CN104395340A - 包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途 - Google Patents

包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本文报道了用于确定抗原结合位点的组合的方法，其包括以下步骤(i)确定大群双特异性抗体的结合特异性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期，通过组合第一大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员与第二大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员，以及在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的接头来制备所述双特异性抗体，由此第一大群特异性结合第一个细胞表面分子并且第二大群特异性结合第二个细胞表面分子，和(ii)选择具有合适的结合特异性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期的双特异性抗体并由此确定抗原结合位点的组合。

Description

包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途
本文报道了用于选择和产生由多肽-多核苷酸-复合体制备的多特异性治疗分子的方法，其中根据治疗靶标的表型选择所述治疗分子的特异性。
发明背景
在过去的几年里，已经开发并临床测试了多种肿瘤特异性治疗蛋白质，包括细胞表面受体的抗体、抗体片段和配体。已经将这些治疗蛋白质缀合到若干种类的治疗毒素上，如小分子药物、酶、放射性同位素、蛋白毒素和用于向患者特定递送的其他毒素。
向疾病位点有效递送是任何治疗分子高效和低毒的前提。例如，抗体可以参与到该背景中。如果抗体本身不是治疗性的，那么药物缀合到抗体上使得可以实现药物在人体内想要位点上完美定位。这增加了该靶区域内有效药物的浓度，由此优化治疗剂的治疗效果。此外，利用靶向递送，临床医师能够降低治疗剂的剂量-如果药物有效负荷具有相关毒性或如果待用于治疗慢性状况，这是特别相关的事情(参见例如McCarron，P.A.，等，Mol.Interventions 5(2005)368-380)。
例如在WO 2004/081051中报道了双特异性抗体的产生。已经设计并开发了广谱的双特异性抗体形式(参见例如Fischer，N.和Leger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14)。螯合的重组抗体(CRAbs)最初由Neri，D.，等(Neri，D.，等，J.Mol.Biol.246(1995)367-373)报道。Wright，M.J.和Deonarain，M.P.(Molecular Immunology 44(2007)2860–2869)报道了用于产生螯合重组抗体的噬菌体展示文库。
用于靶向药物递送的分子载体由Backer，M.V.，等，BioconjugateChem.13(2002)462-467报道。WO 2010/118169报道了具有受控的血清药物动力学的人蛋白质支架。在WO 2009/105671中报道了与具有C末端元件的肽和蛋白质相关的方法和组合物。在WO 2007/038658中，报道了抗体-药物缀合物和使用方法。在WO 2004/062602中报道了用于靶向生物递送分子载体的组合物和方法。在WO 2002/072141中报道了靶向配体。
在WO 2009/037659中报道了小实体的磁力检测。在WO 2006/137932中报道了同质分析物检测。在US 2008/0044834中报道了用于检测大分子和其他分析物的三组分生物传感器。在WO 95/05399中报道了双特异性试剂的设计和合成。
在US 2002/051986中报道了通过核酸报告物检测分析物的方法。在WO 95/05399中报道了通过使用双链DNA作为化学和空间限定的交联剂设计并合成双特异性试剂。
Gosuke，H.，等报道了L-DNA作为分子标签的应用(Nucl.AcidsSymp.Ser.49(2005)261-262。两亲性螺旋(amphiphatic helices)在大肠杆菌(E.coli)中产生具有高亲合力的功能性柔性连接的二聚Fv片段的用途由Pack，P.，等(Biochem.31(1992)1579-1584)报道。Kostelny，S.A.，等报道了通过使用亮氨酸拉链形成双特异性抗体(J.Immunol.148(1992)1547-1553)。组合两种特异性的具有亲合力的二聚双特异性微抗体由Muller，K.M.，等(FEBS Lett.432(1998)45-49)报道。Goldenberg，D.M.，等报道了通过用于改善的癌成像的dock-and-lock方法和通过预先靶向的疗法产生多功能性抗体(J.Nuc.Med.49(2008)158-163)。
发明概述
本文报道了提供定制的高度特异的多特异性治疗分子用于在需要治疗的患者中治疗疾病，如癌症的方法，由此所述治疗分子适合患者的疾病特征和/或患者的基因型/表型。
通过考虑患者携带疾病/受影响细胞的基因型/表型制备定制分子实现这种适合。
在第一步中，确定旨在利用治疗分子靶向的细胞的基因型/表型(疾病特异性细胞表面抗原的存在和数目/数量)。这例如通过细胞成像技术，如使用荧光标记的单特异性(治疗性或诊断性)抗体对来自例如血液和/或活组织检查材料的患者细胞免疫组织化学染色(IHC，免疫组织化学)来实现。或者，可以在利用标记的治疗或诊断抗体染色后使用基于FACS的方法分析细胞的基因型/表型。体内成像技术，包括光学成像、分子成像、荧光成像、生物发光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活体显微镜检查也可以用于确定患者的疾病相关细胞的基因型/表型。根据患者的疾病相关细胞确定的基因型/表型，靶向/结合实体的定制组合可以是/被选择并且组合在治疗分子中。该治疗分子可以是例如双特异性抗体。
此类定制的治疗分子i)将是高度特异的，ii)将具有好的功效，并且iii)与常规选择的治疗剂相比将诱导较少的副作用。这可以通过提供具有改善的靶向和/或改善的定制递送性质，例如对其预期的作用位点上的治疗有效负荷的治疗分子来实现。
可以通过靶向治疗分子与常规选择的治疗分子相比较高的/增加的选择性和/或特异性来实现向其作用位点，如例如癌细胞实现改善递送治疗分子。治疗分子包含至少两个实体，其特异性结合不同的抗原(例如两个不同的表面标志物)或同一抗原上的不同表位(例如同一表面标志物上的两个不同的表位)。
可以通过两个靶向实体同时结合其各自的靶标/表位实现定制治疗分子的增加的选择性和/或特异性，即通过亲合力作用来实现。尤其适合的是对其各自的靶标/表位具有低亲和力到中等亲和力的两个结合实体的组合。此外，脱靶结合被极大地减少或甚至可以被完全消除。
结合特异性可以由形成多特异性治疗分子的初始组分分别提供。因此，可以简单地通过确定细胞，例如癌细胞上存在的表面标志物，将特异性结合这些表面标志物的各结合实体，如抗体片段缀合到核酸上并通过接头核苷酸将这些连接起来，来定制多特异性治疗分子，如双特异性抗体。
已经发现，为了靶向递送效应部分，包含多肽和多核苷酸组分的复合体尤其有用。复合体的效应部分、多肽组分和多核苷酸接头彼此非共价结合。这允许模块产生复合体的各组分。由于复合体的模块结构，可以在不需要改变复合体的其他组分的情况下改变各个组分。这允许容易且有效地装配大量复合体变体，例如用于提供这样的文库，基于所述文库可以选择定制的高度特异的多特异性治疗分子。
如本文报道的一方面是用于从结合实体的集合/文库中选择至少两个结合实体用作治疗剂的方法，通过温育以下物质在单个多特异性结合分子中装配所述结合实体：(a)各自包含或缀合第一个结合对的第一个配偶体或成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv特异性结合第一种细胞表面标志物或第一种细胞表面标志物的第一个表位，(b)各自包含或缀合第二个结合对的第一个配偶体或成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv抗体片段特异性结合第二种细胞表面标志物或第一种细胞表面标志物的第二个表位，和(c)在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的接头。该物质具有改善的靶向/递送性质。
如本文报道的一个方面是用于产生多特异性结合分子的方法，其包括以下步骤：
(i)确定在含有细胞的样品中存在的细胞表面标志物和i)选择其至少第一种细胞表面标志物和任选地第二种细胞表面标志物，或ii)选择其对应于多特异性结合分子的许多结合特异性的大量细胞表面标志物，
(ii)温育(a)各自包含结合对的第一个配偶体或成员的大量结合实体，由此每个结合实体特异性结合不同的细胞表面标志物或其配体或同一细胞表面标志物的表位，由此结合对的各自第一个配偶体或成员仅结合其对应的第二个配偶体或成员而不结合结合对的任何其他第二个配偶体或成员，和(b)包含结合对的对应第二个成员的接头，
并由此产生多特异性结合分子。
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：
(i)确定样品中细胞表面上存在的细胞表面标志物并选择其第一种表面标志物和第二种表面标志物，
(ii)温育(a)包含或缀合第一个结合对的第一个配偶体或成员的抗体Fab片段或scFv抗体，由此Fab片段或scFv特异性结合第一种细胞表面标志物，(b)包含或缀合第二个结合对的第一个配偶体或成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv抗体片段特异性结合第二种细胞表面标志物，和(c)在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的接头，
并由此产生双特异性抗体.
如本文报道的一个方面是用于确定多特异性结合分子的结合实体的组合的方法，其包括以下步骤
(i)确定大量多特异性结合分子的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期，由此在大量多特异性结合分子中包含结合实体的每个(可能)组合，
和
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期的多特异性结合分子并由此确定抗原结合实体的组合。
如本文报道的一个方面是用于确定抗原结合位点的组合的方法，其包括以下步骤：
(i)确定大量双特异性抗体的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期，通过组合包含或缀合第一个结合对的第一个成员的第一大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员与包含或缀合第二个结合对的第一个成员的第二大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员以及在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的接头来制备所述双特异性抗体，
由此第一大群特异性结合第一种细胞表面标志物并且第二大群特异性结合第二种细胞表面标志物，
和
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期的双特异性抗体并由此确定抗原结合位点的组合。
如本文报道的一个方面是双特异性抗体，其包含
a)第一个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第一种表面标志物，并且
ii)其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)第二个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第二种表面标志物，并且
ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，和
c)对映体DNA多核苷酸接头
i)其缀合第一个结合对的第二个成员，并且
ii)其缀合第二个结合对的第二个成员，
由此第一个和第二个Fab片段或scFv抗体片段形成非共价复合体。
以下是如本文报道的所有方面的实施方案。因此指出，每个实施方案可以与每个方面组合并且还可以与如本文给出的所有其他各实施方案组合。
在一个实施方案中，结合实体彼此独立地选自基于darpin结构域的结合实体、基于anticalin结构域的结合实体、T细胞受体片段像基于scTCR结构域的结合实体、基于骆驼VH结构域的结合实体、基于第十个纤连蛋白3结构域的结合实体、基于结合腱糖蛋白结构域的结合实体、基于钙粘蛋白结构域的结合实体、基于ICAM结构域的结合实体、基于肌联蛋白结构域的结合实体、基于GCSF-R结构域的结合实体、基于细胞因子受体结构域的结合实体、基于糖苷酶抑制剂结构域的结合实体、基于超氧化物歧化酶结构域的结合实体或抗体片段(Fab或scFv片段)。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性结合分子是双特异性抗体，或第一个和第二个结合实体彼此独立地是抗体片段。
在一个实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、scFv、scFabs和dsFvs。
在一个实施方案中，包含效应部分、结合特异性和多核苷酸接头的双特异性抗体的至少两个组分彼此非共价结合。
在一个实施方案中，结合实体选自抗体、抗体片段、受体、受体配体和靶标结合支架，条件是所述受体配体不是肠促胰岛素受体配体多肽。
在一个实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、scFv、scFabs和dsFvs。
在一个实施方案中，靶标结合支架选自darpins、血红素蛋白样分子和anticalins。
在一个实施方案中，受体选自T细胞受体片段和scTCR。
在一个实施方案中，多特异性结合分子是复合体，其包含
a)第一个结合实体
i)其特异性结合第一种细胞表面标志物或其配体，并且
ii)其缀合第一个结合对的第一个成员，
a)第二个结合实体
i)其特异性结合第二种细胞表面标志物或其配体，并且
ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，和
c)多核苷酸接头
i)其缀合第一个结合对的第二个成员，并且
ii)其缀合第二个结合对的第二个成员。
在一个实施方案中，双特异性抗体是复合体，其包含
a)第一个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第一种细胞表面标志物，并且
ii)其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)第二个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第二种细胞表面标志物，并且
ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，和
c)多核苷酸接头
i)其缀合第一个结合对的第二个成员，并且
ii)其缀合第二个结合对的第二个成员。
在一个实施方案中，复合体是非共价复合体。
在一个实施方案中，复合体还包含其他多肽i)其特异性结合第二个靶标，并且ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，并且多核苷酸接头缀合第二个结合对的第二个成员。
在一个实施方案中，复合体还包含效应部分，其缀合与多核苷酸接头的至少一部分互补的多核苷酸。
在一个实施方案中，复合体还包含缀合多核苷酸的效应部分，所述多核苷酸i)与缀合第一个或第二个结合实体或Fab片段或scFv抗体片段的多核苷酸的至少一部分互补并且ii)不与多核苷酸接头互补。
在一个实施方案中，第一个和第二个结合实体或Fab片段或scFv抗体片段结合同一个靶标和其上的非重叠表位。
在一个实施方案中，多核苷酸接头包含8、10、15、20、25、50、100个核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸接头包含高达500、750、1000或2000个核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸接头包含10-500个核苷酸。
在一个实施方案中，多核苷酸接头是对映体DNA。在一个实施方案中，对映体DNA是L-DNA。在一个实施方案中，L-DNA是单链L-DNA(ss-L-DNA)。
在一个实施方案中，效应部分选自结合部分、标记部分和生物活性部分。
在一个实施方案中，多核苷酸接头在其第一个或第二个末端缀合结合实体、Fab片段或scFv抗体片段。
在一个实施方案中，多核苷酸接头缀合两个结合对的两个第二个成员，由此第一个结合对的第二个成员缀合多核苷酸接头的第一个末端并且第二个结合对的第二个成员缀合多核苷酸接头的第二个末端。
在一个实施方案中，第一个结合对的第一个和第二个成员分别包含SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:08的核酸序列。
在一个实施方案中，第二个结合对的第一个和第二个成员分别包含SEQ ID NO:06和SEQ ID NO:07的核酸序列。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)合成第一个结合实体或Fab片段或scFv抗体片段，其特异性结合第一种细胞表面标志物或其配体并且其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)合成第二个结合实体或Fab片段或scFv抗体片段，其特异性结合第二种细胞表面标志物或其配体并且其缀合第二个结合对的第一个成员，
c)合成多核苷酸接头，其缀合第一个结合对的第二个成员并且其缀合第二个结合对的第二个成员，和
d)通过组合合成的组分形成复合体。
如本文报道的另一方面是包含如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体和任选地药学上可接受的载体的药物制剂。
如本文报道的其他方面是如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体用作药物。
同样，如本文报道的方面是如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体用于治疗癌症。
如本文报道的另一方面是如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体在制造药物中的用途。
在一个实施方案中，药物用于治疗癌症。
如本文报道的方面是治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体。
发明详述
I.定义
冠词“a”和“an”在本文中用于指冠词的语法对象之一或多于一个(即至少一个)。例如，“抗体”表示一个抗体或多于一个抗体。
“受体人构架”是包含来自如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变域(VL)构架或重链可变域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“来自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列在序列上相同。
术语“亲和力”表示分子(例如多肽或抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如靶标或抗原)之间非共价相互作用的总强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”指内在结合亲和力，其反映结合对的成员之间(例如多肽-多核苷酸-复合体中，或多肽与其靶标之间，或抗体与其抗原之间)的1：1相互作用。一般可以通过解离常数(kD)代表分子X对其配偶体Y的亲和力。可以通过本领域已知的常用方法，如表面等离振子共振，也包括本文报道的那些方法测定亲和力。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVRs)中具有一个或多个改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“笼住的”表示效应物被在血清和体液中具有受控的半衰期的保护基团保护。可以通过内源酶酶促切割保护基团。可以由通过注射外部施用或经口腔给药的第二个效应物，如抗坏血酸去除、切割、降解、酶促消化或代谢保护基团。可以通过体液中天然存在的酶激活笼住的效应分子。可以通过体液中同样存在的还原剂，如抗坏血酸激活笼住的效应部分。
术语“效应部分”表示任何分子或分子组合，期望所述分子的活性向细胞递送和/或定位在细胞中。效应部分包括，但不限于标记、细胞毒素(例如假单胞菌外毒素、篦麻蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、酶、生长因子、转录因子、药物、放射性核素、配体、抗体、抗体Fc区、脂质体、毫微粒、病毒颗粒、细胞因子等。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出想要的抗原结合活性。
术语“抗体片段”表示完整或全长抗体的片段，其保留特异性结合抗原的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fv、FAB、FAB'、FAB’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.，等，Nat.Med.9(2003)129-134。更详细地，术语“抗体片段”包括的是(i)FAB片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价抗体片段(对于包含挽救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的FAB和F(ab')2片段的讨论，参见US 5，869，046)，(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两个FAB片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iv)由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段(参见例如Plueckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore(编辑)，(Springer-Verlag，New York)，(1994)第269-315页，WO 93/16185、US 5，571，894、US5，587，458)，(v)dAb片段(参见例如Ward，E.S.，等，Nature 341(1989)544-546)，其由VH结构域组成，和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分别的基因编码，但是可以使用重组方法通过使得它们能够被制备成单条蛋白质链(其中VL和VH区配对形成单价分子，称为单链Fv(scFv)，参见例如Bird，R.E.，等，Science 242(1988)423-426；Huston，J.S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883)的合成接头将它们连接起来。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段并且可以以与完整抗体相同的方式筛选其结合性质。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指这样的抗体，其在竞争测定中阻断参照抗体结合其抗原50％或更多，并且反过来，参照抗体在竞争测定中阻断抗体结合其抗原50％或更多。
术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链的部分来自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来自不同来源或物种的抗体。
抗体的“种类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有5大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶类，如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺类和甲基戊胺类，包括六甲蜜胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、氧氮芥氢氯化物、美法仓、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、环己亚硝脲、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、奥莱霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、加利车霉素、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；胺苯吖啶；bestrabucil；必桑郡；伊达曲杀；defofamine；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；单哌潘生丁；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸乙肼；2-乙基酰肼；甲基苄肼；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；氮烯咪胺；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他赛(Rh6ne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和碳铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春烯碱；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-II；35拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和上述任何药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括抗激素剂，其作用于调节或抑制激素在肿瘤上的作用，如抗雌激素，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑类、4-羟三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、乙酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“抗血管发生剂”指在一定程度上阻断或干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂例如可以是小分子或抗体，其结合参与促进血管发生的生长因子或生长因子受体。在一个实施方案中，抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。
术语“细胞因子”是用于由作为细胞间介导物作用于另一细胞上的一个细胞群体释放的蛋白质的总称。此类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和常规的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；耻骨松弛激素；耻骨松弛激素原；糖蛋白激素，如促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-P；mullerian抑制物质；小鼠绒促性素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-p；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，如TGF-a和TGF-p；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-a、-P和-y；集落刺激因子(CSFs)，如集落刺激因子-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白细胞介素(ILs)，如IL-I、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-II、IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-P；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等同物。
术语“fMLP”表示由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应部分是fMLP或其衍生物。
术语“患者的表型”表示来自患者的一种细胞中的细胞表面受体的组合物。所述组合物可以是定性的以及定量的组合物。为其确定/给出基因型的细胞可以是单细胞或包含细胞的样品。
术语“前体药物”指与亲本药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较少并且能够被酶促激活或转化成更活跃的亲本形式的药物活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman，"Prodrugs in Cancer Chemotherapy"Biochemical Society Transactions，第14卷，615th Meeting Belfast(1986)第375-382页和Stella，等，"Prodrugs:A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery"，Directed Drug Delivery，Borchardt，等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。可以用作效应部分的前体药物包括，但不限于含磷酸盐的前体药物、含硫代磷酸盐的前体药物、含硫酸盐的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、含b-内酰胺的前体药物，任选地取代的含苯氧乙酰胺的前体药物或任选地取代的含苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和可以转化成更具活性的细胞毒性游离药物的其他5-氟脲嘧啶前体药物。可以衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒素药物的实例包括，但不限于本文所述的那些化学治疗剂。
术语“细胞毒性部分”指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如氨甲喋呤、adriamicin、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如溶核酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及本文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。
物质(例如药物制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现想要的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，其含有恒定区的至少一部分。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或缺失。除非本文另有规定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中所述。
术语“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。该抗体一般包含两条重链和两条轻链。
“人抗体”是拥有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的或来自利用人抗体所有组成成分或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以包含来自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(Hl、Η2、Η3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)上(参见Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102上(参见Kabat，等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDRl外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩短的CDR或CDR的CDR的区内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a--CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102上(参见Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有说明，可变域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等，上文编号。
“免疫缀合物”是缀合到一个或多个非抗体来源分子，包括但不限于结合对的成员、核酸或效应部分上的抗体或抗体片段。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于家养动物(例如，奶牛、羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类，如猴子)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即包含群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然发生的突变或在单克隆抗体制备物的产生过程中出现的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体自基本上同质的抗体群体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过多种技术制备待在如本文报道的复合体中使用的单克隆抗体或单克隆抗体片段，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“单价结合多肽”或“单价结合抗体片段”表示仅具有单个位点或区域用于结合其靶标或抗原的分子。单价结合多肽的实例是肽、肽模拟物、适体、小的有机分子(能够特异性结合靶标多肽的抑制剂)、darpins、锚蛋白重复序列蛋白质、Kunitz类型结构域、单个结构域抗体(参见：Hey，T.，等，Trends Biotechnol.23(2005)514-522)、细胞表面受体的(天然的)配体、全长抗体的单价片段等。例如，全长抗体对其靶标具有两个结合位点，因此其是二价的，然而scFv或FAB'抗体片段对其靶标仅具有一个结合位点，因此其是单价的。如果单价抗体或抗体片段用作多肽，那么该位点被称为互补位。
术语“裸抗体”或“裸抗体片段”表示未与非抗体部分(例如核酸或细胞毒性部分或放射性标记物)缀合的抗体或抗体片段。
“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链和两条相同的重链通过二硫键组成。从N至C末端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C末端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作κ和λ。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其是处于这样的形式，以允许其中含有的活性成分的生物活性有效并且其不含有对将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“多核苷酸”或“核酸序列”表示短的，一般是单链的多核苷酸，其包含至少8个核苷酸和至多约1000个核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸具有至少9、或10、或11、或12、或15、或18、或21、或24、或27、或30个核苷酸的长度。在一个实施方案中，多核苷酸具有不多于200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或45、或40、或35、或30个核苷酸的长度。在其他实施方案中，多核苷酸具有至少9、或10、或11、或12、或15、或18、或21、或24、或27、或30个核苷酸和不多于200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或45、或40、或35、或30个核苷酸的长度。
术语“L-多核苷酸”表示包含多于50％的L-核苷酸作为单体结构单元的核酸，如L-DNA。在一个实施方案中，L-多核苷酸仅包含L-核苷酸。应理解该L-多核苷酸的核苷酸数量在一个L-核苷酸到任何数量的范围内。然而在一个实施方案中，L-核苷酸的数量是至少10、或15、或20、或25、或30、或35、或40、或45、或50、或55、或60、或70、或80、或90或100个核苷酸。L-多核苷酸由L-A、L-G、L-C、L-U、L-T及其组合组成，由此L-A表示L-核糖-腺嘌呤等。L多聚脱氧核苷酸由L-dA、L-dG、L-dC、L-dU、L-dT及其组合组成，由此L-dA表示L-脱氧核糖-腺嘌呤等。
术语“多核苷酸接头”表示将两条核苷酸序列连接在一起的部分。在一个实施方案中，多核苷酸接头是多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸接头包含至少一个多核苷酸和至少一个非多核苷酸。非多核苷酸可以是多肽、聚合物或多糖。在一个实施方案中，多核苷酸接头包含长度从10-30个核苷酸的多核苷酸和线性聚(乙二醇)。
“多肽”是由通过肽键(无论是天然产生的还是合成产生的)连接的氨基酸组成的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，然而由两个或多个多肽组成的或包含多于100个氨基酸残基的一个多肽的分子可以称为“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达多肽的细胞添加，并且可以根据细胞的类型而变化。多肽在本文中其氨基酸骨架结构或编码它们的核酸方面进行定义。添加，如碳水化合物基团一般是未指定的，但是可以存在。
“多肽表位”表示相应的单价结合多肽结合的多肽靶标上的结合位点。其一般由氨基酸组成。结合多肽结合线性表位，即由一段5-12个连续氨基酸组成的表位，或者结合多肽结合由多肽靶标若干短区段的空间排列形成的三维结构。可以认为结合多肽，例如抗体或抗体片段的抗原识别位点或互补位识别的三维表位是抗原分子的三维表面特征。这些特征精确地适合结合多肽的相应结合位点并且由此利于结合多肽与其靶标之间的结合。
术语“特异性结合”表示，多肽或抗体或抗体片段以10-8M或更小，在一个实施方案中为10-5M-10-13M，在一个实施方案中为10-5M-10-10M，在一个实施方案中为10-5M-10-7M，在一个实施方案中为10-8M-10-13M，或在一个实施方案中为10-9M-10-13M的解离常数(KD)结合其靶标。所述术语进一步用于表示，所述多肽不特异性结合存在的其他生物分子，即其以10-4M或更大，在一个实施方案中为10-4M-1M的解离常数(KD)结合其他生物分子。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指尝试改变被治疗的个体的天然过程的临床干预，并且可以为预防或在临床病理学过程中进行。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病的发生或复发、减轻症状、消除疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、降低疾病发展的速率、改善或缓和疾病状态，和减缓或提高预后。在一些实施方案中，如本文报道的复合体用于延迟疾病的发生或减缓疾病的进行。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中参与抗体结合其抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个结构域包含4个保守的构架区(FRs)和3个高变区(HVRs)(参见例如Kindt，等，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freemanand Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(参见例如Portolano，S.，等，J.Immunol.150(1993)880-887，Clarckson，T.，等，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合到其已经引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.定制的多特异性结合分子
在大多数基于细胞的疾病中，通过受体分子的基于抗体的结合靶向疾病相关的细胞是一种有前途的方法。然而，临床相关的表面受体(＝靶标)的表达水平根据患者而不同并且基于标准化的抗体的药物的功效因此非常不同。这尤其应用于二特异性和多特异性结合分子，其作用方式是同时靶向两个不同的表位/受体。
一种有前途的方法是设计特别用于各患者的特定/个体情况的药物(本文中是二特异性或多特异性结合分子)。
基于患者的疾病相关细胞的临床相关表面受体的表达谱数据，从文库中特异地选择一系列结合实体(例如Fab片段)并组合到多特异性结合分子中作为患者特异性药物。在各疾病相关细胞(如例如，基于例如表面受体的表达水平的肿瘤细胞)方面特别选择这些所选择的结合分子，并因此选择各患者的需要和表型。
组合/连接结合实体的接头长度上的变化使得能够选择正确的灵活性和距离，其可能为同时结合两个结合实体所需，并因此为选择性和/或特异性和/或功效所需。
此外，可以通过有效负荷与接头的特异性杂交添加有效负荷，如效应功能或毒素。该可能性进一步增加治疗应用的生命力。
