CN118221829A - 一种il-10单体融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,本发明公开了一种IL‑10单体融合蛋白。本发明的融合蛋白具有较强的靶向性,安全性得到显著提高,且可有效治疗或预防多种肿瘤或炎性疾病。
Description
优先权声明
本申请要求申请号为202211646452.8,申请日为2022年12月21日,发明名称为一种IL-10单体融合蛋白的中国发明专利申请的优先权,其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体而言,涉及一种IL-10单体融合蛋白。
背景技术
白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10,或IL10)也被称为人类细胞因子合成抑制因子(CSIF),是一种抗炎细胞因子,属于同源二聚体分泌物,目前临床上的IL-10蛋白存在安全性问题,少量的天然二聚化的IL-10分子与其受体IL-10Rα高亲和力结合后,进一步与IL-10Rβ结合,形成六聚体复合物并激活下游信号,引起生物学功能反应。
目前的临床IL-10药物分子缺乏靶向性,药物分子容易脱靶,并产生副作用;并且这些融合蛋白分子往往都具有正常的IL-10二聚体结构,IL-10二聚体与IL-10Rα高亲和力结合,可能会影响抗体端的靶向作用,从而导致设计思路失败,并且如果抗体端的活性需求剂量较大,则IL-10端的副作用仍然是一个棘手的问题。
将IL-10单体对称地或非对称地连接在抗体分子的不同部位,通过抗体自身结构的空间位阻可以使IL-10单体被隔离开,当IL-10单体融合蛋白处于游离状态时,即使IL-10单体与IL-10Rα结合也不能引起功能反应。只有当抗体端结合到靶细胞后,才能通过聚集效应,将邻近IL10单体-IL10Rα复合物聚拢,并进一步与IL-10Rβ结合形成复合物产生下游信号并引发生物功能。但IL-10单体连接在抗体分子不同部位的融合蛋白依旧有体内毒性这个问题存在
因此,仍需积极探索靶向性强、副作用小的IL-10药物,该研究方向对预防或治疗肿瘤或炎性疾病具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种IL-10单体融合蛋白。
在本发明的第一方面,本发明提供了一种融合蛋白,其包含:抗体,和插入在上述抗体中的白细胞介素单体或其变体;
在一些具体的实施方式中,上述抗体为免疫球蛋白,其具有两条相同的轻链和两条相同的重链,上述轻链包括VL区和CL区,上述重链包括VH区、CH1区、CH2区、和CH3区;上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的位置为如下(i)或(ii):
(i)上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的其中一条重链的CH2区和CH3区之间;
(ii)上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的其中一条轻链的VL区和CL区之间。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种多特异性结合分子,其包括前述的融合蛋白。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种核酸,其编码前述的融合蛋白或前述的多特异性结合分子。
在本发明的第四方面,本发明提供了一种表达载体,其含前述的核酸。
在本发明的第五方面,本发明提供了一种重组细胞,其携带前述的核酸、前述的表达载体、表达前述的融合蛋白或前述的多特异性结合分子。
在本发明的第六方面,本发明提供了前述的融合蛋白、或前述的多特异性结合分子、前述的核酸、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备药物中的用途,上述药物用于治疗或预防肿瘤或炎性疾病。
在本发明的第七方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含前述的融合蛋白、或前述的多特异性结合分子、前述的核酸、前述的表达载体或前述的重组细胞;可选地,上述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面,本发明提供了一种治疗、预防或诊断肿瘤或炎性疾病、病症或状况的方法,其包括向受试者施用治疗有效量的前述药物组合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是根据本发明实施例的天然IL-10分子及IL-10单体与IL-10受体结合方式的示意图,其中,A表示天然IL-10分子与IL-10受体结合方式的示意图,R1表示IL-10受体α(IL-10Rα),R2表示IL-10受体β(IL-10Rβ);B表示IL-10单体与IL-10受体结合方式的示意图,R1表示IL-10受体α(IL-10Rα),IL-10M1表示IL-10单体。
图2是根据本发明实施例的融合蛋白中抗体与靶细胞上的抗原结合、IL-10单体与IL-10受体结合的示意图,IL-10单体亲和力较弱,靶向作用差,当抗体端靶向肿瘤表面后,抗体的局部富集可以将IL-10单体聚集在一起,变成二聚体IL-10(M)*2发挥作用,其中,IL-10R1表示IL-10受体α(IL-10Rα),IL-10R2表示IL-10受体β(IL-10Rβ),Her2表示人类表皮生长因子受体,是抗体靶向抗原的举例,T-cell表示T细胞,Tumor表示肿瘤。
图3是根据本发明实施例,IL-10单体插入抗体分子中的位置结构示意图(以IL-10单体插入抗体的其中一条重链的CH2区与CH3区之间为例),其中,A表示在抗体含有Knob结构域的重链的CH2区与CH3区之间插入一条IL-10单体的结构示意图,得到的融合蛋白分子命名为R1738;B表在抗体含有Knob结构域的重链的CH3区的C末端插入一条IL-10单体的结构示意图,得到的融合蛋白分子命名为R1740;C表示在抗体含有Obscurin结构域的轻链的VL区的C末端插入一条IL-10单体的结构示意图,得到的融合蛋白分子命名为R1737;D表示在抗体含有Obscurin结构域的轻链的CL区的C末端插入一条IL-10单体的结构示意图,得到的融合蛋白分子命名为R1739;其中,图中的IL-10表示IL-10单体,KIH表示KIH重链防错配结构,Obs结构域表示Obscurin结构域,Tit表示Titin结构域,VL表示轻链可变区,VH表示重链可变区。
图4是本发明实施例中的对照分子(R0987、R0989、R0674、R0862、R1049、R0579、R1187)的结构示意图,其中,图中的IL-10表示IL-10单体,VL表示轻链可变区,VH表示重链可变区。
图5是根据本发明实施例的融合蛋白R1737、R1738、R1739、R1740的SDS-PAGE检测结果图,其中,R是指还原型SDS-PAGE(reducing SDS-PAGE),NR是指非还原型SDS-PAGE(No-reducing SDS-PAGE)。
图6是根据本发明实施例的融合蛋白采用流式法检测IL-10单体端对IL10Rα的结合活性的结果图,其中,横坐标(Ab conc.Log(nM))表示抗体浓度(nM),纵坐标MFIPE表示平均荧光强度。
图7是根据本发明实施例的融合蛋白采用流式法检测抗体端对mPD-1的结合活性的结果图,其中,横坐标(Ab conc.Log(nM))表示抗体浓度(nM),纵坐标MFIPE表示平均荧光强度。
图8是根据本发明实施例的融合蛋白采用报告基因法检测IL-10单体端结合活性的结果图,其中,B是A中R1737、R1738、R1739和R0862的放大图,横坐标(Ab conc.Log(μg/mL))表示抗体浓度(μg/mL),纵坐标(Lum)表示Luminescence荧光强度;实心图表示富集前的信号,空心图表示富集体系的信号。
图9为通过ELISA法检测各IL10融合蛋白与IL10Rα结合的活性检测结果。图10为通过ELISA法检测各IL10融合蛋白与IL10Rβ结合的活性检测结果。
图11为通过ELISA法检测各IL10融合蛋白与IL10Rα/IL10Rβ结合的活性检测结果。
发明详述
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学在本发明中,术语。除非本公开明确定义,否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。除非另有说明,本公开中使用自商业途径获得的试剂盒及试剂的方法通常根据厂商定义的方案和/或参数进行。
本发明中的冠词“一种”(a/an)、“一个”(a/an)和“所述”包括复数指代,除非上下文清楚表明其并非如此。举例来说,“一种抗体”指一种抗体或多于一种抗体。
在本发明中,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本发明的第一方面,本发明提供了一种融合蛋白,其包含:抗体,和插入在上述抗体中的白细胞介素单体或其变体;
在一些具体的实施方式中,上述抗体为免疫球蛋白,其具有两条相同的轻链和两条相同的重链,上述轻链包括VL区和CL区,上述重链包括VH区、CH1区、CH2区、和CH3区;上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的位置为如下(i)或(ii):
(i)上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的其中一条重链的CH2区和CH3区之间;
(ii)上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的其中一条轻链的VL区和CL区之间。
在本发明中,术语“融合蛋白”是指包含两个或更多不同蛋白的融合多肽分子,其中融合蛋白的各组分通过肽键直接相连或通过连接肽相互连接。
在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物,其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
