR5(例如来自枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌或鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白)、TLR8(例如单链RNA，例如具有6UUAU重复序列的ssRNA、RNA均聚物(裸露ssPolyU)、HIV-1LTR衍生的ssRNA(ssRNA40)或具有2个GUCCUUCAA重复序列的ssRNA(ssRNA-DR))、TLR7(例如咪唑喹啉化合物咪喹莫特、Imiquimod VacciGradeTM、Gardiquimod VacciGradeTM或GardiquimodTM；腺嘌呤类似物CL264；碱基类似物CL307；鸟苷类似物洛索立宾；TLR7/8(例如，噻唑并喹啉化合物CL075；咪唑并喹啉化合物CLO97、R848或R848 VacciGradeTM)、TLR9(例如，CpG ODN)；和TLR11(例如，刚地弓形虫抑制蛋白)。在某些实施方案中，TLR激动剂是上述特定的激动剂。在其他实施方案中，TLR激动剂是特异性激动一种TLR或两种TLR的激动剂。
在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR7、TLR8或TLR7/8激动剂。TLR激动剂可以是相同TLR激动剂的多个(聚合)分子或可以是连接的不同TLR激动剂的混合物。TLR激动剂可通过本领域已知和/或本文所述的方法连接或聚合。在一些实施方案中，化合物(例如，TLR激动剂)是水溶性的。水溶性影响化合物的贮藏寿命、稳定性和药物组成。由于TLR7和TLR8的结构，大多数TLR7和/或TLR8激动剂难溶于水。然而，式(I)化合物具有水溶性的优点。
III.另外的疗法
A.免疫疗法
在一些实施方案中，方法包括施用癌症免疫疗法。癌症免疫疗法(有时称为免疫肿瘤学，缩写为IO)是利用免疫系统来治疗癌症。免疫疗法可分为主动、被动或混合(主动和被动)。这些方法利用如下事实，即癌细胞表面通常有可以被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(例如糖类)。主动免疫疗法通过靶向TAA来引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤应答，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。可用于本公开的方法的免疫疗法描述如下。
1.检查点抑制剂和组合治疗
本公开的实施方案可包括施用免疫检查点抑制剂(也称为检查点抑制剂疗法)，其在下文进一步描述。
b.PD-1、PDL1和PDL2抑制剂
PD-1可在T细胞遇到感染或肿瘤的肿瘤微环境中起作用。激活的T细胞上调PD-1并且继续在外周组织中表达它。细胞因子如IFN-γ诱导PDL1在上皮细胞和肿瘤细胞上的表达。PDL2在巨噬细胞和树突状细胞上表达。PD-1的主要作用是限制外周中效应T细胞的活性，防止免疫应答过程中对组织的过度损伤。本公开的抑制剂可阻断PD-1和/或PDL1活性的一种或多于一种功能。
“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PDL1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PDL1和PDL2是人PD-1、PDL1和PDL2。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1抑制剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2抑制剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性的抗体描述于美国专利第8735553号、第8354509号和第8008449号中，其均通过引用并入本文。用于本文提供的方法和组合物中的其他PD-1抑制剂是本领域已知的，例如美国专利申请第US2014/0294898号、第US2014/022021号和第US2011/0008369号中描述的，其均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和匹地利珠单抗(pidilizumab)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PDL1抑制剂包括AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003496477400000631
是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck 3475、帕博利珠单抗、
Figure BDA0003496477400000632
和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。匹地利珠单抗，也称为CT-011、hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。其他PD-1抑制剂包括MEDI0680，也称为AMP-514和REGN2810。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PDL1抑制剂，例如度伐利尤单抗(durvalumab)(也称为MEDI4736)、阿特珠单抗(atezolizumab)(也称为MPDL3280A)、阿维鲁单抗(avelumab)(也称为MSB00010118C、MDX-1105、BMS-936559)或其组合。在某些方面，免疫检查点抑制剂是PDL2抑制剂，例如rHIgM12B7。
在一些实施方案中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及纳武单抗、派姆单抗或匹利地珠单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体竞争结合和/或结合上述抗体的PD-1、PDL1或PDL2上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中任何可衍生的范围)的可变区氨基酸序列同一性。
c.CTLA-4、B7-1和B7-2
可用于本文提供的方法中的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，当与抗原呈递细胞表面上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，在辅助性T细胞表面表达并且向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，两个分子均与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中，可能对其功能是重要的。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致B7分子的抑制性受体CTLA-4的表达增加。本公开的抑制剂可阻断CTLA-4、B7-1、和/或B7-2活性的一种或多于一种功能。在一些实施方案中，抑制剂阻断CTLA-4和B7-1相互作用。在一些实施方案中，抑制剂阻断CTLA-4和B7-2相互作用。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本方法的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于如下中的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中：US 8119129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；原名替西木单抗(ticilimumab))、美国专利第6207156号；Hurwitz等人,1998。前述出版物中各自的教导内容在此通过引用并入。也可使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利第8017114号；其均通过引用并入本文。
在本公开的方法和组合物中用作检查点抑制剂的其他抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003496477400000651
)或其抗原结合片段和变体(参见例如，WO01/14424)。
在一些实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及曲美木单抗或伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体竞争结合和/或结合上述抗体的PD-1、B7-1或B7-2上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中任何可衍生的范围)的可变区氨基酸序列同一性。
2.共刺激分子的抑制剂
在一些实施方案中，免疫疗法包含共刺激分子的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包括如下的抑制剂：B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、ICOS、OX40(TNFRSF4)、4-1BB(CD137；TNFRSF9)、CD40L(CD40LG)、GITR(TNFRSF18)、TIM3、LAG3、VISTA及其组合。抑制剂包括抑制性抗体、多肽、化合物和核酸。
3.树突状细胞疗法
树突状细胞疗法通过使树突状细胞将肿瘤抗原呈递给淋巴细胞来激发抗肿瘤应答，淋巴细胞激活它们，促使它们杀死其他呈递抗原的细胞。树突状细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(APC)。在癌症治疗中，它们有助于癌症抗原靶向。基于树突状细胞的细胞癌症疗法的一个实例是sipuleucel-T。
诱导树突状细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是用自体肿瘤裂解物或短肽(与癌细胞上的蛋白质抗原相对应的蛋白质的小部分)进行疫苗接种。这些肽通常与佐剂(高免疫原性物质)组合以增加免疫和抗肿瘤应答。其他佐剂包括吸引和/或激活树突状细胞的蛋白质或其他化学物质，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
树突状细胞也可通过使肿瘤细胞表达GM-CSF来在体内激活。这可通过基因工程肿瘤细胞产生GM-CSF或用表达GM-CSF的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。
另一种策略是从患者血液中去除树突状细胞并且将其在体外激活。树突状细胞在肿瘤抗原存在时激活，肿瘤抗原可以是单个肿瘤特异性肽/蛋白质或肿瘤细胞裂解物(分解的肿瘤细胞的溶液)。将这些细胞(带有任选的佐剂)输注并且引发免疫应答。
树突状细胞疗法包括使用与树突状细胞表面上的受体结合的抗体。可将抗原添加到抗体中，并且可诱导树突状细胞成熟和提供对肿瘤的免疫力。
4.CAR-T细胞疗法
嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是工程化受体，将新的特异性与免疫细胞结合以靶向癌细胞。通常，这些受体将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。这些受体被称为嵌合体，因为它们由来自不同来源的部分融合而成。CAR-T细胞疗法是指使用这种转化细胞进行癌症治疗的治疗方法。
CAR-T细胞设计的基本原理涉及将抗原结合和T细胞激活功能结合的重组受体。CAR-T细胞的一般前提是人工生成针对癌细胞上发现的标志物的T细胞。科学家可从一个人身上取出T细胞，对它们进行基因改造，然后将它们放回患者体内，以便它们攻击癌细胞。一旦T细胞工程化为CAR-T细胞，它就会充当“活的药物”。CAR-T细胞在细胞外配体识别结构域与细胞内信号分子之间建立联系，其反过来激活T细胞。细胞外配体识别结构域通常是单链可变片段(scFv)。CAR-T细胞疗法安全性的一个重要方面是如何确保只有癌性肿瘤细胞被靶向，而不是正常细胞。CAR-T细胞的特异性通过靶向分子的选择来确定。
示例性的CAR-T疗法包括Tisagenlecleucel(Kymriah)和Axicabtageneciloleucel(Yescarta)。在一些实施方案中，CAR-T疗法靶向CD19。
5.细胞因子疗法
细胞因子是由存在于肿瘤内的多种细胞产生的蛋白质。它们可调节免疫应答。肿瘤经常使用它们来使其生长和降低免疫应答。这些免疫调节作用使它们能够用作激发免疫应答的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白细胞介素。
干扰素由免疫系统产生。它们通常参与抗病毒反应，但也可用于治疗癌症。它们分为三组：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。
白细胞介素具有一系列免疫系统作用。IL-2是示例性的白介素细胞因子疗法。在本公开内容的范围内还预想施用趋化因子疗法作为在本公开的方法中有用的免疫疗法。
6.过继性T细胞疗法
过继性T细胞疗法是一种通过输注T细胞(过继性细胞转移)进行被动免疫的形式。它们存在于血液和组织中，通常在它们发现外来病原体时激活。具体地，当T细胞的表面受体遇到在其表面抗原上展示部分外来蛋白质的细胞时，它们就会激活。这些可以是受感染的细胞，或抗原呈递细胞(APC)。它们存在于正常组织和肿瘤组织中，其中它们称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。它们在APC的存在下激活，例如呈递肿瘤抗原的树突状细胞。虽然这些细胞可攻击肿瘤，但肿瘤内的环境是高度免疫抑制的，从而防止免疫介导的肿瘤死亡。[60]
已开发多种产生和获得肿瘤靶向T细胞的方法。对肿瘤抗原呈特异性的T细胞可从肿瘤样本(TIL)中去除或从血液中过滤。随后的激活和培养离体进行，产物重新输注。激活可通过基因治疗或通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来进行。
预想癌症治疗可排除本文所述的任何癌症治疗。此外，本公开的实施方案包括先前已经接受过本文所述疗法治疗的患者、当前正在接受本文所述疗法治疗或尚未接受本文所述疗法治疗的患者。在一些实施方案中，患者是已确定对本文所述的疗法具有抗性的患者。在一些实施方案中，患者是已确定对本文所述的疗法敏感的患者。
B.溶瘤病毒
在一些实施方案中，另外的疗法包括溶瘤病毒。溶瘤病毒是优先感染和杀死癌细胞的病毒。当感染的癌细胞被溶瘤作用破坏时，溶瘤病毒释放新的传染性病毒颗粒或病毒粒子来帮助破坏剩余的肿瘤。认为溶瘤病毒不仅使得直接破坏肿瘤细胞，还刺激宿主的抗肿瘤免疫应答以进行长期免疫治疗。
C.多糖
在一些实施方案中，另外的疗法包括多糖。在蘑菇中发现的某些化合物，主要是多糖，可上调免疫系统并且可具有抗癌特性。例如，β-葡聚糖如香菇多糖已在实验室研究中显示可刺激巨噬细胞、NK细胞、T细胞和免疫系统细胞因子，并且已在临床试验中作为免疫佐剂进行研究。
D.新生抗原
在一些实施方案中，另外的疗法包括新生抗原施用。许多肿瘤表达突变。这些突变潜在地产生用于T细胞免疫疗法新的可靶向抗原(新生抗原)。使用RNA测序数据识别的癌症病变中CD8+ T细胞的存在，在具有高突变负荷的肿瘤中更高。在许多人类肿瘤中，与自然杀伤细胞和T细胞的细胞溶解活性相关的转录水平与突变负荷呈正相关。
E.化学疗法
