CN108473554A - 多特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及异二聚性地系连的双特异性蛋白质复合物(式为(A‑X)2:(Y‑B)2)及其文库/多重复合物在研究和治疗中的应用，特别是在检测在其它方面未知的靶对的协同性生物学功能的体外/离体方法。这样的复合物可以用于俘获从特定细胞分泌的可溶性分子，用于治疗中，用于研究中，以及用于实验目的，例如用于通过鉴定与病理或预后相关的细胞群体而表征患者群的测定中。

Description

多特异性抗体
发明领域
本公开涉及一种新的多特异性蛋白复合物形式和一种用于检测在异二聚性系连的多特异性蛋白复合物中的协同生物学功能的方法，特别是一种离体/体外的方法，多特异性蛋白复合物的文库/多重复合物，及其试剂盒和组合物。本公开还涉及所述多特异性蛋白复合物用于捕获特定细胞分泌的可溶性分子，用于治疗，用于研究和实验目的(特别是在通过识别与病理或预后相关的细胞群体来表征患者群体的测定中)。本公开也延伸到制备所述多特异性复合物的方法。
发明背景
体内生物学机制是极其复杂的信号级联，其难以解析和理解。T细胞的活化需要至少两种信号。
T细胞受体对抗原的识别被认为是第一信号，第二信号产生自共刺激，其由T细胞上的另外的表面分子与抗原呈递细胞上的另外的分子的连接产生。
因此T细胞活化可用于阐明生物学功能的调节可能需要多个信号。其它生物过程同样复杂或更复杂。尽管基于细胞的体外筛选具有对体内机制的见解以及可以帮助获得对体内机制的见解，但如何鉴定调节生物学功能的合适配体对仍存在问题。
广泛预计双特异性抗体在下一代生物治疗剂中起主要作用(D.Holmes,NatureRev Drug Disc Nov 2011:10；798)。它们有可能为更大比例的患者提供优越、长期、广泛的疗效。这可通过在共同的疾病途径内同时共应用不同的抗原(从而减少冗余)来实现；或通过靶向来自独立途径的抗原以提供累加或协同效应来实现。
双特异性抗体有助于获得新颖生物学，诸如：
1)细胞上的交联受体，
2)诱导细胞介导的效应，
3)将细胞因子定位于细胞以调节信号传导或局部阻断细胞因子功能，
4)同时运用多个表位以产生“新活性”，增加功能或特异性，这样的性质由单个单克隆抗体或未连接的抗体(“多个单克隆抗体”)的真正混合物可能不会表现。
目前接合双靶标的策略主要基于对已知机制的合理设计，包括：交联抑制性受体、受体的共接合/簇集、阻断多个刺激途径、抑制性受体的选择性接合和阻断不同途径诸如共刺激和细胞因子信号传导。然而，与已知机制和靶标相关的现有技术状况是该领域取得进展的限制因素。
尽管双特异性抗体作为生物治疗剂具有巨大潜力，但与单克隆抗体相比，它们在发现和开发中也面临更多挑战。两个关键的困难领域是：1)成功的双特异性抗体形式的开发，以及2)选择双特异性抗体将与其交联或共接合的靶标对。
目前已经开发出许多有前景的双特异性抗体形式，其可潜在地充当成功的治疗剂，包括DVD-Ig(Abbvie)、DuoBodies(Genmab)、Knobs-in-Holes(Genentech)、共同轻链(Merus)。然而，在这些情况中的每一种情况下，这些形式都没有理想地适合于高通量靶标-双抗原(target-dual-antigen)发现筛选，以使得能够发现用于与双特异性抗体交联的新型抗原对。
通常对于单个双特异性抗体构建体而言，需要将至少两个可变区从所发现载体的初始来源(例如噬菌体展示、杂交瘤或单个B细胞克隆)亚克隆到合适的双特异性表达载体中，必须表达双特异性的每个臂，并纯化所得的双特异性抗体。如果要组合大量的可变区对以试图筛选所发现的可变区的最有效组合或发现新的抗原对，则这种克隆和随后的表达努力很快就会成为一个重大的实际瓶颈。
例如，如果针对50种细胞表面靶标的小组发现50种独特的抗体，则可能产生总共2500种双特异性抗体(设想为X x Y网格)。对于上述双特异性抗体形式，这可能需要至少100个单独的克隆反应(50-X和50-Y)，然后进行2500个抗体表达实验。将起始单克隆抗体的数量增加到100将使最少克隆反应数量增加到200(100-X和100-Y)，表达数量增加到10,000。
一般而言，这种“表达瓶颈”的根本原因在于上述形式需要最终双特异性构建体的两个蛋白质链“半部分”在同一细胞内在单个表达实验内同时表达。因此，对于许多形式，为了生产2500种双特异性抗体，需要2500个表达实验。
如果双特异性抗体形式是单顺反子的(即克隆并表达为单链蛋白质)，例如单链双抗体，则“表达瓶颈”进一步加剧，因为对于上文给出的数字，克隆实验的数量分别为2500和10,000。
此外，在表达后，可能需要充分纯化来分离所需的构建体。
一些双特异性方法在双特异性构建体中采用共同的轻链以减少克隆的量，尽管这不减少表达实验的数量。此外，使用共同的链，诸如共同的轻链，将使抗体发现的挑战更加艰难，因为抗体需要通过单独的一条链(诸如重链)以足够高的亲和力结合其抗原，所以找到起始抗体可变结构域更加困难。
因此，在大规模和高通量筛选中使用目前的双特异性形式来鉴定新颖抗原对是不切实际的，并且已导致对双特异性抗原靶向持续使用仅仅假设驱动的方法。
我们提出，不设计和测试有限选择的接合两个已知靶标上的给定表位的双特异性抗体，而是利用双特异性抗体来开发获得新颖生物学的真正潜力只能通过广泛的功能筛选努力(所述功能筛选努力利用双特异性抗体或蛋白质配体的大型多样的组合小组)来实现。为了便于这种筛选，需要使得能够产生大量不同的双特异性蛋白质的形式和方法，所述蛋白质可以容易地构建和在各种功能性筛选中筛选功能性效应。这种方法允许偶然鉴定到协同对。
因此，产生和筛选以各种抗原特异性的组合存在的大量多特异性蛋白质复合物将是有用的。具体而言，能够以快速高效的方式产生和筛选大量不同的多特异性抗体复合物将是有用的。如已在上文中所述，存在一系列用于制造多特异性抗体的现有方法。然而，这些方法中的每一种都有其缺点，如在下文中更详细描述的替代方法那样。
如何高效地鉴定双特异性和多特异性构建体的靶标的问题在本领域尚未得到充分解决。例如，WO2014/001326采用蛋白质与DNA片段的化学缀合，其中DNA片段与将两种这样的蛋白质连接在一起(以产生包含至少两种靶向实体的定制的患者特异性多特异性分子)的互补DNA序列杂交。如果将这种方法应用于鉴定新的多特异性组合，那么存在许多与这种方法相关的困难，例如将蛋白质与DNA缀合可导致蛋白质的活性和/或结构受损。特别是蛋白质-DNA杂交物不是天然存在的，因此存在潜在的干扰。另外，连接蛋白质和DNA所需的化学缀合增加了该过程的复杂性、时间和费用。
存在用于产生抗体药物缀合物的偶联和缀合技术和体内靶向技术。常规化学交联是费力的，因为可能需要从同二聚体和其它不需要的副产物中纯化出相关种类。另外，化学修饰步骤可以改变蛋白质的完整性，从而导致稳定性差或生物学功能改变。因此，通过化学交联产生双特异性抗体常常是无效的，并且还可能导致抗体活性的丧失。
制造双特异性抗体的另一种方法是通过细胞融合(例如使杂交瘤杂交)，其中经工程化的细胞表达随机组装的两条重链和两条轻链抗体链。由于有4种可能的变体可供选择，这导致产生10种可能的双特异性抗体组合，其中仅一些(在许多情况下，仅一种)组合是期望的。因此，通过细胞融合产生双特异性抗体导致低的生产率，并且还需要额外的纯化步骤以从所产生的其它双特异性抗体中分离出所需的双特异性抗体。这些不利方面增加了制造时间和成本。
重组DNA技术也已被用于产生双特异性抗体。例如，重组DNA技术也已被用于产生“旋钮入孔(knob into hole)”双特异性抗体。“旋钮入孔”技术涉及在CH3结构域界面处在多聚化结构域中对空间互补突变进行工程化(参见例如Ridgway等，Protein Eng.9:617-621(1996)；Merchant等，Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998)；也参见，美国专利号5,731,168和7,183,076)。这种策略的一个限制是两个亲本抗体的轻链必须相同，以防止在同一细胞中表达时错配和形成不需要的和/或无活性的分子。每个双特异性(其重链和轻链)必须在单个细胞中表达，蛋白质产物通常含有约20％的同二聚体，随后通过纯化除去所述同二聚体。
其它方法基于全长IgG4分子(Genmab Duobody)中链的天然交换。交换是一个动态的过程，这可导致与实际测试的实体是何物相关的困难。
因此，需要产生多特异性蛋白质复合物以使得能够实现多特异性抗体的更有效和更高通量的筛选的新方法。具体而言，需要这样的形式和方法，在所述形式和方法中，可容易地组合从可用抗体或抗体片段库中选择任何两种抗体或抗体片段以高效地产生不同多特异性抗体的多重复合物，同时例如避免同二聚体的形成或使其最小化。当筛选抗原特异性的新组合的协同生物学功能时，特别是在异二聚体对于发现该功能是必需的情况下，高效地组装不同多特异性抗体尤其重要。
发明概述
在一个方面，提供了特别适用于筛选的新的双特异性形式，因为所有组分个体可以作为单独的单元从细胞表达，而基本上没有聚集，并且单元可以仅通过混合而无需使用缀合或偶联化学来组装，并且具有最低限度的同二聚化。
因此本发明提供了一种具有式(A-X)2:(Y-B)2的多特异性蛋白复合物，其中:
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚性系链；
:是X与Y的结合相互作用；
A是多特异性蛋白复合物的第一蛋白质组分，它是全长抗体的一半，包含轻链(VLCL)和全长重链(VHCH1CH2CH3)配对；
B是多特异性蛋白复合物的第二蛋白质组分，其选自Fab或Fab’片段、sdAb或scFv；
X是结合对的第一结合伙伴，其选自下述：
i.与A连接的抗原、scFv或sdAb，任选地通过接头，和
ii.插入在A的重链的CH1和CH2之间的抗原、scFv或sdAb，任选地通过接头；和
Y是所述结合对的第二结合伙伴，其与B连接，独立地选自抗原、Fab片段、Fab’片段、scFv和sdAb，例如Fab或Fab’的轻链或重链；
条件是，当X是抗原时，则Y是特异于由X代表的抗原的Fab片段、Fab’片段、scFv或sdAb，以及当Y是抗原时，则X是特异于由Y代表的抗原的scFv或sdAb。
在本说明书中，融合蛋白的术语“A-X”和“Y-B”可以类似地表示为“X-A”或“B-Y”。这也适用于异二聚性系链“X:Y”，其也可以用“Y:X”来表示。更具体地说，X和Y可以在A和B的或N端或C端分别与A和B融合。
本发明的多特异性蛋白复合物各包含全长抗体，其中包含两个A-X单位，它们二聚化产生包含Fc域的全长抗体。这样蛋白质组分A包括全长抗体的一半，即含有可变区(VL)和恒定区(CL)二者的轻链与全长重链配对，所述全长重链包含有与恒定区(CH1)连接的可变区(VH)，该恒定区又继而与两个另外的恒定区(CH2CH3)连接。
在一个实施方案中，X与A的重链的C-末端(即CH3的C-末端)融合，可选地通过接头。
在一个实施方案中，X与A的轻链的C-末端(即CHL的C-末端)融合，可选地通过接头。
在一个实施方案中，X被插入到A的重链的CH1和CH2之间，可选地通过一个或多个接头。
在一个实施方案中，B是Fab片段。
在一个实施方案中，B是dsAb，例如VHH或scFv。
在一个实施方案中，Y与Fab或Fab’片段(B)内的重链的C－末端融合(可选地通过接头)，特别是Y通过接头与Fab或Fab’片段内的重链的C－末端融合。
在一个实施方案中，Y与Fab或Fab’片段(B)内的轻链的C－末端融合(可选地通过接头)，特别是Y通过接头与Fab或Fab’片段内的轻链的C－末端融合。
在一个实施方案中，变量X或Y是抗体结合片段，例如Fab片段、Fab’片段、scFv、Fv、VH、VL或sdAb，而另一个变量是肽。
在一个实施方案中，变量X或Y是Fab片段，Fab’片段，scFv或sdAb，并且另一个变量是肽，例如特异于肽GCN4、其变体、衍生物或片段(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1－38)的Fab片段，Fab’片段，scFv或sdAb。
在一个实施方案中，变量X或Y是scFv或sdAb，另一个变量是肽，例如GCN4、其变体、衍生物或片段(表1A中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1－38，其中粗体的氨基酸是任选的，斜体的氨基酸是接头的序列)。在一个实施方案中，X或Y是scFv 52SR4(SEQ IDNOs:3,98或99，或SEQ ID NO:3的氨基酸1－243)。编码SEQ ID NO:1所示的GCN4肽的核苷酸序列在SEQ ID NO:1A中以SEQ ID NO:2显示。
表1A
在一个实施方案中，X独立地选自抗原、scFv、sdAb和肽，前提条件是：当X是肽或抗原时，Y是抗体或其结合片段，例如scFv,Fab或sdAb，以及当X是scFv,Fab或sdAb时，则Y是抗原或肽。
在一个实施方案中，Y独立地选自抗原、scFv、sdAb、抗原或肽，前提条件是：当Y是抗原或肽是，X是抗体或其结合片段，例如scFv,Fab或sdAb，以及当Y是scFv,Fab或sdAb时，则X是抗原，例如肽。
在一个实施方案中，X或Y是肽GCN4、其变体、衍生物或片段(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:1的氨基酸1－38)，例如其表位片段。
在一个实施方案中，X是肽，例如GCN4、其变体、衍生物或片段(SEQ ID NO:1或SEQID NO:1的氨基酸1－38).
