JP6998857B2 - Cd79に結合する抗体分子 - Google Patents

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Description

本開示は、PCT/EP第2015/066368号明細書、PCT/EP第2015/066369号明細書および英国特許第1601075.3号明細書の優先権を主張し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、抗原CD79に少なくとも特異的である抗体分子、当該抗体分子を含む製剤および治療におけるそれらのいずれか1種の使用に関する。本開示は、当該抗体分子および当該製剤を調製する方法にも及ぶ。
インビボの生体機序は、シグナルの極めて複雑なカスケードであり、解析および理解が困難である。このようなシグナル伝達の例は、B細胞を活性化するために必要とされるものである。B細胞抗原受容体(BCR)は、膜免疫グロブリン(mIg)分子および会合したIgα/Igβ(CD79a/CD79b)ヘテロ二量体(α/β)から構成される。mIgサブユニットは抗原と結合し、受容体凝集を生じ、α/βサブユニットはシグナルを細胞内部に伝達する。BCR凝集は、SrcファミリーキナーゼのLyn、Blk、およびFynならびにSykおよびBtkチロシンキナーゼを迅速に活性化する。これは、BCR、前述のチロシンキナーゼ、CD19およびBLNKなどのアダプタータンパク質、ならびにPLCγ2、PI3K、およびVavなどのシグナル伝達酵素から構成される「シグナロソーム」の形成を開始する。
シグナロソームから発せられるシグナルは、キナーゼ、GTPase、および転写因子を含む複数のシグナル伝達カスケードを活性化する。これは、細胞代謝、遺伝子発現、および細胞骨格構成の変化をもたらす。BCRシグナル伝達の複雑さは、生存、忍容性(アネルギー)またはアポトーシス、増殖、ならびに抗体産生細胞またはメモリーB細胞への分化を含む多くの異なる結果を可能にする。応答の結果は、細胞の成熟状態、抗原の性質、BCRシグナル伝達の大きさおよび持続時間、ならびにCD40、IL-21受容体、およびBAFF-Rなどの他の受容体からのシグナルによって決定される。そのいくつかが受容体である多くの他の膜貫通タンパク質は、BCRシグナル伝達の特定の要素を調節する。これらのうちのいくつかとして、CD45、CD19、CD22、PIR-B、およびFcγRIIB1(CD32)が挙げられる。BCRのシグナル伝達の大きさおよび持続時間は、Lyn/CD22/SHP-1経路、Cbp/Csk経路、SHIP、Cbl、Dok-1、Dok-3、FcγRIIB1、PIR-B、およびBCRの内部移行を含む負のフィードバックループによって制限される。多くの場合、インビボでB細胞は、抗原を捕捉し、これらを細胞表面に表示する抗原提示細胞によって活性化される。このような膜関連抗原によるB細胞の活性化には、BCR誘導細胞骨格再構成が必要である。
自己反応性B細胞は病原性自己抗体の産生を担い、これは自己免疫状態を直接的または間接的に引き起こすか、または悪化させ得る。CD20陽性B細胞の枯渇を使用して、多数の自己免疫状態の治療が成功してきており、したがって、B細胞が、多数の自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症およびI型糖尿病を引き起こすか、または維持する上で重要な役割を果たすことが結論として確立されている。B細胞の枯渇は成功した治療選択肢であったが、B細胞の増殖および活性化状態の制御もB細胞機能を調節する有効な方法であり得るという証拠もまた存在する。したがって、B細胞を枯渇させず、いくつかの副作用と関連することが示されているB細胞免疫の長期抑制を行うことなくB細胞を制御する柔軟性を提供する代替戦略が望ましい。さらに、すべてのB細胞応答または活性が有害であるわけではなく、制御性B細胞集団の維持が防御となり得るということが証拠で示唆されている。このようなアプローチは、不適切または過剰なBcRシグナル伝達によって引き起こされる異常なB細胞機能を有する疾患において有効なはずである。このような疾患の例としては、炎症、自己免疫および癌が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味深いのは、BcRシグナル伝達の直接要件を有するか、または液性免疫応答の阻害または刺激を必要とする疾患である。
CD79aはCD79bと伴に(以前はIg-アルファおよびIg-ベータとして知られていた)、ジスルフィド結合によって安定化されたヘテロ二量体をB細胞の表面上に形成する。この複合体は、B細胞シグナル伝達およびB細胞の発生、活性化および忍容性の全段階を調節するBCRのヘテロ二量体シグナル伝達分子である。CD79は、ほぼ独占的にB細胞およびB細胞新生物において発現される。この分子を介して抗体によって送達される差次的シグナルの調節は、B細胞活性化、B細胞アネルギーまたはB細胞死を引き起こすことがあり、したがって、自己免疫、免疫不全および悪性腫瘍を含む、B細胞活性化に依存する多くの異なる疾患において治療上の利点を有し得る(例えば、The B-Cell Antigen Receptor:Formation of Signaling Complexes and the Function of Adaptor Proteins.Current Topics in Microbiology&Immunology.2000年。245巻(1):53-76頁を参照されたい)。
The B-Cell Antigen Receptor:Formation of Signaling Complexes and the Function of Adaptor Proteins.Current Topics in Microbiology&Immunology.2000年。245巻(1):53-76頁
本開示は、CD79に特異的な多数の抗体分子を提供し、これらの抗体分子は、単独またはB細胞表面受容体(例えば、CD22またはCD45)などのさらなる抗原に特異的な抗体またはその結合断片などの実体と組み合わせて用いることができ、例えば、自己免疫および癌などの特定の疾患に関連する異常なB細胞機能の制御に有用である。
したがって、
式(I)のCDRH1:
GFSLXNYX(配列番号1)
(式中、XはSまたはNであり、XはVまたはAであり、XはVまたはMであり、XはSまたはVである)、
式(II)のCDRH2:
IIYX1011YAX12WAKG(配列番号2)
(式中、XはVまたはIであり、XはSまたはEであり、XはTまたはGであり、XはNまたはGであり、XはTまたはAであり、X10はTまたはYであり、X11はWまたは不在であり、X12はNまたはSである)、
CDHR3:EPYEPYDDSNIYYGMDP(配列番号3)またはDAGHSDVDVLDI(配列番号4)、ならびに
軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、抗体分子が提供される。一実施例において、軽鎖可変ドメインは、ウサギ目由来のCDRL1、CDRL2およびCDRL3、特に、ヒトフレームワークならびにウサギ由来のCDRL1、CDRL2およびCDRL3、またはこれらの変異体を含む。
一実施形態において、CDRL1は式(III):
QX13SQSX14151617NX18LA(配列番号5)
(式中、X13はAまたはSであり、X14はVまたはIであり、X15はVまたはYであり、およびX16はNまたはSであり、X17はGまたはNであり、X18はYまたはDである)
を有し、
CDRL2は式(IV):
19ASX20LAS(配列番号6)
(式中、X19はSまたはEであり、X20はTまたはKである)
を有し、
CDRL3は式(V):
21GX2223SX24252627282930A(配列番号7)
(式中、X21はLまたはQであり、X22はGまたはEであり、X23はGまたはFであり、X24はC、SまたはG(特に、SまたはG)であり、X25はSまたはGであり、X26はD、SまたはEであり、X27はH、G、A、SまたはC(特にH、G、AまたはS)であり、X28はIまたはDであり、X29はC、Sまたは不在であり、X30はNまたは不在である)
を有する。
式(I)および(II)の定義に該当するCDRの例は、以下に提供される:
配列番号8 GFSLNNYVMV(例えば、CDRH1として)
配列番号9 IIYVSGNAYYASWAKG(例えば、CDRH2として)
配列番号11 GFSLSNYAVS(例えば、CDRH1として)
配列番号12 IIYIETGTTWYANWAKG(例えば、CDRH2として)
式(III)、(IV)および(V)の定義に該当するCDRの例は、以下に提供される:
配列番号13 QSSQSIYNNNDLA(例えば、CDRL1として)
配列番号14 EASKLAS(例えば、CDRL2として)
配列番号15 QGGGSGGDGIA(例えば、CDRL3として)
配列番号16 QGGGSGGEGIA(例えば、CDRL3変異体1として)
配列番号17 QGGGSGGDAIA(例えば、CDRL3変異体2として)
配列番号18 QGGGSGGDSIA(例えば、CDRL3変異体3として)
配列番号19 QASQSVVSGNYLA(例えば、CDRL1として)
配列番号20 SASTLAS(例えば、CDRL2として)
配列番号21 LGEFSCSSHDCNA(例えば、CDRL3として)
配列番号22 LGEFSSSSHDSNA(例えば、CDRL3変異体1として)
配列番号23 LGEFSCSSHDSNA(例えば、CDRL3変異体2として)
配列番号24 LGEFSSSSHDCNA(例えば、CDRL3変異体3として)
一実施例において、本発明は、本明細書に記載のCD79抗体を任意の適切な抗体フォーマットで提供する。したがって、本明細書および配列番号11、12、3、19、20および21(抗体4447)または配列番号8、9、4、13、14、および15(抗体4450)において提供されるCDRを含む、本明細書および図51に記載の結合ドメインの1または複数を含む抗CD79抗体またはその断片が提供される。前記CDRは、任意の適切な抗体フレームワークおよび任意の適切な抗体フォーマットに組み込むことができる。このような抗体には、完全抗体およびこれらの機能的に活性な断片または誘導体が挙げられ、これらは、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体またはキメラ抗体であってよい。したがって、このような抗体は、完全長の重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子またはこれらの断片を含むことができ、限定するものではないが、Fab、改変Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、単一ドメイン抗体、scFv、二価、三価または四価抗体、Bis-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい(例えば、HolligerおよびHudson、2005年、Nature Biotech.23(9):1126-1136頁;AdairおよびLawson、2005年、Drug Design Reviews-Online 2(3)、209-217頁を参照されたい)。これらの抗体断片を作製し製造する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Vermaら、1998年、Journal of Immunological Methods、216、165-181頁を参照されたい)。多価抗体は、複数の特異性を含んでも、または単一特異性であってもよい(例えば、国際公開第92/22853号パンフレットおよび国際公開第05/113605号パンフレットを参照されたい)。本発明のこの態様は、ヒト化型、およびアミノ酸がCDRにおいて変異して、本明細書に記載のように、1または複数の異性化、脱アミド化、グリコシル化部位またはシステイン残基が除去されているものを含む改変型を含む、これらのCD79抗体の変異体にも及ぶことが理解されよう。
したがって、一実施例において、可変領域を有する重鎖もしくは重鎖断片を含む抗CD79抗体またはその結合断片が提供され、前記可変領域は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4から独立して選択される1、2または3つのCDRを含み、例えば、CDR H1は配列番号1であり、CDR H2は配列番号2であり、CDR H3は配列番号3または配列番号4である。
したがって、一実施形態において、CDR H1は配列番号1であり、かつCDR H2は配列番号2である、またはCDR H1は配列番号1であり、かつCDR H3は配列番号3である、またはCDR H1は配列番号1であり、かつCDR H3は配列番号4である、またはCDR H2は配列番号2であり、かつCDR H3は配列番号3である、またはCDR H2は配列番号2であり、かつCDR H3は配列番号4である。
したがって、一実施例において、可変領域を有する重鎖もしくは重鎖断片を含む抗CD79抗体またはその結合断片が提供され、前記可変領域は、配列番号8、配列番号9、および配列番号4から独立して選択される1、2または3つのCDRを含み、例えば、CDR H1は配列番号8であり、CDR H2は配列番号9であり、CDR H3は配列番号4である。
したがって、一実施形態においてCDR H1は配列番号8であり、かつCDR H2は配列番号9である、またはCDR H1は配列番号8であり、かつCDR H3は配列番号4である、またはCDR H2は配列番号9であり、かつCDR H3は配列番号4である。
したがって、一実施例において、可変領域を有する重鎖もしくは重鎖断片を含む抗CD79抗体またはその結合断片が提供され、前記可変領域は、配列番号11、配列番号12、および配列番号3から独立して選択される1、2または3つのCDRを含み、例えば、CDR H1は配列番号11であり、CDR H2は配列番号12であり、CDR H3は配列番号3である。
したがって、一実施形態においてCDR H1は配列番号11であり、かつCDR H2は配列番号12である、またはCDR H1は配列番号11であり、かつCDR H3は配列番号3である、またはCDR H2は配列番号12であり、かつCDR H3は配列番号3である。
一実施形態において、本開示による抗体分子は、例えば配列番号5、6および7から独立して選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む可変領域を有する軽鎖または軽鎖断片を含み、特にCDR L1は配列番号5に示される配列を有し、CDR L2は配列番号6に示される配列を有し、CDR L3は配列番号7に示される配列を有する。
したがって、一実施形態において、CDR L1は配列番号5であり、かつCDR L2は配列番号6である、またはCDR L1は配列番号5であり、かつCDR L3は配列番号7である、またはCDR L2は配列番号6であり、かつCDR L3は配列番号7である。
一実施形態において、本開示による抗体分子は、例えば配列番号13-24から独立して選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む可変領域を有する軽鎖または軽鎖断片を含み、特にCDR L1は配列番号13または19に示される配列を有し、CDR L2は配列番号14または20に示される配列を有し、CDR L3は配列番号15、16、17、18、21、22、23および24から独立して選択される配列を有する。
したがって、一実施形態において、CDR L1は配列番号13であり、かつCDR L2は配列番号14である、またはCDR L1は配列番号13であり、かつCDR L3は配列番号15、16、17または18である、またはCDR L2は配列番号14であり、かつCDR L3は配列番号15、16、17または18である、またはCDR L1は配列番号13であり、CDR L2は配列番号14であり、かつCDR L3は配列番号15、16、17または18である。
したがって、一実施形態において、CDR L1は配列番号19であり、かつCDR L2は配列番号20である、またはCDR L1は配列番号19であり、かつCDR L3は配列番号21、22、23または24である、またはCDR L2は配列番号20であり、かつCDR L3は配列番号21、22、23または24である、またはCDR L1は配列番号19であり、CDRL2は配列番号20であり、かつCDR L3は配列番号21、22、23または24(例えば配列番号22)である。
一実施形態において、本開示による抗体または結合断片は、配列番号1~24から選択されるCDR配列を含み、例えばCDR H1は配列番号1であり、CDR H2は配列番号2であり、CDR H3は配列番号3または4であり、CDR L1は配列番号5であり、CDR L2は配列番号6であり、CDR L3は配列番号7である。
一実施形態において、CDR H1は配列番号8または11であり、CDR H2は配列番号9または12であり、CDR H3は配列番号3または4であり、CDR L1は配列番号5であり、CDR L2は配列番号6であり、CDR L3は配列番号7である。
一実施形態において、CDR H1は配列番号8または11であり、CDR H2は配列番号9または12であり、CDR H3は配列番号3または4であり、CDR L1は配列番号13または19であり、CDR L2は配列番号14または20であり、CDR L3は配列番号15、16、17、18、21、22、23または24である。
一実施形態において、CDR H1は配列番号1であり、CDR H2は配列番号2であり、CDR H3は配列番号3または4であり、CDR L1は配列番号13または19であり、CDR L2は配列番号14または20であり、CDR L3は配列番号15、16、17、18、21、22、23または24である。
一実施形態において、CDR H1は配列番号8であり、CDR H2は配列番号9であり、CDR H3は配列番号4であり、CDR L1は配列番号13であり、CDR L2は配列番号14であり、CDR L3は配列番号15、16、17または18である。
一実施形態において、CDR H1は配列番号11であり、CDR H2は配列番号12であり、CDR H3は配列番号3であり、CDR L1は配列番号19であり、CDR L2は配列番号20であり、CDR L3は配列番号21、22、23または24である。
文脈が他のことを示さない限り、本明細書ではKabatのナンバリングを用いる。
一実施形態において、本開示による抗体分子はヒト化され、本明細書に記載のCDRまたはその変異体を組み込む。
一実施形態において、本開示の抗体分子に用いられる重鎖可変領域ヒトフレームワークは、IGHV3-48、IGHV4-59、IGHV3-66、およびこれらのいずれか1つの変異体を含む群から選択され、この変異体では1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸で置換され、例えば元のドナー抗体の対応する位置の残基、例えば配列番号31、または38に提供されるドナーVH配列に由来する残基で置換される。典型的には、ヒトフレームワークは、JH4またはJH2 J領域などの適切なJ領域配列をさらに含む。
一実施形態において、(特に、本明細書において上記の重鎖抗CD79 CDRとの使用のための)VHフレームワークにおける置換は、24、37、48、49、67、71、73および78から選択される1または複数の位置、例えば1、2、3、4、5、6、7または8つの位置において行われ(例えば、少なくとも73および78位における置換)、例えば、24、48、49、73および78位のすべて(特にIGHV3-66に適している)、または24、48、49、71、73および78位のすべて(特にIGHV3-48に適している)、または37、49、67、71、73、76および78位のすべて、または37、67、71、73、76および78位のすべて(特にIGHV4-59に適している)において置換が行われる。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの24位はバリンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの37位はバリンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの48位はイソロイシンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの49位はグリシンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの67位はフェニルアラニンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの71位はリジンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの71位はアルギニンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの73位はセリンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの78位はバリンである。
これらの置換の1または複数を組み合わせて、本発明の抗体分子に使用するためのヒト化VH領域を作製可能であることが理解されよう。
一実施形態において、ヒト化VH可変ドメインは、配列番号34、35、41および42から独立して選択される配列を含む。
一実施形態において、VHの残基1をグルタミン酸に変えて、配列のプロセシングを容易にする。
一実施形態において、本開示のヒト化抗体分子に用いられる軽鎖可変領域ヒトフレームワークは、IGKV1-6、IGKV1D-13およびこれらのいずれか1つの変異体を含む群から選択され、この変異体では、1、2、3、4、5または6個のアミノ酸が、システイン以外のアミノ酸で置換され、例えば元のドナー抗体の対応する位置の、例えば配列番号29または36で提供されたドナーVL配列由来のドナー残基で置換されている。典型的には、ヒトフレームワークは、JK4 J領域などの適切なJ領域をさらに含む。
一実施形態において、本開示の抗体分子に(例えば、軽鎖抗CD 79CDRを受容するために)用いられるヒトVLフレームワークは、2、3、36、46、49および70位を含む群から選択される少なくとも1つの位置、例えば1、2、3、4、5または6つの位置で置換されたアミノ酸を含み、例えばフレームワーク中の元のアミノ酸がシステイン以外の別のアミノ酸で置換され、特に、ドナー抗体のフレームワーク中の対応する位置の残基で置換されている。
一実施形態において、用いられるヒトVLフレームワークはIGKV1フレームワークであり、少なくとも3位および70位に置換を有する。
一実施形態において、用いられるヒトVLフレームワーク(IGKV1フレームワークなど)は、2、3、36、46、49および70位(特に、IGKV1D-13に適している)または3および70位(特にIGKV1-6に適している)に置換を有する。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの2位はグルタミンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの3位はバリンまたはアスパラギン酸である。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの36位はロイシンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの46位はグルタミンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの49位はヒスチジンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの70位はグルタミンである。
これらの置換の1または複数を組み合わせて、本発明の抗体に使用するためのヒト化VL領域を作製可能であることが理解されよう。
一実施形態において、ヒト化VL可変ドメインは、配列番号33または40から独立して選択される配列を含む。
一実施形態において、ヒト化VL可変ドメインは、配列番号33、40、341、342および343から独立して選択される配列を含む。
一実施形態において、配列番号34および35から独立して選択されるVH、ならびに配列番号33に示される配列を有するVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号34および35から独立して選択されるVH、ならびに配列番号250に示される配列を有するVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号41および42から独立して選択されるVH、ならびに配列番号40に示される配列を有するVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号41および42から独立して選択されるVH、ならびに配列番号40、341、342および343から独立して選択されるVLを含む抗体分子が提供される。
これらのヒト化移植可変領域(配列番号41、42、40、341、342および343)は、ドナー残基の数を減少させ、これらを元の(1つまたは複数の)ヒト残基と置換するように改変され得ることが理解されよう。
したがって、一実施例において、3位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または70位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されている、配列番号40、341、342および343から独立して選択されるVLを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、24位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または48位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されているか、および/または49位の残基がセリン(S)によって置換されているか、および/または73位の残基がアスパラギン(N)によって置換されているか、および/または78位の残基がロイシン(L)によって置換されている、配列番号41に示される配列を含むVHを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、37位の残基がイソロイシン(I)によって置換されているか、および/または67位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または71位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または73位の残基がスレオニン(T)によって置換されているか、および/または78位の残基がフェニルアラニン(F)によって置換されている、配列番号42に示される配列を含むVHを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、24位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または48位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されているか、および/または49位の残基がセリン(S)によって置換されているか、および/または73位の残基がアスパラギン(N)によって置換されているか、および/または78位の残基がロイシン(L)によって置換されている、配列番号41に示される配列を含むVH、ならびに配列番号40、341、342および343の配列から独立して選択される配列、または3位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または70位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されている、配列番号40、341、342および343から独立して選択される配列を含むVLを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、37位の残基がイソロイシン(I)によって置換されているか、および/または67位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または71位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または73位の残基がスレオニン(T)によって置換されているか、および/または78位の残基がフェニルアラニン(F)によって置換されている、配列番号42に示される配列を含むVH、ならびに配列番号40、341、342および343の配列から独立して選択される配列、または3位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または70位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されている、配列番号40、341、342および343から独立して選択される配列を含むVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、本開示の抗体分子は完全長抗体である。
一実施形態において、本開示の抗体分子は、FabまたはFab’断片である。
一実施形態において、本開示の抗体分子はscFvである。
一実施形態において、本開示の抗体分子は、多重特異性、例えば二重特異性または三重特異性である。
一実施形態において、本開示の多重特異性抗体分子(例えば、二重特異性抗体分子)は、CD79に特異的な結合ドメインに加えて、別の抗原に特異的な結合ドメインを含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性抗体分子(例えば、二重特異性抗体分子)は、CD79に特異的な結合ドメインに加えて、CD22に特異的な結合ドメインを含み、これは、例えば、1、2、3、4、5または6つの本明細書に開示の抗CD22 CDRまたはその変異体、例えば、可変ドメインまたは可変ドメイン対、特に本明細書に開示のヒト化可変ドメインまたは可変ドメイン対を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性抗体分子(例えば、二重特異性抗体分子)は、CD45に対する結合ドメインを含み、これは、例えば、1、2、3、4、5または6つの本明細書に開示の抗CD45 CDRまたは変異体、例えば、可変ドメインまたは可変ドメイン対、特に本明細書に開示のヒト化可変ドメインまたは可変ドメイン対を含む。
一実施形態において、本発明の多重特異性分子の1または複数の結合ドメインは、それぞれ独立して、関連する抗原に特異的な1または2つ(例えば2つ)の抗体可変ドメイン(少なくとも1つのCD79に特異的な結合ドメインおよびCD22またはCD45に特異的なさらなる結合ドメインなど)を含む。
一実施形態において、本開示の抗体分子はCD79aに特異的である。
一実施形態において、本開示の抗体分子はCD79bに特異的である。
一実施形態において、本開示の抗体分子は、CD79a/CD79bヘテロ二量体に特異的である。
本明細書において明示的に開示される抗体または結合断片と同じエピトープに結合する抗体または結合断片もまた提供される。
一実施形態において、本明細書において明示的に開示される、ヒトCD79に対する抗体または結合断片を交差ブロックするか、または前記抗体によってヒトCD79との結合から交差ブロックされる、抗体または結合断片が提供される。
二重特異性または三重特異性フォーマットにおける本開示による抗-CD79と抗-CD45またはCD22との組合せは、機能的インビトロアッセイ、例えば以下のいずれか1つによって測定されるB細胞シグナル伝達の阻害において興味深い生物活性を示す:B細胞上のCD86、CD71および/またはCD40の発現の阻害に加えて、Akt S473のリン酸化の阻害、P38のリン酸化の阻害、およびIkBのPLCγ2 Y759阻害。同じレベルの活性は、個々の成分単独では明らかではなく、混合物で提供されるこれらの成分についても明らかではない、すなわち、その組合せが二重特異性分子で提供される場合にのみ存在する。
これらのアッセイで観察される阻害は、本発明の多重特異性分子がCD45またはCD22に特異的な結合ドメインおよびCD79に特異的な結合ドメインを含み、この組合せを使用して、B細胞機能を改変し、B細胞の枯渇に代わる治療選択肢を提供することができることを示している。
本発明はまた、本発明の多重特異性分子に使用するため、または任意の他の適切な抗体フォーマットに組み込むための新規なCD22抗体を提供する。
本発明はまた、本発明の多重特異性分子に使用するため、または任意の他の適切な抗体フォーマットに組み込むための新規なCD45抗体を提供する。
図1は、CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、リン酸化Akt阻害の相対効力の棒グラフである。 図2は、CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、リン酸化PLCγ2阻害の相対効力の棒グラフである。 図3は、CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、CD86発現阻害の相対効力の棒グラフである。 図4は、CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価または混合物に対する、リン酸化Akt阻害の相対効力の棒グラフである。 図5は、CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価または混合物に対する、リン酸化PLCγ2阻害の相対効力の棒グラフである。 図6は、抗IgM刺激B細胞における総IkBレベルに対する、CD22およびCD79bの二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。 図7は、抗IgM刺激B細胞上のCD86発現に対する、CD22およびCD79bの二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。 図8は、異なるV領域を有する、CD22およびCD79bに対する特異性を有する二重特異性タンパク質に対する、リン酸化PLCγ2阻害のグラフである。 図9は、特定の抗体フォーマットを示す、ChanおよびCarter、Nature Reviews Immunology 10巻、2010年5月、301による抽出物である 図10は、抗原グリッドの交差特異性に関するデータを示す表である。抗原2=CD79bおよび抗原3=CD22。値は、Sykのリン酸化の阻害パーセンテージ(活性化に対する負値)であり、評価された複数のV領域の組合せの平均を表す。 図11は、抗原グリッドの交差特異性に関するデータを示す表である。抗原2=CD79bおよび抗原3=CD22。値は、PLCγ2のリン酸化の阻害パーセンテージ(活性化に対する負値)であり、評価された複数のV領域の組合せの平均を表す。 図12は、抗原グリッドの交差特異性に関するデータを示す表である。抗原2=CD79bおよび抗原3=CD22および抗原4=CD4。値は、AKTのリン酸化の阻害パーセンテージ(活性化に対する負値)であり、評価された複数のV領域の組合せの平均を表す。 図13は、Fab-XのCD79b特異性とFab-YのCD22特異性とを組み合わせるための個々のV領域の組合せに対する、Syk、PLCγ2およびAKTのリン酸化の阻害パーセンテージを示すグラフである 図14は、Fab-XのCD22特異性とFab-YのCD79b特異性とを組み合わせるための個々のV領域の組合せに対する、Syk、PLCγ2およびAKTのリン酸化の阻害パーセンテージを示すグラフである。 図15は、CD79bおよびCD22特異的Fab-Kd-FabまたはBYbeによる、B細胞における抗IgM誘導性リン酸化PLCγ2の阻害パーセンテージのデータを示す 図16は、CD79bおよびCD22特異的Fab-Kd-FabまたはBYbeによる、B細胞における抗IgM誘導性リン酸化P38の阻害パーセンテージのデータを示す 図17は、CD79bおよびCD22特異的Fab-Kd-FabまたはBYbeによる、B細胞における抗IgM誘導性リン酸化Aktの阻害パーセンテージのデータを示す 図18は、CD79bおよびCD22特異的Fab-Kd-FabまたはBYbeによる、B細胞上の抗IgM誘導性CD71発現の阻害パーセンテージのデータを示す 図19は、CD79bおよびCD22特異的Fab-Kd-FabまたはBYbeによる、B細胞上の抗IgM誘導性CD40発現の阻害パーセンテージのデータを示す。 図20は、CD79bおよびCD22特異的Fab-Kd-FabまたはBYbeによる、B細胞上の抗IgM誘導性CD86発現の阻害パーセンテージのデータを示す 図21は、CD79bおよびCD22特異的VR4447/VR4126 BYbeおよびVR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンによるB細胞上のCD27発現の阻害を示す 図22は、CD79bおよびCD22特異的VR4447/VR4126 BYbeおよびVR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンによるB細胞上のCD71発現の阻害を示す 図23は、CD79bおよびCD22特異的VR4447/VR4126 BYbeおよびVR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンによるB細胞上のCD86発現の阻害を示す 図24は、CD79bおよびCD22特異的VR4447/VR4130 BYbeおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンによるB細胞上のCD27発現の阻害を示す 図25は、CD79bおよびCD22特異的VR4447/VR4130 BYbeおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンによるB細胞上のCD71発現の阻害を示す 図26は、CD79bおよびCD22特異的VR4447/VR4130 BYbeおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンによるB細胞上のCD86発現の阻害を示す。 図27は、VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbeおよびVR4447/VR4130 BYbeとともに培養したPBMCによる破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。データは、3人のドナーからプールされたデータを表す。 図28は、VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbeおよびVR4447/VR4130 BYbeとともに培養した精製B細胞による破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。データは、2人のドナーからプールされたデータを表す。 図29は、VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe、VR4447/VR4130 BYbe、VR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンとともに培養した、PBMCまたは精製B細胞のいずれかによる破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。示されたデータは単一ドナー由来である。 図30は、12人の健常者および12人のSLE患者の試料由来の非刺激B細胞におけるリン酸化のベースラインレベルを示す。 図31は、12人の健常なボランティア(HV)および12人のSLEドナー由来のB細胞における、抗IgM誘導性NFkBリン酸化に対するCD79b+CD22特異的VR4447/VR4130 BYbeの効果を示す。 図32は、12人の健常なボランティア(HV)および12人のSLEドナー由来のB細胞における、抗IgM誘導性Aktリン酸化に対するCD79b+CD22特異的VR4447/VR4130 BYbeの効果を示す。 図33は、12人の健常なボランティア(HV)および12人のSLEドナー由来のB細胞における、抗IgM誘導性Sykリン酸化に対するCD79b+CD22特異的VR4447/VR4130 BYbeの効果を示す。 図34は、12人の健常なボランティア(HV)および12人のSLEドナー由来のB細胞における、抗IgM誘導性Erk1および2のリン酸化に対するCD79b+CD22特異的VR4447/VR4130 BYbeの効果を示す。 図35は、CD45およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、リン酸化Akt阻害の相対効力の棒グラフである。 図36は、CD45およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、リン酸化PLCg2阻害の相対効力の棒グラフである。 図37は、抗IgM刺激B細胞上のCD86発現に対する、CD45およびCD79bの二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。 図38は、異なるV領域を有する、CD45およびCD79bに対する特異性を有する二重特異性タンパク質に対する、リン酸化PLCg2阻害のグラフである 図39は、Fab-XのCD79b特異性とFab-YのCD45特異性とを組み合わせるための個々のV領域の組合せに対する、Syk、PLCγ2およびAKTのリン酸化の阻害パーセンテージを示す。 図40は、Fab-YのCD79b特異性とFab-XのCD45特異性とを組み合わせるための個々のV領域の組合せに対する、Syk、PLCγ2およびAKTのリン酸化の阻害パーセンテージを示す。 図41は、ドナー129由来のIgM刺激B細胞における、精製CD79b-CD45(一過性発現)によるPLCγ2の阻害(+/-SD)を示す 図42は、ドナー130由来のIgM刺激B細胞における、精製CD79b-CD45(一過性発現)によるPLCγ2の阻害(+/-SD)を示す 図43は、ドナー129由来のIgM刺激B細胞における、精製CD79b-CD45(一過性発現)によるp38の阻害(+/-SD)を示す 図44は、ドナー130由来のIgM刺激B細胞における、精製CD79b-CD45(一過性発現)によるp38の阻害(+/-SD)を示す 図45は、ドナー129由来のIgM刺激B細胞における、精製CD79b-CD45(一過性発現)によるAktの阻害(+/-SD)を示す 図46は、ドナー130由来のIgM刺激B細胞における、精製CD79b-CD45(一過性発現)によるAktの阻害(+/-SD)を示す 図47は、異なる多重特異性分子とともに培養したPBMCの破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す 図48は、カニクイザル由来のB細胞に対する抗ヒトCD79 V領域の結合を示す 図49は、カニクイザル由来のB細胞に対する抗ヒトCD79 V領域の結合を示す 図50は、ヒトPBMCにおけるB細胞のBCRシグナル伝達の阻害を示す。 図51は、本開示の配列を示す。
B細胞受容体シグナル伝達は、B細胞の重要な機能であり、B細胞の抗原特異的活性化の必要条件である。BcRシグナル伝達は、B細胞発生の初期段階から、メモリーB細胞応答の活性化および発達に至るまで極めて重要である。B細胞受容体は、CD79aおよびCD79bのヘテロ二量体複合体と会合する表面免疫グロブリン(Ig)分子から構成される。表面Igが抗原を認識すると、これは、CD79a/b複合体のクラスタリングをもたらし、これが、SrcファミリーキナーゼならびにSykおよびBtkチロシンキナーゼを含む即時シグナル伝達カスケードの下流活性化をもたらすと考えられる。次いで、このシグナル伝達複合体は、CD19およびBLNKなどのアダプタータンパク質を動員し、PLCγ2およびPI3Kの活性化をもたらし、順次、さらなる下流経路、例えばB細胞の増殖、生存および分化を制御する経路などを活性化することができる。このシグナル伝達複合体は、BAFF-R、IL-21RおよびCD40によるシグナル伝達を介して他の第2のシグナルによってさらに調節され、他のシグナル伝達分子、例えばCD19、CD21、CD83、CD22、CD32bおよびCD45などによっても調節され得る。BcRにより抗原を認識すると、活性化される最初の応答の1つは、共刺激分子CD80およびCD86などの表面受容体のアップレギュレーションである。これらの分子はT細胞上の対応する受容体に結合し、この受容体はMHCクラスIIとの関連で抗原を認識するT細胞の生存および拡大を可能にするさらなる生存および活性化のシグナルを送達する。この応答は、MHCクラスIIとの関連において抗原を提示して、T細胞へ戻すB細胞の能力によってさらに増幅され、このT細胞はIL-2およびIL-21のような因子を放出する。これらのサイトカインは、次にB細胞数を大きく拡大する。したがって、細胞表面上のCD86のダウンレギュレーションは、B細胞シグナル伝達の阻害を示すことができる。
さらに、B細胞受容体シグナル伝達の阻害は、下流機能の阻害をもたらすことができる。このような結果の1つは、T細胞の機能、生存および分化の阻害をもたらすCD86などの共刺激分子の阻害(またはその発現低下)である。
したがって、B細胞受容体シグナル伝達の阻害は、自己免疫および癌に関連する異常なB細胞機能を制御するのに有益であり得る。B細胞受容体のシグナル伝達は、自己免疫疾患におけるB細胞増殖、分化、抗原提示およびサイトカイン放出に必要である。したがって、BcR活性の阻害は、免疫グロブリン分泌、T細胞活性化などのB細胞機能を調節し、例えば自己免疫状態に関連する不適切なB細胞活性を制御することができる。さらに、B細胞受容体活性化の阻害剤によって制御され得る、生存および増殖のためにB細胞受容体シグナル伝達を必要とするいくつかのB細胞白血病およびリンパ腫がある。
本明細書において使用されるCD79は、CD79aとCD79bとから構成される複合体を指す。したがって、CD79に結合する抗体または結合ドメインは、CD79aおよび/またはCD79bに結合することができる。本明細書で用いられるCD79aおよび/またはCD79bへの結合は、CD79aに特異的、CD79bに特異的、CD79aおよびCD79bの両方に特異的(すなわち、CD79a上のエピトープを認識し、同じ抗体または結合ドメインがCD79b上のエピトープも認識する、すなわち汎特異的)であることを指すか、またはCD79aとCD79bとの複合体に特異的である(すなわち、複合体形態のCD79aとCD79bの相互作用から形成されるエピトープを認識し、これにより複合体を個別の成分とは区別できる)。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる抗体またはその結合断片は、CD79aに特異的である。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる抗体またはその結合断片は、CD79bに特異的である。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる抗体またはその結合断片は、CD79複合体に特異的であり、すなわち、複合体中に存在するエピトープ、例えばCD79aとCD79bとの間の相互作用を含むエピトープを認識し、それに対して特異的である。
一実施形態において、結合ドメインがCD79aまたはCD79bに特異的であった場合、2種のタンパク質は細胞表面に天然に同時発現されるので、この結合ドメインが、複合体形態の場合もCD79aまたはCD79bに結合することが好ましいことは理解されるであろう。
1つの結合ドメインおよび/またはそれぞれの結合ドメイン中に2つの可変領域が存在する場合、この2つの可変領域は、一般に、関連する抗原に対する特異性を提供するために協同的に機能し、例えば、これらは、同族対であるか、または親和性成熟して、このドメインが特定の抗原に特異的であるように適切な親和性を提供する。典型的には、これらは重鎖および軽鎖可変領域対(VH/VL対)である。
本発明の抗体分子は、完全長の重鎖および軽鎖またはその断片を有する完全抗体分子を含むことができ、限定するものではないが、Fab、改変Fab、Fab’、改変Fab’、F(ab’)、Fv、単一ドメイン抗体(例えばVHまたはVLまたはVHH)、scFv、二価、三価または四価抗体、Bis-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび上記のいずれかのエピトープ結合断片であってよい(例えば、HolligerおよびHudson、2005年、Nature Biotech.23(9):1126-1136頁;AdairおよびLawson、2005年、Drug Design Reviews-Online 2(3)、209-217頁を参照されたい)。これらの抗体断片を作製し製造する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Vermaら、1998年、Journal of Immunological Methods、216、165-181頁を参照されたい)。本発明に使用するための他の抗体断片には、国際公開第2005/003169号パンフレット、国際公開第2005/003170号パンフレットおよび国際公開第2005/003171号パンフレットに記載されたFabおよびFab’断片が含まれる。多価抗体は多重特異性を含み、例えば二重特異性であっても、または単一特異性であってもよい(例えば、国際公開第92/22853号パンフレット、国際公開第05/113605号パンフレット、国際公開第2009/040562号パンフレットおよび国際公開第2010/035012号パンフレットを参照されたい)。
本明細書において用いられる「多重特異性分子」は、少なくとも2種の別個の抗原、例えば異なる抗原に特異的に結合する能力を有する分子を指す。一実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性、三重特異性または四重特異性分子、特に二重特異性または三重特異性分子である。
一実施形態において、本開示の抗体分子は二重特異性である。
一実施形態において、本開示の抗体分子は二重特異性であり、1つの結合ドメインはCD79に結合する。
一実施形態において、本開示の抗体分子は三重特異性である。
一実施形態において、本開示の抗体分子は三重特異性であり、1つの結合ドメインはCD79に結合する。
一実施形態において、本開示の抗体分子はCD79に対して単一特異性であり、少なくとも1つの他の抗原に対して単一特異性である、すなわち、該分子はCD79に結合する1つの結合ドメインのみを含む。
一実施形態において、本開示の抗体分子はCD79に対して単一特異性であり、CD22に対して単一特異性である、すなわち、該分子はCD79に結合する1つの結合ドメインおよびCD22に結合する1つの結合ドメインのみを含む。
一実施形態において、本開示の抗体分子はCD79に対して単一特異性であり、CD45に対して単一特異性である、すなわち、該分子はCD79に結合する1つの結合ドメインおよびCD45に結合する1つの結合ドメインのみを含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性分子は一本鎖である。
一実施形態において、本開示の多重特異性分子は、重鎖およびさらに軽鎖も含む。一実施例において、本明細書において用いる場合、重鎖および軽鎖の対形成は二量体とは呼ばれず、特に、一実施形態において、本開示の分子が、抗体、単位/断片または成分の二量体などの多量体を含まない場合、二量体とは呼ばれない。
一態様において、本開示は、少なくともCD22およびCD79aに特異的な適切なフォーマットの分子、ならびに二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多重特異性分子における、CD22およびCD79aに特異的な抗体/断片またはこれらの組合せの使用に及ぶ。
一態様において、本開示は、少なくともCD22およびCD79bに特異的な適切なフォーマットの分子、ならびに二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多重特異性分子における、CD22およびCD79bに特異的な抗体/断片またはこれらの組合せの使用に及ぶ。
