CN117229413A - 一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法 - Google Patents

一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法 Download PDF

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CN117229413A CN202311127517.2A CN202311127517A CN117229413A CN 117229413 A CN117229413 A CN 117229413A CN 202311127517 A CN202311127517 A CN 202311127517A CN 117229413 A CN117229413 A CN 117229413A
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，提供一种针对SFTSV‑Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法。本发明提供的一种针对SFTSV‑Gn和CD3的双特异性抗体是两种scFv串联而成，不存在Fc段，组装效率高，不存在抗体轻重链错配的问题，还可以高亲和力地靶向结合有Gn蛋白表达的SFTSV感染细胞，治疗效果稳定，而且可以有效的介导T细胞对SFTSV感染细胞的杀伤作用，杀伤作用显著，并且显著延长了SFTSV感染小鼠的生存期。

Description

一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法。
背景技术
发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)是一种导致人体患伴有发热、血小板减少和白细胞减少等综合性症状的病原体，已经成为公共卫生严重威胁。SFTSV的病毒颗粒附着在细胞膜上，通过糖蛋白和宿主细胞之间的相互作用进入细胞，其中Gn/Gc糖蛋白广泛地介导它进入人类和动物细胞系。感染后的潜伏期通常为5至14天。发热、胃肠道不适、血小板减少，在极端情况下，胰腺损伤、心肌损伤，甚至中枢神经系统病变和脑炎，都是常见的临床表现。
病毒感染伴有抗病毒免疫反应的损害。T淋巴细胞是介导细胞免疫反应的主要免疫细胞。对SFTSV的血清学反应缺陷已被发现与疾病的发病率和病死率相关，而T细胞损伤会导致抗病毒免疫的破坏。在SFTSV感染的早期过程中，T细胞缺乏，特别是在严重疾病的患者，患者T细胞的丢失伴随免疫检查点分子的上调，急性SFTSV感染期间免疫细胞上的程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，T细胞呈现重度耗竭的表型，这些结果显示发热伴感染急性期患者特别是后续发生死亡的患者中T细胞抗病毒免疫被明显的损害。
现有可用于治疗SFTSV的药物有法匹拉韦、硼替佐米(PS-341)和六氯酚等，均属于核苷酸类似物。法匹拉韦是一种吡嗪衍生物，根据法匹拉韦的小鼠实验，它证明了法匹拉韦提高了在SFTSV感染的致死模型中的存活率，而不会导致体重减轻，并降低了血清中的病毒载量，该治疗方法将可用于常规的临床应用；硼替佐米(PS-341)是一种二肽硼酸类似物，是一种FDA批准的高选择性可逆性蛋白酶体抑制剂，已被证明具有抗病毒活性。对PS-341的研究表明，PS-341处理降低了易感细胞中SFTSV的增殖，并抑制了SFTSV的复制和释放以及NSs介导的RIG-I的降解。数据显示，PS-341通过诱导细胞凋亡来抑制SFTSV的复制；六氯酚是通过ELISA对FDA许可的1528种药物进行筛选所得到的一种抗病毒化合物，其活性最好。根据机制研究，六氯酚通过干扰细胞膜融合来阻止SFTSV进入宿主细胞，通过分子对接研究，预测了六氯酚与SFTSV Gc糖蛋白I和III结构域之间的疏水区的高度稳定结合，六氯酚新发现的抗病毒特性和机制将使其能够作为一种先导分子，进一步增加抗SFTSV活性和降低药物毒性。
核苷酸类似物的作用机制是它通过与天然核苷酸竞争反转录酶的结合位点而发挥作用，由于与天然核苷酸的结构相似，核苷酸类似物可与反转录酶结合并成为合成中的病毒DNA链的一部分，一旦与病毒基因结合，核苷酸类似物即阻止其他核苷酸进入合成中的DNA链，从而终止病毒基因的复制。但是核苷酸类似物仅能抑制病毒复制而不是杀灭病毒，停药后容易复发，所以需要长期服用，没有确定的疗程。而且这类药物可引起病毒耐药变异，一旦出现耐药就需要调整治疗方案；如果出现多重耐药，进一步治疗就会非常棘手。
除了小分子核苷酸类似物药物外，研究人员还利用类固醇治疗、静脉注射免疫球蛋白或血浆置换等方法，但这些方法均表现出治疗效果较差和作用机制不明确等特点，还有可能增加并发症的风险。
发明内容
本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，通过T细胞接合器双特异性抗体(Bispecific T-cellengager，BiTE)可以同时结合SFTSV感染细胞膜上的病毒Gn包膜蛋白和T细胞上的CD3受体将T细胞重定向到感染细胞并杀死感染细胞，从而发挥抗病毒作用。
本发明提供一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的一种。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-Gn scFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为3A5-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述3A5-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：11；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-Gn scFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为Mab45-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述Mab45-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：21；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-Gn scFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为5D4-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述5D4-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：31；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述Anti-Gn scFv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述CD3-scFv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述Anti-Gn scFv的氨基酸序列的轻链和所述CD3-scFv的氨基酸序列的重链之间采用GGGGS连接子连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述His标签区的氨基酸序列和所述CD3-scFv的氨基酸序列的重链之间采用串联融合表达的方式连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体用于制备治疗SFTSV的药物。
本发明还提供一种如上所述针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1：以SFTSV康复病人的血液为样本，建立用于筛选特异性结合SFTSV包膜蛋白Gn的噬菌体展示抗体库；
S2：通过筛选，获得Anti-Gn scFv序列，用于构建CD3双特异性抗体表达载体；
S3：在pFuse的起始密码子之后插入IL-2信号肽序列，在pFuse的终止密码子之前插入His标签，获得pFuse真核表达载体；
S4：将所述Anti-Gn scFv序列与GGGGS连接子通过PCR的方法连接到CD3-scFv中，获得PCR产物；
S5：通过无缝克隆的方法将所述PCR产物构建到所述pFuse真核表达载体中，获得单克隆体；
S6：对所述单克隆体进行测序验证，测序验证无误后，提取重组质粒；
S7：将所述重组质粒转染到293F悬浮细胞中，待5～7天后，以4000rpm/min进行离心，提取上清液；
S8：将所述上清液进行过滤，获得滤液，将所述滤液与咪唑进行混合，获得第一混合液，将所述第一混合液通过Akta蛋白纯化仪纯化，获得SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体。
本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：
1、本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的制备方法制备的双特异抗体，由于是两种scFv串联而成，不存在Fc段，使得其组装效率高。传统抗体需要轻重链的结合，而本发明制备的双特异性抗体由于不存在Fc段，即没有重链，因此不存在抗体轻重链错配的问题，避免了引起病毒耐药变异而增加并发症的问题。
2、本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体可以高亲和力地靶向结合有Gn蛋白表达的SFTSV感染细胞，治疗效果稳定。
3、本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体与CD3具有结合作用，亲和力良好，可以较好对T细胞进行活化的同时又不会因为持续活化T细胞而导致细胞因子风暴，可显著提高CD3端双特异性分子的安全性。
4、本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，由于其T细胞接合器双特异性抗体主要在感染急性期杀死感染细胞，因此BiTE设计上缺乏Fc段可避免由于Fc段引起较长的抗体半衰期引发系统免疫副作用的风险，同时BiTE形式分子量较小易于递送到感染部位的优点，作用机制明确，且具有适应于临床需求的药代动力学性质。
5、本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体能有效的介导T细胞对SFTSV感染细胞的杀伤作用，且杀伤作用显著。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的结构示意图。
图2是本发明提供的实施例1中anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的SDS-PAGE电泳检测图。
图3是本发明提供的实施例2中通过ELISA验证anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体与抗原Gn亲和力的表征图。
图4是本发明提供的实施例3中通过SPR验证Mab45 BiTE与CD3亲和力的表征图。
图5是本发明提供的实施例3中通过SPR验证3A5 BiTE与CD3亲和力的表征图。
图6是本发明提供的实施例3中通过SPR验证5D4 BiTE与CD3亲和力的表征图。
图7是本发明提供的实施例3中通过SPR验证Mab45 BiTE与Gn亲和力的表征图。
图8是本发明提供的实施例3中通过SPR验证3A5 BiTE与Gn亲和力的表征图。
图9是本发明提供的实施例3中通过SPR验证5D4 BiTE与Gn亲和力的表征图。
图10是本发明提供的实施例4中通过SFTSV感染Huh-7细胞与人PBMC分离的T细胞共培养后的SFTSV NP阳性率柱状图。
图11是本发明提供的实施例5中anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体治疗被病毒感染小鼠的生存曲线。
图12是本发明提供的实施例6中anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体治疗被病毒感染小鼠的血清病毒载量。
图13是本发明提供的实施例6中anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体治疗被病毒感染小鼠的脾脏病毒载量。
图14是本发明提供的实施例6中anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体治疗被病毒感染小鼠的肝脏病毒载量。
