CN108431035A - 多特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于研究和疗法，特别是检测另外的未知靶标对的协同生物学功能的体外/离体方法的异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物(通式为A‑X:Y‑B)及其文库/多重复合物。

Description

多特异性抗体
发明领域
本公开涉及检测异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能的方法(特别是体外/离体方法)、双特异性蛋白质复合物的文库/多重复合物以及其试剂盒和组合物。本公开还涉及所述新颖双特异性蛋白质复合物以及其在治疗、研究和实验目的中(特别是在寻找协同生物学功能的测定中)的用途。本公开还扩展至制备所述双特异性复合物的方法。
发明背景
体内生物学机制是极其复杂的信号级联，其难以解析和理解。T细胞的活化需要至少两种信号。
T细胞受体对抗原的识别被认为是第一信号，第二信号产生自共刺激，其由T细胞上的另外的表面分子与抗原呈递细胞上的另外的分子的连接产生。
因此T细胞活化可用于阐明生物学功能的调节可能需要多个信号。其它生物过程同样复杂或更复杂。尽管基于细胞的体外筛选具有对体内机制的见解以及可以帮助获得对体内机制的见解，但如何鉴定调节生物学功能的合适配体对仍存在问题。
广泛预计双特异性抗体在下一代生物治疗剂中起主要作用(D.Holmes,NatureRev Drug Disc Nov 2011:10；798)。它们有可能为更大比例的患者提供优越、长期、广泛的疗效。这可通过在共同的疾病途径内同时共应用不同的抗原(从而减少冗余)来实现；或通过靶向来自独立途径的抗原以提供累加或协同效应来实现。
双特异性抗体有助于获得新颖生物学，诸如：
1)细胞上的交联受体，
2)诱导细胞介导的效应，
3)将细胞因子定位于细胞以调节信号传导或局部阻断细胞因子功能，
4)同时运用多个表位以产生“新活性”，增加功能或特异性，这样的性质由单个单克隆抗体或未连接的抗体(“多个单克隆抗体”)的真正混合物可能不会表现。
目前接合双靶标的策略主要基于对已知机制的合理设计，包括：交联抑制性受体、受体的共接合/簇集、阻断多个刺激途径、抑制性受体的选择性接合和阻断不同途径诸如共刺激和细胞因子信号传导。然而，与已知机制和靶标相关的现有技术状况是该领域取得进展的限制因素。
尽管双特异性抗体作为生物治疗剂具有巨大潜力，但与单克隆抗体相比，它们在发现和开发中也面临更多挑战。两个关键的困难领域是：1)成功的双特异性抗体形式的开发，以及2)选择双特异性抗体将与其交联或共接合的靶标对。
目前已经开发出许多有前景的双特异性抗体形式，其可潜在地充当成功的治疗剂，包括DVD-Ig(Abbvie)、DuoBodies(Genmab)、Knobs-in-Holes(Genentech)、共同轻链(Merus)。然而，在这些情况中的每一种情况下，这些形式都没有理想地适合于高通量靶标-双抗原(target-dual-antigen)发现筛选，以使得能够发现用于与双特异性抗体交联的新型抗原对。
通常对于单个双特异性抗体构建体而言，需要将至少两个可变区从所发现载体的初始来源(例如噬菌体展示、杂交瘤或单个B细胞克隆)亚克隆到合适的双特异性表达载体中，必须表达双特异性的每个臂，并纯化所得的双特异性抗体。如果要组合大量的可变区对以试图筛选所发现的可变区的最有效组合或发现新的抗原对，则这种克隆和随后的表达努力很快就会成为一个重大的实际瓶颈。
例如，如果针对50种细胞表面靶标的小组发现50种独特的抗体，则可能产生总共2500种双特异性抗体(设想为X x Y网格)。对于上述双特异性抗体形式，这可能需要至少100个单独的克隆反应(50-X和50-Y)，然后进行2500个抗体表达实验。将起始单克隆抗体的数量增加到100将使最少克隆反应数量增加到200(100-X和100-Y)，表达数量增加到10,000。
一般而言，这种“表达瓶颈”的根本原因在于上述形式需要最终双特异性构建体的两个蛋白质链“半部分”在同一细胞内在单个表达实验内同时表达。因此，对于许多形式，为了生产2500种双特异性抗体，需要2500个表达实验。
如果双特异性抗体形式是单顺反子的(即克隆并表达为单链蛋白质)，例如单链双抗体，则“表达瓶颈”进一步加剧，因为对于上文给出的数字，克隆实验的数量分别为2500和10,000。
此外，在表达后，可能需要充分纯化来分离所需的构建体。
一些双特异性方法在双特异性构建体中采用共同的轻链以减少克隆的量，尽管这不减少表达实验的数量。此外，使用共同的链，诸如共同的轻链，将使抗体发现的挑战更加艰难，因为抗体需要通过单独的一条链(诸如重链)以足够高的亲和力结合其抗原，所以找到起始抗体可变结构域更加困难。
因此，在大规模和高通量筛选中使用目前的双特异性形式来鉴定新颖抗原对是不切实际的，并且已导致对双特异性抗原靶向持续使用仅仅假设驱动的方法。
我们提出，不设计和测试有限选择的接合两个已知靶标上的给定表位的双特异性抗体，而是利用双特异性抗体来开发获得新颖生物学的真正潜力只能通过广泛的功能筛选努力(所述功能筛选努力利用双特异性抗体或蛋白质配体的大型多样的组合小组)来实现。为了便于这种筛选，需要使得能够产生大量不同的双特异性蛋白质的形式和方法，所述蛋白质可以容易地构建和在各种功能性筛选中筛选功能性效应。这种方法允许偶然鉴定到协同对。
因此，产生和筛选以各种抗原特异性的组合存在的大量双特异性蛋白质复合物将是有用的。具体而言，能够以快速高效的方式产生和筛选大量不同的双特异性抗体复合物将是有用的。如已在上文中所述，存在一系列用于制造双特异性抗体的现有方法。然而，这些方法中的每一种都有其缺点，如在下文中更详细描述的替代方法那样。
如何高效地鉴定双特异性和多特异性构建体的靶标的问题在本领域尚未得到充分解决。例如，WO2014/001326采用蛋白质与DNA片段的化学缀合，其中DNA片段与将两种这样的蛋白质连接在一起(以产生包含至少两种靶向实体的定制的患者特异性多特异性分子)的互补DNA序列杂交。如果将这种方法应用于鉴定新的双特异性组合，那么存在许多与这种方法相关的困难，例如将蛋白质与DNA缀合可导致蛋白质的活性和/或结构受损。特别是蛋白质-DNA杂交物不是天然存在的，因此存在潜在的干扰。另外，连接蛋白质和DNA所需的化学缀合增加了该过程的复杂性、时间和费用。
存在用于产生抗体药物缀合物的偶联和缀合技术和体内靶向技术。常规化学交联是费力的，因为可能需要从同二聚体和其它不需要的副产物中纯化出相关种类。另外，化学修饰步骤可以改变蛋白质的完整性，从而导致稳定性差或生物学功能改变。因此，通过化学交联产生双特异性抗体常常是无效的，并且还可能导致抗体活性的丧失。
制造双特异性抗体的另一种方法是通过细胞融合(例如使杂交瘤杂交)，其中经工程化的细胞表达随机组装的两条重链和两条轻链抗体链。由于有4种可能的变体可供选择，这导致产生10种可能的双特异性抗体组合，其中仅一些(在许多情况下，仅一种)组合是期望的。因此，通过细胞融合产生双特异性抗体导致低的生产率，并且还需要额外的纯化步骤以从所产生的其它双特异性抗体中分离出所需的双特异性抗体。这些不利方面增加了制造时间和成本。
重组DNA技术也已被用于产生双特异性抗体。例如，重组DNA技术也已被用于产生'旋钮入孔(knob into hole)'双特异性抗体。'旋钮入孔'技术涉及在CH3结构域界面处在多聚化结构域中对空间互补突变进行工程化(参见例如Ridgway等，Protein Eng.9:617-621(1996)；Merchant等，Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998)；也参见，美国专利号5,731,168和7,183,076)。这种策略的一个限制是两个亲本抗体的轻链必须相同，以防止在同一细胞中表达时错配和形成不需要的和/或无活性的分子。每个双特异性(其重链和轻链)必须在单个细胞中表达，蛋白质产物通常含有约20％的同二聚体，随后通过纯化除去所述同二聚体。
其它方法基于全长IgG4分子(Genmab Duobody)中链的天然交换。然而，这种方法也有困难，因为其不允许在没有Fc区的情况下制备构建体。由于Fc区可促成生物活性，因此可能难以确定观察到的活性是基于包含Fc的双特异性分子中可变区的组合、Fc还是基于这两者。此外，交换是一个动态的过程，这可导致与实际测试的实体是何物相关的困难。
因此，需要产生双特异性蛋白质复合物以使得能够实现双特异性抗体的更有效和更高通量的筛选的新方法。具体而言，需要这样的形式和方法，在所述形式和方法中，可容易地组合从可用抗体或抗体片段库中选择任何两种抗体或抗体片段以高效地产生不同双特异性抗体的多重复合物，同时例如避免同二聚体的形成或使其最小化。当筛选抗原特异性的新组合的协同生物学功能时，特别是在异二聚体对于发现该功能是必需的情况下，高效地组装不同双特异性抗体尤其重要。发明概述
在一个方面，提供了特别适用于筛选的新的双特异性形式，因为所有组分可以作为单独的单元从细胞表达，而基本上没有聚集，并且单元可以仅通过混合而无需使用缀合或偶联化学来组装，并且具有最低限度的同源二聚化。
因此，提供了具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X为第一融合蛋白；
Y-B为第二融合蛋白；
X:Y为异二聚性系链；
:是X与和Y之间的结合相互作用；
A为双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其独立地选自Fab片段、Fab'片段、sdAb和单链Fv(scFv)；
B为单链Fv或sdAb；
X为结合对的第一结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；以及
Y为结合对的第二结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；
条件是当X为抗原时，Y为对由X表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，并且当Y为抗原时，X为对由Y表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb。
X和Y可在A和B的N端或C端分别与A和B融合。
在本公开内，融合蛋白的术语“A-X”和“Y-B”可以类似地表示为“X-A”或“B-Y”。这同样适用于异二聚性系链“X:Y”的术语，其在本文中也可表示为“Y:X”。
在一个实例中，提供了具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中:
A-X为第一融合蛋白；
Y-B为第二融合蛋白；
X:Y为异二聚性系链；
:是X与Y之间的结合相互作用；
A为双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其独立地选自Fab片段、Fab'片段、sdAb和单链Fv(scFv)；
B为单链Fv或sdAb；
X为结合对的第一结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；以及
Y为结合对的第二结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；
条件是当X为抗原时，Y为对由X表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，并且当Y为抗原时，X为对由Y表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb。
在一个实施方案中，将X与scFv的C-端或者Fab片段或Fab'片段中的重链的C端融合，任选地通过接头，所述scFv或Fab片段或Fab'片段均由A表示。
在一个实施方案中，Y与由B表示的scFv的C端融合，任选地通过接头。
在一个实施方案中，X与scFv的N-端或者Fab片段或Fab'片段中的重链的N端融合，任选地通过接头，所述scFv或Fab片段或Fab'片段均由A表示。
在一个实施方案中，Y与由B表示的scFv的N-端融合，任选地通过接头。
在一个实施方案中，变量X或Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb，而另一个变量(X或Y)是肽。
当X或Y为Fab或Fab'分子时，片段的C端(诸如重链CH1或轻链CL的C端)通常通过接头连接至抗体片段A或B的C端。
在一个实施方案中，X与Y之间的结合亲和力为5nM或更强，例如900pM或更强，如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM或300pM。
在一个实施方案中，A、X和/或Y中的至少一个(诸如一个)是Fab或Fab'分子。有利地，在形式中具有至少一个Fab或Fab'分子有利于该形式的稳定性，例如物理稳定性，并且可以使可能影响该形式的聚集或类似的不期望的效应最小化，尤其是在Fab或Fab'片段不存在的情况下。
在一个实施方案中，本公开的双特异性复合物仅包含一个Fab片段或仅包含一个Fab'片段。
在一个实施方案中，本公开的双特异性复合物包含不超过一个或不超过两个scFv。
在一个实施方案中，A为Fab或Fab'片段，诸如Fab片段。
在一个实施方案中，A为scFv。
在一个实施方案中，A为sdAb。
在一个实施方案中，A为scFv并且X或Y为Fab或Fab'片段。
在一个实施方案中，B为scFv。
在一个实施方案中，B为sdAb。
在一个实施方案中，B为scFv并且X或Y为Fab或Fab'片段
包含一个或多个scFv作为A和/或B的形式对于筛选是有用的，因为其允许对来自文库(诸如噬菌体文库)的scFv分子进行快速筛选而无需重新形成化为其它抗体片段，如Fab。
在一个实施方案中(特别是当A为Fab、Fab'时)，X独立地选自scFv、sdAb和肽，条件是当X为Fab、Fab'、scFv或sdAb时，则Y为抗原，诸如肽，以及当X为肽时，Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
在一个实施方案中(特别是当A为scFv时)，X独立地选自Fab片段、Fab'片段和肽，条件是当X为Fab或Fab'片段时，则Y为抗原，诸如肽，以及当X为肽时，Y为Fab片段、Fab'片段。
在一个实施方案中，X为Fab片段或Fab'片段，诸如Fab片段。
在一个实施方案中，X为scFv。
在一个实施方案中，X为sdAb。
在一个实施方案中，Y为Fab片段或Fab'片段，诸如Fab片段。
在一个实施方案中，Y为scFv。
在一个实施方案中，Y为sdAb。
在一个实施方案中，B为scFv并且Y为Fab或Fab'片段。
在一个实施方案中，X为肽。
在一个实施方案中，Y为肽。
在一个实施方案中，X或Y的肽长度在5至25个氨基酸的范围内，特别是肽GCN4、其变体、衍生物或片段。
在一个实施方案中，其中X或Y表示对肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1至38)特异的Fab片段、Fab'片段，scFv或sdAb，诸如scFv 52SR4(SEQ ID NO:3、98或99或SEQ ID NO:3的氨基酸1至243)。当X或Y为结合GCN4的Fab或Fab'片段时，其可包含来自scFv52SR4的VH和VL区。显然，当X或Y为对肽GCN4、其变体、衍生物或片段(表1A中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1至38，其中以粗体表示的氨基酸是任选的，以斜体表示的氨基酸是接头的序列)特异的Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb时，则相应的变量X或Y需要相应的GCN4肽或其变体、衍生物或片段，诸如SEQ ID NO:1的氨基酸1至38或其部分。编码根据SEQID NO:1的GCN4肽的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中显示为SEQ ID NO:2。
表1A
表1B中显示了GCN4肽的其它变体(SEQ ID NO:75-97)，其中以粗体表示的氨基酸是任选的，以斜体表示的氨基酸形成接头的序列。应该注意的是，尽管根据SEQ ID NO:75至82中所示的序列的变体包含4次4个甘氨酸残基和1个丝氨酸(G4S)的重复的接头，但本文中还设想了接头更短(1x G4S、2x G4S或3x G4S)或更长(5x G4S等)的变体。
表1B
应该理解的是，A-X和Y-B融合蛋白可以以各种方向产生，这意味着编码此类融合物的多核苷酸构建体可以被设计成在两个方向表达X或A(A-X，其中A的C端与X的N端融合，或者X-A，其中X的C端与A的N端融合)。这同样适用于Y-B融合物。
无论A、X、Y或B是否位于融合物的N端，产生此类融合物的多核苷酸序列将包含被设计成在融合物的最N端编码信号肽序列的核苷酸序列，用于辅助细胞外释放。信号肽最终从成熟融合体切割下来。优选信号肽序列在表1A中以SEQ ID NO:100-103显示。
在一个实施方案中(特别是当A为Fab、Fab'时)，Y独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和肽，条件是当X为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdA，则Y为抗原，诸如肽，以及当X为抗原如肽时，Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
在一个实施方案中(特别是当A为Fab、Fab'时)，Y独立地选自scFv、sdAb，条件是X为抗原诸如肽。
在一个实施方案中(特别是当A为Fab、Fab时')，Y为肽，条件是X为scFv或sdAb。
在一个实施方案中(特别是当A为scFv时)，Y独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和肽，条件是当X为Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb时，则Y为肽，以及当X为肽时，Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
在一个实施方案中(特别是当A为scFv时)，Y独立地选自scFv、sdAb和肽，条件是当X为Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb时，则Y为肽，以及当X为肽时，Y为Fab片段、Fab'片段。
在一个实施方案中(特别是当A或B为scFv时)，Y独立地选自Fab片段、Fab'片段，条件是X为肽。
在一个实施方案中(特别是当A或B为scFv时)，X独立地选自Fab片段、Fab'片段，条件是Y为肽。
因此，本公开的双特异性形式的A和B元素一起独立地表示:
Fab或Fab'臂和scFv或sdAb臂，或者
两个scFvs臂，或者，
两个sdAb臂，或者，
一个scFv臂和一个sdAb臂，以及
X和Y组分一起独立地表示：
肽和Fab或Fab'片段，或者
肽和scFv，或者
肽和sdAb。
在一个实施方案中，A-X为：
1.Fab或Fab'接头和肽，
2.Fab或Fab'接头和scFv，或者
3.Fab或Fab'接头和sdAb。
在一个实施方案中，B-Y为：
4.scFv接头和肽，
5.scFv接头和scFv，或者
6.scFv接头和sdAb。
在一个实施方案中，本公开的双特异性蛋白质复合物是基于以上数字(诸如表1C所示)的组合：
表1C
该类型的排列非常适合用于筛选可表达的单元A-X和单元B-Y。
表1D给出了根据本发明范围的所有可能组合的概述。
表1D
在一个实施方案中，A中的scFv包含可变结构域内二硫键。
在一个实施方案中，B中的scFv包含可变结构域内二硫键。
在一个实施方案中，X中的scFv包含可变结构域内二硫键。
在一个实施方案中，Y中的scFv包含可变结构域内二硫键。
在一个实施方案中，二硫键介于两者之间(除非上下文另外指出，否则在下面的列表中使用Kabat编号)。无论何处提及Kabat编号，相关参考文献均为Kabat等，1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health andHuman Services,NIH,USA):
●VH37+VL95C，参见诸如Protein Science 6,781-788 Zhu等(1997)；
●VH44+VL100，参见例如；Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等(1994)；或Journal of Biological Chemistry第269卷第28期第18327-18331页Reiter等(1994)；或Protein Engineering，第10卷第12期第1453-1459页Rajagopal等(1997)；
●VH44+VL105，参见诸如J Biochem.118,825-831 Luo等(1995)；
●VH45+VL87，参见诸如Protein Science 6,781-788 Zhu等(1997)；
●VH55+VL101，参见诸如FEBS Letters 377 135-139 Young等(1995)；
●VH100+VL50，参见诸如Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber等(1990)；
●VH100b+VL49；
●VH98+VL46，参见诸如Protein Science 6,781-788 Zhu等(1997)；
●VH101+VL46
●VH105+VL43，参见例如，Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90卷第7538-7542页Brinkmann等(1993)；或Proteins 19,35-47 Jung等(1994)或者
●VH106+VL57，参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等(1995)
上面列出的氨基酸对位于有利于被半胱氨酸置换的位置，从而使得可形成二硫键。可以通过已知技术将半胱氨酸工程化至这些位置。
因此，在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半胱氨酸残基(一个在VH和一个在VL中)之间的二硫键连接，其中该半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半胱氨酸残基(一个在VH中，另一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基在CDR的外部，其中该半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半胱氨酸残基(一个在VH中，另一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基在CDR的外部，其中该半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中VH的半胱氨酸残基位于位置44并且VL的半胱氨酸残基位于位置100。
