KR20160054161A

KR20160054161A - 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단방법

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Publication number: KR20160054161A
Application number: KR1020140153142A
Authority: KR
Inventors: 신연경; 김은주; 이효진; 조수동; 송재영; 최정수; 이지연; 조인수
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2016-05-16
Also published as: KR101785290B1

Abstract

본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스(SFTSV) 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 SFTSV 감염 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 SFTSV HB29 바이러스주의 S segment의 일부인 핵단백질(NP)에 면역반응성을 나타내는 단클론항체와 이 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 KCTC18332P, 그리고 이 단클론항체와 검사대상동물의 혈청을 상기 NP 항원에 경쟁적으로 반응시키고 단클론항체의 결합수준을 측정함으로써 혈청 내 SFTSV에 대한 항체의 유무를 판단하는 SFTSV 감염 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 단클론항체, 하이브리도마, 진단 시약, 진단 키트 또는 진단방법을 사용하면 동물종에 크게 구애받지 않으면서 SFTSV의 감염 여부를 안전하고 신속하며 높은 정확도로 진단할 수 있다. 이에 따라 SFTSV의 잠재적인 매개체가 될 수 있는 가축, 애완동물 그리고 야생의 동물로부터 SFTS의 발생을 차단하거나 유행을 지연할 수 있어 공중보건 및 동물위생에 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다.

Description

중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단방법{Production and application of a monoclonal antibody and the development of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(c-ELISA) for detection of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus(SFTSV)}

본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스(SFTSV) 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 SFTSV 감염 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 SFTSV HB29 바이러스주의 S segment의 일부인 핵단백질(NP)에 면역반응성을 나타내는 단클론항체와 이 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 KCTC18332P, 그리고 이 단클론항체와 검사대상동물의 혈청을 상기 NP 항원에 경쟁적으로 반응시키고 단클론항체의 결합수준을 측정함으로써 혈청 내 SFTSV에 대한 항체의 유무를 판단하는 SFTSV 감염 진단방법에 관한 것이다.

중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, 이하 'SFTSV'로 약기)는 2009년 중국에서 처음 발견되었으며 감염 시 혈소판과 백혈구 감소, 발열, 근육통, 복합장기부전 증상을 보이고 치사율은 평균 12%이다. 중국, 일본, 우리나라에서 사망사례가 보고된 바 있다.

중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, 이하 'SFTS'로 약기)의 원인이 되는 매개체나 숙주동물의 종류는 확실치 않으나, 중국의 경우 방목하여 기르는 양, 소, 개에서 분리한 진드기에서 SFTSV가 분리된 바 있으므로 진드기(Haemaphysalis longicornis, 작은소참진드기)를 통해 전이되는 것으로 추정된다. 일부 환자의 경우 사람 간 혈액이나 분비물을 통해 전이된 경우가 있으며 가축에서 발병 증상은 없으나 양, 소, 돼지, 닭 등에서 SFTSV의 항원과 항체가 발견된 보고가 있다.

SFTS에 대한 백신이 개발된 바 없고, 뚜렷한 치료법이 없어 확산방지가 시급하다. 이에 따라 동물에서 SFTSV의 감염을 신속하게 진단할 수 있는 진단키트 및 진단시약의 개발에 관한 연구가 필요하다. 현재 SFTSV의 항원 진단법으로 RT-PCR을 수행하는 방법이 있고, 항체진단법으로는 바이러스를 세포에 감염시킨 후 고정하여 가검 혈청과 반응시킨 후 형광면역염색하는 간접면역형광항체법(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)이 이용되지만, 시료의 상태에 따라 비 특이반응이 많아 결과 판단이 어렵고 바이러스를 직접 다루어야 하므로 일반 실험실에서 수행하기 힘든 단점이 있다. SFTSV에 대한 항체 진단법 중 뉴클레오캡시드단백질을 이용한 double antigen sandwich ELISA가 중국 등에서 개발된 바 있으나 산업화되지 않아 국내에서 입수하여 사용하기 어렵다.

Liu Q, He B, Huang SY, Wei F, Zhu XQ. Severe fever with thrombocytopenia syndrome, an emerging tick-borne zoonosis. Lancet Infect Dis. 2014. Aug; 14(8):763-72.

따라서 본 발명의 주된 목적은 SFTSV의 감염을 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 진단방법에 필요한 SFTSV에 대한 항체(antibody)를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 SFTSV의 핵단백질(nucleoprotein, 이하 'NP'로 약기)에 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 KCTC18332P를 제공한다.

