KR20040094705A - 자가면역질환에 대한 시약 및 치료 방법 - Google Patents

자가면역질환에 대한 시약 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 독특한 생리학적 성질을 갖는 항-CD22 단클론 항체를 이용한 치료 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은, 순수한 인간 CD22(hCD22)의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인에, 또는 처음 두 개의 Ig-유사 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항-CD22 차단 단클론 항체를 유효량으로 투여함으로써, B-세포 악성종양 및 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

자가면역질환에 대한 시약 및 치료 방법{Reagents and treatment methods for autoimmune diseases}
본 출원은 2002년 2월 21일 자로 출원된 미국 가출원 제 60/359,419 호, 및 2002년 10월 21일 자로 출원된 미국 가출원 제 60/420,472호에 기하여 우선권을 주장하며, 상기 두 출원은 본 명세서에 그 전체 내용이 참고 문헌으로 통합되어 있다. 본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)으로부터의 승인 번호 CA 81776에 기초하여 발명되었다. 미국 정부가 본 발명의 특정 권리를 가지고 있다.
CD22는 거의 모든 B 림프구 및 대부분의 B-세포 림프종에서 발견되는 글리코포스포프로테인 막이다. 교차-결합된 CD22는, CD22 티로신 인산화를 유발하고, 스트레스로 활성화되는 단백질 키나아제 (SAPK) 경로를 활성화시키는 효과기 단백질 복합체를 조립한다. CD22 교차-결합은, 일차 B-세포에 강력한 공자극 신호를 제공하며, 신생 B-세포에는 프로-아폽토틱 신호를 제공한다. 구조적으로 볼 때, CD22는, 면역글로불린(Ig) 유전자 상과의 "시알로어드해신(sialoadhesin)" 아강에 속하며, 7개의 세포외 Ig 도메인을 갖는데, 그 중 하나는 아미노 말단 V-셋 Ig 도메인이고 6개는 C-2 셋 Ig 도메인이다. (참고: Wilson 외,J. Exp Med .173:137-146(1991); Engel 외,J. Esp. Med .181:1581-1586 (1995); 및 Torres 외,J. Immunol.149:2641-2649 (1992)). CD22는, 생리학적으로 적절한 부위에 신호 효과기 분자를 채용함으로써 B 림프구 항원 수용체(BCR) 신호를 양성 및 음성으로 조절하는, 중요한 림프구-특이적 신호 전달 분자라는 것이 나타나 있다. (참조: Tedder 외,Annu . Rev. Imnunol .15:481-504 (1997); Sato 외,Immunology10:287-297 (1998))
항-CD22 항체는 예를 들어, 미국 특허 5,484,892; 6,183,744; 6,187287; 6,254,868, 및 Uscano 외,Blood94(4):1382-92 (1999)에 기재되어 있다. 항-CD22 항체를 포함하는 단클론 항체를 비-호지킨(non-Hodgkin's) 림프종의 치료에 이용하는 것은, 예를 들어, Renner 외,Leukemia11(Suppl. 2):S55-9 (1997)에 검토되어 있다. 인간화된 항-CD22 항체, LymphoCideTM(empatuzumab, Immunomedics, Inc.)는, 지연형 및 공격형의 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 3상 임상 시험 중에 있다. 상기 항체의 이트륨-90-표지된 버전은 같은 징후에 대하여 현재 1상 임상 시험 중에 있다.
암 치료가 최근 발전되었지만, 만성 림프구 백혈병 및 비호지킨 림프종의 B-세포 아유형과 같은 B-세포 악성종양은 암으로 인한 사망에서 가장 큰 요인이다. 따라서, B-세포 악성종양 치료를 위한 더욱 개선된 치료적 처방에 대한 필요성이 매우 크다. 자가면역 질환은 대체로 상당한 질병(morbidity)과 장애를 유발한다. 1965년부터 1995년까지 수집된 발병률 데이터에 기초하면, 대략 1,186,015 명의 사람들이 향후 5년에 걸쳐서 새로운 자가면역 질환이 발병할 것이라는 것이 추정된다. Jacobsen 외. (Clin . Immunol . Immunopathol.84:223 (1997))는 130개 이상의 발표된 연구를 평가하여, 1996년에 미국 내 850만명(인구의 3.2%)의 사람들이 상기 연구들에서 시험된 24종의 자가면역 질환 중 적어도 하나를 갖는 것으로 추정했다. 자가면역 질환이 공중 보건에 미치는 큰 영향을 고려할 때, 효과적이고 안전한 치료법이 이들 질병을 다스리는데 필요하다. 따라서, 자가면역 질환을 치료하기 위한 개선된 시약과 방법에 대한 기술의 필요성이 있다.
본 발명은 독특한 생리학적 성질을 갖는 특정 항-CD22 단클론 항체의 치료적 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 독특한 프로-아폽토틱 성질을 갖는 항-CD22 차단 항체로써, 림프종 및 백혈병과 같은 B-세포 악성종양 및 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 Ig 유사 도메인(도메인 1-7)의 경계를 표시한, 인간 CD22(hCD22) 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는111In-2IT-BAD-항CD22(HB22-7)을 주사한, Raji 및 Ramos 종양을 가진 누드 마우스의 전신 자기방사사진이다. 주사한지 48시간 째에 마우스를 희생시켜서 자기방사촬영하였다. 상단 사진은 Raji-종양 마우스이고, 하단 사진은 Ramos-종양 마우스이다.
도 3은 시험 081500에서 125μCi 90Y-DOTA-펩티드-Lym-1(RIT) 단독, 항-CD22 단독 (HB22-7), 또는 RIT 및 HB22-7(CMRIT)의 3가지 다른 순서로 처리된 또는 처리되지 않은 Raji-이종이식 마우스의 종양 크기의 시간 측정이다. 종양 크기는 일주일에 3회 측정하였다. 각 처리 군의 마우스 수는 표 2에 나타나 있다.
도 4는 모든 독립적인 이종이식 시험에서 관찰된 종양 크기의 요약 분석이다. 시험은 도 2에 설명한 것처럼 수행하였다. 각 시험에 있어서의 마우스 수는 표 2에 나타나 있다.
도 5는 도 2에 설명한 것처럼 처리된 Raji-이종이식 마우스에 대한 반응 비율 및 치유율이다. 종양 반응은 다음과 같이 구분하였다: C, 치유(종양은 사라지고 84일 간의 실험 끝까지 다시 증식하지 않음); CR, 완전 관해(종양은 적어도 7일간은 사라졌으나, 그 후 다시 증식); PR, 불완전 관해(종양 크기가 적어도 7일 간은 50% 이상 감소하였으나, 그 후 다시 증식). 데이터는 모든 독립적인 시험의 결과를 나타낸다.
도 6은 도 2에 설명된 바와 같이 처리된 Raji 이종이식 마우스에 대하여 총 생존률을 검사한 것이다. 84일의 시험의 마지막에 또는 종양 부담이 2000mg을 초과할 때, 마우스를 안락사시켰다. 데이터는 모든 독립적인 시험의 결과를 나타낸다.
도 7a, 7b, 및 7c는, 도 2에 설명된 바와 같이 처리된 Raji-이종이식 마우스에서, 주 2회, 백혈구(WBC)(도 7b), 적혈구(RBC)(도 7c) 및 혈소판(도 7a) 수를 측정함으로써 세포 독성을 검사한 것이다. RIT 단독치료군과 비교했을 때, CMRIT 군에서의 혈액독성에 차이는 없었다. 또한 HB22-7 단독치료 마우스에서도 혈액독성은 없었다.
