KR20180030919A - 인간 호흡기 세포융합 바이러스의 인단백질에 특이적인 단클론 항체 및 사용 방법 - Google Patents
인간 호흡기 세포융합 바이러스의 인단백질에 특이적인 단클론 항체 및 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus; RSV)의 단백질 P에 결합하는 단클론 항체 또는 이의 단편으로서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 5와 적어도 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성되고 분비되는 단클론 항체가 사용되는, RSV의 바이러스 항원 P의 검출을 위한 생체외 또는 시험관내 진단 방법을 제공한다. 본 발명은, 상기 하이브리도마에 의해 생성된 항체를 포함하는, RSV 검출 키트에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus; RSV)의 단백질 P를 인식하는, 인간에서의 RSV 감염의 진단 방법을 개발하는 데 유용한, 단클론 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환은 전세계적인 공중 보건 문제이다. 소아 집단에서 이러한 감염의 주된 원인은 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 아데노바이러스(ADV), 인플루엔자 바이러스 A 및 B(INF A 및 B), 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 및 인간 메타뉴모바이러스(MPV)이다. 현재, 이들 바이러스에 대한 효과적인 예방 메카니즘은 없으며, 매일 94,000,000개의 신규 사례가 발생하는 것으로 추산되고 있다(세계 보건 기구). 또한, 질환 발발과 관련된 의료 시스템의 과포화가 상당한 경제적 손실을 발생시킨다.
RSV는 호흡계를 침범하며, 오늘날 중대한 경제적 및 사회적 문제와의 관련성을 갖는 바이러스로서, 어린이와 노인에 있어서 높은 수준의 이환율 및 사망률로 영향을 미치고 있다. 이들 집단에서, 특히, 2세 미만의 영유아에서, RSV는 비염, 편도선염 및 이염과 같은 보다 경증인 형태부터 폐렴, 기관지염, 세기관지염 및 폐포염과 같은 보다 중증의 다른 형태에 이르기까지 다종 다양한 임상 프로파일을 유발한다. 혈청학적 조사에 의하면, 어린이의 70% 내지 100%가 각각 1세 및 2세 때 그 바이러스에 1회 이상 노출된 적이 있는 것으로 추산된다. 매년 RSV는 5세 이하의 어린이에 있어서 약 3천4백만 건의 감염, 3백4십만 건의 입원 및 약 2십만 건의 사망을 유발하는 것으로 추산되었다. 현재, RSV는 칠레와 라틴 아메리카에서 유행하고 있는 바이러스이다. 몇몇 연구는, 신생아와 유아에서 RSV에 의해 유발되는 호흡기 감염 사례의 비율이 겨울철 발발 기간 동안 70%를 초과할 수 있음을 입증하였다. 또한, 라틴 아메리카에서의 연구는, 2세 미만의 유아에서 하기도 감염의 주된 감염원으로서의 RSV의 역할을 강화하였으며, 보고된 발생률이 40%를 넘는다. 불행히도, 현재는, 신생아를 면역화하기 위한 승인받은 백신도 없고 이 집단에서의 감염을 억제하기 위한 효율적인 치료법도 없는 실정이다.
RSV는 단일 가닥 유전 물질과 네가티브 코딩 극성을 갖는 캡슐화된 약 15.3 kb의 RNA 바이러스로서 파라믹소바이러스과 및 뉴모바이러스에 속한다. RSV 게놈은 다음과 같이, 즉 5'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-3'으로 정렬되는 10종의 유전자를 코딩하며, 상기 유전자는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(단백질 L)에 의해 10개의 RNA 독립적 메신저로 전사된다. 이러한 단백질 중 5종은 유전 물질의 팩킹을 담당하고,각각 막관통 당단백질 F, G 및 SH와 함께, 뉴클레오캡시드 단백질 N과 매트릭스 단백질 M에 해당하는 바이러스 입자의 자체 구조를 획정하는 역할을 한다. 다른 4종의 단백질, 즉 M2-1, M2-2, L 및 P가 바이러스 복제 및 전사에 관여한다. 또한, 단백질 NS-1 및 NS-2는 감염된 세포에 의한 타입 I의 인터페론 발현을 감소시키는 비구조 단백질이며, 따라서, 이들은 내재 면역 반응의 활성화를 방지한다.
공중 보건 서비스에 있어서, 현행 진단 방법은, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)과 면역크로마토그래피 테스트(퀵 테스트)를 이용하여, 비인두 스왑 샘플에서 직접 면역형광법으로 바이러스 항원을 검출하는 것에 기초하는 테스트를 포함한다. 언급된 제품 중에서, 면역형광에 기초한 바이러스 패널이, 호흡기 바이러스 패널(Respiratory Viral Panel; RPV) PCR의 경우 12종, 이센서 호흡기 바이러스 패널(eSensor Respiratory Viral Panel)의 경우 14종으로, 가장 많은 수의 호흡기 바이러스를 검출할 수 있게 한다는 사실로 인해 가장 두드러진다. 이같이 넓은 검출 범위에도 불구하고, 이들에 의해 소요되는 비용과 반응 시간 요인에 주목하는 것이 중요하다. 언급된 첫 번째 테스트의 경우, 그 비용이 약 700 USD이고, 반응 시간이 12 내지 18시간인 한편, 두 번째 테스트 비용은 약 90 USD이고, 반응 시간은 60분이다.
따라서, 이용 가능한 진단법의 특징과 경쟁할 수 있는, RSV를 검출하기 위한 효과적이고 신속하며 저렴한 진단 검사를 개발하는 것이 중요하다. 그러한 문제에 대응하여, 본 발명은, RSV 감염 환자로부터의 샘플 중의 바이러스 항원을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에 상기 요구를 충족시키기 위한 필요한 대안이 되는 단클론 항체를 개시한다. 따라서, 본 발명은, 단클론 항체와 같은 생성물, 및 임상 샘플에서 100%의 특이성으로 RSV 감염 환자를 검출하고 빠르고 효과적이고 정확하게 진단하며 ELISA에 의해 특정 항원 1.5 ng과 동등한 농도를 검출할 수 있는 상기 생성물을 이용하는 대안적 방법을 포함한다. 이것은 임상 전문가가 조기에 적절한 치료를 결정할 수 있게 한다.
단클론 항체는 단일 항원을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 균질한 항체의 유형이다. 단클론 항체는 림프구 B 클론과 종양 형질 세포의 융합 생성물인 단일 하이브리드 세포(하이브리도마)에 의해 생성된다. 항원에 특이적으로 높은 친화성으로 결합하는 특성은, 큰 과학적, 임상적 및 산업적 유용성을 창출하는, 분자를 검출하기 위한 매우 유용한 도구로서의 단클론 항체의 개발을 진척시켰다. 현재, 단클론 항체는, 연구를 더 잘 뒷받침하는 그 특이성과 재현성으로 인하여 기초 연구와 응용 연구 둘 다에 있어서 널리 사용되고 있다. 그러나, 단클론 항체는, 생물의학 분야에서, 다수의 감염성 질환의 진단 또는 치료에 있어서, 그리고 기타 병리학적 상태의 치료법으로서 큰 실용성을 갖는다. 단클론 항체는 모든 유형의 검출 및 진단 기법에 사용되고 있지만, 시험관내 진단 키트 설계에서 최상의 결과가 얻어졌다. 이와 관련하여, 항-hCG 항체를 사용한, 뇨 중의 융모성 고나도트로핀(hCG) 수치의 측정에 기초하는 임신 테스트와 같이 몇 종의 신속 검출 키트가 현재 이용되고 있다. 또한, 치료적 사용을 위한 단클론 항체가 큰 의의를 갖게 되었다. 현재, 특히 알렘투주맙(Alemtuzumab), 젬투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 리툭시맙(Rituximab), 트라스투맙(Trastumab)과 같은 시판되는 단클론 항체를 이용한 다양한 질병의 치료가 행해지고 있다.
