CN107922492A - 结合cd79的抗体分子 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及包含对CD79特异的结合结构域的抗体分子，所述结合结构域包含SEQ ID NO:1、2、3或4，和/或SEQ ID NO:5、6和7。本公开还扩展至包含所述抗体分子的药物组合物以及所述抗体分子/组合物在治疗中的用途。

Description

结合CD79的抗体分子
本公开要求PCT/EP2015/066368、PCT/EP2015/066369和GB1601075.3的优先权，其每一篇通过引用并入本文。
发明领域
本公开涉及至少对抗原CD79特异的抗体分子，包含所述抗体分子的制剂以及其中任一种在治疗中的用途。本公开还扩展至制备所述抗体分子和所述制剂的方法。
发明背景
体内的生物学机制是非常复杂的信号级联，其难以解析和理解。此类信号传导的一个实例是激活B细胞所需的信号传导。B细胞抗原受体(BCR)由膜免疫球蛋白(mIg)分子和缔合的Igα/Igβ(CD79a/CD79b)异二聚体(α/β)组成。mIg亚单位结合抗原，导致受体聚集，而α/β亚单位将信号转导到细胞内部。BCR聚集快速激活Src家族激酶Lyn、Blk和Fyn以及Syk和Btk酪氨酸激酶。这启动由BCR、上述酪氨酸激酶、衔接体蛋白(诸如CD19和BLNK)以及信号传导酶(诸如PLCγ2、PI3K和Vav)组成的‘信号体’(signalosome)的形成。
从信号体发出的信号激活涉及激酶、GTP酶和转录因子的多个信号级联。这导致细胞代谢、基因表达和细胞骨架组织的变化。BCR信号传导的复杂性允许许多不同的结果，包括存活、耐受性(无反应性)或凋亡、增殖和分化为抗体产生细胞或记忆B细胞。应答的结果由细胞的成熟状态、抗原的性质、BCR信号传导的幅度和持续时间以及来自其它受体(诸如CD40、IL-21受体和BAFF-R)的信号所确定。许多其它跨膜蛋白质(其中一些是受体)调节BCR信号传导的特定元件。这些元件中的一些，包括CD45、CD19、CD22、PIR-B和FcγRIIB1(CD32)。BCR信号传导的幅度和持续时间受包括涉及Lyn/CD22/SHP-1途径、Cbp/Csk途径、SHIP、Cbl、Dok-1、Dok-3、FcγRIIB1、PIR-B和BCR内化的负反馈环的限制。在体内，B细胞常常被抗原呈递细胞激活，所述抗原呈递细胞捕获抗原并将其展示在细胞表面。通过这种膜相关抗原活化B细胞需要BCR诱导的细胞骨架重组。
自身反应性B细胞负责可直接或间接引起或加重自身免疫病症的致病性自身抗体的产生。CD20阳性B细胞的耗尽已经用于成功治疗许多自身免疫病症，并因此结论性地确定了B细胞在引起或维持许多自身免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和I型糖尿病)中起重要作用。尽管B细胞耗尽已经是一种成功的治疗选择，但也存在控制B细胞生长和激活状态也可以是调节B细胞功能的有效方式的证据。因此，需要不耗尽B细胞并提供控制B细胞而没有已被证明与一些副作用相关的长期抑制B细胞免疫性的灵活性的替代策略。另外，并非所有B细胞应答或活性都是有害的，并且有证据表明维持调节性B细胞群可能是保护性的。这样的方法应该在由不足或过量的BcR信号传导引起的具有异常B细胞功能的疾病中有效。此类疾病的实例包括但不限于炎症、自身免疫力和癌症。特别感兴趣的是对BcR信号传导具有直接需求或需要抑制或刺激体液免疫应答的疾病。
CD79a与CD79b(以前称为Ig-α和Ig-β)一起在B细胞表面上形成通过二硫键合稳定的异二聚体。该复合物是BCR的异二聚体信号传导分子，其调节B细胞信号传导以及B细胞发育、活化和耐受的所有阶段。CD79几乎只在B细胞和B细胞瘤上表达。抗体对通过该分子递送的差异信号的调节可引起B细胞活化、B细胞无反应性或B细胞死亡，从而在许多不同的、取决于B细胞活化的疾病(包括自身免疫、免疫缺陷和恶性肿瘤)中具有治疗益处(参见例如，The B-Cell Antigen Receptor:Formation of Signaling Complexes and the Functionof Adaptor Proteins.Current Topics in Microbiology&Immunology.2000.第245卷(1):53-76)。
本公开提供了一些对CD79特异的抗体分子，其可单独使用或与实体(诸如对其它抗原诸如B细胞表面受体(诸如CD22或CD45)特异的抗体或其结合片段)组合使用，可用于控制异常B细胞功能(例如与某些疾病诸如自身免疫和癌症相关的)。
本公开的概述
因此提供了抗体分子，其包含：
式(I)的CDRH1：
GFSLX1NYX2X3X4(SEQ ID NO:1)
其中X1为S或N，X2为V或A，X3为V或M，并且X4为S或V，
式(II)的CDRH2：
IIYX5X6X7X8X9X10X11YAX12WAKG(SEQ ID NO:2)
其中X5为V或I，X6为S或E，X7为T或G，并且X8为N或G，X9为T或A，X10为T或Y，X11为W或不存在，X12为N或S，
CDHR3为EPYEPYDDSNIYYGMDP(SEQ ID NO:3)或DAGHSDVDVLDI(SEQ ID NO:4)，以及
轻链可变结构域(VL)。在一个实例中，轻链可变结构域包含来自兔形目动物的CDRL1、CDRL2和CDRL3，特别是包含人框架和来自兔的CDRL1、CDRL2和CDRL3或其变体的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，CDRL1具有式(III)：
QX13SQSX14X15X16X17NX18LA(SEQ ID NO:5)
其中X13为A或S，X14为V或I，X15为V或Y并且X16为N或S，X17为G或N，并且X18为Y或D；
CDRL2具有式(IV)：
X19ASX20LAS(SEQ ID NO:6)
其中X19为S或E，并且X20为T或K；
CDRL3具有式(V):
X21GX22X23SX24X25X26X27X28X29X30A(SEQ ID NO:7)
其中X21为L或Q，X22为G或E，X23为G或F，X24为C、S或G(特别地S或G)，X25为S或G，X26为D、S或E，X27为H、G、A、S或C(特别地H、G、A或S)，X28为I或D，X29为C、S或不存在，并且X30为N或不存在。
符合式(I)和(II)的定义的CDR的实例提供如下：
SEQ ID NO:8GFSLNNYVMV(例如作为CDRH1)
SEQ ID NO:9IIYVSGNAYYASWAKG(例如作为CDRH2)
SEQ ID NO:11GFSLSNYAVS(例如作为CDRH1)
SEQ ID NO:12IIYIETGTTWYANWAKG(例如作为CDRH2)
符合式(III)、(IV)和(V)定义的CDR的实例提供如下：
SEQ ID NO:13QSSQSIYNNNDLA(例如作为CDRL1)
SEQ ID NO:14EASKLAS(例如作为CDRL2)
SEQ ID NO:15QGGGSGGDGIA(例如作为CDRL3)
SEQ ID NO:16QGGGSGGEGIA(例如作为CDRL3变体1)
SEQ ID NO:17QGGGSGGDAIA(例如作为CDRL3变体2)
SEQ ID NO:18QGGGSGGDSIA(例如作为CDRL3变体3)
SEQ ID NO:19QASQSVVSGNYLA(例如作为CDRL1)
SEQ ID NO:20SASTLAS(例如作为CDRL2)
SEQ ID NO:21LGEFSCSSHDCNA(例如作为CDRL3)
SEQ ID NO:22LGEFSSSSHDSNA(例如作为CDRL3变体1)
SEQ ID NO:23LGEFSCSSHDSNA(例如作为CDRL3变体2)
SEQ ID NO:24LGEFSSSSHDCNA(例如作为CDRL3变体3)
在一个实例中，本发明提供了处于任何合适的抗体形式的本文所述CD79抗体。因此提供了包含一个或多个本文和图51中所述的结合结构域的抗CD79抗体或其片段，其包含本文和SEQ ID NO 11、12、3、19、20和21(抗体4447)或SEQ ID NO 8、9、4、13、14和15(抗体4450)中提供的CDR。所述CDR可被并入任何合适的抗体框架中和并入任何合适的抗体形式中。此类抗体包括完整抗体及其功能活性片段或衍生物，其可以是但不限于单克隆、人源化、完全人或嵌合抗体。因此，此类抗体可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，以及可以是、但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体、scFv、双价抗体、三价抗体或四价抗体、Bis-scFv、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和任何上述抗体的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域公知的(参见例如Verma等，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。多价抗体可包含多种特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853和WO05/113605)。应理解的是，本发明的这个方面还扩展到这些CD79抗体的变体，包括人源化形式和经修饰的形式，包括如本文中所述的其中已在CDR中突变氨基酸以除去一个或多个异构化、脱酰胺化、糖基化位点或半胱氨酸的那些形式。
因此，在一个实例中，提供了包含具有可变区的重链或重链片段的抗CD79抗体或其结合片段，其中所述可变区包含独立选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的一个、两个或三个CDR，例如其中CDR H1是SEQ ID NO:1，CDR H2是SEQ IDNO:2并且CDR H3是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
因此，一个实施方案的CDR H1是SEQ ID NO:1并且CDR H2是SEQ ID NO:2，或者CDRH1是SEQ ID NO:1并且CDR H3是SEQ ID NO:3，或者CDR H1是SEQ ID NO:1并且CDR H3是SEQID NO:4，或者CDR H2是SEQ ID NO:2并且CDR H3是SEQ ID NO:3，或者CDR H2是SEQ ID NO:2并且CDR H3是SEQ ID NO:4。
因此，在一个实例中，提供了包含具有可变区的重链或重链片段的抗CD79抗体或其结合片段。其中所述可变区包含独立选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:4的一个、两个或三个CDR，例如其中CDR H1是SEQ ID NO:8，CDR H2是SEQ ID NO:9并且CDR H3是SEQ ID NO:4。
因此，在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:8并且CDR H2是SEQ ID NO:9，或者CDR H1是SEQ ID NO:8并且CDR H3是SEQ ID NO:4，或者CDR H2是SEQ ID NO:9并且CDR H3是SEQ ID NO:4。
因此，在一个实例中，提供了包含具有可变区的重链或重链片段的抗CD79抗体或其结合片段，其中所述可变区包含独立选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:3的一个、两个或三个CDR，例如，其中CDR H1是SEQ ID NO:11，CDR H2是SEQ ID NO:12并且CDRH3是SEQ ID NO:3。
因此，在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:11并且CDR H2是SEQ ID NO:12，或者CDR H1是SEQ ID NO:11并且CDR H3是SEQ ID NO:3，或者CDR H2是SEQ ID NO:12并且CDRH3是SEQ ID NO:3。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体分子包含具有可变区的轻链或轻链片段，所述可变区例如包含独立选自SEQ ID NO:5、6和7的一个、两个或三个CDR，特别地其中CDRL1具有SEQ ID NO:5给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:6给出的序列并且CDR L3具有SEQID NO:7给出的序列。
因此，在一个实施方案中，CDR L1是SEQ ID NO:5并且CDR L2是SEQ ID NO:6，或者CDR L1是SEQ ID NO:5并且CDR L3是SEQ ID NO:7；或者CDR L2是SEQ ID NO:6并且CDR L3是SEQ ID NO:7。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体分子包含具有可变区的轻链或轻链片段，所述可变区例如包含独立选自SEQ ID NO:13-24的一个、两个或三个CDR，特别地其中CDRL1具有在SEQ ID NO:13或19中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:14或20中给出的序列，并且CDR L3具有独立选自SEQ ID NO:15、16、17、18、21、22、23和24的序列。
因此，在一个实施方案中，CDR L1是SEQ ID NO:13并且CDR L2是SEQ ID NO:14；或者CDR L1是SEQ ID NO:13并且CDR L3是SEQ ID NO:15、16、17或18；或者CDR L2是SEQ IDNO:14并且CDR L3是SEQ ID NO:15、16、17或18；或者CDR L1是SEQ ID NO:13，CDR L2是SEQID NO:14并且CDR L3是SEQ ID NO:15、16、17或18。
因此，在一个实施方案中，CDR L1是SEQ ID NO:19并且CDR L2是SEQ ID NO:20，或者CDR L1是SEQ ID NO:19并且CDR L3是SEQ ID NO:21、22、23或24；或者CDR L2是SEQ IDNO:20并且CDR L3是SEQ ID NO:21、22、23或24；或者CDR L1为SEQ ID NO:19，CDRL2为SEQID NO:20并且CDR L3为SEQ ID NO:21、22、23或24(诸如SEQ ID NO:22)。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或结合片段包含选自SEQ ID NO:1-24的CDR序列，例如其中CDR H1是SEQ ID NO:1，CDR H2是SEQ ID NO:2，CDR H3是SEQ ID NO:3或4，CDR L1是SEQ ID NO:5，CDR L2是SEQ ID NO:6并且CDR L3是SEQ ID NO:7。
在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:8或11，CDR H2是SEQ ID NO:9或12，CDRH3是SEQ ID NO:3或4，CDR L1是SEQ ID NO:5，CDR L2是SEQ ID NO NO：6并且CDR L3是SEQID NO:7。
在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:8或11，CDR H2是SEQ ID NO:9或12，CDRH3是SEQ ID NO:3或4，CDR L1是SEQ ID NO:13或19，CDR L2是SEQ ID NO:14或20，并且CDRL3是SEQ ID NO:15、16、17、18、21、22、23或24。
在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:1，CDR H2是SEQ ID NO:2，CDR H3是SEQID NO:3或4，CDR L1是SEQ ID NO:13或19，CDR L2是SEQ ID NO:14或20，并且CDR L3是SEQID NO:15、16、17、18、21、22、23或24。
在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:8，CDR H2是SEQ ID NO:9，CDR H3是SEQID NO:4，CDR L1是SEQ ID NO:13，CDR L2是SEQ ID NO:14，并且CDR L3是SEQ ID NO:15、16、17或18。
在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO:11，CDR H2是SEQ ID NO:12，CDR H3是SEQ ID NO:3，CDR L1是SEQ ID NO:19，CDR L2是SEQ ID NO:20，并且CDR L3是SEQ ID NO:21、22、23或24。
除非上下文另外指出，否则本文使用Kabat编号。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体分子被人源化并且并入了本文所述的CDR或其变体。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子中使用的重链可变区人框架选自IGHV3-48、IGHV4-59、IGHV3-66和其中任一个的变体，其中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸被除半胱氨酸外的氨基酸取代，例如被原始供体抗体中相应位置处的残基(例如来自SEQ ID NO:31或38中提供的供体VH序列的残基)取代。通常地，人框架还包含合适的J区序列，诸如JH4或JH2 J区。
在一个实施方案中，可在一个或多个位置，诸如在选自24、37、48、49、67、71、73和78的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个位置处产生VH框架(特别是与上文所述的重链抗CD79 CDR一起使用)中的取代(诸如至少位置73和78处的取代)，例如在全部位置24、48、49、73和78(特别适用于IGHV3-66)或全部位置24、48、49、71、73和78(特别适用于IGHV3-48)或全部位置37、49、67、71、73、76和78或全部位置37、67、71、73、76和78(特别适用于IGHV4-59)处的取代。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置24是缬氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置37是缬氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置48是异亮氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置49是甘氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置67是苯丙氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置71是赖氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置71是精氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置73是丝氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置78是缬氨酸。
应该理解，可组合这些取代中的一个或多个以产生用于本发明的抗体分子的人源化VH区。
在一个实施方案中，人源化VH可变结构域包含独立选自SEQ ID NO:34、35、41和42的序列。
在一个实施方案中，将VH的残基1改变成谷氨酸以有利于序列的加工。
在一个实施方案中，本公开的人源化抗体分子中使用的轻链可变区人框架选自IGKV1-6、IGKV1D-13和其中任一种的变体，其中一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸被除半胱氨酸外的氨基酸取代，例如被原始供体抗体的相应位置中的供体残基(例如来自SEQ ID NO:29或36中提供的供体VL序列的供体残基)取代。通常人框架还包含合适的J区诸如JK4 J区。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子中使用(例如以便接受轻链抗CD79 CDR)的人VL框架包含在至少一个位置(选自2、3、36、46、49和70的1个、2个、3个、4个、5个或6个位置)处取代的氨基酸，例如其中框架中的原始氨基酸被除半胱氨酸外的另一种氨基酸取代，特别是被供体抗体的框架中的相应位置处的残基取代。
在一个实施方案中，所使用的人VL框架是IGKV1框架并且在至少位置3和70处具有取代。
在一个实施方案中，所使用的人VL框架(诸如IGKV1框架)在位置2、3、36、46、49和70(特别适用于IGKV1D-13)或位置3和70(特别适合于IGKV1-6)处具有取代。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置2是谷氨酰胺。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置3是缬氨酸或天冬氨酸。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置36是亮氨酸。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置46是谷氨酰胺。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置49是组氨酸。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置70是谷氨酰胺。
应当理解的是，可组合这些取代中的一个或多个以产生用于本发明抗体的人源化VL区。
在一个实施方案中，人源化VL可变结构域包含独立选自SEQ ID NO:33或40的序列。
在一个实施方案中，人源化VL可变结构域包含独立选自SEQ ID NO:33、40、341、342和343的序列。
在一个实施方案中，提供了包含独立选自SEQ ID NO:34和35的VH和具有SEQ IDNO:33所示序列的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含独立选自SEQ ID NO:34和35的VH以及具有SEQ IDNO:250所示序列的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含独立选自SEQ ID NO:41和42的VH以及具有SEQ IDNO:40所示序列的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含独立选自SEQ ID NO:41和42的VH以及独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343的VL的抗体分子。
应当理解的是，可修饰这些人源化的移植的可变区(SEQ ID NO 41、42、40、41、342和343)以减少供体残基的数目并用原始人残基替代它们。
因此，在一个实例中，提供了包含独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343的VL的抗体分子，其中位置3处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置70处的残基已被天冬氨酸(D)替代。
在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO:41中给出的序列的VH的抗体分子，其中位置24处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置48处的残基已被天冬氨酸(D)替代和/或位置49处的残基已被丝氨酸(S)替代和/或位置73处的残基已被天冬酰胺(N)替代和/或位置78处的残基已被亮氨酸(L)替代。
在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO:42中给出的序列的VH的抗体分子，其中位置37处的残基已被异亮氨酸(I)替代和/或位置67处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置71处的残基被缬氨酸(V)替代和/或位置73处的残基被苏氨酸(T)替代和/或位置78处的残基被苯丙氨酸(F)替代。
在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO:41中给出的序列的VH(其中位置24处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置48处的残基已被天冬氨酸(D)替代和/或位置49处的残基已被丝氨酸(S)替代和/或位置73处的残基已被天冬酰胺(N)替代和/或位置78处的残基已被亮氨酸(L)替代)和包含独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343序列的序列或独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343的序列、并且其中位置3处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置70处的残基已被天冬氨酸(D)替代的VL的抗体分子。
在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO:42中给出的序列的VH(其中位置37处的残基已被异亮氨酸(I)替代和/或位置67处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置71处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置73处的残基已被苏氨酸(T)替代和/或位置78处的残基已被苯丙氨酸(F)替代)和包含独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343序列的序列或独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343的序列、并且其中位置3处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置70处的残基已被天冬氨酸(D)替代的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是全长抗体，
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是Fab或Fab'片段。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是scFv。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是多特异性的，例如双特异性或三特异性的。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体分子(诸如双特异性抗体分子)除了对CD79特异的结合结构域以外还包含对另一种抗原特异的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体分子(诸如双特异性抗体分子)除了对CD79特异的结合结构域以外，还包含对CD22特异的结合结构域(例如包含1个、2个、3个、4个、5个或6个本文公开的抗CD22 CDR或其变体)，诸如可变结构域或可变结构域对，特别是本文公开的人源化可变结构域或可变结构域对。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体分子(诸如双特异性抗体分子)包含针对CD45的结合结构域(例如包含1个、2个、3个、4个、5个或6个本文公开的抗CD45 CDR或其变体)，诸如可变结构域或可变结构域对，特别是本文公开的人源化可变结构域或可变结构域对。
在一个实施方案中，本发明的多特异性分子的一个或多个结合结构域各自独立地包含一个或多个(诸如两个)对相关抗原特异的抗体可变结构域(诸如对CD79特异的至少一个结合结构域和另外的对CD22或CD45特异的结合结构域)。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子对CD79a是特异的。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子对CD79b是特异的。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子对CD79a/CD79b异二聚体是特异的。
还提供了与本文中明确公开的抗体或结合片段结合相同表位的抗体或结合片段。
在一个实施方案中，提供了交叉阻断本文中明确公开的针对人CD79的抗体或结合片段、或被所述抗体交叉阻断对人CD79的结合的抗体或抗体片段。
抗CD79与以双特异性或三特异形式存在的根据本公开的抗CD45或CD22一起的组合在功能性体外测定中显示了有趣的生物活性，例如如通过以下中的任一种测量的对B细胞信号传导的抑制：除了抑制B细胞上CD86、CD71和/或CD40的表达以外，还抑制Akt S473的磷酸化、抑制P38和PLCγ2 Y759的磷酸化以及抑制IkB。相同水平的活性对于单独的各组分来说不明显，并且对于以混合物形式提供的组分而言可能不明显，即仅当以双特异性分子提供组合时才存在。
在这些测定中观察到的抑制表明包含对CD45或CD22特异的结合结构域和对CD79特异的结合结构域的本发明的多特异性分子，并且该组合可用于改变B细胞功能并提供B细胞耗尽的变通治疗方案。
本发明还提供了用于本发明的多特异性分子或用于掺入任何其他合适的抗体形式的新型CD22抗体。
本发明还提供了用于本发明的多特异性分子或用于掺入任何其他合适的抗体形式的新型CD45抗体。
附图说明
图1是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化Akt的相对效力的条形图。
图2是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化PLCγ2的相对效力的条形图。
图3是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制CD86表达的相对效力的条形图。
图4是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性、二价或混合物抑制磷酸化Akt的相对效力的条形图。
图5是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性、二价或混合物抑制磷酸化PLCγ2的相对效力的条形图。
图6是显示CD22和CD79b的双特异性组合对抗IgM刺激的B细胞中的总IkB水平的效应的滴定的图。
图7是显示CD22和CD79b的双特异性组合对抗-IgM刺激的B细胞上的CD86表达的效应的滴定的图。
图8是具有针对CD22和CD79b的特异性、具有不同V区的双特异性蛋白抑制磷酸化PLCγ2的图。
图9是提取自Chan和Carter，Nature Reviews Immunology第10卷，May 2010,301的图，其显示某些抗体形式
图10是显示抗原网格交叉特异性的数据的表。抗原2＝CD79b，抗原3＝CD22。值是Syk磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)并且代表所评估的多个V区组合的平均值。
图11是显示抗原网格交叉特异性数据的表格。抗原2＝CD79b和抗原3＝CD22。值是PLCγ2磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)并且代表所评估的多个V区组合的平均值。
图12是显示抗原网格交叉特异性数据的表格。抗原2＝CD79b，抗原3＝CD22以及抗原4＝CD4。值是AKT磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)并且代表所评估的多个V区组合的平均值。
图13是显示与Fab-Y中的CD22特异性组合的Fab-X中的CD79b特异性的每个V区组合对Syk、PLCγ2和AKT磷酸化的抑制百分数的图。
图14是显示与Fab-Y中的CD79b特异性组合的Fab-X中的CD22特异性的每个V区组合对Syk、PLCγ2和AKT磷酸化的抑制百分数的图。
图15显示CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞中抗IgM诱导的磷酸化PLCγ2的百分比抑制的数据。
图16显示CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞中抗IgM诱导的磷酸化P38的百分比抑制的数据。
图17显示由CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞中抗IgM诱导的磷酸化Akt的百分比抑制的数据。
图18显示CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞上抗IgM诱导的CD71表达的百分比抑制的数据。
图19显示CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞上抗-IgM诱导的CD40表达的百分比抑制的数据。
图20显示CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞上抗-IgM诱导的CD86表达的百分比抑制的数据。
图21显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上CD27表达的抑制。
图22显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上CD71表达的抑制。
图23显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上CD86表达的抑制。
图24显示了CD79b和CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上CD27表达的抑制。
图25显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上CD71表达的抑制。
图26显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上CD86表达的抑制。
图27显示对从用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130BYbe培养的PBMC中破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据代表来自3个供体的汇总数据。
图28显示对从用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130BYbe培养的纯化B细胞中破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据代表来自2个供体的汇总数据。
图29显示对用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe、VR4447/VR4130 BYbe、VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白培养的PBMC或纯化的B细胞中破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据来自一个供体。
图30显示来自12个健康个体和12个SLE患者样品的未受刺激B细胞中磷酸化的基线水平。
图31显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞NFkB磷酸化的影响，结果来自12名健康志愿者(HV)和12名SLE供体。
图32显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞Akt磷酸化的影响，结果来自12名健康志愿者(HV)和12名SLE供体。
图33显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞Syk磷酸化的影响，结果来自12名健康志愿者(HV)和12名SLE供体。
图34显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞Erk1&2磷酸化的影响，结果来自12名健康志愿者(HV)和12名SLE供体。
图35是具有针对CD45和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化Akt的相对效力的条形图。
图36是具有针对CD45和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化PLCg2的相对效力的条形图。
图37是显示CD45和CD79b的双特异性组合对抗-IgM刺激的B细胞上的CD86表达的效应的滴定的图。
图38是具有针对CD45和CD79b的特异性、具有不同V区的双特异性蛋白对磷酸化PLCg2的抑制的图。
图39显示与Fab-Y中的CD45特异性组合的Fab-X中的CD79b特异性的每个V区组合对Syk、PLCγ2&AKT的磷酸化的百分比抑制。
图40显示与Fab-X中的CD45特异性组合的Fab-Y中的CD79b特异性的每个V区组合对Syk、PLCγ2&AKT的磷酸化的百分比抑制。
图41&42显示纯化的CD79b-CD45(瞬时表达)对来自供体129和130的IgM刺激的B细胞上PLCγ2的抑制(+/-SD)。
图43&44显示纯化的CD79b-CD45(瞬时表达)对来自供体129和130的IgM刺激的B细胞上p38的抑制(+/-SD)。
图45&46显示纯化的CD79b-CD45(瞬时表达)对来自供体129和130的IgM刺激的B细胞上Akt的抑制(+/-SD)。
图47显示对从用不同多特异性分子培养的PBMC的破伤风类毒素IgG产生的抑制。
图48显示抗人CD79 V区对来自食蟹猴的B细胞的结合。
图49显示抗人CD79 V区对来自食蟹猴的B细胞的结合。
图50人PBMC中B细胞的BCR信号传导的抑制。
图51本公开的序列
本公开的详述
B细胞受体信号传导是B细胞的关键功能，也是B细胞的抗原特异性活化的必要条件。BcR信号传导在从B细胞发育的早期阶段至记忆B细胞应答的激活和发展中是至关重要的。B细胞受体由与CD79a和CD79b的异二聚体复合物缔合的表面免疫球蛋白(Ig)分子组成。当表面Ig识别抗原时，认为这引起CD79a/b复合物的簇集，导致包括Src家族激酶以及Syk和Btk酪氨酸激酶的立即信号传导级联的下游激活。该信号传导复合物然后可招募衔接蛋白诸如CD19和BLNK，并导致PLCγ2和PI3K的激活，进而可激活进一步的下游途径，诸如控制B细胞生长、存活和分化的那些下游途径。该信号传导复合物可通过经由BAFF-R、IL-21R和CD40的信号传导的其他第二信号进一步调节，并且还可被其他信号传导分子诸如CD19、CD21、CD83、CD22、CD32b和CD45等调节。BcR识别抗原后，被激活的第一反应之一是表面受体诸如共刺激分子CD80和CD86的上调。这些分子结合T细胞上的相应受体，所述受体递送进一步的存活和激活信号，所述信号使在MHC II类的背景下能够识别抗原的T细胞能够存活和扩增。该反应进一步被B细胞在MHC II类背景下将抗原呈递回到T细胞的能力放大，所述T细胞释放因子诸如IL-2和IL-21。这些细胞因子又大大地扩增B细胞数量。因此，细胞表面上CD86的下调可指示B细胞信号传导的抑制。
此外，抑制B细胞受体信号传导可导致下游功能的抑制。一个这样的结果将是抑制共刺激分子诸如CD86(或减少其表达)，这将导致T细胞功能、存活和分化的抑制。
因此，抑制B细胞受体信号传导可以有利于控制与自身免疫和癌症相关的异常B细胞功能。B细胞受体信号传导是自身免疫疾病中B细胞增殖、分化、抗原呈递和细胞因子释放所必需的。因此，抑制BcR活性可以调节B细胞功能，诸如免疫球蛋白分泌、T细胞活化和控制与例如自身免疫病症相关的不适当的B细胞活性。另外还有一些B细胞白血病和淋巴瘤，其需要B细胞受体信号传导来存活和生长，这可受B细胞受体激活抑制剂的控制。
本文使用的CD79是指由CD79a和CD79b组成的复合物。因此，结合CD79的抗体或结合结构域可以结合CD79a和/或CD79b。与本文使用的CD79a和/或CD79b的结合是指对CD79a是特异的，对CD79b是特异的，对CD79a和CD79b两者是特异的(即识别CD79a上的表位，并且同一抗体或结合结构域也识别CD79b上的表位，即泛特异性的)，或者对CD79a和CD79b的复合物是特异的(即识别由复合物形式的CD79a和CD79b的相互作用形成的表位，这能够将复合物与单个组分区分开)。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的抗体或其结合片段对CD79a是特异的。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的抗体或其结合片段对CD79b是特异的。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的抗体或其结合片段对CD79复合物是特异的，即其识别存在于复合物中的表位并且对其具有特异性，例如包含CD79a与CD79b之间的相互作用的表位。
在一个实施方案中，即使结合结构域对CD79a或CD79b是特异的，应理解的是，当处于复合形式时，结合结构域仍将优选地与CD79a或CD79b结合，因为这两种蛋白质天然地在细胞表面上共表达。
在结合结构域和/或每个结合结构域中存在两个可变区的情况下，则所述两个可变区将通常协同作用以提供对相关抗原的特异性，例如它们是同源对，或是经过亲和力成熟以提供足够的亲和力，使得该结构域对特定抗原是特异的。通常它们是重链和轻链可变区对(VH/VL对)。
本发明的抗体分子可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双scFv、双抗体、三抗体、四抗体和以上任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域公知的(参见例如Verma等，1998,Journal of ImmunologicalMethods,216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所述的Fab和Fab'片段。多价抗体可包含多特异性，例如双特异性，或者可以是单特异性的(参见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。
本文使用的“多特异性分子”是指具有特异性结合至少两种独特抗原(例如不同抗原)的能力的分子。在一个实施方案中，多特异性分子是双特异性、三特异性或四特异性分子，特别是双特异性或三特异性分子。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是双特异性的。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是双特异性的，其中一个结合结构域与CD79结合。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是三特异性的。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子是三特异性的，其中一个结合结构域结合CD79。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子对于CD79是单特异性的，并且对于至少一种其他抗原是单特异性的，即该分子仅包含一个结合CD79的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子对于CD79是单特异性的，并且对于CD22是单特异性的，即该分子仅包含一个结合CD79的结合结构域和一个结合CD22的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子对于CD79是单特异性的，并且对于CD45是单特异性的，即该分子仅包含一个结合CD79的结合结构域和一个结合CD45的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子是单链。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子包含重链和轻链。在一个实例中，如本文中所用，重链和轻链配对不被称为二聚体，特别是在一个实施方案中，本公开的分子不包含抗体、单位/片段或组分的多聚体、诸如二聚体的情况。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD22和CD79a具有特异性的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中对CD22和CD79a特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD22和CD79b特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中对CD22和CD79b特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD22和CD79a/b复合物特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中对CD22和CD79a/b复合物特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD45和CD79a特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(例如双特异性或三特异性形式)中对CD45和CD79a特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD45和CD79b特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(例如双特异性或三特异性形式)中对CD45和CD79b特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD45和CD79a/b复合物特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中对CD45和CD79a/b复合物特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个实施方案中，本公开的分子是三特异性的，例如其中第三结合结构域能够例如通过结合血清载体蛋白延长分子的半衰期。
血浆中存在多种蛋白质，包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白或其任何片段(Bartalena和Robbins，1993,Clinics inLab.Med.13:583-598；Bree等，1986,Clin.Pharmacokin.11:336-342；Gitlin等1964,J.Clin.Invest.10:1938-1951；Peters,1985,Adv Protein Chem.37:161-245；Waldeman和Strober,1969,Progr.Allergy,13:1-110)。例如，第三结合结构域特异于血清白蛋白，例如人血清白蛋白。
多特异性分子形式
用于本发明的合适的多特异性分子的实例在本领域中是已知的，例如以下综述中所公开的：“The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies,Nunez-Prado等Drug Discovery Today第20卷，Number 5Mar 2015，第588-594页，D.Holmes,Nature RevDrug Disc Nov 2011:10；798,Chan and Carter,Nature Reviews Immunology第10卷，May2010,30(通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，多特异性形式包括本领域已知的和本文描述的那些形式，例如其中分子形式选自包含以下分子形式或由以下分子形式组成的组：
·串联sdAb、串联sdAb-sdAb(3个sdAb)；
·(scFv)2(也称为串联scFv)、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv(dsFv)2；
·双抗体、ds双抗体(dsdiabody)、dids双抗体(didsdiabody)；
·sc双抗体(scdiabody)、dssc双抗体(dsscdiabody)、didssc双抗体(didsscdiabody)；
·Dart抗体、即VL1接头VH2接头和VH1接头VL2，其中VH1和VH2的C末端通过二硫键连接；
·dsBiTE、didsBiTE；
·di-双抗体(参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第25号分子)、dsdi-双抗体、didsdi-双抗体；
·三抗体(triabody)、ds三抗体(dstriabody)、dids三抗体(didstriabody)、trids三抗体(tridstriabody)；
·四抗体(tetrabody)、ds四抗体(dstetrabody)、dids四抗体(didstetrabody)、trids四抗体(tridstetrabody)、tetrads四抗体(tetradstetrabody)；
·tandab(参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第22号分子)；dstandab、didstandab、tridstandab、tetradstandab；
·[sc(Fv)2]2、(参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第22号分子)、ds[sc(Fv)2]2、dids[sc(Fv)2]2、trids[sc(Fv)2]2、tetrads[sc(Fv)2]2；
·五抗体(参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第27号分子)；
·Fab-scFv(也称为双靶向抗体(bibody))、Fab’scFv、FabdsscFv(或BYbe)、Fab’dsscFv；
·三体、ds三体、dids三体(也称为FabdidsscFv或TrYbe或Fab-(dsscFv)2)、Fab’didsscFv；
·Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv；
·Fab单接头Fv(本文中也称为如WO2014/096390中所公开的FabdsFv)、Fab’单接头Fv(本文中也称为Fab’dsFv)；
·FabscFv单接头Fv、Fab’scFv单接头Fv；
·FabdsscFv单接头Fv、Fab’dsscFv单接头Fv；
·FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv、
·FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv、
·diFab、diFab’，包括化学缀合的diFab’、
·(FabscFv)2、(Fab)2scFvdsFv、(Fab)2dsscFvdsFv、(FabdscFv)2、
·(Fab’scFv)2、(Fab’)2scFvdsFv、(Fab’)2dsscFvdsFv、(Fab’dscFv)2、
·VHHCK(参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第6号分子)；
·微型抗体(minibody)、ds微型抗体、dids微型抗体、
·微抗体(miniantibody)(ZIP)[参见Nunez-Prado等，特别是其中的图1中的第7号分子]、ds微抗体(ZIP)和dids微抗体(ZIP)；
·tribi-微型抗体[参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第15号分子]dstribi-微型抗体、didstribi-微型抗体、tridstribi-微型抗体；
·双抗体-CH3、ds双抗体-CH3、dids双抗体-CH3、sc双抗体-CH3、dssc双抗体-CH3、didssc双抗体-CH3、
·串联scFv-CH3、串联dsscFv-CH3、串联didsscFv-CH3、串联tridsscFv-CH3、串联tetradsscFv-CH3、
·scFv-Fc(本文中也称为如W02008/012543中所述的(scFvCH2CH3)2)及其单链形式、dsscFvscFv-Fc、dsscFv-Fc(本文中也称为(dsscFvCH2CH3)2)、scFv-dsFv-Fc、dsscFv-dsFv-Fc、dsFv-Fc(本文中也称为(dsFvCH2CH3)2)、
·蝎型分子(Trubion)即结合结构域、接头--CH2CH3结合结构域，如US8,409,577中所述；
·SMIP(Trubion)即(scFv-CH2CH3)2；
·(dsFvCH2CH3)2、串联scFv-Fc、串联dsscFvscFv-Fc、串联dsscFv-Fc、
·scFv-Fc-scFv、dsscFv-Fc-scFv、scFv-Fc-dsscFv、
·双抗体-Fc、ds双抗体-Fc、dids双抗体-Fc、三抗体-Fc、ds三抗体-Fc、dids三抗体-Fc、trids三抗体-Fc、四抗体-Fc、ds四抗体-Fc、dids四抗体-Fc、trids四抗体-Fc、tetrads四抗体-Fc、ds四抗体-Fc、dids四抗体-Fc、trids四抗体-Fc、tetrads四抗体-Fc、sc双抗体-Fc、dssc双抗体、didssc双抗体；
·双功能或三功能抗体，例如具有不同重链可变区和共同的轻链的抗体，例如Merus双特异性抗体形式其具有固定序列的共同轻链和不同重链(包括不同CDR)和工程化改造的CH3结构域以驱动不同重链的二聚化，
·Duobody(即其中抗体中的一条全长链相对于抗体中另一条全长链具有不同的特异性；
·全长抗体，其中已经使用Fab臂交换来产生双特异性形式；
·双功能或三功能抗体、其中全长抗体具有共同的重链和不同的轻链，也称为kappa/lambda体或κ/λ-体、参见例如WO2012/023053；
·来自重链或轻链C末端的Ig-scFv 1、2、3或4、来自重链或轻链N末端的scFv-Ig1、2、3或4、单接头Ig-Fv、来自重链或轻链C末端的Ig-dsscFv 1、2、3或4(具有一、二、三或四个二硫键)；
·来自重链或轻链N末端的Ig-dsscFv 1、2、3或4(具有一、二、三或四个二硫键)；
·Ig单接头Fv(参见PCT/EP2015/064450)；
·Ig-dab、dab-Ig、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V；
·scFabFvFc、scFabdsFvFc(单接头形式的scFavFv)、(FabFvFc)2、(FabdsFvFc)2、scFab’FvFc、scFab’dsFvFc、(Fab’FvFc)2、(Fab’dsFvFc)2；和
·DVDIg，这些将在下面进行更详细地论述。
在一个实施方案中，多特异性分子形式包括本领域已知的那些多特异性分子形式和本文所述的多特异性分子形式，诸如其中所述分子形式选自包含以下分子形式或由以下分子形式组成的组：双抗体、sc双抗体、三抗体、三体、四抗体、串联scFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、串联scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc双抗体-Fc、sc双抗体-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVDIg，在下文中对所述分子形式进行了更详细地论述。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体分子不包含Fc结构域，即不包含CH2和CH3结构域，例如该分子选自下述中：串联scFv、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv didsFv、双抗体、ds双抗体、dids双抗体、sc双抗体(也称为(scFv)2)、dssc双抗体、三抗体、ds三抗体、dids三抗体、trids三抗体、四抗体、ds四抗体、dids四抗体、trids四抗体、tetrads四抗体、三体、ds三体、dids三体、Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv、Fab单接头Fv(如WO2014/096390中公开的)、Fab’单接头Fv、FabdsFv、Fab’dsFv、Fab-scFv(也称为双靶向抗体)、Fab’scFv、FabdsscFv、Fab’dsscFv、FabdidsscFv、Fab’didsscFv、FabscFv单接头Fv、Fab’scFv单接头Fv、FabdsscFvs单接头Fv、Fab’dsscFv单接头Fv、FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv、FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv、diFab、diFab’(包括化学缀合的diFab’)、(FabscFv)2、(Fab)2scFvdsFv、(Fab)2dsscFvdsFv、(FabdscFv)2、微型抗体、ds微型抗体、dids微型抗体、双抗体-CH3、ds双抗体-CH3、dids双抗体-CH3、sc双抗体-CH3、dssc双抗体-CH3、didssc双抗体-CH3、串联scFv-CH3、串联dsscFv-CH3、串联didsscFv-CH3、串联tridsscFv-CH3和串联tetradsscFv-CH3。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含Fc结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子包含如下文所述的改变的Fc结构域。
除非上下文另有明确说明，否则本文使用的Fc结构域通常是指–(CH2CH3)2。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含-CH2CH3片段。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含CH2结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含CH3结构域。
如本文以生物化学意义使用的分子，是指形成有机、特别是蛋白质性物质的一组原子，其包括在合适的条件下一旦形成复合物就适合作为单一实体进行操作的复合物，例如由两条或多条多肽链形成的复合物。
除非上下文另有说明，否则分子和构建体在本文中可互换使用。虽然，构建体可以更经常地用于指多核苷酸分子，而分子可以更经常地用于指主要包含氨基酸序列的实体。
本文使用的特异性(或特异性的)是指其中相互作用中的伴侣仅相互识别或相对于非伴侣彼此具有显著更高的亲和力，例如是例如背景结合水平或结合另一种无关蛋白的亲和力的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍。
本文使用的"结合结构域"是指能够结合靶抗原的结合区，通常是多肽，例如具有足够的亲和力以将所述结构域表征为对所述抗原特异。
任何合适的结合结构域可用于本发明的多特异性分子中。这些可源自任何合适的来源。
在一个实施方案中，生物相容性框架结构用于本公开的分子的结合结构域中，这样的结构基于除免疫球蛋白结构域之外的蛋白质支架或骨架。例如，可使用基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋白、新制癌菌素(neocarzinostain)、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域和tendramisat结构域的那些(参见例如Nygren和Uhlen，1997,Current Opinion in Structural Biology,7,463-469)。
本文使用的术语‘多特异性分子’还可以包括基于生物学支架的结合剂，包括Adnectins、Affibodies、Darpins、Phylomers、Avimers、适体、Anti calins、Tetranectins、微体、Affilins和Kunitz结构域。本发明的多特异性分子通常是多特异性抗体分子，即所述多特异性分子的至少一个或多个结合结构域衍生自抗体或其片段。
当结合结构域衍生自抗体时，本文所用的“结合结构域或位点”是抗体中与抗原接触的部分。在一个实施方案中，结合结构域含有至少一个可变结构域或其衍生物，例如可变结构域对或其衍生物的对，诸如可变结构域的同源对或其衍生物。通常这是VH/VL对。
可变区(本文中也称为可变结构域)通常包含3个CDR和合适的框架。在一个实施方案中，结合结构域包含两个可变区，一个轻链可变区(VL)和一个重链可变区(VH)，并且这些元件一起促成抗体或结合片段的结合相互作用的特异性。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子中的结合结构域中的可变结构域是同源对。
本文使用的"同源对"是指作为预先形成的对从宿主分离的可变结构域的重链和轻链对(或其衍生物，诸如其人源化形式)。该定义不包括从文库中分离的可变结构域，其中不保留来自宿主的原始配对。同源对可能是有利的，因为它们通常在宿主中经历亲和力成熟，并且因此可以比选自文库诸如噬菌体文库的可变结构域对的组合对它们所特异针对的抗原具有更高的亲和力。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子中的结合结构域是天然存在的结合结构域的衍生物。
本文所用的"天然存在的结构域的衍生物"意指其中天然存在的序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸已经被替换或缺失，例如以优化结构域的性质，这可通过诸如消除不期望的性质但是其中保留了结构域的表征特征而实现。修饰的实例是去除糖基化位点、GPI锚或暴露于溶剂的赖氨酸的那些修饰。这些修饰可通过用保守氨基酸取代替换相关的氨基酸残基来实现。
CDR中的修饰可以例如包括用例如丝氨酸残基替代一个或多个半胱氨酸。Asn可以是用于脱氨的底物，并且可以通过用替代性氨基酸替换Asn和/或相邻氨基酸(诸如保守取代)来降低这种倾向。可以对CDR中的氨基酸Asp进行异构化。可以通过用替代氨基酸替换Asp或相邻氨基酸(例如保守取代)来使后者最小化。
在本说明书的上下文中，可变区的人源化形式也是其衍生物。人源化可包括非人框架替换为人框架和任选地一个或多个残基回复突变至"供体残基"。本文使用的供体残基是指在从宿主分离的原始可变区中发现的残基，特别是用供体框架中相应位置中的氨基酸替换人框架中的给定氨基酸。
在一个实施方案中，结合结构域或每个结合结构域是抗体或抗体片段的一部分(被包括或掺入在其中)。
在一个实施方案中，本公开的分子中的结合结构域存在于免疫球蛋白/抗体分子中。
本文所用的"抗体分子"包括抗体及其结合片段。
在一个实施方案中，本文所用的术语"抗体"是指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点(本文中也称为结合位点或结合结构域)特异性结合靶抗原(诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、肽等)的免疫球蛋白分子。