도 8은 도 2에 설명된 바와 같이 처리된 Raji-이종이식 마우스에서, 주 2회, 체중을 측정함으로써, 비-혈액 독성을 검사한 것이다.
도 9는, RIT 처리 개시 후 5 일 동안 매일 전신(WB) 및 혈액에서의 방사활성을 측정함으로써 RIT 클리어런스를 검사한 것이다.90Y의 T1/2에 기초하여 붕괴를 조정한 후 결과를 기록하였다. CMRIT 치료군 중 어느 것에서도 RIT 클리어런스의 유의차는 없었다.
도 10은 리간드 결합을 차단하는 항-CD22 항체(Abs)의 VH 아미노산 서열 분석이다. 각 항체에 대한 코딩 서열 기원의 표시와 아미노산 넘버링은 Kabat 외의 관습(Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Government Printing Office, Bethesda, MD, 1991)에 따르는데, 여기서 아미노산 위치 1-94, CDR1 및 2, 및 FRI1, 2, 및 3은 VH유전자에 의해 인코딩된다. 5' PCR 프라이머와 중첩되는 서열은 도시하지 않았다. 점은 유사한 아미노산 서열의 정열을 최대화하기 위하여 서열 내에 삽입한 갭이다. 서열내의 갭은 명확성을 위하여 VH, D, 및 J 절편 사이에 도입하였다. 도시한 서열의 순위는 HB22-5 서열에의 연관성에 기초한다.
도 11 내지 16은, 하이브리도마 HB22-5(서열번호 8 및 9); HB22-7(서열번호 10 및 11); HB22-13(서열번호 12 및 13); HB22-23(서열번호 14 및 15); HB22-33 (서열번호 16 및 17); 및 HB22-196(서열번호 18 및 19)로부터의 항-CD22 항체에 있어서의 중사슬 VH-D-JH연결 서열에 대한 뉴클레오타이드, 및 인코딩된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 5' PCR 프라이머와 중첩되는 서열은 이중 밑줄로 나타내었다. D 영역 서열은 밑줄로 표시하였다.
도 17은 리간드 결합을 차단하는 항-CD22 Abs의 경사슬 Vκ 아미노산 서열 분석을 나타낸 것이다. 아미노산 넘버링 및 각 항체에 대한 코딩 서열의 기원의 표시는 상기한 Kabat의 관습에 따른다. 예견되는 신호 서열 분할 부위 다음의 아미노산을 1로 넘버링하였다. 점은 유사한 아미노산 서열의 정렬을 최대화하기 위하여 서열에 삽입한 갭을 가리킨다. 서열 내 갭은, 명확성을 위하여, Vκ, J 절편 및 카파 불변 영역(이중 밑줄) 서열 사이에 도입하였다.
도 18 내지 23은 하이브리도마 HB22-5(서열번호 20 및 21); HB22-7(서열번호 22 및 23); HB22-13(서열번호 24 및 25); HB22-23(서열번호 26 및 27); HB22-33(서열번호 28 및 29); 및 HB22-196(서열번호 30 및 31)로부터의 항-CD22 항체의 카파 경사슬 V-J-불변 영역 연결 서열에 대한 뉴클레오타이드 및 추론되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 5' PCR 프라이머와 중첩되는 서열은 이중 밑줄로써 나타내었다.
발명의 요약
본 발명은 항-CD22 단클론 항체를 특정하게 차단하는 독특한 성질을 이용하여, 인간 환자의 B-세포 악성 종양 및 자가면역 질환의 치료를 위한 개선된 임상적 접근에 관한 것이다.
본 발명의 한 태양에 의하면, 본 발명은 B-세포 악성 종양으로 진단된 인간 환자를 치료하는 방법으로서, (1) 서열번호 1의 순수한 인간 CD22(hCD22)의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인에, 또는 처음 두 개의 Ig-유사 도메인과 연관된 에피토프에 특이적으로 결합한, 항-CD22 차단 단클론 항체의 유효량을 환자에게 투여하는단계; 및 (2)상기 치료에 대한 악성종양의 반응을 모니터링 하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은 자가면역질환으로 진단받은 환자(예를 들면, 인간 환자)를 치료하는 방법으로서, (1) 항-CD22 차단 단클론 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계, 선택적으로 (2) 상기 치료에 대한 자감ㄴ역 질환의 반응을 모니터링하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 환자(예를 들면, 인간 환자)에게 유효량의 항-CD22 차단 단클론 항체를 투여함으로써, B-세포 활성을 감소시키는 방법, B 세포 또는 B 세포 부분집합의 수를 감소시키거나 더 나아가 B 세포 또는 특정 B 세포 부분집합을 본질적으로 소거하는 방법, B 세포의 대사회전을 증가시키는 방법 및/또는 B 세포에 의한 항체 생산을 감소시키는 방법을 제공하며, 그리고 선택적으로 (2) 상기 치료에 대한 반응을 모니터링 하는 방법을 제공한다. "감소"라 함은, 적어도 약 25%, 25%, 50%, 또는 75% 의 감소 또는 그 이상을 의미한다. "본질적으로 소거라 함은, 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 감소, 또는 그 이상을 의미한다. "대사회전 증가"라 함은 적어도 약 25%, 35%, 50%, 75%, 100%, 150% 또는 그 이상의 대사회전율의 상승을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 사용된 항체는 HB22-7(HB11347), HB22-23(HB11349), HB22-33, HB22-5, HB22-13, 및 HB22-196, 바람직하게는 HB22-7, HB22-23, 또는 HB22-33, 더욱 바람직하게는 HB22-7 또는 HB22-33으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 태양에 따르면, 상기 항체는 그 리간드에 결합하는 CD22를 적어도 70%, 바람직하게는 80% 이상 차단한다.
다른 태양에 따르면, 상기 항체는 서열번호 9(HB22-5 VH서열)의 아미노산 1 내지 100; 또는 서열번호 11(HB22-7 VH서열); 또는 서열번호 13(HB22-13 VH서열)의 아미노산 1 내지 100; 또는 서열번호 15(HB22-23 VH서열)의 아미노산 1 내지 100; 서열번호 17(HB22-33 VH서열)의 아미노산 1 내지 98; 또는 서열번호 19(HB22-196 VH서열)의 아미노산 1 내지 100의 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 VH서열을 포함하는 중사슬을 포함한다.
또 다른 태양에서, 상기 항체는 서열번호 11(HB22-7 VH서열)의 아미노산 1 내지 97, 또는 서열번호 15(HB22-23 VH서열)의 아미노산 1 내지 100; 서열번호 17(HB22-33 VH서열)의 아미노산 1 내지 98의 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 VH서열을 포함하는 중사슬을 함유한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 11(HB22-7 VH서열)의 아미노산 1 내지 97, 또는 서열번호 15(HB22-23 VH서열)의 아미노산 1 내지 100; 서열번호 17(HB22-33 VH서열)의 아미노산 1 내지 98의 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된VH서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 21(HB22-5 Vκ서열); 또는 서열번호 23(HB22-7 Vκ서열); 또는 서열번호 25(HB22-13 Vκ서열); 또는 서열번호 27(HB22-23 Vκ서열); 또는 서열번호 29(HB22-33 Vκ서열); 또는 서열번호 31(HB22-196 Vκ서열)의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 Vκ서열을 포함하는 경사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 23(HB22-7 Vκ서열); 또는 서열번호 27(HB22-23 Vκ서열); 또는 서열번호 29(HB22-33 Vκ서열)의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 Vκ서열을 포함하는 경사슬을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 23(HB22-7 Vκ서열); 또는 서열번호 27(HB22-23 Vκ서열); 또는 서열번호 29(HB22-33 Vκ서열)의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 Vκ서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 11(HB22-7 VH서열)의 아미노산 1 내지 97 및 서열번호 23(HB22-7 Vκ서열)의 아미노산 서열; 서열번호 15(HB22-23 VH서열)의 아미노산 1 내지 100 및 서열번호 27(HB22-23 Vκ서열)의 아미노산 서열; 및 서열번호 17(HB22-33 VH서열)의 아미노산 1 내지 98 및 서열번호 29(HB22-33 Vκ서열)의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH및 Vκ서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명은, 상기 논의된 항체 경사슬 또는 중사슬 가변 영역, 또는 그 일부를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 논의된 항체 경사슬 또는 중사슬 가변 영역, 또는 그 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
표적 질환은 자가면역 질환 또는 B-세포 악성 종양의 어떠한 유형도 될 수 있으며, 국소적 B-세포 악성 종양도 포함되고(이에 한정되는 것은 아님), B-세포 또는 항체가 관련된 기타 어떠한 질환도 가능하다. 전형적인 대표적 B-세포 악성종양은, 비호지킨 림프종의 B-세포 아유형, 버킷(Burkit) 림프종, 다발성 골수종, 만성 림프종 백혈병, 털모양세포 백혈병 및 전림프구성 백혈병 등이다.