通常将半胱氨酸对被工程化到VH和VL中的那些位置，因此在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可以通过两个工程化半胱氨酸之间的二硫键连接。
因此，每个单元(A-X或B-Y)表达后所需的纯化量最小或实际上是不必要的。双特异性配合物可以通过简单混合相关单元(即不依赖于缀合和偶联化学)而以1:1摩尔比形成。当存在时，Fab/Fab'片段中的恒定区驱动Fab/Fab'组分的二聚化，并且结合伙伴X和Y驱动平衡进一步有利于形成必需的异二聚体双特异性复合物。在异二聚化后形成复合物后，同样几乎不需要或不需要纯化。因此可以容易地制备和组合大量的A-X和B-Y。
在A和B之一或两者表示scFv的情况下，这可以是有利的，因为其允许直接来自文库的scFv在本公开的形式中使用，从而允许快速测试并避免将可变区重构为替代形式诸如Fab的需要。
可以设想根据本发明的双特异性蛋白质复合物的明显替代物。一个实例包括包含不止一个A或不止一个B的分子，诸如A'-A-X:Y-B或A-X:Y-B-B'，其中A'和B'可各自独立地选自scFv、sdAb、Fab或抗原，并且与A融合。诸如，分子的A'-A部分可由两个scFv形成，每个scFv针对同一靶标上的不同表位，形成分子(scFv)2-X:Y-B。
在另一个实例中，双特异性复合物可由非Ig样结合蛋白形成，所述非Ig样结合蛋白包括但不限于阿德奈汀(adnectin)、脂质运载蛋白、基于Kunitz结构域的结合物、avimers、knottin、fynomer、atrimers、基于细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA4)的结合剂、darpins、亲和体(affibodies)、人遍在蛋白(affilins)、犰狳重复蛋白或其组合。
根据本发明的双特异性蛋白质复合物缺少Fc片段。制备和筛选缺少Fc片段CH2-CH3的双特异性复合物的能力还确保了所观察到的生物活性实际上仅归因于复合物中的可变区对。本公开的双特异性复合物的简单性及其制备方法在促进可变域对的高通量筛选以找到新的靶抗原组合以及优化给定组合的可变区序列方面具有巨大的优势。
在一个实施方案中，A和/或B对选自以下的抗原是特异的：细胞表面受体诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、免疫球蛋白样受体、基质金属蛋白酶和金属蛋白酶的膜类型基质金属蛋白酶组织抑制剂、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原(癌症相关抗原和肽)、病原体识别受体、补体受体、激素受体、清道夫受体或可溶性分子诸如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素或酶或离子通道，包括其翻译后修饰形式、包含至少一个表位的其片段。
在一个实施方案中，提供了组合物，诸如药物组合物，其中包含根据本公开的一种或多种双特异性复合物。
此外，本发明人已经设计了检测式A-X:Y-B的异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同功能的方法，
其中:
A-X为第一融合蛋白；
Y-B为第二融合蛋白；
X:Y为异二聚性系链；
:为X与Y之间的结合相互作用；
A为双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其独立地选自Fab片段、Fab'片段、sdAb和单链Fv(scFv)；
B为单链Fv或sdAb；
X为结合对的第一结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；以及
Y为结合对的第二结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；
条件是当X为抗原时，Y为对由X代表的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，以及当Y为抗原时，X为对由Y代表的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，所述方法包括以下步骤:
(i)在功能测定中测试包含至少一个异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物的多重复合物的部分或全部的活性；和
(ii)分析来自功能测定的读数(readout)以检测异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能。
此外，本发明人已经设计了检测式A-X:Y-B的异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物中的协同功能的方法，
其中:
A-X为第一融合蛋白；
Y-B为第二融合蛋白；
X:Y为异二聚性系链；
:为X与Y之间的结合相互作用；
A为双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其独立地选自Fab片段、Fab'片段、sdAb和单链Fv(scFv)；
B为单链Fv或sdAb；
X为结合对的第一结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；和
Y为结合对的第二结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；
条件是当X为抗原时，Y为对由X代表的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，并且当Y为抗原时，X为对由Y代表的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，所述方法包括以下步骤:
(i)在功能测定中测试包含至少一个异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物的多重复合物的部分或全部的活性；以及
(ii)分析来自功能测定的读数以检测异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能。
在一个实施方案中，多重复合物呈网格形式，例如多重复合物包含至少两个异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物。
针对上述形式提供的细节同样适用于在本公开的方法中采用的形式。
在一个实施方案中，在测试之前不纯化异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，瞬时表达A-X和Y-B融合蛋白，并且不进行纯化，然后以1:1摩尔比混合以产生每种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物。
因此，通常不在同一细胞中共表达融合蛋白A-X和B-Y。这是有利的，因为其允许例如100种融合蛋白表达和任选地纯化，并且随后以各种排列混合这100种融合蛋白可提供10,000种异二聚性系连的双特异性蛋白复合物，其中5,000种是独特的对。
相反，某些现有技术方法需要双特异性的共表达，因此对于10,000种复合物，需要10,000次转染、表达和纯化。
然而，如果需要，可以在同一细胞中表达A-X和B-Y。
结合伙伴X和Y彼此之间具有亲和力，并充当或棒状磁铁的生物学等同物，并将复合物保持在一起。有利地，这意味着融合蛋白A-X和Y-B可以仅通过将融合蛋白混合在一起而容易地组装成双特异性蛋白复合物。因此，本公开的双特异性蛋白复合物具有模块化结构，其允许两种不同的蛋白容易地组装，以便例如以网格状方式产生具有不同抗原特异性组合的双特异性蛋白质复合物的大排列组。这允许高效和系统地筛选大量的双特异性蛋白质复合物，以检测累加性、协同性或新颖的生物学功能。
鉴于X和Y对于彼此是特异的，因此这显著降低了形成均二聚体的能力。X和Y在本文中统称为结合对或结合伙伴。在一个实施方案中，X对其它X不具有高亲和力。在一个实施方案中，Y对其它Y不具有高亲和力。有利的是，当X和Y不形成同二聚体时，这防止了不需要的单特异性蛋白质复合物的形成，提高了所需双特异性蛋白质复合物的产率，并且消除了对除去单特异性蛋白质复合物的繁琐纯化步骤的需要。
这允许双特异性蛋白质复合物的快速组装，其产率和/或纯度是通过大多数现有技术方法所无法有效获得的，特别是现有技术方法通常需要广泛的纯化步骤。双特异性复合物的产率在本发明中通常为75％或更高。
进一步有利的是，双特异性蛋白质复合物允许筛选复合物，其中组成蛋白质(包括被组成蛋白质结合的抗原)不具有已知的关系或处于不同的潜在不相关的途径中，诸如可在双特异性蛋白质复合物中测试在两种不同途径中发挥作用、并且例如本领域技术人员通常不会预计到其彼此接触的两种蛋白质，以鉴定累加性、协同性和/或新颖的功能。
此外，可以平行研究针对给定的抗原或表位的多个结合区(诸如可变区)以鉴定生物学功能的细微差别。这允许研究和优化针对给定的一对抗原的可变区序列的组合。
本发明的方法允许科学显示结果，并且不依赖关于生物学功能的预先设想的想法和技术上的偏见。这种方法可能非常强大。
有利地，X和Y组分允许包含由融合蛋白的不同排列构成的双特异性蛋白质复合物的多重复合物迅速且容易地组装。
附图说明
图1是显示本公开的双特异性蛋白质复合物的结构和组装的示意图。
图2是显示使用本发明的双特异性抗体进行功能筛选的示例性4x4网格的表格。通过使用该网格，可以组装16种不同的双特异性蛋白质复合物并高效地筛选协同功能。
图3是根据本发明的双特异性蛋白质复合物的实施方案的卡通图，其中A和B各自独立地由Fab、scFv或sdAb表示；X为抗GCN4肽，诸如Fab、scFv、sdAb，Y为GCN4肽。
图4是根据本发明的双特异性蛋白质复合物的实施方案的卡通图，其中A由Fab表示；X为抗GCN4肽，由Fab、scFv、sdAb代表；Y为GCN4肽，B由Fab、scFv或sdAb表示。
图5是根据本发明的双特异性蛋白质复合物的实施方案的卡通图，其中A由scFv表示；X为抗GCN4肽，由Fab、scFv、sdAb代表；Y为GCN4肽，B由Fab、scFv或sdAb表示。
图6是根据本发明的双特异性蛋白质复合物的实施方案的卡通图，其中A由sdAb表示；X为抗GCN4肽，由Fab、scFv、sdAb代表；Y为GCN4肽，B由Fab、scFv或sdAb表示。
图7显示scFv-Y形式的哺乳动物表达载体。
图8显示来自供体UCB Cone 130的IgM刺激的B细胞上CD79-CD22和CD79-CD45Fab-X:Fab-Y和Fab-X:scFv-Y双特异性组合对PLCg2(+/-SD)的抑制。
图9显示来自供体UCB Cone 130的IgM刺激的B细胞上CD79-CD22和CD79-CD45Fab-X:Fab-Y及Fab-X:scFv-Y双特异性组合对Akt(+/-SD)的抑制。
详述
如本文中所用，“双特异性蛋白质复合物”是指包含通过异二聚性系链保持在一起的两种蛋白质(在本文中称为双特异性组分的A和B在本文中也分别称为双特异性物质的第一蛋白质组分和第二蛋白质组分)的分子。通常所述蛋白质之一或两者包含结合结构域，优选抗体结构域，但也可使用其它结合结构域。当结合结构域包含抗体结构域时，每个结构域包含至少3个互补决定区(CDR)和框架，诸如VHH包含3个CDR，而Fab包含6个CDR。
如本文中所用，“融合蛋白”包含与结合伙伴X或Y融合(视情况而定)的蛋白质组分A或B。在一个实施方案中，融合蛋白是通过重组技术从基因构建体表达的翻译蛋白，例如在宿主中从DNA构建体表达的。在本公开的说明书中，融合蛋白的关键特征之一是其可以从细胞中表达为“单个蛋白质/单元”(当然，在包含Fab/Fab'片段的融合蛋白的情况下将存在两条链，但是为了本说明书的目的，这将被认为是具有一条链的单个蛋白质，优选重链根据需要在其C-端与X或Y融合，任选地通过如本文下面所述的接头；诸如与X和Y的N端融合的其它方向也是可能的)。
异二聚性系链X:Y的功能是使蛋白质A与B保持彼此靠近，使得可以例如采用本文所述的方法实现或鉴定A和B的协同功能。
如本文中所用，术语“异二聚性系链”是指包含两个不同结合伙伴X和Y的系链，其在彼此之间形成相互作用(诸如结合)，该相互作用的总体亲和力足以使两个结合伙伴保持在一起。在一个实施方案中，X和/或Y不适合于形成同二聚体。
异二聚性系连和异二聚性系链在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，如本文中所用，“不适合形成同二聚体”是指X-Y异二聚体的形成比同二聚体更为优选，诸如一旦形成后更稳定，诸如热力学稳定。在一个实施方案中，X与Y之间的结合相互作用是单价的。
在一个实施方案中，X-Y相互作用比X-X或Y-Y相互作用更有利。当融合蛋白A-X和B-Y混合时，这减少了同二聚体X-X或Y-Y的形成。在以1:1的摩尔比混合后通常形成75％或更多的异二聚体。
如果需要，可采用纯化步骤(特别是一步纯化)，诸如柱层析，以便例如纯化根据本公开的融合蛋白单元和/或双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，在表达所述融合蛋白或每种融合蛋白后提供纯化步骤，尽管通常聚集物水平低。因此，在一个实施方案中，在体外混合之前，融合蛋白以基本上纯的形式提供。如本文所用的基本上纯的形式是指其中融合蛋白是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的单体。
在一个实施方案中，不进行融合蛋白的纯化。
在一个实施方案中，每种融合蛋白单元在不同的表达实验/运行中表达。
在一个实施方案中，在混合以产生双特异性蛋白质复合物之前不进行融合蛋白的纯化。在一个实施方案中，在混合之前和/或之后不进行融合蛋白的纯化。
在一个实施方案中，在双特异性蛋白质复合物形成后不需要纯化。
在一个实施方案中，在混合之后并且通常无需进一步纯化，组合物的至少50％是所需的双特异性蛋白质复合物，例如至少60％、65％、70％、75％、80％的组合物是所需的双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，本方法的体外混合步骤中使用的融合蛋白的比例为A-X比B-Y是0.8:1至3:1，诸如1.5:1或2:1。
在一个实施方案中，在本发明方法的体外混合步骤中采用的融合蛋白的比例为B-Y比A-X是0.8:1至3:1，诸如1.5:1或2:1，特别是摩尔比。
在一个实施方案中，在体外混合步骤中采用的A-X与B-Y的比例为1:1，特别是1:1的摩尔比。
本公开还扩展至制备根据本公开的双特异性复合物的方法，包括将融合蛋白A-X和B-Y例如以1:1的摩尔比混合。
在一个实施方案中，混合在体外发生。
在一个实施方式中，混合在细胞中，诸如宿主细胞中发生。
在一个实施方案中，混合在体内发生，即融合蛋白A-X和B-Y在受试者体内彼此相互作用以形成异二聚性系链，并因此形成双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，X和Y彼此是完全特异的，并且不与细胞内或受试者体内的任何其它肽/蛋白质结合。这可例如通过确保X和Y不天然存在于靶细胞或目标受试者体内来实现。这可以例如通过选择来自与受试者不同的物种或实体(诸如酵母蛋白)的X或Y并确保另一变量对其是特异的来实现。有利的是，这防止了融合蛋白A-X和/或B-Y与不需要的靶标结合(从而产生不想要的脱靶效应)。
在一个实施方案中，一种(或至少一种)结合伙伴不能形成同二聚体，例如对结合伙伴的氨基酸序列进行突变以消除或最小化同二聚体的形成。
在一个实施方案中，两个结合伙伴都不能形成同二聚体，例如对肽结合伙伴的氨基酸序列进行突变以消除或最小化同二聚体的形成，并且使用对其特异的sdAb。
如本文中所用的不能形成同二聚体或聚集体是指形成同二聚体或聚集体的低倾向或零倾向。如本文中所用，低是指例如在混合或表达或纯化后5％或更少，诸如4％、3％、2％、1％、0.5％或更少的聚集体。
融合蛋白中聚集物或异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中残余物的量少通常对本公开的筛选方法具有最小的影响。因此，在一个实施方案中，本方法中不使用融合蛋白和/或双特异性蛋白质复合物的纯化，特别是在混合步骤之后。
在一个实施方案中，:是基于吸引力(例如范德华力)的结合相互作用，诸如氢键合和静电相互作用，特别是基于抗体对抗原(诸如肽)的特异性。
在一个实施方案中，:是从特定化学相互作用(诸如点击化学法)形成的共价键。在一个实施方案中，:不是共价键。在一个实施方案中，不使用缀合/偶联化学来制备本公开的双特异性蛋白质复合物。
如本文中所用，“形成复合物”是指包括结合相互作用或化学反应的相互作用，当将融合蛋白组分A-X和B-Y在组装复合物的适当条件下接触并且融合蛋白保持在一起时，所述相互作用足够特异和强。
本文中所用，“保持在一起”是指将组分(融合蛋白)保持在彼此附近，使得在X:Y结合之后，复合物可以如同一个分子一样进行处理，并且在许多情况下表现得像单个分子并像单个分子一样起作用。在一个实施方案中，保持使复合物适用于本文公开的方法，即适用于至少一个功能筛选。
本文中采用的特异性是指例如相互作用中的伙伴例如X:Y或A与抗原或B与抗原仅识别彼此或与非伙伴相比具有显著更高的彼此亲和力，例如是例如与不相关的非伙伴蛋白的结合的背景水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍的亲和力。
如本文中所用，与X和Y相关的特异性是指相互作用中的结合伙伴X和Y仅彼此识别或与非伙伴相比具有显著更高的相互亲和力，例如高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍的亲和力。
在一个实施方案中，结合相互作用是可逆的。在一个实施方案中，结合相互作用基本上是不可逆的。
如本文中所用，基本上不可逆是指抗体或结合片段的缓慢解离速率(解离常数)。
在一个实施方案中，X与Y之间的结合相互作用具有低解离常数。
低解离常数的实例包括1-9x10-2s-1或更少，例如1-9x10-3s-1、1-9x10-4s-1、1-9x10- 5s-1、1-9x10-6s-1或1-9x10-7s-1。特别合适的解离常数包括2x10-4s-1或更少，例如1x10-5s-1、1x10-6s-1或1x10-7s-1。
尽管不希望受理论束缚，但认为低解离常数(也称为解离速率)使得该分子足够稳定而使双特异性蛋白质复合物有用，特别是在功能性筛选测定中。
在一个实施方案中，X与Y彼此的亲和力为5nM或更强，例如900pM或更强，诸如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM或300pM。
亲和力是根据实体的结合和解离速率计算的值。如本文中所用，术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合伙伴(例如肽)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子对其结合伙伴的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些方法，诸如表面等离子体共振方法，特别是BIAcore。
然而，将复合物保持在一起的能力不仅仅关乎亲和力。虽然不希望受到理论的束缚，但我们假设实际上存在三个重要的组成部分：结合速率、解离速率和亲和力。亲和力的计算基于结合速率和解离速率。因此，如果结合速率低并且解离速率快，则亲和力将会低并且不足以将双特异性蛋白质复合物保持在一起。然而，缓慢的结合速率可通过缓慢的解离速率来补偿，从而提供总体适合的亲和力。在一些实施方案中，高结合速率可能足以将复合物保持在一起。
如果复合物中使用的结合伙伴(X和Y)具有缓慢的结合速率，则在混合组分后可能需要额外的时间来使复合物形成。
如果结合伙伴之间的亲和力足够高，即使双特异性蛋白质复合物的蛋白质(A和B)的亲和力仅与它们的靶标弱结合，双特异性蛋白质复合物仍可能执行其所需的生物学功能。相反，如果蛋白质(A和B)能够与其靶标强力结合，即使结合伙伴(X和Y)彼此的亲和力较低，也可能实现相同的生物学功能。换言之，存在“三位一体”(trinity)关系，使得结合伙伴之间的较高亲和力可以补偿针对靶标的较低亲和力，反之亦然。
在一个实施方案中，本文中的方法用于通过从文库制备本公开的融合蛋白来筛选噬菌体展示文库，包括全新噬菌体文库。
本发明的双特异性蛋白质复合物可用于任何合适的应用，包括功能筛选。这种新颖的形式在多重功能筛选中特别有用，以基于功能鉴定蛋白质靶标，和鉴定可被双特异性疗法靶向的那些靶蛋白上的最佳表位。此外，在蛋白质A和B为抗体或其结合片段的情况下，双特异性蛋白质复合物还可用于多重功能筛选以鉴定用于双特异性抗体治疗剂的最佳可变区对。
如本文中所用，“多重复合物”是用于测试的实体群体，包括:
经组合以产生至少一种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物的至少两种组分融合蛋白(A-X和Y-B)和以相同或不同形式存在的至少一种相关生物学比较物，或
至少两种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物和任选地以相同或不同形式存在的至少一种相关生物学比较物。
显然有用的是，用作比较物的不同形式必须适合于在本公开中采用的功能性体外测定中进行测试。在一个实例中，多重复合物中的比较物是A-X和B-X的单价混合物或A-X-Y-A的二价单特异性复合物。
在一个实施方案中，多重复合物包含1种至数十万种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物，例如2至500,000种所述复合物，诸如2至100,000种或2至10,000种，特别是通过在网格中将第一和第二融合蛋白(A-X和B-Y)混合2至100秒产生的。在一个实施方式中，多重复合物包括例如2至1,000种，诸如2至900种、2至800种、2至700种、2至600种、2至500种、2至400种、2至300种、2至200种、2至100种、2至90种、3至80种、4至70种、5至60种、6至50种、7至40种、8至30种、9至25种、10至20种或15种双特异性蛋白质复合物。关于这种网格的实例，参见图2。
在一个实施方案中，该多重复合物中的异二聚性系连的双特异性蛋白质的数目是n2，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多。
多重复合物可呈阵列的形式，例如微量滴定板，其中微孔板的每个孔可含有不同的双特异性蛋白质复合物。可将双特异性蛋白质复合物系连于固体基底表面，诸如附着于珠粒，或者可将它们以液体(诸如溶液或介质)形式悬浮于例如孔内或液滴内。