本文使用的"抗体片段"是指抗体结合片段，包括但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体、scFv、Fv、二价、三价或四价抗体、Bis_scFv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任何抗体的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug DesignReviews-Online 2(3),209-217)。
本文所用的"结合片段"是指这样的片段，所述片段能够以足以将片段表征为对肽或抗原特异的亲和力结合所述靶肽或抗原。
用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域熟知的(参见例如Verma等，1998,Journal of Immunological Methods,216:165-181)。用于本公开的其它抗体片段包括W005/003169、W005/003170和W005/003171中所述的Fab和Fab'片段。多价抗体可以包含多种特异性，例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如W092/22853、W005/113605、W02009/040562和W02010/035012)。
本文所用的术语"Fab片段"是指包含轻链的VL(轻链可变)结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段以及重链的VH(重链可变)结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。
Fv是指两个可变结构域，例如协作的可变结构域，诸如同源对或亲和力成熟的可变结构域，即VH和VL对。
本文所使用的协作的可变结构域是彼此弥补和/或两者促成抗原结合以使得Fv(VH/VL对)特异于针对所述抗原的可变结构域。
以下是可用于本公开的抗体分子中的示例性抗体形式的列表。
本文所用的"单结构域抗体"(本文中也称为dab和sdAb)是指由单个单体性可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的实例包括VH或VL或VHH。
本文所用的串联sdAb是指通过接头(例如肽接头)连接的两个结构域抗体，特别是其中结构域抗体对不同抗原具有特异性的情形。
本文所用的串联sdAb-sdAb是指通过两个接头(例如肽接头)串联连接的三个结构域抗体，特别是其中结构域抗体对不同抗原具有特异性的情形。
本文所用的dsFv是指具有可变区内二硫键的Fv。dsFv可以是较大分子的成分，例如可变结构域之一可以例如通过氨基酸接头连接到另一抗体片段/成分。
本文所用的(dsFv)2是指这样的dsFv，其一个结构域例如通过肽接头或二硫键(例如，两个VH的C末端之间)与第二dsFv中的结构域连接，形式类似于下述的(scFv)2,但每对可变区包含可变区内二硫键。
本文所用的组分是指本公开的多特异性分子的构建单元或部分，特别是其中该组分是抗体片段，诸如scFv、Fab或其他片段，特别是如本文所述的。
本文所用的单链Fv或缩写"scFv"是指包含被连接(例如通过肽接头)以形成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在该形式中省略了重链和轻链的恒定区。
本文所用的dsscFv是指具有可变区内二硫键的scFv。
本文所用的串联scFv(本文中也称为discFv或(scFv)2)是指经由单接头连接的两个scFv，使得存在单个Fv间接头，例如图9b所示。
本文所用的串联dsscFv(本文中也称为scFvdsscFv或dsscFvscFv)是指经由单接头连接的两个scFv，使得存在单个Fv间接头，例如图9b所示，并且其中scFv之一具有可变区内二硫键。
本文所用的串联didsscFv(本文中也称为didsscFv)是指通过单接头连接的两个scFv，使得存在单个Fv间接头，例如图9b所示，并且其中每个scFv包含可变区内二硫键。
本文所用的scFv-dsFv是例如通过肽接头连接到Fv结构域的scFv，所述Fv结构域由通过二硫键连接以形成dsFv的两个可变结构域组成。在该形式中，scFv的VH或VL可以连接dsFv的VH或VL。
本文所用的dsscFv-dsFv是例如通过肽接头连接Fv结构域的dsscFv，所述Fv结构域由通过二硫键连接以形成dsFv的两个可变结构域组成。在该形式中，dsscFv的VH或VL可以连接到dsFv的VH或VL。
本文所用的双抗体指具有两个Fv间接头的两个Fv对VH/VL，使得第一Fv的VH连接到第二Fv的VL，并且第一Fv的VL连接到第二Fv的VH。
本文所用的ds双抗体是指包含可变区内二硫键的双抗体。
本文所用的dids双抗体是指包含两个可变区内二硫键的双抗体，即每对可变区之间有一个ds。
本文所用的sc-双抗体是指包含Fv内接头的双抗体，使得所述分子包含三个接头并形成两个正常scFv，例如VH1接头VL1接头VH2接头VL2。
本文所用的dssc-双抗体是指具有可变区内二硫键的sc-双抗体。
本文所用的didssc-双抗体是指在每对可变区之间具有可变区内二硫键的sc-双抗体。
本文所用的Dart是指VL1接头VH2接头和VH1接头VL2,其中VH1和VH2的C末端通过二硫键连接，Paul A.Moore等，Blood,2011；117(17):4542-4551。
本文所用的是指包含以下形式的两对可变结构域的分子：来自对1的结构域(例如VH1)经由接头连接来自对2的结构域(例如VH2或VL2)，所述第二结构域经由接头连接来自对1的其它结构域(例如VL1)进而连接来自对2的剩余结构域(即VL2或VH2)。
di双抗体，参见Nunez-Prado等，特别是其中图1中的第25号分子。
本文所用的dsdi-双抗体是具有可变区内二硫键的di双抗体。
本文所用的didsdi-双抗体是在每对可变区之间具有可变区内二硫键的di-双抗体。
本文所用的三抗体是指与双抗体类似地包含三个Fv和三个Fv间接头的形式。
本文所用的ds三抗体是指在可变结构域对中之一之间包含可变区内二硫键的三抗体。
本文所用的dids三抗体是指包含两个可变区内二硫键的三抗体，即在两个可变结构域对中的每一个之间有一个ds。
本文所用的trids三抗体是指包含三个可变区内二硫键的三抗体，即在每对可变区之间有一个ds。
本文所用的四抗体是指与双抗体类似地包含四个Fv和四个Fv间接头的形式。
本文所用的ds四抗体是指在可变结构域对中之一之间包含可变区内二硫键的四抗体。
本文所用的dids四抗体是指包含两个可变区内二硫键的四抗体，即在两个可变结构域对的每一对之间有一个ds。
本文所用的trids四抗体是指包含三个可变区内二硫键的四抗体，即在三对可变区的每一对之间有一个ds。
本文所用的tetrads四抗体是指包含四个可变区内二硫键的四抗体，即在每个可变结构域之间有一个ds。
本文所用的三体(也称为Fab(scFv)2)是指具有附加到轻链C端的第一scFv和附加到重链C端的第二scFv的Fab片段。
本文所用的ds三体是指在两个位置之一中包含dsscFv的三体。
本文所用的dids三体或TrYbe是指包含两个dsscFv的三体。
本文所用的dsFab是指具有可变区内二硫键的Fab。
本文所用的dsFab'是指具有可变区内二硫键的Fab'。
scFab是单链Fab片段。
scFab'是单链Fab'片段。
dsscFab是为单链的dsFab。
dsscFab'是为单链的dsFab'。
本文所用的Fabdab是指具有任选地经由接头附加至其重链或轻链的结构域抗体的Fab片段。
本文所用的Fab'dab是指具有任选地经由接头附加至其重链或轻链的结构域抗体的Fab'片段。
本文所用的FabFv是指具有附加至以下中每一个的C末端的另外的可变区的Fab片段：重链的CH1和轻链的CL，参见例如W02009/040562。该形式可以其聚乙二醇化的形式提供，参见例如W02011/061492。
本文所用的Fab'Fv与FabFv类似，其中Fab部分被Fab'替换。该形式可以其聚乙二醇化的形式提供。
本文所用的FabdsFv是指FabFv，其中Fv内二硫键稳定所附加的C末端可变区，参见例如W02010/035012。该形式可以提供为其聚乙二醇化的形式。
本文所用的Fab单接头Fv和Fab'单接头是指连接至可变结构域的Fab或Fab'(例如通过肽接头)，并且所述可变结构域经由可变结构域内二硫键连接至第二可变结构域从而形成dsFv，参见例如W02014/096390。
本文所用的Fab-scFv(也称为双抗体)是具有附加至轻链或重链的C末端上的scFv(任选地经由接头)的Fab分子。
本文所用的Fab'-scFv是具有附加至轻链或重链的C末端上的scFv(任选地经由接头)的Fab'分子。
本文所用的FabdsscFv或BYbe是在单链Fv的可变区之间具有二硫键的FabscFv。
本文所用的Fab'dsscFv是在单链Fv的可变区之间具有二硫键的Fab'scFv。
本文所用的FabscFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的scFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab。
本文所用的Fab'scFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的scFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab'。
本文所用的FabdsscFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的dsscFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab。
本文所用的Fab'dsscFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的dsscFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab'。
本文所用的FabscFv单接头Fv是指一种Fab单接头Fv，其中Fv的结构域连接至Fab的重链或轻链，并且scFv连接至另一Fab链，并且Fv的结构域通过可变区内二硫键连接。
本文所用的FabdsscFv单接头Fv是指一种FabscFv单接头Fv，其中scFv包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab'scFv单接头Fv是指一种Fab'单接头Fv，其中Fv的结构域连接至Fab的重链或轻链，并且scFv连接至另一Fab链，并且Fv的结构域通过可变区内二硫键。
本文所用的Fab'dsscFv单接头Fv是指一种Fab'scFv单接头Fv，其中scFv包含可变区内二硫键。
本文所用的FvFabFv是指这样的Fab，其中第一Fv的结构域附加至Fab的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端。
本文所用的FvFab'Fv是指这样的Fab’，其中第一Fv的结构域附加至Fab'的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端。
本文所用的dsFvFabFv是指这样的Fab，其中第一Fv的结构域附加至Fab的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端，其中第一Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的FvFabdsFv是指这样的Fab，其中第一Fv的结构域附加至Fab的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端，其中第二Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的dsFvFab'Fv是指这样的Fab'，其中第一Fv的结构域附加至Fab'的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端，其中第一Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的FvFab'dsFv是指这样的Fab'，其中第一Fv的结构域附加至重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至Fab'的重链和轻链的C末端，其中第二Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的dsFvFabdsFv是指这样的Fab，其中第一Fv的结构域附加至Fab的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端，其中第一Fv包含可变区内二硫键，其中第二Fv也包含可变区内二硫键。
本文所用的dsFvFab'dsFv是指这样的Fab'，其中第一Fv的结构域附加至Fab'的重链和轻链的N末端，第二Fv的结构域附加至重链和轻链的C末端，其中第一Fv包含可变区内二硫键，其中第二Fv也包含可变区内二硫键。
本文所用的FabFvFv是指这样的Fab片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，参见例如W02011/086091。
本文所用的Fab'FvFv是指这样的Fab'片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，参见例如W02011/086091。
本文所用的FabdsFvFv是指这样的Fab片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，参见例如W02011/086091，其中直接附接至C末端的第一Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab'dsFvFv是指这样的Fab'片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，参见例如W02011/086091，其中直接附接至C末端的第一Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的FabFvdsFv是指这样的Fab片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，其中所述分子的"C"末端处的第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab'FvdsFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab'片段，其中所述分子的"C"末端处的第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的FabdsFvdsFv是指这样的Fab片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，其中第一和第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab'dsFvdsFv是指这样的Fab'片段，其具有两对Fv串联附加至重链和轻链的C末端，其中第一和第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的diFab是指经由它们的重链C末端连接的两个Fab分子。
本文所用的diFab'是指经由其铰链区的一个或多个二硫键连接的两个Fab'分子。
diFab和diFab'分子包括其化学缀合形式。
本文所用的(FabscFv)2是指具有附加至其上的两个scFv的diFab分子，例如附加至重链或轻链(诸如重链)的C末端。
本文所用的(Fab'scFv)2是指具有附加至其上的两个scFv的diFab'分子，例如附加至重链或轻链(诸如重链)的C末端。
本文所用的(Fab)2scFvdsFv是指具有附加的scFv和dsFv的diFab，例如来自重链C末端中每一个的一个的。
本文所用的(Fab')2ScFvdsFv是指具有附加的scFv和dsFv的diFab'，例如来自重链C末端中每一个的一个。
本文所用的(Fab)2dsscFvdsFv是指具有附加的dsscFv和dsFv的diFab，例如来自重链C末端。
本文所用的(Fab')2dsscFvdsFv是指具有附加的dsscFv和dsFv的diFab'，例如来自重链C末端。
本文所用的微型抗体是指(VL/VH-CH3)2。
本文所用的ds微型抗体是指(VL/VH-CH3)2,其中一个VL/VH包含可变区内二硫键。
本文所用的dids微型抗体是指(dsFv-CH3)2。
kappa/lambda体和κ/λ-体呈具有两条重链和两条轻链的正常IgG的形式，其中两条轻链彼此不同，一条是λ轻链(VL-CL)，另一条是κ轻链(VK-CK)。如WO2012/023053所述，重链即使在CDR也是相同的。
本文所用的scFv-Fc是指例如经由铰链附加至恒定区片段–(CH2CH3)的CH2结构域的N末端的scFv，使得该分子具有2个结合结构域。
本文所用的dsscFv-Fc是指例如经由铰链附加至恒定区片段-(CH2CH3)2的CH2结构域的N末端的dsscFv和附加至恒定区片段-(CH2CH3)2的第二CH2结构域的N末端的scFv，使得该分子具有2个结合结构域。
本文所用的didsscFv-Fc是指例如经由铰链附加至恒定区片段-(CH2CH3)2的CH2结构域的N末端的scFv，使得该分子具有2个结合结构域。
本文所用的串联scFv-Fc是指两个串联的scFv，其中每一个(例如经由铰链)串联附加至恒定区片段–(CH2CH3)的CH2结构域的N末端，使得该分子具有4个结合结构域。
本文所用的sc双抗体-Fc是两个sc双抗体，其中每一个例如经由铰链附加至恒定区片段–(CH2CH3)的CH2结构域的N末端。
本文所用的scFv-Fc-scFv是指四个scFv，其中每个之一附加至CH2CH3片段的重链和轻链二者的N末端和C末端。
本文所用的sc双抗体-CH3是指各自例如经由铰链连接至CH3结构域的两个sc双抗体分子。
本文使用的IgG-scFv是全长抗体，其在每条重链或每条轻链的C末端上具有scFv。
本文所用的scFv-IgG是在重链中每一条或轻链中每一条的N末端上具有scFv的全长抗体。
本文所用的V-IgG是在每一条重链或每一条轻链的N末端上具有可变结构域的全长抗体。
本文所用的IgG-V是在每一条重链或每一条轻链的C末端上具有可变结构域的全长抗体。
DVD-Ig(也称为双V结构域IgG)是具有4个另外的可变结构域的全长抗体，每个可变结构域在每条重链和每条轻链的N末端上。
本文所用的Duobody或'Fab臂交换'是双特异性IgG形式抗体，其中在混合后两种不同单克隆抗体的恒定结构域(通常为CH3)中的匹配的和互补的工程化氨基酸改变导致异二聚体的形成。作为残基工程化的结果，来自第一抗体的重链:轻链对将优选与第二抗体的重链:轻链对缔合。参见例如W02008/119353、W02011/131746和W02013/060867。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体分子是具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚体系链；
：是X与Y之间的结合相互作用；
A是选自Fab或Fab'片段的双特异性的第一蛋白质组分；
B是选自Fab或Fab'的双特异性的第二蛋白质组分；
X是独立选自抗原或抗体或其结合片段的结合对的第一结合伴侣；和
Y是独立选自抗原或抗体或其结合片段的结合对的第二结合伴侣；
条件是当X是抗原时，Y是对由X代表的抗原特异的抗体或其结合片段，当Y是抗原时，X是对由Y代表的抗原特异的抗体或其结合片段。
在一方面，提供了多特异性抗体分子，其包含或由以下部分组成：
a)式(I)的多肽链：
VH-CH1-X-(V1)p；
式(II)的多肽链：
VL-CL-Y-(V2)q；
其中：
VH表示重链可变结构域；
CH1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；
X表示键或接头，例如氨基酸接头；
Y表示键或接头，例如氨基酸接头；
V1表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；
VL表示可变结构域，例如轻链可变结构域；
CL表示来自恒定区的结构域，例如轻链恒定区结构域，例如Cκ；
V2表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；
p是0或1；
q是0或1；以及
当p是1时，q是0或1，当q是1时，p是0或1，即p和q不能都表示0。
该形式先前在WO2015/19772中进行了描述。
在一个实施方案中，多特异性抗体分子包含选自VH/VL、V1或V2的针对CD79的不超过一个结合结构域。
在一个实施方案中，多特异性抗体分子包含不超过一个针对CD45的结合结构域和不超过一个针对CD79的结合结构域。
在一个实施方案中，多特异性抗体分子包含不超过一个针对CD22的结合结构域和不超过一个针对CD79的结合结构域。
在一个实施方案中，q是0并且p是1。
在一个实施方案中，q是1并且p是1。
在一个实施方案中，V1是dab，V2是dab，并且它们一起形成可变区的协同对(诸如同源VH/VL对)的单一结合结构域，其任选通过二硫键连接。
在一个实施方案中，VH和VL对CD79例如CD79a或CD79b是特异的。
在一个实施方案中，V1对CD79例如CD79a或CD79b是特异的。
在一个实施方案中，V2对CD79例如CD79a或CD79b是特异的。
在一个实施方案中，V1和V2一起(例如作为结合结构域)对CD79例如CD79a或CD79b是特异性的，VH和VL对CD45或CD22是特异的。
在一个实施例中，V1对CD45或CD22是特异的。
在一个实施例中，V2对CD45或CD22是特异的。
在一个实施方案中，V1和V2一起(例如作为一个结合结构域)对CD45或CD22是特异的，并且VH和VL对CD79是特异的。
在一个实施方案中，V1对CD45或CD22是特异的，V2对白蛋白是特异的，VH和VL对CD79是特异的。
在一个实施方案中，V1对白蛋白是特异的，V2对CD45是特异的，VH和VL对CD79是特异的。
在一个实施方案中，V1对CD79是特异的，V2对白蛋白是特异的，VH和VL对CD45或CD22是特异的。
在一个实施方案中，V1对白蛋白是特异的，V2对CD79是特异的，并且VH和VL对CD45或CD22是特异的。
在一个实施方案中，V1是对CD45或CD22特异的dsscFv，V2是对白蛋白特异的dsscFv，VH和VL对CD79是特异的。
在一个实施方案中，V1是对白蛋白特异的dsscFv，V2是对CD45或CD22特异的dscFv，VH和VL对CD79是特异的。
在一个实施方案中，V1是对CD79特异的dsscFv，V2是对白蛋白特异的dsscFv，VH和VL对CD45或CD22是特异的。
在一个实施方案中，V1是对白蛋白特异的dsscFv，V2是对CD79特异的dsscFv，VH和VL对CD45或CD22是特异的。
以上构建体中的V1、V2、VH和VL可各自表示结合结构域并且掺入本文提供的任何序列。
X和Y表示任何合适的接头，例如X和Y可以独立地为SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:339)或SGGGGTGGGGS(SEQ ID NO:340)。
在一个实施方案中，当V1和/或V2是dab、dsFv或dsscFv时，V1和/或V2的可变结构域VH与VL之间的二硫键形成于位置VH44和VL100之间。
当多特异性抗体分子中的一对或多对可变区包含VH与VL之间的二硫键时，这可以在任何合适的位置，诸如在下面列出的两个残基之间(除非上下文另有指示，否则在下面的列表中使用Kabat编号)。在任何提到Kabat编号的情况下，相关参考文献是Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health andHuman Services，NIH，USA。
在一个实施方案中，二硫键在选自以下的位置：
·VH37+VL95C，参见例如Protein Science 6，781-788 Zhu等(1997)；
·VH44+VL100，参见例如；Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等(1994)；或Journal of Biological Chemistry第269卷第28期第18327-18331页Reiter等(1994)；或Protein Engineering，第10卷第12期第1453-1459页Rajagopal等(1997)；
·VH44+VL105，参见例如J Biochem.118，825-831Luo等(1995)；
·VH45+VL87，参见例如Protein Science 6，781-788 Zhu等(1997)；
·VH55+VL101，参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等(1995)；
·VH100+VL50，参见例如Biochemistry 29 1362-1367Glockshuber等(1990)；
·VH100b+VL49；
·VH98+VL 46，参见例如Protein Science 6，781-788 Zhu等(1997)；
·VH101+VL46；
·VH105+VL43，参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90卷第7538-7542卷Brinkmann等(1993)；或Proteins 19，35-47 Jung等(1994)，
·VH106+VL57，参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等(1995)，
以及位于分子中的可变区对内与其对应的位置。
在一个实施方案中，二硫键在位置VH44与VL100之间形成。
本文使用的“单特异性的”是指仅结合靶抗原一次的能力。
因此，一个实施方案是本发明的多特异性分子对每种抗原是单特异性的。
因此在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子的结合结构域是单特异性的。这在一些治疗应用中是有利的，因为本公开的分子不能通过结合靶抗原多于一次来交联抗原。因此，在一个实施方案中，本公开的双特异性或多特异性分子不能通过在两个不同位置，例如在相同细胞或两个不同细胞上结合相同靶标两次而交联。
交联，特别是与同一细胞或不同细胞上的CD79b相关的交联，可以在体内产生信号，例如所述信号刺激靶抗原的活性。
在一个实例中，本发明的多特异性分子含有不超过一个针对CD22的结合结构域和不超过一个针对CD79的结合结构域。每个结合结构域是单特异性的。
因此，在一个实施方案中，所述多特异性分子对于CD22是单价的并且对于CD79是单价的。
在一个实例中，本发明的多特异性分子含有不多于一个针对CD45的结合结构域和不多于一个针对CD79的结合结构域。每个结合结构域是单特异性的。
因此在一个实例中，所述多特异性分子对于CD45是单价的并且对于CD79是单价的。
在一个实施方案中，用于本公开的多特异性分子中的每种抗体或抗体片段是单价的。
因此在一个实施方案中，本公开的多特异性分子的结合结构域是单价的。
因此，在一个实施方案中，本公开的多特异性分子的结合结构域是单价和单特异性的。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子由以任何合适的方式组合或连接(以构建多特异性分子，例如如上文所述的)的两个或更多个单特异性单价结合结构域如Fab、Fab'、scFv、VH、VL、VHH、Fv、dsFv组成。
在另一个实施方案中，例如在本公开的分子包含至少三个结合结构域的情况下，则两个或三个结合结构域(例如抗体、片段或抗体与片段的组合)可以具有不同的抗原特异性，例如与三种不同的靶抗原的结合。
因此，本发明还提供了如下段落中所述的多特异性分子
1.包含对抗原CD22特异的结合结构域和对抗原CD79a和/或CD79b特异性的结合结构域的多特异性分子，其中对抗原CD79a和/或CD79b特异的结合结构域包含3个重链CDR，其具有SEQ ID NO:8中给出的CDRH1的序列，SEQ ID NO:9中给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:4中给出的CDRH3的序列。
2.包含对抗原CD22特异的结合结构域和对抗原CD79a和/或CD79b特异的结合结构域的多特异性分子，其中对抗原CD79b特异的结合结构域包含3个重链CDR，其具有SEQ IDNO:11中给出的CDRH1的序列，SEQ ID NO:12中给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:13中给出的CDRH3的序列。
3.根据段落1的多特异性分子，其中对CD79b特异的结合结构域包含3个轻链CDR，其具有SEQ ID NO:13中给出的CDRL1的序列，SEQ ID NO:14中给出的CDRL2的序列和SEQ IDNO:15、16、17或18中给出的CDRL3的序列。
4.根据段落2的多特异性分子，其中对CD79b特异的结合结构域包含3个轻链CDR，其具有SEQ ID NO:19中给出的CDRL1的序列，SEQ ID NO:20中给出的CDRL2的序列和SEQ IDNO:21、22、23或24中给出的CDRL3的序列。
5.根据段落1-4中任一段落的多特异性分子，其中一个或多个结合结构域包含对相关抗原特异的抗体可变区。
6.根据段落1-5中任一段落的多特异性分子，其中每个结合结构域包含两个抗体可变结构域。
7.根据段落6的多特异性分子，其中所述两个抗体可变结构域是VH/VL对。
8.根据段1至7中任一段落的多特异性分子，其中所述分子是双特异性或三特异性的。
9.根据段1至8中任一段落的多特异性分子，其中所述分子是融合蛋白。
10.根据段落1至9中任一段落的多特异性分子，其中所述分子形式选自双抗体、sc双抗体、三抗体、串联scFv、FabFv、Fab'Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2diFab、diFab'、三体、串联的scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc双抗体-Fc、sc双抗体-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVD-Ig。
11.根据段1至10中任一段落的多特异性分子，其中每个结合结构域是单特异性的。
12.根据段落1至11中任一段落的多特异性分子，其中所述多特异性分子包含不多于一个对CD22特异的结合结构域和不多于一个对CD79a和/或CD79b特异的结合结构域。
13.根据段1至12中任一段落的多特异性分子，其中对CD22特异的结合结构域和对CD79a和/或CD79b特异的结合结构域独立地选自Fab、scFv、Fv、dsFv和dsscFv。
14.根据段落1-13中任一段落的多特异性分子，其中对CD22特异的结合结构域包含来自本文提供的抗CD22抗体的3个重链CDR和3个轻链CDR。
15.根据段落1至14中任一段的多特异性分子，其中所述结合结构域被人源化。
16.根据段1至15中任一段的多特异性分子，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸取代。
17.根据段落16所述的多特异性分子，其中一个或多个半胱氨酸残基已被另一个氨基酸取代。
18.根据段落16或17的多特异性分子，其中一个或多个天冬氨酸异构化位点和/或天冬酰胺脱酰胺位点和/或糖基化位点已通过取代一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸而被去除。
19.根据段落1至18中任一段的多特异性分子，其还包含对血清白蛋白诸如人血清白蛋白特异的结合结构域。
20.一种组合物，其包含段落1至19中任一段所定义的一种或多种多特异性蛋白质。
21.一种核苷酸序列，其编码如段落1至21中任一段所定义的多特异性蛋白质或其组分。
22.一种载体，其包含段落21中定义的核苷酸序列。
23.根据段落1至22中任一段落所述的多特异性蛋白质或根据段落20所述的组合物，其用于治疗。
24.根据段落1-19中任一段的多特异性蛋白质或根据段落20的组合物用于制备用于治疗，特别是用于治疗本文所述的病症或病况的药物中的用途。
25.一种治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的根据段落1-19中任一段落的多特异性蛋白质或根据段落20的组合物。
因此，本发明还提供如下段落中所述的多特异性分子
26.一种包含对抗原CD45特异的结合结构域和对抗原CD79a和/或CD79b特异的结合结构域的多特异性分子，其中对抗原CD79a和/或CD79b特异性的结合结构域包含3个重链CDR，其具有SEQ ID NO:8中给出的CDRH1的序列，SEQ ID NO:9中给出的CDRH2的序列和SEQID NO:4中给出的CDRH3的序列。
27.一种包含对抗原CD45特异的结合结构域和对抗原CD79a和/或CD79b特异的结合结构域的多特异性分子，其中所述对抗原CD79b特异的结合结构域包含3个重链CDR，其具有SEQ ID NO:11中给出的CDRH1的序列，SEQ ID NO:12中给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDRH3的序列。
28.根据段落1所述的多特异性分子，其中对CD79b特异的结合结构域包含3个轻链CDR，其具有SEQ ID NO:13中给出的CDRL1的序列，SEQ ID NO:14中给出的CDRL2的序列和SEQ ID NO:15、16、17或18中给出的CDRL3的序列。
29.根据段落2所述的多特异性分子，其中对CD79b特异的结合结构域包含3个轻链CDR，其具有SEQ ID NO:19中给出的CDRL1的序列，SEQ ID NO:20中给出的CDRL2的序列和SEQ ID NO:21、22、23或24中给出的CDRL3的序列。
30.根据段落26-29中任一段的多特异性分子，其中一个或多个所述结合结构域包含对相关抗原特异的抗体可变区。
31.根据段落26-30中任一段的多特异性分子，其中每个结合结构域包含两个抗体可变结构域。
32.根据段落31的多特异性分子，其中所述两个抗体可变结构域是VH/VL对。
33.根据段落26至32中任一段的多特异性分子，其中所述分子是双特异性或三特异性的。
34.根据段落26至33中任一段落的多特异性分子，其中所述分子是融合蛋白。
35.根据段落26至34中任一段的多特异性分子，其中所述分子形式选自双抗体、sc双抗体、三抗体、串联scFv、FabFv、Fab'Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2diFab、diFab'、三体、串联的scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc双抗体-Fc、sc双抗体-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVD-Ig。
36.根据段落26至35中任一段的多特异性分子，其中每个结合结构域是单特异性的。
37.根据段落26至36中任一段落的多特异性分子，其中所述多特异性分子包含不多于一个特异于CD45的结合结构域和不多于一个特异于CD79a和/或CD79b的结合结构域。
38.根据段落26至37中任一段的多特异性分子，其中对CD45特异的结合结构域和对CD79a和/或CD79b特异的结合结构域独立地选自Fab、scFv、Fv、dsFv和dsscFv。
39.根据段落26至38中任一段的多特异性分子，其中对CD45特异的结合结构域包含来自本文提供的抗CD45抗体的3个重链CDR和3个轻链CDR。
40.根据段落26至39中任一段的多特异性分子，其中所述结合结构域被人源化。
41.根据段落26至40中任一段的多特异性分子，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸已被另一个氨基酸取代。
42.根据段落41的多特异性分子，其中一个或多个半胱氨酸残基已被另一种氨基酸取代。
43.根据段落41或42的多特异性分子，其中一个或多个天冬氨酸异构化位点和/或天冬酰胺脱酰胺位点和/或糖基化位点已经通过取代一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸而被去除。
44.根据段落26至43中任一段的多特异性分子，其还包含对血清白蛋白诸如人血清白蛋白特异的结合结构域。
45.一种组合物，其包含段落26至44中任一段所定义的一种或多种多特异性蛋白质。
46.一种核苷酸序列，其编码如段落26至45中任一段所定义的多特异性蛋白质或其组分。
47.一种载体，其包含段落46中定义的核苷酸序列。
48.根据段落26至44中任一段的多特异性蛋白质或根据段落45的组合物，其用于治疗。
49.根据段落36-44中任一段的多特异性蛋白质或根据段落45的组合物在制备用于治疗，特别是用于治疗本文所述的病症或病况的药物中的用途。
50.一种治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的根据段落26至44中任一段所述的多特异性蛋白质或根据段落45所述的组合物。
恒定区
可考虑所提出的多特异性抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择本发明的抗体分子的抗体恒定区结构域(如果存在的话，例如全长抗体或多特异性分子中)。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子意欲用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。
应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用如Angal等，1993，Molecular Immunology，1993，30:105-108中所述的其中位置241处的丝氨酸已经改变为脯氨酸的IgG4分子。因此，在其中抗体是IgG4抗体的实施方案中，抗体可包括突变S241P。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，抗体轻链包含κ或λ的CL结构域。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且抗体轻链包含κ或λ的CL结构域。
四种人IgG同种型以不同的亲和力结合激活性Fcγ受体(FcγRI，FcγRIIa，FcγRIIIa)，抑制性FcγRIIb受体和补体的第一组分(C1q)，产生非常不同的效应子功能(Bruhns P.等，2009.Specificity and affinity of human Fcgamma receptors andtheir polymorphic variants for human IgG subclasses.Blood.113(16):3716-25)，也参见Jeffrey B.Stavenhagen等Cancer Research 2007 Sep 15；67(18):8882-90。
IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对于FeγR和C1q结合是至关重要的，并且在IgG2和IgG4中具有独特的序列。已经显示，在位置233-236处的IgG2残基和在位置327、330和331处的IgG4残基对人IgG1的取代大大降低了ADCC和CDC(Armour KL等，1999.Recombinant human IgG molecules lackingFcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities.Eur JImmunol.29(8):2613-24和Shields RL.等，2001.High resolution mapping of thebinding site on human IgG1for Fc gamma RI,Fc gamma RII,Fc gamma RIII,and FcRnand design of IgG1variants with improved binding to the Fc gamma R.J BiolChem.276(9):6591-604)。此外，Idusogie等证明了在不同位置(包括K322)的丙氨酸取代显著降低了补体激活(Idusogie EE.等，2000.Mapping of the C1q binding site onrituxan,a chimeric antibody with a human IgG1 Fc.J Immunol.164(8):4178-84)。类似地，鼠IgG2A的CH2结构域中的突变显示降低与FcγRI和C1q的结合(Steurer W.等，1995.Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotesgraft tolerance.J Immunol.155(3):1165-74)。
在一个实施方案中，所使用的Fc区是突变的，特别是本文所述的突变。在一个实施方案中，突变是去除结合和/或效应子功能。
在一个实施方案中，Fc突变选自：去除Fc区结合的突变，增加或去除效应子功能的突变，增加半衰期的突变及其组合。
在pH 6.0、但不是pH 7.4下选择性结合FcRn的一些抗体在各种动物模型中表现出较高的半衰期。位于CH2与CH3结构域之间的界面的几个突变，诸如T250Q/M428L(Hinton PR.等，2004.Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives inprimates.J Biol Chem.279(8):6213-6)和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro C.等，2005.Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivoantibody levels.Nat Biotechnol.23(10):1283-8)，已经显示在体内增加对FcRn的结合亲和力和IgG1的半衰期。
然而，在增加的FcRn结合与改善的半衰期之间并不总是有直接的关系(Datta-Mannan A.等，2007.Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Propertiesto the Neonatal Fc Receptor:Relationship to Pharmacokinetics in Mice andPrimates.Drug Metab.Dispos.35:86–94)。
IgG4亚类显示降低的Fc受体(FcγRIIIa)结合，其他IgG亚类的抗体通常显示强结合。这些其它IgG亚型中降低的受体结合可以通过改变、例如替换选自Pro238、Aps265、Asp270、Asn270(Fc糖的丢失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435的一个或多个氨基酸而实现。
在一个实施方案中，根据本公开的分子具有IgG亚类(例如IgG1、IgG2或IgG3)的Fc，其中Fc在一个、两个或所有以下位置S228、L234和/或D265中突变。
在一个实施方案中，Fc区中的突变独立选自S228P、L234A、L235A、L235A、L235E及其组合。
减少或增加Fc区的效应子功能可能是比较期望的。对于靶向细胞表面分子、特别是免疫细胞上的那些分子的抗体，需要消除效应子功能。在一些实施方案中，例如为了治疗自身免疫，通过增加阴性Fc受体(FcgRIIb或CD32b)结合增强免疫细胞上的Fc结合可能是需要的，参见Stavenhagen JB等，Advances in Enzyme Regulation 2007 December 3和VeriMC等Arthritis Rheum,2010 Mar 30；62(7):1933-43。相反，对于预期用于肿瘤学使用的抗体，增加效应子功能可以改善治疗活性。
已经在人IgG1的CH2结构域中产生了许多突变，并且在体外测试了它们对ADCC和CDC的影响(Idusogie EE.等，2001.Engineered antibodies with increased activityto recruit complement.J Immunol.166(4):2571-5)。值得注意的是，据报道在位置333处的丙氨酸取代增加ADCC和CDC二者。Lazar等描述了对FcγRIIIa具有更高亲和力并对FcγRIIb具有更低亲和力从而导致增强的ADCC的三重突变体(S239D/I332E/A330L)(Lazar GA.等，2006.Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.PNAS103(11):4005–4010)。使用相同的突变产生具有增加的ADCC的抗体(Ryan MC.等，2007.Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasmacells.Mol.Cancer Ther.,6:3009–3018)。Richards等研究了具有改善的FcγRIIIa亲和力FcγRIIa/FcγRIIb比率的略微不同的三重突变体(S239D/I332E/G236A)，其介导巨噬细胞增强的靶细胞吞噬作用(Richards JO等2008.Optimization of antibody binding toFcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther.7(8):2517-27)。
由于缺乏效应子功能，IgG4抗体代表合适的用于受体阻断而没有细胞耗尽的IgG亚类。IgG4分子可在称为Fab臂交换的动态过程中交换半分子。这种现象可以在治疗性抗体与内源性IgG4之间发生。已经显示S228P突变防止这种重组过程，从而允许设计不可预测性降低的治疗性IgG4抗体(Labrijn AF.等，2009.Therapeutic IgG4 antibodies engage inFab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo.Nat Biotechnol.27(8):767-71)。该技术可用于产生双特异性抗体分子。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。频繁的修饰是由于羧肽酶的作用(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所述的)而导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的丢失。因此，抗体重链的C末端赖氨酸可能不存在。
亲和力
本发明提供了抗CD79抗体分子。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域对CD79a是特异的。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域对CD79b是特异的。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域对CD79复合物是特异的，即其识别存在于复合物中且对其具有特异性的表位，例如包含CD79与CD79b之间相互作用的表位。
CD79a(也称为免疫球蛋白α和B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链)是已知的蛋白质。CD79a的表达限于B淋巴细胞。人序列在UniProt条目号P11912(SEQ ID NO:245和没有信号序列的SEQ ID NO:245的氨基酸33-226)下可获得。鼠形式在UniProt条目号11911下可获得。本公开涉及来自任何物种，特别是人的所有形式的CD79a和其任何天然变体。在一个实施方案中，CD79a指该蛋白质的人形式。
CD79b(也称为免疫球蛋白相关β和分化簇79B)是一种已知的蛋白质。CD79b的表达限于B淋巴细胞。人序列在UniProt条目号P40259(SEQ ID NO:298和没有信号序列的SEQ IDNO:298的氨基酸29-229)下可获得。鼠形式在UniProt条目号P15530下可获得。本公开涉及来自任何物种、特别是人的所有形式的CD79b和其任何天然变体。在一个实施方案中，CD79b指该蛋白质的人形式。
在一个实施方案中，对CD79特异的结合结构域结合CD79a。
在一个实施方案中，对CD79特异的结合结构域结合CD79b。
在一个实施方案中，对CD79特异的结合结构域结合CD79a和CD79b的复合物。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD79的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD79a的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD79b的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
本发明的多特异性分子可包含对抗原CD22特异的结合结构域和对抗原CD79a和/或CD79b特异的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域对CD22是特异的。
CD22(也称为分化簇-22)是一种已知的蛋白质。CD22是B细胞受体(BCR)的抑制性共受体，其在确立B细胞活化的信号传导阈值方面起着关键作用。人序列在UniProt条目号P20273(SEQ ID NO:244和没有信号肽的SEQ ID NO:244的氨基酸20-847)下可获得。鼠形式在UniProt条目P35329下可获得。本公开涉及来自任何物种，特别是人的所有形式的CD22和其天然变体。在一个实施方案中，CD22是指蛋白质的人形式。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD22的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强，特别是50pM或更强。
CD79的结合结构域可以结合CD79a和/或CD79b。
应该理解的是，结合结构域对CD22的亲和力可以与所述结合结构域对CD79的亲和力相同或不同。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域对CD45是特异的。
CD45(也称为PTPRC)是一种已知的蛋白质。CD45是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员。已知PTP是调节多种细胞过程(包括细胞生长、分化、有丝分裂周期和致癌转化)的信号传导分子。该PTP包含细胞外结构域、单个跨膜区段和两个串联细胞质内催化结构域，因此属于受体类型PTP。存在CD45的各种同种型：CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)。CD45RA位于初始T细胞上，CD45RO位于记忆T细胞上。CD45剪接变体同种型A、B和C在人B细胞上差异表达。CD45是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员：其胞内(COOH-末端)区域含有两个PTP催化结构域，并且由于外显子4、5和6(分别称为A、B和C)的选择性剪接加上不同水平的糖基化，细胞外区域是高度可变的。检测到的CD45同种型是细胞类型、成熟和活化状态特异性的。一般而言，蛋白质(A、B或C)的长形式在初始或未活化的B细胞上表达，而CD45(RO)的成熟或截短形式在活化的或成熟/记忆B细胞上表达。
人序列在UniProt条目号P08575下可获得，并且在本文中提供于SEQ ID NO:10或缺少信号肽的SEQ ID NO:10中的氨基酸24-1304中。鼠形式在UniProt条目号P06800下可获得。本公开涉及来自任何物种的所有形式的CD45。在一个实施方案中，CD45是指蛋白质的人形式以及其天然变体和同种型。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD45的亲和力为约100nM或更强，例如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强，特别是50pM或更强的结合亲和力。
在一个实施方案中，加工本公开的多特异性抗体分子或其抗体/片段成分以提供改善的对一种或多种靶抗原的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟操作方案获得，包括突变CDR(Yang等，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等，Bio/Technology,10,779-783,1992)、大肠杆菌(E.coli)突变菌株的使用(Low等，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等(同上)讨论了这些亲和力成熟方法。
抗体及其产生
用于本发明的结合结构域可以通过本领域已知的任何合适的方法产生，例如CDR可以取自非人抗体(包括市售的抗体)并且移植到人框架中，或者可以用非人可变区和人恒定区制备嵌合抗体等。
通常，用于本发明的结合结构域是来源于结合所选抗原的抗体的结合结构域，诸如结合CD22、CD45或者CD79a和/或CD79b的抗体。
CD22、CD45和CD79抗体的实例是本领域已知的，并且这些可以直接用于本发明的分子中，或者使用本文所述的方法筛选适合性，并且随后如果需要则使用本文所述的方法进行修饰，例如进行人源化。临床中的CD22抗体的实例包括依帕珠单抗和伊珠单抗。本领域已经描述了其它治疗性抗体，例如US2003202975和WO14/011520中公开的抗CD22抗体、WO14011521和WO15021089中公开的抗CD79b抗体。非人抗CD22抗体包括来自克隆SP104的兔单克隆抗体LS-C2210357(LSBio)、来自克隆4C3的小鼠单克隆LS-C174778、小鼠单克隆LS-C4802、来自克隆1B1的小鼠单克隆LS-B9996、来自克隆2E6的小鼠单克隆LS-C340404、小鼠单克隆LS-C312263、小鼠单克隆LS-C152867、小鼠单克隆LS-C87523、来自克隆FRB4的小鼠单克隆LS-C134333、小鼠单克隆LS-C134336、来自克隆HIB22的小鼠单克隆LS-C40961、小鼠单克隆LS-C134332、来自Santa Cruz Biotechnology的以下抗体：sc-271579、sc-377304、sc-7032、sc-18909、sc-7932、sc-7323、sc-7307、sc-7031、sc-20053、sc-189000、sc-136440、sc-136507、sc-53031、sc-73363、sc-53032、Abcam兔单克隆Ab33859(EP498Y)、小鼠单克隆抗体AA 1-687目录号ABIN1999423、来自Biolegend工位号V CD22.14的小鼠单克隆抗体(来自克隆HIB22)。
市售的抗CD79a抗体包括来自克隆HM57的小鼠单克隆LS-B4504(LSBio)、小鼠单克隆LS-B8330、小鼠单克隆LS-C44954、兔单克隆LS-B9093、来自克隆JCB117的小鼠单克隆LS-B8513、来自克隆SP18的兔单克隆LS-C210607、来自克隆5E2的小鼠单克隆LS-C175441、来自克隆3D3的小鼠单克隆LS-C338670、来自克隆HM47/A9的小鼠单克隆LS-C88120、小鼠单克隆LS-C191714、小鼠单克隆LS-C87592、小鼠单克隆LS-C44955、小鼠单克隆LS-C95934、小鼠单克隆LS-C121584、小鼠单克隆LS-C121585、小鼠单克隆LS-C204347、小鼠单克隆LS-C88122、Abcam小鼠单克隆ab3121[HM47/A9]、兔单克隆ab79414和兔单克隆ab133483。
市售的CD79b抗体包括小鼠单克隆Abcam抗体ab33295、大鼠单克隆ab23826、小鼠单克隆ab103422、兔单克隆ab134103、兔单克隆ab134147和兔单克隆ab183343。
CD45抗体的实例包括大鼠单克隆YTH54、YTH25.4、来自Miltenyi克隆5B1和克隆30F11的小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体YAML568，来自BD Bioscience，小鼠单克隆抗体克隆2D1目录号347460、来自Novus小鼠单克隆抗体5D3A3目录号NBP2-37293、小鼠单克隆抗体HI30目录号NBP1-79127、小鼠单克隆抗体4A8A4C7A2目录号NBP1-47428、小鼠单克隆抗体2B11目录号NBP2-32934、大鼠单克隆抗体YTH24.5目录号NB100-63828、兔单克隆抗体Y321目录号NB110-55701、小鼠单克隆抗体PD7/26/16目录号NB120-875、来自Santa Cruz的小鼠单克隆抗体、来自克隆B8目录号sc-28369、来自克隆F10-89-4目录号sc-52490的小鼠单克隆抗体、来自克隆H-230目录号sc-25590的兔单克隆抗体、来自克隆N-19目录号sc-1123的山羊单克隆抗体、来自克隆OX1目录号sc-53045的小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体(T29/33)目录号sc-18901、大鼠单克隆抗体(YAML501.4)目录号sc65344、大鼠单克隆抗体(YTH80.103)目录号sc-59071、小鼠单克隆抗体(351C5)目录号sc-53201、小鼠单克隆抗体(35-Z6)目录号sc-1178、小鼠单克隆抗体(158-4D3)目录号sc-52386、抗CD45RO的小鼠单克隆抗体(UCH-L1)目录号sc-1183、抗CD45RO的小鼠单克隆抗体(2Q1392)目录号sc-70712。
CD45抗体也公开在WO2005/026210、WO02/072832和WO2003/048327中，通过引用并入本文。
此类市售的抗体可以是发现其它治疗性抗体的有用工具。
技术人员可使用本领域已知的任何合适的方法产生用于本发明的多特异性分子的抗体。
用于产生例如用于免疫宿主或用于淘选(诸如在噬菌体展示中)的抗体的抗原多肽可通过本领域熟知的方法从包含表达系统的遗传工程改造的宿主细胞制备，或者可从天然生物来源回收它们。在本申请中，术语"多肽"包括肽、多肽和蛋白质。除非另有说明，否则这些可互换使用。在一些情况下，抗原多肽可以是较大蛋白质(诸如融合蛋白(例如与亲和标签或类似物融合的融合蛋白)的一部分。在一个实施方案中，可用转染了相关蛋白或多肽(例如用CD79a和CD79b共转染的)的细胞(诸如成纤维细胞)免疫宿主。
可以获得针对抗原多肽产生的抗体，其中动物的免疫是必需的，其通过使用众所周知的常规操作方案将多肽施用于动物，优选非人动物来施行(参见例如Handbook ofExperimental Immunology，D.M.Weir(编辑)，第14卷，Blackwell ScientificPublishers,Oxford，England，1986)。可以免疫许多温血动物，诸如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，所述方法是诸如杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975,Nature,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等1983,Immunology Today,4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96页，Alan R Liss,Inc.,1985)。
还可使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生(通过例如由Babcook,J.等1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377所述的方法)的免疫球蛋白可变区cDNA来产生抗体。
还可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生用于本公开的抗体，所述抗体包括由以下公开的那些抗体：Brinkman等(于J.Immunol.Methods,1995,182:41-50中)、Ames等(J.Immunol.Methods,1995,184:177-186)、Kettleborough等(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958)、Persic等(Gene,1997187 9-18)、Burton等(Advances in Immunology,1994,57:191-280)以及WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401和US 5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743、5,969,108和WO20011/30305。
在一个实例中，本公开的多特异性分子是完全人的，特别是一个或多个可变结构域是完全人的。
完全人分子是这样的抗体，其中重链和轻链二者的可变区和恒定区(如果存在)都是人来源的，或基本上与人来源的序列相同，但不必来自同一抗体。完全人抗体的实例可包括例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，其中所述小鼠中鼠免疫球蛋白可变区和任选地恒定区基因已被其的人对应物替代(例如如EP0546073、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP 0438474和EP0463151中概述的)。
在一个实例中，根据本公开的多特异性分子的结合结构域是人源化的。
本文使用的人源化(其包括CDR移植抗体)是指具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的分子(参见例如US 5,585,089；W091/09967)。应当理解，可能仅需要转移CDR的特异性决定残基而不是整个CDR(参见例如，Kashmiri等，2005,Methods,36,25-34)。人源化抗体可任选地还包含一个或多个来源于CDR所源自的非人物种的框架残基。
本文所用的术语"人源化抗体分子"是指其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如鼠或兔单克隆抗体抗体)移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中的一个或多个CDR(如果需要的话，包括一个或多个经修饰的CDR)的抗体分子。有关综述参见Vaughan等，Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移整个CDR，而是只有一个或多个来自本文上述任何一个CDR的特异性决定残基被转移到人抗体框架(参见例如，Kashmiri等，2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自一个或多个本文上述CDR的特异性决定残基转移到人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自上文描述的每个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。
当CDR或特异性决定残基被移植时，考虑到CDR所源自的供体抗体的类别/类型，可以使用任何合适的受体可变区框架序列(包括小鼠、灵长类动物和人框架区)。合适地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体框架区以及本文提供的一个或多个CDR的可变结构域。