在本发明中,术语“氨基酸(amino acid)”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸,以及与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala;A)、精氨酸(Arg;R)、天冬酰胺(Asn;N)、天冬氨酸(Asp;D)、半胱氨酸(Cys;C);谷氨酸(Glu;E)、谷氨酰胺(Gln;Q)、甘氨酸(Gly;G);组氨酸(His;H)、异亮氨酸(Ile;I)、亮氨酸(Leu;L)、赖氨酸(Lys;K)、甲硫氨酸(Met;M)、苯丙氨酸(Phe;F)、脯氨酸(Pro;P)、丝胺酸(Ser;S)、苏氨酸(Thr;T)、色氨酸(Trp;W)、酪氨酸(Tyr;Y)和缬氨酸(Val;V)。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。氨基酸类似物通常具有修饰的R基团(例如,正亮氨酸)或修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构,但具有与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
在本发明中,术语“连接肽”是指由氨基酸组成的肽段,例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基,以连接抗体中的各个结构域。在某些实施方案中,所述连接肽可以为约1至约100个氨基酸长,例如,约1至50个氨基酸长。在本发明中,“第一连接肽”、“第二连接肽”、“第三连接肽”、“第四连接肽”、“第五连接肽”表示不同的连接肽。
在一些具体的实施方式中,上述连接肽为柔性连接肽。
在一些具体的方式中,上述柔性连接肽氨基酸序列包括但不限于(GS)n、(GGGGS)nG或(GGGGSSG)n,其中n是等于或大于1的正整数,例如,n是1-10中的正整数。
在一些具体的方式中,柔性连接肽的氨基酸序列可以是GSGSGSGS(SEQ ID NO:6)、GGGGSG(SEQ ID NO:12)、GSGSGSGSGGGGSSG(SEQ ID NO:13)、GGGGSSG(SEQ ID NO:16)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:17)。
在本发明中,术语“间隔肽”是指插入特定蛋白质并用于改变蛋白质的结构和/或功能的肽。从这个意义上说,它与连接其他融合伙伴的连接肽不同,但连接肽可以用作间隔肽。
在一些具体的方式中,间隔肽具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本发明中,术语“抗体”是能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子,包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链,重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中,肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大,称为可变区(V区),羧基端(C端)相对稳定,变化很小,称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH,L链的C区为CL,H链的C区包含CH1区、CH2区和CH3区,CH1区与CH2区一般之间通过铰链区(hinge)连接。
在本发明中,术语“铰链区(hinge)”是指免疫球蛋白重链CH1区和CH2区之间的区域,该区包括H链间二硫键,富含脯氨酸,不形成α螺旋,易发生伸展及一定程度扭曲,有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。
在本发明中,术语“白细胞介素(IL)”是指具有复杂免疫调节功能的一组细胞因子,此外它们还参与机体的多种生理及病理反应,比如在炎症反应中起重要作用。目前至少发现了38个白细胞介素,分别命名为IL-1~IL-38。
在本发明中,术语“单体”是指聚集体的其中一条单链多肽。例如,对于白细胞介素单体,是指某些通常以二聚体形式存在的白细胞介素的两条肽链中的其中一条肽链。
在本发明中,术语“二聚体”表示以成双的型态出现的一类物质。天然状态下的呈二聚体结构的白细胞介素包括但不限于IL-10(康名超,卢迎春,等.白细胞介素-10多肽缀合物其二聚体及其用途)、IL-5(Clutterbuck EJ,Hirst EM,Sanderson CJ.Humaninterleukin-5(IL-5)regulates the production of eosinophils in human bonemarrow cultures:comparison and interaction with IL-1,IL-3,IL-6,andGMCSF.Blood.1989May1;73(6):1504-12.PMID:2653458.)、IL-12(宋舸,袁玫,卢世璧.白细胞介素-12临床应用研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2007,14(001):75-79.)、IL-23(谭广,王忠裕.白细胞介素-23的研究进展[J].国际检验医学杂志,2006,27(10):3.)、IL-25(孟洁,厉小梅,徐蓓.白细胞介素-25在免疫炎症性疾病中的研究进展[J].中华风湿病学杂志,2012,16(11):3.)、IL-27(李阳夏丽坤.白细胞介素-27的生物学功能及其抗病毒作用的研究进展[J].国际免疫学杂志,2015,38(2):5.)和IL-35(张俊凤,田志康,薛庆节,等.IL-35在肿瘤中的作用机制研究进展[J].中国免疫学杂志,2020,36(7):5.)。
天然IL-5单体具有如下所示的氨基酸序列:
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES(SEQ ID NO:25)
在本发明中,术语“IL-10”和“IL10”可互换使用,天然状态下的IL-10分子通常以二聚体结构存在(包括两条天然IL-10单体,单个天然IL-10单体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列),天然IL-10分子与IL-10受体(IL-10R)结合方式如图1-A所示。目前临床IL-10药物缺乏靶向性,药物分子容易脱靶,不仅药效不易发挥且容易产生副作用。IL-10单体对IL-10Rα的活性比天然IL-10二聚体弱10倍(具体实验数据参考文献:J Biol Chem.2000May5;275(18):13552-7.doi:10.1074/jbc.275.18.13552.),且几乎无法介导与IL-10Rβ的进一步结合,因此很难激活下游信号引起生物学功能反应,IL-10单体与IL-10受体结合方式如图1-B所示。在本发明的一些具体的实施例中,将一条IL-10单体插入至抗体的其中一条轻链或重链的特定位置,形成“非对称结构”,制备得到非对称IL-10单体融合蛋白。根据本发明设计的IL-10单体融合蛋白,在无靶细胞聚集情况下,IL-10单体与IL-10Rα只有非常微弱的结合,甚至没有IL-10下游信号。只有抗体端结合到靶细胞后,才能通过聚集效应,将邻近的IL-10单体-IL-10Rα复合物聚拢,并进一步与IL-10Rβ结合形成复合物产生下游信号并引发生物功能(以IL-10单体插入抗体的其中一条重链的CH2区与CH3区之间为例,其作用机理如图2所示)。相较于IL-10单体融合蛋白,非对称IL-10单体融合蛋白只有一个IL-10单体,所以非对称IL-10单体融合蛋白就没有了类似正常IL-10分子或其抗体融合蛋白的给药剂量限制。非对称IL-10单体融合蛋白可以具有更大的给药剂量,这样也能为融合的抗体端(不同抗体的临床剂量有差异,如果IL-10的剂量限制太低,会严重限制非对称IL-10单体融合蛋白的抗体靶标选择)发挥功能提供更广泛的空间。
在一些具体的实施方式中,IL-5、IL-12、IL-23、IL-25、IL-27和IL-35等也可以应用于本发明的融合蛋白,取得与IL-10类似的效果。即,将一条白细胞介素单体插入到抗体的其中一条重链或轻链的特定位置,在抗体结合到靶细胞前,这些白细胞介素单体不能激活下游的信号;抗体结合到靶细胞后,白细胞介素单体通过聚集形成二聚体与对应的受体结合,进而发挥生物学功能。
在本发明中,术语“变体”,涵盖天然存在的变体和非天然存在的变体,通常是指具有天然多肽序列和结构的一种或多种化合物,相对于天然分子其具有一个或多个氨基酸添加、取代(本质上是保守的)和/或缺失。白细胞介素“变体”与“修饰后的”白细胞介素可互换使用,是指相对于天然白细胞介素分子其具有一个或多个氨基酸添加、取代(本质上是保守的)和/或缺失或者与天然白细胞介素的氨基酸序列具有至少95%(例如95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的该白细胞介素氨基酸序列的等同术语。
在本发明中,术语序列“同一性”指,当对两条序列进行最佳比对时(必要时引入间隙,以获取最大序列同一性百分比,且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分),两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)。为测定序列同一性百分比,比对可以通过本领域技术已知的技术来实现,例如使用公开可得到的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数,包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
在本发明中,术语“IL-10变体”是指与野生型IL-10的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)具有至少95%(例如95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的IL-10氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的位置为(i);该抗体的重链包含防止重链错配的修饰。