선행 기술로서, 호흡기 세포융합 바이러스의 검출에 특이적인 단클론 항체의 사용을 기술하는 WO 2013/076702가 있고, 이 문헌에 구체적으로 본 발명자들의 실험실에서 생성한, M2-1 항원에 대해 특이적으로 유도된 항체가 기술된다(Gomez et al, J Med Virol. 2014 Jul; 86(7): 1256-66). 상기 항체는 본 발명의 항체와 다르며, RSV 검출을 위한 본 발명의 단클론 항체는 인용 문헌에 기재된 M2-1이 아니라 단백질 P를 항원으로서 갖는다. 단백질 P에 대해 항체를 생성하는 것의 이점은, 상이한 항원에 대한 이들 항체가 항-M2-1 항체(이전에 공개된 것)와 함께 면역분석에 이용될 수 있어서, 비인두 샘플 중에 소량으로 존재하는 항원 검출의 감도를 증가시킨다는 것이다.
문헌 US 2014/093501은 RSV에 대한 1종 이상의 쥐과동물 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 항체에 관해 기재한다. 구체적으로, 상기 항체는 단백질 F에 대한 것이다. 이와는 달리, RSV 검출을 위한 본 발명의 단클론 항체는 인용 문헌에 기재된 것과 같이 F에 대한 것이 아니라 단백질 P를 항원으로서 갖는다. 특히, 항원 P는 항원 F보다 더 보존되어 있어서 다양한 혈청형을 나타내는 RSV 균주의 검출을 가능하게 한다.
본 발명은 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 2종의 단클론 항체를 개시한다. 구체적으로, 본 발명은 2E6/D2 및 6H5/H1로 명명되는 하이브리도마 세포주에 의해 분비되고 RSV의 항원에 대해 반응하는 단클론 항체에 해당하는 2종의 쥐과동물 단클론 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 항원 결합 부위에 대해 서로 경쟁하지 않으며 상기 항원 결합 부위에 동시에 결합하기 위해 방해하지도 않는다. 상기 단클론 항체는 RSV 감염의 검출 분석, 진단 및/또는 측정에 이용될 수 있다. 상기 항체들은, 이용 가능한 항원이 적은 임상 샘플에서 측정 감도를 증가시키기 위해 동시에 사용될 수 있다. 특히, 하이브리도마 2E6/D2로부터의 항체는 임상 샘플에서 RSV의 단백질 P를 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 포획 및 고정화된 단백질은, 나중에, 색원체 기질에 작용하는 효소에 접합되어 있는, 하이브리도마 6H5/H1에 의해 생성되는 항체의 의해 검출된다. 이러한 특성으로 인해, 소량으로 존재하는 샘플 중의 동일한 항원을 검출하기 위해 서로 다른 표지를 갖는 두 항체를 병용하는 것이 가능하다.
본 발명은 RSV의 바이러스 항원 P의 검출을 위한 생체외 또는 시험관내 진단 방법을 제공하며, 이 방법에서 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성되고 분비되는 단클론 항체가 ELISA, 형광 현미경법, 면역블롯, 면역형광법, 면역조직화학법, 면역크로마토그래피, 유세포 분석, 셀 소터(cell sorter), 면역침전법 및/또는 웨스턴 블롯과 같은 분석에 사용된다. 분석하고자 하는 샘플은, 특히, RSV에 감염된 시험관내 세포, 코 분비물, 코 세척물, 인두 분비물 및/또는 기관지 세척물 또는 분비물, 뇌척수액, 혈장으로부터 선택된다. 본 발명은 니트로셀룰로스, 나일론 멤브레인, 마그네틱 비드, 형광 비드 또는 다른 지지체와 같은 임의의 유형의 고체 지지체에 커플링되거나, 효소, 단백질, 형광체, 방사성 동위원소 또는 임의의 다른 화학적 화합물과 같은 임의의 다른 분자에 커플링된, 앞서 언급한 하이브리도마의 세포주에 의해 생성 및/또는 분비되는 단클론 항체를 사용하여 생물학적 샘플 및 세포 배양물에서 RSV를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 언급된 하이브리도마에 의해 생성되는 항체를 포함하는 RSV 검출 키트에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 분비되는 단클론 항체에 커플링된 표지, 형광체, 바이오틴, 방사성 동위원소, 금속, 효소 및/또는 임의의 화학적 요소와 같은 화학적으로 결합된 임의의 종류의 분자 또는 기질을 그 범위 내에 포함하며, 여기서 화학적으로 결합된 상기 분자 또는 기질은 항체의 가시화 또는 검출을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 또한 생물학적 샘플의 검출, 분석 및/또는 진단 방법의 일부로서의 상기 항체와 상이한 분자 또는 기질 또는 마커에 커플링된 단백질 P를 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.
도 1: 간접 ELISA 분석을 이용한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 단클론 항체에 의한 RSV의 단백질 P의 검출. 플레이트를 정제된 재조합 RSV의 단백질 P 50 ng 또는 1×106 pfu의 RSV로 활성화시켰다. 음성 대조군으로서, 다른 웰을 1×106 pfu의 메타뉴모바이러스(MPV) 또는 50 ng의 BSA 단백질로 활성화시키고, 항원이 없고 1차 항체를 가지며 HRP와 접합된 마우스 항-IgG를 갖는 웰(활성화되지 않음)과, 항원도 1차 항체도 없고 마우스 항-IgG 항체만을 갖는 웰(HRP)도 포함시켰다. 그 후, 이 웰들을 웰당 170 ng의 양의 하이브리도마 2E6/D2 유래의 항-P 항체(A), 웰당 170 ng의 양의 하이브리도마 6H5/H1 유래의 항체(B) 및 웰당 170 ng의 양으로 사용된 항-P RSVH102 항-호흡기 세포융합 바이러스 인단백질 항체(카탈로그 번호 #AB94965(Abcam))(C)와 인큐베이션하였다. 막대 그래프에 표시된 데이터는, 하이브리도마 2E6/D2, 6H5/H1 및 Abcam의 RSVH102에 의해 분비된 항체에 특이적으로 결합한 마우스 2차 항체 항-IgG에 존재하는 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 효소가 촉매작용을 한, 기질 테트라메틸벤지딘의 발색 화합물로의 전환에 의해 방출된 450 nm에서의 검출된 흡광도를 나타낸다. 이 값은 적어도 2개의 독립적 분석에서 각 샘플에 의한 방출된 흡광도의 평균±표준 편차에 해당한다. ***P<0.0001, 음성 대조군과 비교한 원웨이 ANOVA 검정 및 Dunnett 다중 비교를 이용한 검정, ns: 음성 대조군과 비교하여 유의적인 차이 없음.
도 2: RSV의 단백질 P의 검출에 있어서 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 단클론 항체의 감도 측정. ELISA 플레이트를 단백질 50 ng에서 시작하여 0.04 ng으로 끝나는 1:2 계열 희석액(A)과, 1×105 pfu의 RSV 접종물에서 시작하여 1:5 희석배율로 끝나는 계열 희석액(B)으로 활성화시켰다. 비활성화 웰을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 플롯 차트에 표시된 데이터는, 170 ng/웰의 양으로 사용된 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 유래의 항-P 항체에 존재하는 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 의해 방출되는 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다(A 및 B). Abcam의 RSV의 항-P RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)도 170 ng/웰의 농도로 사용되었다(A 및 B). 값은 적어도 2개의 독립적 분석에서 각 샘플에 대한 방출된 흡광도의 평균에 해당한다.