본 발명의 치료 방법은, 악성종양 B 세포 또는 자가면역 질환의 어떠한 다른 치료 없이도 수행이 가능하다. B-세포 악성 종양에 관하여, 본 발명의 치료 방법은, 치료하지 않은 경우, 같은 항체와 방사면역치료의 통합 치료 또는 방사면역치료 단독 치료의 경우와 비교하여, 일반적으로 개선된 치유율 및/또는 증가된 생존률 및/또는 우수한 종양 크기 감소를 제공한다.
항체는 완전 항체, 또는 항체 단편일 수 있는데, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 등이다. 따라서, 항체는 부가적인 항원 특이성을 더 가질 수도 있으며, 즉 이중특이적 항체일 수도 있다. 이중 특이적 항체는 예를 들어, CD22의 또 다른 에피토프에 부가적으로 결합할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체는 CD19, CD20, CD52, CD3, CD28, HLA-DR10(Lym-1)와 같은 기타의 항원에 대하여; 또는 CD16, CD64, 및 CD89와 같은 Fc 수용체에 대하여 결합특이성을 가질 수도 있다.
항체는 키메릭, 인간화된 것, 프리머타이징(primatized)된 것, 또는 인간의 것일 수 있다.
항체의 투여는 정맥 주입의 반복에 의한 정맥내(i.v.) 투여와 같은 종래의 방법에 의하여 수행할 수 있다.
치료 반응은, 예를 들면, 당업자에게 공지된 바와 같이, 자기 공명 영상(MRI)에 의해, 또는 자가면역 질환의 임상 징후의 개선 또는 안정화를 측정함으로써 고형 종양의 수축을 모니터링하는 방법 등, 당업자에게 공지된 방법에 의해 모니터링할 수 있다.
바람직한 구현예에 대한 상세한 설명
다르게 정의되지 않는 한, 본문에 사용되는 모든 과학 기술 용어는 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 갖고 있는 자가 상식적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 설명에 사용되는 용어는, 본 발명의 구체적 태양을 설명하기 위한 것이며, 발명을 제한하는 의도로 사용되지 않는다.
본문에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 문헌은 그 전체 내용이 참고문헌으로서 본 명세서에 통합되어 있다.
A. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본문에 사용되는 과학 기술 용어는 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.
당해 기술분야의 당업자라면, 본문에 설명된 것과 유사하거나 동등한 많은 물질 및 방법을 알고 있을 것이며, 본 발명의 실시에 사용할 수 있을 것이다. 사실, 본 발명은 설명된 물질과 방법으로 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, 다음의 용어를 하기와 같이 정의한다.
"면역글로불린"(Ig)이라 함은, 혈청의 글로불린 단백질의 면역-제공 부분, 및 원래 생기지 않을 수도 있지만 동일한 기능적 특성을 갖는 기타 당단백질을 의미한다. "면역글로불린" 또는 "Ig"는 구체적으로 "항체"(Abs)를 포함한다. 항체가 특정 항원에 대한 결합 특이성을 보이는 반면, 면역 글로불린은 항원 특이성이 없는 항체 및 기타 항체-유사 분자들을 모두 포함한다. 원래의 면역글로불린은 형질세포라고 불리는 분화된 B-세포에서 분비되며, 항원 특이성이 없는 면역글로불린은, 골수종에서 높은 수준으로, 그리고 림프계에서 낮은 수준으로 생산된다. 본문에서, "면역글로불린", "Ig" 및 이들의 문법적으로 변화된 형태의 용어는 항체(상기 정의된) 및 항원특이성이 없는 Ig 분자를 포함하는 것으로 사용된다.
순수한 면역글로불린은 보통, 동일한 두 개의 경사슬(L) 및 동일한 두 개의 중사슬(H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경사슬은 하나의 공유 이황화결합에 의하여 하나의 중사슬에 연결되며, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중사슬에 따라 다양하다. 각 중사슬 및 경사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 갖는다. 각 중사슬은 한쪽 말단에 가변 부위(VH)를 가지며 거기에 많은 불변 부위가 이어져 있다. 각 경사슬은 한쪽 말단에 가변 부위(VL)를 가지며, 다른 쪽 말단에 불변 부위가 있는데; 경사슬의 불변 부위는 중사슬의 첫 번째 불변 부위와 나란한 위치에 있고, 경사슬 가변 부위는 중사슬의 가변 부위와 나란한 위치에 있다. 특정한 아미노산 잔기가 경사슬과 중사슬 가변 부위 사이의 접경을 형성하는 것으로 생각된다.
혈청에서 발견되는 주된 Ig 이소타입(클래스) 및 해당 Ig 중사슬(괄호 안에 표시)을 하기에 나열한다;
IgG (γ 사슬) : 혈청 내 중요한 Ig, 항원에 대한 반응에서 자극되는 주된 항체, 이 항체는 태반을 통과한다;
IgE (ε 사슬) : 이 Ig은 비만 세포 및 호염구에 강하게 결합하며, 또한 항원에 결합하면, 히스타민 및 기타 즉각적 과민반응의 매개물질의 방출을 유도하며; 건초열, 천식 및 아나필락시성 반응을 포함하는 알러지 반응에서 주된 역할을 하며; 그리고 기생체에 대한 보호 역할을 수행할 수도 있다;
IgA (α 사슬) : 이 Ig은 타액, 누액, 점액 및 초유와 같은 외분비액에 존재한다;
IgM (μ 사슬) : 이 Ig은 항원에 대한 반응에서 가장 처음 유도되며; 보통은 나중에 생성되는 기타의 항체 이소타입들보다 낮은 친화성을 가지며, 일반적으로 펜타머이다.
IgD (δ 사슬) : 이 Ig는 제대혈에서 비교적 높은 농도로 발견되며, 항원에 대한 초기 세포 수용체가 될 수 있으며, 주된 림프구 세포 표면 분자이다.
본문에서 사용되는 "항체"라 함은, 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단클론 항체(온길이(full length) 단클론 항체를 포함하지만 이에 한정되지는 않음), 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타낼 정도의 길이의 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"이라 함은, 온길이 항체의 일부분, 일반적으로 항원 결합 부위 또는 가변 (V) 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"단클론 항체"라 함은, 거의 동종의 항체들의 집단으로부터 얻어지는 항체를 말한다. 즉, 그 집단에 포함되는 개개 항체들이, 자연적으로 일어날 수 있는 미량의 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 말한다. 단클론 항체는 매우 특이적으로서, 하나의 항원 사이트에 대한 지향성을 갖는다. 더욱이, 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 지향성을 갖는 상이한 항체들을 일반적으로 포함하는 종래의 (다클론) 항체 제조물과는 반대로, 각 단클론 항체는 항원 상의 하나의 결정기에 대하여만 지향성을 갖는다.