在一个实施方案中，Y是肽，例如GCN4、其变体、衍生物或片段(SEQ ID NO:1或SEQID NO:1的氨基酸1－38)。
在一个实施方案中，X或Y是长度为5－25个氨基酸的肽，例如长度为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25个氨基酸。
表1B中显示了GCN4肽的其它变体(SEQ ID NO:75-97)，其中以粗体表示的氨基酸是任选的，以斜体表示的氨基酸形成接头的序列。应该注意的是，尽管根据SEQ ID NO:75至82中所示的序列的变体包含4次4个甘氨酸残基和1个丝氨酸(G4S)的重复的接头，但本文中还设想了接头更短(1x G4S、2x G4S或3x G4S)或更长(5x G4S等)的变体。
表1B
应该理解的是，A-X和Y-B融合蛋白可以以各种方向产生，这意味着编码此类融合物的多核苷酸构建体可以被设计成在两个方向表达X或A(A-X，其中A的C端与X的N端融合，或者X-A，其中X的C端与A的N端融合)。这同样适用于Y-B融合物。
无论A、X、Y或B是否位于融合物的N端，产生此类融合物的多核苷酸序列将包含被设计成在融合物的最N端编码信号肽序列的核苷酸序列，用于辅助细胞外释放。信号肽最终从成熟融合体切割下来。优选的信号肽序列在表1A中以SEQ ID NO:100-103显示。
在一个实施方案中，X和Y之间的结合亲和力是5nM或更强，例如900pM或更强，如800、700、600、500、400或300pM。
在一个实施方案中，A或B中的至少一个特异于独立地选自下述的抗原：细胞表面受体例如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、免疫球蛋白样受体、基质金属蛋白酶和膜类型的基质金属蛋白酶、金属蛋白酶的组织抑制剂、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCRs、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子例如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素、酶和离子通道，包括其翻译性修饰的形式，其包含至少一个表位的片段。
在一个实施方案中，A或B中的至少一个特异于细胞标志物，例如B或T细胞标志物。
在一个实施方案中，本发明的多特异性蛋白质复合物以预先形成的复合物(A-X)2:(Y-B)2或者在同一时间或不同时间添加的组分(A-X)2和B-Y的混合物的形式应用。应当理解，(A-X)2中的每个X与(B-Y)2的B-Y蛋白融合体的Y相结合。
在一个实施方案中，所述复合物应用于其中A泊入细胞表面标志以及B结合由细胞分泌的可溶性分子的方法中，或相反的情况，即A结合由细胞分泌的可溶性分子，而B泊入细胞表面标志。
在一个实施方案中，A特异于第一细胞上的蛋白质(例如细胞表面标志)，B特异于不同细胞类型或亚型上的蛋白质(例如细胞表面标志)。
应当理解，本形式的变通方法可以通过在标准IgG的一条臂的每一端包含A和X来进行。因此，IgG的两条臂之一的可变区将结合例如细胞表面标志或者可溶性分子，而另一臂的可变区将结合Y。
在一个实施方案中，感兴趣的可溶性分子选自下述中：激素，细胞因子，趋化因子，化学引诱物，白三烯，前列腺素，血管活性胺，酶，补体和补体片段，脂质，鞘脂，第二信使组分(例如一氧化氮，环AMP等)，维生素，矿物质，阳离子，阴离子，糖，凝血因子，急性期蛋白，γ球蛋白(包括免疫球蛋白)，白蛋白，可溶性细胞膜受体，细胞表达蛋白的剪接变体，核酸，小膜囊泡(如外体，微泡，脂质体等)，分泌肽，免疫复合物和来自死亡或垂死细胞的细胞内蛋白质。
在活化状态下，细胞可能分泌一种或多种细胞因子。因此，在一个实施方案中，所述可溶性分子是细胞因子，例如GM-CSF,IFNγ,TNFα,TGFβ,CCL20,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL12,IL-13,IL-17,IL-18,IL-21,IL-22,IL-24,IL-26,IL-27和IL-33。本发明的多特异性复合物可以用于检测产生细胞因子的细胞，以用于分离、检查、中和和/或靶向。这具有许多应用，例如产生Th2细胞因子的细胞被认为例如通过分泌IL-17,IL-13和IL-5中的一种或多种细胞因子而对肺疾病例如哮喘具有有害功能。
在一个实施方案中，感兴趣的可溶性分子是趋化因子，其例如选自下述中：CCL1,2,3,4,5,6,7,8,9/10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,CXCL1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,XCL1,XCL2和CX3CL1。
在一个实施方案中，免疫球蛋白是由B细胞或浆细胞分泌的(即是本发明上下文中的可溶性分子)，例如A特异于由所述细胞表达和分泌的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
因此，在一个实施方案中，(A-X)2融合蛋白的A特异于一种特定的抗体同种型，其例如选自：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE和IgM。这些标志物对于鉴定种类转换的细胞可能特别有用。或者，A可能是能够特异性结合由细胞分泌的免疫球蛋白的结合结构域的抗原。
在一个实施方案中，Y-B融合蛋白的蛋白质组分B对抗体是特异性的，例如B对由所述细胞分泌的免疫球蛋白内的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区是特异性的。B可以特异于特定抗体同种型，其例如选自下述中：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE和IgM。或者，B可以是能够特异性结合所述细胞分泌的免疫球蛋白的结合结构域的抗原。
因此，在一个实施方案中，所述方法采用与细胞表面标志物结合的(A-X)2，而Y-B中的B被用于捕获分泌的免疫球蛋白。
一般而言，如果B特异于细胞分泌的免疫球蛋白，例如B是特异于所分泌的免疫球蛋白的恒定区中的表位的抗体或结合片段，或者B是所分泌的免疫球蛋白的结合结构域具备特异性的抗原，那么A通常将针对(特异于)本身不是相应的表面表达的免疫球蛋白的细胞表面标志物。
或者，可以使用除免疫球蛋白外的B细胞标志物物，以通过一个结合结构域(例如B)将双/多特异性蛋白质复合物锚定在细胞表面，然后A可以包含对所分泌的免疫球蛋白的恒定区内的表位特异的抗体或结合片段，或A是所分泌的免疫球蛋白的结合结构域具备特异性的抗原。
本方法可用于检测产生抗体的细胞，以用于分离、检查或靶向，例如产生自身抗体或病原体特异性抗体的浆细胞(特别是在表面IgG阴性细胞的情况下)。
因此，本发明的方法可以应用于免疫球蛋白亚类特异性应答的分离，例如IgG4而非IgG其他亚类的特异性捕获，其可以证明可用于治疗或检测IgG4样疾病。
在一个实施方案中，细胞表面标志物选自稳定表达的细胞谱系标志物和在非谱系细胞上稳定表达的标志物。
在一个实施方案中，细胞标志物选自B细胞标志物或T细胞标志物。
在一个实施方案中，B细胞标志物独立地选自下述中：CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD27,CD35,CD38,CD40,B220(也已知为CD45),CD43,CD138,CXCR4,BCMA和IL-6R，例如CD38,CD138,CD45,CD27,CD19或CD20，例如CD38或CD13。
本领域技术人员知道一些表达抗体的细胞也在其表面上表达免疫球蛋白。这种表面结合的免疫球蛋白可以用作抗体产生细胞的细胞表面标志物。在一个实施方案中，A或B中的结合结构域对作为细胞表面上的免疫球蛋白一部分表达的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区是特异性的，例如泛特异于抗体同种型或特异于例如选自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE和IgM的特定抗体同种型。
在一个实施方案中，所述T细胞标志物选自：CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD25,CD127CD196(CCR6),CD197(CCR7),CD62L,CD69和CD45。
如上所述，本公开的复合物可用于基于其分泌表型通过捕获所述细胞分泌的可溶性分子来鉴定细胞群，例如T细胞群。一个例子是捕获CD4阳性T细胞上的IL-17，以鉴定或分离与自身免疫的发作和维持有关的T辅助17细胞。
在活化状态下，细胞可以分泌例如本文所述的一种或多种细胞因子。本公开的多特异性复合物可以用于检测产生细胞因子的细胞，以用于分离、检查、中和和/或靶向。
Th2细胞因子产生细胞被认为例如通过分泌选自IL-17、IL-13和IL-5中的一种或多种细胞因子而在肺疾病如哮喘中具有有害的功能。
如上所述，趋化因子可被本公开的多特异性抗体复合物中的结合结构域靶向。
本公开的抗体形式是能够使得双特异性抗体和多特异性抗体可以容易地组装的形式，它们可以用于筛选患者(并且例如从其获得的离体样品，例如血液样品)以获得对疾病机制和/或预后的了解和/或确定的患者亚组和/或将患者分配到亚组。
可快速制备本公开的抗体复合物以包含对细胞表面标志物特异的结合结构域，通过该结合结构域将复合物锚定在所需细胞的表面上。另一个结合结合域特异于：
·另外的细胞表面标志物，
·含有对细胞表面标志物特异的结合结构域的抗体或结合片段，
·由所述细胞分泌的可溶性因子，或
·抗原。
因此，根据本公开的双/多特异性形式可用于细胞的检测，鉴定，分离，表征和/或定量。
在一个实施方案中，选自A或B的第一结合结构域特异于CD38，CD138，CD45，CD27，CD19或CD20(如CD38或CD138)；和
选自A和B的第二结合结构域特异于CH1，CK，Fc泛同种型，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE或IgA。
在一个方面，提供了采用根据本公开内容的式(A-X)2:(Y-B)2的异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)向细胞中引入未复合形式的融合蛋白A-X和B-Y组合或以异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物形式加入(A-X)2:(Y-B)2用于分析，和
ii)检测蛋白质组分B对目标可溶性分子的捕获(例如结合)。
此外，本发明人设计了检测根据本公开的式(A-X)2:(Y-B)2的异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物中的协同功能的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)在功能测定中针对包含至少一种异源二聚性系连的多特异性蛋白复合物的多重复合物的部分或全部测试活性；和
(ii)分析来自该功能测定的读数以检测异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能。
还提供了应用根据本公开的式(A–X)2:(Y-B)2的异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物的方法，其中所述方法包括向细胞的群体中加入：
(i)未复合形式的融合蛋白A-X和B-Y的组合，或者
(ii)以异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物形式存在的(A-X)2:(Y-B)2。
复合物本身上下文中描述的要素同样适用于应用于本公开的方法中的复合物。
在一个实施方案中，(A-X)2和B-Y在步骤i)中作为单独的组分同时加入。
在一个实施方案中，(A-X)2和B-Y在步骤i)中作为预先形成的复合物同时加入。
在一个实施方案中，(A-X)2和B-Y在步骤i)中作为单独的组分在不同时间加入。
本公开的形式对于用于筛选是理想的，因为表达单元(A-X)2或单元B-Y不存在困难。每个单元(A-X)2或B-Y表达后所需的纯化量最小或实际上是不必要的。
多特异性复合物可以通过简单混合相关单元而以1:2摩尔比(具有2个B-Y单元)形成，即不依赖于缀合和偶联化学。结合伙伴X和Y进一步驱动平衡，以有利于形成所需的异二聚体多特异性复合物。在异二聚化后形成复合物后，同样需要很少纯化或不需要纯化。因此可以容易地制备和组合大量的(A-X)2和B-Y。
本发明的多特异性复合物及其制备方法的简单性在促进可变结构域对的高通量筛选以找到新的靶抗原组合以及针对给定组合优化可变区序列方面具有巨大的优势。
在一个实施方案中，本公开的异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物或其单位(即(A-X)2和B-Y)在体内使用。特别地，通过在体外混合(A-X)2和B-Y来制备所述异源二聚性系连的多特异性蛋白质复合物。因此，在一个实施方案中，所述方法包括使(A-X)2和B-Y接触的体外混合步骤。
因此，通常不在同一细胞中共表达融合蛋白(A-X)2和B-Y。这是有利的，因为其允许例如100种融合蛋白表达和任选地纯化，并且随后以各种排列混合这100种融合蛋白可提供10,000种异二聚性系连的多特异性蛋白复合物，其中5,000种是独特的对。
相反，某些现有技术方法需要多特异性的共表达，因此对于10,000种复合物，需要10,000次转染、表达和纯化。
然而，如果需要，可以在同一细胞中表达(A-X)2和B-Y。
结合伙伴X和Y彼此之间具有亲和力，并充当或棒状磁铁的生物学等同物，并将复合物保持在一起。有利地，这意味着融合蛋白(A-X)2和Y-B可以仅通过将融合蛋白混合在一起而容易地组装成多特异性蛋白复合物。因此，本公开的多特异性蛋白复合物具有模块化结构，其允许两种不同的蛋白A和B容易地组装，以便例如以网格状方式产生具有不同抗原特异性组合的多特异性蛋白质复合物的大排列组。这允许高效和系统地筛选大量的多特异性蛋白质复合物，以检测累加性、协同性或新颖的生物学功能。
鉴于X和Y对于彼此是特异的，因此这显著降低了形成均二聚体的能力。X和Y在本文中统称为结合对或结合伙伴。在一个实施方案中，X对其它X不具有高亲和力。在一个实施方案中，Y对其它Y不具有高亲和力。有利的是，当X和Y不形成同二聚体时，这防止了不需要的单特异性蛋白质复合物的形成，提高了所需多特异性蛋白质复合物的产率，并且消除了对除去单特异性蛋白质复合物的繁琐纯化步骤的需要。
这允许多特异性蛋白质复合物的快速组装，其产率和/或纯度是通过大多数现有技术方法所无法有效获得的，特别是现有技术方法通常需要广泛的纯化步骤。多特异性复合物的产率在本发明中通常为75％或更高。
进一步有利的是，多特异性蛋白质复合物允许筛选复合物，其中组成蛋白质(包括被组成蛋白质结合的抗原)不具有已知的关系或处于不同的潜在不相关的途径中，诸如可在多特异性蛋白质复合物中测试在两种不同途径中发挥作用、并且例如本领域技术人员通常不会预计到其彼此接触的两种蛋白质，以鉴定累加性、协同性和/或新颖的功能。
此外，可以平行研究针对给定的抗原或表位的多个结合区(诸如可变区)以鉴定生物学功能的细微差别。这允许研究和优化针对给定的一对抗原的可变区序列的组合。
本发明的方法允许科学显示结果，并且不依赖关于生物学功能的预先设想的想法和技术上的偏见。这种方法可能非常强大。
有利地，X和Y组分允许包含由融合蛋白的不同排列构成的多特异性蛋白质复合物的多重复合物迅速且容易地组装。
在一个实施方案中，蛋白质A和B是抗体或抗体片段。当抗体或抗体片段通过X和Y保持在一起成为复合物时，形成多特异性抗体复合物。
附图描述
图1是根据本公开将(A-X)2和B-Y单元混合的图示。
图2是根据本公开用于筛选的网格格式的图示。
图3是根据本公开的异二聚性系连的多特异性蛋白复合物及其组分/单元的示意图。
发明详述
如本文所用的“多特异性蛋白质复合物”是指包含两种蛋白质的分子(A和B，本文中称为多特异性组分，在本文中也分别称为多特异性的第一蛋白质组分和第二蛋白质组分)，其通过异二聚性系链保持在一起。所述蛋白质之一或两者可以包含另外的结合结构域，使得复合物总体上具有多于两个结合位点(不包括该异二聚性系链)。
因此，多特异性蛋白质复合物可以包含三个或更多个结合结构域，并且可以是例如三特异性的。当有三个结合位点时，它们可以独立地结合相同或不同的抗原。在一个实施例中，所述复合物结合两种不同的抗原，即两个结合位点结合相同的抗原，第三个结合位点结合另一种不同的抗原。在一个实施例中，三个结合位点结合三种不同的抗原。
如本文中所用，“融合蛋白”包含与结合伙伴X或Y融合(视情况而定)的蛋白质组分A或B。在一个实施方案中，融合蛋白是通过重组技术从基因构建体表达的翻译蛋白，例如在宿主中从DNA构建体表达的。在本公开的说明书中，融合蛋白的关键特征之一是其可以从细胞中表达为“单个蛋白质/单元”(当然，在包含Fab/Fab'片段的融合蛋白的情况下将存在两条链，但是为了本说明书的目的，这将被认为是具有一条链的单个蛋白质，优选重链根据需要在其C-端与X或Y融合，任选地通过如本文下面所述的接头；诸如与X和Y的N端融合的其它方向也是可能的)。
异二聚性系链X:Y的功能是使蛋白质A与B保持彼此靠近，使得可以例如采用本文所述的方法实现或鉴定A和B的协同功能。
此处使用的单位指(A-X)2和B-Y。
此处使用的组件指的是单元或组件。
如本文中所用，术语“异二聚性系链”是指包含两个不同结合伙伴X和Y的系链，其在彼此之间形成相互作用(诸如结合)，该相互作用的总体亲和力。足以使两个结合伙伴保持在一起。在一个实施方案中，X和/或Y不适合于形成同二聚体。