도 3: 정제된 RSV 항원 검출을 위한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 RSV 항-P 단클론 항체의 계열 희석 분석. ELISA 플레이트를 50 ng의 RSV 재조합 단백질 P로 활성화시키고, 항원을, 3.4 ㎍/ml(170 ng/웰)의 농도로부터 시작하여 항-P 항체 2E6/D1 또는 6H5/H1의 1:2 계열 희석액으로 검출하였다. 데이터는, 적어도 2회의 독립적 분석에서, 2중의 각 샘플의 450 nm에서의 방출 흡광도 값의 평균으로서 나타내어진다.
도 4: 도트 블롯을 이용한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 분비된 단클론 항체의 특이성 확인. 하이브리도마 2E6/D2 또는 6H5/H1에 의해 생성된 RSV 항-P 항체를, 하기 고정화 샘플을 (균주 형태 또는 "도트"로) 포함하는 니트로셀룰로스 멤브레인과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다: MPV(1×106 PFU), RSV(1×106 PFU), BSA(1 ㎍), RSV의 단백질 P(1 ㎍, 500 ng 및 50 ng), 및 RSV로 감염되거나 감염되지 않은 세포 HEp-2의 추출물 20 ㎍. 인큐베이션 후, 멤브레인을 세척하고, 단백질 HRP에 접합된 마우스 항-IgG 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시판되는 기질인 "증강 화학발광 웨스턴 블롯 검출 시스템"(ECL, Amersham, 스웨덴 웁살라 소재)의 촉매작용에 의해 생성된 화학발광의 포획을 이용하여 항원에 대한 단클론 항체의 결합을 가시화하였다. 하이브리도마 2E6/D2 또는 6H5/H1에 의해 생성된 항체는, RSV의 단백질 P, RSV 바이러스 및 RSV에 감염된 세포가 존재하는 도트에만 결합하는 것으로 관찰되어, 이들 항체의 특이성이 확인된다.
도 5: RSV에 감염된 세포 HEp-2에서의 면역형광법에 의한 단백질 P-RSV의 검출. 세포 HEp-2를 컨플루언스(70% 내지 90%)에 가까워질 때까지 시험관내에서 증식시키고 RSV로 48시간 동안 감염시켰다. 마지막으로, 이 세포를 파라포름알데히드로 고정시키고 간접 면역형광법을 위한 준비를 하였다. 이를 위해, 1차 단클론 항체로서, 하이브리도마 2E6/D2, 또는 하이브리도마 6H5/H1 유래의 단클론 항체, 또는 Abcam의 RSVH102 항-P 항체(카탈로그 번호 #AB94965)를 사용하였다. 2차 항체로서, 519 nm에서 형광을 방출하는(강한 신호) 형광체 Alexa Fluor 488에 접합된 시판되는 마우스 항-IgG 항체를 사용하였다. 세포 코어를 661 nm에서 형광을 방출하는 형광체 TOPRO-3 요오다이드로 염색하였다(비감염 세포와 감염 세포에서 연회색 원이 관찰됨). 3종의 1차 항체 중 어느 하나가 사용된 감염 세포에서만 세포질에서 강한 반응성이 관찰된다(강한 백색 신호, 백색 화살표로 표시됨).
도 6: 하이브리도마 2E6/D, 6H5/H1 및 Abcam의 항체 RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)에 의해 분비되는 단클론 항체의 조합을 이용하는, 샌드위치 ELISA를 이용한 임상 샘플 중의 RSV 검출. ELISA 플레이트를, 포획 항체로서의 역할을 하는, 하이브리도마 2E6/D2에 의해 분비되는 항체 170 ng(A) 또는 Abcam의 항체 항-P RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)(B)로 활성화시켰다. 포획 항체에 의해 활성화된 웰을 바이러스 호흡기 증상을 나타낸 환자의 비인두 스왑(HNF) 샘플 50 ㎕와 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 건강한 환자의 샘플 10개(A) 및 3개(B)를 분석하였다. RSV 양성 환자의 샘플이 20(A)개 및 5개(B) 사용되었고, 특이성 대조군으로서, 메타뉴모바이러스 양성 환자 샘플 20개(A) 및 5개(B)를 사용하였다. 양성 대조군으로서, 정제된 RSV 단백질 P를 첨가한 웰을 포함시켰다. 2E6/D2 항체 또는 시판되는 항-P RSVH102 항체에 의한 포획된 단백질의 검출을 위해, 호스래디쉬 퍼옥시다제 효소에 접합된 하이브리도마 6H5/H1(A 및 B) 및 2E6/D2(B)에 의해 생성된 항체를 1:2,000의 희석배율로 사용하였다(웰당 75 ng). 제시된 데이터는 각 샘플의 450 nm에서 방출된 흡광도 값의 평균±표준 편차이다(*P<0.05; **P<0.001; ***P<0.0001 및 ns: 유의적인 차이 없음; MPV 양성 환자 또는 건강한 환자와 비교하여 원웨이 ANOVA 검정을 이용함).
도 2: RSV의 단백질 P의 검출에 있어서 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 단클론 항체의 감도 측정. ELISA 플레이트를 단백질 50 ng에서 시작하여 0.04 ng으로 끝나는 1:2 계열 희석액(A)과, 1×105 pfu의 RSV 접종물에서 시작하여 1:5 희석배율로 끝나는 계열 희석액(B)으로 활성화시켰다. 비활성화 웰을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 플롯 차트에 표시된 데이터는, 170 ng/웰의 양으로 사용된 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 유래의 항-P 항체에 존재하는 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 의해 방출되는 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다(A 및 B). Abcam의 RSV의 항-P RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)도 170 ng/웰의 농도로 사용되었다(A 및 B). 값은 적어도 2개의 독립적 분석에서 각 샘플에 대한 방출된 흡광도의 평균에 해당한다.
도 3: 정제된 RSV 항원 검출을 위한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 RSV 항-P 단클론 항체의 계열 희석 분석. ELISA 플레이트를 50 ng의 RSV 재조합 단백질 P로 활성화시키고, 항원을, 3.4 ㎍/ml(170 ng/웰)의 농도로부터 시작하여 항-P 항체 2E6/D1 또는 6H5/H1의 1:2 계열 희석액으로 검출하였다. 데이터는, 적어도 2회의 독립적 분석에서, 2중의 각 샘플의 450 nm에서의 방출 흡광도 값의 평균으로서 나타내어진다.
도 4: 도트 블롯을 이용한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 분비된 단클론 항체의 특이성 확인. 하이브리도마 2E6/D2 또는 6H5/H1에 의해 생성된 RSV 항-P 항체를, 하기 고정화 샘플을 (균주 형태 또는 "도트"로) 포함하는 니트로셀룰로스 멤브레인과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다: MPV(1×106 PFU), RSV(1×106 PFU), BSA(1 ㎍), RSV의 단백질 P(1 ㎍, 500 ng 및 50 ng), 및 RSV로 감염되거나 감염되지 않은 세포 HEp-2의 추출물 20 ㎍. 인큐베이션 후, 멤브레인을 세척하고, 단백질 HRP에 접합된 마우스 항-IgG 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시판되는 기질인 "증강 화학발광 웨스턴 블롯 검출 시스템"(ECL, Amersham, 스웨덴 웁살라 소재)의 촉매작용에 의해 생성된 화학발광의 포획을 이용하여 항원에 대한 단클론 항체의 결합을 가시화하였다. 하이브리도마 2E6/D2 또는 6H5/H1에 의해 생성된 항체는, RSV의 단백질 P, RSV 바이러스 및 RSV에 감염된 세포가 존재하는 도트에만 결합하는 것으로 관찰되어, 이들 항체의 특이성이 확인된다.