본 발명의 하이브리도마 세포주는 SFTSV의 NP를 대장균 발현 시스템을 이용하여 대량으로 수득한 다음 수득한 NP를 항원으로 이용하여 마우스에서 면역반응을 유도하고 면역화된 마우스 유래 면역 B세포와 골수종세포를 융합하여 제조되었다.

이때 사용한 유전정보는 2011년 중국에서 분리된 SFTSV HB29의 S segment 부위의 일부를 암호화하는 것으로서 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 HQ141612.1(서열번호 3)이다. 이 서열은 29 ~ 907번 뉴클레오타이드 위치에 정방향으로 NS(non-structural) 단백질을 암호화하고 965 ~ 1,702번 뉴클레오타이드 위치에 NP 단백질을 역방향으로 암호화한다. 이 중 NP를 코딩하는 738개의 뉴클레오타이드 염기서열을 사용하였다(서열번호 2). 이 NP는 비리온(virion)을 구성하는 바이러스 유래 단백질 중 발현 양이 많고 숙주세포 내에서 쉽게 발견할 수 있는 단백질로서, 감염 숙주로 하여금 강한 세포성 면역반응을 유발할 수 있다.

본 발명에서는 NP 부위를 발현하기 위해 재조합 DNA기술을 이용하였다. SFTSV의 NP 아미노산 서열을 코딩하는 전체 DNA를 단백질 발현벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜 생성된 형질전환 대장균에서 상기 DNA가 발현되도록 적합한 조건하에서 배양한 다음 배양물로부터 분리하는 단계를 거쳐 NP를 생산할 수 있다.

이렇게 생산된 NP를 항원으로 하여 마우스에 면역반응을 유도하고 면역화된 마우스의 슬와임파절 유래 면역 B세포를 골수종세포와 융합하여 하이브리도마를 생성한 다음 이중 NP를 선택적으로 인식하는 하이브리도마를 선별하여 본 발명의 하이브리도마 세포주가 완성되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 하이브리도마 세포주 KCTC18332P로부터 생산되는 단클론항체를 제공한다.

본 발명의 단클론항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 SFTSV의 NP에 특이적으로 면역반응성을 나타낸다. 따라서 시료에 존재하는 SFTSV를 용이하게 검출할 수 있다.

SFTSV의 검출을 보다 용이하게 하기 위해 본 발명의 단클론항체에 검출표지물질을 결합하는 것이 바람직하다. 이때 검출표지로는 항원-항체 결합반응 시의 조건, 검출대상시료의 상태, 검출의 가시화 방법 등에 따라 공지된 다양한 표지물질을 적용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 SFTSV 감염 진단 시약을 제공한다. 상기 설명한 바와 같이 본 발명의 단클론항체는 SFTSV의 NP에 특이적으로 면역반응성을 나타내어 SFTSV를 용이하게 검출할 수 있으므로, 이를 바이러스 진단 시약의 항체로 적용하면 SFTSV의 감염을 효과적으로 진단할 수 있는 시약이 될 수 있다. 본 발명의 SFTSV 감염 진단 시약에는 항체의 활성 유지 및 항원-항체 결합을 확인하기 위한 보조물질 등 통상의 바이러스 검출용 항체 시약에 포함될 수 있는 첨가물이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 SFTSV 감염 진단 시약을 포함하는 SFTSV 감염 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 SFTSV 감염 진단 키트에는 검사대상의 혈청을 채취 또는 진단 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 바이러스의 존재유무를 확인하는 통상의 진단키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 고체상 지지체에 진단용 항원을 고정하는 단계; 검사대상동물의 혈청 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 상기 고체상 지지체에 고정된 진단용 항원과 반응시키는 단계; 상기 진단용 항원에 항원-항체 결합하지 않은 단클론항체들을 세척하여 제거하는 단계; 및 상기 진단용 항원에 항원-항체 결합한 단클론항체의 검출표지의 수준을 측정하는 단계;를 포함하고, 상기 진단용 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주 KCTC18332P로부터 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 SFTSV 감염 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 SFTSV 감염 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 항원에 대해 검사혈청과 진단용 항체가 경쟁적으로 반응하도록 한 다음 항원에 결합한 진단용 항체의 농도를 바탕으로 검사혈청 내에 SFTSV에 대한 항체가 존재하는지의 여부를 확인하는 방법이다.

