CN108264561A - 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用 - Google Patents

一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结合CD19、CD3和T细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用。所述三功能分子，其结构中包括能够结合于CD19的第一功能域、能够结合并激活CD3的第二功能域和能够结合并阻断T细胞负共刺激分子的第三功能域。该分子在制备工艺和实际应用方面具有明显的优势：在赋予T细胞对CD19阳性细胞靶向性的同时进一步提高了活化T细胞的功效，单独添加时所介导的T细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤效果均优于抗CD19/抗CD3 BiTE双特异性抗体，在使用的方便性上优于靶向CD19的CAR‑T技术。

Description

一种结合CD19、CD3和T细胞负共刺激分子的三功能分子及其 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结合CD19、CD3和T细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用。
背景技术
人类CD19抗原是大小为95kDa的跨膜糖蛋白，从属于免疫球蛋白超家族，除表达于正常B淋巴细胞表面，CD19也高表达于B细胞恶性肿瘤，因此抗CD19单克隆全长抗体已被开发应用于治疗急/慢性淋巴细胞性白血病以及B细胞淋巴瘤(Wang K等人，ExperimentalHematology&Oncology，1:36-42，2012)。鉴于抗CD19单克隆抗体无法有效募集细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL，该类CD3/CD8双阳性T细胞可特异性识别靶细胞表面的抗原肽/MHC I类分子复合物，自身活化后释放穿孔素(Peforin)，导致靶细胞裂解死亡，也可分泌细胞毒素和颗粒酶(Granzyme)等致使靶细胞核的DNA损伤，引起靶细胞凋亡)，人们进一步设计和开发了可衔接T细胞和淋巴瘤B细胞的双特异性抗体(Bi-specificantibody,BsAb)以及基因工程嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptorT-cell immunotherapy,CAR-T)(Zhukovsky EA等人，Current Opinion in Immunology，40:24–35，2016)。
目前一种比较成熟的靶向CD19的双特异性抗体类型是抗CD19/抗CD3的双特异性T细胞衔接器(Bi-specific T cell engager,BiTE)，其结构是两个单链抗体(Single-chainvariable fragment,scFv)功能域通过具有柔性的连接肽片段(Linker)共价串联(Goebeler ME等人，Leukemia&Lymphoma,57：1021–1032，2016)。在机体的细胞免疫过程中，CD8阳性T细胞表面的TCR/CD3复合物与抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)表面的内源性抗原肽/MHC I类分子复合物发生特异性识别，导致CD3与共受体CD8的胞质段相互作用，激活与胞质段尾部相连的蛋白质酪氨酸激酶，使CD3胞质区免疫受体酪氨酸激酶激活模体(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)中的酪氨酸磷酸化，启动信号传导分子级联反应，激活转录因子，使得T细胞初步活化。抗CD19/抗CD3 BiTE双特异性抗体由于具有人类CD3和CD19两种抗原的结合活性，能够在T细胞与肿瘤B细胞间形成细胞衔接，同时给予T细胞初步活化信号，提高了其对肿瘤细胞的杀伤靶向性。但是，BiTE双特异性抗体不具有全长抗体的Fc片段，蛋白分子量较小(～54kDa)，因此在肿瘤治疗的过程中可穿越尿血屏障和脑血屏障，生物利用度低，需持续静脉注射给药，同时具有一定的神经毒性。
此外，人体内T细胞的活化需要依赖双信号传递途径(Baxter AG等人，NatureReviews Immunology，2：439-446，2002)。首先，APC细胞表面的抗原肽-MHC分子复合物与T细胞表面的TCR/CD3复合物相互作用产生第一信号，使得T细胞初步活化，之后APC细胞表面的共刺激分子配体(例如CD80、CD86、4-1BBL、B7RP-1、OX40L、GITRL、CD40、CD70、PD-L1、PD-L2、Galectin-9和HVEM等)与T细胞表面相应的共刺激分子(Co-stimulatory molecule，例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40、GITR、CD40L、CD27、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA等)相互作用产生第二信号(共刺激信号)：其中CD28、4-1BB、ICOS、OX40、GITR、CD40L和CD27等属于正共刺激分子，与相应配体相互作用所产生的第二信号(正共刺激信号)可导致T细胞的完全活化；而CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA等属于负共刺激分子，与相应配体相互作用所产生的第二信号(负共刺激信号)可下调和终止T细胞的活化。已有研究表明仅有第一信号传递途径无法充分活化T细胞，相反会导致其失能甚至产生激活诱导的T细胞死亡(Activation induced cell death，AICD)。为解决这一问题，可将抗肿瘤抗原/抗T细胞正(负)共刺激分子的双特异性抗体与抗肿瘤抗原/抗CD3的双特异性抗体联合使用，以提高T细胞的活化及肿瘤细胞杀伤效率(Jung G等人，Int J Cancer，91：225-230，2001；KodamaH等人，Immunol Lett，81：99-106，2002)。但该方法在实际操作过程中存在诸多不便，例如会增加重组双特异性抗体表达与纯化的工作量及生产成本，活化扩增T细胞时还需优化两种双特异性抗体的相对比例。相比之下，CAR-T技术能更好地解决T细胞的活化问题。CAR的构建通常包括：肿瘤相关抗原结合区(例如CD19抗原结合区，通常来源于抗CD19单克隆全长抗体的scFv片段)、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号区。其中胞内信号区负责介导T细胞的激活，一方面通过CD3ζ链上的酪氨酸激活基序来完成第一刺激信号，一方面通过CD28共刺激信号实现第一刺激信号的扩大，促进T细胞增殖与活化，并导致细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟等。但CAR-T技术本身也存在着一些不足：首先，该技术依赖病毒转染对T细胞进行基因改造，步骤繁琐，对实验条件要求较高；其次，具体使用时需将体外扩增活化后的CAR-T细胞回输至病人体内，剂量把控相对抗体药物具有更大难度；此外，CAR-T细胞进入患者体内后数量急剧增加可导致细胞因子风暴(Cytokine storm)，短时期内产生超量的细胞因子，从而引起高烧、低压、休克甚至死亡等副反应。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种同时结合CD19、CD3和T细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种三功能分子，其结构中包括能够结合于CD19的第一功能域、能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第二功能域和能够结合并阻断T细胞负共刺激分子的第三功能域。
优选地，所述三功能分子能够在识别CD19的同时，结合并激活T细胞表面CD3分子、结合并阻断T细胞负共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。
优选地，所述第一功能域为抗CD19的抗体，所述第二功能域为抗CD3的抗体，所述第三功能域为抗T细胞负共刺激分子的抗体。
优选地，所述抗体为小分子抗体。
优选地，所述抗体选自Fab抗体、Fv抗体或单链抗体(scFv)。
优选地，所述第一功能域和所述第二功能域之间通过连接片段1连接，所述第二功能域和所述第三功能域之间通过连接片段2连接。
优选地，所述连接片段1和连接片段2选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。
所述G4S具体为GGGGS。所述以G4S为单位的连接片段包括一个或多个G4S单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的G4S单位。本发明的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过以G4S为单位的连接片段2连接。所述连接片段1含有一个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述连接片段2含有三个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段可以为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。本发明的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过免疫球蛋白IgD的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。所述连接片段1含有一个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述连接片段2可通过二硫键相互连接形成二聚体。
优选地，所述第一功能域的C末端与所述第二功能域的N末端连接；所述第二功能域的C末端与所述第三功能域的N末端连接。
优选地，所述第一功能域为抗CD19的单链抗体，所述第二功能域为抗CD3的单链抗体，所述第三功能域为抗T细胞负共刺激分子的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
优选地，所述抗CD19的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。所述抗CD19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。
优选地，所述抗T细胞负共刺激分子的单链抗体可以是抗PD-1的单链抗体、抗CTLA-4的单链抗体、抗LAG-3的单链抗体、抗TIM-3的单链抗体、抗TIGIT的单链抗体或抗BTLA的单链抗体之任一。
优选地，所述抗PD-1的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示。所述抗PD-1的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示。
优选地，所述抗CTLA-4的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示。所述抗CTLA-4的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示。
优选地，所述抗LAG-3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示。所述抗LAG-3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示。
优选地，所述抗TIM-3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示。所述抗TIM-3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示。
优选地，所述抗TIGIT的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示。所述抗TIGIT的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。
优选地，所述抗BTLA的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示。所述抗BTLA的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示。
本发明一些实施例中，列举了所述抗CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.39所示。所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。所述抗PD-1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。所述抗CTLA-4的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.48所示。所述抗LAG-3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。所述抗TIM-3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示。所述抗TIGIT的单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO.57所示。所述抗BTLA的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示。
在本案的较佳案例中，单体形式的三功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、SEQID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.35之任一所示。二聚体形式的三功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.37之任一所示。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码前述三功能分子。
本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。
本发明的第五方面，提供一种制备前述三功能分子的方法，包括：构建含有三功能分子基因序列的表达载体，然后将含三功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的三功能分子。
本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
本发明的第六方面，提供前述三功能分子用于制备肿瘤治疗药物的用途。
本发明的第七方面，提供一种肿瘤治疗药物组合物，含有前述三功能分子及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。所述肿瘤为细胞表面为CD19阳性的肿瘤。
本发明的第八方面，公开了一种体外治疗肿瘤的方法，包括将前述三功能分子或肿瘤治疗药物组合物施用于肿瘤患者。所述方法可以是非治疗目的的。所述肿瘤为细胞表面为CD19阳性的肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述的三功能分子将能够结合于CD19的第一功能域、能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第二功能域和能够结合并阻断T细胞负共刺激分子的第三功能域融合于同一蛋白肽链，采用真核细胞表达系统生产，表达产物结构单一，纯化工艺简便，蛋白产量高，制备工艺及产品稳定，使用方便；而抗CD19/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗T细胞正(负)共刺激分子双特异性抗体如果联合使用，两个双特异性抗体需分别表达纯化，制备工艺更复杂，工作量和生产成本显著增加，且使用时需优化两者的相对比例。
(2)本发明所述的三功能分子，能够阻断或下调T细胞活化的第二(负)刺激信号，在赋予T细胞靶向性的同时进一步提高了对T细胞的激活功效，使得细胞因子和抗细胞凋亡蛋白分泌增加，有效避免了T细胞失能及死亡的现象，所介导的T细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤能够达到甚至优于抗CD19/抗CD3 BiTE双特异性抗体的效果，且蛋白用量更少。
(3)本发明所述的三功能分子与靶向CD19的CAR-T技术相比，不涉及病毒介导转基因、体外T细胞培养及回输等操作步骤，使用更方便，剂量可控，进入病人机体后引起细胞因子过量释放的风险小，避免了使用CAR-T时的毒副作用。
附图说明
图1：A.单体形式抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异性抗体的结构图；B.二聚体形式抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异性抗体的结构图。
图2：A.纯化的CD19-CD3-PD-1 TsA_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-PD-1 TsAb_M；泳道3：非还原性CD19-CD3-PD-1 TsAb_M；B.纯化的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-PD-1 TsAb_D；泳道3：非还原性CD19-CD3-PD-1 TsAb_D。
图3A：CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原PD-1-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图3B：CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原PD-1-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图4：CD19-CD3-PD-1三特异抗体介导的细胞杀伤实验。以Raji淋巴瘤细胞作为CD19阳性的靶细胞，CIK(Cytokine induced killer)细胞作为CD3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度CD19-CD3-PD-1 TsAb_M、CD19-CD3-PD-1 TsAb_D以及CD19-CD3 BsAb所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(E:T比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图5：A.纯化的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M；泳道3：非还原性CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M；B.纯化的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D；泳道3：非还原性CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D。
图6A：CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原CTLA-4-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图6B：CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原CTLA-4-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图7：CD19-CD3-CTLA-4三特异抗体介导的细胞杀伤实验。以Raji淋巴瘤细胞作为CD19阳性的靶细胞，CIK细胞作为CD3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M、CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D以及CD19-CD3 BsAb所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(E:T比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图8：A.纯化的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M；泳道3：非还原性CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M；B.纯化的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D；泳道3：非还原性CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D。
图9A：CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原LAG-3-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图9B：CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原LAG-3-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图10：CD19-CD3-LAG-3三特异抗体介导的细胞杀伤实验。以Raji淋巴瘤细胞作为CD19阳性的靶细胞，CIK细胞作为CD3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M、CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D以及CD19-CD3 BsAb所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(E:T比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图11：A.纯化的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M；泳道3：非还原性CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M；B.纯化的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D；泳道3：非还原性CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D。
图12A：CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原TIM-3-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图12B：CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原TIM-3-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图13：CD19-CD3-TIM-3三特异抗体介导的细胞杀伤实验。以Raji淋巴瘤细胞作为CD19阳性的靶细胞，CIK细胞作为CD3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M、CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D以及CD19-CD3 BsAb所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(E:T比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图14：A.纯化的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-TIGIT TsAb_M；泳道3：非还原性CD19-CD3-TIGIT TsAb_M；B.纯化的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-TIGIT TsAb_D；泳道3：非还原性CD19-CD3-TIGIT TsAb_D。
图15A：CD19-CD3-TIGIT TsAb_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原TIGIT-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图15B：CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原TIGIT-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图16：CD19-CD3-TIGIT三特异抗体介导的细胞杀伤实验。以Raji淋巴瘤细胞作为CD19阳性的靶细胞，CIK细胞作为CD3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度CD19-CD3-TIGIT TsAb_M、CD19-CD3-TIGIT TsAb_D以及CD19-CD3 BsAb所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(E:T比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图17：A.纯化的CD19-CD3-BTLA TsAb_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-BTLA TsAb_M；泳道3：非还原性CD19-CD3-BTLA TsAb_M；B.纯化的CD19-CD3-BTLA TsAb_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD19-CD3-BTLA TsAb_D；泳道3：非还原性CD19-CD3-BTLA TsAb_D。
图18A：CD19-CD3-BTLA TsAb_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原BTLA-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图18B：CD19-CD3-BTLA TsAb_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原CD19-hFc；●包被1μg/ml重组抗原CD3-hFc；▲包被1μg/ml重组抗原BTLA-hFc；不包被任何抗原的测定结果。
图19：CD19-CD3-BTLA三特异抗体介导的细胞杀伤实验。以Raji淋巴瘤细胞作为CD19阳性的靶细胞，CIK细胞作为CD3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度CD19-CD3-BTLA TsAb_M、CD19-CD3-BTLA TsAb_D以及CD19-CD3 BsAb所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(E:T比)＝1：1，杀伤时间：3h。
具体实施方式
一、术语和缩略语：
CTL：细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte)
BsAb：双特异性抗体(Bi-specific Antibody)
TsAb：三特异性抗体(Tri-specific Antibody)
BiTE:双特异性T细胞衔接器(Bi-specific T cell engager)
TiTE：三特异性T细胞衔接器(Tri-specific T cell engager)
Fab：抗原结合片段(Fragment of antigen binding)
Fv：可变区片段(Variable fragment)
scFv:单链可变区片段(Single-chain variable fragment)，又称为单链抗体
VH：重链可变区(Heavy chain variable region)
VL：轻链可变区(Light chain variable region)
Linker1：连接片段1
Linker2:连接片段2
Extracellular domain：胞外区
Co-stimulatory molecule:共刺激分子
CD19-CD3-PD-1 TsAb_M:单体形式的抗CD19/抗CD3/抗PD-1三特异性抗体
CD19-CD3-PD-1 TsAb_D:二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗PD-1三特异性抗体
CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M:单体形式的抗CD19/抗CD3/抗CTLA-4三特异性抗体
CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D:二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗CTLA-4三特异性抗体
CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M:单体形式的抗CD19/抗CD3/抗LAG-3三特异性抗体
CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D:二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗LAG-3三特异性抗体
CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M:单体形式的抗CD19/抗CD3/抗TIM-3三特异性抗体
CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D:二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗TIM-3三特异性抗体
CD19-CD3-TIGIT TsAb_M:单体形式的抗CD19/抗CD3/抗TIGIT三特异性抗体
CD19-CD3-TIGIT TsAb_D:二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗TIGIT三特异性抗体
CD19-CD3-BTLA TsAb_M:单体形式的抗CD19/抗CD3/抗BTLA三特异性抗体
CD19-CD3-BTLA TsAb_D:二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗BTLA三特异性抗体
二、三功能分子
本发明所述的三功能分子，其结构中包括能够结合于CD19的第一功能域、能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第二功能域和能够结合并阻断T细胞负共刺激分子的第三功能域。