도 5: RSV에 감염된 세포 HEp-2에서의 면역형광법에 의한 단백질 P-RSV의 검출. 세포 HEp-2를 컨플루언스(70% 내지 90%)에 가까워질 때까지 시험관내에서 증식시키고 RSV로 48시간 동안 감염시켰다. 마지막으로, 이 세포를 파라포름알데히드로 고정시키고 간접 면역형광법을 위한 준비를 하였다. 이를 위해, 1차 단클론 항체로서, 하이브리도마 2E6/D2, 또는 하이브리도마 6H5/H1 유래의 단클론 항체, 또는 Abcam의 RSVH102 항-P 항체(카탈로그 번호 #AB94965)를 사용하였다. 2차 항체로서, 519 nm에서 형광을 방출하는(강한 신호) 형광체 Alexa Fluor 488에 접합된 시판되는 마우스 항-IgG 항체를 사용하였다. 세포 코어를 661 nm에서 형광을 방출하는 형광체 TOPRO-3 요오다이드로 염색하였다(비감염 세포와 감염 세포에서 연회색 원이 관찰됨). 3종의 1차 항체 중 어느 하나가 사용된 감염 세포에서만 세포질에서 강한 반응성이 관찰된다(강한 백색 신호, 백색 화살표로 표시됨).
도 6: 하이브리도마 2E6/D, 6H5/H1 및 Abcam의 항체 RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)에 의해 분비되는 단클론 항체의 조합을 이용하는, 샌드위치 ELISA를 이용한 임상 샘플 중의 RSV 검출. ELISA 플레이트를, 포획 항체로서의 역할을 하는, 하이브리도마 2E6/D2에 의해 분비되는 항체 170 ng(A) 또는 Abcam의 항체 항-P RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)(B)로 활성화시켰다. 포획 항체에 의해 활성화된 웰을 바이러스 호흡기 증상을 나타낸 환자의 비인두 스왑(HNF) 샘플 50 ㎕와 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 건강한 환자의 샘플 10개(A) 및 3개(B)를 분석하였다. RSV 양성 환자의 샘플이 20(A)개 및 5개(B) 사용되었고, 특이성 대조군으로서, 메타뉴모바이러스 양성 환자 샘플 20개(A) 및 5개(B)를 사용하였다. 양성 대조군으로서, 정제된 RSV 단백질 P를 첨가한 웰을 포함시켰다. 2E6/D2 항체 또는 시판되는 항-P RSVH102 항체에 의한 포획된 단백질의 검출을 위해, 호스래디쉬 퍼옥시다제 효소에 접합된 하이브리도마 6H5/H1(A 및 B) 및 2E6/D2(B)에 의해 생성된 항체를 1:2,000의 희석배율로 사용하였다(웰당 75 ng). 제시된 데이터는 각 샘플의 450 nm에서 방출된 흡광도 값의 평균±표준 편차이다(*P<0.05; **P<0.001; ***P<0.0001 및 ns: 유의적인 차이 없음; MPV 양성 환자 또는 건강한 환자와 비교하여 원웨이 ANOVA 검정을 이용함).
본 발명은, RSV의 단백질 P를 특이적으로 인식하는 2종의 단클론 항체 또는 이의 단편, 즉 IgG1 이소타입의 2E6/D2 및 IgG2A 이소타입의 6F5/H1(본원에서 항-P 항체로서 명명되기도 함)에 관한 것이다.
본 발명은, RSV 단백질 P를 특이적으로 인식하는 2종의 단클론 항체를 개시한다. 언급한 바와 같이, 이들 항체는 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된다. 하이브리도마 2E6/D2에 의해 생성되는 두 항체 사슬의 가변 영역의 아미노산 서열은 중쇄의 경우 서열 번호 1에, 경쇄의 경우 서열 번호 2에 기재된다. 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 각각 기재되어 있다. 같은 방식으로, 하이브리도마 6H5/H1에 의해 생성되는 두 항체 사슬의 가변 영역의 아미노산 서열은 중쇄의 경우 서열 번호 5에, 경쇄의 경우 서열 번호 6에 기재되어 있다. 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 8에 기재되어 있다.
이러한 가변 서열로부터, 가변 영역 중 단 하나만을 포함하거나 가능한 모든 조합으로 이들을 혼합하여 포함하는 것을 비롯한, 이들을 포함하는 항체가 만들어진다. 이러한 모든 실시양태가 본 발명의 접근법에 포함된다. 즉, 본 발명은, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 서열과, 상기 아미노산 서열 중 어느 것과 90% 이하, 95% 이하 또는 99% 이하의 상동성 또는 동일성을 갖는 유사한 서열 중 하나 이상을 포함하는 항체를 포함한다. 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 서열과, 이의 역상보서열 및 상기 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하 및 99% 이하의 상동성 또는 동일성을 갖는 유사 서열 중 하나 이상을 포함하는 뉴클레오티드 서열도 포함한다. 상기 뉴클레오티드 서열에 고려되는 높은 상동성 정도는 유전자 코드의 축퇴성에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 RSV 단백질 P를 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 세트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 바이오틴, 금속, 효소, 단백질, 형광체, 방사성 동위원소 또는 임의의 다른 화학적 화합물과 같은 그 검출을 가능하게 하는 표지와 접합된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 쥐과동물 항체 또는 인간화된 항체이다.
도면에 도시된 바와 같이, 이들 항체는 관련된 바이러스, 또는 호흡기 감염과 관련된 다른 바이러스를 갖는 환자 샘플 중에 존재하는 다른 단백질 또는 분자와 반응하지 않는다. 이것은 진단법에 사용될 때 위음성률을 현저히 감소시킨다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플 중의 RSV 바이러스 P 항원의 생체외 또는 시험관내 진단 및 검출 방법을 제공하며, 여기서 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성되고 분비되는 단클론 항체가 항원과 항체의 결합의 검출 분석에 사용된다.
상기 방법은, 특히, RSV에 감염된 시험관내 세포, 콧물, 코 세척물, 인두 분비물 및/또는 기관지 세척물 또는 분비물로부터 선택되는 생물학적 샘플을 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 분비되는 RSV에 대한 단클론 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계, 및 그 후, ELISA, 형광 현미경법, 면역블롯, 면역형광법, 면역조직화학법, 면역크로마토그래피, 유세포 분석, 셀 소터, 면역침전법 및/또는 웨스턴 블롯으로부터 선택되는 분석으로 항체와 항원의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 방법은, 니트로셀룰로스, 나일론 멤브레인, 마그네틱 비드, 형광 비드 또는 다른 지지체와 같은 임의의 다른 유형의 고체 지지체와 커플링된 상기에 언급된 하이브리도마의 세포주에 의해 생성 및/또는 분비되는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 항체 또는 이의 단편은 바이오틴, 금속, 효소, 단백질, 형광체, 방사성 동위원소, 또는 임의의 다른 화학적 화합물과 같은, 그 검출을 가능하게 하는 표지와 접합된다.
본 발명은 또한 언급된 하이브리도마에 의해 생성된 1종 이상의 항체를 포함하는 RSV를 검출하기 위한 키트를 개시한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 키트에 사용되는 상기에 언급한 하이브리도마 세포주에 의해 생성 및/또는 분비되는 항체 또는 이의 단편이 니트로셀룰로스, 나일론 멤브레인, 마그네틱 비드, 형광 비드 또는 다른 지지체와 같은 임의의 유형의 고체 지지체와 커플링된다. 또한, 본 발명의 특정 실시양태에서, 키트에 사용되는 항체 또는 단편이 이것의 검출을 가능하게 하는 표지, 예컨대 바이오틴, 금속, 효소, 단백질, 형광체, 방사성 동위원소, 또는 임의의 다른 화학적 화합물과 접합된다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 진단 키트는 면역크로마토그래피 테스트, 루미넥스(Luminex), 유세포 분석, 면역형광법, 방사성면역측정법, 웨스턴 블롯, 도트 블롯, ELISA, 면역확산법 또는 면역침전법에 해당한다. 따라서, 본 발명은 또한 생물학적 샘플의 검출 방법, 분석 및/또는 진단의 일부로서, 상기 항체와 다른 분자 또는 기질 또는 표지에 커플링된 단백질 P를 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.