在一个实施方案中，多重复合物中的每个“A”都是不同的蛋白质，优选与靶抗原结合的抗体或其结合片段，并且每个“B”是不同的蛋白质，优选结合靶抗原的抗体或其结合片段。
在一个实施方案中，在如下面论述的网格(例如分别等同于64、256或320个样品的8x 8、16x 16或16x 20)中提供多重复合物。
如本文中所用，“网格”是指二维图或阵列，其中一个变量(诸如蛋白A(在A-X中))沿着一个轴(诸如X轴(水平轴))变化，并且另一个变量(诸如蛋白质B(在B-Y中))沿着另一个轴(诸如Y轴(垂直轴))变化。这种排列有助于系统地评估变量的各种组合(排列)。
在一个实施方案中，在96孔板上提供多重复合物，分析的样品可以是其倍数，即96倍、192倍、384倍等。
有利地，网格排列对于高效筛选根据本公开的双特异性蛋白质复合物的生物学功能是特别有利的。图2显示了这种网格的一个实例，其中可将4种第一融合蛋白容易地与4种第二融合蛋白组合以产生16种双特异性蛋白质复合物。
筛选网格的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的，例如可将第一融合蛋白(A-X)中的第一蛋白(A)保持不变，而使第二融合蛋白(B-Y)中的第二蛋白(B)变化。这对于快速筛选大量不同的第二蛋白以寻求与预先选择的第一蛋白的协同功能是有用的。
在另一个实施方案中，通过改变蛋白质A的抗体可变区来使得蛋白质A沿着一条轴变化，使得每个抗体变体对相同抗原是特异的，但具有可变区的不同组合。蛋白质B可保持不变，或者也可以以相同的方式变化或使得针对B蛋白质的抗原特异性改变而变化(横穿网格或沿网格向下)。
有利地，当双特异性蛋白质复合物对相同抗原特异但具有可变区的不同组合时，这样的筛选网格可潜在地允许检测协同功能的微小差异。
在一个实施方案中，根据本公开的“共同”第一融合蛋白(A-X)可存在于每个孔内。然后可将根据本公开的一系列不同的第二融合蛋白(B-Y)分配到每个孔中。随后，两个结合伙伴(X和Y)的特异性结合相互作用物理地将两种融合蛋白拉在一起以形成双特异性蛋白质复合物。这导致包含双特异性蛋白质复合物的多重复合物，所述复合物全部结合至共同第一靶抗原(由A结合)，但也能够结合第二靶抗原(由B结合)，所述第二靶抗原对于每种双特异性蛋白质复合物可以不同。
在一个实施方案中，B-Y融合蛋白包含针对相同靶抗原的不同可变区，以允许当与A-X中的可变区组合时优化被B结合的给定靶抗原的可变区和/或表位。
本文中所用，“共同”第一融合蛋白质是这样的融合蛋白质，其中其A或B组分与相同的蛋白质或表位结合，特别是当A或B组分在共同融合蛋白质中具有完全同一性时，即共同第一融合蛋白质始终包含相同的可变区序列。
本领域技术人员也知道上述的不同变化，使得可以容易地控制多重复合物中每个位置处的双特异性蛋白质复合物的所需特异性。当在功能测定中使用这种多重复合物时，这允许高效筛选双特异性蛋白质复合物的不同组合。在一个实施方案中，将因子设计用于定义网格中使用的变量。
在一个实施方案中，本公开的方法有助于高通量分析。
在一个实施方案中，平行或基本上同时测试多种双特异性蛋白质复合物。
如本文中所用，同时是指在同一分析中(诸如在同一“运行”中)分析样品/分子/复合物。这可以是有利的，因为通常地用于给定样品运行的试剂将是相同的批次、浓度、细胞来源等，因此具有相同的性质。此外，进行分析所处的环境条件，诸如温度和湿度可能相似。
在一个实施方案中，同时是指伴随分析，其中基本上在同一时间通过仪器分析信号输出。该信号可能需要解析来解释所获得的结果。
有利地，测试多个双特异性蛋白质复合物可允许更高效地筛选大量双特异性蛋白质复合物和鉴定新的和有趣的关系。
在一个实施方案中，通过使用如上定义的多重复合物并对其进行一种或多种功能测定来测试多种双特异性蛋白质复合物。因此，本发明提供了用于检测式A-X:Y-B的异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能的方法，
其中X:Y为异二聚性系链，
:是X与Y之间的结合相互作用，
A和B分别是与X和Y的融合蛋白形式存在的双特异性的蛋白质组分，所述方法包括以下步骤:
(i)在功能测定中测试包含至少一种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物的多重复合物的部分或全部的活性；和
(ii)分析来自功能测定法的读数以鉴定或检测异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能；以及
其中Y为抗原并且X为对Y特异的抗体或其结合片段，或者X为抗原并且Y为对X特异的抗体或其结合片段。
如本文中所用，术语“生物学功能”是指对于被测试的生物实体是天然的或作为所述生物实体的目的的活性，例如细胞、蛋白质或类似物的天然活性。理想地，可使用体外功能测定来测试生物学功能的存在，包括采用哺乳动物细胞诸如活细胞(诸如B或T细胞)或离体组织的测定。本文中采用的天然功能还包括异常功能，诸如与疾病诸如癌症相关的功能。
本文中采用的相关“生物学比较物”是指用于在与用于双特异性蛋白质复合物的测定相同的测定中评估活性，以确定是否存在任何改变或新颖活性或功能的合适实体。用于A-X:Y-B的合适比较物可包括呈天然形式的或以与双特异性蛋白相同的形式存在的纯化蛋白质(包括重组蛋白质)，例如其中A和B为相同的实体，诸如A-X:Y-A或B-X:Y-B，即二价单特异性复合物。或者，呈未复合形式的融合蛋白A-X或B-Y可单独用作比较物或一起用作未复合的混合物诸如A-X和B-X一起或A-Y和B-Y一起。或者，可采用不同形式(特别是如本文所述的)的多个比较物。本领域技术人员能够基于在文献中找到的公知常识或信息来鉴定和包括合适的对照/比较物。
如本文中所用，术语“协同功能”或“协同生物学功能”是指生物活性或生物活性水平或者对生物学功能或活性的影响，所述生物学功能或活性：
●对于单个融合蛋白组分没有观察到，除非采用双特异性(并且可包括对针对所述抗原的抗体组合观察到的活性，所述活性不是以双特异性形式存在的，但特别地指仅当两个结合域以双特异性形式连接时才被观察到的活性)或者
●与当本公开的双特异性蛋白质复合物的第一和第二蛋白质单独使用时观察到的活性(例如仅在双特异性形式中观察到的活性)相比，活性更高或更低。
因此，“协同”包括新颖生物学功能或新颖活性。本文使用的协同功能通常不包括简单靶向，即仅基于结合，但通常在结合后涉及一些抑制、激活、信号传导等。
本文中采用的新颖生物学功能或新颖活性是指直至两种或更多种协同实体(蛋白质A和蛋白质B)被拉在一起(作为双特异性或其它物质)时才出现或存在的生物学功能或活性，或先前未鉴定的功能。
如本文中所用，较高的是指活性的增加，包括从零的增加，例如其中未复合的双特异性组分个体在相关功能测定中无活性的双特异性中的某些活性，在本文中也被称为新的活性或新颖的生物学功能。如本文中采用的“较高的”还包括在相关功能测定中与未复合的双特异性组分个体(单独测试的或连接组合测试的)相比较大于双特异性中的累加功能，例如相关活性增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。
在一个实施方案中，未复合的蛋白质一起具有与双特异性相同的活性，并且该活性或功能以前是未知的。这在本说明书的上下文中也是新颖的协同功能。
在一个实施方案中，协同功能是较高功能。
在一个实施方案中，协同功能是较低功能。
如本文中所用，较低功能是指在相关功能测定中，与在相关功能测定中具有活性的未复合的双特异性组分个体相比，双特异性分子具有较少活性或无活性，在本文中也被称为作为单独的蛋白质分析的或在相同条件下作为蛋白质的混合物分析的新的活性或新颖的生物学功能(诸如天然蛋白质，即不存在于融合蛋白中也不是除其中存在于体内的复合物外的任何其它复合物的部分-包括所述蛋白质的活性结构域或片段)，例如相关活性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。大于100％的活性的降低是指在不同方向上积极活性的增加，例如当实体是激动剂时，超过100％的活性降低可使实体成为拮抗剂，反之亦然。
在一个实施方案中，双特异性复合物的活性低于蛋白质A和蛋白质B的已知功能的总和。
在一些实施方案中，本公开的双特异性蛋白质复合物仅具有累加的生物学功能。如本文中所用，累加的生物学功能是指当在相同条件下测试时，与单独组分A和B的每一种的总和相同的功能。如果活动或功能是以前未知的或未被鉴定的，则累加功能可以是新颖的功能。
取决待鉴定的所需功能，使用本领域已知的任何合适的分析进行筛选。
在一个实施方案中，在本公开的方法中采用的功能测定是体外或离体测定。
如本文中所用，“功能测定”是可用于测定经历测定条件的双特异性蛋白复合物、抗体复合物或抗体混合物的一种或多种所需性质或活性的测定。合适的功能测定可以是结合测定、凋亡测定、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、补体依赖性细胞毒性(CDC)测定、细胞生长或增殖的抑制(细胞生长抑制效应)测定、细胞杀伤(细胞毒性效应)测定、细胞信号传导测定、细胞因子产生测定、抗体产生和同种型转换、细胞分化测定、集落形成测定、趋化作用测定、细胞粘附测定、细胞迁移测定、细胞周期测定、代谢测定(全细胞和细胞器功能)、用于测量病原体与靶细胞结合的抑制的测定、用于测量血管内皮生长因子(VEGF)或其它分泌分子的分泌的测定、用于抑菌、杀菌活性、病毒中和的测定、测量免疫系统的组分至抗体所结合的部位的吸引力的测定，包括原位杂交方法、标记方法等。
在一个实施方案中，可以采用体内测定，诸如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫性疾病的模型、病毒感染或细菌感染的啮齿类动物模型或灵长类动物模型等。
本领域技术人员完全能够基于正在研究的靶标/蛋白质选择合适的功能测定。然而，可将所述复合物经历一小组“标准”测定，而不预先选择被认为与尝试鉴定新的功能性相关的测定。
在双特异性抗体复合物的情况下，可通过本领域普通技术人员通常已知的方法，将根据本公开的双特异性抗体复合物的功效与此类模型中的单独的抗体或抗体(或片段)的混合物进行比较。
例如，可测试双特异性抗体复合物的抑制细胞增殖，影响细胞活力或代谢活性(例如利用诸如allamar蓝之类的染色剂或通过监测由细胞表达的萤光素酶引起的发光)或引起癌细胞凋亡的能力，所述能力是包括除与抗原结合外的特性的生物学功能。
通过选择与特定目标疾病密切相关的功能测定，本公开的方法使得有可能鉴定结合已知或未知靶分子的潜在治疗性抗体。因此可能使用本公开的方法鉴定新的靶分子和/或直接鉴定潜在的治疗性抗体。有利地，本发明的方法不限于任何特定的测定，并且根据需要为用户提供完全的灵活性以选择最合适的功能测定。
当筛选双特异性抗体复合物的所需生物学功能时，可采用各种策略。例如，可对含有抗体的培养基直接筛选生物活性。或者，可在筛选生物活性之前将抗体结合至包被的珠粒或微量滴定板。或者，可在镍捕获纯化步骤中通过His标签纯化融合蛋白。此类策略可以增加抗体的局部浓度，从而导致功能测定结果更清楚。
可根据需要使用或不使用特定双特异性抗体复合物的不同样品重复功能测定多次，以增强结果的可靠性。可采用本领域技术人员已知的各种统计测试来鉴定统计学上显著的结果，从而鉴定具有生物学功能的双特异性抗体复合物。
当建立用于筛选的功能测定时，技术人员可设定合适的阈值，超过该阈值，所鉴定的活性被视为“命中”。在使用不止一种功能测定的情况下，可将每个测定的阈值设定在合适的水平以建立可控的命中率。在一个实例中，命中率可以是3-5％。在一个实例中，搜寻抑制B细胞功能的抗原对时设定的标准可以是B细胞活化测定中至少两个磷酸读数有至少30％的抑制。
在本发明的双特异性蛋白质复合物中，可使用以下蛋白质和肽组分。
在一个实施方案中，结合对的第一结合伙伴X和第二结合伙伴Y中的至少一个独立地选自肽和蛋白质；例如第一结合伙伴或第二结合伙伴是肽。
合适的肽包括包含GCN4、Fos/Jun(人和鼠Fos分别具有Uniprot编号P01100和P01101，以及人和鼠jun分别具有Uniprot编号05412和05627)、HA标签(其对应于人流感病毒血凝素的氨基酸98至106)、多组氨酸(His)、c-myc和FLAG的组。其它肽也被认为适合用于本公开，并且特别合适的肽是用于蛋白质纯化的亲和标签，因为此类肽具有以高亲和力与其各自的结合伙伴结合的趋势。
在一个实施方案中，肽不是E5B9。
如本文中所用，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物，其中所述肽含有2至100个氨基酸，例如5至99个，诸如6至98个、7至97个、8至96个或5至25个氨基酸。在一个实施方案中，本公开中采用的肽是具有50个氨基酸残基或更少(例如40个、30个、20个、10个或更少)的氨基酸序列。
在一个实施方案中，蛋白质是抗体或抗体片段。
如本文中所用，术语“抗体”是指能够经由位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别部位(在本文中也称为结合部位)特异性结合靶抗原(诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、肽、蛋白质等)的免疫球蛋白分子。
如本文中所用，术语“抗体”或“抗体分子”包括抗体及其抗原结合片段。
本文中所采用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指天然存在的或人造的抗体的片段，包括但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单结构域抗体(sdAb)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug DesignReviews-Online 2(3),209-217)。
用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域中是公知的(参见例如Verma等，1998,Journal of Immunological Methods,216:165-181)。用于本公开的其它抗体片段包括国际专利申请WO05/003169、WO05/003170和WO05/003171中描述的Fab和Fab'片段。多价抗体可包含多种特异性，例如双特异性，或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。
如本文中采用的，“抗原结合片段”是指例如抗体或另一分子的片段，所述片段能够以足够的亲和力结合靶肽或抗原以将该片段表征为对所述肽或抗原是特异的。
如本文中所用，术语“Fab片段”是指包含含有轻链的VL(可变轻链)结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段和重链的VH(可变重链)结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。在一个实例中，Fab片段的重链序列在CH1的链间半胱氨酸处“终止”。在一个实施方案中，用于本公开的融合蛋白诸如A-X和/或B-Y的Fab片段是单价的。
本文中所采用的Fab'片段是指还包含全部或部分铰链区的Fab片段。在一个实施方案中，用于本公开的融合蛋白诸如A-X和/或B-Y的Fab'片段是单价的。
如本文所用，术语“单链Fv”或缩写为“scFv”是指包含连接(例如通过肽接头)形成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。重和轻链的恒定区在这种形式中被省略。本文中采用的单链Fv包括其二硫键稳定化的形式，其中除了肽接头以外，可变区之间还存在二硫键。
二硫键稳定化的scFv可以消除一些可变区域动态呼吸的倾向，这种呼吸涉及可变区域分离和再次聚集在一起。
如本文中所用，术语“sdAb”或“单结构域抗体”是指包含单个抗原结合结构域的分子。它们可以是人工产生的或天然存在的，并且包括但不限于仅VH、仅VL、骆驼科VHH、人结构域抗体、鲨鱼来源的抗体诸如IgNAR和其它非抗体单结构域结合形式，包括但不限于adnectins、脂质支载蛋白、基于Kunitz结构域的粘合剂、avimers、knottin、fynomers、atrimers、基于细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA4)的粘合剂、darpins、亲和体、人遍在蛋白、犰狳重复蛋白。
抗体结合片段和/或双特异性抗体复合物不包含Fc区域。如本文中所采用的“不包含Fc区域”是指不存在的较低恒定的结构域，诸如CH2、CH3和CH4。然而，恒定结构域诸如CH1、Cκ/Cλ可能存在。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)中采用的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，特别是单价Fab、Fab'、scFv、Fv、sdAb等。
在一个实施方案中，第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，特别是单价Fab、Fab'、scFv等。
本文中采用的“单特异性”是指仅结合一种靶抗原的能力。
本文中采用的“单价”是指具有单一结合部位并因此仅结合靶抗原一次的抗体或抗体片段。
如本文中所用，“多价”是指具有能够以相同、同一的特异性结合两个或更多个表位(例如病毒颗粒表面上的重复的相同单元)的至少两个结合部位的抗体或其片段。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)中采用的抗体或抗体片段是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)中采用的抗体或抗体片段是单价的，并且第二融合蛋白(B-X)中采用的抗体或抗体片段是单价的。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)中采用的抗体或抗体片段是单价的，并且第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)中采用的抗体或抗体片段是多价的，并且第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是单价的。
在一个实施方案中，第一融合蛋白(A-X)中采用的抗体或抗体片段是多价的，并且第二融合蛋白(B-Y)中采用的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，A-X或B-Y不是包含两个scFv(一个对抗原CD33特异，并且一个对抗原CD3特异)的融合蛋白，或者可选择地对这两种抗原特异的双特异性复合物形式。
在一个实施方案中，A-X或B-Y不是包含与肽E5B9连接的对CD3特异的scFv(或可选地另一种抗体形式)的融合蛋白。
本文中采用的“结合结构域或部位”是与抗原/表位接触并参与与其的结合相互作用的抗体的部分。在一个实施方案中，结合结构域含有至少一个可变结构域或其衍生物，例如一对可变结构域或其衍生物，诸如可变结构域或其衍生物的同源对。
在一个实施方案中，可变结构域包含3个CDR，特别是抗体结构域，诸如VH、VL或sdAb。在一个实施方案中，结合结构域包含两个可变结构域和6个CDR和框架，并且这些元件一起促成了抗体或结合片段与抗原/表位的结合相互作用的特异性。
本文中采用的“同源对”是指作为预先形成的偶对从宿主分离的重链和轻链对。该定义不包括从文库中分离的可变结构域，其中来自宿主的原始配对不被保留。同源对可能是有利的，因为它们在宿主中通常是亲和力成熟的，因此可对它们特异性的抗原具有高亲和力。
本文中采用的“天然存在的结构域的衍生物”旨在指天然存在的序列中的1个、2个、3个、4个、5个或多于5个氨基酸已被替换或删除，例如以优化结构域的性质，诸如通过消除不需要的属性，但其中结构域的一个或多个特性特征得以保留。修饰的实例是去除糖基化位点或暴露于溶剂的赖氨酸。这些修饰可通过用保守氨基酸取代替换相关的氨基酸残基来实现。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物或其抗体/片段组分被加工来提供针对靶抗原的改善的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟方案获得，所述方案包括突变CDRs(Yang等，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等，Bio/Technology,10,779-783,1992)、大肠杆菌(E.coli)突变株的使用(Low等，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等(同上)论述了这些亲和力成熟的方法。
在一个实施方案中，第一抗体或抗体片段(A)对第一抗原是特异的，第二抗体或抗体片段(B)对第二抗原是特异的，其中第一和第二抗原是不同的。有利地，双特异性抗体复合物对两种不同抗原可以是特异的。这表明抗体复合物与两种不同抗原结合的可能性，每种抗原位于不同的实体上，由此使两个实体彼此紧密地物理接近。
或者，第一抗体或抗体片段(A)对第一表位可以是特异的，并且第二抗体或抗体片段(B)对第二表位可以是特异的，其中第一和第二表位都在同一抗原上。由于抗原与双特异性抗体复合物之间的多重相互作用，这可极大地增强双特异性抗体复合物对抗原的亲合力。
在一个实施方案中，第一(A)或第二(B)抗体片段选自：片段抗原结合(Fab)、Fab'、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)诸如VHH。
为方便起见，本公开的双特异性蛋白质复合物在本文中被称为A-X:Y-B。然而，该命名法并非旨在限制如何设计融合蛋白A-X和B-Y，因为我们的实验表明结合伙伴X和Y可以颠倒，即A-Y和B-X，而不会不利地影响该方法。因此A和B以及X和Y是被提及用于帮助解释本技术的名义标签。
本文中采用的“附接的”是指直接或间接(例如通过接头，诸如其实例在下文中论述的肽接头)连接或联接的。直接连接包括融合在一起(例如肽键)或化学偶联。
本文中采用的“结合伙伴”是指结合对的一个组成部分。
在一个实施方案中，结合伙伴的亲和力高，为5nM或更强，诸如900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM或更强。
本文中采用的“结合对”是指彼此特异性结合的两个结合伙伴。结合对的实例包括肽和特异于其的抗体或其结合片段，或酶和配体，或酶和该酶的抑制剂。
在一个实施方案中，X通过接头(诸如ASGGGG SEQ ID NO:71或ASGGGGSG SEQ IDNO:72或ASGGG SEQ ID NO:73或AAASGGG SEQ ID NO:74)或本领域已知的或本文下文中描述的任何其它合适的接头附接于抗体或片段(蛋白质A)的重链的C端，并且Y通过接头(诸如ASGGGG SEQ ID NO:71或ASGGGGSG SEQ ID NO:72或ASGGG SEQ ID NO:73或AAASGGG SEQID NO:74)附接于抗体或片段(蛋白B)的重链的C端。