由于发明中的抗体的四条多肽链包括两条结构不同的重链和轻链,将一条白细胞介素单体或其变体插入重链或轻链后,在采用基因工程技术制备本发明的融合蛋白时,四条多肽链在组装的过程中可随机产生多种可能的结构组合,但仅有一种为目标产物(即正确配对的产物),其余的产物均为错配产生的无效产物甚至副产物(即非正确配对的产物)。因此为了提高抗体的正确组装,减少抗体链间的错配,以防止错配和形成无活性的分子,当白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的其中一条重链上时,可在抗体的两条中重链引入防止重链错配的修饰即防止两条相同的重链配对的修饰。
在本发明中,术语“防止重链错配的修饰”是指本领域内技术人员用来防止重链错配的一些设计或者修饰,包括但不限于KIH(Knob-In-Hole)、SEEDbodies(trand-exchangeengineered domain)、cFAE(arm exchange)、XmAb、亮氨酸拉链技术(LUZ-Y)等。其中,KIH技术是指在抗体的其中一条重链的CH3区发生突变,形成一个突起的类似“杵”的结构(Knob),在另外一条重链的CH3区发生突变,形成一个凹陷的类似“臼”的结构(Hole),杵臼设计有利于抗体重链的正确装配,含Knob的重链与含Hole的重链配对,含Knob的两条重链彼此之间不配对,含Hole的两条重链彼此之间不配对。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的一条重链的CH3区含有Knob结构域,该抗体的另一条重链的CH3区含有Hole结构域,上述Knob结构域与上述Hole结构域配对形成重链防错配结构。
在一些具体的实施方式中,根据EU编号系统,上述含有Knob结构域的重链的CH3区包含氨基酸突变:T366W、K392D和K409D,上述含有Hole结构域的重链的CH3区包含氨基酸突变:L368R、D399K和Y407A。
在本发明中,术语突变“AxxB”表示第xx位的氨基酸A突变为氨基酸B。例如,“T366W”表示第366位的苏氨酸(Thr;T)突变成色氨酸(Trp;W)。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体插入至含有Knob结构域的重链上。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体与上述抗体的含有Knob结构域的重链通过第一连接肽连接。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体的N末端与上述抗体的含有Knob结构域的重链的CH2区的C末端通过第一连接肽连接,上述白细胞介素单体或其变体的C末端与上述抗体的含有Knob结构域的重链的CH3区的N末端通过第一连接肽连接。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的含有Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-L1-Int-L1-CH3(Knob);其中,L1代表:第一连接肽,Int代表:白细胞介素单体或其变体。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3(Hole)。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL。
在一些具体的实施方式中,上述第一连接肽具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的位置为(ii);上述抗体包含防止轻链错配设计和防止重链错配设计。
在采用基因工程技术制备本发明融合蛋白时,若白细胞介素单体或其变体插入至上述抗体的其中一条轻链上时,可在抗体上引入防止轻链错配和重链错配的修饰:即防止两条相同的含白细胞介素单体或其变体的轻链与两条重链配对,也防止两条相同的不含白细胞介素单体或其变体的轻链与两条重链配对。
在本发明中,术语“防止轻链错配的修饰”是指本领域内技术人员用来防止轻链错配的一些设计或者修饰,包括但不限于Titin-Obscurin、CrossMab等。其中,Titin-Obscurin的核心设计在于一对互作蛋白的引入,即Titin(肌联蛋白)和Obscurin(遮蔽蛋白),将抗体一侧的CH1和CL分别用Titin和Obscurin替换,以避免轻链的错配。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的一条轻链的CL区被Obscurin结构域替换,上述抗体的一条重链的CH1区被Titin结构域替换,上述Obscurin结构域与上述Titin结构域配对形成轻链防错配结构;上述抗体的含Titin结构域的重链的CH3区含有Knob结构域,上述抗体的另一条重链的CH3区含有Hole结构域,上述Knob结构域与上述Hole结构域配对形成重链防错配结构。
在一些具体的实施方式中,上述Obscurin结构域具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,上述Titin结构域具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;
在一些具体的实施方式中,根据EU编号系统,上述含有Knob结构域的重链的CH3区包含突变:T366W、K392D和K409D,上述含有Hole结构域的重链的CH3区包含突变:L368R、D399K和Y407A。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体插入至含Obscurin结构域的轻链上。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体与上述抗体的轻链的Obscurin结构域通过第三连接肽连接;上述抗体的Titin结构域与VH区通过第二连接肽连接。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体或其变体的N末端与上述抗体的含有Obscurin结构域的轻链的VL区的C末端通过第一连接肽连接,上述白细胞介素单体或其变体的C末端与上述抗体的轻链的Obscurin结构域的N末端通过第三连接肽连接;
上述Titin结构域的N末端与VH的C末端通过第二连接肽连接;
在一些具体的实施方式中,上述抗体的含有Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-L1-Int-L3-Obs,其中,L1代表:第一连接肽,L3代表:第三连接肽,Int代表:白细胞介素单体或其变体,Obs代表:Obscurin结构域。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的不含Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的含有Titin结构域和Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-L2-Tit-CH2-CH3,其中,L2代表:第二连接肽,Tit代表:Titin结构域。
在一些具体的实施方式中,上述抗体的含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3。
在一些具体的实施方式中,上述第二连接肽具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,上述第三连接肽具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素选自IL-10单体、IL-5单体、IL-12单体、IL-23单体、IL-25单体、IL-27单体、IL-35单体。
在一些具体的实施方式中,上述白细胞介素单体为IL-10单体。
在一些具体的实施方式中,上述IL-10单体为天然IL-10单体或修饰后的IL-10单体。
在一些具体的实施方式中,上述天然IL-10单体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中,所述修饰后的IL-10单体在天然IL-10单体分子序列的其中两个氨基酸位点之间插入一段间隔肽;
在一些具体的实施方式中,所述修饰后的IL-10单体在天然IL-10单体分子序列的116N、117K两个位点之间插入一段间隔肽;
在一些具体的实施方式中,所述间隔肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;
在一些具体的实施方式中,所述修饰后的IL-10单体缺失了天然IL-10单体分子序列的N末端的前2个氨基酸;
在一些具体的实施方式中,上述修饰后的IL-10单体具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中,上述融合蛋白中的抗体特异性结合免疫检查点和/或肿瘤抗原。
在本发明中,术语“免疫检查点”是一类免疫抑制性分子,在免疫细胞上表达、能调节免疫激活程度,它们对防止自身免疫作用的发生起着重要作用。免疫检查点分子过度表达、功能过强或免疫抑制功能太差,都会导致机体的免疫功能出现异常。
在一些具体的实施方式中,上述免疫检查点分子选自PD-1、CD47、TIGIT、CD137、CD134、KIR、LAG-3、PD-L1、CTLA-4、B7.1、B7H3、CCRY、OX-40和CD40。
在本发明中,术语“肿瘤抗原”是指源自或与肿瘤或癌症疾病相关的抗原性多肽或蛋白质,通常来源于肿瘤/癌细胞,优选哺乳动物肿瘤/癌细胞,并且可以位于来源于哺乳动物,优选来源于人类的肿瘤细胞中或肿瘤细胞的表面,例如全身性或实体瘤。“肿瘤抗原”通常包括肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。TSA通常由肿瘤特异性突变引起,并由肿瘤细胞特异性表达。TAA通常由肿瘤细胞和“正常”(健康、非肿瘤)细胞呈现。
在一些具体的实施方式中,上述肿瘤抗原选自GUCY2C、MSLN、Claudin18.2、GPC3、EGFR、HER2、CEA、GD2、EGFRⅧ、MUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS1IE、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISSIR、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、EphA2、FAP、IL13-Ra2、PSMA、ROR1、VEGFR-Ⅱ、FR-a、EpCAM、EGFRⅦ、tMUC1、PSCA、FCER2、GPR18、FCRLA、CXCR5、FCRL3、FCRL2、HTR3A、CLEC17A、TRPMI、SLC45A2、SLC24A5、DPEP3、KCNK16、LIM2,KCNV2、SLC26A4、CD171、Glypican-3、IL-13、CD79a/b和MAGEA4等。