进一步地，所述三功能分子能够在识别CD19的同时，结合并激活T细胞表面CD3分子、结合并阻断T细胞负共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。所述T细胞负共刺激分子包括但不限于人类PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA等。
本发明对于第一功能域、第二功能域和第三功能域并无特殊限制，只要能够在识别CD19的同时，结合并激活T细胞表面CD3分子、结合并阻断T细胞负共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号即可。例如，所述第一功能域可以是抗CD19的抗体，所述第二功能域可以是抗CD3的抗体，所述第三功能域可以是抗T细胞负共刺激分子的抗体。所述抗体可以是任意形式。但无论是何种形式的抗体，其抗原结合部位均含有重链可变区和轻链可变区。所述抗体优选地可以是小分子抗体。所述小分子抗体是分子量较小的抗体片段，其抗原结合部位包括重链可变区和轻链可变区。所述小分子抗体的分子量虽小但保持了亲本单抗的亲和力，具有亲本单抗一样的特异性。所述小分子抗体的种类主要包括Fab抗体、Fv抗体、单链抗体(scFv)等。Fab抗体由完整的轻链(可变区VL和恒定区CL)和重链Fd段(可变区VH和第一恒定区CH1)通过二硫键连接形成。Fv抗体仅由轻链和重链的可变区通过非共价键连接，是抗体分子保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体(scFv)是重链可变区和轻链可变区通过连接片段连接而成的单一蛋白肽链分子。
所述第一功能域和所述第二功能域之间通过连接片段1连接，所述第二功能域和所述第三功能域之间通过连接片段2连接。本发明对于连接顺序没有特殊要求，只要不限制本发明的目的即可。例如，可以是所述第一功能域的C末端与所述第二功能域的N末端连接；所述第二功能域的C末端与所述第三功能域的N末端连接。本发明对于连接片段1和连接片段2也没有特殊的限制，只要是不限制本发明的目的即可。
进一步地，所述连接片段1和连接片段2选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。
所述G4S具体为GGGGS。所述以G4S为单位的连接片段包括一个或多个G4S单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的G4S单位。本发明的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过以G4S为单位的连接片段2连接。所述连接片段1含有一个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述连接片段2含有三个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段可以为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。本发明的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过免疫球蛋白IgD的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。所述连接片段1含有一个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述连接片段2可通过二硫键相互连接形成二聚体。
在本发明的较佳实施例中，所述三功能分子的结构示意图如图1所示。所述三功能分子可以是单体形式也可以是二聚体形式。本发明的单体形式的三功能分子的结构示意图如图1中A所示，所述三功能分子的结构中含有一个与CD19抗原结合的第一功能域，一个与CD3抗原结合的第二功能域，一个与T细胞负共刺激分子抗原结合的第三功能域，所述第一功能域为与CD19抗原结合的单链抗体(scFv)，所述第二功能域为与CD3抗原结合的单链抗体(scFv)，所述第三功能域为与T细胞负共刺激分子抗原结合的单链抗体(scFv)。本发明的二聚体形式的三功能分子的结构示意图如图1中B所示，所述三功能分子的结构中含有两个与CD19抗原结合的第一功能域，两个与CD3抗原结合的第二功能域，两个与T细胞负共刺激分子抗原结合的第三功能域，所述第一功能域为与CD19抗原结合的单链抗体(scFv)，所述第二功能域为与CD3抗原结合的单链抗体(scFv)，所述第三功能域为与T细胞负共刺激分子抗原结合的单链抗体(scFv)。本发明的二聚体形式的三功能分子的抗原结合效价是单体形式的二倍。由于T细胞活化第一信号(CD3)和第二信号(负共刺激信号被阻断)的加倍，致使T细胞活化更为充分，对靶细胞的杀伤效果更强；CD19单链抗体结构域的加倍使其对靶细胞的识别也更为精准，因此二聚体较单体具有更好的使用效果。
所述T细胞负共刺激分子可以是PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA等。
T细胞负共刺激分子人类PD-1(Uniprot ID：Q15116)胞外区的氨基酸序列如SEQID NO.9所示，具体为：
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV。
T细胞负共刺激分子人类CTLA-4(Uniprot ID：P16410)胞外区的氨基酸序列如SEQID NO.10所示，具体为：
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD。
T细胞负共刺激分子人类LAG-3(Uniprot ID：P18627)胞外区的氨基酸序列如SEQID NO.11所示，具体为：
VPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHL。
T细胞负共刺激分子人类TIM-3(Uniprot ID：Q8TDQ0)胞外区的氨基酸序列如SEQID NO.12所示，具体为：
SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIG。
T细胞负共刺激分子人类TIGIT(Uniprot ID：Q495A1)胞外区的氨基酸序列如SEQID NO.13所示，具体为：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP。
T细胞负共刺激分子人类BTLA(Uniprot ID：Q7Z6A9)胞外区的氨基酸序列如SEQID NO.14所示，具体为：
KESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVKYCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNLIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYR。
具体地，所述第一功能域为抗CD19的单链抗体。所述抗CD19的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述抗CD19的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。所述抗CD19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。进一步地，所述抗CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
所述第二功能域为抗CD3的单链抗体。所述抗CD3的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。进一步地，所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
所述第三功能域为抗T细胞负共刺激分子的单链抗体。所述抗T细胞负共刺激分子的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
所述抗T细胞负共刺激分子的单链抗体可以是抗PD-1的单链抗体、抗CTLA-4的单链抗体、抗LAG-3的单链抗体、抗TIM-3的单链抗体、抗TIGIT的单链抗体或抗BTLA的单链抗体。
所述抗PD-1的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示。所述抗PD-1的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示。所述抗PD-1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。
所述抗CTLA-4的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示。所述抗CTLA-4的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示。所述抗CTLA-4的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。
所述抗LAG-3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示。所述抗LAG-3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示。所述抗LAG-3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。
所述抗TIM-3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示。所述抗TIM-3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示。所述抗TIM-3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示。
所述抗TIGIT的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示。所述抗TIGIT的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述抗TIGIT的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示。
所述抗BTLA的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示。所述抗BTLA的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示。所述抗BTLA的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示。
在本案的较佳案例中，单体形式的三功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、SEQID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.35之任一所示。二聚体形式的三功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.37之任一所示。但不限于本发明较佳案例中所列举的具体形式。
三、编码三功能分子的多核苷酸
本发明的编码所述三功能分子的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本发明的编码所述三功能分子的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸PCR法。
在本发明的较佳实施例中，编码所述抗CD19的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。编码所述抗CD19的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.65所示。编码所述抗CD19的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
编码所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。编码所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。编码所述抗CD3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
编码所述抗PD-1的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示。编码所述抗PD-1的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示。编码所述抗PD-1的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示。
编码所述抗CTLA-4的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示。编码所述抗CTLA-4的单链抗体的轻链可变区的核苷酸列如SEQ ID NO.74所示。编码所述抗CTLA-4的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示。
编码所述抗LAG-3的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示。编码所述抗LAG-3的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示。编码所述抗LAG-3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示。
编码所述抗TIM-3的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示。编码所述抗TIM-3的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示。编码所述抗TIM-3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示。
编码所述抗TIGIT的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。编码所述抗TIGIT的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示。编码所述抗TIGIT的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
编码所述抗BTLA的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示。编码所述抗BTLA的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示。编码所述抗BTLA的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的连接片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的连接片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
编码氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的连接片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
编码氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的连接片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，编码单体形式的三功能分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.36之任一所示。编码二聚体形式的三功能分子的核苷酸序列如如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQID NO.30、SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.38之任一所示。
四、表达载体
本发明的所述表达载体含有编码所述三功能分子的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
五、制备三功能分子的方法
本发明的制备前述三功能分子的方法，包括：构建含有三功能分子基因序列的表达载体，然后将含三功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的三功能分子。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
六、三功能分子的用途
本发明的三功能分子可用于肿瘤治疗药物。所述肿瘤为细胞表面为CD19阳性的肿瘤。
本发明较佳实施例中，通过试验发现，本发明的三功能分子均具有与CD19、CD3和相应T细胞负共刺激分子重组抗原的体外结合活性，可促进T细胞对CD19阳性靶细胞的靶向杀伤，并且二聚体较单体具有更好的效果。
七、肿瘤治疗药物组合物
本发明的所述肿瘤治疗药物组合物，含有前述三功能分子及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。所述肿瘤为细胞表面为CD19阳性的肿瘤。
本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂等。
如上所述的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选周剂量为0.1-5mg/kg体重，优选的疗程为10至30天。一次性给药，或分次给药。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据具体的治疗而定。
八、体外治疗肿瘤的方法
本发明的体外治疗肿瘤的方法，包括将前述三功能分子或肿瘤治疗药物组合物施用于于肿瘤患者。所述肿瘤为细胞表面为CD19阳性的肿瘤。所述方法可以是非治疗目的的。本发明较佳实施例中，通过试验发现，本发明的三功能分子均具有与CD19、CD3和相应T细胞负共刺激分子重组抗原的体外结合活性，可促进T细胞对CD19阳性靶细胞的靶向杀伤，并且二聚体较单体具有更好的效果。
本发明针对抗CD19/抗CD3 BiTE双特异性抗体以及靶向CD19的CAR-T技术的不足，通过基因工程和抗体工程的方法构建了能同时识别CD19，CD3及任一T细胞负共刺激分子的三特异性抗体分子(Tri-specific Antibody,TsAb)。该分子在制备工艺和实际应用方面具有明显的优势：在赋予T细胞对CD19阳性细胞靶向性的同时进一步提高了活化T细胞的功效，单独添加时所介导的T细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤效果均优于抗CD19/抗CD3 BiTE双特异性抗体，在使用的方便性上优于靶向CD19的CAR-T技术。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1：CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D真核表达载体的构建
在本发明中，以淋巴瘤B细胞表面的人类CD19蛋白，T细胞表面人类CD3和T细胞负共刺激分子PD-1蛋白为靶点的TiTE三特异性抗体被命名为CD19-CD3-PD-1 TsAb。
一、CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D构建方案设计
单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗PD-1 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗PD-1 scFv序列之间则通过连接片段2(Linker 2)相连。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗PD-1 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗PD-1 scFv序列之间以IgD铰链区(Ala90-Val170)作为连接片段2(Linker 2)相连。
为使三特异性抗体在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD19 scFv，抗CD3 scFv，抗PD-1 scFv序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC。
抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG。
抗CD19 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC。
抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGC。
抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG。
抗CD3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG。
抗PD-1 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGGACTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAACAGCGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAAGCGCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC。
抗PD-1 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示，具体为：
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAGCAACTGGCCCCGCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
抗PD-1 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGGACTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAACAGCGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAAGCGCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAGCAACTGGCCCCGCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，具体为：
GGCGGCGGCGGCAGC。
单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，具体为：
GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，具体为：
GGCGGCGGCGGCAGC。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，具体为：
GCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTG。
为使三特异性抗体在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了抗体分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示，具体为：MTRLTVLALLAGLLASSRA。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示，具体为：ATGACCCGCCTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCCGGCCTGCTGGCCAGCAGCCGCGCC。
二、CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D真核表达载体构建
本发明三特异性抗体的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性抗体，分别设计了如表1所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-PD-1-F和pcDNA3.1-PD-1-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker 2+抗PD-1 scFv的基因序列；针对CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-PD-1-F和pcDNA3.1-PD-1-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、IgD铰链区Linker 2、抗PD-1scFv的基因序列。扩增完毕后，利用 PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式三特异性抗体全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和二聚体形式的CD19-CD3-PD-1TsAb_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGGACTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAACAGCGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAAGCGCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAGCAACTGGCCCCGCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGGACTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAACAGCGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAAGCGCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAGCAACTGGCCCCGCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
表1.CD19-CD3-PD-1三特异性抗体基因克隆中使用的引物
实施例2：CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的表达与纯化
一、CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例1中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTM MAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图2所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D重组蛋白的纯度均>95％：其中CD19-CD3-PD-1 TsAb_M重组蛋白的理论分子量为79.4kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性抗体为单体形式(图2A)；CD19-CD3-PD-1 TsAb_D重组蛋白的理论分子量为87.3kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(约180kDa)(图2B)，说明两个蛋白分子可通过IgD铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性抗体为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD19-CD3-PD-1 TsAb_M为单体形式，CD19-CD3-PD-1 TsAb_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKR。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKR。
抗CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS。
抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，具体为：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS。
抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK。
抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。
抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS。
抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，具体为：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。
抗PD-1 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示，具体为：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKR。
抗PD-1 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示，具体为：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS。
抗PD-1 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示，具体为：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKR。
单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体为：GGGGS。
单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，具体为：GGGGSGGGGSGGGGS。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，具体为：GGGGS。
二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，具体为：ASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGV。