可以在多种细胞体外测定/细胞样品中测试所选患者特异的多特异性结合分子的相关标准(例如最佳结合/结合配偶体，最佳接头长度等)：
-确定磷酸酪氨酸激酶的磷酸化状态
-确定JNK抑制
-确定分子诱导的程序性细胞死亡
-利用单特异性相对于多特异性结合分子进行结合测定
-确定增殖抑制
利用该方法，产生定制的并因此高度有效的治疗分子是可能的。这些分子将通过改善的靶向/递送(例如用于肿瘤细胞的有效负荷)减少副作用并且改善的靶向靶标细胞基于靶向组分(包含至少两个结合分子)更高的选择性和特异性。
多特异性结合分子更高的选择性和特异性是由于减少可能的“脱靶”结合的两个“低亲和力”结合剂的组合的同时结合(亲合力)。
来自个体的每个细胞在所表达的细胞表面分子，如受体的数量和种类方面不同。这对于癌细胞和非癌细胞尤其正确。因此，可以通过存在的细胞表面分子来表征细胞。
可以通过基于体外和体内的细胞成像技术完成该表征。体内成像技术包括例如光学成像、分子成像、荧光成像、生物发光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活体显微镜检查。体外成像技术包括例如利用例如荧光标记的抗体(识别特定的细胞表面标志物)免疫组织化学染色患者细胞并通过显微镜分析荧光信号。或者，可以在利用标记的治疗或诊断抗体染色后使用基于FACS的方法分析细胞的基因型/表型。
在一个实施方案中，通过基于FACS的方法确定患者来源细胞的基因型/表型。在一个实施方案中，通过使用荧光标记的诊断或治疗抗体确定细胞表面标志物。在一个实施方案中，使用荧光标记的治疗抗体。
某些疾病可以与特定细胞表面分子的数量的改变或新细胞表面分子的出现相关。
受该疾病影响的个体将在某些范围内展示疾病和/或个体特异的细胞表面标志物模式。
这必须纳入考虑，以向个体提供定制的靶向治疗剂。
针对细胞表面分子及其配体的许多治疗抗体是已知的，其可以用于选择和构建定制的多特异性靶向实体，如Rituxan/MabThera/利妥昔单抗、2H7/Ocrelizumab、Zevalin/Ibrizumomab、Arzerra/Ofatumumab(CD20)、HLL2/依帕珠单抗、Inotuzomab(CD22)、赛尼哌/达克珠单抗、Simulect/巴利昔单抗(CD25)、Herceptin/曲妥珠单抗、Pertuzumab(Her2/ERBB2)、麦罗塔/吉妥珠单抗(CD33)、Raptiva/依法珠单抗(Cd11a)、艾比特思/西妥昔单抗(EGFR，表皮生长因子受体)、IMC-1121B(VEGF受体2)、Tysabri/那他珠单抗(α4β1和α4β7整联蛋白的α4-亚基)、ReoPro/阿昔单抗(gpIIb-gpIIa和αvβ3-整联蛋白)、Orthoclone OKT3/Muromonab-CD3(CD3)、Benlysta/Belimumab(BAFF)、Tolerx/Oteliximab(CD3)、Soliris/Eculizumab(C5组分蛋白质)、Actemra/Tocilizumab(IL-6R)、Panorex/依决洛单抗(EpCAM，上皮细胞粘附分子)、CEA-CAM5/Labetuzumab(CD66/CEA，癌胚抗原)、CT-11(PD-1，程序性死亡-1T-细胞抑制受体、CD-d279)、H224G11(c-Met受体)、SAR3419(CD19)、IMC-A12/Cixutumumab(IGF-1R，胰岛素样生长因子1受体)、MEDI-575(PDGF-R，血小板衍生的生长因子受体)、CP-675、206/Tremelimumab(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)、RO5323441(胎盘生长因子或PGF)、HGS1012/Mapatumumab(TRAIL-R1)、SGN-70(CD70)、Vedotin(SGN-35)/Brentuximab(CD30)和ARH460-16-2(CD44)。
为了确定例如患者样品中存在的细胞表面标志物，已知有不同的方法。一种示例性方法基于荧光激活的细胞分选(FACS)，特别是特异性染色和分选细胞群体的分析。在该方法中，通过使用针对这些标志物的荧光标记的抗体在呈现的细胞表面标志物方面分析个体细胞实现样品(细胞群体)的表型分型，任选地包括细胞群体中表面标志物的统计分布。尤其适合使用已经用荧光标记为此目的标记的治疗抗体，因为于是保证后者定制的多特异性结合分子将结合与诊断抗体相同的表位。如本文报道的多特异性结合分子/双特异性抗体可以用于制备用于治疗例如肿瘤疾病、心血管疾病、传染病、炎症疾病、自身免疫性疾病、代谢(例如内分泌)疾病或神经学(例如，神经变性)疾病的药物。这些疾病的示例性非限制性实例是阿尔茨海默氏病、非霍奇金淋巴瘤、B-细胞急性和慢性淋巴样白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性和慢性髓细胞性白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌(如口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌)、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤，和皮肤癌、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺-许兰氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu's动脉炎、艾迪生病、类风性湿关节炎、多发性硬化症、肉瘤样病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、肺出血肾炎综合征、闭塞性血栓性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多发性软骨炎、寻常性天疱疮、Wegener's肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
许多细胞表面标志物及其配体是已知的。例如，已经报道癌细胞表达以下细胞表面标志物和或配体中的至少一个，包括但不限于碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α-ctinin-4、A3(对A33抗体特异的抗原)、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CD1-1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-l-α、结肠特异的抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸盐受体、G250抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、HM1.24、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、低氧可诱导的因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或la、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞游走抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、腱糖蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn-抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管发生标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因标志物和致癌基因产物(参见例如，Sensi等，Clin.Cancer Res.12(2006)5023-5032；Parmiani等，J.Immunol.178(2007)1975-1979；Novellino等，CancerImmunol.Immunother.54(2005)187-207)。
因此，识别特定细胞表面受体的抗体(包括其配体)可以用于特异性地和选择性地靶向并结合与疾病相关的许多/大量细胞表面标志物。细胞表面标志物是定位在细胞(例如疾病相关细胞)表面上的多肽，其例如与信号传递事件或配体结合相关。
在一个实施方案中，为了治疗癌症/肿瘤，使用多特异性结合分子/双特异性抗体，其靶向肿瘤相关的抗原，如在Herberman，"Immunodiagnosis of Cancer"，Fleisher编辑，"The ClinicalBiochemistry of Cancer"，第347页(American Association of ClinicalChemists，1979)和US 4，150，149；US 4，361，544；和US 4，444，744中报道的那些。
关于肿瘤相关抗原(TAAs)的报道包括Mizukami等，Nature Med.11(2005)992-997；Hatfield等，Curr.Cancer Drug Targets 5(2005)229-248；Vallbohmer等，J.Clin.Oncol.23(2005)3536-3544；和Ren等，Ann.Surg.242(2005)55-63)，各自在鉴定的TAAs方面作为参考并入本文。
疾病涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫性疾病时，靶向抗原可以选自CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1或la、HM1.24、HLA-DR、腱糖蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因、癌基因产物(例如，c-met或PLAGL2)、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。
已知许多双特异性抗体针对两个不同的靶标，如BCMA/CD3，HER家族中不同抗原的组合(EGFR、HER2、HER3)、CD19/CD3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL-1-β/IL-8、IL-6或IL-6R/IL-21或IL-21R，针对选自Lewisx-、Lewis b-和Lewis y-结构、Globo H-结构、KH1、Tn-抗原、TF-抗原和粘蛋白的碳水化合物结构、CD44、糖脂类和糖苷神经鞘脂类，如Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、sialyltetraosylceramide的抗原的糖表位的第一个特异性和针对选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体酪氨酸激酶的第二个特异性、与第二个抗原结合位点组合的GD2与选自以下的免疫细胞相关：T-淋巴细胞、NK细胞、B-淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、间充质干细胞、神经干细胞、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3，选自VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FLT3、c-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、HER3、HER4、、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整联蛋白和MMPs的抗原与选自VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF和血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体1/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、ENDOSIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-1R、IL 17A/F、EGF受体1/CD3，和CD19/CD16的水溶性配体的组合。
因此，已经发现通过使用如本文报道的模块方法，可以提供定制的双特异性治疗抗体。在实际上存在于需要治疗的个体细胞上的细胞表面分子方面或在与该细胞表面分子相互作用的配体方面定制这些抗体。通过确定个体的细胞表面分子状态，可以选择治疗靶标的定制组合。
通过组合用于同时靶向和结合两个不同表位的2个单一治疗分子定制产生双特异性治疗剂，与单一治疗分子相比可以预期累加/协同效果。
通过使用早已可用的单特异性治疗结合实体，如来自治疗抗体的那些，可以实现快速并容易地产生所需的多特异性结合分子。
这些亲和力改造的结合分子/抗体可以结合单个细胞上存在的两个或多个细胞表面标志物。如果所有/两个结合实体同时结合细胞，才仅希望该结合。为此目次，中等到高度精炼的抗体尤其合适。另一方面，这也允许在筛选过程中排除结合特异性的较不特异的组合。
“Combimatrix”方法
希望组合第一个结合实体，如抗体Fab片段与另一个特异的结合实体，如第二个抗体Fab片段。此外，可以筛选当将第一个结合实体连接到许多不同的其他结合实体时，第一个结合实体是否显示更好的性质。使用所谓的Combimatrix方法，可以以容易的方式解决结合实体的大量组合。应该指出，第二个结合实体可以结合不同的靶标/表位/抗原，或可以结合相同的抗原，但是不同的表位，或可以结合相同的表位，但是单一结合实体的不同变体(例如，人源化候选物)。
在该方案中，自动化平台可以执行任务来吸取、纯化并组合结合实体及其反应物或衍生物。使用例如96孔板或其他高通量形式的任何平台均是合适的，如Eppendorf epMotion 5075vac移液机器人。
首先，进行结合实体(如抗体Fab片段)编码构建体的克隆。一般通过基因合成获得具有结合实体编码核酸的质粒，由此所编码的结合实体的C-末端区域含有分选酶-motive和His标签。将质粒分别转移到多孔板的各孔中(可以装载整个板)。然后，用切开结合实体编码区的限制性内切核酸酶混合物消化质粒。希望以仅需要一种限制性内切核酸酶混合物用于所有质粒的方式设计所有的基因合成。然后，任选的清洗步骤产生纯化的DNA片段。这些片段连接到已经用如上提及的同一限制性混合物从受体载体切开的质粒骨架中。或者，可以通过SLIC介导的克隆步骤进行克隆方法。连接后，自动化的平台将所有的连接混合物转移到具有感受态大肠杆菌细胞(例如，Top10Multi Shot，Invitrogen)的其他多孔板中并且进行转化反应。培养细胞至想要的密度。从培养混合物的等分试样中可以获得甘油原种。从培养物中分离质粒(例如使用质粒分离小量试剂盒(例如NucleoSpin96 Plasmid，Macherey& Nagel))。通过用适当的限制酶混合物消化等分试样和SDS-凝胶电泳(例如E-Gel 48，Invitrogen)检查质粒身份。然后，可以用质粒的等分试样装载新的平板用于进行对照测序反应。
在下一步中，表达结合实体。因而，将HEK细胞接种到多孔板(例如48孔板)中并用分离的质粒(在适当的骨架载体中含有结合实体编码区)进行转染。将转染的HEK细胞培养若干天并收集(例如，使用真空操作台通过1.2μm和0.22μm滤板过滤)。可以通过进行例如ELISA监测滴度。
可以使用分选酶介导的转肽反应将结合实体共价连接寡核苷酸结合对的各成员。在多孔形式中组合结合实体和分选酶反应混合物。在37℃温育4-16小时后，通过使用负向His标签选择方法(将混合物应用到例如His MultiTrap HP平板上(GE Healthcare))收集结合实体-寡核苷酸缀合物并过滤，由此仍然具有His标签的所有分子结合到层析柱上，然而在滤液中发现了所有其他分子，像寡核苷酸缀合物；例如应该通过将结合实体-寡核苷酸缀合物应用到超滤膜上或通过使用含有对结合实体特异的亲和介质的平板，利用滤液进行缓冲液交换；缓冲液交换(其也去除了过量的游离寡核苷酸)后，可以连接结合实体-寡核苷酸缀合物，以变成多特异性结合分子。
使用Combimatrix方法制备多特异性结合分子，参见下表。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 11A
B 1B … … … … … … … … … …
C 1C … … … … … … … … … …
D 1D … … … … … … … … … …
E 1E … … … … … … … … … …
F 1F … … … … … … … … … …
G 1G … … … … … … … … 10G 11G
在多孔板的第一行中，将等摩尔浓度的不同结合实体-寡核苷酸缀合物吸取到每个孔中(除第一行的第一个孔外)，用阿拉伯数字(例如，1-11)命名。在同一个平板的第一列中，将等摩尔浓度的不同结合实体-寡核苷酸缀合物吸取到每个孔中(除第一列的第一个孔外)，用字母(例如，A-G)命名。然后，将第一行的所有结合实体-寡核苷酸缀合物与第一列的所有结合实体-寡核苷酸缀合物组合(例如在96孔板中产生77种组合)，用数字和字母的组合(例如1A-11G)命名。向所有组合中加入与结合实体-寡核苷酸缀合物等摩尔比例的接头分子和适当的缓冲液(例如具有150mM NaCl，1.5mM MgCl2的PBS)。可以在室温下或通过在60℃下变性混合物，然后缓慢冷却来进行连接反应。然后，可以进行通过例如大小排阻层析的任选纯化步骤。多特异性结合分子然后即可用于在基于细胞的测定中进行评估。
如本文报道的方法
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：
(i)确定样品中细胞表面上存在的表面标志物并选择其第一种表面标志物和第二种表面标志物，
(ii)温育(a)缀合第一个结合对的第一个配偶体或成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv特异性结合第一种表面标志物，(b)缀合第二个结合对的第一个成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv抗体片段特异性结合第二种表面标志物，和(c)在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的接头，
并由此产生双特异性抗体。
如本文报道的一个方面是用于确定抗原结合位点的组合的方法，其包括以下步骤：
(i)确定大量双特异性抗体的结合特异性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期，通过组合第一大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员与第二大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员以及在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的接头来制备所述双特异性抗体，
由此第一大群特异性结合第一个细胞表面分子并且第二大群特异性结合第二个细胞表面分子，
和
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期的双特异性抗体并由此确定抗原结合位点的组合。
在一个实施方案中，双特异性抗体是复合体，其包含
a)第一个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第一种细胞表面标志物，并且
ii)其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)第二个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第二种细胞表面标志物，并且
ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，和
c)多核苷酸接头
i)其缀合第一个结合对的第二个成员，并且
ii)其缀合第二个结合对的第二个成员。
以下是如本文报道的所有方面的实施方案。
在一个实施方案中，复合体是非共价复合体。
在一个实施方案中，复合体还包含效应部分，其缀合与多核苷酸接头的至少一部分互补的多核苷酸。
在一个实施方案中，复合体还包含其他多肽i)其特异性结合第二个靶标，并且ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，并且多核苷酸接头缀合第二个结合对的第二个成员。
在一个实施方案中，复合体还包含缀合多核苷酸的效应部分，所述多核苷酸i)与缀合第一个效应部分的多核苷酸的至少一部分互补并且ii)不与多核苷酸接头互补。
在一个实施方案中，第一个和第二个Fab片段或scFv抗体片段结合同一个靶标和其上的非重叠表位。
在一个实施方案中，多核苷酸接头包含8-1000个核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸接头包含10-500个核苷酸。
在一个实施方案中，多核苷酸接头是对映体DNA。在一个实施方案中，对映体DNA是L-DNA。在一个实施方案中，L-DNA是单链L-DNA(ss-L-DNA)。
在一个实施方案中，效应部分选自结合部分、标记部分和生物活性部分。
在一个实施方案中，多核苷酸接头在其第一个或第二个末端缀合Fab片段或scFv抗体片段。
在一个实施方案中，多核苷酸接头缀合两个结合对的两个第二个成员，由此第一个结合对的第二个成员缀合多核苷酸接头的第一个末端并且第二个结合对的第二个成员缀合多核苷酸接头的第二个末端。
在一个实施方案中，第一个结合对的第一个和第二个成员分别包含SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:08的核酸序列。
在一个实施方案中，第二个结合对的第一个和第二个成员分别包含SEQ ID NO:06和SEQ ID NO:07的核酸序列。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)合成第一个Fab片段或scFv抗体片段，其特异性结合第一种细胞表面标志物并且其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)合成第二个Fab片段或scFv抗体片段，其特异性结合第二种细胞表面标志物并且其缀合第二个结合对的第一个成员，
c)合成多核苷酸接头，其缀合第一个结合对的第二个成员并且其缀合第二个结合对的第二个成员，和
d)通过组合合成的组分形成复合体。
多肽-多核苷酸-复合体
本文报道的是多特异性结合分子，如双特异性抗体，其是包含由非共价相互作用连接的至少两个组分的复合体，由此所述组分对体内的蛋白水解和酶促降解比分离的RNA或DNA，尤其是D-DNA更具有抵抗力。复合体对其靶标开发结合亲和力具有高亲和力并具有良好的可溶性。复合体可以用于向靶标递送一个或多个效应部分。
已经发现，包含多肽和多核苷酸部分，尤其是L-多核苷酸部分的混合物的复合体满足这些需求并尤其适合于体内递送效应部分。
如果待靶向的细胞具有至少两个细胞表面分子，那么如本文报道的多特异性结合分子(例如双特异性抗体)包含接头多核苷酸和两个或多个多肽(结合实体)，其特异性结合非重叠表位并其如此构建，从而所述接头多核苷酸具有最佳长度，用于协同结合特异性结合这些细胞表面分子的多肽。
如本文报道的一个方面是下式的多肽-多核苷酸-复合体：
(A–a’:a–S–b:b’–B)–X(n)或(A–a’:a–S–b:b’–B):X(n)，
其中A以及B是特异性结合靶标的结合实体，
其中a’:a以及b:b’是结合对，其中a’和a不干扰b与b’的结合，反之亦然，
其中S是接头多核苷酸，
其中(:X)表示共价结合或通过结合对结合到a’、a、b、b’或S的至少一个上的效应部分，
其中(n)是整数，
其中-代表共价键，并且
其中：代表非共价键。
本文还报道的一个方面是用于产生下式的多肽-多核苷酸-复合体的方法：
(A–a’:a–S–b:b’–B)–X(n)或(A–a’:a–S–b:b’–B):X(n)，
如上概括包括步骤：
a)分别合成A-a’和b’-B，
b)合成接头a–S–b，和
c)形成所述式的复合体，
其中效应部分X在步骤a)、b)或c)中结合a’、a、b、b’或S中的至少一个。
基于其各组分，可以根据标准方法通过在缀合复合体的各组分的结合对成员之间杂交获得如本文报道的复合体。
为了获得复合体(例如具有1:1:1化学计量)，可以通过从其他缀合副产物中层析分离复合体。可以通过使用染料标记的结合对成员和/或带电接头促进该方法。通过使用这种类型的标记的且高度带负电的结合对成员，从非标记结合实体/多肽和携带多于一个接头的结合实体/多肽中容易地分离单一缀合的结合实体，因为电荷和分子量的差异可以用于分离。荧光染料可以用于从非结合的组分，像标记的单价结合物中纯化复合体。
如本文报道的一个方面是报道了产生结合实体-多核苷酸-复合体的方法，所述复合体包含组分：
a)结合实体，如多肽，其特异性结合靶标并且其缀合结合对的第一个成员，
b)在其第一个末端缀合结合对的第二个成员的多核苷酸接头，和
c)缀合与多核苷酸接头的至少一部分互补的多核苷酸的效应部分。
所述方法包括步骤：a)分别合成i)特异性结合靶标并且缀合结合对的第一个成员的结合实体和ii)缀合与多核苷酸接头的至少一部分互补的多核苷酸的效应部分，b)合成在其第一个末端缀合结合对的第二个成员的多核苷酸接头，和c)通过杂交合成的组分形成结合实体-多核苷酸-复合体。
如本文报道的另一方面是产生结合实体-多核苷酸-复合体的方法，所述复合体包含组分：
a)第一个结合实体，如多肽，其特异性结合缀合第一个结合对的第一个成员的第一个靶标，
b)第二个结合实体，如多肽，其特异性结合缀合第二个结合对的第一个成员的第二个靶标，和
c)在其第一个末端缀合第一个结合对的第二个成员并且在其第二个末端缀合第二个结合对的第二个成员的多核苷酸接头，
所述方法包括步骤：a)分别合成特异性结合缀合第一个结合对的第一个成员的第一个靶标的第一个结合实体，和特异性结合缀合第二个结合对的第一个成员的第二个靶标的第二个结合实体，和b)合成在其第一个末端缀合第一个结合对的第二个成员并且在其第二个末端缀合第二个结合对的第二个成员的多核苷酸接头，和c)通过杂交所合成的组分形成结合实体-多核苷酸-复合体。
复合体可以额外地含有一个或若干个平衡离子Y以均衡电荷。合适的带负电平衡离子的实例是卤化物、OH-、碳酸根、烷基羧酸根，例如三氟乙酸根、硫酸根、六氟磷酸根和四氟硼酸根基团。六氟磷酸根、三氟乙酸根和四氟硼酸根基团尤其合适。其他合适的带正电平衡离子是单价阳离子，如碱性金属离子和/或铵离子。
可以容易地提供、分析如本文报道的复合体全部文库，并且需要时可以大规模产生该文库以外的合适的结合剂。
文库指如本文报道的一组复合体，其中调整结合实体、多核苷酸接头的长度，以最佳满足为结合剂设置的需求。
可以容易地例如使用横跨1nm-100nm完整谱并且具有间隔约10nm级别的多核苷酸接头梯度。然后在第一轮中鉴定的最适当长度周围再次容易地进一步完善接头长度。
本文还报道了用于从包含大量复合体(其具有不同的多核苷酸接头长度)的文库中选择结合实体-多核苷酸-复合体的方法。在该方法的一个实施方案中，合成具有多种长度的多核苷酸接头的若干接头分子并用于形成如本文报道的包含可变长度的多核苷酸接头的复合体，并且选择那些复合体，其Kdiss比两个单价多肽结合物中较好的一个提高至少5倍。在一个实施方案中，通过实施例中公开的BIAcore分析进行具有想要的Kdiss的二价结合剂的选择。
如本文报道的一个方面是这样的复合体，其包含
a)结合实体(例如多肽)，其特异性结合第一个靶标并且其缀合第一个单链L-DNA部分，
b)第二个结合实体(例如多肽)，其特异性结合第二个靶标并且其缀合第二个单链L-DNA部分，和
c)接头，在其第一个(或3’)末端包含与第一个单链L-DNA部分互补的第一个单链L-DNA接头部分并且在其第二个(或5’)末端包含与第二个单链L-DNA部分互补的第二个单链L-DNA接头部分。
如本文报道的一个方面是这样的复合体，其包含
a)抗体FAB片段或scFv，其特异性结合第一个靶标并且其缀合第一个单链L-DNA部分，
b)抗体FAB片段或scFv，其特异性结合第二个靶标并且其缀合第二个单链L-DNA部分，和
c)接头，在其第一个(或3’)末端包含与第一个单链L-DNA部分互补的第一个单链L-DNA接头部分并且在其第二个(或5’)末端包含与第二个单链L-DNA部分互补的第二个单链L-DNA接头部分。
第一个单链L-DNA部分不与第二个单链L-DNA部分杂交并且不与第二个单链L-DNA接头部分杂交。继而，第二个单链L-DNA部分不与第一个单链L-DNA部分杂交并且不与第一个单链L-DNA接头部分杂交。
在本文呈现的所有方面的以下实施方案中给出：
在一个实施方案中，特异性结合靶标的结合实体是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段是Fab。
在一个实施方案中，第一个和/或第二个单链L-DNA部分具有10-50个核苷酸的长度。在一个实施方案中，长度是15-35个核苷酸。在一个实施方案中，长度是20-30个核苷酸。
在一个实施方案中，接头包含第一个单链L-DNA接头部分、第二个单链L-DNA接头部分，和单链对接部分。在一个实施方案中，接头还包含线性非核苷酸部分。在一个实施方案中，线性非核苷酸部分是多肽或非离子聚合物。在一个实施方案中，非离子聚合物是线性聚(乙二醇)。在一个实施方案中，线性聚(乙二醇)包含1-100个乙二醇单位。在一个实施方案中，线性聚(乙二醇)包含1-50个乙二醇单位。在一个实施方案中，线性聚(乙二醇)包含1-25个乙二醇单位。
在一个实施方案中，复合体包含
a)多肽，其特异性结合第一个靶标并且其缀合第一个单链L-DNA部分，
b)多肽，其特异性结合第二个靶标并且其缀合第二个单链L-DNA部分，和
c)接头，在其第一个(或3’)末端包含与第一个单链L-DNA部分互补的第一个单链L-DNA接头部分，在其第二个(或5’)末端包含与第二个单链L-DNA部分互补的第二个单链L-DNA接头部分，并其在第一个和第二个单链L-DNA部分之间包含第三个单链L-DNA接头部分。
在一个实施方案中，接头从3’-5’方向包含
-第一个单链L-DNA接头部分，其与第一个单链L-DNA部分互补，
-对接单链L-DNA部分，和
-第二个单链L-DNA接头部分，其与第二个单链L-DNA部分互补。
对接单链L-DNA部分不与第一个单链L-DNA部分或其互补的第一个单链接头部分杂交并且不与第二个单链L-DNA部分或其互补的第二个单链L-DNA接头部分杂交。
在一个实施方案中，接头从3’-5’方向包含
-第一个单链L-DNA接头部分，其与第一个单链L-DNA部分互补，
-线性非核苷酸部分，
-对接单链L-DNA部分，和
-第二个单链L-DNA接头部分，其与第二个单链L-DNA部分互补。
在一个实施方案中，接头从3’-5’方向包含
-第一个单链L-DNA接头部分，其与第一个单链L-DNA部分互补，
-对接单链L-DNA部分，
-非核苷酸部分，和
-第二个单链L-DNA接头部分，其与第二个单链L-DNA部分互补。
在一个实施方案中，接头从3’-5’方向包含
-第一个单链L-DNA接头部分，其与第一个单链L-DNA部分互补，
-非核苷酸部分，
-对接单链L-DNA部分，和
-第二个单链L-DNA接头部分，其与第二个单链L-DNA部分互补。
在一个实施方案中，接头从3’-5’方向包含
-第一个单链L-DNA接头部分，其与第一个单链L-DNA部分互补，
-第一个非核苷酸部分，
-对接单链L-DNA部分，
-第二个非核苷酸部分，
-第二个单链L-DNA接头部分，其与第二个单链L-DNA部分互补。
在一个实施方案中，第一个非核苷酸部分和第二个非核苷酸部分是相同的或不同的。在一个实施方案中，线性非核苷酸部分是多肽或非离子聚合物。在一个实施方案中，非离子聚合物是线性聚(乙二醇)。在一个实施方案中，线性聚(乙二醇)包含1-100个乙二醇单位。在一个实施方案中，线性聚(乙二醇)包含1-50个乙二醇单位。在一个实施方案中，线性聚(乙二醇)包含1-25个乙二醇单位。
结合实体组分
单克隆抗体技术允许产生特异性结合单克隆抗体或其片段形式的特异性结合剂。为了产生单克隆抗体或其片段，可以使用这样的技术，如用多肽，即抗体的靶标，和/或编码多肽的核酸免疫小鼠、兔、仓鼠或任何其他哺乳动物。或者，可以通过使用scFv(单链可变区)，尤其是人scFv的噬菌体文库获得单克隆抗体或其片段(参见例如US 5，885，793、WO92/01047、WO 99/06587)。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的结合实体是单价抗体片段。在一个实施方案中，单价抗体片段来自单克隆抗体。
单价抗体片段包括，但不限于Fab、Fab’-SH、单结构域抗体、F(ab’)2、Fv和scFv片段。因此，在一个实施方案中，单价抗体片段选自Fab、Fab’-SH、单结构域抗体、F(ab’)2、Fv和scFv片段。
在一个实施方案中，如本文报道的复合体的结合实体中的至少一个是单克隆抗体的单结构域抗体，或Fab片段，或Fab’片段。
在一个实施方案中，如本文报道的复合体的结合实体中的两个各自独立地是单克隆抗体的单结构域抗体，或Fab片段，或Fab’片段。
在一个实施方案中，如本文报道的复合体的结合实体中的两个均是单结构域抗体，或Fab片段，或Fab’片段。
在一个实施方案中，结合实体特异性结合的靶标或表位不重叠。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(参见例如EP 0404097，WO 93/01161，Hudson，P.J.，等，Nat.Med.9(2003)129-134，和Holliger，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)。三抗体和四抗体也描述于Hudson，P.J.，等，Nat.Med.9(2003)129-134中。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或部分或轻链可变域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；US 6，248，516)。
Fv是含有完整抗原结合位点并缺少恒定区的最小抗体片段。对于scFv的综述，参见例如Plueckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore(编辑)，(Springer-Verlag，New York，1994)，第269-315页，WO 93/16185、US 5，571，894、US 5，587，458。一般地，六个高变区(HVRs)赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或包含仅对抗原特异的三个HVRs的Fv的一半)也具有识别并结合其抗原的能力。
在一个实施方案中，单价抗体片段是两条链Fv种类，其由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。
在一个实施方案中，单价抗体片段是单链Fv(scFv)种类，其由通过柔韧肽接头共价连接的一个重链和一个轻链可变域组成。
抗体的Fab片段含有重链和轻链可变域以及轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CH1)。
Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基端添加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段。
Fab’-SH表示Fab’，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。
已经开发了多种技术用于产生抗体片段。传统上，可以通过蛋白水解消化全长抗体获得抗体片段(参见例如Morimoto，K.，等，J.Biochem.Biophys.Meth.24(1992)107-117，Brennan，M.，等，Science229(1985)81-83)。例如，木瓜蛋白酶消化全长抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每一个具有单个抗原结合位点，和剩余的“Fc”片段，其名字反映了其容易结晶的能力。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.，等，Nat.Med.9(2003)129-134。
还可以通过重组手段直接产生抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段均可以在例如大肠杆菌中表达并分泌，因此允许容易产生大量的这些片段。可以根据标准方法从抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段。(Carter，P.，等，Bio/Technology 10(1992)163-167)。哺乳动物细胞系统也可以用于表达，并且需要时分泌抗体片段。
在一个实施方案中，特异性结合抗原的结合实体是单结构域抗体。在某个实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(参见，例如US 6，248，516)。在一个实施方案中，单结构域抗体由抗体的重链可变域的全部或部分组成。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或部分或轻链可变域的全部或部分的单条多肽链。
在某些实施方案中，结合实体以≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M-10-13M，例如10-9M-10-13M)的解离常数(KD)结合其靶标。
在某些实施方案中，结合实体以10-5M-10-13M，或10-5M-10-10M或10-5M-10-8M的解离常数(KD)结合其靶标。
在其中结合实体是抗体或抗体片段的一个实施方案中，通过利用以下测定中描述的抗体的Fab片段及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测定解离常数。
通过在存在滴定系列的未标记抗原的情况下，利用最小浓度(125I)标记的抗原平衡Fab，然后利用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原来测定Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如，Chen，Y.，等，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了为测定建立条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗FAB抗体(Cappel Labs)将多孔板(ThermoScientific)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大概23℃)下封闭2-5小时。在非吸附的平板(Nunc#269620)中，100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如，与抗VEGF抗体、Fab-12的评估一致，Presta，L.G.，等，Cancer Res.57(1997)4593-4599)。目的FAB然后温育过夜；然而，所述温育可以持续更长的时间(例如，约65小时)，以保证达到平衡。然后，将混合物转移到捕获板中用于在室温下温育(例如1小时)。然后去除溶液并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗涤平板8次。当平板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数平板10分钟。选择给出少于或等于20％最大结合的每一种FAB的浓度，用于竞争性结合测定。
根据另一实施方案，使用-2000或-3000或A-100(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)使用表面等离振子共振测定在25℃下，利用～10响应单位(RU)的固定的抗原CM5芯片测定解离常数。
简言之，根据供应商的说明书，利用N-乙基-N’-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。在以5μl/分钟的流速注射之前，利用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释抗原，以达到大概10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原后，注射1M乙醇胺，以封闭未反应的基团。对于动力学测定，以大概25μl/分钟的流速在25℃下注射具有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的两倍连续稀释的FAB(0.78nM-500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software version 3.2)，通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比例koff/kon(参见例如Chen，Y.，等，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过上文的表面等离振子共振测定，on-rate超过106M-1s-1，那么可以在存在增加浓度的抗原(如在分光计，如停流装配的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌比色杯的8000-系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测定)的情况下，通过使用测定荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少的荧光猝灭技术在25℃下测定PBS，pH 7.2中20nM抗抗原抗体(FAB形式)的on-rate。
如果，两个结合分子识别两个独立的结合位点，那么可以产生协同结合事件，这可以依赖于多核苷酸接头长度。
协同结合作用的物理特征在于自由Gibbs结合能ΔG°1和ΔG°2总结为ΔG°coop:ΔG°1+ΔG°2＝ΔG°coop。
根据Gibbs等式ΔG°coop＝-RTlnKDcoop，ΔG°coop从亲和力KD1和KD2形成产物。
通过协同性增加自由Gibbs结合能显著增加了结合亲和力(KDcoop)和结合特异性。
当所处理的结合位点独立地定位在两个不同靶标分子(其例如可能共同定位在肿瘤细胞的表面上)上时，结合特异性进一步增加。
特异性结合靶标的结合实体可能携带一个或多个游离的OH、COOH、NH2和/或SH基团，其可能潜在地与某些偶联试剂反应。为了在缀合反应过程中避免(副)反应，可以选择下表1中给出的偶联化学物之一。
表1提供了用于共价结合多肽至结合对各成员以及用于共价结合接头至结合对各成员的反应基团的概括。
表1.