在一些具体的实施方式中,上述抗体特异性结合PD-1。在本发明中,术语“PD-1”是指程序性死亡受体1,其属于免疫球蛋白超家族并且作为共抑制受体发挥负向调节免疫系统的作用。在本发明中,“PD-1”与“PD1”可互换使用。PD-1是CD28/CTLA-4家族的一员,有两个已知的配体,包括PD-L1和PD-L2。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡,使肿瘤细胞获得免疫逃逸,以PD-1和PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。人PD-1的代表性氨基酸序列公开于NCBI登录号:NP005009.2,编码人PD-1的代表性核酸序列显示于NCBI登录号:NM 005018.2。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种多特异性结合分子,其包括前述的融合蛋白。
在本发明中,术语“多特异性结合分子”是指能够与两种或更多种不同的目标抗原或表位结合的多特异性分子。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种核酸,其编码前述的融合蛋白。
在本发明中,术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用,并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物,涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸,所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的,具有与参考核酸相似的结合特性,并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。编码多肽或融合蛋白的核酸指编码多肽或融合蛋白的一个或更多个核酸分子,包括在单一载体或分开的载体中的这样的一个或更多个核酸分子,和存在于宿主细胞中一个或更多个位置的这样的一个或更多个核酸分子。除非另有说明,否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。
在本发明的第四方面,本发明提供了一种表达载体,其含有前述的核酸。
在本发明中,术语“载体”是指可将遗传元件(例如前述核酸分子)操作性地插入其中并使该遗传元件获得表达的一种运载工具,例如产生由该遗传元件编码的蛋白质、RNA或DNA,或者复制所述遗传元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。举例来说,载体包括:质粒、噬菌粒、柯斯质粒(cosmid)、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体,以及动物病毒等。载体可含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分,包括但不限于,病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。在一些实施方案中,本发明提供的载体(例如表达载体)含有本发明所述的编码融合蛋白的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如,SV40、CMV、EF-1α),以及至少一个选择标记。
在本发明的第五方面,本发明提供了一种重组细胞,其携带前述的核酸、前述的表达载体、表达前述的融合蛋白或表达前述的多特异性结合分子。
在本发明中,术语“重组细胞”是指可以或已经导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。该重组细胞中包含有该载体,可以将载体导入到哺乳动物细胞中,构建获得重组细胞,然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。对该重组细胞进行培养,即可以获得相应抗体或融合蛋白。可用的哺乳动物细胞可以为CHO细胞等。
在本发明的第六方面,本发明提供了前述的融合蛋白、前述的多特异性结合分子前述的核酸、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备药物中的用途,上述药物用于治疗、预防或诊断肿瘤或炎性疾病。
在本发明中,术语“治疗或预防”指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预,并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗或预防的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生,减轻症状,减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果,预防转移,降低疾病进展速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。
在本发明在,术语“诊断”是指病理状态、疾病或状况的鉴定、揭示、查明和/或定义致病过程的定位。在一些具体的实施方式中,本发明中的药物组合物施用于受试者或接触来自受试者的样品时,有助于诊断癌症、肿瘤形成或状况。
在本发明中,术语“癌症”和“肿瘤”可互换使用,是指多细胞生物体内异常的细胞团,由不受控制和进行性的过度细胞分裂引起,不受控制的生长会导致这些细胞侵入、进入甚至破坏邻近组织。癌细胞也可以扩散到其他位置,这可能导致转移的形成。
在本发明中,术语“炎性疾病”是指以异常炎症为特征的疾病或病症(例如,与对照如未患疾病的健康人相比炎症水平增加)。炎性疾病的实例包括但不限于自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、幼年发病糖尿病、1型糖尿病、格林-巴利综合征、桥本脑炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、干燥综合征、血管炎、肾小球肾炎、自身免疫性甲状腺炎、白塞病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、结节病、鱼鳞病、格雷夫斯眼病、炎症性肠病、艾迪生病、白癜风、哮喘、过敏性哮喘、寻常痤疮、乳糜泻、慢性前列腺炎、炎症性肠病、盆腔炎、再灌注损伤、缺血再灌注损伤、中风、结节病、移植排斥、间质性膀胱炎、动脉粥样硬化、硬皮病和特应性皮炎等。
在本发明的第七方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含前述的融合蛋白、前述的多特异性结合分子、前述的核酸、前述的表达载体或前述的重组细胞。
在本发明中,术语“药物组合物”是以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在,并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。
在一些具体的实施方式中,上述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明中,术语“药学上可接受的载体”指药学配制剂中与活性成分不同的,且对受试者无毒的成分,包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、或生理学上相容的任何溶剂等。
在本发明的第八方面,本发明提供了一种治疗、预防或诊断肿瘤或炎性疾病、病症或状况的方法,其包括向受试者施用治疗有效量的前述药物组合物。
在本发明中,术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物受试者或患者。除非指出时,否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。示例性受试者包括但不限于人、猴、犬、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、禽、山羊和绵羊。在某些实施方案,所述受试者是人。在一些实施方案,所述受试者是疑似患有癌症、自体免疫性疾病或病况、和/或感染的人。
在本发明中,术语“施用”或“给予”,当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时,是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。
在本发明中,术语“有效量”一般是指足以降低症状的严重程度及/或频率、消除这些症状及/或潜在病因、预防症状及/或其潜在病因出现及/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤(例如肺病)的量。在一些实施例中,有效量是治疗有效量或预防有效量。
在本发明中,术语“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状,或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。
在本发明中,术语“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应,例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发),或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。完全治疗或预防未必在给予一个剂量之后便发生,可能在给予一系列剂量之后发生。因而,治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。