在一些实施方案中，另外的疗法包括化学疗法。合适类别的化学治疗剂包括(a)烷基化剂，例如氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派)、烷基磺酸盐/酯(例如，白消安)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、chlorozoticin、链脲菌素)和三嗪(例如，达卡巴嗪)，(b)抗代谢药，例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮杂尿苷)和嘌呤类似物和相关物质(例如，6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、喷司他丁)，(c)天然产物，例如长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(例如，依托泊苷、替尼泊苷)、抗生素(例如，更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素和米托蒽醌)、酶(例如，L-天冬酰胺酶)和生物应答调节剂(例如，干扰素-α)，和(d)其他试剂，例如铂配合物(例如，顺铂、卡铂)、经取代的脲(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如甲苄肼)和肾上腺皮质抑制剂(例如紫杉醇和米托坦)。在一些实施方案中，顺铂是特别合适的化学治疗剂。
顺铂已广泛用于治疗癌症，例如转移性睾丸癌或卵巢癌、晚期膀胱癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺铂不能口服吸收，因此必须通过其他途径递送，例如静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射。顺铂可单独使用或与其他试剂组合使用，在某些实施方案中预期，临床应用中使用的有效剂量包括约15mg/m2至约20mg/m2，每三周施用5天，总共三个疗程。在一些实施方案中，与包含可操作地连接至编码治疗性多肽的多核苷酸的Egr-1启动子的构建体一起递送至细胞和/或对象的顺铂的量小于单独使用顺铂时递送的量。
其他合适的化学治疗剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“紫杉酚”)和盐酸阿霉素(“多柔比星”)。通过腺病毒载体递送的Egr-1启动子/TNFα构建体和阿霉素的组合确定可有效克服对化学疗法和/或TNF-α的耐药性，其表明构建体和阿霉素的组合治疗克服了对阿霉素和TNF-α的耐药性。
阿霉素吸收不良，优选静脉内施用。在某些实施方案中，成人的适当静脉内剂量包括约60mg/m2至约75mg/m2，间隔约21天，或约25mg/m2至约30mg/m2，每次连续2或3天，重复间隔约3周至约4周，或约20mg/m2，每周一次。当既往化疗或肿瘤性骨髓浸润引起了既往骨髓抑制时，或当药物与其他骨髓生成抑制药物组合时，对老年患者应该使用最低剂量。
氮芥是可用于本公开的方法的另一种合适的化学治疗剂。氮芥可包括但不限于二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺和/或异环磷酰胺、美法仑(左旋溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥。环磷酰胺(
Figure BDA0003496477400000691
可获自Mead Johnson，
Figure BDA0003496477400000692
可获自Adria)是另一种合适的化学治疗剂。成人的合适口服剂量包括例如约1mg/kg/天至约5mg/kg/天，静脉内剂量包括例如初始约40mg/kg至约50mg/kg，在约2天至约5天的时段内分次施用，或约10mg/kg至约15mg/kg，周期约每7天至约10天，或约3mg/kg至约5mg/kg，每周两次，或约1.5mg/kg/天至约3mg/kg/天。由于胃肠道不良反应，优选静脉途径。药物有时也通过肌肉注射、渗透或进入体腔施用。
其他合适的化学治疗剂包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-FU)和氟尿苷(氟脱氧尿苷；FudR)。5-FU可以约7.5mg/m2至约1000mg/m2的任何剂量施用于对象。此外，5-FU剂量方案可以针对多种时间段，例如至多六周，或由本公开所属领域的普通技术人员确定。
吉西他滨二磷酸酯(
Figure BDA0003496477400000693
Eli Lilly&Co.，“gemcitabine”)是另一种合适的化学治疗剂，其被推荐用于治疗晚期和转移性胰腺癌，因此在本公开中也可用于这些癌症。
递送给患者的化学治疗剂的量可以是可变的。在一个合适的实施方案中，当化学疗法与构建体一起施用时，化学治疗剂的施用量可以是引起宿主的癌症停止或消退的有效量。在其他实施方案中，化学治疗剂的施用量可以比化学治疗剂的化学治疗有效剂量小2至10000倍。例如，化学治疗剂可以以比化学治疗剂的化学治疗有效剂量少约20倍、约500倍或甚至约5000倍的量施用。可在体内测试本公开的化学治疗剂与构建体组合的所需治疗活性，以及确定有效剂量。例如，这种化合物可在人体测试之前在合适的动物模型系统中进行测试，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。体外测试也可用于确定合适的组合和剂量，如实施例中所述。
F.放射疗法
在一些实施方案中，另外的疗法或既往疗法包括辐射，例如电离辐射。如本文所用，“电离辐射”是指包含具有足够能量或可通过核相互作用产生足够能量以产生电离(电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射。示例性和优选的电离辐射是x-辐射。向靶组织或细胞递送x射线的方法是本领域公知的。
在一些实施方案中，电离辐射的量大于20Gy并且以单次剂量施用。在一些实施例中，电离辐射的量是18Gy并且以三次剂量施用。在一些实施方案中，电离辐射的量是至少、至多或恰好2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy、20Gy、21Gy、22Gy、23Gy、24Gy、25Gy、26Gy、27Gy、18Gy、19Gy、30Gy、31Gy、32Gy、33Gy、34Gy、35Gy、36Gy、37Gy、38Gy、39Gy、40Gy、41Gy、42Gy、43Gy、44Gy、45Gy、46Gy、47Gy、48Gy、49Gy或40Gy(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，电离辐射以至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次剂量(或其中任何可衍生的范围)施用。当施用多于一次剂量时，剂量可以是间隔约1小时、4小时、8小时、12小时或24小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天或1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14周或16周，或其中任何可衍生的范围。
在一些实施方案中，IR的量可以表示为IR的总剂量，其然后以分次剂量施用。例如，在一些实施方案中，总剂量是50Gy，分10次分次施用，每次5Gy。在一些实施方案中，总剂量是50Gy至90Gy，以20个至60个分次剂量施用，每次2Gy至3Gy。在一些实施方案中，IR的总剂量是至少、至多或约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140或150(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，总剂量以至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45或50Gy(或其中任何可衍生的范围)的分次剂量施用。在一些实施方案中，施用至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100次分次剂量(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，每天施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次(或其中任何可衍生的范围)分次剂量。在一些实施方案中，每周施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30次(或其中任何可衍生的范围)分次剂量。
G.外科手术
约60％癌症患者将接受某种类型的外科手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织进行物理去除、切除和/或破坏，并且可与其他疗法组合使用，例如本文实施方案中的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理切除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外手术和显微控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可通过灌注、直接注射或局部应用其他抗癌疗法来完成。这样的治疗可以重复，例如，每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1周、2周、3周、4周和5周或每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月重复一次。这些治疗也可具有不同剂量。
H.其他试剂
预想其他试剂可与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些另外的试剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的试剂、细胞生长抑制剂和分化试剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂或其他生物试剂。通过增加GAP连接的数量来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。预想细胞粘附抑制剂提高本实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预想增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂，例如抗体c225，可与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗功效。
IV.核酸
在某些实施方案中，存在编码本文所述多肽的重组核酸。
如在本申请中使用的，术语“多核苷酸”是指重组的或已经分离出不含总基因组核酸的核酸分子。术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(长度为100个残基或更少的核酸)、重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括与其天然存在的基因或蛋白质编码序列基本上分离的调节序列。多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是RNA、DNA(基因组、cDNA或合成的)、其类似物或其组合。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸中。
在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽(包括用于正确转录、翻译后修饰、定位所需的任何序列)的核酸。如本领域技术人员将理解的，该术语包括基因组序列、表达框、cDNA序列和较小的工程化核酸区段，其表达或可适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。编码全部或部分多肽的核酸可包含编码多肽的全部或部分的连续核酸序列。还预想特定多肽可由包含具有略微不同核酸序列但仍然编码相同或基本相似的蛋白质的变体的核酸编码(参见上文)。
在特定的实施方案中，存在分离的核酸区段和重组载体，其并入编码多肽(例如，聚合酶、RNA聚合酶、一个或多个截短的聚合酶结构域或作为多肽的相互作用组分)的核酸序列，当相互作用组分相互作用时，其驱动依赖于来自聚合酶结构域的聚合酶活性的基因转录。术语“重组”可与多肽或特定多肽的名称结合使用，这通常是指由已在体外操作的核酸分子产生的多肽或该分子的复制产物。
不论编码序列本身的长度如何，核酸区段都可以与其他核酸序列组合，例如启动子、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等，使得它们的总长度可能会有很大差异。因此预想可使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受在预期的重组核酸方案中制备和使用的容易性的限制。在一些情况下，核酸序列可编码具有另外异源编码序列的多肽序列，例如以允许多肽的纯化、转运、分泌、翻译后修饰，或用于治疗益处例如靶向或功效。如上所述，可向经修饰的多肽编码序列添加标签或其他异源多肽，其中“异源”是指与经修饰的多肽不相同的多肽。
在某些实施方案中，存在与本文公开的序列具有大量同一性的多核苷酸变体；与使用本文描述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)的本文提供的多核苷酸序列相比，其包括至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或高于99％的序列同一性，包括其间的所有值和范围。在某些方面，分离的多核苷酸将包含编码多肽的核苷酸序列，其与本文描述的氨基酸序列在序列的整个长度上具有至少90％、优选95％及高于95％的同一性；或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
A.载体
多肽可由核酸分子编码。核酸分子可以是核酸载体的形式。术语“载体”用于指载体核酸分子，向其中可插入异源核酸序列以引入到细胞中，其中它可进行复制和表达。核酸序列可以是“异源的”，其意指它在引入载体的细胞或并入其中的核酸的环境中是外来的，其包括与细胞或核酸中的序列同源但位于宿主细胞或核酸内通常不存在的位置的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(例如Sambrook等人,2001；Ausubel等人,1996，两者均通过引用并入本文)。载体可用于宿主细胞以产生聚合酶、RNA聚合酶、一种或多于一种截短的聚合酶结构域，或融合、附着或连接至一种或多于一种截短的RNA聚合酶结构域的相互作用组分。
术语“表达载体”是指含有编码至少部分能够转录的基因产物的核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，其指特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可包含也具有其他功能的核酸序列，并且其在本文中描述。
B.细胞
本公开提供用于修饰感兴趣的靶标RNA的方法，特别是在原核细胞、真核细胞、组织、器官或生物体中，更特别是在哺乳动物细胞、组织、器官或生物体中。靶标RNA可包含在细胞内的核酸分子中。在一些实施方案中，靶标RNA在真核细胞中，例如哺乳动物细胞或植物细胞。哺乳动物细胞可以是人、非人灵长类动物、牛、猪、啮齿动物或小鼠细胞。细胞可以是非哺乳动物真核细胞，例如家禽、鱼或虾。植物细胞可以是作物植物，例如木薯、玉米、高粱、小麦或稻。植物细胞也可以是藻类、树木或蔬菜。通过本公开的方法、系统和组合物在细胞中诱导的RNA的调节可使得细胞和细胞的后代被改变以改善生物产品例如抗体、淀粉、醇或其他所需细胞输出的生产。在细胞中诱导的RNA的调节可使得细胞和细胞的后代包括改变所产生的生物产物的改变。
哺乳动物细胞可以是人或非人哺乳动物，例如灵长类动物、牛科、绵羊、猪、犬、啮齿动物、兔科，如猴、牛、羊、猪、狗、兔、大鼠或小鼠细胞。细胞可以是非哺乳动物真核细胞，例如禽鸟(例如鸡)、脊椎动物鱼(例如鲑鱼)或贝类(例如牡蛎、蛤蜊、龙虾、虾)细胞。细胞也可以是植物细胞。植物细胞可以是单子叶植物或双子叶植物或作物或谷物植物，例如木薯、玉米、高粱、大豆、小麦、燕麦或稻。植物细胞也可以是藻类、树木或生产植物、水果或蔬菜(例如，树例如柑橘树，例如橙、葡萄柚或柠檬树；桃树或油桃树；苹果树或梨树；坚果树，例如扁桃仁或核桃或开心果树；茄属植物；芸苔属植物；莴苣属植物；菠菜属植物；辣椒属植物；棉花、烟草、芦笋、胡萝卜、卷心菜、西兰花、花椰菜、番茄、茄子、胡椒、生菜、菠菜、草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、葡萄、咖啡、可可等)。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，即任何和所有后续世代。应该理解，由于有意或无意的突变，所有后代可能不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其包括任何能够复制载体或表达载体编码的异源基因的可转化生物体。宿主细胞可以并且已用作载体或病毒的受体。宿主细胞可“转染”或“转化”，这是指外源核酸例如重组蛋白编码序列转移或引入宿主细胞的过程。经转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。