上述双正交偶联化学物尤其适合于单价结合多肽的缀合。如果两个结合配偶体不携带某些反应官能团，例如在两个适体组合的情况下，那么在反应位点的选择上会有更大的自由。因而，此外或与上表给出的相应反应位点对的组合中，氨基/活性酯(例如NHS酯)和SH/SH或SH/maleinimido可以用于正交偶联。
单价结合多肽也可以是合成肽或肽模拟物。如果多肽是化学合成的，那么可以在该合成过程中掺入具有正交化学反应性的氨基酸(参见例如deGraaf，A.J.，等，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。因为大多数正交官能团在危险中并且可以引入到合成肽中，所以该肽缀合到接头上是标准的化学作用。
多核苷酸组分
如本文报道的复合体包含(多核苷酸)接头。接头可以共价结合多肽或(多核苷酸)接头并且多肽可以通过特定的结合对彼此结合。
当使用不同长度的(多核苷酸)接头时，可以获得在特异性结合靶标的第一个和第二个多肽之间具有不同距离的所得复合体构建体。这允许最佳距离和/或灵活性。
术语多核苷酸应广泛地理解并包括DNA和RNA以及其类似物和修饰。
在一个实施方案中，多核苷酸接头包括不同类型单体的混合物，只要多于20％的单体是核苷。在一个实施方案中，多核苷酸接头由不同类型单体的混合物组成，只要多于30％的单体是核苷。在一个实施方案中，多核苷酸接头由不同类型单体的混合物组成，只要多于40％的单体是核苷。在一个实施方案中，多核苷酸接头由不同类型单体的混合物组成，只要多于50％的单体是核苷。
例如，接头可以仅由核苷组成或者其可以是核苷和氨基酸，和/或糖残基，和/或二元醇，和/或磷-糖单位，和/或非离子聚合物结构单元的混合物。
寡核苷酸可以例如含有在标准碱基脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞嘧啶(dC)、脱氧胸腺嘧啶(dT)、脱氧尿苷(dU)上携带取代基的取代核苷酸。此类取代的核碱基的实例是5-取代的嘧啶(像5-甲基-dC、氨基烯丙基-dU或-dC、5-(或-3-丙烯酰亚氨)-dU、5-丙炔基-dU或-dC)、5-卤代的-dU或-dC、N-取代的嘧啶(像N4-乙基-dC)、N-取代的嘌呤(像N6-乙基-dA、N2–乙基-dG)、8-取代的嘌呤(像8-[6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或-dA)、8-卤代的-dA或-dG、8-烷基-dG或-dA和2-取代的-dA(像2-氨基-dA)。
寡核苷酸可以含有核苷酸或核苷类似物。即可以通过使用核碱基类似物，像5-硝基吲哚-D-肌苷、3-硝基-吡咯-D-肌苷、脱氧肌苷(dI)、脱氧黄苷(dX)、7-脱氮杂-dG、-dA、-dI或-dX、7-脱氮杂-8-氮杂-dG、-dA、-dI或-dX、8-氮杂-dA、-dG、-dI或-dX、D-间型霉素、假-dU、假-异-dC、4-硫-dT、6-硫-dG、2-硫-dT、异-dG、5-甲基-异-dC、N8-连接的-8-氮杂-7-脱氮杂-dA、5、6-二氢-5-氮杂-dC、亚乙烯基-dA或pyrollo-dC交换天然发生的核碱基。如对技术人员显而易见的是，必须以双链体形成是特异的这种方式选择互补链中的核碱基。例如如果5-甲基-异-dC用于一条链(例如(a))中，异-dG必须在互补链(例如(a’))中。
在一个实施方案中，修饰接头的寡核苷酸骨架，以含有取代的糖残基、糖类似物、核苷间磷酸部分的修饰，和/或是PNA(具有骨架，但没有磷酸盐和d-核糖)。
寡核苷酸例如可以含有具有取代的脱氧核糖，像2’-甲氧基-、2’-氟代-、2’-甲基硒基-、2’-烯丙氧基-、4’-甲基-dN(其中N是核碱基，例如，A、G、C、T或U)的核苷酸。
糖类似物例如是木糖、2’，4’-桥接的核糖，像(2'-O，4'-C甲叉)(低聚物，称为LNA)或(2'-O，4'-C乙烯)(低聚物，称为ENA)、L-核糖、L-D-核糖、己糖醇(低聚物，称为HNA)、环己烯基(低聚物，称为CeNA)、阿卓糖醇(低聚物，称为ANA)、三环核糖类似物，其中C3′和C5′原子通过乙烯桥连接，所述乙烯桥融合环丙烷环(低聚物，称为三环DNA)、丙三醇(低聚物，称为GNA)、吡喃型葡萄糖(低聚物，称为Homo DNA)、carbaribose(具有环戊烷，而非四氢呋喃亚基)、羟甲基-吗啉(低聚物，称为吗啉代DNA)。
也已知核苷间磷酸部分的大量修饰不干扰杂交性质并且此类骨架修饰还可以与取代的核苷酸或核苷酸类似物组合。实例是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯寡核苷酸。
可以如希望在如本文报道的复合体中包含的多核苷酸中组合上述修饰的核苷酸、核苷酸类似物以及多核苷酸骨架修饰。
(多核苷酸)接头具有1nm-100nm的长度。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头具有4nm-80nm的长度。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头具有5nm-50nm或6nm-40nm的长度。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头具有10nm或更长或15nm或更长的长度。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头具有10nm-50nm的长度。
在一个实施方案中，缀合(多核苷酸)接头的结合对的成员各自具有至少2.5nm的长度。
可以通过使用与实体化学上相似的组分的已知键长和键角计算(多核苷酸)接头的长度。在标准教科书中为一些分子概括了该键长(参见例如CRC Handbook of Chemistry and Physics，第91版(2010-2011)，第9部分)。
在间隔物或接头长度的计算中，应用以下近似值：a)为了计算非核苷实体的长度，使用独立于所连接原子的性质的130pm的平均键长和180°的键角，b)单链中的一个核苷酸用500pm计算，和c)双链中的一个核苷酸用330pm计算。
130pm的数值基于C(sp3)-C(sp3)-C(sp3)链的两个末端碳原子的距离的计算，其中键角为109°28’，两个C(sp3)间的距离为153pm，这用假定键角180°和两个C(sp3)间的键长125pm转化成约250pm。考虑杂原子，像P和S以及sp2和sp1C原子也可以是接头的部分，采用数值130pm。如果接头包含环状结构，像环烷基或芳基，通过计算环状结构的键的数量以类似方式计算距离，所述环状结构是定义距离的整条原子链的部分。
可以如期望地改变如本文报道的复合体中的(多核苷酸)接头的长度。为了容易地利用可变长度的接头，即文库，适合的是简单合成该文库的不同接头。组合固相合成接头是适合的。因为必须将接头合成为具有高达约100nm的长度，所以以这样的方式选择合成策略，从而在固相合成过程中高效装配单体合成的结构单元。基于亚磷酰胺作为单体结构单元装配的脱氧寡核苷酸合成满足该需求。在该接头中，接头内的接头单体单元在各种情况下通过磷酸酯或磷酸酯类似物部分连接。
在一个实施方案中，(多核苷酸)接头可以含有游离的带正电荷或/和负电荷的多官能性氨基-羧酸基团，例如氨基、羧酸根或磷酸根。例如，电荷载体可以来自三官能性氨基羧酸，其含有a)氨基基团和两个羧酸根基团，或b)两个氨基基团和一个羧酸根基团。此类三官能性氨基羧酸的实例是赖氨酸、鸟氨酸、羟基赖氨酸、α，β-二氨基丙酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、羧基谷氨酸和对称的三官能性羧酸，像描述于EP 0 618 192或US 5，519，142中的那些。或者，a)的三官能性氨基羧酸中的一个羧酸根基团可以用磷酸根、磺酸根或硫酸根基团替换。此类三官能性氨基酸的一个实例是磷酸丝氨酸。
在一个实施方案中，(多核苷酸)接头也可以含有不带电荷的亲水性基团。不带电荷的亲水性基团的合适实例是环氧乙烷或尤其包含至少3个结构单元的聚(环氧乙烷)基团，如环氧乙烷、亚砜、砜、羧酸酰胺、羧酸酯、膦酸酰胺、膦酸酯、磷酸酰胺、磷酸酯、磺酸酰胺、磺酸酯、硫酸酰胺和硫酸酯基团。在一个实施方案中，酰胺基团是伯酰胺基团，尤其是氨基酸侧链基团(例如氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺)中的羧酸酰胺残基。酯尤其来自亲水性醇，特别是C1-C3醇或二元醇或三元醇。
对映体L-DNA因其正交杂交行为、其核酸酶抗性和容易合成可变长度的多核苷酸而闻名。
在一个实施方案中，复合体中所有的多核苷酸是对映体L-DNA或L-RNA。在一个实施方案中，复合体中所有的多核苷酸是对映体L-DNA。
对映体、单链L-DNA(ss-L-DNA)在体液中组合高分子柔性和稳定性。当单链L-DNA用作两个或多个独立结合分子之间的接头时，可以将这些结合分子调整至实际上任何结合角度和结合距离，其仅依赖于ss-L-DNA接头长度。
在一个实施方案中，在可以彼此杂交的区段中合成(多核苷酸)接头。
在该情况下，可以通过区段彼此杂交形成接头。所得的接头构建体包含寡核苷酸双链体部分。如果以这种方式构建接头，那么以这样的方式选择形成双链体的可杂交多核苷酸实体的序列，使得不会发生与结合对核酸的杂交或干扰结合对核酸。
在一个实施方案中，在可以彼此杂交的ss-L-DNA区段，例如A和B中合成多核苷酸接头。
在该情况下，可以通过区段彼此杂交构建多核苷酸接头。因而，可以简单地通过连续应用多联体形成结构单元，即如所示例的A和B将接头长度自我调整至两个结合位点之间的距离。接头的特征在于建立的接头的核酸末端以比多联体间解链温度(即TM2，因此TM2>TM1)低的解链温度(即TM1)与ss-L-DNA标记的结合分子杂交。为了分析全长接头的最终长度，在高于第一个解链温度但低于第二个解链温度的第三个温度(即TM3)(即TM3>TM1并且TM3<TM2)下温育所获得的复合体。可以通过标准方法，例如使用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶分析温度洗脱的接头。还可以计算接头长度，因为每个多联体的长度是已知的。在一个实施方案中可以标记各多联体。
双链体部分可以硬化寡核苷酸接头。这可以用于降低接头移动性和柔性。
在一个实施方案中，一个或多个L-DNA寡核苷酸与寡核苷酸L-DNA接头杂交。
在该实施方案中，寡核苷酸接头通过L-DNA双链体形成而被硬化。
在一个实施方案中，L-DNA/聚(乙二醇)杂合体用作(寡核苷酸)接头。
在一个实施方案中，L-DNA/D-DNA/聚(乙二醇)杂合体用作(寡核苷酸)接头。
在一个实施方案中，L-DNA/D-DNA/聚(乙二醇)/多肽杂合体用作(寡核苷酸)接头。
在一个实施方案中，一个或多个L-DNA寡核苷酸与L-DNA/聚(乙二醇)杂合体(寡核苷酸)接头杂交。
在一个实施方案中，共价偶联不同长度的聚(乙二醇)分子的一个或多个L-DNA寡核苷酸与寡核苷酸L-DNA聚(乙二醇)杂合体(寡核苷酸)接头杂交。
在一个实施方案中，L-DNA/D-DNA杂合体用作(寡核苷酸)接头。
在一个实施方案中，L-DNA/D-DNA杂合体用作(寡核苷酸)接头，其中一个或多个D-DNA寡核苷酸与(寡核苷酸)接头的寡核苷酸D-DNA部分杂交，以形成双链D-DNA。
在一个实施方案中，L-DNA/D-DNA杂合体用作接头，其中一个或多个L-DNA寡核苷酸与(寡核苷酸)接头的寡核苷酸L-DNA部分杂交，以形成双链L-DNA。
双链，即螺旋DNA双链体的形成可以用于修饰或调整复合体的体内半衰期，使得其可用于核酸酶的酶促作用。
构建(多核苷酸)接头的简单方式是使用标准的D或L核苷亚磷酰胺结构单元。
在一个实施方案中，使用dT的单链区段。
这是有利的，因为dT不需要携带碱基保护基团。
可以使用杂交，以改变(多核苷酸)接头长度(多核苷酸接头末端的碱基对成员之间的距离)和间隔臂的灵活性，因为与单链相比双链长度减小并且双链比单链更具刚性。
在一个实施方案中，对于杂交使用用功能性部分修饰的寡核苷酸。
用于杂交的寡核苷酸可以具有一个或两个不与接头杂交的末端延伸和/或是内部分支的。可以将此类不与接头杂交(且不干扰结合对的成员)的末端延伸用于其他杂交事件。
在一个实施方案中，与末端延伸杂交的寡核苷酸是包含效应部分的寡核苷酸。
该标记的寡核苷酸可以再次包含末端延伸或是分支的，以允许其他杂交，由此可以获得多核苷酸聚集物或树枝状聚合物(dendrimer)。尤其使用聚寡核酸树枝状聚合物，以产生多标记，或得到局部浓度高的效应部分。
可以将不干扰多核苷酸杂交的经修饰的核苷酸掺入到那些多核苷酸中。适当修饰的核苷酸是C5-取代的嘧啶或C7-取代的7-脱氮杂嘌呤。可以用非核苷酸实体在内部或在5’或3’末端修饰多核苷酸，所述非核苷酸实体用于引入功能部分。
在一个实施方案中，此类非核苷酸实体定位在缀合其末端的两个结合对成员之间的(多核苷酸)接头内。
用于构建多核苷酸的许多不同非核苷酸结构单元是文献中已知的，并且很多种是商品化的。对于功能部分的引入，使用非核苷双功能性结构单元或非核苷三功能性结构单元作为用于末端标记的CPG或作为用于内部标记的亚磷酰胺(参见例如Wojczewski，C.，等，Synlett 10(1999)1667-1678)。
在一个实施方案中，双功能性间隔区结构单元是非核苷组分。例如，此类接头是C2-C18烷基、烯基、炔基碳链，然而所述烷基、烯基、炔基链可以由额外的乙烯氧基和/或酰胺部分或季铵化阳离子胺部分中断，以增加接头的亲水性。也可以使用环状部分，像C5-C6-环烷基、C4N、C5N、C4O、C5O-杂环烷基、苯基(任选地用一个或两个C1-C6烷基基团取代)作为非核苷双功能性接头。合适的双功能性结构单元包含C3-C6烃基部分和三-至六-乙二醇链。表2a和2b显示了具有不同亲水性、不同刚性和不同电荷的核苷酸双功能性间隔区结构单元的一些实例。一个氧原子与酸不稳定性保护基(优选为二甲氧三苯甲基)连接，而另一个是亚磷酰胺的一部分。
表2a
表2b
因而，三功能性结构单元允许功能部分定位在多核苷酸内的任何位置。三功能性结构单元也是使用固相支持体，例如可控多孔玻璃(CPG)进行合成的前提，其用于多核苷酸的3’末端标记。在这种情况下，三功能性接头经由C2-C18烷基、烯基、炔基碳链连接至功能部分或(若必要的话)受保护的功能部分，然而所述烷基、烯基、炔基链可以被额外的乙烯氧基和/或酰胺部分中断，以增加接头的亲水性，并且包含经由可切割的间隔区附着到固相的羟基基团和用酸性不稳定性保护基保护的羟基基团。在除去此保护基后，释放出羟基基团，其然后能与亚磷酰胺起反应。
三功能性结构单元可以是非核苷的或核苷的。
非核苷的三功能性结构单元是C2-C18烷基、烯基、炔基碳链，然而所述烷基、烯基、炔基任选地被额外的乙烯氧基和/或酰胺部分中断，以增加接头的亲水性。其他三功能性结构单元是环状基团如C5-C6环烷基、C4N、C5N、C4O、C5O杂环烷基、苯基，其任选地被一个或两个C1-C6烷基基团取代。环状和非环状基团可以被一个(C1-C18)烷基-O-PG基团取代，然而所述C1-C18烷基包含(乙烯氧基)n、(酰胺)m部分，其中n和m彼此独立地＝0-6，并且PG是酸不稳定性保护基。优选的三功能性结构单元是C3-C6烷基、环烷基、C5O-杂环烷基部分，其任选地包含一个酰胺键，并且被C1-C6烷基O-PG基团取代，其中PG是酸不稳定性保护基，优选为单甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、pixyl、呫吨基(xanthyl)，最优选为二甲氧三苯甲基。
例如在表3中概括了非核苷三功能性结构单元的非限制性但合适的实例。
表3.
每当有必要与非修饰的多核苷酸相比不影响多核苷酸杂交性质时，核苷三功能性结构单元用于内部标记。因而，核苷结构单元包含仍然能够与互补碱基杂交的碱基或碱基类似物。在式II中给出了标记化合物的通式，其用于标记如本文报道的复合体中包含的a、a’、b、b’或S中的一种或多种的核酸序列。
式II：
其中PG是酸不稳定性保护基，尤其是单甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、pixyl、呫吨基，尤其是二甲氧三苯甲基，其中Y是C2-C18烷基、烯基、炔基，其中所述烷基、烯基、炔基可以包含乙烯氧基和/或酰胺部分，其中Y优选为C4-C18烷基、烯基、或炔基，并且含有一个酰胺部分，并且其中X是功能部分。
可以针对这类取代选择特定的碱基位置以使对杂交性质的影响最小化。因而，下列位置尤其适于取代：a)利用天然碱基：在C5处取代的尿嘧啶，在C5或N4处取代的胞嘧啶，在C8或N6处取代的腺嘌呤以及在C8或N2处取代的鸟嘌呤，和b)利用碱基类似物：在C7处取代的7-脱氮杂-A和7-脱氮杂－G，在C7处取代的7-脱氮杂－8-氮杂A和7-脱氮杂－8-氮杂-G，在C7处取代的7-脱氮杂-氮杂-2-氨基-A，在N1处取代的假尿苷和在N2处取代的间型霉素。
表4.