在本发明中,术语“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于多种因素变化,诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重,以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另外指明,否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
IL-10单体融合蛋白的构建方法
本实施例将IL-10单体插入到抗体分子(本实施例以抗PD-1抗体为例,本发明所用抗PD-1抗体的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示)的不同位置中以获得融合蛋白,其中,IL-10单体分子的构建的具体实验操作主要参考《分子克隆实验指南》。
天然IL-10单体分子(即IL-10WT)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,在天然IL-10单体分子序列的116N、117K两个位点之间插入如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的间隔肽,同时去除天然IL-10单体的N末端的前2个氨基酸,从而形成本发明实施例的修饰后的IL-10单体(即IL-10M),其序列如SEQ ID NO:5所示。
抗PD-1抗体的重链的氨基酸序列:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1);
抗PD-1抗体的轻链的氨基酸序列:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:2);
天然IL-10单体分子的氨基酸序列:
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALS EMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:3);
间隔肽的氨基酸序列:
GGGSGG(SEQ ID NO:4);
本实施例修饰后的IL-10单体(后文也用“IL-10单体”或“IL-10M”表示)的氨基酸序列:
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEM IQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:5);
示例性融合蛋白R1738的构建
按照EU编号,将抗体的一条重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:T366W、K392D和K409D,形成Knob结构域,另一条重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:L368R、D399K和Y407A,形成Hole结构域,Knob结构域与Hole结构域配对形成KIH重链防错配结构。抗体的两条轻链相同,不做任何修饰。
将IL-10单体的N末端与抗体的含有Knob结构域的重链的CH2区的C末端通过具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的肽段(即,第一连接肽,L1,linker1)连接,IL-10单体的C末端与抗体的含有Knob结构域的重链的CH3区的N末端通过第一连接肽连接。所得示例性融合蛋白R1738具有如SEQ ID NO:7(含有Knob结构域的重链)、SEQ ID NO:8(含有Hole结构域的重链)和SEQ ID NO:9(轻链)所示的氨基酸序列,融合蛋白的具体结构如图3A所示(图中展示了IL-10单体的插入位置)。
第一连接肽的氨基酸序列:
GSGSGSGS(SEQ ID NO:6);
融合蛋白R1738中含有Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-L1-IL10-L1-CH3,其中,L1代表:第一连接肽
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGSGSGSGSGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7);
融合蛋白R1738中含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:8);
融合蛋白R1738的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:9);
示例性融合蛋白R1737的构建
抗体的一条轻链的CL区被具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的Obscurin结构域替换,抗体的一条重链的CH1区被具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的Titin结构域替换,Titin结构域的N末端与VH的C末端通过具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的肽段(即,第二连接肽,L2)连接,Obscurin结构域与Titin结构域配对形成轻链防错配结构;按照EU编号,将抗体中含有Knob结构域的重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:T366W、K392D和K409D,形成Knob结构域,另一条重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:L368R、D399K和Y407A,形成Hole结构域,Knob结构域与Hole结构域配对形成KIH重链防错配结构。
将IL-10单体的N末端与抗体的含有Obscurin结构域的轻链的VL区的C末端通过第一连接肽连接,IL-10单体的C末端与抗体的Obscurin结构域的N末端通过具有如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列的肽段(即,第三连接肽,L3)连接。所得示例性融合蛋白R1737具有如SEQ ID NO:14(含有Obscurin结构域的轻链)和SEQ ID NO:9(不含Obscurin结构域的轻链)、SEQ ID NO:15(含有Titin结构域和Knob结构域的重链)、SEQ ID NO:8(含有Hole结构域的重链)所示的氨基酸序列,融合蛋白的具体结构如图3C所示(图中展示了IL-10单体的插入位置)。
Obscurin结构域的氨基酸序列:
APRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA(SEQ ID NO:10);
Titin结构域的氨基酸序列:
IPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQD GGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI(SEQ ID NO:11);
第二连接肽的氨基酸序列:
GGGGSG(SEQ ID NO:12);
第三连接肽的氨基酸序列:
GSGSGSGSGGGGSSG(SEQ ID NO:13);
融合蛋白R1737中含有Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-L1-IL10-L3-Obs,其中,L1代表:第一连接肽,L3代表:第三连接肽,Obs代表:Obscurin结构域
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRGSGSGSGSGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSGGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA(SEQ ID NO:14);
融合蛋白R1737中不含Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFT LTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:9);
融合蛋白R1737中含有Titin结构域和Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-L2-Tit-hinge-CH2-CH3,其中,L2代表:第三连接肽,Tit代表:Titin结构域
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSIEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:15);
融合蛋白R1737中含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:8);
对照融合蛋白R1739的构建
抗体的一条轻链的CL区被具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的Obscurin结构域替换,Obscurin结构域的N末端与VL的C末端通过具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的肽段(即,第四连接肽,L4)连接,抗体的一条重链的CH1区被具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的Titin结构域替换,Titin结构域的N末端与VH的C末端通过第二连接肽连接,Obscurin结构域与Titin结构域配对形成轻链防错配结构;按照EU编号,将抗体中含有Knob结构域的重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:T366W、K392D和K409D,形成Knob结构域,另一条重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:L368R、D399K和Y407A,形成Hole结构域,Knob结构域与Hole结构域配对形成KIH重链防错配结构。