异二聚性系连和异二聚性系链在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，如本文中所用，“不适合形成同二聚体”是指X-Y异二聚体的形成比同二聚体更为优选，诸如一旦形成后更稳定，诸如热力学稳定。在一个实施方案中，X与Y之间的结合相互作用是单价的。
在一个实施方案中，X-Y相互作用比X-X或Y-Y相互作用更有利。当融合蛋白A-X和B-Y混合时，这减少了同二聚体X-X或Y-Y的形成。在以1:1的摩尔比混合后通常形成超过75％的异二聚体。
如果需要，可采用纯化步骤(特别是一步纯化)，诸如柱层析，以便例如纯化根据本公开的融合蛋白单元和/或多特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，在表达所述融合蛋白或每种融合蛋白后提供纯化步骤，尽管通常聚集物水平低。因此，在一个实施方案中，在体外混合之前，融合蛋白以基本上纯的形式提供。如本文所用的基本上纯的形式是指其中融合蛋白是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的单体。
在一个实施方案中，不进行融合蛋白的纯化。
在一个实施方案中，每种融合蛋白单元在不同的表达实验/运行中表达。
在一个实施方案中，在混合以产生多特异性蛋白质复合物之前不进行融合蛋白的纯化。在一个实施方案中，在混合之前和/或之后不进行融合蛋白的纯化。
在一个实施方案中，在多特异性蛋白质复合物形成后不需要纯化。
在一个实施方案中，在混合之后并且通常无需进一步纯化，组合物的至少50％是所需的多特异性蛋白质复合物，例如至少60％、65％、70％、75％、80％的组合物是所需的多特异性蛋白质复合物。
本公开还扩展至制备根据本公开的多特异性复合物的方法，包括将融合蛋白(A-X)2和B-Y例如以1:2的摩尔比混合。
在一个实施方案中，混合在体外发生。
在一个实施方式中，混合在细胞中，诸如宿主细胞中发生。
在一个实施方案中，混合在体内发生，即融合蛋白(A-X)2和B-Y在受试者体内彼此相互作用以形成异二聚性系链，并因此形成多特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，X和Y彼此是完全特异的，并且不与细胞内或受试者体内的任何其它肽/蛋白质结合。这可例如通过确保X和Y不天然存在于靶细胞或目标受试者体内来实现。这可以例如通过选择来自与受试者不同的物种或实体(诸如酵母蛋白)的X或Y并确保另一变量对其是特异的来实现。有利的是，这防止了融合蛋白A-X和/或B-Y与不需要的靶标结合(从而产生不想要的脱靶效应)。
在一个实施方案中，一种(或至少一种)结合伙伴不能形成同二聚体，例如对结合伙伴的氨基酸序列进行突变以消除或最小化同二聚体的形成。
在一个实施方案中，两个结合伙伴都不能形成同二聚体，例如对肽结合伙伴的氨基酸序列进行突变以消除或最小化同二聚体的形成，并且使用对其特异的VHH。
如本文中所用的不能形成同二聚体或聚集体是指形成同二聚体或聚集体的低倾向或零倾向。如本文中所用，低是指例如在混合或表达或纯化后5％或更少，诸如4％、3％、2％、1％、0.5％或更少的聚集体。
融合蛋白中聚集物或异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物中残余物的量少通常对本公开的筛选方法具有最小的影响。因此，在一个实施方案中，本方法中不使用融合蛋白和/或多特异性蛋白质复合物的纯化，特别是在混合步骤之后。
在一个实施方案中，:是基于吸引力(例如范德华力)的结合相互作用，诸如氢键合和静电相互作用，特别是基于抗体对抗原(诸如肽)的特异性。
在一个实施方案中，:是从特定化学相互作用(诸如点击化学法)形成的共价键。在一个实施方案中，:不是共价键。在一个实施方案中，不使用缀合/偶联化学来制备本公开的多特异性蛋白质复合物。
如本文中所用，“形成复合物”是指包括结合相互作用或化学反应的相互作用，当将融合蛋白组分A-X和B-Y在组装复合物的适当条件下接触并且融合蛋白保持在一起时，所述相互作用足够特异和强。
本文中所用，“保持在一起”是指将组分(融合蛋白)保持在彼此附近，使得在X:Y结合之后，复合物可以如同一个分子一样进行处理，并且在许多情况下表现得像单个分子并像单个分子一样起作用。在一个实施方案中，保持使复合物适用于本文公开的方法，即适用于至少一个功能筛选。
本文中采用的特异性是指例如相互作用中的伙伴例如X:Y或A与抗原或B与抗原仅识别彼此或与非伙伴相比具有显著更高的彼此亲和力，例如是例如与不相关的非伙伴蛋白的结合的背景水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍的亲和力。
如本文中所用，与X和Y相关的特异性是指相互作用中的结合伙伴X和Y仅彼此识别或与非伙伴相比具有显著更高的相互亲和力，例如高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍的亲和力。
在一个实施方案中，结合相互作用是可逆的。在一个实施方案中，结合相互作用基本上是不可逆的。
如本文中所用，基本上不可逆是指抗体或结合片段的缓慢解离速率(解离常数)。
在一个实施方案中，X与Y之间的结合相互作用具有低解离常数。
低解离常数的实例包括1-9x10-2s-1或更少，例如1-9x10-3s-1、1-9x10-4s-1、1-9x10- 5s-1、1-9x10-6s-1或1-9x10-7s-1。特别合适的解离常数包括2x10-4s-1或更少，例如1x10-5s-1、1x10-6s-1或1x10-7s-1。
尽管不希望受理论束缚，但认为低解离常数(也称为解离速率)使得该分子足够稳定而使多特异性蛋白质复合物有用，特别是在功能性筛选测定中。
在一个实施方案中，X与Y彼此之间的结合亲和力为5nM或更强，例如900pM或更强，如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM或50pM或更强。
在另一个实施方案中，X与Y彼此的亲和力为10pM或更强，诸如9pM、8pM、7pM、6pM或5pM。
亲和力是根据实体的结合和解离速率计算的值。如本文中所用，术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合伙伴(例如肽)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子对其结合伙伴的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些方法，诸如表面等离子体共振方法，特别是BIAcore。
然而，将复合物保持在一起的能力不仅仅关乎亲和力。虽然不希望受到理论的束缚，但我们假设实际上存在三个重要的组成部分：结合速率、解离速率和亲和力。亲和力的计算基于结合速率和解离速率。因此，如果结合速率低并且解离速率快，则亲和力将会低并且不足以将多特异性蛋白质复合物保持在一起。然而，缓慢的结合速率可通过缓慢的解离速率来补偿，从而提供总体适合的亲和力。在一些实施方案中，高结合速率可能足以将复合物保持在一起。
如果复合物中使用的结合伙伴(X和Y)具有缓慢的结合速率，则在混合组分后可能需要额外的时间来使复合物形成。
如果结合伙伴之间的亲和力足够高，即使多特异性蛋白质复合物的蛋白质(A和B)的亲和力仅与它们的靶标弱结合，多特异性蛋白质复合物仍可能执行其所需的生物学功能。相反，如果蛋白质(A和B)能够与其靶标强力结合，即使结合伙伴(X和Y)彼此的亲和力较低，也可能实现相同的生物学功能。换言之，存在“三位一体”(trinity)关系，使得结合伙伴之间的较高亲和力可以补偿针对靶标的较低亲和力，反之亦然。
本发明的多特异性蛋白质复合物可用于任何合适的应用，包括功能筛选。这种新颖的形式在多重功能筛选中特别有用，以基于功能鉴定蛋白质靶标，和鉴定可被多特异性疗法靶向的那些靶蛋白上的最佳表位。此外，在蛋白质A和B为抗体或其结合片段的情况下，多特异性蛋白质复合物还可用于多重功能筛选以鉴定用于多特异性抗体治疗剂的最佳可变区对。
如本文中所用，“多重复合物”是用于测试的实体群体，包括:
经组合以产生至少一种异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物的至少两种组分融合蛋白((A-X)2(Y-B)2)和以相同或不同形式存在的至少一种相关生物学比较物，或
至少两种异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物和任选地以相同或不同形式存在的至少一种相关生物学比较物。
显然有用的是，用作比较物的不同形式必须适合于在本公开中采用的功能性体外测定中进行测试。在一个实例中，多重复合物中的比较物是(A-X)2和B-Y的单价混合物或(A-X)2-Y-A的二价单特异性复合物。
在一个实施方案中，多重复合物包含1种至数十万种异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物，例如2至500,000种所述复合物，诸如2至100,000种或2至10,000种，特别是通过在网格中将第一和第二融合蛋白((A-X)2和Y-B)混合2至100秒产生的。在一个实施方式中，多重复合物包括例如2至1,000种，诸如2至900种、2至800种、2至700种、2至600种、2至500种、2至400种、2至300种、2至200种、2至100种、2至90种、3至80种、4至70种、5至60种、6至50种、7至40种、8至30种、9至25种、10至20种或15种多特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，该多重复合物中的异二聚性系连的多特异性蛋白质的数目是n2，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多。
多重复合物可呈阵列的形式，例如微量滴定板，其中微孔板的每个孔可含有不同的多重复合物可呈阵列的形式，例如微量滴定板，其中微孔板的每个孔可含有不同的多特异性蛋白质复合物。可将多特异性蛋白质复合物系连于固体基底表面，诸如附着于珠粒，或者可将它们以液体(诸如溶液或介质)形式悬浮于例如孔内或液滴内。
在一个实施方案中，多重复合物中的每个“A”都是不同的蛋白质，优选与靶抗原结合的抗体或其结合片段，并且每个“B”是不同的蛋白质，优选结合靶抗原的抗体或其结合片段。
在一个实施方案中，在如下面论述的网格(例如分别等同于64、256或320个样品的8x 8、16x 16或16x 20)中提供多重复合物。
如本文中所用，“网格”是指二维图或阵列，其中一个变量(诸如蛋白A(在(A-X)2中))沿着一个轴(诸如X轴(水平轴))变化，并且另一个变量(诸如蛋白质B(在B-Y中))沿着另一个轴(诸如Y轴(垂直轴))变化。这种排列有助于系统地评估变量的各种组合(排列)。
在一个实施方案中，在96孔板上提供多重复合物，分析的样品可以是其倍数，即96倍、192倍、384倍等。
有利地，网格排列对于高效筛选根据本公开的多特异性蛋白质复合物的生物学功能是特别有利的。在这种网格的一个实例中，可将4种第一融合蛋白容易地与4种第二融合蛋白组合以产生16种多特异性蛋白质复合物。
筛选网格的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的，例如可将第一融合蛋白(A-X)2中的第一蛋白(A)保持不变，而使第二融合蛋白(B-Y)中的第二蛋白(B)变化。这对于快速筛选大量不同的第二蛋白以寻求与预先选择的第一蛋白的协同功能是有用的。
在另一个实施方案中，通过改变蛋白质A的抗体可变区来使得蛋白质A沿着一条轴变化，使得每个抗体变体对相同抗原是特异的，但具有可变区的不同组合。蛋白质B可保持不变，或者也可以以相同的方式变化或使得针对B蛋白质的抗原特异性改变而变化(横穿网格或沿网格向下)。
有利地，当多特异性蛋白质复合物对相同抗原特异但具有可变区的不同组合时，这样的筛选网格可潜在地允许检测协同功能的微小差异。
在一个实施方案中，根据本公开的“共同”第一融合蛋白(A-X)可存在于每个孔内。然后可将根据本公开的一系列不同的第二融合蛋白(B-Y)分配到每个孔中。随后，两个结合伙伴(X和Y)的特异性结合相互作用物理地将两种融合蛋白拉在一起以形成多特异性蛋白质复合物。这导致包含多特异性蛋白质复合物的多重复合物，所述复合物全部结合至共同第一靶抗原(由A结合)，但也能够结合第二靶抗原(由B结合)，所述第二靶抗原对于每种多特异性蛋白质复合物可以不同。
在一个实施方案中，B-Y融合蛋白包含针对相同靶抗原的不同可变区，以允许当与(A-X)2中的可变区组合时优化被B结合的给定靶抗原的可变区和/或表位。
如本文中所用，“共同”第一融合蛋白质是这样的融合蛋白质，其中其A或B组分与相同的蛋白质或表位结合，特别是当A或B组分在共同融合蛋白质中具有完全同一性时，即共同第一融合蛋白质始终包含相同的可变区序列。
本领域技术人员也知道上述的不同变化，使得可以容易地控制多重复合物中每个位置处的多特异性蛋白质复合物的所需特异性。当在功能测定中使用这种多重复合物时，这允许高效筛选多特异性蛋白质复合物的不同组合。在一个实施方案中，将因子设计用于定义网格中使用的变量。
在一个实施方案中，本公开的方法有助于高通量分析。
在一个实施方案中，平行或基本上同时测试多种多特异性蛋白质复合物。
如本文中所用，同时是指在同一分析中(诸如在同一“运行”中)分析样品/分子/复合物。这可以是有利的，因为通常地用于给定样品运行的试剂将是相同的批次、浓度、细胞来源等，因此具有相同的性质。此外，进行分析所处的环境条件，诸如温度和湿度可能相似。
在一个实施方案中，同时是指伴随分析，其中基本上在同一时间通过仪器分析信号输出。该信号可能需要解析来解释所获得的结果。
有利地，测试多个多特异性蛋白质复合物可允许更高效地筛选大量多特异性蛋白质复合物和鉴定新的和有趣的关系。
在一个实施方案中，通过使用如上定义的多重复合物并对其进行一种或多种功能测定来测试多种多特异性蛋白质复合物。
如本文中所用，术语“生物学功能”是指对于被测试的生物实体是天然的或作为所述生物实体的目的的活性，例如细胞、蛋白质或类似物的天然活性。理想地，可使用体外功能测定来测试生物学功能的存在，包括采用哺乳动物细胞诸如活细胞(诸如B或T细胞)或离体组织的测定。本文中采用的天然功能还包括异常功能，诸如与疾病诸如癌症相关的功能。
本文中采用的相关“生物学比较物”是指用于在与用于本文中采用的相关“生物学比较物”是指用于在与用于多特异性蛋白质复合物的测定相同的测定中评估活性，以确定是否存在任何改变或新颖活性或功能的合适实体。用于(A-X)2:(Y-B)2的合适比较物可包括呈天然形式的或以与多特异性蛋白相同的形式存在的纯化蛋白质(包括重组蛋白质)，例如其中A和B为相同的实体，诸如(A-X)2:(Y-A)2或B-X:Y-B，即二价单特异性复合物。或者，呈未复合形式的融合蛋白(A-X)2或B-Y可单独用作比较物或一起用作未复合的混合物诸如(A-X)2和B-X一起或(A-Y)2和B-Y一起。或者，可采用不同形式(特别是如本文所述的)的多个比较物。本领域技术人员能够基于在文献中找到的公知常识或信息来鉴定和包括合适的对照/比较物。
如本文中所用，术语“协同功能”或“协同生物学功能”是指生物活性或生物活性水平或者对生物学功能或活性的影响，所述生物学功能或活性：
●对于单个融合蛋白组分没有观察到，除非采用多特异性(并且可包括对针对所述抗原的抗体组合观察到的活性，所述活性不是以多特异性形式存在的，但特别地指仅当两个结合域以多特异性形式连接时才被观察到的活性)或者
●与当本公开的多特异性蛋白质复合物的第一和第二蛋白质单独使用时观察到的活性(例如仅在多特异性形式中观察到的活性)相比，活性更高或更低。
因此，“协同”包括新颖生物学功能或新颖活性。本文使用的协同功能通常不包括简单靶向，即仅基于结合，但通常在结合后涉及一些抑制、激活、信号传导等。
本文中采用的新颖生物学功能或新颖活性是指直至两种或更多种协同实体(蛋白质A和蛋白质B)被拉在一起(作为多特异性或其它物质)时才出现或存在的生物学功能或活性，或先前未鉴定的功能。
如本文中所用，较高的是指活性的增加，包括从零的增加，例如其中未复合的多特异性组分个体在相关功能测定中无活性的多特异性中的某些活性，在本文中也被称为新的活性或新颖的生物学功能。如本文中采用的“较高的”还包括在相关功能测定中与未复合的多特异性组分个体(单独测试的或连接组合测试的)相比较大于多特异性中的累加功能，例如相关活性增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。
在一个实施方案中，未复合的蛋白质一起具有与多特异性相同的活性，并且该活性或功能以前是未知的。这在本说明书的上下文中也是新颖的协同功能。
在一个实施方案中，协同功能是较高功能。
在一个实施方案中，协同功能是较低功能。
如本文中所用，较低功能是指在相关功能测定中，与在相关功能测定中具有活性的未复合的多特异性组分个体相比，多特异性分子具有较少活性或无活性，在本文中也被称为作为单独的蛋白质分析的或在相同条件下作为蛋白质的混合物分析的新的活性或新颖的生物学功能(诸如天然蛋白质，即不存在于融合蛋白中也不是除其中存在于体内的复合物外的任何其它复合物的部分-包括所述蛋白质的活性结构域或片段)，例如相关活性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。大于100％的活性的降低是指在不同方向上积极活性的增加，例如当实体是激动剂时，超过100％的活性降低可使实体成为拮抗剂，反之亦然。
在一个实施方案中，多特异性复合物的活性低于蛋白质A和蛋白质B的已知功能的总和。
在一些实施方案中，本公开的多特异性蛋白质复合物仅具有累加的生物学功能。如本文中所用，累加的生物学功能是指当在相同条件下测试时，与单独组分A和B的每一种的总和相同的功能。如果活动或功能是以前未知的或未被鉴定的，则累加功能可以是新颖的功能。
取决待鉴定的所需功能，使用本领域已知的任何合适的分析进行筛选。
在一个实施方案中，在本公开的方法中采用的功能测定是体外或离体测定。