一態様において、本開示は、少なくともCD22およびCD79a/b複合体に特異的な適切なフォーマットの分子、ならびに二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多重特異性分子における、CD22およびCD79a/b複合体に特異的な抗体/断片またはこれらの組合せの使用に及ぶ。
一態様において、本開示は、少なくともCD45およびCD79aに特異的な適切なフォーマットの分子、ならびに二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多重特異性分子における、CD45およびCD79aに特異的な抗体/断片またはこれらの組合せの使用に及ぶ。
一態様において、本開示は、少なくともCD45およびCD79bに特異的な適切なフォーマットの分子、ならびに二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多重特異性分子における、CD45およびCD79bに特異的な抗体/断片またはこれらの組合せの使用に及ぶ。
一態様において、本開示は、少なくともCD45およびCD79a/b複合体に特異的な適切なフォーマットの分子、ならびに二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多重特異性分子における、CD45およびCD79a/b複合体に特異的な抗体/断片またはこれらの組合せの使用に及ぶ。
一実施形態において、本開示の分子は、例えば、第3の結合ドメインが、例えば血清担体タンパク質に結合することによって分子の半減期を延長することができる場合、三重特異性である。
さまざまなタンパク質が血漿中に存在し、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α1酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲンおよびアルブミン、またはそれらのいずれかの断片が含まれる(Bartalena&Robbins、1993年、Clinics in Lab.Med.13:583-598頁;Breeら、1986年、Clin.Pharmacokin.11:336-342頁;Gitlinら、1964年、J.Clin.Invest.10:1938-1951頁;Peters、1985年、Adv Protein Chem.37:161-245頁;Waldeman&Strober、1969年、Progr.Allergy、13:1-110頁)。一実施例において、第3の結合ドメインは血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに特異的である。
多重特異性分子フォーマット
本発明に使用するための適切な多重特異性分子の例は当技術分野において公知であり、例えば、総説「The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies、Nunez-Pradoら、Drug Discovery Today、20巻5号、2015年3月、588-594頁、D.Holmes、Nature Rev Drug Disc 2011年11月:10;798頁、Chan and Carter、Nature Reviews Immunology 10巻、2010年5月、301頁、に開示されており、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、多重特異性フォーマットには、当技術分野において公知のものおよび本明細書に記載のものが含まれ、例えば、この分子フォーマットは、以下を含むか、または以下からなる群から選択される:
・タンデムsdAb、タンデムsdAb-sdAb(3つのsdAb);
・(scFv)(タンデムscFvとも呼ばれる)、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv(dsFv)
・ダイアボディ、dsダイアボディ、didsダイアボディ、
・scダイアボディ、dsscダイアボディ、didsscダイアボディ;
・Dart抗体、すなわち、VHおよびVHのC末端がジスルフィド結合によって接合されているVLリンカーVHリンカーおよびVHリンカーVL
・BiTE(登録商標)、dsBiTE、didsBiTE;
・Di-ダイアボディ(Nunez-Pradoら、特に図1の分子番号25を参照されたい)、dsdi-ダイアボディ、didsdi-ダイアボディ;
・トリアボディ、dsトリアボディ、didsトリアボディ、tridsトリアボディ;
・テトラボディ、dsテトラボディ、didsテトラボディ、tridsテトラボディ、tetradsテトラボディ;
・tandab(Nunez-Pradoら、特に図1の分子番号22を参照されたい);dstandab、didstandab、tridstandab、tetradstandab;
・[sc(Fv)、(Nunez-Pradoら、特にその中の図1の分子番号22を参照されたい)、ds[sc(Fv)、dids[sc(Fv)、trids[sc(Fv)、tetrads[sc(Fv)
・ペンタボディ(Nunez-Pradoら、特にその中の図1の分子番号27を参照されたい);
・Fab-scFv(バイボディとも呼ばれる)、Fab’scFv、FabdsscFv(またはBYbe)、Fab’dsscFv;
・トリボディ、dsトリボディ、didsトリボディ(FabdidsscFvまたはTrYbeまたはFab-(dsscFv)とも呼ばれる)、Fab’didsscFv;
・Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv;
・Fab単一リンカーFv(本明細書において、国際公開第2014/096390号パンフレットに開示されるようにFabdsFvとも呼ばれる)、Fab’単一リンカーFv(本明細書においてFab’dsFvとも呼ばれる);
・FabscFv単一リンカーFv、Fab’scFv単一リンカーFv;
・FabdsscFv単一リンカーFv、Fab’dsscFv単一リンカーFv;
・FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv、
・FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv、
・diFab、diFab’(化学的にコンジュゲートされたdiFab’を含む)、
・(FabscFv)、(Fab)scFvdsFv、(Fab)dsscFvdsFv、(FabdscFv)
・(Fab’scFv)、(Fab’)scFvdsFv、(Fab’)dsscFvdsFv、(Fab’dscFv)
・VHC(Nunez-Pradoら、特にその中の図1の分子番号6を参照されたい);
・ミニボディ、dsミニボディ、didsミニボディ、
・ミニ抗体(ZIP)[Nunez-Pradoら、特にその中の図1の分子番号7を参照されたい]、dsミニ抗体(ZIP)およびdidsミニ抗体(ZIP);
・tribi-ミニボディ[Nunez-Pradoら、特にその中の図1の分子番号15を参照されたい]dstribi-ミニボディ、didstribi-ミニボディ、tridstribi-ミニボディ;
・ダイアボディ-CH、dsダイアボディ-CH、didsダイアボディ-CH、scダイアボディ-CH、dsscダイアボディ-CH、didsscダイアボディ-CH
・タンデムscFv-CH、タンデムdsscFv-CH、タンデムdidsscFv-CH、タンデムtridsscFv-CH、タンデムtetradsscFv-CH
・国際公開第2008/012543号パンフレットに記載のように本明細書においてscFv-Fc((scFvCHCHとも呼ばれる)およびこれらの一本鎖型、dsscFvscFv-Fc、dsscFv-Fc((本明細書においてdsscFvCHCHとも呼ばれる)、scFv-dsFv-Fc、dsscFv-dsFv-Fc、dsFv-Fc(本明細書において(dsFvCHCHとも呼ばれる)、
・スコーピオン分子(scorpion molecule)(Trubion)すなわち、結合ドメイン、米国特許第8,409,577号明細書に記載のリンカー-CHCH結合ドメイン;
・SMIP(Trubion)すなわち(scFv-CHCH
・(dsFvCHCH、タンデムscFv-Fc、タンデムdsscFvscFv-Fc、タンデムdsscFv-Fc、
・scFv-Fc-scFv、dsscFv-Fc-scFv、scFv-Fc-dsscFv、
・ダイアボディ-Fc、dsダイアボディ-Fc、didsダイアボディ-Fc、トリアボディ-Fc、dsトリアボディ-Fc、didsトリアボディ-Fc、tridsトリアボディ-Fc、テトラボディ-Fc、dsテトラボディ-Fc、didsテトラボディ-Fc、tridsテトラボディ-Fc、tetradsテトラボディ-Fc、dsテトラボディ-Fc、didsテトラボディ-Fc、tridsテトラボディ-Fc、tetradsテトラボディ-Fc、scダイアボディ-Fc、dsscダイアボディ、didsscダイアボディ;
・例えば異なる重鎖可変領域および共通の軽鎖を有する2または3官能性抗体、例えば、固定配列の共通の軽鎖および(異なるCDRを含む)異なる重鎖と、異なる重鎖の二量体化(the dimerization o the different heavy chains)を推進するように操作されたCHドメインとを有する、Merus二重特異性抗体フォーマット(Biclonics(登録商標))、
・Duobody(すなわち、抗体中の1つの完全長鎖が抗体中の他の完全長鎖に対して異なる特異性を有する);
・二重特異性フォーマットを作成するためにFabアームの交換が用いられている完全長抗体;
・完全長抗体が共通の重鎖および異なる軽鎖を有する2または3官能性抗体、「カッパ/ラムダボディ」または「κ/λ-ボディ」とも呼ばれ、例えば国際公開第2012/023053号パンフレットを参照されたい;
・重鎖または軽鎖のC末端由来の1、2、3または4つのIg-scFv、重鎖または軽鎖のN末端由来の1、2、3または4つのscFv-Ig、単一リンカーIg-Fv、重鎖または軽鎖C末端由来の1、2、3または4つのIg-dsscFv(1、2、3または4個のジスルフィド結合を含む);
・重鎖または軽鎖のN末端由来の1、2、3または4つのIg-dsscFv(1、2、3または4個のジスルフィド結合を含む)、
・Ig単一リンカーFv(PCT/EP第2015/064450号明細書を参照されたい)、
・Ig-dab、dab-Ig、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、
・scFabFvFc、scFabdsFvFc(単一リンカー型scFavFv)、(FabFvFc)、(FabdsFvFc)、scFab’FvFc、scFab’dsFvFc、(Fab’FvFc)、(Fab’dsFvFc);ならびに
・DVDIg、(以下により詳細に考察される)。
一態様において、多重特異性分子フォーマットには、当技術分野において公知のもの、および本明細書に記載のものが含まれ、例えば、該分子フォーマットは、ダイアボディ、scダイアボディ、トリアボディ、トリボディ、テトラボディ、タンデムscFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)、diFab、diFab’、タンデムScFv-Fc、scFv-Fc-scFv、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、DuobodyおよびDVDIgを含む群またはこれらからなる群から選択され、これらについて以下に詳細に考察する。
一実施形態において、本開示の多重特異性抗体分子はFcドメインを含まず、すなわちCHおよびCHドメインを含まず、例えば、該分子は、タンデムscFv、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv didsFv、ダイアボディ、dsダイアボディ、didsダイアボディ、scダイアボディ((scFv)とも呼ばれる)、dsscダイアボディ、トリアボディ、dsトリアボディ、didsトリアボディ、tridsトリアボディ、テトラボディ、dsテトラボディ、didsテトラボディ、tridsテトラボディ、tetradsテトラボディ、トリボディ、dsトリボディ、didsトリボディ、Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv、Fab単一リンカーFv(国際公開第2014/096390号パンフレットに開示)、Fab’単一リンカーFv、FabdsFv、Fab’dsFv、Fab-scFv(バイボディとも呼ばれる)、Fab’scFv、FabdsscFv、Fab’dsscFv、FabdidsscFv、Fab’didsscFv、FabscFv単一リンカーFv、Fab’scFv単一リンカーFv、FabdsscFvs単一リンカーFv、Fab’dsscFv単一リンカーFv、FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv、FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv、diFab、化学的にコンジュゲートされたdiFab’を含むdiFab’、(FabscFv)、(Fab)scFvdsFv、(Fab)dsscFvdsFv、(FabdscFv)、ミニボディ、dsミニボディ、didsミニボディ、ダイアボディ-CH、dsダイアボディ-CH、didsダイアボディ-CH、scダイアボディ-CH、dsscダイアボディ-CH、didsscダイアボディ-CH、タンデムscFv-CH、タンデムdsscFv-CH、タンデムdidsscFv-CH、タンデムtridsscFv-CHおよびタンデムtetradsscFv-CHを含む群から選択される。
一実施形態において、本開示の分子はFcドメインを含まない。
一実施形態において、本開示の分子は、以下に記載されるような改変されたFcドメインを含む。
本明細書において用いられるFcドメインは、文脈上他のことが明白に示されない限り、一般に-(CHCHを指す。
一実施形態において、本開示の分子は、-CHCH断片を含まない。
一実施形態において、本開示の分子は、CHドメインを含まない。
一実施形態において、本開示の分子はCHドメインを含まない。
本明細書において用いられる分子は、有機物の、特にタンパク質性の塊を形成する原子群を指すために生化学的な意味で使用され、この塊には、複合体が形成されたら、適切な条件下で単一の実体として取り扱うのに適している複合体、例えば、2以上のポリペプチド鎖により形成される複合体が含まれる。
分子および構築物は、文脈が他のことを示さない限り、本明細書において互換的に使用される。しかし構築物のほうがポリヌクレオチド分子を指すためにより頻繁に使用され、分子のほうが、主にアミノ酸配列を含む実体を指すためにより頻繁に使用される。
本明細書において用いられる特異性(または特異的)は、相互作用におけるパートナーが互いのみを認識するか、または、非パートナーと比較して互いに対して有意に高い親和性、例えば、結合のバックグラウンドレベルまたは他の無関係のタンパク質への結合よりも、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10倍高い親和性を有することを指す。
本明細書において用いられる「結合ドメイン」とは、例えば抗原に対して特異的であるドメインを特徴付けるのに十分な親和性で、標的抗原に結合することができる結合領域、典型的にはポリペプチドを指す。
任意の適切な結合ドメインが、本発明の多重特異性分子に使用され得る。これらは、任意の適切な供給源に由来し得る。
一実施形態において、生体適合性のフレームワーク構造が本開示の分子の結合ドメインに使用され、このような構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質の足場または骨格に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン(neocarzinostain)、チトクロームb、CP1ジンクフィンガー、PST1、コイルドコイル、LACI-D1、Zドメインおよびテンドラミサット(tendramisat)ドメインに基づくものを使用することができる(例えば、NygrenおよびUhlen、1997年、Current Opinion in Structural Biology、7、463-469頁を参照されたい)。
本明細書において使用される用語「多重特異性分子」はまた、アドネクチン(Adnectin)、アフィボディ(Affibody)、ダルピン(Darpin)、フィロマー(Phylomer)、アビマー(Avimer)、アプタマー(Aptamer)、アンチカリン(Anticalin)、テトラネクチン(Tetranectin)、微小体、アフィリン(Affilin)およびKunitzドメインを含む、生物学的足場に基づく結合剤を含み得る。本発明の多重特異性分子は、典型的には、多重特異性抗体分子であり、すなわち、多重特異性分子の少なくとも1つまたはそれ以上の結合ドメインが、抗体またはその断片に由来する。
結合ドメインが抗体に由来する場合、本明細書において用いられる「結合ドメインまたは部位」は、抗原と接触する抗体の部分である。一実施形態において、結合ドメインは、少なくとも1つの可変ドメインまたはその誘導体、例えば、可変ドメインまたはその誘導体の同族対などの可変ドメインまたはその誘導体の対を含む。通常、これはVH/VL対である。
可変領域(本明細書では可変ドメインとも呼ばれる)は、一般に、3つのCDRおよび適切なフレームワークを含む。一実施形態において、結合ドメインは、2つの可変領域、軽鎖可変領域(VL)および重鎖可変領域(VH)を含み、これらの要素が一緒になって抗体または結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
一実施形態において、本開示の抗体分子の結合ドメインにおける可変ドメインは、同族対である。
本明細書において用いられる「同族対」は、予備形成されたカップルとして宿主から単離された重鎖および軽鎖の可変ドメイン(またはそれらの誘導体、例えばこれらのヒト化型)の対を指す。この定義は、宿主由来の元の対形成が保持されないライブラリーから単離された可変ドメインを含まない。同族対は、多くの場合に宿主内で親和性成熟しており、したがってそれらが特異的である抗原に対して、ファージライブラリーなどのライブラリーから選択された可変ドメイン対の組合せより高い親和性を有することがあるので有利であり得る。
一実施形態において、本開示の抗体分子における結合ドメインは、天然に存在する結合ドメインの誘導体である。
本明細書において用いられる「天然に存在するドメインの誘導体」とは、天然に存在する配列中の1、2、3、4または5個のアミノ酸が置換または欠失されており、例えば、望ましくない特性が排除されるが、このドメインを特徴付ける(1または複数の)特性は保持されることによって、このドメインの特性が最適化された場合を指す。改変の例は、グリコシル化部位、GPIアンカーまたは溶媒に暴露されたリジンを除去するためのものである。これらの改変は、関連するアミノ酸残基を保存的アミノ酸置換で置換することによって達成することができる。
CDRの改変は、例えば、1または複数個のシステインを、例えばセリン残基で置換することを含むことができる。Asnは脱アミノ化のための基質であり得、この傾向は、Asnおよび/または隣接するアミノ酸を、保存的置換などの代替アミノ酸で置換することによって低減させることができる。CDR中のアミノ酸Aspは、異性化の対象となり得る。後者は、Aspまたは隣接するアミノ酸を、例えば保存的置換の代替アミノ酸で置換することによって最小化することができる。
可変領域のヒト化型もまた、本明細書の文脈において、これらの誘導体である。ヒト化としては、非ヒトフレームワークのヒトフレームワークへの置換、および場合により1または複数の残基の「ドナー残基」への復帰突然変異を挙げることができる。本明細書において用いられるドナー残基は、宿主から単離された元の可変領域に見られる残基、特に、ヒトフレームワークの所定のアミノ酸をドナーフレームワークの対応する位置のアミノ酸で置換する残基を指す。
一実施形態において、結合ドメインまたは個々の結合ドメインは、抗体または抗体断片の一部である(含まれているかまたは組み込まれている)。
一実施形態において、本開示の分子中の結合ドメインは、免疫グロブリン/抗体分子中にある。
本明細書において使用される場合、「抗体分子」は、抗体およびその結合断片を含む。
一実施形態において、本明細書において使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する、少なくとも1つの抗原認識部位(本明細書において結合部位または結合ドメインとも呼ばれる)を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチドなどの標的抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。
本明細書において用いられる「抗体断片」は、限定するものではないが、Fab、改変Fab、Fab’、改変Fab’、F(ab’)2、Fv、単一ドメイン抗体、scFv、Fv、二価、三価または四価抗体、Bis-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む抗体の結合断片を指す(例えば、HolligerおよびHudson、2005年、Nature Biotech.23(9):1126-1136頁;AdairおよびLawson、2005年、Drug Design Reviews-Online 2(3)、209-217頁を参照されたい)。
本明細書において用いられる「結合断片」は、断片がペプチドまたは抗原に特異的であることを特徴付けるために十分な親和性で、標的ペプチドまたは抗原に結合することができる断片を指す。
これらの抗体断片を作製し製造する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Vermaら、1998年、Journal of Immunological Methods、216:165-181頁を参照されたい)。本開示に使用するための他の抗体断片には、国際公開第05/003169号パンフレット、国際公開第05/003170号パンフレットおよび国際公開第05/003171号パンフレットに記載のFabおよびFab’断片が含まれる。多価抗体は、多重特異性を含むことができ、例えば、二重特異性であっても、または単一特異性であってもよい(例えば、国際公開第92/22853号パンフレット、国際公開第05/113605号パンフレット、国際公開第2009/040562号パンフレットおよび国際公開第2010/035012号パンフレットを参照されたい)。
本明細書において使用される「Fab断片」という用語は、V(可変軽鎖)ドメインおよび軽鎖の定常ドメイン(C)を含む軽鎖断片と、V(可変重鎖)ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン(CH)とを含む抗体断片を指す。
Fvは、2つの可変ドメイン、例えば、同族対または親和性成熟可変ドメイン、すなわちVおよびV対などの協同的可変ドメインを指す。
本明細書において用いられる協同的可変ドメインは、互いに相補的な可変ドメインおよび/または両方が、問題の抗原に特異的なFv(V/V対)を提供するために抗原結合に寄与する可変ドメインである。
以下は、本開示の抗体分子において用いることができる例示的な抗体フォーマットのリストである。
「単一ドメイン抗体」(本明細書においてdabおよびsdAbとも呼ばれる)は、本明細書において使用する場合、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。単一ドメイン抗体の例としては、VまたはVまたはVHが挙げられる。
タンデム-sdAbは、本明細書において用いる場合、リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された、特に、異なる抗原に対して特異性を有する2つのドメイン抗体を指す。
タンデム-sdAb-sdAbは、本明細書において用いる場合、2つのリンカー、例えばペプチドリンカーによって直列に連結された、特に、異なる抗原に対して特異性を有する3つのドメイン抗体を指す。
dsFvは、本明細書において用いる場合、可変内ジスルフィド結合を有するFvを指す。dsFvはより大きな分子の成分であってもよく、例えば、可変ドメインの1つは、例えばアミノ酸リンカーを介して別の抗体断片/成分に連結されていてもよい。
(dsFv)は、本明細書において用いる場合、1つのドメインが、例えば、(例えば、2つのVのC末端の間で)ペプチドリンカーまたはジスルフィド結合を介して第2のdsFvのドメインに連結されたdsFvを指し、そのフォーマットは下記の(scFv)と類似しているが、可変領域の各対は、可変領域内ジスルフィド結合を含む。
成分は、本明細書において用いる場合、本開示の多重特異性分子の基本単位または部分を指し、特に本明細書に記載のscFv、Fabまたは他の断片のような抗体断片である。
単鎖Fvまたは略して「scFv」は、本明細書において使用される場合、(例えば、ペプチドリンカーによって)連結されて単一ポリペプチド鎖を形成するVおよびV抗体ドメインを含む抗体断片を指す。重鎖および軽鎖の定常領域はこのフォーマットでは省略されている。
dsscFvは、本明細書において用いる場合、可変領域内ジスルフィド結合を有するscFvを指す。
タンデムscFv(本明細書においてdiscFvまたは(scFv)とも呼ばれる)は、本明細書において用いる場合、例えば図9bに示すように、単一のFv間リンカーが存在するように単一のリンカーを介して連結された2つのscFvを指す。
タンデムdsscFv(本明細書においてscFvdsscFvまたはdsscFvscFvとも呼ばれる)は、本明細書において用いる場合、例えば図9bに示すように、単一のFv間リンカーが存在するように単一のリンカーを介して連結され、scFvの1つが可変領域内ジスルフィド結合を有する2つのscFvを指す。
タンデムdidsscFv(本明細書ではdidsscFvとも呼ばれる)は、本明細書において用いる場合、例えば図9bに示すように、単一のFv間リンカーが存在するように単一のリンカーを介して連結され、各scFvが可変領域内ジスルフィド結合を含む2つのscFvを指す。
scFv-dsFvは、本明細書において用いる場合、dsFvを形成するようにジスルフィド結合を介して連結された2つの可変ドメインで構成されるFvドメインに、例えばペプチドリンカーによって連結されたscFvである。このフォーマットでは、scFvのVHまたはVLを、dsFvのVHまたはVLに連結することができる。
dsscFv-dsFvは、本明細書において用いる場合、dsFvを形成するようにジスルフィド結合を介して連結された2つの可変ドメインで構成されるFvドメインに、例えばペプチドリンカーによって連結されたdsscFvである。このフォーマットでは、dsscFvのVHまたはVLを、dsFvのVHまたはVLに連結することができる。
ダイアボディは、本明細書において用いる場合、第一のFvのVが第二のFvのVに連結され、第一のFvのVが第2のFvのVに連結されるように2つのFv間リンカーを有する、2つのFv対V/Vを指す。
dsダイアボディは、本明細書において用いる場合、可変領域内ジスルフィド結合を含むダイアボディを指す。
didsダイアボディは、本明細書において用いる場合、2つの可変領域内ジスルフィド結合を含む、すなわち、可変領域の各対の間に1つのdsを含むダイアボディを指す。
sc-ダイアボディは、本明細書において用いる場合、分子が3つのリンカーを含み、2つの通常のscFv、例えばVHリンカーVLリンカーVHリンカーVLを形成するように、Fv内リンカーを含むダイアボディを指す。
dssc-ダイアボディは、本明細書において用いる場合、可変領域内ジスルフィド結合を有するsc-ダイアボディを指す。
didssc-ダイアボディは、本明細書において用いる場合、可変領域の各対の間に可変領域内ジスルフィド結合を有するsc-ダイアボディを指す。
Dartは、本明細書において用いる場合、VHおよびVHのC末端がジスルフィド結合によって結合されている、VLリンカーVHリンカーおよびVHリンカーVLを指す、Paul A.Mooreら、Blood、2011年;117(17):4542-4551頁。
Bite(登録商標)は、本明細書において用いる場合、以下のフォーマットで2対の可変ドメインを含む分子を指す;対1由来のドメイン(例えばVH)が、リンカーを介して対2由来のドメイン(例えば、VHまたはVL)に連結され、前記第2のドメインが、リンカーによってさらなる対1由来のドメイン(例えばVL)に連結され、次に対2由来の残りのドメイン(すなわちVLまたはVH)に連結される。
Di-ダイアボディは、Nunez-Pradoら、特にその中の図1の分子番号25を参照されたい。
Dsdi-ダイアボディは、本明細書において用いる場合、可変領域内ジスルフィド結合を有するdi-ダイアボディである。
Didsdi-ダイアボディは、本明細書において用いる場合、可変領域の各対の間に可変領域内ジスルフィド結合を有するdi-ダイアボディである。
トリアボディは、本明細書において用いる場合、3つのFvおよび3つのFv間リンカーを含む、ダイアボディに類似のフォーマットを指す。
dsトリアボディは、本明細書において用いる場合、可変ドメイン対の1つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むトリアボディを指す。
Didsトリアボディは、本明細書において用いる場合、2つの可変領域内ジスルフィド結合を含む、すなわち2つの可変ドメイン対のそれぞれの間に1つのdsを含むトリアボディを指す。
Tridsトリアボディは、本明細書において用いる場合、3つの可変領域内ジスルフィド結合を含む、すなわち可変領域の各対の間に1つのdsを含むトリアボディを指す。
テトラボディは、本明細書において用いる場合、4つのFvおよび4つのFv間リンカーを含む、ダイアボディに類似したフォーマットを指す。
dsテトラボディは、本明細書において用いる場合、可変ドメイン対の1つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むテトラボディを指す。
Didsテトラボディは、本明細書において用いる場合、2つの可変領域内ジスルフィド結合を含む、すなわち2つの可変ドメイン対のそれぞれの間に1つのdsを含むテトラボディを指す。
Tridsテトラボディは、本明細書において用いる場合、3つの可変領域内ジスルフィド結合を含む、すなわち可変領域の3つの対のそれぞれの間に1つのdsを含むテトラボディを指す。
テトラdsテトラボディは、本明細書において用いる場合、4つの可変領域内ジスルフィド結合を含む、すなわち各可変ドメインの間に1つのdsを含むテトラボディを指す。
トリボディ(Fab(scFv)とも呼ばれる)は、本明細書において用いる場合、第1のscFvが軽鎖のC末端に付加され、第2のscFvが重鎖のC末端に付加されたFab断片を指す。
dsトリボディは、本明細書において用いる場合、2つの位置のうちの1つにdsscFvを含むトリボディを指す。
didsトリボディまたはTrYbeは、本明細書において用いる場合、2つのdsscFvを含むトリボディを指す。
dsFabは、本明細書において用いる場合、可変領域内ジスルフィド結合を有するFabを指す。
dsFab’は、本明細書において用いる場合、可変領域内ジスルフィド結合を有するFab’を指す。
scFabは、一本鎖Fab断片である。
scFab’は、一本鎖Fab’断片である。
dsscFabは、一本鎖のdsFabである。
dsscFab’は、一本鎖のdsFab’である。
Fabdabは、本明細書において用いる場合、ドメイン抗体が、場合によりリンカーを介してその重鎖または軽鎖に付加されたFab断片を指す。
Fab’dabは、本明細書において用いる場合、ドメイン抗体が、場合によりリンカーを介してその重鎖または軽鎖に付加されたFab’断片を指す。
FabFvは、本明細書において用いる場合、追加の可変領域が、重鎖のCH1および軽鎖のCLのそれぞれのC末端に付加されたFab断片を指し、例えば国際公開第2009/040562号パンフレットを参照されたい。このフォーマットは、そのPEG化型として提供されてもよく、例えば国際公開第2011/061492号パンフレットを参照されたい。
Fab’Fvは、本明細書において用いる場合、Fab部分がFab’に置換された、FabFvに類似したものである。このフォーマットは、そのPEG化型として提供されてもよい。
FabdsFvは、本明細書において用いる場合、Fv内ジスルフィド結合が、付加されたC末端可変領域を安定化させているFabFvを指し、例えば国際公開第2010/035012号パンフレットを参照されたい。このフォーマットは、そのPEG化型として提供されてもよい。
Fab単一リンカーFvおよびFab’単一リンカーは、本明細書において用いる場合、例えばペプチドリンカーによって可変ドメインに連結されたFabまたはFab’断片を指し、前記可変ドメインは、可変ドメイン内ジスルフィド結合を介して第2の可変ドメインに連結され、それによってdsFvを形成する(例えば、国際公開第2014/096390号パンフレットを参照されたい)。
Fab-scFv(バイボディとも呼ばれる)は、本明細書において用いる場合、scFvが、場合によりリンカーを介して、軽鎖または重鎖のC末端に付加されたFab分子である。
Fab’-scFvは、本明細書において用いる場合、scFvが、場合によりリンカーを介して、軽鎖または重鎖のC末端に付加されたFab’分子である。
FabdsscFvまたはBYbeは、本明細書において用いる場合、一本鎖Fvの可変領域間にジスルフィド結合を有するFab-scFvである。
Fab’dsscFvは、本明細書において用いる場合、一本鎖Fvの可変領域間にジスルフィド結合を有するFab’scFvである。
FabscFv-dabは、本明細書において用いる場合、scFvが一方の鎖のC末端に付加され、ドメイン抗体が他方の鎖のC末端に付加されたFabを指す。
Fab’scFv-dabは、本明細書において用いる場合、scFvが一方の鎖のC末端に付加され、ドメイン抗体が他方の鎖のC末端に付加されたFab’を指す。
FabdsscFv-dabは、本明細書において用いる場合、dsscFvが一方の鎖のC末端に付加され、ドメイン抗体が他方の鎖のC末端に付加されたFabを指す。
Fab’dsscFv-dabは、本明細書において用いる場合、dsscFvが一方の鎖のC末端に付加され、ドメイン抗体が他方の鎖のC末端に付加されたFab’を指す。
FabscFv単一リンカーFvは、本明細書において用いる場合、FvのドメインがFabの重鎖または軽鎖に連結され、scFvが他のFab鎖に連結され、Fvのドメインが可変領域内ジスルフィドにより連結されたFab単一リンカーFvを指す。
FabdsscFv単一リンカーFvは、本明細書において用いる場合、scFvが可変領域内ジスルフィド結合を含むFabscFv単一リンカーFvを指す。
Fab’scFv単一リンカーFvは、本明細書において用いる場合、FvのドメインがFabの重鎖または軽鎖に連結され、scFvが他のFab鎖に連結され、Fvのドメインが、可変領域内ジスルフィドによって連結されているFab’単一リンカーFvを指す。
Fab’dsscFv単一リンカーFvは、本明細書において用いる場合、scFvが、可変領域内ジスルフィド結合を含むFab’scFv単一リンカーFvを指す。
FvFabFvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFabの重鎖および軽鎖のN末端に付加され、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加されたFabを指す。
FvFab’Fvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFab’の重鎖および軽鎖のN末端に付加され、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加されたFab’を指す。
dsFvFabFvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFabの重鎖および軽鎖のN末端に付加され、前記第1のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加されたFabを指す。
FvFabdsFvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFabの重鎖および軽鎖のN末端に付加され、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加され、前記第2のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含むFabを指す。
dsFvFab’Fvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFab’の重鎖および軽鎖のN末端に付加され、前記第1のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加されたFab’を指す。
FvFab’dsFvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインが重鎖および軽鎖のN末端に付加され、第2のFvのドメインがFab’の重鎖および軽鎖のC末端に付加され、前記第2のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含むFab’を指す。
dsFvFabdsFvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFabの重鎖および軽鎖のN末端に付加され、前記第1のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加され、前記第2のFvもまた可変領域内ジスルフィド結合を含むFabを指す。
dsFvFab’dsFvは、本明細書において用いる場合、第1のFvのドメインがFab’の重鎖および軽鎖のN末端に付加され、前記第1のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第2のFvのドメインが重鎖および軽鎖のC末端に付加され、前記第2のFvもまた可変領域内ジスルフィド結合を含むFab’を指す。
FabFvFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加されたFab断片を指し、例えば、国際公開第2011/086091号パンフレットを参照されたい。
Fab’FvFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加されたFab’断片を指し、例えば、国際公開第2011/086091号パンフレットを参照されたい。
FabdsFvFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加され、C末端に直接結合した第1のFv対が可変領域内ジスルフィド結合を含むFab断片を指し、例えば国際公開第2011/086091号パンフレットを参照されたい。
Fab’dsFvFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加され、C末端に直接結合した第1のFv対が可変領域内ジスルフィド結合を含むFab’断片を指し、例えば国際公開第2011/086091号パンフレットを参照されたい。
FabFvdsFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加され、分子の「C」末端の第2のFv対が可変領域内ジスルフィド結合を含むFab断片を指す。
Fab’FvdsFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加され、分子の「C」末端の第2のFv対が可変領域内ジスルフィド結合を含むFab’断片を指す。
FabdsFvdsFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加され、第1および第2のFv対が可変領域内ジスルフィド結合を含むFab断片を指す。
Fab’dsFvdsFvは、本明細書において用いる場合、2対のFvが重鎖および軽鎖のC末端に直列に付加され、第1および第2のFvが可変領域内ジスルフィド結合を含むFab’断片を指す。
DiFabは、本明細書において用いる場合、重鎖のC末端を介して連結された2つのFab分子を指す。
DiFab’は、本明細書において用いる場合、ヒンジ領域内の1または複数のジスルフィド結合を介して連結された2つのFab’分子を指す。
DiFabおよびDiFab’分子は、それらの化学的にコンジュゲートされた形態を含む。
(FabscFv)は、本明細書において用いる場合、2つのscFvが付加されている、例えば、重鎖または軽鎖、例えば重鎖のC末端に付加されているdiFab分子を指す。
(Fab’scFv)は、本明細書において用いる場合、2つのscFvが付加されている、例えば、重鎖または軽鎖、例えば重鎖のC末端に付加されているdiFab’分子を指す。
(Fab)scFvdsFvは、本明細書において用いる場合、scFvおよびdsFvが、例えばそれぞれの重鎖C末端から1つ付加されたdiFabを指す。
(Fab’)scFvdsFvは、本明細書において用いる場合、scFvおよびdsFvが、例えばそれぞれの重鎖C末端から1つ付加されたdiFab’を指す。
(Fab)dsscFvdsFvは、本明細書において用いる場合、dsscFvおよびdsFvが、例えば重鎖C末端から付加されたdiFabを指す。
(Fab’)dsscFvdsFvは、本明細書において用いる場合、dsscFvおよびdsFvが、例えば重鎖C末端から付加されたdiFab’を指す。
ミニボディは、本明細書において用いる場合、(VL/VH-CHを指す。
dsミニボディは、本明細書において用いる場合、1つのVL/VHが、可変領域内ジスルフィド結合を含む(VL/VH-CHを指す。
didsミニボディは、本明細書において用いる場合、(dsFv-CHを指す。
「カッパ/ラムダ体」または「κ/λ体」は、2つの軽鎖が互いに異なり、一方はラムダ軽鎖(VL-CL)であり、他方はがカッパ軽鎖(VK-CK)である、2つの重鎖および2つの軽鎖を有する、正常なIgGのフォーマットである。重鎖は、国際公開第2012/023053号パンフレットに記載のCDRにおいても同一である。
scFv-Fcは、本明細書において用いる場合、分子が2つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して、定常領域断片-(CHCH)のCHドメインのN末端に付加されたscFvを指す。
dsscFv-Fcは、本明細書において用いる場合、分子が2つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して、定常領域断片-(CHCHのCHドメインのN末端に付加されたdsscFvと第2のCHドメインのN末端に付加されたscFvとを指す。
didsscFv-Fcは、本明細書において用いる場合、分子が2つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して、定常領域断片-(CHCHのCHドメインのN末端に付加されたscFvを指す。
タンデムscFv-Fcは、本明細書において用いる場合、分子が4つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して、定常領域断片-(CHCH)のCHドメインのN末端にそれぞれが直列に付加された2つのタンデムscFvを指す。
scダイアボディ-Fcは、本明細書において用いる場合、それぞれが、例えばヒンジを介して、定常領域断片-CHCHのCHドメインのN末端に付加された2つのscダイアボディである。
ScFv-Fc-scFvは、本明細書において用いる場合、それぞれのうちの1つが-CHCH断片の重鎖および軽鎖の両方のN末端およびC末端に付加された4つのscFvを指す。
scダイアボディ-CHは、本明細書において用いる場合、それぞれが、例えばヒンジを介してCHドメインに連結された2つのscダイアボディ分子を指す。
IgG-scFvは、本明細書において用いる場合、各重鎖または各軽鎖のC末端にscFvを有する完全長抗体である。
scFv-IgGは、本明細書において用いる場合、各重鎖または各軽鎖のN末端にscFvを有する完全長抗体である。
V-IgGは、本明細書において用いる場合、各重鎖または各軽鎖のN末端に可変ドメインを有する完全長抗体である。
IgG-Vは、本明細書において用いる場合、各重鎖または各軽鎖のC末端に可変ドメインを有する完全長抗体である。
DVD-Ig(二重VドメインIgGとしても知られている)は、各重鎖および各軽鎖のN末端に1つずつ、4つの追加の可変ドメインを有する全長抗体である。
Duobodyまたは「Fab-アーム交換」は、本明細書において用いる場合、2つの異なるモノクローナル抗体の定常ドメイン(典型的にはCH3)において適合し、相補的に操作されたアミノ酸変化が、混合の際にヘテロ二量体の形成を導く二重特異性IgGフォーマット抗体である。第1の抗体からの重鎖:軽鎖の対は、残基の工学の結果として、第2の抗体の重鎖:軽鎖の対と会合するほうを好む。例えば、国際公開第2008/119353号パンフレット、国際公開第2011/131746号パンフレットおよび国際公開第2013/060867号パンフレットを参照されたい。
一実施形態において、本開示による抗体分子は、式A-X:Y-B
(式中、
A-Xは第1の融合タンパク質であり;
Y-Bは第2の融合タンパク質であり;
X:Yはヘテロ二量体テザーであり;
:は、XとYとの間の結合相互作用であり;
Aは、FabまたはFab’断片から選択される二重特異性の第1のタンパク質成分であり;
Bは、FabまたはFab’から選択される二重特異性の第2タンパク質成分であり;
Xは、抗原または抗体もしくはその結合断片から独立して選択される、結合対の第1の結合パートナーであり;
Yは、抗原または抗体もしくはその結合断片から独立して選択される、結合対の第2の結合パートナーであり;
但し、Xが抗原である場合、YはXで表される抗原に特異的な抗体またはその結合断片であり、Yが抗原である場合、XはYで表される抗原に特異的な抗体またはその結合断片である)
を有する二重特異性タンパク質複合体である。
一態様において、
a)式(I)のポリペプチド鎖:
-CH-X-(V
b)式(II)のポリペプチド鎖:
-C-Y-(V
(式中、
は、重鎖可変ドメインを表し;
CHは、重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを表し;
Yは、結合またはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを表し;
は、dab、scFv、dsscFvまたはdsFvを表し;
は、可変ドメイン、例えば軽鎖可変ドメインを表し;
は、定常領域由来のドメイン、例えば軽鎖定常領域ドメイン、例えばCカッパを表し;
は、dab、scFv、dsscFvまたはdsFvを表し;
pは、0または1であり;
qは、0または1であり;
pが1である場合、qは0または1であり、qが1である場合、pは0または1であり、すなわちpおよびqが両方とも0を表すことはない)
を含むか、またはこれらからなる多重特異性抗体分子が提供される。
このフォーマットは、国際公開第2015/19772号パンフレットに以前に記載されている。
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、VH/VL、V1またはV2から選択される、CD79に対する1以下の結合ドメインを含む。
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、CD45に対する1以下の結合ドメインを含み、CD79に対する1以下の結合ドメインを含む。
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、CD22に対する1以下の結合ドメインを含み、CD79に対する1以下の結合ドメインを含む。
一実施形態において、qが0であり、pが1である。
一実施形態において、qが1であり、pが1である。
一実施形態において、Vはdabであり、Vはdabであり、これらは一緒になって、場合によりジスルフィド結合により連結された可変領域の協同的な対、例えば同族VH/VL対の単一結合ドメインを形成する。
一実施形態において、VおよびVはCD79、例えばCD79aまたはCD79bに特異的である。
一実施形態において、Vは、CD79、例えばCD79aまたはCD79bに特異的である。
一実施形態において、VはCD79、例えばCD79aまたはCD79bに特異的である。
一実施形態において、VおよびVは一緒になって(例えば、結合ドメインとして)、CD79、例えばCD79aまたはCD79bに特異的であり、VおよびVはCD45またはCD22に特異的である。
一実施形態において、VはCD45またはCD22に特異的である。
一実施形態において、VはCD45またはCD22に特異的である。
一実施形態において、VおよびVは一緒になって(例えば、1つの結合ドメインとして)、CD45またはCD22に特異的であり、VおよびVはCD79に特異的である。
一実施形態において、VはCD45またはCD22に特異的であり、Vはアルブミンに特異的であり、VおよびVはCD79に特異的である。
一実施形態において、Vはアルブミンに特異的であり、VはCD45に特異的であり、VおよびVはCD79に特異的である。
一実施形態において、VはCD79に特異的であり、Vはアルブミンに特異的であり、VおよびVはCD45またはCD22に特異的である。
一実施形態において、Vはアルブミンに特異的であり、VはCD79に特異的であり、VおよびVはCD45またはCD22に特異的である。
一実施形態において、VはCD45またはCD22に特異的なdsscFvであり、Vはアルブミンに特異的なdsscFvであり、VおよびVはCD79に特異的である。
一実施形態において、Vはアルブミンに特異的なdsscFvであり、VはCD45またはCD22に特異的なdscFvであり、VおよびVはCD79に特異的である。
一実施形態において、VはCD79に特異的なdsscFvであり、Vはアルブミンに特異的なdsscFvであり、VおよびVはCD45またはCD22に特異的である。
一実施形態において、Vはアルブミンに特異的なdsscFvであり、VはCD79に特異的なdsscFvであり、VおよびVはCD45またはCD22に特異的である。
上記の構築物中のV1、V2、VHおよびVLは、それぞれ結合ドメインを表し、本明細書で提供される配列のいずれかを組み込むことができる。
XおよびYは、任意の適切なリンカーを表し、例えば、XおよびYは、独立して、SGGGGSGGGGS(配列番号339)またはSGGGGTGGGGS(配列番号340)であり得る。
一実施形態において、Vおよび/またはVがdab、dsFvまたはdsscFvである場合、Vおよび/またはVの可変ドメインVおよびV間のジスルフィド結合は、V44位およびV100位の間に形成される。
多重特異性抗体分子中の可変領域の1または複数の対がVHとVLとの間のジスルフィド結合を含む場合、これは、任意の適切な位置、例えば以下に列挙される2つの残基の間にあり得る(文脈が特に他のことを示さない限り、下記のリストにはKabatのナンバリングが用いられる)。Kabatのナンバリングを参照する場合、関連する参考文献はKabatら、1987年、Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Department of Health and Human Services、NIH、USAである。
一実施形態において、ジスルフィド結合は、下記を含む群から選択される位置にある:
・V37+V95C 例えば、Protein Science 6、781-788頁、Zhuら(1997年)を参照されたい;
・V44+V100 例えば、Biochemistry 33 5451-5459頁、Reiterら、(1994年);またはJournal of Biological Chemistry 269巻、28、18327-18331頁、Reiterら(1994年);またはProtein Engineering、10巻12、1453-1459頁、Rajagopalら(1997年)を参照されたい;