实施例3：ELISA检测CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的抗原结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组抗原包被：人类CD19-hFc、人类CD3-hFc与人类PD-1-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，抗原浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24gNaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的三特异性抗体样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M或CD19-CD3-PD-1TsAb_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(OD450)。
ELISA结果如图3A和图3B所示：图3A说明CD19-CD3-PD-1 TsAb_M与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和PD-1-hFc均具有体外结合活性，其中PD-1结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱；图3B说明CD19-CD3-PD-1 TsAb_D与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和PD-1-hFc同样具有体外结合活性，其中PD-1结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱。
实施例4：CD19-CD3-PD-1三特异性抗体介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-PD-1 TsAb_M)、二聚体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-PD-1 TsAb_D)以及抗CD19/抗CD3 BiTE双特异抗体(CD19-CD3 BsAb，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血PBMC制备的CIK细胞(CD3+CD56+)与CCL-86Raji淋巴瘤细胞(CD19+，购自ATCC)，检测细胞死亡情况，比较三种抗体介导的CIK效应细胞对CCL-86Raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.PBMC的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)(购自Gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体Anti-CD3(5ug/ml)、全长抗体Anti-CD28(5ug/ml)和NovoNectin(25ug/ml)包被的T25培养瓶中(全长抗体与NovoNectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500U/mlIL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100uL，取上述培养的CIK细胞1×105个，加入Raji细胞1×105个(CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的CD19-CD3 BsAb、CD19-CD3-PD-1 TsAb_M和CD19-CD3-PD-1 TsAb_D抗体样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的CCK-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测OD450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何抗体的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图4所示：当CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1时，在未添加任何抗体的条件下，CIK细胞对Raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度抗体(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中CD19-CD3-PD-1 TsAb_D所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为97％、94％和93％，CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的效果次之，杀伤效率约为92％、89％和83％，CD19-CD3 BsAb的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度抗体(3.125ng/ml)的条件下，CD19-CD3-PD-1 TsAb_D与CD19-CD3-PD-1 TsAb_M所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率仍有明显地提高，杀伤效率分别约为86％和75％，而CD19-CD3 BsAb与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的CD19-CD3-PD-1 TiTE三特异抗体所介导的T细胞对CD19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于CD19-CD3 BiTE双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例5：CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D真核表达载体的构建
在本发明中，以淋巴瘤B细胞表面的人类CD19蛋白，T细胞表面人类CD3和T细胞负共刺激分子CTLA-4蛋白为靶点的TiTE三特异性抗体被命名为CD19-CD3-CTLA-4 TsAb。
一、CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D构建方案设计
单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗CTLA-4 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗CTLA-4 scFv序列之间则通过连接片段2(Linker 2)相连。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3scFv和抗CTLA-4 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗CTLA-4 scFv序列之间以IgD铰链区(Ala90-Val170)作为连接片段2(Linker 2)相连。
为使三特异性抗体在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD19 scFv，抗CD3 scFv，抗CTLA-4 scFv序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示。
抗CD19 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。
抗CD3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
抗CTLA-4 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCCGCACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC。
抗CTLA-4 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示，具体为：
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCCGCGCCACCGGCATCCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
抗CTLA-4 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCCGCACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCCGCGCCACCGGCATCCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
为使三特异性抗体在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了抗体分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示。
二、CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D真核表达载体构建
本发明三特异性抗体的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性抗体，分别设计了如表2所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-CTLA-4-F和pcDNA3.1-CTLA-4-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、(GGGGS)3Linker 2+抗CTLA-4 scFv的基因序列；针对CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-CTLA-4-F和pcDNA3.1-CTLA-4-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、IgD铰链区Linker2、抗CTLA-4 scFv的基因序列。扩增完毕后，利用 PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式三特异性抗体全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCCGCACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCCGCGCCACCGGCATCCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，具体为：GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCCGCACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCCGCGCCACCGGCATCCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
表2.CD19-CD3-CTLA-4三特异性抗体基因克隆中使用的引物
实施例6：CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的表达与纯化
一、CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4TsAb_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例5中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTM MAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图5所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D重组蛋白的纯度均>95％：其中CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M重组蛋白的理论分子量为80.1kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性抗体为单体形式(图5A)；CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D重组蛋白的理论分子量为88.0kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(约180kDa)(图5B)，说明两个蛋白分子可通过IgD铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性抗体为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD19-CD3-CTLA-4TsAb_M为单体形式，CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M的氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKR。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，具体为：DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKR。
抗CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。
抗CTLA-4 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示，具体为：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKR。
抗CTLA-4 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示，具体为：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS。
抗CTLA-4 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示，具体为：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKR。
单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例7：ELISA检测CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的抗原结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组抗原包被：人类CD19-hFc、人类CD3-hFc与人类CTLA-4-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，抗原浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24gNaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的三特异性抗体样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M或CD19-CD3-CTLA-4TsAb_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(OD450)。
ELISA结果如图6A和图6B所示：图6A说明CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和CTLA-4-hFc均具有体外结合活性，其中CTLA-4结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱；图6B说明CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和CTLA-4-hFc同样具有体外结合活性，其中CTLA-4结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱。
实施例8：CD19-CD3-CTLA-4三特异性抗体介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M)、二聚体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D)以及抗CD19/抗CD3 BiTE双特异抗体(CD19-CD3 BsAb，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血PBMC制备的CIK细胞(CD3+CD56+)与CCL-86Raji淋巴瘤细胞(CD19+，购自ATCC)，检测细胞死亡情况，比较三种抗体介导的CIK效应细胞对CCL-86Raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.PBMC的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)(购自Gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体Anti-CD3(5ug/ml)、全长抗体Anti-CD28(5ug/ml)和NovoNectin(25ug/ml)包被的T25培养瓶中(全长抗体与NovoNectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500U/mlIL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100uL，取上述培养的CIK细胞1×105个，加入Raji细胞1×105个(CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的CD19-CD3 BsAb、CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M和CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D抗体样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的CCK-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测OD450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何抗体的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图7所示：当CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1时，在未添加任何抗体的条件下，CIK细胞对Raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度抗体(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为94％、91％和89％，CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M的效果次之，杀伤效率约为86％、82％和76％，CD19-CD3 BsAb的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度抗体(3.125ng/ml)的条件，CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D与CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率仍有明显地提高，杀伤效率分别约为82％和71％，而CD19-CD3BsAb与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的CD19-CD3-CTLA-4 TiTE三特异抗体所介导的T细胞对CD19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于CD19-CD3 BiTE双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例9：CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D真核表达载体的构建
在本发明中，以淋巴瘤B细胞表面的人类CD19蛋白，T细胞表面人类CD3和T细胞负共刺激分子LAG-3蛋白为靶点的TiTE三特异性抗体被命名为CD19-CD3-LAG-3 TsAb。
一、CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D构建方案设计
单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗LAG-3 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗LAG-3 scFv序列之间则通过连接片段2(Linker 2)相连。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3scFv和抗LAG-3 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗LAG-3 scFv序列之间以IgD铰链区(Ala90-Val170)作为连接片段2(Linker 2)相连。
为使三特异性抗体在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD19 scFv，抗CD3 scFv，抗LAG-3 scFv序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示。
抗CD19 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。
抗CD3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
抗LAG-3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAGCTTCAGCGACTACTACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCACCGCGGCAGCACCAACAGCAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCCTGAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGCGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTTCGGCTACAGCGACTACGAGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC。
抗LAG-3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示，具体为：
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAACCTGGAGATCAAGCGC。
抗LAG-3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAGCTTCAGCGACTACTACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCACCGCGGCAGCACCAACAGCAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCCTGAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGCGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTTCGGCTACAGCGACTACGAGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAACCTGGAGATCAAGCGC。
单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
为使三特异性抗体在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了抗体分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示。
二、CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D真核表达载体构建
本发明三特异性抗体的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性抗体，分别设计了如表3所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-LAG-3-F和pcDNA3.1-LAG-3-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker 2+抗LAG-3 scFv的基因序列；针对CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-LAG-3-F和pcDNA3.1-LAG-3-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、IgD铰链区Linker2、抗LAG-3 scFv的基因序列。扩增完毕后，利用 PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式三特异性抗体全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAGCTTCAGCGACTACTACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCACCGCGGCAGCACCAACAGCAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCCTGAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGCGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTTCGGCTACAGCGACTACGAGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAACCTGGAGATCAAGCGC。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAGCTTCAGCGACTACTACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCACCGCGGCAGCACCAACAGCAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCCTGAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGCGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTTCGGCTACAGCGACTACGAGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAACCTGGAGATCAAGCGC。
表3.CD19-CD3-LAG-3三特异性抗体基因克隆中使用的引物
实施例10：CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的表达与纯化
一、CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3TsAb_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例9中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTM MAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图8所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D重组蛋白的纯度均>95％：其中CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M重组蛋白的理论分子量为80.4kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性抗体为单体形式(图8A)；CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D重组蛋白的理论分子量为88.3kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(约180kDa)(图8B)，说明两个蛋白分子可通过IgD铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性抗体为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M为单体形式，CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKR。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKR。
抗CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。
抗LAG-3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示，具体为：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKR。
抗LAG-3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示，具体为：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS。
抗LAG-3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示，具体为：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKR。
单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
实施例11：ELISA检测CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的抗原结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组抗原包被：人类CD19-hFc、人类CD3-hFc与人类LAG-3-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，抗原浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24gNaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的三特异性抗体样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M或CD19-CD3-LAG-3TsAb_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(OD450)。