이하에서는, 본 발명의 단클론 항체의 다양한 적용예를 입증하는 실시예를 기술한다.
적용예
실시예 1: 정제된 RSV 단백질 P의 입수
정제된 RSV 단백질 P를 얻기 위해, 박테리아 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) BL21에서 이종성 형태(재조합)의 발현법을 수행하였다. 이를 위해, RSV에 감염된 세포 배양물 HEp-2로부터 RNA를 추출하고, 단백질 P를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭시키고, 박테리아 발현 벡터(pET15b)에 클로닝하였으며, 이것은 인듀서 분자 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 사용하여 클로닝된 유전자의 발현을 컨트롤할 수 있게 하였다. 재조합 단백질의 정제 수단으로서, 사용된 발현 벡터는 6개의 연속 히스티딘을 코딩하는 인서트를 보유하며, 이로써 단백질의 과발현이 유도될 때 이들은 그 C-말단에 6개의 연속 His를 발현하였다. 상기 에너지를 이용하는 것의 장점은, 적절한 pH에서 친화성 크로마토그래피를 통한 정제가 가능하도록 단백질이 특징적인 전하를 갖게 한다는 것이다. 히스티딘 테일을 갖는 재조합 단백질의 정제는, Ni+가 충전된 수지 컬럼에서 결합 부위에 대해 단백질과 경쟁하는, 히스티딘과 유사한 이미다졸을 함유하는 탐폰 용액을 사용한 용리로 행하였다
마지막으로, 정제된 샘플을 SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석하였다.
실시예 2: 림프구 B의 클론과 종양 형질 세포의 융합 생성물인 하이브리도마의 생성
순도 50% 초과의 항원(프로인트 보조제로 유화시킨 정제된 RSV 재조합 단백질 P) 1 mg으로 면역화한 BALB/c 마우스를 이용하여 하이브리도마를 만들었다. 면역화 후, 혈청 중에 높은 역가의 항체를 제시한 마우스를 선택하여 추가 부스터 접종을 실시하였다. 3일 후, 비분비 골수 세포주 NSO/2의 세포와의 체세포 융합체를 제조하기 위해 그 마우스의 비장 림프구를 단리하였다. 제조된 하이브리도마를, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)을 함유하는 선택 배지에서 96웰 플레이트에 시딩하였다. 10일 후, 면역화에 사용된 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 ELISA로 생존 하이브리도마의 상청액을 평가하였다. 더 많은 양의 상청액을 얻기 위해 양성 하이브리도마를 24웰 플레이트로 증폭시켰고, 그 후 이것을 특성화 분석(특이성, 민감성, 효율성)을 행하는 데 사용하였다. 마지막으로, 더 큰 특이성을 갖는 하이브리도마를 한계 희석에 의해 클로닝하였으며, 즉, 단일 세포를 함유하는 분액이 얻어질 때가지 세포 현탁액의 연속 희석액을 만들었다. 그 후, 마우스의 복수액을 얻어, 각각의 단클론 항체의 서브클래스를 결정하였다. 표준 곡선의 작성을 위해, 다양한 농도의 항체를 인큐베이션하고 마우스 단클론 항체 항-Melan A(Santa Cruz Biotechnology, 미국 텍사스주 댈러스 소재)를 사용하여, 생성된 단클론 항체의 농도를 ELISA로 측정하였다.
실시예 3: 하이브리도마 2E6/D2에 의해 분비된 RSV 항-P 항체 및 하이브리도마 6H5/H1에 의해 분비된 RSV 항-P 항체의 가변 영역의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결정
하기 프로토콜을 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 각각에 이용하였다. 하이브리도마를, 37℃에서 10% CO2 하에, 3.7 g/L의 중탄산나트륨 및 10% 우태 혈청이 보충된 DMEM 고글루코스 배양 배지에서, 세포 밀도가 700,000개 세포/ml가 될 때까지 증식시켰다. 트리졸(Trizol)(Invitrogen) 화합물로 처리함으로써, 3.5×106개 세포의 전체 RNA를 얻었다. 0.5 ㎍의 RNA를 사용하여, Impron II(Promega) 키트를 이용하여 역전사 반응에 의해 cDNA를 생성하였다. PCR을 이용하여, 면역글로불린의 카파 및 람다 사슬을 코딩하는 유전자의 가변 영역을 증폭시켰다. 이를 위해, Novagen(카탈로그 번호 69831-3) 키트의 Ig 프라이머 세트의 유니버셜 프라이머를 사용하였고, 제조업자의 설명서에 따랐다.
경쇄 가변 영역은 프라이머 MuIgκVL5'-B: 5'ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT3'(서열 번호 10)을 사용하여 증폭시켰고, 중쇄 가변 영역은 프라이머 MuIgVH5'-A: 5'GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT3'(서열 번호 11) 및 MuIgVH5'-F: 5'ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT3'(서열 번호 12)을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 제조업체의 설명서에 따라 클로닝 벡터 pTOPO-TA(Invitrogen)로 클로닝하고 폰티피씨아 유니베르시다드 까똘리까 데 칠레(Pontificia Universidad Catolica de Chile)의 시퀀싱 서비스로 시퀀서 ABI 프리즘 3130xI(Applied Biosystem)를 이용하여 시퀀싱하였다. 바이오인포매틱 프로그램 벡터 NTI(Invitrogen)를 이용하여, 하이브리도마 2E6/D2에 대한 추론 아미노산 서열인 서열 번호 1 및 서열 번호 2과, 하이브리도마 6H5/H1에 대한 추론 아미노산 서열인 서열 번호 5 및 서열 번호 6을 얻었다.