图15是本发明提供的实施例6中anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体治疗被病毒感染小鼠的肺脏病毒载量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明实施例的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明实施例中的具体含义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明实施例的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
首先进行说明的是，本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法中涉及到的缩略词含义解释如表1所示。
表1缩略词含义解释表
下面结合图1-图15描述本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法。
本发明提供一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的一种。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-Gn scFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为3A5-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述3A5-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：11；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-Gn scFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为Mab45-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述Mab45-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：21；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-Gn scFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为5D4-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述5D4-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：31；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
其中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列如表2所示：
表2氨基酸序列表
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述Anti-Gn scFv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述CD3-scFv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述Anti-Gn scFv的氨基酸序列的轻链和所述CD3-scFv的氨基酸序列的重链之间采用GGGGS连接子连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述His标签区的氨基酸序列和所述CD3-scFv的氨基酸序列的重链之间采用串联融合表达方式连接。
根据本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，所述针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体用于制备治疗SFTSV的药物。
本发明还提供一种如上所述针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1：以SFTSV康复病人的血液为样本，建立用于筛选特异性结合SFTSV包膜蛋白Gn的噬菌体展示抗体库；
S2：通过筛选，获得Anti-Gn scFv序列，用于构建CD3双特异性抗体表达载体；
S3：在pFuse的起始密码子之后插入IL-2信号肽序列，在pFuse的终止密码子之前插入His标签，获得pFuse真核表达载体；
其中，在pFuse的起始密码子之后即第0位开始插入IL-2信号肽序列，所需引物序列如下：
IL2-ss-fusion：CGAATTCGTGACAAGTGCAAGACTT；
在pFuse的终止密码子之前即1581位插入His标签，所需引物序列如下：
CD3-fusion：GGAGGTGGCGGTTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCG。
通过上述两个引物，利用PCR获得pFuse真核表达载体，进一步地，PCR反应体系如表3所示：
表3 PCR反应体系
其中，模板DNA指的是pFuse载体的碱基序列。
PCR基本反应程序如表4所示：
表4PCR基本反应程序
反应温度 反应时间
98℃(预变性) 3min
98℃(变性) 15s
58℃(退火) 15s
72℃(延伸) 30s
72℃(终延伸) 5min
16℃(终止反应) ∞
其中，在98℃下进行变性，在58℃下进行退火的操作，需要反复进行30个循环。
S4：将所述Anti-Gn scFv序列与GGGGS连接子通过PCR的方法连接到CD3-scFv中，获得PCR产物；
其中，将筛选到的Anti-Gn scFv序列与GGGGS连接子通过Overlap PCR的方法连接到CD3-scFv中，插入位点为第61位，以Anti-Gn-scFv和CD3-scFv为模板，通过引物，利用PCR使Anti-Gn-scFv和CD3-scFv连接在一起。
在一个实施例中，筛选到的Anti-Gn scFv为3A5-scFv，则所需引物序列如下：
3A5-VH-1：
TCTTGCACTTGTCACGAATTCGCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGG；
3A5-VH-2：
GGATCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCGGATCCGCCGCCGCCTGAGGAGACG；
3A5-VL-1：
GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCTT；
3A5-VL-2：
CCAGCTGCACTTCAGAACCGCCACCTCCACCTAAAACGGTCAGCTTGGTCCCTCCG。
进一步地，重复上述PCR实验操作步骤，获得PCR产物。
进一步地，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行处理，具体操作步骤如下：
(1)配胶：将制胶模具组装好，用锥形瓶配置1～2％的琼脂糖与1×TAE，微波炉加热至沸腾三次，期间充分摇匀，使琼脂糖全部溶解，待其稍降温后加入YeaRed核酸染料，稀释倍数为10000倍，充分摇匀，将胶倒入模具中，如有气泡，用枪头挑出后，等待至少30min凝固。
(2)电泳：在电泳槽中加好足量的1×TAE后，把制好的胶放入电泳槽中依次在胶中加入Marker和混合好Loading buffer的样品。对好正负极盖上盖子，打开电源，设置恒压180V，电泳时间为20min。
进一步地，在照胶仪下观察到正确条带后，切下正确大小的胶块，进行产物回收，琼脂糖凝胶回收步骤如下：
(1)将切下来的胶块转至干净的EP管中，称重，按照每0.1g胶块加100μL的比例加入溶胶液，并放入到55℃水浴锅中，水浴10min，期间上下颠倒混匀，确保胶块完全溶解。
(2)从水浴锅中拿出胶液，静置冷却至室温，将液体转移至DNA吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重复该步骤直至所有胶液过完吸附柱。
(3)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃掉废液，重复一次。
(4)12000rpm离心1min，去掉残留的漂洗液，将吸附柱打开盖子放到超净台中，将残留漂洗液挥发干净
(5)把吸附柱放到干净的EP管中，加入30u L的70℃预热的ddH2O 12000rpm离心2min，将收集管中的液体重新加至吸附柱，再次洗脱一遍得到PCR产物，并通过Nanodrop测定DNA浓度。
由于质粒载体和基因片段无合适酶切位点，故使用Overlap PCR和同源重组酶进行构建。Overlap PCR的原理是一段基因序列的3`端和另一端基因序列的5`端通过碱基互补配对原则，将二者在PCR过程中连接起来，从而得到完整的序列。
S5：通过无缝克隆的方法将所述PCR产物构建到所述pFuse真核表达载体中，获得单克隆体；
其中，pFuse真核表达载体带有可与金属Ni离子结合的组氨酸标签，可用于在转化后的Zeocin抗性的平板中挑取单克隆，获得单克隆体，Zeocin抗性的平板转化步骤如下：
(1)提前将100μL DH5α大肠杆菌感受态细胞从-80℃冰箱取出放置于冰上解冻；
(2)取10uL连接产物加入到DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，放置于冰上静置30min；
(3)然后在42℃热激60s后，立刻放置于冰上冷却5min；
(4)用200μL无抗生素LB培养基重悬，随后直接吸取100μL细菌悬液滴加到含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，获得Zeocin抗性的平板；
(5)在Zeocin抗性的平板中挑取单克隆，获得单克隆菌落。
S6：对所述单克隆体进行测序验证，测序验证无误后，提取重组质粒；
对所述单克隆体进行测序验证，测序验证无误后，提取重组质粒，转染到293F悬浮细胞中，待5天后，以4000rpm/min进行离心，提取上清液。
其中，对所述单克隆体进行测序验证并进行提取重组质粒的步骤如下：
(1)准备好含青霉素的LB液体培养基，将过夜培养的单菌落挑到培养基中，放入37℃摇床160rpm，培养12～16h。
(2)取2mL过夜培养的菌液，加入到EP管中，12000rpm离心1min，尽量去除上清液。
(3)向菌液中加入250μL含RNaseA的P1溶液，用涡旋仪器或移液器充分重悬沉淀，使液体中没有肉眼可见的菌块。
其中，P1溶液由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成。
(4)加入250μL的P2溶液，轻轻上下翻转混合，静置5min。
其中，P2溶液由SDS和NaOH组成。
(5)加入350μL的P3溶液，立刻轻轻上下翻转混匀，将蛋白质和细菌基因组DNA充分沉淀出来，12000rpm离心10min，获得不含蛋白质和细菌基因组DNA的上清液。
其中，P3溶液由KAc和HAc组成，是pH为5.5的高盐溶液。
(6)将500μL平衡液BL加入到CP3吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)将步骤(5)中不含蛋白质和细菌基因组DNA的上清液转移至平衡好的吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液。
(8)向吸附柱中加入600μL的PW漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重复1次。
(9)将吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min，随后打开盖子放入到超净台中充分晾干残留的乙醇。
(10)将吸附柱放置于干净的EP管中，向吸附膜上滴加50μL经70℃加热的ddH2O，室温放置2min后，12000rpm离心2min，即可在离心管中得到重组质粒。
S7：将所述重组质粒转染到293F悬浮细胞中(转染采用PEI试剂)，待5～7天后，将表达完蛋白的293F细胞取出，在4℃条件下以4000rpm/min进行离心，提取上清液；
其中，将提取出的重组质粒用Nanodrop测定浓度后，取500ng送至金唯智测序。将正确的菌液加入20％甘油，放入-80℃冰箱长期保存。
S8：将所述上清液进行过滤，获得滤液，将所述滤液与咪唑进行混合，获得第一混合液，将所述第一混合液通过Akta蛋白纯化仪纯化，获得SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体。
其中，将所述上清液过0.45μM滤膜，并将其与20mM咪唑以体积比为1：1混匀后，通过Akta蛋白纯化仪纯化，流速为5mL/min。具体操作过程如下：