ELISA结果如图9A和图9B所示：图9A说明CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和LAG-3-hFc均具有体外结合活性，其中LAG-3结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱；图9B说明CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和LAG-3-hFc同样具有体外结合活性，其中LAG-3结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱。
实施例12：CD19-CD3-LAG-3三特异性抗体介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M)、二聚体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D)以及抗CD19/抗CD3 BiTE双特异抗体(CD19-CD3 BsAb，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血PBMC制备的CIK细胞(CD3+CD56+)与CCL-86Raji淋巴瘤细胞(CD19+，购自ATCC)，检测细胞死亡情况，比较三种抗体介导的CIK效应细胞对CCL-86Raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.PBMC的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)(购自Gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体Anti-CD3(5ug/ml)、全长抗体Anti-CD28(5ug/ml)和NovoNectin(25ug/ml)包被的T25培养瓶中(全长抗体与NovoNectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500U/mlIL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100uL，取上述培养的CIK细胞1×105个，加入Raji细胞1×105个(CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的CD19-CD3 BsAb、CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M和CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D抗体样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的CCK-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测OD450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何抗体的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图10所示：当CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1时，在未添加任何抗体的条件下，CIK细胞对Raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度抗体(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为95％、92％和83％，CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的效果次之，杀伤效率约为89％、86％和73％，CD19-CD3 BsAb的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度抗体(3.125ng/ml)的条件下，CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D与CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率仍有一定程度地提高，杀伤效率分别约为72％和61％，而CD19-CD3BsAb与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的CD19-CD3-LAG-3 TiTE三特异抗体所介导的T细胞对CD19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于CD19-CD3 BiTE双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例13：CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D真核表达载体的构建
在本发明中，以淋巴瘤B细胞表面的人类CD19蛋白，T细胞表面人类CD3和T细胞负共刺激分子TIM-3蛋白为靶点的TiTE三特异性抗体被命名为CD19-CD3-TIM-3 TsAb。
一、CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D构建方案设计
单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗TIM-3 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗TIM-3 scFv序列之间则通过连接片段2(Linker 2)相连。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3scFv和抗TIM-3 scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗TIM-3 scFv序列之间以IgD铰链区(Ala90-Val170)作为连接片段2(Linker 2)相连。
为使三特异性抗体在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD19 scFv，抗CD3 scFv，抗TIM-3 scFv序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示
抗CD19 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。
抗CD3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
抗TIM-3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示，具体为：CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCCGGCCAGGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCATGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGTGGGCGGCGCCTTCCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC。
抗TIM-3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示，具体为：GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTACGGCACCAGCCTGATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACGTGGAGAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCCGCAAGGACCCCAGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
抗TIM-3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCCGGCCAGGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCATGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGTGGGCGGCGCCTTCCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTACGGCACCAGCCTGATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACGTGGAGAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCCGCAAGGACCCCAGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
为使三特异性抗体在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了抗体分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示。
二、CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D真核表达载体构建
本发明三特异性抗体的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性抗体，分别设计了如表4所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-TIM-3-F和pcDNA3.1-TIM-3-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker 2+抗TIM-3 scFv的基因序列；针对CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-TIM-3-F和pcDNA3.1-TIM-3-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、IgD铰链区Linker2、抗TIM-3 scFv的基因序列。扩增完毕后，利用 PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式三特异性抗体全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCCGGCCAGGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCATGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGTGGGCGGCGCCTTCCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTACGGCACCAGCCTGATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACGTGGAGAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCCGCAAGGACCCCAGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCCGGCCAGGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCATGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGTGGGCGGCGCCTTCCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTACGGCACCAGCCTGATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACGTGGAGAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCCGCAAGGACCCCAGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGC。
表4.CD19-CD3-TIM-3三特异性抗体基因克隆中使用的引物
实施例14：CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的表达与纯化
一、CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3TsAb_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例13中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTM MAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图11所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D重组蛋白的纯度均>95％：其中CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M重组蛋白的理论分子量为80.1kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性抗体为单体形式(图11A)；CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D重组蛋白的理论分子量为88.0kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(约180kDa)(图11B)，说明两个蛋白分子可通过IgD铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性抗体为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M为单体形式，CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWIGDIYPGQGDTSYNQKFKGRATMTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVGGAFPMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSRKDPSTFGGGTKVEIKR。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWIGDIYPGQGDTSYNQKFKGRATMTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVGGAFPMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSRKDPSTFGGGTKVEIKR。
抗CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。
抗TIM-3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示，具体为：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWIGDIYPGQGDTSYNQKFKGRATMTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVGGAFPMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSRKDPSTFGGGTKVEIKR。
抗TIM-3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示，具体为：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWIGDIYPGQGDTSYNQKFKGRATMTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVGGAFPMDYWGQGTLVTVSS。
抗TIM-3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示，具体为：
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSRKDPSTFGGGTKVEIKR。
单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
实施例15：ELISA检测CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D的抗原结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组抗原包被：人类CD19-hFc、人类CD3-hFc与人类TIM-3-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，抗原浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24gNaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的三特异性抗体样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M或CD19-CD3-TIM-3TsAb_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(OD450)。
ELISA结果如图12A和图12B所示：图12A说明CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和TIM-3-hFc均具有体外结合活性，其中TIM-3结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱；图12B说明CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和TIM-3-hFc同样具有体外结合活性，其中TIM-3结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱。
实施例16：CD19-CD3-TIM-3三特异性抗体介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M)、二聚体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D)以及抗CD19/抗CD3 BiTE双特异抗体(CD19-CD3 BsAb，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血PBMC制备的CIK细胞(CD3+CD56+)与CCL-86Raji淋巴瘤细胞(CD19+，购自ATCC)，检测细胞死亡情况，比较三种抗体介导的CIK效应细胞对CCL-86Raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.PBMC的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)(购自Gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体Anti-CD3(5ug/ml)、全长抗体Anti-CD28(5ug/ml)和NovoNectin(25ug/ml)包被的T25培养瓶中(全长抗体与NovoNectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500U/mlIL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100uL，取上述培养的CIK细胞1×105个，加入Raji细胞1×105个(CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的CD19-CD3 BsAb、CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M和CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D抗体样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的CCK-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测OD450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何抗体的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图13所示：当CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1时，在未添加任何抗体的条件下，CIK细胞对Raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度抗体(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为98％、97％和86％，CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M的效果次之，杀伤效率约为92％、89％和76％，CD19-CD3 BsAb的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度抗体(3.125ng/ml)的条件下，CD19-CD3-TIM-3 TsAb_D与CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率仍有一定程度地提高，杀伤效率分别约为76％和68％，而CD19-CD3 BsAb与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的CD19-CD3-TIM-3 TiTE三特异抗体所介导的T细胞对CD19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于CD19-CD3 BiTE双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例17：CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D真核表达载体的构建
在本发明中，以淋巴瘤B细胞表面的人类CD19蛋白，T细胞表面人类CD3和T细胞负共刺激分子TIGIT蛋白为靶点的TiTE三特异性抗体被命名为CD19-CD3-TIGIT TsAb。
一、CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D构建方案设计
单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗TIGIT scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗TIGIT scFv序列之间则通过连接片段2(Linker 2)相连。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3scFv和抗TIGIT scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗TIGIT scFv序列之间以IgD铰链区(Ala90-Val170)作为连接片段2(Linker 2)相连。
为使三特异性抗体在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD19 scFv，抗CD3 scFv，抗TIGIT scFv序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示。
抗CD19 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。
抗CD3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
抗TIGIT scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示，具体为：
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCCTGACCTGCAGCGTGACCGGCAGCAGCATCGCCAGCGACTACTGGGGCTGGATCCGCAAGTTCCCCGGCAACAAGATGGAGTGGATGGGCTTCATCACCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCATCAGCATCACCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGCACAGCGTGACCACCGACGACACCGCCACCTACAGCTGCGCCCGCATGCCCAGCTTCATCACCCTGGCCAGCCTGAGCACCTGGGAGGGCTACTTCGACTTCTGGGGCCCCGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC。
抗TIGIT scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示，具体为：
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCCTGCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCCTGAACTGCAAGGCCAGCCAGAGCATCCACAAGAACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTACTACGCCAACAGCCTGCAGACCGGCATCCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTACTACAGCGGCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGCTGAAGCGC。
抗TIGIT scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，具体为：
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCCTGACCTGCAGCGTGACCGGCAGCAGCATCGCCAGCGACTACTGGGGCTGGATCCGCAAGTTCCCCGGCAACAAGATGGAGTGGATGGGCTTCATCACCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCATCAGCATCACCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGCACAGCGTGACCACCGACGACACCGCCACCTACAGCTGCGCCCGCATGCCCAGCTTCATCACCCTGGCCAGCCTGAGCACCTGGGAGGGCTACTTCGACTTCTGGGGCCCCGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCCTGCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCCTGAACTGCAAGGCCAGCCAGAGCATCCACAAGAACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTACTACGCCAACAGCCTGCAGACCGGCATCCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTACTACAGCGGCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGCTGAAGCGC。
单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
为使三特异性抗体在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了抗体分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示。
二、CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D真核表达载体构建