시료에 항체를 첨가하여 시료 내에 존재하는 항원과 항체의 결합정도를 직접적으로 파악하는 방법을 사용할 수도 있으나, 이는 검사대상동물의 종류에 따라 각각 별도의 적합한 반응조건을 설정해야하므로 검사대상동물이 제한적이 될 수 있다. 반면 본 발명의 방법을 사용하면 다양한 종류의 동물에 모두 적용하여 SFTSV 감염을 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명의 단클론항체, 하이브리도마, 진단 시약, 진단 키트 또는 진단방법을 사용하면 동물종에 크게 구애받지 않으면서 SFTSV의 감염 여부를 안전하고 신속하며 높은 정확도로 진단할 수 있다. 이에 따라 SFTSV의 잠재적인 매개체가 될 수 있는 가축, 애완동물 그리고 야생의 동물로부터 SFTS의 발생을 차단하거나 유행을 지연할 수 있어 공중보건 및 동물위생에 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다.

도 1은 SFTSV의 NP 유전자가 클로닝된 대장균 발현 벡터 작성 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 NP의 과발현 및 정제(레인 M: 단백질 분자량 크기 레더, 레인 1: 재조합 NP를 발현하고 있는 대장균의 전체 단백질, 레인 2: 6×histidine을 이용해 정제한 재조합 NP)된 결과를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 3은 본 발명에서 사용한 NP 특이 단클론항체(10G7 mAb) 및 토끼를 이용한 다클론항체(NP polyclonal Ab)의 항원 결합성과 시중에서 판매하는 anti-SFTSV polyclonal Ab(ProSci Inc., 1:200)의 항원 결합성을 면역염색으로 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 사용한 SFTSV 특이 다클론항체의 항원 결합성을 나타내는 면역염색 결과이다. 상단: FITC staining, 하단: DAPI.
도 5는 본 발명의 SFTSV 감염 진단방법의 원리를 설명한 모식도이다.
도 6은 본 발명의 SFTSV 감염 진단방법을 이용한 SFTSV 양성혈청의 농도 별 경합 정도를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. SFTSV의 NP 유전자 클로닝

2011년 중국에서 분리된 SFTSV HB29의 S segment(NCBI accession number HQ141612)의 염기서열에 대한 cDNA(서열번호 3)를 국내 유전자합성회사인 Bioneer사(한국)에 의뢰하여 인공적으로 합성하였다. 이 중 NP를 코딩하는 유전자 염기서열은 S segment의 965 ~ 1,702번에 해당하는 738개의 뉴클레오타이드이며 이 서열은 서열번호 2에 기재되어 있다.

NP 유전자를 증폭하여 얻기 위해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 실시하였으며, 단백질 발현벡터에 효율적으로 결합시키기 위하여 5'-말단에 EcoRI, 3'-말단에 HindIII의 인식부위를 가질 수 있도록 표 1의 프라이머(primer)를 사용하여 증폭하였다.

SFTSV의 NP 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열

primer name	sequence(5'-3')	product size
SF-NP-1	CTCGGAATTCACATGTCAGAGTGGTCC	735bp(245aa)
SFTS-NP-735	CTTCAAGCTTCAGGTTCCTGTAAGCAG	735bp(245aa)

HotStar HiFidelity Polymerase Kit(QIAGEN, 독일)을 이용하여 PCR을 수행하였으며, 합성한 cDNA(template), SF-NP-1 프라이머 및 SFTS-NP-735 프라이머의 존재 하에서 94℃에서 5분간 처리한 후 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 1분을 1 cycle로 25회 수행하였다.

PCR로 증폭된 결과물은 SFTSV의 뉴클레오캡시드를 코딩하는 합성 유전자로서 EcoRI과 HindIII의 절단부위를 가지고 있다. 이를 EcoRI과 HindIII으로 절단하여 단백질 발현벡터인 pET-30a(+)에 삽입하였다. 이렇게 제조된 pET-30a(+)/NP 재조합 벡터는 대장균(Escherichia coli) T7 프로모터(promoter)를 가지며 6개의 히스티딘(Histidine)이 융합된 형태로 발현될 수 있도록 구성되어 있다. 염기서열 분석회사인 ㈜마크로젠의 유전자 서열 분석서비스를 이용하여 올바른 클로닝 여부를 확인하였다. NP 유전자를 삽입한 대장균 단백질 발현벡터는 도 1과 같다.