(1)将转染5～7天的293F细胞转移至50mL离心管中，在4℃下，以4000rpm/min离心15min。
(2)将细胞上清液使用0.45μM膜过以去除细胞碎片，将过滤后的细胞上清液与20mM咪唑以体积比为1:1混合。
(3)通过Akta蛋白纯化仪纯化，流速为5mL/min，获得SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体。
进一步地，步骤S8的整个操作过程在冰上进行。
由于重组质粒带有His标签，可以很好地结合金属Ni离子。过Ni柱吸附后，采用咪唑进行梯度洗脱，BiTE分子(双特异性T细胞接合器)一般为50kDa，采用10kDa超滤管截留的方式超滤，用PBS置换Buffer三次后，过Spin-X 0.45μM滤膜除菌，获得针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，将其标记为anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体，用于后续实验。
进一步地，纯化抗体的消光系数为20.48～20.57。
进一步地，纯化的最佳洗脱浓度是咪唑浓度为375mM时，有最佳的纯化效果，即得到的抗体纯度达到峰值。
在一个实施例中，图1为制备的SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的结构示意图，其中，3A5-scFv氨基酸序列的重链3A5-VH与3A5-scFv氨基酸序列的轻链3A5-VL之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接，图1中所示的连接箭头是指GGGGSGGGGSGGGGS和GGGGS连接子；
从图1可以看出，双特异抗体由于本质是两种scFv串联而成，不存在Fc段，使得其组装效率高。传统抗体需要轻重链的结合，而该方法制备的双特异性抗体由于不存在Fc段，即没有重链，因此不存在抗体轻重链错配的问题。并且，抗体本质属于一种蛋白质，可以杀灭病毒，难以使病毒产生耐药变异。
进一步地，3A5-scFv氨基酸序列的轻链3A5-VL与CD3-scFv氨基酸序列的重链CD3-VH之间采用GGGGS连接子连接；
进一步地，CD3-scFv氨基酸序列的重链CD3-VH与CD3-scFv氨基酸序列的轻链CD3-VL之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接；
进一步地，CD3-scFv氨基酸序列的轻链CD3-VL与His标签区His-tag之间采用直接连接方式连接。
其中，CD3双特异性抗体，在双特异性抗体药物研发中，通过构建一端结合T细胞上CD3受体，另一端结合病毒抗原或者肿瘤抗原的双特异性抗体，可以发挥T细胞的杀伤性作用，具有很强的药物疗效。第一代BsAb平台，BiTE(双特异性T细胞接合器)，最初是为了克服单克隆抗体用于癌症治疗的局限性而开发的，由肿瘤特异性可变片段和由GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接的CD3特异性片段组成。这种形式使效应T细胞能够重定向，以消除携带目标抗原的肿瘤细胞。
进一步地，本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体为BiTE形式的双特异性抗体，具有易于递送到感染部位的优点，并且具有良好的药代动力学性质。
下面通过实施例1-6对本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体进行功能验证。
实施例1anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的表达纯化
通过本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的制备方法，分别制备了三种5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体,5D4BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体均由串联的scFv和His-tag构成，电泳检测其条带是否正确。
采用SDS-PAGE的方法，检测制备anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的蛋白的大小与条带形状是否正常。实验结果如图2所示，我们构建的三个样品5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体在SDS-PAGE电泳检中位置均在45～60kDa之间，即50kDa大小附近，说明制备的5D4 BiTE、Mab45BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的蛋白的大小正确，此外还体外表达了融合病毒包膜糖蛋白Gn，可用于实施例2中进行表征实验，检测抗体分子的亲和力大小。
实施例2anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的亲和力验证
通过ELISA酶联免疫吸附实验来验证anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的亲和力：将5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体固定于固相载体表面，并保持其免疫活性，采用人工构建表达的Gn-Flag蛋白作为一抗，采用HRP Anti-Human IgG抗体作为二抗与一抗结合(即酶标抗体)，测定时，随受检标本结合力强弱的变化，酶标抗体的显色也会随之改变。据此，可以定量测量基于5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体与Gn-Flag蛋白的结合力。
anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的ELISA酶联免疫吸附实验的具体操作步骤如下：
(1)在4℃下，将anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体蛋白(1ng/μL，100μL)进行铺孔，静置24h；
(2)在37℃下，通过PBS(含2％BSA)进行封闭，封闭1.5h；