・V44+V105 例えばJ Biochem.118、825-831頁、Luoら(1995年)を参照されたい;
・V45+V87 例えば、Protein Science 6、781-788頁、Zhuら(1997年)を参照されたい;
・V55+V101 例えばFEBS Letters 377 135-139頁、Youngら(1995年)を参照されたい;
・V100+V50 例えばBiochemistry 29 1362-1367頁、Glockshuberら(1990年)を参照されたい;
・V100b+V49;
・V98+V46 例えば、Protein Science 6、781-788頁、Zhuら(1997年)を参照されたい;
・V101+V46;
・V105+V43 例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90巻、7538-7542頁、Brinkmannら(1993年);またはProteins 19、35-47頁、Jungら(1994)年を参照されたい
・V106+V57 例えば、FEBS Letters 377 135-139頁、Youngら(1995年)を参照されたい
ならびに分子内に位置する可変領域の対の対応する位置。
一実施形態において、ジスルフィド結合は、V44位とV100位の間に形成される。
本明細書において用いられる「単一特異性」は、標的抗原に一度だけ結合する能力を指す。
したがって、一実施形態において、本発明の多重特異性分子は、各抗原に対して単一特異性である。
したがって、一実施形態において、本開示による多重特異性分子の結合ドメインは単一特異性である。これは、本開示の分子が標的抗原に2回以上結合することによって抗原を架橋することができないので、いくつかの治療用途において有利である。したがって、一実施形態において、本開示の二重特異性または多重特異性分子は、例えば同じ細胞または2つの異なる細胞の2つの異なる位置において同じ標的に2回結合することによって架橋することができない。
特に、同じ細胞または異なる細胞上のCD79bに関連する架橋は、例えば標的抗原の活性を刺激するシグナルをインビボで生成することができる。
一実施例において、本発明の多重特異性分子は、CD22に対する1以下の結合ドメインを含み、CD79に対する1以下の結合ドメインを含む。各結合ドメインは単一特異性である。
したがって、一実施例において、多重特異性分子は、CD22に対して1価であり、CD79に対して1価である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子は、CD45に対する1以下の結合ドメインを含み、CD79に対する1以下の結合ドメインを含む。各結合ドメインは単一特異性である。
したがって、一実施例において、多重特異性分子は、CD45に対して1価であり、CD79に対して1価である。
一実施形態において、本開示の多重特異性分子に用いられる各抗体または抗体断片は一価である。
したがって、一実施形態において、本開示の多重特異性分子の結合ドメインは一価である。
したがって、一実施形態において、本開示の多重特異性分子の結合ドメインは一価であり、単一特異性である。
一実施形態において、本開示の多重特異性分子は、例えば本明細書に上記のような、多重特異性分子を構築する任意の適切な方法で組み合わされた、または連結された、Fab、Fab’、scFv、VH、VL、VHH、Fv、dsFvなどの2以上の単一特異性の一価結合ドメインで構成される。
別の実施形態において、例えば、本開示の分子が少なくとも3つの結合ドメインを含む場合、2つまたは3つの結合ドメイン(例えば抗体、断片または抗体と断片との組合せ)は、異なる抗原特異性を有し、例えば3つの異なる標的抗原に結合する。
したがって、本発明は、以下の項目に記載の多重特異性分子も提供する
1.抗原CD22に特異的な結合ドメイン、ならびに抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインを含み、抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインが、CDRH1については配列番号8、CDRH2については配列番号9、およびCDRH3については配列番号4で示される配列を有する3つの重鎖CDRを含む多重特異性分子。
2.抗原CD22に特異的な結合ドメイン、ならびに抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインを含み、抗原CD79bに特異的な結合ドメインが、CDRH1については配列番号11、CDRH2については配列番号12、およびCDRH3については配列番号3で示される配列を有する3つの重鎖CDRを含む多重特異性分子。
3.CD79bに特異的な結合ドメインが、CDRL1については配列番号13、CDRL2については配列番号14、およびCDRL3については配列番号15、16、17または18で示される配列を有する3つの軽鎖CDRを含む、項目1に記載の多重特異性分子。
4.CD79bに特異的な結合ドメインが、CDRL1については配列番号19、CDRL2については配列番号20、およびCDRL3については配列番号21、22、23または24で示される配列を有する3つの軽鎖CDRを含む、項目2に記載の多重特異性分子。
5.1または複数の結合ドメインが、関連抗原に特異的な抗体可変領域を含む、項目1から4のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
6.各結合ドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、項目1から5のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
7.2つの抗体可変ドメインがVH/VL対である、項目6に記載の多重特異性分子。
8.分子が二重特異性または三重特異性である、項目1から7のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
9.分子が融合タンパク質である、項目1から8のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
10.分子フォーマットが、ダイアボディ、scダイアボディ、トリアボディ、タンデムscFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv) diFab、diFab’、トリボディ、タンデムscFv-Fc、scFv-Fc-scFv、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、DuobodyおよびDVD-Igから選択される、項目1から9のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
11.各結合ドメインが単一特異性である、項目1から10のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
12.CD22に特異的な1以下の結合ドメイン、ならびにCD79aおよび/またはCD79bに特異的な1以下の結合ドメインを含む、項目1から11のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
13.CD22に特異的な結合ドメイン、ならびにCD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインが、Fab、scFv、Fv、dsFvおよびdsscFvから独立して選択される、項目1から12のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
14.CD22に特異的な結合ドメインが、本明細書において提供される抗CD22抗体に由来する3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRを含む、項目1から13のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
15.結合ドメインがヒト化されている、項目1から14のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
16.1または複数のCDR中の1または複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、項目1から15のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
17.1または複数のシステイン残基が別のアミノ酸で置換されている、項目16に記載の多重特異性分子。
18.1または複数のアスパラギン酸異性化部位および/またはアスパラギン脱アミド部位および/またはグリコシル化部位が、1つまたは複数のCDR中の1または複数のアミノ酸を置換することによって除去されている、項目16または17に記載の多重特異性分子。
19.ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに特異的な結合ドメインをさらに含む、項目1から18のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
20.項目1から19のいずれか1つにおいて定義される1または複数の多重特異性タンパク質を含む組成物。
21.項目1から21のいずれか1つにおいて定義される多重特異性タンパク質またはその成分をコードするヌクレオチド配列。
22.項目21において定義されるヌクレオチド配列を含むベクター。
23.治療に使用するための、項目1から22のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質または項目20に記載の組成物。
24.治療、特に本明細書に記載の状態または障害の治療に使用する医薬品の製造のための、項目1から19のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質または項目20に記載の組成物の使用。
25.項目1から19のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質または項目20に記載の組成物の治療有効量の投与を含む、患者を治療する方法。
したがって、本発明は、以下の項目に記載の多重特異性分子も提供する
26.抗原CD45に特異的な結合ドメイン、ならびに抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインを含み、抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインが、CDRH1については配列番号8、CDRH2については配列番号9、およびCDRH3については配列番号4で示される配列を有する3つの重鎖CDRを含む多重特異性分子。
27.抗原CD45に特異的な結合ドメイン、ならびに抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインを含み、抗原CD79bに特異的な結合ドメインが、CDRH1については配列番号11、CDRH2については配列番号12、およびCDRH3については配列番号3で示される配列を有する3つの重鎖CDRを含む多重特異性分子。
28.CD79bに特異的な結合ドメインが、CDRL1については配列番号13、CDRL2については配列番号14、およびCDRL3については配列番号15、16、17または18で示される配列を有する3つの軽鎖CDRを含む、項目1に記載の多重特異性分子。
29.CD79bに特異的な結合ドメインが、CDRL1については配列番号19、CDRL2については配列番号20、およびCDRL3については配列番号21、22、23または24で示される配列を有する3つの軽鎖CDRを含む、項目2に記載の多重特異性分子。
30.1または複数の結合ドメインが、関連抗原に特異的な抗体可変領域を含む、項目26から29のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
31.各結合ドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、項目26から30のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
32.2つの抗体可変ドメインがVH/VL対である、項目31に記載の多重特異性分子。
33.分子が二重特異性または三重特異性である、項目26から32のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
34.分子が融合タンパク質である、項目26から33のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
35.分子フォーマットが、ダイアボディ、scダイアボディ、トリアボディ、タンデムscFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv) diFab、diFab’、トリボディ、タンデムscFv-Fc、scFv-Fc-scFv、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、DuobodyおよびDVD-Igから選択される、項目26から34のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
36.各結合ドメインが単一特異性である、項目26から35のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
37.CD45に特異的な1以下の結合ドメインならびにCD79aおよび/またはCD79bに特異的な1以下の結合ドメインを含む、項目26から36のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
38.CD45に特異的な結合ドメイン、ならびにCD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインが、Fab、scFv、Fv、dsFvおよびdsscFvから独立して選択される、項目26から37のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
39.CD45に特異的な結合ドメインが、本明細書において提供される抗CD45抗体に由来する3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRを含む、項目26から38のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
40.結合ドメインがヒト化されている、項目26から39のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
41.1または複数のCDR中の1または複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、項目26から40のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
42.1または複数のシステイン残基が別のアミノ酸で置換されている、項目41に記載の多重特異性分子。
43.1または複数のアスパラギン酸異性化部位および/またはアスパラギン脱アミド部位および/またはグリコシル化部位が、1つまたは複数のCDR中の1または複数のアミノ酸を置換することによって除去されている、項目41または42に記載の多重特異性分子。
44.ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに特異的な結合ドメインをさらに含む、項目26から43のいずれか1つに記載の多重特異性分子。
45.項目26から44のいずれか1つにおいて定義される1または複数の多重特異性タンパク質を含む組成物。
46.項目26から45のいずれか1つにおいて定義される多重特異性タンパク質またはその成分をコードするヌクレオチド配列。
47.項目46において定義されるヌクレオチド配列を含むベクター。
48.治療に使用するための、項目26から44のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質または項目45に記載の組成物。
49.治療、特に本明細書に記載の状態または障害の治療に使用する医薬品の製造のための、項目36から44のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質または項目45に記載の組成物の使用。
50.項目26から44のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質または項目45に記載の組成物の治療有効量の投与を含む、患者を治療する方法。
定常領域
本開示の抗体分子の抗体定常領域ドメインは、例えば完全長抗体または多重特異性分子中に存在する場合、抗体分子の指定された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMドメインであり得る。特に、抗体分子が治療用途に意図され、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特にIgG1およびIgG3アイソタイプのヒトIgG定常領域ドメインを使用することができる。または、抗体分子が治療目的で意図され、抗体エフェクター機能が必要でない場合、IgG2およびIgG4アイソタイプを使用することができる。
これらの定常領域ドメインの配列変異体もまた使用できることが理解されるであろう。例えば、Angalら、1993年、Molecular Immunology、1993、30:105-108頁に記載されているように、241位のセリンがプロリンに変化したIgG4分子を使用することができる。したがって、抗体がIgG4抗体である実施形態において、抗体は変異S241Pを含み得る。
一実施形態において、抗体重鎖はCHドメインを含み、抗体軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかのCLドメインを含む。
一実施形態において、抗体重鎖は、CHドメイン、CHドメインおよびCHドメインを含み、抗体軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかのCLドメインを含む。
4つのヒトIgGアイソタイプは、活性化Fcγ受容体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、阻害性FcγRIIb受容体および補体の第1成分(C1q)に異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能を生じる(Bruhns P.ら、2009年。Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses.Blood.113(16):3716-25頁)、さらにJeffrey B.Stavenhagenら、Cancer Research 2007年9月15日;67(18):8882-90頁も参照されたい。
IgGのFcγRまたはC1qへの結合は、ヒンジ領域およびCHドメインに位置する残基に依存する。CHドメインの2つの領域は、FcγRおよびC1qの結合に重要であり、IgG2およびIgG4に特有の配列を有する。233~236位のIgG2残基および327、330および331位のIgG4残基のヒトIgG1への置換は、ADCCおよびCDCを大きく減少させることが示されている(Armour KL.ら、1999年、Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities.Eur J Immunol.29(8):2613-24頁、ならびにShields RL.ら、2001年、High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI,Fc gamma RII,Fc gamma RIII,and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R.J Biol Chem.276(9):6591-604頁)。さらに、Idusogieらは、K322を含む異なる位置でのアラニン置換が補体活性化を有意に低下させることを実証した(Idusogie EE.ら、2000年、Mapping of the C1q binding site on rituxan,a chimeric antibody with a human IgG1 Fc、J Immunol.164(8):4178-84頁)。同様に、マウスIgG2AのCHドメインにおける変異は、FcγRIおよびC1qへの結合を減少させることが示された(Steurer W.ら、1995年、Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance、J Immunol.155(3):1165-74頁)。
一実施形態において、用いられるFc領域は変異、特に本明細書に記載の変異をしている。一実施形態において、変異は、結合および/またはエフェクター機能を除去することである。
一実施形態において、Fc変異は、Fc領域の結合を除去するための変異、エフェクター機能を増加または除去する変異、半減期を増加させる変異およびこれらの組合せを含む群から選択される。
pH6.0ではFcRnに選択的に結合するがpH7.4では結合しないいくつかの抗体は、さまざまな動物モデルにおいてより長い半減期を示す。CHとCHドメインとの間の接点に位置するいくつかの変異、例えばT250Q/M428L(Hinton PR.ら、2004年、Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates。J Biol Chem.279(8):6213-6頁)、ならびにM252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro C.ら、2005年、Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels。Nat Biotechnol.23(10):1283-8頁)は、インビボでのFcRnへの結合親和性およびIgG1の半減期を増加させることが示されている。
しかし、FcRn結合の増加と半減期の改善との間に直接の関係は必ずしも存在しない(Datta-Mannan A.ら、2007年、Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor:Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates。Drug Metab.Dispos.35:86-94頁)。
IgG4サブクラスはFc受容体(FcγRIIIa)結合の減少を示し、他のIgGサブクラスの抗体は一般に強い結合を示す。これらの他のIgGサブタイプにおける受容体結合の低下は、Pro238、Aps265、Asp270、Asn270(Fc炭水化物の喪失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435を含む群から選択される1以上のアミノ酸の改変、例えば置換によって達成することができる。
一実施形態において、本開示による分子は、IgGサブクラス、例えばIgG1、IgG2またはIgG3の、以下のS228、L234および/またはD265位の1つ、2つ、またはすべてにおいて変異を有するFcを有する。
一実施形態において、Fc領域の変異は、S228P、L234A、L235A、L235A、L235Eおよびこれらの組合せから独立して選択される。
Fc領域のエフェクター機能を低減または増加させることが望ましい場合がある。細胞表面分子、特に免疫細胞上の細胞表面分子を標的とする抗体は、エフェクター機能を無効にすることが必要である。いくつかの実施形態において、例えば、自己免疫の治療のために、負のFc受容体結合(FcgRIIbまたはCD32b)を増加させることによって免疫細胞上のFc結合が増強されることが望ましいと思われ、Stavenhagen JBら、Advances in Enzyme Regulation 2007 December 3 and Veri MCら、Arthritis Rheum、2010 Mar 30;62(7):1933-43を参照されたい。反対に、腫瘍学的使用を意図した抗体では、エフェクター機能の増加は治療活性を改善し得る。
多数の変異がヒトIgG1のCHドメインに生じており、インビトロで試験したADCCおよびCDCに対するそれらの効果が報告されている(Idusogie EE.ら、2001年。Engineered antibodies with increased activity to recruit complement.J Immunol.166(4):2571-5頁)。注目すべきことに、333位のアラニン置換は、ADCCおよびCDCの両方を増加させることが報告されている。Lazarらは、FcγRIIIaに対して高い親和性を有し、FcγRIIbに対して低い親和性を有し、ADCCの増強をもたらす三重変異体(S239D/I332E/A330L)を記載した(Lazar GA.ら、2006年。Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function。PNAS 103(11):4005-4010頁)。同じ変異を使用して、ADCCが増加した抗体を作製した(Ryan MC.ら、2007年。Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells。Mol.Cancer Ther.、6:3009-3018頁)。Richardsらは、FcγRIIIa親和性およびマクロファージによる標的細胞の食作用の増強を媒介するFcγRIIa/FcγRIIb比を改善する、わずかに異なる三重変異体(S239D/I332E/G236A)を研究した(Richards JOら、2008年。Optimization of antibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells。Mol Cancer Ther.7(8):2517-27頁)。
エフェクター機能の欠如のために、IgG4抗体は、細胞枯渇をせずに受容体のブロッキングに適したIgGサブクラスを表す。IgG4分子は、Fabアーム交換と呼ばれる動的プロセスで半分子を交換することができる。この現象は、治療抗体と内因性IgG4との間で起こり得る。S228P変異は、あまり予測できない治療用IgG4抗体の設計を可能にするこの組換えプロセスを妨げることが示されている(Labrijn AF.ら、2009年。Therapeutic IgG4 antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo。Nat Biotechnol.27(8):767-71頁)。この技術を用いて、二重特異性抗体分子を作製することができる。
当業者には、抗体がさまざまな翻訳後修飾を受け得ることも理解されるであろう。これらの修飾のタイプおよび程度は、多くの場合、抗体を発現するために使用される宿主細胞系ならびに培養条件に依存する。このような修飾としては、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン脱アミド化の変異を挙げることができる。頻繁な改変は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基(リジンまたはアルギニンなど)の喪失である(Harris、RJ.Journal of Chromatography 705:129-134頁、1995年に記載されている)。したがって、抗体重鎖のC末端リジンは存在しなくてもよい。
親和性
本発明は、抗CD79抗体分子を提供する。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる結合ドメインは、CD79aに特異的である。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる結合ドメインは、CD79bに特異的である。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる結合ドメインは、CD79複合体に特異的であり、すなわち、複合体中に存在するエピトープ、例えばCD79aとCD79bとの間の相互作用を含むエピトープを認識し、それに対して特異的である。
CD79a(免疫グロブリンαおよびB細胞抗原受容体複合体会合タンパク質アルファ鎖としても知られている)は、公知のタンパク質である。CD79aの発現は、Bリンパ球に限定される。ヒト配列はUniProtのエントリーP11912(配列番号245およびシグナル配列を含まない配列番号245のアミノ酸33-226)で入手可能である。マウス型はUniProtのエントリー11911で入手可能である。本開示は、任意の種、特にヒトおよびその任意の天然変異体に由来するCD79aのすべての形態に関する。一実施形態において、CD79aは、このタンパク質のヒト形態を指す。
CD79b(免疫グロブリン会合ベータおよび分化抗原クラスター(cluster differentiation)79Bとしても知られている)は、公知のタンパク質である。CD79bの発現は、Bリンパ球に限定される。ヒト配列はUniProtのエントリーP40259(配列番号298およびシグナル配列を含まない配列番号298のアミノ酸29-229)で入手可能である。マウス型はUniProtのエントリーP15530で入手可能である。本開示は、任意の種、特にヒトおよびその任意の天然変異体に由来するCD79bのすべての形態に関する。一実施形態において、CD79bは、このタンパク質のヒト形態を指す。
一実施形態において、CD79に特異的な結合ドメインはCD79aに結合する。
一実施形態において、CD79に特異的な結合ドメインはCD79bに結合する。
一実施形態において、CD79に特異的な結合ドメインは、CD79aおよびCD79bの複合体に結合する。
一実施形態において、本開示の分子におけるCD79に対する結合ドメインの親和性は、約100nM以上の強さであり、例えば、約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pMまたはそれ以上、特に、50pM以上の強さの結合親和性である。
一実施形態において、本開示の分子におけるCD79aに対する結合ドメインの親和性は、約100nM以上の強さであり、例えば、約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pMまたはそれ以上、特に、50pM以上の強さの結合親和性である。
一実施形態において、本開示の分子におけるCD79bに対する結合ドメインの親和性は、約100nM以上の強さであり、例えば、約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pMまたはそれ以上、特に、50pM以上の強さの結合親和性である。
本発明の多重特異性分子は、抗原CD22に特異的な結合ドメイン、ならびに抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインを含むことができる。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる結合ドメインは、CD22に特異的である。
CD22(分化クラスター-22としても知られている)は、公知のタンパク質である。CD22は、B細胞受容体(BCR)の阻害性共受容体であり、B細胞活性化のシグナル伝達閾値を確立する上で重要な役割を果たす。ヒト配列はUniProtエントリー番号P20273(配列番号244およびシグナルペプチドを含まない、配列番号244のアミノ酸20-847)で利用可能である。マウス型はUniProtエントリーP35329である。本開示は、任意の種、特にヒトおよびその天然変異体に由来するCD22のすべての形態に関する。一実施形態において、CD22は、このタンパク質のヒト形態を指す。
一実施形態において、本開示の分子におけるCD22に対する結合ドメインの親和性は、約100nM以上の強さであり、例えば、約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pMまたはそれ以上、特に、50pM以上の強さの結合親和性である。
CD79に対する結合ドメインは、CD79aおよび/またはCD79bに結合することができる。
CD22に対する結合ドメインの親和性は、CD79に対する結合ドメインの親和性と同じであっても、または異なっていてもよいことが理解されよう。
一実施形態において、本開示の分子に用いられる結合ドメインは、CD45に特異的である。
CD45(PTPRCとしても公知)は、公知のタンパク質である。CD45は、プロテインチロシンホスファターゼ(PTP)ファミリーのメンバーである。PTPは、細胞増殖、分化、有糸分裂周期および発癌性形質転換を含むさまざまな細胞過程を調節するシグナル伝達分子であることが知られている。このPTPは、細胞外ドメイン、単一の膜貫通セグメントおよび2つのタンデム細胞質内触媒ドメインを含み、したがって受容体型PTPに属する。CD45のさまざまなアイソフォーム:CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)が存在する。CD45RAはナイーブT細胞上に位置し、CD45ROはメモリーT細胞上に位置する。CD45スプライス変異型アイソフォームA、BおよびCは、ヒトB細胞上で差次的に発現される。CD45は、プロテインチロシンホスファターゼ(PTP)ファミリーのメンバーであり、その細胞内(COOH-末端)領域は2つのPTP触媒ドメインを含み、細胞外領域はエキソン4,5および6(それぞれ、A、B、およびCと呼ばれる)の選択的スプライシングおよび異なるレベルのグリコシル化のために非常に可変である。検出されたCD45アイソフォームは、細胞型、成熟、および活性化状態に特異的である。一般に、タンパク質の長い形態(A、BまたはC)はナイーブまたは不活性化B細胞上で発現され、成熟または切断型のCD45(RO)は活性化または成熟/メモリーB細胞上で発現される。
ヒト配列はUniProtエントリー番号P08575で利用可能であり、配列番号10またはシグナルペプチドを欠いた配列番号10のアミノ酸24-1304で本明細書に提供されている。マウス型はUniProtエントリーP06800である。本開示は、任意の種由来のCD45のすべての型に関する。一実施形態において、CD45は、タンパク質のヒト型、およびその天然の変異体およびアイソフォームを指す。
一実施形態において、本開示の分子におけるCD45に対する結合ドメインの親和性は、約100nM以上の強さであり、例えば、約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pMまたはそれ以上、特に、50pM以上の強さの結合親和性である。
一実施形態において、本開示の多重特異性抗体分子またはその抗体/断片成分は、1または複数の標的抗原に対する親和性の改善を提供するように処理される。このような変異体は、CDRを変異させること(Yangら、J.Mol.Biol.、254、392-403頁、1995年)、鎖シャッフリング(Marksら、Bio/Technology、10、779-783頁、1992年)、大腸菌のミューテーター株の使用(Lowら、J.Mol.Biol.、250、359-368頁、1996年)、DNAシャッフリング(Pattenら、Curr.Opin.Biotechnol.、8、724-733頁、1997年)、ファージディスプレイ(Thompsonら、J.Mol.Biol.、256、77-88頁、1996年)および性的PCR(Crameriら、Nature、391、288-291頁、1998年)を含む、多数の親和性成熟プロトコルにより得ることができる。Vaughanら(前出)は、これらの親和性成熟方法を論じている。
抗体およびこれらの作製
本発明に使用するための結合ドメインは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって作製することができ、例えばCDRを市販の抗体を含む非ヒト抗体から採取して、ヒトフレームワークに移植することができ、またはキメラ抗体を非ヒト可変領域およびヒト定常領域などを用いて調製することができる。
典型的には、本発明に使用するための結合ドメインは、選択された抗原に結合する抗体、例えば、CD22、CD45、またはCD79aおよび/またはCD79bに結合する抗体に由来する結合ドメインである。
CD22、CD45およびCD79抗体の例は当技術分野で公知であり、これらを本明細書に記載の方法を使用して本発明の分子に直接用いるか、または適合性についてスクリーニングし、次いで、必要に応じて、本明細書に記載の方法を使用して改変、例えばヒト化する。臨床講義におけるCD22抗体の例には、エプラツズマブおよびイノツズマブが含まれる。他の治療用抗体、例えば、米国特許出願第2003202975号明細書および国際公開第14/011520号パンフレットに開示されている抗CD22抗体、国際公開第14011521号パンフレットおよび国際公開第15021089号パンフレットに開示されている抗CD79b抗体が、当技術分野で記載されている。非ヒト抗CD22抗体としては、クローンSP104由来のウサギモノクローナル抗体LS-C2210357(LSBio)、クローン4C3由来のマウスモノクローナルLS-C174778、マウスモノクローナルLS-C4802、クローン1B1由来のマウスモノクローナルLS-B9996、クローン2E6由来のマウスモノクローナルLS-C340404、マウスモノクローナルLS-C312263、マウスモノクローナルLS-C152867、マウスモノクローナルLS-C87523、クローンFRB4由来のマウスモノクローナルLS-C134333、マウスモノクローナルLS-C134336、クローンHIB22由来のマウスモノクローナルLS-C40961、マウスモノクローナルLS-C134332、Santa Cruz Biotechnology社製の以下の抗体、sc-271579、sc-377304、sc-7032、sc-18909、sc-7932、sc-7323、sc-7307、sc-7031、sc-20053、sc-189000、sc-136440、sc-136507、sc-53031、sc-73363、sc-53032、AbcamウサギモノクローナルAb33859(EP498Y)、マウスモノクローナル抗体AA1-687、カタログ番号ABIN1999423、Biolegend社製クローンHIB22由来のマウスモノクローナル、ワークショップ番号V CD22.14.が挙げられる。
市販の抗CD79a抗体としては、クローンHM57由来のマウスモノクローナルLS-B4504(LSBio)、マウスモノクローナルLS-B8330、マウスモノクローナルLS-C44954、ウサギモノクローナルLS-B9093、クローンJCB117由来のマウスモノクローナルLS-B8513、クローンSP18由来のウサギモノクローナルLS-C210607、クローン5E2由来のマウスモノクローナルLS-C175441、クローン3D3由来のマウスモノクローナルLS-C338670、クローンHM47/A9由来のマウスモノクローナルLS-C88120、マウスモノクローナルLS-C191714、マウスモノクローナルLS-C87592、マウスモノクローナルLS-C44955、マウスモノクローナルLS-C95934、マウスモノクローナルLS-C121584、マウスモノクローナルLS-C121585、マウスモノクローナルLS-C204347、マウスモノクローナルLS-C88122、Abcamマウスモノクローナルab3121[HM47/A9]、ウサギモノクローナルab79414、およびウサギモノクローナルab133483が挙げられる。
市販のCD79b抗体としては、マウスモノクローナルAbcam抗体ab33295、ラットモノクローナルab23826、マウスモノクローナルab103422、ウサギモノクローナルab134103、ウサギモノクローナルab134147およびウサギモノクローナルab183343が挙げられる。
CD45抗体の例としては、ラットモノクローナルYTH54、YTH25.4、Miltenyiクローン5B1およびクローン30F11由来のマウスモノクローナル、ラットモノクローナルYAML568、BD Bioscience社製マウスモノクローナル クローン2D1カタログ番号347460、Novus社製マウス モノクローナル抗体5D3A3 カタログ番号NBP2-37293、マウス モノクローナル HI30 カタログ番号NBP1-79127、マウス モノクローナル 4A8A4C7A2 カタログ番号NBP1-47428、マウス モノクローナル 2B11 カタログ番号NBP2-32934、ラット モノクローナル YTH24.5 カタログ番号NB100-63828、ウサギ モノクローナル Y321 カタログ番号NB110-55701、マウス モノクローナル PD7/26/16 カタログ番号NB120-875、Santa Cruz社製 クローン B8由来のマウス モノクローナルカタログ番号sc-28369、クローンF10-89-4由来のマウスモノクローナルカタログ番号sc-52490、クローン H-230由来のウサギ モノクローナルカタログ番号sc-25590、クローン N-19由来のヤギモノクローナルカタログ番号sc-1123、クローン OX1由来のマウス モノクローナルカタログ番号sc-53045、ラットモノクローナル(T29/33)カタログ番号sc-18901、ラット モノクローナル(YAML 501.4)カタログ番号sc65344、ラット モノクローナル(YTH80.103)カタログ番号sc-59071、マウス モノクローナル(351C5)カタログ番号sc-53201、マウス モノクローナル(35-Z6)カタログ番号sc-1178、マウス モノクローナル(158-4D3)カタログ番号sc-52386、CD45ROに対するマウス モノクローナル(UCH-L1)カタログ番号sc-1183、CD45ROに対するマウスモノクローナル(2Q1392)カタログ番号sc-70712が挙げられる。
CD45抗体は、国際公開第2005/026210号パンフレット、国際公開第02/072832号パンフレットおよび国際公開第2003/048327号パンフレットにも開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
このような市販の抗体は、さらなる治療抗体の発見において有用なツールであり得る。
当業者は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、本発明の多重特異性分子に使用するための抗体を作製することができる。
例えば宿主を免疫化するために、またはファージディスプレイのようなパンニングに使用する抗体を作製するために使用する抗原ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野で周知の方法によって調製することができ、または天然の生物源から回収されてもよい。本出願において、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。これらは、他のことが指定されない限り互換的に使用される。抗原ポリペプチドは、いくつかの例では、例えば親和性タグなどに融合された融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。一実施形態において、宿主は、関連するタンパク質またはポリペプチドでトランスフェクトされた、線維芽細胞などの細胞、例えばCD79aおよびCD79bで同時トランスフェクトされた細胞で免疫化することができる。
抗原ポリペプチドに対して作製された抗体は、動物の免疫化が必要な場合、周知の慣習的なプロトコルを使用して動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することにより得ることができる(例えば、Handbook of Experimental Immunology、D.M.Weir(編)、第4巻、Blackwell Scientific Publishers、Oxford、England、1986年を参照されたい)。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタのような多くの温血動物を免疫化することができる。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタおよびラットが一般に最も適している。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術(Kohler&Milstein、1975年、Nature、256:495-497頁)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983、Immunology Today、4:72)およびEBV-ハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、77-96頁、Alan R Liss、Inc.、1985年)などの当技術分野において公知の任意の方法によって調製することができる。
抗体は、特異的抗体作製のために選択された単一のリンパ球から産生された免疫グロブリン可変領域cDNAをクローニングおよび発現させることによって、単一のリンパ球抗体法を使用して、例えば、Babcook,J.ら、1996年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l頁;国際公開第92/02551号パンフレット;国際公開第2004/051268号パンフレットおよび国際公開第2004/106377号パンフレットにより記載された方法により作製することもできる。
本開示における使用のための抗体はまた、当技術分野で公知のさまざまなファージディスプレイ法を用いて作製することができ、Brinkmanら、(J.Immunol.Methods、1995年、182:41-50頁)、Amesら、(J.Immunol.Methods、1995年、184:177-186頁)、Kettleboroughら、(Eur.J.Immunol.1994年、24:952-958頁)、Persicら、(Gene、1997年、187 9-18頁)、Burtonら、(Advances in Immunology、1994年、57:191-280頁)および国際公開第90/02809号;国際公開第91/10737号;国際公開第92/01047号;国際公開第92/18619号;国際公開第93/11236号;国際公開第95/15982号;国際公開第95/20401号パンフレット;および米国特許第5,698,426号;第5,223,409号;第5,403,484号;5,580,717号;第5,427,908号;第5,750,753号;第5,821,047号;第5,571,698号;第5,427,908号;5,516,637号;第5,780,225号;第5,658,727号;第5,733,743号;第5,969,108号明細書および国際公開第20011/30305号パンフレットにより開示された方法が挙げられる。
一実施例において、本開示の多重特異性分子は完全にヒト型であり、特に可変ドメインの1または複数は完全にヒト型である。
完全なヒト分子は、重鎖および軽鎖の両方の可変領域および定常領域(存在する場合)がすべてヒト起源であるか、またはヒト起源の配列と実質的に同一であり、必ずしも同じ抗体由来ではない。完全ヒト抗体の例としては、例えば、上記のファージディスプレイ法によって産生された抗体、およびマウス免疫グロブリン可変領域および場合により定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置換されたマウスによって産生された抗体、例えば、欧州特許第0546073号、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,770,429号、欧州特許第0438474号および欧州特許第0463151号に一般用語で記載された抗体を挙げることができる。
一実施例において、本開示による多重特異性分子の結合ドメインがヒト化される。
本明細書において用いられるヒト化(CDR移植抗体を含む)とは、非ヒト種由来の1または複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する分子を指す(例えば、米国特許第5,585,089号明細書;国際公開第91/09967号パンフレットを参照されたい)。CDR全体ではなくCDRの特異性決定残基を移入することだけが必要なことが理解されるであろう(例えば、Kashmiriら、2005年、Methods、36、25-34頁を参照されたい)。ヒト化抗体は、場合により、CDRが由来する非ヒト種に由来する1または複数のフレームワーク残基をさらに含んでいてもよい。
本明細書において使用される場合、用語「ヒト化抗体分子」は、重鎖および/または軽鎖が、アクセプター抗体(例えば、ヒト抗体)の重鎖および/または軽鎖可変領域フレームワークに移植された、ドナー抗体(例えば、マウスまたはウサギモノクローナル抗体)由来の1または複数のCDR(必要に応じて1または複数の改変CDRを含む)を含む抗体分子を指す。総説については、Vaughanら、Nature Biotechnology、16、535-539頁、1998年を参照されたい。一実施形態において、全CDRが移されるのではなく、本明細書に上記のCDRのいずれか1つに由来する特異性決定残基の1または複数だけがヒト抗体フレームワークに移入される(例えば、Kashmiriら、2005年、Methods、36、25-34頁を参照されたい)。一実施形態において、本明細書に上記のCDRの1または複数に由来する特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移入される。別の実施形態において、本明細書に上記のCDRそれぞれに由来する特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移入される。
CDRまたは特異性決定残基が移植される場合、CDRが由来するドナー抗体のクラス/タイプ(マウス、霊長類およびヒトフレームワーク領域を含む)を考慮して、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を用いることができる。適切には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域ならびに本明細書で提供される1または複数のCDRを含む可変ドメインを有する。
本開示に使用可能なヒトフレームワークの例は、KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAYおよびPOMである(Kabatら、前出)。例えば、KOLおよびNEWMは重鎖に使用でき、REIは軽鎖に使用でき、EU、LAYおよびPOMは重鎖および軽鎖の両方に使用することができる。または、ヒト生殖系列配列を使用してもよく、これらはhttp://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.phpで入手可能である。
本開示のヒト化抗体分子において、アクセプター重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望であれば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでいてもよい。
フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと全く同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプのより頻繁に生じる残基に変化させることができる。または、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基は、それらがドナー抗体中の同じ位置で見出される残基に対応するように変化させることができる(Reichmannら、1998年、Nature、332、323-324頁を参照のこと)。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に保たれるべきである。変化させる必要のあるアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコルは、国際公開第91/09967号パンフレットに記載されている。