실시예 2. NP 발현 및 정제

상기 재조합된 pET-30a(+)/NP 벡터로 단백질 발현용 대장균인 BL21(DE3)을 형질전환하고 0.2mM IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 넣은 조건에서 25℃로 20시간 교반배양하여 NP를 과발현시켰다. 배양물을 2,500rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액은 버리고 대장균 펠렛만 수거하여 20mM Sodium phosphate, 500mM NaCl, 8M Urea, 20mM Imidazole(pH7.4)의 용액에 고르게 부유시켰다. 이를 소니케이션(sonication)한 후, Ni-NTA Agarose(QIAGEN)를 이용하여 과발현된 NP를 정제하였다. 정제한 NP는 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(Thermo)를 이용하여 1×PBS로 완충액 교환하였다. 단백질 발현 양상은 도 2와 같다.

실시예 3. SFTS 항체효소면역법 개발용 단클론 및 다클론 항체 생산

단클론항체를 만들기 위해 두 마리의 생쥐(Balb/C mouse)에 각 100㎍의 상기 NP를 복강주사하여 면역반응을 수행하였고 이는 총 4회에 걸쳐 진행하였다. 면역반응 후 ELISA 방법을 이용하여 생쥐의 NP 다클론 항체의 항원 결합성 정도를 확인하였다. 항체 반응성이 높은 쥐로 단클론항체 제작을 시작하고 NP 단백질에만 특이적으로 반응하는 클론을 선별하여 하이브리도마 세포를 다량 배양한 후 배지 내 항체를 사용하였다. 단클론항체의 항원 특이성은 도 3과 같이 면역염색을 통해 증명하였다.

SFTSV의 다클론 양성혈청을 얻기 위해 여덟 마리의 생쥐에 각 50㎍의 불활화된 SFTSV를 복강주사하여 면역반응을 수행하였고 이는 총 3회에 걸쳐 진행하였다. 면역반응 후 얻은 생쥐의 SFTSV 다클론 항체의 항원 결합성 정도는 면역 염색을 통하여 확인하였다(도 4 참조).

SFTSV의 감염 세포 면역염색 방법은 다음과 같다. 10% FBS와 DMEM배지에서 배양한 Vero E6 세포를 1×DPBS로 씻어낸 후 2% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 MOI의 SFTSV를 접종하고 7일 후 세포를 모아 multitest slide(12 well, Mp Biomedical) 상에 올린 후 아세톤(acetone)으로 고정하여 -20℃에 보관하였다. 5% horse serum in PBS를 이용하여 블로킹한 후 같은 용액에 1:50으로 희석한 1차 항체를 처리하였다. 세포를 PBS에 세척한 다음, 형광 염색약인 Fluorescein-Labeled antibody to mouse IgG(KPL, 미국)를 1:500으로 희석하여 처리하고 PBS로 세척하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, Invitrogen, 미국)를 이용해 핵을 염색시키고 Nikon ECLIPSE(TE2000-U, Japan) 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.

실험을 통해 선발된 SFTSV NP에 대한 단클론항체 생산 세포주의 특성은 표 2와 같다.

SFTSV에 대한 단클론항체의 특성 확인

단클론항체	Isotype	웨스턴블롯*	간접면역염색*
10G7	IgG2a, kappa	+	+

* : SFTSV 감염 세포 사용.

실시예 4. 경합적 ELISA를 위한 단클론 항체와 HRP 단백질의 접합

상기 제조된 단클론항체의 IgG를 정제한 후 HRP(horseradish peroxidase) 단백질을 접합하였다.

이를 위해 단클론 항체가 함유된 배지 2㎖을 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(Thermo)를 이용하여 1×PBS로 완충액 교환한 후 Protein G Agarose Purification Kit(KPL, 미국)를 이용하여 정제하였다. 1×PBS로 씻어낸 후 0.2M Glycine(pH 3)을 이용해 protein G와 붙은 IgG를 추출하고 1.5M Tris-Cl(pH 8.0)을 이용하여 중화하였다. 추출된 IgG는 40mM HEPES(pH 8.4)로 완충액 교환을 한 후 EZ-LinkTMPlusactivated HRP(Thermo scientific, 미국)와 반응하여 HRP단백질과 IgG가 붙을 수 있게 하였다. 환원제인 NaBH₄ 용액(4㎎/㎖) 100㎕를 첨가하여 융합반응을 종료시킨 후 1×PBS로 완충액 교환하여 사용하였다.

실시예 5. SFTSV 항체 진단을 위한 경합적 ELISA 방법

SFTSV 항체 진단을 위해 개발한 경합적 ELISA방법은 도 5와 같다.