在表4中，双功能性部分的末端氧原子或三功能性部分的末端氧原子之一是亚磷酰胺的一部分，其没有完全详细地显示但是对技术人员来说是显而易见的。三功能性结构单元的第二个末端氧原子受酸不稳定性保护基PG保护，如对上文式II定义。
合成后修饰是将共价结合的功能部分引入接头中的另一种策略。在这种方法中，通过在固相合成过程中使用双功能性或三功能性结构单元引入氨基基团。在从支持体切割并纯化氨基修饰的接头后，接头与功能部分的活化酯或双功能性试剂反应，其中一个官能团是活性酯。尤其合适的活性酯是NHS酯或五氟苯基酯。
合成后修饰尤其用于在固相合成和脱保护过程中引入不稳定的功能部分。实例是为了Staudinger连接用三苯基膦羧甲基酯的修饰(Wang，Charles C.-Y.，等，Bioconjugate Chemistry 14(2003)697-701)，用洋地黄毒苷的修饰或使用商品化磺基SMCC引入马来酰亚胺基团。
结合对组分
在一个实施方案中，结合对的每个成员是/具有10kDa或更小的分子量。在一个实施方案中，结合对的每个成员的分子量是8kDa，或7kDa，或6kDa，或5kDa，或4kDa或更小。
解离常数，即结合对(之内)的结合亲和力是至少10-8M(＝10-8mol/l＝108l/mol)。如本文报道的复合体中的两个结合对的成员是不同的。如果交互结合，例如a以及a’与b或b’的结合的解离常数是对a:a’的解离常数的10倍或更高，那么例如承认结合对a:a’和b:b’之间的差异。
在一个实施方案中，交互结合，即a以及a’与b或b’的分别结合的解离常数是对a:a’的解离常数的20倍或更高。在一个实施方案中，解离常数是对a:a’内的解离常数的50倍或更高。在一个实施方案中，交互(交叉反应)结合解离常数是结合对内解离常数的100倍或更高。
在一个实施方案中，结合对的成员选自亮氨酸拉链结构域二聚体和杂交核酸序列。在一个实施方案中，两个结合对是亮氨酸拉链结构域二聚体。
在一个实施方案中，两个结合对是杂交核酸序列。在一个实施方案中，所有结合对成员是L-DNA序列。在一个实施方案中，两个结合对是杂交L-DNAs。
在一个实施方案中，结合对的两个成员代表亮氨酸拉链结构域。
术语“亮氨酸拉链结构域”表示这样的二聚化结构域，其特征在于在约35个残基的区段中每第七个残基处存在一个亮氨酸残基。亮氨酸拉链结构域是促进蛋白质的寡聚化的肽，在所述蛋白质中发现所述肽。亮氨酸拉链最初在若干DNA结合蛋白质中鉴定出来(Landschulz，W.H.，等，Science240(1988)1759-1764)。在已知的亮氨酸拉链中有天然存在的肽和其二聚化或三聚化的衍生物。适合于产生可溶性多聚体蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实例是在WO 94/10308中报道的那些，和如Hoppe，H.J.，等，FEBSLett.344(1994)191-195中报道的来自肺表面活性剂蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链。
亮氨酸拉链结构域形成通过α螺旋卷曲螺旋保持在一起的二聚体(结合对)。卷曲螺旋每圈具有3.5个残基，这意味着每第7个残基相对于螺旋轴占据等同的位置。卷曲螺旋内部的亮氨酸的规则排列通过疏水性和范德华相互作用使结构稳定化。
如果亮氨酸拉链结构域形成第一结合对和第二结合对，那么这两个亮氨酸拉链序列是不同的，即第一个结合对的成员不结合第二个结合对的成员。亮氨酸拉链结构域可以从已知含有此类结构域的天然蛋白质如转录因子中分离。一个亮氨酸拉链结构域可以例如来自转录因子fos，而第二个可以来自转录因子jun。亮氨酸拉链结构域也可以使用本领域中已知的标准合成和设计技术进行人工设计和合成。
在一个实施方案中，两个结合对是杂交核酸序列。
因此，每个结合对的成员，即a和a’以及b和b’分别彼此杂交。一方面，核酸序列包含在第一个结合对中，另一方面，在第二个结合对中包含的核酸序列是不同的，即彼此不杂交。
在一个实施方案中，结合对均与核酸对杂交，其中不同结合对的杂交核酸序列彼此不杂交。
换言之，第一个结合对的核酸彼此杂交，但不结合第二个结合对的任何核酸或干扰其杂交，反之亦然。可以通过解链温度分析容易地监测杂交动力学和杂交特异性。如果结合对的解链温度与同其他结合对的任何可能组合或结合对成员的组合相比高至少20℃，那么承认结合对的特异杂交和非干扰性。
形成结合对的核酸序列原则上可以包含任何天然存在的核碱基或其类似物，并且原则上可以具有如上文所描述的经修饰的或未修饰的骨架，只要它能够经由多碱基配对形成稳定的双链体。稳定的表示双链体的解链温度高于30℃，尤其高于37℃。
在一个实施方案中，双链由两条完全互补的单链多核苷酸组成。
然而，错配或插入是有可能的，只要给予在37℃下的稳定性。
可以通过链间交联使核酸双链体进一步稳定化。若干适当的交联方法是已知的，例如使用补骨脂素或基于硫代核苷的方法。
在一个实施方案中，代表结合对成员的核酸序列由12-50个核苷酸组成。在一个实施方案中，该核酸序列由15-35个核苷酸组成。
RNA酶是普遍存在的，并且必须特别注意避免对基于RNA的结合对和/或接头序列的不想要的消化。尽管可以使用基于RNA的结合对和/或接头，但基于DNA的结合对和/或接头尤其合适。
可以容易地设计适当的杂交核酸序列以提供超过两对正交互补的多核苷酸，允许简单产生并使用超过两个结合对。在如本文报道的复合体中使用杂交核酸序列的另一优势是可以容易地引入修饰。修饰的结构单元是商品化的，其例如允许容易合成包含功能部分的多核苷酸。可以在任何想要的位置且在第一个和/或第二个结合对的任何成员和/或多核苷酸接头中容易地引入此类功能部分，只要它们全部代表多核苷酸。
在其末端包含结合对的成员的(多核苷酸)接头可以提供为并且合成为单一多核苷酸。特异性结合靶标的多肽可以各自偶联到杂交核酸序列，即结合对的成员。可以以任何想要的方式容易地改变(多核苷酸)接头的长度。
根据特异性结合靶标的多肽的生物化学性质，可用用于缀合结合对的成员的不同策略。如果多肽是天然存在的或重组产生的并且长度在50-500个氨基酸残基之间，技术人员可以容易地遵循如教科书中报道的标准方法(参见例如Hackenberger，C.P.R.，和Schwarzer，D.，Angew.Chem.Int.Ed.47(2008)10030-10074)。
在一个实施方案中，对于缀合，使用马来酰亚胺部分与多肽内的半胱氨酸残基的反应。
如果例如使用抗体的Fab或Fab’片段作为单价结合多肽，这是尤其合适的偶联化学。
在一个实施方案中，进行结合对的成员与多肽C端末端的偶联。
可以例如如(Sunbul，M.和Yin，J.，Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)中所述进行蛋白质，例如FAB片段的C末端修饰。
一般而言，结合对成员与单价结合多肽的位点特异性反应和共价偶联基于将天然的氨基酸转化成具有这样的反应性的氨基酸，其与多肽中存在的其他官能团的反应性正交。
例如，在罕见的序列背景内的特定半胱氨酸可以酶促转化成醛(参见例如Frese，M-A.和Dierks，T.，ChemBioChem 10(2009)425-427)。还有可能通过利用某些酶与给定序列背景中的天然氨基酸的特异性酶促反应性来获得想要的氨基酸修饰(参见例如：Taki，M.，等，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126，Gautier，A.，等，Chem.Biol.15(2008)128-136；Bordusa，F.，Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)，Schmuck，C.和Wennemers，H.，(编辑)，Wiley VCH，Weinheim，第389-403页)。
通过末端氨基酸与适当的修饰剂的选择性反应也可以实现结合对成员与单价结合多肽的位点特异性反应和共价偶联。
可以使用N-末端半胱氨酸与苄腈(benzonitril)的反应性(参见Ren，H.，等，Angew.Chem.Int.Ed.48(2009)9658-9662)来实现位点特异性共价偶联。
天然的化学连接也可以依赖于C-末端半胱氨酸残基(Taylor，E.，等，Nucl.Acids Mol.Biol.22(2009)65-96)。
EP 1 074 563报道了这样的缀合方法，其基于带负电荷的氨基酸区段内的半胱氨酸与位于带正电荷的氨基酸区段中的半胱氨酸的较快反应。
效应组分
效应部分可以选自结合部分、标记部分、生物活性部分和反应部分。如果复合体中存在超过一个效应部分，那么每个这种效应部分在每种情况下均可以独立地是结合部分、标记部分、生物活性部分或反应部分。将选择结合部分以不干扰每个结合对。
在一个实施方案中，效应部分选自结合部分、标记部分和生物活性部分。
在一个实施方案中，效应部分是结合部分。
结合部分的实例是生物亲和性(bioaffine)结合对的成员，其彼此可以特异性地相互作用。合适的生物亲和性结合对是半抗原或抗原和抗体；生物素或生物素类似物(如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素)和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；糖和凝集素、多核苷酸和互补的多核苷酸、受体和配体(例如类固醇激素受体和类固醇激素)；和牛核糖核酸酶A的104-aa片段(已知为S-蛋白质)和牛核糖核酸酶A的15-aa片段(已知为S-肽)的对。
在一个实施方案中，效应部分是结合部分并且共价结合复合体的至少一个组分。
在一个实施方案中，生物亲和性结合对的较小配偶体，例如生物素或其类似物、受体配体、半抗原或多核苷酸共价结合如本文报道的复合体中包含的至少一个多核苷酸。
在一个实施方案中，效应部分是选自半抗原、生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素；多核苷酸和类固醇激素的结合部分。
在一个实施方案中，效应部分是标记基团。
标记基团可以选自任何已知的可检测基团。
在一个实施方案中，标记基团选自染料，像发光标记基团，如化学发光基团(例如吖啶酯或二氧杂环丁烷(dioxetane)或荧光染料例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵、花青素及其衍生物)、发光金属络合物(如钌或铕络合物)、如用于CEDIA的酶(Cloned Enzyme Donor Immunoassay，例如EP 0061888)、微粒或纳米颗粒，例如胶乳颗粒或金属溶胶、和放射性同位素。
在一个实施方案中，标记基团是发光金属络合物，并且化合物具有通式(I)的结构：
[M(L1L2L3)]n-Y-XmA   (I)
其中M是选自稀土或过渡金属离子的二价或三价金属阳离子，L1、L2和L3是相同的或不同的，并且表示具有至少两个含氮杂环的配体，其中L1、L2和L3经由氮原子结合金属阳离子，X是经由接头Y共价结合配体L1、L2和L3中至少一个的反应性官能团，n是1-10，尤其是1-4的整数，m是1或2，且尤其是1，并且A表示平衡电荷可能需要的平衡离子。
在一个实施方案中，金属络合物是发光金属络合物，即在适当激发后经历可检测的发光反应的金属络合物。
可以例如通过荧光或通过电化学发光测量检测所述发光反应。此络合物中的金属阳离子例如是过渡金属或稀土金属。
在一个实施方案中，金属是钌、锇、铼、铱、铑、铂、铟、钯、钼、锝、铜、铬、或钨。钌、铱、铼、铬和锇尤其合适。钌最合适。
金纳米棒(GNRs)也可以用作如本文报道的络合体中的标记部分。纳米棒可以具有10-100nm在内并包括其之间的所有整数的长度。
在一个实施方案中，GNRs具有70-75nm的平均长度。
GNRs可以具有5-45nm在内并包括其之间的所有整数的直径。
在一个实施方案中，GNRs具有25-30nm的平均直径。GNRs可以是纯金或可以是90％-99％在内并包括其之间的所有整数的纯金。
在多个实施方案中，GNRs在其表面上可以含有高达1％的银，并且可以含有溴化十六烷基三甲铵(CTAB)。
在这方面，可以通过任何合适的方法制备GNRs。例如，溶液中的电化学合成、膜制模、光化学合成、微波合成和种子介导的生长以及制备GNRs的方法的非限制性实例均合适。
在一个实施方案中，在溴化十六烷基三甲铵(CTAB)中使用种子介导的生长方法制备金纳米棒。
为了形成金纳米棒与RNA多核苷酸的络合物，可以将金纳米棒的表面官能化，以便赋予适合于将GNRs与DNA或RNA多核苷酸静电络合的正电ζ电位。可以使用在金纳米棒上产生正电ζ电位的任何合适方法。例如，可以用双功能性分子，如硫醇化的PEG-NH2或硫醇化的-PEG-COOH将金纳米棒的表面官能化。
在一个实施方案中，通过首先用阴离子聚合电解质聚(3，4-乙烯二氧基噻-6-吩)/聚(苯乙烯硫酸酯)(PEDT/PSS)，然后用阳离子聚电解质聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDAC)包被CTAB包被的金纳米棒来实现表面官能化。
这导致金纳米棒具有阳离子表面电荷(正电ζ电位)，并且还掩盖CTAB层(参见例如，Ding，H.，等，J.Phys.Chem.C 111(2007)12552-12557)。
带正电荷的金纳米棒使用静电相互作用而静电络合到DNA多核苷酸上。
可以从观察到的金纳米棒的定位的纵向等离子共振峰的红移以及使用凝胶电泳从纳米复合体的限制性电泳迁移率来验证纳米复合体的形成。
在一个实施方案中，效应部分X是治疗活性物质。
治疗活性物质具有不同的方式，其中它们例如在抑制癌症、通过烷基化、通过交联或通过双链切割DNA破坏DNA模板中有效。其他治疗活性物质可以通过嵌入阻断RNA合成。一些试剂是纺锤体毒物，如长春花生物碱类，或抑制酶活性的抗代谢物，或激素和抗激素剂。效应部分可以选自烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、亚硝基脲、激素和抗激素剂、和毒素。
合适的烷化剂是环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、噻替派、异环磷酰胺或氮芥。
合适的抗代谢物是氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤。
合适的抗肿瘤抗生素是阿霉素、柔红霉素、伊达比星(idorubicin)、nimitoxantron、更生霉素、博来霉素、丝裂霉素和普卡霉素。
合适的纺锤体毒物是美登素和美登木素生物碱(maytansinoids)，长春花生物碱并且表鬼臼毒素可以以长春新碱、长春碱、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷示例。
此外，合适的紫杉烷剂可以以紫杉醇、多西他赛、SB-T-1214示例。
合适的亚硝基脲是卡莫司汀、环己亚硝脲、司莫司汀、链脲霉素。
合适的激素和抗激素剂是肾上腺类皮质激素、雌激素类、抗雌激素类、孕激素类、芳香酶抑制剂、雄激素类、抗雄激素类。
合适的随机合成剂是达卡巴嗪、六甲密胺、羟基脲、米托坦、丙卡巴肼、顺铂、碳铂。
合适的单核细胞趋化因子是f-Met-Leu-Phe(fMLP)、f-Met-Leu-Phe-o-甲基酯、甲酰基-正亮氨酰-苯丙氨酸、甲酰基-甲硫氨酰-苯丙氨酸。
合适的NK细胞吸引因子是IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和CCL5，抗体的FC部分。
在一个实施方案中，效应部分X是抗体Fc区或其片段。
在一个实施方案中，人抗体Fc区是人IgG1亚类的、或人IgG2亚类的、或人IgG3亚类的、或人IgG4亚类的。
在一个实施方案中，抗体Fc区是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fc区。
在一个实施方案中，人抗体Fc区包含以下氨基酸位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、329和/或331中的至少一个上的天然存在的氨基酸残基突变成不同的残基，其中根据Kabat的EU索引编号抗体Fc区中的残基。
在一个实施方案中，人抗体Fc区包含位置329上的天然存在的氨基酸残基突变成不同的残基和选自位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331上的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的至少一个进一步突变成不同的残基，其中根据Kabat的EU索引编号Fc区中的残基。相比于未修饰(野生型)Fc区，这些特定氨基酸残基的改变导致改变Fc区的效应功能。
在一个实施方案中，相比于包含相应的野生型IgG Fc区的缀合物，人抗体Fc区对人FcγRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI具有降低的亲和力。
在一个实施方案中，人抗体Fc区中位置329上的氨基酸残基被甘氨酸或精氨酸或大的足以破坏Fc区内的脯氨酸夹层的氨基酸残基所取代。
在一个实施方案中，天然存在的氨基酸残基的人抗体Fc区中的突变是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和/或P331S中的至少一个。
在一个实施方案中，如果抗体Fc区是人IgG1亚类的，那么突变是L234A和L235A，或者如果抗体Fc区是人IgG4亚类的，那么突变是S228P和L235E。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含突变P329G。
效应部分可以共价或经由额外的结合对结合复合体的至少一个组分。如本文报道的复合体中可以包含效应部分1至若干(n)次，由此(n)是整数，0或1或超过1。在一个实施方案中，(n)在1-1，000，000之间。在一个实施方案中，(n)在1，000-300，000之间。在一个实施方案中，(n)是1-50。在一个实施方案中，(n)是1-10或1-5。在一个实施方案中，(n)是1或2。
为了将效应部分共价结合到复合体中的至少一个组分上，可以使用任何适当的偶联化学。当合成第一个和/或第二个结合对的成员和/或(多核苷酸)接头时，还可以通过使用适当的结构单元将功能部分掺入到尤其是缀合多肽的结合对的成员或(多核苷酸)接头中。
导致基本上(或几乎)无免疫原性的连接的缀合方法尤其合适。因而，肽(即酰胺)、硫化物(立体阻碍的)、二硫化物、腙或醚连接尤其合适。这些连接几乎是无免疫原性的并且在血清中显示合理的稳定性(参见例如Senter，P.D.，Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO 2009/059278；WO 95/17886)。
在一个实施方案中，效应部分结合如本文报道的复合体的(多核苷酸)接头。
在一个实施方案中，效应部分共价结合缀合多肽的结合对的成员或如本文报道的复合体的(多核苷酸)接头。
如果效应部分定位在杂交多核苷酸内，尤其适合于将其结合到修饰的核苷酸上或附着到核苷间P原子上(参见例如WO 2007/059816)。
双功能性结构单元(如上文所述)可以用于将效应部分或-若必要的话-受保护的效应部分连接到亚磷酰胺基团上，用于将5’-末端(常规合成)或3’-末端(反向合成)的结构单元附着到生长的多核苷酸链的末端羟基上。
三功能性结构单元(如上文所述)可以用于连接(i)效应部分或-若必要的话-受保护的效应部分，(ii)亚磷酰胺基团，以在多核苷酸合成过程中将报告物或效应部分或-若必要的话-受保护的效应部分与生长的多核苷酸链的羟基基团偶联，以及(iii)用酸不稳定性保护基团，尤其用二甲氧三苯甲基保护基团保护的羟基基团。在除去此酸不稳定性保护基后，释放出可以与其他亚磷酰胺起反应的羟基基团。
在一个实施方案中，效应部分结合第一个和/或第二个结合对的至少一个成员或经由额外的第三个结合对结合多核苷酸接头。在一个实施方案中，第三个结合对是一对杂交核酸序列。第三个结合对的成员不干扰其他结合对的成员彼此的结合。
效应部分可以结合的额外的结合对尤其是亮氨酸拉链结构域或杂交核酸。如果效应部分结合第一个和/或第二个结合对的至少一个成员或经由额外的结合对成员结合(多核苷酸)接头，那么分别全部选择效应部分结合的结合对成员和第一个和第二个结合对成员以具有不同的特异性。第一个和第二个结合对以及效应部分结合的结合对的成员各自结合(例如杂交)其各自的配偶体，但不干扰任何其他结合对的结合。
在一个实施方案中，结合对和/或(多核苷酸)接头的互补核酸由至少部分L-DNA、或L-RNA、或LNA、或异-C核酸、或异-G核酸、或其任何组合组成。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头由至少50％的L-DNA、或L-RNA、或LNA、或异-C核酸、或异-G核酸、或其任何组合组成。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头是L-多核苷酸(spiegelmer)。在一个实施方案中，L-多核苷酸是L-DNA。
在一个实施方案中，(多核苷酸)接头是DNA。在一个实施方案中，(多核苷酸)接头是DNA的L-立体异构体，也称为β-L-DNA或L-DNA或镜像DNA。
该立体异构DNA的特征在于具有以下优势，像正交杂交行为(其表示仅在L-DNA的两条互补单链间形成双链体，但在L-DNA的单链和互补D-DNA链之间不形成双链体)、核酸酶抗性和容易合成甚至长的接头。容易合成和间隔区长度的可变性对于提供接头文库来说是重要的。可变长度的(多核苷酸)接头用于鉴定具有最佳长度的多核苷酸接头的如本文报道的复合体，因此，提供特异性结合靶标的两个多肽间的最佳距离。
在一个实施方案中，复合体是非共价复合体。在一个实施方案中，非共价复合体经过结合对形成。
在一些实施方案中，效应部分是治疗药物。
例如，效应部分可以是治疗性放射性核素、激素、细胞因子、干扰素、抗体或抗体片段、核酸适体、酶、多肽、毒素、细胞毒素、化学治疗剂或放射致敏剂。
如本文报道的一个方面是使用如本文报道的复合体的方法。
例如，本文报道了杀死细胞的方法，其中以足以杀死细胞的量向细胞施用如本文报道的复合体。
在一个实施方案中，所述细胞是癌细胞。
本文还报道了在哺乳动物中延缓或终止癌细胞生长的方法，其中以足以延缓或终止癌细胞生长的量向哺乳动物施用如本文报道的复合体。
在一个实施方案中，所述方法是用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的多肽特异性结合细胞的细胞表面分子。在一个实施方案中，细胞表面分子特异地存在于癌细胞上。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的第一个和第二个多肽彼此独立地选自抗体、抗体片段、单链可变区抗体、小肽分子、环状多肽、肽模拟物和适体。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的第一个和第二个多肽是单价结合多肽。
在一个实施方案中，多肽是抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段来自特异性结合细胞表面分子的内化抗体。
效应部分与如本文报道的复合体的缀合允许效应部分特异地定位在细胞上的想要位点上。定位增加了靶细胞上的效应部分的有效浓度，并由此使效应部分的效果最佳化。此外，相比于非靶向效应部分，可以以更低的剂量施用复合体。这可以是特别相关的，如果效应部分具有伴随的毒性或者如果其用于治疗慢性疾病的话。
L-DNA是形成如本文报道的复合体中的有用核苷酸。L-DNA本身不与DNA(D-DNA)或RNA的天然存在形式杂交。因为L-DNA不是许多酶的天然底物，所以L-DNA在体内的稳定性可以比D-DNA的稳定性高。L-DNA双链体在可溶性、双链体稳定性和选择性方面与D-DNA具有相同的物理特征，但形成左旋的双螺旋。应理解，如本文所用的L-多核苷酸还可以包含一些D-多核苷酸。
由于L-多核苷酸的化学性质，这些是不能代谢的，从而使用L-核苷酸的药物代谢动力学不受DNA特异的降解方法的影响或至少没有达到受DNA特异的降解方法的影响的程度。鉴于L-多核苷酸的增加的稳定性，如本文报道的复合体在哺乳动物中的体内半衰期因此确实是不受限的。特别重要的是L-多核苷酸对肾脏无害的事实。
在一个实施方案中，哺乳动物选自人、猴、狗、猫、马、大鼠或小鼠。在一个实施方案中，多核苷酸接头包含D-DNA和L-DNA核苷酸，即多核苷酸接头是D-DNA和L-DNA的混合物。
利用该接头可以改造多核苷酸接头的半衰期，即可以定制寡核苷酸接头的体内半衰期并对其进行调整至预期地应用复合体。
如本文报道的复合体中存在的每一个多核苷酸可以包含一个或多个效应部分。效应部分允许在治疗疾病中使用如本文报道的复合体。效应部分可以用于例如载体目的，即递送效应功能，和/或调节药物代谢动力学行为，和/或调节物理-化学性质。
在一个实施方案中，效应部分选自亲脂部分、肽、蛋白质、碳水化合物和脂质体。
在一个实施方案中，多核苷酸是L-多核苷酸。
L-多(脱氧)核苷酸可以以单链或双链多核苷酸存在。通常，L-多(脱氧)核苷酸以单链核酸存在，其可以形成(确定的)二级结构，还有四级结构。在该二级结构中，还可以存在双链区段。然而，在彼此互补的两条链杂交的意义上，L-多(脱氧)核苷酸也可以至少部分以双链分子存在。L-多核苷酸还可以是被修饰的。修饰可以与多核苷酸的各个核苷酸相关。
在一个实施方案中，为了避免形成二级结构，2，4-二羟基-5-甲基嘧啶(T)可以用作核碱基。
在一个实施方案中，如本文报道的复合体中的L-多核苷酸不易于“自我杂交”。
因此，L-多核苷酸更容易能够与互补的L-多核苷酸序列杂交，但不与天然的DNA或RNA形成稳定的双链体。
在一个实施方案中，L-DNA区段中的核苷酸具有1'S、3'R和4'S的构象。
在一个实施方案中，L-DNA多核苷酸接头通过其末端的结合对成员的杂交而与复合体的多肽缀合。
在一个实施方案中，多核苷酸接头具有至少1nm的长度。在一个实施方案中，多核苷酸接头具有6nm-100nm的长度。在一个实施方案中，多核苷酸接头具有至少70个核苷酸的长度。
多核苷酸接头还可以包含标签序列。标签序列可以选自通常使用的蛋白质识别标签如YPYDVPDYA(HA-标签，SEQ ID NO:64)或GLNDIFEAQKIEWHE(Avi-标签，SEQ ID NO:65)。
因此，在如本文报道的方法的一个实施方案中，首先施用不包含效应部分的如本文报道的复合体并允许结合其靶标，然后施用缀合与(多核苷酸)接头的至少一部分互补的多核苷酸的效应部分。由此，效应部分通过与如本文报道的复合体原位杂交共定位在结合其靶标的复合体中。
应理解，如本文报道的复合体不限于任何特定核酸序列，或特异性结合靶标的任何结合实体(多肽)，或特定的细胞类型，或特定条件，或特定方法等，因为这些均可以变化并且其中的许多修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。
在如本文报道的方法的一个实施方案中，复合体结合肿瘤细胞的细胞表面并局部富集至高密度或高局部浓度的效应部分。
在一个实施方案中，效应部分标记为ss-L-DNA，其在复合体的初始靶标结合的同时或其后施用。
标记的ss-L-DNA效应部分与复合体的ss-L-DNA(寡核苷酸)接头杂交。
靶标结合的复合体用于激活先天免疫反应，即吸引细胞毒性淋巴细胞，也称为天然杀伤细胞(NK细胞)。NK细胞在排斥肿瘤和病毒感染的细胞中起重要作用。它们通过释放小的细胞质蛋白质颗粒(称为穿孔蛋白)和引起靶细胞通过程序性细胞死亡而死亡的粒酶杀死细胞。
在一个实施方案中，如本文报道的复合体用于将NK细胞吸引到结合的复合体附近。在一个实施方案中，缀合细胞因子的ss-L-DNA用作效应部分。
该细胞因子标记的效应部分可以用于吸引NK细胞。涉及NK激活的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和CCL5。
在一个实施方案中，缀合抗体的Fc区的ss-L-DNA用作效应部分。
NK细胞与巨噬细胞和若干其他细胞类型一起表达Fc受体(FcR)分子(FC-γ-RIII＝CD16)，其为结合抗体的Fc区的激活生物化学受体。这允许NK细胞靶向细胞(针对所述细胞已经诱导了体液应答)并通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)裂解细胞。
在一个实施方案中，缀合一个或多个Fc部分的ss-L-DNA的一个或多个或组合用作效应部分。
在该实施方案中，复合体可以用于调节ADCC和/或补体激活(CDC)。
在一个实施方案中，该复合体用于方法中，以筛选改造的Fc区室其参与ADCC和CDC的功效。
在一个实施方案中，复合体用于抑制精液磷酸酶。
在该实施方案中，复合体可以用于避免NK细胞失活。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的多肽，如特异性结合细胞表面分子的抗体或抗体片段缀合靶标受体的配体或更容易被细胞的内吞机制吞入的大分子，以增加复合体吸收到呈递靶标的细胞中。
然后可以通过内吞作用内化靶标结合的复合体并将效应部分释放到细胞内部。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的结合实体(多肽)是抗体片段。
术语“单链可变区片段”或“scFv”表示通过具有足以允许轻链和重链部分形成抗原结合位点的长度的共价连接而连接在一起的单条抗体轻链和单条抗体重链的可变抗原结合区。该接头可以短如共价键。尤其合适的接头包含2-50个氨基酸残基，并且尤其包含5-25个氨基酸残基。
其他抗体片段是双抗体，其首先由Holliger，P.，等(PNAS(USA)90(1993)6444-6448)描述。这些可以使用抗体的重链和轻链，以及通过使用抗体的各CDR区来构建。通常，双抗体包含通过接头连接轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)，所述接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VH和VL结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。可以类似地构建具有三个抗原结合位点的三抗体。
Fv抗体片段含有完整的抗原结合位点，其包括通过非共价相互作用结合在一起的VL结构域和VH结构域。Fv片段还包括这样的构建体，其中VH和VL结构域通过戊二醛、分子间二硫键或其他接头交联。重链和轻链的可变域可以融合在一起形成单链可变片段(scFv)，其保留亲本抗体的原始特异性。可以使用抗体的重链和轻链，以及通过使用抗体的各CDR区来构建首先由Gruber，M.，等，J.Immunol.152(1994)5368-5374描述的单链Fv(scFv)二聚体。本领域已知的许多技术可以用于制备适合于如本文报道的复合体中的特异性结合构建体(参见例如US 2007/0196274，US 2005/0163782)。
可以通过化学交联或通过杂合体杂交瘤技术产生双特异性抗体。或者，可以通过重组技术产生双特异性抗体分子。可以通过减少连接VH和VL结构域的接头长度约15个氨基酸(通常用于产生scFv片段)至于约5个氨基酸来促进二聚体化。这些接头利于VH和VL结构域的链内装配。合适的短接头是SGGGS(SEQ ID NO:66)，但可以使用其他接头。因此，两个片段装配成二聚体分子。将接头长度进一步减少至0-2个氨基酸残基可以产生三聚体(三抗体)或四聚体(四抗体)分子。
在一个实施方案中，特异性结合靶标的结合实体(多肽)，例如特异性结合细胞表面受体的抗体可以连接靶标受体的配体或更容易被细胞的内吞机制吞入的大分子。
在该实施方案中，复合体可以用于增加复合体吸收到呈递靶标的细胞中。然后可以通过内吞作用内化靶标结合的复合体并通过酸水解或酶活性(当内吞囊泡与溶酶体融合时)释放效应部分。
如本文报道的复合体可以用于细胞内和细胞外递送效应部分。复合体可以用于识别原位癌细胞，使得它们成为开发靶向治疗的有吸引力候选者。
当希望组分与另一组分(或颗粒或胶囊)的非共价结合时，可以使用的适当结合相互作用包括，但不限于抗体-抗原、受体-激素、抗生物素蛋白-生物素对、链霉抗生物素蛋白-生物素、金属-螯合物、小分子/多核苷酸(参见例如Dervan，P.B.，Bioorg.Med.Chem.9(2001)2215-2235；Zahn，Z.Y.和Dervan，P.B.，Bioorg.Med.Chem.8(2000)2467-2474)；多核苷酸/互补的多核苷酸(例如二聚体和三聚体的螺旋)、适体/小分子、适体/多肽、卷曲螺旋，和多核苷酸/多肽(例如锌指、螺旋-转角-螺旋、亮氨酸拉链，和结合DNA序列的螺旋-环-螺旋基序)。
如本文报道的复合体可以用于向细胞递送多种效应部分，如细胞毒素药物，包括治疗药物、发射射线的组分、植物、真菌或细菌来源的分子、生物蛋白质及其混合物。细胞毒素药物例如可以是细胞内作用的细胞毒素药物，如短程辐射体，包括例如短程高能量α-发射体。
在一个实施方案中，效应部分是这样的脂质体，其包封药物(例如抗癌药物，如abraxane、阿霉素、帕米膦酸二钠、阿那曲唑、依西美坦、环磷酰胺、表柔比星、托瑞米芬、来曲唑、曲妥珠单抗、甲地孕酮三苯氧胺(megestroltamoxifen)、紫杉醇、多西他赛、卡培他滨、乙酸戈舍瑞林、唑来膦酸、长春碱等)、刺激结合的细胞被免疫系统的组分识别的抗原、特异性结合免疫系统组分并将其指向细胞的抗体等。
在一个实施方案中，效应部分可以包含辐射致敏剂，其增强电离辐射对细胞的细胞毒性效应(例如，如可能由60Co或X射线源产生)。
在一个实施方案中，效应部分选自单核细胞趋化因子、或f-Met-Leu-Phe(fMLP)、或f-Met-Leu-Phe-o-甲基酯、或甲酰基-正亮氨酰-苯丙氨酸、或甲酰基-甲硫氨酰-苯丙氨酸、或其衍生物。
在一个实施方案中，效应部分是反应基团。
反应基团可以选自任何已知的反应基团，像氨基、巯基、羧酸酯、羟基、叠氮基、炔基(Alkinyl)或烯基。
在一个实施方案中，反应基团选自马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、二硫代吡啶基、硝基苯酯、六氟苯酯。
如果作用方式依赖于在靶标上产生高局部浓度的效应物，像在fMLP作为效应部分的情况下，接头实体的L-DNA性质允许与用相同或不同效应部分修饰的第二个L-DNA寡核苷酸特异杂交。
必须限制结合第二个L-DNA的效应部分的数量，以便单个效应物修饰的L-DNA不诱导应答。若需要，第二个L-DNA包含其他位点，其能够特异地与利用相同或不同效应部分修饰的第三个L-DNA寡核苷酸杂交。因为可以容易地选择在存在其他双链体的情况下特异地形成双链体的许多不同序列，可以容易地累积多聚体复合体。
可以使用具有重叠序列的寡核苷酸建立多聚体复合体，以形成线性多聚体复合体，或通过使用分支的寡核苷酸建立多聚体复合体，其中所述分支能够与第三个寡核苷酸杂交，导致树状多聚体复合体的形成。
在一个实施方案中，效应部分是α发射体，即发射α粒子的放射性同位素。合适的α发射体包括，但不限于Bi、213Bi、211At等。
效应部分还可以包含配体、表位标签、抗体Fc区或抗体。
酶促活性的毒素及其片段可以选自白喉毒素A片段、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-sacrin、某些油桐(Aleurites fordii)蛋白质、某些石竹素蛋白质、美洲商陆(Phytolaccaamericana)蛋白质、某些香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAP、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Morodica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝裂吉菌素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素。
在一个实施方案中，用高密度笼住的效应部分修饰的一个或多个L-DNA寡核苷酸与L-DNA接头杂交。
癌细胞在许多方面与正常细胞不同，其中之一是细胞表面的分子组成。改变的表面化学允许癌细胞对生长和存活的外部信号有效应答并且直接与多种宿主组织元件相互作用以迁移、进入循环、外渗物，并移居到远端位点上。除了充当恶性细胞的标志物，肿瘤细胞表面分子是用于治疗的有价值靶标，这是由于其相对容易地进入向血流或细胞外间隙施用的靶向分子(Feng，A.，等，Mol.Cancer Ther.7(2008)569-578)。
涵盖的肿瘤特异性抗原包括，但不限于CEA、CD20、HER1、HER2/neu、HER4、PSCA、PSMA、CA-125、CA-19-9、c-Met、MUC1、RCAS1、Ep-CAM、Melan-A/MART1、RHA-MM、VEGF、EGFR、整联蛋白、纤连蛋白的ED-B、ChL6、Lym-1、CD1b、CD3、CD5、CD14、CD20、CD22、CD33、CD56、TAO-72、白细胞介素-2受体(IL-2R)、铁蛋白、神经细胞粘着分子(NCAM)、黑色素瘤相关抗原、神经节苷脂Gm、EOF受体、腱糖蛋白、c-Met(HGFR)。
在一个实施方案中，抗体特异性结合细胞表面受体上的翻译后修饰的靶标。在一个实施方案中，通过磷酸化或糖基化修饰翻译后的靶标。
在一个实施方案中，第一个多肽和第二个多肽结合相同的或重叠的表位。
已经发现，可以通过由特异性结合靶标的两个单价多肽组成的复合体检测翻译后修饰的靶标多肽，所述单价多肽经由多核苷酸接头彼此连接，其中所述第一个多肽结合靶标的多肽表位，所述第二个多肽结合翻译后多肽修饰，其中每个单价结合物具有10-2/sec-10-3/sec的Kdiss，并且其中复合体具有10-4/sec或更小的Kdiss。
不同类型的共价氨基酸修饰是已知的。例如Mann和Jensen(2003)以及Seo和Lee(2004)报道的翻译后修饰由此包括在内作为参考(Mann，M.和Jensen，O.N.，Biochemistry 21(2003)255-261；Seo，J.和Lee，K.-J.，Biochemistry and Molecular Biology 37/1(2004)35-44)。
在一个实施方案中，翻译后修饰选自乙酰化、磷酸化、酰化、甲基化、糖基化、泛素化、SUMO化、硫酸化和硝化。