可用于本公开的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等，同上)。例如，KOL和NEWM可以用于重链，REI可以用于轻链以及EU、LAY和POM可以用于重链和轻链二者。或者，可使用人种系序列；这些可在以下网址获得：http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php。
在本公开的人源化抗体分子中，受体重链和轻链不一定需要衍生自同一抗体，并且如果需要，可以包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。
框架区不需要具有与受体抗体完全相同的序列。例如，稀有残基可以改变为该受体链类别或类型的更频繁存在的残基。或者，可以改变受体框架区中的选定残基，使得它们对应于在供体抗体中相同位置处发现的残基(参见Reichmann等，1998,Nature,332,323-324)。这样的变化应保持在恢复供体抗体亲和力所需的最小值。在W091/09967中阐述了用于在受体框架区中选择可能需要改变的残基的操作方案。
框架的衍生物可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸用替代氨基酸(例如用供体残基)替换。
供体残基是来自供体抗体(即，CDR最初所源自的抗体)的残基，特别是采用来自供体序列的相应位置处的残基。供体残基可以被源自人受体框架的合适残基(受体残基)替换。
抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等设计的系统进行编号。在Kabat等，1987,in Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department ofHealth and Human Services,NIH,USA(下文称为"Kabat等(同上)")中阐述了该系统。该编号系统用于本说明书中，除非另有说明。
Kabat残基命名并不总是与氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可以包含比严格的Kabat编号中的更少或额外的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的结构组分(无论框架还是互补决定区(CDR))的缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列进行比对，可以确定给定抗体的残基的正确Kabat编号。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等同于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另有说明，否则本文所用的“CDR-H1”是指残基26至35，如由Kabat编号系统和Chothia拓扑环定义的组合所描述的。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。
在一个实例中，提供了对CD79特异的、包含重链可变区(例如VH)的结合结构域，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:11中给出的序列，CDR H2具有SEQID NO:12中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO:3中给出的序列。
在一个实施方案中，提供了对CD79特异的、包含重链可变区(例如VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR：对于CDR H1的SEQ ID NO:8、对于CDR H2的SEQ ID NO:9和对于CDR H3的SEQ ID NO:4。
在一个实施方案中，提供了对CD79特异的、包含轻链可变区(例如VL)的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDR L1的SEQ ID NO:19、对于CDR L2的SEQ IDNO:20和对于CDR L3的SEQ ID NO:21。
在一个实施方案中，提供了对CD79特异的、包含轻链可变区(例如VL)的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:13，对于CDRL2的SEQID NO：14和对于CDRL3的SEQ ID NO:15。
在一个实例中，提供了对CD79特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:11中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:12中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:3中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:19中给出的序列，CDR L2具有SEQ IDNO:20中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:21、22、23或24中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD79特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:11中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:12中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:3中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有序列SEQ ID NO:19中给出的序列，CDR L2具有SEQID NO:20中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:21中给出的序列。
在一个实例中，提供了包含一个或多个结合结构域的抗CD79抗体或其片段，所述结合结构域包含SEQ ID NO 11、12、3、19、20和21中给出的CDR。
在一个实例中，提供了对CD79特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:8中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:9中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:4中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:13中给出的序列，CDR L2具有SEQ IDNO:14给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:15中给出的序列。
在一个实例中，提供了含有一个或多个结合结构域的抗CD79抗体或其片段，所述结合结构域包含SEQ ID NO 8、9、4、13、14和15中给出的CDR。
在一个实例中，提供了包含对CD79特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:8中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:9中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:4中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:13中给出的序列，CDR L2具有SEQID NO:14给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:15、16、17或18中给出的序列。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体分子被人源化并且掺入了本文描述的CDR或其变体。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子中使用的重链可变区人框架选自IGHV3-48、IGHV4-59、IGHV3-66和其中任一个的变体，其中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸用除半胱氨酸外的氨基酸取代，例如用原始供体抗体(例如来自在SEQ ID NO:31或38中提供的供体VH序列)中相应位置处的残基取代。通常人框架还包含合适的J区序列，诸如JH4或JH2 J区。
在一个实施方案中，可在一个或多个位置诸如选自位置24、37、48、49、67、71、73和78的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个位置(诸如至少位置73和78处的取代)，例如全部位置24、48、49、73和78(特别适合于IGHV3-66)或全部位置24、48、49、71、73和78(特别适合于IGHV3-48)或全部位置37、49、67、71、73、76和78或全部位置37、67、71、73、76和78(特别适合于IGHV4-59)处产生VH框架中的取代(特别地与上文所述的重链抗CD79 CDR一起使用)。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置24是缬氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置37是缬氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置48是异亮氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置49是甘氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置67是苯丙氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置71是赖氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置71是精氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置73是丝氨酸。
在一个实施方案中，取代后VH框架的位置78是缬氨酸。
应该理解，可将这些取代中的一个或多个组合以产生用于本发明抗体分子的人源化VH区。
在一个实施方案中，人源化VH可变结构域包含独立地选自SEQ ID NO:34、35、41和42的序列。
在一个实施方案中，将VH的残基1改变成谷氨酸以有利于所述序列的加工。
在一个实施方案中，本公开的人源化抗体分子中采用的轻链可变区人框架选自IGKV1-6、IGKV1D-13和其中任一种的变体，其中一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸被除半胱氨酸外的氨基酸取代，例如被原始供体抗体(例如来自SEQ ID NO:29或36中提供的供体VL序列)的相应位置处的供体残基取代。通常人框架还包含合适的J区，诸如JK4 J区。
在一个实施方案中，本公开的抗体分子中使用(例如以接受轻链抗CD79 CDR)的人VL框架包含在至少一个位置(诸如选自位置2、3、34、46、49和70中的1、2、3、4、5或6个位置)处取代的氨基酸，例如其中框架中的原始氨基酸被除半胱氨酸外的另一种氨基酸取代，特别是对供体抗体的框架中相应位置处的残基取代。
在一个实施方案中，所使用的人VL框架是IGKV1框架并且在至少位置3和70处具有取代。
在一个实施方案中，所使用的人VL框架(诸如IGKV1框架)在位置2、3、36、46、49和70(特别适合于IGKV1D-13)或位置3和70(特别适合于IGKV1-6)处具有取代。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置2是谷氨酰胺。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置3是缬氨酸或天冬氨酸。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置36是亮氨酸。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置46是谷氨酰胺。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置49是组氨酸。
在一个实施方案中，取代后VL框架的位置70是谷氨酰胺。
应当理解的是，可将这些取代中的一个或多个组合以产生用于本发明抗体的人源化VL区。
在一个实施方案中，人源化VL可变结构域包含独立地选自SEQ ID NO:33或40的序列。
在一个实施方案中，人源化VL可变结构域包含独立地选自SEQ ID NO:33、40、341、342和343的序列。
在一个实施方案中，提供了包含独立地选自SEQ ID NO:34和35的VH和具有SEQ IDNO:33所示序列的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含独立地选自SEQ ID NO:34和35的VH和具有SEQ IDNO:250所示序列的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含独立地选自SEQ ID NO:41和42的VH和具有SEQ IDNO:40所示序列的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，提供了包含独立地选自SEQ ID NO:41和42的VH和独立选自SEQ ID NO:40、341、342和343的VL的抗体分子。
应该理解的是，这些人源化的移植可变区(SEQ ID NO 41、42、40、341、342和343)可被进一步修饰以减少供体残基的数目并用原始人残基取代它们。
因此，在一个实例中，提供了包含独立地选自SEQ ID NO:40、341、342和343的VL的抗体分子，其中位置3处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置70处的残基已被天冬氨酸(D)取代。
在一个实例中，提供了包含含有SEQ ID NO:41中给出的序列的VH的抗体分子，其中位置24处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置48处的残基已被天冬氨酸(D)和/或位置49处的残基被丝氨酸(S)取代和/或位置73处的残基已被天冬酰胺(N)替代和/或位置78处的残基已被亮氨酸(L)替代。
在一个实例中，提供了包含含有SEQ ID NO:42中给出的序列的VH的抗体分子，其中位置37处的残基已被异亮氨酸(I)替代和/或位置67处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置71处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置73处的残基已被苏氨酸(T)替代和/或位置78处的残基已被苯丙氨酸(F)替代。
在一个实例中，提供了包含含有SEQ ID NO:41中给出的序列的VH(其中位置24处的残基已被谷氨酰胺(Q)替换和/或位置48处的残基已被天冬氨酸(D)替代和/或位置49处的残基已被丝氨酸(S)替代和/或位置73处的残基已被天冬酰胺(N)替代和/或位置78处的残基已被亮氨酸(L)替代)和含有独立地选自SEQ ID NO:40、341、342和343序列的序列或者独立地选自SEQ ID NO:40、341、342和343序列的序列、(其中位置3处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置70处的残基已被天冬氨酸(D)替代)的VL的抗体分子。
在一个实例中，提供了包含含有SEQ ID NO:42中给出的序列的VH(其中位置37处的残基已被异亮氨酸(I)替换和/或位置67处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置71处的残基已被缬氨酸(V)替代和/或位置73处的残基已被苏氨酸(T)替代和/或位置78处的残基已被苯丙氨酸(F)替代)和含有独立地选自SEQ ID NO:40、341、342和343序列的序列、或者独立地选自SEQ ID NO:40、341、342和343序列(其中位置3处的残基已被谷氨酰胺(Q)替代和/或位置70处的残基已被天冬氨酸(D)替代)的VL的抗体分子。
在一个实施方案中，本发明提供了包含如上文所述的CD79结合结构域和CD22结合结构域(诸如下文所述的结合结构域)或其变体的多特异性分子。
在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子包含对CD22特异的结合结构域，所述结构结构域包含选自SEQ ID NO:43、44、45、46、47、60、61、62、63、64、65、72、73、74、75、76、101、102、103、104、105、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、136、137、138、139、140、141、142、143和144的3个重链CDR。
在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子包含对CD22特异的结合结构域，所述结构结构域包含选自SEQ ID NO:48、49、50、66、67、68、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、106、107、108、126、127、128、145、146和147的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子包含对CD22特异的结合结构域，所述结构结构域包含选自SEQ ID NO:43、44、45、46、47、60、61、62、63、64、65、72、73、74、75、76、101、102、103、104、105、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、136、137、138、139、140、141、142、143和144的3个重链CDR和选自SEQ ID NO:48、49、50、66、67、68、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、106、107、108、126、127、128、145、146和147的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:43或44、对于CDRH2的SEQ ID NO:45或46以及对于CDRH3的SEQ ID NO:47。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:60或61、对于CDRH2的SEQ ID NO:62或63以及对于CDRH3的SEQ ID NO:64或65。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:72或73、对于CDRH2的SEQ ID NO:74或75以及对于CDRH3的SEQ ID NO:76。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:101或102、对于CDRH2的SEQ IDNO:103或104以及对于CDRH3的SEQ ID NO:105。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:116、对于CDRH2的SEQ ID NO:117、118、119、120、121或122以及对于CDRH3的SEQ ID NO:123、124或125。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:136或137、对于CDRH2的SEQ IDNO:138、139、140、141、142和143以及对于CDRH3的SEQ ID NO:144。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:48、对于CDRL2的SEQ ID NO:49以及对于CDRL3的SEQ ID NO:50。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:66、对于CDRL2的SEQ ID NO:67以及对于CDRL3的SEQ ID NO:68。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO：77、对于CDRL2的SEQ ID NO：78以及对于CDRL3的SEQ ID NO:79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:106、对于CDRL2的SEQ ID NO:107以及对于CDRL3的SEQ ID NO:108。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:126、对于CDRL2的SEQ ID NO:127以及对于CDRL3的SEQ ID NO:128。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:145、对于CDRL2的SEQ ID NO:146以及对于CDRL3的SEQ ID NO:147。
在一个实例中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR，其中CDRH1具有SEQ ID NO:43或44中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:45或46中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:47中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:48中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:49中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:50中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:60或61中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:62或63中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:64或65中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:66中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:67中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:68中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:72或73中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:74或75中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:76中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:77中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:78给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:101或102中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:103或104中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:105中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:106中给出的序列，CDRL2具有SEQ ID NO:107中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:108中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:116中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:117、118、119、120、121或122中给出的序列并且CDR H3具有SEQ IDNO:123、124或125中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:126中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:127中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:128中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD22特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO:136或137中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:138、139、140、141、142或143中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:144中给出的序列，所述轻链可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:145中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:146中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:147中给出的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含如上文所述的CD79结合结构域和CD45结合结构域(诸如下文所述的结合结构域)的多特异性分子。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:155或156、对于CDRH2的SEQ IDNO:157、158、159、160、161、162、163或164以及对于CDRH3的SEQ ID NO:165。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:178或179、对于CDRH2的SEQ IDNO:180或181以及对于CDRH3的SEQ ID NO:182。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:195、对于CDRH2的SEQ ID NO:196或197以及对于CDRH3的SEQ ID NO:198。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)的结合结构域，所述重链可变区包含3个重链CDR：对于CDRH1的SEQ ID NO:212或213、对于CDRH2的SEQ IDNO:214或215以及对于CDRH3的SEQ ID NO:216、217、218或219。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:166、对于CDRL2的SEQ ID NO:167以及对于CDRL3的SEQ ID NO:168、169或170。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:183、对于CDRL2的SEQ ID NO:184以及对于CDRL3的SEQ ID NO:185、186或187。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:199、对于CDRL2的SEQ ID NO:200以及对于CDRL3的SEQ ID NO:201、202、203或204。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的、包含轻链可变区的结合结构域，所述轻链可变区包含3个轻链CDR：对于CDRL1的SEQ ID NO:220、221、222或223、对于CDRL2的SEQID NO:224以及对于CDRL3的SEQ ID NO:225。
在一个实例中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR、其中CDR H1具有SEQ ID NO:155或156中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:157、158、159、160、161、162、163或164中给出的序列并且CDRH3具有SEQ ID NO:165中给出的序列，所述轻链可变区具有3个CDR，其中CDR L1具有SEQ IDNO:166中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:167中给出的序列并且CDR L3具有SEQ IDNO:168、169或170中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR、其中CDR H1具有SEQ ID NO:178或179中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:180或181中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:182中给出的序列，所述轻链可变区具有3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:183中给出的序列，CDRL2具有SEQ ID NO:184中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:185、186或187中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR、其中CDR H1具有SEQ ID NO:195中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:196或197中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:198中给出的序列，所述轻链可变区具有3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:199中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:200中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO:201、202、203或204中给出的序列。
在一个实例中，提供了对CD45特异的、包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合结构域，所述重链可变区包含3个CDR、其中CDR H1具有SEQ ID NO:212或213中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO:214或215中给出的序列并且CDR H3具有SEQ ID NO:216，217，218或219中给出的序列，所述轻链可变区具有3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO:220、221、222或223中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO:224中给出的序列并且CDR L3具有SEQID NO:225中给出的序列。
在一个实施方案中，提供了对CD79b特异的抗体分子，其包含选自SEQ ID NO:33和34、33和35、250和34、250和35、40和41以及40和42的VL和VH对。
在一个实施方案中，提供了对CD79b特异的抗体分子，其包含选自SEQ ID NO:341和41、341和42、342和41、342和42、343和41以及343和42的VL和VH对。
在一个实施方案中，提供了对CD22特异的抗体分子，其包含选自SEQ ID NO:55和56、55和246、55和247、55和248、69和70、69和71、69和251、69和252、69和253、69和254、98和99、98和100、98和255、98和256、113和114、113和115、113和257、113和258、133和134、133和135、133和259、133和260、152和153、152和154、152和261以及152和262的VL和VH对。
在一个实施方案中，提供了对CD45特异的抗体分子，其包含选自SEQ ID NO:175和176、175和177、175和263、175和264、192和193、192和194、192和265、192和266、209和211、209和267、209和268、209和269、210和211、210和267、210和268、210和269、230和232、230和270、230和271、230和272、231和232、231和270、231和271以及231和272的VL和VH对。
在一个实例中，本发明提供了包含对抗原CD79特异的结合结构域和对抗原CD22特异的结合结构域的多特异性分子，其中该结合结构域对包含来自CD79抗体的6个CDR和来自CD22抗体的6个CDR，所述抗体对选自以下所列的CD79和CD22抗体对：4447和4120、4447和4126、4447和4127、4447和4128、4447和4130、4447和4132、4450和4120、4450和4126、4450和4127、4450和4128、4450和4130以及4450和4132。
在一个实例中，本发明提供了包含对抗原CD79特异的结合结构域和对抗原CD45特异的结合结构域的多特异性分子，其中该结合结构域对包含来自CD79抗体的6个CDR和来自CD45抗体的6个CDR，所述抗体对选自以下所列的CD79和CD45抗体对：4447和4122、4447和4129、4447和4131、4447和4133、4450和4122、4450和4129、4450和4131以及4450和4133。
本文和图51中提供了这些CD79抗体(抗体4447和抗体4450)的序列，包括VH、VL和CDR序列。在本文中提供了这些CD22抗体(抗体4120、4126、4127、4128、4130、4132)的序列，包括VH、VL和CDR序列，它们可以组合为本发明分子中的结合结构域。本文提供了包括VH、VL和CDR序列的这些CD45抗体(抗体4122、4129、4131和4133)的序列，它们可以组合为本发明分子中的结合结构域。
在一个实施方案中，提供了包含具有本文公开的序列的一对可变结构域的可变结构域或结合结构域。
在一个实例中，提供了对白蛋白特异的结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:240中给出的序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO:242中给出的序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中，对一个或多个结合结构域进行人源化。
在一个实例中，本文提供的一个或多个CDR可以被修饰以除去不需要的残基或位点，诸如半胱氨酸残基或天冬氨酸(D)异构化位点或天冬酰胺(N)脱酰胺位点。
例如，任何一个CDR中的一个或多个半胱氨酸残基可被另一个氨基酸如丝氨酸取代。
在一个实例中，天冬酰胺脱酰胺位点可以通过使天冬酰胺残基(N)和/或相邻残基突变为任何其他合适的氨基酸而从一个或多个CDR中去除。在一个实例中，天冬酰胺脱酰胺位点诸如NG或NS可被突变例如成NA或NT。
在一个实例中，天冬氨酸异构化位点可通过使天冬氨酸残基(D)和/或邻近的残基突变成任何其它合适的氨基酸而从一个或多个CDR中去除。在一个实例中，天冬氨酸异构化位点诸如DG或DS可被突变成例如EG、DA或DT。
在一个实例中，可通过将天冬酰胺残基(N)突变成任何其它合适的氨基酸(例如SLS或QLS)来去除N-糖基化位点(诸如NLS)。在一个实例中，通过使丝氨酸残基(S)突变成除苏氨酸(T)外的任何其他残基，可去除N-糖基化位点诸如NLS。
本领域技术人员能够在任何合适的测定(诸如本文所述的测定)中测试CDR或人源化序列的变体，以确认活性是否得以维持。
可使用任何合适的测定(例如ELISA或表面等离子体共振方法，诸如BIAcore，其中可以测量与抗原(CD22或CD79)的结合)来测试对抗原的特异性结合。此类测定可以使用分离的天然或重组CD22或CD79(a和/或b)或合适的融合蛋白/多肽。在一个实例中，可使用重组CD22(诸如SEQ ID NO:244中提供的序列或SEQ ID NO:244的氨基酸20-847)或CD79(诸如SEQ ID NO:245和SEQ ID NO:298(CD79b)中提供的序列以及SEQ ID NO:245的氨基酸33-226和SEQ ID NO:298的氨基酸29-229)或CD45(诸如本文SEQ ID NO:10中提供的序列或没有信号肽的SEQ ID NO:10的氨基酸24-1304)，通过例如表面等离子体共振(诸如BIAcore)来测量结合。或者，可在细胞(诸如HEK细胞)上表达所述蛋白质，并使用基于流式细胞术的亲和力测定来测量亲和力。
本发明提供的抗体序列可以用于鉴定另外的抗体，从而鉴定适用于本发明的抗体分子诸如本发明的多特异性分子的结合结构域。交叉阻断根据本发明的抗体分子与CD79结合的抗体，特别是包含SEQ ID NO:38、41或42中给出的重链序列和SEQ ID NO:36或40中给出的轻链序列的抗体分子，或者包含SEQ ID NO:31、34或35中给出的重链序列和SEQ IDNO:29或33中给出的轻链序列的抗体分子，可以类似地用于结合CD79，因此是类似地有用的抗体(例如在本发明的多特异性分子中)。因此，本发明还提供了包含对抗原CD79b特异的结合结构域(其中CD79b的结合结构域交叉阻断了上文所述的任何一种抗体分子与CD79的结合和/或被那些抗体中的任一种交叉阻断与CD79的结合)，任选地还包含对抗原CD22或CD45特异的结合结构域的抗体分子。在一个实施方案中，这种抗体与上文所述的抗CD79抗体结合相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断抗体结合与被上文所述的抗CD79抗体结合的表位相邻接和/或重叠的表位。
类似地，交叉阻断根据本发明的抗体分子与CD22的结合的抗体，特别是包含表1所示的重链和相应的轻链的抗体分子：
因此，本发明还提供了包含对抗原CD22特异的结合结构域和对抗原CD79特异的结合结构域的多特异性分子，其中CD22的结合结构域交叉阻断上文所述的任一种抗体分子与CD22的结合和/或被那些抗体中的任何一种交叉阻断与CD22的结合。在一个实施方案中，这样的抗体与上文所述的抗体结合相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断抗体结合与被上文所述的抗体结合的表位相邻接和/或重叠的表位。
类似地，交叉阻断根据本发明的抗体分子与CD45的结合的抗体，特别是包含表2所示重链和相应轻链的抗体分子：
因此，在一个实例中，本发明还提供了多特异性分子，其包含对抗原CD45特异的结合结构域和对抗原CD79特异的结合结构域，其中CD45的结合结构域交叉阻断上文所述的任一种抗体分子与CD45的结合和/或被那些抗体中的任一种交叉阻断与CD45的结合。在一个实施方案中，这样的抗体与上文所述的抗体结合相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断抗体结合与被上文所述的抗体结合的表位相邻接和/或重叠的表位。
可使用本领域中任何合适的方法(例如通过使用竞争性ELISA或BIAcore测定，其中交叉阻断性抗体对抗原(CD22和/或CD45和/或CD79)的结合阻止本发明的抗体的结合或反之亦然)来鉴定交叉阻断性抗体。此类交叉阻断测定可使用细胞表达的分离的天然或重组的CD22、CD45或CD79(a和/或b)或合适的融合蛋白/多肽。在一个实例中，结合和交叉阻断使用重组CD22或其合适的片段或其天然变体(诸如SEQ ID NO:244中提供的序列或SEQ IDNO:244的氨基酸20-847中提供的序列)或CD79的序列(诸如SEQ ID NO:245中提供的序列或SEQ ID NO:245的氨基酸33-226中提供的序列(CD79a)和/或SEQ ID NO:298(CD79b)中提供的序列或SEQ ID NO:298的氨基酸29-229中提供的序列)来进行测量。
在一个实例中，使用重组CD45或其合适的片段或其天然变体(诸如SEQ ID NO:10中提供的序列或没有信号肽的SEQ ID NO:10的氨基酸24-1304)来测量结合和交叉阻断。
可选地或另外地，根据本发明的该方面的抗体可被本文公开的结合结构域(例如包含来源于表1中给出的重链可变序列和轻链序列的CDR)交叉阻断与抗原(CD22或CD79)的结合。
可选地或另外地，根据本发明的该方面的抗体可被本文公开的结合结构域(例如包含来源于表2中给出的重链可变序列和轻链序列的CDR)交叉阻断与抗原(CD45或CD79)的结合。
因此还提供了包含对抗原CD22特异的结合结构域和对抗原CD79b特异的结合结构域的多特异性分子，其中CD79b的结合结构域交叉阻断上文所述的任一种抗体分子与CD79b的结合/或被这些抗体中的任一种交叉阻断与CD79b的结合超过80％，例如超过85％，诸如超过90％，特别地超过95％，并且任选地其中CD22的结合结构域交叉阻断上文所述的任一种抗体分子与CD22的结合和/或被这些抗体中的任何一种交叉阻断与CD22的结合超过80％，例如超过85％，诸如超过90％，特别地超过95％。
此类交叉阻断抗体在功能测定中可具有与下文所述的多特异性抗体分子相当的活性。
因此还提供了包含对抗原CD45特异的结合结构域和对抗原CD79b特异的结合结构域的多特异性分子，其中CD79b的结合结构域交叉阻断上文所述的任一种抗体分子与CD79b的结合和/或被这些抗体中的任一种交叉阻断与CD79b的结合超过80％，例如超过85％，诸如超过90％，特别地超过95％，并且任选地其中CD45的结合结构域交叉阻断上文所述的任一种抗体分子与CD45的结合和/或被这些抗体中的任一种交叉阻断与CD45的结合超过于80％，例如超过85％，诸如超过90％，特别地超过95％。
此类交叉阻断抗体在功能测定中可具有与下文所述的多特异性抗体分子相当的活性。
本公开还扩展至本文公开的新型多肽序列，以及与其具有至少80％相似性或同一性，例如85％或更大，诸如90％或更大，特别地95％，96％，97％，98％或99％或更大的相似性或同一性的序列。
本文所用的"同一性"表示在比对序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间是相同的。本文所用的"相似性"表示在比对序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间具有相似类型。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以彼此取代的其他氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可以容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.，编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.，编辑，Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1，Griffin,A.M.和Griffin，H.G.，编辑，HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.编辑Devereux,J.,编辑，M Stockton Press,New York,1991，可从NCBI获得的BLASTTM软件(Altschul，S.F.等，1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish，W.&States，D.J.1993，Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等，1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等，1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang，J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。
因此，在一个实例中，本发明提供了抗体分子，其中轻链的可变结构域包含与SEQID NO:36、29、33、40或250的轻链可变结构域具有至少80％同一性或相似性的序列。
本发明还提供了抗体分子，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO:38、31、34、35、41或42的重链可变结构域具有至少80％同一性或相似性的序列。
在一个实例中，本发明提供了抗体分子，其中轻链的可变结构域包含与SEQ IDNO:36、29、33、40或250的轻链可变结构域具有至少80％同一性或相似性的序列，并且重链的可变结构域包含与SEQ ID NO:38、31、34、35、41或42的重链可变结构域具有至少80％同一性或相似性的序列。
此类序列与参考序列具有至少80％相似性或同一性，例如85％或更大，诸如90％或更大，特别地95％、96％、97％、98％或99％或更大相似性或同一性。
应当理解，可将本发明的抗体分子掺入其他分子形式或构建体中，其中本发明提供的结合结构域结合并由此靶向CD79。例如，本发明的结合区(例如片段诸如Fab或scFv)可用于体内重定向细胞，例如通过用嵌合抗原受体(CAR-T细胞)转导T细胞，然后将这些细胞转移到患者体内(Nat.Revs.Drug Disc.2015.14.499-509)。因此，本发明还提供了包含如本文所述的一个或多个结合结构域的嵌合抗原受体。
接头
本文中在一种情形下对接头的教导同样可以应用于其中使用接头的不同情形(诸如本发明的任何多特异性分子)下的接头。
在一个实施方案中，在本公开的分子中使用的接头是长度为50个残基或更少的氨基酸接头，例如选自序列273至336所示的序列。
表3.铰链接头序列
SEQ ID NO: 序列
273 DKTHTCAA
274 DKTHTCPPCPA
275 DKTHTCPPCPATCPPCPA
276 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
277 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
278 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
279 DKTHTCCVECPPCPA
280 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
281 DKTHTCPSCPA
表4.柔性接头序列
(S)在序列284至288中是任选的。
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:337)、PPPP(SEQ ID NO:338)和PPP。
其它接头示于表5中:
SEQ ID NO: 序列
323 DLCLRDWGCLW
324 DICLPRWGCLW
325 MEDICLPRWGCLWGD
326 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
327 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
328 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
329 EDICLPRWGCLWEDD
330 RLMEDICLPRWGCLWEDD
331 MEDICLPRWGCLWEDD
332 MEDICLPRWGCLWED
333 RLMEDICLARWGCLWEDD
334 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
335 RAPESFVCYWETICFERSEQ
336 EMCYFPGICWM
效应子分子
如果需要，可将用于本发明的多特异性分子与一个或多个效应子分子缀合。应当理解，效应子分子可以包含单个效应子分子或者两个或更多个这样的分子，所述两个或更多个这样的分子经连接以形成可以附接至本发明的多特异性分子上的单个部分。当期望获得连接至效应子分子的根据本公开的抗体或多特异性分子时，这可通过标准化学或重组DNA操作制备，其中将抗体片段直接或通过偶联剂连接至效应子分子。将此类效应子分子与抗体缀合的技术是本领域熟知的(参见，Hellstrom等，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等，编辑，1987，第623-53页；Thorpe等，1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括，例如在WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03/031581所述的那些。或者，当效应子分子是蛋白质或多肽时，可以使用重组DNA方法实现连接，例如在WO 86/01533和EP0392745中所述的。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子可以包含效应子分子。
本文所用的术语效应子分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白，例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、RNA及其片段、放射性核素，特别是放射性碘、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，诸如荧光化合物或者可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。
效应子分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括combrestatin、尾海兔素、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物碱、海绵抑制素、根霉素、软海绵素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春花新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普奈洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
效应子分子还包括但不限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿啼啶氨烯咪胺)、烧化剂(例如氮芥、三胺硫磷苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨曲霉素(AMC)、加利车霉素或倍癌霉素)和抗有丝分裂剂(例如长春花新碱和长春花碱)。
其它效应子分子可包括螯合放射性核素诸如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物诸如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。
其他效应子分子包括蛋白质、肽和酶。目标酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂合酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质诸如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活剂、血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素或内皮抑制蛋白、或生物应答调节剂诸如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。
其他效应子分子可包括可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层成像)和非放射性顺磁金属离子。关于可与抗体缀合用作诊断剂的金属离子，一般参见美国专利号4,741，900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一个实例中，效应子分子可以增加体内抗体的半衰期和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨上皮屏障至免疫系统的递送。这种类型的合适效应子分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如在W005/117984中所述的那些。
当效应子分子是聚合物时，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷、聚亚烯或聚氧化烯聚合物或者支链或非支链多糖，例如同多糖或异多糖。
可存在于上述合成聚合物上的特定的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)，诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
功能测定
通常用于本发明的合适的结合结构域可以通过在功能测定中测试一个或多个结合结构域对来鉴定。例如，可在一个或多个功能测定中测试抗CD79抗体分子，诸如包含对抗原CD22特异的结合结构域和对抗原CD79a和/或CD79b特异的结合结构域的多特异性分子。
本文所用的"功能测定"是可用于确定经受测定条件的蛋白质复合物、抗体复合物或抗体混合物的一种或多种所需性质或活性的测定。合适的功能测定可以是结合测定、细胞凋亡测定、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、补体依赖性细胞毒性(CDC)测定、细胞生长或增殖抑制(细胞抑制作用)测定、细胞杀伤(细胞毒性效应)测定、细胞信号传导测定、细胞因子产生测定、抗体生产和同种型转换以及细胞分化测定。
根据本公开的多特异性抗体的功效可以通过本领域普通技术人员通常已知的方法与此类模型中的个体抗体或抗体(或片段)的混合物进行比较。
功能测定可以根据需要重复多次以增强结果的可靠性。可以采用本领域技术人员已知的各种统计学检验来鉴定统计学显著的结果，从而鉴定具有生物功能的多特异性分子。
合适的功能测定的实例描述于本文的实施例中，并且包括测量本发明的多特异性分子在用抗IgM刺激后抑制B细胞活化的能力，如通过检测B细胞活化的标志物诸如磷酸化Akt表达、磷酸化P38表达、PLCγ信号传导、CD40表达、CD71表达和/或CD86表达所测量的。
当建立用于筛选的功能测定时，本领域技术人员可以设定合适的阈值，其中所鉴定的活性超过该阈值被认为是"命中"。在使用不止一种功能测定的情况下，可以将每种测定的阈值设定在合适的水平以建立可控的命中率。在一个实例中，命中率可以是3-5％。在一个实例中，当在B细胞活化测定中搜索抑制B细胞功能的结合结构域对时，所设定的标准可以是至少两个磷酸读出数据(phospho-readout)有至少30％抑制，如上文和本文实施例中所述的。
在一个实例中，本发明的抗体分子诸如多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化P38的抑制具有小于1nM的IC50，优选小于0.5nM的IC50。在一个实例中，该测定中多特异性分子的IC50小于0.05nM。
在一个实例中，本发明的抗体分子诸如多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化Akt的抑制具有小于1nM的IC50，优选小于0.1nM的IC50。在一个实例中，该测定中多特异性分子的IC 50小于0.05nM。
在一个实例中，本发明的抗体分子诸如多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化PLCγ2的抑制具有小于1nM的IC50，优选小于0.8nM的IC50。在一个实例中，该测定中多特异性分子的IC50小于0.05nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的CD71表达的抑制具有小于5nM的IC50，优选IC50小于3nM。在一个实例中，该测定中多特异性分子的IC50小于0.5nM。
在一个实例中，本发明的抗体分子诸如多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的CD40表达的抑制具有小于5nM的IC50。在一个实例中，该测定中多特异性分子的IC50小于0.5nM。
在一个实施例中，本发明的抗体分子诸如多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的CD86表达具有小于5nM的IC50，优选小于2nM的IC50。在一个实例中，该测定中多特异性分子的IC50小于0.5nM。
在一个实例中，本发明的抗体分子诸如多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中的CD71、CD40和CD86表达的抑制具有小于5nM的IC50，和/或对于抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化PLCγ2、P38和AKT具有小于1nM的IC50。
在一个实施方案中，体内测定法诸(例如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或细菌感染的啮齿动物或灵长类动物模型等)可用来测试本公开的分子。
下文描述了用于筛选和发现结合结构域的合适形式的实例。
本文使用的术语"生物功能"是指被测试的生物实体的天然活性或目的活性，例如细胞、蛋白质或类似物的天然活性。理想地，可以使用体外功能测定法(包括使用活哺乳动物细胞的测定)来测试功能的存在。本文所用的天然功能包括异常功能，诸如与癌症相关的功能。
本文使用的术语"协同功能"是指这样的生物活性，其在本公开的双特异性蛋白质复合物的第一和第二蛋白没有一起使用时没有被观察到，或者其高于前述活性，例如仅在双特异性形式中观察到的活性。因此，"协同"包括新的生物功能。
本公开提供了具有新的生物功能的具有至少针对CD22和CD79的特异性的分子。
本文所用的新的生物功能是指在两种或更多种协同实体[蛋白A和蛋白B]被放在一起(作为双特异性或其它方式)之前不明显或不存在的功能，或以前未鉴定的功能。
本文所用的更高是指活性增加，包括从零增加，即双特异性中的某种活性，其中一种或多种个体未复合双特异性组分在相关功能测定中没有活性，在本文也称为新活性或新的生物功能。本文所用的更高还包括相比于个体未复合双特异性组分或二价结合结构域，在相关功能测定中双特异性形式高于加和功能，例如相关活性增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更高。
在一个实施方案中，新的协同功能是更高的抑制活性。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体分子具有比单独或混合提供的针对CD45的二价结合结构域和针对CD79a的二价结合结构域的活性的总和更高的抑制活性。
本文所用的术语"肽"是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物，其中所述肽含有2至100个氨基酸，例如5至99个，诸如6至98个、7至97个或8至96个。在一个实施方案中，本公开中使用的肽是具有50个氨基酸残基或更少，例如40个、30个、10个氨基酸残基或更少的氨基酸序列。本公开中使用的肽具有足够长度以适合目的，例如如果肽是接头，则其需要适当长以允许其连接的片段发挥其生物功能；或者如果肽是结合伴侣，则其必须能够特异性结合另一个实体，诸如抗体。
本文所用的"功能测定"是可用于确定经受测定条件的蛋白质复合物、抗体复合物或抗体混合物的一种或多种所需性质或活性的测定。合适的功能测定可以是结合测定、细胞凋亡测定、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、补体依赖性细胞毒性(CDC)测定、细胞生长或增殖抑制(细胞抑制作用)测定、细胞杀伤(细胞毒性效应)测定、细胞信号传导测定、细胞因子产生测定、抗体生产和同种型转换以及细胞分化测定。在一个实施方案中，可以使用体内测定，诸如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或细菌感染的啮齿动物或灵长类动物模型等，来测试本公开的分子。
在双特异性抗体复合物的情形中，根据本公开的双特异性抗体分子的功效可以通过本领域普通技术人员通常已知的方法与此类模型中个体抗体或抗体(或片段)的混合物进行比较。
功能测定可以根据需要重复多次，利用或不利用具有特定双特异性抗体复合物的不同样品，以增强结果的可靠性。可以采用本领域技术人员已知的各种统计学检验来鉴定统计学显著的结果，从而鉴定具有生物功能的双特异性抗体复合物，特别是鉴定用于本发明的多特异性分子的最佳可变区对。
组合物和医疗用途
在一个方面，提供了根据本公开的分子或组分，诸如融合蛋白、异二聚体系链束缚的双特异性蛋白质复合物、包含本发明的分子的组合物，包括融合蛋白或所述双特异性蛋白质复合物，如本文定义的多元体(multiplex)、阵列、文库。
在一个实施方案中，本公开的分子，例如本文所述的抗体，多特异性分子和/或双特异性蛋白质复合物适合于治疗应用，并且可以提供用于治疗疾病的新疗法。因此，在另一方面，提供了本发明的分子，例如上述的双特异性蛋白质复合物，其用于治疗。包括本文所述的双特异性蛋白质复合物的本公开的分子适合于治疗一系列疾病，诸如癌症。
本公开的分子，包括本文所述的多特异性分子和双特异性蛋白质复合物，也特别适合于抑制B细胞功能，以便控制各种自身免疫疾病中的免疫和自身免疫反应。
因此，本公开扩展到治疗患者疾病的方法，包括施用治疗有效量的本公开的分子，例如本公开的多特异性分子或双特异性蛋白质复合物。
在一个方面，提供了包含一种或多种本公开分子，例如本公开的多特异性分子的药物组合物。
组合物中可包括各种不同的组分，包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。组合物可以任选地包含能够改变本发明的多特异性分子群体的特征、从而例如降低、稳定、延迟、调节和/或激活抗体功能的其它分子。组合物可以是固体或液体形式，并且尤其可以是粉末、片剂、溶液或气雾剂的形式。
本发明还提供了药物或诊断组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的抗体分子或多特异性分子。因此，提供了本发明的多特异性分子用于治疗和制造用于治疗病理性病况或病症的药物的用途。
病理学病况