96 웰 ELISA 플레이트(Polysorp; Nunc, Rochester, NY, 미국)에 50mM 카보네이트-바이카보네이트 완충액(pH 9.6)에 녹인 NP 항원 1㎍/㎖을 4℃에서 16시간 이상 두어 코팅하였다. 플레이트를 PBST(phosphate-buffered salin with 0.05% Tween 20)으로 2회 세척하고 5% horse serum이 첨가된 PBST를 이용하여 상온에서 한 시간 동안 블로킹하였다. 샘플 및 양성혈청은 블로킹 완충액을 이용하여 1/1, 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/100, 1/500으로 희석한 다음 웰당 50㎕씩 분주하였다. 동시에 mAb에 HRP 단백질을 접합시킨 컨쥬게이트는 1:200, 1:50으로 희석한 다음 웰당 50㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 후 ELISA 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 100㎕의 TrueBlue™ Substrate(KPL, 미국)를 분주하여 37℃에서 20분간 발색반응을 수행하였다. 그 후 1.25M 황산용액을 웰당 100㎕씩 분주하여 발색반응을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 반응의 결과 발색저해도(percent inhibition, PI)의 계산은 PI=((1-(test serum O.D/negative serum O.D))×100)으로 계산하였다. 이와 같은 방법으로 수행한 결과는 도 6과 같으며 3회 반복되었다.