合适的结合对(X或Y)的实例可包括GCN4(SEQ ID NO:1或缺少SEQ ID NO:1的HIS标签氨基酸1-38)、其变体，衍生物或片段(例如SEQ ID NO:75-97所示的序列中的任一个)和52SR4(SEQ ID NO:3或缺少SEQ ID NO:3的HIS标签氨基酸1至243)或其变体，所述52SR4或其变体为对GCN4特异的scFv。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(名义上为X)是GCN4(例如如SEQ ID NO:1中所示的)或其片段或衍生物或变体(例如没有His标签或如由SEQ ID NO:75-97所示序列中的任一个中所示的)，并且第二结合伙伴(名义上为Y)是对GCN4特异的scFv或sdAb(例如如SEQID NO:3、98或99所示的)或其变体或衍生物或片段。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(名义上为X)是对GCN4特异的sFv或sdA(诸如如SEQ ID NO:3所示的)或其变体或衍生物或片段，并且第二结合伙伴(名义上为Y)是GCN4(例如如SEQ ID NO:1所示的)或其片段或变体或衍生物(诸如由SEQ ID NO:75-97所示序列中的任一个)。
GCN4变体包括与SEQ ID NO:1具有至少80％,85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％或98％或99％同一性的氨基酸序列。GCN4变体还包括与由核苷酸序列SEQID NO:2编码的序列或由在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
GCN4片段包括比SEQ ID NO:1的氨基酸序列短的GCN4的氨基酸序列。
GCN4衍生物是指在N端或C端比SEQ ID NO:1的氨基酸序列更长的GCN4的氨基酸序列。
对GCN4特异的合适的scFv是52SR4(SEQ ID NO:3)或其变体(SEQ ID NO:98或99)。52SR4的变体包括与SEQ ID NO:3具有至少80％，或85％，或90％，或95％，或98％或99％同一性的氨基酸序列。52SR4变体还包括与由核苷酸序列SEQ ID NO:4编码的序列或由在严格条件下与SEQ ID NO:4杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％，或85％，或90％，或95％，或98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明人已经发现，单链抗体52SR4和肽GCN4是适用于本公开的双特异性蛋白质复合物的结合对。
或者，可将任何合适的抗体/片段和抗原(诸如肽)用作X和Y。当A-X和Y-B以1:1的摩尔比组合时，优选地，这样的X和Y对产生大于75％的异二聚体。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(X)和第二结合伙伴(Y)是蛋白质。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(X)是酶或其活性片段，并且第二结合伙伴(Y)是配体，或反之亦然。
在一个实施方案中，第一结合伙伴(X)是酶或其活性片段，并且第二结合伙伴(Y)是该酶的抑制剂，或反之亦然。
本文中采用的“活性片段”是指氨基酸片段，其小于该实体的全部氨基酸序列，并且保留基本上相同的生物活性或相关生物活性，诸如大于50％的活性，诸如60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。
在另一个实施方案中，第一结合伙伴X为谷胱甘肽(GSH)，并且第二结合伙伴Y为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X为Fos并且Y为Jun，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X为His并且Y为抗His，或反之亦然。
在另一个实施方案中，结合对是钙调蛋白结合肽，并且Y为钙调蛋白，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X为麦芽糖结合蛋白，并且Y为抗麦芽糖结合蛋白或其片段，或反之亦然。
其它酶-配体组合也被设想用于结合伙伴。在本领域中已知用于蛋白质纯化的亲和标签也是合适的，因为它们倾向于以高亲和力与其各自的结合伙伴结合。
如本文中所用，“同一性”表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文中所用，“相似性”表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间具有相似类型。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。可以经常彼此取代的其它氨基酸包括但不限于:
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可以容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.，编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.，编辑，Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.，编辑，HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.，编辑，MStockton Press,New York,1991，可获自NCBI的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等，1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等，1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等，1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656,)。
在一个实施方案中，第一或第二结合伙伴(X或Y)是蛋白质或肽。
在一个实施方案中，第一和第二融合蛋白包含一个或多个肽接头。可将接头在不同位置掺入融合蛋白中。例如，可在结合伙伴与附接于其的蛋白质之间引入接头。
在一个实施方案中，接头是肽接头。
如本文中所用，术语“肽接头”是指具有氨基酸序列的肽。本领域技术人员将知道一系列合适的肽接头。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物的结合伙伴通过肽接头连接至它们各自的蛋白质。肽接头的实例显示于SEQ ID NO:5至74(表2、3和4)中。
在一个实施方案中，融合蛋白是翻译的融合体，即在包含从其表达融合蛋白的基因构建体的宿主细胞中表达的融合蛋白。
在一个实施方案中，通过将A的重链与X和/或B的重链与Y融合(任选地经由肽接头)来制备融合蛋白。
在一个实施方案中，肽接头长度为50个氨基酸或更少，诸如20个氨基酸或更少。
一般来说，重组表达融合蛋白会更高效，因此可由宿主细胞表达的直接肽键或肽接头可能是有利的。
在一个实施方案中，接头选自序列5至72或PPP中所示的序列。
表2
SEQ ID NO: 序列
5 DKTHTCAA
6 DKTHTCPPCPA
7 DKTHTCPPCPATCPPCPA
8 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
9 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
10 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
11 DKTHTCCVECPPCPA
12 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
13 DKTHTCPSCPA
表3
(S)在序列17至20中是任选的。另一接头可以是肽序列GS。
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:69)、PPPP(SEQ ID NO:70)和PPP。
其它接头示于表4中。
表4
在一个方面，提供了产生本公开的双特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤:
(a)产生第一融合蛋白(A-X)，其包含附接至结合对的第一结合伙伴(X)的第一蛋白质(A)；
(b)产生第二融合蛋白(B-Y)，其包含附接至结合对的第二结合伙伴(Y)的第二蛋白质(B)；和
(c)将步骤a)和b)中制备的第一(A-X)和第二融合蛋白(B-Y)混合在一起。
通常步骤(c)中A-X和B-Y的混合摩尔比为1:1。
在一个实施方案中，通过在表达实验中在宿主细胞中表达来产生本公开的复合物中采用的每种融合蛋白。
在一个方面，提供了制备本公开的双特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤:
(a)表达第一融合蛋白(如本文中定义的A-X)，其包含附接于结合对的第一结合伙伴(X)的第一蛋白质(A)；
(b)表达第二融合蛋白(如本文中定义的B-Y)，其包含附接至结合对的第二结合伙伴(Y)的第二蛋白质(B)；
其中融合蛋白A-X和B-Y由相同的宿主细胞或不同的宿主细胞表达。
本文中采用的不同宿主细胞是指细胞个体，包括相同类型的细胞(甚至相同的克隆类型)。
在一个实施方案中，该表达是瞬时表达。当与产生双特异性复合物而无需纯化的能力相结合时，瞬时表达的使用是非常有利的。这将得到一种产生双特异性蛋白质复合物的快速方法，因为瞬时转染比稳定转染简单得多并且资源密集程度更低。
在一个实施方案中，所述表达是稳定表达，即其中编码所述融合蛋白的DNA被稳定地整合到宿主细胞基因组中。
在一个实施方案中，作为功能测定的一部分将在相同或不同多核苷酸序列上的编码A-X(如本文所定义的)的多核苷酸和编码B-Y(如本文所定义的)的多核苷酸转染入细胞中，其中所述蛋白在细胞中表达和/或从其释放。特别地，将多核苷酸在相同或不同的质粒上瞬时转染。
通常在X和Y可以相互作用的条件下进行A-X和B-Y的混合。在一个实施方案中，在细胞培养条件下将融合蛋白在细胞培养基中孵育，例如将融合蛋白在37℃/5％CO2环境中孵育90分钟。
在一个实施方案中，将本公开的融合蛋白在含水环境中混合，例如可将一种融合蛋白结合至固体表面诸如珠粒或板上，并且可将另一种融合蛋白以水溶液/混悬剂形式引入其中。固相使得过量的组分和试剂被容易地洗掉。在一个实施方案中，不将两种融合物附接于固相，而是简单地将其在液体/溶液/介质中混合。因此，在一个实施方案中，将A-X和B-Y作为游离蛋白质在水性介质中混合。
有利地，本公开的方法可用于制备在异源对之间(即第一融合蛋白[A-X]与第二融合蛋白[B-Y]之间)形成的复合物，其中同源对之间(即两个第一融合蛋白[A-X]或两个第二融合蛋白[B]之间)的相互作用被最小化。因此，本方法允许制备大量的双特异性蛋白质复合物，其中同二聚复合物的污染最小或者无污染。本公开的构建体和方法的一个有利方面是A-X对B-Y的比例受A-X和B-Y的性质控制，特别是可以达到1:1的摩尔比。这种控制要素是对某些现有技术方法的重大改进。
在一个实施方案中，本公开的方法包括另一步骤：将鉴定为具有协同活性的一对可变区(特别是两对可变区)转化成可选的双特异性、三特异性或多特异性形式，如果需要，任选地预先人源化所述可变区，这是一种替代治疗形式和/或具有延长的半衰期的形式，适于在具有更长持续时间(诸如运行一周或更长时间)的测定中进行测试。
如本文中所用，“多特异性”是指具有至少两个不同结合部位的抗体或其片段，每个结合部位能够以不同的特异性结合表位，例如能够交联两种不同的抗原。多特异性形式包括本领域已知的那些多特异性形式和本文描述的那些多特异性形式，诸如例如WO2009/040562和WO2010/035012中公开的DVD-Ig、FabFv、双抗体、三抗体、四抗体等。
双特异性和多特异性形式(包括治疗形式)的其它实例包括双抗体、三抗体、四抗体、串联scFv、串联scFv-Fc、FabFv、Fab'Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab'-scFv、diFab、diFab'、scdiabody、scdiabody-Fc、ScFv-Fc-scFv、scdiabody-CH3、IgG-scFv、scFv-IgG、V-IgG、IgG-V、DVD-Ig和DuoBody。
本文中采用的双抗体是指两个Fv对：具有两个Fv间接头的VH/VL和另一VH/VL对，使得第一Fv的VH连接至第二Fv的VL，而第一Fv的VL连接至第二Fv的VH。
本文中采用的三抗体是指与双抗体类似地包含三个Fv对和三个Fv间接头的形式。
本文中采用的四抗体是指与双抗体类似地包含四个Fv对和四个Fv间接头的形式。
本文中采用的串联scFv是指通过单接头彼此连接(使得存在单个Fv间接头)的两个scFv(各自包含接头是常用方式)。
本文中采用的串联scFv-Fc是指两个串联scFv，其中每个串联scFv例如通过恒定区片段-CH2CH3的铰链附接至CH2结构域的N端。
本文中采用的FabFv是指具有附接至以下每一个的C端的可变区的Fab片段：重链的CH1和轻链的CL。该形式可以作为其PEG化形式提供。
本文中采用的Fab'Fv类似于FabFv，其中Fab部分被Fab'替换。该形式可以作为其PEG化形式提供。
本文中采用的FabdsFv是指其中Fv内二硫键使所附接的C端可变区稳定化的FabFv。该形式可以作为其PEG化形式提供。
本文中采用的Fab-scFv是在轻链或重链的C端附接有scFv的Fab分子。
本文中采用的Fab'-scFv是在轻链或重链的C端附接有scFv的Fab'分子。
本文中采用的DiFab是指经由其重链的C端连接的两个Fab分子。
本文中采用的DiFab’是指通过其铰链区中的一个或多个二硫键连接的两个Fab'分子。
如本文中所采用的，scdiabodY为包含Fv内接头的双抗体，使得该分子包含三个接头，并且形成其VH和VL端各自连接至另一个Fv对的可变区之一的正常scFv。
本文中采用的scdiabody-Fc是两个scdiabodies，其中每个scdiabodies例如通过恒定区片段-CH2CH3的铰链附接至CH2结构域的N端。
本文中采用的ScFv-Fc-scFv是指四个scFv，其中每个scFv附接至-CH2CH3片段的重链和轻链二者的N端和C端。
本文中采用的Scdiabody-CH3是指两个scdiabody分子，每个分子例如通过铰链连接至CH3结构域。
本文中采用的IgG-scFv是在每条重链或每条轻链的C端上具有scFv的全长抗体。
本文中采用的scFv-IgG是在每条重链或每条轻链的N端上具有scFv的全长抗体。
本文中采用的V-IgG是在每条重链或每条轻链的N端上具有可变结构域的全长抗体。
本文中采用的IgG-V是在每条重链或每条轻链的C端上具有可变结构域的全长抗体。
DVD-Ig(也称为双重V结构域IgG)是具有4个额外可变结构域的全长抗体，在每条重链和每条轻链的N端上各有一个。
本文中采用的Duobody或“Fab臂-交换”是一种双特异性IgG抗体形式，其中两种不同单克隆抗体的恒定结构域(通常为CH3)中的匹配和互补的工程化氨基酸变化在混合时导致异二聚体形成。作为残基工程化的结果，来自第一抗体的重/轻链对将优先与第二抗体的重:轻链对缔合。
本公开的双特异性抗体复合物或抗体分子的恒定区结构域(如果存在的话)可以根据所提出的复合物或抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子打算用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型的IgG恒定区结构域。或者，当抗体分子旨在用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。应该理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用如Angal等，1993,Molecular Immunology,1993,30:105-108中所述的其中位置241处的丝氨酸已被改变成脯氨酸的IgG4分子。因此，在其中抗体是IgG4抗体的实施方案中，抗体可包含突变S241P。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化的变化。一种常见修饰是由于羧肽酶的作用(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所述)而丧失羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)。因此，抗体重链的C末端赖氨酸可能不存在。
本公开还提供了包含一种或多种如上所述的双特异性蛋白质复合物的组合物，其中所述组合物主要包含根据本公开的异二聚性双特异性复合物，例如具有最少的同二聚体复合物的污染或无同二聚体复合物的污染。
在一个实施方案中，组合物中融合蛋白的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％呈双特异性蛋白复合物形式。
在一个实施方案中，组合物中至少60％的融合蛋白呈双特异性蛋白复合物形式。
在一个实施方案中，形成的复合物不需要进一步的纯化步骤，因此组合物包含未纯化的双特异性复合物。
在一个实施方案中，形成的复合物需要一个纯化步骤，诸如柱层析。
在一个实施方案中，该方法在例如在表达根据本公开的融合蛋白之后且在混合融合蛋白之前还包括至少一个纯化步骤。
在一个方面，本公开涉及融合蛋白、异二聚性系连的双特异性蛋白复合物、包含融合蛋白或所述双特异性蛋白质复合物的组合物，如本文所定义的多重阵列文库。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物处于溶液或混悬剂中。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物被固定在固相基质表面上。
在一个实施例中，多重复合物呈阵列的形式，例如在微量板诸如96或384孔板中。此类阵列可在筛选测定中容易地实施以鉴定具有所需功能的双特异性蛋白质复合物。
在另一个实施方案中，将双特异性蛋白质复合物缀合至珠粒。
如上定义的融合蛋白是根据本公开的双特异性蛋白质复合物的组分。在一个方面，本公开涉及本文所述的融合蛋白。
在另一方面，提供了包含如上定义的两种或更多种融合蛋白的文库。
如本文中所用，术语“文库”是指本公开的两种或更多种双特异性抗体复合物或可被组合以形成至少两种不同的根据本公开的双特异性抗体复合物的多种融合蛋白。如整个说明书中所描述的，术语“文库”以其最广泛的含义使用，并且还可涵盖子文库。
有利地，文库可包含一系列不同的融合蛋白，所述融合蛋白具有附接于其的特定结合对的第一结合伙伴(X)或第二结合伙伴(Y)。在一个实施方案中，文库的一部分包含各自连接至结合伙伴X的蛋白质/抗体/片段，并且文库的其余部分包含各自连接至结合伙伴Y的相同蛋白质/抗体/片段。这因此允许任何两种融合蛋白质容易地组合以形成本公开的双特异性蛋白质复合物，只要一种融合蛋白具有附接的结合对的第一结合伙伴，并且另一融合蛋白具有附接的结合对的第二结合伙伴。
在一个实施方案中，本发明的双特异性蛋白质复合物适用于治疗应用并且可提供治疗疾病的新型疗法。因此，在另一方面，提供了用于疗法的如上所述的双特异性蛋白质复合物。双特异性蛋白质复合物适用于治疗一系列疾病，诸如自身免疫性疾病和癌症。
相反，本公开的双特异性蛋白质复合物可用对T淋巴细胞特异的一种抗体或抗体片段和对癌症特异性抗原特异的另一种抗体或抗体片段进行工程化。结果，与普通单克隆抗体相比，本公开的双特异性抗体复合物可有利地具有更高的细胞毒性潜力。
本公开的双特异性蛋白质复合物还特别适用于抑制B细胞功能，以控制各种自身免疫性疾病中的免疫和自身免疫反应。
因此，本公开扩展至治疗患者疾病的方法，包括施用本公开的双特异性蛋白质复合物。
在一个方面，提供了包含本公开的一种或多种双特异性蛋白质复合物的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了从本公开的方法从本公开的方法获得或能够获得的融合蛋白。
在一个实施方案中，提供了从本公开的方法获得或能够获得的双特异性抗体复合物。
在一个实施方案中，提供了包含通过根据本公开的方法鉴定的可变区组合的双特异性或多特异性抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含从本公开的方法获得的融合蛋白、双特异性抗体复合物或双特异性/多特异性抗体分子的组合物，诸如药物组合物。
组合物中可包含各种不同的组分，包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。组合物可以任选地包含能够改变本发明的抗体群体的特征的其它分子，从而例如减弱、稳定、延缓、调节和/或激活抗体的功能。组合物可呈固体或液体形式，并且尤其可呈粉末、片剂、溶液或气雾剂的形式。
本公开还提供了药物或诊断组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的双特异性蛋白质复合物。因此，提供了本发明的双特异性蛋白质复合物用于治疗病理状况或病症的用途或用于制造用于治疗病理状况或病症的药剂的用途。
所述病理状况或病症可以例如选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫感染)、与感染相关的内毒素休克、关节炎诸如类风湿性关节炎、哮喘诸如严重哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、脉管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、中枢和外周神经系统的免疫介导的炎性病症诸如多发性硬化症、狼疮(诸如系统性红斑狼疮)和Guillain-Barr综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、肉瘤样病、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、其它自身免疫性疾病、胰腺炎、外伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病包括局部缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和癌症，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、肾癌，特别是肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌和甲状腺癌及其转移形式。