乙酰化(+42Da分子量改变)是特别稳定的二级修饰。实例是在许多蛋白质N-末端上发现的乙酰化或赖氨酸或丝氨酸残基上的乙酰化。一般地，在多肽链内一个或多个充分定义的位置上发现赖氨酸残基的乙酰化，而其他赖氨酸残基较少地被乙酰化或根本不被乙酰化。
已知蛋白质的磷酸化和脱磷酸化(其净平衡可以被称为磷酸化状态)是调节蛋白质生物活性中的关键元件之一。低百分比的磷酸化氨基酸残基早已可以足以触发某些生物活性。磷酸化导致质量增加80Da(分子量增加)。氨基酸酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)可以被磷酸化。多肽的生物学功能越复杂，磷酸化可能位点的相应模式越复杂。这对膜结合的受体，尤其是所谓的受体酪氨酸激酶(RTKs)尤其已知并且正确。因为命名法早已提示，RTKs的至少部分细胞内信号传递由该RTKs的细胞内结构域的某些酪氨酸的磷酸化状态介导。
多肽可以被法呢基、肉豆蔻酰或棕榈酰基团酰化。酰化一般发生在半胱氨酸残基的侧链上。
甲基化作为二级修饰经由赖氨酸残基的侧链发生。已经显示，能够结合核酸的调节蛋白质的结合性质可以例如经甲基化被调节。
糖基化是常见的二级修饰。其对蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质的增溶作用、其稳定性也具有重要影响。两种不同类型的糖基化是已知的：N-连接的(经由氨基酸N(天冬酰胺))侧链和O-连接的侧链(经由丝氨酸(S)或苏氨酸(T))。已经鉴定了许多不同的多糖(线性的或具有分支的侧链)，其中一些含有糖衍生物像O-Glc-NAc。
已知泛素化和SUMO化分别影响蛋白质在循环中的半衰期。泛素化可以充当破坏信号，导致泛素化的多肽的切割和/或去除。
经由酪氨酸残基(Y)的硫酸化看起来在调节蛋白质-蛋白质(细胞-细胞)相互作用以及蛋白质配体-相互作用中是重要的。
酪氨酸残基(Y)的硝化看起来是例如炎症过程中氧化损伤的标志。
可以根据文献制备L-脱氧核苷亚磷酰胺单位L-dT、L-dC、L-dA和L-dG(参见例如Urata，H.，等，Nucl.Acids Res.20(1992)3325-3332；Shi，Z.D.，等，Tetrahed.58(2002)3287-3296)。可以从L-阿拉伯糖通过8个步骤合成L-脱氧核糖衍生物。可以通过L-脱氧核糖衍生物糖基化适当的核碱基衍生物来获得L-脱氧核苷。衍生成核苷亚磷酰胺后，它们可以通过固相DNA合成方法掺入到寡脱氧核苷中。可以通过反相HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化寡聚物。
可以通过使用标准合成方案大规模合成L-DNA，像DNA。
为了表达和纯化scFv抗体片段，可以将编码scFv的核酸克隆到表达和/或分泌载体中，如pUC119mycHis，其可以导致在scFv的C-末端添加c-myc标签和六组氨酸标签。为了产生(scFv')2二聚体用于免疫组织化学(Adams，G.P.，等，Cancer Res.53(1993)4026-4034)，可以从pUC119mycHis上遗传去除c-myc表位标签，并且可以在六组氨酸标签前面的scFv的C-末端引入游离的半胱氨酸。可以从细菌周质收集scFv或(scFv')2二聚体蛋白质并通过固定的金属亲和层析和凝胶过滤进行纯化(Nielsen，U.B.，等，Biochim.Biophys.Acta 1591(2002)109-118)。
或者，可以通过引入编码scFvs的结构基因(在其C-末端赋予c-myc和六组氨酸标签的表达载体)产生scFvs(Liu，B.，等，Cancer Res.64(2004)704-710)。为了产生可溶性的(scFv)2，第二个载体可以用于在C-末端赋予半胱氨酸和六组氨酸标签。IPTG诱导后，可以在氮川三乙酸-镍珠上从细菌周质空间纯化抗体片段。为了FACS和免疫组织化学研究，可以使用EZ-连接磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)根据制造商的说明书将scFvs生物素化。
对于解离常数(KD)测定，表达各靶标表面分子的细胞系可以在合适的培养基，如补充有10％FCS的RPMI 1640中生长至90％汇合。可以通过2mmol/l EDTA/PBS中的胰蛋白酶(0.2％)短暂消化来收集细胞。生物素化的scFvs可以与105个细胞在PBS/0.25％牛血清白蛋白中在4℃下温育4小时。可以通过链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白检测结合的scFvs并通过FACS进行分析。可以曲线拟合数据并使用GraphPad Prism(Graph-PadSoftware)计算KD值。
对于免疫组织化学，可以使用来自冰冻和/或石蜡包埋块的组织切片。对于免疫组织化学分析，组织切片可以与纯化的二聚体scFv(例如在2％乳/PBS中50μg/ml)在4℃下温育4小时，用PBS进行洗涤，与1:400稀释的抗(His)6抗体(Santa Cruz Biotechnology)温育，随后与1:400稀释的生物素化的抗-抗(His)6抗体抗体(Vector Lab)和1:400稀释的辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Sigma)温育。可以使用二氨基联苯作为底物(Sigma)检测结合。
或者，可以用生物素化的scFvs(250nmol/l)在室温下染色测试和对照组织的冰冻切片1小时。通过FACS不结合测试细胞系的scFv可以用作所有实验的对照。可以通过链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶，使用3，3'-二氨基联苯底物检测结合的scFvs。可以用苏木精负染染色的组织，在70％、95％和100％乙醇中干燥，包埋并分析。
关于免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)用于检测HER2过表达和扩增，特别参见US 2003/0152987(通过参考并入本文)。
对于内化的测定，可以使用以下方法。对于荧光显微术实验，细胞可以在24孔板中生长至约80％汇合并与1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青-5，5'-二磺酸标记的非靶向或靶向复合体在37℃下共温育4小时。然后用PBS洗涤细胞并用Nikon Eclipse TE300荧光显微镜检查。对于FACS分析，细胞与1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青-5，5'-二磺酸标记的复合体在37℃下温育2小时，通过胰蛋白酶消化从平皿中取出，在室温下暴露于甘氨酸缓冲液(pH 2.8；150mmol/lNaCl)中5分钟，以取出表面结合的脂质体，并通过FACS(LSRII；BDBiosciences)分析。平均荧光强度值可以用于计算内化的脂质体(对甘氨酸处理具有抗性)占总的细胞结合脂质体(在甘氨酸处理之前)的百分比。
对于生长抑制和内化测定，约30％-80％汇合的癌细胞可以与多种浓度的亲和纯化的复合体在含有1％FCS的培养基中在37℃下温育72小时。可以使用四唑盐3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑测定(Promega)评估生长状态并可以使用KaleidaGraph 3.5(SynergySoftware)计算IC50。对于内化测定，可以用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)将复合体生物素化并将其与靶标细胞在37℃下温育大量时间。可以用100mM甘氨酸缓冲液(pH 2.8)洗涤细胞，用2％甲醛固定，用冰冷的100％的甲醇透化，并与链霉抗生物素蛋白-FITC温育。可以首先用Axiophot荧光显微镜(Zeiss)检查染色的细胞，并用Leica TCS NT共聚焦激光荧光显微镜(Leica)进一步研究。
对于毒性测定，细胞可以在96孔板中以6，000/孔进行平板培养并与多种浓度(0-10μg/ml)的如本文报道的复合体在37℃下温育2小时。去除复合体后，细胞可以用补充有10％FCS的RPMI 1640洗涤一次并在37℃下温育额外的70小时。可以使用Cell Counting Kit-8(Dojindo)根据制造商的说明书测定细胞活力。数据可以表示为活力细胞与未处理对照细胞相比的百分比。
对于体外细胞毒性测定，可以将癌细胞接种在96孔板中(对于例如PC3和Du-145细胞，6，000个细胞/孔，或对于例如LNCaP细胞，10，000个细胞/孔)并且将其与如本文报道的复合体(0-10μg/ml)在37℃下温育4小时。可以用补充的RPMI 1640洗涤细胞两次以去除药物并将其与新鲜的培养基在37℃下温育额外的72小时。可以使用(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑染色测定细胞活力(Carmichael，J.，等，Cancer Res.47(1987)936-942)，并且可以使用微量滴定板读出器(SpectraMax 190，Molecular Devices)在570nm处读取结果。可以使用Cell counting kit-8(Dojindo)根据制造商的说明书测定细胞活力。
对于细胞内递送的测定，可以使用以下方法。为了评估细胞内复合体递送，可以向细胞中加入复合体与1μg/ml纯化的(His)6-标记的scFv，在37℃下温育30分钟，并用含有1mM EDTA的盐水洗涤3次，以去除不能被内化的细胞表面结合的复合体。可以利用Gemini显微荧光计(Molecular Devices)显微荧光测定和通过倒置荧光显微镜(Nikon)测定复合体的吸收。
重组方法和组合物
一般地，可以使用例如US 4，816，567描述的重组方法和组合物产生结合实体，如抗体片段或结合对的成员。
在一个实施方案中，提供编码如本文报道的复合体的每个结合实体的分离的核酸。
该核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)和/或结合对成员的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供包含该核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，提供这样的宿主细胞，其包含(例如已经被以下转化)：(1)包含这样的核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含这样的核酸的第一个载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含这样的核酸的第二个载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5，648，237、US 5，789，199和US 5，840，523；Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷，B.K.C.Lo，(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ，(2004)第245-254页。表达后，可以从细菌细胞沉淀中分离可溶级分中的抗体并可以进一步纯化。
除了原核细胞，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主(参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2003)1409-1414)，和Li，H.，等，Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
植物细胞培养物也可以用作宿主(参见例如，US 5，959，177、US 6，040，498、US 6，420，548、US 7，125，978和US 6，417，429)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系、人胚肾系(HEK 293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利细胞(例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、水牛鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)、例如Mather，J.P.，等，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的TRI细胞、MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)，和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
可以在多种培养基中培养用于产生如本文报道的复合体的多肽的宿主细胞。商品化的培养基，如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma)，RPMI-I640(Sigma)和Dulbecco's改良的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，在Ham，R.G.，等，Meth.Enzymol.58(1979)44-93，Barnes，D.，等，Anal.Biochem.102(1980)255-270、US 4，767，704、US 4，657，866、US 4，927，762、US 4，560，655、US 5，122，469、WO 90/03430、WO 87/00195和US Re 30，985中描述的任何培养基均可以用作宿主细胞的培养基。必要时可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为一般以微摩尔范围的终浓度存在的无机组分)和葡萄糖或等同能源补充任何这些培养基。还可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必需补充物。培养条件，如温度、pH等是被选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
当使用重组技术时，结合实体/多肽可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生多肽，那么作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)。例如，Carter，P.，等，Bio/Technology 10(1992)163-167描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间中的抗体的方法。简言之，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的情况下将细胞沉淀解冻超过约30分钟。通过离心去除细胞碎片。当多肽分泌到培养基中时，一般首先使用商品化的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤设备浓缩来自该表达系统的上清液。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以防止外来污染物的生长。可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的多肽组合物，其中亲和层析是用于抗体的优选纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和亚类。蛋白A可以用于纯化基于人γl、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark，R.，等，J.Immunol.Meth.62(1983)1-13)。为所有小鼠亚类和人γ3推荐蛋白G(Guss，B.，等，EMBO J.5(1986)1567-1575)。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但其他基质也是可用的。机械稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许比利用琼脂糖实现的流速更快和处理的时间更短。其中抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ，USA)用于纯化。根据待回收的抗体，还可用用于蛋白质纯化的其他技术，如在离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
任何初步纯化步骤之后，包含目的多肽和污染物的混合物可以使用pH约为2.5-4.5的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用层析，尤其在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
可以如期望地分离并纯化如本文报道的复合体及其各自的组分。其中形成复合体的反应混合物的不想要组分是例如不以想要的复合体结束但组成其结构单元的多肽和多核苷酸。在一个实施方案中，如通过分析性小大排阻层析测定，将复合体纯化到大于80％纯度。在一些实施方案中，如通过分析性小大排阻层析测定，分别将复合体纯化到以重量计大于90％、95％、98％或99％纯度。或者在蛋白质检测中，例如可以例如通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE，使用例如考马斯蓝或银染容易地测定纯度。如果在复合体水平上评估纯度，大小排阻层析可以应用于从副产物中分离复合体并监测260nm的OD以评估其纯度。
免疫缀合物
本文还提供了复合体，其中特异性结合靶标或接头的至少一个结合实体进一步缀合一个或多个效应部分，例如细胞毒性剂，如化学治疗剂或化学治疗药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施方案中，效应部分是药物，包括但不限于maytansinoid(参见US 5，208，020、US 5，416，064、EP 0425235)、阿里他汀，如单甲基阿里他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF，参见US 5，635，483、US 5，780，588、US 7，498，298)、多拉司他汀、加利车霉素或其衍生物(参见US 5，712，374、US 5，714，586、US 5，739，116、US 5，767，285、US 5，770，701、US 5，770，710、US 5，773，001、US 5，877，296、Hinman，L.M.，等，Cancer Res.53(1993)3336-3342，Lode，H.N.，等，Cancer Res.58(1998)2925-2928)、蒽环类抗生素，如道诺霉素或阿霉素(参见Kratz，F.，等，Current Med.Chem.13(2006)477-523，Jeffrey，S.C.，等，Bioorg.Med.Chem.Letters 16(2006)358-362，Torgov，M.Y.，等，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721，Nagy，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834，Dubowchik，G.M.，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.12(2002)1529-1532，King，H.D.，等，J.Med.Chem.45(2002)4336-4343和US 6，630，579)、氨甲喋呤、长春地辛、紫杉烷如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、tesetaxel和ortataxel、单端孢霉烯和CC1065。
在一个实施方案中，效应部分是酶促活性的毒素或其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒素、油桐蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAPS)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、多花白树毒蛋白、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
在一个实施方案中，效应部分是放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212，和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如Tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(还称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，如再次I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、钆、锰或铁。
效应部分可以使用多种双功能性蛋白质偶联剂缀合如本文报道的复合体的任何组分，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸盐酸)、活性酯类(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮组分(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)-乙烯二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)，和双活性氟组分(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta，E.S.，等，Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫球蛋白。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合到复合体上的示例性螯合剂(参见WO 94/11026)。用于将毒素部分缀合到如本文报道的复合体上的接头可以是利于在细胞中释放细胞毒素药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感的接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari，R.V.，等，Cancer Res.52(1992)127-131，US 5，208，020)。
效应部分可以缀合到如本文报道的复合体的化合物上，但不限于用交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其是商品化的(例如来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
药物制剂
通过混合具有想要程度的纯度的该多特异性结合分子与一种或多种任选的药学上可接受的载体来制备如本文报道的多特异性结合分子(如双特异性抗体)的药物制剂(Osol，A.(编辑)，Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Mack Publishing Company(1980))，其为冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度上对接受者一般是无毒的，并且包括，但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、烷基对羟苯甲酸酯如对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白、亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸、单糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精、螯合剂如EDTA、糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的平衡离子如钠、金属络合物(例如Zn-蛋白质金属络合物)，和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质性药物分散剂，如可溶性的中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGPs和使用方法，包括rHuPH20。一方面，sHASEGP与一种或多种额外的glycosaminoglycanases，如软骨素酶组合。
在US 6，267，958中描述了示例性冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括在US 6，171，586和WO 2006/044908中描述的那些，后一种制剂包括组氨酸乙酸盐缓冲液。
本文的制剂还含有多于一种活性成分，必要时用于所治疗的特定适应症，尤其是具有不彼此负面影响的互补活性的那些成分。此类活性成分以对预期目的有效的量组合适当地存在。
活性成分可以包裹在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳颗粒和纳胶囊)中的羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊或大乳剂。在Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980)中公开了此类技术。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
待用于体内施用的制剂一般是无菌的。例如通过无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
治疗方法和组合物
如本文报道的任何多特异性结合分子(例如双特异性抗体)可以用于治疗方法中。
一方面，提供如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体用作药物。另一方面，提供多特异性结合分子或双特异性抗体用于治疗癌症。在某些实施方案中，提供多特异性结合分子或双特异性抗体用于治疗方法中。在某些实施方案中，本发明提供多特异性结合分子或双特异性抗体用于治疗患有癌症的个体的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的多特异性结合分子或双特异性抗体。在一个该实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”尤其是人。
本文的其他方面提供如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗癌症。在其他实施方案中，所述药物用于治疗癌的方法中，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的药物。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在如本文报道的其他方面，提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有该癌症的个体施用有效量的如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在如本文报道的其他方面，提供包含如本文提供的任何多特异性结合分子或双特异性抗体的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何多特异性结合分子或双特异性抗体和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，药物制剂包含如本文报道的任何多特异性结合分子或双特异性抗体和至少一种额外的治疗剂。
如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体可以单独或与其他物质在治疗中组合使用。例如，如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。
上文指出的此类组合疗法包括组合施用(其中两种或多种治疗剂包括在相同的或单独的制剂中)，和单独施用，在该情况中，施用本发明的多特异性结合分子或双特异性抗体可以发生在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后。如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体还可以与放射性疗法组合使用。
可以通过任何合适的手段，包括肠胃外、肺内和鼻内施用如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体，并且需要时用于局部治疗、损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以是任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，其部分取决于施用是暂时的还是长期的。本文涵盖包括但不限于在多个时间点上的单次或多次施用、快速浓注施用，和脉冲输注的多种给药方案。
可以以与良好医学实践一致的方式配制、给药和施用如本文报道的多特异性结合分子和双特异性抗体。在该上下文中考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、物质的递送位点、施用方法、施用方案，和医学实践者已知的其他因素。多特异性结合分子或双特异性抗体不必，但任选地与目前用于预防或治疗正在讨论的病症的一种或多种物质配制。此类其他物质的有效量取决于制剂中存在的多特异性结合分子或双特异性抗体的量、病症或治疗的类型，和上文讨论的其他因素。一般以上文所述的相同剂量和施用途径，或本文所述约1％-99％的剂量，或根据经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用这些。
对于疾病的预防或治疗，如本文报道的多特异性结合分子或双特异性抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、多特异性结合分子或双特异性抗体的类型、疾病的严重性和病程、多特异性结合分子或双特异性抗体是为预防目的施用还是治疗目的施用、先前的疗法、患者的临床史和对多特异性结合分子或双特异性抗体的应答，和主治医师的判断。多特异性结合分子或双特异性抗体适当地向患者一次施用或在一系列治疗中施用。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的多特异性结合分子或双特异性抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。一次典型的日用剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更高的范围内，其取决于上文提及的因素。对于若干天或更长时间内的重复施用，根据条件，治疗一般可以持续直至出现想要的疾病症状抑制。多特异性结合分子或双特异性抗体的一次示例性剂量可以在约0.05mg/kg-约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用一次或多次约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的剂量。可以间隔地，例如每周或每三周施用该剂量(例如，从而患者接受约二次到约二十次，或例如约六次剂量的多特异性结合分子或双特异性抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后是一次或多次较低的剂量。可以通过常规技术和测定容易地监测该疗法的进程。
制成品
在如本文报道的一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上文所述病症的材料的制成品。制成品包含容器和容器上面或结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。可以从多种材料如玻璃或塑料形成容器。容器保存单独或与有效治疗、预防和/或诊断状况的另一种组合物组合的组合物，并可具有无菌入口(例如，该容器可以是静脉溶液带或具有皮下注射针头可穿透的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文报道的复合体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选的状况。此外，制成品可包含(a)其中含有组合物的第一个容器，其中所述组合物包含如本文报道的复合体；和(b)其中含有组合物的第二个容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施方案中的制成品可进一步包含包装插页，其说明所述组合物可用于治疗特定状况。或者，或此外，制成品可进一步包含第二个(或第三个)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、格林液和葡萄糖溶液。其还包括从商业和用户立场出发想要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
提供以下实施例、图和序列，以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中给出。应理解，可以在所示方法中进行修饰，但不背离本发明的精神。
序列
SEQ ID NO:01 VH(mAb 1.4.168)
SEQ ID NO:02 VL(mAb 1.4.168)
SEQ ID NO:03 VH(mAb 8.1.2)
SEQ ID NO:04VL(mAb 8.1.2)
SEQ ID NO:05 17mer ss-DNA(5’末端共价结合抗肌钙蛋白T MABa的FAB’并且FAB’1.4.168共价结合IGF-1R)
SEQ ID NO:06 19mer ss-DNA(3’末端共价结合抗肌钙蛋白T MABb的FAB’并且FAB’8.1.2共价结合磷酸化的IGF-1R)SEQ ID NO:07 互补的19mer ss-DNA(用作接头的一部分)
SEQ ID NO:08 互补的17mer ss-DNA(用作接头的一部)
SEQ ID NO:09 抗肌钙蛋白抗体a的表位“A”
SEQ ID NO:10 抗肌钙蛋白抗体b的表位“B”
SEQ ID NO:11 IGF-1R(1340-1366)
SEQ ID NO:12 hInsR(1355-1382)
SEQ ID NO:13 35-mer L-DNA多核苷酸接头
SEQ ID NO:14 75-mer L-DNA多核苷酸接头
SEQ ID NO:15 95-mer L-DNA多核苷酸接头
SEQ ID NO:16 4D5FAB’重链氨基酸序列
SEQ ID NO:17 4D5FAB’轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:18 2C4FAB’重链氨基酸序列
SEQ ID NO:19 2C4FAB’轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:20 ErbB2的胞外域(ECD)内的残基22-645
SEQ ID NO:21 5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-XXX-Y-Z-3’，其中X＝经由亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)引入的丙烯磷酸酯，其中Y＝经由(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入的5'-氨基修饰剂C6，并且其中Z＝经由磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)引入的4[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基。
SEQ ID NO:22 5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’，其中X＝经由亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(GlenResearch)引入的丙烯磷酸酯，其中Y＝经由(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入的5'-氨基修饰剂C6，并且其中Z＝经由磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)引入的4[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基。
SEQ ID NO:23 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T(生物素-dT)-GG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:24 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T TTTTT-(生物素-dT)-TTTTT GG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:25 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC TTTTTTTTTTTTTTTT-(生物素-dT)-TTTTTTTTTTTTTTT GG ACG ACG ATA GAACT-3'.