如本文中所用，“功能测定”是可用于测定经历测定条件的多特异性蛋白复合物、抗体复合物或抗体混合物的一种或多种所需性质或活性的测定。合适的功能测定可以是结合测定、凋亡测定、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、补体依赖性细胞毒性(CDC)测定、细胞生长或增殖的抑制(细胞生长抑制效应)测定、细胞杀伤(细胞毒性效应)测定、细胞信号传导测定、细胞因子产生测定、抗体产生和同种型转换、细胞分化测定、集落形成测定、趋化作用测定、细胞粘附测定、细胞迁移测定、细胞周期测定、代谢测定(全细胞和细胞器功能)、用于测量病原体与靶细胞结合的抑制的测定、用于测量血管内皮生长因子(VEGF)或其它分泌分子的分泌的测定、用于抑菌、杀菌活性、病毒中和的测定、测量免疫系统的组分至抗体所结合的部位的吸引力的测定，包括原位杂交方法、标记方法等。
在一个实施方案中，可以采用体内测定，诸如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫性疾病的模型、病毒感染或细菌感染的啮齿类动物模型或灵长类动物模型等。
本领域技术人员完全能够基于正在研究的靶标/蛋白质选择合适的功能测定。然而，可将所述复合物经历一小组“标准”测定，而不预先选择被认为与尝试鉴定新的功能性相关的测定。
在多特异性抗体复合物的情况下，可通过本领域普通技术人员通常已知的方法，将根据本公开的多特异性抗体复合物的功效与此类模型中的单独的抗体或抗体(或片段)的混合物进行比较。
例如，可测试多特异性抗体复合物的抑制细胞增殖，影响细胞活力或代谢活性(例如利用诸如allamar蓝之类的染色剂或通过监测由细胞表达的萤光素酶引起的发光)或引起癌细胞凋亡的能力，所述能力是包括除与抗原结合外的特性的生物学功能。
通过选择与特定目标疾病密切相关的功能测定，本公开的方法使得有可能鉴定结合已知或未知靶分子的潜在治疗性抗体。因此可能使用本公开的方法鉴定新的靶分子和/或直接鉴定潜在的治疗性抗体。有利地，本发明的方法不限于任何特定的测定，并且根据需要为用户提供完全的灵活性以选择最合适的功能测定。
当筛选多特异性抗体复合物的所需生物学功能时，可采用各种策略。例如，可对含有抗体的培养基直接筛选生物活性。或者，可在筛选生物活性之前将抗体结合至包被的珠粒或微量滴定板。或者，可在镍捕获纯化步骤中通过His标签纯化融合蛋白。此类策略可以增加抗体的局部浓度，从而导致功能测定结果更清楚。
可根据需要使用或不使用特定多特异性抗体复合物的不同样品重复功能测定多次，以增强结果的可靠性。可采用本领域技术人员已知的各种统计测试来鉴定统计学上显著的结果，从而鉴定具有生物学功能的多特异性抗体复合物。
当建立用于筛选的功能测定时，技术人员可设定合适的阈值，超过该阈值，所鉴定的活性被视为“命中”。在使用不止一种功能测定的情况下，可将每个测定的阈值设定在合适的水平以建立可控的命中率。在一个实例中，命中率可以是3-5％。在一个实例中，搜寻抑制B细胞功能的抗原对时设定的标准可以是B细胞活化测定中至少两个磷酸读数有至少30％的抑制。
在本发明的多特异性蛋白质复合物中，可使用以下蛋白质和肽组分。
在一个实施方案中，结合对的第一结合伙伴X和第二结合伙伴Y中的至少一个独立地选自肽和蛋白质；例如第一结合伙伴或第二结合伙伴是肽。
合适的肽包括包含GCN4、Fos/Jun(人和鼠Fos分别具有Uniprot编号P01100和P01101，以及人和鼠jun分别具有Uniprot编号05412和05627)、HA标签(其对应于人流感病毒血凝素的氨基酸98至106)、多组氨酸(His)、c-myc和FLAG的组。其它肽也被认为适合用于本公开，并且特别合适的肽是用于蛋白质纯化的亲和标签，因为此类肽具有以高亲和力与其各自的结合伙伴结合的趋势。
在一个实施方案中，肽不是E5B9。
如本文中所用，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物，其中所述肽含有2至100个氨基酸，例如5至99个，诸如6至98个、7至97个、8至96个或5至25个氨基酸。在一个实施方案中，本公开中采用的肽是具有50个氨基酸残基或更少(例如40个、30个、20个、10个或更少)的氨基酸序列。本公开中使用的肽的长度适合于其目的，例如，如果肽是接头，那么它需要足够长以便所连接的片段能够发挥其生物学功能；或者，如果肽是结合伙伴，那么它必须能够特异性结合另一实体例如抗体。
在一个实施方案中，结合对的另一结合伙伴(交替的第一或第二结合伙伴)是抗原。
在一个实施方案中，蛋白质是抗体或抗体片段。
如本文中所用，术语“抗体”是指能够经由位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别部位(在本文中也称为结合部位)特异性结合靶抗原(诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、肽、蛋白质等)的免疫球蛋白分子。
如本文中所用，术语“抗体”或“抗体分子”包括抗体及其抗原结合片段。
本文中所采用的术语“抗原结合片段”或“抗体片段”是指抗体的片段，包括但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单结构域抗体(sdAb)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。
用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域中是公知的(参见例如Verma等，1998,Journal of Immunological Methods,216:165-181)。用于本公开的其它抗体片段包括国际专利申请WO05/003169、WO05/003170和WO05/003171中描述的Fab和Fab'片段。多价抗体可包含多种特异性，例如多特异性，或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。
如本文中采用的，“抗原结合片段”是指例如抗体或另一分子的片段，所述片段能够以足够的亲和力结合靶肽或抗原以将该片段表征为对所述肽或抗原是特异的。
如本文中所用，术语“Fab片段”是指包含含有轻链的VL(可变轻链)结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段和重链的VH(可变重链)结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。在一个实例中，Fab片段的重链序列在CH1的链间半胱氨酸处“终止”。在一个实施方案中，用于本公开的融合蛋白诸如A-X和/或B-Y的Fab片段是单价的。
本文中所采用的Fab'片段是指还包含全部或部分铰链区的Fab片段。在一个实施方案中，用于本公开的融合蛋白诸如A-X和/或B-Y的Fab'片段是单价的。
如本文所用，术语“单链Fv”或缩写为“scFv”是指包含连接(例如通过肽接头)形成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。重和轻链的恒定区在这种形式中被省略。本文中采用的单链Fv包括其二硫键稳定化的形式，其中除了肽接头以外，可变区之间还存在二硫键。
二硫键稳定化的scFv可以消除一些可变区域动态呼吸的倾向，这种呼吸涉及可变区域分离和再次聚集在一起。
本文中使用的术语“单结构域抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的实例包括VH或VL或sdAb。
如本文中所用，术语“sdAb”或“单结构域抗体”是指包含单个抗原结合结构域的分子。它们可以是人工产生的或天然存在的，并且包括但不限于仅VH、仅VL、骆驼科VHH、人结构域抗体、鲨鱼来源的抗体诸如IgNAR和其它非抗体单结构域结合形式，包括但不限于adnectins、脂质支载蛋白、基于Kunitz结构域的粘合剂、avimers、knottin、fynomers、atrimers、基于细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA4)的粘合剂、darpins、亲和体、人遍在蛋白、犰狳重复蛋白。
在B中，Fc区如CH2，CH3和CH4不存在。然而，恒定域如CH1，CKappa/CLambda可能存在。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，抗体轻链包含CL结构域，其或者是κ或者是λ。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，CH2结构域和CH3结构域，抗体轻链包含CL结构域，其或者是κ或者是λ。
多特异性蛋白质复合物和多特异性抗体复合物在本文中可互换使用。
如本文中使用的“多特异性抗体复合物”是指包含至少两个抗体结合位点的多特异性蛋白质复合物，其中组分抗体、片段或两者通过异二聚性系链复合在一起。
多特异性抗体复合物通常是指包含至少两个抗原结合位点的分子，其中所述结合位点具有不同的特异性。
在一个实施方案中，所述两种蛋白质(例如抗体、片段或抗体和片段的组合)靶向相同的抗原，例如结合相同靶抗原上的两个不同表位，在本文中也称为双互补的多特异性(biparatopic multispecific)。
在另一个实施方案中，所述两种蛋白质(例如抗体、片段或抗体和片段的组合)可以具有不同的抗原特异性，例如结合两种不同的靶抗原。
在又一个实施方案中，所述两种蛋白质是相同的，即与相同靶抗原上的相同表位结合，因此该复合物是单特异性的。
在一个实施方案中，本公开内容的多特异性抗体复合物中采用的每种抗体或片段包含一个结合位点，即每个结合位点对于每种靶抗原是单价的。
用于融合蛋白((A-X)2或B-Y)的全长抗体或抗体片段可以是单特异性的、单价的、多价的或多特异性的。
有利的是，使用两种多特异性抗体或抗体片段允许本公开的多特异性抗体复合物潜在地对多达4种不同抗原具有特异性(即复合物可以是四特异性的)。这可以用于研究亲合类型效应。
在一个实施方案中，第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，特别是单价Fab、Fab'、scFv等。
本文中采用的“单特异性”是指仅结合一种靶抗原的能力。
本文中采用的“单价”是指具有单一结合部位并因此仅结合靶抗原一次的抗体或抗体片段。
如本文中所用，“多价”是指具有能够以相同、同一的特异性结合两个或更多个表位(例如病毒颗粒表面上的重复的相同单元)的至少两个结合部位的抗体或其片段。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)2中采用的抗体是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)2中采用的抗体是多价的，并且第二融合蛋白(B-X)中采用的抗体或抗体片段是单价的。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)2中采用的抗体是多价的，并且第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，(A-X)2或B-Y不是包含两个scFv(一个对抗原CD33特异，并且一个对抗原CD3特异)的融合蛋白，或者可选择地对这两种抗原特异的多特异性复合物形式。
在一个实施方案中，(A-X)2或B-Y不是包含与肽E5B9连接的对CD3特异的scFv(或可选地另一种抗体形式)的融合蛋白。
本文中采用的“结合结构域或部位”是与抗原/表位接触并参与与其的结合相互作用的抗体的部分。在一个实施方案中，结合结构域含有至少一个可变结构域或其衍生物，例如一对可变结构域或其衍生物，诸如可变结构域或其衍生物的同源对。
在一个实施方案中，结合结构域包含3个CDR，特别是其中所述结合结构域是结构域抗体，诸如VH、VL或VHH。在一个实施方案中，结合结构域包含两个可变结构域和6个CDR和框架，并且这些元件一起促成了抗体或结合片段与抗原/表位的结合相互作用的特异性。
本文中采用的“同源对”是指作为预先形成的偶对从宿主免疫细胞例如B细胞分离的重链和轻链对。该定义不包括从文库中分离的可变结构域，其中来自宿主免疫细胞例如B细胞的原始配对不被保留。同源对可能是有利的，因为它们在宿主中通常是亲和力成熟的，因此可对它们特异性的抗原具有高亲和力。
本文中采用的“天然存在的结构域的衍生物”旨在指天然存在的序列中的1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸已被替换或删除，例如以优化结构域的性质，诸如通过消除不需要的属性，但其中结构域的一个或多个特性特征得以保留。修饰的实例是去除糖基化位点或暴露于溶剂的赖氨酸。这些修饰可通过用保守氨基酸取代替换相关的氨基酸残基来实现。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体复合物或其抗体/片段组分被加工来提供针对靶抗原的改善的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟方案获得，所述方案包括突变CDRs(Yang等，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等，Bio/Technology,10,779-783,1992)、大肠杆菌(E.coli)突变株的使用(Low等，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等(同上)论述了这些亲和力成熟的方法。
在一个实施方案中，第一抗体或抗体片段(A)对第一抗原是特异的，第二抗体或抗体片段(B)对第二抗原是特异的，其中第一和第二抗原是不同的。有利地，多特异性抗体复合物对两种不同抗原可以是特异的。这表明抗体复合物与两种不同抗原结合的可能性，每种抗原位于不同的实体上，由此使两个实体彼此紧密地物理接近。
或者，第一抗体或抗体片段(A)对第一表位可以是特异的，并且第二抗体或抗体片段(B)对第二表位可以是特异的，其中第一和第二表位都在同一抗原上。由于抗原与多特异性抗体复合物之间的多重相互作用，这可极大地增强多特异性抗体复合物对抗原的亲合力。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体复合物的第一抗体(A)可以是IgG，任选地具有活性或非活性的Fc区。在一个实施方案中，第二(B)抗体选自：抗原结合片段(Fab)、Fab'、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)诸如VHH。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体复合物的第二抗体/片段(B)或第一和第二抗体/片段二者可以是Fab。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体复合物的第二抗体/片段(B)或第一和第二抗体/片段二者可以是Fab'。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体复合物的第二抗体/片段(B)或第一和第二抗体/片段二者可以是scFv。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体复合物的第二(B)抗体/片段或第一和第二抗体/片段二者是sdAb。
本文中采用的“附接的”是指直接或间接(通过接头，诸如其实例在下文中论述的肽接头)连接或联接的。直接连接包括融合在一起(例如肽键)或化学偶联。
本文中采用的“结合伙伴”是指结合对的一个组成部分。
在一个实施方案中，结合伙伴的亲和力高，为5nM或更强，诸如900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM或更强。
本文中采用的“结合对”是指彼此特异性结合的两个结合伙伴。结合对的实例包括肽和特异于其的抗体或其结合片段，或酶和配体，或酶和该酶的抑制剂。
当X是抗体或其结合片段时，Y是蛋白质或肽，特别是肽。
在一个实施方案中，第二伙伴(Y)选自全长抗体，Fab，Fab'，Fv，dsFv，scFv和sdAb，其中sdAb的实例包括VH或VL或VHH。
当Y是抗体或其结合片段时，则X是蛋白质或肽，特别是肽。
在一个实施方案中，在A是抗体或其片段时，第一结合伙伴(X)连接至第一抗体或抗体片段的重链或轻链的C端，例如第一结合伙伴(X)连接至第一抗体或抗体片段(A)的重链的C端。
在另一个实施方案中，在B是抗体或其片段时，第二结合伙伴(Y)连接至第二抗体或抗体片段的重链或轻链的C端，例如第二结合伙伴(Y)附着于第二抗体或抗体片段(B)的重链的C-末端。
在一个实施方案中，X连接到抗体或片段(蛋白A)的重链的C端，并且Y连接到抗体或片段(蛋白B)的重链的C端。
在一个实施方案中，X通过接头(诸如ASGGGG SEQ ID NO:71或ASGGGGSG SEQ IDNO:72)或ASGGG SEQ ID NO:73或AAASGGG SEQ ID NO:74或本领域已知的或本文下文中描述的任何其它合适的接头附接于抗体或片段(蛋白质A)的重链的C端，并且Y通过接头(诸如ASGGGG SEQ ID NO:71或ASGGGGSG SEQ ID NO:72)附接于抗体或片段(蛋白B)的重链的C端。