病理学病况或病症可以例如选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫感染)，与感染相关的内毒素性休克、关节炎诸如类风湿性关节炎、哮喘诸如重症哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨盆炎性疾病、阿尔茨海默氏病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、中枢和周围神经系统的免疫介导的炎性病症诸如多发性硬化、狼疮(诸如系统性红斑狼疮)和吉兰-巴雷综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维性肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、梅尼埃病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦氏肉芽肿病、其它自身免疫性疾病、胰腺炎、创伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病包括缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少症和癌症,包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头颈癌、肾脏癌症，特别是肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌和甲状腺癌及其转移形式。
在一个实施方案中，所述病症是癌症，例如白血病，包括淋巴细胞白血病，诸如急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病；或髓性白血病，诸如急性髓性白血病或慢性髓性白血病。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病包括：-急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生病、肾上腺皮质功能不全、皮质醇减少症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、脊柱关节炎、施-马二氏病、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经障碍、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生性综合征(ALPS)、Canale-Smith综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎(AIP)、自身免疫性多内分泌腺综合征(I、II&III型)、自身免疫性视网膜病变(AR)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突/神经元神经病变、巴洛病、白塞氏综合征疾病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特尔曼氏疾病、乳糜泻、美洲锥虫病(chagasdisease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮(CP)、克罗恩病、炎症性肠病、结肠炎、肠炎、回肠炎、Cogans综合征、冷凝集病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、crest病、冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病变、疱疹样皮炎、杜氏病、皮肌炎、I型糖尿病、盘状红斑狼疮(DLE)、心肌梗死后综合征、子宫内膜异位症、大疱性表皮松解症(EB)和耳聋(EBA)、嗜酸性胃肠炎、食管炎、嗜酸性筋膜炎、舒曼综合征、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球性肾炎(非增殖性：局灶性节段性肾小球硬化和膜性肾小球肾炎。增殖性：IgA肾病)、肺出血-肾炎综合征、具有多发性血管炎的肉芽肿病(GPA)(以前称为韦氏肉芽肿病)、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、米勒费希尔综合征、急性运动性轴突性神经病、急性运动感觉轴突性神经病、急性泛自主神经病、Bickerstaff氏脑干脑炎、桥本氏脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、亨诺-许兰氏紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病(IGAN)、berger综合征、咽炎性肾小球肾炎、IgA天疱疮、IgG4相关性硬化疾病、免疫调节不育、包涵体肌炎、胰岛素依赖型糖尿病、间质性膀胱炎、艾萨克综合征、神经性肌强直、幼年型关节炎、幼年型肌炎、川崎综合征、兰伯特伊顿综合征、白细胞分裂性血管炎、扁平苔藓、硬化萎缩性苔藓、木质性结膜炎、线性IgA皮肤病(LAD)、类天疱疮、红斑狼疮(SLE)、莱姆病、梅尼埃病、显微多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、单克隆γ病变、蚕食性角膜溃疡、Mucha-Habermann疾病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic病)、神经性肌强直、艾萨克综合征(获得性、副肿瘤性、遗传性)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、卵巢炎、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、睾丸炎、复发性风湿病、pandas(与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性自身免疫多器官综合征(PAMS)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性天疱疮(PNP)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕里龙贝格综合征、Parsonnage-Turner综合征、parsplanitis(周围葡萄膜炎)、妊娠性类天疱疮(PG)、寻常型天疱疮(PV)、叶状疱疹(PF)、周围神经病、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、Poems综合征、结节性多动脉炎(PAN)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕激素皮炎原发性胆汁性肝硬化、汉诺氏综合征、原发性硬化性胆管炎(PSC)、硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、拉斯马森脑炎、慢性局灶性脑炎(CFE)、雷诺现象、反应性关节炎、莱特尔综合征、康复相关性视网膜病(RAR)、反射性交感神经营养不良、莱特尔综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、系统性硬化病、舍格伦综合征、精子&睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、伯格氏病、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、风湿性多肌痛、大动脉炎、颞动脉炎、伯格氏病、皮肤血管炎、川崎病、结节性多动脉炎、白塞氏综合征、Churg–Strauss综合征、皮肤血管炎、过敏性紫癜、显微多血管炎、韦氏肉芽肿病、高尔夫球性血管炎、水泡性皮肤病、Vitiligowegener肉芽肿病(现在称为具有多发性血管炎的肉芽肿病(GPA))。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病选自包含以下的组或由以下组成的组：ANCA血管炎、IgA肾病(Berger's)、寻常型天疱疮/大疱性类天疱疮、ITP、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性甲状腺炎(格雷夫斯病)、桥本氏病、狼疮性肾炎、膜性肾小球肾炎(或膜性肾病)、APS、重症肌无力、视神经脊髓炎、原发性舍格伦综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、皮肤肌炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病、白塞氏病、IPF、系统性硬化病、肝纤维化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、白癜风、肺出血-肾炎综合征、肺泡蛋白沉着症、慢性自身免疫性荨麻疹、银屑病、类风湿性关节炎、银肩病关节炎、轴向脊椎关节炎、移植术(包括GvHD)、哮喘、COPD、巨细胞动脉炎、难治性自身免疫性血细胞减少症、伊文思综合征(自身免疫性溶血性贫血)、I型糖尿病、结节病、多发性肌炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻、Waldenstrom巨球蛋白血症、局灶性节段性肾小球硬化症、慢性莱姆病(莱姆疏螺旋体病)、扁平苔藓、僵人综合征、扩张型心肌病、自身免疫性(淋巴细胞性)卵巢炎、获得性大疱性表皮松解症、自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、特应性皮炎、动脉粥样硬化、多发性硬化、拉斯马森脑炎、吉兰-巴雷综合征和获得性神经性肌强直、中风。
在一个实施方案中、所述病症是癌症，例如白血病，例如淋巴细胞白血病，诸如急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病；或髓性白血病，诸如急性髓性白血病或慢性髓性白血病；或淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤或者霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
本发明还提供了包含本公开的分子(诸如本文所述的多特异性分子)与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的药物或诊断组合物。因此，提供了本公开的分子(诸如本文所述的多特异性分子)用于治疗和制造药物的用途。
所述组合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述药物组合物通常包含药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的多特异性分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起加入和混合。
本文所用的术语"药学上可接受的赋形剂"是指药学上可接受的制剂载体、溶液或添加剂，以增强本公开的组合物的期望特征。赋形剂是本领域众所周知的并且包括缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、脲、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以包封在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的缓冲溶剂溶液，抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液的生产和灭菌，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
药学上可接受的载体本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且不应是有毒的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。这样的载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以供患者摄取。
本公开的分子(诸如本文所述的多特异性分子)可以分散在溶剂中递送，例如以溶液或悬浮液的形式。其可以悬浮在适当的生理溶液中，例如生理盐水，药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每lml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH。如上所述，悬浮液可以例如由冻干抗体制备。
药学上可接受的载体的详尽论述可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。
本文所用的术语"治疗有效量"是指治疗、改善或预防被靶向疾病或病况或显示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，可以在细胞培养测定或动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中初始估计治疗有效量。动物模型也可用于确定施用的合适的浓度范围和途径。这样的信息然后可以用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。
对于人受试者，精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/应答。该量可以通过常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至50mg/kg，诸如0.1mg/kg至20mg/kg。或者，剂量可以是每天1至500mg，诸如每天10至100、200、300或400mg。药物组合物可以方便地以含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
组合物可以单独地施用给患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、顺序或分开)施用。
施用本公开的多特异性分子的剂量取决于待治疗的病况的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是被预防性使用还是用于治疗已有病况。
剂量的频率将取决于多特异性分子的半衰期和其作用的持续时间。如果多特异性分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可能有必要每天给予一个或多个剂量。或者，如果多特异性分子具有长的半衰期(例如2至15天)，则可能仅需要每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次给予剂量。
在本公开中，最终制剂的pH与多特异性分子的等电点值不相似，例如，如果制剂的pH为7，则pI为8-9或更高可能是合适的。尽管不希望受理论束缚，但据认为这可能最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下注射器(hypospray)也可以用于施用本发明的药物组合物。
组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送到组织的间隙空间来完成。组合物也可以施用到特定的目标组织中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
当产品用于注射或输注时，其可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，多特异性分子可以是无水形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解、但是一旦其从胃肠道被吸收就释放双特异性蛋白质复合物的试剂。
根据本公开的可雾化制剂可以例如作为包装在箔包封中的单剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积(例如2ml)的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
本文所用的术语"变体"是指与相应的野生型肽或蛋白质的氨基酸或核苷酸序列相比，含有至少一个氨基酸序列或核苷酸序列改变的肽或蛋白质。变体可以包含与相应的野生型肽或蛋白质至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％或99％的序列同一性。然而，变体可能包含小于80％的序列同一性，条件是所述变体表现出与其相应的野生型肽或蛋白质基本相似的功能。
在一个实施方案中，本公开的构建体是至少三特异性的。在这种情况下，进一步的特异性可以针对任何感兴趣抗原，例如延长半衰期的抗原，诸如白蛋白或Fc新生儿受体(FcRn)；用于效应子功能(诸如激活或抑制Fc受体或共刺激分子)的抗原；组织或细胞靶向抗原；或帮助血液/脑屏障(BBB)转移的抗原，诸如转铁蛋白受体或LRP1。
本公开还扩展至组合物，诸如包含具有特定抗原特异性的所述新形式的药物组合物。
在另一方面，本公开包括所述形式和组合物在治疗中的用途。
本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的抗体分子或多特异性分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加并混合。
抗体分子或多特异性分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其它活性成分，包括其他抗体成分或非抗体成分,诸如类固醇或其他药物分子。
药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。本文所用的术语"治疗有效量"是指治疗、改善或预防被靶向疾病或病症或显示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，可以在细胞培养测定或动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中初始估计治疗有效量。动物模型也可用于确定施用的适当浓度范围和途径。这样的信息然后可以用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。
对于人受试者，精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/应答。该量可以通过常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，诸如100mg/Kg。
药物组合物可以方便地以每剂含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
组合物可以单独地施用给患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、顺序或分开)施用。
本文所用的药剂是指当施用时具有生理效果的实体。
本文所用的药物是指在治疗剂量下具有适当的生理效果的化学实体。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段与免疫抑制剂疗法(诸如类固醇，特别是泼尼松)一起使用。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段与利妥昔单抗或其它B细胞疗法一起使用。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起使用。实例包括氨甲蝶呤、微苯酚盐/酯和硫唑嘌呤(azathioprine)。
施用本发明的抗体分子的剂量取决于待治疗的病况的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是被预防性使用还是治疗已有病况。
剂量的频率将取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可能有必要每天给予一个或多个剂量。或者，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)和/或长期的药效学(PD)谱，则可能仅需要每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次给予剂量。
在一个实施方案中，剂量每两周递送一次，即每月两次。
在一个实施方案中，剂量被间隔开以允许抗药物(在这种情况下是抗抗体)应答在施用进一步的剂量之前消失。
本文使用的半衰期意指分子在循环中(例如在血清/血浆中)的持续时间。
本文所用的药效学是指根据本公开的分子的生物学作用的谱，特别是持续时间。
药学上可接受的载体本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且不应是有毒的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质，可以存在于这样的组合物中。此类载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以供患者摄取。
适合的给药形式包括适于肠胃外给药的形式，例如通过注射或输注，例如通过大剂量注射或连续输注。当产品用于注射或输注时，其可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可以是无水形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。
一旦配制，本发明的组合物可以直接施用于受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，所述组合物适于施用于人受试者。
适当地，在根据本公开的制剂中，最终制剂的pH不类似于抗体或片段的等电点的值，例如，如果蛋白质的pI在8-9或以上的范围内，则制剂pH为7可能是合适的。尽管不希望受理论束缚，但据认为这可能最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。
在一个实例中，pH在4.0至7.0范围内的药物制剂包含：1至200mg/mL根据本公开的抗体分子，1至100mM缓冲剂、0.001至1％表面活性剂，a)10至500mM的稳定剂，b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张力剂，或c)5至500mM的张力剂。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下注射也可以用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备为注射剂，其为液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。
组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送到组织的间隙空间来完成。组合物也可以施用到损伤中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
应当理解，组合物中的活性成分将是抗体分子。因此，其将易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解、但一旦其已经从胃肠道吸收就释放抗体的试剂。
药学上可接受的载体的详尽讨论可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。
在一个实施方案中，制剂作为用于局部施用(包括吸入)的制剂提供。
合适的可吸入制剂包含可吸入粉末、含推进剂气体的计量气溶胶或不含推进剂气体的可吸入溶液。根据本发明的含有活性物质的可吸入粉末可以仅由上述活性物质或上述活性物质与生理上可接受的赋形剂的混合物组成。
这些可吸入粉末可以包含单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些彼此的混合物。适合使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别是但不限于以其水合物的形式。
用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米的颗粒尺寸，诸如1-9微米，例如1-5μm。活性成分(诸如抗体或片段)的粒度是最重要的。
可用于制备可吸入气溶胶的推进气体是本领域已知的。合适的推进剂气体选自烃诸如正丙烷、正丁烷或异丁烷和卤代烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进气体可以单独使用或以其混合物使用。
特别合适的推进气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。
含推进剂气体的可吸入气溶胶还可含有其它成分，诸如助溶剂、稳定剂、表面活化剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和调节pH的方式。所有这些成分在本领域中是已知的。
根据本发明的含推进剂气体的可吸入气溶胶可含有按重量计多达5％的活性物质。本发明的气溶胶含有例如按重量计0.002至5％，按重量计0.01至3％，按重量计0.015至2％，按重量计0.1至2％，按重量计0.5至2％或按重量计0.5至1％的活性成分。
或者，对肺的局部给药还可以是通过施用液体溶液或悬浮液制剂，例如使用装置诸如喷雾器，例如连接到压缩机的喷雾器(例如，连接到由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)。
本发明的抗体或多特异性分子可以分散在溶剂中递送，例如以溶液或悬浮液的形式。其可以悬浮在合适的生理溶液中，例如盐水或其它药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每lml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mgNaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH。悬浮液可以使用例如冻干抗体。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可以含有一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域众所周知的，包括缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、脲、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以包封在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的缓冲溶剂/溶液，抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液的生产和灭菌，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
根据本公开的可雾化制剂可以例如作为包装在箔包封中的单剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积(例如2ml)的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
本文公开的抗体可适于通过雾化递送。
还设想本发明的抗体可以通过使用基因疗法来施用。为了实现这一点，将在适当的DNA成分控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入患者，使得抗体链从DNA序列表达并原位组装。
在一个实施方案中，本公开的分子，诸如本文所述的抗体分子可用于在功能上改变一种或多种感兴趣抗原的活性。例如，本公的抗体分子可以直接或间接中和、拮抗或激动所述一种或多种抗原的活性。
在一个实施方案中，提供本公开的分子(包括融合蛋白、双特异性蛋白复合物或包含其的组合物)用作实验试剂。
其它方面
在其它方面，提供了核苷酸序列，例如编码如本文所述的构建体(包括如上定义的多特异性分子或融合蛋白)的DNA序列。
在一个实施方案中，提供了核苷酸序列，例如编码本文所述构建体的DNA序列，包括根据本公开的多特异性分子或双特异性蛋白质复合物或抗体。
本文的公开内容还扩展至包含如上定义的核苷酸序列的载体。
本文所用的术语"载体"是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的实例是"质粒"，其是另外的DNA区段可以连接的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)中自主复制。其他载体(例如非附加体型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组中，其中它们随后与宿主基因组一起复制。在本说明书中，术语"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。
可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员众所周知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York and the Maniatis Manual produced by ColdSpring Harbor Publishing。
本文使用的术语"选择性标记"是指其表达允许用于鉴定已经被含有该标记基因的载体转化或转染的细胞的蛋白质。多种选择性标记是本领域已知的。例如，通常选择性标记基因赋予载体已被导入的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。选择性标记也可以是视觉上可识别的标记，诸如例如荧光标记。荧光标记的实例包括罗丹明、FITC、TRITC、Alexa Fluors及其各种缀合物。
还提供了包含一个或多个克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包含编码本公开的抗体的一个或多个DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可以用于表达编码本公开的抗体分子的DNA序列。可以使用细菌例如大肠杆菌和其他微生物系统，或者也可以使用真核生物例如哺乳动物的宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本公开还提供了用于生产根据本公开的分子或其组分的方法，其包括在适于导致从编码本公开的分子的DNA表达蛋白的条件下培养含有本公开的载体的宿主细胞，并分离该分子。
包括本文所述的双特异性蛋白质复合物的本公开的分子可用于诊断/检测试剂盒。试剂盒可以例如包含对两种抗原特异的双特异性抗体复合物，其中两种抗原均存在于相同的细胞类型上，并且其中只有在成功检测到两种抗原时才可进行阳性诊断。通过使用本公开的分子诸如本文所述的双特异性抗体复合物而不是非复合形式的两种分开的抗体或抗体片段，可以极大地增强检测的特异性。
在一个实施方案中，将本公开的分子诸如双特异性抗体复合物固定在固体表面上。固体表面可以例如是芯片或ELISA板。
还提供了根据本发明的分子，例如本文所述的双特异性蛋白质复合物用于在样品中检测第一和第二肽的存在的用途，其中所述分子用作检测剂。
可以例如将本公开的分子诸如本文所述的双特异性抗体复合物缀合于荧光标记，所述荧光标记有助于检测结合的抗体-抗原复合物。此类双特异性抗体复合物可用于免疫荧光显微镜术。或者，双特异性抗体复合物也可用于蛋白质印迹或ELISA。
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的分子或其组分的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的分子或其组分的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，使得杂质保留在柱上，并且抗体保持在未结合的级分中。该步骤可以例如在约6-8的pH下进行。
该方法还可包括使用阳离子交换层析的初始捕获步骤，例如在约4至5的pH下进行。
该方法还可包括另外的层析步骤，以确保产物和方法相关的杂质从产物流中适当地拆分开。
纯化方法还可以包括一个或多个超滤步骤，诸如浓缩和渗滤步骤。
如上所用的"纯化形式"意指至少90％的纯度，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％w/w或更纯。
在本文下文中和附图中提供了本公开的序列。
在本说明书的上下文中，"包含"被解释为"包括"。
包含某些要素的本公开的方面也旨在扩展到"由相关要素组成"或"基本上由相关要素组成"的替代实施方案。
本文中可以采用积极引述的实施方案作为具体排除的基础。
本文引用的所有参考文献明确地通过引用并入。
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinityantibodies in vitro from immune libraries.Hanes J,Jermutus L,Weber-BornhauserS,Bosshard HR,Plückthun A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of aPeptide-binding Single Chain Antibody Fragment(scFv)withLow PicomolarAffinity.Zhand C,Spinelli S,Luginbuhl B,Amstutz P,Cambillau C,Pluckthun A.(2004)J.Biol.Chem.279,18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection.Berger C,Weber-Bornhauser S,Eggenberger Y,Hanes J,Pluckthun A,Bosshard H.R.(1999)F.E.B.S.Letters 450,149-153
实施例
实施例中所用的术语Fab-Kd-Fab描述了具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚体性的系链；
A包含对抗原(诸如CD79)特异的Fab片段；
B包含对抗原(诸如CD45)特异的Fab片段；
X是结合对的第一结合伴侣，诸如scFv；
Y是结合对的第二结合伴侣，诸如肽；和
：是X与Y之间的相互作用(诸如结合相互作用)。
实施例1-产生Fab’-A(Fab-scFv[A-X])和Fab’-B(Fab-肽[B-Y)用于功能测定
克隆策略
通过PCR或基因合成产生侧接有限制性酶切位点DNA序列的抗体可变区DNA。这些位点是用于可变重链的HindIII和XhoI以及用于可变轻链的HindIII和BsiWI。这使得重链可变区适于连接到两个重链载体(与FabB-Y连接的pNAFH和与FabA-Xds[二硫键稳定的]连接的pNAFH)，因为它们具有互补的限制性位点。这将可变区连接到鼠恒定区和肽Y(GCN4)或scFv X(52SR4)的上游(或5')，产生整个阅读框。将轻链克隆到标准的内部鼠恒定κ载体(pMmCK或pMmCK S171C)中，其再次使用相同的互补的限制性位点。如果可变区分离自兔，则使用pMmCK S171C载体。通过使用位于整个开放阅读框侧翼的引物进行测序来确认克隆事件。
培养CHO-S
将悬浮CHOS细胞预先适应于补充有2mM(100X)glutamx的CDCHO培养基(Invitrogen)。在摇床培养箱(Kuner AG，Birsfelden，Switzerland)上以140rpm摇动将细胞维持在对数生长期，并在补充有8％CO2的37℃下培养。
电穿孔转染
在转染前，使用CEDEX细胞计数器(Innovatis AG.Bielefeld,Germany)测定细胞数和存活率，将所需量的细胞(2xl08个细胞/ml)转移到离心锥形管中，并以1400rpm旋转10分钟。将沉淀的细胞重悬于无菌Earls平衡盐溶液中，并以1400rpm再旋转10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬浮至所需的细胞密度。
载体DNA的最终浓度为400ug用于2xl08个细胞/ml的混合物，将800μl用移液管移至比色杯(Biorad)中并使用内部电穿孔系统进行电穿孔。
将转染的细胞直接转移到含有富含2mM glutamx和抗生素抗有丝分裂(100X)溶液(1比500)的ProCHO 5培养基的1X3L锥形瓶中。将细胞在设定为37℃，5％CO2和140rpm摇动的Kuhner摇床培养箱中培养。在转染后24小时加入进料补充剂2g/L ASF(AJINOMOTO)，将温度降至32℃进一步培养13天。在第4天，向培养物中加入3mM的丁酸钠(正丁酸钠盐,SigmaB-5887)。
在第14天，将培养物转移到管中，并以4000rpm离心30分钟后从细胞中分离上清液。将保留的上清液进一步通过0.22um SARTO BRAN PMillipore，随后通过0.22μm Gamma金过滤器过滤。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
大规模(1.0L)纯化
通过使用AKTA Xpress系统和HisTrap Excel预包装的镍柱(GE Healthcare)的亲和捕获来纯化Fab-A和Fab-B。将培养物上清液经0.22μm无菌过滤，并且如果需要，在加载到柱上之前用弱酸或碱将pH调节至中性。使用含有15-25mM咪唑的第二洗涤步骤从镍树脂中置换任何弱结合的宿主细胞蛋白质/非特异性His结合物。用10mM磷酸钠，pH7.4+1M NaCl+250mM咪唑进行洗脱，收集2ml级分。将一个柱体积加入洗脱液中，将体系暂停10分钟以收紧洗脱峰，并因此降低总洗脱体积。合并最干净的级分并经缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中并且经0.22μm过滤。通过A280Scan,SE-HPLC(G3000方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)和使用PTS Endosafe系统(针对内毒素)测定最终汇集物。
实施例2–以异二聚体性系链的双特异性蛋白质复合物形式使用Fab’-A(Fab-scFv [A-X])和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])以证明CD79/CD22双特异性而非二价组合可抑制Akt信号传 导
将源自血小板单采血成份术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-A(Fab-scFv)和Fab-B(Fab-肽)来产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表4所示。
表4:具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合的可能网格。
其中X是scFv(52SR4)，而Y是肽(GCN4)
将Fab’A-X和Fab’B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)8分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗磷酸Akt抗体染色细胞，所述荧光标记的抗磷酸Akt抗体识别蛋白质上位置473处的经修饰的丝氨酸残基。然后将板重悬浮并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和Akt的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的Akt水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD22和CD79b的组合的相对效果显示在表5中(↓＝抑制，↑＝刺激而＝没有总体效应)。
表5：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化Akt的相对效力的表。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
该数据也以条形图(图1)的形式显示：数据表示平均值，误差条是95％置信区间。数据显示，CD22与CD79b的组合可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸-Akt表达。相反地，而CD22与CD22的组合表现出升高水平的磷酸--Akt表达。
实施例3–以异二聚体性系链的双特异性蛋白质复合物形式使用Fab’-A(Fab-scFv [A-X])和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])来证明CD79/CD22双特异性但非二价组合抑制PLCγ2信号 传导。
将源自血小板单采血成份术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对于细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab’-a(Fab-scFv[A-X])和Fab’-B(Fab-肽[B-Y])来产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表4所示。
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)8分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BDBiosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流动缓冲液中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的PermBuffer III(BDBiosciences)中重悬浮30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗磷酸PLCγ2抗体染色细胞，所述荧光标记的抗磷酸PLCγ2抗体识别该蛋白质上位置759处的经修饰的酪氨酸残基。然后将板重悬浮并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl的流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD22与CD79b的组合的相对效果显示在表6中(↓＝抑制，↑＝刺激，而＝没有总体效应)。
表6：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化PLCg2表达的相对效力的表。
其中X是scFv而Y是肽
该数据也可表示为条形图(图2)，数据表示平均值，误差条为95％置信区间。数据显示，CD22与CD79b以及CD79b与CD79b的组合均可抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸-PLCγ2表达。相反地，CD22与CD22的组合表现出升高水平的磷酸-PLCγ2表达。
实施例4–以异二聚体性系链的双特异性蛋白质复合物形式使用Fab’-A(Fab-scFv [A-X])和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])证明CD79/CD22双特异性组合抑制CD86表达
将源自血小板单采血成份术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab’-X(Fab-scFv)和Fab’-Y(Fab-肽)来产生双特异性或二价抗体的网格。该网格示于表4中。
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)24小时来活化B细胞。此后，将板置于冰上，在冰冷的流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗涤一次。然后用荧光标记的抗CD19抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗CD86抗体染色细胞，并在黑暗中于冰上孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl的流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD19和CD86的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD22与CD79b的组合的相对效果显示在表7中(↓＝抑制，↑＝刺激，而＝没有总体效应)。
表7：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制B细胞CD86表达的相对效力的表。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
该数据也以条形图(图3)的形式显示，数据表示平均值，误差棒为95％置信区间。数据显示，CD22与CD79b以及CD79b与CD79b的组合均能抑制用抗IgM刺激的B细胞上的CD86表达。相反，CD22与CD22的组合表现出升高水平的CD86表达。
实施例5–仅当抗体以双特异性取向排列时才可再现CD22和CD76b的抑制效应
将源自血小板单采血成份术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab’-X(Fab-scFv)和Fab’-Y(Fab-肽)来产生抗体的双特异性、二价或混合物的组合。这些组合示于表8中。对于滴定曲线实验，然后将这些组合以1比2.5的稀释度逐步稀释8次，以产生用于该组合的剂量滴定。
表8：具有对CD22和CD79b的特异性的双特异性、二价或混合物的网格
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加Fab'A-X和/或Fab'B-Y组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)活化B细胞8分钟。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再洗涤一次。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)、抗磷酸Akt抗体(其识别位置473处的经修饰的丝氨酸残基)以及抗磷酸PLCγ2抗体(其识别位置759处的经修饰的酪氨酸残基)染色细胞。然后将板重悬浮并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤2次，并重悬浮于25μl的流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20、Akt和PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的Akt和PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。图4和5显示只有CD22与CD79b的双特异性组合而非CD22与CD79b的混合物抑制磷酸化Akt和PLCγ2表达(数据表示平均值，误差棒为95％置信区间)。
为了验证用CD22与CD79b的双特异性组合观察到的抑制作用，对该组合连同CD22与CD79b抗体的混合物一起进行了滴定，并测定了B细胞中的总细胞内IkB(信号传导读出)和CD86(24小时后的活化标志)的抑制。
如从图6中可看出的，CD22-X/CD79b-Y的组合但非CD22-X/CD79b-X的组合能够抑制抗IgM刺激后的NF-kB信号激活，如通过总IkB蛋白的水平测量的。使用Graphpad Prism6，利用4参数逻辑曲线拟合外推的IC50为7.5nM(数据表示平均值，误差棒为标准偏差)。另外，CD22-X/CD79b-Y的组合而非CD22-X/CD79b-X的组合的滴定能够在24小时后抑制B细胞上的抗IgM诱导的CD86表达(参见图7)。
将源自血小板单采血成份术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(500nM)量的对细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab’-X(Fab-scFv)和Fab’-Y(Fab-肽)来产生双特异性组合。将这些组合以1比2.5的稀释度逐步稀释8次，以产生用于该组合的剂量滴定。将Fab'-X和Fab'-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC添加至Fab’-X和Fab’-Y组合，并一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)24小时来活化B细胞。为了能够检测细胞表面激活标志物，将板置于冰上，在冰冷的流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗涤一次。然后用荧光标记的抗CD19抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗CD86抗体染色细胞，并在冰上于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl的流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD19和CD86的细胞表达。使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。如图7a中所见，CD22-X/CD79b-Y组合的滴定能够在24小时后抑制B细胞上抗-IgM诱导的CD86表达。使用Graphpad Prism 6，利用四参数逻辑曲线拟合外推的IC50为10.3nM(数据表示平均值，误差棒为标准偏差)。
实施例6–可利用不同抗体V区再现CD22和CD79b双特异性蛋白的抑制效应
免疫：通过基因合成或商业来源获得编码选定的抗原的DNA，并将其克隆到具有强组成型启动子的表达载体中。然后使用内部电穿孔系统将质粒DNA转染到Rab-9兔成纤维细胞(CRL-1414TM)中。24小时后，通过流式细胞术检查细胞的抗原表达，并在液氮中以等分试样冷冻直至使用。通过在相同细胞上共表达或制备单一或多重转染细胞的混合物，每只兔用多达6种抗原免疫。用3剂量的细胞免疫兔。
抗体发现：使用与Zubler等(1985)描述的方法类似的方法制备B细胞培养物。简言之，将来自免疫兔的脾或PBMC衍生的B细胞以约2000-5000个细胞/孔的密度在具有200μl/孔RPMI 1640培养基(Gibco BRL)的条形码化96孔组织培养板中在37℃下、在5％CO2气氛中培养7天，所述RPMI 1640培养基补充有10％FCS(PAA laboratoriesltd)、2％HEPES(SigmaAldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、3％激活的脾细胞培养物上清液和γ照射的突变体EL4鼠胸腺瘤细胞(5x104个/孔)。
使用HEK293细胞并使用基于均匀荧光的结合测定来测定B细胞培养物上清液中抗原特异性抗体的存在，所述HEK293细胞使用用于免疫兔的抗原进行了共转染。筛选涉及使用Matrix Platemate液体处理器将10ul来自条形码化的96孔组织培养板的上清液转移到含有用靶抗原转染的HEK293细胞(约3000个细胞/孔)的条形码化384孔黑壁测定板中。用山羊抗兔IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。
初次筛选后，使用Aviso Onyx命中挑取机器人将阳性上清液定位在96孔条形码化的母板上，并将细胞培养板中的B细胞在-80℃冷冻。然后在基于均匀荧光的结合测定中，在分别用抗原转染的HEK293细胞或用重组蛋白作为抗原来源包被的SuperavidinTM珠(BangsLaboratories)上筛选母板。这是为了确定每个孔的抗原特异性。
为了允许从目标孔的选择中回收抗体可变区基因，进行分析步骤以使得能够鉴定含有B细胞的异质群体的给定孔中的抗原特异性B细胞。这是使用荧光聚焦方法(Clargo等，2014.Mabs 2014 Jan 1:6(1)143-159；EP1570267B1)实现的。简言之，将来自阳性孔的分泌免疫球蛋白的B细胞与用靶抗原转染的HEK293细胞或用生物素化的靶抗原包被的链霉抗生物素蛋白珠(New England Biolabs)和1:1200最终稀释度的山羊抗兔Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)混合。在37℃下静态孵育1小时后，由于围绕B细胞的荧光晕的存在，可以鉴定抗原特异性B细胞。然后将使用奥林巴斯显微镜鉴定的多个这些个体B细胞克隆用Eppendorf微操作器挑取并沉积到PCR管中。荧光聚焦方法也用于从直接来自免疫兔的骨髓的B细胞的异质群体中鉴定抗原特异性B细胞。
通过使用重链和轻链可变区特异性引物的逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收抗体可变区基因。进行两轮PCR，其中巢式二级PCR在3'和5'末端引入限制性位点，允许将可变区克隆到小鼠Fab-X和Fab-Y(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。将Fab-X和Fab-Y表达载体的重链和轻链构建体使用Fectin 293(Life Technologies)共转染到HEK-293细胞中或使用Expifectamine(Life Technologies)将其共转染到Expi293细胞中，并在6孔组织培养板中于5ml的体积中表达重组抗体。在5-7天表达后，收获上清液。在对用抗原转染的HEK293细胞和包被有重组蛋白或抗原转染的HEK细胞的SuperavidinTM珠(Bangs Laboratories)上基于均匀荧光的结合测定中测试上清液。这是为了确认克隆的抗体的特异性。
小规模FabA-X和FabB-Y的生产(小规模(50mL)Expi293转染)
将Expi293细胞在Expi293TM表达培养基中常规地继代培养至终浓度为0.5×106个活细胞/mL，并在轨道摇床培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
在转染当天，使用自动化细胞计数器(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。为了达到2.5X 106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞悬浮液加入到无菌的250mL锥形瓶中，对于每50mL转染，通过加入新鲜的、预热的Expi293TM表达培养基来达到42.5mL的体积。
为了对每次转染制备脂质-DNA复合物，将总共50μg的重链和轻链质粒DNA在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至总体积为2.5mL，并将135μL的ExpiFectamineTM 293试剂(Life Technologies)在I培养基中稀释至总体积为2.5mL。将所有稀释液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟，然后将每种DNA溶液加入相应的稀释的Exp iFec tamineTM 293试剂中，以获得5mL的总体积。轻轻混合DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物，并在室温下孵育20-30分钟，以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将5mLDNA-ExpiFectamineTM293试剂复合物加入每个摇瓶中。将摇瓶在轨道摇床培养箱(Multitron,Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃培养。
转染后约16-18小时，向每个摇瓶中加入250μL ExpiFectamineTM293转染增强子1(LifeTechnologies)和2.5mL的ExpiFectamineTM293转染增强子2(LifeTechnologies)。
转染后7天收获细胞培养物。将细胞转移到50mL旋转管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，然后通过0.22um Stericup(MerckMillipore)无菌过滤。将澄清和无菌过滤的上清液储存在4℃。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
小规模(50ml)纯化：使用小规模基于真空的纯化系统通过亲和捕获分别纯化Fab-X和Fab-Y二者。简言之，将50ml培养物上清液经过0.22μm无菌过滤，然后加入500μm NiSepharose珠(GE Healthcare)。然后将上清液珠混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空除去上清液。然后用洗涤液1(50mM磷酸钠、1M NaCl，pH 6.2)和洗涤液2(0.5M NaCl)洗涤珠。用50mM乙酸钠，pH4.0+1M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中并进行0.22μm过滤。通过A280扫描，SE-UPLC(BH1200方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)和使用PTS Endosafe系统(对于内毒素)测定最终汇集物。
将源自血小板血浆单采血成分术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在RPMI 1640(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％胎牛血清、50单位/mL青霉素、50μg/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对细胞表面蛋白质CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-X(Fab-scFv)和Fab'-Y(Fab_肽)来产生抗体的双特异性、二价或混合物的组合。3种不同的CD79b Fab-Y和2种不同的CD22 Fab-X的这些组合显示在表9中。
表9:具有针对CD22和CD79b的特异性的双特异性蛋白的网格。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
将Fab’A-X和Fab’B-Y-起孵育60分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加上Fab’A-X和/或Fab’B-Y组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入12.5μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)10分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500x g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％NaN3+2mM EDTA)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm缓冲液III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和识别位置759处的经修饰的酪氨酸残基的抗磷酸PLCγ2抗体染色细胞。然后将平板重悬浮并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于40μl流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
如可从图8看出的，数据显示使用所有不同抗体V区的CD22与CD79b的组合可以抑制被抗IgM刺激的B细胞中的磷酸-PLCγ2表达。
实施例7：网格筛选大组的异二聚体系链束缚的蛋白质复合物来鉴定新的双特异性抗体靶。
简介：在前面的实施例中成功验证了双特异性形式和筛选方法之后，将筛选扩展到更大数量的抗原对。产生针对在B细胞上表达的23种不同抗原的一组抗体可变(V)区。使用Fab-Kd-Fab[即A-X:Y-B，其中A和B是Fab片段]形式，形成异二聚体系链束缚的蛋白质复合物的网格，其代表315种不同抗原对组合中的每一种的多种V区组合。在高通量流式细胞术测定中筛选这些组合调节BCR(B细胞受体)信号传导的能力，以选择用于用双特异性抗体干预的新靶对。
如实施例6中所述分离抗体。
筛选测定
使用设定为37℃的水浴将供体PBMC快速解冻，并小心地转移到50ml Falcon管中。然后将它们在测定培养基中逐滴稀释至5ml，以使渗透性休克最小化。然后将细胞小心稀释至20ml，然后加入最终的培养基稀释剂以使体积为50ml。然后将细胞以500g旋转5分钟，然后除去上清液并将细胞重悬于lml培养基中。然后计数细胞并稀释至1.66x106个细胞/ml，然后将每孔30μl分配到V-底TC板中，得到5.0x104个细胞/孔的最终测定浓度。然后将细胞板保持覆盖状态存储于37℃，5％CO2培养箱中，直到需要它们，给予它们至少1小时休息。
将Fab-X和Fab-Y试剂在测定培养基中以最终测定浓度的5倍等摩尔浓度比混合，并在37℃，5％CO2下孵育90分钟。在96孔U形底聚丙烯板中制备样品，并在孵育期间覆盖。
将10μl的5x Fab-KD-Fab混合物加入到含有细胞的合适的测试孔中，并通过以1000rpm摇动混合30秒，然后在37℃，5％CO2下孵育90分钟。
然后用10μl抗人IgM刺激细胞。刺激的最终测定浓度根据测定面板读出数据而变化，以50μg/ml(混合物A和C)或25μg/ml(混合物B)的最终测定浓度刺激三种抗体混合物A、B和C(下文中详述)。然后将测定板以1000rpm温和混合30秒，然后在37℃，5％CO2下孵育5分钟(抗体混合物A和C)或2分钟(抗体混合物B)。通过向所有孔中加入150μl冰冷的BDCytoFix来终止测定，并在室温下孵育15分钟。然后将固定的细胞以500g旋转5分钟以沉淀细胞，并使用BioTek ELx405板洗涤器除去上清液。通过以2400rpm涡旋平板30秒来重悬沉淀。然后通过加入100μl冰冷的BD细胞透化缓冲液III在4℃下使细胞透化30分钟。然后将细胞在100μl FACS缓冲液中洗涤，并以500g旋转5分钟。通过ELx405再次去除上清液，然后使用ELx405快速分配200μl FACS缓冲液以洗去任何残余的透化缓冲液。再次将细胞以500g旋转，通过倒置除去上清液。在前述旋转步骤期间，在FACS缓冲液中制备抗体混合物并保持屏蔽光。然后通过涡旋(2400RPM，30秒)将细胞重悬浮，然后向所有孔中加入20μl抗体混合物，并将板在1000rpm下摇动30秒。然后将细胞在室温下于黑暗中孵育60分钟。
然后将细胞在200μl FACS缓冲液中用500g旋转洗涤两次，并在每个步骤后除去上清液。最后，通过以2400rpm涡旋30秒来重悬细胞，然后加入最终20μl FACS缓冲液。然后在Intellicyt HTFC/iQue仪器上读板。
FACS缓冲液＝PBS+l％BSA+0.05％NaN3+2mM EDTA
抗体混合液A＝1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)+1:5 PLCγ2 AF88+l:10 Akt AF647+1:50 ERK1/2 PE(稀释于FACS缓冲液中)。
抗体混合液B＝l:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)+1:5 Syk PE+1:5 BLNKAF647(稀释于FACS缓冲液中)
抗体混合液C＝l:5 CD20 PerCp-Cy5.5(Biolegend)+1:5 PLCγ2AF488+l:10 AktAF647+1:5 Syk PE(稀释于FACS缓冲液中)
试剂 提供商 目录号
抗-人IgM Southern Biotech 2022-14
CytoFix BD Biosciences 554655
Perm缓冲液III BD Biosciences 558050
抗Akt(pS473)AF647 BD Biosciences 561670