本公开还提供了药物或诊断组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的双特异性蛋白质复合物。因此，提供了本发明的双特异性蛋白质复合物用于治疗和制造药剂的用途。
通常将组合物作为通常包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，其包括将本发明的抗体分子或双特异性抗体复合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加并混合。
如本文中所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指用于增强本公开组合物的所需特征的药学上可接受的配制载体、溶液或添加剂。赋形剂在本领域中是公知的，包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、脲、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。可将溶液或混悬剂包封在脂质体或可生物降解的微球体中。通常使用无菌制造工艺以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的被缓冲溶剂溶液来进行生产和灭菌，在无菌的被缓冲溶剂溶液中无菌悬浮抗体，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
药学上可接受的载体本身不应诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生，并且应该不具有毒性。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体诸如水、盐水、甘油和乙醇。此类载体使药物组合物能够被配制成用于由患者摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂和混悬剂。
可将本发明的双特异性蛋白质复合物分散在溶剂中，例如以溶液或混悬剂的形式进行递送。其可悬浮在合适的生理溶液例如生理盐水、药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mgNaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH值。如上所述，混悬剂可以例如由冻干抗体制成。
药学上可接受的载体的详细论述可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。
双特异性抗体复合物(或本公开的双特异性/多特异性抗体分子)可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可伴随有其它活性成分，包括其它抗体成分，例如抗-TNF、抗IL-1β、抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体，或者非抗体成分如黄嘌呤。其它合适的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体，诸如抗-CD3或抗-CD4抗体。
在另一个实施方案中，将根据本公开的抗体、片段或组合物与另外的药学活性剂例如皮质类固醇(诸如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(诸如沙丁胺醇、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖抑制剂(诸如雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤)或可选地CD28和/或CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂是对靶标特异的抗体。
药物组合物合适地包含治疗有效量的本发明的双特异性抗体复合物(或本公开的双特异性/多特异性抗体分子)。
如本文中所用，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防被靶向的疾病或病症或者表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可以在细胞培养测定或动物模型中(通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)估计治疗有效量。动物模型也可用于确定适当的浓度范围和施用途径。然后可将这些信息用于确定用于人中施用的有用剂量和途径。
用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对疗法的反应敏感性和耐受性/反应。这个数量可通过常规实验来确定，并且在临床医师的判断之内。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。或者，剂量可以是每天1至500mg，诸如每天10至100mg、200mg、300mg或400mg。药物组合物可以方便地以含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
可将组合物单独地施用于患者，或者可将其与其它药剂、药物或激素组合(诸如同时、顺序地或分开地)施用。
施用本发明抗体分子的剂量取决于待治疗病症的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子被预防性使用还是治疗已有病症。
剂量频率取决于抗体分子的半衰期和其作用持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2-10小时)，则可能需要每天给予一剂或多剂。或者，如果抗体分子具有较长的半衰期(例如2至15天)，则可能仅需每天给予一次剂量，每周给予一次剂量或甚至每1或2个月给予一次剂量。
在本公开中，最终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值不相似，因为如果制剂的pH为7，则8-9或以上的pI可以是合适的。不希望受理论束缚，推测这可以最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，诸如抗体或片段保留在溶液中。
本发明的药物组合物可通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(诸如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器也可用于施用本发明的药物组合物。
组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送至组织的间质间隙来实现。还可将组合物施用至特定的目标组织中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
当产品用于注射或输注时，其可采取油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳液的形式，并且其可含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，双特异性蛋白质复合物(或本公开的双特异性/多特异性抗体分子)可呈干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重建。如果组合物要通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有防止抗体降解、但一旦其从胃肠道被吸收就释放双特异性蛋白质复合物的试剂。
可将根据本公开的可雾化制剂例如作为在箔封套中包装的单剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积(例如2ml的溶剂/溶液缓冲液)中的单位剂量。
如本文中所用，术语“变体”是指与对应的野生型肽或蛋白质的氨基酸或核苷酸序列相比包含至少一个氨基酸序列或核苷酸序列改变的肽或蛋白质。变体可包含与相应的野生型肽或蛋白质至少80％，或85％，或90％，或95％，或98％或99％的序列同一性。然而，变体可能包含小于80％的序列同一性，条件是变体表现出与其相应的野生型肽或蛋白质基本相似的功能。
抗原包括细胞表面受体诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素或酶或离子通道、表位、片段及其翻译后修饰的形式。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物包含一种或两种细胞表面受体特异性。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物包含一种或两种细胞因子或趋化因子特异性。
可将通过根据本公开的方法鉴定的针对一对靶标的抗体或片段可以掺入适合用作实验室试剂、分析试剂或治疗剂的任何形式中。
因此，在一个方面，本公开扩展至以任何形式成对使用抗体片段或其组合，其实例在上文中给出。
本公开还扩展至组合物，诸如药物组合物，其中具有特定抗原特异性的所述新颖形式。
在另一方面，本公开包括所述形式和组合物在治疗中的用途。
在一个实施方案中，本公开的双特异性蛋白质复合物可用于功能性改变一种或多种目标抗原的活性。例如，双特异性蛋白质复合物可以直接或间接中和、拮抗或激动所述一种或多种抗原的活性。
本公开还扩展至试剂盒，例如包含:
a)一种或多种融合蛋白(如本文中定义的A-X)，其包含附接于结
合对的第一结合伙伴(X)的第一抗体或抗体片段(A)；和
b)一种或多种融合蛋白(如本文定义的B-Y)，其包含附接于结合对的第二结合伙伴(Y)的第二抗体或抗体片段(B)，其中后者对第一结合伙伴是特异的；
例如其中第一结合伙伴(X)是肽或多肽，并且第二结合(Y)伙伴是对其特异的抗体或抗体片段；
其中Y(第二结合伙伴)对第一结合伙伴X是特异的，并且第二结合伙伴是例如对其特异的抗体或抗体片段；并且两个结合伙伴的特异性相互作用(诸如结合相互作用)形成异二聚性系链，其将来自a)和b)的两个融合蛋白物理地拉在一起形成双特异性蛋白质复合物；以及
其中所述融合蛋白呈复合或非复合形式。
有利地，试剂盒可包含本公开的双特异性蛋白质复合物，或者可包含呈复合或非复合形式的融合蛋白。在前一种情况下，双特异性蛋白质复合物可以“开箱”即用，这提供了方便和易用性，而在后一种情况下，双特异性蛋白质复合物可以根据用户的需要通过组合不同的融合蛋白来进行组装。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含用于进行一种或多种功能测定的一种或多种试剂。
在一个实施方案中，如本文所述的融合蛋白、双特异性蛋白复合物、多重复合物、网格、文库、组合物等用作实验室试剂。
在另一方面，提供了编码如上所定义的融合蛋白和/或双特异性蛋白质复合物的核苷酸序列，例如DNA序列。
在一个实施方案中，提供了编码根据本公开的双特异性蛋白质复合物的核苷酸序列，例如DNA序列。
在一个实施方案中，提供了编码根据本公开的双特异性或多特异性抗体分子的核苷酸序列，例如DNA序列。
本文的公开内容还扩展至包含如上定义的核苷酸序列的载体。
如本文中所用，术语“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一个实例是“质粒”，其是可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(诸如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加体型哺乳动物载体)可被整合至宿主细胞的基因组中，其中它们随后与宿主基因组一起复制。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术人员来说是公知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York以及Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。
如本文中所用，术语“选择标记”是指其表达允许人们鉴定已被用含有标记基因的载体转化或转染的细胞的蛋白质。本领域已知多种选择标记。例如，通常选择标记基因赋予载体已被导入其中的宿主细胞对药物(诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择标记也可以是视觉上可鉴定的标记，例如，诸如荧光标记。荧光标记的实例包括罗丹明、FITC、TRITC、Alexa Fluors及其各种缀合物。
还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述克隆或表达载体包含一种或多种编码本公开的抗体的DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本公开的抗体分子的DNA序列。可使用细菌，例如大肠杆菌和其它微生物系统，或者也可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本公开还提供了用于产生根据本公开的融合蛋白的方法，其包括在适合于导致蛋白质从编码本公开的分子的DNA表达的条件下培养包含本公开的载体的宿主细胞，并分离该分子。
本公开的双特异性蛋白质复合物可用于诊断/检测试剂盒，其中使用具有抗原特异性的特定组合的双特异性蛋白质复合物。例如，试剂盒可包含对两种抗原特异的双特异性抗体复合物，所述两种抗原均存在于相同的细胞类型中，并且其中只有在两种抗原都被成功检测到的情况下才能产生阳性诊断。通过使用本公开的双特异性抗体复合物而非呈非复合形式的两种单独的抗体或抗体片段，可以大大提高检测的特异性。
在一个实施方案中，将双特异性抗体复合物固定在固体表面上。固体表面可以例如是芯片或ELISA板。
还提供了本公开的双特异性蛋白质复合物用于在样品中检测第一和第二肽的存在的用途，其中双特异性复合物用作检测剂。
可将本公开的双特异性抗体复合物例如缀合至促进结合的抗体-抗原复合物的检测的荧光标记。此类双特异性抗体复合物可用于免疫荧光显微术。或者，双特异性抗体复合物也可用于蛋白质印迹或ELISA。
在一个实施方案中，提供了纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的融合蛋白或双特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，使得杂质保留在柱上，并且抗体保持在未结合的级分中。该步骤可以例如在约6-8的pH下进行。
该方法还可包括采用阳离子交换层析(例如在约4至5的pH下进行)的初始捕获步骤。
该方法还可包括额外的层析步骤以确保从产物流中适当地分离产物和工艺相关的杂质。
纯化过程还可包括一个或多个超滤步骤，诸如浓缩和透滤步骤。
如上所使用的“纯化形式”旨在表示至少90％的纯度，诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％w/w或更高的纯度。
在本说明书的上下文中，“包含”将被解释为“包括”。
包含某些要素的本公开的各个方面也旨在扩展至“由相关要素组成”或“基本上由相关要素组成”的替代实施方案。
本文使用的正面实施方案可以用作排除本公开的某些方面的基础。
涉及双特异性复合物的方法中的公开内容同样适用于复合物本身，反之亦然。
本文中引用的所有参考文献通过引用明确地并入。
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinityantibodies in vitro from immune libraries.Hanes J,Jermutus L,Weber-BornhauserS,Bosshard HR,Plückthun A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of aPeptide-binding Single Chain Antibody Fragment(scFv)withLow PicomolarAffinity.Zhand C,Spinelli S,Luginbuhl B,Amstutz P,Cambillau C,Pluckthun A.(2004)J.Biol.Chem.279,18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection.Berger C,Weber-Bornhauser S,Eggenberger Y,Hanes J,Pluckthun A,Bosshard H.R.(1999)F.E.B.S.Letters 450,149-153
参考
实施例
实施例1：利用以不同形式组合的从不同方法获得的V区评估异二聚体系连的蛋白质复合物与双特异性抗体靶标
引言:
为了筛选大量的双特异性组合，V区可从不同方法获得，并因此以不同的A-X:Y-B形式通过异二聚性系链连接。例如，通过B细胞培养和单细胞分离衍生的V区可呈Fab-X或Fab-Y形式，以产生Fab-X:Fab-Y双特异性。通过噬菌体展示衍生的V区可呈scFv-X或scFv-Y形式以产生scFv-X:scFv-Y双特异性。双特异性也可通过组合不同来源的V区和形式(即Fab-X:scFv:Y或scFv:X:Fab-Y)来产生。Fab-X、Fab-Y、scFv-X或scFv-Y可被纯化或用作定量的瞬时上清液。在本实施例中，将通过B细胞培养和单细胞分离获得的V区彼此(Fab-X:Fab-Y)组合以及与源自噬菌体展示的V区(Fab-X:scFv-Y)组合。下文实施例中的X表示scFv52SR4(SEQ ID NO:3)，Y为GCN4肽(SEQ ID NO:1)。
方法:
免疫：通过基因合成或商业来源获得编码所选抗原的DNA并将其克隆入具有强组成型启动子的表达载体中。然后使用内部电穿孔系统将质粒DNA转染入Rab-9兔成纤维细胞(CRL-1414TM)中。24小时后，通过流式细胞术检查细胞的抗原表达，并将其在液氮中以等分试样冷冻直至使用。通过在相同细胞上共表达或制备单一或多重转染的细胞的混合物，使每只兔子免疫多达6种抗原。用3个剂量的细胞免疫兔。
通过B细胞培养和分离发现抗体：使用与Zubler等(1985)描述的方法类似的方法制备B细胞培养物。简言之，在37℃，5％CO2的环境中，将来自被免疫兔的脾或PBMC衍生的B细胞以约2000-5000个细胞/孔的密度在条形码化的96孔组织培养板中用补充有以下成分的200μl/孔RPMI 1640培养基(Gibco BRL)培养7天：10％FCS(PAAlaboratories ltd)、2％HEPES(Sigma Aldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(GibcoBRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、3％活化的脾细胞培养物上清液和γ-照射的突变型EL4鼠胸腺瘤细胞(5x 104/孔)。
B细胞培养物上清液中抗原特异性抗体的存在使用基于均相荧光的结合测定来确定，所述测定使用利用用于免疫兔的抗原共转染的HEK293细胞。筛选涉及使用MatrixPlatemate液体处理器将来自条形码化的96孔组织培养板的10ul上清液转移至含有用靶抗原转染的HEK293细胞(约3000个细胞/孔)的条形码化的384孔黑壁测定板中。用山羊抗-兔IgG Fcγ-特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在AppliedBiosystems 8200细胞检测系统上读板。
初次筛选后，使用Aviso Onyx hit-picking机器人将阳性上清液固定在96孔条形码化的主板上，并将细胞培养板中的B细胞在-80℃下冷冻。然后对针对用抗原单独转染的HEK293细胞在包被有重组蛋白(作为抗原来源)的SuperavidinTM珠粒(BangsLaboratories)上基于均相荧光的结合测定中筛选主板。这样做是为了确定每个孔的抗原特异性。
为了允许从选择的目标孔中回收抗体可变区基因，进行解析步骤以使得能够鉴定含有异质B细胞群的给定孔中的抗原特异性B细胞。这利用荧光焦点法(Clargo等，2014.Mabs 2014 Jan 1:6(1)143-159；EP1570267B1)来实现。简言之，将来自阳性孔的免疫球蛋白分泌性B细胞与用靶抗原转染的HEK293细胞或包被有生物素化的靶抗原的链霉抗生物素蛋白珠粒(New England Biolabs)和山羊抗-兔Fcγ片段-特异性FITC缀合物(Jackson)的1:1200最终稀释物混合。在37℃静置孵育1小时后，由于该B细胞周围存在荧光晕而可鉴定抗原特异性B细胞。然后利用Eppendorf显微操作器挑取使用Olympus显微镜鉴定的这些单个B细胞克隆中的一些，并将其保存在PCR管中。荧光焦点法也用于从直接来自免疫兔的骨髓的异质B细胞群中鉴定抗原特异性B细胞。
使用重链和轻链可变区特异性引物通过逆转录(RT)-PCR从单细胞回收抗体可变区基因。进行两轮PCR，其中巢式第二PCR在3'和5'端掺入限制性位点，允许将可变区克隆到小鼠Fab-X和Fab-Y(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。使用Fectin 293(LifeTechnologies)将Fab-X和Fab-Y表达载体的重和轻链构建体共转染至HEK-293中，或使用Expifectamine(Life Technologies)将所述构建体共转染至Expi293细胞中，并且在体积为5ml的6孔组织培养板中表达重组抗体。表达5-7天后，收集上清液。在针对用抗原转染的HEK293细胞和包被有重组蛋白或抗原转染的HEK细胞的SuperavidinTM珠粒(BangsLaboratories)上基于均相荧光的结合测定中测试上清液。这是为了确认克隆抗体的特异性。
小规模Fab A-X和Fab B-Y的生产
将Expi293细胞常规地在Expi293TM表达培养基中继代培养至终浓度为0.5x 106个活细胞/mL，并将其在轨道振荡培养箱(Multitron,Infors HT)中以120rpm 8％CO2和37℃进行孵育。
在转染当天，使用自动化细胞计数器(Vi-CELL,Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。对于每个50mL的转染，为了达到2.5x 106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞混悬剂添加至无菌250mL锥形摇瓶中，并通过添加新鲜的预热的Expi293TM表达培养基使其达到42.5mL的体积。