合适的结合对(X或Y)的实例可包括GCN4(SEQ ID NO:1或缺少SEQ ID NO:1的HIS标签氨基酸1-38)、其变体，衍生物或片段(例如SEQ ID NO:75-97所示的序列中的任一个)和52SR4(SEQ ID NO:3或缺少SEQ ID NO:3的HIS标签氨基酸1至243)或其变体，所述52SR4或其变体为对GCN4特异的scFv。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(名义上为X)是GCN4(例如如SEQ ID NO:1中所示的)或其片段或衍生物或变体(例如没有His标签或如由SEQ ID NO:75-97所示序列中的任一个中所示的)，并且第二结合伙伴(名义上为Y)是对GCN4特异的scFv或sdAb(例如如SEQID NO:3所示的)或其变体或衍生物(例如如SEQ ID NO:98或99所示序列中任一种)。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(名义上为X)是对GCN4特异的sFv或sdA(诸如如SEQ ID NO:3、98或99所示的)或其变体，并且第二结合伙伴(名义上为Y)是GCN4(例如如SEQID NO:1所示的)或其片段或变体(诸如由SEQ ID NO:75-97所示序列中的任一个)。
GCN4变体包括与SEQ ID NO:1具有至少80％,85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％或98％或99％同一性的氨基酸序列。GCN4变体还包括与由核苷酸序列SEQID NO:2编码的序列或由在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
GCN4片段包括比SEQ ID NO:1的氨基酸序列短的GCN4的氨基酸序列。
GCN4衍生物是指在N端或C端比SEQ ID NO:1的氨基酸序列更长的GCN4的氨基酸序列。
对GCN4特异的合适的scFv是52SR4(SEQ ID NO:3)或其变体(SEQ ID NO:98或99)。52SR4的变体包括与SEQ ID NO:3具有至少80％，或85％，或90％，或95％，或98％或99％同一性的氨基酸序列。52SR4变体还包括与由核苷酸序列SEQ ID NO:4编码的序列或由在严格条件下与SEQ ID NO:4杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％，或85％，或90％，或95％，或98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明人已经发现，单链抗体52SR4和肽GCN4是适用于本公开的多特异性蛋白质复合物的结合对。
或者，可将任何合适的抗体/片段和抗原(诸如肽)用作X和Y。当A-X和Y-B以1:1的摩尔比组合时，优选地，这样的X和Y对产生大于75％的异二聚体。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(X)和第二结合伙伴(Y)是蛋白质。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(X)是酶或其活性片段，并且第二结合伙伴(Y)是配体，或反之亦然。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(X)是酶或其活性片段，并且第二结合伙伴(Y)是该酶的抑制剂，或反之亦然。
本文中采用的“活性片段”是指氨基酸片段，其小于该实体的全部氨基酸序列，并且保留基本上相同的生物活性或相关生物活性，诸如大于50％的活性，诸如60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。
在另一个实施方案中，第一结合伙伴X为谷胱甘肽(GSH)，并且第二结合伙伴Y为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X为Fos并且Y为Jun，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X为His并且Y为抗His，或反之亦然。
在另一个实施方案中，结合对是钙调蛋白结合肽，并且Y为钙调蛋白，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X为麦芽糖结合蛋白，并且Y为抗麦芽糖结合蛋白或其片段，或反之亦然。
其它酶-配体组合也被设想用于结合伙伴。在本领域中已知用于蛋白质纯化的亲和标签也是合适的，因为它们倾向于以高亲和力与其各自的结合伙伴结合。
如本文中所用，“同一性”表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文中所用，“相似性”表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间具有相似类型。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。可以经常彼此取代的其它氨基酸包括但不限于:
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可以容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.，编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.，编辑，Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.，编辑，HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.，编辑，MStockton Press,New York,1991，可获自NCBI的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等，1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等，1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等，1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。
在一个实施方案中，第一和第二融合蛋白包含一个或多个肽接头。可将接头在不同位置掺入融合蛋白中。例如，可在结合伙伴与附接于其的蛋白质之间引入接头。
在一个实施方案中，接头是肽接头。
如本文中所用，术语“肽接头”是指具有氨基酸序列的肽。本领域技术人员将知道一系列合适的肽接头。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质复合物的结合伙伴通过肽接头连接至它们各自的蛋白质。肽接头的实例显示于SEQ ID NO:5至74(表2、3和4)中。
在一个实施方案中，融合蛋白是翻译的融合体，即在包含从其表达融合蛋白的基因构建体的宿主细胞中表达的融合蛋白。
在一个实施方案中，通过将A的重链与X和/或B的重链与Y融合(任选地经由肽接头)来制备融合蛋白。
在一个实施方案中，肽接头长度为50个氨基酸或更少，诸如20个氨基酸或更少。
一般来说，重组表达融合蛋白会更高效，因此可由宿主细胞表达的直接肽键或肽接头可能是有利的。
在一个实施方案中，接头选自序列5至72或PPP中所示的序列。
表2
SEQ ID NO: 序列
5 DKTHTCAA
6 DKTHTCPPCPA
7 DKTHTCPPCPATCPPCPA
8 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
9 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
10 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
11 DKTHTCCVECPPCPA
12 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
13 DKTHTCPSCPA
表3
(S)在序列17至20中是任选的。另一接头可以是肽序列GS。
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:69)、PPPP(SEQ ID NO:70)和PPP。
其它接头示于表4中。
表4
在一个方面，提供了产生本公开的多特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤:
(a)产生第一融合蛋白(A-X)，其包含附接至结合对的第一结合伙伴(X)的第一蛋白质(A)；
(b)产生第二融合蛋白(B-Y)，其包含附接至结合对的第二结合伙伴(Y)的第二蛋白质(B)；和
(c)将步骤a)和b)中制备的第一(A-X)和第二融合蛋白(B-Y)混合在一起。
通常步骤(c)中(A-X)2和B-Y的混合摩尔比为1:2。
在一个实施方案中，通过在表达实验中在宿主细胞中表达来产生本公开的复合物中采用的每种融合蛋白。
在一个方面，提供了制备本公开的多特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤:
(a)表达第一融合蛋白(A-X)，其包含附接于结合对的第一结合伙伴(X)的第一蛋白质(A)；
(b)表达第二融合蛋白(B-Y)，其包含附接至结合对的第二结合伙伴(Y)的第二蛋白质(B)；
其中融合蛋白A-X和B-Y由相同的宿主细胞或不同的宿主细胞表达。
本文中采用的不同宿主细胞是指细胞个体，包括相同类型的细胞(甚至相同的克隆类型)。
在一个实施方案中，该表达是瞬时表达。当与产生多特异性复合物而无需纯化的能力相结合时，瞬时表达的使用是非常有利的。这将得到一种产生多特异性蛋白质复合物的快速方法，因为瞬时转染比稳定转染简单得多并且资源密集程度更低。
在一个实施方案中，所述表达是稳定表达，即其中编码所述融合蛋白的DNA被稳定地整合到宿主细胞基因组中。
在一个实施方案中，作为功能测定的一部分将在相同或不同多核苷酸序列上的编码A-X的多核苷酸和编码B-Y的多核苷酸转染入细胞中，其中所述蛋白在细胞中表达和/或从其释放。特别地，将多核苷酸在相同或不同的质粒上瞬时转染。
通常在X和Y可以相互作用的条件下进行(A-X)2和B-Y的混合。在一个实施方案中，在细胞培养条件下将融合蛋白在细胞培养基中孵育，例如将融合蛋白在37℃/5％CO2环境中孵育90分钟。
在一个实施方案中，将本公开的融合蛋白在含水环境中混合，例如可将一种融合蛋白结合至固体表面诸如珠粒或板上，并且可将另一种融合蛋白以水溶液/混悬剂形式引入其中。固相使得过量的组分和试剂被容易地洗掉。在一个实施方案中，不将两种融合物附接于固相，而是简单地将其在液体/溶液/介质中混合。因此，在一个实施方案中，将A-X和B-Y作为游离蛋白质在水性介质中混合。
有利地，本公开的方法可用于制备在异源对之间(即第一融合蛋白[A-X]2与第二融合蛋白[B-Y]之间)形成的复合物，其中同源对之间(即两个第一融合蛋白[A-X]2或两个第二融合蛋白[B]之间)的相互作用被最小化。因此，本方法允许制备大量的多特异性蛋白质复合物，其中同二聚复合物的污染最小或者无污染。本公开的构建体和方法的一个有利方面是A-X对B-Y的比例受A-X和B-Y的性质控制，特别是可以达到1:1的摩尔比。这等于1个(A-X)2对2个(B-Y)。
在一个实施方案中，本公开的方法包括另一步骤：将鉴定为具有协同活性的一对可变区(特别是两对可变区)转化成可选的多特异性形式，如果需要，任选地预先人源化所述可变区，这是一种替代治疗形式和/或具有延长的半衰期的形式，适于在具有更长持续时间(诸如运行一周或更长时间)的测定中进行测试。
多价形式包括本领域已知的那些多特异性形式和本文描述的那些多特异性形式，诸如例如WO2009/040562和WO2010/035012中公开的DVD-Ig、FabFv、双抗体、三抗体、四抗体等。
双特异性和多特异性形式(包括治疗形式)的其它实例包括双抗体、三抗体、四抗体、串联scFv、串联scFv-Fc、FabFv、Fab'Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab'-scFv、diFab、diFab'、scdiabody、scdiabody-Fc、scFv-Fc-scFv、scdiabody-CH3、IgG-scFv、scFv-IgG、V-IgG、IgG-V、DVD-Ig和DuoBody。
本文中采用的双抗体是指两个Fv对：具有两个Fv间接头的VH/VL和另一VH/VL对，使得第一Fv的VH连接至第二Fv的VL，而第一Fv的VL连接至第二Fv的VH。
本文中采用的三抗体是指与双抗体类似地包含三个Fv对和三个Fv间接头的形式。
本文中采用的四抗体是指与双抗体类似地包含四个Fv对和四个Fv间接头的形式。
本文中采用的串联scFv是指通过单接头彼此连接(使得存在单个Fv间接头)的两个scFv(各自包含接头是常用方式)。
本文中采用的串联scFv-Fc是指两个串联scFv，其中每个串联scFv例如通过恒定区片段-CH2CH3的铰链附接至CH2结构域的N端。
本文中采用的FabFv是指具有附接至以下每一个的C端的可变区的Fab片段：重链的CH1和轻链的CL。该形式可以作为其PEG化形式提供。
本文中采用的Fab'Fv类似于FabFv，其中Fab部分被Fab'替换。该形式可以作为其PEG化形式提供。
本文中采用的FabdsFv是指其中Fv内二硫键使所附接的C端可变区稳定化的FabFv。该形式可以作为其PEG化形式提供。
本文中采用的Fab-scFv是在轻链或重链的C端附接有scFv的Fab分子。
本文中采用的Fab'-scFv是在轻链或重链的C端附接有scFv的Fab'分子。
本文中采用的DiFab是指经由其重链的C端连接的两个Fab分子。
本文中采用的DiFab’是指通过其铰链区中的一个或多个二硫键连接的两个Fab'分子。
如本文中所采用的，scdiabodY为包含Fv内接头的双抗体，使得该分子包含三个接头，并且形成其VH和VL端各自连接至另一个Fv对的可变区之一的正常scFv。
本文中采用的scdiabody-Fc是两个scdiabodies，其中每个scdiabodies例如通过恒定区片段-CH2CH3的铰链附接至CH2结构域的N端。
本文中采用的ScFv-Fc-scFv是指四个scFv，其中每个scFv附接至-CH2CH3片段的重链和轻链二者的N端和C端。
本文中采用的Scdiabody-CH3是指两个scdiabody分子，每个分子例如通过铰链连接至CH3结构域。
本文中采用的IgG-scFv是在每条重链或每条轻链的C端上具有scFv的全长抗体。
本文中采用的scFv-IgG是在每条重链或每条轻链的N端上具有scFv的全长抗体。
本文中采用的V-IgG是在每条重链或每条轻链的N端上具有可变结构域的全长抗体。
本文中采用的IgG-V是在每条重链或每条轻链的C端上具有可变结构域的全长抗体。
DVD-Ig(也称为双重V结构域IgG)是具有4个额外可变结构域的全长抗体，在每条重链和每条轻链的N端上各有一个。
本文中采用的Duobody或“Fab臂-交换”是一种多特异性IgG抗体形式，其中两种不同单克隆抗体的恒定结构域(通常为CH3)中的匹配和互补的工程化氨基酸变化在混合时导致异二聚体形成。作为残基工程化的结果，来自第一抗体的重/轻链对将优先与第二抗体的重:轻链对缔合。
本公开的多特异性抗体复合物或抗体分子的恒定区结构域(如果存在的话)可以根据所提出的复合物或抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子打算用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型的IgG恒定区结构域。或者，当抗体分子旨在用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。应该理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用如Angal等，1993,Molecular Immunology,1993,30:105-108中所述的其中位置241处的丝氨酸已被改变成脯氨酸的IgG4分子。因此，在其中抗体是IgG4抗体的实施方案中，抗体可包含突变S241P。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化的变化。一种常见修饰是由于羧肽酶的作用(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所述)而丧失羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)。因此，抗体重链的C末端赖氨酸可能不存在。
本公开还提供了包含一种或多种如上所述的多特异性蛋白质复合物的组合物，其中所述组合物主要包含根据本公开的异二聚性多特异性复合物，例如具有最少的同二聚体复合物的污染或无同二聚体复合物的污染。
在一个实施方案中，组合物中融合蛋白的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％呈多特异性蛋白复合物形式。
在一个实施方案中，组合物中至少60％的融合蛋白呈多特异性蛋白复合物形式。
在一个实施方案中，形成的复合物不需要进一步的纯化步骤，因此组合物包含未纯化的多特异性复合物。
在一个实施方案中，形成的复合物需要一个纯化步骤，诸如柱层析。
在一个实施方案中，该方法在例如在表达根据本公开的融合蛋白之后且在混合融合蛋白之前还包括至少一个纯化步骤。
在一个方面，本公开涉及融合蛋白、异二聚性系连的双特异性蛋白复合物、包含融合蛋白或所述多特异性蛋白质复合物的组合物，如本文所定义的多重阵列文库。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质复合物处于溶液或混悬剂中。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质复合物被固定在固相基质表面上。
在一个实施例中，多重复合物呈阵列的形式，例如在微量板诸如96或384孔板中。此类阵列可在筛选测定中容易地实施以鉴定具有所需功能的多特异性蛋白质复合物。
在另一个实施方案中，将多特异性蛋白质复合物缀合至珠粒。