フレームワークの誘導体は1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸が、代替アミノ酸、例えばドナー残基で置換されていてもよい。
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわちCDRが元々由来する抗体由来の残基であり、特にドナー配列由来の対応する位置の残基が採用される。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワークに由来する適切な残基(アクセプター残基)によって置換されてもよい。
抗体可変ドメイン中の残基は、Kabatらによって考案されたシステムに従って通常どおりナンバリングされている。このシステムは、Kabatら、1987年、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健社会福祉省(US Department of Health and Human Services)、NIH、米国(以下、「Kabatら(前出)」)に記載されている。特に他のことが記載されている場合を除いて、本明細書ではこのナンバリングシステムが使用される。
Kabatの残基指定は、必ずしもアミノ酸残基の線形なナンバリングと直接対応するとは限らない。実際の線形アミノ酸配列は、フレームワークまたは相補性決定領域(CDR)であろうとなかろうと、基本可変ドメイン構造の構造成分の短縮または挿入に対応する厳密なKabatナンバリングよりも少数または追加のアミノ酸を含むことがある。抗体の配列に相同な残基と、「標準的な」Kabatナンバリング配列とのアラインメントにより、所定の抗体について残基の正しいKabatナンバリングを決定することができる。
重鎖可変ドメインのCDRは、Kabatナンバリングシステムに従って残基31~35(CDR-H1)、残基50~65(CDR-H2)および残基95~102(CDR-H3)に位置する。しかし、Chothia(Chothia、C.およびLesk、A.M.(J.Mol.Biol.、196、901-917頁(1987年))によれば、CDR-H1に相当するループは残基26から残基32に及ぶ。したがって、特に明記しない限り、本明細書において用いられる「CDR-H1」は、KabatナンバリングシステムとChothiaの位相的ループ定義との組合せによって記載される残基26~35を指すものとする。
軽鎖可変ドメインのCDRは、Kabatナンバリングシステムに従って残基24~34(CDR-L1)、残基50~56(CDR-L2)および残基89~97(CDR-L3)に位置する。
一実施例において、CDR H1が配列番号11に示される配列を有し、CDR H2が配列番号12に示される配列を有し、CDR H3が配列番号3に示される配列を有する3つのCDRを含む、CD79に特異的な重鎖可変領域(例えばVH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号8、CDRH2については配列番号9およびCDRH3については配列番号4を含む、CD79に特異的な重鎖可変領域(例えばVH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号19、CDRL2については配列番号20およびCDRL3については配列番号21を含む、CD79に特異的な軽鎖可変領域(例えばVL)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号13、CDRL2については配列番号14およびCDRL3については配列番号15を含む、CD79に特異的な軽鎖可変領域(例えばVL)を含む結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号11に示される配列を有するCDR H1、配列番号12に示される配列を有するCDR H2、および配列番号3に示される配列を有するCDR H3を含むCD79に特異的な重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号19に示される配列を有するCDR L1、配列番号20に示される配列を有するCDR L2、および配列番号21、22、23または24に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号11に示される配列を有するCDR H1、配列番号12に示される配列を有するCDR H2、および配列番号3に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号19に示される配列を有するCDR L1、配列番号20に示される配列を有するCDR L2、および配列番号21に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD79に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、配列番号11、12、3、19、20および21に示されるCDRを含む1または複数の結合ドメインを含む抗CD79抗体またはその断片が提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号8に示される配列を有するCDR H1、配列番号9に示される配列を有するCDR H2、および配列番号4に示される配列を有するCDR H3を含むCD79に特異的な重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号13に示される配列を有するCDR L1、配列番号14に示される配列を有するCDR L2、および配列番号15に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、結合ドメインが提供される。
一実施例において、配列番号8、9、4、13、14および15に示されるCDRを含む1または複数の結合ドメインを含む抗CD79抗体またはその断片が提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号8に示される配列を有するCDR H1、配列番号9に示される配列を有するCDR H2、および配列番号4に示される配列を有するCDR H3を含むCD79に特異的な重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号13に示される配列を有するCDR L1、配列番号14に示される配列を有するCDR L2、および配列番号15、16、17または18に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、結合ドメインが提供される。
一実施形態において、本開示による抗体分子はヒト化され、本明細書に記載のCDRまたはその変異体を組み込む。
一実施形態において、本開示の抗体分子に用いられる重鎖可変領域ヒトフレームワークは、IGHV3-48、IGHV4-59、IGHV3-66、およびこれらのいずれか1つの変異体を含む群から選択され、この変異体では1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸で置換され、例えば元のドナー抗体の対応する位置の残基、例えば配列番号31、または38に提供されるドナーVH配列に由来する残基で置換される。典型的には、ヒトフレームワークは、JH4またはJH2 J領域などの適切なJ領域配列をさらに含む。
一実施形態において、(特に、本明細書において上記の重鎖抗CD79 CDRとの使用のための)VHフレームワークにおける置換は、24、37、48、49、67、71、73および78から選択される1または複数の位置、例えば1、2、3、4、5、6、7または8つの位置において行われ(例えば、少なくとも73および78位における置換)、例えば、24、48、49、73および78位のすべて(特にIGHV3-66に適している)、または24、48、49、71、73および78位のすべて(特にIGHV3-48に適している)、または37、49、67、71、73、76および78位のすべて、または37、67、71、73、76および78位のすべて(特にIGHV4-59に適している)において置換が行われる。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの24位はバリンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの37位はバリンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの48位はイソロイシンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの49位はグリシンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの67位はフェニルアラニンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの71位はリジンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの71位はアルギニンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの73位はセリンである。
一実施形態において、置換後のVHフレームワークの78位はバリンである。
これらの置換の1または複数を組み合わせて、本発明の抗体分子に使用するためのヒト化VH領域を作製可能であることが理解されよう。
一実施形態において、ヒト化VH可変ドメインは、配列番号34、35、41および42から独立して選択される配列を含む。
一実施形態において、VHの残基1をグルタミン酸に変えて、配列のプロセシングを容易にする。
一実施形態において、本開示のヒト化抗体分子に用いられる軽鎖可変領域ヒトフレームワークは、IGKV1-6、IGKV1D-13およびこれらのいずれか1つの変異体を含む群から選択され、この変異体では、1、2、3、4、5または6個のアミノ酸が、システイン以外のアミノ酸で置換され、例えば元のドナー抗体の対応する位置の、例えば配列番号29または36で提供されたドナーVL配列由来のドナー残基で置換されている。典型的には、ヒトフレームワークは、JK4 J領域などの適切なJ領域をさらに含む。
一実施形態において、本開示の抗体分子に(例えば、軽鎖抗CD 79CDRを受容するために)用いられるヒトVLフレームワークは、2、3、36、46、49および70位を含む群から選択される少なくとも1つの位置、例えば1、2、3、4、5または6の位置に置換されたアミノ酸を含み、例えばフレームワーク中の元のアミノ酸がシステイン以外の別のアミノ酸で置換され、特に、ドナー抗体のフレームワーク中の対応する位置の残基で置換されている。
一実施形態において、用いられるヒトVLフレームワークはIGKV1フレームワークであり、少なくとも3位および70位に置換を有する。
一実施形態において、用いられるヒトVLフレームワーク(IGKV1フレームワークなど)は、2、3、36、46、49および70位(特に、IGKV1D-13に適している)または3および70位(特にIGKV1-6に適している)に置換を有する。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの2位はグルタミンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの3位はバリンまたはアスパラギン酸である。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの36位はロイシンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの46位はグルタミンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの49位はヒスチジンである。
一実施形態において、置換後のVLフレームワークの70位はグルタミンである。
これらの置換の1または複数を組み合わせて、本発明の抗体に使用するためのヒト化VL領域を作製可能であることが理解されよう。
一実施形態において、ヒト化VL可変ドメインは、配列番号33または40から独立して選択される配列を含む。
一実施形態において、ヒト化VL可変ドメインは、配列番号33、40、341、342および343から独立して選択される配列を含む。
一実施形態において、配列番号34および35から独立して選択されるVH、ならびに配列番号33に示される配列を有するVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号34および35から独立して選択されるVH、ならびに配列番号250に示される配列を有するVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号41および42から独立して選択されるVH、ならびに配列番号40に示される配列を有するVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号41および42から独立して選択されるVH、ならびに配列番号40、341、342および343から独立して選択されるVLを含む抗体分子が提供される。
これらのヒト化移植可変領域(配列番号41、42、40、341、342および343)は、ドナー残基の数を減少させ、これらを元の(1つまたは複数の)ヒト残基と置換するようにさらに改変され得ることが理解されよう。
したがって、一実施例において、3位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または70位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されている、配列番号40、341、342および343から独立して選択されるVLを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、24位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または48位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されているか、および/または49位の残基がセリン(S)によって置換されているか、および/または73位の残基がアスパラギン(N)によって置換されているか、および/または78位の残基がロイシン(L)によって置換されている、配列番号41に示される配列を含むVHを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、37位の残基がイソロイシン(I)によって置換されているか、および/または67位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または71位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または73位の残基がスレオニン(T)によって置換されているか、および/または78位の残基がフェニルアラニン(F)によって置換されている、配列番号42に示される配列を含むVHを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、24位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または48位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されているか、および/または49位の残基がセリン(S)によって置換されているか、および/または73位の残基がアスパラギン(N)によって置換されているか、および/または78位の残基がロイシン(L)によって置換されている、配列番号41に示される配列を含むVH、ならびに配列番号40、341、342および343の配列から独立して選択される配列、または3位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または70位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されている、配列番号40、341、342および343から独立して選択される配列を含むVLを含む抗体分子が提供される。
一実施例において、37位の残基がイソロイシン(I)によって置換されているか、および/または67位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または71位の残基がバリン(V)によって置換されているか、および/または73位の残基がスレオニン(T)によって置換されているか、および/または78位の残基がフェニルアラニン(F)によって置換されている、配列番号42に示される配列を含むVH、ならびに配列番号40、341、342および343の配列から独立して選択される配列、または3位の残基がグルタミン(Q)によって置換されているか、および/または70位の残基がアスパラギン酸(D)によって置換されている、配列番号40、341、342および343から独立して選択される配列を含むVLを含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、本発明は、本明細書において上記のCD79結合ドメインおよび本明細書の以下に記載される結合ドメインまたはその変異体などのCD22結合ドメインを含む多重特異性分子を提供する。
一実施形態において、本開示による多重特異性分子は、配列番号43、44、45、46、47、60、61、62、63、64、65、72、73、74、75、76、101、102、103、104、105、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、136、137、138、139、140、141、142、143および144を含む群から選択される3つの重鎖CDRを含む、CD22に特異的な結合ドメインを含む。
一実施形態において、本開示による多重特異性分子は、配列番号48、49、50、66、67、68、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、106、107、108、126、127、128、145、146および147を含む群から選択される3つの軽鎖CDRを含む、CD22に特異的な結合ドメインを含む。
一実施形態において、本開示による多重特異性分子は、配列番号43、44、45、46、47、60、61、62、63、64、65、72、73、74、75、76、101、102、103、104、105、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、136、137、138、139、140、141、142、143および144を含む群から選択される3つの重鎖CDR、ならびに配列番号48、49、50、66、67、68、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、106、107、108、126、127、128、145、146および147を含む群から選択される3つの軽鎖CDRを含む、CD22に特異的な結合ドメインを含む。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号43または44、CDRH2については配列番号45または46およびCDRH3については配列番号47を含む、CD22に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号60または61、CDRH2については配列番号62または63およびCDRH3については配列番号64または65を含む、CD22に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号72または73、CDRH2については配列番号74または75およびCDRH3については配列番号76を含む、CD22に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号101または102、CDRH2については配列番号103または104およびCDRH3については配列番号105を含む、CD22に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号116、CDRH2については配列番号117、118、119、120、121または122およびCDRH3については配列番号123、124または125を含む、CD22に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号136または137、CDRH2については配列番号138、139、140、141、142および143ならびにCDRH3については配列番号144を含む、CD22に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号48、CDRL2については配列番号49およびCDRL3については配列番号50を含む、CD22に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号66、CDRL2については配列番号67およびCDRL3については配列番号68を含む、CD22に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号77、CDRL2については配列番号78およびCDRL3については配列番号79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93または94を含む、CD22に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号106、CDRL2については配列番号107およびCDRL3については配列番号108を含む、CD22に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号126、CDRL2については配列番号127およびCDRL3については配列番号128を含む、CD22に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号145、CDRL2については配列番号146およびCDRL3については配列番号147を含む、CD22に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号43または44に示される配列を有するCDR H1、配列番号45または46に示される配列を有するCDR H2、および配列番号47に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号48に示される配列を有するCDR L1、配列番号49に示される配列を有するCDR L2、および配列番号50に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD22に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号60または61に示される配列を有するCDR H1、配列番号62または63に示される配列を有するCDR H2、および配列番号64または65に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号66に示される配列を有するCDR L1、配列番号67に示される配列を有するCDR L2、および配列番号68に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD22に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号72または73に示される配列を有するCDR H1、配列番号74または75に示される配列を有するCDR H2、および配列番号76に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号77に示される配列を有するCDR L1、配列番号78に示される配列を有するCDR L2、および配列番号79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93または94に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD22に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号101または102に示される配列を有するCDR H1、配列番号103または104に示される配列を有するCDR H2、および配列番号105に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号106に示される配列を有するCDR L1、配列番号107に示される配列を有するCDR L2、および配列番号108に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD22に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号116に示される配列を有するCDR H1、配列番号117、118、119、120、121または122に示される配列を有するCDR H2、および配列番号123、124または125に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号126に示される配列を有するCDR L1、配列番号127に示される配列を有するCDR L2、および配列番号128に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD22に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号136または137に示される配列を有するCDR H1、配列番号138、139、140、141、142または143に示される配列を有するCDR H2、および配列番号144に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号145に示される配列を有するCDR L1、配列番号146に示される配列を有するCDR L2、および配列番号147に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD22に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施形態において、本発明は、本明細書において上記のCD79結合ドメインおよびCD45結合ドメイン、例えば本明細書の以下に記載される結合ドメインを含む多重特異性分子を提供する。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号155または156、CDRH2については配列番号157、158、159、160、161、162、163または164およびCDRH3については配列番号165を含む、CD45に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号178または179、CDRH2については配列番号180または181およびCDRH3については配列番号182を含む、CD45に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号195、CDRH2については配列番号196または197およびCDRH3については配列番号198を含む、CD45に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの重鎖CDR、CDRH1については配列番号212または213、CDRH2については配列番号214または215およびCDRH3については配列番号216、217、218または219を含む、CD45に特異的な重鎖可変領域(VH)を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号166、CDRL2については配列番号167およびCDRL3については配列番号168、169または170を含む、CD45に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号183、CDRL2については配列番号184およびCDRL3については配列番号185、186または187を含む、CD45に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号199、CDRL2については配列番号200およびCDRL3については配列番号201、202、203または204を含む、CD45に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施形態において、3つの軽鎖CDR、CDRL1については配列番号220、221、222または223、CDRL2については配列番号224およびCDRL3については配列番号225を含む、CD45に特異的な軽鎖可変領域を含む結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号155または156に示される配列を有するCDR H1、配列番号157、158、159、160、161、162、163または164に示される配列を有するCDR H2、および配列番号165に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号166に示される配列を有するCDR L1、配列番号167に示される配列を有するCDR L2、および配列番号168、169または170に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD45に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号178または179に示される配列を有するCDR H1、配列番号180または181に示される配列を有するCDR H2、および配列番号182に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号183に示される配列を有するCDR L1、配列番号184に示される配列を有するCDR L2、および配列番号185、186または187に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD45に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号195に示される配列を有するCDR H1、配列番号196または197に示される配列を有するCDR H2、および配列番号198に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号199に示される配列を有するCDR L1、配列番号200に示される配列を有するCDR L2、および配列番号201、202、203または204に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD45に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施例において、3つのCDR、配列番号212または213に示される配列を有するCDR H1、配列番号214または215に示される配列を有するCDR H2、および配列番号216、217、218または219に示される配列を有するCDR H3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに、3つのCDR、配列番号220、221、222または223に示される配列を有するCDR L1、配列番号224に示される配列を有するCDR L2、および配列番号225に示される配列を有するCDR L3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、CD45に特異的な結合ドメインが提供される。
一実施形態において、配列番号33および34、33および35、250および34、250および35、40および41、ならびに40および42から選択される、CD79bに特異的なVLおよびVH対を含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号341および41、341および42、342および41、342および42、343および41、ならびに343および42から選択されるCD79bに特異的なVLおよびVH対を含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号55および56、55および246、55および247、55および248、69および70、69および71、69および251、69および252、69および253、69および254、98および99、98および100、98および255、98および256、113および114、113および115、113および257、113および258、133および134、133および135、133および259、133および260、152および153、152および154、152および261、ならびに152および262から選択される、CD22に特異的なVLおよびVH対を含む抗体分子が提供される。
一実施形態において、配列番号175および176、175および177、175および263、175および264、192および193、192および194、192および265、192および266、209および211、209および267、209および268、209および269、210および211、210および267、210および268、210および269、230および232、230および270、230および271、230および272、231および232、231および270、231および271、ならびに231および272から選択される、CD45に特異的なVLおよびVH対を含む抗体分子が提供される。
一実施例において、本発明は、抗原CD79に特異的な結合ドメインおよび抗原CD22に特異的な結合ドメインを含む多重特異性分子を提供し、この結合ドメイン対はCD79抗体由来の6つのCDRおよびCD22抗体由来の6つのCDRを含み、前記抗体対は以下のCD79およびCD22抗体の対のリスト;4447および4120、4447および4126、4447および4127、4447および4128、4447および4130、4447および4132、4450および4120、4450および4126、4450および4127、4450および4128、4450および4130、ならびに4450および4132、から選択される。
一実施例において、本発明は、抗原CD79に特異的な結合ドメインおよび抗原CD45に特異的な結合ドメインを含む多重特異性分子を提供し、この結合ドメイン対はCD79抗体由来の6つのCDRおよびCD45抗体由来の6つのCDRを含み、前記抗体対は以下のCD79およびCD45抗体の対のリスト;4447および4122、4447および4129、4447および4131、4447および4133、4450および4122、4450および4129、4450および4131、ならびに4450および4133、から選択される。
VH、VLおよびCDR配列を含むこれらのCD79抗体(抗体4447および抗体4450)の配列は、本明細書および図51に提供される。VH、VLおよびCDR配列を含むこれらのCD22抗体(抗体4120、4126、4127、4128、4130、4132)の配列は、本明細書に提供され、本発明の分子中の結合ドメインとして組み合わせることができる。VH、VLおよびCDR配列を含むこれらのCD45抗体(抗体4122、4129、4131および4133)の配列は、本明細書に提供され、本発明の分子中の結合ドメインとして組み合わせることができる。
一実施形態において、本明細書に開示される配列を有する、可変ドメインまたは一対の可変ドメインを含む結合ドメインが提供される。
一実施例において、配列番号240に示される配列を有する重鎖可変領域(VH)および配列番号242に示される配列を有する軽鎖可変領域(VL)を含む、アルブミンに特異的な結合ドメインが提供される。
一実施形態において、1または複数の結合ドメインがヒト化される。
一実施例において、本明細書に提供される1または複数のCDRは、望ましくない残基または部位、例えばシステイン残基またはアスパラギン酸(D)異性化部位またはアスパラギン(N)脱アミド部位を除去するように改変することができる。
例えば、CDRのいずれか1つの中の1または複数のシステイン残基を、セリンなどの別のアミノ酸で置換することができる。
一実施例において、アスパラギン脱アミド部位は、アスパラギン残基(N)および/または隣接残基を任意の他の適切なアミノ酸に変異させることによって、1または複数のCDRから除去することができる。一実施例において、NGまたはNSなどのアスパラギン脱アミド部位を、例えばNAまたはNTに変異させることができる。
一実施例において、アスパラギン酸異性化部位は、アスパラギン酸残基(D)および/または隣接残基を任意の他の適切なアミノ酸に変異させることによって、1または複数のCDRから除去することができる。一実施例において、DGまたはDSなどのアスパラギン酸異性化部位を、例えばEG、DAまたはDTに変異させることができる。
一実施例において、NLSのようなN-グリコシル化部位は、アスパラギン残基(N)を任意の他の適切なアミノ酸、例えばSLSまたはQLSに変異させることによって除去することができる。一実施例において、NLSのようなN-グリコシル化部位は、セリン残基(S)を、スレオニン(T)を除く任意の他の残基に変異させることによって除去することができる。
当業者は、活性が維持されていることを確認するために、本明細書に記載されているような任意の適切なアッセイでCDRまたはヒト化配列の変異体を試験することができる。
抗原への特異的結合は、例えばELISAまたは抗原(CD22またはCD79)への結合を測定することができるBIAcoreなどの表面プラズモン共鳴法を含む任意の適切なアッセイを使用して試験することができる。このようなアッセイは、単離された天然もしくは組換えのCD22もしくはCD79(aおよび/またはb)または適切な融合タンパク質/ポリペプチドを使用することができる。一実施例において、結合は、組換えCD22(配列番号244または配列番号244のアミノ酸20~847に提供される配列など)またはCD79(配列番号245および配列番号298(CD79b)、ならびに配列番号245のアミノ酸33~226および配列番号298のアミノ酸29~229に提供される配列など)またはCD45(本明細書において配列番号10、またはシグナルペプチドを欠いている配列番号10のアミノ酸24~1304に提供される配列)を使用して、例えば、BIAcoreなどの表面プラズモン共鳴により測定される。または、タンパク質をHEK細胞などの細胞上で発現させ、フローサイトメトリーに基づく親和性決定を用いて親和性を測定することができる。
本発明によって提供される抗体配列は、本発明の多重特異性分子などの本発明の抗体分子への使用に適したさらなる抗体、したがって結合ドメインを同定するために使用することができる。本発明による抗体分子の特にCD79への結合を交差ブロックする抗体、配列番号38、41もしくは42に示される重鎖配列および配列番号36もしくは40に示される軽鎖配列を含む抗体分子、または配列番号31、34もしくは35に示される重鎖配列および配列番号29もしくは33に示される軽鎖配列を含む抗体分子は、CD79への結合に同様に有用であり得、したがって、例えば本発明の多重特異性分子に同様に有用な抗体であり得る。したがって、本発明はまた、抗原CD79bに特異的な結合ドメインを含み、CD79bに対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD79に対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックする、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD79に結合することから交差ブロックされ、場合により抗原CD22またはCD45に特異的な結合ドメインをさらに含む、抗体分子を提供する。一実施形態において、このような抗体は、本明細書に上記の抗CD79抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、交差ブロッキング抗体は、本明細書に上記の抗CD79抗体によって結合されたエピトープに隣接および/または重複するエピトープに結合する。
同様に、本発明による抗体分子のCD22への結合を交差ブロックする抗体は、特に表1に示す重鎖および対応する軽鎖を含む抗体分子である:
Figure 0006998857000001
したがって、本発明はまた、抗原CD22に特異的な結合ドメインおよび抗原CD79に特異的な結合ドメインを含み、CD22に対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD22に対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックする、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD22に結合することから交差ブロックされる多重特異性分子を提供する。一実施形態において、このような抗体は、本明細書に上記の抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、交差ブロッキング抗体は、本明細書に上記の抗体によって結合されたエピトープに隣接および/または重複するエピトープに結合する。
同様に、本発明による抗体分子のCD45への結合を交差ブロックする抗体は、特に表2に示す重鎖および対応する軽鎖を含む抗体分子である:
Figure 0006998857000002
したがって、一実施例において、本発明はまた、抗原CD45に特異的な結合ドメインおよび抗原CD79に特異的な結合ドメインを含み、CD45に対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD45に対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックする、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD45に結合することから交差ブロックされる多重特異性分子を提供する。一実施形態において、このような抗体は、本明細書に上記の抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、交差ブロッキング抗体は、本明細書に上記の抗体によって結合されたエピトープに隣接および/または重複するエピトープに結合する。
交差ブロッキング抗体は、当技術分野における任意の適切な方法、例えば競合ELISAまたはBIAcoreアッセイを使用して同定することができ、該交差ブロッキング抗体と抗原(CD22および/またはCD45および/またはCD79)との結合が本発明の抗体の結合を妨げ、またその逆も同様である。このような交差ブロッキングアッセイは、細胞発現され、単離された天然または組換えのCD22、CD45もしくはCD79(aおよび/またはb)、または適切な融合タンパク質/ポリペプチドを使用することができる。一実施例において、結合および交差ブロッキングは、組換えCD22もしくはその適切な断片もしくは天然変異体(配列番号244に提供される配列もしくは配列番号244のアミノ酸20~847に提供される配列など)、またはCD79、例えば、配列番号245に提供される配列もしくは配列番号245のアミノ酸33~226(CD79a)および/または配列番号298に提供される配列(CD79b)もしくは配列番号298のアミノ酸29~229に提供される配列を使用して測定される。
一実施例において、結合および交差ブロッキングは、組換えCD45またはその適切な断片もしくは天然変異体(例えば、配列番号10に提供される配列、またはシグナルペプチドを欠いている配列番号10のアミノ酸24~1304)を使用して測定される。
これに代えて、またはさらに、本発明のこの態様による抗体は、例えば、表1に示される重鎖可変配列および軽鎖配列に由来するCDRを含む本明細書に開示される結合ドメインによって、抗原(CD22またはCD79)への結合から交差ブロックされ得る。
これに代えて、またはさらに、本発明のこの態様による抗体は、例えば、表2に示される重鎖可変配列および軽鎖配列に由来するCDRを含む本明細書に開示される結合ドメインによって、抗原(CD45またはCD79)への結合から交差ブロックされ得る。
したがって、抗原CD22に特異的な結合ドメインおよび抗原CD79bに特異的な結合ドメインを含み、前記CD79bに対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD79bに対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックする、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD79bとの結合から80%超、例えば85%超、例えば90%超、特に95%超交差ブロックされ、ならびに場合により、前記CD22に対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD22に対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックするか、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD22との結合から80%超、例えば85%超、例えば90%超、特に95%超交差ブロックされる多重特異性分子が提供される。
このような交差ブロッキング抗体は、機能アッセイにおいて本明細書において以下に記載される多重特異性抗体分子と同等の活性を有し得る。
したがって、抗原CD45に特異的な結合ドメインおよび抗原CD79bに特異的な結合ドメインを含み、前記CD79bに対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD79bに対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックする、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD79bとの結合から80%超、例えば85%超、例えば90%超、特に95%超交差ブロックされ、ならびに場合により、前記CD45に対する結合ドメインが、本明細書に上記のCD45に対する抗体分子のいずれか1つの結合を交差ブロックするか、および/またはこれらの抗体のいずれか1つによってCD45との結合から80%超、例えば85%超、例えば90%超、特に95%超交差ブロックされる多重特異性分子が提供される。
このような交差ブロッキング抗体は、機能アッセイにおいて本明細書において以下に記載される多重特異性抗体分子と同等の活性を有し得る。
本開示はまた、本明細書中に開示される新規なポリペプチド配列およびそれに対して少なくとも80%類似または同一の配列、例えば85%以上、例えば90%以上、特に95%、96%、97%、98%または99%以上の類似性または同一性の配列に及ぶ。
本明細書で使用される「同一性」は、アライメントされた配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用される「類似性」は、アライメントされた配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、イソロイシンまたはバリンをロイシンに置換してもよい。多くの場合に相互に置換することができる他のアミノ酸としては以下が挙げられるが、これらに限定されない:
-フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸);
-リジン、アルギニンおよびヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸);
-アスパラギン酸およびグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸);
-アスパラギンおよびグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸);ならびに
-システインおよびメチオニン(硫黄含有側鎖を有するアミノ酸);
が挙げられる。
同一性および類似性の程度は容易に計算することができる(Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、Oxford University Press、New York、1988年;Biocomputing.Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993年;Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin,A.M.,およびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、Academic Press、1987年、Sequence Analysis Primer、Gribskov,M.およびDevereux,J.,編、M Stockton Press、New York、1991年、NCBIから利用可能なBLAST(商標)ソフトウェア(Altschul,S.F.ら、1990年、J.Mol.Biol.215:403-410頁;Gish,W.&States,D.J.1993年、Nature Genet.3:266-272頁.Madden,T.L.ら、1996年、Meth.Enzymol.266:131-141頁;Altschul,S.F.ら、1997年、Nucleic Acids Res.25:3389-3402頁;Zhang,J.&Madden,T.L.1997年、Genome Res.7:649-656頁)。
したがって、一実施例において、本発明は、軽鎖の可変ドメインが、配列番号36、29、33、40または250の軽鎖可変ドメインと少なくとも80%の同一性または類似性を有する配列を含む抗体分子を提供する。
本発明はまた、重鎖の可変ドメインが、配列番号38、31、34、35、41または42の重鎖可変ドメインと少なくとも80%の同一性または類似性を有する配列を含む抗体分子を提供する。
一実施例において、本発明は、前記軽鎖の可変ドメインが、配列番号36、29、33、40または250の軽鎖可変ドメインと少なくとも80%の同一性または類似性を有する配列を含み、前記重鎖の可変ドメインが、配列番号38、31、34、35、41または42の重鎖可変ドメインと少なくとも80%の同一性または類似性を有する配列を含む抗体分子を提供する。
このような配列は、参照配列と少なくとも80%類似または同一、例えば85%以上、例えば90%以上、特に95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれ以上の類似性または同一性である。
本発明の抗体分子は、他の分子フォーマットまたは構築物に組み込み可能であり、本発明によって提供される結合ドメインはCD79に結合し、それによってCD79を標的とすることが理解されよう。例えば、本発明の結合領域、例えばFabまたはscFvなどの断片は、例えばキメラ抗原受容体によるT細胞の形質導入(CAR-T細胞)を介して細胞をインビボで再度方向付けし、次いでこれらの細胞を患者に移入するために使用することができる(Nat.Revs.Drug Disc.2015年、14、499-509頁)。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の1または複数の結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
リンカー
ある状況におけるリンカーの本明細書の教示は、リンカーが用いられる異なる状況、例えば本発明の任意の多重特異性分子のリンカーに等しく適用することができる。
一実施形態において、本開示の分子に用いられるリンカーは、例えば、配列273~336に示される配列から選択される長さ50残基以下のアミノ酸リンカーである。
表3:ヒンジリンカー配列
Figure 0006998857000003
表4.フレキシブルリンカー配列
Figure 0006998857000004