抗SYK(pY348)PE BD Biosciences 558529
抗PLCγ2(pY759)AF488 BD Biosciences 558507
抗-BLNK(pY84)AF647 BD Biosciences 558443
抗ERK1/2(pT202/pY204)PE BD Biosciences 561991
抗-人CD20 PerCp-Cy5.5 BD Biosciences 558021
抗-人CD20 AF488 BD Biosciences 558056
抗-人CD20 PerCp-Cy5.5 Biolegend 340508
磷酸盐缓冲盐溶液(PBS) Fisher Scientific 10562765
RPMI 1640 Life Technologies 31870
胎牛血清(FCS) Life Technologies 16140
Glutamax Life Technologies 35050
青霉素/链霉素(P/S) Life Technologies 15070
EDTA Sigma 03690
叠氮化钠(NaN3) Sigma S2002
牛血清白蛋白(BSA) Sigma A1470
用抗体混合物A和B或单独的C筛选Fab-X+Fab-Y组合。所有筛选均在来自2个不同献血者的视锥细胞上进行。使用商购可得的软件工具捕获和评估数据。针对315种不同的抗原组合筛选总共2500个Fab-X+Fab-Y组合。
结果
计算每种Fab-Kd-Fab[即其中A和B是Fab片段的A-X:Y-B]组合对BCR信号传导级联蛋白的磷酸化的诱导的抑制百分比，在该实施例中寻找抑制B细胞功能的抗原的新组合，将阳性组合的标准设定为V区的至少一个组合对至少两个磷酸读数有至少30％的抑制。根据该阈值，在315次检查中有11个新的抗原对组合符合所要求的标准。这代表了3.5％的命中率，证明了筛选大量组合以发现期望活性的重要性，以及CC79b和CD22的组合的活性是多么罕见。
图10-12显示了抗原网格交叉特异性的数据。值分别是Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分比(对于激活是负值)，并且表示被评估的多个V区组合的平均值。测试了315种不同的抗原组合，并且如可看出的，不同抗体组合对BCR信号传导的效应从强烈抑制(例如Fab-X上的抗原2(CD79b)与Fab-Y上的抗原3(CD22)的组合(69.66％的对磷酸Syk的抑制)和Fab-Y上的抗原2(CD79b)与Fab-X上的抗原3(CD22)的组合(52.32％的对磷酸Syk的抑制)，图11中所示)至激活(例如X上的抗原6和Y上的抗原11(-118.10％的磷酸Syk，图11))变化很大。
在图13中显示了针对Fab-X上的抗原2(CD79b)和Fab-Y上的抗原3(CD22)的代表图10-12中所示的平均百分比值的每个数据点。在这种情况下，评估了不同抗体V区域的23种不同组合。图14中显示了相同的但采用另一种取向的抗原组合，即Fab-Y上的抗原2(CD79b)和Fab-X上的抗原3(CD22)。在这种情况下，评估了不同抗体V区的9种不同组合。所有的V区均显示出抑制作用，但有利的是，这种方法也可用于选择最佳的V区组合。
实施例8以Fab-Kd-Fab筛选形式与分子性连接的双特异性BYbe形式共靶向抗原CD79b加抗原CD22的活性的比较。
简介：为了检查在Fab-Kd-Fab异二聚体系链束缚的筛选复合物中鉴定的CD79b/CD22靶标对活性可转化为另一种治疗性分子连接的形式中的类似所需活性，以BYbe形式生成抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD22特异性(VR4130)。该BYbe形式由作为通过接头SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)与抗-抗原CD79b Fab(VR4447)的重链融合的二硫键稳定化(ds)单链(sc)-Fv的抗-抗原CD22 V区(VR4130)组成。
方法：
如下进行用于功能性筛选的BYbe的纯化：
如下纯化用于功能性筛选的BYbe(Fab-dsscFv[缺乏Fab重链C-末端的scFv])形式。将来自标准expiHEK或CHO表达的澄清细胞培养物上清液进行0.22μm无菌过滤。将过滤的上清液以2ml/分钟加载到50ml在pH7.4的PBS(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的GammabindPlus Sepharose XK26柱(GE Healthcare)上。加载后，用pH7.4的PBS洗柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.7进行洗脱。洗脱后测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰，然后用1/25体积的2MTris/HCl pH8.5中和。使用具有10kDa(BYbes)分子量截留膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩被中和的样品，并在甩平式转子中以4000xg离心。将浓缩的样品应用于在PBS，pH7.4中平衡的XK16/60或XK26/60 Superdex200柱(GE Healthcare)。分别以1ml/分钟或2.6ml/分钟使用等度梯度的PBS，pH7.4对柱子进行展开。收集级分并在TSK凝胶G3000SWXL上通过尺寸排阻层析进行分析；以1ml/分钟使用等度梯度的0.2ml磷酸盐，pH7.0对5μm，7.8X 300mm柱子进行展开，在280nm处通过吸光度进行检测。将选定的单体级分合并，使用具有10kDa分子量截留膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩至>1mg/ml，并在甩平式转子中以4000xg离心。测定最终样品；用A280 Scanning UV-可见光分光光度计(Cary 50Bio)测量浓度；在TSK gel G3000SWXL上通过尺寸排阻层析法测定单体百分数；以1ml/分钟使用等度梯度的0.2M磷酸盐，pH7.0对5μm，7.8×300mm柱进行展开，通过280nm处的吸光度进行检测；通过以50mA(每凝胶)在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝胶(Novex)上运行还原和非还原性SDS-PAGE，持续53分钟；和通过Charles River’s便携式测试系统，利用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)测试盒测定内毒素。
功能分析
活化标志物测定：将抗原CD79b特异性Fab'-Y和抗原CD22特异性Fab'-X以等摩尔浓度一起孵育60分钟(在37℃和5％CO2环境中)。以1:4的系列稀释度从100nM的起始摩尔浓度滴定组合。还以1:4的系列稀释度从100nM的起始摩尔浓度滴定抗原CD79b和CD22特异性BYbe。在V形底96孔板中，向孔中加入1.5x105个PBMC，向其中加入滴定的Fab'-X和Fab'-Y组合或滴定的BYB。将Fab'-X和Fab'-Y组合或BYbe与细胞再孵育90分钟。此后，通过在37℃加5％CO2下添加25μg/mL山羊F(ab')2抗-人IgM(Southern Biotechnology)，进行24小时来活化B细胞。
向孔中加入100μL冰冷的FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％NaN3+2mM EDTA)，密封板并用湿冰覆盖约15分钟，然后在4℃以500xg离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，并以2000rpm摇动板30秒钟。
然后将细胞用荧光标记的抗CD19、抗CD20和抗CD71、抗CD40和抗CD86抗体(BDBiosciences)的混合物染色。摇动平板并在黑暗处于湿冰上孵育1小时。此后，将板洗涤两次并重悬于20μL FACS缓冲液中。使用IntellicytScreener流式细胞仪测量CD19、CD20和CD71、CD40和CD86的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群，并计算每个孔的CD71、CD40和CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
PhosFlow分析：将抗原CD79b特异性Fab'-Y和抗原CD22特异性Fab'-X以等摩尔浓度一起孵育60分钟(在37℃和5％CO2环境中)。以1:4的系列稀释度从100nM的起始摩尔浓度滴定各组合。还以1:4的系列稀释度从100nM的起始摩尔浓度滴定抗原CD79b和抗原CD22特异性BYbe。在V形底96孔板中，将5.0x104个PBMC加入到孔中，向其中加入滴定的Fab'-X和Fab'-Y组合或滴定的BYbe。将Fab'-X和Fab'-Y组合或BYbe与细胞再孵育90分钟。此后，通过在37℃加5％CO2下加入25μg/mL山羊F(ab')2抗-人IgM(Southern Biotechnology)，持续15分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)终止信号传导反应。然后将平板在室温下放置15分钟，然后以500xg离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将其再悬浮于FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mM EDTA)中并再洗涤一次。然后将细胞重悬于冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和抗磷酸化的PLCγ2、抗磷酸化的Akt和抗磷酸化的p38抗体(BD Biosciences)对细胞进行染色。然后将平板重悬并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将平板再洗涤两次并重悬于20μL FACS缓冲液中。使用Intellicyt流式细胞仪测量CD20和磷酸-PLCγ2、磷酸-Akt和磷酸-p38的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴别为不同于其他细胞群体，并计算每个孔的PLCγ2、Akt和p38水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
结果
PhosFlow测定：图15中的数据显示以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗-IgM刺激的B-细胞中的磷酸化PLCγ2。图16中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可抑制用抗-IgM刺激的B细胞中的磷酸化P38。图17中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗-IgM刺激的B细胞中的磷酸化Akt。
活化标志物测定：如在图18中可看到的，数据显示以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可抑制用抗-IgM刺激的B细胞上的CD71表达。图19中的数据显示以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可抑制用抗-IgM刺激的B细胞上的CD40表达。图20中的数据显示以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗-IgM刺激的B细胞上的CD86表达。
实施例9-以分子性连接的双特异性Bybe形式与进一步添加抗-白蛋白结合结构域以延长体内半衰期来共靶向抗原CD79b加抗原CD22的活性的比较。
简介：为了检查在Fab-Kd-Fab异二聚体系链束缚的筛选复合物中鉴定的CD79b/CD22靶标对活性可以转化为具有抗白蛋白靶向的体内半衰期延长的潜在治疗性分子性连接的形式中的相似的所需活性，通过具有序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)的接头将抗-白蛋白抗体片段与如实施例8中所述的BYbe形式的抗原CD22 Fab的轻链融合。在添加和不添加抗白蛋白片段(VR0645)的情况下以Bybe形式生成抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD22特异性(VR4130和VR4126)。
本实验中使用的构建体的描述。
方法
具有/不具有抗白蛋白额外特异性的BYbe的纯化
如下纯化BYbe(Fab-dsscFv[缺乏Fab重链的C末端的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[缺乏Fab重链和轻链的C-末端的scFv])。将来自标准expiHEK或CHO表达的澄清细胞培养物上清液进行0.22μm无菌过滤。将过滤的上清液以2ml/分钟加载到50ml在pH7.4的PBS(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的GammabindPlus Sepharose XK26柱(GE Healthcare)上。加载后，用pH7.4的PBS洗柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.7进行洗脱。洗脱后测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰，然后用1/25体积的2MTris/HCl pH8.5中和。使用具有10kDa或30kDa分子量截留膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩经过中和的样品，并在甩平式转子中以4000xg离心。将浓缩的样品应用于在PBS，pH7.4中平衡的XK16/60或XK26/60Superdex200柱(GE Healthcare)。分别以1ml/分钟或2.6ml/分钟使用等度梯度的PBS，pH7.4对柱子进行展开。收集级分并在TSK凝胶G3000SWXL上通过尺寸排阻层析进行分析；以1M/分钟使用等度梯度的0.2M磷酸盐，pH7.0对5μm，7.8X 300mm柱子进行展开，在280nm处通过吸光度进行检测。将选定的单体级分合并，使用具有10kDa或30kDa分子量截留膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩至>1mg/ml，并在甩平式转子中以4000xg离心。测定最终样品；用A280Scanning UV-可见光分光光度计(Cary 50Bio)测量浓度；在TSK gel G3000SWXL上通过尺寸排阻层析法测定单体百分数；以1ml/分钟使用等度梯度的0.2M磷酸盐，pH7.0对5μm，7.8×300mm柱进行展开，通过280nm处的吸光度进行检测；通过以50mA(每凝胶)在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝胶(Novex)上运行还原和非还原性SDS-PAGE，持续53分钟；和通过Charles River’s便携式测试系统，利用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)测试盒测定内毒素。
将100nM的每种构建体纯化的蛋白质与来源于5个独立供体的人PBMC在37℃/5％CO2下于RMPI 1640培养基加10％胎牛血清和2mMGlutamax(R10培养基)中预孵育60分钟。60分钟后，仅用25ug/ml被设计为仅刺激B细胞的山羊抗IgM抗体刺激细胞。24小时后，将板置于冰上以停止任何进一步的细胞活化，然后用冰冷的流式细胞术缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)洗涤一次。除去所有上清液并重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上并加入抗CD19、CD20、CD27、CD71和CD86抗体的混合物。将细胞孵育60分钟，然后在流式细胞术缓冲液中洗涤两次。使用iQUE高通量流式细胞仪生成抗-CD27、-CD71和-CD86与CD19/CD20阳性B细胞的结合的数据。使用Forecyt软件来生成直方图并导出抗-CD27、-CD71和CD86抗体与B细胞结合的几何平均强度读数。将此数据导入到Excel中，并为每个组合生成百分比抑制值。然后将数据导入到Graphpad Prism中，并为每个组合生成盒须形图，其中用“+”表示平均值。
图21显示由VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白诱导的对B细胞上CD27表达的抑制。在所测试的5个供体中，两者均显示出始终相似的对抗IgM诱导的CD27的抑制水平。图22显示由VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白诱导的对B细胞上CD71表达的抑制。在5个供体中，两者均显示出始终相似的对抗IgM诱导的CD71的抑制水平。图23显示由VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白诱导的对B细胞上CD86表达的抑制。在5个供体中，两者均显示出始终相似的对抗IgM诱导的CD86的抑制水平。
图24显示VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白诱导的对B细胞上CD27表达的抑制。在所测试的5个供体中，两者均显示出始终相似的对抗IgM诱导的CD27的抑制水平。图25显示VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白诱导的对B细胞上CD71表达的抑制。在5个供体中，两者均显示出始终相似的对抗IgM诱导的CD71的抑制水平。图26显示由VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白诱导的对B细胞上CD86表达的抑制。在5个供体中，两者均显示出始终相似的对抗IgM诱导的CD86的抑制水平。
实施例10-使用进一步添加或不添加抗白蛋白的分子性连接的双特异性Bybe共同靶向抗原CD79b加抗原CD22对记忆B细胞功能的效果。
简介：为了评估靶向CD79b/CD22在长期培养中是否对B细胞具有功能性作用，测量了来自分离培养的或在混合的PBMC培养物中培养的B细胞的IgG产生。回忆抗原破伤风类毒素的特异性抗体的测量提供了记忆B细胞功能的读出。
以添加或不添加抗白蛋白片段(VR0645)的BYbe形式产生抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD22特异性(VR4126、VR4127和VR4130)。如实施例8中所述，通过具有序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)的接头将抗白蛋白抗体片段与BYbe形式的抗原CD22 Fab的轻链融合。
本实验中使用的构建体的描述。
方法
具有/不具有抗白蛋白额外特异性的BYbe的纯化
如实施例9中所述纯化BYbe(Fab-dsscFv[无Fab重链C末端的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[无Fab重链和轻链C-末端的scFv]。
B细胞的活化和破伤风类毒素特异性IgG的测量
在1640培养基加10％胎牛血清和2mM Glutamax(R10培养基)中，用500ng/mlCD40L，1ug/ml CpG和50ng/ml IL-21刺激源自多达3个独立供体的人PBMC或纯化的B细胞6天。在第0天以100nM的终浓度添加纯化的蛋白质的构建体，并在测定期间保持在培养基中。6天后，收集上清液，通过ELISA检测破伤风类毒素特异性IgG的量。简言之，将Maxisorp半孔ELISA板(Nunc)在用PBS中的10ug/ml破伤风类毒素于4℃包被过夜。然后将平板在含有0.05％吐温20的PBS中的5％牛奶中封闭2小时。稀释上清液，然后在室温下添加上清液，持续2小时。用PBS-0.05％吐温20洗涤平板，并使用在5％牛奶-PBS-0.05％吐温20中稀释至1ug/ml的过氧化物酶-山羊抗人IgG(H+L)检测破伤风结合抗体。使用TMB底物溶液(KPL)将板显色，使用Synergy 2微型读板仪(Biotek)在450nM处测量吸光度。将数据输出到Excel中，并且相对于在测试抗体不存在的情况下培养的细胞计算百分比抑制。然后将数据导入Graphpad并绘制为条形图。
图27显示从用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130 BYbe培养的PBMC产生破伤风类毒素IgG的抑制。数据代表来自3个供体的汇总数据。
图28显示从用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130 BYbe培养的纯化的B细胞产生破伤风类毒素IgG的抑制。数据代表来自2个供体的汇总数据。
图29显示从用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe、VR4447/VR4130 BYbe、VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白培养的PBMC或纯化的B细胞产生破伤风类毒素IgG的抑制。显示的数据来自一个供体。
实施例11-SLE患者B细胞中的BCR信号传导的失调以及共同靶向抗原CD79b加抗原CD22对SLE B细胞功能的效果。
简介：为了评估CD79b/CD22的组合是否可用于治疗患有自身免疫性疾病的人，我们将系统性红斑狼疮(SLE)患者的B细胞用作模型系统。测试了CD79b/CD22组合(VR4447/VR4130)对已知参与B细胞功能但在SLE患者中与健康志愿者相比发生失调的信号传导蛋白的活化状态的影响。在该实验中，比较了来自12名SLE患者和12名健康志愿者的B细胞中共靶向CD79b和CD22对其活化状态的效果。
方法：
PhosFlow测定：所有测定均使用2x105个PBMC/孔进行。
在处理的样品中，以100nM的浓度测试抗原CD79b和抗原CD22特异性BYbe。将来自健康志愿者和SLE患者的PBMC在37℃与BYbe预孵育90分钟。在未处理的样品中，在该孵育期期间只省略了BYbe。此后，在37℃加5％CO2下用25μg/mL山羊F(ab')2抗-人IgM(SouthernBiotechnology)活化细胞10分钟，通过加入固定剂(Cytofix-BD Biosciences)终止反应。在未刺激的样品中，在该孵育期期间只省略了抗人IgM。在室温下进行15分钟后，将细胞沉淀(500xg，5分钟)，然后重悬于冰冷的Perm缓冲液III(BD Biosciences)中，然后在流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mM EDTA)中洗涤2次。然后用抗CD20、抗磷酸化(p)NF-κB、抗pSyk、抗pAtk和抗pErk1&2染色细胞，并在室温下于黑暗中孵育1小时。最后，将板在流动缓冲液中洗涤两次，然后在iQUE流式细胞仪(Intellicyt)上测量。然后计算B细胞中pNF-βB、pSyk、pAkt和pErk1&2表达的几何平均值(平均荧光强度，MFI)，并以图形形式表示。
结果：
图30显示，与健康志愿者的那些相比，在SLE患者B细胞中NF-κB、Syk、Akt和Erk1&2(未刺激的和未处理的)的基线磷酸化升高。
图31至34显示CD79/CD22 BYbe可以等同地抑制健康志愿者和SLE患者中的pNF-kB、pSyk、pAkt和pErk1&2。
结论：
该数据显示，与健康志愿者相比，来自SLE患者的B细胞在任何体外刺激之前被活化。通过B细胞受体刺激细胞后，健康志愿者和SLE患者均表现出与背景信号相比增强的活化水平。在健康志愿者和SLE患者中，该信号基本上被CD79b/CD22组合阻断。该数据表明，CD79b/CD22组合可抑制来自健康志愿者以及具有潜在自身免疫疾病的人的B细胞，表明该途径对B细胞活化具有根本重要性。
实施例12-CD45 Fab/CD79Fab双特异性复合物但非CD45和CD79Fab的混合物或二价CD79 Fab复合物抑制Akt信号传导
将源自血小板单采血成分术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对细胞表面蛋白CD45和CD79b具有抗原特异性的Fab'-A(Fab-scFv)和Fab-B(Fab-肽)或者Tab-A(Fab-肽)和Fab-B(Fab-肽)来产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表10所示。
表10：对CD45和CD79b具有特异性的抗体的双特异性和二价组合的网格。
其中X为scFv(52SR4)而Y为肽(GCN4)
将FabA-X和FabB-Y或FabA-Y和FabB-X一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)8分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BDBiosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗磷酸Akt抗体染色细胞，所述荧光标记的抗磷酸Akt抗体识别蛋白质上位置473处的经修饰的丝氨酸残基。然后将板重悬浮并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和Akt的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的Akt水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD45和CD79b的组合的相对效果显示在表11中(↓＝抑制，↑＝刺激，而＝没有总体效应)。
表11：具有针对CD45和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化Akt的相对效力的表。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)。
该数据也以条形图(图35)的形式显示：数据表示平均值，误差棒是95％置信区间。数据显示，CD45与CD79b的双特异性组合可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸-Akt表达，而组合CD79b-Y与CD79b-Y(其为不能形成双特异性的混合物)不抑制所述磷酸-Akt表达。
实施例13-CD45 Fab/CD79Fab双特异性复合物而非CD45和CD79 Fab的混合物或二价CD79 Fab'复合物抑制PLCγ2信号传导
将源自血小板单采血成分术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对于细胞表面蛋白CD45和CD79b具有抗原特异性的Fab-a(Fab-scFv[A-X])和Fab’-B(Fab-肽[B-Y])或Fab-A(Fab-肽)和Fab-B(Fab-肽)来产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表10所示。
将Fab’A-X和Fab’B-Y或Fab-A-Y和Fab-B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)8分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BDBiosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流动缓冲液中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm缓冲液III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗磷酸PLCγ2抗体染色细胞，所述荧光标记的抗磷酸PLCγ2抗体识别蛋白质上位置759处的经修饰的酪氨酸残基。然后将板重悬浮并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl的流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和PLCg2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD45与CD79b的组合的相对效果显示在表12中(↓＝抑制，↑＝刺激，而＝没有总体效应)。
表6：具有针对CD45和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化PLCg2的相对效力的表。
其中X是scFv而Y是肽
该数据也可表示为条形图(图36)，数据表示平均值，误差棒为95％置信区间。数据显示，CD45与CD79b的双特异性组合可抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸-PLCγ2表达，而组合CD79b-Y与CD79b-Y(其为不能形成双特异性的混合物)不抑制所述磷酸-Akt表达。
实施例14-双特异性CD45和CD79b复合物可强力地抑制B细胞上的CD86表达
将源自血小板单采血成分术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔浓度(500nM)量的对细胞表面蛋白CD45和CD79b具有抗原特异性的Fab-X(Fab-scFv)和Fab-Y(Fab-肽)来产生双特异性组合。将这些组合以1比2.5的稀释度逐步稀释8次，以产生用于该组合的剂量滴定。将Fab-X和Fab-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC添加至Fab’-X和Fab’-Y组合，并一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)24小时来活化B细胞。为了能够检测细胞表面激活标志物，将板置于冰上，并在冰冷的流动缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗涤一次。然后用荧光标记的抗CD19抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗CD86抗体染色细胞，并在冰上于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl的流动缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD19和CD86的细胞表达。使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。如图37中所见，CD45-X/CD79b-Y组合的滴定能够在24小时后抑制B细胞上抗-IgM诱导的CD86表达。使用Graphpad Prism 6，利用四参数逻辑曲线拟合外推的IC50为4.7nM(数据表示平均值，误差棒为标准偏差)。
实施例15-可以用不同的抗体V区再现CD45和CD79b双特异性蛋白质的抑制作用
免疫：通过基因合成或商业来源获得编码抗原CD79a和CD79b和CD45的DNA，并将其克隆到具有强组成型启动子的表达载体中。然后使用内部电穿孔系统将质粒DNA转染到Rab-9兔成纤维细胞(CRL-1414TM)中。对于CD79免疫，共转染CD79a和CD79b。24小时后，通过流式细胞术检查细胞的抗原表达，并在液氮中以等分试样冷冻直至使用。通过在同一细胞上共表达或者制备单一或多重转染细胞的混合物，每只兔免疫多达6种抗原。用3剂量的细胞免疫兔。
抗体发现：使用与Zubler等(1985)描述的方法类似的方法制备B细胞培养物。简言之，将来自被免疫兔的脾或PBMC衍生的B细胞以约2000-5000个细胞/孔的密度在具有200μl/孔RPMI 1640培养基(Gibco BRL)的条形码化的96孔组织培养板中在37℃下、在5％CO2气氛中培养7天，所述RPMI 1640培养基补充有10％FCS(PAA laboratories ltd)、2％HEPES(Sigma Aldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、3％激活的脾细胞培养物上清液和γ照射的突变体EL4鼠胸腺瘤细胞(5x104个/孔)。
B细胞培养上清液中抗原特异性抗体的存在使用基于均匀荧光的结合测定法，使用被CD79a和CD79b或CD45共转染的HEK293细胞进行测定。筛选涉及使用Matrix Platemate液体处理器将10ul来自条形码化的96-孔组织培养板的上清液转移至包含用靶抗原转染的HEK293细胞(约3000个细胞/孔)的条形码化384孔黑壁测定板中。用山羊抗兔IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。
初次筛选后，使用Aviso Onyx命中挑取机器人将阳性上清液固定在96孔条形码化的母板上，并将细胞培养板中的B细胞在-80℃冷冻。然后在基于均匀荧光的结合测定中，在用CD79a和CD79b或CD45抗原转染的HEK293细胞或用重组CD45蛋白(作为抗原来源)包被的SuperavidinTM珠(Bangs Laboratories)上筛选母板。这是为了确定每个孔的抗原特异性。
为了允许从感兴趣孔的选择中回收抗体可变区基因，进行拆分步骤以使得能够在含有B细胞的异质群体的给定孔中鉴定抗原特异性B细胞。这是使用荧光聚焦方法(Clargo等，2014.Mabs 2014 Jan 1:6(1)143-159；EP1570267B1)实现的。简言之，将来自阳性孔的分泌免疫球蛋白的B细胞与用靶抗原转染的HEK293细胞或用生物素化的靶抗原包被的链霉抗生物素蛋白珠(New England Biolabs)和1:1200最终稀释度的山羊抗兔Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)混合。在37℃下静态孵育1小时后，由于围绕B细胞的荧光晕的存在，可以鉴定抗原特异性B细胞。然后将使用奥林巴斯显微镜鉴定的多个这些个体B细胞克隆用Eppendorf微操作器挑取并沉积到PCR管中。荧光聚焦方法也用于从直接来自被免疫兔的骨髓的B细胞的异质群体中鉴定抗原特异性B细胞。
通过使用重链和轻链可变区特异性引物的逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收抗体可变区基因。进行两轮PCR，其中巢式二级PCR在3'和5'末端引入限制性位点，从而允许将可变区克隆到小鼠Fab-X和Fab-Y(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。将Fab-X和Fab-Y表达载体的重链和轻链构建体使用Fectin 293(Life Technologies)共转染到HEK-293细胞中，或使用Expifectamine(Life Technologies)将其共转染到Expi293细胞中，并在6孔组织培养板中于5ml的体积中表达重组抗体。在5-7天表达后，收获上清液。在基于均匀荧光的结合测定中在用抗原转染的HEK293细胞和包被有重组蛋白或抗原转染的HEK细胞的SuperavidinTM珠(Bangs Laboratories)上测试上清液。这是为了确认所克隆的抗体的特异性。
小规模Fab A-X和Fab B-Y的生产(小规模(50mL)Expi293转染)
将Expi293细胞在Expi293TM表达培养基中常规地传代培养至终浓度为0.5×106个活细胞/mL，并在轨道摇动培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃孵育。
在转染当天，使用自动化细胞计数器(Vi-CELL,Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。为了达到2.5x106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞悬浮液加入到无菌的250mL锥形摇瓶中，对于每50mL转染，通过加入新鲜的、预温的Expi293TM表达培养基来达到42.5mL的体积。
为了对每次转染制备脂质-DNA复合物，将总共50μg的重链和轻链质粒DNA在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至总体积为2.5mL，并将135μL的ExpiFectamineTM 293试剂(Life Technologies)在I培养基中稀释至总体积为2.5mL。将所有稀释液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟，然后将每种DNA溶液加入相应的稀释的Exp iFec tamineTM 293试剂中，以获得5mL的总体积。轻轻混合DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物，并在室温下孵育20-30分钟，以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将5mLDNA-ExpiFectamineTM293试剂复合物加入每个摇瓶中。将摇瓶在轨道摇床培养箱(Multitr On，InfOrs HT)中以120rpm，8％CO2和37℃孵育。
转染后约16-18小时，向每个摇瓶中加入250μL的ExpiFectamineTM 293转染增强剂1(LifeTechnologies)和2.5mL的ExpiFectamineTM 293转染增强剂2(LifeTechnologies)。
转染后7天收获细胞培养物。将细胞转移到50mL旋转管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，然后通过0.22um Stericup(Merck Millipore)无菌过滤。将经澄清和无菌过滤的上清液储存在4℃。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
小规模(50ml)纯化：使用小规模基于真空的纯化系统通过亲和捕获分别纯化Fab-X和Fab-Y二者。简言之，将50ml培养物上清液经0.22μm无菌过滤，然后加入500μL NiSepharose珠(GE Healthcare)。然后将上清液珠混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空除去上清液。然后用洗涤液1(50mM磷酸钠、1M NaCl，pH 6.2)和洗涤液2(0.5M NaCl)洗涤珠粒。用50mM乙酸钠，pH4.0+l M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中并进行0.22μm过滤。通过A280扫描、SE-UPLC(BEH200方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)和使用PTS Endosafe系统(针对内毒素)测定最终汇集物。
将源自血小板单采血成分术圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在RPMI 1640(Life Technologies)中洗涤并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％胎牛血清、50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI1640中稀释等摩尔浓度(200nM)量的对细胞表面蛋白CD45和CD79b具有抗原特异性的Fab'-X(Fab-scFv)和Fab’-Y(Fab-肽)来产生抗体的双特异性、二价或混合物组合。3种不同CD79b Fab-Y和2种不同CD45 Fab-X的这些组合示于表13中。
表13：对CD45和CD79b具有特异性的双特异性蛋白质的网格。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
将FabA-X和FabB-Y一起孵育60分钟(在37℃和5％CO2环境中)，然后与2.5x105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加FabA-X和/或FabB-Y组合一起再孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入12.5μg/mL山羊F(ab')2抗-人IgM(Southern Biotechnology)，进行10分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)终止信号传导反应。然后将平板在室温下放置15分钟，然后以500xg离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将其再悬浮于FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mM EDTA)中并再洗涤一次。然后将细胞重悬于冰冷的Perm缓冲液III(BD Biosciences)中30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和抗磷酸PLCγ2抗体对细胞进行染色。所述抗磷酸PLCγ2识别位置759处的经修饰的酪氨酸残基。然后将平板重悬并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将平板再洗涤两次并重悬于40μL流动缓冲液中。使用Intellicyt流式细胞仪测量CD20和磷酸-PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴别为不同于其他细胞群，并计算每个孔的PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大响应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
如从图38中可以看到的，数据显示CD45与CD79b(具有不同抗体V区)的组合可以抑制用抗-IgM刺激的B细胞中的磷酸-PLCγ2表达。
实施例16如先前在实施例7中所述的大组的网格筛选
结果
计算每种Fab-Kd-Fab[即其中A和B是Fab片段的A-X:Y-B]组合对BCR信号传导级联蛋白的磷酸化的诱导的抑制百分比，在该实施例中寻找抑制B细胞功能的抗原的新组合，将阳性组合的标准设定为至少一个V区组合对至少两个磷酸化读数有至少30％的抑制。根据该阈值，在315次检查中有11个新的抗原对组合符合所要求的标准。这代表了3.5％的命中率，证明了筛选大量组合以发现期望活性的重要性，以及CC79b和CD45的组合的活性是多么罕见。
图10-12显示了抗原网格交叉特异性的数据。值分别是Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分比(对于激活是负值)，并且表示被评估的多个V区组合的平均值。测试了315种不同的抗原组合，并且如可看出的，不同抗体组合对BCR信号传导的效应从强烈抑制(例如Fab-X上的抗原2(CD79b)与Fab-Y上的抗原4(CD45)的组合(对磷酸Syk有70.4％的抑制，图10)至激活(例如X上的抗原6和Y上的抗原11(-118.10％的磷酸Syk，图10))变化很大。
在图39中显示了针对Fab-X上的抗原2(CD79b)和Fab-Y上的抗原4(CD45)的代表图10-12中所示的平均百分比值的每个数据点。在这种情况下，评估了不同抗体V区域的10种不同组合。图40中显示了相同的抗原组合但采用另一种取向，即Fab-Y上的抗原2(CD79b)和Fab-X上的抗原4(CD45)。在这种情况下，评估了不同抗体V区的6种不同组合。再次地，所有的V区均显示出抑制作用，但可使用所述方法鉴定和选择最佳V区组合。
实施例17-在异二聚体系链束缚的蛋白质复合物中用纯化的抗CD79b Fab-Y筛选作为Fab-X的针对抗原CD45的瞬时表达的V区，以选择最佳的抗CD45抗体V区
简介：使用异二聚体系链束缚的蛋白质复合物的网格筛选，鉴定作为双特异性抗体与CD79b特异性V区的组合抑制B细胞信号传导的针对CD45的新V区。将CD45 V区瞬时表达为Fab-X并与纯化的抗CD79bFab-Y组合。测量对B细胞信号传导的激活的抑制，以选择最有效力的抗CD45和抗CD79b V区。
以与实施例6中所述相同的方式进行抗原表达细胞的制备和兔的免疫。
抗体发现：以与实施例6中所述相同的方式制备B细胞培养物。
以与实施例6相同的方式测定B细胞培养上清液中的抗原特异性抗体的筛选和鉴定抗原特异性B细胞的拆分步骤。
使用重链和轻链可变区特异性引物通过逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收抗体可变区基因。进行两轮PCR，其中巢式二级PCR在3'和5'末端引入限制性位点，允许将可变区克隆到小鼠Fab-X和小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。随后将这些载体使用Fectin 293(LifeTechnologies)共转染到HEK-293细胞中或使用Expifectamine(Life Technologies)将其共转染到Expi293细胞中，并让其表达6天。在基于均匀荧光的结合测定中在用抗原转染的HEK293细胞和包被有重组蛋白的SuperavidinTM珠(Bangs Laboratories)或抗原转染的HEK细胞上测试上清液。这样做是为了确认所克隆的抗体的特异性。
除了Fab-X瞬时上清液以外，还使用无关对照DNA以相同方式制备阴性对照模拟物上清液。
通过蛋白质G-HPLC测定Fab-X的表达水平。
纯化的Fab-X和Fab-Y的生产：纯化的Fab-X和Fab-Y使用与实施例6中所述相同的方法制备。
PhosFlow测定：将纯化的或瞬时上清液中的CD79b特异性Fab-Y和CD45特异性Fab-X以200nM和90nM的等摩尔浓度一起孵育60分钟(在37℃和5％CO2的环境中)。模拟物上清液也包括在内。在V底96孔板中，向孔中加入5.0x104个PBMC，向其中加入滴定的Fab-X和Fab-Y组合或模拟物上清液。然后将组合和细胞一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃加5％CO2下加入25μg/mL山羊F(ab')2抗-人IgM(Southern Biotechnology)，进行15分钟来活化B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)来终止信号传导反应。然后将平板在室温下放置15分钟，然后以500xg离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀再悬浮于FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mM EDTA)中并再洗涤一次。然后将细胞重悬于冰冷的Perm缓冲液III(BD Biosciences)中30分钟，然后在流动缓冲液中洗涤两次。
然后如实施例6中所述对细胞染色，不同之处在于不是使用3种不同的抗体混合物，而是以与实施例6中针对抗体混合物A所述相同的测定浓度和孵育条件使用仅一种混合物。
抗体混合物＝1:3 CD20 PerCp-Cy5.5+1:5 PLCγ2 AF88+1:10 Akt AF647+1:5p38 MAPK PE(在FACS缓冲液中稀释)。
结果
如在图41至46中可看到的，数据显示Fab-X中不同的瞬时表达的抗原CD45 V区与Fab-Y中2个不同的纯化的抗原CD79b V区(VR447和VR4450)的组合可在不同水平上抑制B细胞活化(如通过PLCγ2、p38和Akt的抑制所测量)，因此以其双特异性形式进行筛选将有利于选择最佳V区组合。将与瞬时Fab-X的组合与具有纯化的CD45 Fab-X(VR4122)的参考组合进行比较。
实施例18–使用进一步添加或不添加抗白蛋白的分子性连接的双特异性Bybe共靶向抗原CD79b加抗原CD45对记忆B细胞功能的效果
简介：为了检查靶向CD79b/CD45在长期培养中对B细胞的功能效果，测量混合PBMC培养物中来自B细胞的IgG产生。针对回忆抗原破伤风类毒素的特异性抗体的测量提供了记忆B细胞功能的读出。
在添加或不添加抗白蛋白片段(VR0645)的情况下以BYbe形式生成抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD45特异性(VR4248和VR4133)。如实施例8中所述，将抗白蛋白抗体片段与BYbe形式的抗原CD45 Fab的轻链融合。
本实验中使用的构建体的描述。
方法
具有/不具有抗白蛋白额外特异性的BYbe的纯化
如下纯化BYbe(Fab-dsscFv[无Fab重链C末端的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[无Fab重链和轻链C-末端的scFv])形式。将来自标准expiHEK或CHO表达的澄清细胞培养物上清液进行0.22μm无菌过滤。将过滤的上清液以2ml/分钟加载到在PBSpH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的50ml GammabindPlus Sepharose XK26柱(GE Healthcare)上。加载后，用pH7.4的PBS洗柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.7进行洗脱。洗脱后测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰，然后用1/25体积的2M Tris/HCl pH8.5中和。使用具有10kDa或30kDa分子量截留膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩经中和的样品，并在甩平式转子中以4000xg离心。将浓缩的样品应用于在PBS，pH7.4中平衡的XK16/60或XK26/60Superdex200柱(GE Healthcare)。分别以1ml/分钟或2.6ml/分钟使用等度梯度的PBS，pH7.4对柱子进行展开。收集级分并且在TSK凝胶G3000SWXL上通过尺寸排阻层析进行分析；以1ml/分钟使用等度梯度的0.2M磷酸盐，pH7.0对5μm，7.8X 300mm柱子进行展开，在280nm处通过吸光度进行检测。将选定的单体级分合并，使用具有10kDa或30kDa分子量截留膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩至>1mg/ml，并在甩平式转子中以4000xg离心。测定最终样品；用A280扫描式UV-可见光分光光度计(Cary 50Bio)测量浓度；在TSK gel G3000SWXL上通过尺寸排阻层析法测定单体百分数；以1ml/分钟使用等度梯度的0.2M磷酸盐，pH7.0对5μm，7.8×300mm柱进行展开，通过280nm处的吸光度进行检测；通过以50mA(每凝胶)在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝胶(Novex)上运行还原和非还原性SDS-PAGE，持续53分钟；和通过Charles River’s便携式测试系统，利用LimulusAmebocyte Lysate(LAL)测试盒测定内毒素。
B细胞的活化和破伤风类毒素特异性IgG的测量
在1640培养基加10％胎牛血清和2mM Glutamax(R10培养基)中，用500ng/mlCD40L，1ug/ml CpG和50ng/ml IL-21刺激人PBMC6天。在第0天以100nM的终浓度添加纯化的蛋白质的构建体，并在测定期间保持在培养基中。6天后，收集上清液，通过ELISA检测破伤风类毒素特异性IgG的量。简言之，将Maxisorp半孔ELISA板(Nunc)用PBS中的10ug/ml破伤风类毒素于4℃包被过夜。然后将平板在含有0.05％吐温20的PBS中的5％牛奶中封闭2小时。稀释上清液，然后在室温下添加上清液，持续2小时。用PBS-0.05％吐温20洗涤平板，并使用在5％牛奶-PBS-0.05％吐温20中稀释至1ug/ml的过氧化物酶-山羊抗人IgG(H+L)检测破伤风结合抗体。使用TMB底物溶液(KPL)将板显色，使用Synergy 2微型读板仪(Biotek)在450nM处测量吸光度。将数据输出到Excel中，并且计算相对于在测试抗体不存的情况下培养的细胞的百分比抑制。然后将数据导入Graphpad并绘制为条形图。
图47显示对用VR4447/VR4248 BYbe、VR4447/VR4133 BYbe、VR4447/VR4248/VR645BYbe/白蛋白和VR4447/VR4133/VR645 BYbe/白蛋白培养的PBMC中破伤风类毒素IgG产生的抑制。显示的数据来自单个供体。
实施例19人源化方法
通过将来自兔抗体V区的CDR移植至人种系抗体V区框架上来设计前述实施例中获得的和本文图51中提供的抗体的人源化形式。为了提高恢复抗体活性的可能性，来自兔V区的许多框架残基也保留在设计的人源化序列中。使用Adair等(1991)(Humanisedantibodies.WO91/09967)概述的方案选择这些残基。从供体移植到受体序列的CDR是如Kabat(Kabat等，1987)所定义的，但其中使用组合的Chothia/Kabat定义的CDRH1除外(参见Adair等，1991 Humanisedantibodies.WO91/09967)。通常兔抗体的VH基因比选择的人VH受体基因短。当与人受体序列比对时，兔抗体的VH区的框架1通常缺少保留在人源化抗体中的N-末端残基。兔抗体VH区的框架3通常在β-折叠链D与E之间的环中缺乏一个或两个残基(75，或75和76)：在人源化抗体中，缺口用来自选择的人受体序列的相应残基填充。
图51中提供了人源化序列，供体残基以粗体显示并加以下划线。还提供了变体CDR序列。
表达和测试对抗体4450的某些移植物，参见实施例21。
CD79 Ab 4447
选择人V区IGKV1D-13加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4447轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4447 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置2、3、36、46、49和70(Kabat编号)：谷氨酰胺(Q2)、缬氨酸(V3)、亮氨酸(L36)、谷氨酰胺(Q46)、组氨酸(H49)和谷氨酰胺(Q70)。
在一些情况下，可以突变CDRL3以去除一对半胱氨酸残基(CDRL3变体1或CDRL3可以被突变以去除仅一个半胱氨酸残基CDRL3变体2和3)。
选择人V-区IGHV3-48加JH4 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4447的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4447 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、48、49、71、73和78(Kabat编号)：缬氨酸(V24)、异亮氨酸(I48)、甘氨酸(G49)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)和缬氨酸(V78)。
选择人V区IGHV4-59加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4447的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4447 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置37、67、71、73和78(Kabat编号)：缬氨酸(V37)、苯丙氨酸(F67)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化：抗体和抗体片段的N末端上谷氨酰胺至焦谷氨酸的转化被广泛报道。
CD79 Ab 4450
选择人V区IGKV1-6加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4450轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4450 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置3和70(Kabat编号)：天冬氨酸(D3)和谷氨酰胺(Q70)。某些情况下，可将CDRL3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRL3变体1-3)。
选择人V-区IGHV3-66加JH4 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4450的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4450 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、48、49、73和78(Kabat编号)：缬氨酸(V24)、异亮氨酸(I48)、甘氨酸(G49)、丝氨酸(S73)和缬氨酸(V78)。
选择人V区IGHV4-59加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4450的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4450 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置37、67、71、73和78(Kabat编号)：缬氨酸(V37)、苯丙氨酸(F67)、精氨酸(R71)、丝氨酸S73)和缬氨酸(V78)。将人框架位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。
CD22 Ab 4120
选择人V-区IGKV1D-13加JK4 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4120轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4120 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置2和3(Kabat编号)：苯丙氨酸(F2)和谷氨酸(E3)。
选择人V-区IGHV3-33加JH4 J-区(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为抗体4120的重链CDR的受体。除CDR以外，来自4120 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置11、48、71、73、76和78(Kabat编号)：亮氨酸(L11)、异亮氨酸(I48)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。
在一些情况下，可以突变CDRH1和CDRH2以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
选择人V区IGHV4-38-2加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4120的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4120 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、37、49、67、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、缬氨酸(V37)、丙氨酸(A49)、苯丙氨酸(F67)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。
在一些情况下，可以突变CDRH1和CDRH2以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
CD22 Ab 4126
选择人V-区IGKV1-5加JK4 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4126轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4126 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置3和70(Kabat编号)：缬氨酸(V3)和谷氨酰胺(Q70)。
选择人V区IGHV3-7加JH4 J区(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为抗体4126的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4126 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置71、73、76和78(Kabat编号)：赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。
在一些情况下，可以突变CDRH1、CDRH2和CDRH3以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体、CDRH2变体和CDRH3变体)。
选择人V区IGHV4-4加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4126的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4126 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、48、49、67、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、缬氨酸(V48)、丙氨酸(V48)、苯丙氨酸(F67)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。
在一些情况下，可以突变CDRH1、CDRH2和CDRH3以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体、CDRH2变体和CDRH3变体)。
CD22 Ab 4127
选择人V-区IGKV1-5加JK4J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4127轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4127 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置1、3和70(Kabat编号)：丙氨酸(A1)、缬氨酸(V3)和谷氨酰胺(Q70)。在一些情况下，可将CDRL3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRL3变体1-15)。
选择人V-区IGHV3-9加JH4 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4127的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4127 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置47、48、49、71、73、76、78和94(Kabat编号)：亮氨酸(L47)、异亮氨酸(I48)、甘氨酸(G49)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)、缬氨酸(V78)和精氨酸(R94)。