본문에서, 단클론 항체는 구체적으로, 원하는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 길이를 갖는 항체 단편과 함께, "키메릭" 항체 (면역글로불린)를 포함한다( 미국 특허 제 4,8916,567호; Morrison 외,Proc. Natl . Acad . Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Oi 외,Biotechnologies4(3):214-221 (1986); 및 Liu 외,Proc. Natl . Acad Sci. USA 84:3439-43 (1987)).
비인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 또는 "CDR 이식된" 형태는, 수여자의 과변이 부위 잔기를, 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는, 마우스, 랫트, 토끼 또는 인간이 아닌 영장류와 같은 비-인간 종으로부터 얻어진 과변이 부위 잔기(공여자 항체)로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 부위(FR) 잔기를, 대응하는 비-인간형 잔기로 대체하기도 한다(소위, "역돌연변이"). 더욱이, 친화성 등의 항체의 성질을 더욱 개선하기 위하여, 인간화 항체를, 공여자 항체에서 또는 수여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함하도록 변형할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 모든 또는 거의 모든 과변이 부위가 비-인간 면역글로불린의 그것에 해당하고, 모든 또는 거의 모든 FR들이 인간 면역글로불린 서열의 그것에 해당하는, 적어도 하나, 일반적으로는 두 개의 가변 부위를 거의 모두 포함하게 될 것이다. 인간화 항체는, 선택적으로, 하나 이상의 면역글로불린 불변 부위 (Fc) 부분, 보통은 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 더 상세한 것은, Jones 외,Nature321:522-525 (1986); 및 Reichmann 외,Nature332:323-329 (1988) 참조.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은, 항체의 VH및 VL부위를 포함하며, 상기 부위들은 폴리펩티드 단일 사슬 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는,sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 해주는, VH및 VL부위 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. sFv의 검토를 위하여는,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Resenburg 및 Moore eds.Springer - Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)의 Pluckthun 참조.
"디아바디(diabodies)"라 함은, 두 개의 항원-결합 사이트를 갖는 작은 항체 단편을 말하는데, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 경사슬 가변부위 (VL)에 연결된 중사슬 가변부위 (VH)를 포함한다. 너무 짧아서 같은 사슬 상의 두 부위 사이를 연결할 수 없는 링커를 이용함으로써, 상기 부위들은 다른 사슬의 상보적 부위와 짝을 이루어 두 개의 항원-결합 사이트를 형성할 수밖에 없게 된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 외,Proc. Natl . Acad. Sci .USA 90:6444-6448 (1993)에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
"선형 항체"라 함은 본 명세서 내에서 Zapta 외, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)에 기재된 항체를 의미하는 것으로 사용한다. 간략히 말하면, 이들 항체는 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한 쌍의 종열(tandem) Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다.
IgG, IgE, IgA, IgM 및 IgD 이소타입의 항체들은, 중사슬의 불변 부위는 서로 다르지만, 동일한 가변 부위, 즉 동일한 항원 결합 능력을 가질 수도 있다. 항체 등의 면역글로불린의 불변 부위는 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지는않지만, 항체의존성 세포독성(ADCC)에 대한 항체의 관여 등과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
주요 항체 이소타입(강(class)) 중 일부는 아강으로 더 나누어진다. IgG는 4개의 공지된 아강:IgG1(γ1), IgG2(γ2), IgG3(γ3), 및 IgG4(γ4)을 갖는 반면, IgA는 2개의 공지된 아강:IgA1(α1) 및 IgA2(α2)를 갖는다.
"에피토프"라 함은, 단백질 항원 상의 (단클론 또는 다클론) 항체와 결합하는 사이트를 의미한다.
순수한 인간 CD22 시퀀스의 아미노산 서열 내의 도메인 1 및/또는 2에 결합하는, 또는 HB22-7, HB22-23 및 HB22-33과 같이 본 명세서에 구체적으로 개시된 단클론 항체 중 어떤 것에 의해 결합되는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 "에피토프 매핑"에 의해 확인될 수 있다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 지도화하고 특징화하기 위한 많은 공지의 방법이 있는데, 예를 들면 문헌(Harlow and Lane,Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999의 11장)에서 기술된 바와 같이, 항원-항체 복합체의 결정 구조 해석법, 경쟁 시험법, 유전자 단편 발현 분석법 및 합성 펩티드에 기초한 시험법이 있다. 유전자 단편 발현 분석법에 의하면, 단백질을 인코딩하는 해독틀(open reading frame)을 무작위로 또는 특정 유전자 구조로써 단편화하여, 테스트하고자 하는 항체로써 발현된 단백질 단편의 반응성을 측정한다. 유전자 단편은, 예를 들어, PCR에 의해 생성되고, 그리고 나서 방사성 아미노산의 존재 하에서 실험관내에서 단백질로 전사 및 번역된다. 그리고 난 후, 방사성 표지된 단백질 단편에 부착된 항체를, 면역적정 및 겔 전기영동에 의하여 측정한다. 어떤 에피토프는, 파지 입자의 표면에 나타나는 랜덤 펩타이드 서열의 라이브러리(파지 라이브러리)를 이용함으로써 확인할 수도 있다. 택일적으로는, 테스트 항체에의 결합에 대하여는, 간단한 결합시험법으로, 중첩하는 펩타이드 단편의 정해진 라이브러리를 테스트할 수 있다. 마지막 접근법은 약 5 내지 15 아미노산의 선형 에피토프를 정하는데 적절하다.
두 개의 항체가 동일한 또는 입체적으로 중첩하는 에피토프를 인식할 때, 한 항체는 다른 한 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 두 개의 항체가 동일한 또는 입체적으로 중첩하는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는, 가장 널리 사용되면서 빠른 방법은 경쟁 시험법(예를 들어, 경쟁적 ELISA 법)으로서, 이 방법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 온갖 다양한 형식으로 할 수 있다. 보통은 항원을 96-웰 플레이트에 고정화시키고, 표지되지 않은 항체가 표지된 항체의 결합을 차단하는 능력을, 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.
아미노산 또는 아미노산 잔기라 함은, 본 명세서에서, 자연적으로 발생하는 L 아미노산을 말하거나 또는 변이체에 대하여 하기에 더 기술하는 바와 같이 D 아미노산을 말한다. 통상적으로 사용되는 아미노산에 대한 한글자 및 세글자 약어를 본 명세서에서도 사용한다(참조: Bruce Alberts 외, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York(3 판 1994))
본 명세서에서, "폴리펩티드"라 함은 융합 단백질을 포함하는 단백질 및 펩티드를 포함한다.
"서열 동일"이란, 순수한 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되는데, 필요한 경우 서열들을 일렬로 나열하고 갭을 준 후, 서열 동일성의 최대 백분율을 얻으며, 보존성 치환은 서열동일 부분으로 생각하지 않는다. 서열 동일성 % 값은 문헌(Altschul 외, (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs",Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)에 기재된 NCBI BLAST2.0 소프트웨어에 의해 산출될 수 있다. 파라미터는 디폴트 값으로 설정하되, 단, 미스매치에 대한 페널티(Penalty) 경우에는 -1로 설정한다.