(S)は、配列284~288では任意選択である。
剛性リンカーの例としては、ペプチド配列GAPAPAAPAPA(配列番号337)、PPPP(配列番号338)およびPPPが挙げられる。
他のリンカーを表5に示す:
Figure 0006998857000005
エフェクター分子
所望であれば、本発明に使用するための多重特異性分子は、1または複数のエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、または本発明の多重特異性分子に結合することができる単一の部分を形成するように連結された2以上のこのような分子を含み得ることが理解されよう。エフェクター分子に連結された本開示による抗体または多重特異性分子を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片を直接またはカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する標準的な化学的または組換えDNA手順によって調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野で周知である(Hellstromら、Controlled Drug Delivery、第2版、Robinsonら編、1987年、623-53頁;Thorpeら、1982年、Immunol.Rev.、62:119-58頁およびDubowchikら、1999年、Pharmacology and Therapeutics、83、67-123頁を参照されたい)。特定の化学的手順には、例えば、国際公開第93/06231号、国際公開第92/22583号、国際公開第89/00195号、国際公開第89/01476号および国際公開第03/031581号パンフレットに記載の手順が挙げられる。または、エフェクター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、例えば国際公開第86/01533号パンフレットおよび欧州特許第0392745号明細書に記載の組換えDNA手順を使用して連結を達成することができる。
一実施形態において、本開示の多重特異性分子は、エフェクター分子を含むことができる。
本明細書で使用されるエフェクター分子という用語は、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然に存在するポリマー、核酸およびこれらの断片、例えばDNA、RNAおよびその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子および蛍光化合物またはNMRまたはESR分光法によって検出され得る化合物などのレポーター基を含む。
エフェクター分子の例としては、細胞毒素または細胞に有害な(例えば、死滅させる)任意の薬剤を含む細胞傷害性薬剤を挙げることができる。例としては、コンブレスタチン(combrestatins)、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリン、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログが挙げられる。
エフェクター分子としてはさらに、限定するものではないが、代謝拮抗物質(例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス-白金ジクロロジアミン(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン、(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン(AMC)、カリチアマイシンまたはデュオカルマイシン)および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が挙げられる。
他のエフェクター分子としては、111Inおよび90Y、Lu177、ビスマス213、カルフォルニウム252、イリジウム192およびタングステン188/レニウム188などのキレート化放射性核種、または限定するものではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼI阻害剤、タキソイドおよびスラミンなどの薬物が挙げられ得る。
他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチドおよび酵素が挙げられる。対象となる酵素としては、限定するものではないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。対象となるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、限定するものではないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子もしくは組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのタンパク質、血栓剤もしくは抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン、または生体応答修飾物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、神経成長因子(NGF)または他の成長因子および免疫グロブリンが挙げられる。
他のエフェクター分子としては、例えば診断に有用な検出可能な物質が挙げられ得る。検出可能な物質の例としては、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属(陽電子放出断層撮影に使用するため)、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、一般に、米国特許第4,741,900号明細書を参照されたい。適切な酵素としては、ホースラッディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドおよびフィコエリトリンが挙げられ、適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられ、適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性核種としては、125I、131I、111Inおよび99Tcが挙げられる。
別の実施例において、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を延長し、および/または抗体の免疫原性を低下させ、および/または免疫系に対する上皮障壁を横切る抗体の送達を増強させることができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、または国際公開第05/117984号パンフレットに記載されているようなアルブミン結合化合物が挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成または天然に存在するポリマー、例えば場合により置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝状または非分枝状多糖類、例えばホモ-またはヘテロ-多糖類であってよい。
上述の合成ポリマー上に存在し得る特定の任意の置換基としては、1または複数のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基が挙げられる。
合成ポリマーの特定の例としては、場合により置換された直鎖または分枝鎖のポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)ポリ(ビニルアルコール)またはこれらの誘導体、特に場合より置換されたポリ(エチレングリコール)、例えばメトキシポリ(エチレングリコール)またはその誘導体が挙げられる。
機能アッセイ
典型的には、本発明に使用するための適切な結合ドメインは、機能アッセイにおいて1つまたは複数の結合ドメイン対を試験することによって同定することができる。例えば、抗原CD22に特異的な結合ドメインおよび抗原CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインを含む多重特異性分子などの抗CD79抗体分子は、1または複数の機能アッセイにおいて試験することができる。
本明細書で使用される「機能アッセイ」は、アッセイ条件の対象となるタンパク質複合体、抗体複合体または抗体混合物の1または複数の所望の特性または活性を決定するために使用できるアッセイである。適切な機能アッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ、細胞成長または増殖の阻害(細胞静止作用)アッセイ、細胞死滅(細胞傷害性)アッセイ、細胞シグナリングアッセイ、サイトカイン産生アッセイ、抗体産生およびアイソタイプスイッチング、ならびに細胞分化アッセイであり得る。
本開示による多重特異性抗体の有効性は、当業者に一般的に公知の方法によって、このようなモデルにおいて個々の抗体または抗体(または断片)の混合物と比較することができる。
機能アッセイは、結果の信頼性を高めるために必要に応じて何回も繰り返すことができる。当業者に公知のさまざまな統計的試験を用いて、統計的に有意な結果を同定し、したがって生物学的機能を有する多重特異性分子を同定することができる。
適切な機能アッセイの例は、本明細書中の実施例に記載されており、B細胞活性化のマーカー、例えば、リン酸化されたAkt発現、リン酸化されたP38発現、PLCγシグナル伝達、CD40発現、CD71発現および/またはCD86発現の阻害を検出することによって測定される、抗IgMによる刺激後のB細胞活性化を阻害する本発明の多重特異性分子の能力の測定が挙げられる。
スクリーニングのための機能アッセイを確立する場合、当業者は、同定された活性が「ヒット」とみなされる適切な閾値を設定することができる。2つ以上の機能アッセイが使用される場合、各アッセイの閾値は、管理可能なヒット率を確立するのに適切なレベルに設定することができる。一実施例において、ヒット率は3~5%であり得る。一実施例において、B細胞機能を阻害する結合ドメインの対を探索する際に設定される基準は、上記および本明細書の実施例に記載のように、B細胞活性化アッセイにおいて、少なくとも2つのリン酸化の読み出しの少なくとも30%阻害であってよい。
一実施例において、本発明の多重特異性分子などの抗体分子は、抗IgM刺激B細胞におけるリン酸化P38の阻害について1nM未満のIC50、好ましくは0.5nM未満のIC50を有する。一実施例において、このアッセイにおける多重特異性分子のIC50は0.05nM未満である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子などの抗体分子は、抗IgM刺激B細胞におけるリン酸化Aktの阻害について1nM未満のIC50、好ましくは0.1nM未満のIC50を有する。一実施例において、このアッセイにおける多重特異性分子のIC50は0.05nM未満である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子などの抗体分子は、抗IgM刺激B細胞におけるリン酸化PLCγ2の阻害について1nM未満のIC50、好ましくは0.8nM未満のIC50を有する。一実施例において、このアッセイにおける多重特異性分子のIC50は0.05nM未満である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子は、抗IgM刺激B細胞におけるCD71発現の阻害について5nM未満のIC50、好ましくは3nM未満のIC50を有する。一実施例において、このアッセイにおける多重特異性分子のIC50は、0.5nM未満である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子などの抗体分子は、抗IgM刺激B細胞におけるCD40発現の阻害について5nM未満のIC50を有する。一実施例において、このアッセイにおける多重特異性分子のIC50は0.5nM未満である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子などの抗体分子は、抗IgM刺激B細胞におけるCD86発現の阻害について5nM未満のIC50、好ましくは2nM未満のIC50を有する。一実施例において、このアッセイにおける多重特異性分子のIC50は0.5nM未満である。
一実施例において、本発明の多重特異性分子などの抗体分子は、抗IgM刺激B細胞におけるCD71、CD40およびCD86発現の阻害について5nM未満のIC50および/または抗IgM刺激B細胞におけるリン酸化PLCγ2、P38およびAKTの阻害について1nM未満のIC50を有する。
一実施形態において、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染または細菌感染のげっ歯類または霊長類モデルなどを含む動物モデルなどのインビボアッセイを、本開示の分子を試験するために用いることができる。
結合ドメインのスクリーニングおよび発見のための適切なフォーマットの例は、以下に記載される。
本明細書で使用される「生物学的機能」という用語は、試験される生物学的実体に対する自然な活性またはその目的、例えば細胞、タンパク質などの天然の活性を指す。理想的には、機能の存在は、生きた哺乳動物細胞を利用するアッセイを含むインビトロ機能アッセイを使用して試験することができる。本明細書において用いられる自然機能は、癌に関連する機能などの異常な機能を含む。
本明細書で使用される「相乗的機能」という用語は、本開示の二重特異性タンパク質複合体の第1および第2のタンパク質が一緒に用いられない場合には観察されないか、またはその場合に観察されるより高い生物学的活性、例えば、二重特異性形態においてのみ観察される活性を指す。したがって、「相乗的」には、新規な生物学的機能が含まれる。
本開示は、新規な生物学的機能を有する、CD22およびCD79に対して少なくとも特異性を有する分子を提供する。
本明細書において用いられる新規な生物学的機能は、2以上の相乗的実体[タンパク質Aおよびタンパク質B]が(二重特異性または他のものとして)一緒にされるまで明白でないかまたは存在しない機能か、または以前は同定されていない機能を指す。
本明細書において用いられる、より高い、は、ゼロからの増加を含む活性の増加、すなわち、個々の複合体化されていない1または複数の二重特異性成分が、関連する機能アッセイにおいて活性を有さない場合の二重特異性におけるいくつかの活性を指し、さらに本明細書において新規な活性または新規な生物学的機能とも称される。本明細書において用いられる、より高い、はまた、個々の複合体化されていない二重特異性成分または二価の結合ドメインと比較して、関連機能アッセイにおいて二重特異性の相加的機能より大きい、例えば、関連活性の10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300%またはそれ以上の増加を含む。
一実施形態において、新規な相乗的機能は、より高い阻害活性である。
一実施形態において、本発明の多重特異性抗体分子は、単独または混合物で提供された、CD22に対する二価結合ドメインの活性とCD79aに対する二価結合ドメインの活性との合計より高い阻害活性を有する。
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを指し、このペプチドは2~100個のアミノ酸の範囲、例えば5~99、例えば6~98,7~97または8~96個を含む。一実施形態において、本開示に用いられるペプチドは、50アミノ酸残基以下、例えば40、30、10またはそれ以下のアミノ酸配列である。本開示で使用されるペプチドは、目的にかなった十分な長さであり、例えばペプチドがリンカーである場合、連結する断片がその生物学的機能を果たし得るような適切な長さが必要であり、またはペプチドが結合パートナーである場合、抗体などの別の実体に特異的に結合することができなければならない。
本明細書で使用される「機能アッセイ」は、アッセイ条件の対象となるタンパク質複合体、抗体複合体または抗体混合物の1または複数の所望の特性または活性を決定するために使用できるアッセイである。適切な機能アッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ、細胞成長または増殖の阻害(細胞静止作用)アッセイ、細胞死滅(細胞傷害性)アッセイ、細胞シグナリングアッセイ、サイトカイン産生アッセイ、抗体産生およびアイソタイプスイッチング、ならびに細胞分化アッセイであってよい。一実施形態において、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染または細菌感染のげっ歯類または霊長類モデルなどを含む動物モデルなどのインビボアッセイを、本開示の分子を試験するために用いることができる。
二重特異性抗体複合体の文脈において、本開示による二重特異性抗体分子の有効性は、当業者に一般的に公知の方法によって、このようなモデルにおいて個々の抗体または抗体(または断片)の混合物と比較することができる。
機能アッセイは、結果の信頼性を高めるために、特定の二重特異性抗体複合体の異なるサンプルの有無にかかわらず、必要に応じて何度も繰り返すことができる。当業者に公知のさまざまな統計学的試験を用いて、統計的に有意な結果を同定し、したがって生物学的機能を有する二重特異性抗体複合体を同定することができ、特に本発明の多重特異性分子に使用するための最適可変領域対を同定することができる。
組成物および医療用途
一態様において、本開示による分子または融合タンパク質、ヘテロ二量体的につながれた二重特異性タンパク質複合体などの構成要素、融合タンパク質または前記二重特異性タンパク質複合体を含む本発明の分子を含む組成物、本明細書で定義されるマルチプレックス、アレイ、ライブラリーが提供される。
一実施形態において、本開示の分子、例えば本明細書に記載の抗体、多重特異性分子および二重特異性タンパク質複合体は治療用途に適しており、疾患を治療するための新規治療法を提供することができる。したがって、さらなる態様において、本開示の分子、例えば上記の二重特異性タンパク質複合体が治療に使用するために提供される。本明細書に記載の二重特異性タンパク質複合体を含む本開示の分子は、癌などの一連の疾患の治療に適している。
本明細書に記載の多重特異性分子および二重特異性タンパク質複合体を含む本開示の分子はまた、さまざまな自己免疫疾患における免疫および自己免疫反応を制御するためにB細胞機能を阻害するのに特に適している。
したがって、本開示は、患者における疾患を治療する方法であって、治療有効量の本開示の分子、例えば本開示の多重特異性分子または二重特異性タンパク質複合体の投与を含む方法に及ぶ。
一態様において、本開示の1または複数の分子、例えば本開示の多重特異性分子を含む医薬組成物が提供される。
医薬として許容され得る担体、賦形剤および/または希釈剤を含むさまざまな異なる成分が、この組成物に含まれてよい。この組成物は、場合により、本発明の多重特異性分子の集団の特性を改変、例えば、抗体の機能の低下、安定化、遅延、調節および/または活性化することができるさらなる分子を含むことができる。組成物は、固体であっても、または液体形態であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤、溶液またはエアロゾルの形態であってもよい。
本発明はまた、本発明の抗体分子または多重特異性分子を、医薬として許容され得る賦形剤、希釈剤または担体の1または複数と組み合わせて含む医薬組成物または診断組成物を提供する。したがって、病態または傷害の治療に使用するための、および治療用医薬品製造のための本発明の多重特異性分子の使用が提供される。
病態
病態または障害は、例えば、感染(ウイルス性、細菌性、真菌性および寄生虫性)、感染に伴う内毒素性ショック、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科手術による癒着、脳卒中、I型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、狼瘡(全身性エリテマトーデスなど)およびギラン・バレー症候群(Guillain-Barr syndrome)などの中枢および末梢神経系の免疫媒介炎症性障害、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーブス病、IgA腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷(外科手術)、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、虚血性疾患を含む心疾患、例えば、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低酸症(hypochlorhydia)ならびに乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌および特に、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛癌、子宮頸癌、および甲状腺癌を含む癌、ならびにそれらの転移形態からなる群から選択され得る。
一実施形態において、障害は癌、例えば急性リンパ芽球性白血病もしくは慢性リンパ球性白血病などのリンパ球性白血病、または急性骨髄性白血病もしくは慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病を含む白血病である。
一実施形態において、自己免疫疾患としては、-急性播種性脳脊髄炎(adem)、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎不全、コルチゾール低下症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節症、シュトリュンペル-マリー病、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質抗体症候群(aps)、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性リンパ増殖性症候群(ALPS)、カナル-スミス症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎(AIP)、自己免疫性多内分泌腺症候群(I型、II型およびIII型)、自己免疫性網膜症(AR)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索型/神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー(CIDP)、慢性再発性多発性骨髄炎(chronic recurrent multifocal ostomyelitis)(CRMO)、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡(CP)、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群(crest disease)、クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、糖尿病、I型、円板状エリテマトーデス(DLE)、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮水疱症(EB)および後天性表皮水疱症(eb acquisita)(EBA)、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎(側頭動脈炎)、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎(非増殖性:巣状分節性糸球体硬化症および膜性糸球体腎炎 増殖性:IgA腎症)、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症(GPA)(以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた)、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚性軸索型ニューロパシー、急性全自律(panautonomic)ニューロパシー、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症(IGAN)、ベルガー症候群、咽頭炎併発糸球体腎炎(synpharyngitic glomerulonephritis)、IgA天疱瘡、IgG4関連硬化性疾患、免疫調節性不妊症(immune-regulated infertility)、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病、間質性膀胱炎、アイザック症候群、神経性筋強直症、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線形IgA皮膚症(LAD)、類天疱瘡、ループス(SLE)、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎(MPA)、混合性結合組織病(MCTD)、単クローン性γグロブリン血症(monoclonal gammaopathy)、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎(デビック病)、神経性筋強直症、アイザックス症候群(後天性、腫瘍随伴、遺伝性)、好中球減少症、眼球瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、精巣炎、回帰性リウマチ、pandas(連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神障害)、腫瘍随伴自己免疫多臓器症候群(PAMS)、傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡(PNP)、発作性夜間血色素尿症(PNH)、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎(周辺性ブドウ膜炎)、妊娠性類天疱瘡(pempgigoid gestationis)(PG)、尋常性天疱瘡(PV)、落葉状天疱瘡(pemphigus folliaceus)(PF)、末梢性ニューロパシー、静脈周囲脳脊髄炎(perivenous encephalomyelitis)、悪性貧血、Poems症候群、結節性多発動脈炎(PAN)、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、黄体ホルモン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、ハノット症候群、原発性硬化性胆管炎(PSC)、硬化性胆管炎(sclerosong cholangitis)、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性限局性脳炎(CFE)、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症(RAR)、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性硬化症、シェーグレン症候群、精液精巣自己免疫、全身硬直症候群(stiff person/man syndrome)、亜急性細菌性心内膜炎(SBE)、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病(TTP)、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患(UCTD)、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファーの脈管炎、水疱性皮膚炎、白斑ウェゲナー肉芽腫症(Vitiligowegener’s granulomatosis)(現在では多発血管炎性肉芽腫症(GPA)と名付けられている)が挙げられる。
一実施形態において、自己免疫疾患は、ANCA血管炎、IgA腎症(ベルジェ病)、尋常性天疱瘡/水疱性類天疱瘡、ITP、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性甲状腺炎(グレーブス病)、橋本病、ループス腎炎、膜性糸球体腎炎(または膜性腎症)、APS、重症筋無力症、視神経脊髄炎、原発性シェーグレン、自己免疫好中球減少症、自己免疫膵炎、皮膚筋炎(dermatosmyositis)、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫網膜症、ベーチェット病、IPF、全身性硬化症、肝線維症、自己免疫肝炎、原発性硬化性胆管炎、白斑、グッドパスチャー症候群、肺胞蛋白症、慢性自己免疫蕁麻疹、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、軸性脊椎関節炎(axial spodyloarthritis)、移植(GvHDを含む)、喘息、COPD、巨細胞性動脈炎、難治性自己免疫血球減少症、エヴァンス症候群(自己免疫溶血性貧血)、I型糖尿病、サルコイドーシス、多発性筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、巣状分節性糸球体硬化症、慢性ライム病(ライムボレリア症)、扁平苔癬、全身硬直症候群、拡張型心筋症、自己免疫(リンパ球性)卵巣炎、後天性表皮水疱症、自己免疫萎縮性胃炎、悪性貧血、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化、多発性硬化症、ラスムッセン脳炎、ギラン・バレー症候群、後天性神経性筋強直症、脳卒中を含む、またはからなる群から選択される。
一実施形態において、障害は癌、例えば白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病もしくは慢性リンパ球性白血病などのリンパ球性白血病、または急性骨髄性白血病もしくは慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病であり、またはリンパ腫、例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫またはホジキンまたは非ホジキンリンパ腫である。
本発明はまた、本明細書に記載の多重特異性分子などの本開示の分子を、医薬として許容され得る賦形剤、希釈剤または担体の1または複数と組み合わせて含む医薬組成物または診断組成物を提供する。したがって、治療および医薬品の製造において使用するための、本開示の分子、例えば本明細書に記載の多重特異性分子の使用が提供される。
本組成物は、通常、医薬として許容され得る担体を標準的に含む滅菌の医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、医薬として許容され得るアジュバントをさらに含むことができる。
本発明はまた、本発明の多重特異性分子を、医薬として許容され得る賦形剤、希釈剤または担体の1または複数と一緒に加える工程、および混合する工程を含む、医薬組成物または診断組成物の調製方法を提供する。
本明細書において使用される「医薬として許容され得る賦形剤」という用語は、本開示の組成物の所望の特性を高めるために、医薬として許容され得る製剤担体、溶液または添加剤を指す。賦形剤は当技術分野において周知であり、緩衝液(例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液)、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質(例えば、血清アルブミン)、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生分解性ミクロスフェアに封入することができる。製剤は、一般的に、滅菌製造法を用いて実質的に滅菌形態で提供される。
これには、製剤に使用される緩衝化溶媒溶液の濾過、滅菌緩衝化溶媒溶液への抗体の無菌懸濁、および当業者によく知られている方法での滅菌容器への製剤の分配による製造および滅菌を含むことができる。
医薬として許容され得る担体は、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発すべきではなく、有毒であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの、大型で緩徐に代謝される巨大分子であってもよい。
医薬として許容され得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
治療用組成物中の医薬として許容され得る担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体をさらに含有することができる。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として製剤化することを可能にする。
本明細書に記載の多重特異性分子などの本開示の分子は、溶媒中に分散させて、例えば溶液または懸濁液の形態で送達することができる。本開示の分子は、適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水、薬理学的に許容され得る溶媒または緩衝溶液に懸濁させることができる。当技術分野で公知の緩衝溶液は、pH約4.0~5.0を達成するように、水1mlあたり、0.05mg~0.15mgのエデト酸二ナトリウム、8.0mg~9.0mgのNaCl、0.15mg~0.25mgのポリソルベート、0.25mg~0.30mgの無水クエン酸、および0.45mg~0.55mgのクエン酸ナトリウムを含むことができる。前出のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体から作製することができる。
医薬として許容され得る担体の完全な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company、N.J.1991年)において利用可能である。
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、標的とされる疾患もしくは状態を治療、改善もしくは予防するため、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を発揮するために必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類のいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することができる。このような情報は、その後、ヒトへの投与のための有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
ヒト対象への正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性および治療に対する忍容性/応答に依存するものである。この量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、0.01mg/kg~50mg/kg、例えば0.1mg/kg~20mg/kgである。または、用量は1~500mg/日、例えば10~100、200、300または400mg/日であり得る。医薬組成物は、本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位剤形で簡便に提供することができる。
組成物は、患者に個別に投与しても、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて(例えば、同時に、逐次的にまたは別々に)投与してもよい。
本開示の多重特異性分子が投与される用量は、治療すべき状態の性質、存在する炎症の程度、および抗体分子が予防的に使用されるのか、または既存の状態を治療するために使用されるのかに依存する。
用量の頻度は、多重特異性分子の半減期およびその効果の持続時間に依存する。多重特異性分子の半減期が短い(例えば、2~10時間)場合、1日に1または複数回の用量を与えることが必要な場合がある。または、多重特異性分子の半減期が長い(例えば、2~15日)場合、必要な投薬量は1日1回、1週間に1回、または1または2ヶ月に1回の投与に過ぎない。
本開示では、製剤のpHが7である場合、8~9またはそれ以上のpIが適切であり得るので、最終製剤のpHは、多重特異性分子の等電点の値と類似しない。理論に縛られることを望むものではないが、このことが、安定性が改善された、例えば、抗体または断片が溶液中に残存する最終製剤を最終的に提供することができると考えられる。
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮的(例えば国際公開第98/20734号パンフレットを参照されたい)、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む任意の数の経路によって投与することができる。皮下噴射器もまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる。
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内の注射によって達成されるか、または組織の間質腔に送達される。組成物はまた、目的の特定の組織に投与することができる。投薬治療は、単回投与スケジュールであっても、または複数回投与スケジュールであってもよい。
生成物が注射または注入用である場合、それは油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳状液の形態をとることができ、懸濁剤、保存剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化剤(formulatory agent)を含むことができる。または、多重特異性分子は、使用前に適切な滅菌液で再構成するための乾燥形態であってもよい。組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収されたら、二重特異性タンパク質複合体を放出する薬剤を含有する必要がある。
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単回用量単位(例えば、密封されたプラスチック容器またはバイアル)として提供することができる。各バイアルは、溶媒/溶液緩衝液の体積、例えば2ml中に単位用量を含有する。
本明細書において使用する「変異体」という用語は、対応する野生型のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化を含むペプチドまたはタンパク質を指す。変異体は、対応する野生型のペプチドまたはタンパク質に対して少なくとも80%、または85%、または90%、または95%、または98%または99%の配列同一性を含み得る。しかし、変異体がその対応する野生型のペプチドまたはタンパク質と実質的に類似の機能を示すならば、変異体は80%未満の配列同一性を含むことが可能である。
一実施形態において、本開示の構築物は少なくとも三重特異的である。この状況では、さらなる特異性は、目的の抗原のいずれか、例えば、アルブミンまたはFc新生児受容体(FcRn)などの半減期を延長させる抗原;Fc受容体もしくは共刺激分子を活性化または阻害するなどのエフェクター機能のための抗原;組織もしくは細胞標的化抗原;またはトランスフェリン受容体またはLRP1などの血液/脳関門(BBB)移行を助けるための抗原を対象とする。
本開示はまた、特定の抗原特異性を有する前記新規なフォーマットを含む医薬組成物などの組成物にも及ぶ。
さらなる態様において、本開示は、治療における前記フォーマットおよび前記組成物の使用を含む。
本発明はまた、本発明の抗体分子または多重特異性分子を、医薬として許容され得る賦形剤、希釈剤または担体の1または複数と一緒に加える工程、および混合する工程を含む、医薬組成物または診断組成物の調製方法を提供する。
抗体分子または多重特異性分子は、医薬組成物または診断用組成物中の唯一の活性成分であっても、または他の抗体成分またはステロイドまたは他の薬物分子などの非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を適切に含む。本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、標的とされる疾患もしくは状態を治療、改善もしくは予防するため、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を発揮するために必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類のいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することができる。このような情報は、その後、ヒトへの投与のための有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
ヒト対象への正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性および治療に対する忍容性/応答に依存するものである。この量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、0.01mg/kg~500mg/kg、例えば0.1mg/kg~200mg/kg、例えば100mg/Kgである。
医薬組成物は、用量あたり本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位剤形で簡便に提供することができる。
組成物は、患者に個別に投与しても、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて(例えば、同時に、逐次的にまたは別々に)投与してもよい。
本明細書において用いられる薬剤は、投与されると生理学的影響を有する実体を指す。
本明細書において用いられる薬物は、治療用量で適切な生理学的影響を有する化学的実体を指す。
一実施形態において、本開示による抗体または断片は、ステロイド、特にプレドニゾンなどの免疫抑制剤療法とともに用いられる。
一実施形態において、本開示による抗体または断片は、リツキシマブまたは他のB細胞療法とともに使用される。
一実施形態において、本開示による抗体または断片は、任意のB細胞もしくはT細胞調節剤または免疫調節剤とともに使用される。例としては、メトトレキサート、ミコフェニレート(microphenyolate)およびアザチオプリンが挙げられる。
本発明の抗体分子が投与される用量は、治療すべき状態の性質、存在する炎症の程度、および抗体分子が予防的に使用されるのか、または既存の状態を治療するために使用されるのかに依存する。
用量の頻度は、抗体分子の半減期およびその効果の持続時間に依存する。抗体分子の半減期が短い(例えば、2~10時間)場合、1日に1または複数回の用量を与えることが必要な場合がある。または、抗体分子の半減期が長い(例えば、2~15日)および/または薬力学的(PD)プロファイルが長く続く場合、必要な投薬量は1日1回、1週間に1回、または1または2ヶ月に1回の投与に過ぎない。
一実施形態において、用量は2週間に1回、すなわち1ヶ月に2回送達される。
一実施形態において、用量は、さらなる用量の投与前に、抗薬物(この場合、抗抗体)応答をウェイン(waine)させるように間隔が空けられる。
本明細書において用いられる半減期は、循環中、例えば血清/血漿中の分子の持続時間を指すことを意図する。
本明細書において用いられる薬力学は、本開示による分子の生物学的作用のプロファイル、特に持続時間を指す。
医薬として許容され得る担体は、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発すべきではなく、有毒であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの、大型で緩徐に代謝される巨大分子であってもよい。
医薬として許容され得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
治療用組成物中の医薬として許容され得る担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体をさらに含有することができる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝物質が、このような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として製剤化することを可能にする。
投与に適した形態には、非経口投与に適した形態、例えば、注射または注入によって、例えば、ボーラス注射または連続注入によって投与することができる。生成物が注射または注入用である場合、それは油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳状液の形態をとることができ、懸濁剤、保存剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化剤(formulatory agent)を含むことができる。または、抗体分子は、使用前に適切な滅菌液で再構成するための乾燥形態であってもよい。
製剤化したならば、本発明の組成物は、対象に直接投与され得る。治療される対象は動物であってもよい。しかし、1または複数の実施形態において、組成物はヒト対象に投与するために適合させられる。
適切には、本開示による製剤において、例えば、タンパク質のpIが8~9またはそれ以上の範囲にある場合、製剤はpH7が適切であり得るので、最終製剤のpHは、抗体または断片の等電点の値と類似していない。理論に縛られることを望むものではないが、このことが、安定性が改善された、例えば、抗体または断片が溶液中に残存する最終製剤を最終的に提供することができると考えられる。
一実施例において、4.0~7.0の範囲のpHの医薬製剤は、1~200mg/mLの本開示による抗体分子、1~100mMの緩衝液、0.001~1%の界面活性剤、a)10~500mMの安定剤、b)10~500mMの安定剤および5~500mMの等張化剤、またはc)5~500mMの等張化剤を含む。
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮的(例えば国際公開第98/20734号パンフレットを参照されたい)、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む任意の数の経路によって投与することができる。皮下噴射器もまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態もまた調製することができる。
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内の注射によって達成されるか、または組織の間質腔に送達される。組成物は、病変部に投与することもできる。投薬治療は、単回投与スケジュールであっても、または複数回投与スケジュールであってもよい。
組成物中の活性成分は抗体分子であることが理解されよう。したがって、活性成分は消化管において分解を受けやすい。したがって、組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収されたら、抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。
医薬として許容され得る担体の完全な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company、N.J.1991年)において利用可能である。
一実施形態において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
適切な吸入可能な調製物は、吸入可能な粉末、噴射ガスを含む計量エアロゾルまたは噴射ガスを含まない吸入可能な溶液を含む。活性物質を含有する本開示による吸入可能な粉末は、上記の活性物質単独または上記の活性物質と生理学的に許容され得る賦形剤との混合物からなることができる。
これらの吸入可能な粉末としては、単糖類(例えばグルコースまたはアラビノース)、二糖類(例えばラクトース、サッカロース、マルトース)、オリゴ糖および多糖類(例えばデキストラン)、ポリアルコール(例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール)、塩類(例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム)またはこれらの混合物を挙げることができる。単糖類または二糖類が適切に使用され、特にラクトースまたはグルコースの使用がこれらの水和物の形態で適切であるが、これには限るものではない。
肺に沈着するための粒子は、10ミクロン未満、例えば1~9ミクロン、例えば1~5μmなどの粒径を必要とする。活性成分(抗体または断片など)の粒径は、最も重要である。
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用できる推進ガスは、当技術分野で公知である。適切な推進ガスは、n-プロパン、n-ブタンまたはイソブタンなどの炭化水素、およびメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩素化および/またはフッ素化誘導体などのハロ炭化水素から選択される。上記の推進ガスは、単独でまたはそれらの混合物として使用することができる。
特に適切な推進ガスは、TG11、TG12、TG134aおよびTG227から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、TG134a(1,1,1,2-テトラフルオロエタン)およびTG227(1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン)およびそれらの混合物が特に適している。
推進ガス含有吸入可能エアロゾルはまた、共溶媒、安定剤、表面活性剤(界面活性剤)、抗酸化剤、滑沢剤およびpH調整手段などの他の成分を含有してもよい。これらの成分はすべて当技術分野において公知である。
本発明による噴射ガス含有吸入可能エアロゾルは、5重量%までの活性物質を含有することができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、0.002~5重量%、0.01~3重量%、0.015~2重量%、0.1~2重量%、0.5~2重量%、または0.5~1重量%の活性成分を含有する。
または、肺への局所投与は、例えばネブライザーなどの装置、例えば圧縮機に接続されたネブライザーを用いて、液体溶液または懸濁液製剤の投与であってよい(例えば、Pari Master(登録商標)圧縮機に接続されたPari LC-Jet Plus(登録商標)ネブライザー、Pari Respiratory Equipment、Inc.Richmond,Va.製)。
本発明の抗体または多重特異性分子は、溶媒中に分散させて、例えば溶液または懸濁液の形態で送達することができる。本発明の抗体または多重特異性分子は、適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水または他の薬理学的に許容され得る溶媒または緩衝溶液に懸濁させることができる。当技術分野で公知の緩衝溶液は、pH約4.0~5.0を達成するように、水1mlあたり、0.05mg~0.15mgのエデト酸二ナトリウム、8.0mg~9.0mgのNaCl、0.15mg~0.25mgのポリソルベート、0.25mg~0.30mgの無水クエン酸、および0.45mg~0.55mgのクエン酸ナトリウムを含むことができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体を用いることができる。
懸濁液または溶液の治療用製剤はまた、1または複数の賦形剤を含むことができる。賦形剤は当技術分野において周知であり、緩衝液(例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液)、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質(例えば、血清アルブミン)、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生分解性ミクロスフェアに封入することができる。製剤は、一般的に、滅菌製造法を用いて実質的に滅菌形態で提供される。
これには、製剤に使用される緩衝化溶媒/溶液の濾過、滅菌緩衝化溶媒溶液への抗体の無菌懸濁、および当業者によく知られている方法での滅菌容器への製剤の分配による製造および滅菌を含むことができる。
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単回用量単位(例えば、密封されたプラスチック容器またはバイアル)として提供することができる。各バイアルは、溶媒/溶液緩衝液の体積、例えば2mL中に単位用量を含有する。
本明細書に開示される抗体は、噴霧による送達に適切であり得る。
本発明の抗体は、遺伝子療法の使用によって投与され得ることも想定される。これを達成するために、抗体鎖がDNA配列から発現され、in situで組み立てられるように、適切なDNA成分の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするDNA配列を患者に導入する。
一実施形態において、本明細書に記載の抗体分子などの本開示の分子を使用して、対象の1または複数の抗原の活性を機能的に改変することができる。例えば、本開示の抗体分子は、前記1または複数の抗原の活性を直接的または間接的に中和、拮抗または作動させることができる。
一実施形態において、融合タンパク質、二重特異性タンパク質複合体またはそれらを含む組成物を含む本開示の分子は、実験室用試薬として使用するために提供される。
さらなる態様
さらなる態様において、ヌクレオチド配列、例えば上記に定義した多重特異性分子または融合タンパク質を含む、本明細書に記載の構築物をコードするDNA配列が提供される。
一実施形態において、ヌクレオチド配列、例えば本開示による多重特異性分子、または二重特異性タンパク質複合体、または抗体を含む、本明細書に記載の構築物をコードするDNA配列が提供される。
本明細書の開示はまた、上記で定義したヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの例は、追加のDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループである「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)を宿主細胞のゲノムに統合することができ、その後それらは宿主ゲノムとともに複製される。本明細書において、用語「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、互換的に使用され得る。
ベクターを構築する一般的な方法、トランスフェクション方法および培養方法は、当業者に周知である。この点に関しては、「Current Protocols in Molecular Biology」、1999年、F.M.Ausubel(編)、Wiley Interscience、New YorkおよびCold Spring Harbor Publishingにより製造されたManiatis Manualを参照されたい。
本明細書において使用される「選択可能なマーカー」という用語は、その発現が、マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞の同定を可能にするタンパク質を指す。広範囲の選択マーカーが当技術分野において公知である。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞においてG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択可能なマーカーは、例えば、蛍光マーカーなどの視覚的に識別可能なマーカーであってもよい。蛍光マーカーの例としては、ローダミン、FITC、TRITC、Alexa Fluorsおよびそれらのさまざまなコンジュゲートが挙げられる。
また、本開示の抗体をコードする1または複数のDNA配列を含む、1または複数のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞/ベクター系を、本開示の抗体分子をコードするDNA配列の発現に使用することができる。細菌、例えばE.coli、および他の微生物系を使用してもよいし、真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞としては、CHO、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞が挙げられる。
本開示はまた、本開示による分子またはその構成要素の製造方法であって、本開示の分子をコードするDNAからタンパク質の発現を導くのに適した条件下で、本開示のベクターを含む宿主細胞を培養する工程、および前記分子を単離する工程、を含む方法を提供する。
本明細書に記載の二重特異性タンパク質複合体を含む本開示の分子は、診断/検出キットに使用することができる。キットは、例えば、両方が同じ細胞型に存在する2つの抗原に特異的な二重特異性抗体複合体を含み、両方の抗原が首尾よく検出された場合にのみ陽性診断を行うことができる。非複合型の2つの別個の抗体または抗体断片ではなく、本明細書に記載の二重特異性抗体複合体などの本開示の分子を使用することにより、検出の特異性を大幅に高めることができる。
一実施形態において、二重特異性抗体複合体などの本開示の分子は、固体表面上に固定される。固体表面は、例えば、チップまたはELISAプレートであってよい。
さらに、試料中の第1および第2のペプチドの存在を検出するための、本開示による分子、例えば本明細書に記載の二重特異性タンパク質複合体の、検出剤としての使用が提供される。
本明細書に記載の二重特異性抗体複合体などの本開示の分子は、例えば、結合した抗体-抗原複合体の検出を容易にする蛍光マーカーにコンジュゲートすることができる。このような二重特異性抗体複合体は、免疫蛍光顕微鏡法に使用することができる。または、二重特異性抗体複合体をウェスタンブロッティングまたはELISAに使用することもできる。
一実施形態において、本開示による分子またはその成分を精製する方法が提供される。
一実施形態において、本開示による分子またはその成分を精製する方法であって、不純物がカラム上に保持され、前記抗体が非結合画分に維持されるように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施する工程を含む方法が提供される。この工程は、例えば、約6~8のpHで行うことができる。
この方法は、例えば約4~5のpHで実施される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる初期捕捉工程をさらに含んでもよい。
この方法は、生成物と方法関連不純物とが確実に生成物流から適切に分離されるための追加のクロマトグラフィー工程をさらに含んでいてもよい。
精製方法は、濃縮および透析濾過工程などの1または複数の限外濾過工程を含むこともできる。
前出で使用された「精製形態」は、少なくとも90%の純度、例えば91、92、93、94、95、96、97、98、99w/w%またはそれ以上の純度を指すと意図される。
本開示の配列は、本明細書の以下および図面に提供される。
本明細書の文脈において、「含む(comprising)」は「含む(including)」として解釈されるべきである。
特定の要素を含む本開示の態様はまた、関連要素「からなる」または「から本質的になる」代替の実施形態にも及ぶことを意図している。
本明細書では、正当に列挙された実施形態を、否認の根拠として用いることができる。
本明細書において参照されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries.Hanes J、Jermutus L、Weber-Bornhauser S、Bosshard HR、PluckthunA。(1998年)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95、14130-14135頁
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment(scFv)with Low Picomolar Affinity。Zhand C、Spinelli S、Luginbuhl B、Amstutz P、Cambillau C、Pluckthun A.(2004年)J.Biol.Chem.279、18870-18877頁
3.Antigen recognition by conformational selection.Berger C、Weber-Bornhauser S、Eggenberger Y、Hanes J、Pluckthun A、Bosshard H.R.(1999年)F.E.B.S.Letters 450、149-153頁
実施例で使用される用語Fab-Kd-Fabは、式A-X:Y-B
(式中、
A-Xは第1の融合タンパク質であり;
Y-Bは第2の融合タンパク質であり;
X:Yはヘテロ二量体-テザーであり;
Aは、CD79などの抗原に特異的なFab断片を含み;
Bは、CD45などの抗原に特異的なFab断片を含み;
Xは、scFvなどの結合対の第1の結合パートナーであり;
Yは、ペプチドなどの結合対の第2の結合パートナーであり;
:はXとYとの間の相互作用(結合相互作用など)である)
を有する二重特異性タンパク質複合体を表す。
機能アッセイのためのFab’-A(Fab-scFv[A-X])およびFab’-B(Fab-ペプチド[B-Y])の作製
クローニング戦略
抗体可変領域DNAを、PCRまたは隣接する制限酵素部位のDNA配列の遺伝子合成によって作製した。これらの部位は、可変重鎖についてはHindIIIおよびXhoIであり、可変軽鎖についてはHindIIIおよびBsiWIであった。重鎖可変領域は、相補的制限部位を有するので、これにより、2つの重鎖ベクター(FabB-Yを有するpNAFHおよびFabA-Xdsを有するpNAFH[ジスルフィド安定化])に連結しやすくなる。これは、可変領域を、マウス定常領域およびペプチドY(GCN4)またはscFv X(52SR4)の上流(または5’)に連結して、全リーディングフレームを形成する。軽鎖は、同じ相補的制限部位を再び使用して標準的にハウスマウスの定常κベクター(pMmCKまたはpMmCK S171C)にクローニングした。pMmCK S171Cベクターは、可変領域がウサギから単離されている場合に使用される。クローニング事象は、全オープンリーディングフレームに隣接するプライマーを用いた配列決定によって確認した。
CHO-Sの培養
懸濁液CHOS細胞を、2mM(100×)glutamxを補充したCDCHO培地(Invitrogen)に予め適合させた。細胞を、シェーカーインキュベーター(Kuner AG、Birsfelden、Switzerland)において140rpmで撹拌して対数増殖期に維持し、8%COを補充して37℃で培養した。
エレクトロポレーショントランスフェクション
トランスフェクションの前に、CEDEX細胞カウンター(Innovatis AG.Bielefeld、Germany)を用いて細胞数および生存率を決定し、必要な量の細胞(2×10細胞/ml)を遠心分離コニカルチューブに移し、1400rpmで10分間回転させた。ペレット化した細胞を滅菌のEarls Balanced Salts Solutionに再懸濁し、1400rpmでさらに10分間回転させた。上清を捨て、ペレットを所望の細胞密度に再懸濁した。
ベクターDNAを、2×10細胞/mlに対して最終濃度400ugで混合し、800μlをCuvettes(Biorad)にピペットで入れ、インハウスエレクトロポレーションシステムを用いてエレクトロポレーションした。
トランスフェクションした細胞を、2mMのglutamxおよび抗生物質の有糸分裂阻害剤(100X)溶液(1/500)で富化したProCHO5培地を含む1×3Lの三角フラスコに直接移し、細胞を、37℃、5%COおよび140rpmの振盪に設定したKuhnerシェーカーインキュベーターにおいて培養した。トランスフェクション後24時間目に飼料補充物2g/LのASF(味の素(株))を添加し、温度を37℃に下げてさらに13日間培養した。4日目に、3mMの酪酸ナトリウム((n-BUTRIC ACID Sodium Salt、Sigma B-5887)を培養物に添加した。
14日目に、培養物をチューブに移し、4000rpmで30分間の遠心分離後に上清を細胞から分離した。保持された上清をさらに0.22umのSARTO BRAN P Milliporeで濾過し、続いて0.22μm Gamma goldフィルターで濾過した。最終発現レベルを、プロテインG-HPLCによって決定した。
大規模(1.0L)精製
Fab-AおよびFab-Bを、AKTA XpressシステムおよびHisTrap Excelプレパックニッケルカラム(GE Healthcare)を用いた親和性捕捉によって精製した。培養上清を0.22μmで滅菌濾過し、必要に応じて弱酸または弱塩基でpHを中性に調整した後、カラムに負荷した。15~25mMのイミダゾールを含有する二次洗浄工程を使用して、結合の弱い宿主細胞タンパク質/非特異的His結合剤をニッケル樹脂から置換した。溶出は、10mMのリン酸ナトリウム、pH7.4+1MのNaCl+250mMイミダゾールで行い、2mlの画分を回収した。1カラム容量が溶出したら、システムを10分間一時停止させて溶出ピークを狭め、結果的に全溶出量を減少させた。最もきれいな画分をプールし、緩衝液をPBS(Sigma)、pH7.4に交換し、0.22μmで濾過した。最終プールを、A280 Scan、SE-HPLC(G3000法)、SDS-PAGE(還元型および非還元型)によりアッセイし、エンドトキシンについてはPTS Endosafeシステムを使用してアッセイした。
CD79/CD22二重特異性がAktシグナル伝達を阻害するが、二価の組合せは阻害しないことを実証するための、ヘテロ二量体的テザー二重特異性タンパク質複合体フォーマットでのFab’-A(Fab-scFv[A-X])およびFab’-b(Fab-ペプチド[B-Y])の使用
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD22およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-A(Fab-scFv)とFab-B(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性抗体または二価抗体のグリッドを作製した。このグリッドを表4に示す。
表4:CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せの可能なグリッド。
Figure 0006998857000006