在一些情况下，可以突变CDRH1和CDRH2以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
选择人V区IGHV4-38-2加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4127的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4127 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、37、47、67、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、缬氨酸(V37)、亮氨酸(L47)、苯丙氨酸(F67)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可以突变CDRH1和CDRH2以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
CD22 Ab 4128
选择人V-区IGKV1-5加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4128轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4128 VK基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以保留在位置3、36、63、65、66和71(Kabat编号)：缬氨酸(V3)、苯丙氨酸(F36)、赖氨酸(K63)、天冬氨酸(D65)、精氨酸(R66)和酪氨酸(Y71)。
选择人V-区IGHV3-33加JH4 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4128的重链CDR的受体。除CDR以外，来自4128 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置11、23、24、48、71、73、76和78(Kabat编号)：亮氨酸(L11)、赖氨酸(K23)、甘氨酸(G24)、异亮氨酸(I48)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可以突变CDRH1和CDRH2以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
选择人V-区IGHV4-59加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4128的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4128 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置23、24、37、49、67、71、73、76和78(Kabat编号)：赖氨酸(K23)、甘氨酸(G24)、缬氨酸(37)、丙氨酸(A49)、苯丙氨酸(F67)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可以突变CDRH1和CDRH2以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
CD22 Ab 4130
选择人V区IGKV1-9加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4130轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4130 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置1、2和3(Kabat编号)：丙氨酸(A1)、丙氨酸(A2)和缬氨酸(V3)。
选择人V-区IGHV3-66加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4130的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4130 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置48、49、67、71、73、76和78(Kabat编号)：异亮氨酸(I48)、甘氨酸(G49)、缬氨酸(V67)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。在一些情况下，可以突变CDRH2以去除半胱氨酸残基和/或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH2变体1-5)。也可将CDRH3突变以修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH3变体1-2)。
选择人V区IGHV4-4加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4130的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4130 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可将CDRH2突变以除去半胱氨酸残基和/或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH2变体1-5)。也可将CDRH3突变以修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH3变体1-2)。
CD22 Ab 4132
选择人V区IGKV1-5加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4132轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4132 VK基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置3和71(Kabat编号)：缬氨酸(V3)和酪氨酸(Y71)。
选择人V区IGHV3-21加JH4 J区(IMGT，http：//www.imgt.org/)作为抗体4132的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4132 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置48、49、71、73、76和78(Kabat编号)：丝氨酸(S48)、甘氨酸(G49)、天冬酰胺(N71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。
在一些情况下，可将CDRH1突变以除去半胱氨酸残基(CDRH1变体)。也可将CDRH2突变以去除半胱氨酸残基和/或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH2变体1-5)。
选择人V-区IGHV4-4加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4132的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4132 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、48、67、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、丝氨酸(S48)、苯丙氨酸(F67)、天冬酰胺(N71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可将CDRH1突变以除去半胱氨酸残基(CDRH1变体)。也可将CDRH2突变以去除半胱氨酸残基和/或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH2变体1-5)。
CD45 Ab 4122
选择人V-区IGKV1-5加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4122轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4122 VK基因的下列框架残基(供体残基)可保留在位置71(Kabat编号)：酪氨酸(Y71)。在一些情况下，可将CDRL3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRL3变体1-2)。
选择人V-区IGHV3-7加JH2 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4122的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4122 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置48、71、73、76和78(Kabat编号)：异亮氨酸(I48)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。
在一些情况下，可将CDRH1突变以除去半胱氨酸残基(CDRH1变体)。也可将CDRH2突变以去除半胱氨酸残基和/或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH2变体1-7)。
选择人V-区IGHV2-70加JH2 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4122的重链CDR的备选受体。除CDR以外，来自4122 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、37、44、48、67、73和76(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、缬氨酸(V37)、甘氨酸(G44)、异亮氨酸(I48)、苯丙氨酸(F67)、丝氨酸(S73)和苏氨酸(T76)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可将CDRH1突变以除去半胱氨酸残基(CDRH1变体)。也可将CDRH2突变以去除半胱氨酸残基和/或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点(CDRH2变体1-7)。
CD45 Ab 4129
选择人V区IGKV1-5加JH4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4129轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4129 VK基因的下列框架残基(供体残基)可保留在位置70(Kabat编号)：谷氨酰胺(Q70)。
在一些情况下，可将CDRL3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRL3变体1-2)。
选择人V区IGHV3-7加JH2 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4129的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4129 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置48、71、73、76和78(Kabat编号)：异亮氨酸(I48)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。
在一些情况下，可将CDRH1和CDRH2突变以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
选择人V-区IGHV2-70加JH2 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4129的重链CDR的备选受体。除CDR以外，来自4129 VH基因的下列框架残基(供体残基)中的一个或多个也可分别保留在位置24、37、44、48、67、73和76(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、缬氨酸(V37)、甘氨酸(G44)、异亮氨酸(I48)、苯丙氨酸(F67)、丝氨酸(S73)和苏氨酸(T76)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)以提供均质产物的表达和纯化。在一些情况下，可将CDRH1和CDRH2突变以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。
CD45 Ab 4131
选择人V区IGKV1-12加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4131轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4131 VK基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以分别保留在位置3和63(Kabat编号)：缬氨酸(V3)和赖氨酸(K63)。
在一些情况下，可将CDRL3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRL3变体1-3)。
选择人V区IGHV3-7加JH2 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4131的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4131 VH基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以分别保留在位置48、69、71、73、76和78(Kabat编号)：异亮氨酸(I48)、缬氨酸(V69)、谷氨酸(E71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。
在一些情况下，可将CDRH2突变以除去半胱氨酸残基(CDRH2变体)。
选择人V区IGHV4-31加JH2 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4131的重链CDR的备选受体。除了CDR以外，来自4131 VH基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以分别保留在位置24、37、49、67、69、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、缬氨酸(V37)、丙氨酸(A49)、苯丙氨酸(F67)、缬氨酸(V69)、谷氨酸(E71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。
在一些情况下，可将CDRH2突变以除去半胱氨酸残基(CDRH2变体)。
CD45 Ab4133
选择人V区IGKV1D-13加JK4 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4133轻链CDR的受体。除了CDR以外，来自4133 VK基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以分别保留在位置2、3和70(Kabat编号)：谷氨酰胺(Q2)、缬氨酸(V3)和谷氨酰胺(Q70)。
在某些情况下，可将CDRL1突变以去除潜在的N-糖基化位点(CDRL1变体1-2)。
选择人V-区IGHV3-21加JH1 J-区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4133的重链CDR的受体。除了CDR以外，来自4133 VH基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以分别保留在位置48、49、71、73、76和78(Kabat编号)：异亮氨酸(I48)、甘氨酸(G49)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。
在一些情况下，可将CDRH1和CDRH2突变以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。也可将CDRH3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRH3变体1-3)。
选择人V区IGHV4-4加JH1 J区(IMGT，http://www.imgt.org/)作为抗体4133的重链CDR的备选受体。除CDR以外，来自4133 VH基因的以下框架残基(供体残基)中的一个或多个可以分别保留在位置24、71、73、76和78(Kabat编号)：丙氨酸(A24)、赖氨酸(K71)、丝氨酸(S73)、苏氨酸(T76)和缬氨酸(V78)。将人框架的位置1处的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸(E1)，以提供均质产物的表达和纯化。
在一些情况下，可将CDRH1和CDRH2突变以去除半胱氨酸残基(分别为CDRH1变体和CDRH2变体)。也可将CDRH3突变以修饰潜在的天冬氨酸异构化位点(CDRH3变体1-3)。
实施例20-测试抗人CD79 V区与食蟹猴B细胞的交叉反应性。
简介
对食蟹猴PBMC进行结合研究以测试抗人CD79 V区是否与用于临床前研究的非人灵长类B细胞发生交叉反应。将CD79 V区VR4447和VR4450生成为Fab-Y纯化的分子，并使用结合Fab-Y构建体的恒定区的抗小鼠第二抗体检测这些V区与B细胞的特异性结合。
本实验中使用的构建体的描述。
构建体名称 Fab特异性
VR4447 Fab-Y 抗原–人CD79b
VR4450 Fab-Y 抗原–人CD79b
方法
Fab-Y分子的生成
如(W02016/009030)所述，将从来自兔B细胞的用于抗CD79b(VR4447)和(VR4450)的亲本兔V区克隆到如前所述的Fab-Y构建体载体中。
瞬时表达和纯化Fab-Y
将Expi293细胞在Expi293TM表达培养基中常规地传代培养至终浓度为0.5×106个活细胞/mL，并在轨道振摇床培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
在转染当天，使用自动化细胞计数器(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。为了达到2.94X 106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞悬浮液加入到无菌的1L锥形摇瓶中，对于每200mL转染，通过加入新鲜的、预温热的Expi293TM表达培养基来达到170mL的体积。
为了对每次转染制备脂质-DNA复合物，将总共200μg的重链和轻链质粒DNA(2:1的轻链:重链DNA比率)在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至总体积为10mL，并将540μL的ExpiFectamineTM 293试剂(Life Technologies)在I培养基中稀释至总体积为10mL。将所有稀释液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟，然后将每种DNA溶液加入到各自稀释的Exp iFectamineTM 293试剂中，以获得20mL的总体积。轻轻混合DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物，并在室温下孵育20-30分钟，以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将20mLDNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物加入每个摇瓶中。将摇瓶在轨道摇床培养箱(Multitron,Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
转染后约16-18小时，向每个摇瓶中加入1mL ExpiFectamineTM293转染增强剂1(LifeTechnologies)和10mL的ExpiFectamineTM 293转染增强剂2(LifeTechnologies)。
转染后7天收获细胞培养物。将细胞转移到50mL旋转管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，然后通过0.22um Stericup(Merck Millipore)无菌过滤。将经过澄清和无菌过滤的上清液储存在4℃。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
使用小规模基于真空的纯化系统通过亲和捕获纯化Fab-Y。简言之，将200ml培养物上清液经过0.22μm无菌过滤，然后加入约2mLNi Sepharose珠(GE Healthcare)。然后将上清液珠粒混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空除去上清液。然后用洗涤液1(50mM磷酸钠、0.5M NaCl，pH 6.2)和洗涤液2(0.5M NaCl)洗涤珠粒。用50mM乙酸钠，pH4.0+1M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分经缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中并进行0.22μm过滤。通过A280扫描，SE-UPLC(BH1200方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)和使用PTS Endosafe系统(针对内毒素)测定最终汇集物。
抗人CD79 V区与来自食蟹猴的B细胞的结合。
使用密度离心从全血中纯化食蟹猴PBMC。简言之，将全血在RPMI培养基中以1:2稀释，然后分层于哺乳动物分离培养基(CedarLane)上。将样品在无加速和制动的情况下以800g离心25分钟，收集界面处的细胞层。使用5ml ACK裂解缓冲液(Gibco)将污染的红细胞裂解5分钟。
将分离的PBMC铺在96孔圆底平板中，然后在冷的结合缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.1％叠氮化钠)中洗涤。将VR4447和VR4450 Fab-Y分子以在冷的结合缓冲液中50ug/ml的浓度加入到细胞中。在冰上30分钟后，洗涤细胞并用在冷的结合缓冲液(JacksonImmunoResearch)中稀释至10μg/ml的缀合有FITC的山羊抗小鼠IgGF(ab')2检测Fab-Y分子的结合。在BD FACS Canto II仪上采集样品，使用FLOWJO软件测定结合。使用CD20抗体鉴定B细胞。在B细胞(CD20+)上以FITC-荧光的几何均值或以作为阳性细胞百分比分析结合。然后将数据导入Graphpad并绘制为条形图。
结果
图48和图49显示VR4447和VR4450 Fab-Y分子与CD20+B细胞的结合。将数据绘制为FITC-荧光的几何均值或阳性细胞百分比。显示的数据来自单个动物。
抗CD79b V区4450与B细胞上的食蟹猴CD79b交叉反应，而V区域4447不与所述CD79b交叉反应。
实施例21：-评估人源化抗CD79b V区域4450的不同形式的活性
简介
为了评估VR4450的人源化V区的活性，将它们克隆到Fab-Y构建体中，并与亲本兔4450V区一起克隆到瞬时表达的Fab-Y中，用于与纯化的抗CD22Fab-X(VR4130)一起产生双特异性抗体，以使得能够通过测量对人PBMC中B细胞的BCR信号传导的抑制来测试功能。
方法
如(WO2016/009030)所述从兔B细胞分别将用于抗CD79b(VR4450)和抗CD22(VR4130)(图51)的亲本兔V区克隆到Fab-Y和Fab-X构建体载体中。通过基因合成产生人源化的4450 V区域并克隆到Fab-Y构建体载体中。
Fab-X和Fab-Y的瞬时表达
将Expi293细胞在Expi293TM表达培养基中常规地继代培养至终浓度为0.5×106个活细胞/mL，并在轨道摇床培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
在转染当天，使用自动化细胞计数器(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。为了达到2.94X 106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞悬浮液加入到无菌的1L锥形摇瓶中，对于每200mL转染，通过加入新鲜的、预温热的Expi293TM表达培养基来达到170mL的体积。
为了对每次转染制备脂质-DNA复合物，将总共200μg的重链和轻链质粒DNA(2:1的轻链:重链DNA比率)在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至总体积为10mL，并将540μL的ExpiFectamineTM 293试剂(Life Technologies)在I培养基中稀释至总体积为10mL。将所有稀释液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟，然后将每种DNA溶液加入到各自稀释的ExpiFectamineTM 293试剂中，以获得20mL的总体积。轻轻混合DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物，并在室温下孵育20-30分钟，以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将20mLDNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物加入每个摇瓶中。将摇瓶在轨道摇床培养箱(Multitron,Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
转染后约16-18小时，向每个摇瓶中加入1mL ExpiFectamineTM293转染增强剂1(LifeTechnologies)和10mL的ExpiFectamineTM 293转染增强剂2(LifeTechnologies)。
转染后7天收获细胞培养物。将细胞转移到50mL旋转管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，然后通过0.22um Stericup(Merck Millipore)无菌过滤。将经过澄清和无菌过滤的上清液储存在4℃。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
纯化
使用小规模基于真空的纯化系统通过亲和捕获纯化Fab-X。简言之，将200ml培养物上清液经过0.22μm无菌过滤，然后加入约2mLNi Sepharose珠粒(GE Healthcare)。然后将上清液珠粒混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空除去上清液。然后用洗涤液1(50mM磷酸钠、0.5M NaCl，pH 6.2)和洗涤液2(0.5M NaCl)洗涤珠粒。用50mM乙酸钠，pH4.0+1M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分经缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中并进行0.22μm过滤。通过A280扫描，SE-UPLC(BH1200方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)和使用PTS Endosafe系统(针对内毒素)测定最终汇集物。
筛选测定
使用设定为37℃的水浴将供体PBMC快速解冻，然后逐滴稀释到测定培养基(补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素和1％Glutamax的RPMI-1640培养基)中以使渗透压休克最小化。将细胞以500g离心，然后除去上清液并将细胞重悬于测定培养基中。然后计数细胞，并将其加入到96孔V底板(Nunc)的每个孔中，然后在37℃,5％CO2培养箱中孵育1小时。
将Fab-X和Fab-Y试剂在测定培养基中以最终测定浓度的5倍等摩尔浓度比混合，并在37℃，5％CO2下孵育1小时。将合适的Fab-KD-Fab混合物加入到含有细胞的测试孔中(表14)，以使起始浓度为100nM，然后以一式二份连续稀释(1:5)，并以1000rpm摇动混合30秒，然后在37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时。
然后用12.5μg/ml终浓度的抗人IgM(Southern Biotech)刺激细胞，同时将测定培养基加入到对照未刺激的细胞中。然后将试验板以1000rpm温和混合30秒，然后在37℃，5％CO2培养箱中孵育8分钟。通过向所有孔中加入冰冷的BD CytoFix来终止测定,并在室温孵育15分钟。然后将固定的细胞以500g离心5分钟以沉淀细胞，并使用BioTek ELx405洗板机除去上清液。通过以2400rpm涡旋板30秒来将沉淀物重新悬浮。然后通过加入冰冷的BD细胞透化缓冲液III持续30分钟使细胞在4℃透化。然后用FACS缓冲液(含有1％BSA，0.05％NaN3和2mM EDTA的PBS)洗涤细胞，并以500g离心5分钟。再次用ELx405去除上清液，然后使用其快速分配FACS缓冲液以洗去任何剩余的透化缓冲液。再次将细胞以500g离心并通过ELx405去除上清液。然后通过涡旋(2400RPM，30秒)重新悬浮细胞，随后向所有孔中加入抗体混合物(抗人CD20(H1FB1)Alexa Fluor 488(1:10稀释)；抗人Akt Alexa Fluor 647(1:10稀释))。然后将平板以1000rpm摇动30秒，并将细胞在室温下于黑暗中孵育45分钟。
然后将细胞通过500g旋转在FACS缓冲液中洗涤两次，并且在每个步骤之后除去上清液。最后，通过以2400rpm涡旋30秒来重悬细胞，然后加入20μl FACS缓冲液。然后在Intellicyt iQue plus仪上读板。
表14.平板布局
表14(平板布局)-将Fab-KD-Fab混合物一式两份以100nM的起始浓度添加在第2-11列中。用添加至第1-11列中的12.5μg/ml终浓度的抗人IgM刺激细胞。第1列(MAX)含有未用Fab-KD-Fab混合物处理的抗人IgM刺激的细胞，而第12列(MIN)含有对照未刺激/未处理的细胞。
样品
Fab-KD-Fab 纯化的Fab-X 瞬时s/n Fab-Y
兔 4130 Fab-X/兔 4450 Fab-Y 兔 VR4130 兔 VR4450
兔 4130 Fab-X/gL1gH1 4450 Fab-Y 兔 VR4130 gL1gH1 VR4450
兔 4130 Fab-X/gL5gH1 4450 Fab-Y 兔 VR4130 gL5gH1 VR4450
兔 4130 Fab-X/gL6gH1 4450 Fab-Y 兔 VR4130 gL6gH1 VR4450
兔 4130 Fab-X/gL7gH1 4450 Fab-Y 兔 VR4130 gL7gH1 VR4450
结果
从图50中可以看出，VR4450的全部四种人源化形式均具有与亲本兔VR4450 V区相似的活性。
序列表
<110> UCB BIOPHARMA SPRL
<120> 结合CD79的抗体分子
<130> PF0062
<160> 343
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 式(I)的CDRH1
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是S或N
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是V或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是V或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是S或V
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 式(II)的CDRH2
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是V或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是S或E
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是T或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是N或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是T或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是T或Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是W或缺少
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是N或S
<400> 2
Ile Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Xaa Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDHR3
<400> 3
Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 4
Asp Ala Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在一个实施方案中CDRL1具有式(III)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是A或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是V或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是V或Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是N或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是G或N
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是L或D
<400> 5
Gln Xaa Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Leu Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2具有式(IV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S或E
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是T或K
<400> 6
Xaa Ala Ser Xaa Leu Ala Ser
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3具有式(V)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是L或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是G或E
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是G或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是C, S或G (特别是S或G)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是S或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是D, S或E
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是H, G, A, S或C (特别是H, G, A或S)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是I或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是C, S或缺少
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是N或缺少
<400> 7
Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 8
Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val Met Val
1 5 10
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 9
Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 10
<211> 1304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD45
<400> 10
Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe Leu Asp
1 5 10 15
Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro Thr Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp Pro Leu
35 40 45
Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu Arg Glu
50 55 60
Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser
65 70 75 80
Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe Asn Thr
85 90 95
Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp
100 105 110
Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser Gly Ser
115 120 125
Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala Ile Ser
130 135 140
Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro
145 150 155 160
Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala
165 170 175
Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser
180 185 190
Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro Ser Gly
195 200 205
Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser Lys Pro
210 215 220
Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn
225 230 235 240
Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val
245 250 255
Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr
260 265 270
Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala
275 280 285
Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu Lys Phe
290 295 300
Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys
305 310 315 320
Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile
325 330 335
Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu Ile
340 345 350
Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser Glu
355 360 365
Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile Lys
370 375 380
Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg Ser
385 390 395 400
Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg Ser
405 410 415
Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp Cys
420 425 430
Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu Lys
435 440 445
Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile Ala Lys
450 455 460
Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys Ser
465 470 475 480
Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr Ser Asp
485 490 495
Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn Gly Pro
500 505 510
His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu Val Arg
515 520 525
Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu Gln Tyr
530 535 540
Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp Tyr Pro
545 550 555 560
Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser Lys Ala
565 570 575
Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu
580 585 590
Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys
595 600 605
Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln
610 615 620
Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr
625 630 635 640
Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln
645 650 655
Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg Lys
660 665 670
Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp
675 680 685
Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser Asn
690 695 700
Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr
705 710 715 720
Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg
725 730 735
Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys
740 745 750
Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu
755 760 765
Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His
770 775 780
Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys
785 790 795 800
Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser
805 810 815
Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu
820 825 830
Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val
835 840 845
Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile
850 855 860
Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr
865 870 875 880
Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val
885 890 895
Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln
900 905 910
Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His
915 920 925
Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala
930 935 940
Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile
945 950 955 960
Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile
965 970 975
Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser
980 985 990
Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp
995 1000 1005
Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser
1010 1015 1020
Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys
1025 1030 1035
Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val
1040 1045 1050
Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu
1055 1060 1065
Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp
1070 1075 1080
Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr
1085 1090 1095
Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg
1100 1105 1110
Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu
1115 1120 1125
Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys
1130 1135 1140
Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His
1145 1150 1155
Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln
1160 1165 1170
Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu
1175 1180 1185
Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala Leu Arg
1190 1195 1200
Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln Phe
1205 1210 1215
Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln
1220 1225 1230
Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn
1235 1240 1245
Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu
1250 1255 1260
Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly
1265 1270 1275
Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn
1280 1285 1290
Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser
1295 1300
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 11
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala Val Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 12
Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 13
Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn Asn Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 14
Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 15
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ile Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 变体 1
<400> 16
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 变体 2
<400> 17
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala Ile Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 变体 3
<400> 18
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Ile Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 19
Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 20
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 21
Leu Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser His Asp Cys Asn Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 变体 1
<400> 22
Leu Gly Glu Phe Ser Ser Ser Ser His Asp Ser Asn Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 变体 2
<400> 23
Leu Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser His Asp Ser Asn Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 变体 3
<400> 24
Leu Gly Glu Phe Ser Ser Ser Ser His Asp Cys Asn Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4(7P14P) 序列
<400> 25
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 26
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4(7P14P) 序列
<400> 26
Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ala
20 25 30
Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala
35 40 45
Thr Thr Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr
50 55 60
Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gly Gly Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys
100 105 110
Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala
115 120 125
Thr Cys Ala Cys
130
<210> 27
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 ds scFv 序列
<400> 27
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Glu Gln Lys Leu
245 250 255
Ile Ser Glu Glu Asp Leu
260
<210> 28
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 ds scFv 序列
<400> 28
gatgcggtgg tgacccagga aagcgcgctg accagcagcc cgggcgaaac cgtgaccctg 60
acctgccgca gcagcaccgg cgcggtgacc accagcaact atgcgagctg ggtgcaggaa 120
aaaccggatc atctgtttac cggcctgatt ggcggcacca acaaccgcgc gccgggcgtg 180
ccggcgcgct ttagcggcag cctgattggc gataaagcgg cgctgaccat taccggcgcg 240
cagaccgaag atgaagcgat ttatttttgc gtgctgtggt atagcgacca ttgggtgttt 300
ggctgcggca ccaaactgac cgtgctgggt ggaggcggtg gctcaggcgg aggtggctca 360
ggcggtggcg ggtctggcgg cggcggcagc gatgtgcagc tgcagcagag cggcccgggc 420
ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt acctgcaccg tgagcggctt tctcctgacc 480
gattatggcg tgaactgggt gcgccagagc ccgggcaaat gcctggaatg gctgggcgtg 540
atttggggcg atggcattac cgattataac agcgcgctga aaagccgcct gagcgtgacc 600
aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg aaaatgaaca gcctgcagag cggcgatagc 660
gcgcgctatt attgcgtgac cggcctgttt gattattggg gccagggcac caccctgacc 720
gtgagcagcg cggccgccca tcaccatcac catcacgaac agaaactgat tagcgaagaa 780
gatctgtaat ag 792
<210> 29
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VL 区
<400> 29
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln
35 40 45
Leu Ile His Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Ser Cys
85 90 95
Ser Ser His Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys
<210> 30
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VL 区
<400> 30
gcccaagtgc tgacccagac tccgtcccct gtgtctgcac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc aggccagtca gagtgttgtt agtggcaatt acctagcctg gcttcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gcaactgatc cattctgcat ccactctggc atctggggtc 180
tcatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacaattca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgaag atgctgccac ttactactgt ctaggcgaat ttagttgtag tagtcatgat 300
tgtaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaa 339
<210> 31
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VH 区
<400> 31
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Ser Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu
85 90 95
Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VH 区
<400> 32
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagtaac tatgcagtaa gctgggtccg ccaggctcca 120
ggggagggac tggaatggat cgggatcatt tatattgaaa ctggtaccac atggtacgcg 180
aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga tctgacaatc 240
accagtccgt caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagaacc ttatgaacct 300
tatgatgata gtaatattta ctacggcatg gacccctggg gcccaggcac cctcgtcacc 360
gtctcgagt 369
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4447 gL1 V-区- IGKV1D-13框架
<400> 33
Ala Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gln
35 40 45
Leu Ile His Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Ser Cys
85 90 95
Ser Ser His Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 34
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4447 gH1 V-区- IGHV3-48框架
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4447 gH3 V-区- IGHV4-59框架
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VL 区
<400> 36
Ala Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 37
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VL 区
<400> 37
gccattgata tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtatttat aataataatg acttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaagcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagtggcgtg 240
cagtgtgatg atgctgccac ttactactgt cagggcggtg gtagtggtgg tgatggcatt 300
gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa 333
<210> 38
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VH 区
<400> 38
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Ala Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val
20 25 30
Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ala
85 90 95
Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VH 区
<400> 39
cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg gggcacccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattctc cctcaataac tatgtaatgg tctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt tatgttagtg gtaatgcata ctacgcgagc 180
tgggcaaaag gccgattcac catctccaga acctcgacca cggtggatct gaaagtgacc 240
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gagatgctgg tcatagtgat 300
gtcgatgttt tggatatttg gggcccgggc accctcgtca ccgtctcgag t 351
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4450 gL1 V-区- IGKV1-6框架
<400> 40
Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4450 gH1 V-区- IGHV3-66框架
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Ala Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4450 gH3 V-区- IGHV4-59框架
<400> 42
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Met Val Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Ala Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRH1
<400> 43
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRH1 变体
<400> 44
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRH2
<400> 45
Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRH2 变体
<400> 46
Ser Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRH3
<400> 47
Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr Leu Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRL1
<400> 48
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRL2
<400> 49
Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4120 CDRL3
<400> 50
Gln Ser Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ser Trp Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VL 区
<400> 51
Ala Phe Glu Leu Ser Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser
85 90 95
Gly Gly Ser Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VL 区
<400> 52
gcattcgaat tgagccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattagc actgcattag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcgtc ccaagctcct gatctatggt gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatggta cgagtagtgg tggttcttgg 300
gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc aaa 333
<210> 53
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VH 区
<400> 53
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr Leu Tyr
100 105 110
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VH 区
<400> 54
cagtcattgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagt agctactaca tgtgctgggt ccgccagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatactg gtagtagtgg tgacacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgtct 240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccactt atttctgtgc gagagggcct 300
tatgttggtt atggttatga tcttcaatac ttgtacttgt ggggcccggg gaccctcgtc 360
accgtctcga gt 372
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4120 gL1 V-区IGKV1D-13框架
<400> 55
Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser
85 90 95
Gly Gly Ser Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4120 gH1 V-区- IGHV3-33框架
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr
100 105 110
Leu Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VL 区
<400> 57
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gaacattggt agtggtttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctattat gcatccactc tggcatctgg ggtcccatca 180
aggttcaaag gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgacgctg ccacttacta ctgtcaaagt catgattata gtagtgttcg gagttacggt 300
aatgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaa 336
<210> 58
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VH 区
<400> 58
Gln Gln His Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Cys Tyr
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 59
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VH 区
<400> 59
cagcagcacc tggaggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctggaggaac cctgacactc 60
acctgcaaag cctctggaat cgacttcagt agctactact acatgtgctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtgggtcgcg tgcattgatc ctgctagtag tggtactact 180
tactacgcga cctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagggca 300
tatggtagtg ggggtagtgg ttatataggg tgctactttg acttgtgggg ccaaggcacc 360
ctcgtcaccg tctcgagt 378
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 60
Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 变体
<400> 61
Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 62
Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 63
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 变体
<400> 63
Ser Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 64
Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Cys Tyr Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 变体
<400> 65
Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser Tyr Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 66
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Gly Leu Ala
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 67
Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 68
Gln Ser His Asp Tyr Ser Ser Val Arg Ser Tyr Gly Asn Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gL3 V-区- IGKV1-5框架
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Tyr Ser Ser Val
85 90 95
Arg Ser Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gH12 V-区- IGHV3-7框架
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Cys
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 71
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gH3 V-区- IGHV3-7框架
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRH1
<400> 72
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRH1 变体
<400> 73
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRH2
<400> 74
Cys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRH2 变体
<400> 75
Ser Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRH3
<400> 76
Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL1
<400> 77
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser
1 5 10
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL2
<400> 78
Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser
1 5
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3
<400> 79
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Asp Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 1
<400> 80
Ala Gly Tyr Lys Ser Glu Ser Asp Asp Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 2 Ab 4127
<400> 81
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ala Asp Asp Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 3
<400> 82
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Asp Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 4
<400> 83
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Glu Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 5
<400> 84
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Asp Ala Thr Thr
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127CDRL3 变体 6
<400> 85
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Asp Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 7
<400> 86
Ala Gly Tyr Lys Ser Glu Ser Asp Glu Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 8
<400> 87
Ala Gly Tyr Lys Ser Glu Ser Asp Asp Ala Thr Thr
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 9
<400> 88
Ala Gly Tyr Lys Ser Glu Ser Asp Asp Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 10
<400> 89
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ala Asp Glu Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 11
<400> 90
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ala Asp Asp Ala Thr Thr
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 12
<400> 91
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ala Asp Asp Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 13
<400> 92
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Glu Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 14
<400> 93
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Asp Ala Thr Thr
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4127 CDRL3 变体 15
<400> 94
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Asp Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 95
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VL 区
<400> 95
Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Met Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Asp
85 90 95
Ser Asp Asp Gly Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 96
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VL 区
<400> 96
gccatcgtga tgacccagac tccatcttcc aagtctgtcc ctatgggagg cacagtcacc 60
atcaactgcc aggccagtca gagtgtttat ggtaataacg aattatcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatttggcat ccaggctggc atcgggggtc 180
ccatcgcggt ttagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggctata aaagtgatag tgatgatggc 300
actactttcg gcggagggac caaggtggtg gtcgaa 336
<210> 97
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VH 区
<400> 97
Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 98
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4127 gL3 V-区- IGKV1-5框架
<400> 98
Ala Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Asp
85 90 95
Ser Asp Asp Gly Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 99
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4127 gH3 V-区- IGHV3-9框架
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4127 gH4 V-区- IGHV3-9框架
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRH1
<400> 101
Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRH1 变体
<400> 102
Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Ser
1 5 10
<210> 103
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRH2
<400> 103
Cys Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRH2 变体
<400> 104
Ser Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRH3
<400> 105
Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRL1
<400> 106
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRL2
<400> 107
Ala Ser Ser Lys Leu Ser Ser
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4128 CDRL3
<400> 108
Gln Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Arg Asp Trp Thr
1 5 10
<210> 109
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VL 区
<400> 109
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Asp Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly
85 90 95
Ser Arg Asp Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 110
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VL 区
<400> 110
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga aagcattagc aactacttat cctggtttca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgct tcatccaaac tgtcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcgatagatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaatc tattattcgg ctagtggcag tcgtgattgg 300
actttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa 333
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VH 区
<400> 111
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr Trp
20 25 30
Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
35 40 45
Cys Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VH 区
<400> 112
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 60
tgcaaaggct ccgggttaga cttcagtagc tactggatat gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggagtggat cgcatgcatt gttactggta gtagtgataa cacttactac 180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag aggtggtggt 300
gctggttata gtggtgcctt tgacttgtgg ggccaaggga ccctcgtcac cgtctcgagt 360
<210> 113
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4128 gL1 V-区- IGKV1-5框架
<400> 113
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Asp Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly
85 90 95
Ser Arg Asp Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 114
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4128 gH1 V-区- IGHV3-33框架
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4128 gH2 V-区- IGHV3-33框架
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ser Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH1
<400> 116
Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly Tyr Asp Ile Ser
1 5 10
<210> 117
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH2
<400> 117
Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 118
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH2 变体 1
<400> 118
Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ala Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 119
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH2 变体 2
<400> 119
Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Thr Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH2 变体 3
<400> 120
Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 121
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH2 变体 4
<400> 121
Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ala Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 122
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH2 变体 5
<400> 122
Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Thr Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 123
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH3
<400> 123
Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH3 变体 1
<400> 124
Asp Val Ser Asn Ala Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 125
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRH3 变体 2
<400> 125
Asp Val Ser Asn Thr Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRL1
<400> 126
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Thr Lys Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRL2
<400> 127
Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4130 CDRL3
<400> 128
Gln Gly Gly Phe Ser Ser Ser Asp Leu Asn Val
1 5 10
<210> 129
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VL 区
<400> 129
Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Thr
20 25 30
Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Leu Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 130
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VL 区
<400> 130
gccgccgtgc tgacccagac tccatctccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc 60
atcagttgcc agtccagtca gagtgtttat aatacaaagg acttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatggtacat ccactctggc atctggggtc 180
tcatcacggt tcagcggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttattactgt caaggcggtt ttagtagtag tgatttgaat 300
gttttcggcg gagggaccaa ggtggtggtc aaa 333
<210> 131
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VH 区
<400> 131
Gln Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 132
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VH 区
<400> 132
cagcagcagc tggaggagtc cgggggagac ctggtcaggc ctgagggatc cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt cgacttcagt ggcggctacg acatttcctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcatttatg gtggtatcaa tagtgtcact 180
gactacgcga gctgggcgaa aggccgagtc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaga tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat 300
gttagtaata gcgatcatta tactcggttg gatctctggg gccaaggcac cctggtcacc 360
gtctcgagt 369
<210> 133
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4130 gL3 V-区- IGKV1-9框架
<400> 133
Ala Ala Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Thr
20 25 30
Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Leu Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 134
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4130 gH8 V-区- IGHV3-66框架
<400> 134
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4130 gH3 V-区- IGHV3-66框架
<400> 135
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH1
<400> 136
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH1 变体
<400> 137
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Ser
1 5 10
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH2
<400> 138
Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH2 变体 1
<400> 139
Cys Ile Asn Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH2 变体 2
<400> 140
Cys Ile Asn Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH2 变体 3
<400> 141
Ser Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH2 变体 4
<400> 142
Ser Ile Asn Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH2 变体 5
<400> 143
Ser Ile Asn Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 144
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRH3
<400> 144
Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRL1
<400> 145
Gln Ala Ser Glu Thr Ile Ser Ser Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRL2
<400> 146
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 147
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4132 CDRL3
<400> 147
Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Gly
1 5 10
<210> 148
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VL 区
<400> 148
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Thr Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly
85 90 95
Ser Asp Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 149
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VL 区
<400> 149
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga gaccattagt agtagattag cctggtatca gcagaagcta 120
gggcagcctc ccaaactcct gatctattct gcatccactc tggcgtctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt 240
gccgatgctg ccacttatta ctgtcaaggc tattattata gtagtggtag tgattatggt 300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcaaa 330
<210> 150
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VH 区
<400> 150
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ser
35 40 45
Gly Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Ser Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 151
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VH 区
<400> 151
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agctactgga tatgctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gagcggatgc attaatagtg gtactggtgg cactgcctac 180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaattcct cgtcgaccac ggtgactctt 240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agaatgggtt 300
agtggttatt ataaagatgc ttttgatctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360
agt 363
<210> 152
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4132 gL1 V-区- IGKV1-5框架
<400> 152
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Thr Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly
85 90 95
Ser Asp Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 153
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4132 gH1 V-区- IGHV3-21框架
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ser Gly Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Ser Ala Lys Thr Ser Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 154
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4132 gH2 V-区- IGHV3-21框架
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ser Gly Ser Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Ser Ala Lys Thr Ser Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH1
<400> 155
Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH1 变体 1
<400> 156
Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr Trp Ile Ser
1 5 10
<210> 157
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2
<400> 157
Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Gly
<210> 158
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 1
<400> 158
Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Ala
<210> 159
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 2
<400> 159
Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 3
<400> 160
Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Thr
<210> 161
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 4
<400> 161
Ser Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Gly
<210> 162
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 5
<400> 162
Ser Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Ala
<210> 163
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 6
<400> 163
Ser Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 164
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH2 变体 7
<400> 164
Ser Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10 15
Asn Thr
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRH3
<400> 165
Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu
1 5 10
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRL1
<400> 166
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRL2
<400> 167
Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 168
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRL3
<400> 168
Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Asn Val Phe Phe Ala
1 5 10
<210> 169
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRL3 变体 1
<400> 169
Gln Ser Tyr Tyr Asp Ala Gly Ser Asn Val Phe Phe Ala
1 5 10
<210> 170
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4122 CDRL3 变体 2
<400> 170
Gln Ser Tyr Tyr Asp Thr Gly Ser Asn Val Phe Phe Ala
1 5 10
<210> 171
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4122 VL 区
<400> 171
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Met Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser
85 90 95
Asn Val Phe Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 172
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4122 VL 区
<400> 172
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcatgtgcc aggccagtca gagcattagc aattggttag cctggtatca acagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgata gtggtagtaa tgtttttttt 300
gctttcggcg gagggaccaa ggtggtggtc gaa 333
<210> 173
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4122 VH 区
<400> 173
Leu Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp
50 55 60
Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Pro Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Ser Gly Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 174
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4122 VH 区
<400> 174
ctgtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtgcc ggctattgga tatgttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc acttatgctg gtcgtagtgg tagcacttac 180
tacgcgaact gggtgaatgg ccgattcacc atccccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcaaatga ccagtctgtc aggcgcggac acggccagct atttctgtgc gagaggtaat 300
gctggtgttg ctgttggtgc cttgtggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 175
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4122 gL1 V-区- IGKV1-5框架
<400> 175
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser
85 90 95
Asn Val Phe Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 176
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4122 gH6 V-区- IGHV3-7框架
<400> 176
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 177
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4122 gH4 V-区- IGHV3-7框架
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 178
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRH1
<400> 178
Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 179
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRH1 变体
<400> 179
Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr Trp Ile Ser
1 5 10
<210> 180
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRH2
<400> 180
Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 181
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRH2 变体
<400> 181
Ser Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRH3
<400> 182
Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu
1 5 10
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRL1
<400> 183
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRL2
<400> 184
Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 185
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRL3
<400> 185
Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Ser Val Phe Phe Asn
1 5 10
<210> 186
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRL3 变体 1
<400> 186
Gln Ser Tyr Tyr Asp Ala Gly Ser Ser Val Phe Phe Asn
1 5 10
<210> 187
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4129 CDRL3 变体 2
<400> 187
Gln Ser Tyr Tyr Asp Thr Gly Ser Ser Val Phe Phe Asn
1 5 10
<210> 188
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4129 VL 区
<400> 188
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser
85 90 95
Ser Val Phe Phe Asn Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 189
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4129 VL 区
<400> 189
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc aagccagtca gagcattagc agttggttat cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatggt gcatccaatc tggcatctgg ggtcccatca 180
cggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcagtctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgata gtggtagtag tgtttttttt 300
aatttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc aaa 333
<210> 190
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4129 VH 区
<400> 190
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Pro Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 191
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4129 VH 区
<400> 191
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gttaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtgcc ggctattgga tatgttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgctg gtagtagtgg tagcacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atccccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcaaatga ccagtctgac aggcgcggac acggccacct atttctgtgc gagaggtaat 300
gctggtgttg ctgttggtgc cttgtggggc ccaggcaccc tcgtcaccgt ctcgagt 357
<210> 192
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4129 gL3 V-区- IGKV1-5框架
<400> 192
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser
85 90 95
Ser Val Phe Phe Asn Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 193
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4129 gH1 V-区- IGHV3-7框架
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 194
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4129 gH4 V-区- IGHV3-7框架
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 195
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRH1
<400> 195
Gly Val Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Tyr
1 5 10
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRH2
<400> 196
Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 197
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRH2 变体
<400> 197
Ser Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRH3
<400> 198
Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Gly Met Asp Leu
1 5 10
<210> 199
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRL1
<400> 199
Gln Ala Ser Gln Ser Phe Tyr Asn Leu Leu Ala
1 5 10
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRL2
<400> 200
Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRL3
<400> 201
Gln Ser Ala Asp Gly Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRL3 变体 1
<400> 202
Gln Ser Ala Asp Ser Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRL3 变体 2
<400> 203
Gln Ser Ala Asp Ala Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4131 CDRL3 变体 3
<400> 204
Gln Ser Ala Asp Thr Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 205
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4131 VL 区
<400> 205
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Ser Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Phe Tyr Asn Leu
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Gly Ser Ser Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105
<210> 206
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4131 VL 区
<400> 206
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg ctcagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagcttttac aacctcttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaaactcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggactgat ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccgcttacta ctgtcaaagt gctgatggta gtagttacgc tttcggcgga 300
gggaccgagg tggtcgtcaa a 321
<210> 207
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4131 VH 区
<400> 207
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Val Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Glu Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 208
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4131 VH 区
<400> 208