本发明三特异性抗体的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性抗体，分别设计了如表5所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD19-CD3-TIGIT TsAb_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-TIGIT-F和pcDNA3.1-TIGIT-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker 2+抗TIGIT scFv的基因序列；针对CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-TIGIT-F和pcDNA3.1-TIGIT-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、IgD铰链区Linker2、抗TIGIT scFv的基因序列。扩增完毕后，利用 PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式三特异性抗体全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCCTGACCTGCAGCGTGACCGGCAGCAGCATCGCCAGCGACTACTGGGGCTGGATCCGCAAGTTCCCCGGCAACAAGATGGAGTGGATGGGCTTCATCACCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCATCAGCATCACCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGCACAGCGTGACCACCGACGACACCGCCACCTACAGCTGCGCCCGCATGCCCAGCTTCATCACCCTGGCCAGCCTGAGCACCTGGGAGGGCTACTTCGACTTCTGGGGCCCCGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCCTGCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCCTGAACTGCAAGGCCAGCCAGAGCATCCACAAGAACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTACTACGCCAACAGCCTGCAGACCGGCATCCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTACTACAGCGGCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGCTGAAGCGC。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGGAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCCTGACCTGCAGCGTGACCGGCAGCAGCATCGCCAGCGACTACTGGGGCTGGATCCGCAAGTTCCCCGGCAACAAGATGGAGTGGATGGGCTTCATCACCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCATCAGCATCACCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGCACAGCGTGACCACCGACGACACCGCCACCTACAGCTGCGCCCGCATGCCCAGCTTCATCACCCTGGCCAGCCTGAGCACCTGGGAGGGCTACTTCGACTTCTGGGGCCCCGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCCTGCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCCTGAACTGCAAGGCCAGCCAGAGCATCCACAAGAACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTACTACGCCAACAGCCTGCAGACCGGCATCCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTACTACAGCGGCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGCTGAAGCGC。
表5.CD19-CD3-TIGIT三特异性抗体基因克隆中使用的引物
实施例18：CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的表达与纯化
一、CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGITTsAb_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例17中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTM MAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图14所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D重组蛋白的纯度均>95％：其中CD19-CD3-TIGIT TsAb_M重组蛋白的理论分子量为80.9kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性抗体为单体形式(图14A)；CD19-CD3-TIGIT TsAb_D重组蛋白的理论分子量为88.8kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(约180kDa)(图14B)，说明两个蛋白分子可通过IgD铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性抗体为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD19-CD3-TIGIT TsAb_M为单体形式，CD19-CD3-TIGIT TsAb_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGSSIASDYWGWIRKFPGNKMEWMGFITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLHSVTTDDTATYSCARMPSFITLASLSTWEGYFDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNCKASQSIHKNLAWYQQKLGEAPKFLIYYANSLQTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDVATYFCQQYYSGWTFGGGTKVELKR。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGSSIASDYWGWIRKFPGNKMEWMGFITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLHSVTTDDTATYSCARMPSFITLASLSTWEGYFDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNCKASQSIHKNLAWYQQKLGEAPKFLIYYANSLQTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDVATYFCQQYYSGWTFGGGTKVELKR。
抗CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。
抗TIGIT scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示，具体为：
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGSSIASDYWGWIRKFPGNKMEWMGFITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLHSVTTDDTATYSCARMPSFITLASLSTWEGYFDFWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNCKASQSIHKNLAWYQQKLGEAPKFLIYYANSLQTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDVATYFCQQYYSGWTFGGGTKVELKR。
抗TIGIT scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示，具体为：
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGSSIASDYWGWIRKFPGNKMEWMGFITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLHSVTTDDTATYSCARMPSFITLASLSTWEGYFDFWGPGTMVTVSS。
抗TIGIT scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示，具体为：
DIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNCKASQSIHKNLAWYQQKLGEAPKFLIYYANSLQTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDVATYFCQQYYSGWTFGGGTKVELKR。
单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
实施例19：ELISA检测CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGITTsAb_D的抗原结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组抗原包被：人类CD19-hFc、人类CD3-hFc与人类TIGIT-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，抗原浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24gNaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的三特异性抗体样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M或CD19-CD3-TIGITTsAb_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(OD450)。
ELISA结果如图15A和图15B所示：图15A说明CD19-CD3-TIGIT TsAb_M与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和TIGIT-hFc均具有体外结合活性，其中TIGIT和CD19结合活性均较高，CD3结合活性较弱；图15B说明CD19-CD3-TIGIT TsAb_D与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和TIGIT-hFc同样具有体外结合活性，其中TIGIT和CD19结合活性均较高，CD3结合活性较弱。
实施例20：CD19-CD3-TIGIT三特异性抗体介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-TIGIT TsAb_M)、二聚体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-TIGIT TsAb_D)以及抗CD19/抗CD3 BiTE双特异抗体(CD19-CD3 BsAb，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血PBMC制备的CIK细胞(CD3+CD56+)与CCL-86Raji淋巴瘤细胞(CD19+，购自ATCC)，检测细胞死亡情况，比较三种抗体介导的CIK效应细胞对CCL-86Raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.PBMC的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)(购自Gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体Anti-CD3(5ug/ml)、全长抗体Anti-CD28(5ug/ml)和NovoNectin(25ug/ml)包被的T25培养瓶中(全长抗体与NovoNectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500U/mlIL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100uL，取上述培养的CIK细胞1×105个，加入Raji细胞1×105个(CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的CD19-CD3 BsAb、CD19-CD3-TIGIT TsAb_M和CD19-CD3-TIGIT TsAb_D抗体样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的CCK-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测OD450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何抗体的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图16所示：当CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1时，在未添加任何抗体的条件下，CIK细胞对Raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度抗体(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中CD19-CD3-TIGIT TsAb_D所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为88％、86％和76％，CD19-CD3-TIGIT TsAb_M的效果次之，杀伤效率约为82％、79％和66％，CD19-CD3 BsAb的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度抗体(3.125ng/ml)的条件下，CD19-CD3-TIGIT TsAb_D与CD19-CD3-TIGIT TsAb_M所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率仍有一定程度地提高，杀伤效率分别约为66％和55％，而CD19-CD3 BsAb与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的CD19-CD3-TIGIT TiTE三特异抗体所介导的T细胞对CD19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于CD19-CD3 BiTE双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例21：CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D真核表达载体的构建
在本发明中，以淋巴瘤B细胞表面的人类CD19蛋白，T细胞表面人类CD3和T细胞负共刺激分子BTLA蛋白为靶点的TiTE三特异性抗体被命名为CD19-CD3-BTLA TsAb。
一、CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D构建方案设计
单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗BTLA scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗BTLA scFv序列之间则通过连接片段2(Linker 2)相连。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D具体构建方案为：抗CD19 scFv，抗CD3 scFv和抗BTLA scFv的序列通过连接片段(Linker)相连，具体地，抗CD19 scFv和抗CD3 scFv之间通过连接片段1(Linker 1)相连，抗CD3 scFv和抗BTLA scFv序列之间以IgD铰链区(Ala90-Val170)作为连接片段2(Linker 2)相连。
为使三特异性抗体在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD19 scFv，抗CD3 scFv，抗BTLA scFv序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示。
抗CD19 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。
抗CD3 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
抗BTLA scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示，具体为：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCATCAGCAGCTACGACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCACCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGTGATCGGCCCCGCCGGCGACACCTACTACCCCGGCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAGAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGGCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGAGGGCATGGCCGCCCACAACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC。
抗BTLA scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示，具体为：
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCCGCCTGGAGATCAAGCGC。
抗BTLA scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示，具体为：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCATCAGCAGCTACGACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCACCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGTGATCGGCCCCGCCGGCGACACCTACTACCCCGGCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAGAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGGCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGAGGGCATGGCCGCCCACAACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCCGCCTGGAGATCAAGCGC。
单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D连接片段1(Linker 1)的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D连接片段2(Linker 2)的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
为使三特异性抗体在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了抗体分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示。
二、CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D真核表达载体构建
本发明三特异性抗体的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性抗体，分别设计了如表6所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD19-CD3-BTLA TsAb_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-BTLA-F和pcDNA3.1-BTLA-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker 2+抗BTLA scFv的基因序列；针对CD19-CD3-BTLA TsAb_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD19-F和CD19-R、CD19-G4S-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-BTLA-F和pcDNA3.1-BTLA-R扩增出抗CD19 scFv、GGGGS Linker 1+抗CD3 scFv、IgD铰链区Linker 2、抗BTLAscFv的基因序列。扩增完毕后，利用 PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式三特异性抗体全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M和二聚体形式的CD19-CD3-BTLATsAb_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCATCAGCAGCTACGACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCACCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGTGATCGGCCCCGCCGGCGACACCTACTACCCCGGCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAGAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGGCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGAGGGCATGGCCGCCCACAACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCCGCCTGGAGATCAAGCGC。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGTGAGCGGCATCCCCCCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGAAGGTGGACGCCGCCACCTACCACTGCCAGCAGAGCACCGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCAGATCTGGCCCGGCGACGGCGACACCAACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACGAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGGCCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCGCGAGACCACCACCGTGGGCCGCTACTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCATCAGCAGCTACGACATGCACTGGGTGCGCCAGGCCACCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGTGATCGGCCCCGCCGGCGACACCTACTACCCCGGCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAGAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGGCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGAGGGCATGGCCGCCCACAACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCCGCCTGGAGATCAAGCGC。
表6.CD19-CD3-BTLA三特异性抗体基因克隆中使用的引物
实施例22：CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D的表达与纯化
一、CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例21中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTM MAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图17所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D重组蛋白的纯度均>95％：其中CD19-CD3-BTLA TsAb_M重组蛋白的理论分子量为80.0kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性抗体为单体形式(图17A)；CD19-CD3-BTLA TsAb_D重组蛋白的理论分子量为87.9kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(约180kDa)(图17B)，说明两个蛋白分子可通过IgD铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性抗体为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD19-CD3-BTLA TsAb_M为单体形式，CD19-CD3-BTLA TsAb_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSYDMHWVRQATGKGLEWVSVIGPAGDTYYPGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCAREGMAAHNYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPITFGQGTRLEIKR。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，具体为：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSYDMHWVRQATGKGLEWVSVIGPAGDTYYPGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCAREGMAAHNYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPITFGQGTRLEIKR。
抗CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示。
抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示。
抗BTLA scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示，具体为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSYDMHWVRQATGKGLEWVSVIGPAGDTYYPGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCAREGMAAHNYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPITFGQGTRLEIKR。
抗BTLA scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示，具体为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSYDMHWVRQATGKGLEWVSVIGPAGDTYYPGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCAREGMAAHNYYGMDVWGQGTTVTVSS。
抗BTLA scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示，具体为：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPITFGQGTRLEIKR。
单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D连接片段1(Linker 1)的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D连接片段2(Linker 2)的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
实施例23：ELISA检测CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D的抗原结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组抗原包被：人类CD19-hFc、人类CD3-hFc与人类BTLA-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，抗原浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24gNaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的三特异性抗体样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD19-CD3-BTLA TsAb_M或CD19-CD3-BTLATsAb_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(OD450)。
ELISA结果如图18A和图18B所示：图18A说明CD19-CD3-BTLA TsAb_M与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和BTLA-hFc均具有体外结合活性，其中BTLA结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱；图18B说明CD19-CD3-BTLA TsAb_D与重组抗原CD19-hFc、CD3-hFc和BTLA-hFc同样具有体外结合活性，其中BTLA结合活性最高，CD19结合活性次之，CD3结合活性较弱。