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である
Fab’A-XとFab’B-Yとを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMCと二重特異性または二価との組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で8分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。その後、プレートを室温で15分間放置した後、500gで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、細胞を、蛍光標識抗CD20抗体(BD Biosciences)およびタンパク質の473位の改変セリン残基を認識する蛍光標識抗ホスホAkt抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20およびAktの細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、Aktレベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。CD22およびCD79bの組合せの相対的効果を表5に示す(↓=阻害、↑=刺激および⇔=全体的効果なし)。
表5:CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、リン酸化Akt阻害の相対効力の表。
Figure 0006998857000007

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である。
このデータは棒グラフの形でも示され(図1)、データは平均値を表し、エラーバーは95%信頼区間である。このデータは、CD22とCD79bとの組合せが、抗IgMで刺激されたB細胞におけるホスホ-Akt発現を阻害し得ることを示す。対照的に、CD22とCD22との組合せは、高レベルのホスホ-Akt発現を示した。
CD79/CD22二重特異性がPLCγ2シグナル伝達を阻害するが、二価の組合せは阻害しないことを実証するための、ヘテロ二量体的テザー二重特異性タンパク質複合体フォーマットでのFab’-A(Fab-scFv[A-X])およびFab’-b(Fab-ペプチド[B-Y])の使用
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD22およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-a(Fab-scFv[A-X])とFab’-B(Fab-ペプチド[B-Y])を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性抗体または二価抗体のグリッドを作製した。このグリッドを表4に示す。
Fab’A-XとFab’B-Yとを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMCと二重特異性または二価との組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で8分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。その後、プレートを室温で15分間放置した後、500gで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、細胞を、蛍光標識抗CD20抗体(BD Biosciences)およびタンパク質の759位の改変チロシン残基を認識する蛍光標識抗ホスホPLCγ2抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20およびPLCγ2の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、PLCγ2レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。CD22およびCD79bの組合せの相対的効果を表6に示す(↓=阻害、↑=刺激および⇔=全体的効果なし)。
表6:CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対する、リン酸化PLCg2阻害の相対効力の表。
Figure 0006998857000008

XはscFvであり、Yはペプチドである
このデータは棒グラフとしても表すことができ(図2)、データは平均値を表し、エラーバーは95%信頼区間である。このデータは、CD22とCD79b、およびCD79bとCD79bとの組合せがすべて、抗IgMで刺激されたB細胞におけるホスホ-PLCγ2発現を阻害し得ることを示す。対照的に、CD22とCD22との組合せは、高いレベルのホスホ-PLCγ2発現を示した。
CD79/CD22二重特異性組合せがCD86発現を阻害することを実証するための、ヘテロ二量体的テザー二重特異性タンパク質複合体フォーマットでのFab’-A(Fab-scFv[A-X])およびFab’-b(Fab-ペプチド[B-Y])の使用
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD22およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-X(Fab-scFv)とFab-Y(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性抗体または二価抗体のグリッドを作製した。このグリッドを表4に示す。
Fab’A-XとFab’B-Yとを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMCと二重特異性または二価との組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で24時間活性化した。この後、プレートを氷上に置き、氷冷したフロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN)で1回洗浄した。次いで、細胞を蛍光標識抗CD19抗体(BD Biosciences)および蛍光標識抗CD86抗体で染色し、暗所で1時間氷上でインキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD19およびCD86の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを用いて測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、CD86レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。CD22およびCD79bの組合せの相対的効果を表7に示す(↓=阻害、↑=刺激および⇔=全体的効果なし)。
表7:CD22およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対するB細胞CD86発現の阻害の相対効力の表。
Figure 0006998857000009

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である
このデータは棒グラフの形でも示され(図3)、データは平均値を表し、エラーバーは95%信頼区間である。このデータは、CD22とCD79b、およびCD79bとCD79bとの組合せがすべて、抗IgMで刺激されたB細胞上のCD86発現を阻害し得ることを示す。対照的に、CD22とCD22との組合せは、高レベルのCD86発現を示した。
CD22およびCD79bの阻害効果は、抗体が二重特異性方向に配列されている場合にのみ再現され得る
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD22およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-X(Fab-scFv)および/またはFab’-Y(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、抗体の二重特異性、二価または混合物の組合せを作製した。これらの組合せを表8に示す。滴定曲線実験のために、次いで、これらの組合せを2.5希釈で1段階ずつ8段階に希釈して、この組合せについて用量漸増を作成した。
表8:CD22およびCD79bに対する特異性を有する、二重特異性、二価または混合物のグリッド。
Figure 0006998857000010

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である
Fab’A-Xおよび/またはFab’B-Yを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMC+Fab’A-Xおよび/またはFab’B-Yの組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で8分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。その後、プレートを室温で15分間放置した後、500gで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、細胞を、蛍光標識された抗CD20抗体(BD Biosciences)、473位の改変セリン残基を認識する抗ホスホ-Akt抗体、および759位の改変チロシン残基を認識する抗ホスホ-PLCγ2抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20、AktおよびPLCγ2の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、AktおよびPLCγ2レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。図4および5は、CD22およびCD79bの二重特異性の組合せのみがリン酸化されたAktおよびPLCγ2の発現を阻害し、CD22およびCD79b抗体の混合物は阻害しないことを示している(データは平均値を表し、エラーバーは95%信頼区間である)。
CD22とCD79bとの二重特異性の組合せで見られる阻害を検証するために、この組合せとともに、CD22とCD79b抗体との混合物を滴定し、全細胞内IkB(シグナル伝達読み出し)およびCD86(24時間後の活性化マーカー)の阻害をB細胞において測定した。
図6に見られるように、総IkBタンパク質のレベルによって測定されるように、CD22-X/CD79b-Yの組合せは、抗IgM刺激後のNF-κBシグナル活性化を阻害することができるが、CD22-X/CD79b-Xの組合せは阻害できない。Graphpad Prism 6を使用した4パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて外挿したIC50は7.5nMであった(データは平均値を表し、エラーバーは標準偏差である)。さらに、CD22-X/CD79b-Yの組合せの滴定は24時間後のB細胞上の抗IgM誘導性CD86発現を阻害することができるが、CD22-X/CD79b-Xの組合せの滴定は阻害できない(図7参照)。
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD22およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(500nM)量のFab’-X(Fab-scFv)とFab’-Y(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性の組合せを作製した。次いで、これらの組合せを2.5希釈で1段階ずつ8段階に希釈して、この組合せについて用量漸増を作成した。Fab’-XとFab’-Yとを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレートに2.5×105のPBMCを添加した。次いで、PBMCをFab’-XおよびFab’-Yの組合せに加え、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、B細胞を、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を37℃で24時間添加することにより活性化した。細胞表面活性化マーカーの検出を可能にするために、プレートを氷上に置き、氷冷フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN 3)で1回洗浄した。次いで、細胞を蛍光標識抗CD19抗体(BD Biosciences)および蛍光標識抗CD86抗体で染色し、暗所で1時間氷上でインキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25ulのフロー緩衝液に再懸濁した。CD19およびCD86の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを用いて測定した。データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、CD86レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。図7に見られるように、CD22-X/CD79b-Yの組合せの滴定は、24時間後のB細胞上の抗IgM誘導性CD86発現を阻害することができた。Graphpad Prism 6を用いた4パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて外挿したIC50は10.3nMであった(データは平均値を表し、エラーバーは標準偏差である)。
CD22およびCD79b二重特異性タンパク質の阻害効果は、異なる抗体V領域を用いて再生することができる
免疫化:選択された抗原をコードするDNAを、遺伝子合成または商業的供給源によって得て、強い構成的プロモーターを有する発現ベクターにクローニングした。次いで、プラスミドDNAを、インハウスエレクトロポレーションシステムを使用してRab-9ウサギ線維芽細胞(ATCC(登録商標)CRL-1414(商標))にトランスフェクトした。24時間後、細胞をフローサイトメトリーにより抗原発現について検査し、使用まで液体窒素中でアリコートで凍結した。同じ細胞上で同時発現させるか、または単一または複数のトランスフェクトされた細胞の混合物を作製することによって、ウサギ1羽あたり最大6つの抗原を免疫化した。ウサギを3用量の細胞で免疫化した。
抗体発見:B細胞培養物を、Zublerら(1985年)によって記載された方法と同様の方法を用いて調製した。簡潔には、免疫化ウサギ由来の脾臓またはPBMC由来B細胞を、10% FCS(PAA laboratories ltd)、2% HEPES(Sigma Aldrich)、1%L-グルタミン(Gibco BRL)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Gibco BRL)、0.1%β-メルカプトエタノール(Gibco BRL)、3%の活性化脾臓細胞培養上清およびガンマ線照射変異体EL4マウス胸腺腫細胞(5x10/ウェル)を補充した200μl/ウェルのRPMI1640培地(Gibco BRL)を含むバーコード化96ウェル組織培養プレート中で、ウェルあたり約2000~5000細胞の密度で、37℃、5%CO雰囲気下で7日間培養した。
B細胞培養上清中の抗原特異的抗体の存在を、ウサギを免疫化した抗原で同時トランスフェクトしたHEK293細胞を使用して、均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して測定した。スクリーニングは、10ulの上清を、バーコード化96ウェル組織培養プレートから、Matrix Platemateリキッドハンドラーを用いて標的抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞(約3000細胞/ウェル)を含むバーコード化384ウェル黒色アッセイプレートに移すことを含む。結合は、ヤギ抗ウサギIgGFcγ特異的Cy-5コンジュゲート(Jackson)を用いて明らかにした。プレートを、Applied Biosystems 8200細胞検出システムで読み取った。
一次スクリーニング後、陽性上清を、Aviso Onyxヒットピッキングロボットおよび-80℃で凍結させた細胞培養プレート中のB細胞を使用して、96ウェルバーコード化マスタープレートに固定させた。次いで、マスタープレートを、抗原で別々にトランスフェクトしたHEK293細胞および抗原の供給源として組換えタンパク質でコーティングしたSuperavidin(商標)ビーズ(Bangs Laboratories)について、均一蛍光ベースの結合アッセイでスクリーニングした。これは各ウェルの抗原特異性を決定するために行った。
対象のウェルの選択から抗体可変領域遺伝子を回収するために、にデコンボリューションステップを実施して、B細胞の異種集団を含む所定のウェル中の抗原特異的B細胞の同定を可能した。これは、蛍光フォーカス法(Clargoら、2014年。Mabs 2014年1月1日:6(1)143-159頁;欧州特許第1570267号明細書)を使用して達成した。簡潔には、陽性ウェル由来の免疫グロブリン分泌B細胞を、標的抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞またはビオチン化標的抗原でコーティングしたストレプトアビジンビーズ(New England Biolabs)のいずれかと、最終希釈1:1200のヤギ抗ウサギFcγ断片-特異的FITCコンジュゲート(Jackson)と混合した。37℃で1時間静的インキュベーションした後、抗原特異的B細胞は、そのB細胞を取り囲む蛍光ハローの存在により同定することができた。次いで、オリンパス顕微鏡を使用して同定された多数のこれらの個々のB細胞クローンをエッペンドルフマイクロマニピュレーターで採取し、PCRチューブに入れた。蛍光フォーカス法は、免疫化ウサギの骨髄に直接由来するB細胞の異種集団から、抗原特異的B細胞を同定するためにも使用した。
重鎖および軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写(RT)-PCRによって単一細胞から抗体可変領域遺伝子を回収した。可変領域を、マウスFab-XおよびFab-Y(VH)またはマウスκ(VL)哺乳動物発現ベクターにクローニング可能にする制限部位を3’および5’末端に組み込んだネステッド二次PCRを用いて、2回のPCRを行った。Fab-XおよびFab-Y発現ベクターのための重鎖および軽鎖構築物を、Fectin 293(Life Technologies)を使用してHEK-293細胞に、またはExpifectamine(Life Technologies)を使用してExpi293細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体を、5mlの容量の6ウェル組織培養プレートで発現させた。5~7日の発現後、上清を回収した。上清を、抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞および組換えタンパク質または抗原トランスフェクトHEK細胞でコーティングしたSuperavidin(商標)ビーズ(Bangs Laboratories)について、均一蛍光ベースの結合アッセイで試験した。これは、クローニングされた抗体の特異性を確認するために行った。
小規模なFab A-XおよびFab B-Yの作製(小規模(50mL)なExpi293のトランスフェクション)
Expi293細胞をExpi293(商標)発現培地において最終濃度0.5×10生存細胞/mLまで日常的に継代培養し、オービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)で120rpm、8%COおよび37℃でインキュベートした。
トランスフェクションの日に、細胞の生存率および濃度を、自動細胞カウンター(Vi-CELL、Beckman Coulter)を用いて測定した。2.5x10生存細胞/mLの最終細胞濃度を達成するために、適切な容積の細胞懸濁液を250mLの滅菌三角振盪フラスコに添加し、各50mLのトランスフェクションに対して、新鮮な予熱したExpi293(商標)発現培地を添加することにより容積42.5mLにした。
各トランスフェクションのための脂質-DNA複合体を調製するために、全量50μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNAをOpti-MEM(登録商標)I培地(LifeTechnologies)で総容積2.5mLに希釈し、135μLのExpiFectamine(商標)293試薬(LifeTechnologies)をOpti-MEM(登録商標)I培地で総容積2.5mLに希釈した。すべての希釈液を穏やかに混合し、室温で5分以内インキュベートした後、各DNA溶液をそれぞれの希釈したExpiFectamine(商標)293試薬に加えて、総容積5mLとした。DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬混合物を穏やかに混合し、室温で20~30分間インキュベートして、DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を形成させた。
DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体のインキュベーションが完了した後、5mLのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を各振盪フラスコに添加した。振盪フラスコを、120rpm、8%COおよび37℃でオービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)中でインキュベートした。
トランスフェクションの約16~18時間後、250μLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1(LifeTechnologies)および2.5mLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー2(LifeTechnologies)を各振盪フラスコに添加した。
トランスフェクションの7日後に細胞培養物を収穫した。細胞を50mLのスピンチューブ(Falcon)に移し、4000rpmで30分間遠心沈殿させた後、0.22umのStericup(Merck Millipore)を通して滅菌濾過した。清澄化し滅菌濾過した上清を4℃において保存した。最終発現レベルを、プロテインG-HPLCによって決定した。
小規模(50ml)精製:Fab-XおよびFab-Yの両方を、小規模の真空系精製システムを使用した親和性捕捉によって別々に精製した。簡潔には、50mlの培養上清を0.22μmで滅菌濾過した後、500μLのNiセファロースビーズ(GE Healthcare)を添加した。次いで上清とビーズとの混合物を約1時間回転させてから、上清を真空を適用することによって除去した。次いでビーズを洗浄液1(50mMリン酸ナトリウム1M NaCl、pH6.2)および洗浄液2(0.5M NaCl)で洗浄した。溶出は50mM酢酸ナトリウム、pH4.0+1M NaClで行った。溶出画分緩衝液をPBS(Sigma)、pH7.4に交換し、0.22μmで濾過した。最終プールを、A280スキャン、SE-UPLC(BEH200法)、SDS-PAGE(還元型および非還元型)によりアッセイし、エンドトキシンについてはPTS Endosafeシステムを使用してアッセイした。
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、RPMI 1640(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、抗体の二重特異性、二価または混合物の組合せを、細胞表面タンパク質CD22およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-X(Fab-scFv)および/またはFab’-Y(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清、50単位/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンおよび2mMのグルタミンを含有するRPMI1640で希釈することにより作製した。3つの異なるCD79b Fab-Yおよび3つの異なるCD22 Fab-Xのこれらの組合せを表9に示す。
表9:CD22およびCD79bに対する特異性を有する二重特異性タンパク質のグリッド。
Figure 0006998857000011