(3)以Gn-Flag作为标准品进行稀释，稀释的浓度梯度分别为10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.313nM、0.156nM和0.078nM，对每个浓度做复孔，在37℃孵育1.5h；
(4)用1：10000稀释的HRP-anti Human IgG的二抗作为酶标抗体，每孔100uL，在37℃孵育1h；
(5)在50μL的TMB显色液显色15min后，加入50μL终止液(1M盐酸)，酶标仪测定OD450值(在450nm下的吸光度)。
其中，5D4 BiTE Control、Mab45 BiTE Control和3A5 BiTE Control为空白对照组，即不添加5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的对照组。
ELISA的实验结果通过OD450值的大小来反映，OD450数值越高，证明被显色的HRP底物越多，侧面证明我们的5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体与抗原Gn的结合越强，如图3所示，随Gn浓度的升高，其数值呈现梯度升高，表明我们构建的5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体可以与抗原Gn的亲和力强，可以很好的进行结合。
实施例3anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的亲和力
还可以通过SPR表面等离子共振实验来验证5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的亲和力，SPR表面等离子共振实验可以实时观测到分子结合、薄膜形成等表面现象，并能给出高灵敏度、高选择性同时最小的非特异结合的信号，通过将抗原Gn或CD3受体固定到芯片上，基于不同浓度anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体下SPR信号可以定量测量双特异性抗体的部分表征。
SPR具体操作步骤如下：
(1)将125uL浓度为1μM的Gn蛋白固定于SPR的芯片上；
(2)5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体为流动相，浓度梯度分别为1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.063μM、0.031μM、0.016μM和0.008μM；
(3)设置Biacore的参数，随着Biacore系统的运行，出现5D4 BiTE、Mab45BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体的基线、结合、解离和再生等相关参数，获得参数模拟相关曲线。
根据图4至图6所示，SPR曲线展现了随着5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体上样体积的增加，5D4 BiTE、Mab45BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3的信号基线与CD3受体的信号基线结合、解离和再生的过程。根据图7至图9所示，SPR曲线展现了随着5D4 BiTE、Mab45BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体上样体积的增加，5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3的信号基线与抗原Gn的信号基线结合、解离和再生的过程。其中，图4至图6中最上方的线条对应的CD3受体浓度最大，相应地其信号应答也最为明显。图7至图9中最上方的线条对应的Gn浓度最大，相应地其信号应答也最为明显。图4至图9中展示，5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE三个样品均与CD3有较好的亲和力，可以作为一种T细胞接合器发挥作用，其中5D4 BiTE、Mab45BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×
anti-CD3双特异性抗体对Gn受体和CD3受体均显出了良好的结合力，从大到小依次为：Mab45 BiTE＞3A5 BiTE＞5D4 BiTE。ELISA的实验结果通过OD450大小来反映，随Gn浓度的升高，其数值呈现梯度变化；SPR的实验结果显示在Gn为1μM时我们所构建的双特异性抗体可以与其很好地结合，与ELISA结果可以很好地相互验证。
实施例4anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体介导的T细胞杀伤SFTSV感染细胞实验
为了进一步验证基于5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体在细胞水平上对SFTSV感染细胞的杀伤作用，我们选择被SFTSV感染后的Huh-7细胞为靶细胞，人PBMC细胞分离得到的T细胞作为效应细胞，验证5D4 BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体可以在两种细胞间起到桥接作用，介导T细胞对靶细胞的杀伤作用；其中流式分析SFTSV感染细胞数量(SFTSV NP阳性率)，进而体现药物的具体效果。
具体实验步骤如下：
(1)PBMC中CD3+T细胞的分离和培养：采用美天旎CD3磁珠分选试剂盒(Cat.130-097-043)进行分选，具体分离步骤参照试剂盒说明书进行。对分离得到的CD3+T细胞，用含10％FBS+1％双特异性抗体+IL-2(10U/mL)的DMEM培养于12孔板，24h后离心获得激活的CD3+T细胞。
(2)细胞铺板：Huh-7细胞以5×10^4个/孔接种于24孔板，培养过夜使其贴壁；
(3)SFTSV感染：加入MOI＝0.2的SFTSV或等体积的DMEM培养基，于培养箱中静置培养2h；
(4)CD3+T细胞介导双特异性抗体的杀伤：Huh-7细胞更换新鲜培养基，每孔加入5×10^4个分离得到的CD3+T细胞(效靶比5：1)，以及抗体BiTE、空白对照Mab45-scFv，阴性对照抗体Claudin18.2-scFv或等体积DMEM培养基500μL(抗体浓度梯度：0.5μg/mL)，共孵育48h；