一些载体可采用允许其在原核和真核细胞中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将进一步理解孵育所有上述宿主细胞以维持它们并且允许载体复制的条件。还理解和已知允许大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
C.表达系统
存在包含至少部分或全部上述组合物的多种表达系统。可使用基于原核生物和/或真核生物的系统与实施方案一起使用以产生核酸序列，或者它们的同源多肽、蛋白质和肽。例如，本公开的载体、融合蛋白、RNA发夹结合蛋白、RNA靶向分子、RNA调节结构域和辅助蛋白可利用表达系统，例如诱导型或组成型表达系统。许多这样的系统在商业上广泛可用。在一些实施方案中，表达系统包含可从Gibco商购获得的FreestyleTM HEK293-F细胞。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白质表达，例如在美国专利第5871986号、第4879236号中描述的，两者均通过引用并入本文，并且可购自例如来自
Figure BDA0003496477400000751
的名称
Figure BDA0003496477400000752
和来自
Figure BDA0003496477400000753
的BACPACKTM杆状病毒表达系统。
除了公开的表达系统之外，表达系统的其他实例包括
Figure BDA0003496477400000754
的COMPLETE CONTROL诱导型哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮激素诱导型受体，或其pET表达系统，这是一种大肠杆菌表达系统。诱导型表达系统的另一个实例可获自
Figure BDA0003496477400000755
其携带T-REXTM(四环素调节表达)系统，这是一种使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。
Figure BDA0003496477400000756
还提供称为甲醇毕赤酵母表达系统的酵母表达系统，其被设计为在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白。本领域技术人员会知道如何表达载体，例如表达构建体，以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
V.蛋白质组合物
本公开的多肽或多核苷酸，例如包含或编码与TLR激动剂和/或白蛋白连接的肿瘤靶向剂的多肽或多核苷酸，可以包括SEQ ID No:1-27的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或多于50个变体氨基酸或核酸置换，或与SEQ IDNo:1-27的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或多于1000或其中可衍生的任何范围的连续的氨基酸或核酸有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似、相同或同源。
本公开的多肽或多核苷酸，例如包含或编码与TLR激动剂和/或白蛋白连接的肿瘤靶向剂的多肽或多核苷酸，可以包括SEQ ID NO:1-27的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或多于1000个连续的氨基酸，或其中可衍生的任何范围。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No:1-27的氨基酸1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615(或其中任何可衍生的范围)。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No:1-27的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615(或其中任何可衍生的范围)个连续氨基酸。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No:1-27中任一个的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615(或其中任何可衍生的范围)个连续氨基酸，并且开始于SEQ ID No:1-27中任意的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No:1-27的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615(或其中任何可衍生的范围)个连续氨基酸，其与SEQ ID NO:1-27的一个有至少、至多或恰好60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似、相同或同源。
本公开的多肽可包括至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个置换。
置换可位于SEQ ID NO:1-27的一个的氨基酸位置或核酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615。
本文描述的多肽可以是至少、至多或恰好5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或多于1000个氨基酸(或其中任何可衍生的范围)的固定长度。
置换变体通常包含在蛋白质内的一个或多于一个位点处一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可设计成调节多肽的一种或多于一种特性，具有或不具有其他功能或特性的损失。置换可以是保守的，即，将一个氨基酸替换为一个形状和电荷相似的氨基酸。保守置换是本领域公知的并且包括例如如下的变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。或者，置换可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的变化通常涉及用化学上不同的残基替换残基，例如用极性或带电荷的氨基酸替换非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
蛋白质可以是重组的，也可以是体外合成的。或者，非重组或重组蛋白质可从细菌、真核细胞、酵母或哺乳动物细胞中分离。还预想可在组合物和方法中实施含有这种变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。
术语“功能等效密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，也指编码生物学等效氨基酸的密码子。
还将理解，氨基酸和核酸序列可包括另外的残基，例如另外的N-末端或C-末端氨基酸，或分别为5'或3'序列，但仍将基本上如本文公开的序列之一中所述，只要序列满足上述标准即可，包括在涉及蛋白质表达的情况下维持生物蛋白质活性。末端序列的增加特别适用于核酸序列，其可以例如包括位于编码区的5'或3'部分侧翼的各种非编码序列。
以下是基于改变蛋白质的氨基酸以创建等效甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以替代蛋白质结构中的其他氨基酸，而不会显著丧失相互作用的结合能力。诸如酶催化结构域或相互作用组分的结构可以具有置换的氨基酸以维持这种功能。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定该蛋白质的生物功能活性，因此可在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中进行置换某些氨基酸，但仍产生具有类似特性的蛋白质。因此，本发明人预想可在基因的DNA序列中进行各种改变而不会明显损失其生物学效用或活性。
在其他实施方案中，意在通过引入一个或多于一个置换改变多肽的功能。例如，某些氨基酸可置换蛋白质结构中的其他氨基酸，目的是改变相互作用组分的相互作用结合能力。诸如例如蛋白质相互作用结构域、核酸相互作用结构域和催化位点的结构可具有置换的氨基酸以改变这种功能。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定该蛋白质的生物功能活性，因此可在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中置换某些氨基酸，但仍产生具有不同特性的蛋白质。因此，发明人预想可在基因的DNA序列中进行各种改变从而显著改变其生物学效用或活性。
在进行这种改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性是本领域普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982)。公认氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其进而定义蛋白质与其他分子的相互作用，例如酶、底物、受体、DNA、抗体和抗原等。
本领域还应理解，基于亲水性可有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利第4554101号(通过引用并入本文)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性由其相邻氨基酸的亲水性控制，与蛋白质的生物学特性相关。应理解，一个氨基酸可被另一个具有相似亲水性值的氨基酸置换，并且仍然产生生物学等效和免疫学等效的蛋白质。
如上所述，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷和大小等。考虑到上述各种特性的示例性置换是众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
在具体的实施方案中，本文所述的蛋白质的全部或部分也可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成器是商购可得的并且可根据已知方案使用。参见例如，Stewart和Young,(1984)；Tam等人,(1983)；Merrifield,(1986)；和Barany和Merrifield(1979)，各自通过引用并入本文。或者，可采用重组DNA技术，其中将编码肽或多肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞中并且在适合表达的条件下培养。
一个实施方案包括使用基因转移至细胞，包括微生物，以产生和/或呈递蛋白质。可将感兴趣蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。可采用实际上编码任何多肽的核酸。本文讨论重组表达载体以及其中包含的元件的产生。或者，待产生的蛋白质可以是通常由用于蛋白质生产的细胞合成的内源蛋白质。
VI.组合疗法
本公开的组合物和相关方法，特别是包含与TLR激动剂连接的肿瘤靶向剂的多肽的施用也可与另外的疗法的施用组合使用，例如本文所述的另外的疗法，或与本领域已知的其他传统疗法组合使用。
本文公开的治疗组合物和治疗可以以数分钟至数周的间隔在另一治疗或试剂之前、同时和/或之后进行。在将试剂分别应用于细胞、组织或生物体的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得治疗剂仍将能够对细胞、组织或生物体发挥有利的组合作用。例如，在这样的情况下，预想可将细胞、组织或生物体与两种、三种、四种或多于四种试剂或治疗基本同时(即，在不到约一分钟内)接触。在其他方面，一种或多于一种治疗剂或治疗可以在给予另一种治疗剂或治疗之前和/或之后1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或多于8周以及其中可衍生的任何范围施用或提供。
可采用治疗剂和治疗的各种组合方案。这种组合的非限制性实例如下所示，其中治疗剂例如本文公开的组合物是“A”，而第二试剂例如本文描述或本领域已知的另外试剂、化学疗法或检查点抑制剂是“B”。
Figure BDA0003496477400000911
在一些实施方案中，可使用不止一个疗程。预想可实施多个疗程。
VII.治疗方法
本方法和组合物涉及治疗癌症的方法。在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症是非淋巴癌。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌或结肠癌。
本公开的组合物可用于体内、体外或离体施用。组合物的施用途径可以是例如瘤内、皮内、皮下、静脉内、淋巴管内和腹膜内施用。在一些实施方案中，施用是瘤内或淋巴管内或瘤周施用。在一些实施方案中，将组合物直接施用到癌组织或淋巴结中。
如本文所用，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌变细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性疾病”、“增殖性疾病”和“肿瘤”在本文中并不相互排斥。
适合治疗的癌症包括但不限于所有类型、位置、大小和特征的肿瘤。本公开的方法和组合物适用于治疗例如胰腺癌、结肠癌、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤脑瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑瘤、室管膜瘤脑瘤、髓母细胞瘤脑瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤脑瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、特异性乳腺癌如导管原位癌、浸润性导管癌、乳腺管状癌、乳腺髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺乳头状癌、乳腺筛状癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、小叶原位癌、男性乳腺癌、乳头佩吉特病、乳腺叶状肿瘤、复发性和/或转移性乳腺癌、管腔A或B型乳腺癌、三阴性/基底样乳腺癌和富HER2乳腺癌、淋巴癌、支气管腺瘤/类癌、气管癌、伯基特淋巴瘤、类癌、儿童类癌、不明原发性胃肠道癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、儿童宫颈癌、儿童癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性骨髓增生性疾病、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、儿童性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道基质瘤(GIST)、生殖细胞瘤：颅外、性腺外或卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干胶质瘤、胶质瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性成淋巴细胞(也称为急性淋巴球白血病)白血病、急性髓细胞(也称为急性髓性白血病)白血病、慢性淋巴细胞(也称为慢性淋巴球白血病)白血病、慢性髓细胞(也称为慢性髓性白血病)白血病、毛细胞唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金(除霍奇金病以外的所有淋巴瘤的旧分类)淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、儿童成神经管细胞瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、成人恶性间皮瘤、儿童间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性粒细胞白血病、成人急性髓样白血病、儿童急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性、骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮基质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞性鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童涎腺癌肉瘤、尤文氏家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫Sezary综合征肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌、默克尔细胞小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、伴隐匿性原发性颈部鳞状癌、转移性胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、儿童胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、儿童外阴癌和肾母细胞瘤(肾癌)。