실시예 4: 간접 ELISA 분석을 이용한, 정제된 RSV 항원에 대한 RSV 항-P 단클론 항체의 특이성 측정, RSV 항원 검출 분석
이 분석의 목적은, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 항체의 RSV 단백질 P에 대한 특이성을 입증하는 것이다. 간접 ELISA 기법을 이용하여 항원의 검출을 행하였으며, 이 때 ELISA 플레이트를 50 ng의 정제된 항원으로 37℃에서 1시간 동안 활성화시켰다. 같은 방식으로, 플레이트를 1×106의 플라크 형성 단위(pfu)의 RSV로 활성화시켰다. 음성 대조군으로서, 메타뉴모바이러스(MPV)를 RSV를 인큐베이션한 것과 동일한 조건 하에 포함시켰고, 또한 50 ng의 단백질 BSA를 독립된 웰에 포함시켰다. 이어서, 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)/0.05% Tween으로 2회 세척하였다. 그 후, 플레이트를 PBS/10% FBS로 37℃에서 2시간 동안 블로킹하였다. 계속해서, 세척을 반복한 후, PBS/10% FBS에 최종 농도 3.4 ㎍/ml로 희석시킨 각각의 항체(2E6/D2 및 6H5/H1)와 인큐베이션하였다(각각의 항체는 별개의 플레이트에 위치함). 동일한 조건 하에, 다른 플레이트에서, RSV 단백질 P(항-호흡기 세포융합 바이러스 인단백질 항체 RSVH102, 카탈로그 번호 #AB94965, Abcam)를 인식하는 단클론 항체를 3.4 ㎍/ml의 농도로 사용하여 대조군 분석을 수행하였다. 인큐베이션 시간 후, 세척을 반복하고, PBS/10% FBS 중에 1:2,000배로 희석시킨 효소 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase; HRP)(웰당 25 ng)로 표지된 각각의 웰에 마우스 항-IgG 2차 항체를 주위 온도에서 1시간 동안 첨가하였다. 마지막으로, 세척을 행하고, 50 ㎕의 시트레이트 완충액/테트라메틸벤지딘(TMB, 3-3'-5-5' 테트라메틸벤지딘, 1 mg/ml, Becton Dickinson)으로 발색되게 하였다. 반응을 중단시키기 위해, 2 N H2SO4 50 ㎕를 첨가하고, 그 결과를 ELISA 리더로 450 nm에서 판독하였다. 2차 항체의 반응이 1차 항체를 인식하는 데 있어서 특이적인지와 생성된 신호가 바이러스 항원에 대한 2차 항체의 비특이적 결합에 의해 유발된 것이 아닌지를 확인하기 위해, 1차 항체 또는 샘플 없이 2차 항체만을 사용한 대조군도 이용하였다(활성화되지 않은 웰). 1차 항체의 반응이 항원에 특이적인지를 확인하기 위한 다른 대조군은, 50 ng의 단백질 BSA 또는 다른 바이러스(MPV)를 갖는 ELISA 플레이트에서 항체를 사용하는 것 또는 항원으로 활성화시키지 않은(항원이 없는) ELISA 플레이트에서 항체를 사용하는 것으로 이루어졌다. 그 결과는, 본 발명의 단클론 항체가 단백질 BSA도 인식하지 않고 다른 관련된 바이러스의 단백질도 인식하지 않기 때문에(도 1A 및 도 1B), 본 발명의 단클론 항체는 50 ng의 정제된 항원을 특이적으로 인식할 수 있음을 보여준다. 이에 반해, 분석에서 대조군으로서 이용된 시판되는 항체 RSV H102(도 1C)는 바이러스와 재조합 RSV의 단백질 P 둘 다의 검출에 특이적인 것으로 관찰되었다.
실시예 5: 바이러스 항원의 검출을 위한 단클론 항체의 감도를 측정하기 위한 분석
이 분석은, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 유래의 RSV 항-P 단클론 항체가 검출할 수 있는 단백질 및 바이러스의 최대 희석배율을 간접 ELISA를 이용하여 측정하기 위해 수행되었다. 이를 위해, 실시예 4에 기재된 것과 동일한 기법을 이용하였다. 플레이트를, 정제된 항원 50 ng으로부터 시작하여, 11개의 1:2 계열 희석의 RSV 단백질 P로 활성화시켰다. 바이러스의 경우, 1×105 pfu의 바이러스로부터 시작하여, 1:2 계열 희석액으로 플레이트를 활성화시켰다. PBS/10% FBS에 희석시킨 3.4 ㎍/ml(170 ng/웰) 농도의 항-P 2E6/D2 또는 6H5/H1 항체를 사용하였다. 그 후, 마우스 항-IgG 검출 항체를 1:2,000의 희석배율(25 ng/웰)로 사용하였다. 결과는, 항-P 2E6/D2 항체가 40 피코그램(pg) 이하의 RSV 단백질 P를 인식할 수 있다는 것을 보여주었다. 하이브리도마 6H5/H1 유래의 항-P 항체가 더 민감하였고, 포획된 신호에서 더 큰 강도로 최종 희석배율의 RSV 단백질 P까지 검출하였다(도 2A). Abcam의 항-P RSVH102 항체 #AB94965 역시 모든 희석배율의 RSV 단백질 P를 인식할 수 있었지만, 하이브리도마 6H5/H1 유래의 항-P 항체보다 더 낮은 효율을 가졌다.
높은 희석배율에서 RSV를 검출할 수 있는 능력으로 나타내어지는 항체의 감도와 관련하여, 하이브리도마 2E6/D2 유래의 항-P 항체는 하이브리도마 6H5/H1 유래의 항체와 마찬가지로 바이러스로 만들어진 모든 희석배율을 검출할 수 있음을 확인할 수 있으며, 이는 약 390개 바이러스 입자와 동등하였다. 2종의 단클론 항체가, 1:40의 희석배율까지 검출하는 시판되는 RSV 항-P 항체보다 더 효율적이다(도 2B).
모든 경우에, 샘플(RSV 단백질 P 또는 바이러스)을 제외하고 모든 분석 성분들을 포함하는, 비특이적 항체 반응을 배제할 수 있게 하는 대조군 분석을 포함시켰다.
실시예 6: 바이러스 항원을 검출하는 단클론 항체의 효율성을 측정하기 위한 분석
이 분석은, ELISA를 이용하여 바이러스 항원을 검출할 수 있는, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 유래의 단클론 RSV 항-P 항체의 최고 희석배율을 결정하기 위해 수행되었다. 이를 위해, 실시예 4에 기재된 것과 동일한 간접 ELISA 기법을 이용하였다. 웰을 정제된 항원 50 ng으로 활성화시키고, 항-P 항체 2E6/D2 또는 6H5/H1을, PBC/10% FBS 중의 유효 농도(3.4 ㎍/ml)에서 시작하여 11개 희석까지 1:2 희석배율로 사용하였다. 도 3으로부터, 분석에 이용된 모든 희석배율에서, 항-P 2E6/D2 및 6H5/H1 항체가 RSV 단백질 P를 검출할 수 있음이 확인된다. Abcam의 항-P RSVH102 항체(카탈로그 번호 #AB94965) 역시 모든 희석배율에서 RSV 단백질 P를 검출할 수 있었지만, 항-P 6H5/H1 항체보다 효율이 뒤떨어졌다.
이 분석에 포함된 음성 대조군은 샘플(단백질 P)을 포함하지 않는 웰에 해당하며, 이 웰은 PBS/10% FBS로 블로킹하였고, 1차 항체(항-P 2E6/D2 또는 항-P 6H5/H1)를 첨가하지 않았으며, 이것은 HRP와 접합된 항-IgG 항체만을 포함한다.