본 명세서에서, "치료"라 함은 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근을 말한다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익한 또는 바람직한 임상 결과는, 검사가능한 또는 검사불가능한, 증상의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정 상태(예를 들어, 더 나빠지지 않는), 질병 진행의 지연, 질병 상태의 개선 및 일시적 완화, 및 진정(부분적이든 전체적이든)을 포함하는데 이것에 한정되는 것은 아니다. "치료"라 함은 또한, 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존기간에 비해서 생존기간을 연장하는 것을 의미한다. "치료"는 또한 병의 진행을 예방하거나 병의 이상을 개선할 목적으로 이루어지는 개입을 의미한다. 따라서, 치료는 치유를 위한 치료 및 예방법 모두를 의미한다. 치료가 필요한 사람들은, 이미 병에 걸린 사람들은 물론, 병의 예방이 필요한 사람들도 포함한다. 자가면역 질환에 있어서 치료의 결과는, 환자의 자가면역 질환의 임상 증상 한 가지 이상의 약간의 개선, 완화, 안정화 및/또는 지연으로 나타난다. B 세포 악성 종양 부분에서는 치료를 통하여, 악성종양의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 예를 들면, 연부 조직이나 뼈 등의 주위 조직으로의 침투 등의 악성종양의 퍼짐을 막고(지연시키거나 정지시킴); 전이를 막고(지연시키거나 정지시킴); 종양 성장을 막고; B 세포 악성종양과 관련된 증상으로부터의 완화를 제공하고; 사망률을 줄이고; 삶의 질의 개선하는 것 등이 가능하다. 항체로 치료함으로써, 세포독성 파괴 효과 및/또는 세포증식 억제 효과가 야기된다.
"B 세포 악성종양"이라는 용어는, 림프절이나 골수와 같은 림프조직에서 보통 생기지만, 갑상선, 위장관, 침샘 및 결막과 같은 비-림프조직에서도 생길 수 있는, B 세포의 악성종양 또는 신생물을 의미하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 본 발명의 치료 방법은 구체적으로, 비호지킨(non-Hodgkin) 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 털모양 세포성 백혈병 및 전림프구성 백혈병의 B-세포 아유형을 포함(이로 한정하는 것은 아님)하는 CD22-양성 B 세포 악성종양에 관한 것이다.
"자가면역 질환"이라 함은, 일반 체세포에 대해 반응성을 나타내는 항체의 생성으로부터 기인하거나, 또는 그것에 의해 더욱 악화되는 병적 상태를 의미한다.
B. 상세한 설명
1. 항체
HB22-7, HB22-23, HB22-33, HB22-5, HB22-13, 및 HB22-196로 표시되는 항-CD22 차단 단클론 항체는 것은 공지되어 있으며, 미국 특허 제 5,484,892호, Tuscano 외,Eur . J. Immunol. 26:1246 (1996), 및 Tuscano 외,Blood94(4),1382-1392 (1999)에 개시되어 있다. HB22-7 및 HB22-23은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC), 12302 Parklawn Drive, Rockvill, Md. 20852로부터, 각각 수탁 번호 HB22374 및 HB11349로 입수가능하다. 상기 항체 제제는 또한 하기 실시예 1에 기재되어 있다. CD22의 에피토프 매핑은, 상기 차단 단클론 항체가 인간 CD22의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인과 연관된 에피토프에, 또는 처음 두 개의 Ig-유사 도메인에 결합한다는 것을 보여준다(미국 특허 제 5,484,892호 및 Tedder 외,Annu . Rev. Immunol, 15:481-504 (1997)). 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 서열은 본 출원에 개시되어 있다.
본 발명은, 부분적으로, B-세포형 비호지킨 림프종(NHL)의 이종이식 모델에서 얻어진 결과에 기초하여, B-세포 악성종양의 치료에 있어서 HB22-7, HB22-23, HB22-33, HB22-5, HB22-13 및 HB22-196의 특징을 전부 갖는 항-CD22 차단 항체의 의외의 우수성에 기초한다. 본 발명은 또한 자가면역질환의 치료에 있어서, HB22-7, HB22-23, HB22-33, HB22-5, HB22-13 및 HB22-196의 특징을 전부 갖는 항-CD22 차단 항체의 이용에 기초한다.
항-CD22 단클론 항체는 당업계에 공지된 어떠한 표준방법에 의하여도 만들 수 있는데, 예를 들면, 하이브리도마법(Koehler 및 Milstein,Nature256:495-497 (1975); 및 Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp.59-103, (Academic Press, 1986))에 의하여, 또는 예를 들면 미국 특허 제 4,816,567호 및 Wood 외,Nature314:446-9 (1985)에 개시된 재조합 기술에 의하여 만들 수 있다.
면역처리하여, 내생 면역글로불린 생산 없이 인간 항체의 레퍼터리를 생성할수 있는 유전자 이식 동물(예를 들면, 마우스)을 제조할 수도 있다. 예를 들어, 키메릭 및 배자계열(germ-line) 돌연변이 마우스의 항체 중사슬 연결 영역(JH) 유전자의 동종접합 결실은, 내생 항체 생산을 완전하게 막는다. 상기 배자단계 돌연변이 쥐 내에 인간 배자계열 면역글로불린 유전자 배열을 전달하면, 항원 공격 시에 인간 항체를 생산할 것이다. 예를 들어, Jakobovits 외,Proc. Natl . Acad . Sci. USA 90,2551-225 (1993); Jakobovits 외,Nature362, 255-258 (1993)를 참조.
Mendez 외, (Nature Genetics15: 146-156 (1997))은 기술을 더욱 개선시켜서, 항원의 공격을 받을 때 인간 항원에 대하여 완전한 고도의 친화성을 나타내는 "제노마우스(Xenomouse) II"라고 불리는 유전자이식 마우스 라인을 생산하였다. 이는 상술한 바와 같이 내생 JH절편내의 결실과 함께, 메가베이스 인간 중사슬 및 경사슬 유전자좌를 마우스로 배자단계 삽입함으로써 이루어진다. 제노마우스 II는, 대략 66VH유전자, 완전한 DH및 JH영역 및 3개의 다른 불변 영역(μ, δ 및 χ)을 포함하는 1,020 kb의 인간 중사슬 유전자좌가 있고, 또한 32Vκ유전자, Jκ절편 및 Cκ유전자를 포함하는 800 kb의 인간 κ 유전자좌도 있다. 상기 마우스에서 생산되는 항체는, 유전자 재배열, 조립 및 레퍼터리 등의 모든 면에서 인간의 것과 매우 유사하다. 인간 항체는 쥐의 유전자좌 내의 유전자 재배열을 방지하는 내생 JH절편 내의 결실로 인하여 내생 항체에 있어서 우선적으로 발현된다.