VIII.药物组合物和方法
在一些实施方案中，向对象施用药物组合物。不同方面涉及向对象施用有效量的组合物。在一些实施方案中，可向对象或患者施用包含抑制剂的组合物以治疗癌症和/或降低肿瘤大小。此外，这种化合物可与另外的癌症疗法组合施用。
组合物可配制用于肠胃外施用，例如配制用于通过静脉内注射、经导管注射、动脉内注射、肌肉内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，组合物可制成注射剂，例如液体溶液或悬浮液；也可制备适用于在注射前加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；而且也可以将制剂乳化。根据本公开，这种制剂的制备对于本领域技术人员来说将是已知的。其他施用途径包括瘤内、瘤周、淋巴管内、癌组织注射或淋巴结注射。在一些实施方案中，施用是全身性的。
还预想其他施用途径。例如，构建体和试剂可与载体联合施用。在一些实施方案中，载体是纳米颗粒或微粒。在一些实施方案中，纳米颗粒或微粒是肿瘤导向的纳米颗粒或微粒。例如，载体还可包含将载体导向肿瘤的靶向部分。靶向部分可以是特异性识别肿瘤细胞的结合剂(例如抗体，包括scFv等或其他抗原结合剂)。在一些实施方案中，构建体封装在载体内。在一些实施方案中，构建体共价或非共价附着至载体表面。在一些实施方案中，载体是脂质体。在其他实施方案中，本文所述的载体分子被排除。
颗粒可以具有可变尺寸的结构，并且不同地被称为微球、微粒、纳米颗粒、纳米球或脂质体。这种颗粒制剂可通过构建体与颗粒的共价或非共价连接形成。在一些实施方案中，本文所述的颗粒被排除。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是易于注射的流体。它还应该在制造和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。
载体也可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过使用涂层如卵磷脂、通过在分散的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。微生物的作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液通过将所需量的活性化合物根据需要与上面列举的各种其他成分一起加入适当的溶剂中来制备，随后过滤灭菌。通常，分散体是通过将各种已灭菌的活性成分掺入包含基本分散介质和上述列举的所需的其他成分的无菌载体中来制备的。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题并发症与合理的收益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。术语“药学上可接受的载体”是指涉及携带或运输化学试剂的药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。
根据对象的状况，将一定会出现剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。治疗或预防组合物的有效量基于预期目标确定。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的组合物，其经计算以产生上文讨论的与其施用相关的所需反应，即适当的途径和方案。根据治疗次数和单位剂量，待施用量取决于所需的效果。组合物的精确量也取决于从业者的判断并且因每个人而异。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(缓解症状还是治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。
在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗或预防有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如上述注射溶液的类型。
通常，对于成人(重约70千克)，施用如下量的化合物：约0.1mg至约3000mg(包括其间的所有值和范围)，或约5mg至约1000mg(包括其间的所有值和范围)，或约10mg至100mg(包括其间的所有值和范围)。应理解，这些剂量范围仅作为示例，并且可根据技术人员已知的因素调整施用。
在某些实施方案中，对象被施用约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或μg/kg或微克/kg/分钟或mg/kg/分钟或微克/kg/小时或mg/kg/小时，或其中可衍生的任何范围。
剂量可根据需要使用或每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时或24小时，每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天(或其中可衍生的任何范围)，或每天1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次(或其中可衍生的任何范围)。可在出现病症的体征之前或之后首先施用剂量。在一些实施方案中，在患者经历或表现出病症的体征或症状后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时(或其中可衍生的任何范围)或1天、2天、3天、4天或5天(或其中可衍生的任何范围)后，患者施用第一剂量的方案。患者可持续治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或多于10天(或其中可衍生的任何范围)，或直到病症症状消失或减轻，或肿瘤或癌症适应症后6小时、12小时、18小时或24小时或1天、2天、3天、4天或5天。
IX.实施例
以下实施例被包括以展示本公开的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得同样或相似的结果。
实施例1–使用聚合糖佐剂辅助肿瘤抗原以诱导抗肿瘤免疫
B.概述
在此，发明人证明使用p(Man-TLR7)糖聚合物佐剂产生治疗性癌症疫苗。疫苗材料由与肿瘤结合部分缀合的pManTLR7组成，充分利用佐剂成为原位疫苗，其中肿瘤本身用作产生免疫反应的抗原来源。
发明人的工程材料寻求延长这种强佐剂的肿瘤保留，以增加肿瘤微环境中的APC激活并促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。通过增加肿瘤内APC激活，发明人的疫苗接种将肿瘤免疫环境从抑制性的转变为炎症性的。由激活的APC产生的细胞因子将产生促炎细胞因子环境，其将增强肿瘤内的T细胞功能，以及促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。引流淋巴结炎症状况的延长的持续时间和程度更接近于自然感染，先前研究报告称，延长的抗原可用性和向免疫细胞的递送可通过滤泡辅助T细胞分化、适当的T细胞极化和体液应答提高疫苗接种效力。此外，佐剂和抗原的延长的炎症反应已证明改善T细胞记忆分化和克隆扩增。总之，发明人的疫苗接种策略旨在为初始T细胞针对癌症抗原的启动提供最佳的免疫刺激环境，并且增强肿瘤微环境中T细胞的功能。
发明人的疫苗包含p(ManTLR7)糖聚合物，其化学连接到用于在肿瘤内接种疫苗时增强其组织定位和生物分布的肿瘤结合部分。肿瘤细胞结合部分可以是能够识别肿瘤配体或细胞表面蛋白的抗体(或原始抗体的fAb、scFv、f(ab)2形式)。通过简单地修饰肿瘤结合抗体以适应给定的癌症，发明人的原位疫苗可以广泛应用于多种癌症。具体地，p(ManTLR7)可与各种抗体化学连接，这些抗体已证明与在恶性细胞表面上表达或富集的配体连接。可用作抗体-p(ManTLR7)疫苗接种的肿瘤细胞靶标的配体有多种：肿瘤特异性抗原(即TRP1)、整合素、分化抗原簇(即CD20或CD19)、生长因子受体(即HER2、EGFR)、过度表达的免疫抑制配体(即PD-L1)或甚至糖蛋白(即MUC1)。原则上，这种抗体成分充当细胞表面锚，在结合其配体时减缓佐剂通过肿瘤的排出。除了调节佐剂动力学和生物分布的这种基本用途外，每种单克隆抗体还可贡献自己另外的功能分布，例如阻断免疫抑制配体、启动肿瘤细胞的ADCC、通过Fc相互作用增加抗原摄取或阻断肿瘤细胞上的抗吞噬信号，这可能会给pManTLR7免疫激活或疫苗应答带来叠加效应。
在此，发明人使用与黑素细胞特异性抗TRP1抗体缀合的pManTLR7，在免疫原性较差的黑色素瘤B16F10小鼠模型中对他们的抗体-pManTLR7疫苗接种平台进行初步测试。发明人还探索它们疫苗利用其他肿瘤结合抗体的模块性，并已产生抗CD47-pManTLR7，其将用于在各种其他肿瘤模型中进一步测试，包括B16F10黑色素瘤和EMT6三阴性乳腺癌。pManTLR7的抗体缀合延长肿瘤内保留，并且使用肿瘤结合抗体-pManTLR7缀合物进行治疗能够减缓肿瘤生长、延长生存期和产生肿瘤特异性T细胞应答。
除了用作单一疗法之外，发明人计划评估它们的抗体-pManTLR7疫苗与检查点阻断抗体组合的功效。具体地，抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA4或这些抗体的组合可与发明人的抗体-pManTLR7疫苗显示治疗协同作用并且提高其功效。肿瘤内调节性T细胞(Treg)已证明通过多种机制抑制效应T细胞的活性，因此Treg耗竭疗法如抗CTLA4可有助于增强由发明人的疫苗产生的效应T细胞的功能。激活的T细胞分泌的IFNγ也已证明增加肿瘤细胞的PD-L1表达，导致T细胞应答抑制或功能失调。接种疫苗后活化肿瘤浸润淋巴细胞的密度增加可以导致PD-L1上调。为了解决这个问题，阻断PD-L1或其受体PD-1的抗体可以进一步增强抗肿瘤T细胞的应答。虽然本文描述的初步结果没有显示协同功效，但替代抗体组合或单一抗体施用可以是有益的。
C.具有肿瘤结合亲和力的p(Man-TLR7)缀合物的设计
研究了针对肿瘤特异性抗原或肿瘤细胞上富集的表面配体的特异性抗体将pManTLR7锚定在肿瘤环境中并且增加局部佐剂浓度的能力。对于他们的疫苗的抗体组分，本发明人迄今已通过实验探索两种肿瘤结合抗体：抗CD47和抗TRP1。抗TRP1(克隆TA99)是经深入研究的黑色素细胞反应性抗体，其识别酪氨酸酶相关蛋白1，是对黑色素瘤有反应性的癌症特异性抗体。发明人证实抗TRP1抗体结合B16F10细胞(图1A、D)和来自黑色素瘤Tyr:Cre-ER+/LSL-BrafV600E/Ptenfl/fl的基因工程小鼠模型的肿瘤组织(称为BP)(图1D)的能力。发明人证实该抗体在体内肿瘤微环境内结合的能力，并且观察到在注射后10小时相对于具有无关特异性的对照抗体的改善的肿瘤保留(图1E)。在早期时间点的增加的保留可减少佐剂的系统暴露和与毒性相关的副作用的可能性。重要的是，当抗体与p(ManTLR7)化学连接时，观察到的p(ManTLR7)的添加不会干扰抗TRP1与B16F10细胞结合的能力(图1A，图2D)。
本发明人还调整抗CD47抗体以用于它们的疫苗，因为已经观察到各种恶性肿瘤的CD47表达升高，包括淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌和结肠癌。抗体已在癌症的临床治疗中进行测试，因为阻断CD47导致巨噬细胞和树突状胞清除细胞，这是由于与APC上的前吞噬细胞SIRPα受体的抑制性CD47相互作用的丧失。流式细胞术分析显示抗CD47能够结合多种肿瘤模型，随后可用于使发明人的疫苗适应B16F10、EMT6、PyMT和BP的治疗(图1A-D)。类似于抗TRP1，发明人观察到抗CD47抗体能够以抗原特异性方式保留在肿瘤环境中(图1E)。
总之，这些数据证明发明人的抗体-p(ManTLR7)疫苗设计的模块性，并且明与各种肿瘤结合抗体的缀合允许适应不同的肿瘤模型，并且通过抗原特异性相互作用，其能够延长肿瘤保留。
D.抗体-pManTLR7缀合物的制备
使用其先前公布的缀合策略和双官能BCN连接子，发明人能够将pManTLR7化学连接到其肿瘤结合抗体上的游离胺。通过其缀合策略，发明人基于对用其(BCN)修饰的连接子修饰的抗体的MALDI分析，估计每种抗体将具有连接的约6p(ManTLR7)聚合物(图2C)。发明人可估计，与每个抗体缀合的BCN修饰的连接子的定量对应于每个抗体的pManTLR的最终量，因为与pManTLR7聚合物的末端叠氮基反应的双环壬炔部分的环加成反应产生完整的蛋白质-连接子-pManTLR7缀合物的收率>95％。抗体-p(ManTLR7)缀合物的生产具有可重复性，允许一致地产生极小变异性的疫苗材料。对于缀合的每个步骤，发明人观察到蛋白质迁移率的一致变化，其对应于在抗体与连接子和抗体-连接子与pManTLR7反应后其材料的总kDa的增加(图2B)。
E.抗体-p(Man-TLR7)在肿瘤微环境中的生物分布和积累
在确认pManTLR7可与肿瘤结合抗体(tAb)连接后，发明人接着想要测试这种连接是否可以调节作为疫苗的tAb-pManTLR7的淋巴结引流的生物分布和动力学。重要的是，pManTLR7与抗TRP1或抗CD47抗体的缀合显示出在瘤内施用后在B16F10和EMT6肿瘤环境中的保留。与非肿瘤结合抗体相比，tAb缀合物将肿瘤内半衰期提高1.5至3倍(图3B-D)。抗TRP1-p(ManTLR7)在肿瘤内持续数天表明p(ManTLR7)与肿瘤结合抗体的缀合可增强肿瘤微环境中APC的激动剂可用性和延长LN引流。与立即排至淋巴结的团注剂量(bolus dose)相比，发明人预期pManTLR7在大量肿瘤抗原中的持久性将更好地模拟自然感染，从而促进更成熟的免疫应答。除了调节其疫苗材料的生物分布外，发明人还预测抗体缀合将同时降低其激动剂的全身分布，从而限制对外周器官的暴露和随后的毒性。
F.治疗功效