SEQ ID NO:26 抗-HER2抗体4D5重链可变域
SEQ ID NO:27 VH CDR1
SEQ ID NO:28 VH CDR2
SEQ ID NO:29 VH CDR3
SEQ ID NO:30 抗-HER2抗体4D5重链可变域
SEQ ID NO:31 VL CDR1
SEQ ID NO:32 VL CDR2
SEQ ID NO:33 VL CDR3
SEQ ID NO:34 抗-HER2抗体2C4重链可变域
SEQ ID NO:35 VH CDR1
SEQ ID NO:36 VH CDR2
SEQ ID NO:37 VH CDR3
SEQ ID NO:38 抗-HER2抗体2C4轻链可变域
SEQ ID NO:39 VL CDR1
SEQ ID NO:40 VL CDR2
SEQ ID NO:41 VL CDR3
SEQ ID NO:42 5`-X-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-ZZZ-Y-；X＝荧光素Y＝C7氨基接头Z＝C3间隔区
SEQ ID NO:43 5`-X AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-ZZZ-Y-；X＝Cy5Y＝C7氨基接头Z＝C3间隔区
SEQ ID NO:44 5`-X-ZZZ-AGT TCT ATC GTC GTC CA-Y-3`；X＝氨基接头Y＝荧光素Z＝C3间隔区
SEQ ID NO:45 5`-X-(AGT CTA TTA ATG CTT CTG C)-(ZZZ)-y-；X＝荧光素Y＝C7氨基接头Z＝C3间隔区
SEQ ID NO:46 5`-X-(ZZZ-(AGT TCT ATC GTC GTC CA)-Y-3`；X＝氨基接头Y＝荧光素Z＝C3间隔区
SEQ ID NO:47 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-TGG ACGACG ATA GAA CT-3’
SEQ ID NO:48 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T40)-TGGACG ACG ATA GAA CT-3‘
SEQ ID NO:49 5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(生物素-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:50 5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T5-(生物素-dT)-T5-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:51 5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(生物素-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:52 5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T30-(生物素-dT)-T30-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:53 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(生物素-dT)-T5TG GAC GAC GAT AGA ACT-3'
SEQ ID NO:54 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T10-(生物素-dT)-T10TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:55 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(生物素-dT)-T15TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:56 5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T20-(生物素-dT)-T20TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:57 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-间隔区C18-(生物素-dT)-间隔区C18-TGG ACG ACG ATA GAACT-3'
SEQ ID NO:58 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔区C18)2-(生物素-dT)-(间隔区C18)2-TGG ACG ACGATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:59 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔区C18)3-(生物素-dT)-(间隔区C18)3-TGG ACG ACGATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:60 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔区C18)4-(生物素-dT)-(间隔区C18)4-TGG ACG ACGATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:61 5`-G CAG AAG CAT TAA TAGACT-T20-(Dig-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAACT-3'
SEQ ID NO:62 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(Dig-dT)-TGGACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:63 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(生物素-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:64 YPYDVPDYA
SEQ ID NO:65 GLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID NO:66 SGGGS
SEQ ID NO:67 f-Met-Leu-Phe(fMLP)
SEQ ID NO:68 f-Met-Leu-Phe-o-甲酯
SEQ ID NO:69 IgG1恒定域
SEQ ID NO:70 IgG2恒定域
SEQ ID NO:71 IgG4恒定域
SEQ ID NO:72 Cy5-Y-ATG CGA-GTA CCT TAG AGT C-Z-Cy5
SEQ ID NO:73 5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-GACTCT AAG GTA CTC GCA T-T20-TGG ACG ACGATA GAA CT-3'
SEQ ID NO:74 分选酶标签
SEQ ID NO:75 结合对成员寡核苷酸
SEQ ID NO:76 L-DNA接头
附图
图1BIAcore测定设置的方案。ss-L-DNA-双接头呈现在BIAcore SA传感器上。流动室1充当对照(未显示)。
图2HER2-ECD与ss-D-DNA标记的FAB片段相互作用的BIAcore传感图。
图3BIAcore传感图，显示了包含35-mer(＝35个核苷酸长度)作为接头多核苷酸的如本文报道的复合体与HER2-ECD的浓度依赖性相互作用测定。
图4BIAcore传感图，显示了包含75-mer(＝75个核苷酸长度)作为接头多核苷酸的如本文报道的复合体与HER2-ECD的浓度依赖性相互作用测定。
图5BIAcore传感图，显示了包含95-mer(＝95个核苷酸长度)作为接头多核苷酸的如本文报道的复合体与HER2-ECD的浓度依赖性相互作用测定。
图6BIAcore测定设置的方案：多克隆山羊抗人IgG-Fcγ抗体呈现在BIAcore SA传感器上。流动室1充当对照(未显示)。
图7BIAcore传感图显示了50nM注射抗-HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA(2C4)、抗-HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA(4D5)和通过75mer ss-L-DNA接头连接的完全建立的复合体(2C4-75mer-4D5)后相互作用信号的叠加图。
图8BIAcore传感图，其显示完全建立的75-mer复合体作为分析物在溶液中与表面呈递的huFc嵌合体HER2ECD相互作用的浓度依赖性测定的叠加图。
图9图8的响应水平相对于完全建立的复合体的分析物浓度的图。
图10评估抗pIGF1-R复合体装配效率的分析性凝胶过滤实验。图表a、b和c显示了各复合体组分(荧光素-ss-FAB’1.4.168，Cy5-ssFab’8.1.2和接头DNA(T＝0))的洗脱谱。图表d显示了形成二价结合剂所需要的3个组分已经以1:1:1摩尔比例混合后的洗脱谱。较粗(底部)曲线代表280nm处的吸光度，表明分别存在ss-FAB’蛋白质或接头DNA。b)和d)中较细的上部曲线(495nm处的吸光度)表明Cy5的存在并且a)中较细的上部曲线和d)中中间的曲线(635nm处的吸光度)表明荧光素的存在。单一复合体组分(VEssFab’1.4.168～15ml；VEssFab’8.1.2～15ml；VElinker～16ml)的洗脱体积与反应混合物(VEmix～12ml)的洗脱体积的比较证明，复合体装配反应是成功的(产率：～90％)。代表洗脱复合体的280nm的主峰恰好与495nm和695nm通道中的主峰重叠，证实了ss-FAB’8.1.2和ssFab’1.4.168在代表二价结合剂的峰中的存在。
图11BIAcore实验的方案：图示和示例性地显示溶液中的两个结合分子。T＝0-Dig，二价结合剂和T＝40-Dig，二价结合剂。这两个二价结合剂仅在接头长度上不同(没有额外的T相对于40个额外的Ts，分隔两条杂交核酸序列)。此外，使用ss-FAB’片段8.1.2和1.4.168。
图12与100nM ss-FAB 1.4.168或100nM ss-FAB 8.1.2和同一肽的结合特征相比，具有显示100nM二价结合剂(由在T40-Dig ss-DNA-接头上杂交的ss-FAB 8.1.2和ss-FAB 1.4.168组成)与固定的肽pIGF-1R的相互作用的三种动力学的叠加图的BIAcore传感图。仅利用复合体构建体获得最强的结合性能，这清楚地显示复合体的协同结合作用相对于靶标肽pIGF-1R增加了亲和力。
图13具有显示二价结合剂(由在T40-Dig ss-DNA-接头上杂交的ss-FAB 8.1.2和ss-FAB 1.4.168组成)与固定的肽pIGF-1R(磷酸化的IGF-1R)、IGF-1R或IR(磷酸化的胰岛素受体)的相互作用的三种动力学的叠加图的BIAcore传感图。利用pIGF-1R肽获得最强的结合性能，这清楚地显示与例如磷酸化的胰岛素受体肽(IR)相比，复合体的协同结合作用相对于靶标肽pIGF-1R增加了特异性。
图14具有显示100nM二价结合剂(由在T40-Dig ss-DNA-接头上杂交的ss-FAB 8.1.2和ss-FAB 1.4.168组成)与没有接头DNA的100nMss-FAB’8.1.2和100nM ss-FAB’1.4.168的混合物的相互作用两种动力学的叠加图的BIAcore传感图。仅利用二价结合剂才获得最佳的结合性能，然而没有接头的ss-FAB’s的混合物不显示可观察的协同结合作用，尽管这些ss-FAB’s的总浓度已经是200nM的事实。
图15BIAcore夹层测定的概要图。该测定已经用于研究两种抗体对磷酸化IGF-1R肽的表位可及性。<MIgGFcy>R呈现用于捕获鼠类抗体M-1.4.168的兔抗小鼠抗体。M-1.4.168然后用于捕获pIGF-1R肽。M-8.1.2最终形成由M-1.4.168、肽和M-8.1.2组成的夹层。
图16显示在BIAcore芯片上被抗体1.4.168捕获后二级抗体8.1.2与pIGF-1R肽的结合信号(粗线)的BIAcore传感图。其他信号(细线)是对照信号：分别给出了具有500nM 1.4.168、500nM靶标不相关抗体<CKMM>M-33-IgG；和500nM靶标不相关对照抗体<TSH>M-1.20-IgG的同源对照的线。在任何这些对照中没有检测到结合事件。
图17BIAcore测定的概括图，其在传感器表面上呈现复合体。在流动室1(＝FC1)(未显示)上，捕获氨基-PEO-生物素。在FC2、FC3和FC4上固定具有增加接头长度的二价结合剂。分析物1：含有M-1.4.168ss-FAB表位(细线)-M-8.1.2ss-FAB磷酸表位的IGF-1R肽不存在，因为该肽不是磷酸化的；分析物2：含有M-8.1.2ss-FAB磷酸表位(P)和M-1.4.168ss-FAB表位(细线)的pIGF-1R肽。分析物3：pINR肽，其含有交叉反应的M-8.1.2ss-FAB磷酸表位，但不是M-1.4.168的表位。
图18复合体实验的动力学数据。具有ss-FAB 8.1.2和ss-FAB 1.4.168的T40-bi复合体当与pINR(KD＝3.70E-02)相比时，显示相对于pIGF-1R低1300倍的解离速率(KD＝2.79E-05/s)。
图19BIAcore传感图，其显示T40-bi复合体相对于pIGF-1R肽(磷酸化的IGF-1R肽)的浓度依赖性测定。
图20BIAcore传感图，其显示T40-bi复合体相对于IGF-1R肽(非磷酸化的IGF-1R肽)的浓度依赖性测定。
图21BIAcore传感图，其显示T40-bi复合体相对于pINR肽(磷酸化的胰岛素受体肽)的浓度依赖性测定。
图22利用Cy5标记的和对肿瘤细胞的染色。
图23KPL-4细胞的NIRF成像。
图24KPL-4异种移植物的离体染色。
图25新鲜制备的4D5-95mer-2C4复合体的大小排阻谱。上边的信号：260nm信号，下边的信号：280nm信号。在0.0分钟开始和5.64分钟的洗脱峰之间没有检测到聚集体。
图26冰冻和解冻循环后4D5-95mer-2C4复合体的大小排阻谱。上边的信号：260nm信号，下边的信号：280nm信号。在0.0分钟开始和5.71分钟的洗脱峰之间没有检测到聚集体。
图27双特异性结合分子的典型层析图(分析性SEC)。
图28在工作流的不同阶段监测抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的LabChip系统(Perkin Elmer)的电泳图。
实施例1
FAB-ss-DNA-缀合物的形成
使用分别在不同的非重叠表位(表位a和表位b)结合人心脏肌钙蛋白T的两个单克隆抗体。这两个抗体均用于目前的Roche ElecsysTM Troponin T测定，其中在夹层免疫测定形式中检测肌钙蛋白T。
使用现有技术蛋白质化学方法进行从培养物上清液中纯化单克隆抗体。
用预先激活的木瓜蛋白酶(抗表位a MAB)或胃蛋白酶(抗表位b MAB)蛋白酶消化纯化的单克隆抗体，产生F(ab')2片段，其随后在37℃被低浓度的半胱胺还原成FAB’-片段。通过在Sephadex G-25柱(GE Healthcare)上从样品的含多肽部分分离半胱胺终止反应。
将FAB’-片段与下文所述的激活的ss-DNAa和ss-DNAb寡核苷酸缀合。
a)抗肌钙蛋白T(表位A)抗体FAB-ss-DNA-缀合物A
为了制备抗肌钙蛋白T<表位a>抗体FAB-ss-DNAa-缀合物A，使用SEQ ID NO:05的衍生物，即5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(＝SEQID NO:5)-XXX-Y-Z-3’，其中X＝经由亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(GlenResearch)引入的丙烯磷酸酯，其中Y＝经由3'-氨基酸修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG(ChemGenes)引入的3’'-氨基酸修饰剂C6，并且其中Z＝经由磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)引入的4[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基。
b)抗肌钙蛋白T(表位B)抗体FAB-ss-DNA-缀合物B
为了制备抗肌钙蛋白T<表位b>抗体FAB-ss-DNAa-缀合物B，使用SEQ ID NO:06的衍生物，即5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTCCA-3’，其中X＝经由亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)引入的丙烯磷酸酯，其中Y＝经由(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入的5'-氨基修饰剂C6，并且其中Z＝经由磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)引入的4[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基。
已经通过本领域寡核苷酸合成方法分别合成了SEQ ID NO:05或06的寡核苷酸。经由Y的氨基基团与Z的琥珀酰亚胺基基团(其在固相寡核苷酸合成方法过程中掺入)反应完成马来酰亚胺基团的引入。
上文显示的单链DNA构建体携带巯基反应性马来酰亚胺基团，其与通过半胱胺处理产生的FAB’铰链区的半胱氨酸反应。为了获得高百分比的单标记的FAB’片段，保持低的ss-DNA与FAB’片段的相对摩尔比例。经由阴离子交换层析(柱：MonoQ，GE Healthcare)发生对单标记的FAB’片段(ss-DNA:FAB’＝1:1)的纯化。通过分析性凝胶过滤层析和SDS-PAGE完成有效标记和纯化的验证。
实施例2
生物素化接头分子的形成
已经通过本领域寡核苷酸合成方法并使用用于生物素化的生物素化亚磷酰胺试剂分别合成了用于ss-DNA接头L1、L2和L3的寡核苷酸。
接头1(＝L1)，没有间隔区的生物素化的ss-DNA接头1具有以下组成：
5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T(生物素-dT)-GG ACG ACGATA GAA CT-3'。其分别包含SEQ ID NO:7和8的ss-DNA寡核苷酸并且通过使用生物素dT(5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯甲酰)-生物素基)-氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)将其生物素化。
接头2(＝L2)，具有10mer间隔区的生物素化的ss-DNA接头2具有以下组成：
5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(生物素-dT)-T5GG ACGACG ATA GAA CT-3'。其分别包含SEQ ID NO:7和8(各自5个胸苷的两个寡核苷酸区段)的ss-DNA寡核苷酸并且通过使用生物素dT(5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯甲酰)-生物素基)-氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)将其生物素化。
接头3(＝L3)，具有30mer间隔区的生物素化的ss-DNA接头2具有以下组成：
5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(生物素-dT)-T15 GGACG ACG ATA GAA CT-3'。其分别包含SEQ ID NO:7和8(各自15个胸苷的两个寡核苷酸区段)的ss-DNA寡核苷酸并且通过使用生物素dT(5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯甲酰)-生物素基)-氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)将其生物素化。
实施例3
分别用于单价肌钙蛋白T结合物a和b的表位
已经解释了合成肽，其各自仅对分别来自抗肌钙蛋白T抗体a和b的相应FAB’-片段具有中等亲和力。
a)抗体a的表位“A”包含在：
SEQ ID NO:9＝ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAE酰胺中，其中U代表β-丙氨酸。
b)抗体b的表位“B”包含在：
SEQ ID NO:10＝SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKE酰胺中，其中O代表氨基-三烷-辛-酸
如技术人员将理解的，可以将这两个含表位的肽以两种方式组合并且已经通过线性组合表位“A”和“B”设计并制备了两个变体。已经通过现有技术肽合成方法分别制备了两个变体的序列，即表位“A”-“B”(＝TnT 1)和“B”-“A”(＝TnT 2)的线性序列。
相比于人心脏肌钙蛋白T序列(P45379/UniProtKB)上的原始表位，已经分别修饰了表位“A”和“B”的序列，以降低对其中每个FAB的结合亲和力。在这些环境中，例如通过BIAcore Technology分析结合亲和力更好地看见异源二价结合作用的动力学。
实施例4
生物分子相互作用分析
对于该实验，在T＝25℃使用具有BIAcore SA传感器装在系统中的BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)。利用3x1分钟注射50mM NaOH中的1M NaCl和1分钟10mM HCl，以100μl/分钟完成预处理。
HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％20用作系统缓冲液。样品缓冲液与系统缓冲液相同。
在控制软件V1.1.1下驱动BIAcore 3000系统。用7RU D-生物素饱和流动室1。在流动室2上，固定1063RU生物素化的ss-DNA接头L1。在流动室3上，固定879RU生物素化的ss-DNA接头L2。在流动室4上，捕获674RU生物素化的ss-DNA接头L3。
然后，注射600nM的FAB片段DNA缀合物A。将900nM的FAB片段DNA缀合物B注射到系统中。以2μl/分钟的流速注射缀合物3分钟。连续注射缀合物，以监测其各接头上每一个FAB片段DNA缀合物的各自饱和信号。利用各接头上呈现的单一的FAB片段DNA缀合物A、单一的FAB片段DNA缀合物B和两个FAB片段DNA缀合物A和B驱动FAB组合。已经通过FAB片段DNA缀合物饱和接头后产生稳定的基线，其是进一步动态测定的前提。
将肽分析物TnT1和TnT2作为溶液中的分析物注射到系统中，以与表面呈现的FAB片段相互作用。
注射500nM TnT1，注射900nM分析物浓度的TnT2。以50μl/分钟注射两种肽4分钟结合时间。监测解离5分钟。在所有流动室上以50μl/分钟的1分钟注射50mM NaOH进行再生。
使用BIAevaluation软件(V.4.1)测定动力学数据。根据线性Langmuir1:1拟合模型测定TnT1和TnT2肽从各自表面存在的FAB片段组合的解离速率KD(1/s)。根据第一级动力学等式:ln(2)/(60*kD)的解计算以分钟计的复合体半衰期。
结果：
分别在表5和6中给出的实验数据证明了相比于单价dsDNA FAB A或B缀合物，分析物(TnT1或TnT2)与多个异源二价FAB-FAB缀合物A-B之间复合体稳定性的分别增加。与第2行和第3行相比，在每个表第1行中看到该效果。
表5：使用具有多种长度接头的TnT1的分析数据
a)接头L1
b)接头L2
c)接头L3
表6：使用具有多种长度接头的TnT2的分析数据
a)接头L1
b)接头L2
c)接头L3
亲和力效果进一步依赖于接头的长度。在表1显示的副表中，30mer的接头L3显示最低的解离速率或最高的复合体稳定性，在表2显示的副表中，10mer的接头L2显示最低的解离速率或最高的复合体稳定性。这些数据一起证明本发明中给出的方法固有的接头长度的灵活性具有最大的实用性和优势。
实施例5
FAB’-ss-DNA-缀合物的形成
使用在不同的非重叠表位A和B上结合人HER2(ErbB2或p185neu)的两种单克隆抗体。第一种抗体是抗HER2抗体4D5(huMAb4D5-8、rhuMab HER2、曲妥珠单抗或参见以其整体并入本文的US 5，821，337)。第二种抗体是抗HER2抗体2C4(Pertuzumab)。
可以使用现有技术蛋白质化学方法进行从培养物上清液中纯化单克隆抗体。
用预先激活的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶蛋白酶消化纯化的单克隆抗体，产生F(ab')2片段。这些随后在37℃被低浓度的半胱胺还原成FAB’-片段。通过在Sephadex G-25柱(GE Healthcare)上从样品的含多肽部分分离半胱胺终止反应。
将所得的FAB’-片段与激活的ss-DNA多核苷酸缀合。
a)抗HER2抗体4D5FAB’-ss-DNA-缀合物
为了制备抗HER2抗体4D5FAB’-ss-DNA-缀合物，使用SEQ ID NO:05的衍生物，即5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(＝SEQ ID NO:05)-XXX-Y-Z-3’，其中X＝经由亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)引入的丙烯磷酸酯，其中Y＝经由(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入的5'-氨基修饰剂C6，并且其中Z＝经由磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)引入的4[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基。
b)抗HER2抗体2C4FAB’-ss-DNA-缀合物
为了制备抗HER2抗体2C4FAB’-ss-DNA-缀合物，使用SEQ ID NO:06的衍生物，即5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’，其中X＝经由亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)引入的丙烯磷酸酯，其中Y＝经由(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入的5'-氨基修饰剂C6，并且其中Z＝经由磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)引入的4[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基。
已经通过现有技术多核苷酸合成方法分别合成了SEQ ID NO:05或SEQ ID NO:06的多核苷酸。经由Y的氨基基团(其在固相多核苷酸合成方法过程中掺入)与磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(ThermoFischer)反应完成马来酰亚胺基团的引入。
单链DNA构建体携带巯基反应性马来酰亚胺基团，其与通过半胱胺处理产生的FAB’铰链区的半胱氨酸反应。为了获得高百分比的单一标记的FAB’片段，保持低的ss-DNA与FAB’片段的相对摩尔比例。经由阴离子交换层析(柱：MonoQ，GE Healthcare)发生对单一标记的FAB’片段(ss-DNA:FAB’＝1:1)的纯化。通过分析性凝胶过滤层析和SDS-PAGE完成有效标记和纯化的验证。
实施例6
生物分子相互作用分析
对于该实验，在T＝25℃使用具有BIAcore SA传感器装在系统中的BIAcore T100仪器(GE Healthcare)。利用3x1分钟注射50mM NaOH，pH8.0中的1M NaCl，随后1分钟注射10mM HCl，以100μl/分钟完成预处理。系统缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％P 20)。样品缓冲液是补充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖)的系统缓冲液。
在各流动室中的SA表面上捕获生物素化的ss-L-DNA接头。用氨基-PEO-生物素(PIERCE)饱和流动室1。
在流动室2上捕获40RU生物素化的35mer寡核苷酸接头。在流动室3上捕获55RU生物素化的75mer寡核苷酸接头。在流动室4上捕获60RU生物素化的95mer寡核苷酸接头。
将250nM抗-HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA注射到系统中3分钟。将300nM抗-HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA以2μl/分钟注射到系统中5分钟。单独或组合注射DNA标记的FAB片段。
作为对照，仅将250nM抗-HER2抗体4D5-FAB'-ss-D-DNA和300nM抗-HER2抗体2C4-FAB'-ss-D-DNA注射到系统中。作为其他对照，注射缓冲液，而非DNA标记的FAB片段。ss-L-DNA标记的FAB片段在各ss-L-DNA双接头上杂交后，将溶液hHER2-ECD中24nM、8nM、3nM、1nM、0.3nM、0nM的不同浓度系列的分析物以100μl/分钟注射到系统中用于3.5分钟结合相。以100μl/分钟监测解离相15分钟。以20μl/分钟30秒注射100mM甘氨酸缓冲液(甘氨酸pH 11，150mM NaCl)，随后以30μl/分钟第二次1分钟注射再生系统。
信号测定为分析物浓度依赖性的、时间分辨的传感图。使用BIAcoreBIAevaluation软件4.1评估数据。作为拟合模型，使用标准的Langmuir二元结合模型。
结果：
当将ss-D-DNA标记的FAB片段注射到系统中时，没有观察到HER2-ECD相互作用，因为ss-D-DNA标记的FAB片段不与传感器表面上呈现的spiegelmeric ss-L-DNA接头杂交(图2)。
表7：复合体形成实验的动力学结果。接头：表面呈现的接头长度不同的生物素化的ss-L-DNA多核苷酸接头、Oligo_35mer-Bi、Oligo_75mer-Bi和Oligo_95mer-Bi。ss-L-DNA-FAB:2C4-ss-L-DNA：用19mer-荧光素标记的抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA。4D5-ss-L-DNA:用17mer-荧光素标记的抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA。4D5-+2C4-ss-L-DNA:表面呈现的两个片段的组合。LRU:响应单位的质量，其在传感器表面上杂交。抗原：87kDa HER2-ECD用作溶液中的分析物。ka：(1/Ms)的结合速率。kd：(1/Ms)的解离速率。t1/2diss：根据第一级动力学等式的解ln(2)/kD*3600以小时计算的抗原复合体半衰期。kD：摩尔亲和力。kD：以皮摩尔计算的亲和力。Rmax：以响应单位(RU)表示的饱和时最大分析物响应信号。MR：摩尔比例，表明相互作用的化学计量。Chi2，U值：测定的质量指标。
表7.