택일적으로, 면역처리하지 않은 공여체로부터 얻어진 면역글로불린 가변 (V)도메인 유전자 레퍼터리로부터 실험관 내 인간 항체 및 항체 단편을 제조하는 데에, 파지 디스플레이 기술(McCafferty 외,Nature348, 552-553 (1990))를 이용할 수 있다. 상기 기술에 따르면, 항체 V 부위 유전자를, M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 주(主) 또는 부수 외피 단백질 유전자 내로 인-프레임 클로닝하여, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 항체 V 도메인 유전자를 디스플레이한다. 상기 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 사본을 포함하기 때문에, 항체의 기능적 성질에 기초한 선택은 역시 그 성질을 나타내는 항체를 인코딩하는 유전자의 선택을 유도한다. 이와 같이 파지는 B-세포의 성질과 일부 닮아 있다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있다. 자세한 것은, 예를 들어 문헌(Johnson, Kevin S. 및 Chiswell, David J.,Current Opinion in Structural Biology3, 564-571 (1993))을 참조. 몇몇 V-유전자 절편의 소스들이 파지 디스플레이에 사용될 수도 있다. 문헌(Clackson 외,Nature352, 624-628 (1991))은, 면역처리된 쥐의 비장으로부터 유래한 V-유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 분리하였다. 면역처리된 인간 공여자로부터의 V-유전자의 레퍼터리를 구성할 수 있으며, 본질적으로 문헌(Marks 외,J. Mol , Biol. 222, 581-597 (1991), 또는 Griffith 외,EMBO J.12, 725-734 (1993))에 기재된 기술에 따라, 다양한 항원 베열에 대한 항체(자기 항원 포함)를 분리할 수 있다. 자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적한다(체세포 초돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 높은 친화도를 부여할 것이고, 고친화성 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포는, 뒤따르는 항원 공격동안, 우선적으로 복제되고 분화된다. 이러한 자연적인 과정은 "사슬 셔플링"(Marks 외,Bio / Technol. 10, 779-783)이라고 알려진 기술을 채용함으로써 모방되어 질 수 있다. 이 방법에서는, 중사슬 및 경사슬 V-영역 유전자를, 면역처리되지 않은 공여자로부터 얻어진 V-도메인 유전자의 자연발생 변이체의 레퍼터리로써 차례대로 대체함으로써, 파지 디스플레이에 의해 얻어진 "일차" 인간 항체의 친화도를 개선시킬 수 있다. 이 기술은 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 제조를 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼터리를 만들기 위한 전략은 문헌(Waterhouse 외.Nucl . Acids Res. 21, 2265-2266 (1993))에 기술되어 있다.
단클론 항체의 생산에 관한 정보를 더 얻기 위하여, 문헌 (Goding, J.W.,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, Inc., London, San Diego, 1996; Liddell and Weeks: Antibody Technology: A Comprehensive Overview, Bios Scientific Publishers: Oxford, UK, 1995; Breitling 및 Dubel:Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; 및Phage Display: A Laboratory Manual, Barbas 등, editors, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2001) 참조.
항체 단편을 제조하기 위하여 다양한 기술들이 개발되고 있다. 전통적으로, 상기 단편들은 항체 그대로를 단백질 가수분해함으로써 유도하였다(예를 들어, Morimoto 외,J. Biochem.Biophys . Methods24:107-117 (1992) 및 Brennan 등,Science229:81 (1985) 참조). 그러나, 이들 단편들은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산할 수 있게 되었다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 E.coli로부터 직접얻을 수 있으며, 화학적으로 커플링하여 F(ab')2단편을 형성할 수 있다(Carter 외,Bio/Technology10:163-167(1992)). 또 다른 태양에서는, F(ab')2는, F(ab')2분자의 조립을 촉진하는 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성한다. 또 다른 방법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 분리할 수도 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 기타의 기술들은 당업자가 잘 알 것이다.
두 개의 공유결합된 항체로 이루어진 이종결합(heteroconjugate) 항체도 본 발명의 범위 내에 속한다. 상기 항체들은 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포로 표적화하기 위해(미국 특허, 제 4,676,980), 그리고 HIV 감염의 치료를 위하여 제안된 바 있다(PCT 출원 공개 제 WO91/00360 호 및 제 WO92/200373 호). 이종결합 항체는, 시판되는 주지의 교차결합제를 사용하는 편리한 교차-결합법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 항체는 설치류의 것이든, 인간의 것이든 또는 인간화된 것이든 상관없이 항원-특이성을 더 가짐으로써 이중 특이적 항체를 형성할 수도 있다. 두 번째 결합 특이성은, 예를 들어, CD19, CD20, CD52 및 B 세포 상에 발현되는 기타의 CD 항원, 특히 표적 B 세포 악성종양과 관련된 항원과 같은 또다른 B 세포 항원에 대하여 특이적일 수 있다. 예를 들어, CD20은 90% 이상의 비호지킨 림프종에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 항-CD20 항체(등록명 Rituxan, IDEC Pharmaceuticals)는 비호지킨 림프종의 치료를 위해 임상에 사용되고 있다. CAMAPATH-1H (항-CD52w)는 B 세포 악성종양의 치료를 위해 개발된 또다른 항체이다. CD20 또는 CD52 항원에 대한 결합특이성을 포함하는 이중 특이적 항체는 구체적으로 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 이중 특이적 항체가 결합할 수 있는 또 다른 B 세포 항원은 HLA-DR10(Lym-1)인데, 이것은 비호지킨 림프종의 마커로 알려져 있다. 이중 특이적 항체는 종양 부위를 강화할 뿐만 아니라 종양-특이적 면역 반응을 보강하고 그리고/또는 증대시킨다. 기타의 항원 표적의 예로는, CD3, CD28, 및 Fc 수용체(CD16, CD64 및 CD89)를 포함한다. 이중 특이적 항체는 강화된 세포독성을 가질 것으로 기대되며, 결과적으로 병의 완화 속도 및 생존력을 향상시킬 것으로 기대된다.
HB22-7, HB22-23, HB22-33, HB22-5, HB22-13 및 HB22-196과 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 에피토프 매핑에 의하여 확인할 수 있다. 두 가지의 다른 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지의 여부를 정하는 가장 간단한 방법은 경쟁 결합법이다. 이 방법은 두 항체가 각각 항원에 결합하는 것을 서로 차단할 수 있는지 여부를 측정한다. 경쟁 결합법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 이용하여 수많은 상이한 형식으로 형태화될 수 있다. 이 방법의 가장 일반적인 형태에서는, 항원을 96-플레이트 웰에 고정시킨다. 표지되지 않은 항체가, 표지된 항체의 항원 결합을 차단하는 능력을 방사성 표지 또는 효소 표지를 이용하여 측정한다. 더 자세한 것은, 예를 들어, Wagener 외,J. Immunol., 130"2308-2315 (1983); Wagener 외,J. Immunol . Methods, 68:269-274 (1984); Kuroki 외,Cancer Res. 50:4872-4879 (1990); Kuroki 외,Immunol . Invest. 21:523-538 (1992); Kuroki 외,Hybridoma11:391-407(1992), 및 Using Antibodies: A LaboratoryManual, Ed Harlow and David Lane editors, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York, 1999, pp. 386-389) 참조.
택일적으로, 또는 부가적으로, 에피토프 매핑는, 항체가 결합하는 항원의 무작위 단편화, 또는 특정 유전자 구조에 의한 단편화에 기초한 기술을 이용하여, 항체로써 얻어지는 단편의 반응성을 측정한다. 단편화는, 예를 들어 PCR을 행한 후, 뒤이어 방사성 아미노산의 존재 하에 실험관 내에서 단백질로 전사 및 번역을 행하는 것처럼 핵산 수준에서 수행될 수도 있다. 더 상세한 것은, 문헌(상기 Harlow and Lane, 390-392쪽)을 참조.
에피토프 매핑의 또 다른 방법에 의하면, 단백질 항원의 작은 선형 절편에 각각 대응하는 중첩 펩티드 한 셋트를 합성한 후, 고체 상에 배열한다. 그리고 나서 상기 펩티드 패널을 테스트 항체로써 검사하고, 결합된 항체를 효소-표지된 두 번째 항체를 사용하여 검출한다.(Harlow and Lane,supra, 393-396쪽).