在证明抗体-p(ManTLR7)结合和在肿瘤内保留的能力之后，发明人然后评估其原位p(ManTLR7)疫苗在体内的抗肿瘤功效。与赋形剂处理的对照动物相比，用抗TRP1-p(ManTLR7)处理携带B16F10肿瘤的小鼠导致肿瘤大小显著减小(图4B)以及总体存活率提高(图4C)。另外，相对于含有以与完整缀合物等摩尔量混合的游离p(ManTLR7)和抗TRP1抗体的未缀合的对照，在抗Trp1-p(ManTLR7)疫苗接种的动物中观察到肿瘤生长比更慢(图4B)，表明抗体连接对整体疫苗效力很重要。通过使用gp100黑色素瘤肽的抗原再刺激测试肿瘤特异性T细胞应答，证实了发明人的功效数据。与未结合的pManTLR7或盐水处理的对照相比，在用抗TRP1-p(ManTLR7)疫苗处理后的肿瘤引流淋巴结中观察到gp100肽再刺激后的显著更高的IFNγ分泌(图4D)。这些数据共同表明，抗TRP1-pManTLR7疫苗接种增强了抗肿瘤T细胞应答，并且在免疫原性差的黑色素瘤模型中显示出治疗益处。
为了对照该领域的当前标准来衡量p(ManTLR7)的功效和安全性，发明人将其疫苗与等摩尔剂量的TLR9刺激佐剂CpG进行比较。在此，抗TRP1-pManTLR7疫苗接种在减缓肿瘤生长的能力方面优于CpG(图4B)。因为激动剂的全身传播与毒性和炎症相关的副作用相关，发明人量化接种疫苗后24小时的IL-6和IL-12p70血清水平，作为通过TLR刺激的全身APC激活的读数。与盐水处理的动物相比，CpG处理的动物的IL-6和活性形式的IL-12细胞因子的血清水平明显升高。然而，用抗TRP1-pManTLR7接种疫苗与盐水处理的动物相比没有显示出可检测到的反应，这表明发明人的疫苗制剂降低了脱靶效应的可能性和翻译的总体耐受性(图4F、G)。
对免疫疗法抗体难治的或无反应的一部分患者显示出肿瘤中最小的T细胞浸润。在此，肿瘤描述为“冷”肿瘤模型，其中T细胞物理排除在肿瘤的基质边界之外，或者肿瘤环境中任何地方的T细胞很少。为了测试我们的疫苗在这些环境中的效力，我们在三阴性乳腺癌EMT6的小鼠模型中测试我们的抗CD47-pManTLR7疫苗(图6A-B)。引人注目的是，我们在50％的免疫排除EMT6乳腺癌肿瘤中观察到完全缓解(CR)(图6C)。肿瘤内保留的抗CD47-pManTLR7显示出比抗CD47抗体和pManTLR7的等摩尔未缀合混合物更好的肿瘤控制，表明抗体和pManTLR7的连接对于最大治疗效果是重要的(抗CD47-pManTLR，CR＝8中的4，pManTLR+抗CD47混合物，CR＝8中的1)(图6C)。
为了证实我们的疫苗接种能够提供抗肿瘤记忆，我们在原发肿瘤不明显后30天用第二肿瘤在远侧乳腺脂肪垫上再次激发EMT6存活者(图6A)。无论是否进行另外的抗PD1和抗CTLA4治疗，用抗CD47-pManTLR7疫苗接种的小鼠都对第二肿瘤再激发具有抗性，而所有初始对照均发展出肿瘤(图6D)，因而证实抗CD47-pManTLR7疫苗接种提供了持久的全身抗肿瘤记忆。
我们接着想评估tAb-pManTLR治疗功效需要哪些免疫细胞亚群。为了测试这一点，我们在耗竭巨噬细胞或CD8T细胞亚群后使用耗竭抗体接种小鼠，并且通过肿瘤生长观察治疗功效。我们观察到巨噬细胞耗竭的接种疫苗的小鼠与接种疫苗的野生型非耗竭小鼠具有相似的治疗功效，表明巨噬细胞是不需要的。然而，当CD8T细胞在接种疫苗的小鼠中耗竭时，我们没有看到疫苗接种的治疗效果，并且肿瘤的生长与盐水处理的动物相似(图6E-F)。
G.tAb-pManTLR7激活APC并且由多个APC亚群内吞
为了确定哪些抗原呈递细胞内化tAb-pManTLR7，我们用荧光标记的抗CD47647-pManTLR7对EMT6荷瘤小鼠进行了疫苗接种，并且评估肿瘤中的APC亚群，以及24小时后肿瘤引流淋巴结的摄取。在淋巴结中，我们观察到tAb-pManTLR7存在于所有APC亚群中，并且存在于总交叉呈递DC亚群的一半以上(图7A)。我们还观察到抗CD47-pManTLR疫苗接种可增加巨噬细胞、炎性单核细胞、CD11c+ DC和CD103+ DC亚群的频率(图7B-E)。在疫苗接种后24小时的肿瘤中，我们通过CD80上调的测量观察到显著更多的巨噬细胞和cDC2激活(图7F)。在淋巴结中，巨噬细胞和CD103+ DC在抗CD47-pManTLR疫苗接种的动物中比在抗CD47+pManTLR7的未结合混合物接种的动物中显著更加活化。
H.与检查点抗体疗法的结合
为了避免免疫识别和破坏，肿瘤会选择多种机制来抑制免疫活性。因此，发明人的疫苗接种很可能可以通过与检查点阻断疗法一同实现最大的治疗功效，以克服Treg或PD-L1介导的免疫抑制。因为肿瘤微环境内的炎症可增加肿瘤细胞上PD-L1的表面表达以及募集免疫抑制性调节性T细胞(Treg)，发明人首先想探索他们的疫苗接种与抗PD1和抗CTLA4抗体治疗的组合的协同作用。
出人意料的是，发明人发现用抗CTLA4和抗PD1进行治疗并没有提高他们疫苗接种的效力。单独的抗-TRP1-pManTLR疫苗接种或其与检查点阻断抗体的组合之间的肿瘤生长(图4B)、存活率(图4C)和抗原特异性T细胞应答(图4D)没有显著差异。在接种疫苗的同一天施用检查点阻断抗体可能是次优的，发明人将评估另外的施用策略。在检查点抗体可以有效缓解PD-1阻断或Treg耗竭导致的T细胞耗竭之前，可能需要更多时间通过疫苗接种来首先引发T细胞应答。或者，对抗TRP1-pManTLR单独作为原位疫苗的疫苗接种反应可能会引发充分炎性的肿瘤环境，进一步的检查点阻断疗法可能会激活和耗竭非肿瘤特异性T细胞，导致治疗功效降低。
I.材料和方法
1.试剂
CpG-B 1826购自InvivoGen。小鼠抗大鼠/小鼠TRP1(克隆TA99)、大鼠抗小鼠CD47(克隆MIAP301)和小鼠IgG2a同种型对照(克隆C1.182)抗体购自BioXCell。大鼠抗小鼠PD-L1(克隆10F.9G2，Bio X Cell)和仓鼠抗小鼠CTLA4(克隆9H10，Bio X Cell)用于检查点阻断抗体研究。在对小鼠施用之前，所有内部制备的制剂的内毒素水平通过来自InvivoGen的HEK-Blue hTLR4细胞进行测试。NHS Ester Sulfo-Cy7染料(Lumiprobe)、AlexaFluor 647(Invivogen)或DyLight 800 NHS Ester(ThermoFisher)用于标记抗体或抗体-pManTLR聚合物，用于根据制造商建议进行流式细胞术、免疫荧光染色和体内成像分析。
2.抗体-pManTLR7缀合物的制备
将抗体(>5mg/mL)与10至30摩尔当量的2kDa自牺牲PEG连接子在500μL磷酸盐缓冲液(pH 7.7)中混合，并且在室温下混合反应2小时。然后通过具有30kDa截断值的Zeba旋转脱盐柱将反应溶液纯化两次以去除未反应的连接子(Thermo Fisher)。使用凝胶电泳并与未修饰抗体的大小标准进行比较来确认连接子缀合成功。然后在无内毒素的Eppendorf管中使PBS(pH 7.4)中的抗体-连接子构建体与7摩尔过量的p(Man-TLR7)聚合物反应2小时，在室温下混合。使用FPLC尺寸排阻色谱Superdex 200柱(GE)去除过量的p(Man-TLR7)聚合物。然后将具有高于150kDa的MW(通过凝胶电泳评估)的物质的级分合并并用100kDaAmicon离心装置浓缩。然后通过327nm处的吸光度确定TLR7含量，并且通过凝胶电泳确定抗体含量，如下所述。
3.确定p(ManTLR7)缀合物中的TLR7含量
为了确定聚合物和聚合物-抗体缀合物中TLR7含量的浓度，测量327nm处的吸光度。在327nm处以8mg/mL至1mg/mL的几种浓度测量盐水中已知量的mTLR7(n＝3个独立样品)，以计算如Wilson等人，2019中先前公布的标准曲线。然后将确定的标准曲线[TLR7(mg/mL)＝1.9663*A327+0.0517]用于计算最终抗体-p(ManTLR7)缀合物中的TLR7浓度。
4.确定抗体-pManTLR7缀合物中的抗体含量
使用标准曲线的抗体(2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL)在4％至20％梯度凝胶(Bio-Rad)上进行SDS-PAGE，并且用10mM二硫苏糖醇还原抗体-pManTLR7缀合物样品的两种稀释液。还原条件释放任何缀合的pManTLR7，从而允许分析降低的抗体条带强度。然后使用ImageJ分析还原样品的条带密度和抗体标准曲线，并且使用生成的标准曲线根据强度计算样品的抗体浓度。
5.细胞培养
B16F10细胞(ATCC)和EMT6(ATCC)在含有10％FBS(Thermo Fisher Scientific)的DMEM(Gibco)中培养。MMTV-PyMT细胞从乳腺癌转基因小鼠(FVB-Tg(MMTV-PyMT))在病毒启动子诱导致癌基因后自发形成的肿瘤中获得，并且在体外培养。通过IMPACT I PCR测试(IDEXX Laboratories)对所有细胞系进行测试以确认没有小鼠病原体。
6.动物
所有动物研究均按照芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的程序进行，并且安置在芝加哥大学的特定无病原体环境中。8-12周龄的C57BL/6雌性小鼠获自CharlesRiver或The Jackson Laboratory。8-16周龄的Tyr:Cre-ER+/LSL-BrafV600E/Ptenfl/fl小鼠由T.Gajewski(芝加哥大学)提供。
7.B16F10和EMT6肿瘤接种和治疗
将重新悬浮在50uL PBS中的3x105至5x105个B16F10细胞皮内接种在每只C57BL/6小鼠的背部左侧或左翼。将重新悬浮在50uL PBS中的5x105个EMT6细胞接种到乳腺脂肪垫中。从肿瘤接种后第5天开始，每隔一天用数显卡尺测量肿瘤。体积计算为体积V＝长x宽x高。当肿瘤体积达到超过1000mm3时处死小鼠。治疗按照在图中和图例中描述的天数进行。tAb-pManTLR7疫苗接种或对照治疗通过肿瘤内注射以描述的剂量施用，总体积是35μL。腹膜内施用100μg抗PDL1和100μg抗CTLA4治疗剂。在初始治疗之前，将小鼠随机分为治疗组，每个治疗组在笼子之间分开以减少笼蔽效应。
8.Tyr:Cre-ER+/LSL-BrafV600E/Ptenfl/fl黑色素瘤诱导
在8-16周龄Tyr:Cre-ER+/LSL-BrafV600E/Ptenfl/fl小鼠的背部诱导肿瘤。如前所述(Spranger等人,2015)，在局部应用10mg/mL的50μg 4-OH-他莫昔芬(Sigma-Aldrich)之前，将毛皮剃掉。体积计算为体积＝表面*Z，其中表面通过ImageJ分析计算，Z是由数显卡尺测量的深度。当肿瘤体积达到1000mm3时处死小鼠。
9.组织处理
收集脾脏、淋巴结和肿瘤并且将其保存在IMDM中的冰上直至处理。将肿瘤在补充有2％FBS、胶原酶D(2mg/mL；Gibco)、DNase I(40μg/mL；Roche)的1mL DMEM中在37℃混合下消化45分钟。将淋巴结机械破碎并在胶原酶D中在37℃下消化45分钟。通过机械破碎将经消化的肿瘤或淋巴结或脾脏加工成单细胞悬液，并通过70μm无菌筛网。通过在ACK裂解缓冲液(Quality Biological)中重悬并在室温下孵育5分钟来裂解肿瘤细胞和脾细胞中的红细胞。使用15mL DMEM+10％FBS淬灭裂解反应。然后将肿瘤、淋巴结或脾细胞的单细胞悬液用PBS或DMEM洗涤一次，然后再悬浮在DMEM中。然后将这些单细胞悬液用于再刺激实验或染色用于流式细胞术分析。
10.离体T细胞刺激
如上所述制备来自脾脏或淋巴结的单细胞悬液。通过添加1.0μg/mL gp10025-33CD8显性肽(EGSRNQDWL)表位(Genscript)对来自脾脏或淋巴结的5x105个细胞进行体外再刺激72小时。再刺激后，将细胞离心并且收集上清液用于通过ELISA测量分泌的细胞因子。根据制造商的方案，使用Ready-Set-Go试剂盒(eBioscience)进行细胞因子ELISA。对于每个生物重复所有细胞再刺激，还设置了未刺激(未添加肽)对照孔以确定非特异性激活的背景水平。
11.肿瘤组织切片的免疫荧光
如上所述对B16F10和Tyr:Cre-ER+/LSL-BrafV600E/Ptenfl/fl黑色素瘤模型接种肿瘤。收获的肿瘤用4％多聚甲醛(PFA)固定，包埋在OCT培养基中速冻，在-20℃下保存直至切片。从侧面开始裂解肿瘤的连续切片(10μm厚)，直到到达肿瘤的中部。然后用10％酪蛋白溶液封闭玻片固定的切片，然后用20％大鼠血清并之后用一抗孵育：生物素化抗胶原IV Ab(Jackson ImmunoResearch)、大鼠抗小鼠CD47(Bio X Cell)和Sulfo-Cy7(Lumican)标记的小鼠抗小鼠TRP1Ab，在室温下孵育2小时，然后用Alexa Fluor 750缀合的链霉亲和素(BioLegend)和山羊抗大鼠647(Invitrogen)(对于所有均为1:400最终浓度)染色1小时。将载玻片用具有DAPI(Invitrogen)的ProLong金抗褪色培养基封固，然后在Olympus共聚焦显微镜上成像。图像用20x油镜拍摄，合成图像和比例尺覆盖用ImageJ制作。
12.血清细胞因子浓度分析
使用3x105个细胞接种B16F10黑色素瘤肿瘤，并且从接种后第5天开始每4天接种有30μg TLR7，形式为TRP1-pManTLR7和摩尔等效剂量的对照CpG、抗TRP1和游离pManTLR7聚合物，或盐水。第2次接种后24小时，于肝素包被管中收集200μL血液，离心分离血清并在-20℃下保存。按照制造商的说明，用Ready-Set-Go试剂盒(eBioscience)使用ELISA评估血清的IL-6和IL-12p70。
13.肿瘤结合抗体的流式细胞术分析
使用BD FACS LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术分析，并且使用FlowJo软件(Tree Star)分析。对于染色，细胞用PBS洗涤两次，然后用含有Cy7标记的抗TRP1、抗CD47、小鼠IgG2a同种型对照抗体的PBS+0.2％FBS以30μg/mL或用5μg/mL抗体作为抗体-pManTLR7缀合物染色。细胞在冰上染色20分钟。将染色的细胞洗涤两次并且重悬于PBS+2％FBS中用于分析。
14.肿瘤保留研究
对C57BL/6小鼠B16F10荷瘤小鼠(80mm3)瘤内注射抗TRP1-pManTLR7800、抗TRP1-750、抗CD47-750、小鼠IgG2a同种型对照-750或PBS。在注射后10小时和在每24小时时间点，对小鼠进行成像，并且通过IVIS Spectrum体内成像系统(Perkin Elmer)测量荧光。使用Living Imaging 4.5.5软件(Perkin Elmer)通过肿瘤区域的ROI选择处理和量化图像。为了标准化抗TRP1、抗CD47和同种型对照抗体的荧光标记之间的任何差异，用包被不同浓度的标记抗体(5μg、2.5μg、1μg、0.5μg)确定标准曲线，重复一次。然后使用每个抗体的计算的标准曲线从每个时间点的荧光读数计算肿瘤蛋白。对于没有在材料之间进行对照的实验，荧光信号直接报告为辐射效率。
15.基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱
首先，在50:50乙腈:在水中的1％TFA中制备基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma-Aldrich)的饱和溶液作为溶剂。然后将PBS中的分析物(5μl,0.1mg/ml)和基质溶液(25μl)混合，并且将1μl此混合物沉积在MTP 384研磨钢靶板上。使液滴在氮气流中干燥，从而形成均匀的样品/基质共沉淀物。使用高质量线性正模式方法对所有样品进行分析，在75％的激光强度下进行2500次激光发射。
16.组织处理
收集脏、淋巴结和肿瘤并保存在冰上、在IMDM中直到处理。将肿瘤在补充有2％FBS、胶原酶D(2mg/mL；Gibco)、DNase I(40μg/mL；Roche)的1mL DMEM中在37℃混合下消化45分钟。将淋巴结机械破碎并且在胶原酶D中于37℃消化45分钟。通过机械破碎将经消化的肿瘤或淋巴结或脾脏加工成单细胞悬液，并且通过70μm无菌筛网。通过在ACK裂解缓冲液(Quality Biological)中重悬并且在室温下孵育5分钟来裂解肿瘤细胞和脾细胞中的红细胞。使用15mL DMEM+10％FBS淬灭裂解反应。然后将肿瘤、淋巴结或脾细胞的单细胞悬液PBS或DMEM洗涤一次，并且重新悬浮在DMEM中。然后将这些单细胞悬液用于再刺激实验或直接染色用于流式细胞术分析。
17.对肿瘤和肿瘤引流淋巴结的流式细胞术分析