实施例24：CD19-CD3-BTLA三特异性抗体介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-BTLA TsAb_M)、二聚体形式的TiTE三特异抗体(CD19-CD3-BTLA TsAb_D)以及抗CD19/抗CD3 BiTE双特异抗体(CD19-CD3 BsAb，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血PBMC制备的CIK细胞(CD3+CD56+)与CCL-86Raji淋巴瘤细胞(CD19+，购自ATCC)，检测细胞死亡情况，比较三种抗体介导的CIK效应细胞对CCL-86Raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.PBMC的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)(购自Gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体Anti-CD3(5ug/ml)、全长抗体Anti-CD28(5ug/ml)和NovoNectin(25ug/ml)包被的T25培养瓶中(全长抗体与NovoNectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500U/mlIL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100uL，取上述培养的CIK细胞1×105个，加入Raji细胞1×105个(CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的CD19-CD3 BsAb、CD19-CD3-BTLA TsAb_M和CD19-CD3-BTLA TsAb_D抗体样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的CCK-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测OD450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何抗体的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图19所示：当CIK效应细胞：Raji靶细胞(E：T比)为1：1时，在未添加任何抗体的条件下，CIK细胞对Raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度抗体(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中CD19-CD3-BTLA TsAb_D所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为90％、87％和86％，CD19-CD3-BTLA TsAb_M的效果次之，杀伤效率约为86％、82％和76％，CD19-CD3 BsAb的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度抗体(3.125ng/ml)的条件下，CD19-CD3-BTLA TsAb_D与CD19-CD3-BTLA TsAb_M所介导的CIK细胞对Raji细胞的杀伤效率仍有一定程度地提高，杀伤效率分别约为79％和68％，而CD19-CD3 BsAb与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的CD19-CD3-BTLA TiTE三特异抗体所介导的T细胞对CD19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于CD19-CD3 BiTE双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海近岸生物科技有限公司
<120> 一种结合CD19、CD3和T细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用
<130> 164637
<160> 114
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异抗体中连接片段1的
氨基酸序列
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<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异抗体中连接片段1的
核苷酸序列
<400> 2
ggcggcggcg gcagc 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异抗体中连接片段2的
氨基酸序列
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异抗体中连接片段2的
核苷酸序列
<400> 4
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异性抗体中连接片段
1的氨基酸序列
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Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异性抗体中连接片段
1的核苷酸序列
<400> 6
ggcggcggcg gcagc 15
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<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异性抗体中连接片段
2的氨基酸序列
<400> 7
Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys
1 5 10 15
Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg
35 40 45
Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu
50 55 60
Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly
65 70 75 80
Val
<210> 8
<211> 243
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的抗CD19/抗CD3/抗T细胞负共刺激分子三特异性抗体中连接片段
2的核苷酸序列
<400> 8
gccagcaaga gcaagaagga gatcttccgc tggcccgaga gccccaaggc ccaggccagc 60
agcgtgccca ccgcccagcc ccaggccgag ggcagcctgg ccaaggccac caccgccccc 120
gccaccaccc gcaacaccgg ccgcggcggc gaggagaaga agaaggagaa ggagaaggag 180
gagcaggagg agcgcgagac caagaccccc gagtgcccca gccacaccca gcccctgggc 240
gtg 243
<210> 9
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞负共刺激分子人类PD-1胞外区的氨基酸序列
<400> 9
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val
145 150
<210> 10
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞负共刺激分子人类CTLA-4胞外区的氨基酸序列
<400> 10
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp
115 120 125
<210> 11
<211> 422
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞负共刺激分子人类LAG-3胞外区的氨基酸序列
<400> 11
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385 390 395 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
Leu Pro Ala Gly His Leu
420
<210> 12
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞负共刺激分子人类TIM-3胞外区的氨基酸序列
<400> 12
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly
180
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞负共刺激分子人类TIGIT胞外区的氨基酸序列
<400> 13
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
115 120
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞负共刺激分子人类BTLA胞外区的氨基酸序列
<400> 14
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
20 25 30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
35 40 45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65 70 75 80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
85 90 95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
100 105 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg
115 120 125
<210> 15
<211> 749
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的氨基酸序列
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
260 265 270
Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
275 280 285
Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
290 295 300
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
305 310 315 320
Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
325 330 335
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
385 390 395 400
Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg
405 410 415
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
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Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly
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Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
450 455 460
Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
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Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro
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<210> 16
<211> 2247
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_M的核苷酸序列
<400> 16
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ggcatccccc cccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240
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<220>
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<400> 17
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260 265 270
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275 280 285
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<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-PD-1 TsAb_D的核苷酸序列
<400> 18
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 单体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_M的核苷酸序列
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<211> 821
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的氨基酸序列
<400> 21
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705 710 715 720
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
725 730 735
Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
740 745 750
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala
755 760 765
Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
770 775 780
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
785 790 795 800
Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
805 810 815
Val Glu Ile Lys Arg
820
<210> 22
<211> 2463
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-CTLA-4 TsAb_D的核苷酸序列
<400> 22
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<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的氨基酸序列
<400> 23
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Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
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Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
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Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Glu Ile Lys Arg
755
<210> 24
<211> 2268
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_M的核苷酸序列
<400> 24
gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gcgcgccacc 60
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-LAG-3 TsAb_D的氨基酸序列
<400> 25
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
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Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
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Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
260 265 270
Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
275 280 285
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Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
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Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
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<212> DNA
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<220>
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<400> 26
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<210> 27
<211> 758
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<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-TIM-3 TsAb_M的氨基酸序列
<400> 27
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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<223> 单体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_M的核苷酸序列
<400> 32
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aactgggtga agcagcgccc cggccagggc ctggagtgga tcggccagat ctggcccggc 540
gacggcgaca ccaactacaa cggcaagttc aagggcaagg ccaccctgac cgccgacgag 600
agcagcagca ccgcctacat gcagctgagc agcctggcca gcgaggacag cgccgtgtac 660
ttctgcgccc gccgcgagac caccaccgtg ggccgctact actacgccat ggactactgg 720
ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcgacat caagctgcag 780
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ggctacacct tcacccgcta caccatgcac tgggtgaagc agcgccccgg ccagggcctg 900
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gacaaggcca ccctgaccac cgacaagagc agcagcaccg cctacatgca gctgagcagc 1020
ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgcccgct actacgacga ccactactgc 1080
ctggactact ggggccaggg caccaccctg accgtgagca gcgtggaggg cggcagcggc 1140
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gtgagctaca tgaactggta ccagcagaag agcggcacca gccccaagcg ctggatctac 1320
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agctacagcc tgaccatcag cagcatggag gccgaggacg ccgccaccta ctactgccag 1440
cagtggagca gcaaccccct gaccttcggc gccggcacca agctggagct gaagggcggc 1500
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg aggtgcagct gcaggagagc 1560
ggccccggcc tggtgaagcc cagccagagc ctgagcctga cctgcagcgt gaccggcagc 1620
agcatcgcca gcgactactg gggctggatc cgcaagttcc ccggcaacaa gatggagtgg 1680
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gacgacaccg ccacctacag ctgcgcccgc atgcccagct tcatcaccct ggccagcctg 1860
agcacctggg agggctactt cgacttctgg ggccccggca ccatggtgac cgtgagcagc 1920
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgacat ccagatgacc 1980
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ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcggcctgc agcccgagga cgtggccacc 2220
tacttctgcc agcagtacta cagcggctgg accttcggcg gcggcaccaa ggtggagctg 2280
aagcgc 2286
<210> 33
<211> 828
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的氨基酸序列
<400> 33
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
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195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
260 265 270
Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
275 280 285
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290 295 300
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
305 310 315 320
Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
325 330 335
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
385 390 395 400
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Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
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<211> 2484
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-TIGIT TsAb_D的核苷酸序列
<400> 34
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M的氨基酸序列
<400> 35
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1 5 10 15
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580 585 590
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595 600 605
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Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
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675 680 685
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740 745 750
Arg Leu Glu Ile Lys Arg
755
<210> 36
<211> 2274
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_M的核苷酸序列
<400> 36
gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gcgcgccacc 60
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<210> 37
<211> 824
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D的氨基酸序列
<400> 37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
325 330 335
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
385 390 395 400
Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg
405 410 415
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
420 425 430
Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly
435 440 445
Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
450 455 460
Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
465 470 475 480
Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
485 490 495
Leu Lys Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser
500 505 510
Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu
515 520 525
Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr
530 535 540
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln
545 550 555 560
Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro
565 570 575
Leu Gly Val Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
580 585 590
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile
595 600 605
Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu
610 615 620
Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly
625 630 635 640
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser
645 650 655
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr
660 665 670
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Met Ala Ala His Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
675 680 685
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
705 710 715 720
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
725 730 735
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
740 745 750
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
755 760 765
Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
770 775 780
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
785 790 795 800
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln
805 810 815
Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
820
<210> 38
<211> 2472