如上定义的融合蛋白是根据本公开的多特异性蛋白质复合物的组分。在一个方面，本公开涉及本文所述的融合蛋白。
在另一方面，提供了包含如上定义的两种或更多种融合蛋白的文库。
如本文中所用，术语“文库”是指本公开的两种或更多种多特异性抗体复合物或可被组合以形成至少两种不同的根据本公开的多特异性抗体复合物的多种融合蛋白。如整个说明书中所描述的，术语“文库”以其最广泛的含义使用，并且还可涵盖子文库。
有利地，文库可包含一系列不同的融合蛋白，所述融合蛋白具有附接于其的特定结合对的第一结合伙伴(X)或第二结合伙伴(Y)。在一个实施方案中，文库的一部分包含各自连接至结合伙伴X的蛋白质/抗体/片段，并且文库的其余部分包含各自连接至结合伙伴Y的相同蛋白质/抗体/片段。这因此允许任何两种融合蛋白质容易地组合以形成本公开的多特异性蛋白质复合物，只要一种融合蛋白具有附接的结合对的第一结合伙伴，并且另一融合蛋白具有附接的结合对的第二结合伙伴。
在一个实施方案中，本发明的多特异性蛋白质复合物适用于治疗应用并且可提供治疗疾病的新型疗法。因此，在另一方面，提供了用于疗法的如上所述的多特异性蛋白质复合物。多特异性蛋白质复合物适用于治疗一系列疾病，诸如自身免疫性疾病和癌症。
相反，本公开的多特异性蛋白质复合物可用对T淋巴细胞特异的一种抗体或抗体片段和对癌症特异性抗原特异的另一种抗体或抗体片段进行工程化。结果，与普通单克隆抗体相比，本公开的多特异性抗体复合物可有利地具有更高的细胞毒性潜力。
本公开的多特异性蛋白质复合物还特别适用于抑制B细胞功能，以控制各种自身免疫性疾病中的免疫和自身免疫反应。
因此，本公开扩展至治疗患者疾病的方法，包括施用本公开的多特异性蛋白质复合物。
在一个方面，提供了包含本公开的一种或多种多特异性蛋白质复合物的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了从本公开的方法获得或能够获得的融合蛋白。
在一个实施方案中，提供了从本公开的方法获得或能够获得的多特异性抗体复合物。
在一个实施方案中，提供了包含通过根据本公开的方法鉴定的可变区组合的多特异性或多特异性抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含从本公开的方法获得的融合蛋白、多特异性抗体复合物或多特异性/多特异性抗体分子的组合物，诸如药物组合物。
组合物中可包含各种不同的组分，包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。组合物可以任选地包含能够改变本发明的抗体群体的特征的其它分子，从而例如减弱、稳定、延缓、调节和/或激活抗体的功能。组合物可呈固体或液体形式，并且尤其可呈粉末、片剂、溶液或气雾剂的形式。
本公开还提供了药物或诊断组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的多特异性蛋白质复合物。因此，提供了本发明的多特异性蛋白质复合物用于治疗病理状况或病症的用途或用于制造用于治疗病理状况或病症的药剂的用途。
所述病理状况或病症可以例如选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫感染)、与感染相关的内毒素休克、关节炎诸如类风湿性关节炎、哮喘诸如严重哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、脉管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、中枢和外周神经系统的免疫介导的炎性病症诸如多发性硬化症、狼疮(诸如系统性红斑狼疮)和Guillain-Barr综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、肉瘤样病、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、其它自身免疫性疾病、胰腺炎、外伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病包括局部缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和癌症，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、肾癌，特别是肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌和甲状腺癌及其转移形式。
本公开还提供了药物或诊断组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的多特异性蛋白质复合物。因此，提供了本发明的多特异性蛋白质复合物用于治疗和制造药剂的用途。
通常将组合物作为通常包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，其包括将本发明的抗体分子或多特异性抗体复合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加并混合。
如本文中所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指用于增强本公开组合物的所需特征的药学上可接受的配制载体、溶液或添加剂。赋形剂在本领域中是公知的，包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、脲、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。可将溶液或混悬剂包封在脂质体或可生物降解的微球体中。通常使用无菌制造工艺以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的被缓冲溶剂溶液来进行生产和灭菌，在无菌的被缓冲溶剂溶液中无菌悬浮抗体，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
药学上可接受的载体本身不应诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生，并且应该不具有毒性。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体诸如水、盐水、甘油和乙醇。此类载体使药物组合物能够被配制成用于由患者摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂和混悬剂。
可将本发明的多特异性蛋白质复合物分散在溶剂中，例如以溶液或混悬剂的形式进行递送。其可悬浮在合适的生理溶液例如生理盐水、药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mgNaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH值。如上所述，混悬剂可以例如由冻干抗体制成。
药学上可接受的载体的详细论述可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。
多特异性抗体复合物(或本公开的多特异性/多特异性抗体分子)可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可伴随有其它活性成分，包括其它抗体成分，例如抗-TNF、抗IL-1β、抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体，或者非抗体成分如黄嘌呤。其它合适的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体，诸如抗-CD3或抗-CD4抗体。
在另一个实施方案中，将根据本公开的抗体、片段或组合物与另外的药学活性剂例如皮质类固醇(诸如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(诸如沙丁胺醇、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖抑制剂(诸如雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤)或可选地CD28和/或CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂是对靶标特异的抗体。
药物组合物合适地包含治疗有效量的本发明的多特异性抗体复合物(或本公开的多特异性/多特异性抗体分子)。
如本文中所用，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防被靶向的疾病或病症或者表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可以在细胞培养测定或动物模型中(通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)估计治疗有效量。动物模型也可用于确定适当的浓度范围和施用途径。然后可将这些信息用于确定用于人中施用的有用剂量和途径。
用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对疗法的反应敏感性和耐受性/反应。这个数量可通过常规实验来确定，并且在临床医师的判断之内。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。或者，剂量可以是每天1至500mg，诸如每天10至100mg、200mg、300mg或400mg。药物组合物可以方便地以含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
可将组合物单独地施用于患者，或者可将其与其它药剂、药物或激素组合(诸如同时、顺序地或分开地)施用。
施用本发明抗体分子的剂量取决于待治疗病症的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子被预防性使用还是治疗已有病症。
剂量频率取决于抗体分子的半衰期和其作用持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2-10小时)，则可能需要每天给予一剂或多剂。或者，如果抗体分子具有较长的半衰期(例如2至15天)，则可能仅需每天给予一次剂量，每周给予一次剂量或甚至每1或2个月给予一次剂量。
在本公开中，最终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值不相似，因为如果制剂的pH为7，则8-9或以上的pI可以是合适的。不希望受理论束缚，推测这可以最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，诸如抗体或片段保留在溶液中。
本发明的药物组合物可通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(诸如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器也可用于施用本发明的药物组合物。
组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送至组织的间质间隙来实现。还可将组合物施用至特定的目标组织中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
当产品用于注射或输注时，其可采取油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳液的形式，并且其可含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，多特异性蛋白质复合物(或本公开的多特异性/多特异性抗体分子)可呈干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重建。如果组合物要通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有防止抗体降解、但一旦其从胃肠道被吸收就释放多特异性蛋白质复合物的试剂。
可将根据本公开的可雾化制剂例如作为在箔封套中包装的单剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积(例如2ml的溶剂/溶液缓冲液)中的单位剂量。
如本文中所用，术语“变体”是指与对应的野生型肽或蛋白质的氨基酸或核苷酸序列相比包含至少一个氨基酸序列或核苷酸序列改变的肽或蛋白质。变体可包含与相应的野生型肽或蛋白质至少80％，或85％，或90％，或95％，或98％或99％的序列同一性。然而，变体可能包含小于80％的序列同一性，条件是变体表现出与其相应的野生型肽或蛋白质基本相似的功能。
抗原包括细胞表面受体诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素或酶或离子通道、表位、片段及其翻译后修饰的形式。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质复合物包含一种或两种细胞表面受体特异性。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质复合物包含一种或两种细胞因子或趋化因子特异性。
可将通过根据本公开的方法鉴定的针对一对靶标的抗体或片段可以掺入适合用作实验室试剂、分析试剂或治疗剂的任何形式中。
因此，在一个方面，本公开扩展至以任何形式成对使用抗体片段或其组合，其实例在上文中给出。
本公开还扩展至组合物，诸如药物组合物，其中具有特定抗原特异性的所述新颖形式。
在另一方面，本公开包括所述形式和组合物在治疗中的用途。
在一个实施方案中，本公开的多特异性蛋白质复合物可用于功能性改变一种或多种目标抗原的活性。例如，多特异性蛋白质复合物可以直接或间接中和、拮抗或激动所述一种或多种抗原的活性。
本公开还扩展至试剂盒，例如包含:
a)一种或多种融合蛋白(A-X)2，其包含附接于结合对的第一结合伙伴(X)的第一抗体(A)；和
b)一种或多种融合蛋白(B-Y)，其包含附接于结合对的第二结合伙伴(Y)的第二抗体或抗体片段(B)，其中后者对第一结合伙伴是特异的；
例如其中第一结合伙伴(X)是肽或多肽，并且第二结合(Y)伙伴是对其特异的抗体或抗体片段；
其中Y(第二结合伙伴)对第一结合伙伴X是特异的，并且第二结合伙伴是例如对其特异的抗体或抗体片段；并且两个结合伙伴的特异性相互作用(诸如结合相互作用)形成异二聚性系链，其将来自a)和b)的两个融合蛋白物理地拉在一起形成多特异性蛋白质复合物；以及
其中所述融合蛋白呈复合或非复合形式。
有利地，试剂盒可包含本公开的多特异性蛋白质复合物，或者可包含呈复合或非复合形式的融合蛋白。在前一种情况下，多特异性蛋白质复合物可以“开箱”即用，这提供了方便和易用性，而在后一种情况下，多特异性蛋白质复合物可以根据用户的需要通过组合不同的融合蛋白来进行组装。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含用于进行一种或多种功能测定的一种或多种试剂。
在一个实施方案中，如本文所述的融合蛋白、多特异性蛋白复合物、多重复合物、网格、文库、组合物等用作实验室试剂。
在另一方面，提供了核苷酸序列，例如DNA序列，其编码如上所定义的融合蛋白和/或多特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，提供了编码根据本公开的多特异性蛋白质复合物的核苷酸序列，例如DNA序列。
在一个实施方案中，提供了核苷酸序列，例如编码根据本公开的多特异性或多特异性抗体分子的DNA序列。
本文的公开内容还扩展至包含如上定义的核苷酸序列的载体。
如本文中所用，术语“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一个实例是“质粒”，其是可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(诸如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加体型哺乳动物载体)可被整合至宿主细胞的基因组中，其中它们随后与宿主基因组一起复制。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术人员来说是公知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York以及Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。
如本文中所用，术语“选择标记”是指其表达允许人们鉴定已被用含有标记基因的载体转化或转染的细胞的蛋白质。本领域已知多种选择标记。例如，通常选择标记基因赋予载体已被导入其中的宿主细胞对药物(诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择标记也可以是视觉上可鉴定的标记，例如，诸如荧光标记。荧光标记的实例包括罗丹明、FITC、TRITC、Alexa Fluors及其各种缀合物。
还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述克隆或表达载体包含一种或多种编码本公开的抗体的DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本公开的抗体分子的DNA序列。可使用细菌，例如大肠杆菌和其它微生物系统，或者也可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本公开还提供了用于产生根据本公开的融合蛋白的方法，其包括在适合于导致蛋白质从编码本公开的分子的DNA表达的条件下培养包含本公开的载体的宿主细胞，并分离该分子。