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である
Fab’A-XとFab’B-Yとを一緒に60分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMC+Fab’A-Xおよび/またはFab’B-Yの組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、12.5μg/mLのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で10分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。その後、プレートを室温で15分間放置した後、500gで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.1%NaN+2mM EDTA)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、細胞を、蛍光標識抗CD20抗体(BD Biosciences)および759位の改変チロシン残基を認識する抗ホスホPLCγ2抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、40μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20およびPLCγ2の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、PLCγ2レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。
図8に見られるように、データは、すべての異なる抗体V領域を使用するCD22とCD79bとの組合せが、抗IgMで刺激されたB細胞におけるホスホ-PLCγ2発現を阻害できることを示す。
新規な二重特異性抗体標的を同定するためのヘテロ二量体的につながれたタンパク質複合体の大きなパネルのグリッドスクリーニング。
序論:先の実施例における二重特異性フォーマットおよびスクリーニング方法の検証成功の後、スクリーニングをより多数の抗原対に拡大した。B細胞上に発現された23の異なる抗原に対する抗体可変(V)領域対のパネルを作製した。Fab-Kd-Fab(すなわち、A-X:Y-B、式中、AおよびBはFab断片である]フォーマットを使用して、315の異なる抗原対の組合せそれぞれについての複数のV領域の組合せを表す、ヘテロ二量体的につながれたタンパク質複合体のグリッドを形成した。これらの組合せを、高スループットフローサイトメトリーアッセイでBCR(B細胞受容体)シグナル伝達を調節する能力についてスクリーニングして、二重特異性抗体の介入のための新規標的対を選択した。
抗体を、実施例6に記載のように単離した。
スクリーニングアッセイ
ドナーPBMCを、37℃に設定した水浴を用いて迅速に解凍し、注意深く50mlのファルコンチューブに移した。次いで、それらをアッセイ培地に滴下して5mlに希釈し、浸透圧ショックを最小にした。次いで、細胞を20mlに慎重に希釈した後、最終培地希釈液を加えて容積50mlにした。次いで細胞を500gで5分間回転させた後、上清を除去し、細胞を1mlの培地に再懸濁した。次いで、細胞を計数し、1.66×10細胞/mlに希釈した後、V-底TCプレートにウェルあたり30μlを分注し、5.0×10細胞/ウェルの最終アッセイ濃度を得た。次いで、細胞プレートを37℃、5%COインキュベーター中で必要になるまでカバー付きで保存し、最低1時間静置した。
Fab-XおよびFab-Y試薬を、アッセイ培地中の最終アッセイ濃度の5倍で等モル比で混合し、37℃、5%COで90分間インキュベートした。試料を96ウェルU底ポリプロピレンプレート中で調製し、インキュベーションの際はカバーをした。
10μlの5×Fab-KD-Fab混合物を、細胞を含む適切な試験ウェルに添加し、1000rpmで30秒間振盪することによって混合して、37℃、5%COで90分間インキュベートした。
次いで、細胞を10μlの抗ヒトIgMで刺激した。刺激の最終アッセイ濃度は、アッセイパネルの読み取り値に依存して変化し、3種の抗体カクテルA、BおよびC(詳細は下記)を、50μg/ml(カクテルAおよびC)または25μg/ml(カクテルB)の最終アッセイ濃度で刺激した。次いで、アッセイプレートを1000rpmで30秒間穏やかに混合した後、37℃、5%COで5分間(抗体カクテルAおよびC)または2分間(抗体カクテルB)インキュベートした。アッセイを、150μlの氷冷BD CytoFixをすべてのウェルに添加することによって停止させ、室温で15分間インキュベートした。次いで固定された細胞を500gで5分間回転させて細胞をペレット化し、BioTek ELx405プレート洗浄器を用いて上清を除去した。プレートを2400rpmで30秒間ボルテックスすることにより、ペレットを再懸濁した。次いで細胞を、100μlの氷冷BD細胞透過性緩衝液IIIを添加することによって、4℃で30分間透過処理した。次いで細胞を100μlのFACS緩衝液で洗浄し、500gで5分間回転させた。上清をELx405によって再度除去した後、使用前に、200μlのFACS緩衝液を迅速に分注し、残留する透過性緩衝液をすべて洗い流した。細胞を再び500gで回転させ、上清を反転によって除去した。先行する回転ステップの間、抗体カクテルをFACS緩衝液中で調製し、光から遮蔽したままにした。次いで、細胞をボルテックス(2400RPM、30秒)によって再懸濁した後、20μlの抗体カクテルをすべてのウェルに添加し、プレートを1000rpmで30秒間振盪した。次いで、細胞を室温で60分間暗所においてインキュベートした。
次いで、細胞を500gで回転させながら200μlのFACS緩衝液中で2回洗浄し、各工程後に上清を除去した。最後に、細胞を2400rpmで30秒間ボルテックスして再懸濁した後、最終の20μlのFACS緩衝液を添加した。次いで、(1または複数の)プレートをIntellicyt HTFC/iQue装置で読み取った。
FACS緩衝液=PBS+1%BSA+0.05%NaN+2mM EDTA
抗体カクテルA=1:2のCD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)+1:5のPLCγ2 AF88+1:10のAkt AF647+1:50のERK1/2 PE(FACS緩衝液で希釈)。
抗体カクテルB=1:2のCD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)+1:5のSyk PE+1:5のBLNK AF647(FACS緩衝液で希釈)
抗体カクテルC=1:5のCD20 PerCp-Cy5.5(Biolegend)+1:5のPLCγ2 AF488+1:10のAkt AF647+1:5のSyk PE(FACS緩衝液で希釈)
Figure 0006998857000012
Fab-X+Fab-Yの組合せを、抗体カクテルAおよびBまたはC単独でスクリーニングした。すべてのスクリーニングは2人の異なる献血者由来のコーン細胞について行った。市販のソフトウェアツールを使用してデータを取得し、評価した。合計2500のFab-X+Fab-Yの組合せを315の異なる抗原の組合せに対してスクリーニングした。
結果
各Fab-Kd-Fab(すなわち、A-X:Y-B(式中、AおよびBはFab断片である)]の組合せによるBCRシグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化の誘導の阻害パーセンテージを計算し、この実施例において、B細胞機能を阻害する新規な抗原の組合せを探しているが、陽性の組合せの基準は、V領域の少なくとも1つの組合せによる少なくとも2つホスホの読み出しの少なくとも30%の阻害として設定した。この閾値に従って、検査した315のうち11の新しい抗原対の組合せが、必要な基準を満たした。これは3.5%のヒット率を表し、所望の活性の組合せを見出すために多数の組合せをスクリーニングすることの重要性、およびCD79bとCD22の組合せの活性がどれほど稀であるかを示している。
図10-12は、抗原グリッドの交差特異性に関するデータを示す。値は、それぞれSyk、PLCγ2およびAKTのリン酸化の阻害パーセンテージ(活性化に対する負値)であり、評価された複数のV領域の組合せの平均を表す。315の異なる抗原の組合せが試験され、見てわかるように、抗体の異なる組合せによるBCRシグナル伝達に対する効果は、強い阻害、例えば、Fab-X上の抗原2(CD79b)と組み合わせたFab-Y上の抗原3(CD22)(ホスホSykの69.66%の阻害)およびFab-Y上の抗原2(CD79b)と組み合わせたFab-X上の抗原3(CD22)(図10に示すホスホSykの52.32%の阻害)から活性化、例えば、X上の抗原6とY上の抗原11(-118.10%のホスホSyk、図10)へ有意に変化した。
図10-12に表される平均%値を表す各データ点は、Fab-X上の抗原2(CD79b)とFab-Y上の抗原3(CD22)について、図13に示されている。この場合、異なる抗体V領域の23種の異なる組合せを評価した。同じ抗原の組合せであるが、別の配向、すなわちFab-Y上の抗原2(CD79b)とFab-X上の抗原3(CD22)とを図14に示す。この場合、異なる抗体V領域の9種の異なる組合せを評価した。すべてのV領域は阻害を示すが、この方法はまた、最適なV領域の組合せの選択においても有利に使用することができる。
Fab-Kd-Fabスクリーニングフォーマットにおける抗原CD79bと抗原CD22の同時標的化と、分子的に連結された二重特異性BYbeフォーマットとの活性の比較。
序論:ヘテロ二量体的につながれたスクリーニング複合体であるFab-Kd-Fabにおいて同定されたCD79b/CD22標的対の活性が、治療的な分子的に連結された別のフォーマットで同様の望ましい活性に変換され得ることを確認するために、抗原CD79b特異性(VR4447)および抗原CD22特異性(VR4130)をBYbe形式で作製した。このBYbeフォーマットは、リンカーSGGGGSGGGGS(配列番号17)を介して抗-抗原CD79b Fab(VR4447)の重鎖に融合されたジスルフィド安定化(ds)一本鎖(sc)-Fvとしての抗-抗原CD22 V領域(VR4130)からなる。
方法:
機能的スクリーニングのためのBYbeの精製は以下のように行った:
機能的スクリーニングのBYbe(Fab-dsscFv[Fab重鎖のC末端のscFv])フォーマットを以下のように精製した。標準的なexpiHEKまたはCHO発現からの清澄化された細胞培養上清を、0.22μmで滅菌濾過した。濾過した上清を、PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)で平衡化した50mlのGammabindPlus Sepharose XK26カラム(GE Healthcare)に2ml/分で負荷した。負荷後、カラムをPBS pH7.4で洗浄し、次いで0.1Mグリシン/HCl、pH2.7で溶出した。溶出に続いて280nmでの吸光度を測定し、溶出ピークを集め、次いで1/25容積の2M Tris/HCl、pH8.5で中和した。中和された試料を、10kDa(BYbe)の分子量カットオフ膜を有するAmicon Ultra-15濃縮器およびスイングアウトローターにおける4000xgでの遠心分離を使用して濃縮した。濃縮した試料を、pH7.4のPBSで平衡化したXK16/60またはXK26/60のSuperdex 200カラム(GE Healthcare)のいずれかに適用した。カラムは、それぞれ1ml/分または2.6ml/分いずれかのPBS、pH7.4の定組成勾配で展開した。画分を回収し、TSKゲルG3000SWXL;5μm、7.8×300mmカラム、1ml/分で0.2Mリン酸塩、pH7.0の定組成勾配で展開、のサイズ排除クロマトグラフィー、280nmにおける吸光度による検出によって分析した。選択された単量体画分をプールし、10kDaの分子量カットオフ膜を有するAmicon Ultra-15濃縮器およびスイングアウトローターにおける4000xgでの遠心分離を使用して1mg/ml超に濃縮した。最終試料をアッセイした;濃度は、A280スキャンUV-可視分光光度計(Cary 50Bio)による;単量体%は、TSKゲルG3000SWXL;5μm、7.8×300mmカラム、1ml/分で0.2Mリン酸塩、pH7.0の定組成勾配で展開、のサイズ排除クロマトグラフィーにより、および検出は280nmにおける吸光度による;還元型および非還元型SDS-PAGEを4-20%トリス-グリシン1.5mmゲル(Novex)において50mA(ゲルあたり)で53分間行い;エンドトキシンについては、Limulus Amebocyte Lysate(LAL)試験カートリッジを備えたCharles RiverのEndoSafe(登録商標)ポータブル試験システムによるものであった。
機能アッセイ
活性化マーカーアッセイ:抗原CD79b特異的Fab’-Yおよび抗原CD22特異的Fab’-Xを、等モル濃度で60分間(37℃および5%CO環境で)一緒にインキュベートした。この組合せを、100nMの開始モル濃度から1:4連続希釈で滴定した。抗原CD79bおよびCD22特異的BYbeもまた、100nMの開始モル濃度から1:4連続希釈で滴定した。V底96ウェルプレートにおいて、1.5x10のPBMCをウェルに添加し、これに滴定したFab’-XおよびFab’-Yの組合せ、または滴定したBYbeを添加した。Fab’-XおよびFab’-Yの組合せ、またはBYbeを細胞とともにさらに90分間インキュベートした。この後、25μg/mLのヤギF(ab’)抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃+5%COで24時間活性化した。
ウェルに100μLの氷冷FACS緩衝液(PBS+1%BSA+0.1%NaN+2mM EDTA)を添加し、プレートを密封し、湿った氷で約15分間覆った後、500xgで5分間、4℃において遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、プレートを2000rpmで30秒間振盪した。
次いで、蛍光標識された抗CD19、抗CD20および抗CD71、抗CD40および抗CD86抗体のカクテル(BD Biosciences)で細胞を染色した。プレートを短時間振盪し、湿った氷上で暗所において1時間インキュベートした。この後、プレートを2回洗浄し、20μLのFACS緩衝液に再懸濁した。CD19、CD20およびCD71、CD40およびCD86の細胞発現は、Intellicyt iQUE(登録商標)Screenerフローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、CD71、CD40およびCD86レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。
PhosFlowアッセイ:抗原CD79b特異的Fab’-Yおよび抗原CD22特異的Fab’-Xを、等モル濃度で60分間(37℃および5%CO環境で)一緒にインキュベートした。この組合せを、100nMの開始モル濃度から1:4連続希釈で滴定した。抗原CD79bおよび抗原CD22特異的BYbeも、100nMの開始モル濃度から1:4連続希釈で滴定した。V底96ウェルプレートにおいて、5.0x10のPBMCをウェルに添加し、これに滴定したFab’-XおよびFab’-Yの組合せ、または滴定したBYbeを添加した。Fab’-XおよびFab’-Yの組合せ、またはBYbeを細胞とともにさらに90分間インキュベートした。この後、25μg/mLのヤギF(ab’)抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃+5%COで15分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。次いで、プレートを室温で15分間放置した後、500xgで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、FACS緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN+2mM EDTA)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、蛍光標識された抗CD20抗体(BD Biosciences)ならびに抗リン酸化PLCγ2、抗リン酸化Aktおよび抗リン酸化p38抗体(BD Biosciences)で細胞を染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、20μLのFACS緩衝液に再懸濁した。CD20ならびにホスホ-PLCγ2、ホスホ-Aktおよびホスホ-p38の細胞発現を、Intellicyt iQUE(登録商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、PLCγ2、Aktおよびp38レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。
結果
PhosFlowアッセイ:図15のデータは、Fab-Kd-FabまたはBYbeいずれかのフォーマットで抗原CD79bおよび抗原CD22を標的とすることにより、抗IgMで刺激されたB細胞におけるリン酸化PLCγ2を阻害し得ることを示す。図16のデータは、Fab-Kd-FabまたはBYbeいずれかのフォーマットで抗原CD79bおよび抗原CD22を標的とすることにより、抗IgMで刺激されたB細胞におけるリン酸化P38を阻害し得ることを示す。図17のデータは、Fab-Kd-FabまたはBYbeいずれかのフォーマットで抗原CD79bおよび抗原CD22を標的とすることにより、抗IgMで刺激されたB細胞におけるリン酸化Aktを阻害し得ることを示す。
活性化マーカーアッセイ:図18に見られるように、このデータは、Fab-Kd-FabまたはBYbeいずれかのフォーマットで抗原CD79bおよび抗原CD22を標的とすることにより、抗IgMで刺激されたB細胞上のCD71の発現を阻害し得ることを示す。図19のデータは、Fab-Kd-FabまたはBYbeいずれかのフォーマットで抗原CD79bおよび抗原CD22を標的とすることにより、抗IgMで刺激されたB細胞上のCD40の発現を阻害し得ることを示す。図20のデータは、Fab-Kd-FabまたはBYbeいずれかのフォーマットで抗原CD79bおよび抗原CD22を標的とすることにより、抗IgMで刺激されたB細胞上のCD86の発現を阻害し得ることを示す。
分子的に連結された二重特異性Bybeフォーマットと、インビボ半減期の延長のために抗アルブミン結合ドメインがさらに加えられたものとにおける、抗原CD79b+抗原CD22同時標的化の活性の比較。
序論:ヘテロ二量体的につながれたスクリーニング複合体であるFab-Kd-Fabにおいて同定されたCD79b/CD22標的対活性が、抗アルブミン標的化によるインビボ半減期延長を有する、治療的に可能性のある分子的に連結されたフォーマットで同様の望ましい活性に変換され得ることを確認するために、抗アルブミン抗体断片を、配列SGGGGSGGGGS(配列番号17)を有するリンカーを介して、実施例8に記載のBYbeフォーマットの、抗原CD22に対するFabの軽鎖に融合させた。抗原CD79b特異性(VR4447)および抗原CD22特異性(VR4130およびVR4126)を、抗アルブミン断片(VR0645)を加えた場合と、および加えない場合とでBybeフォーマットで作製した。
この実験で使用された構築物の説明。
Figure 0006998857000013
方法
抗アルブミンというさらなる特異性を有する/有さないBYbeの精製
BYbe(Fab-dsscFv[Fab重鎖のC末端のscFv])および抗アルブミンを有するBYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重鎖および軽鎖のC末端のscFv])フォーマットを以下のようにして精製した。標準的なexpiHEKまたはCHO発現からの清澄化された細胞培養上清を、0.22μmで滅菌濾過した。濾過した上清を、PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)で平衡化した50mlのGammabindPlus Sepharose XK26カラム(GE Healthcare)に2ml/分で負荷した。負荷後、カラムをPBS pH7.4で洗浄し、次いで0.1Mグリシン/HCl、pH2.7で溶出した。溶出に続いて280nmでの吸光度を測定し、溶出ピークを集め、次いで1/25容積の2M Tris/HCl、pH8.5で中和した。中和された試料を、10kDaまたは30kDaいずれかの分子量カットオフ膜を有するAmicon Ultra-15濃縮器およびスイングアウトローターにおける4000xgでの遠心分離を使用して濃縮した。濃縮した試料を、pH7.4のPBSで平衡化したXK16/60またはXK26/60 Superdex 200カラム(GE Healthcare)のいずれかに適用した。カラムは、それぞれ1ml/分または2.6ml/分いずれかのPBSの定組成勾配、pH7.4で展開した。画分を回収し、TSKゲルG3000SWXL;5μm、7.8×300mmカラム、1ml/分で0.2Mリン酸塩、pH7.0の定組成勾配で展開、のサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、280nmにおける吸光度によって検出した。選択された単量体画分をプールし、10kDaまたは30kDaの分子量カットオフ膜を有するAmicon Ultra-15濃縮器およびスイングアウトローターにおける4000xgでの遠心分離を使用して1mg/ml超に濃縮した。最終試料をアッセイした;濃度は、A280スキャンUV-可視分光光度計(Cary 50Bio)による;単量体%は、TSKゲルG3000SWXL;5μm、7.8×300mmカラム、1ml/分で0.2Mリン酸塩、pH7.0の定組成勾配で展開、のサイズ排除クロマトグラフィーにより、および検出は280nmにおける吸光度による;還元型および非還元型SDS-PAGEを4-20%トリス-グリシン1.5mmゲル(Novex)において50mA(ゲルあたり)で53分間行い、エンドトキシンについては、Limulus Amebocyte Lysate(LAL)試験カートリッジを備えたCharles RiverのEndoSafe(登録商標)ポータブル試験システムによるものであった。
100nMの各構築物精製タンパク質を、5人の別個のドナー由来のヒトPBMCとともに、RMPI1640培地+10%ウシ胎仔血清および2mMのGlutamax(R10培地)において37℃/5%COで60分間プレインキュベートした。60分後、B細胞のみを刺激するように設計されたヤギ抗IgM抗体、25ug/mlにより細胞を刺激した。24時間後、プレートを氷上に置き、すべてのさらなる細胞活性化を停止させた後、氷冷したフローサイトメトリー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN)で1回洗浄した。すべての上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁した。細胞を氷上に置き、抗-CD19、-CD20、-CD27、-CD71およびCD86抗体のカクテルを添加した。細胞を60分間インキュベートした後、フローサイトメトリー緩衝液で2回洗浄した。抗-CD27、-CD71およびCD86のCD19/CD20陽性B細胞への結合に関するデータを、iQUEハイスループットフローサイトメーターを使用して作成した。Forecytソフトウェアを使用してヒストグラムを作成し、B細胞に対する抗-CD27、-CD71およびCD86抗体の結合についての幾何平均強度の読み取り値を得た。このデータをExcelにインポートして、阻害パーセンテージの値を各組合せに対して作成した。次いで、データをGraphpad Prismにインポートし、「+」で示される平均を有する各組合せについて箱ひげ図(box and whisker chart)を作成した。
図21は、VR4447/VR4126 BYbeおよびVR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンにより誘導される、B細胞上のCD27発現の阻害を示す。5人の被験ドナーにわたって、両者は、抗IgM誘導性CD27に対して一貫して同様のレベルの阻害を示した。図22は、VR4447/VR4126 BYbeおよびVR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンにより誘導される、B細胞上のCD71発現の阻害を示す。5人のドナーにわたって、両者は、抗IgM誘導性CD71に対して一貫して同様のレベルの阻害を示した。図23は、VR4447/VR4126 BYbeおよびVR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンにより誘導される、B細胞上のCD86発現の阻害を示す。5人のドナーにわたって、両者は、抗IgM誘導性CD86に対して一貫して同様のレベルの阻害を示した。
図24は、VR4447/VR4130 BYbeおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンにより誘導される、B細胞上のCD27発現の阻害を示す。5人の被験ドナーにわたって、両者は、抗IgM誘導性CD27に対して一貫して同様のレベルの阻害を示した。図25は、VR4447/VR4130 BYbeおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンにより誘導される、B細胞上のCD71発現の阻害を示す。5人のドナーにわたって、両者は、抗IgM誘導性CD71に対して一貫して同様のレベルの阻害を示した。図26は、VR4447/VR4130 BYbeおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンにより誘導される、B細胞上のCD86発現の阻害を示す。5人のドナーにわたって、両者は、抗IgM誘導性CD86に対して一貫して同様のレベルの阻害を示した。
抗アルブミンをさらに加えた場合と、または加えない場合との、分子的に連結された二重特異性Bybeを使用した、メモリーB細胞機能に対する抗原CD79b+抗原CD22の同時標的化の効果。
序論:CD79b/CD22の標的化が長期培養でB細胞に機能的効果を有するかどうかを評価するために、単離培養またはPBMCとの混合培養におけるB細胞からのIgG産生を測定した。リコール抗原破傷風トキソイドに対する特異的抗体の測定は、メモリーB細胞機能の読み出しを提供する。
抗原CD79b特異性(VR4447)および抗原CD22特異性(VR4126、VR4127およびVR4130)を、抗アルブミン断片(VR0645)を加えた場合と、または加えない場合とでBYbeフォーマットで作製した。抗アルブミン抗体断片を、配列SGGGGSGGGGS(配列番号17)を有するリンカーを介して、実施例8に記載のBYbeフォーマットの抗原CD22に対するFabの軽鎖に融合させた。
この実験で使用された構築物の説明。
Figure 0006998857000014
方法
抗アルブミンというさらなる特異性を有する/有さないBYbeの精製
BYbe(Fab-dsscFv[Fab重鎖のC末端のscFv])および抗アルブミンを有するBYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重鎖および軽鎖のC末端のscFv])フォーマットを実施例9に記載のようにして精製した。
B細胞の活性化および破傷風トキソイド特異的IgGの測定
ヒトPBMCまたは3人までの別々のドナー由来の精製B細胞を、1640培地+10%ウシ胎仔血清および2mMのGlutamax(R10培地)中で、500ng/mlのCD40L、1ug/mlのCpGおよび50ng/mlのIL-21により6日間刺激した。精製タンパク質の構築物を、0日目に100nMの最終濃度で添加し、アッセイ期間中、培養培地中に保持した。6日後、上清を採取し、破傷風トキソイド特異的IgGの量をELISAによって検出した。簡潔には、MaxisorpハーフウェルELISAプレート(Nunc)を、PBS中10ug/ml破傷風トキソイドで4℃において一晩コーティングした。次いで、プレートを、0.05%Tween20を含むPBS中5%ミルク中で2時間ブロックした。上清を希釈し、次いで室温で2時間添加した。プレートをPBS-0.05%Tween20で洗浄し、破傷風結合抗体を、5%ミルク-PBS-0.05%Tween20で1ug/mlに希釈したペルオキシダーゼ-ヤギ抗ヒトIgG(H+L)を使用して検出した。TMB基質溶液(KPL)を用いてプレートを発色させ、Synergy 2マイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して吸光度を450nMにおいて測定した。データをExcelにエクスポートし、試験抗体なしで培養した細胞と比較して阻害パーセンテージを計算した。次いで、データをGraphpad Prism(登録商標)にインポートし、棒グラフとしてプロットした。
図27は、VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbeおよびVR4447/VR4130 BYbeとともに培養したPBMCによる破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。データは、3人のドナーからプールされたデータを表す。
図28は、VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbeおよびVR4447/VR4130 BYbeとともに培養した精製B細胞による破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。データは、2人のドナーからプールされたデータを表す。
図29は、VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe、VR4447/VR4130 BYbe、VR4447/VR4126/VR645 BYbe/アルブミンおよびVR4447/VR4130/VR645 BYbe/アルブミンとともに培養した、PBMCまたは精製B細胞のいずれかによる破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。示されたデータは単一ドナー由来である。
SLE患者B細胞におけるBCRシグナル伝達の調節不全およびSLE B細胞機能に対する抗原CD79b+抗原CD22の同時標的化の効果。
序論:CD79b/CD22の組合せが自己免疫疾患の人々を治療するために使用できるかどうかを評価するために、本発明者らは全身性エリテマトーデス(SLE)患者由来のB細胞をモデル系として使用した。CD79b/CD22の組合せ(VR4447/VR4130)の影響を、B細胞機能に関与することが知られているが、健常なボランティアと比較してSLE患者で調節不全であるシグナル伝達タンパク質の活性化状態について試験した。この実験では、12人のSLE患者および12人の健常なボランティア由来のB細胞を、活性化状態にあるCD79bおよびCD22を同時標的化する効果について比較した。
方法:
PhosFlowアッセイ:すべてのアッセイは、2x10 PBMC/ウェルを使用して行った。
処理した試料において、抗原CD79bおよび抗原CD22特異的BYbeを、100nMの濃度で試験した。健常なボランティアおよびSLE患者由来の両方のPBMCをBYbeとともに37℃で90分間プレインキュベートした。未処理試料では、このインキュベーション期間中にBYbeは単に省略された。この後、25μg/mLのヤギF(ab’)抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)により細胞を37℃+5%COにおいて10分間活性化し、固定液(Cytofix-BD Biosciences)の添加により反応を停止させた。非刺激試料では、抗ヒトIgMは、このインキュベーション期間中に単に省略された。室温で15分後、細胞をペレット化し(500xgで5分間)、次いで氷冷perm buffer III(BD Biosciences)に再懸濁し、その後フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN+2mM EDTA)で2回洗浄した。次いで、細胞を抗-CD20、抗リン酸化(p)NF-κB、抗pSyk、抗pAtkならびに抗pErk1および2で染色し、暗所において室温で1時間インキュベートした。最後に、プレートをフロー緩衝液で2回洗浄した後、iQUEフローサイトメーター(Intellicyt)で測定した。次に、B細胞におけるpNF-κB、pSyk、pAktならびにpErk1および2の発現の幾何平均(平均蛍光強度、MFI)を計算し、グラフ形式で表した。
結果:
図30は、NF-κB、Syk、AktならびにErk1および2(非刺激および未処理)のリン酸化ベースラインが、健常なボランティア由来B細胞と比較して、SLE患者のB細胞において上昇することを示す。
図31~34は、CD79/CD22 BYbeが、健常なボランティアおよびSLE患者においてpNF-κB、pSyk、pAktならびにpErk1および2を等しく阻害し得ることを示す。
結論:
このデータは、健常なボランティアと比較した場合、SLE患者由来のB細胞がすべてのインビトロ刺激の前に活性化されることを示す。B細胞受容体を介して細胞を刺激すると、健常なボランティアおよびSLE患者の両方は、バックグラウンドシグナルと比較して高レベルの活性化を示す。健常なボランティアおよびSLE患者の両方において、このシグナルは、CD79b/CD22の組合せによって実質的にブロックされる。このデータは、CD79b/CD22の組合せが、健常なボランティアおよび基礎自己免疫疾患を有する人々に由来する両方のB細胞を阻害できることを示し、この経路がB細胞活性化に本質的に重要であることを示している。
CD45 Fab/CD79Fab二重特異性複合体はAktシグナル伝達を阻害するが、CD45とCD79 Fabとの混合物または二価CD79 Fab複合体は前記シグナル伝達を阻害しない
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD45およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-A(Fab-scFv)とFab-B(Fab-ペプチド)またはFab-A(Fab-ペプチド)とFab-B(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性抗体または二価抗体のグリッドを作製した。このグリッドを表10に示す。
表10:CD45およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せのグリッド。
Figure 0006998857000015

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である
FabA-XとFabB-YまたはFab-A-YとFab-B-Yを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMCと二重特異性または二価との組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で8分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。その後、プレートを室温で15分間放置した後、500gで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。次いで、細胞を、蛍光標識抗CD20抗体(BD Biosciences)およびタンパク質の473位の改変セリン残基を認識する蛍光標識抗ホスホAkt抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20およびAktの細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、Aktレベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。CD45およびCD79bの組合せの相対的効果を表11に示す(↓=阻害、↑=刺激および⇔=全体的効果なし)。
表11:CD45およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異的および二価の組合せに対するリン酸化Akt阻害の相対効力の表。
Figure 0006998857000016

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である。
このデータは棒グラフの形でも示され(図35)、データは平均値を表し、エラーバーは95%信頼区間である。このデータは、CD45とCD79bとの二重特異的組合せが、抗IgMで刺激されたB細胞におけるホスホAkt発現を阻害することができ、二重特異性を形成することができない混合物であるCD79b-YとCD79b-Yとの組合せは前記発現を阻害できないことを示している。
CD45 Fab/CD79Fab二重特異性複合体はPLCγ2シグナル伝達を阻害するが、CD45とCD79 Fabとの混合物または二価CD79 Fab’複合体は前記シグナル伝達を阻害しない
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD45およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab-a(Fab-scFv[A-X])とFab’-B(Fab-ペプチド[B-Y])またはFab-A(Fab-ペプチド)とFab-B(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性抗体または二価抗体のグリッドを作製した。このグリッドを表10に示す。
Fab’A-XとFab’B-YまたはFab-A-YとFab-B-Yを一緒に90分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMCと二重特異性または二価との組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で8分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。その後、プレートを室温で15分間放置した後、500gで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、細胞を、蛍光標識抗CD20抗体(BD Biosciences)およびタンパク質の759位の改変チロシン残基を認識する蛍光標識抗ホスホPLCγ2抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20およびPLCg2の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、PLCγ2レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。CD45およびCD79bの組合せの相対的効果を表12に示す(↓=阻害、↑=刺激および⇔=全体的効果なし)。
表12:CD45およびCD79bに対する特異性を有する抗体の二重特異性および二価の組合せに対するリン酸化PLCg2阻害の相対効力の表。
Figure 0006998857000017

XはscFvであり、Yはペプチドである
このデータは棒グラフとしても表すことができ(図36)、データは平均値を表し、エラーバーは95%信頼区間である。このデータは、CD45とCD79bとの二重特異的組合せが、抗IgMで刺激されたB細胞におけるホスホPLCγ2発現を阻害し、二重特異性を形成することができない混合物であるCD79b-YとCD79b-Yとの組合せは前記発現を阻害しないことを示している。
二重特異性CD45およびCD79b複合体は、B細胞上のCD86の発現を強力に阻害することができる。
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、DMEM(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、細胞表面タンパク質CD45およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(500nM)量のFab-X(Fab-scFv)とFab-Y(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含むDMEMで希釈することによって、二重特異性の組合せを作製した。次いで、これらの組合せを2.5希釈で1段階ずつ8段階に希釈して、この組合せについて用量漸増を作成した。Fab-XとFab-Yとを一緒に90分間(37℃/5%CO2環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレートに2.5×105のPBMCを添加した。次いで、PBMCをFab’-XおよびFab’-Yの組合せに加え、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、B細胞を、200nMのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を37℃で24時間添加することにより活性化した。細胞表面活性化マーカーの検出を可能にするために、プレートを氷上に置き、氷冷フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN3)で1回洗浄した。次いで、細胞を蛍光標識抗CD19抗体(BD Biosciences)および蛍光標識抗CD86抗体で染色し、暗所で1時間氷上でインキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、25ulのフロー緩衝液に再懸濁した。CD19およびCD86の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを用いて測定した。データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、CD86レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。図37に見られるように、CD45-X/CD79b-Yの組合せの滴定は、24時間後のB細胞上の抗IgM誘導性CD86発現を阻害することができた。Graphpad Prism 6を用いた4パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて外挿したIC50は4.7nMであった(データは平均値を表し、エラーバーは標準偏差である)。
CD45およびCD79b二重特異性タンパク質の阻害効果は、異なる抗体V領域を用いて再生することができる
免疫化:抗原CD79aおよびCD79bおよびCD45をコードするDNAを、遺伝子合成または商業的供給源によって得て、強い構成的プロモーターを有する発現ベクターにクローニングした。次いで、プラスミドDNAを、インハウスエレクトロポレーションシステムを使用してRab-9ウサギ線維芽細胞(ATCC(登録商標)CRL-1414(商標))にトランスフェクトした。CD79免疫化のために、CD79aおよびCD79bの両方を同時トランスフェクトした。24時間後、細胞をフローサイトメトリーにより抗原発現について検査し、使用まで液体窒素中でアリコートで凍結した。同じ細胞上で同時発現させるか、または単一または複数のトランスフェクトされた細胞の混合物を作製することによって、ウサギ1羽あたり最大6つの抗原を免疫化した。ウサギを3用量の細胞で免疫化した。
抗体発見:B細胞培養物を、Zublerら(1985年)によって記載された方法と同様の方法を用いて調製した。簡潔には、免疫化ウサギ由来の脾臓またはPBMC由来B細胞を、10% FCS(PAA laboratories ltd)、2% HEPES(Sigma Aldrich)、1%L-グルタミン(Gibco BRL)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Gibco BRL)、0.1%β-メルカプトエタノール(Gibco BRL)、3%の活性化脾臓細胞培養上清およびガンマ線照射変異体EL4マウス胸腺腫細胞(5x10/ウェル)を補充した200μl/ウェルのRPMI1640培地(Gibco BRL)を含むバーコード化96ウェル組織培養プレート中で、ウェルあたり約2000~5000細胞の密度で、37℃、5%CO雰囲気下で7日間培養した。
B細胞培養上清中の抗原特異的抗体の存在を、CD79aおよびCD79bまたはCD45で同時トランスフェクトしたHEK293細胞を使用して、均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して測定した。スクリーニングは、10ulの上清を、バーコード化96ウェル組織培養プレートから、Matrix Platemateリキッドハンドラーを用いて標的抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞(約3000細胞/ウェル)を含むバーコード化384ウェル黒色アッセイプレートに移すことを含む。結合は、ヤギ抗ウサギIgGFcγ特異的Cy-5コンジュゲート(Jackson)を用いて明らかにした。プレートを、Applied Biosystems 8200細胞検出システムで読み取った。
一次スクリーニング後、陽性上清を、Aviso Onyxヒットピッキングロボットおよび-80℃で凍結させた細胞培養プレート中のB細胞を使用して、96ウェルバーコード化マスタープレートに固定させた。次に、マスタープレートを、CD79aおよびCD79bまたはCD45抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞または抗原源として組換えCD45タンパク質でコーティングされたSuperavidin(商標)ビーズ(Bangs Laboratories)について、均一蛍光ベースの結合アッセイでスクリーニングした。これは各ウェルの抗原特異性を決定するために行った。
対象のウェルの選択から抗体可変領域遺伝子を回収するために、にデコンボリューションステップを実施して、B細胞の異種集団を含む所定のウェル中の抗原特異的B細胞の同定を可能した。これは、蛍光フォーカス法(Clargoら、2014年。Mabs 2014年1月1日:6(1)143-159頁;欧州特許第1570267号明細書)を使用して達成した。簡潔には、陽性ウェル由来の免疫グロブリン分泌B細胞を、標的抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞またはビオチン化標的抗原でコーティングしたストレプトアビジンビーズ(New England Biolabs)のいずれかと、最終希釈1:1200のヤギ抗ウサギFcγ断片-特異的FITCコンジュゲート(Jackson)と混合した。37℃で1時間静的インキュベーションした後、抗原特異的B細胞は、そのB細胞を取り囲む蛍光ハローの存在により同定することができた。次いで、オリンパス顕微鏡を使用して同定された多数のこれらの個々のB細胞クローンをエッペンドルフマイクロマニピュレーターで採取し、PCRチューブに入れた。蛍光フォーカス法は、免疫化ウサギの骨髄に直接由来するB細胞の異種集団から、抗原特異的B細胞を同定するためにも使用した。
重鎖および軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写(RT)-PCRによって単一細胞から抗体可変領域遺伝子を回収した。可変領域を、マウスFab-XおよびFab-Y(VH)またはマウスκ(VL)哺乳動物発現ベクターにクローニング可能にする制限部位を3’および5’末端に組み込んだネステッド二次PCRを用いて、2回のPCRを行った。Fab-XおよびFab-Y発現ベクターのための重鎖および軽鎖構築物を、Fectin 293(Life Technologies)を使用してHEK-293細胞に、またはExpifectamine(Life Technologies)を使用してExpi293細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体を、5mlの容量の6ウェル組織培養プレートで発現させた。5~7日の発現後、上清を回収した。上清を、抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞および組換えタンパク質または抗原トランスフェクトHEK細胞でコーティングしたSuperavidin(商標)ビーズ(Bangs Laboratories)について、均一蛍光ベースの結合アッセイで試験した。これは、クローニングされた抗体の特異性を確認するために行った。
小規模なFab A-XおよびFab B-Yの作製(小規模(50mL)なExpi293のトランスフェクション)
Expi293細胞をExpi293(商標)発現培地において最終濃度0.5×10生存細胞/mLまで日常的に継代培養し、オービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)で120rpm、8%COおよび37℃でインキュベートした。
トランスフェクションの日に、細胞の生存率および濃度を、自動細胞カウンター(Vi-CELL、Beckman Coulter)を用いて測定した。2.5x10生存細胞/mLの最終細胞濃度を達成するために、適切な容積の細胞懸濁液を250mLの滅菌三角振盪フラスコに添加し、各50mLのトランスフェクションに対して、新鮮な予熱したExpi293(商標)発現培地を添加することにより容積42.5mLにした。
各トランスフェクションのための脂質-DNA複合体を調製するために、全量50μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNAをOpti-MEM(登録商標)I培地(LifeTechnologies)で総容積2.5mLに希釈し、135μLのExpiFectamine(商標)293試薬(LifeTechnologies)をOpti-MEM(登録商標)I培地で総容積2.5mLに希釈した。すべての希釈液を穏やかに混合し、室温で5分以内インキュベートした後、各DNA溶液をそれぞれの希釈したExpiFectamine(商標)293試薬に加えて、総容積5mLとした。DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬混合物を穏やかに混合し、室温で20~30分間インキュベートして、DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を形成させた。
DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体のインキュベーションが完了した後、5mLのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を各振盪フラスコに添加した。振盪フラスコを、120rpm、8%COおよび37℃でオービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)中でインキュベートした。
トランスフェクションの約16~18時間後、250μLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1(LifeTechnologies)および2.5mLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー2(LifeTechnologies)を各振盪フラスコに添加した。
トランスフェクションの7日後に細胞培養物を収穫した。細胞を50mLのスピンチューブ(Falcon)に移し、4000rpmで30分間遠心沈殿させた後、0.22umのStericup(Merck Millipore)を通して滅菌濾過した。清澄化し滅菌濾過した上清を4℃において保存した。最終発現レベルを、プロテインG-HPLCによって決定した。
小規模(50ml)精製:Fab-XおよびFab-Yの両方を、小規模の真空系精製システムを使用した親和性捕捉によって別々に精製した。簡潔には、50mlの培養上清を0.22μmで滅菌濾過した後、500μLのNiセファロースビーズ(GE Healthcare)を添加した。次いで上清とビーズとの混合物を約1時間回転させてから、上清を真空を適用することによって除去した。次いでビーズを洗浄液1(50mMリン酸ナトリウム1M NaCl、pH6.2)および洗浄液2(0.5M NaCl)で洗浄した。溶出は50mM酢酸ナトリウム、pH4.0+1M NaClで行った。溶出画分緩衝液をPBS(Sigma)、pH7.4に交換し、0.22μmで濾過した。最終プールを、A280スキャン、SE-UPLC(BEH200法)、SDS-PAGE(還元型および非還元型)によりアッセイし、エンドトキシンについてはPTS Endosafeシステムを使用してアッセイした。
血小板アフェレーシスコーン由来のヒトPBMCを凍結アリコートとして貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞を解凍し、RPMI 1640(Life Technologies)で洗浄し、37℃/5%COの環境に順応させた。この期間中、二重特異性、二価または抗体の混合物の組合せを、細胞表面タンパク質CD45およびCD79bに対する抗原特異性を有する、等モル(200nM)量のFab’-X(Fab-scFv)およびFab’-Y(Fab-ペプチド)を、10%ウシ胎仔血清、50単位/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを含有するRPMI1640で希釈することにより作製した。3つの異なるCD79b Fab-Yおよび2つの異なるCD45 Fab-Xのこれらの組合せを表13に示す。
表13:CD45およびCD79bに対する特異性を有する二重特異性タンパク質のグリッド。
Figure 0006998857000018