BIAcore传感图显示了35-mer复合体HER2-ECD相互作用的浓度依赖性测定(图3)。该接头单独由DNA标记的杂交运动序列组成。动力学数据表明，完全建立的复合体不显示动力学性能的改善。这是由于35-mer的不充足接头长度和缺少柔性。
BIAcore传感图显示了75-mer复合体HER2-ECD相互作用的浓度依赖性测定(图4)。75-mer接头与35-mer接头相比携带poly-T以增加接头长度。动力学数据表明，完全建立的复合体显示其动力学性能的显著改善。这是由于75-mer的最佳接头长度和柔性。
BIAcore传感图显示了95-mer复合体HER2-ECD相互作用的浓度依赖性测定(图5)。95-mer接头与35-mer接头相比携带poly-T以增加接头长度。动力学数据表明，完全建立的复合体显示其动力学性能的显著改善。这是由于95-mer的增加的接头长度和柔性。
BIAcore测定设置包含以下(还参见图1)：ss-L-DNA-双接头呈现在BIAcore SA传感器上。流动室1充当对照。使用溶液Her2-ECD中的分析物。抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA和抗-HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA杂交成表面呈现的接头。
本文第一次显示了经由高度柔性的ss-L-DNA接头连接在一起的Herceptin-FAB与Pertuzumab-FAB之间的完全功能协同结合事件。表3中的数据为协同结合事件的存在提供了证据。尽管完全建立的复合体的Rmax值大概是单个FAB-臂构建体的信号高度的两倍，但是摩尔比例值精确地是1(MR＝1)。这是两个FAB片段同时协同结合事件存在的明确证据。复合体计数为具有1:1Langmuir结合化学计量的单个分子。尽管具有2个独立的结合HER2界面，但是在一个复合体与两个HER2结构域之间没有检测到分子间结合。
用于单克隆抗体协同对或化学交联双特异性F(ab’)2的亲和力常数一般仅比用于各单克隆抗体的亲和力常数大高达15倍，其显著低于反应物之间理想组合预期的理论亲和力(Cheong，H.S.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.173(1990)795-800)。不希望受该理论的束缚，为此的一个原因可能是参与协同结合的各表位/互补位相互作用(导致高亲和力)必须以彼此相对的特定方式定向用于最佳协同性。
此外，表7中呈现的数据提供了这样的证据，即仅由ss-L-DNA杂交基序组成的短35-mer接头不显示足够的柔性和/或接头长度，以产生协同结合作用。35-mer接头是刚性的双螺旋L-DNA构建体。杂交产生双链L-DNA螺旋，其比ss-L-DNA序列更短并且更不柔软。该螺旋显示降低的自由度并且可以认作是刚性接头构建体。表7显示，35-mer接头不能够产生协同结合事件。
通过高度柔性的聚-T ss-L-DNA延伸接头长度以分别形成75-mer和95-mer提供了亲和力的增加，尤其是抗原复合体稳定性kD(1/s)的增加。
chi2值表示高质量的测定。所有测定显示了非常小的误差。可以将数据拟合到Langmuir 1:1拟合模型中，残差偏离仅+/-1RU，小的chi2值和仅10次迭代计算对获得数据是必需的。
协同结合作用根据物理定律而工作，因为综合了自由结合能ΔG1和ΔG2。亲和力相乘：KDcoop＝KD1x KD2。此外，解离常数也相乘：KD coop＝kd1x KD 2。这在75-mer和95-mer接头实验中精确地可观察到。这分别产生4146小时(173天)和3942小时(164天)非常长的复合体半衰期。亲和力在100fmol/l的范围内。发生协同结合事件是显而易见的。
当与单个杂交的构建体相比时，所有完全建立的复合体s的结合速率更快。尽管显示更大的分子量，但结合速率增加。
本文中我们显示在如本文报道的复合体中连接在一起的司徒曼布和Pertuzumab同时结合HER-2胞外域(ECD)。两个FAB片段结合HER2-ECD(PDB 1S78和PDB 1N82)上的真正表位。此外，两个FAB片段在其结合角度上非常不同。通过使用最佳75-mer(30nm)ss-L-DNA接头长度及其有利的柔性以及长度性质，可以显示协同结合事件。
信号测定为分析物浓度依赖性的，时间分辨的传感图。使用BIAcoreBIAevaluation软件4.1评估数据。作为拟合模型，使用标准的Langmuir二元结合模型。
实施例7
额外的生物分子相互作用分析
BIAcore 3000仪器装配有CM-5传感器芯片。根据制造商(GEhealthcare，Uppsala，Sweden)推荐预处理传感器。系统缓冲液是(10mMHEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％20)。系统缓冲液也用作样品缓冲液。在25℃控制软件4.1下操作系统。
以13，952RU在流动室1和15，047RU在流动室2上通过标准的NHS/EDC化学固定10mM乙酸盐缓冲液pH 4.5中的30μg/ml多克隆山羊抗人IgG-Fcγ抗体(Jackson Laboratories，USA)。使用20秒脉冲的10mM甘氨酸pH 1.5缓冲液、1分钟脉冲10mM甘氨酸pH 1.7缓冲液和30秒脉冲10mM甘氨酸pH 1.5缓冲液以20μl/分钟再生系统。在流动室1上，以10μl/分钟注射5nM huIgG(Bayer Healthcare)1分钟作为参考。
在流动室2上，以10μl/分钟注射10nM人HER2胞外受体FC嵌合体(hHER2-ECDpresSFc)1分钟。通常通过山羊抗人IgG-Fcγ抗体在流动室2上经由人FC部分捕获100个响应单位的预先建立的同源二聚体hHER2-ECDpresSFc。通常，在流动室1上经由人FC部分捕获130个响应单位的huIgG。
流动室2上的信号参考相对于流动室1上的信号。
ss-L-DNA标记的FAB片段抗-HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA和抗-HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA与75mer ss-L-DNA接头以1:1:1摩尔化学计量杂交。将完全建立的复合体2C4-75mer-4D5以50nM 3分钟内注射到系统中。作为对照，将50nM单个FAB片段注射到系统中。
注射结束后立即将250nM链霉抗生物素蛋白或系统缓冲液以10μl/分钟注射到系统中3分钟。因为75mer接头在其序列中心含有单个生物素部分，所以SA将充当探针来识别接头内的生物素，而不是FAB片段的存在。
在另一实验中，将不同浓度步骤0nM、0.6nM、1.9nM、2x 5.6nM、16.7nM、50nM的完全建立的4D5-75mer-2C4复合体以10μl/分钟注射到系统中3分钟。监测hHER2-ECDpresSFc分析物的浓度依赖性响应水平。在hHER2-ECDpresSFc浓度步骤上绘制响应水平。使用软件Origin 7观察数据。使用Origin 7软件提供的Hill等式y＝Vmax*xn/(kn+xn)拟合数据。
BIAcore测定设置包含以下(也参见图6)：多克隆山羊抗人IgG-Fcγ抗体固定在BIAcore CM5传感器上并充当捕获系统用于huFc嵌合体HER2ECD。注射抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA(2C4FAB)、抗-HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA(4D5FAB)和完全建立的复合体，随后注射链霉抗生物素蛋白(SA)。实验的目的是证明75mer ss-L-DNA接头内生物素部分的存在和可及性。
在图7中描述了实验结果。BIAcore传感图显示了50nM注射由75merss-L-DNA接头连接的抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA(2C4)、抗-HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA(4D5)和完全建立的复合体(2C4-75mer-4D5)后相互作用信号的叠加图。叠加图显示由于其137kDa较大的质量，完全建立的复合体结合物(2C4-75mer-4D5+缓冲液)产生了当与FAB片段注射(2C4+缓冲液，4D5+缓冲液)相比时较高的信号应答水平。FAB片段各自具有57kDa的计算分子量。420秒注射结束后立即注射250nM链霉抗生物素蛋白或系统缓冲液。双头箭头标记了与缓冲液注射(2C4-75mer-4D5+缓冲液)相比，由250nM链霉抗生物素蛋白注射(2C4-75mer-4D5+SA)诱导的14RU信号位移(ΔRU)。FAB片段在SA注射后没有显示信号位移而且维持在缓冲液信号水平上((2C4+SA)、(2C4+缓冲液)、(4D5+SA)、(4D5+缓冲液))。链霉抗生物素蛋白是效应部分。其显示了ss-L-DNA接头的可及性。
在图8中显示了BIAcore传感图，其显示了完全建立的75-mer复合体在溶液中作为分析物与表面呈现的huFc嵌合体HER2ECD相互作用的浓度依赖性测定的叠加图。黑线代表对数据的1:1Langmuir拟合。动力学数据，结合速率ka＝1.25*1051/Ms，解离速率KD＝3.39*10-51/s，亲和力常数0.3nM。
图8的响应水平相对于完全建立的复合体的分析物浓度而绘制(图9)。根据hill方程拟合数据并确定hill因子(Origin 7)。等式：y＝Vmax*xn/(kn+xn)，Chi2/DoF＝0.6653，R2＝0.99973；n＝1.00201+/-0.06143。
在表8中显示了图6中描述的BIAcore测定形式的动力学数据。可以利用溶液中的复合体产生协同结合作用。摩尔比显示，单个复合体精确地识别单个HER2-ECD嵌合体。动力学数据，结合速率ka 1/Ms，解离速率kd 1/s，亲和力常数KD(M)和(nM)，最大结合响应信号(Rmax)，捕获的huFc Chim Her2ECD Ligand(RU)的量，根据Langmuir t1/2diss的复合体半衰期。Molar Ratio MR，表示结合事件的化学计量。Error chi2.4D5-2C4-75mer是完全建立的复合体。4D5-75mer和2C4-75mer是FAB片段，但与ss-L-DNA 75mer接头杂交。
表8
表8中呈现的数据表面，经由75mer ss-L-DNA接头连接的完全建立的复合体显示协同结合。当与完全建立的复合体相比时，单个FAB片段显示更低的亲和力。Rmax时的信号水平显示了复合体相对于单个FAB片段的增加的分子量。尽管具有较高的信号水平，但是Molar Ratios精确地是1.1。这显示统计学上各复合体结合单个huFc嵌合HER2ECD分子。
当与先前的测定形式相比时，通过协同性的放大系数并不是如此地高，其中复合体在传感器表面上装配。Kdcoop被触发高达6倍。不希望受理论束缚，这可能是由于同源二聚体huFc嵌合HER2 ECD的性质。二元结合物可能识别huFc HER2嵌合体中的两个分离的HER2 ECDs并且不能完全建立协同性。
可以通过FACS分析(参见下一个实施例)在活细胞上使用藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白探针显示染料形式的效应部分的有效递送。链霉抗生物素蛋白标记的探针可以容易地进入75mer ss-L-DNA接头构建体中的生物素部分。
来自上文概括的测定的数据用于产生Hill Plot(图9)。复合体的Hill分析显示，FAB片段的结合事件彼此独立并且彼此不干扰。没有检测到HER2分子结构扰动方面的协同结合，Hill系数(n＝1.00201+/-0.06143)精确地是1。因而，接头化学、ss-L-DNA接头的性质和寡聚物-标记的FAB片段不负面干扰靶标分子识别。
实施例8
进一步的复合体-合成和表征
可杂交的寡核苷酸的合成
根据标准方法分别合成包含SEQ ID NOs:05和06中给出的序列的以下氨基修饰的前体。下文给出的寡核苷酸不仅包含所谓的氨基接头，还包含荧光染料。技术人员将容易地理解，该荧光染料非常方便地利于纯化寡核苷酸，以及包含它们的组分。
a)5`-荧光素-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(间隔区C3)3-C7氨基接头-；
b)5`-Cy5AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(间隔区C3)3-C7氨基接头-；
c)5`-氨基接头-(间隔区C3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-荧光素-3`；
d)5`-荧光素-(βL AGT CTA TTA ATG CTT CTG C)-(间隔区C3)3-C7氨基接头-；(βL表示这是L-DNA寡核苷酸)；和
e)5`-氨基接头-(间隔区C3)3-(βL-AGT TCT ATC GTC GTC CA)-荧光素-3`(βL表示这是L-DNA寡核苷酸)。
使用商品化的CPGs作为固相支持体和标准的dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺(Sigma Aldrich)在ABI 394合成仪上利用三苯甲基开(对于5’氨基修饰)或三苯甲基关模式(对于3’氨基修饰)以10μmol规模进行合成。
以下亚酰胺、氨基修饰剂和CPG支持体用于在寡核苷酸合成过程中分别引入C3间隔区、染料和氨基部分：
-间隔区亚磷酰胺C3(3-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)；
-通过使用5'-氨基修饰剂C6(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入5’氨基修饰剂；
-5'-荧光素亚磷酰胺6-(3'，6'-二特戊酰荧光素基-6-甲酰胺)-己基-1-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)；
-Cy5TM亚磷酰胺1-[3-(4-单甲氧基三苯甲基氧基)丙基]-1'-[3-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基亚磷酰胺基]丙基]-3，3，3'，3'-四甲基吲哚双碳菁氯化物(Glen Research)；
-LightCycler荧光素CPG 500A(Roche Applied Science)；和
-3'-氨基修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG 500A(ChemGenes)。
对于Cy5标记的寡核苷酸，使用dA(tac)、dT、dG(tac)、dC(tac)亚磷酰胺，(Sigma Aldrich)并在室温下进行利用33％氨水的脱保护2小时。
通过使用β-L-dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺(ChemGenes)合成L-DNA寡核苷酸。
通过两步骤方法进行荧光素修饰的可杂交寡核苷酸的纯化：首先，在反相HPLC(Merck-Hitachi-HPLC；RP-18柱；梯度系统[A:0.1M(Et3NH)OAc(pH 7.0)/MeCN 95:5；B:MeCN]:3分钟，20％B在A中，12分钟，20-50％B在A中25分钟，20％B在A中，以1.0ml/分钟的流速，在260nm处检测纯化寡核苷酸。将含有想要产物的级分(通过分析性RPHPLC监测)组合并蒸发至干燥。(通过与20％乙酸温育20分钟来脱三苯甲基化在5’末端利用单甲氧基三苯甲基保护的烷氨基基团修饰的寡核苷酸)。再次通过IEX层析仪在HPLC[Mono Q柱:缓冲液A:氢氧化钠(10mmol/l；pH～12)缓冲液B:溶解在氢氧化钠中的1M氯化钠(10mmol/l；pH～12)梯度:在30分钟内100％缓冲液A-100％缓冲液B流速1ml/分钟，在260nm处检测]纯化含有作为标记的荧光素的寡聚物。经由透析将产物脱盐。
在反相HPLC(Merck-Hitachi-HPLC；RP-18柱；梯度系统[A:0.1M(Et3NH)OAc(pH 7.0)/MeCN 95:5；B:MeCN]:3分钟，20％B在A中，12分钟，20-50％B在A中和25分钟，20％B在A中以1.0ml/分钟的流速，在260nm处检测第一次纯化后使用Cy5标记的寡聚物。通过透析将寡聚物脱盐并在Speed-Vac蒸发器上冻干，以产生在-24℃冰冻的固体。
可杂交寡核苷酸的激活
来自实施例2的氨基修饰的寡核苷酸溶解在0.1M硼酸钠缓冲液pH8.5缓冲液(c＝600μmol)中并与18倍摩尔过量的磺基SMCC(来自ThermoScientific的溶解在DMF(c＝3mg/100μl)中的磺基琥珀酰4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)反应。反应产物针对水彻底透析，以去除磺基SMCC4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯的水解产物。
透析物通过蒸发而进行浓缩并直接用于与包含巯基基团的单价结合物缀合。
合成在两个末端包含可杂交寡核苷酸的接头寡核苷酸
通过标准方法在ABI 394合成仪上以10μmol规模三苯甲基开放模式，使用商品化的dT-CPG作为固相支持体并使用标准的dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺(Sigma Aldrich)合成寡核苷酸。
通过使用商品化的βL-dT-CPG作为固相支持体和β-L-dA(Bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺(ChemGenes)合成L-DNA寡核苷酸。
如实施例3所述在反相HPLC上进行寡核苷酸的纯化。组合含有想要产物的级分(通过分析性RP HPLC监测)并蒸发至干燥。通过与80％乙酸温育15分钟进行去三苯甲基化。通过蒸发去除乙酸。剩余部分溶解在水中并冻干。
以下亚酰胺和CPG支持体用于在寡核苷酸合成过程中引入C10间隔区、洋地黄毒苷和生物素基团：
-间隔区亚磷酰胺18(18-O-二甲氧基三苯甲基六乙二醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)；
-生物素-dT(5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯甲酰基)-生物素基)-氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research)；
-生物素亚磷酰胺1-二甲氧基三苯甲基氧基-2-(N-生物素基-4-氨基丁基)-丙基-3-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺和
-5'-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙酰氨基己基)-3-丙烯基亚胺基]-2'-脱氧尿苷，3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺用于氨基修饰和洋地黄毒苷-N-羟基-酸琥珀酰亚胺酯的后标记。
合成以下桥接构建体或接头：
接头1:5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-TGG ACG ACG ATAGAA CT-3’
接头2:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T40)-TGG ACGACG ATA GAA CT-3‘
接头3:5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(生物素-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头4:5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T5-(生物素-dT)-T5-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头5:5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(生物素-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头6:5`-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T30-(生物素-dT)-T30-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头7:5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(生物素-dT)-T5TG GAC GAC GAT AGA ACT-3'
接头8:5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T10-(生物素-dT)-T10TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头9:5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(生物素-dT)-T15TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头10:5`-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T20-(生物素-dT)-T20TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头11:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-间隔区C18-(生物素-dT)-间隔区C18-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头12:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔区C18)2-(生物素-dT)-(间隔区C18)2-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头13:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔区C18)3-(生物素-dT)-(间隔区C18)3-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头14:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔区C18)4-(生物素-dT)-(间隔区C18)4-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头15:5`-G CAG AAG CAT TAA TAGACT-T20-(Dig-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'
接头16:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(Dig-dT)-TGG ACGACG ATA GAA CT-3'
接头17:5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(生物素-dT)-TGGACG ACG ATA GAA CT-3'
上文桥接构建体实例包含至少第一个可杂交的寡核苷酸和第二个可杂交的寡核苷酸。接头3-18除了可杂交的核酸区段，还分别包含中心生物素化的或地高辛化的胸苷或由上文给定长度的胸苷单位组成的间隔区。
5’-可杂交的寡核苷酸对应于SEQ ID NO:07并且3’-可杂交的寡核苷酸对应于SEQ ID NO:08。SEQ ID NO:07的寡核苷酸将容易地与SEQ IDNO:06的寡核苷酸杂交。SEQ ID NO:08的寡核苷酸将容易地与SEQ IDNO:05的寡核苷酸杂交。
在上文桥接构建体中，实例[B-L]表示L-DNA寡核苷酸序列是给定的；间隔区C 18、生物素和生物素dT分别称为来自上文给定的结构单元的C18间隔区、生物素和生物素-dT；并且具有数字的T表示在给定位置上掺入到接头中的胸苷残基的数量。
复合体的装配
A)IgGs的切割和利用ss-DNA对FAB’片段的标记
在胃蛋白酶蛋白酶的帮助下切割纯化的单克隆抗体，产生随后通过低浓度的半胱胺在37℃下处理还原成FAB’片段的F(ab')2片段。在PD 10柱上通过分离半胱胺终止反应。利用根据实施例3产生的激活的寡核苷酸标记FAB’片段。该单链DNA(＝ss-DNA)携带巯基反应性马来酰亚胺基团，其与FAB’铰链区的半胱氨酸反应。为了获得高百分比的单一标记的FAB’片段，保持低的ss-DNA与FAB’片段的相对摩尔比例。经由离子交换层析(柱:Source 15Q PE 4.6/100，Pharmacia/GE)发生单一标记的FAB’片段(ss-DNA:FAB’＝1:1)的纯化。通过分析性凝胶过滤和SDS-PAGE完成有效纯化的验证。
B)包含特异性结合靶标的两个多肽的复合体的装配
抗pIGF-1R复合体基于两个FAB’片段，其靶向IGF-1R的胞内域的不同表位：FAB’8.1.2检测靶蛋白的磷酸化位点(pTyr 1346)并且FAB’1.4.168检测其非磷酸位点。FAB’片段已经共价连接单链DNA(ss-DNA)：FAB’1.4.168连接包含SEQ ID NO:05并且含有荧光素作为荧光标志物的17mer ss-DNA，并且FAB’8.1.2连接包含SEQ ID NO:06并且含有Cy5作为荧光标志物的19mer ss-DNA。在以下中，具有共价结合的17mer或19mer ss-DNA的这些FAB’s分别称为ss-FAB’1.4.168和ss-FAB’8.1.2。复合体装配由与ss-FAB’片段的相应ss-DNAs杂交的接头(即包含两个互补ss-DNA寡核苷酸(分别是SEQ ID NOs:7和8)的桥接构建体)介导。可以通过使用间隔区，例如C18-间隔区或不同长度的DNA分别修饰复合体的两个ss-FAB’片段之间的距离。
对于装配评估，复合体组分ss-FAB’8.1.2、ss-FAB’1.4.168和接头构建体(1)(＝实施例2.4的接头17)5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACTT(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’和(2)(＝实施例2.4的接头10)5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-T(-Bi)-(T20)-TGG ACGACG ATA GAA CT-3’在室温下以等摩尔的量混合。1分钟温育步骤后，在分析性凝胶过滤柱(SuperdexTM 200，10/300GL，GE Healthcare)上分析反应混合物。单一复合体组分的洗脱体积(VE)与反应混合物的VE的比较证明已经成功形成了复合体(图10)。
BIAcore实验评估抗pIGF-1R复合体与固定的IGF-1R和IR肽的结合
对于该实验，在T＝25℃使用具有安装在系统中的BIAcore SA传感器的BIAcore 2000仪器(GE Healthcare)。利用3x1分钟注射50mM NaOH中的1M NaCl和1分钟10mM HCl，以100μl/分钟完成预处理。
HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％20用作系统缓冲液。样品缓冲液与系统缓冲液相同。
在控制软件V1.1.1下驱动BIAcore 2000系统。
随后在各流动室中的SA表面上捕获生物素化的肽。在流动室2上捕获16RU的IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr；Glu(Bi-PEG-1340]amid(即–1346酪氨酸磷酸化的–包含经由对应于位置1340的谷氨酸结合的PEG接头并在接头的另一个末端生物素化的SEQ ID NO:11的肽)。在流动室3上捕获18RU的IGF-1R(1340-1366)；Glu(Bi-PEG-1340]amid(即–1346酪氨酸非磷酸化的–包含经由对应于位置1340的谷氨酸结合的PEG接头并在接头的另一个末端生物素化的SEQ ID NO:11的肽)。在流动室4上捕获20RU的hInsR(1355-1382)[1361-pTyr；Glu(Bi-PEG-1355]amid(即–1361酪氨酸磷酸化的–包含经由对应于人胰岛素受体位置1355的谷氨酸结合的PEG接头并在接头的另一个末端生物素化的SEQ ID NO:12的肽)。最后用d-生物素饱和所有的流动室。
对于复合体形成，使用上文描述的装配方案。当进行仅利用两个ss-FAB's之一各自运行时，接头DNA的缺少或存在不影响结合或解离曲线。
溶液中100nM分析物(即在这些实验中，二价二元结合剂)以50μl/分钟注射240秒结合时间并监测解离500秒。通过使用以80mM NaOH，50μl/分钟的1分钟注射步骤完成有效的再生。流动室1充当参考。使用空白缓冲液注射代替抗原注射，以通过缓冲液信号消减来倍增参考数据。
在每个测定循环中，将溶液中以下分析物之一注射到所有4个流动室上：100nM ss-FAB’8.1.2、100nM ss-FAB'1.4.168、100nM ss-FAB'8.1.2和100nM ss-FAB’的混合物、由在接头(3)(5`-G CAG AAG CAT TAATAG ACT-T(20)-T(-Dig)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’(＝接头15))上杂交的ss-FAB'8.1.2和ss-FAB'1.4.168组成的100nM二价结合剂，和由在接头(1)(5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Dig)-TGG ACGACG ATA GAA CT-3’(＝接头16))上杂交的ss-FAB'8.1.2和ss-FAB'1.4.168组成的100nM二价结合剂。
信号监测为时间依赖的BIAcore传感图。
在分析物结合相(Binding Late，BL)的结束和分析物解离相(StabilityLate，SL)的结束设置报告点，以监测每一相互作用的响应单位信号高度。根据线性1:1Langmuir拟合，使用BIAcore评估软件4.1计算解离速率kd(1/s)。根据式ln(2)/(60*kD)计算以分钟计的复合体半衰期。
传感图(图11和图14)显示当ss-FAB’1.4.168和ss-FAB’1.4.168以复合体形式(＝二价结合剂)使用时，pIGF-1R结合的特异性和复合体稳定性均提高，可能是由于潜在的协同结合作用。FAB’1.4.168单独对pIR肽不显示交叉反应性，但不能区分IGF-1R的磷酸化和非磷酸化形成(在两种情况下T1/2dis＝3分钟)。然而，FAB’8.1.2仅结合IGF1-R肽的磷酸化形式，但显示与磷酸化胰岛素受体的一些不想要的交叉反应性。复合体在pIGF-1R肽和两个其他肽之间很好地区分(参见图13)，因此帮助克服非特异性结合的问题。注意，当应用没有接头DNA的两个FAB’s(图14)时，特异性的提高丢失。复合体针对pIGF-1R肽的亲和力的提高表现为与各FAB’s和省略接头DNA的FAB’混合物相比增加的解离半衰期(图12和图14)。尽管具有两个不同DNA接头的测试复合体s对靶标结合特异性和亲和力拥有整体积极作用，更长的接头(具有T40-Dig作为间隔区)(即接头15)看起来在两个标准方面具有优势。
M-1.4.168-IgG和M-8.1.2的BIAcore测定夹层
使用具有安装在系统中的BIAcore CM5传感器的BIAcore T100仪器(GE Healthcare)。以100μl/分钟1分钟注射0.1％SDS、50mM NaOH、10mM HCl和100mM H3PO4预处理传感器。
系统缓冲液是HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％20)。样品缓冲液是系统缓冲液。