将IL-10单体的N末端与抗体的轻链的Obscurin结构域的C末端通过具有如SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列的肽段(即,第5连接肽,L5)连接。所得对照融合蛋白R1739具有如SEQ ID NO:18(含有Obscurin结构域的轻链)和SEQ ID NO:9(不含Obscurin结构域的轻链)、SEQ ID NO:15(含有Knob结构域和Titin结构域的重链)、SEQ ID NO:8(含有Hole结构域的重链)所示的氨基酸序列,融合蛋白的具体结构如图3D所示(图中展示了IL-10单体的插入位置)。
第四连接肽的氨基酸序列:
GGGGSSG(SEQ ID NO:16);
第五连接肽的氨基酸序列:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:17);
融合蛋白R1739中含有Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-L4-Obs-L5-IL10,其中,L4代表:第四连接肽,Obs代表:Obscurin结构域,L5代表:第五连接肽
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRGGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:18);
融合蛋白R1739中不含Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:9);
融合蛋白R1739中含有Titin结构域和Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-L2-Tit-hinge-CH2-CH3,其中,Tit代表:Titin结构域
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSIEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:15);
融合蛋白R1739中含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:8);
对照融合蛋白R1740的构建
按照EU编号,将抗体的一条重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:T366W、K392D和K409D,形成Knob结构域,另一条重链的CH3的三个氨基酸位点进行突变:L368R、D399K和Y407A,形成Hole结构域,Knob结构域与Hole结构域配对形成KIH重链防错配结构。抗体的两条轻链相同,不做任何修饰。
将IL-10单体的N末端与抗体的含有Knob结构域的重链的CH3区的C末端通过第五连接肽连接。所得示例性融合蛋白R1740具有如SEQ ID NO:19(含有Knob结构域的重链)、SEQ ID NO:8(含有Hole结构域的重链)和SEQ ID NO:9(轻链)所示的氨基酸序列,融合蛋白的具体结构如图3B所示(图中展示了IL-10单体的插入位置)。
融合蛋白R1740中含有Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3-L5-IL10,其中,L5代表:第五连接肽
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:19);
融合蛋白R1740中含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:8);
融合蛋白R1740的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:9);
实施例2.非对称结构IL10单体融合蛋白的制备
通过常规方法构建、制备含目的基因的质粒。将含有目的基因的质粒通过与转染试剂PEI形成阳离子复合物后,导入到Expi293宿主细胞,质粒在细胞内期间,质粒上的外源基因在细胞内发生转录翻译,从而得到所述融合蛋白,具体实验操作如下:
Expi293宿主细胞在37℃、8%二氧化碳、130rpm条件培养,并在转染前通过细胞计数,将2E6的细胞接种至1L摇瓶中,培养体系约为300mL。配制转染复合物准备转染:首先将750μg目标质粒加入到含有15mL Opti-MEM试剂的50mL离心管中,轻轻混匀,标记为A管;将1.5mg转染试剂PEI加入到含有15mL Opti-MEM试剂的50mL离心管中,轻轻混匀后,室温孵育5min,标记为B管;将B管PEI稀释液逐滴加入到A管DNA稀释液中,轻轻混匀后,室温孵育15min,孵育结束后,将PEI-目标质粒复合物加入到Expi293细胞,置于37℃摇床中继续培养,培养至D5-D10后收样。
瞬转细胞表达液经过9000rpm/20min离心,收集上清,再经过0.22μm滤膜除菌过滤。纯化采用ProA亲和层析。过程如下,使用AKTA avant 150层析设备,用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)平衡层析柱(如MabSelectSuRe LX,GE),加载样品至层析柱,使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)再次冲洗层析柱,随后使用洗脱缓冲液(20mM NaAc,pH=3.4)洗脱目标蛋白,收集管中预先加入中和缓冲液(1M Tris,pH=8.0),中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定,一般加入10%洗脱体积量。
R0987具有两条相同的轻链和两条相同的重链,两条轻链的VL区与CL区之间各插入一条IL-10单体,其结构示意图如图4所示,其中一条轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRGSGSGSGSGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:21);
其中一条重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:20)。
R0989具有两条相同的重链,两条重链的CH2区与CH3区之间各插入一条IL-10单体,其结构示意图如图4所示,其中一条重链序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGSGSGSGSGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:22)。
R0987具有两条相同的轻链,其中一条轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:23)。
部分融合蛋白表达数据如表1所示,一步亲和纯化后样品经SEC-HPLC检测,目标纯度在60%以上。样品经SDS-PAGE检测,显示正确的轻重链分布,并与SEC-HPLC检测结果一致,电泳图见图5。得出结论,R1737和R1738融合蛋白展现出良好的生产性质。
表1
实施例3.IL-10单体融合蛋白的体外活性
3.1流式法检测IL-10单体融合蛋白的抗体端、IL-10单体端的结合活性
用含3%BSA的PBS buffer将融合蛋白分子、R0674(IL10端阳性对照分子,由Fc区以及在其C端融合的IL10WT组成,其包括两条相同的肽链,其中一条肽链如下:Hinge-CH2-CH3-linker-IL10WT,其结构如图4所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)、R1049(其结构如图4所示,抗PD-1的单抗对照,其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)、R0862(其结构如图4所示,即Isotype,阴性对照抗体;其重链氨基酸序列、轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:28、29所示)稀释成初始浓度200nM,体积180μL,3倍梯度稀释(60样品μL+120μL稀释Buffer),10个浓度梯度点。将CHO-mPD1细胞(表达小鼠PD-1的CHO细胞)或者CHO-hIL10R细胞(表达人IL10Rα的CHO细胞)离心350g/5min离心后弃去上清,用3%BSA的PBS buffer调整细胞密度为2E+06,按100μL/管均分到96孔V型板中;将上述稀释好的分子加入到细胞中,100μL/孔,2-8度孵育0.5h;取出96孔板,350g离心5min,小心去上清后,加入3%BSA的PBS buffer 200μL/孔,再次350g离心5min,小心去上清;用含3%BSA的PBS buffer配制PE荧光二抗(1:500稀释),按100μL/孔加入对于的96孔板中,重悬细胞,2-8度孵育30min;取出96孔板,250g离心5min,小心去上清后,加入含3%BSA的PBS buffer 200μL/孔,再次350g离心5min,小心去上清;用1xPBS100μL/孔重悬,FACS检测。
R0674的其中一条肽链的氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:24)。
R1049的其中一条重链序列:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:26)。
R1049的其中一条轻链序列:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:27)
R0862的其中一条重链序列:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYDGSNKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRGVMYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:28)。
R0862的其中一条轻链序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRNNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:29)。