한국생명공학연구원

KCTC18332P

20141007

<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Production and application of a monoclonal antibody and the development of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(c-ELISA) for detection of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus(SFTSV) <130> PA140911-C01 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus(SFTSV HB29) <400> 1 Met Ser Glu Trp Ser Arg Ile Ala Val Glu Phe Gly Glu Gln Gln Leu 1 5 10 15 Asn Leu Thr Glu Leu Glu Asp Phe Ala Arg Glu Leu Ala Tyr Glu Gly 20 25 30 Leu Asp Pro Ala Leu Ile Ile Lys Lys Leu Lys Glu Thr Gly Gly Asp 35 40 45 Asp Trp Val Lys Asp Thr Lys Phe Ile Ile Val Phe Ala Leu Thr Arg 50 55 60 Gly Asn Lys Ile Val Lys Ala Ser Gly Lys Met Ser Asn Ser Gly Ser 65 70 75 80 Lys Arg Leu Met Ala Leu Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Val Glu Arg Ala 85 90 95 Glu Thr Arg Leu Ser Ile Thr Pro Val Arg Val Ala Gln Ser Leu Pro 100 105 110 Thr Trp Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Val 115 120 125 Gly Pro Ala Val Met Asn Leu Lys Val Glu Asn Tyr Pro Pro Glu Met 130 135 140 Met Cys Met Ala Phe Gly Ser Leu Ile Pro Thr Ala Gly Val Ser Glu 145 150 155 160 Ala Thr Thr Lys Thr Leu Met Glu Ala Tyr Ser Leu Trp Gln Asp Ala 165 170 175 Phe Thr Lys Thr Ile Asn Val Lys Met Arg Gly Ala Ser Lys Thr Glu 180 185 190 Val Tyr Asn Ser Phe Arg Asp Pro Leu His Ala Ala Val Asn Ser Val 195 200 205 Phe Phe Pro Asn Asp Val Arg Val Lys Trp Leu Lys Ala Lys Gly Ile 210 215 220 Leu Gly Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Ala Ala Glu Val Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Tyr Arg Asn Leu 245 <210> 2 <211> 738 <212> DNA <213> Nucleoprotein(NP) gene cDNA of SFTSV HB29 <400> 2 atgtcagagt ggtccaggat tgcagtggaa tttggtgagc agcagctcaa tttgactgag 60 cttgaggatt tcgcaagaga gctggcctat gaaggccttg atcctgctct gatcatcaag 120 aagctgaagg agacaggtgg agatgattgg gtgaaggata cgaagttcat cattgtcttt 180 gccctgactc gaggcaataa gatcgtcaag gcatcaggga aaatgtcaaa ctcagggtct 240 aagaggttga tggcactcca agagaaatat ggactggttg agagggcaga aaccaggctc 300 tcaatcactc ctgtgagggt agcgcagagc cttcccacct ggacatgtgc agcagcagca 360 gccttaaagg agtatctccc agtggggcca gccgtcatga acctgaaggt tgagaattat 420 ccccctgaga tgatgtgcat ggcctttgga tccctgattc caactgcggg ggtatctgaa 480 gccacgacca agaccctgat ggaggcctac tctctgtggc aagatgcctt caccaagacc 540 atcaatgtga agatgcgtgg agccagcaag acagaagttt acaactcctt cagggaccct 600 ctccatgcag ctgtgaactc tgtcttcttt cccaatgatg ttcgggtgaa gtggctgaag 660 gccaagggaa tccttggccc agatggggtc cccagcagag ctgctgaggt tgctgctgct 720 gcttacagaa acctgtaa 738 <210> 3 <211> 1744 <212> DNA <213> S segment cDNA of SFTSV HB29(Genbank: HQ141612.1) <400> 3 acacaaagac ccccttcatt tggaaaccat gtcgctgagc aaatgctcca acgttgacct 60 caaatctgta gcaatgaatg ctaacactgt taggcttgag ccttccctgg gagagtaccc 120 cactcttagg agagacctcg ttgaatgctc ttgtagtgtg ttgactttgt caatggtcaa 180 gaggatgggc aagatgacca acacagtatg gttgtttggc aaccccaaaa atcctcttca 240 tcagcttgag cctggacttg agcagctgtt agacatgtac tacaaggaca tgaggtgcta 300 ctcccagaga gaactgagtg ctcttaggtg gcctagtggg aagccatctg tatggttcct 360 acaggcagct cacatgttct tctccatcaa gaacagctgg gcaatggaaa ccggaagaga 420 gaactggcgg ggcctcttcc acaggataac aaaaggccaa aagtatcttt ttgaagggga 480 catgatattg gattctcttg aagccataga gaagcgaaga cttagacttg ggttgcctga 540 gattctgata actggactat ccccaattct ggatgtggcc ctcctccaga tagagtcact 600 tgcaaggcta agaggcatga gcttgaacca ccacttgttc acttcttcct cattgcgtaa 660 gcctctgtta gactgttggg atttcttcat tcctatccgc aaaaagaaga cagatggctc 720 atacagtgtc ttggatgagg atgatgagcc tggggtcctc cagggttacc catatctgat 780 ggcacactat ttaaataggt gcccattcca caacctcatc aggtttgatg aagaactgag 840 aactgcagcc ctgaacacca tttggggaag agattggcca gccattggtg acctcccgaa 900 ggaggtctaa ttttgtcgaa ttggatcatg gaatttagcc taattggata tgtcaaattg 960 ctgcttacag gtttctgtaa gcagcagcag caacctcagc agctctgctg gggaccccat 1020 ctgggccaag gattcccttg gccttcagcc acttcacccg aacatcattg ggaaagaaga 1080 cagagttcac agctgcatgg agagggtccc tgaaggagtt gtaaacttct gtcttgctgg 1140 ctccacgcat cttcacattg atggtcttgg tgaaggcatc ttgccacaga gagtaggcct 1200 ccatcagggt cttggtcgtg gcttcagata cccccgcagt tggaatcagg gatccaaagg 1260 ccatgcacat catctcaggg ggataattct caaccttcag gttcatgacg gctggcccca 1320 ctgggagata ctcctttaag gctgctgctg ctgcacatgt ccaggtggga aggctctgcg 1380 ctaccctcac aggagtgatt gagagcctgg tttctgccct ctcaaccagt ccatatttct 1440 cttggagtgc catcaacctc ttagaccctg agtttgacat tttccctgat gccttgacga 1500 tcttattgcc tcgagtcagg gcaaagacaa tgatgaactt cgtatccttc acccaatcat 1560 ctccacctgt ctccttcagc ttcttgatga tcagagcagg atcaaggcct tcataggcca 1620 gctctcttgc gaaatcctca agctcagtca aattgagctg ctgctcacca aattccactg 1680 caatcctgga ccactctgac atgatcactc ctttgcgtct ttcctttttt gggggtcttt 1740 gtgt 1744

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV)의 핵단백질(nucleoprotein)에 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 KCTC18332P.
제 1항의 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체.
제 2항의 단클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단 시약.
제 3항의 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단 시약을 포함하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단 키트.
고체상 지지체에 진단용 항원을 고정하는 단계;
검사대상동물의 혈청 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 상기 고체상 지지체에 고정된 진단용 항원과 반응시키는 단계;
상기 진단용 항원에 항원-항체 결합하지 않은 단클론항체들을 세척하여 제거하는 단계; 및
상기 진단용 항원에 항원-항체 결합한 단클론항체의 검출표지의 수준을 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 진단용 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이며,
상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주 KCTC18332P로부터 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.