에피토프 매핑으로 당업계에 주지된 또다른 방법은 무작위 합성 또는 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터의 항체 선택이다. 파지 디스플레이 라이브러리는, Fl-타입 ssDNA 파지의 부수 외피 단백질 유전자의 아미노 말단 내로, 펩티드-인코딩 올리고뉴클레오티드 복합 혼합물을 클로닝함으로써 형성된다. 상기 파지 디스플레이 라이브러리는 예를 들어, 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)으로부터 입수 가능하다. 스톡으로서의 라이브러리를 증폭하고, 그 후, 각각 독립된 클론을 여러번 복제하기에 충분한 분량을 원하는 항체와 혼합한다. 항체-결합 파지는 "바이오패닝(biopanning)"이라 불리는 공정으로 수집하고, 결합하지 않은 파지는 제거한다. 결합된 파지를 용출시켜서 박테리아 감염에 사용하고, 선택된 스톡을 증폭시킨다. 최종 선택된 스톡의 개개의 용균반을 성장시키고, ELISA 등에 의하여 특이적 항체 반응성을 체크한 후, 삽입 부위 주변의 DNA를 시퀀싱한다. 항체가 결합한 펩티드를 인코딩하는 서열의 분석은 항체의 특이성을 결정한다. 자세한 것은, Smith and Scott,Methods Enzymol. 217:228-257 (1993) 및 상기 Harlow and Lane, 397-398쪽 참조.
비-인간(설치류) 항체는, 인간의 임상 적용에 더욱 적절하도록 더 개조될 수 있다. 인간의 불변 부위 유전자 절편 내로 스플라이싱된 원하는 특이성을 갖는 마우스 가변 영역 유전자 절편으로써 키메릭 항체를 생성한다(미국 특허, 제 4,816,567호 참조).
비-인간(설치류) 항체는 또한, 인간의 치료에 항체를 사용할 때의 항원성의 문제를 피하기 위하여 인간화시킬 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 비인간 근원에서 나와 그 내부로 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기라고 불리며, 보통은 "유입" 가변 부위로부터 취한다. 인간화는, 본질적으로, Winter 및 공동연구자 (Jones 외,Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 외,Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen 외,Science, 239:1534-1536 (1988))의 방법을 따라서, 설치류 CDR(s) 서열을 인간 항체의 해당 서열로 치환함으로써 수행할 수 있다. 항체 인간화가 비교적 직접적임에도 불구하고, 인간 프레임워크(FR)로의 설치류 CDR의 간단한 이식이, 원래의 설치류 단클론 항체의 결합 친화도와 특이성을 항상 바꾸는 것은 아니다. 인간화 항체의 성질은, 예를 들어, 설치류 항체로부터 인간 프레임워크로의 잔기의 치환(역돌연변이) 등 적절한 디자인에 의해 개선될 수 있다. 그러한 역돌연변이의 위치는 서열 및 구조 분석에 의하여, 또는 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의하여 결정될 수 있다. 게다가, 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여, 선택된 위치에서의 아미노산을, 항체 서열 내에서 변경시킬 수 있다. 인간화 항체의 성질은 또한 인간 프레임워크의 선택에 의해 영향을 받는다. 초기 실험은, 설치류 단클론 항체와의 서열 동일성에 관계없이, 잘 특징화된 인간 단클론 항체의 한정된 하위집합을 이용하였다(소위, 고정 프레임워크 접근). 최근에는, 설치류 가변 영역에 대한 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 가변 영역을 사용하기도 한다(상동성 매칭 또는 최적법(best-fit method)). 또 다른 접근법에 따르면, 일치(consensus) 서열 또는 배자단계 서열을 사용하거나, 몇몇 상이한 인간 단클론 항체로부터, 경사슬 또는 중사슬 가변 영역 내의 프레임워크 서열의 단편을 선택한다.
상술한 또는 입수가능한 기타의 어떤 방법에 의하여 제조된 항체의 아미노산 변이체는, 항-CD22 DNA내에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 예를 들어 펩티드 합성에 의하여 제조할 수 있다. 아미노산 변화는 또한 인간화된 또는 변이된 항-CD22 항체의 번역후 과정을 변경할 수도 있는데, 예를 들면 글리코실레이션 부위의 위치 및 수를 변경할 수 있다.
항체는 불변 영역 내의 보존 위치에서 글리코실레이션된다(Jefferis and Lund,Chem . Immunol. 65:111-128 (1997); Wright and Morrison,TibTECH15:26-32(1997)). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 미치며(Boyd 외,Mol . Immunol. 32:1311-1318 (1996); Wittwe and Howard,Biochem. 29:4175-4180 (1990)), 형태에 영향을 미칠 수 있는 당단백질 부분과 당단백질의 제시된 3차원 표면과의 분자내 상호작용에 영향을 미친다(상기 Jefferis and Lund; Wyss and Wagner,Current Opin . Biotech. 7:409-416 (1996)). 올리고당은 또한 주어진 당단백질을, 특이적 인식 구조에 기초한 특정 분자로 타겟팅하는 역할을 할 수도 있다. 예를 들어, 아갈락토실레이션된 IgG에서, 올리고당 모이어티는 내부-CH2 공간 밖으로 역전(flip)되고, 말단 N-아세틸글루코사민 잔기를 이용할 수 있게 되어 만노스 결합 단백질에 결합한다(Malhotra 외,Nature Med. 1:237-243 (1995)). 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서 생성된 CAMPATH-1H(인간림프종의 CDw52 항원을 이식하는, 인간화된 재조합 쥐 단클론 IgG1 항체)로부터의 올리고당의 글리코펩티다아제에 의한 제거는 보체 매개 용균(CMCL)(Boyd 외,Mol . Immunol. 32:1311-1318 (1996))의 완전한 감소를 초래하는 반면, 뉴라미니다제를 이용한 시알산 잔기의 선택적 제거는 CMCL의 손실이 전혀 생기지 않는다. 항체의 글리코실레이션도 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 구체적으로, β(1,4)-N-아세틸글루코사민 전이효소 III(GnTIII)(글리코실전이효소는 양분된 GlcNAc의 형성을 촉매함)의 테트라사이클린-조절 발현을 갖는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Umana 외,Naturr Biotech. 17:176-180 (1999)).
항체의 글리코실레이션 변이체는, 밑줄친 핵산 서열 내의 글리코실레이션 부위를 변경함으로써 제조할 수 있다. 부가적으로, 항체의 글리코실레이션은 또한 밑줄친 핵산 서열을 변경하지 않고 바꿀 수도 있다. 글리코실레이션은 대체로 항체 발현에 사용되는 숙주 세포에 의존적이다. 잠재적 치료법으로서, 예를 들어 항체와 같은 재조합 당단백질의 발현에 사용되는 세포 유형은, 거의 순수한 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실레이션 패턴은 상당히 다양할 것으로 예상된다(Hse 외,J. Biol . Chem. 272:9062-9070(1997) 참조). 숙주 세포의 선택 외에, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실레이션에 영향을 미치는 요인으로서는, 생장 형태, 배지 조성, 컬쳐 밀도, 산소화(oxygenation), pH, 정제 방법 등을 포함한다. 올리고당 생성에 관여하는 어떤 효소를 도입하거나 과발현시키는 것을 포함하여, 특정 숙주 조직에서 얻어지는 글리코실레이션 패턴을 변경하기 위한 다양한 방법이 제안되어 있다(미국 특허 제 5,047,335호;제 5,510,261호 및 제 5,278,299호). 글리코실레이션 또는 특정한 유형의 글리코실레이션은, 당단백질로부터 효소적으로, 예를 들어 엔도글리코시다아제 H(Endo H)를 사용하여 제거할 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 유전공학적으로 조작할 수도 있는데, 예를 들어 특정 유형의 다당류 작용에 결함을 갖도록 만들 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 항체-지향성 효소 전구약물 치료법(ADEPT)에 사용될 수도 있다. ADEPT는 종양 항원을 타겟팅하는 단클론 항체의 특이성을 이용하여, 촉매 효소를 암세포의 표면으로 표적화시키는 기술이다. 거기서, 효소는 항암 약물의 전구약물 형태(예를 들어, 펩티딜 화학치료제, WO81/01145 참조)를 완전한 활성 형태로 활성화시키는 역할에 있다. 예를 들어, WO88/07378 및 미국 특허 제4,975,278 참조.