caggagcaat tggaggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc 60
acctgcacag cctctggagt ctccttcagt agcagctatt ggatatactg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgca tgcatttata ctggtagtag tggtagcact 180
tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accgtctccg aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagca 300
agcgcttgga cctacggcat ggacctctgg ggcccgggca ccctcgtcac cgtctcgagt 360
<210> 209
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4131 gL8 V-区- IGKV1-12框架
<400> 209
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Phe Tyr Asn Leu
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Gly Ser Ser Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 210
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4131 gL3 V-区- IGKV1-12框架
<400> 210
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Phe Tyr Asn Leu
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Gly Ser Ser Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 211
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4131 gH5 V-区- IGHV3-7框架
<400> 211
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Glu Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 212
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH1
<400> 212
Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 213
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH1 变体
<400> 213
Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 214
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH2
<400> 214
Cys Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 215
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH2 变体
<400> 215
Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH3
<400> 216
Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Leu
1 5 10
<210> 217
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH3 变体 1
<400> 217
Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Ser Tyr Gly Gly Leu
1 5 10
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH3 变体 2
<400> 218
Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Ala Tyr Gly Gly Leu
1 5 10
<210> 219
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRH3 变体 3
<400> 219
Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Thr Tyr Gly Gly Leu
1 5 10
<210> 220
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRL1
<400> 220
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asn Leu Ser
1 5 10
<210> 221
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRL1 变体 1
<400> 221
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Ser Leu Ser
1 5 10
<210> 222
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRL1 变体 2
<400> 222
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Gln Leu Ser
1 5 10
<210> 223
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRL1 变体 3
<400> 223
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 224
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRL2
<400> 224
Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 225
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab 4133 CDRL3
<400> 225
Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Phe Ala
1 5 10
<210> 226
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4133 VL 区
<400> 226
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Val Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asn Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ser Gly Trp Tyr Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 227
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4133 VL 区
<400> 227
gcgcaagtgc tgacccagac tccatctccc gtgtctgcag ttgtgggagg cacagtcagc 60
atcagttgcc aggccagtca gagtgtttat aataacaaca acttatcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcttgatc tacgatgcat ccaaattggc atctggggtc 180
ccatcccggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcggtt attatagtag tggttggtat 300
tttgctttcg gcggagggac caaggtggtg gtcaaa 336
<210> 228
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4133 VH 区
<400> 228
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 229
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4133 VH 区
<400> 229
caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacacta 60
acctgcacag cttctggatt ctccttcagt ggcaactact acatgtgctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcctttata ctggtagtag tggtagcaca 180
tattacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat 300
ctaggttatg aaattgatgg ttatgggggc ttgtggggcc agggcaccct cgtcaccgtc 360
tcgagt 366
<210> 230
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4133 gL7 V-区- IGKV1D-13框架
<400> 230
Ala Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asn Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ser Gly Trp Tyr Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 231
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4133 gL1 V-区- IGKV1D-13框架
<400> 231
Ala Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ser Gly Trp Tyr Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 232
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4133 gH1 V-区- IGHV3-21框架
<400> 232
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 233
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VH 区
<400> 233
cagcagctgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtaat ctctattaca tgtgttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtt gatcggatgc attgatatta gcagtagtgg tagcacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcagatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagattac 300
tattctagtg actggggtgt tagatttaac ttgtggggcc agggcaccct cgtcaccgtc 360
tcgagt 366
<210> 234
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 dAbH1
<400> 234
Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 235
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 dAbH1
<400> 235
Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 236
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 dAbH1
<400> 236
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1 dAbL1
<400> 237
Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
1 5 10
<210> 238
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2 dAbL1
<400> 238
Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser
1 5
<210> 239
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 dAbL1
<400> 239
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
1 5 10
<210> 240
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域 (无ds)
<400> 240
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 241
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域 (ds)
<400> 241
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 242
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域 (无ds)
<400> 242
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 243
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域 (ds)
<400> 243
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 244
<211> 847
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD22
<400> 244
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu
20 25 30
Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala
35 40 45
Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr
50 55 60
Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr
65 70 75 80
Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly
85 90 95
Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn
100 105 110
Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp
115 120 125
Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His
130 135 140
Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp
165 170 175
Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser
180 185 190
Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro
195 200 205
Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala
210 215 220
Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His
225 230 235 240
Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg
245 250 255
Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys
275 280 285
Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser
290 295 300
Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser
305 310 315 320
Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val
325 330 335
Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu
340 345 350
Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro
370 375 380
Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn
385 390 395 400
Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln
405 410 415
Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile
420 425 430
Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn
435 440 445
Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu
450 455 460
Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr
465 470 475 480
Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro
485 490 495
Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys
500 505 510
Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln
515 520 525
Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu
530 535 540
Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser
545 550 555 560
Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser
565 570 575
Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala
580 585 590
Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu
595 600 605
Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val
610 615 620
Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His
625 630 635 640
Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala
645 650 655
Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu
660 665 670
Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val
675 680 685
Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys
690 695 700
Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly
705 710 715 720
Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys
725 730 735
Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr
740 745 750
Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro
755 760 765
Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln
770 775 780
Arg Pro Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His
785 790 795 800
Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu
805 810 815
Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu
820 825 830
Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His
835 840 845
<210> 245
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD79a
<400> 245
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro
225
<210> 246
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4120 gH2 V-区- IGHV3-33框架
<400> 246
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr
100 105 110
Leu Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 247
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4120 gH5 V-区- IGHV4-38-2框架
<400> 247
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr
100 105 110
Leu Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 248
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4120 gH4 V-区- IGHV4-38-2框架
<400> 248
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr
100 105 110
Leu Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 249
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VL 区
<400> 249
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Tyr Ser Ser Val
85 90 95
Arg Ser Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 250
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4447 gL2 V-区- IGKV1D-13框架
<400> 250
Ala Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gln
35 40 45
Leu Ile His Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Ser Ser
85 90 95
Ser Ser His Asp Ser Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 251
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gH4 V-区- IGHV3-7框架
<400> 251
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 252
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gH13 V-区- IGHV4-4框架
<400> 252
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Cys
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 253
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gH6 V-区- IGHV4-4框架
<400> 253
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 254
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4126 gH7 V-区- IGHV4-4框架
<400> 254
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 255
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4127 gH6 V-区- IGHV4-38-2框架
<400> 255
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 256
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4127 gH7 V-区- IGHV4-38-2框架
<400> 256
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 257
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4128 gH4 V-区- IGHV4-59框架
<400> 257
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln Val
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 258
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4128 gH5 V-区- IGHV4-59框架
<400> 258
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ser Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln Val
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 259
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4130 gH9 V-区- IGHV4-4框架
<400> 259
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 260
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4130 gH5 V-区- IGHV4-4框架
<400> 260
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 261
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4132 gH4 V-区- IGHV4-4框架
<400> 261
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ser Gly Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Ser Ser Lys Thr Gln Val
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 262
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4132 gH5 V-区- IGHV4-4框架
<400> 262
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ser Gly Ser Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Ser Ser Lys Thr Gln Val
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 263
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4122 gH3 V-区- IGHV2-70框架
<400> 263
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 264
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4122 gH5 V-区- IGHV2-70框架
<400> 264
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Thr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 265
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4129 gH3 V-区- IGHV2-70框架
<400> 265
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 266
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4129 gH5 V-区- IGHV2-70框架
<400> 266
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ala Gly Val Ala Val Gly Ala Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 267
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4131 gH4 V-区- IGHV3-7框架
<400> 267
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Glu Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 268
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4131 gH6 V-区- IGHV4-31框架
<400> 268
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Val Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Glu Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 269
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4131 gH3 V-区- IGHV4-31框架
<400> 269
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Val Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Ser Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Glu Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Ala Trp Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 270
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4133 gH4 V-区- IGHV3-21框架
<400> 270
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 271
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4133 gH3 V-区- IGHV4-4框架
<400> 271
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 272
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4133 gH5 V-区- IGHV4-4框架
<400> 272
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 273
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 273
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 274
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 275
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 275
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 276
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 276
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 277
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 277
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 278
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 278
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 279
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 279
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 280
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 280
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 281
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头序列
<400> 281
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 282
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 282
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 283
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 283
Asp Lys Thr His Thr Ser
1 5
<210> 284
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 284
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 285
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 286
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 286
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 287
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 287
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 288
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 288
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 289
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 289
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 290
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 290
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10 15
<210> 291
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 291
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser
20
<210> 292
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 292
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25
<210> 293
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 293
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 294
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 294
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 295
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 295
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 296
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 296
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 297
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 297
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 298
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD79b
<400> 298
Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu
20 25 30
Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His
50 55 60
Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln
65 70 75 80
Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met
85 90 95
Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile
100 105 110
Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn
115 120 125
Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly
130 135 140
Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly
145 150 155 160
Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro
165 170 175
Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu
180 185 190
Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu
195 200 205
Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu
210 215 220
His Pro Gly Gln Glu
225
<210> 299
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 299
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 300
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 300
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 301
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 301
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 302
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 302
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 303
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 303
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 304
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 305
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 305
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 306
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 306
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 307
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 307
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 308
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 308
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 309
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 309
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 310
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 310
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 311
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 311
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 312
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 312
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 313
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 313
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 314
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 314
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 315
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 315
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 316
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 316
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 317
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 317
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 318
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 318
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 319
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 319
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 320
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 320
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 321
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 321
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 322
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头序列
<400> 322
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 323
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 323
Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 324
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 324
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 325
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 325
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp
1 5 10 15
<210> 326
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 326
Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu
20
<210> 327
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 327
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val
20
<210> 328
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 328
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val Lys
20
<210> 329
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 329
Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 330
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 330
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 331
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 331
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 332
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 332
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
1 5 10 15
<210> 333
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 333
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 334
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 334
Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly
20
<210> 335
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 335
Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Ser Glu Gln
20
<210> 336
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它接头
<400> 336
Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met
1 5 10
<210> 337
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 337
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 338
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 338
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 339
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 339
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 340
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 340
Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 341
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4450gL5 V-区- IGKV1-6框架
<400> 341
Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Glu Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 342
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4450gL6 V-区- IGKV1-6框架
<400> 342
Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Ala Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 343
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4450gL7 V-区- IGKV1-6框架
<400> 343
Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Ser Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (35)

1.一种包含对CD79特异的结合结构域的抗体分子，其中所述结合结构域包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含：
式(I)的CDRH1：
GFSLX1NYX2X3X4(SEQ ID NO:1)
其中X1为S或N，X2为V或A，X3为V或M，X4为S或V，
式(II)的CDRH2：
IIYX5X6X7X8X9X10X11YAX12WAKG(SEQ ID NO:2)
其中X5为V或I，X6为S或E，X7为T或G，X8为N或G，X9为T或A，X10为T或Y，X11为W或不存在，X12为N或S，
CDHR3为EPYEPYDDSNIYYGMDP(SEQ ID NO:3)或DAGHSDVDVLDI(SEQ ID NO:4)，以及
轻链可变结构域(VL)。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述轻链可变结构域(VL)包含：
式(III)的CDRL1：
QX13SQSX14X15X16X17NX18LA(SEQ ID NO:5)
其中X13为A或S，X14为V或I，X15为V或Y，X16为N或S，X17为G或N，X18为Y或D；
式(IV)的CDRL2：
X19ASX20LAS(SEQ ID NO:6)
其中X19为S或E，并且X20为T或K；
具有式(V)的CDRL3：
X21GX22X23SX24X25X26X27X28X29X30A(SEQ ID NO:7)
其中X21为L或Q，X22为G或E，X23为G或F，X24为C、S或G(特别为S或G)，X25为S或G,X26为D、S或E，X27为H、G、A、S或C(特别为H、G、A或S)，X28为I或D，X29为C、S或不存在，X30为N或不存在.
3.权利要求1或2的抗体分子，其中式(I)是SEQ ID NO:8或11，诸如SEQ ID NO:8。
4.权利要求1至3中任一项的抗体分子，其中式(II)为SEQ ID NO:9或12，诸如SEQ IDNO:9。
5.权利要求1至4中任一项的抗体分子，其中CDRH3是SEQ ID NO:3。
6.权利要求1至4中任一项的抗体分子，其中CDRH3是SEQ ID NO:4。
7.权利要求1至6中任一项的抗体分子，其中式(III)为SEQ ID NO:13或19，诸如SEQ IDNO:13。
8.权利要求1至7中任一项的抗体分子，其中式(IV)是SEQ ID NO:14或20，诸如SEQ IDNO:14。
9.权利要求1至8中任一项的抗体分子，其中式(V)独立地选自包含SEQ ID NO:15、16、17、18、21、22、23和24。
10.权利要求1的抗体分子，其中CDR H1是SEQ ID NO:8，CDR H2是SEQ ID NO:9，CDRH3是SEQ ID NO:4，CDRL1是SEQ ID NO:13，CDRL2是SEQ ID NO:14,并且CDRL3独立地选自SEQID NO:15、16、17或18。
11.权利要求1的抗体分子，其中CDR H1是SEQ ID NO:11，CDR H2是SEQ ID NO:12，CDRH3是SEQ ID NO:3，CDRL1是SEQ ID NO:19，CDRL2是SEQ ID NO:20,并且CDRL3独立地选自SEQ ID NO:21、22、23或24。
12.权利要求1至11中任一项的抗体分子，其中VH和VL是人源化的。
13.权利要求12的抗体分子，其中所述重链(VH)的可变结构域包含人框架区，其中在位置24、37、48、49、67、71、73和78中的至少一个处的残基是供体残基，并且轻链可变结构域(VL)包含人框架区，其中在位置2、3、36、46、49和70的至少一个处的残基是供体残基。
14.权利要求12或13的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:34或35中给出的序列的VH和具有SEQ ID NO:33或250中给出的序列的VL。
15.权利要求12或13的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:41或42中给出的序列的VH和具有SEQ ID NO:40、341、342或343中给出的序列的VL。
16.权利要求12的抗体分子，其中所述轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO:33、40或250的轻链可变结构域具有至少80％同一性或相似性的序列，并且其中所述重链的可变结构域包含与SEQ ID NO:34、35、41或42的重链可变结构域具有至少80％同一性或相似性的序列。
17.权利要求1至16中任一项的抗体分子，其中所述抗体是全长抗体。
18.权利要求1至16中任一项的抗体分子，其中所述抗体是scFv、Fv、Fab或Fab'片段。
19.权利要求1至16中任一项的抗体分子，其中所述抗体是多特异性分子，诸如双特异性或三特异性分子。
20.权利要求1-19中任一项的抗体分子，其中所述分子形式选自双抗体、sc双抗体、三抗体、串联scFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、三体、串联scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc双抗体-Fc、sc双抗体-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVDIg。
21.权利要求19或20的抗体分子，其包含对CD79特异的一个结合结构域和对CD22或CD45特异的一个结合结构域。
22.权利要求1-21中任一项的抗体分子，其中每个结合结构域是单特异性的。
23.权利要求21或22的抗体分子，其中所述双特异性或三特异性分子包含不多于一个对CD22特异的结合结构域和不多于一个对CD79a和/或CD79b特异的结合结构域。
24.权利要求21或22的抗体分子，其中所述双特异性或三特异性分子包含不多于一个对CD45特异的结合结构域和不多于一个对CD79a和/或CD79b特异的结合结构域。
25.权利要求21或22的抗体分子，其中对CD22或CD45特异的结合结构域和对CD79a和/或CD79b特异的结合结构域独立地选自Fab、scFv、Fv、dsFv和dsscFv。
26.权利要求1至25中任一项的抗体分子，其中一个或多个结合结构域被人源化(诸如所有结合结构域被人源化)。
27.权利要求1至26中任一项的抗体分子，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸已被另一种除半胱氨酸外的氨基酸取代。
28.权利要求27的抗体分子，其中一个或多个半胱氨酸残基已被另一种氨基酸取代。
29.权利要求1至28中任一项的抗体分子，其还包含对血清白蛋白诸如人血清白蛋白特异的结合结构域。
30.一种组合物，其包含权利要求1至29中任一项中定义的一种或多种抗体分子。
31.一种核苷酸序列，其编码如权利要求1至30中任一项中定义的抗体分子或其功能片段。
32.一种载体，其包含权利要求31中定义的核苷酸序列。
33.权利要求1至29中任一项的抗体分子或权利要求30的组合物，其用于治疗。
34.权利要求1至29中任一项的抗体分子或权利要求30的组合物用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗，特别是用于治疗本文所述的病况或病症。
35.一种治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1至29中任一项的抗体分子或权利要求30的组合物。
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