(5)细胞SFTSV感染NP阳性率测定：胰酶消化细胞，收集Huh-7细胞于5mL流式管，400g离心5min，弃上清，再加入1mL PBS洗一遍细胞，400g离心5min，弃上清。加入死活细胞染料Ghost Dye TM Violet 510(1μL/1mL 1×10^6cell)，室温避光孵育10min，加入1mL含1％FBS的PBS洗2遍细胞，400g离心5min，弃上清。然后加入200μL/管固定液，4℃固定20min，然后用1×破膜洗液1mL/管洗2遍，400g离心5min，弃上清。SFTSV-NP鼠单抗1：1000稀释，每管加入100μL，轻柔混匀后4℃过夜孵育。一抗孵育结束后，用PBS洗2遍，加入羊抗鼠FITC标记的抗体(1：1000破膜洗液稀释)，4℃孵育1.5h，然后用PBS洗2遍，流式上机检测细胞SFTSV感染NP阳性率。
通过SFTSV感染Huh-7细胞与PBMC共培养后的被感染Huh-7细胞数量验证双特异性抗体效果实验。通过流式细胞术分析，与病毒感染细胞共培养后，存活细胞中SFTSV NP阳性率，可以一定程度地反应双特异性抗体介导T细胞发挥杀伤感染细胞的药效。不加T细胞组的双特异性抗体包括空白对照组(Blank-no BiTE)、阴性对照组(Claudin18.2-BiTE)、Mab45-scFv、Mab45 BiTE、3A5 BiTE和5D4 BiTE；加T细胞组的双特异性抗体包括空白对照组(Blank-no BiTE+T)、阴性对照组(Claudin18.2 BiTE+T)、Mab45-scFv+T、3A5 BiTE(基于3A5 scFv的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体)+T、5D4 BiTE(基于5D4 scFv的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体)+T和Mab45 BiTE(基于Mab45 scFv的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体)+T。结果如图10所示，与未加T细胞组比较，T细胞对感染的细胞具有一定的杀伤作用，其中，Mab45-scFv+T、3A5 BiTE+T和5D4 BiTE+T细胞组，Huh-7细胞SFTSV NP阳性率显著降低。结果表明构建的Mab45 BiTE、3A5 BiTE和5D4 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体可以有效介导T细胞杀伤被感染的Huh-7细胞。
本实施例说明本发明提供的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体能有效的介导T细胞对SFTSV感染细胞的杀伤作用，杀伤作用显著。
实施例5anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体对SFTSV感染小鼠生存情况检测
通过构建SFTSV感染的CD3人源化小鼠模型，更好地模拟抗体药物在人体内的作用机制。
具体实验步骤如下：
取饲养于SPF环境的6-10周龄的CD3人源化C57BL/6J小鼠(购自南模生物)，30只分5组，6只/组；腹腔注射Ⅰ型干扰素封闭抗体(IFNAR1)(BioXCell,Cat.BE0241，Clone.MAR1-5A3)，250μg/只，预处理24h，然后腹腔接种SFTSV毒株HBMC16病毒100μL/只(4×105FFU/mL)。小鼠分组情况见表5：
表5anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体体内实验分组
序号 实验分组(n＝6) 给药情况(10mg/kg)
1 空白对照组 PBS
2 Claudin18.2BiTE组 Claudin18.2 BiTE
3 Mab45 BiTE组 Mab45 BiTE
4 3A5 BiTE组 3A5 BiTE
5 5D4 BiTE组 5D4 BiTE
病毒接种2h后，每组腹腔分别注射阴性对照(Negative-Claudin18.2-CD3)、5D4BiTE、Mab45 BiTE和3A5 BiTE的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体，按10mg/kg/次剂量进行给药，对照组腹腔注射等体积PBS。每隔48h进行一次腹腔给药，共进行3次给药治疗，每天称量小鼠体重及观察小鼠生存状态,若小鼠体重下降25％，则视为死亡。
结果如图11所示，SFTSV感染第一天后小鼠体重出现下降，感染第3天PBS对照组小鼠出现死亡，但在感染第6天后，各组小鼠体重逐渐回升，其中进行3A5 BiTE治疗组的小鼠体重回升更快，并且其生存率显著高于PBS空白对照组(p＝0.0129)和阴性对照Claudin18.2 BiTE(p＝0.316)，其中ns是指没有显著性，p<1表示显著性良好小鼠的生存率是验证药物疗效的一个重要指标，说明3A5 BiTE能显著提升SFTSV感染小鼠的存活率。
实施例6anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体对SFTSV感染小鼠治疗效果检测
具体实施方式同实施例5所述，待小鼠进行3次给药治疗后，于SFTSV感染第6天解剖小鼠，取血清50μL和脾、肝、肺组织各10mg进行SFTSV病毒载量检测。其中，血清核酸提取采用病毒RNA提取试剂盒(Cat.DP315-R)进行提取，具体步骤按照说明书进行；组织核酸采用动物组织总RNA提取试剂盒(Cat.DP451)进行提取，具体步骤按照说明书进行。利用实时荧光定量PCR(探针法)检测血清及组织中SFTSV病毒的基因表达，探针法qPCR试剂盒(诺唯赞，Q225)进行检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行，所用引物如下所述。
SFTSV-S-Forward：5’-AGCCTAATTGGATATGTCAAATTGC-3’；
SFTSV-S-Reverse：5’-CGGGTGAAGTGGCTGAAGG-3’；
探针：5’-6-FAM-AGCAGCAGCAGCAACCTCAGCAGC-BHQ1-3’。
血清检测结果如图12所示，3A5 BiTE治疗组小鼠血清中的病毒载量显著低于PBS空白对照组和阴性对照Claudin18.2 BiTE(均p＜0.001)，脾肝肺组织检测结果如图13至15所示，3A5 BiTE治疗组小鼠的脾脏、肝脏和肺脏病毒载量均显著低于PBS空白对照组和阴性对照Claudin18.2-BiTE(均p＜0.001)，结果说明3A5 BiTE抗体的治疗能够显著降低SFTSV在小鼠体内的增殖和感染，对SFTSV感染的小鼠起到显著的治疗作用。其作用机制可能是3A5 BiTE分子连接T细胞和SFTSV感染后的细胞起杀伤作用，导致了SFTSV感染的CD3人源化小鼠在病毒感染能显著降低血清及肝脾肺组织中的病毒载量，对感染小鼠起到了很好的治疗效果。