为了制备用于每个转染的脂质-DNA复合物，将总共50μg的重链和轻链质粒DNA在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至2.5mL的总体积，并将135μL的ExpiFectamineTM 293试剂(LifeTechnologies)在I培养基中稀释至2.5mL的总体积。轻轻混合所有稀释液并在室温下孵育不超过5分钟，然后将各DNA溶液添加至各自稀释的ExpiFectamineTM 293试剂中以获得5mL的总体积。将DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物轻轻混合并在室温下孵育20-30分钟以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将5mL DDNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物添加至每个摇瓶中。将摇瓶在轨道振荡培养箱(Multitron,Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
转染后约16-18小时，将250μL ExpiFectamineTM 293转染增强剂1(LifeTechnologies)和2.5mL ExpiFectamineTM 293转染增强剂2(LifeTechnologies)添加至每个摇瓶中。
转染后7天收集细胞培养物。将细胞转移至50mL离心管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，随后通过0.22um Stericup(Merck Millipore)进行无菌过滤。将澄清的和无菌过滤的上清液在4℃下储存。通过蛋白G-HPLC确定最终的表达水平。
小规模(50ml)纯化：使用基于小规模真空的纯化系统通过亲和捕获分开纯化Fab-X和Fab-Y两者。简言之，将50ml培养物上清液进行0.22μm无菌过滤，然后添加500μL NiSepharose珠(GE Healthcare)。然后将上清液珠粒混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空去除上清液。然后通过洗涤液1(50mM磷酸钠，1M NaCl，pH 6.2)和洗涤液2(0.5MNaCl)洗涤珠粒。用50mM乙酸钠，pH4.0+1M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中，并进行0.22μm过滤。通过A280扫描、SE-UPLC(BEH200方法)、SDS-PAGE(还原和非还原的)测定最终合并物，并使用PTS Endosafe系统测定内毒素。
通过噬菌体展示发现抗体：
使用内部大型新颖人scFv噬菌粒展示文库完成噬菌体选择。使用内部电穿孔系统在Rab-9兔成纤维细胞(CRL-1414TM)上表达抗原，或使用Fectin 293(LifeTechnologies)在HEK293细胞上瞬时表达抗原，或者展示为直接包被在Nunc maxisorbELISA板上的来自R&D系统(1968-SL,1430-CD)的重组Fc融合物。
为了进行细胞淘选，在含有3％BSA、0.5mM EDTA、0.1％叠氮化钠的PBS中封闭～1012个噬菌体、～1-10x107个抗原转染的细胞和～1-10x107个非抗原转染的细胞。然后将封闭的噬菌体颗粒与封闭的非抗原转染的细胞一起孵育至少30分钟，在冰上振荡。然后将未结合的噬菌体从非抗原转染的细胞中移除并与封闭的抗原转染的细胞一起孵育至少30分钟，在冰上振荡。然后将转染的细胞在含有0.5mM EDTA的冷PBS中洗涤四次以去除任何未结合的噬菌体。然后用100mM HCl洗脱已结合抗原转染的细胞的噬菌体并用1M Tris-HCl(pH7.4)中和。将细胞碎片重新悬浮于PBS中，并且将细胞碎片和经酸中和的洗脱液用于在37℃下感染指数生长的(OD600)大肠杆菌TG-1细胞(Lucigen)，进行1小时。然后将TG-1细胞涂布在含有抗生素选择性培养基的琼脂上并在30℃下生长过夜。
为了进行Nunc maxisorb ELISA平板淘选，将平板在5℃下于PBS中用5μg/mL的来自R&D系统(1968-SL,1430-CD)的重组Fc融合物包被过夜。第二天，将～1012个噬菌体在含有1.5％BSA和2.5％脱脂奶粉的PBS中封闭至少1小时。将ELISA板在3％BSA中封闭至少1小时。将封闭的噬菌体颗粒添加至洗涤过的封闭的ELISA板中，持续至少30分钟。然后通过在含有0.1％Tween 20的PBS中洗涤来去除未结合的噬菌体。然后使用100mM HCl洗脱结合于ELISA板的噬菌体并用1MTris-HCl(pH 7.4)中和。将酸中和的洗脱液在37℃下感染指数生长的(～0.5OD600)大肠杆菌TG-1细胞1小时。然后将TG-1细胞涂布在含有抗生素选择性培养基的琼脂上并在30℃下生长过夜。
对于只是细胞、只是蛋白质或这两种技术的组合的每个实验完成了三轮淘选。每轮之间通过以下方法拯救噬菌体颗粒。
将含有噬菌粒的TG1细胞(总共约5x 109个)用于接种2xTY(含有抗生素和0.1％葡萄糖)，并在37℃，250rpm下生长直至它们达到对数中期，OD600＝0.5-0.6，此时用M13KO7(Amersham-Pharmacia)干扰抗性辅助噬菌体(20倍的MOI)感染它们。将培养物涡旋并在37℃静置30分钟，然后在37℃下以50rpm缓慢摇动30分钟。然后通过以2,500x g下离心15分钟沉淀经辅助噬菌体感染的TG1细胞，除去上清液并将细胞重悬于2xTY(含有抗生素)中。将重悬的细胞在30℃下以250rpm振荡生长16小时，以允许噬菌体产生。
第二天早上，通过以2,500x g离心15分钟从培养物中分离细胞。将含噬菌体的上清液移入新鲜试管并重复离心。向纯化的上清液中加入1/5体积的20％PEG盐(2.5M NaCl,20％(w/v)PEG 8000)，混合并在冰上放置30分钟，以从上清液中沉淀出噬菌体。然后通过以2,500x g离心15分钟使沉淀的噬菌体沉淀，并且将噬菌体沉淀重新悬浮于PBS中以备下一轮淘选。
完成三轮淘选后，对从最后一轮淘选的输出噬菌体感染的集落中挑取的单个大肠杆菌菌落进行质粒纯化和连续1mL规模的噬菌体拯救。在可能的情况下，通过ELISA测试每个样品对重组Fc融合蛋白或不相关蛋白的结合。阳性'命中'被确定为抗原结合信号大于3倍负信号的任何样品。简言之，将所有ELISA板在4℃用PBS中的2μg/ml抗原包被过夜。在每个测定步骤之间进行洗涤，所述洗涤由在PBS(含有0.1％Tween20)中进行的四次洗涤组成。将所有平板在含有3％BSA的PBS中封闭，并且将所有样品在含有2.5％牛奶的PBS中封闭至少1小时，然后将筛选样品添加至ELISA平板中。然后将抗-M13HRP(GEHealthcare)以1:5,000稀释度添加至PBS(含有3％BSA)中，持续1小时。最后一次洗涤后，将TMB(Calbiochem)添加至所有孔中，在630和490nm处读取平板的OD，使用Biotek Synergy平板读数器记录ΔOD。选择来自不同淘选策略的命中，其中从噬菌粒载体亚克隆至哺乳动物表达载体以产生scFv-FC构建体。当没有重组蛋白用于筛选时，在没有事先筛选的情况下亚克隆scFv。使用Fectin 293(Life Technologies)将ScFv-FC构建体转染至HEK-293细胞中，或使用Expifectamine(Life Technologies)将所述构建体转染至Expi293细胞中，并在体积为5ml的6孔组织培养板中表达重组抗体。表达5-7天后，收集上清液。使用基于均相荧光的结合测定，利用用针对其淘选scFv的抗原共转染的HEK293细胞来确定HEK293培养物上清液中抗原特异性抗体的存在情况。筛选涉及将10μl上清液转移到含有用靶抗原转染的HEK293细胞(约3000个细胞/孔)的条形码化的384孔黑壁测定板中。用山羊抗-小鼠IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。这样做是为了确认克隆抗体的特异性。
为了在生物测定中测试scFv的功能活性，将它们再次亚克隆入scFv-Y哺乳动物表达载体(AAASGGG接头)以及Fab-X(ASGGGG接头)和Fab-Y(ASGGG接头)(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体。
用于scFv-Y形式的哺乳动物表达载体示于图7中。
筛选测定
使用设定为37℃的水浴将供体PBMC快速解冻，并小心转移至50ml Falcon管中。然后将它们在测定介质中逐滴稀释至5ml以使渗透压休克最小化。然后将细胞小心稀释至20ml，然后加入最终的培养基稀释液使体积为50ml。然后将细胞以500g离心5分钟，然后除去上清液并将细胞重悬于1ml培养基中。然后计数细胞并稀释至1.66x106个细胞/ml，然后每孔分配30μl至V型底TC板中，得到5.0x104个细胞/孔的最终测定浓度。然后将细胞板在37℃，5％CO2培养箱中覆盖储存，直到需要它们，使它们至少静置1小时。
将Fab-X和Fab-Y试剂以等摩尔比，以5x最终测定浓度在测定培养基中混合，并在37℃，5％CO2下孵育90分钟。在96孔U型底聚丙烯板中制备样品并在孵育期间覆盖其。
将10μl的5x Fab或scFv-X+Fab或scFv-Y混合物添加至含有细胞的适当测试孔中，并以1000rpm摇动混合30秒，然后在37℃，5％CO2下孵育90分钟。
然后用10μl抗-人IgM刺激细胞。刺激的最终测定浓度根据测定组读数变化而变化，以50μg/ml(混合物A和C)或25μg/ml(混合物B)的最终测定浓度刺激三种抗体混合物A、B和C(下文中详述的)。将测定平板以1000rpm轻轻混合30秒，然后在37℃，5％CO2下孵育5分钟(抗体混合物A和C)或2分钟(抗体混合物B)。通过向所有孔中加入150μl冰冷的BDCytoFix终止测定，并在室温下孵育15分钟。然后将固定的细胞以500g离心5分钟以沉淀细胞，并使用BioTekELx405洗板机除去上清液。通过以2400rpm涡旋平板30秒来将沉淀重新悬浮。然后通过加入100μl冰冷的BD细胞透化缓冲液III使细胞在4℃下透化30分钟。然后将细胞在100μl FACS缓冲液中洗涤并以500g离心5分钟。再次通过ELx405去除上清液，然后使用ELx405快速分配200μl FACS缓冲液以洗去任何残留的透化缓冲液。将细胞再次以500g离心并通过倒置除去上清液。在前面的旋转步骤中，在FACS缓冲液中制备抗体混合物并保持避光。然后通过涡旋(2400RPM，30秒)重悬细胞，然后将20μl抗体混合物添加到所有孔中，并将板以1000rpm振荡30秒。然后将细胞在室温下于黑暗中孵育60分钟。
然后将细胞在200μl FACS缓冲液中以500g旋转洗涤两次，并在每一步骤后移除上清液。最后，通过以2400rpm涡旋30秒来重悬细胞，然后加入最终的20μl FACS缓冲液。然后在Intellicyt HTFC/iQue仪上读取平板。
FACS缓冲液＝PBS+1％BSA+0.05％NaN3+2mM EDTA
抗体混合物＝1:5 CD20 PE(BD Biosciences)+1:5 PLCγ2 AF88+1:10 AktAF647(在FACS缓冲液中稀释的)。
试剂 供应商 目录号
抗人IgM Southern Biotech 2022-14
CytoFix BD Biosciences 554655
Perm缓冲剂III BD Biosciences 558050
抗Akt(pS473)AF647 BD Biosciences 561670
抗PLCγ2(pY759)AF488 BD Biosciences 561174
抗人CD20PE BD Biosciences 558021
磷酸盐缓冲盐溶液(PBS) Fisher Scientific 10562765
RPMI 1640 Life Technologies 31870
胎牛血清(FCS) Life Technologies 16140
Glutamax Life Technologies 35050
青霉素/链霉素(P/S) Life Technologies 15070
EDTA Sigma 03690
叠氮化钠(NaN3) Sigma S2002
牛血清白蛋白(BSA) Sigma A1470
使用商购可得的软件工具捕获和评估数据。
结果
图8和图9证明了当用抗-IgM活化时，在用由异二聚性系连的Fab-X+Fab-Y或Fab-X+scFv-Y构建体形成的CD79b/CD22和CD79b/CD45双特异性组合进行处理时，对人B细胞中PLCγ2和Akt的磷酸化的抑制。Fab-X和Fab-Y构建体是纯化的，而scFv-Y构建体是未经纯化的瞬时HEK上清液。
序列表
<110> UCB Biopharma sprl
<120> 抗体
<130> PF0049_WO01
<150> GB1521382.0
<151> 2015-12-03
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CN4(7P14P) 序列
<400> 1
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 2
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码DNA
<400> 2
gctagcggag gcggaagaat gaaacaactt gaacccaagg ttgaagaatt gcttccgaaa 60
aattatcact tggaaaatga ggttgccaga ttaaagaaat tagttggcga acgccatcac 120
catcaccatc ac 132
<210> 3
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 ds scFv 序列
<400> 3
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Glu Gln Lys Leu
245 250 255
Ile Ser Glu Glu Asp Leu
260
<210> 4
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码DNA
<400> 4
gatgcggtgg tgacccagga aagcgcgctg accagcagcc cgggcgaaac cgtgaccctg 60
acctgccgca gcagcaccgg cgcggtgacc accagcaact atgcgagctg ggtgcaggaa 120
aaaccggatc atctgtttac cggcctgatt ggcggcacca acaaccgcgc gccgggcgtg 180
ccggcgcgct ttagcggcag cctgattggc gataaagcgg cgctgaccat taccggcgcg 240
cagaccgaag atgaagcgat ttatttttgc gtgctgtggt atagcgacca ttgggtgttt 300
ggctgcggca ccaaactgac cgtgctgggt ggaggcggtg gctcaggcgg aggtggctca 360
ggcggtggcg ggtctggcgg cggcggcagc gatgtgcagc tgcagcagag cggcccgggc 420
ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt acctgcaccg tgagcggctt tctcctgacc 480
gattatggcg tgaactgggt gcgccagagc ccgggcaaat gcctggaatg gctgggcgtg 540
atttggggcg atggcattac cgattataac agcgcgctga aaagccgcct gagcgtgacc 600
aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg aaaatgaaca gcctgcagag cggcgatagc 660
gcgcgctatt attgcgtgac cggcctgttt gattattggg gccagggcac caccctgacc 720
gtgagcagcg cggccgccca tcaccatcac catcacgaac agaaactgat tagcgaagaa 780
gatctgtaat ag 792
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 14
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Ser
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 16
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 17
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 18
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 19
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 20
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 21
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<400> 22
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<400> 23
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser
20
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<400> 24
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<400> 25
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸
<400> 26
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 27
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 28
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 29
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 31
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 32
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 38
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 39
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 40
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 41
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 42
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 43
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 44
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 45
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 46
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 47
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 48
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 49
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 50
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 51
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 52
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 53
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 54
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 55
Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 56
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 57
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp
1 5 10 15
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 58
Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu
20
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val
20
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 60
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val Lys
20
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 61
Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 62