对于染色，将细胞用PBS洗涤并且在冰上用eFluor 455UV(eBioscience)可固定活力染料染色15分钟。细胞用PBS洗涤两次，然后在含有抗体混合物(BD Biosciences和Biolegend)的PBS+2％胎牛血清(FBS)中在冰上染色20分钟。染色的细胞用PBS+2％FBS洗涤两次，然后将细胞在PBS+2％多聚甲醛中固定15分钟。将细胞洗涤两次并且重悬于PBS+2％FBS中。如果需要，根据制造商的说明，使用eBioscience Foxp3转录因子染色缓冲液组对FoxP3进行细胞内染色。使用LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术测量，并且使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。
18.细胞耗竭实验
通过每周两次腹膜内施用400μg抗CD8a(克隆2.43，BioXCell)耗竭抗体来耗竭CD8T细胞亚群。通过每隔一天施用300μg抗CSF1R(克隆AFS98，BioXcell)耗竭抗体来耗竭巨噬细胞。对照组(仅接种疫苗)每隔一天接受300μg IgG2a同种型对照抗体。耗竭抗体在整个疫苗接种治疗窗口期间施用。通过对肿瘤、脾脏或LN群体的流式细胞术分析确认细胞耗竭。
19.数据分析
使用Prism软件(V7；GraphPad Software)生成统计分析和图表。对于单一比较，使用双尾t检验。还使用单向方差分析和Bonferroni事后检验分析数据。使用对数秩(MantelCox)检验分析存活曲线的差异。用于计算显著性的组大小(n)在图例中指明。除非在图例中另有说明，否则报告关于载体对照组的显著性。为了表示统计显著性，***P≤0.001；**P≤0.01；*P≤0.05，除非另有说明。
J.参考文献
在整个说明书中提及的以下参考文献和出版物，在它们提供对本文中阐述的示例性程序或其他细节补充的范围内，通过引用具体并入本文。
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实施例2-将聚合糖佐剂靶向肿瘤基质以诱导抗肿瘤免疫
A.概述
在此，发明人报告使用p(Man-TLR7)糖聚合物佐剂来产生治疗性癌症疫苗。发明人的疫苗材料由与肿瘤基质结合部分缀合的p(Man-TLR7)组成，充分利用佐剂成为靶向疫苗，其中肿瘤本身用作产生免疫应答的抗原来源。
发明人的工程材料旨在将这种强佐剂定位于肿瘤微环境和延长肿瘤保留，以便增加肿瘤微环境内的APC激活并且促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。通过增加肿瘤内APC的激活，疫苗接种将使肿瘤免疫环境从抑制性的转变为炎症性的。由激活的APC产生的细胞因子将产生促炎细胞因子环境，其将增强肿瘤内的T细胞功能，以及增强肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。引流淋巴结中炎症状况的延长的持续时间和程度更接近于自然感染。这种疫苗接种策略旨在为初始T细胞针对癌抗原的启动提供最佳的免疫刺激环境，并且增强肿瘤微环境中T细胞的功能。
发明人的疫苗包含p(Man-TLR7)糖聚合物，其化学连接到用于在静脉内或肿瘤内接种疫苗时增强其组织定位和生物分布的肿瘤基质结合部分。这些肿瘤细胞结合部分可以是能够识别肿瘤基质细胞外基质组分或其他肿瘤基质组分的抗体(或原始抗体的Fab、scFv、F(ab’)2形式)。通过简单地修改肿瘤基质结合抗体以适应给定的癌症，发明人的原位疫苗可广泛适用于多种癌症。具体地，p(Man-TLR7)可与各种抗体进行化学连接，这些抗体已证明可与在肿瘤基质中表达、独特暴露或富集的配体连接。可用作抗体-p(Man-TLR7)疫苗接种的肿瘤基质靶标的配体有多种：纤连蛋白(或纤连蛋白的选择性剪接结构域，例如额外结构域A)、胶原蛋白、腱生蛋白、骨膜蛋白、黏结蛋白聚糖、其他蛋白质或蛋白聚糖，或甚至肿瘤基质细胞特异性抗原(即FAP)。原则上，该抗体组分用作将发明人的佐剂定位于肿瘤的手段，然后随着抗体与其在肿瘤微环境中的配体结合而减缓佐剂通过肿瘤的排出。除了调节佐剂动力学和生物分布的这种基本用途外，每种单克隆抗体还可贡献自己的另外功能分布，例如阻断免疫抑制配体、启动肿瘤细胞的ADCC、通过Fc相互作用增加抗原摄取或阻断肿瘤细胞上的抗吞噬信号，这可以给p(Man-TLR7)免疫激活或疫苗应答带来叠加效应。
在此，发明人使用与对已发现在许多癌症中过度表达的纤连蛋白的额外结构域A(EDA)特异性的抗体的抗原结合片段(Fab)缀合的p(Man-TLR7)，在免疫原性差的黑色素瘤B16F10鼠类模型中对他们的抗体-p(Man-TLR7)疫苗接种平台进行初步测试。用抗EDA Fab-p(Man-TLR7)治疗荷瘤小鼠能够减缓肿瘤生长和延长生存期。
除了用作单一疗法之外，发明人计划评估他们的抗体-p(Man-TLR7)疫苗与检查点阻断抗体组合的功效。具体地，抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4或这些抗体的组合可能与发明人的抗体-p(Man-TLR7)疫苗显示治疗协同作用并且提高其疗效。肿瘤内调节性T细胞(Treg)已证明通过多种机制抑制效应T细胞的活性，因此Treg耗竭疗法如抗CTLA-4可有助于增强疫苗产生的效应T细胞的功能。接种疫苗后活化肿瘤浸润淋巴细胞的密度增加可能导致PD-L1上调。因此，在存在免疫检查点抑制剂下向肿瘤递送佐剂可能会提供治疗功效。当发明人的抗体-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合使用时，本文所述的初步结果显示出协同功效。这项工作证明了疫苗接种策略的功效，还提供证据表明替代抗体组合或单一抗体施用也可在癌症治疗中提供协同功效。
B.具有肿瘤定位和保留的p(Man-TLR7)缀合物的设计
为了开始评估抗体-p(Man-TLR7)平台，探索了对肿瘤基质组分具有特异性的抗体的将p(Man-TLR7)定位到肿瘤微环境并且增加佐剂的局部浓度的能力。对于疫苗的这种抗体组分，发明人决定集中于靶向纤连蛋白的额外结构域A(EDA)的抗体。出于他们的目的，发明人决定使用抗原结合片段(Fab)抗体形式。发明人重组产生抗EDA Fab(图8A-B)，然后证实其与EDA的结合(图8C)。发明人还证实EDA在B16F10肿瘤中表达，因此他们计划使用该模型来评估抗EDA Fab-p(Man-TLR7)缀合物的体内抗肿瘤功效(图8D)。
C.抗EDA Fab-p(Man-TLR7)缀合物的制备
使用他们先前公布的缀合策略和双官能环壬炔(BCN)连接子，发明人能够将p(Man-TLR7)化学连接到其EDA结合Fab上的游离胺(图9A)。基于所使用的Fab和BCN的初始摩尔浓度，本文使用的Fab-p(Man-TLR7)缀合物将具有估计的1:5摩尔比的Fab:p(Man-TLR7)聚合物。发明人可估计，与每个抗体缀合的BCN修饰的连接子的定量对应于每个抗体的p(Man-TLR7)的最终量，因为BCN部分与p(Man-TLR7)聚合物的末端叠氮基的为了产生完整的蛋白质-连接子-p(Man-TLR7)缀合物的环加成反应的产率>95％。Fab-p(ManTLR7)缀合物的生产具有可重复性，并且允许一致地产生极小变异性的疫苗材料。对于缀合的每个步骤，发明人观察到蛋白质迁移率的一致变化，其对应于抗体与连接子和抗体-连接子与p(Man-TLR7)反应后其材料的总kDa的增加(图9B)。
D.治疗功效
当发明人制备Fab-p(Man-TLR7)缀合物，他们随后评估体内抗肿瘤功效(图10A)。发明人决定评估单独疫苗接种和其与检查点抗体疗法组合的抗肿瘤功效。为了避免免疫识别和破坏，肿瘤会选择多种机制来抑制免疫活性。因此，发明人假设其疫苗接种将通过与检查点阻断疗法一同实现最大治疗功效，以克服Treg或PD-L1介导的免疫抑制。由于肿瘤微环境内的炎症可增加肿瘤细胞上PD-L1的表面表达以及募集免疫抑制性调节性T细胞(Treg)，发明人首先想探索其疫苗接种与抗PD-1和抗CTLA4抗体处理组合的协同作用。
与未治疗的对照动物相比，用静脉内(i.v.)递送的人抗EDA Fab-p(Man-TLR7)治疗B16F10荷瘤小鼠导致肿瘤大小略微减小(图10B)。当发明人将Fab-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合时，发明人观察到提高的抗肿瘤功效和显著提高的总体存活率(图10B-C)。该数据表明，抗EDA Fab-p(Man-TLR7)疫苗接种与检查点抗体疗法的组合在免疫原性差的黑色素瘤模型治疗中提供了治疗益处。
为了开始评估所观察到的抗肿瘤功效背后的免疫学机制，发明人接着研究在用静脉内递送的人抗EDA Fab-p(Man-TLR7)接种后肿瘤内存在的细胞类型(图11A)。与先前的结果相似，用Fab-p(Man-TLR7)与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合的疫苗接种显著减缓B16F10肿瘤的生长(图11B)。处死小鼠后，发明人没有观察到肿瘤中CD8+T细胞数量的任何显著差异(图11C)。然而，发明人确实看到肿瘤中CD4+T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞显著减少(图11D-E)。另外，观察到肿瘤中NK细胞的显著增加(图11F)，以及肿瘤内巨噬细胞的减少(图11G)。这些结果表明这些细胞类型在观察到的抗肿瘤功效中起作用。
由于与将人蛋白质(抗EDAFab)连同强佐剂一起注射到小鼠中相关的免疫原性问题，本发明人随后转向使用Fab的嵌合鼠源化版本，其由小鼠恒定区和人可变区组成。在用与p(Man-TLR7)缀合的鼠源抗EDA Fab对B16F10荷瘤小鼠通过静脉注射递送进行疫苗接种后(图12A)，当疫苗与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合时，观察到肿瘤生长显著减慢(图12B)和存活率显著提高(图12C)，类似于用人Fab-p(Man-TLR7)疫苗观察到的结果。
最后，发明人评估疫苗的两种不同施用途径：静脉内施用和瘤内施用(i.t.)(图13A)。使用静脉内和瘤内施用鼠源抗EDA Fab-p(Man-TLR7)与抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，均观察到肿瘤生长显著减慢(图13B)和存活率提高(图13C)。然而，与静脉内施用相比，瘤内施用疫苗导致抗肿瘤功效提高(图13B-C)和抗Fab抗体减少的趋势(图13D)。重要的是，通过任一施用途径接种疫苗后，血清中细胞因子IL-6、IL-12p70、TNFα和IFNγ(图13E-H)的全身水平没有显著增加，表明发明人疫苗具有安全性。该数据表明，抗EDA Fab-p(Man-TLR7)与检查点抗体疗法的组合是对于免疫原性差的B16F10小鼠黑色素瘤模型的有效治疗，并且全身毒性最小。
E.材料和方法
1.抗EDA Fab蛋白的制备和纯化
将编码人或鼠源抗EDA Fab的序列合成并且亚克隆到哺乳动物表达载体pSecTagA中。鼠源抗EDA Fab是由小鼠恒定区和人可变区组成的嵌合Fab。将悬浮适应的HEK-293F细胞常规维持在无血清FreeStyle 293表达培养基(Gibco)中。在转染当天，将细胞接种到新鲜培养基中，密度是1x106个细胞/mL，依次加入2μg/mL质粒DNA、2μg/ml线性25kDa聚乙烯亚胺(Polysciences)和OptiPRO SFM培养基(4％的最终浓度，Thermo Fisher)。在5％CO2存在下，在37℃下以135rpm的轨道摇动来搅动培养瓶。转染后7天，通过离心收集细胞培养基并且通过0.22μm过滤器过滤。将培养基使用
Figure BDA0003496477400001141
pure 25(GE Healthcare)装入HiTrapMabSelect 5mL柱(GE Healthcare)。用PBS洗涤柱后，将蛋白质用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)洗脱。所有纯化步骤均在4℃下进行。将抗EDA Fab的表达使用抗人IgG抗体(JacksonImmunoResearch)通过蛋白质印迹法测定，蛋白质通过SDS-PAGE(在4％至20％梯度凝胶(Bio-Rad)上进行)确定为纯度>90％。
2.EDA蛋白的制备和纯化
将EDA如前所述进行重组表达和纯化(Julier等人，2015)。
3.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE在4％至20％梯度凝胶(Bio-Rad)上进行。在还原条件下运行的样品在95℃下与10mM二硫苏糖醇孵育5分钟。电泳后，根据制造商的说明，用SimpleBlue SafeStain(Thermo Fisher Scientific)对凝胶进行染色。凝胶图像用ChemiDoc XRS+系统(Bio-Rad)获得。
4.蛋白质印迹
如上所述运行SDS-PAGE凝胶。随后，在80V将蛋白质转移到PVDF膜(MilliporeSigma)上达1小时。将膜在4℃下在含有0.1％Tween 20(TBS-T)和5％脱脂乳的Tris缓冲盐水中封闭过夜。然后将膜用TBS-T洗涤5次，然后在室温下与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在2％脱脂乳中孵育1小时。用TBS-T再次洗涤膜5次。然后按照制造商的说明将Clarity Western ECL底物(BioRad)添加到膜上，并且使用ChemiDoc XRS+系统(Bio-Rad)对蛋白质印迹进行成像。
5.抗EDA Fab与EDA的结合
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行亲和力测量。将96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp平底板，Thermo Fisher)在4℃下用10μg/mL EDA(在发明人实验室生产)的PBS溶液包被过夜。第二天，将板用含有0.05％Tween 20(PBS-T)的PBS洗涤，然后用在PBS中稀释的1x酪蛋白(Sigma)在室温下封闭1小时。然后，将孔用PBS-T洗涤并且在室温下进一步用抗EDA Fab的各种稀释液孵育2小时。用PBS-T洗涤6次后，将孔与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温下孵育1小时。用PBS-T洗涤6次后，通过测量450nm处的吸光度并且减去570nm处的测量值，用四甲基联苯胺底物检测结合的抗EDA Fab。表观解离常数(Kd)值通过在Prism软件(v7，GraphPad Software)中进行非线性回归分析获得，假设为单位点特异性结合。
6.试剂体内研究
大鼠抗小鼠PD-1(克隆29F.1A12，Bio X Cell)和仓鼠抗小鼠CTLA-4(克隆9H10，Bio X Cell)用于检查点阻断抗体研究。在对小鼠施用之前，通过来自InvivoGen的HEK-Blue mTLR4细胞测试所有制剂的内毒素水平。发明人的前出版物(Wilson等人，2019)中提供了对p(Man-TLR7)聚合物和中间体合成的详细说明。
7.Fab-p(Man-TLR7)缀合物的制备
在500μL磷酸盐缓冲液(pH 7.7)中将Fab(>3mg/mL)与5(或至多30)摩尔当量的2kDa自牺牲PEG连接子混合，并且室温下混合反应2小时。然后通过具有30kDa截断值的Zeba旋转脱盐柱将反应溶液纯化两次以去除未反应的连接子(Thermo Fisher)。使用凝胶电泳并与未修饰Fab的大小标准进行比较，确认连接子成功缀合。然后将PBS(pH 7.4)中的Fab-连接子构建体与7摩尔过量的p(Man-TLR7)聚合物在无内毒素的Eppendorf管中反应2小时，在室温下混合。使用FPLC尺寸排阻色谱Superdex 200柱(GE)去除过量的p(Man-TLR7)聚合物。然后将含有高于50kDa的MW(通过凝胶电泳评估)的物质的级分合并并且用30kDaAmicon离心装置浓缩。然后通过327nm处的吸光度确定TLR7含量，通过凝胶电泳确定Fab含量。
8.确定p(Man-TLR7)缀合物中的TLR7含量
为了确定聚合物和聚合物-Fab缀合物中TLR7含量的浓度，测量327nm处的吸光度。在327nm处以8mg/mL至1mg/mL的几种浓度测量盐水中已知量的mTLR7(n＝3个独立样品)，以计算如Wilson等人，2019中先前公布的标准曲线。然后将确定的标准曲线[TLR7(mg/mL)＝1.9663*A327+0.0517]用于计算制备的p(Man-TLR7)缀合物中的TLR7浓度。