실시예 7: 샌드위치 ELISA 기법에 의한, RSV 항-P 단클론 항체를 이용한 RSV에 감염된 환자 샘플의 임상 진단
비인두 스왑으로부터 얻은 임상 샘플 중의 바이러스 단백질의 가용성(availability)과 농도로 인하여, 검출 방법을 변경하여, 하이브리도마 2E6/D2 유래의 항-P 항체 또는 Abcam의 RSV 항-P 항체 RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)를 포획 항체로서 이용하는 샌드위치 ELISA법을 이용할 필요가 있었다. HRP에 접합된 항-P 6H5/H1 클론 또는 항-P 2E6/D2 클론에 의해 분비되는 항체를 검출 항체로서 사용하였다. 분석을 위해, ELISA 플레이트의 웰을 PBS에 희석시킨 하이브리도마 2E6/D2 유래의 3.4 ㎍/ml(170 ng/웰)의 항-P 항체 또는 Abcam의 RSV 항-P 항체 RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)로 37℃에서 1시간 동안 활성화시켰다. PBS-0.05% Tween 20으로 2회 세척하고, 그 후 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕의 PBS/10% FBS로 블로킹하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였으며, 각각의 웰은, 통상, "바이러스 패널(viral panel)"로 불리는 진단 방법인 "D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI(Diagnostics Hibryds) USA"에 따라 RSV 양성 환자의 비인두 흡인물 50 ㎕를 포함하였고, 이것을 아래에 기재하는 바와 같이 처리하였다*. 대조군으로서 하기 1) 내지 3)을 포함시켰다: 1) 특이성 대조군(바이러스 패널을 이용하여 MPV로 진단된 환자 샘플 50 ㎕), 2) 양성 대조군(재조합 RSV 단백질 P 50 ng) 및 3) 건강한 환자 샘플에 해당하는 음성 대조군(바이러스 패널을 이용할 때 바이러스에 음성). 다음 날, 세척을 행하고, 각 웰을 HRP에 접합된 하이브리도마 6H5/H1 또는 2E6/D2 유래의 항-P 항체 50 ㎕와 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 2회 세척하고, TMB 용액 50 ㎕로 발색시키고, 이것을 암소에서 10분 내지 15분 동안 인큐베이션하였다. 2 N H2SO4 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 임상 진단용으로 공인된 ELISA lector Epoch로 플레이트를 판독하였다. 이 분석에 대해 얻은 결과가 도 6에 도시되며, 여기서, 포획 항체로서의 하이브리도마 2E6/D2 유래의 항체와 검출 항체로서의 하이브리도마 6H5/H1-HRP 유래의 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 기법이, 바이러스 패널을 이용한 공인된 임상 실험실에서의 직접 면역형광법에 의해 이전에 확인된, RSV에 감염된 환자 샘플 중의 항원의 검출을 가능하게 한다는 것을 알 수 있다(도 6A). 이 분석에 포함된 환자의 수는 20명이었고, 그 중 17명은 흡광도(OD) 0.1 초과로, ELISA에 의해 양성인 것으로 확인되었다. 이 분석은 또한, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 유래의 항체의 범용성을 입증하는데, 왜냐하면, 이 항체들은 서로 경쟁하거나 간섭하는 일 없이 항원에 동시에 결합하여, 환자의 샘플 중의 단백질 P의 포획 및 후속 검출을 가능하게 하기 때문이다. 도 6B에, 시판되는 포획 항체와 검출 항체로서의 2종의 항-P 클론 6H5/H1 및 2E6/D2를 사용하여 얻은 결과가 도시되어 있다. 이 결과는, 포획 항체로서의 Abcam의 RSV 항-P 항체 RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)와 항-P 6H5/H1 클론 및 2E6/D2 클론과의 두 조합에 대해, RSV에 대한 총 5명의 양성 환자 중에서 단 1명이 샌드위치 ELISA에서 검출되었음을 보여준다. 이러한 결과들은, 임상 샘플 중의 바이러스의 검출에 있어서 Abcam의 RSV 항-P 항체 RSVH102(카탈로그 번호 #AB94965)에 비해 본 발명의 단클론 항체의 높은 효율성을 보여준다.
*: 임상 샘플 처리. 분석에 사용된 샘플들은 유니버셜 운반 배지 중에 포함된 비인두 스왑으로부터 얻었다. 샘플을 4℃에서 2,000 rpm으로 10분 동안 스핀 건조시켰다. 그 후, 펠릿으로부터 상청액(SN1)을 분리하고, 이 상청액을 5분마다 볼텍스로 진탕시키면서 4℃에서 15분 동안 완충액 RIPA(프로테아제 억제제 칵테일 중 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 100 ㎕와 인큐베이션하였다. 그 후, 이것을 4℃에서 2,000 rpm으로 10분 동안 스핀 건조시켰다. 마지막으로, 얻은 상청액(SN2)을 취하여 SN1과 혼합하였다.
실시예 8: 도트 블롯 분석을 이용한, 정제된 RSV 항원에 대한 RSV 항-P 단클론 항체의 특이성 분석
이 분석은, 면역블롯법을 이용하여 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1에 의해 생성된 항체의 RSV 단백질 P에 의한 특이성을 확인하기 위한 목적을 갖는다. 항원 검출은 도트 블롯 기법을 이용하여 수행하였고, 이 때 니트로셀룰로스 멤브레인을 현탁액 드롭 중에 존재하는 항원을 고정화하기 위한 고체 지지체로서 사용한다. 이를 위해, 니트로셀룰로스 멤브레인 위에, 다음 중 하나를 각각 함유하는 20 ㎕를 침적시켰다: 1×106 pfu의 MPV, 1×106 pfu의 RSV, 정제된 RSV 단백질 P(1 ㎍, 500 ng 및 50 ng), RSV에 감염된 세포 추출물 HEp-2 20 ㎍ 및 비감염 세포 추출물 HEp-20 ㎍. 음성 대조군으로서 200 ㎕에 포함된 500 ng의 BSA를 이용하였다. 멤브레인 위의 적용된 용액을 15분 정도 공기 건조시켰다. 그 후, 멤브레인을 0.05% Tween-20 함유 PBS 중의 5% BSA로 25℃에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 멤브레인을 블로킹 용액 중의 하이브리도마 2E6/D2 또는 하이브리도마 6H5/H1 유래의 3.4 ㎍/ml의 항-P 단클론 항체와 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 25℃에서, 항원에 부착되지 않은 과잉 항체를 PBS-0.05% Tween-20을 사용한 3회 세척을 이용하여 제거하였다. 항원에 결합된 항체의 검출은 HRP에 접합된 마우스 항-IgG 항체(Invitrogen, Life Technologies #62-6520)를 사용하여 행하였다. 이것을 25℃에서 블로킹 용액 중에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 25℃에서 PBS-0.05% Tween-20으로 3회 세척하여 과잉 비결합 항체를 제거하였다. 항원에 대한 단클론 항체의 결합의 가시화는, 마우스 항-IgG 항체에 결합된 효소 HRP에 의해 매개되는, 시판되는 기질인 "증강 화학발광 웨스턴 블롯 검출 시스템"(ECL, Amersham, 스웨덴 웁살라 소재)의 촉매작용으로 생성되는 화학발광의 포착을 이용하여 행하였다. 화학발광의 포착은 포토다큐멘테이션 MyECL(Thermo Fisher)로 행하였다. 도 4에, 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1 유래의 항체가 RSV 또는 단백질 P를 함유하는 "도트"에만 결합되며, 이들은 관련이 없는 단백질, 다른 바이러스 또는 비감염 세포를 함유하는 "도트"에 비특이적으로 결합하지 않는다는 것이 확인된다.
실시예 9: RSV 항-P 단클론 항체를 사용한, 면역형광법에 의한 세포 HEp-2에서의 RSV 감염의 검출
이 분석은, 기재된 본 발명을 이용하여 RSV 감염을 검출할 수 있는 기법의 스펙트럼을 확장하기 위해 행해졌다. 형광 현미경법을 위한 분석을 수행하였고, 이 때 RSV 감염 또는 비감염 세포 HEp-2를 하이브리도마 2E6/D2 또는 6H5/H1 유래의 RSV 항-P 단클론 항체와 인큐베이션하였다. 이용된 프로토콜은 다음과 같았다: PBS에 희석시킨 4% 파라포름알데히드로 25℃에서 10분 동안 세포를 고정시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고, PBS/10% FBS에 희석시킨 0.2% 사포닌으로 25℃에서 30분 동안 투과화시켰다. 하이브리도마 2E6/D2 또는 6H5/H1 유래의 단클론 항체를 PBS/10% FBS에 희석된 3.4 ㎍/ml의 농도로 25℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 그 후, PBS로 2회 세척하고, 암소에서, 25℃에서, PBS/10% FBS 중 1:200의 희석배율로 형광체 Alexa fluor 488(Life Technologies)에 접합된 마우스 항-IgG 2차 항체를 1시간 동안 첨가하였다. 세척을 반복하고, 25℃에서 15분 동안, 1:5,000의 희석배율로 코어를 TOPRO-3 요오다이드 642/661(Invitrogen, #T3605)로 염색하였다. 마지막으로, 이것을 PBS로 세척하고, EPi 형광 현미경을 이용한 후속 관찰을 위해 커버슬립을 마운팅하였다. 얻어진 결과는, 본 발명의 구성요소인 항체가 또한, 비감염 세포에 비특이적으로 결합하지 않으면서, 면역형광법을 이용하여, 감염된 세포를 특이적으로 인식하는 데 유용하다는 것을 보여준다(도 5).