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 63
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 64
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 65
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 66
Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly
20
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 67
Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Ser Glu Gln
20
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 68
Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 69
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 70
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 71
Ala Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 72
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 73
Ala Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 74
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 75
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 75
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 76
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 77
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 78
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 78
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 79
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 79
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 80
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 81
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 82
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 83
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 83
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 84
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 84
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 85
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 85
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 86
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 86
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 87
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 87
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 88
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 88
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 89
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 89
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 90
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 90
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 91
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 91
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 92
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 92
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 93
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 93
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 94
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 94
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 95
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 95
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 96
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 96
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 97
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4肽变体
<400> 97
Ala Ser Gly Gly Gly Ala Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Asn
20 25 30
Ala Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 98
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 scFV 变体
<400> 98
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 99
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 scFv 变体
<400> 99
Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val
130 135 140
Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr
145 150 155 160
Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser
195 200 205
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys
210 215 220
Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala
225 230 235 240
Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala
245 250 255
Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe
260 265 270
Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys
275 280 285
Leu Thr Val Leu
290
<210> 100
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ?信号序列
<400> 100
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 101
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 101
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 102
Met Asp Trp Leu Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ala Gln Ala
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 103
Met Gly Trp Ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ser Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser

Claims (52)

1.一种具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X为第一融合蛋白；
Y-B为第二融合蛋白；
X:Y为异二聚性系链；
是X与Y之间的结合相互作用；
A为双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其独立地选自Fab片段、Fab'片段、单结构域抗体(sdAb)和单链Fv(scFv)；
B为单链Fv或sdAb；
X为结合对的第一结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；以及
Y为结合对的第二结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；
条件是当X为抗原时，Y为对由X表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，并且当Y为抗原时，X为对由Y表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb。
2.根据权利要求1所述的双特异性蛋白质复合物，其中X与A诸如Fab片段或Fab'片段的重链的C端或与所述scFv或sdAb的C端融合，任选地通过接头。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y与B的C端，诸如与所述scFv或sdAb的C端融合，任选地经由接头。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中X与Y之间的结合亲和力为5nM或更强。
5.根据权利要求4所述的双特异性蛋白质复合物，其中X与Y之间的结合亲和力为900pM或更强，诸如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM或300pM。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中A为Fab片段。
7.根据权利要求6所述的双特异性蛋白质复合物，其中X独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和抗原诸如肽，条件是当X为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb时，则Y为抗原诸如肽，并且当X为抗原诸如肽时，Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
8.根据权利要求7所述的双特异性蛋白质复合物，其中X为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
9.根据权利要求8所述的双特异性蛋白质复合物，其中所述Fab片段、所述Fab’片段、所述scFv或所述sdAb对所述肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1至38)特异。
10.根据权利要求9所述的双特异性蛋白质复合物，其中所述scFv为52SR4(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的氨基酸1至243)。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y为肽。
12.根据权利要求7所述的双特异性蛋白质复合物，其中X为肽。
13.根据权利要求7、11或12所述的双特异性蛋白质复合物，其中所述肽的长度在5至25个氨基酸的范围内。
14.根据权利要求12或13所述的双特异性复合物，其中Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
15.权利要求14所述的双特异性复合物，其中所述Fab片段、所述Fab'片段、所述scFv或所述sdAb对肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1至38)特异。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y为Fab片段。
18.根据权利要求12至16中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y为scFv或sdAb。
19.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中A为scFv或sdAb。
20.根据权利要求19所述的双特异性蛋白质复合物，其中X独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和抗原诸如肽，条件是当X为肽时，Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb，并且当X为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb时，则Y为抗原诸如肽。
21.根据权利要求19或20所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和抗原诸如肽，条件是当Y为肽时，X为Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb，并且当Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb时，则X为抗原诸如肽。
22.根据权利要求20或21所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y为Fab。
23.根据权利要求20或21所述的双特异性蛋白质复合物，其中Y为scFv或sdAb。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中所述Fab片段、所述Fab'片段、所述scFv或所述sdAb对肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1至38)特异。
25.根据权利要求24所述的双特异性蛋白质复合物，其中所述scFv为52SR4(SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:3的氨基酸1至243)。
26.根据权利要求20或21所述的双特异性蛋白质复合物，其中X或Y为肽，例如所述GCN4肽(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1至38)。
27.根据权利要求26所述的双特异性蛋白质复合物，其中所述肽的长度在5至25个氨基酸的范围内。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其包含不超过两个scFv。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白质复合物，其中A和/或B对选自以下的抗原具有特异性：细胞表面受体诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子诸如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素、酶和离子通道。
30.一种组合物，其包含权利要求1至29中任一项所定义的一种或多种双特异性蛋白质复合物。
31.根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性蛋白质复合物或根据权利要求30所述的组合物，所述蛋白质复合物或组合物用于治疗。
32.一种方法，其用于检测根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能，其包括在一种或多种功能测定中测试所述双特异性蛋白质复合物。
33.一种用于检测式A-X:Y-B的异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能的方法，其中:
A-X为第一融合蛋白；
Y-B为第二融合蛋白；
X:Y为异二聚性系链；
为X与Y之间的结合相互作用；
A为双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分，其独立地选自Fab片段、Fab'片段、sdAb和单链Fv(scFv)；
B为单链Fv或sdAb；
X为独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb的结合对的第一结合伙伴；以及
Y为结合对的第二结合伙伴，其独立地选自抗原、Fab片段、Fab'片段、单链Fv和sdAb；
条件是当X为抗原时，Y为对由X表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，并且当Y为抗原时，X为对由Y表示的抗原特异的Fab片段、Fab'片段、单链Fv或sdAb，所述方法包括以下步骤：
(i)在功能测定中测试包含至少一种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物的多重复合物的部分或全部的活性；和
(ii)分析来自功能测定的读数以检测异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物中的协同生物学功能。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多重复合物呈网格形式。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述多重复合物包含至少两种异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物不包含Fc区域。
37.根据权利要求33或36中任一项所述的方法，其中A独立地选自Fab片段、Fab'片段、sdAb和scFv。
38.根据权利要求37所述的方法，其中A为Fab或Fab'片段，诸如Fab。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中X与A诸如抗体、Fab或Fab'片段中的重链的C端融合，任选地通过接头。
40.根据权利要求39所述的方法，其中A为scFv或sdAb。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中Y与所述scFv或sdAb的C末端融合，任选地通过接头。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的方法，其中X独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和肽，条件是当X为肽时，Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb，并且当X为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb时，则Y为抗原诸如肽。
43.根据权利要求33-41中任一项的方法，其中Y独立地选自Fab片段、Fab'片段、scFv、sdAb和肽，条件是Y为肽时，X为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb，并且当Y为Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb时，则X为抗原诸如肽。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述肽的长度在5至25个氨基酸的范围内。
45.根据权利要求32至44中任一项所述的方法，其中X与Y之间的结合亲和力为5nM或更强。
46.根据权利要求45所述的方法，其中X与Y之间的结合亲和力为900pM或更强，诸如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM或300pM。
47.根据权利要求32至46中任一项所述的方法，其中X或Y为对肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1-38)特异的Fab片段、Fab'片段、scFv或sdA。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述scFv为52SR4(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的氨基酸1-243)。