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD19-CD3-BTLA TsAb_D的核苷酸酸序列
<400> 38
gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gcgcgccacc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct gaactggtac 120
cagcagatcc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180
ggcatccccc cccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaga aggtggacgc cgccacctac cactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 360
agcggcggcg gcggcagcca ggtgcagctg cagcagagcg gcgccgagct ggtgcgcccc 420
ggcagcagcg tgaagatcag ctgcaaggcc agcggctacg ccttcagcag ctactggatg 480
aactgggtga agcagcgccc cggccagggc ctggagtgga tcggccagat ctggcccggc 540
gacggcgaca ccaactacaa cggcaagttc aagggcaagg ccaccctgac cgccgacgag 600
agcagcagca ccgcctacat gcagctgagc agcctggcca gcgaggacag cgccgtgtac 660
ttctgcgccc gccgcgagac caccaccgtg ggccgctact actacgccat ggactactgg 720
ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcgacat caagctgcag 780
cagagcggcg ccgagctggc ccgccccggc gccagcgtga agatgagctg caagaccagc 840
ggctacacct tcacccgcta caccatgcac tgggtgaagc agcgccccgg ccagggcctg 900
gagtggatcg gctacatcaa ccccagccgc ggctacacca actacaacca gaagttcaag 960
gacaaggcca ccctgaccac cgacaagagc agcagcaccg cctacatgca gctgagcagc 1020
ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgcccgct actacgacga ccactactgc 1080
ctggactact ggggccaggg caccaccctg accgtgagca gcgtggaggg cggcagcggc 1140
ggcagcggcg gcagcggcgg cagcggcggc gtggacgaca tccagctgac ccagagcccc 1200
gccatcatga gcgccagccc cggcgagaag gtgaccatga cctgccgcgc cagcagcagc 1260
gtgagctaca tgaactggta ccagcagaag agcggcacca gccccaagcg ctggatctac 1320
gacaccagca aggtggccag cggcgtgccc taccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc 1380
agctacagcc tgaccatcag cagcatggag gccgaggacg ccgccaccta ctactgccag 1440
cagtggagca gcaaccccct gaccttcggc gccggcacca agctggagct gaaggccagc 1500
aagagcaaga aggagatctt ccgctggccc gagagcccca aggcccaggc cagcagcgtg 1560
cccaccgccc agccccaggc cgagggcagc ctggccaagg ccaccaccgc ccccgccacc 1620
acccgcaaca ccggccgcgg cggcgaggag aagaagaagg agaaggagaa ggaggagcag 1680
gaggagcgcg agaccaagac ccccgagtgc cccagccaca cccagcccct gggcgtggag 1740
gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgcctgagc 1800
tgcgccgcca gcggcttcac catcagcagc tacgacatgc actgggtgcg ccaggccacc 1860
ggcaagggcc tggagtgggt gagcgtgatc ggccccgccg gcgacaccta ctaccccggc 1920
agcgtgaagg gccgcttcac catcagccgc gagaacgcca agaacagcct gtacctgcag 1980
atgaacagcc tgcgcgccgg cgacaccgcc gtgtactact gcgcccgcga gggcatggcc 2040
gcccacaact actacggcat ggacgtgtgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc 2100
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgagat cgtgctgacc 2160
cagagccccg ccaccctgag cctgagcccc ggcgagcgcg ccaccctgag ctgccgcgcc 2220
agccagagcg tgagcagcta cctggcctgg taccagcaga agcccggcca ggccccccgc 2280
ctgctgatct acgacgccag caaccgcgcc accggcatcc ccgcccgctt cagcggcagc 2340
ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcagcctgg agcccgagga cttcgccgtg 2400
tactactgcc agcagcgcag caactggccc cccatcacct tcggccaggg cacccgcctg 2460
gagatcaagc gc 2472
<210> 39
<211> 250
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD19 scFv的氨基酸序列
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 40
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD19 scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD19 scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 41
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv的氨基酸序列
<400> 42
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 43
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 45
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-1 scFv的氨基酸序列
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
210 215 220
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-1 scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 47
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-1 scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 48
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CTLA-4 scFv的氨基酸序列
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys Arg
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CTLA-4 scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CTLA-4 scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 51
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗LAG-3 scFv的氨基酸序列
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗LAG-3 scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗LAG-3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 54
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIM-3 scFv的氨基酸序列
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Ala Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
130 135 140
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu
145 150 155 160
Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Arg Lys Asp Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 55
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIM-3 scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Ala Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIM-3 scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 56
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Asp Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 57
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIGIT scFv的氨基酸序列
<400> 57
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Ser Ser Ile Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu His Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys Ala
85 90 95
Arg Met Pro Ser Phe Ile Thr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Trp Glu Gly
100 105 110
Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
130 135 140
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
145 150 155 160
Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile His Lys Asn Leu Ala
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Tyr
180 185 190
Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg
245
<210> 58
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIGIT scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 58
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Ser Ser Ile Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu His Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys Ala
85 90 95
Arg Met Pro Ser Phe Ile Thr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Trp Glu Gly
100 105 110
Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIGIT scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile His Lys Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 60
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗BTLA scFv的氨基酸序列
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gly Met Ala Ala His Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 61
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗BTLA scFv的重链可变区的氨基酸序列
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gly Met Ala Ala His Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗BTLA scFv的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 62
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 63
<211> 750
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD19 scFv的核苷酸序列
<400> 63
gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gcgcgccacc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct gaactggtac 120
cagcagatcc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180
ggcatccccc cccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaga aggtggacgc cgccacctac cactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 360
agcggcggcg gcggcagcca ggtgcagctg cagcagagcg gcgccgagct ggtgcgcccc 420
ggcagcagcg tgaagatcag ctgcaaggcc agcggctacg ccttcagcag ctactggatg 480
aactgggtga agcagcgccc cggccagggc ctggagtgga tcggccagat ctggcccggc 540
gacggcgaca ccaactacaa cggcaagttc aagggcaagg ccaccctgac cgccgacgag 600
agcagcagca ccgcctacat gcagctgagc agcctggcca gcgaggacag cgccgtgtac 660
ttctgcgccc gccgcgagac caccaccgtg ggccgctact actacgccat ggactactgg 720
ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc 750
<210> 64
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD19 scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 64
caggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag ctggtgcgcc ccggcagcag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cgccttcagc agctactgga tgaactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggccag atctggcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgacg agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctggc cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcgc ccgccgcgag 300
accaccaccg tgggccgcta ctactacgcc atggactact ggggccaggg caccaccgtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 65
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD19 scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 65
gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gcgcgccacc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct gaactggtac 120
cagcagatcc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180
ggcatccccc cccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaga aggtggacgc cgccacctac cactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aag 333
<210> 66
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv的核苷酸序列
<400> 66
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaag 729
<210> 67
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 67
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagc 357
<210> 68
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 68
gacatccagc tgacccagag ccccgccatc atgagcgcca gccccggcga gaaggtgacc 60
atgacctgcc gcgccagcag cagcgtgagc tacatgaact ggtaccagca gaagagcggc 120
accagcccca agcgctggat ctacgacacc agcaaggtgg ccagcggcgt gccctaccgc 180
ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagcat ggaggccgag 240
gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg agcagcaacc ccctgacctt cggcgccggc 300
accaagctgg agctgaag 318
<210> 69
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-1 scFv的核苷酸序列
<400> 69
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60
gactgcaagg ccagcggcat caccttcagc aacagcggca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atctggtacg acggcagcaa gcgctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgttc 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc caccaacgac 300
gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgagatc gtgctgaccc agagccccgc caccctgagc 420
ctgagccccg gcgagcgcgc caccctgagc tgccgcgcca gccagagcgt gagcagctac 480
ctggcctggt accagcagaa gcccggccag gccccccgcc tgctgatcta cgacgccagc 540
aaccgcgcca ccggcatccc cgcccgcttc agcggcagcg gcagcggcac cgacttcacc 600
ctgaccatca gcagcctgga gcccgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcagagcagc 660
aactggcccc gcaccttcgg ccagggcacc aaggtggaga tcaagcgc 708
<210> 70
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-1 scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 70
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60
gactgcaagg ccagcggcat caccttcagc aacagcggca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atctggtacg acggcagcaa gcgctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgttc 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc caccaacgac 300
gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagc 339
<210> 71
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-1 scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 71
gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gcgcgccacc 60
ctgagctgcc gcgccagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggccaggccc cccgcctgct gatctacgac gccagcaacc gcgccaccgg catccccgcc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag agcagcaact ggccccgcac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgc 324
<210> 72
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CTLA-4 scFv的核苷酸序列
<400> 72
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacacca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgaccttc atcagctacg acggcaacaa caagtactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccatct actactgcgc ccgcaccggc 300
tggctgggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcggcggc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg agatcgtgct gacccagagc 420
cccggcaccc tgagcctgag ccccggcgag cgcgccaccc tgagctgccg cgccagccag 480
agcgtgggca gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggccaggc cccccgcctg 540
ctgatctacg gcgccttcag ccgcgccacc ggcatccccg accgcttcag cggcagcggc 600
agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc cgcctggagc ccgaggactt cgccgtgtac 660
tactgccagc agtacggcag cagcccctgg accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc 720
aagcgc 726
<210> 73
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CTLA-4 scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 73
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacacca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgaccttc atcagctacg acggcaacaa caagtactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccatct actactgcgc ccgcaccggc 300
tggctgggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 74
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CTLA-4 scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 74
gagatcgtgc tgacccagag ccccggcacc ctgagcctga gccccggcga gcgcgccacc 60
ctgagctgcc gcgccagcca gagcgtgggc agcagctacc tggcctggta ccagcagaag 120
cccggccagg ccccccgcct gctgatctac ggcgccttca gccgcgccac cggcatcccc 180
gaccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag ccgcctggag 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacggca gcagcccctg gaccttcggc 300
cagggcacca aggtggagat caagcgc 327
<210> 75
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗LAG-3 scFv的核苷酸序列
<400> 75
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgccggc ctgctgaagc ccagcgagac cctgagcctg 60
acctgcgccg tgtacggcgg cagcttcagc gactactact ggaactggat ccgccagccc 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacc gcggcagcac caacagcaac 180
cccagcctga agagccgcgt gaccctgagc ctggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240
aagctgcgca gcgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgcctt cggctacagc 300
gactacgagt acaactggtt cgacccctgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgagat cgtgctgacc 420