本公开的多特异性蛋白质复合物可用于诊断/检测试剂盒，其中使用具有抗原特异性的特定组合的多特异性蛋白质复合物。例如，试剂盒可包含对两种抗原特异的多特异性抗体复合物，所述两种抗原均存在于相同的细胞类型中，并且其中只有在两种抗原都被成功检测到的情况下才能产生阳性诊断。通过使用本公开的多特异性抗体复合物而非呈非复合形式的两种单独的抗体或抗体片段，可以大大提高检测的特异性。
在一个实施方案中，将多特异性抗体复合物固定在固体表面上。固体表面可以例如是芯片或ELISA板。
还提供了本公开的多特异性蛋白质复合物用于在样品中检测第一和第二肽的存在的用途，其中多特异性复合物用作检测剂。
可将本公开的多特异性抗体复合物例如缀合至促进结合的抗体-抗原复合物的检测的荧光标记。此类多特异性抗体复合物可用于免疫荧光显微术。或者，多特异性抗体复合物也可用于蛋白质印迹或ELISA。
在一个实施方案中，提供了纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的融合蛋白或多特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，使得杂质保留在柱上，并且抗体保持在未结合的级分中。该步骤可以例如在约6-8的pH下进行。
该方法还可包括采用阳离子交换层析(例如在约4至5的pH下进行)的初始捕获步骤。
该方法还可包括额外的层析步骤以确保从产物流中适当地分离产物和工艺相关的杂质。
纯化过程还可包括一个或多个超滤步骤，诸如浓缩和透滤步骤。
如上所使用的“纯化形式”旨在表示至少90％的纯度，诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％w/w或更高的纯度。
在本说明书的上下文中，“包含”将被解释为“包括”。
包含某些要素的本公开的各个方面也旨在扩展至“由相关要素组成”或“基本上由相关要素组成”的替代实施方案。
本文使用的正面实施方案可以用作排除本公开的某些方面的基础。
涉及多特异性复合物的方法中的公开内容同样适用于复合物本身，反之亦然。
实施例1构建本公开的多特异性抗体复合物
图3显示了本公开的一些具有代表性的双特异性抗体复合物。所述双特异性抗体复合物由第一和第二融合蛋白构成。
第一融合蛋白A-X是全长抗体的一半，它能二聚化而生成对给定抗原具有特异性的全长抗体(A-X)2。全长抗体的每个一半通过肽接头而附着到X，一种肽上，该肽接头再连接抗体的CL结构域的C-末端(iii)，抗体的重链的C-末端(i)，或者插入到全长抗体的CH1和CH2之间(ii)。X可以是任何肽，例如肽GCN4(克隆7p14p SEQ ID NO:1)。
第二融合蛋白B-Y包括Fab片段(对给定抗原具有特异性的FabB)。然而，与第一蛋白相比，Fab片段通过肽接头附着到Y，一种scFv(克隆52SR4SEQ ID:3)，该肽接头继而连接Fab片段的CH1结构域。
该scFv,Y，是特异于结合伙伴X，肽GCN4，并与其互补。因此，当使两种融合蛋白相互接触时，将发生scFv和GCN4肽之间的非共价结合相互作用，从而在物理上使两种融合蛋白保持为多特异性抗体复合物的形式。由于(A-X)2含有两个X肽，两个B-Y蛋白会结合到(A-X)2复合物上，得到(A-X)2:(Y-B)2。
单链抗体(scFv)52SR4是通过从用GCN4(7P14P)免疫的小鼠的脾构建核糖体展示VL-接头-VH scFv文库并进行淘选而获得的(Ribosome display efficiently selectsand evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries.Hanes J,Jermutus L,Weber-Bornhauser S,Bosshard HR,Plückthun A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14130-14135)。另一篇2004年发表的文章描述了使用随机化文库的核糖体展示将52SR4亲和力成熟为报道的5pM(Directed in Vitro Evolutionand Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain AntibodyFragment(scFv)with Low Picomolar Affinity.Zhand C,Spinelli S,Luginbuhl B,Amstutz P,Cambillau C,Pluckthun A.(2004)J.Biol.Chem.279,18870-18877)。
GCN4肽来自酵母转录因子GCN4，其在第7和14位包含脯氨酸残基，因此GCN4(7P14P)在scFv结合上仍然处于单体状态，如Berger等人在1999年发表的一篇文章中所描述的(Antigen recognition by conformational selection.Berger C,Weber-Bornhauser S,Eggenberger Y,Hanes J,Pluckthun A,Bosshard H.R.(1999)F.E.B.S.Letters 450,149-153)。
序列表
<110> UCB Biopharma SPRL
<120> 抗体
<130> PF0050_WO01
<150> GB1521391.1
<151> 2015-12-03
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CN4(7P14P)序列
<400> 1
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1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 2
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码DNA
<400> 2
gctagcggag gcggaagaat gaaacaactt gaacccaagg ttgaagaatt gcttccgaaa 60
aattatcact tggaaaatga ggttgccaga ttaaagaaat tagttggcga acgccatcac 120
catcaccatc ac 132
<210> 3
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 ds scFv序列
<400> 3
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Glu Gln Lys Leu
245 250 255
Ile Ser Glu Glu Asp Leu
260
<210> 4
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码DNA
<400> 4
gatgcggtgg tgacccagga aagcgcgctg accagcagcc cgggcgaaac cgtgaccctg 60
acctgccgca gcagcaccgg cgcggtgacc accagcaact atgcgagctg ggtgcaggaa 120
aaaccggatc atctgtttac cggcctgatt ggcggcacca acaaccgcgc gccgggcgtg 180
ccggcgcgct ttagcggcag cctgattggc gataaagcgg cgctgaccat taccggcgcg 240
cagaccgaag atgaagcgat ttatttttgc gtgctgtggt atagcgacca ttgggtgttt 300
ggctgcggca ccaaactgac cgtgctgggt ggaggcggtg gctcaggcgg aggtggctca 360
ggcggtggcg ggtctggcgg cggcggcagc gatgtgcagc tgcagcagag cggcccgggc 420
ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt acctgcaccg tgagcggctt tctcctgacc 480
gattatggcg tgaactgggt gcgccagagc ccgggcaaat gcctggaatg gctgggcgtg 540
atttggggcg atggcattac cgattataac agcgcgctga aaagccgcct gagcgtgacc 600
aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg aaaatgaaca gcctgcagag cggcgatagc 660
gcgcgctatt attgcgtgac cggcctgttt gattattggg gccagggcac caccctgacc 720
gtgagcagcg cggccgccca tcaccatcac catcacgaac agaaactgat tagcgaagaa 780
gatctgtaat ag 792
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<220>
<223>
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<220>
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
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<220>
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Pro Ala
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<212> PRT
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<220>
<223> 柔性肽接头
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1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
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Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 柔性肽接头
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 柔性肽接头
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 14
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<212> PRT
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> 柔性接头
<400> 18
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> 柔性接头
<400> 19
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 20
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 21
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 22
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 23
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
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20
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 24
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<212> PRT
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<223> 柔性接头
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<222> (7)..(7)
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<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 25
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 26
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 27
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 28
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 29
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 31
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 32
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 38
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 39
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 40
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 41
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 42
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 43
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 44
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 45
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 46
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 47
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 48
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 49
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 50
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 51
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 52
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 53
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 54
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 55
Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 56
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 57
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp
1 5 10 15
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 58
Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu
20
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val
20
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 60
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val Lys
20
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 61
Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 62
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 63
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 64