49.根据权利要求32至48中任一项所述的方法，其中X或Y为肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQID NO:1的氨基酸1-38)。
50.根据权利要求32至49中任一项所述的方法，其中A和/或B对选自以下的抗原具有特异性：细胞表面受体诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子诸如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素、酶或离子通道。
51.根据权利要求32至50中任一项所述的方法，其中所述异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物在测试之前未被纯化。
52.根据权利要求51所述的方法，其中瞬时表达所述A-X和Y-B融合蛋白并且不对其进行纯化，然后以1:1摩尔比混合所述A-X和Y-B融合蛋白以产生每一个异二聚性系连的双特异性蛋白质复合物。
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US (1) US11286312B2 (zh)
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GB (1) GB201521382D0 (zh)
WO (1) WO2017093402A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459220A (zh) * 2014-05-29 2017-02-22 Ucb生物制药私人有限公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式
CN108473557A (zh) * 2015-12-03 2018-08-31 Ucb生物制药私人有限公司 使用双特异性蛋白质复合物的方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521393D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201817309D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201817311D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2021160268A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9
WO2021160265A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9 and cd137
EP4103610A1 (en) 2020-02-13 2022-12-21 UCB Biopharma SRL Anti cd44-ctla4 bispecific antibodies
WO2021160266A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies binding hvem and cd9
WO2021160267A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9 and cd7

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459220A (zh) * 2014-05-29 2017-02-22 Ucb生物制药私人有限公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
IL91501A (en) 1988-09-02 1998-03-10 Dyax Corp Generation of a variegated library of mutant potential binding proteins and screening of said library for proteins with a desired binding activity
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
BR9007769A (pt) 1989-10-20 1992-08-11 Lynxvale Ltd Preparacao para o tratamento de tecido alheio,processo para a preparacao de tecido alheio ex-vivo antes de transplante ou de seu uso como material curativo,processo para o tratamento de um paciente,e,processo para realizacao de transplantes de orgaos alogenicos ou xenogenicos a um paciente humano,ou para fornecimento de curativo alogenico ou xenogenico a este paciente
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US6106834A (en) 1993-06-02 2000-08-22 Research Corporation Technologies, Inc. Use of anti-CD45 leukocyte antigen antibodies for immunomodulation
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
AU696293B2 (en) 1993-12-08 1998-09-03 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
EP1049787B1 (en) * 1998-01-23 2004-11-24 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
DE19952956A1 (de) 1999-11-03 2001-05-17 Acgt Progenomics Ag Verfahren zur Verbindung von molekularen Substanzen
WO2001048017A1 (en) 1999-12-28 2001-07-05 Esbatech Ag Intrabodies with defined framework that is stable in a reducing environment and applications thereof
US20050069538A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Gregorio Aversa Therapeutic binding molecules
GB0103389D0 (en) 2001-02-12 2001-03-28 Novartis Ag Organic compounds
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
JP2005536180A (ja) 2001-12-03 2005-12-02 アブジェニックス・インコーポレーテッド 自己免疫疾患の治療および移植拒絶の処置に使用する抗ｃｄ４５ｒｂ抗体
KR20040094705A (ko) 2002-02-21 2004-11-10 듀크 유니버시티 자가면역질환에 대한 시약 및 치료 방법
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0225279D0 (en) 2002-10-30 2002-12-11 Celltech R&D Ltd Biological products
US7993864B2 (en) 2002-12-03 2011-08-09 Ucb Pharma S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
US20050048578A1 (en) 2003-06-26 2005-03-03 Epitomics, Inc. Methods of screening for monoclonal antibodies with desirable activity
CA2527020A1 (en) 2003-07-01 2005-01-13 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
AU2003259718A1 (en) 2003-08-07 2005-03-07 Epitomics, Inc. Methods for humanizing rabbit monoclonal antibodies
DE602004026081D1 (de) 2003-09-18 2010-04-29 Novartis Ag Therapeutische humanisierte antikörper gegen cd45-isoformen
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1784427A2 (en) 2004-06-01 2007-05-16 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
US20060018897A1 (en) 2004-06-28 2006-01-26 Transtarget Inc. Bispecific antibodies
ES2341126T3 (es) 2005-05-11 2010-06-15 Philogen S.P.A. Proteina de fusion del anticuerpo l19 contra fibronectina ed-b e interleucina 12.
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7745393B2 (en) 2005-11-03 2010-06-29 Jumi Shin Minimalist bZIP proteins and uses thereof
GB0523954D0 (en) 2005-11-24 2006-01-04 Ucb Celltech Bioassays
GB0601513D0 (en) 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
US20080003224A1 (en) 2006-01-27 2008-01-03 Cellerant Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating haematological proliferative disorders
SG172698A1 (en) 2006-06-12 2011-07-28 Trubion Pharmaceuticals Inc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
TWI447124B (zh) 2006-12-01 2014-08-01 Medarex Llc 結合ｃｄ２２的人類抗體與其應用
CN101802015B (zh) 2007-03-29 2015-05-06 根马布股份公司 双特异性抗体及其制造方法
AR067544A1 (es) 2007-07-16 2009-10-14 Genentech Inc Anticuerpos anti- cd79b e inmunoconjugados y metodos de uso de los mismos
CN104004088B (zh) 2007-09-26 2017-11-07 Ucb医药有限公司 双特异性抗体融合物
SG187517A1 (en) 2008-01-31 2013-02-28 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2009120178A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Epitomics, Inc. Anti-vegf antibody
KR102095257B1 (ko) 2008-06-25 2020-04-01 노바르티스 아게 Ｖｅｇｆ를 억제하는 안정하고 가용성인 항체
US8540235B2 (en) 2008-09-05 2013-09-24 Peter Kern Conveying apparatus for envelopes and related methods
CN102164965B (zh) 2008-09-26 2016-03-30 Ucb医药有限公司 生物产品
CA2772572A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific immunocytokine dock-and-lock (dnl) complexes and therapeutic use thereof
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
EP2558587A4 (en) 2010-04-12 2015-05-06 Sorrento Therapeutics Inc METHOD FOR DISPLAYING ANTIBODIES
SG10201800757TA (en) 2010-04-20 2018-02-27 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
US9146241B2 (en) 2011-11-23 2015-09-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Proteomic identification of antibodies
CN107441480A (zh) 2010-06-30 2017-12-08 卡姆普根有限公司 多肽及其作为用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的药物的用途
PL2606064T3 (pl) 2010-08-16 2015-07-31 Novimmune Sa Sposoby wytwarzania wieloswoistych i wielowartościowych przeciwciał
WO2012116453A1 (en) * 2011-03-03 2012-09-07 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
JP6024025B2 (ja) 2011-05-02 2016-11-09 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． 少容量投与用のアロタイプ選択抗体の限外濾過濃縮
AU2012258637B2 (en) 2011-05-24 2017-07-20 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
SG10201805291TA (en) 2011-10-27 2018-08-30 Genmab As Production of heterodimeric proteins
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
CA2853138A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-cd22 antibodies for inducing trogocytosis
US20140212425A1 (en) 2011-12-05 2014-07-31 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-cd22 antibodies for inducing trogocytosis
JP6445429B2 (ja) * 2012-06-27 2018-12-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる標的化実体を含むテーラーメイドで選択的かつ多重特異性治療用分子を選択および作製するための方法およびその使用
AU2013288930A1 (en) 2012-07-09 2014-12-04 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-CD79b antibodies
BR112015000439A2 (pt) 2012-07-09 2017-12-19 Genentech Inc imunoconjugado , formulação farmacêutica e métodos de tratamento de um indivíduo e de inibição da proliferação
EP2869849A1 (en) 2012-07-09 2015-05-13 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
MX2015000314A (es) 2012-07-09 2015-04-10 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados.
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
KR101963231B1 (ko) 2012-09-11 2019-03-28 삼성전자주식회사 이중특이 항체의 제작을 위한 단백질 복합체 및 이를 이용한 이중특이 항체 제조 방법
US20150299315A1 (en) 2012-10-22 2015-10-22 Becton, Dickinson And Company Non-b-lineage cells capable of producing antibody
GB201223276D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
ES2845924T3 (es) * 2013-10-15 2021-07-28 Scripps Research Inst Interruptores de células T con receptores de antígenos quiméricos peptídicos y usos de los mismos
WO2015101587A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
US9139649B2 (en) 2014-02-25 2015-09-22 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD22 antibody
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201411420D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Ucb Biopharma Sprl Antibody constructs
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
WO2016168773A2 (en) 2015-04-15 2016-10-20 The California Institute For Biomedical Research Optimized pne-based chimeric receptor t cell switches and uses thereof
GB201601075D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521391D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521389D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521393D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459220A (zh) * 2014-05-29 2017-02-22 Ucb生物制药私人有限公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C ARNDT等: "Costimulation improves the killing capability of T cells redirected to tumor cells expressing low levels of CD33: description of a novel modular targeting system", 《LEUKEMIA》 *
CHRISTIAN ZAHND等: "Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
JOZEF HANES等: "Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459220A (zh) * 2014-05-29 2017-02-22 Ucb生物制药私人有限公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式
CN106459220B (zh) * 2014-05-29 2021-10-08 Ucb生物制药有限责任公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式
CN108473557A (zh) * 2015-12-03 2018-08-31 Ucb生物制药私人有限公司 使用双特异性蛋白质复合物的方法

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