IL-10单体融合蛋白对IL-10Rα的结合活性检测结果见图6,R1738的IL-10端结合活性相较R0989和R1740均下降;R1737的IL-10端结合活性相较R0987和R1739均下降。
IL-10单体融合蛋白抗体端的结合活性检测结果见图7,非对称结构IL10单体融合蛋白分子R1737的mPD1端结合活性相较R0987和R1739均没有太大变化,非对称结构IL10单体融合蛋白分子R1738的mPD1端结合活性相较R0989和R1740均没有太大变化。
3.2融合蛋白的IL10端报告基因活性检测
用DMEM将融合蛋白、R0674、R0579(IL-10-阳性抗体融合蛋白对照,其中所述IL-10去除了天然IL-10的前2个氨基酸,未插入间隔肽,其结构如图4其重链氨基酸序列如SEQ IDNO:30所示,其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示)、R1187(不带靶向的IL10端阳性对照分子,由非PD1靶向抗体与IL10M融合而成,包括两条相同的重链和两条相同的轻链,两条轻链的C端均融合IL10M,其结构如图4所示,其重链氨基酸序列、轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:32、33所示)稀释成初始浓度50nM,体积360μL,3倍梯度稀释(120μL样品+240μL稀释Buffer),6个浓度梯度点;细胞准备:取出正在培养的HEK293-hIL10报告基因细胞(吉满生物科技公司,货号为GM-C07927;该细胞系稳定表达IL10R及STAT3信号通路报告基因系统,使用IL10蛋白刺激,能够激活细胞荧光素酶表达上升)在显微镜下观察,细胞贴壁正常,颗粒透亮,且密度适中的细胞可以作为实验所用的效应细胞。
将上述细胞用TE消化,终止消化后在350g/4min离心去上清,用1%FBS-PBS重悬后再清洗一遍;弃上清,最终使用培养基重悬细胞,细胞计数后调整细胞密度5E5/mL,按照每孔50μL铺板,之后置于37℃培养箱贴壁处理6h。将靶细胞R0326Fc-118细胞(稳定表达PD1,在该体系中发挥富集作用)离心350g/5min离心后弃去上清,用3%BSA的PBS buffer调整细胞密度为1E+06;在平底板中配制反应体系(1.富集体系:按照实验设计先将稀释好的融合蛋白以25μL/孔的体积与靶细胞R0326Fc-118等体积混合后,共孵育约30min,之后将靶细胞R0326与Ab一起小心转入到贴壁处理的HEK293-hIL10报告基因细胞中;在Medium only的孔里加100ΜI Assay Buffer,Cell only的孔中补加25μL的Assay Buffer,最终所有孔的终体积为100μL,边缘孔用200μL的无菌水封上,将96孔板继续在培养箱中培养16h;2.无富集 体系:不加靶细胞(R0326Fc-118),即直接往贴壁处理好的细胞中加入对应抗体;其他操作同富集体系)。提前解冻Bright-LumiTM萤火虫荧光素酶检测试剂,平衡至室温。细胞培养到时间点后取出细胞培养板平衡至室温10min(不宜超过30min)。每孔加入100μL Bright-Lumi TM萤火虫荧光素酶检测试剂,室温孵育5-10min。将反应结束的体系,每孔取100μL至96孔全白板中;多功能酶标仪,使用化学发光模式检测信号。
R0579的其中一条重链序列:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:30)。
R0579的其中一条轻链序列:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQID NO:31)。
R1187的重链从N端到C端的结构为VH-CH1-Hinge-CH2-CH3,其氨基酸序列如下:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYDGSNKYYTDSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRGVMYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS
KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN
HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:32)。
R1187的轻链从N端到C端的结构为VL-CL-L5-IL10,其氨基酸序列如下:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT
DFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRNNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLD
NLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPC
ENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:33)。
检测结果见图8,对照分子在富集前、后的报告基因信号值无较大改变;而R1738和R1737在有靶细胞的富集体系中报告基因信号值均有所提升;其中,非对称结构IL-10单体融合蛋白R1738在无抗体靶细胞的体系中无信号值,在含抗体靶细胞的富集体系中信号值明显提升,说明本发明实施例提供的R1738和R1737融合蛋白分子在缺乏抗体靶细胞的情况下不会产生IL-10的生物学活性,具有低副作用的特点,可以具有更大的给药剂量。
实施例4
采用ELISA法检测各IL10融合蛋白与IL10Rα结合的活性
将抗原IL10Rα(IL10Rα-his)稀释成1μg/mL(稀释液:50mM CB),按照100μL/孔加入96孔酶标板,用封板膜封住,4℃冰箱静置过夜;第二天用1×PBST清洗3次并拍干,按照200μL/孔加入assay buffer(1% BSA),室温封闭1.5h;用1×PBST清洗1次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的待测抗体(60nM起始,3倍稀释11个浓度点),用封板膜封住,室温振荡(500rpm)孵育1.5h;用1×PBST清洗板条5次并拍干,按照100μL/孔加入assaybuffer稀释后的GAH-IgG Fc HRP(1:10K),用封板膜封住,室温孵育40min;用1×PBST清洗板条6次并拍干,按照100μL/孔加入TMB显色液,室温孵育5-10min;按照100μL/孔加入终止液,于450nm&630nm处读板,用SoftMax Pro分析数据。
结合活性检测结果见图9(图中“Span”表示高平台和低平台的差值,数值越大说明窗口比较大,检测灵敏度高);可以看出,R1737、R1738、R1739对IL10Rα的结合活性分别较改造前的对照分子(R0987、R0989、R0991)降低较多。说明IL10单体插入R1737、R1738、R1739所示位置减弱了IL10单体对IL10Rα的结合活性。
实施例5
采用ELISA法检测各IL10融合蛋白与IL10Rβ结合的活性
将抗体His-Tag Mouse mAb稀释成1μg/mL(稀释液:50mM CB),按照100μL/孔加入96孔酶标板,用封板膜封住,4℃冰箱静置过夜;第二天用1×PBST清洗3次并拍干,按照200μL/孔加入assay buffer(1% BSA),室温封闭1.5h;用1×PBST清洗1次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的抗原R2050(IL10β-his,1μg/mL),用封板膜封住,室温振荡(500rpm)孵育1h;用1×PBST清洗5次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的待测抗体(60nM起始,3倍稀释11个浓度点),用封板膜封住,室温振荡(500rpm)孵育1.5h;用1×PBST清洗板条5次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的GAH-IgG Fc HRP(1:10K),用封板膜封住,室温孵育40min;用1×PBST清洗板条6次并拍干,按照100μL/孔加入TMB显色液,室温孵育20-30min;按照100μL/孔加入终止液,于450nm&630nm处读板,SoftMaxPro分析数据。
结合活性检测结果见图10;可以看出,R1737、R1738、R1739对IL10Rβ的结合活性分别较改造前的对照分子(R0987、R0989)降低较多。说明IL10单体插入R1737、R1738所示位置减弱了IL10单体对IL10Rβ的结合活性。
实施例6
PD1采用ELISA法检测各IL10融合蛋白与IL10Rα/IL10Rβ结合的活性
将抗原R2051-E7(IL10Rα/IL10Rβ-hFc)稀释成1μg/mL(稀释液:50mM CB),按照100μL/孔加入96孔酶标板,用封板膜封住,4℃冰箱静置过夜;第二天用1×PBST清洗3次并拍干,按照200μL/孔加入assay buffer(1% BSA),室温封闭1.5h;用1×PBST清洗1次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的待测抗体(60nM起始,3倍稀释11个浓度点),用封板膜封住,室温振荡(500rpm)孵育1.5h;用1×PBST清洗板条5次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的mPD1-His(1μg/mL),用封板膜封住,室温孵育1h;用1×PBST清洗板条5次并拍干,按照100μL/孔加入assay buffer稀释后的anti-his HRP(1:5K),用封板膜封住,室温孵育40min;用1×PBST清洗板条6次并拍干,按照100μL/孔加入TMB显色液,室温孵育10-15min;按照100μL/孔加入终止液,于450nm&630nm处读板,SoftMax Pro分析数据。
结合活性检测结果见图11;可以看出,R1737、R1738对IL10Rα/IL10Rβ的结合活性分别较改造前的对照分子(R0987、R0989)降低较多。说明IL10单体插入R1737、R1738所示位置减弱了IL10单体对IL10Rα/IL10Rβ的结合活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