根据图13至15所示被病毒感染小鼠的脾脏病毒载量，3A5 BiTE治疗后，组织中的病毒载量相较于对照组下降了至少一个数量级，表明3A5 BiTE治疗后，由SFTSV感染导致的小鼠体内免疫细胞耗竭情况得到缓解。将本发明提供的anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体两天给药一次，在固定疗程内，体内实验结果显示，3A5 BiTE对于SFTSV的治疗效果恒定，通过活化T细胞调动自身免疫起抗病毒感染作用，不会增加并发症，为SFTSV感染的治疗提供了一种崭新的策略。
通过小鼠生存率和血清、各组织内病毒载量检测验证anti-Gn×anti-CD3双特异性抗体体内药效。由于BiTE抗体缺乏Fc段，可避免由于Fc段引起的全身性的免疫副作用，进一步保证了抗体的特异性，BiTE形式抗体本身具有易于递送到感染部位的优点，并且具有良好的药代动力学性质这使得其成药性较强，具有良好的体内实验治疗效果。3A5 BiTE给药后，药物通过将T细胞和SFTSV感染的细胞连接，起到了杀伤作用，发挥了预期药效。并且，随着给药次数的增加血清和组织中病毒载量显著降低，并且较对照组和其他实验组而言，疗效最为明显。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-GnscFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为3A5-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述3A5-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：11；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
3.根据权利要求1所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-GnscFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为Mab45-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述Mab45-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：21；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
4.根据权利要求1所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，所述特异性抗体包括IL-2信号肽、Anti-GnscFv、CD3-scFv和His标签区；
所述Anti-Gn scFv为5D4-scFv；
所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
所述5D4-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：31；
所述CD3-scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
所述His标签区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
5.根据权利要求2或3或4所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述Anti-Gn scFv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接。
6.根据权利要求2或3或4所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述CD3-scFv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用GGGGSGGGGSGGGGS连接子连接。
7.根据权利要求2或3或4所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述Anti-Gn scFv的氨基酸序列的轻链和所述CD3-scFv的氨基酸序列的重链之间采用GGGGS连接子连接。
8.根据权利要求2或3或4所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述His标签区的氨基酸序列和所述CD3-scFv的氨基酸序列的重链之间采用串联融合表达的方式连接。
9.根据权利要求1所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体用于制备治疗SFTSV的药物。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：以SFTSV康复病人的血液为样本，建立用于筛选特异性结合SFTSV包膜蛋白Gn的噬菌体展示抗体库；
S2：通过筛选，获得Anti-Gn scFv序列，用于构建CD3双特异性抗体表达载体；
S3：在pFuse的起始密码子之后插入IL-2信号肽序列，在pFuse的终止密码子之前插入His标签，获得pFuse真核表达载体；
S4：将所述Anti-Gn scFv序列与GGGGS连接子通过PCR的方法连接到CD3-scFv中，获得PCR产物；
S5：通过无缝克隆的方法将所述PCR产物构建到所述pFuse真核表达载体中，获得单克隆体；
S6：对所述单克隆体进行测序验证，测序验证无误后，提取重组质粒；
S7：将所述重组质粒转染到293F悬浮细胞中，待5～7天后，以4000rpm/min进行离心，提取上清液；
S8：将所述上清液进行过滤，获得滤液，将所述滤液与咪唑进行混合，获得第一混合液，将所述第一混合液通过Akta蛋白纯化仪纯化，获得SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体。
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