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 65
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 66
Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly
20
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 67
Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Ser Glu Gln
20
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 68
Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 69
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 70
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 71
Ala Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 72
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 73
Ala Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 74
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 75
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 75
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 76
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 77
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 78
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 78
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 79
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 79
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 80
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 81
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 82
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 83
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 83
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 84
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 84
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 85
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 85
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 86
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 86
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 87
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 87
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 88
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 88
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 89
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 89
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 90
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 90
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 91
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 91
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 92
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 92
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 93
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 93
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 94
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 94
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 95
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 95
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 96
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 96
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 97
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 97
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 98
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 scFV变体
<400> 98
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 99
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 scFv变体
<400> 99
Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val
130 135 140
Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr
145 150 155 160
Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser
195 200 205
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys
210 215 220
Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala
225 230 235 240
Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala
245 250 255
Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe
260 265 270
Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys
275 280 285
Leu Thr Val Leu
290
<210> 100
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 100
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 101
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 101
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 102
Met Asp Trp Leu Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ala Gln Ala
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 103
Met Gly Trp Ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ser Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser

Claims (27)

1.具有式(A-X)2:(Y-B)2的多特异性蛋白质复合物，其中：
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚化的系链；
:是X和Y之间的结合相互作用；
A是所述多特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其是包含与全长重链(VHCH1CH2CH3)配对的轻链(VLCL)的全长抗体的一半；
B是所述多特异性蛋白质复合物的第二蛋白质组分，其选自Fab或Fab’片段、sdAb或scFv；
X是结合对的第一结合伙伴，其选自下述：
i.附接在A的轻链或重链的C-末端的抗原、scFv或sdAb，任选地通过接头，和
ii.插入在A的重链的CH1和CH2之间的抗原、scFv或sdAb，任选地通过接头；和
Y是所述结合对的第二结合伙伴，其附接在B的C末端，独立地选自抗原、Fab片段、Fab’片段、scFv和sdAb，例如Fab或Fab’的轻链或重链；
条件是，当X是抗原时，则Y是特异于由X代表的抗原的Fab片段、Fab’片段、scFv或sdAb，以及当Y是抗原时，则X是特异于由Y代表的抗原的scFv或sdAb。
2.根据权利要求1的多特异性蛋白质复合物，其中X是抗原，例如肽。
3.根据权利要求1的多特异性蛋白质复合物，其中X是sdAb，以及是VHH、VH或VL。
4.根据权利要求1－3中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中B是Fab片段、VHH或scFv。
5.根据权利要求1－4中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中X通过接头与A的重链的C末端相融合。
6.根据权利要求1－4中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中X通过接头与A的轻链的C末端相融合。
7.根据权利要求1－4中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中X被插入在A的重链的CH1和CH2之间。
8.根据权利要求1和3－7中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中Y是抗原，例如肽。
9.根据权利要求1、2和4－7中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中Y是sdAb，以及是VHH、VH或VL。
10.根据权利要求1、2和4－7中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中Y是scFv。
11.根据权利要求1－10中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中Y特异于肽GCN4(SEQID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1-38)。
12.根据权利要求11的多特异性蛋白质复合物，其中Y是scFv52SR4(SEQ ID NO:3或SEQID NO:3的氨基酸1-243)。
13.根据权利要求1－12中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中所述抗原是长度为5-25个氨基酸的肽。
14.根据权利要求1－13中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中X或Y是肽GCN4(SEQID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1-38)。
15.根据权利要求1－14中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中X和Y之间的结合亲和力为5nM或更高。
16.根据权利要求15的多特异性蛋白质复合物，其中X和Y之间的结合亲和力为900pM或更高，例如800,700,600,500,400或300pM。
17.根据权利要求1－16中任一项的多特异性蛋白质复合物，其中A和/或B特异于独立地选自下述中的抗原：细胞表面受体例如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCRs、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子例如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素、酶和离子通道。
18.根据权利要求1－17任一项的多特异性蛋白质复合物，其中A或B中的至少一个特异于细胞标志物。
19.根据权利要求18的多特异性蛋白质复合物，其中所述细胞标志物选自B细胞标志物和T细胞标志物。
20.一种组合物，其中包含权利要求1－19中任一项所述的一种或多种多特异性蛋白质复合物。
21.根据权利要求1－19中任一项所述的多特异性蛋白质复合物或根据权利要求20所述的组合物在治疗中的应用。
22.一种检测权利要求1－20中任一项所述的多特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能的方法，其中包括在一个或多个功能性测定中测试所述多特异性蛋白质复合物。
23.一种检测具有式(A-X)2:(Y-B)2的异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物中的的协同生物学功能的方法，其中：
A-X是第一融合蛋白质；
Y-B是第二融合蛋白质；
X:Y是异二聚性系链；
:是X和Y之间的结合相互作用；
A是所述多特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其是包含与全长重链(VHCH1CH2CH3)配对的轻链(VLCL)的全长抗体的一半；
B是所述多特异性蛋白质复合物的第二蛋白质组分，其选自Fab或Fab’片段、sdAb或scFv；
X是选自下述的结合对的第一结合伙伴：
i.附接在A的轻链或重链的C-末端的抗原、scFv或sdAb，任选地通过接头，和
ii.插入在A的重链的CH1和CH2之间的抗原、scFv或sdAb，任选地通过接头；和
Y是所述结合对的第二结合伙伴，其附接在B的C末端，独立地选自抗原、Fab片段、Fab’片段、scFv和sdAb，例如Fab或Fab’的轻链或重链；
条件是，当X是抗原时，则Y是特异于由X代表的抗原的Fab片段、Fab’片段、scFv或sdAb，以及当Y是抗原时，则X是特异于由Y代表的抗原的scFv或sdAb；
所述方法包括以下步骤：
(i)在功能性测定中测试包含至少一种异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物的多重复合物的部分或全部的活性；和
(ii)分析来自功能性测定的读数以检测异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述多重复合物呈网格形式。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述多重复合物包含至少两种异二聚性系连的多特异性蛋白质复合物。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述异二聚体系连的多特异性蛋白质复合物在测试之前未被纯化。
27.根据权利要求26所述的方法，其中瞬时表达所述A-X和Y-B融合蛋白并且在以1:1摩尔比混合之前不对其进行纯化，产生每一个异二聚体系连的多特异性蛋白质复合物。
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