1.一种融合蛋白,其特征在于,其包含:抗体,和插入在所述抗体中的白细胞介素单体或其变体;
所述抗体为免疫球蛋白,其具有两条相同的轻链和两条相同的重链,所述轻链包括VL区和CL区,所述重链包括VH区、CH1区、CH2区、和CH3区;所述白细胞介素单体或其变体插入至所述抗体的位置为如下(i)或(ii):
(i)所述白细胞介素单体或其变体插入至所述抗体的其中一条重链的CH2区和CH3区之间;
(ii)所述白细胞介素单体或其变体插入至所述抗体的其中一条轻链的VL区和CL区之间。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体或其变体插入至所述抗体的位置为(i);所述抗体的重链包含防止重链错配的修饰。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述抗体的一条重链的CH3区含有Knob结构域,所述抗体的另一条重链的CH3区含有Hole结构域,所述Knob结构域与所述Hole结构域配对形成重链防错配结构。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白,其特征在于,根据EU编号系统,含有Knob结构域的重链的CH3区包含氨基酸突变:T366W、K392D和K409D,含有Hole结构域的重链的CH3区包含氨基酸突变:L368R、D399K和Y407A。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体或其变体插入至含有Knob结构域的重链上;
可选地,所述白细胞介素单体或其变体与所述抗体的含有Knob结构域的重链通过第一连接肽连接。
6.根据权利要求3-5任一项所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体或其变体的N末端与所述抗体的含有Knob结构域的重链的CH2区的C末端通过第一连接肽连接,所述白细胞介素单体或其变体的C末端与所述抗体的含有Knob结构域的重链的CH3区的N末端通过第一连接肽连接;
可选地,所述抗体的含有Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-L1-Int-L1-CH3,其中,L1代表:第一连接肽,Int代表:白细胞介素单体或其变体;
所述抗体的含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3;
所述抗体的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL。
7.根据权利要求5或6所述的融合蛋白,其特征在于,所述第一连接肽具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体或其变体插入至所述抗体的位置为(ii);所述抗体包含防止轻链错配的修饰和防止重链错配的修饰。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白,其特征在于,所述抗体的一条轻链的CL区被Obscurin结构域替换,所述抗体的一条重链的CH1区被Titin结构域替换,所述Obscurin结构域与所述Titin结构域配对形成轻链防错配结构;
所述抗体的含Titin结构域的重链的CH3区含有Knob结构域,所述抗体的另一条重链的CH3区含有Hole结构域,所述Knob结构域与所述Hole结构域配对形成重链防错配结构。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白,其特征在于,所述Obscurin结构域具有如SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列,所述Titin结构域具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;
可选地,根据EU编号系统,所述含有Knob结构域的重链的CH3区包含氨基酸突变:T366W、K392D和K409D,所述含有Hole结构域的重链的CH3区包含氨基酸突变:L368R、D399K和Y407A。
11.根据权利要求9或10所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体或其变体插入至含Obscurin结构域的轻链上;
可选地,所述白细胞介素单体或其变体与所述抗体的轻链的Obscurin结构域通过第三连接肽连接;所述抗体的Titin结构域与VH区通过第二连接肽连接。
12.根据权利要求9-11任一项所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体或其变体的N末端与所述抗体的含有Obscurin结构域的轻链的VL区的C末端通过第一连接肽连接,所述白细胞介素单体或其变体的C末端与所述抗体的轻链的Obscurin结构域的N末端通过第三连接肽连接;所述Titin结构域的N末端与VH的C末端通过第二连接肽连接;
可选地,所述抗体的含有Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-L1-Int-L3-Obs,其中,L1代表:第一连接肽,L3代表:第三连接肽,Int代表:白细胞介素单体或其变体,Obs代表:Obscurin结构域;
所述抗体的不含Obscurin结构域的轻链从N端到C端的结构如下:VL-CL;
所述抗体的含有Titin结构域和Knob结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-L2-Tit-CH2-CH3,其中,L2代表:第二连接肽,Tit代表:Titin结构域;
所述抗体的含有Hole结构域的重链从N端到C端的结构如下:VH-CH1-hinge-CH2-CH3。
13.根据权利要求11或12所述的融合蛋白,其特征在于,所述第二连接肽具有如SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列,所述第三连接肽具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13任一项所述的融合蛋白,其特征在于,所述白细胞介素单体选自IL-10单体、IL-5单体、IL-12单体、IL-23单体、IL-25单体、IL-27单体、和IL-35单体;
优选地,所述白细胞介素单体为IL-10单体。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白,其特征在于,所述IL-10单体为天然IL-10单体或修饰后的IL-10单体;
优选地,所述天然IL-10单体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;
优选地,所述修饰后的IL-10单体在天然IL-10单体分子序列的其中两个氨基酸位点之间插入一段间隔肽;
优选地,所述修饰后的IL-10单体在天然IL-10单体分子序列的116N、117K两个位点之间插入一段间隔肽;
优选地,所述间隔肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;
优选地,所述修饰后的IL-10单体缺失了天然IL-10单体分子序列的N末端的前2个氨基酸;
优选地,所述修饰后的IL-10单体具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15任一项所述的融合蛋白,其特征在于,所述抗体特异性结合免疫检查点和/或肿瘤抗原;
优选地,所述免疫检查点分子选自PD-1、CD47、TIGIT、CD137、CD134、KIR、LAG-3、PD-L1、CTLA-4、B7.1、B7H3、CCRY、OX-40和CD40;
优选地,所述肿瘤抗原选自GUCY2C、MSLN、Claudin18.2、GPC3、EGFR、HER2、CEA、GD2、EGFRⅧ、MUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS1IE、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISSIR、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、EphA2、FAP、IL13-Ra2、PSMA、ROR1、VEGFR-Ⅱ、FR-a、EpCAM、EGFRⅦ、tMUC1、PSCA、FCER2、GPR18、FCRLA、CXCR5、FCRL3、FCRL2、HTR3A、CLEC17A、TRPMI、SLC45A2、SLC24A5、DPEP3、KCNK16、LIM2,KCNV2、SLC26A4、CD171、Glypican-3、IL-13、CD79a/b和MAGEA4;
优选地,所述抗体特异性结合PD-1。
17.一种多特异性结合分子,其特征在于,所述多特异性结合分子包括权利要求1-16任一项所述的融合蛋白。
18.一种核酸,其特征在于,所述核酸编码权利要求1-16任一项所述的融合蛋白或权利要求17所述的多特异性结合分子。
19.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体包含权利要求18所述的核酸。
20.一种重组细胞,其特征在于,所述重组细胞携带权利要求18所述的核酸、权利要求19所述的表达载体、表达权利要求1-16任一项所述的融合蛋白或表达权利要求17所述的多特异性结合分子。
21.权利要求1-16任一项所述的融合蛋白、权利要求17所述的多特异性结合分子、权利要求18所述的核酸、权利要求19所述的表达载体或权利要求20所述的重组细胞在制备药物中的用途,所述药物用于治疗或预防肿瘤或炎性疾病。
22.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1-16任一项所述的融合蛋白、权利要求17所述的多特异性结合分子、权利要求18所述的核酸、权利要求19所述的表达载体或权利要求20所述的重组细胞;
可选地,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
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