9.确定Fab-p(Man-TLR7)缀合物中的抗体含量
使用Fab蛋白(2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL)的标准曲线在4％至20％梯度凝胶(Bio-Rad)上进行SDS-PAGE，将Fab-p(Man-TLR7)缀合物样品的两种稀释液用10mM二硫苏糖醇还原。还原条件释放缀合的p(Man-TLR7)，允许分析还原的抗体条带强度。然后使用ImageJ分析还原样品的条带密度和Fab标准曲线，并且使用生成的标准曲线计算样品的Fab浓度。
10.细胞培养
B16F10细胞(ATCC)在含有10％FBS(Thermo Fisher Scientific)的DMEM(Gibco)中培养。通过IMPACT I PCR测试(IDEXX实验室)测试细胞系以确认没有小鼠病原体。
11.动物
所有动物研究均按照芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的程序进行，并且安置在芝加哥大学的特定无病原体环境中。8-12周龄C57BL/6雌性小鼠获自CharlesRiver或The Jackson Laboratory。
12.B16F10肿瘤接种与治疗
将重新悬浮在50μL PBS中的3x105至5x105个B16F10细胞，在每只C57BL/6小鼠背部左侧皮内接种。从接种肿瘤后的第3天或第4天开始，每隔一天用数显卡尺测量肿瘤。体积计算为体积V＝长x宽x高xπ/6。当肿瘤体积达到超过500mm3或达到早期终点标准时，处死小鼠。在附图(图10A、11A、12A、13A)和图例中描述的天数进行处理。Fab-p(Man-TLR7)疫苗接种或对照治疗以描述的剂量和治疗通过静脉注射总体积为100μL或瘤内注射总体积为30μL进行施用。100μg抗PD-1和100μg抗CTLA-4治疗剂通过腹膜内或静脉内施用。在初始治疗之前，将小鼠随机分为治疗组，其中每个治疗组在笼之间分开以减少笼蔽效应。
13.肿瘤组织切片的免疫荧光
如上所述针对B16F10黑色素瘤模型接种肿瘤。收获的肿瘤用4％多聚甲醛(PFA)固定，包埋在OCT培养基中速冻，在-20℃保存直至切片。切片由芝加哥大学人体组织资源中心进行。简而言之，从侧面开始肿瘤的连续切片(10μm厚)直到到达肿瘤的中部。然后在室温下用PBS-T中的2％BSA封闭玻片固定的切片达1小时。组织与一抗一起孵育：生物素化小鼠抗EDA抗体(抗体来自Abcam，使用来自Thermo Fisher的生物素-XX微型蛋白质标记试剂盒生物素化，1:500最终浓度)和大鼠抗小鼠CD31(BioLegend克隆MEC13.3，1:100最终浓度)，在室温下孵育2小时，然后用Alexa Fluor 488缀合的链霉亲和素(BioLegend，1:1000最终浓度)和山羊Alexa Fluor 647缀合的抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，1:500最终浓度)在室温下染色1小时。在Leica DMi8显微镜上成像之前，将载玻片用含有DAPI(Invitrogen)的ProLong金抗褪色培养基封固。图像用10倍镜头拍摄。使用ImageJ(NIH)制作合成图像。
14.血清细胞因子浓度分析
如上所述接种B16F10黑色素瘤肿瘤，并且如上所述接种小鼠。接种肿瘤后第11天，于肝素包被管中收集50μL血液，离心分离血清，在-20℃保存。按照制造商的说明，使用Ready-Set-Go(eBioscience)或Quantikine(R&D)ELISA试剂盒评估血清中的IL-6、IL-12p70、TNFα和IFNγ。
15.抗Fab IgG浓度分析
如上所述接种B16F10黑色素瘤肿瘤，并且如上所述接种小鼠。接种肿瘤后第11天，于肝素包被管中收集50μL血液，离心分离血浆，在-20℃保存。通过ELISA评估血浆的抗FabIgG。96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp平底板，Thermo Fisher)在4℃下用10μg/mL抗EDA Fab的PBS溶液包被过夜。第二天，将板在含有0.05％Tween 20(PBS-T)的PBS中洗涤，然后用在PBS中稀释的1x酪蛋白(Sigma)在室温下封闭1小时。然后，将孔用PBS-T洗涤，并且在室温下进一步用血浆的各种稀释液孵育2小时。用PBS-T洗涤6次后，将孔与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG抗体(Fc区特异性，Jackson ImmunoResearch)在室温下孵育1小时。用PBS-T洗涤6次后，通过测量450nm处的吸光度并且减去570nm处的测量值，用四甲基联苯胺底物检测结合的抗EDA Fab。
16.对肿瘤的流式细胞术分析
在接种后第10天从B16F10荷瘤小鼠中收获肿瘤，并且制备细胞悬液。对于染色，细胞用PBS洗涤并且在冰上用eFluor 455UV(eBioscience)可固定活力染料染色15分钟。细胞用PBS洗涤两次，然后在含有抗体混合物(BD Biosciences和Biolegend)的PBS+2％胎牛血清(FBS)中在冰上染色20分钟。染色的细胞用PBS+2％FBS洗涤两次，然后将细胞在PBS+2％多聚甲醛中固定15分钟。将细胞洗涤两次并且重悬于PBS+2％FBS中。如果需要，根据制造商的说明，使用eBioscience Foxp3转录因子染色缓冲液组对FoxP3进行细胞内染色。使用LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术测量，并且使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
17.数据分析
使用Prism软件(V7；GraphPad Software)生成统计分析和图表。对于单一比较，使用双尾t检验。数据还使用单向方差分析和Tukey的HSD事后检验进行分析。使用对数秩(Mantel Cox)检验分析存活曲线的差异。用于计算显著性的组大小(n)显示在图例中。除非在图例中另有说明，否则报告关于载体对照组的显著性。为了显示统计显著性，****P≤0.0001；***P≤0.001；**P≤0.01；*P≤0.05，除非另有说明。
F.参考文献
在整个说明书中提及的以下参考文献和出版物，在它们提供对本文中阐述的示例性程序或其他细节补充的范围内，通过引用具体并入本文。
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实施例3-工程化胶原结合血清白蛋白作为用于癌症治疗的聚合物糖佐剂载体
A.概述
在此，发明人报告使用p(Man-TLR7)糖聚合物佐剂产生靶向治疗性癌症疫苗。发明人的疫苗材料由与融合蛋白缀合的p(Man-TLR7)组成，融合蛋白由与称为血管性血友病因子(VWF)的A3结构域的胶原结合结构域(CBD)融合的血清白蛋白(SA)组成(图14A)。CBD-SA组合CBD的主动肿瘤靶向机制和SA的被动靶向机制，因此发明人假设CBD-SA可将p(Man-TLR7)靶向肿瘤微环境并且提高其抗肿瘤功效。
发明人的工程化材料旨在将这种强佐剂定位于肿瘤微环境并且延长肿瘤保留，以便增加肿瘤微环境内的APC激活并且促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。在这种疫苗方法中，肿瘤本身用作产生免疫应答的抗原来源。通过增加肿瘤内APC激活，发明人的疫苗接种将肿瘤免疫环境从抑制性的转变为炎症性的。由激活的APC产生的细胞因子将产生促炎细胞因子环境，其将增强肿瘤内的T细胞功能，以及促进肿瘤引流淋巴结中的T细胞启动。这种疫苗接种策略旨在为初始T细胞针对癌抗原的启动提供最佳的免疫刺激环境，并且增强肿瘤微环境中T细胞的功能。
通过将p(Man-TLR7)糖聚合物化学连接到CBD-SA部分，发明人旨在通过静脉内或肿瘤内疫苗接种其聚合物糖佐剂来增强组织定位和生物分布。原则上，CBD-SA组分用作将发明人的佐剂定位于肿瘤的手段，然后随着CBD-SA与肿瘤微环境中的胶原蛋白结合而减缓佐剂通过肿瘤的排出。在此，发明人在免疫原性差的B16F10黑色素瘤小鼠模型中对其CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种平台进行初步测试。用CBD-SA-p(Man-TLR7)治疗荷瘤小鼠能够减缓肿瘤生长和延长生存期。
除了用作单一疗法外，发明人计划评估其CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗与检查点阻断抗体组合的功效。具体地，抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4或这些抗体的组合可以与发明人的CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗显示治疗协同作用并且提高其疗效。肿瘤内调节性T细胞(Treg)已证明通过多种机制抑制效应T细胞的活性，因此Treg耗竭疗法如抗CTLA-4可能有助于增强由发明人的疫苗产生的效应T细胞的功能。然而，激活的T细胞分泌的IFNγ也已证明增加肿瘤细胞的PD-L1表达，导致T细胞应答减弱或功能失调。接种疫苗后激活的肿瘤浸润淋巴细胞的密度的增加可能导致PD-L1上调。为了解决这个问题，阻断PD-L1或其受体PD-1的抗体可能会进一步增强抗肿瘤T细胞的应答。当发明人的CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合使用时，本文所述的初步结果显示出协同功效。发明人计划在未来测试替代的抗体组合或单一抗体剂量，以查看是否可实现进一步的协同功效。
B.CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物的制备
使用本发明人先前公布的缀合策略和双官能环壬炔(BCN)连接子，发明人能够将p(Man-TLR7)与CBD-SA上的游离胺化学连接(图14A)。基于使用的CBD-SA和BCN的初始摩尔浓度，本文使用的CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物将具有估计1:5摩尔比的CBD-SA:p(Man-TLR7)聚合物。发明人可估计，与每个CBD-SA分子缀合的BCN修饰的连接子的定量对应于每个CBD-SA的p(Man-TLR7)的最终量，因为为了产生完整的蛋白质-连接子-p(Man-TLR7)缀合物，BCN部分与p(Man-TLR7)聚合物的末端叠氮基的环加成反应的产率>95％。CBD-SA-p(ManTLR7)缀合物的生产具有可重复性，并且允许一致地产生极小变异性的疫苗材料。对于缀合的每个步骤，发明人观察到蛋白质迁移率的一致变化，其对应于在CBD-SA与连接子和CBD-SA-连接子与p(Man-TLR7)反应后其材料的总kDa的增加(图14B-C)。重要的是，当CBD-SA与p(Man-TLR7)缀合时，CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物保留了与胶原I和胶原III两者结合的能力(图14D)。
C.治疗功效
一旦发明人制备CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物，他们随后评估了其体内抗肿瘤功效(图15A)。发明人决定评估单独的疫苗接种和其与检查点抗体疗法组合的抗肿瘤功效。为了避免免疫识别和破坏，肿瘤会选择多种机制来抑制免疫活性。因此，发明人假设其疫苗接种将通过检查点阻断疗法实现最大治疗功效，以克服Treg或PD-L1介导的免疫抑制。因为肿瘤微环境内的炎症性可增加肿瘤细胞上PD-L1的表面表达以及募集免疫抑制性调节性T细胞(Treg)，发明人首先想探索其疫苗接种与抗PD-1和抗CTLA4抗体治疗的组合。
与未治疗的对照动物相比，用静脉内(i.v.)递送的人CBD-SA-p(Man-TLR7)治疗B16F10荷瘤小鼠导致肿瘤尺寸减小(图15B)。当发明人将他们的CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合时，发明人观察到提高的抗肿瘤功效和提高的总体存活率(图15B-C)。该数据表明CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种与检查点抗体疗法的组合，在这种免疫原性差的黑色素瘤模型的治疗中提供了治疗益处。
由于与将人蛋白质(CBD-SA)连同强佐剂一起注射到小鼠体内的免疫原性问题，发明人随后转而使用CBD-SA的鼠源版本。在用与p(Man-TLR7)缀合的小鼠CBD-SA对B16F10荷瘤小鼠通过静脉内递送进行疫苗接种后(图16A)，当疫苗与抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合时，观察到肿瘤生长显著减慢(图16B)和存活率显著提高(图16C)，类似于用人CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗观察到的结果。
最后，发明人评估疫苗的两种不同施用途径：静脉内施用和瘤内施用(i.t.)(图17A)。使用静脉内和瘤内施用的鼠源CBD-SA-p(Man-TLR7)与抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，均观察到肿瘤生长显著减慢(图17B)和存活率提高(图17C)。然而，与静脉内施用相比，瘤内施用疫苗导致抗肿瘤功效提高(图17B-C)。重要的是，经由任一种施用途径免疫接种后，血清中抗CBD-SA抗体(图17D)和细胞因子IL-6、IL-12p70、TNFα和IFNγ(图17E-H)的全身水平没有显著增加，表明发明人疫苗具有安全性。该数据表明，CBD-SA-p(Man-TLR7)与检查点抗体疗法的组合是对于免疫原性差的B16F10小鼠黑色素瘤模型的有效治疗，并且全身毒性最小。
D.材料和方法
1.制备和纯化CBD-SA蛋白
合成了编码人或鼠源VWF A3结构域残基Cys1670-Gly1874(成熟VWF的907至1111)和不含前肽的小鼠SA(完整SA的25至608个氨基酸)的融合的序列，并且通过Genscript亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中。在C-末端添加编码6His的序列以进一步纯化重组蛋白。悬浮适应的HEK-293F细胞常规维持在无血清FreeStyle 293表达培养基(Gibco)中。在转染当天，将细胞稀释到新鲜培养基中，密度是1x106个细胞/mL，添加2μg/mL质粒DNA、2μg/mL线性25kDa聚乙烯亚胺(Polysciences)和OptiPRO SFM培养基(4％最终浓度，ThermoFisher Scientific)。在5％CO2存在下，在37℃下以135rpm的轨道摇动来搅动培养瓶。转染后7天，通过离心收集细胞培养基并且通过0.22μm过滤器过滤。使用
Figure BDA0003496477400001241
pure 25(GEHealthcare)将培养基装入HisTrap HP 5mL柱(GE Healthcare)。用洗涤缓冲液(20mM咪唑、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl，pH 7.4)洗涤柱后，用梯度的500mM咪唑(于20mM NaH2PO4、0.5MNaCl中，pH 7.4)洗脱蛋白质。将洗脱液使用HiLoad Superdex 200PG柱(GE Healthcare)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。所有纯化步骤均在4℃下进行。通过SDS-PAGE证实蛋白质的纯度>90％。
2.结合亲和力测定