在控制软件V1.1.1下驱动BIAcore T100系统。在10mM乙酸钠pH 4.5中30μg/ml的多克隆兔IgG抗体<IgGFCγM>R(JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)根据制造商的说明书经由EDC/NHS化学分别以10000RU固定在流动室1、2、3和4上。最后，用1M乙醇胺封闭传感器表面。在13℃驱动整个实验。
在<IgGFCγM>R表面上以10μl/分钟捕获500nM一级mAbM-1.004.168-IgG，1分钟。以30μl/分钟注射含有封闭溶液的3μM的IgG片段混合物(IgG类型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的)5分钟。以30μl/分钟注射300nM的肽IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr；Glu(Bi-PEG-1340]amid 3分钟。以30μl/分钟注射300nM的二级抗体M-8.1.2-IgG。使用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7以50μl/分钟再生传感器3分钟。
在图15中呈现测定设置。在图18中，给出测定结果。测定清楚地表明，两个单克隆抗体均能够同时结合其各自靶标肽上的两个不同的不相关表位。这是任何后续实验的前提，目标是产生协同结合事件。
传感器表面上的BIAcore测定复合体
在T＝25℃使用具有安装在系统中的BIAcore SA传感器的BIAcore3000仪器(GE Healthcare)。利用3x1分钟注射50mM NaOH中的1M NaCl和1分钟10mM HCl，以100μl/分钟预处理系统。
系统缓冲液是HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％20)。样品缓冲液是系统缓冲液。
在控制软件V4.1下驱动BIAcore 3000系统。
在参考流动室1上捕获124RU氨基-PEO-生物素。在不同的流动室上捕获1595RU生物素化的14.6kDa T0-Bi 37-mer ss-DNA-接头(1)(5’-GCAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAACT-3’)(＝实施例2.4的接头17)和1042RU生物素化的23.7kDa T40-Bi77-mer ss-DNA-接头(2)(5`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-(生物素-dT)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’＝接头10)。
将300nM ss-FAB 8.1.2和300nM ss-FAB 1.004.168以50μl/分钟注射到系统中3分钟。作为对照，仅注射300nM ss-FAB 8.1.2或300nM ss-FAB1.004.168，以测试每一ss-FAB的动力学贡献。作为对照，注射缓冲液，而非ss-Fabs。以0nM、4nM、11nM、33nM(两次)、100nM和300nM的浓度步骤，以50μl/分钟将溶液中游离的肽IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr]amid、INR(1355-1382)[1361-pTyr]amidIGF-1R(1340-1366)amid注射到系统中4分钟。在测定相对于肽IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr]amid的亲和力的另一实施方案中，使用0nM、0.4nM、1.1nM、3.3nM(两次)、10nM和30nM的浓度步骤。
以50μl/分钟监测解离5.3分钟。利用12秒脉冲250mM NaOH的每一个浓缩步骤后再生系统并用ss-FAB配体重新装载。
图17概要地描述了在BIAcore仪器上的测定设置。图18中给出的表显示了该方法的定量结果。图19、图20和图21描述了该测定设置的示例性BIAcore结果。
图18中的表证明了复合体概念的益处。与分别具有192分钟和30pM的T0二元结合剂(即具有接头16的二元结合剂)相比，T40二元结合剂(具有实施例2.4的接头10的二元结合剂，即具有T20-生物素-dT-T20的间隔区的接头)导致2倍提高的抗原复合体半衰期(414分钟)和3倍提高的亲和力(10pM)。这强调了优化接头长度以产生最佳协同结合作用的必要性。
T40二元结合剂(即，包含T40-Bi接头(接头10)的二元结合剂)相对于磷酸化的IGF-1R肽显示10pM亲和力(图18、图19中的表)。这是相对于磷酸化的胰岛素受体肽(24nM)的2400倍亲和力提高和相对于非磷酸化的IGF-1R肽的100倍提高。
因而，实现了通过组合两个不同的和分离的结合事件增加特异性和亲和力的目标。
协同结合作用尤其从针对磷酸化的IGF-1R肽的解离速率而变得显而易见，其中复合体显示414分钟的抗原复合体半衰期，分别相对于单独具有单价结合物8.1.2的0.5分钟和相对于单独具有单价结合物1.4.168的3分钟。
此外，当与单一FAB杂交的构建体相比时，完全装配的构建体大致乘以其解离速率kd(1/s)(图21、图20、图21和图18中的表)。有趣的是，当与单一FAB相互作用事件相比时，结合速率ka(1/Ms)也轻微地增加，这可能是由于构建体的分子柔性增加。
实施例9
结合测定-体外和离体
检测寡核苷酸探针-Cy5
已经通过现有技术寡核苷酸合成方法合成了ss-L-DNA检测寡核苷酸探针-Cy55’Cy5-Y-ATG CGA-GTA CCT TAG AGT C-Z-Cy53’(SEQID NO:72)。经过氨基基团与Cy5单反应性NHS酯的反应完成了Cy5的引入。(GE Healthcare Lifescience，STADT，LAND)。对于核苷酸，使用L-DNA亚酰胺(ChemGenes，STADT，LAND)。在固相寡核苷酸合成方法过程中引入5'和3'氨基基团，其中Y＝经由(6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)引入的5'-氨基修饰剂C6，并且Z＝经由3'氨基修饰剂TFA氨基C6长链氨基烷基可控多孔玻璃1000A(ChemGenes)引入的3'-氨基修饰剂C6。
二元结合物接头寡核苷酸
已经通过现有寡技术核苷酸合成方法合成了ss-L-DNA寡核苷酸接头SEQ ID NO:735`-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-GAC TCTAAG GTA CTC GCA T-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3'。
复合体的装配
通过等摩尔化学计量的FITC标记的抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA和FITC标记的抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA与SEQ ID NO:73的ss-L-DNA接头杂交装配复合体。为了验证复合体的正确装配，将复合体进行SEC层析步骤并且通过无菌滤器进行过滤。
体外结合测定
以2x106细胞/ml的浓度，30μl的体积将人乳腺癌KPL-4细胞接种到μ-载玻片VI(ibidi，Germany)中。三小时后，加入70μl培养基(RPMI1640，2mM L-谷氨酰胺，10％FCS)以允许细胞粘附。
在37℃和水饱和大气压中5％CO2下温育24小时后(对所有后续的温育有效)，去除上清液并用100μl PBS洗涤细胞一次，以去除残留的培养基。
为了连续应用，加入用FITC溶液(c＝2.5μg/ml)标记的如上制备的50μl复合体4D5-2C4并温育45分钟，随后利用100μl PBS进行一个洗涤步骤并与等摩尔量(0.13μg/ml)的50μl的DNA-探针(SEQ ID NO:72)进一步温育。
通过首先将复合体和检测探针混合来进行预先混合步骤。然后，将其加入到细胞(浓度，参见上文)中，随后温育45分钟。
靶向人IgE免疫球蛋白的人源化IgG1单克隆抗体用作阴性对照并且靶向人HER-2受体的Cy5标记的用作阳性对照。以相同浓度(2.5μg/ml)应用这两种抗体。
随后，去除上清液并用100μl PBS洗涤细胞一次。然后通过加入50μl的HOECHST33342溶液(c＝10μg/ml)利用DAPI染色细胞核并温育15分钟。为了去除细胞染料，去除上清液后用100μl PBS洗涤细胞两次。加入额外的120μl PBS以保持细胞湿润来保证活力。利用培养基(不含L-谷氨酰胺和FCS)制备所有的稀释液以保证细胞活力并避免细胞剥离。该步骤后，通过多谱荧光分析使用NUANCE System(CRi，Cambridge，USA)对载玻片成像。为了荧光强度的可比性，将图像归一化。
离体分析
以100μl PBS中的50μg复合体静脉注射具有确定的KPL-4肿瘤(正位植入的)的免疫缺陷SCID米色小鼠并且18小时后，以等摩尔浓度(2.63μg/小鼠)注射Cy5-标记的DNA探针。48小时后移出肿瘤并通过多谱荧光分析使用MAESTRO系统(CRi，Cambridge，USA)进行检查。
结果
体外结合测定
复合体经由其每一个FAB'-ss-L-DNA组分而被双重标记。检测探针是双重Cy5标记的ss-L-DNA 20-mer寡核苷酸探针，其可以与复合体的95mer ss-L-DNA接头杂交。
与Xolair-Cy5相反(无荧光信号，阴性对照)，Herceptin-Cy5特异性地染色肿瘤细胞(图22)。FITC标记的4D5-2C4-95mer复合体特异性结合KPL-4肿瘤细胞，如通过与检测探针(在Cy5荧光通道测定)连续温育所见，所述检测探针与复合体共定位到肿瘤细胞上，表明检测寡核苷酸探针-Cy5与复合体的杂交。在连续温育模式以及预先混合的设置中，可以证明肿瘤细胞特异性染色Her-2抗原(图2)。
在图22中，显示了与复合体和检测探针温育的癌细胞的近红外图像(NIRF成像)。在图的右上部，显示了与Cy5标记的检测寡核苷酸杂交的完全装配的4D5-2C4-95mer复合体的草图。在图的中间右部，显示了Cy5标记的Herceptin的草图。在图的右下部，显示了信号强度条。
在图22的左上部，显示了Cy5标记的与癌细胞的结合(阳性对照)。KPL-4细胞膜看起来是围绕DAPI染色的细胞核的明亮光环。在左下部，显示了Cy5标记的的温育(阴性对照)。没有检测到膜染色，但是检测到了细胞核的DAPI染色。在图的中间下部，显示了4D5-2C4-FITC复合体的结合。膜结合的复合体的荧光信号看起来是围绕DAPI染色细胞核的光环。在图的中间上部，显示了4D5-2C4-FITC复合体与Cy5标记的检测探针的结合。可以看见经由连续杂交的Cy5标记的ss-L-DNA检测探针对复合体的检测。检测寡核苷酸的Cy5信号看起来是膜染色，显示了围绕DAPI染色细胞核的明亮光环。
在图23中，显示了KPL-4细胞的近红外(NIRF)成像。在图23A中，显示了FITC标记的4D5-2C4复合体与Cy5标记的检测探针的连续应用。在图23B中，显示了KPL-4细胞与预先混合的FITC标记的4D5-2C4复合体和Cy5标记的检测探针的温育结果。两个图像均显示了膜定位信号。作为对照，用DAPI染色细胞。
实验证明，可以首先应用如本文报道的复合体，以特异性靶向HER-2阳性细胞。第二步，可以应用标记的检测探针，以杂交靶标结合的复合体。荧光标记的检测探针由此是用于基于寡核苷酸的效应部分的时间延迟的连续应用和特异性靶向的概念证据。在这种情况下，有效负荷是用于体外细胞成像目的的荧光染料。
离体结合测定
如图24中所述(左边的图)，在其中样品首先与复合体温育，然后与Cy5标记的检测探针温育的实验环境中可检测到强的荧光信号。相反(右边的图)，在先前注射到仅与Cy5标记的检测探针温育的KPL-4异种移植物中的肿瘤中没有检测到荧光信号。
图24显示了移植的KPL-4肿瘤进行NIRF成像。在第一个图像中，显示了从小鼠移植的三个KPL-4肿瘤获得的Cy5荧光信号，首先用4D5-2C4复合体，随后用检测探针连续处理所述小鼠。在右边的图像中，显示从三个KPL-4肿瘤中没有获得荧光信号，此时其中仅用检测探针处理了三只小鼠，省略了4D5-2C4复合体。
实施例10
在MDA-MB-175乳腺癌细胞系中抑制细胞增殖
将在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中培养的2x 104MDA-MB-175乳腺癌细胞接种在96孔板中。第二天以指示浓度(40-0.0063μg/ml)分别加入抗体和复合体。温育6天后，加入Alamar Blue并将平板在组织培养箱中温育3-4小时。测量荧光(激发530nm/发射590)并使用未处理的细胞作为参考计算百分比抑制。
结果
抗HER2抗体2C4(Pertuzumab)显示44％的最大抑制。抗HER2抗体Herceptin显示9％的最大抑制。包含Pertuzumab和的FAB片段的如本文报道的复合体显示46％的最大抑制。
必须指出，Pertuzumab被测试为具有两个HER2结合位点的全长IgG抗体，然而复合体包含具有单个HER2结合位点的单一Pertuzumab Fab片段。
实施例11
复合体的冷冻-解冻-稳定性
通过等摩尔化学计量的FITC标记的抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA和FITC标记的抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA与SEQ ID NO:73的ss-L-DNA接头杂交装配复合体。为了验证复合体的正确装配，复合体进行SEC层析步骤并通过无菌过滤器进行过滤。
通过分析性SEC使用TSK3000柱(GE)分析50μl的复合体(1.5mg/ml)。运行缓冲液是0.1M KH2PO4pH 6.8。流速是1ml/分钟。在图25中显示了层析图。
冰冻和解冻后，重新层析复合体。通过分析性SEC使用TSK3000柱(GE)分析50μl的复合体(1.5mg/ml)。运行缓冲液是0.1M KH2PO4pH 6.8。流速是1ml/分钟。在图26中显示了层析图。
实施例12
结合实体的克隆和表达
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
通过瞬时转染人胚肾细胞(HEK 293)表达想要的蛋白质。为了表达想要的基因/蛋白质，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-鼠类免疫球蛋白重链信号序列(SS)，
-待表达的基因/蛋白质(例如全长抗体重链)，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
除包括待表达的想要基因的表达单位/盒外，基础/标准哺乳动物表达质粒含有
-来自载体pUC18的复制起始区，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-β-内酰胺酶基因，其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
克隆
首先，进行结合实体(如抗体Fab片段)编码构建体的克隆。一般通过基因合成获得具有结合实体编码核酸的质粒，由此所编码结合实体的C-末端区含有分选酶-基序和His-标签。将质粒分别转移到多孔板的单独的孔中(可装载整个板)。然后，用切开结合实体编码区的限制性内切核酸酶混合物消化质粒。希望以这样的方式设计所有的基因合成，即对所有质粒而言仅需要一种限制性酶混合物。然后，任选的清洗步骤产生纯化的DNA片段。这些片段连接到已经用如上提及的同一限制性混合物从受体载体切开的质粒骨架中。或者，可以通过SLIC介导的克隆步骤进行克隆方法。连接后，自动化平台将所有连接混合物转移到具有感受态大肠杆菌细胞(例如Top10Multi Shot，Invitrogen)的其他多孔板中并进行转化反应。将细胞培养至想要的密度。可以从培养混合物的等分试样中获得甘油原种。从培养物中分离质粒(例如使用质粒分离小量试剂盒(例如NucleoSpin 96Plasmid，Macherey&Nagel))。通过用适当的限制酶混合物消化等分试样和SDS-凝胶电泳(例如E-Gel 48，Invitrogen)检查质粒身份。然后，可以用质粒等分试样装载新的平板用于进行对照测序反应。
表达
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的HEK293细胞(人胚肾细胞系293来源)产生抗体Fab片段。对于转染，使用“293-Fectin”转染试剂(Invitrogen)。从两个不同的质粒表达抗体Fab片段，其编码全长轻链和相应的截短的重链，其含有C-末端LPXTG序列(SEQ ID NO:74)。转染后以等摩尔质粒比例使用两种质粒。如制造商说明书中说明进行转染。转染后7天收集含有抗体Fab片段的细胞培养物上清液。将上清液冰冻储存，直至纯化。
过滤并通过两个层析步骤纯化含有抗体Fab片段的培养物上清液。通过亲和层析使用用包含20mM咪唑(1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，20mM咪唑)，pH 7.4的PBS平衡的HisTrap HP Ni-NTA柱(GE Healthcare)捕获抗体Fab片段。通过平衡缓冲液洗涤去除未结合的蛋白质。用10柱体积的PBS(1mM KH2PO4，10mMNa2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，400mM咪唑)中的20mM-400mM线性咪唑梯度洗脱组氨酸标记的蛋白质。Superdex 200TM(GEHealthcare)上的大小排阻层析用作第二个纯化步骤。在40mM Tris-HCl缓冲液，0.15M NaCl，pH 7.5中进行大小排阻层析。利用Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)装配的Ultrafree-CL离心过滤单元浓缩抗体Fab片段并储存在-80℃。
通过使用在氨基酸序列基础上计算的摩尔消光系数测定280nm的光密度(OD)来测定抗体Fab片段的蛋白质浓度。通过在存在和缺少还原剂(5mM 1.4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE并利用考马斯亮蓝染色分析纯度和正确的抗体Fab形成。
实施例13
经由抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的连接产生双特异性结合分子
使用酶分选酶A进行抗体Fab片段与寡核苷酸的偶联。由此，具有含有LPXTG肽(SEQ ID NO:74)的部分的分子共价附着拥有GG部分的另一分子。因而，寡核苷酸具有这些部分中的一个，而抗体Fab片段具有各自另外的部分。酶促反应可以比化学反应更有利，因为更高的周转、更高的特异性、更少的副产物和更少的有害废物。
以超过抗体Fab片段4倍摩尔过量加入10x分选酶缓冲液(1x:50mMTris-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl2，pH 7.5)、分选酶酶(0.15μg酶/μg Fab)和寡核苷酸表达抗体Fab片段后，在过滤的HEK培养基中进行抗体Fab片段与寡核苷酸的反应。寡核苷酸由18mer L-DNA组成，其中向所述18mer L-DNA通过氨基接头和间隔区(5'-(Gly)4-氨基接头-(间隔区C3)3-AG TTC TAT CGT CGT CCA-荧光素-3')(SEQ ID NO:75)加入了两个甘氨酸残基。温育在37℃下进行4-16小时。
对于纯化，应用(半)自动化的方法。因为不是所有的抗体Fab片段都转化成缀合物，必须分离这两个群体。这使用装载有Nickel Sepharose的HisMultiTrap HP 96-孔过滤板(GE Healthcare)通过反向His-Tag选择来完成。用400μl水/孔洗涤平板两次并通过真空过滤，然后用400μl结合缓冲液/孔(25mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)平衡两次并通过真空过滤。向分选酶反应混合物中加入等体积的结合缓冲液。将混合物装载到柱上并温育5分钟。向柱应用真空通过柱过滤缀合物，而未缀合的抗体Fab片段通过其His-Tag部分保持结合在柱上。因为所用的分选酶被遗传改造以含有His-Tag部分，其也结合到柱上，以便所得的过滤物没有酶。
在下一步中，从样品中去除游离的寡核苷酸，因为它们会干扰随后的连接反应。有两种可能性来完成该任务：通过超滤或通过基于亲和力的方法。对于超滤，那些设备是适当的，其保留缀合物，同时它们允许游离的寡核苷酸穿过膜，例如Zeba 96-孔Spin Desalting Plates、40K MWCO(Thermo Scientific cat.no.89807)或AcroPrep 96，30K(Pall，cat.no.5035)或通过任何其他相当的超滤设备。应用样品和过滤步骤后，用连接缓冲液(PBS)洗涤样品三次。将溶液转移到新的平板中并将体积调整到200μl。取出等分试样用于定量。作为超滤的备选，可以应用基于亲和力的方法，这需要允许结合缀合物的基质，同时游离的寡核苷酸保持不被结合。该基质的实例是KappaSelect(GE Healthcare，cat.no.17-5458-01)、CaptoL(GEHealthcare，cat.no.17-5478-99)或CaptureSelect IgG-CH1Affinity Matrix(BAC，cat.no.191.3120.05)。基质可以用作96孔过滤板内的柱或其可以作为悬浮液出售。在后一种情况中，其可以等分至96孔过滤板中，像MSGVN2250(MultiScreen HTS Millipore cat.no.MSGVN2250)，其充当封固板/载体板。亲和基质可以对轻链特异(如在KappaSelect and CaptoL的情况下)或者其可以对重链特异(如在Capture Select IgG-CH1的情况下)。因为可以对每一种基质应用不同的方案，所以以下概括基于用于KappaSelect的方案作为实例。利用水洗涤含有KappaSelect的平板，然后用400μl PBSpH 4.0洗涤三次。然后，应用样品(在PBS pH 4.0中稀释)并允许在搅拌下结合基质90分钟。利用400μl PBS pH 4.0进行三次洗涤步骤，然后利用200μl洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，250mM NaCl，5％PEG，pH 2.5)进行两次洗脱步骤。洗脱后，向每一种200μl缓冲液中加入30μl中和缓冲液(1MTris-H Cl pH 8.0)。若需要的话，可以进行超滤步骤以将样品带入另一缓冲液，像PBS中。
为了产生双特异性结合分子，一起吸取两种抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物，包括等摩尔比例的接头L-DNA(5`-G CAG AAG CAT TAA TAGACT-T10-GAC TCT AAG GTA CTC GCA T–T10-TGG ACG ACGATA GAA CT-3‘，SEQ ID NO:76)。接头DNA以其5′末端与第一个抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物杂交，而其3′末端与第二个抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物互补，由此在两个不同的抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物之间建立物理连接。为了正确的杂交，将溶液加热至60℃，然后缓慢冷却至室温，然后至4℃，用于储存。对于快速方案，在室温下几分钟也足够。
通过制备性大小排阻层析纯化双特异性结合分子。在具有2x PBS作为运行缓冲液的Superdex200柱上，根据其大小分离蛋白质级分。在图27中显示了典型的层析图(分析性SEC)。在连接反应中，形成高分子量种类，其清楚地与纯的Fab、缀合物和接头结合的一种抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的中间产物区分开。可以在细胞测定中进一步分析含有双特异性结合分子的级分。
制备方法
如果需要较大量的双特异性结合分子或如果有其他限制，可以应用所谓的制备方法。由此，将分选酶反应混合物应用到以1x PBS作为运行缓冲液的Superdex200柱上。在0.4ml体积中收集级分。然后，经过LabChip系统(Perkin Elmer)分析所有相关级分的等分试样，以确定含有抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的级分。此外，将所有相关级分的等分试样装载到琼脂糖凝胶上，由此在应用到凝胶上之前将所谓的捕获寡核苷酸加入到样品中。该捕获寡核苷酸与抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸互补，由此产生dsDNA部分，其在琼脂糖凝胶上比单独抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的ssDNA更容易被观察到。将含有抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物的(如LabChip系统上所见的)和不含游离寡核苷酸(如琼脂糖凝胶上所见的)的那些级分合并，并且若需要，例如利用Amicon Ultra 0.5ML，10K(Millipore)通过超滤将其浓缩。对于连接反应，将两个抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物分子吸取到一起，包括等摩尔比例的接头L-DNA并如先前部分中概述进行处理。
可以利用蛋白质凝胶或利用LabChip系统(Perkin Elmer)监测分选酶反应和清除方法的效率。后一种方法以大小估计和浓度测定递送电泳图(electrospherograms)。在图28中显示了该运行的实例，其中分析工作流不同阶段的样品。注意低于10kDa的峰是所谓的系统峰，其是LabChip设备固有的并且不属于样品。根据缓冲液，抗体Fab片段具有55-56kDa的大小。图28-1显示了初始材料(纯的抗体Fab片段)，图28-2是分选酶反应的开始(注意具有27kDa质量的分选酶的出现)。在分选酶反应结束时(图28-3)，抗体Fab片段峰后的明显峰出现在64kDa处，代表抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物(偶联速率/效率约为60％)。通过反向His-Tag选择和超滤进行纯化后，可以看见几乎纯的抗体Fab片段-寡核苷酸缀合物峰(图28-4)。

Claims (16)

1.用于产生双特异性抗体的方法，其包括以下步骤
(i)确定样品中细胞表面上存在的表面标志物并选择其第一种表面标志物和第二种表面标志物，
(ii)温育(a)缀合第一个结合对的第一个成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv特异性结合第一种表面标志物，(b)缀合第二个结合对的第一个成员的抗体Fab片段或scFv抗体片段，由此Fab片段或scFv抗体片段特异性结合第二种表面标志物，和(c)对映体DNA多核苷酸接头，其在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员，
由此产生双特异性抗体。
2.用于确定抗原结合位点的组合的方法，其包括以下步骤
(i)确定大量双特异性抗体的结合特异性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期，通过组合各自连接第一个结合对的相同第一个成员的第一大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员与各自连接第二个结合对的相同第一个成员的第二大群抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员，以及在其末端之一包含第一个结合对的第二个成员并在各自另一末端包含第二个结合对的第二个成员的对映体DNA多核苷酸接头来制备所述双特异性抗体，
由此第一大群特异性结合第一种细胞表面标志物并且第二大群特异性结合第二种细胞表面标志物，
和
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或亲和力和/或效应功能和/或体内半衰期的双特异性抗体并由此确定抗原结合位点的组合。
3.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述双特异性抗体是这样的复合体，其包含
a)第一个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第一种表面标志物，并且
ii)其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)第二个Fab片段或scFv抗体片段，
i)其特异性结合第二种表面标志物，并且
ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，和
c)对映体DNA多核苷酸接头
i)其缀合第一个结合对的第二个成员，并且
ii)其缀合第二个结合对的第二个成员。
4.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述复合体是非共价复合体。
5.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述结合对是多核苷酸的互补对。
6.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述复合体进一步包含缀合多核苷酸的效应部分，所述多核苷酸与接头的至少一部分互补。
7.权利要求6的方法，其特征在于所述复合体包含缀合多核苷酸的第二个效应部分，所述多核苷酸与缀合第一个效应部分的多核苷酸的至少一部分互补并且ii)不与所述多核苷酸接头互补。
8.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述第一个和第二个Fab片段或scFv抗体片段结合相同靶标和其上的非重叠表位。
9.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述多核苷酸接头包含8-1000个核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸接头包含10-500个核苷酸。
10.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述对映体DNA是L-DNA。
11.权利要求10的方法，其特征在于所述L-DNA是单链L-DNA(ss-L-DNA)。
12.药物制剂，其包含通过权利要求1-11任一项的方法获得的双特异性抗体和任选地药学上可接受的载体。
13.通过权利要求1-11任一项的方法获得的双特异性抗体用作药物。
14.通过权利要求1-11任一项的方法获得的双特异性抗体在制造药物中的用途。
15.治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的通过权利要求1-11任一项的方法获得的双特异性抗体。
16.双特异性抗体，其包含
a)第一个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第一种表面标志物，并且
ii)其缀合第一个结合对的第一个成员，
b)第二个Fab片段或scFv抗体片段
i)其特异性结合第二种表面标志物，并且
ii)其缀合第二个结合对的第一个成员，和
c)对映体DNA多核苷酸接头
i)其缀合第一个结合对的第二个成员，并且
ii)其缀合第二个结合对的第二个成员，
由此第一个和第二个Fab片段或scFv抗体片段与对映体DNA多核苷酸接头形成非共价复合体。
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