cagagccccg ccaccctgag cctgagcccc ggcgagcgcg ccaccctgag ctgccgcgcc 480
agccagagca tcagcagcta cctggcctgg taccagcaga agcccggcca ggccccccgc 540
ctgctgatct acgacgccag caaccgcgcc accggcatcc ccgcccgctt cagcggcagc 600
ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcagcctgg agcccgagga cttcgccgtg 660
tactactgcc agcagcgcag caactggccc ctgaccttcg gccagggcac caacctggag 720
atcaagcgc 729
<210> 76
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗LAG-3 scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 76
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgccggc ctgctgaagc ccagcgagac cctgagcctg 60
acctgcgccg tgtacggcgg cagcttcagc gactactact ggaactggat ccgccagccc 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacc gcggcagcac caacagcaac 180
cccagcctga agagccgcgt gaccctgagc ctggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240
aagctgcgca gcgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgcctt cggctacagc 300
gactacgagt acaactggtt cgacccctgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 77
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗LAG-3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 77
gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gcgcgccacc 60
ctgagctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggccaggccc cccgcctgct gatctacgac gccagcaacc gcgccaccgg catccccgcc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cgcagcaact ggcccctgac cttcggccag 300
ggcaccaacc tggagatcaa gcgc 324
<210> 78
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIM-3 scFv的核苷酸酸序列
<400> 78
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcgac atctaccccg gccagggcga caccagctac 180
aaccagaagt tcaagggccg cgccaccatg accgccgaca agagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcgtgggc 300
ggcgccttcc ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcggcggc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg acatcgtgct gacccagagc 420
cccgacagcc tggccgtgag cctgggcgag cgcgccacca tcaactgccg cgccagcgag 480
agcgtggagt actacggcac cagcctgatg cagtggtacc agcagaagcc cggccagccc 540
cccaagctgc tgatctacgc cgccagcaac gtggagagcg gcgtgcccga ccgcttcagc 600
ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctgcaggc cgaggacgtg 660
gccgtgtact actgccagca gagccgcaag gaccccagca ccttcggcgg cggcaccaag 720
gtggagatca agcgc 735
<210> 79
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIM-3 scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 79
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcgac atctaccccg gccagggcga caccagctac 180
aaccagaagt tcaagggccg cgccaccatg accgccgaca agagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcgtgggc 300
ggcgccttcc ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 80
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIM-3 scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 80
gacatcgtgc tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgcc gcgccagcga gagcgtggag tactacggca ccagcctgat gcagtggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cgtggagagc 180
ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagccgcaa ggaccccagc 300
accttcggcg gcggcaccaa ggtggagatc aagcgc 336
<210> 81
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIGIT scFv的核苷酸序列
<400> 81
gaggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctggtgaagc ccagccagag cctgagcctg 60
acctgcagcg tgaccggcag cagcatcgcc agcgactact ggggctggat ccgcaagttc 120
cccggcaaca agatggagtg gatgggcttc atcacctaca gcggcagcac cagctacaac 180
cccagcctga agagccgcat cagcatcacc cgcgacacca gcaagaacca gttcttcctg 240
cagctgcaca gcgtgaccac cgacgacacc gccacctaca gctgcgcccg catgcccagc 300
ttcatcaccc tggccagcct gagcacctgg gagggctact tcgacttctg gggccccggc 360
accatggtga ccgtgagcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcgaca tccagatgac ccagagcccc agcctgctga gcgccagcgt gggcgaccgc 480
gtgaccctga actgcaaggc cagccagagc atccacaaga acctggcctg gtaccagcag 540
aagctgggcg aggcccccaa gttcctgatc tactacgcca acagcctgca gaccggcatc 600
cccagccgct tcagcggcag cggcagcggc accgacttca ccctgaccat cagcggcctg 660
cagcccgagg acgtggccac ctacttctgc cagcagtact acagcggctg gaccttcggc 720
ggcggcacca aggtggagct gaagcgc 747
<210> 82
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIGIT scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 82
gaggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctggtgaagc ccagccagag cctgagcctg 60
acctgcagcg tgaccggcag cagcatcgcc agcgactact ggggctggat ccgcaagttc 120
cccggcaaca agatggagtg gatgggcttc atcacctaca gcggcagcac cagctacaac 180
cccagcctga agagccgcat cagcatcacc cgcgacacca gcaagaacca gttcttcctg 240
cagctgcaca gcgtgaccac cgacgacacc gccacctaca gctgcgcccg catgcccagc 300
ttcatcaccc tggccagcct gagcacctgg gagggctact tcgacttctg gggccccggc 360
accatggtga ccgtgagcag c 381
<210> 83
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗TIGIT scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 83
gacatccaga tgacccagag ccccagcctg ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
ctgaactgca aggccagcca gagcatccac aagaacctgg cctggtacca gcagaagctg 120
ggcgaggccc ccaagttcct gatctactac gccaacagcc tgcagaccgg catccccagc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcgg cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctactt ctgccagcag tactacagcg gctggacctt cggcggcggc 300
accaaggtgg agctgaagcg c 321
<210> 84
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗BTLA scFv的核苷酸序列
<400> 84
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccatcagc agctacgaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
accggcaagg gcctggagtg ggtgagcgtg atcggccccg ccggcgacac ctactacccc 180
ggcagcgtga agggccgctt caccatcagc cgcgagaacg ccaagaacag cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgcgcgc cggcgacacc gccgtgtact actgcgcccg cgagggcatg 300
gccgcccaca actactacgg catggacgtg tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgagc 360
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgtgctg 420
acccagagcc ccgccaccct gagcctgagc cccggcgagc gcgccaccct gagctgccgc 480
gccagccaga gcgtgagcag ctacctggcc tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc 540
cgcctgctga tctacgacgc cagcaaccgc gccaccggca tccccgcccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tggagcccga ggacttcgcc 660
gtgtactact gccagcagcg cagcaactgg ccccccatca ccttcggcca gggcacccgc 720
ctggagatca agcgc 735
<210> 85
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗BTLA scFv的重链可变区的核苷酸序列
<400> 85
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccatcagc agctacgaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
accggcaagg gcctggagtg ggtgagcgtg atcggccccg ccggcgacac ctactacccc 180
ggcagcgtga agggccgctt caccatcagc cgcgagaacg ccaagaacag cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgcgcgc cggcgacacc gccgtgtact actgcgcccg cgagggcatg 300
gccgcccaca actactacgg catggacgtg tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 86
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗BTLA scFv的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 86
gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gcgcgccacc 60
ctgagctgcc gcgccagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggccaggccc cccgcctgct gatctacgac gccagcaacc gcgccaccgg catccccgcc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cgcagcaact ggccccccat caccttcggc 300
cagggcaccc gcctggagat caagcgc 327
<210> 87
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 分泌表达信号肽的氨基酸序列
<400> 87
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 88
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 分泌表达信号肽的核苷酸序列
<400> 88
atgacccgcc tgaccgtgct ggccctgctg gccggcctgc tggccagcag ccgcgcc 57
<210> 89
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-Sig-F
<400> 89
gtgctggata tctgcagaat tcgccgccac catgacccgg ctgaccgtgc tggccctgc 59
<210> 90
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sig-R
<400> 90
ggccctggag gaggccagca ggccggccag cagggccagc acggtcagc 49
<210> 91
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sig-CD19-F
<400> 91
ctgctggcct cctccagggc cgacatccag ctgacccaga gc 42
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-R
<400> 92
gctgctcacg gtcacggtgg tgc 23
<210> 93
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-G4S-CD3-F
<400> 93
ccaccgtgac cgtgagcagc ggtggcggag ggtccgacat caagctgcag cagagc 56
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-R
<400> 94
cttcagctcc agcttggtgc 20
<210> 95
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-PD-1-F
<400> 95
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagccagg tgcagctggt ggagagc 87
<210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-PD-1-R
<400> 96
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag cgcttgatct ccaccttggt 50
<210> 97
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-IgD-F
<400> 97
gcaccaagct ggagctgaag gccagcaaga gcaagaagga g 41
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-R
<400> 98
cacgcccagg ggctgggtgt g 21
<210> 99
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-PD-1-F
<400> 99
cacacccagc ccctgggcgt gcaggtgcag ctggtggaga gc 42
<210> 100
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-CTLA-4-F
<400> 100
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagccagg tgcagctggt ggagagc 87
<210> 101
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-CTLA-4-R
<400> 101
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag cgcttgatct ccaccttggt 50
<210> 102
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-CTLA-4-F
<400> 102
cacacccagc ccctgggcgt gcaggtgcag ctggtggaga gc 42
<210> 103
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-LAG-3-F
<400> 103
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagccagg tgcagctgca gcagtgg 87
<210> 104
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-LAG-3-R
<400> 104
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag cgcttgatct ccaggttggt 50
<210> 105
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-LAG-3-F
<400> 105
cacacccagc ccctgggcgt gcaggtgcag ctgcagcagt gg 42
<210> 106
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-TIM-3-F
<400> 106
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagccagg tgcagctggt gcagagc 87
<210> 107
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-TIM-3-R
<400> 107
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag cgcttgatct ccaccttggt 50
<210> 108
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-TIM-3-F
<400> 108
cacacccagc ccctgggcgt gcaggtgcag ctggtgcaga gc 42
<210> 109
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-TIGIT-F
<400> 109
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagcgagg tgcagctgca ggagagc 87
<210> 110
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-TIGIT-R
<400> 110
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag cgcttcagct ccaccttggt 50
<210> 111
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-TIGIT-F
<400> 111
cacacccagc ccctgggcgt ggaggtgcag ctgcaggaga gc 42
<210> 112
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-BTLA-F
<400> 112
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagcgagg tgcagctggt ggagagc 87
<210> 113
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-BTLA-R
<400> 113
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag cgcttgatct ccaggcgggt 50
<210> 114
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-BTLA-F
<400> 114
cacacccagc ccctgggcgt ggaggtgcag ctggtggaga gc 42

Claims (16)

1.一种三功能分子，其结构中包括能够结合于CD19的第一功能域、能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第二功能域和能够结合并阻断T细胞负共刺激分子的第三功能域。
2.根据权利要求1所述的三功能分子，其特征在于，所述三功能分子能够在识别CD19的同时，结合并激活T细胞表面CD3分子、结合并阻断T细胞负共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。
3.根据权利要求1所述的三功能分子，其特征在于，所述第一功能域为抗CD19的抗体，所述第二功能域为抗CD3的抗体，所述第三功能域为抗T细胞负共刺激分子的抗体。
4.根据权利要求3所述的三功能分子，其特征在于，所述抗体选自Fab抗体、Fv抗体或单链抗体。
5.根据权利要求1所述的三功能分子，其特征在于，所述第一功能域和所述第二功能域之间通过连接片段1连接，所述第二功能域和所述第三功能域之间通过连接片段2连接。
6.根据权利要求5所述的三功能分子，其特征在于，所述连接片段1和连接片段2选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。
7.根据权利要求6所述的三功能分子，其特征在于，以G4S为单位的连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5之任一所示；免疫球蛋白IgD的铰链区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
8.所述第一功能域为抗CD19的单链抗体，所述第二功能域为抗CD3的单链抗体，所述第三功能域为抗T细胞负共刺激分子的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的三功能分子，其特征在于，所述抗CD19的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述抗CD19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示；所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述抗T细胞负共刺激分子的单链抗体选自抗PD-1的单链抗体、抗CTLA-4的单链抗体、抗LAG-3的单链抗体、抗TIM-3的单链抗体、抗TIGIT的单链抗体或抗BTLA的单链抗体之任一；所述抗PD-1的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述抗PD-1的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述抗CTLA-4的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；所述抗CTLA-4的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.50所示；所述抗LAG-3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示；所述抗LAG-3 的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示；所述抗TIM-3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示；所述抗TIM-3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示；所述抗TIGIT的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示；所述抗TIGIT的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示；所述抗BTLA的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示；所述抗BTLA的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示。
10.根据权利要求9所述的三功能分子，其特征在于，所述抗CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；所述抗PD-1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；所述抗CTLA-4的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示；所述抗LAG-3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示；所述抗TIM-3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示；所述抗TIGIT的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示；所述抗BTLA的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示。
11.根据权利要求1所述的三功能分子，其特征在于，所述三功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35或SEQID NO.37之任一所示。
12.一种多核苷酸，其编码如权利要求1～11任一项所述三功能分子。
13.一种表达载体，其含有如权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，其被如权利要求13所述的表达载体所转化。
15.如权利要求1～11任一项所述三功能分子的制备方法，包括：构建含有三功能分子基因序列的表达载体，然后将含三功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的三功能分子。
16.如权利要求1～11任一项所述三功能分子用于制备肿瘤治疗药物的用途。
CN201611260817.8A 2016-12-30 2016-12-30 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用 Active CN108264561B (zh)

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