XはscFv(52SR4)であり、Yはペプチド(GCN4)である
FabA-XとFabB-Yとを一緒に60分間(37℃/5%CO環境で)インキュベートし、その後V底96ウェルプレート中で2.5×10のPBMCと混合した。次いで、PBMC+FabA-Xおよび/またはFabB-Yの組合せを、さらに90分間一緒にインキュベートした。この後、12.5μg/mLのヤギF(ab’)2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃で10分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。次いで、プレートを室温で15分間放置した後、500xgで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、フロー緩衝液(PBS+1%BSA+0.1%NaN+2mM EDTA)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、細胞を、蛍光標識抗CD20抗体(BD Biosciences)および759位の改変チロシン残基を認識する抗ホスホPLCγ2抗体で染色した。次いで、プレートを再懸濁し、暗所において室温で1時間インキュベートした。この後、プレートをさらに2回洗浄し、40μlのフロー緩衝液に再懸濁した。CD20およびPLCγ2の細胞発現は、Intellicyt HTFC(商標)フローサイトメーターを使用して測定した。
データ解析ソフトウェアパッケージForecyt(商標)(Intellicyt)を使用して、B細胞を他の細胞集団とは異なるものとして同定し、PLCγ2レベルの幾何平均を各ウェルについて計算した。次いで、すべてのデータを、最大応答(抗IgMのみ)からバックグラウンド(細胞のみ)を差し引いた阻害パーセンテージとして表した。
図38に見られるように、データは、異なる抗体V領域を有するCD45とCD79bとの組合せが、抗IgMで刺激されたB細胞におけるホスホ-PLCγ2発現を阻害できることを示す。
実施例7に前記の大型のパネルのグリッドスクリーニング
結果
各Fab-Kd-Fab(すなわち、A-X:Y-B(式中、AおよびBはFab断片である)]の組合せによるBCRシグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化の誘導の阻害パーセンテージを計算し、この実施例において、B細胞機能を阻害する新規な抗原の組合せを探しているが、陽性の組合せの基準は、V領域の少なくとも1つの組合せによる少なくとも2つホスホの読み出しの少なくとも30%の阻害として設定した。この閾値に従って、検査した315のうち11の新しい抗原対の組合せが、必要な基準を満たした。これは3.5%のヒット率を表し、所望の活性の組合せを見出すために多数の組合せをスクリーニングすることの重要性、およびCD79bとCD45の組合せの活性がどれほど稀であるかを示している。
図10-12は、抗原グリッドの交差特異性に関するデータを示す。値は、それぞれSyk、PLCγ2およびAKTのリン酸化の阻害パーセンテージ(活性化に対する負値)であり、評価された複数のV領域の組合せの平均を表す。315の異なる抗原の組合せが試験され、見てわかるように、抗体の異なる組合せによるBCRシグナル伝達に対する効果は、強い阻害、例えば、Fab-X上の抗原2(CD79b)と組み合わせたFab-Y上の抗原4(CD45)(ホスホSykの70.4%の阻害、図10)から活性化、例えば、X上の抗原6とY上の抗原11(-118.10%のホスホSyk、図10)へ有意に変化した。
図10-12に表される平均%値を表す各データ点は、Fab-X上の2(CD79b)とFab-Y上の抗原4(CD45)との抗原組合せについて、図39に示されている。この場合、異なる抗体V領域の10種類の異なる組合せを評価した。同じ抗原の組合せであるが、別の配向、すなわちFab-Y上の抗原2(CD79b)とFab-X上の抗原4(CD45)とを図40に示す。この場合、異なる抗体V領域の6種の異なる組合せを評価した。この場合もまた、すべてのV領域は阻害を示すが、最適なV領域の組合せを、この方法を用いて同定し、選択することができる。
ヘテロ二量体的につながれたタンパク質複合体中の精製抗CD79b Fab-Yによる、最適な抗CD45抗体V領域を選択するための、Fab-Xとして抗原CD45に対して一過性発現されたV領域のスクリーニング
序論:CD79b特異的V領域との組合せで二重特異性抗体としてB細胞シグナル伝達を阻害するCD45に対する新規V領域を、ヘテロ二量体的につながれたタンパク質複合体のグリッドスクリーニングを使用して同定した。CD45 V領域を、Fab-Xとして一過性発現させ、精製した抗CD79b Fab-Yと組み合わせた。B細胞シグナル伝達の活性化の阻害を測定して、最も強力な抗CD45および抗CD79b V領域を選択した。
抗原発現細胞の調製およびウサギの免疫化は、実施例6に記載した方法と同じ方法で行った。
抗体発見:B細胞培養物を、実施例6に記載した方法と同じ方法で調製した。
B細胞培養上清中の抗原特異的抗体のスクリーニングおよび抗原特異的B細胞の同定のためのデコンボリューション工程を、実施例6と同じ方法で決定した。
重鎖および軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写(RT)-PCRによって単一細胞から抗体可変領域遺伝子を回収した。可変領域を、マウスFab-Xおよびマウスκ(VL)哺乳動物発現ベクターにクローニング可能にする制限部位を3’および5’末端に組み込んだネステッド二次PCRを用いて、2回のPCRを行った。次いで、これらのベクターを293Fectin(Life Technologies)を使用してHEK-293細胞に、またはExpifectamine(Life Technologies)を使用してExpi293細胞に同時トランスフェクトし、6日間発現させた。上清を、抗原でトランスフェクトしたHEK293細胞および組換えタンパク質または抗原トランスフェクトHEK細胞でコーティングしたSuperavidin(商標)ビーズ(Bangs Laboratories)について、均一蛍光ベースの結合アッセイで試験した。これは、クローニングされた抗体の特異性を確認するために行った。
Fab-X一過性上清に加えて、陰性対照の擬似上清を、無関係の対照DNAを使用して同じ方法で調製した。
Fab-Xの発現レベルを、プロテインG-HPLCによって決定した。
精製されたFab-XおよびFab-Yの作製:精製Fab-XおよびFab-Yを、実施例6に記載した同じ方法を用いて調製した。
PhosFlowアッセイ:精製または一過性上清のいずれかのCD79b特異的Fab-YおよびCD45特異的Fab-Xを、200nMおよび90nMの等モル濃度で60分間(37℃および5%CO環境において)一緒にインキュベートした。擬似上清も正味含んだ。V底96ウェルプレートにおいて、5.0×10のPBMCをウェルに添加し、これに滴定したFab-XおよびFab-Yの組合せまたは擬似上清を添加した。次いで、この組合せおよび細胞をさらに90分間一緒にインキュベートした。この後、25μg/mLのヤギF(ab’)抗ヒトIgM(Southern Biotechnology)を添加することによって、B細胞を37℃+5%COで15分間活性化した。次いで、等量のCytofix緩衝液(BD Biosciences)を添加することにより、シグナル伝達反応を停止させた。次いで、プレートを室温で15分間放置した後、500xgで5分間遠心分離した。過剰の上清を細胞ペレットから捨て、FACS緩衝液(PBS+1%BSA+0.01%NaN+2mM EDTA)に再懸濁し、もう一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences)に30分間再懸濁してから、フロー緩衝液で2回洗浄した。
次いで、3つの異なる抗体カクテルの代わりに、1つのカクテルのみを使用したことを除いて、実施例6の抗体カクテルAについて記載したのと同じアッセイ濃度およびインキュベーション条件で、実施例6に記載のように細胞を染色した。
抗体カクテル=1:3のCD20 PerCp-Cy5.5+1:5のPLCγ2 AF88+1:10のAkt AF647+1:5のp38 MAPK PE(FACS緩衝液で希釈)。
結果
図41から46に見られるように、データは、Fab-Xにおける一過性発現された種々の抗原CD45 V領域とFab-Yにおける2つの異なる精製抗原CD79b V領域(VR447およびVR4450)との組合せが、B細胞活性化を異なるレベルで阻害できる(PLCγ2、p38およびAktの阻害によって測定される)ことを示しており、したがって、二重特異性フォーマットでのスクリーニングは、最適なV領域の組合せの選択を容易にする。一過性Fab-Xとの組合せを、精製CD45 Fab-X(VR4122)との参照の組合せと比較する。
抗アルブミンをさらに加えた場合と、または加えない場合との、分子的に連結された二重特異性Bybeを使用した、メモリーB細胞機能に対する抗原CD79b+抗原CD45の同時標的化の効果。
序論:CD79b/CD45の標的化が長期間の培養におけるB細胞に対する機能的効果を有することを確認するために、混合PBMC培養物中のB細胞からのIgG産生を測定した。リコール抗原破傷風トキソイドに対する特異的抗体の測定は、メモリーB細胞機能の読み出しを提供する。
抗原CD79b特異性(VR4447)および抗原CD45特異性(VR4248およびVR4133)を、抗アルブミン断片(VR0645)を加えた場合と、または加えない場合とでBYbeフォーマットで作製した。抗アルブミン抗体断片をBYbeフォーマットの抗原CD45 Fabの軽鎖に、実施例8に記載のように融合させた。
この実験で使用された構築物の説明。
Figure 0006998857000019
方法
抗アルブミンというさらなる特異性を有する/有さないBYbeの精製
BYbe(Fab-dsscFv[Fab重鎖のC末端のscFv])および抗アルブミンを有するBYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重鎖および軽鎖のC末端のscFvs])フォーマットを以下のようにして精製した。標準的なexpiHEKまたはCHO発現からの清澄化された細胞培養上清を、0.22μmで滅菌濾過した。濾過した上清を、PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)で平衡化した50mlのGammabindPlus Sepharose XK26カラム(GE Healthcare)に2ml/分で負荷した。負荷後、カラムをPBS pH7.4で洗浄し、次いで0.1Mグリシン/HCl、pH2.7で溶出した。溶出に続いて280nmでの吸光度を測定し、溶出ピークを集め、次いで1/25容積の2M Tris/HCl、pH8.5で中和した。中和された試料を、10kDaまたは30kDaいずれかの分子量カットオフ膜を有するAmicon Ultra-15濃縮器およびスイングアウトローターにおける4000xgでの遠心分離を使用して濃縮した。濃縮した試料を、pH7.4のPBSで平衡化したXK16/60またはXK26/60 Superdex 200カラム(GE Healthcare)のいずれかに適用した。カラムは、それぞれ1ml/分または2.6ml/分いずれかのPBSの定組成勾配、pH7.4で展開した。画分を回収し、TSKゲルG3000SWXL;5μm、7.8×300mmカラム、1ml/分で0.2Mリン酸塩、pH7.0の定組成勾配で展開、のサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、280nmにおける吸光度によって検出した。選択された単量体画分をプールし、10kDaまたは30kDaの分子量カットオフ膜を有するAmicon Ultra-15濃縮器およびスイングアウトローターにおける4000xgでの遠心分離を使用して1mg/ml超に濃縮した。最終試料をアッセイした;濃度は、A280スキャンUV-可視分光光度計(Cary 50Bio)による;単量体%は、TSKゲルG3000SWXL;5μm、7.8×300mmカラム、1ml/分で0.2Mリン酸塩、pH7.0の定組成勾配で展開、のサイズ排除クロマトグラフィーにより、および検出は280nmにおける吸光度による;還元型および非還元型SDS-PAGEを4-20%トリス-グリシン1.5mmゲル(Novex)において50mA(ゲルあたり)で53分間行い、エンドトキシンについては、Limulus Amebocyte Lysate(LAL)試験カートリッジを備えたCharles RiverのEndoSafe(登録商標)ポータブル試験システムによるものであった。
B細胞の活性化および破傷風トキソイド特異的IgGの測定
ヒトPBMCを、1640培地+10%ウシ胎仔血清および2mMのGlutamax(R10培地)中で、500ng/mlのCD40L、1ug/mlのCpGおよび50ng/mlのIL-21により6日間刺激した。精製タンパク質の構築物を、0日目に100nMの最終濃度で添加し、アッセイ期間中、培養培地中に保持した。6日後、上清を採取し、破傷風トキソイド特異的IgGの量をELISAによって検出した。簡潔には、MaxisorpハーフウェルELISAプレート(Nunc)を、PBS中10ug/ml破傷風トキソイドで4℃において一晩コーティングした。次いで、プレートを、0.05%Tween20を含むPBS中5%ミルク中で2時間ブロックした。上清を希釈し、次いで室温で2時間添加した。プレートをPBS-0.05%Tween20で洗浄し、破傷風結合抗体を、5%ミルク-PBS 0.05%Tween20で1ug/mlに希釈したペルオキシダーゼ-ヤギ抗ヒトIgG(H+L)を用いて検出した。TMB基質溶液(KPL)を用いてプレートを発色させ、Synergy 2マイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して吸光度を450nMにおいて測定した。データをExcelにエクスポートし、試験抗体なしで培養した細胞と比較して阻害パーセンテージを計算した。次いで、データをGraphpad Prism(登録商標)にインポートし、棒グラフとしてプロットした。
図47は、VR4447/VR4248 BYbe、VR4447/VR4133 BYbe、VR4447/VR4248/VR645 BYbe/アルブミン、およびVR4447/VR4133/VR645 BYbe/アルブミンと一緒に培養したPBMCの破傷風トキソイドIgG産生の阻害を示す。示されたデータは単一ドナー由来である。
ヒト化方法
前記実施例において得られ、図51に本明細書で提供される抗体のヒト化型を、ウサギ抗体V領域由来のCDRをヒト生殖系列抗体V領域フレームワークに移植することによって設計した。抗体活性回復の可能性を改善するために、ウサギV領域由来の多数のフレームワーク残基も設計されたヒト化配列中に保持した。これらの残基は、Adairら(1991年)(Humanised antibodies。国際公開第91/09967号パンフレット)によって概説されたプロトコルを使用して選択した。ドナーからアクセプター配列に移植されたCDRは、Chothia/Kabatの組合せの定義が使用されるCDRH1を除いて、Kabat(Kabatら、1987)によって定義されたとおりである(Adairら、1991年、Humanised antibodies.国際公開第91/09967号パンフレットを参照されたい)。一般に、ウサギ抗体のVH遺伝子は、選択されたヒトVHアクセプター遺伝子よりも短い。ヒトアクセプター配列とアライメントした場合、ウサギ抗体のVH領域のフレームワーク1は、典型的には、ヒト化抗体に保持されるN末端残基を欠いている。ウサギ抗体VH領域のフレームワーク3はまた、典型的には、ベータシート鎖DおよびEの間のループにおいて1つまたは2つの残基(75または75および76)を欠いている:ヒト化抗体において、ギャップは選択されたヒトアクセプター配列由来の対応する残基で満たされる。
ヒト化配列を図51に提供し、ドナー残基を太字および下線で示す。 変異体CDR配列もまた提供する。
抗体4450の特定の移植片を発現させ、試験した(実施例21を参照されたい)。
CD79 Ab 4447
ヒトV領域IGKV1D-13+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4447軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4447VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):グルタミン(Q2)、バリン(V3)、ロイシン(L36)、グルタミン(Q46)、ヒスチジン(H49)およびグルタミン(Q70)の1つまたは複数は、それぞれ、2、3、36、46、49および70位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合により、CDRL3を変異させて1対のシステイン残基を除去することができる(CDRL3変異体1またはCDRL3を変異させて、システイン残基を1つだけ除去することができる、CDRL3変異体2および3)。
ヒトV領域IGHV3-48+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を抗体4447の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4447 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V24)、イソロイシン(I48)、グリシン(G49)、リジン(K71)、セリン(S73)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、48、49、71、73および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV4-59+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4447の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4447 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V37)、フェニルアラニン(F67)、リジン(K71)、セリン(S73)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、37、67、71、73および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た:抗体および抗体断片のN末端でグルタミンからピログルタミン酸への変換が広く報告されている。
CD79 Ab 4450
ヒトV領域IGKV1-6+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4450軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4450VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アスパラギン酸(D3)およびグルタミン(Q70)の1つまたは複数は、それぞれ、3および70位(Kabatナンバリング)に保持され得る。場合によっては、CDRL3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRL3変異体1~3)。
ヒトV領域IGHV3-66+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4450の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4450 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V24)、イソロイシン(I48)、グリシン(G49)、セリン(S73)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、48、49、73および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV4-59+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4450の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4450 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V37)、フェニルアラニン(F67)、アルギニン(R71)、セリン(S73)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、37、67、71、73、78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。
CD22 Ab 4120
ヒトV領域IGKV1D-13+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4120軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4120VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):フェニルアラニン(F2)およびグルタミン酸(E3)の1つまたは複数は、それぞれ、2および3位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV3-33+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4120の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4120 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):ロイシン(L11)、イソロイシン(I48)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、11、48、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。
場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
ヒトV領域IGHV4-38-2+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4120の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4120 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、バリン(V37)、アラニン(A49)、フェニルアラニン(F67)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)、およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、37、49、67、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。
場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
CD22 Ab 4126
ヒトV領域IGKV1-5+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4126軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4126VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V3)およびグルタミン(Q70)の1つまたは複数は、それぞれ、3、および70位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV3-7+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4126の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4126 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合により、CDRH1、CDRH2およびCDRH3を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体、CDRH2変異体およびCDRH3変異体)。
ヒトV領域IGHV4-4+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4126の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4126 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、バリン(V48)、アラニン(A49)、フェニルアラニン(F67)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)、およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、48、49、67、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。
場合により、CDRH1、CDRH2およびCDRH3を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体、CDRH2変異体およびCDRH3変異体)。
CD22 Ab 4127
ヒトV領域IGKV1-5+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4127軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4127VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A1)、バリン(V3)およびグルタミン(Q70)の1つまたは複数は、それぞれ、1、3、および70位(Kabatナンバリング)に保持され得る。場合により、CDRL3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRL3変異体1~15)。
ヒトV領域IGHV3-9+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4127の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4127 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):ロイシン(L47)、イソロイシン(I48)、グリシン(G49)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)、バリン(V78)およびアルギニン(R94)の1つまたは複数は、それぞれ、47、48、49、71、73、76、78および94位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
ヒトV領域IGHV4-38-2+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4127の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4127 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、バリン(V37)、ロイシン(L47)、フェニルアラニン(F67)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)、およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、37、47、67、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
CD22 Ab 4128
ヒトV領域IGKV1-5+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4128軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4128VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V3)、フェニルアラニン(F36)、リジン(K63)、アスパラギン酸(D65)、アルギニン(R66)およびチロシン(Y71)の1つまたは複数は、それぞれ、3、36、63、65、66および71位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV3-33+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4128の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4128 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):ロイシン(L11)、リジン(K23)、グリシン(G24)、イソロイシン(I48)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、11、23、24、48、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
ヒトV領域IGHV4-59+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4128の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4128 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):リジン(K23)、グリシン(G24)、バリン(37)、アラニン(A49)、フェニルアラニン(F67)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、23、24、37、49、67、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
CD22 Ab 4130
ヒトV領域IGKV1-9+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4130軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4130VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A1)、アラニン(A2)およびバリン(V3)の1つまたは複数は、それぞれ、1、2および3位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV3-66+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4130の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4130 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):イソロイシン(I48)、グリシン(G49)、バリン(V67)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、48、49、67、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。場合により、CDRH2は、システイン残基を除去し、および/または潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH2変異体1-5)。CDRH3もまた、潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH3変異体1-2)。
ヒトV領域IGHV4-4+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4130の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4130 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合により、CDRH2は、システイン残基を除去し、および/または潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH2変異体1-5)。CDRH3もまた、潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH3変異体1-2)。
CD22 Ab 4132
ヒトV領域IGKV1-5+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4132の軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4132VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V3)およびチロシン(Y71)の1つまたは複数は、それぞれ、3および71位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
ヒトV領域IGHV3-21+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4132の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4132 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):セリン(S48)、グリシン(G49)、アスパラギン(N71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、48、49、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、システイン残基を除去するように、CDRH1を変異させることができる(CDRH1変異体)。CDRH2もまた、システイン残基を除去し、および/または潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH2変異体1-5)。
ヒトV領域IGHV4-4+JH4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4132の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4132 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、セリン(S48)、フェニルアラニン(F67)、アスパラギン(N71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、48、67、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合によっては、システイン残基を除去するように、CDRH1を変異させることができる(CDRH1変異体)。CDRH2もまた、システイン残基を除去し、および/または潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH2変異体1-5)。
CD45 Ab 4122
ヒトV領域IGKV1-5+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4122軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4122VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):チロシン(Y71)は、71位(Kabatナンバリング)に保持され得る。場合によっては、CDRL3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRL3変異体1-2)。
ヒトV領域IGHV3-7+JH2 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4122の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4122 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):イソロイシン(I48)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、48、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、システイン残基を除去するように、CDRH1を変異させることができる(CDRH1変異体)。CDRH2もまた、システイン残基を除去し、および/または潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH2変異体1-7)。
ヒトV領域IGHV2-70+JH2 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4122の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4122 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、バリン(V37)、グリシン(G44)、イソロイシン(I48)、フェニルアラニン(F67)、セリン(S73)およびスレオニン(T76)の1つまたは複数は、それぞれ、24、37、44、48、67、73および76位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合によっては、システイン残基を除去するように、CDRH1を変異させることができる(CDRH1変異体)。CDRH2もまた、システイン残基を除去し、および/または潜在的なアスパラギン脱アミド部位を改変するように変異させることができる(CDRH2変異体1-7)。
CD45 Ab 4129
ヒトV領域IGKV1-5+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4129軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4129VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):グルタミン(Q70)は、70位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRL3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRL3変異体1-2)。
ヒトV領域IGHV3-7+JH2 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4129の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4129 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):イソロイシン(I48)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、48、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
ヒトV領域IGHV2-70+JH2 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4129の重鎖CDRのための別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4129 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、バリン(V37)、グリシン(G44)、イソロイシン(I48)、フェニルアラニン(F67)、セリン(S73)およびスレオニン(T76)の1つまたは複数は、それぞれ、24、37、44、48、67、73および76位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。
CD45 Ab 4131
ヒトV領域IGKV1-12+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4131軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4131VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):バリン(V3)およびリジン(K63)の1つまたは複数は、それぞれ3および63位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRL3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRL3変異体1~3)。
ヒトV領域IGHV3-7+JH2 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4131の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4131 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):イソロイシン(I48)、バリン(V69)、グルタミン酸(E71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)、およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、48、69、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(CDRH2変異体)。
ヒトV領域IGHV4-31+JH2 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4131の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4131 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、バリン(V37)、アラニン(A49)、フェニルアラニン(F67)、バリン(V69)、グルタミン酸(E71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)、およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、37、49、67、69、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。
場合によっては、CDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(CDRH2変異体)。
CD45 Ab4133
ヒトV領域IGKV1D-13+JK4 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4133軽鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4133VK遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):グルタミン(Q2)、バリン(V3)およびグルタミン(Q70)の1つまたは複数は、それぞれ、2、3、および70位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRL1を、潜在的N-グリコシル化部位を除去するように変異させることができる(CDRL1変異体1-2)。
ヒトV領域IGHV3-21+JH1 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4133の重鎖CDRのアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4133 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):イソロイシン(I48)、グリシン(G49)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、48、49、71、73、76および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。
場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。CDRH3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRH3変異体1-3)。
ヒトV領域IGHV4-4+JH1 J領域(IMGT、http://www.imgt.org/)を、抗体4133の重鎖CDRの別のアクセプターとして選択した。CDRに加えて、4133 VH遺伝子由来の以下のフレームワーク残基(ドナー残基):アラニン(A24)、リジン(K71)、セリン(S73)、スレオニン(T76)およびバリン(V78)の1つまたは複数は、それぞれ、24、71、73、76、および78位(Kabatナンバリング)に保持され得る。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基をグルタミン酸(E1)で置換して、均質な生成物の発現および精製を得た。
場合によっては、CDRH1およびCDRH2を、システイン残基を除去するように変異させることができる(それぞれCDRH1変異体およびCDRH2変異体)。CDRH3を、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変するように変異させることができる(CDRH3変異体1-3)。
カニクイザルB細胞に対する抗ヒトCD79 V領域の交差反応性の試験。
序論
結合研究をカニクイザルPBMCに対して行い、前臨床試験のために抗ヒトCD79 V領域が非ヒト霊長類B細胞と交差反応するかどうかを試験した。CD79 V領域VR4447およびVR4450をFab-Y精製分子として作製し、これらのV領域のB細胞への特異的結合を、Fab-Y構築物の定常領域に結合する抗マウス二次抗体を使用して検出した。
この実験で使用された構築物の説明。
Figure 0006998857000020
方法
Fab-Y分子の作製
抗CD79b(VR4447)および(VR4450)の親ウサギV領域を、記載(国際公開第2016/009030号パンフレット)のようにウサギB細胞から、前述のようにFab-Y構築物ベクターにクローニングした。
一過性発現および精製Fab-Y
Expi293細胞をExpi293(商標)発現培地において最終濃度0.5×10生存細胞/mLまで日常的に継代培養し、オービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)で120rpm、8%COおよび37℃でインキュベートした。
トランスフェクションの日に、細胞の生存率および濃度を、自動細胞カウンター(Vi-CELL、Beckman Coulter)を用いて測定した。2.94×10生存細胞/mLの最終細胞濃度を達成するために、適切な容積の細胞懸濁液を1Lの滅菌三角振盪フラスコに添加し、各200mLのトランスフェクションに対して、新鮮な予熱したExpi293(商標)発現培地を添加することにより容積170mLにした。
各トランスフェクションのための脂質-DNA複合体を調製するために、全量200μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNA(2:1の軽鎖:重鎖DNA比)をOpti-MEM(登録商標)I培地(LifeTechnologies)で総容積10mLに希釈し、540μLのExpiFectamine(商標)293試薬(LifeTechnologies)をOpti-MEM(登録商標)I培地で総容積10mLに希釈した。すべての希釈液を穏やかに混合し、室温で5分以内インキュベートした後、各DNA溶液をそれぞれの希釈したExpiFectamine(商標)293試薬に加えて、総容積20mLとした。DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬混合物を穏やかに混合し、室温で20~30分間インキュベートして、DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を形成させた。
DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体のインキュベーションが完了した後、20mLのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を各振盪フラスコに添加した。振盪フラスコを、120rpm、8%COおよび37℃でオービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)中でインキュベートした。
トランスフェクションの約16~18時間後、1mLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1(LifeTechnologies)および10mLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー2(LifeTechnologies)を各振盪フラスコに添加した。
トランスフェクションの7日後に細胞培養物を収穫した。細胞を50mLのスピンチューブ(Falcon)に移し、4000rpmで30分間遠心沈殿させた後、0.22umのStericup(Merck Millipore)を通して滅菌濾過した。清澄化し滅菌濾過した上清を4℃において保存した。最終発現レベルを、プロテインG-HPLCによって決定した。
Fab-Yを、小規模の真空系精製システムを使用した親和性捕捉によって精製した。簡潔には、200mlの培養上清を0.22μmで滅菌濾過した後、約2mLのNiセファロースビーズ(GE Healthcare)を添加した。次いで上清とビーズとの混合物を約1時間回転させてから、上清を真空を適用することによって除去した。次いでビーズを洗浄液1(50mMリン酸ナトリウム0.5M NaCl、pH6.2)および洗浄液2(0.5M NaCl)で洗浄した。溶出は50mM酢酸ナトリウム、pH4.0+1M NaClで行った。溶出画分をPBS(Sigma、)pH7.4に緩衝液交換し、0.22μmで濾過した。最終プールを、A280スキャン、SE-UPLC(BEH200法)、SDS-PAGE(還元型および非還元型)によりアッセイし、エンドトキシンについてはPTS Endosafeシステムを使用してアッセイした。
カニクイザル由来のB細胞に対する抗ヒトCD79 V領域の結合。
カニクイザルPBMCを、密度遠心分離を使用して全血から精製した。簡潔には、全血をRPMI培地で1:2に希釈し、次いでLympholyte(登録商標)哺乳動物分離培地(CedarLane)上に重層した。試料を加速およびブレーキなしで800gにおいて25分間遠心分離し、界面の細胞層を回収した。混入している赤血球を5mlのACK Lysis buffer(Gibco)を使用して5分間溶解させた。
単離したPBMCを96ウェル丸底プレートにプレーティングし、次いで低温結合緩衝液(PBS+0.5%BSA+0.1%アジ化ナトリウム)で洗浄した。VR4447およびVR4450 Fab-Y分子を、低温結合緩衝液中50ug/mlの濃度で細胞に添加した。30分間氷上で細胞を洗浄した後、低温結合緩衝液(Jackson ImmunoResearch)で10μg/mlに希釈したFITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG F(ab’)2を用いてFab-Y分子の結合を検出した。試料をBD FACS Canto II機器に取得し、FLOWJOソフトウェアを使用して結合を測定した。CD20抗体を使用してB細胞を同定した。結合は、FITC蛍光の幾何平均(geomean)または陽性細胞のパーセンテージのいずれかとして、B細胞(CD20+)について分析した。次いで、データをGraphpad Prism(登録商標)にインポートし、棒グラフとしてプロットした。
結果
図48および図49は、VR4447およびVR4450 Fab-Y分子のCD20+B細胞への結合を示す。データは、FITC蛍光の幾何平均(geomean)として、または陽性細胞のパーセンテージのいずれかとしてプロットされる。示されたデータは単一動物由来である。
抗CD79b V領域4450は、B細胞上のカニクイザルCD79bと交差反応性であるが、V領域4447は交差反応性ではない。
ヒト化抗CD79b V領域4450の異なる型の活性の評価
序論
VR4450のヒト化V領域の活性を評価するために、これらをFab-Y構築物にクローニングし、Fab-Y中の親ウサギ4450V領域とともに一過性に発現させ、精製した抗CD22 Fab-X(VR4130)とともに二重特異性抗体の作製に使用し、ヒトPBMCにおけるB細胞のBCRシグナル伝達の測定阻害による機能の試験を可能にした。
方法
抗CD79b(VR4450)および抗CD22(VR4130)の親ウサギV領域(図51)を、記載(国際公開第2016/009030号パンフレット)のウサギB細胞から、それぞれFab-YおよびFab-X構築物ベクターにクローニングした。ヒト化4450V領域を遺伝子合成によって作製し、Fab-Y構築物ベクターにクローニングした。
一過性発現Fab-XおよびFab-Y
Expi293細胞をExpi293(商標)発現培地において最終濃度0.5×10生存細胞/mLまで日常的に継代培養し、オービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)で120rpm、8%COおよび37℃でインキュベートした。
トランスフェクションの日に、細胞の生存率および濃度を、自動細胞カウンター(Vi-CELL、Beckman Coulter)を用いて測定した。2.94×10生存細胞/mLの最終細胞濃度を達成するために、適切な容積の細胞懸濁液を1Lの滅菌三角振盪フラスコに添加し、各200mLのトランスフェクションに対して、新鮮な予熱したExpi293(商標)発現培地を添加することにより容積170mLにした。
各トランスフェクションのための脂質-DNA複合体を調製するために、全量200μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNA(2:1の軽鎖:重鎖DNA比)をOpti-MEM(登録商標)I培地(LifeTechnologies)で総容積10mLに希釈し、540μLのExpiFectamine(商標)293試薬(LifeTechnologies)をOpti-MEM(登録商標)I培地で総容積10mLに希釈した。すべての希釈液を穏やかに混合し、室温で5分以内インキュベートした後、各DNA溶液をそれぞれの希釈したExpiFectamine(商標)293試薬に加えて、総容積20mLとした。DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬混合物を穏やかに混合し、室温で20~30分間インキュベートして、DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を形成させた。
DNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体のインキュベーションが完了した後、20mLのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を各振盪フラスコに添加した。振盪フラスコを、120rpm、8%COおよび37℃でオービタル振盪インキュベーター(Multitron、Infors HT)中でインキュベートした。
トランスフェクションの約16~18時間後、1mLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1(LifeTechnologies)および10mLのExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー2(LifeTechnologies)を各振盪フラスコに添加した。
トランスフェクションの7日後に細胞培養物を収穫した。細胞を50mLのスピンチューブ(Falcon)に移し、4000rpmで30分間遠心沈殿させた後、0.22umのStericup(Merck Millipore)を通して滅菌濾過した。清澄化し滅菌濾過した上清を4℃において保存した。最終発現レベルを、プロテインG-HPLCによって決定した。
精製
Fab-Xを、小規模の真空系精製システムを使用した親和性捕捉によって精製した。簡潔には、200mlの培養上清を0.22μmで滅菌濾過した後、約2mLのNiセファロースビーズ(GE Healthcare)を添加した。次いで上清とビーズとの混合物を約1時間回転させてから、上清を真空を適用することによって除去した。次いでビーズを洗浄液1(50mMリン酸ナトリウム0.5M NaCl、pH6.2)および洗浄液2(0.5M NaCl)で洗浄した。溶出は50mM酢酸ナトリウム、pH4.0+1M NaClで行った。溶出画分をPBS(Sigma、)pH7.4に緩衝液交換し、0.22μmで濾過した。最終プールを、A280スキャン、SE-UPLC(BEH200法)、SDS-PAGE(還元型および非還元型)によりアッセイし、エンドトキシンについてはPTS Endosafeシステムを使用してアッセイした。
スクリーニングアッセイ
ドナーPBMCを37℃に設定した水浴を用いて迅速に解凍し、浸透圧ショックを最小にするためにアッセイ培地(10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%Glutamaxを補充したRPMI-1640培地)に滴下して希釈した。細胞を500gで回転させ、その後上清を除去し、細胞をアッセイ培地に再懸濁した。次いで、細胞を計数し、5.0×10の細胞を、96ウェルV底プレート(Nunc)の各ウェルに添加し、37℃、5%COのインキュベーターにおいて1時間インキュベートした。
Fab-XおよびFab-Y試薬を、アッセイ培地中の最終アッセイ濃度の5倍で等モル比で混合し、37℃、5%COのインキュベーターにおいて1時間インキュベートした。適切なFab-KD-Fab混合物を100nMの開始濃度となるように細胞を含む試験ウェルに添加し(表14)、次いで2連で連続希釈(1:5)し、1000rpmで30秒間振盪により混合し、37℃、5%COのインキュベーターにおいて1時間インキュベートした。
次いで、最終濃度12.5μg/mlの抗ヒトIgM(Southern Biotech)で細胞を刺激し、一方、対照の非刺激細胞にはアッセイ培地を添加した。次いで、アッセイプレートを1000rpmで30秒間穏やかに混合した後、37℃、5%COのインキュベーターで8分間インキュベートした。アッセイを、氷冷BD CytoFixをすべてのウェルに添加することによって停止させ、室温で15分間インキュベートした。次いで固定された細胞を500gで5分間回転させて細胞をペレット化し、BioTek ELx405プレート洗浄器を用いて上清を除去した。プレートを2400rpmで30秒間ボルテックスすることにより、ペレットを再懸濁した。次いで、氷冷BD Cell Permeabilisation Buffer IIIを30分間添加することにより、細胞を4℃で透過処理した。次いで、細胞をFACS緩衝液(1%BSA、0.05%NaNおよび2mM EDTAを含むPBS)で洗浄し、500gで5分間回転させた。上清をELx405により再度除去した後、これを使用してFACS緩衝液をすばやく分注し、残留するすべての透過緩衝液を洗い流した。細胞を再び500gで回転させ、上清をELx405によって除去した。次いで、細胞をボルテックス(2400RPM、30秒)によって再懸濁した後、抗体カクテル(抗ヒトCD20(H1FB1)Alexa Fluor488(1:10希釈));抗ヒトAkt Alexa Fluor 647(1:10希釈))をすべてのウェルに添加した。次いで、プレートを1000rpmで30秒間振盪し、細胞を室温で45分間暗所においてインキュベートした。
次いで、細胞を500gで回転させながらFACS緩衝液中で2回洗浄し、各工程後に上清を除去した。最後に、細胞を2400rpmで30秒間ボルテックスして再懸濁した後、20μlのFACS緩衝液を添加した。その後、プレートをIntellicyt iQue plus計器で読み取った。
表14:プレートレイアウト
Figure 0006998857000021
表14(プレートレイアウト)-Fab-KD-Fab混合物をカラム2~11において100nMの開始濃度で二連に加えた。細胞を、カラム1~11に加えた抗ヒトIgMの最終濃度12.5μg/mlで刺激した。カラム1(MAX)は、Fab-KD-Fab混合物で処理していない抗ヒトIgM刺激細胞を含み、カラム12(MIN)は対照の非刺激/未処理細胞を含んだ。
試料
Figure 0006998857000022
結果
図50に見られるように、VR4450の4種すべてのヒト化型は、親ウサギVR4450V領域と類似の活性を有する。

Claims (23)

  1. CD79に特異的な結合ドメインを含む抗体分子であって、前記結合ドメインが以下を含む抗体分子:
    (a) 重鎖可変領域(VH)として、配列番号11のCDR H1、配列番号12のCDR H2、及び配列番号3のCDR H3を含むVH、ならびに軽鎖可変領域(VL)として、配列番号19のCDR L1、配列番号20のCDR L2ならびに配列番号21、22、23もしくは24のCDR L3を含むVL;又は
    (b) VHとして配列番号8のCDR H1、配列番号9のCDR H2、及び配列番号4のCDR H3を含むVH、ならびにVLとして配列番号13のCDR L1、配列番号14のCDR L2及び配列番号15、16、17もしくは18のCDR L3を含むVL。
  2. VHおよびVLがヒト化されている、請求項1に記載の抗体分子。
  3. 前記重鎖の可変ドメイン(VH)が、24、37、48、49、67、71、73、および78位の少なくとも1つの残基がドナー残基であるヒトフレームワーク領域を含み、前記軽鎖の可変ドメイン(VL)が、2、3、36、46、49および70位の少なくとも1つの残基がドナー残基であるヒトフレームワーク領域を含む、請求項2に記載の抗体分子。
  4. 配列番号34または35に示される配列を有するVHおよび配列番号33または250に示される配列を有するVLを含む、請求項2または3に記載の抗体分子。
  5. 配列番号41または42に示される配列を有するVHおよび配列番号40、341、342または343に示される配列を有するVLを含む、請求項2または3に記載の抗体分子。
  6. 完全長抗体である、請求項1からのいずれか一項に記載の抗体分子。
  7. scFv、Fv、FabまたはFab’断片である、請求項1からのいずれか一項に記載の抗体分子。
  8. 二重特異性または三重特異性などの多重特異性分子である、請求項1からのいずれか一項に記載の抗体分子。
  9. 分子フォーマットが、ダイアボディ、scダイアボディ、トリアボディ、タンデムscFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv) diFab、diFab’、トリボディ、タンデムscFv-Fc、scFv-Fc-scFv、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、DuobodyおよびDVD-Igから選択される、請求項1からのいずれか一項に記載の抗体分子。
  10. CD79に特異的な1つの結合ドメインおよびCD22またはCD45に特異的な1つの結合ドメインを含む、請求項またはに記載の抗体分子。
  11. 各結合ドメインが単一特異性である、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子。
  12. 前記CD22またはCD45に特異的な結合ドメインならびに前記CD79aおよび/またはCD79bに特異的な結合ドメインが、Fab、scFv、Fv、dsFvおよびdsscFvから独立して選択される、請求項10または11に記載の抗体分子。
  13. 前記1または複数の結合ドメインがヒト化されている、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体分子。
  14. すべての結合ドメインがヒト化されている、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体分子。
  15. 1または複数のCDR中の1または複数のアミノ酸が、システイン以外の別のアミノ酸で置換されている、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体分子。
  16. 1または複数のシステイン残基が別のアミノ酸で置換されている、請求項15に記載の抗体分子。
  17. 血清アルブミンに特異的な結合ドメインをさらに含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体分子。
  18. 血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項17記載の抗体分子。
  19. 請求項1から18のいずれか一項に記載の1または複数の抗体分子を含む組成物。
  20. 請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体分子をコードするポリヌクレオチド。
  21. 請求項20に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  22. B細胞の活性化による疾患の治療に使用するための、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体分子または請求項19に記載の組成物。
  23. 状態または障害の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体分子または請求項19に記載の組成物の使用。
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