본 명세서에 기재된 실시예는 하이브리도마 2E6/D2 및 6H5/H1의 세포주에 의해 분비되는 RSV 항-P 단클론 항체가 갖는 특이성, 효율성, 민감성 및 범용성을 입증한다. 본 명세서에 제시된 실시예는 RSV 항-P 단클론 항체의 용도 중 일부를 입증하며, 이들 실시예는 어떤 경우에도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
<120> MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFICALLY FOR THE ANTIGEN P OF THE HUMAN
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS, PRODUCED AND SECRETED BY THE CELLS
HYBRIDOMAS, USEFUL FOR DETECTION AND DIAGNOSTIC OF THE INFECTION
CAUSED BY RSV
<130> W 2016/7469
<150> CL 201502152
<151> 2015-07-31
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 2E6/D2 - anti-P VH
<400> 1
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Met Ala Gln Ser Gly Pro
1 5 10 15
Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
20 25 30
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro
35 40 45
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Leu Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro
65 70 75 80
Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr
85 90 95
Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp
100 105 110
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
115 120 125
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Pro Ser Val Tyr Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Gly Ser Leu Gly Ile Thr Ser
145 150
<210> 2
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 2E6/D2 - anti-P VL
<400> 2
Met Glu Ser Asp Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Tyr
100 105 110
Gln Gln Thr His Pro Pro Thr Gln Pro Thr Cys Asn Ser Ala Ala Trp
115 120 125
His Leu Arg Thr Leu Pro Ser Ile Thr Val Arg Ala Ala Ser Thr Cys
130 135 140
Gly His Pro Val Ser Leu Gly Ile
145 150
<210> 3
<211> 459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 2E6/D2 - anti-P VH
<400> 3
atggaatgga gctgggtctt cctcttcctg atggcacagt ctgggcctga gctggtgagg 60
cctggggctt cagtgaagat gtcctgcaag gcttcaggct ataccttcac cagctcctgg 120
atgcactggg tgaaacagag gcctggacaa ggccttgagt ggatgaggca gaggcctgaa 180
cagggcctgg agtggcttgg gaggattgat cctgcgaatg gtaattctaa atatgacccg 240
aagttccagg gcaaggccac tataacagca gacacatcct ccaacacagc ctacctgcaa 300
ctcagcagcc tgggtagtta tacctactat ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc 360
tccagagaca atgccaagaa ttccctatac ctgcaaatga gcagtctgag gtctccatcc 420
gtctatcccc tggcccctgg aagcttggga atcactagt 459
<210> 4
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 2E6/D2 - anti-P VL
<400> 4
atggagtcag acacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60
actggtgaca ttgtgctgac acagtctcct gcttccttag ctgtatctct ggggcagagg 120
gccaccatct catacagggc cagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 180
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300
cctgtggagg agcaactcag cagcctgaca tcttaccagc agacacatcc tccaacacag 360
cctacctgca actcagcagc ctggcatctg aggacactgc cgtctattac tgtgcgagcg 420
gcttctactt gcggacatcc agtaagcttg ggaatc 456
<210> 5
<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 6H5/H1 - anti-P VH
<400> 5
Met Glu Trp Ser Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10 15
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
20 25 30
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Ser
35 40 45
Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
50 55 60
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser
65 70 75 80
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro
85 90 95
Gly Met Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Ala Met Ser Trp Ala
100 105 110
Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Pro
130 135 140
Val Tyr Ala Leu Gly Pro Trp Lys Leu Gly
145 150
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 6H5/H1 - anti-P VL
<400> 6
Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Gly Asp Ile
20 25 30
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr
50 55 60
Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu
65 70 75 80
Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ile Arg Glu
85 90 95
Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Tyr Ser Ser Ser Ile
100 105 110
Phe Pro Pro Ser Ser Lys Leu Gly Asn
115 120
<210> 7
<211> 462
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic - Hibridoma 6H5/H1 - anti-P VH
<400> 7
atggaatgga gcaggcagag gcctgaacag ggcctggagt ggcttgggag gattgatcct 60
gcgaatggta attctaaata tgacccgaag ttccagggca aggccactat aacagcagac 120
acatcctcca acacagccta ctcctgcaca gcttctggct tcaacattac acagtctcct 180
gcttccttag ctgtatctct ggggcagagg gccaccatct catacagggc cagcaaaagt 240
gtcagtacat ctggctatag ttatatgcac tggaaccaac agaaaccagg aatggcctct 300
ggattcactt tcagtcacta tgccatgtct tgggctcgcc agactccgga gaagcagcag 360
tctgggcctg agctggtgag gcctggggct tcagtggtca ctgtctctgc agccaaaaca 420
acacccccac ccgtctatgc ccttggcccc tggaagcttg gg 462
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ttagctgtat ctctggggca gagggccacc atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt 180
acatctggct atagttatat gcactggaac caacagaaac caggacagcc acccagactc 240
ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct ggggtcccta ttagggagct tacacgttcg 300
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aat 363
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<223> Synthetic - Nucleotides of primer MuIgVH5'-F
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Claims (14)
- 인간 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus; RSV)의 단백질 P에 결합하는 단클론 항체 또는 이의 단편으로서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 5와 적어도 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 또한 그 검출을 가능하게 하는 표지에 결합되어 있고, 상기 표지는 형광체, 바이오틴, 방사성 동위원소, 금속 및 효소를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 단클론 항체 또는 이의 단편.
- 제1항 또는 제2항에 따른 단클론 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 세트로서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는, 서열 번호 3 또는 서열 번호 7 및 이의 역상보서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 및 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 8 및 이의 역상보서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 및 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 세트.
- 생물학적 샘플 중의 RSV 감염을 진단하기 위한 시험관내 및/또는 생체외 방법으로서, 상기 생물학적 샘플을 제1항 또는 제2항에 따른 RSV 단백질 P에 대한 단클론 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계 및 항체-항원 결합을 검출하는 단계를 포함하는 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 RSV에 감염된 시험관내 세포, 코 분비물, 코 세척물, 인두 분비물 및/또는 기관지 세척물 또는 분비물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 이용되는 분석이 ELISA, 면역형광법, 면역조직화학법, 면역크로마토그래피, 유세포 분석, 셀 소터(cell sorter), 면역침전법 및/또는 웨스턴 블롯으로부터 선택되는 것인 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 이의 단편이 그 검출을 가능하게 하는 표지와 접합되어 있는 것인 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항체가 형광체, 바이오틴, 방사성 동위원소, 금속 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지에 결합되어 있는 것인 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항체가 고체 지지체에 부착되어 있는 것인 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제7항에 있어서, 고체 지지체가 니트로셀룰로스, 셀룰로스, 폴리에틸렌 및 나일론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 중 하나로 형성된 멤브레인인 시험관내 및/또는 생체외 방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 RSV에 대한 단클론 항체를 포함하는, RSV를 검출하기 위한 진단 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 항체가 고체 지지체에 부착되어 있는 것인 진단 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 고체 지지체가 니트로셀룰로스, 셀룰로스, 폴리에틸렌 및 나일론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 중 하나로 형성된 멤브레인인 진단 키트.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, RSV를 검출하기 위한 면역크로마토그래피 테스트, 루미넥스(Luminex), 유세포 분석, 면역형광법, 방사성면역측정법, 웨스턴 블롯, 도트 블롯, ELISA, 면역확산법 또는 면역침전법에 해당하는 진단 키트.
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