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行亲和力测量。96孔ELISA板(Greiner Bio-One)在37℃下用胶原I或胶原III(在PBS中各为10μg/mL，EMD Millipore)包被过夜，然后在室温下用含0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA(PBS-T)封闭1小时。然后，将孔用PBS-T洗涤，并且在室温下与浓度不断增加的CBD-SA进一步孵育2小时。用PBS-T洗涤3次后，将孔与抗小鼠SA的生物素缀合抗体在室温下孵育1小时。在用PBS-T连续洗涤3次后，将孔与抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)在室温下孵育30分钟。洗涤3次后，通过测量450nm处的吸光度减去570nm处的吸光度，用四甲基联苯胺底物检测结合的CBD-SA。表观Kd值通过在Prism软件(版本7，GraphPad)中通过非线性回归分析获得，假设为单位点特异性结合。
3.用于体内研究的试剂
大鼠抗小鼠PD-1(克隆29F.1A12，Bio X Cell)和仓鼠抗小鼠CTLA-4(克隆9H10，Bio X Cell)用于检查点阻断抗体研究。在对小鼠施用之前，通过来自InvivoGen的HEK-Blue mTLR4细胞测试所有制剂的内毒素水平。发明人先前出版物(Wilson等人，2019)中提供了对p(Man-TLR7)聚合物和中间体合成的详细说明。
4.CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物的制备
CBD-SA(>3mg/mL)在500μL磷酸盐缓冲液(pH 7.7)中与5(或至多30)摩尔当量的2kDa自牺牲PEG连接子混合，并且在室温下混合反应2小时。然后通过具有30kDa截断值的Zeba旋转脱盐柱将反应溶液纯化两次以去除未反应的连接子(Thermo Fisher)。使用凝胶电泳并与未修饰的CBD-SA的大小标准进行比较，确认连接子的成功缀合。然后将PBS(pH7.4)中的CBD-SA-连接子构建体与7摩尔过量的p(Man-TLR7)聚合物在无内毒素的Eppendorf管中反应2小时，在室温下混合。使用FPLC尺寸排阻色谱Superdex 200柱(GE)去除过量的p(Man-TLR7)聚合物。然后将包含高于90kDa的MW(通过凝胶电泳评估)的级分合并并且用30kDa Amicon离心机浓缩。然后通过327nm处的吸光度确定TLR7含量，通过凝胶电泳确定CBD-SA含量。
5.确定p(Man-TLR7)缀合物中的TLR7含量
为了确定聚合物和聚合物-CBD-SA缀合物中TLR7含量的浓度，测量了327nm处的吸光度。在327nm处以8mg/mL至1mg/mL的几种浓度测量盐水中已知量的mTLR7(n＝3个独立样品)，以计算如Wilson等人，2019中先前公布的标准曲线。确定的标准曲线[TLR7(mg/mL)＝1.9663*A327+0.0517]随后用于计算制备的p(Man-TLR7)缀合物中的TLR7浓度。
6.确定CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物中的CBD-SA含量
使用CBD-SA蛋白(2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL)的标准曲线对4％至20％梯度的凝胶(Bio-Rad)进行SDS-PAGE，将CBD-SA-p(Man-TLR7)缀合物样品的两种稀释液用10mM二硫苏糖醇还原。还原条件释放缀合的p(Man-TLR7)，允许分析降低的CBD-SA条带强度。然后使用ImageJ分析还原样品的条带密度和CBD-SA标准曲线，并且使用生成的标准曲线计算样品的CBD-SA浓度。
7.细胞培养
B16F10细胞(ATCC)在含有10％FBS(Thermo Fisher Scientific)的DMEM(Gibco)中培养。通过IMPACT I PCR测试(IDEXX实验室)测试细胞系以确认不含小鼠病原体。
8.动物
所有动物研究均按照芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的程序进行，并且安置在芝加哥大学的特定无病原体环境中。8-12周龄C57BL/6雌性小鼠获自CharlesRiver或The Jackson Laboratory。
9.B16F10肿瘤接种与治疗
将重新悬浮于50uL PBS中的5x105个B16F10细胞皮内接种到每只C57BL/6小鼠背部的左侧上。从接种肿瘤后的第3天或第4天开始，每隔一天用数显卡尺测量肿瘤。体积计算为体积V＝长x宽x高xπ/6。当肿瘤体积达到超过500mm3或达到早期终点标准时，处死小鼠。在附图(图15A、16A、17A)和图例中描述的天数进行处理。CBD-SA-p(Man-TLR7)疫苗接种或对照治疗以描述的剂量和治疗通过总体积为100μL的静脉内注射或总体积为30μL的瘤内注射施用。100μg抗PD-1和100μg抗CTLA-4治疗剂通过腹膜内或静脉内施用。药物施用以盲法方式进行。在初始治疗之前，将小鼠随机分为治疗组，每个治疗组在笼之间分开以减少笼蔽效应。
10.血清细胞因子浓度分析
如上所述接种B16F10黑色素瘤肿瘤，并且如上所述疫苗接种小鼠。接种肿瘤后第11天，于肝素包被管中收集50μL血液，离心分离血清，在-20℃下保存。按照制造商的说明，使用Ready-Set-Go(eBioscience)或Quantikine(R&D)ELISA试剂盒评估血清中的IL-6、IL-12p70、TNFα和IFNγ。
11.抗CBD IgG浓度分析
如上所述接种B16F10黑色素瘤肿瘤，并且如上所述疫苗接种小鼠。接种肿瘤后第11天，于肝素包被管中收集50μL血液，离心分离血浆，在-20℃下保存。通过ELISA评估血浆的抗CBD-SA IgG。96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp平底板，Thermo Fisher)在4℃下用10μg/mLCBD-SA的PBS溶液包被过夜。第二天，将板在含有0.05％Tween 20(PBS-T)的PBS中洗涤，然后用在PBS中稀释的1x酪蛋白(Sigma)在室温下封闭1小时。然后，将孔用PBS-T洗涤，并且在室温下进一步用血浆的各种稀释液孵育2小时。用PBS-T洗涤6次后，将孔与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温下孵育1小时。用PBS-T洗涤6次后，通过测量450nm处的吸光度并且减去570nm处的测量值，用四甲基联苯胺底物检测结合的抗EDA Fab。
12.数据分析
使用Prism软件(V7；GraphPad Software)生成统计分析和图表。对于单一比较，使用双尾t检验。还使用单向方差分析和Tukey的HSD事后检验分析数据，并且通过Brown-Forsythe检验发现组间差异是相似的。使用对数秩(Mantel Cox)检验分析存活曲线的差异。用于计算显著性的组大小(n)显示在图例中。除非在图例中另有说明，否则报告关于载体对照组的显著性。为了显示统计显著性，****P≤0.0001；***P≤0.001；**P≤0.01；*P≤0.05；N.S.＝不显著，除非另有说明。
E.参考文献
在整个说明书中提及的以下参考文献和出版物，在它们提供对本文中阐述的示例性程序或其他细节补充的范围内，通过引用具体并入本文。
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尽管上文已经以一定程度的特定性或者参考一个或多于一个单独的实施方案描述了某些实施方案，但是本领域技术人员可在不脱离本发明范围的情况下对所公开的实施方案做出多种改变。此外，在适当的情况下，上述任何实施例的方面可与所描述的任何其他实施例的方面组合以形成具有相当或不同的特性并且解决相同或不同的问题的其他实施例。类似地，应理解，上述益处和优点可涉及一个实施方案或可涉及多于一个实施方案。对专利出版物或其他出版物的任何引用都是通过引用该出版物的公开内容具体并入本文。权利要求不应解释为包括手段加功能或步骤加功能的限制，除非在给定权利要求中分别使用短语“用于...的手段”或“用于...的步骤”明确叙述这种限制。

Claims (43)

1.一种多肽，其包含与p(Man-TLR)可操作地连接的肿瘤靶向剂。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中p(Man-TLR)包含p(Man-TLR7)、p(Man-TLR8)、p(Man-TLR7/8)或其组合。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中p(Man-TLR)包含p(Man-TLR7)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂靶向肿瘤细胞。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂靶向基质。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂包含抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中抗体或抗原结合片段包含基质靶向抗体或其基质结合片段。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中抗体或结合片段特异性结合纤连蛋白，纤连蛋白的选择性剪接结构域、胶原、腱生蛋白、骨膜蛋白、黏结蛋白聚糖、蛋白聚糖，或肿瘤基质细胞特异性抗原。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂包含与包含额外结构域A(EDA)的纤连蛋白的选择性剪接结构域特异性结合的Fab。
10.根据权利要求8或9所述的多肽，其中抗体或结合片段包含重链可变区，其包含与SEQ ID NO:17-19分别具有至少80％同一性的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3；和轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:22-24分别具有至少80％同一性的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。
11.根据权利要求10所述的多肽，其中抗体或结合片段包含含有与SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和/或含有与SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的多肽，其中抗体或结合片段包含含有与SEQ IDNO:26具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的重链恒定区和/或含有与SEQ ID NO:27具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。
13.根据权利要求8至11中任一项所述的多肽，其中抗体或结合片段包含含有与SEQ IDNO:20具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的重链恒定区和/或含有与SEQ ID NO:25具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂包含特异性结合肿瘤相关抗原的抗体或其抗原结合片段。
15.根据权利要求14所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂与CD47或TRP1特异性结合。
16.根据权利要求1或5中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂包含胶原结合域。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述多肽还与白蛋白分子可操作地连接。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂与p(Man-TLR)共价连接。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含来自饰胶蛋白聚糖或血管性血友病因子(VWF)的胶原结合域。
20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述胶原结合域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的多肽。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的多肽，其中所述胶原结合域位于白蛋白多肽的氨基末端。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含白蛋白多肽和胶原结合域之间的连接子。
23.根据权利要求22所述的多肽，其中所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。
24.根据权利要求23所述的多肽，其中所述连接子包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15中的一个。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述多肽不与颗粒、纳米囊泡或脂质体可操作地连接。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含至少两个胶原结合域。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的多肽，其中所述肿瘤靶向剂与p(Man-TLR)的摩尔比是1:5。
28.一种组合物，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的多肽。
29.一种用于治疗对象的癌症的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1至27中任一项所述的多肽或根据权利要求28所述的组合物。
30.一种将TLR激动剂靶向对象的肿瘤的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1至27中任一项所述的多肽或根据权利要求28所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述对象患有癌症。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中癌症包括黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、乳腺上皮癌或结肠癌。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述癌症包括黑色素瘤、乳腺癌或乳腺上皮癌。
34.一种用于增加对象肿瘤中TLR激动剂积累的方法，所述方法包括向所述对象施用根据权利要求1至27中任一项所述的多肽或根据权利要求28所述的组合物。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用一种或多于一种另外的癌症疗法。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述对象已经或将接受免疫疗法。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用免疫疗法。
38.根据权利要求37所述的方法，其中免疫疗法在多肽之前、之后或同时施用。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法包括检查点抑制剂疗法。
40.根据权利要求39所述的方法，其中检查点抑制剂疗法包括PD-1抗体、CTLA4抗体或两者。
41.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述多肽或组合物是全身施用。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述多肽或组合物通过静脉注射施用。
43.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述多肽或组合物是瘤内施用或瘤周施用。
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