본 발명의 방법에 유용한 효소로는, 포스페이트-함유 전구약물을 유리형 약물로 전환하는데 유용한 알칼리성 포스파타아제; 설페이트-함유 전구약물을 유리형 약물로 전환하는데 유용한 아릴설파타아제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 디아미나제; 세라티아 프로테아제, 써모리신(thermolysin), 서브틸리신, 카르복시펩티다아제 및 카텝신(예를 들어, 카텝신 B 및 L)과 같이, 펩티드-함유 전구약물을 유리형 약물로 전환하는데 유용한 프로테아제; D-아미노산 치환기를 포함하는 전구약물을 전환하는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제; 글리코실레이션된 전구 약물을 유리형 약물로 전환하는데 유용한, β-갈락토시다아제 및 뉴라미다아제와 같은 탄수화물-분해 효소;β-락탐으로 유도된 약물을 유리형 약물로 변환하는데 유용한 β-락타미나제; 및 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기를 포함하는 아민기의 질소원자에서 유도된 약물을 유리형 약물로 변환하는데 유용한 페니실린 아미다제(예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제)가 있다. 다른 방법으로는, 종래 기술에 "항체효소(abzymes)"로서 알려져 있는 효소 활성을 갖는 항체를 본 발명의 전구약물을 유리형 활성 약물로 변환하기 위하여 사용할 수 있다(참조예: Massey,Nature328; 457-458 (1987)). 항체-항체효소 결합체는 암세포 군집으로 상기 항체 효소를 전달하기 위하여 본 명세서에 기술한 바와 같이 제조할 수 있다.
본 명세서에서 상기 항체의 면역결합체도 상세하게는 본 발명의 범위에 포함된다. 면역 결합체는 화학요법 약제, 독소 또는 방사성 동위원소와 같은 세포독성약제에 접합된 항체를 포함한다.
구체적으로는, 본 명세서에서 상기 항-CD22 항체의 효율을 세포독성 방사성 동위원소에 접합시켜 더 강화시킴으로써 특징적인 표적 위치로 방사선 치료법을 약물표적화시키게 된다(방사선 면역요법). 적절한 방사성 동위원소로서는 예를 들어 I131및 Y90이 있으며, 이들은 임상적으로 사용된다. 다른 적절한 방사선 동위원소로서는 예를 들어 In111, Cu67, I131, As211, Bi212, Bi213및 Re186등이 있으며, 제한없이 사용가능하다.
면역결합체의 생성에 유용한 화학치료제로서는 예를 들어 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(탁솔, 브리스톨-마이에르 스퀴브 온콜로지, 프린스톤, NJ), 및 독세탁셀(탁소테르, 로네-푸렝 로러, Antony, Rnace), 톡소테레, 메토트렉사테, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미토크산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 칼미노마이신, 아미놉테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신(참조 미국특허 4,675,187), 5-FU, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린, 악티노마이신 D, VP-16, 클로람부실, 멜팔란, 및 기타 관련 질소 머스타드를 포함한다.
본 명세서에서 면역결합체에 사용되는 독소는 예를 들어 디프테리아 A 사슬, 엑소톡신 A 사슬, 리신 A 사슬, 에노마이신, 및 트리코테신을 들 수 있다. 구체적으로는 항체-메이탄시노이드 및 항체-칼리케아미신 결합체를 포함한다. 메이탄시노이드를 포함하는 면역결합체로서는 예를 들어 미국 특허 5,208,020, 5,416,020 및 유럽특허 EP 0 425 235에 개시되어 있다. (참조 Liu 등,Proc. Natl . Acad . Sci . USA93:8618-8623 (1996)). 항체-칼리케아미신 결합체는 예를 들어 미국특허 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; 및 5,877,296에 개시되어 있다.
상기 항체 및 세포독성 약제의 결합체는 이중 기능을 갖는 다양한 단백질 커플링제를 사용하여 만들어지며, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중 기능 유도체(디메틸 아디피미데이트 HCl 등), 활성 에스테르계(디숙신이미딜 수베레이트 등), 알데히드계(글루타렐드하이드 등), 비스-아지도 화합물계(비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민 등), 비스-디아조늄 유도체(비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민 등), 디이소시아네이트(톨리엔 2,6-디이소시아네이트 등) 및 비스-활성 불소 화합물계(1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 등) 등이 있다. 예를 들어 리신 면역독소는 문헌(Vitetta 등,Science238:1098 (1987))에 개시되어 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)는 방사성 뉴클레오티드를 상기 항체에 결합시키기 위한 킬레이트화제의 예이다. 참조 WO94/11026.
본 발명의 영역에는 상기 항-CD22 항체의 공유 개질도 포함된다. 가능한 경우에는 화학 합성 또는 상기 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이들을 제조할 수 있다. 상기 항체에 대한 다른 종류의 공유 개질은 타겟인 상기 항체의 아미노산 잔기와 유기 유도화제를 반응시켜 분자내로 도입하는 것이며, 상기 유기 유도화제는 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 것을 의미한다. 상기 항체의 바람직한 공유 개질은 다양한 비단백질계 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 등과 같이 종래 기술에 잘 알려져 있는 물질에 상기 항체를 연결시키는 단계를 포함한다.
2. 약학적 제제 및 치료법
B-세포형 비호지킨 림프종은 악성(암) B세포 림프구에 의해 발생하는 거대군(29종 이상)의 림프종을 포함하기 위하여 사용되며, 공지된 종류의 림프종의 거대 하위 집합을 나타낸다. B-세포는 복잡한 세포내 신호처리단계에 의존적으로 수명주기에 있어서 많은 변화를 겪는 것으로 알려져 있으며, B-세포의 수명 주기의 다른 단계에서 다른 종류의 B-세포 악성 종양이 발생함은 명백하다. 일반적으로 줄기세포 단계에서 급성 림프구 백혈병(ALL) 또는 림프모구 림프종/백혈병으로 발전할 수 있다. 전구성 B-세포는 전구성 B 림프모구 림프종/백혈병으로 발전할 수 있다. 미성숙 B-세포의 일반적인 악성 종양은 작은 비절단 세포 림프종을 포함하며, 가능하게는 버킷/비버킷 림프종을 포함할 수 있다. 항원 노출 이전의 B 세포는 일반적으로 만성 림프구 백혈병(CLL) 또는 작은 림프구 림프종으로 발전하는 반면, 큰 세포 림프종 및 면역모세포 림프종이 관찰된다. 성장 속도에 따라 공격성 (빠른 성장) 및 무통성 (느린 성장)으로 림프종을 구별하여 B-세포 림프종을 특정하는 분류 체계도 있다. 예를 들어, 버킷/비버킷 림프종 및 LCL 림프종은 공격성 그룹에 속하는반면, 무통성 림프종은 소포 중심 세포 림프종(FCCL), 소포 큰세포 림프종, 및 소포 작은세포 림프종을 포함한다.
비호지킨 림프종은 또한 발전 단계에 의해서도 특정된다. I 단계: 암은 하나의 림프절 영역에서만 발견되거나, 상기 림프절 외부의 오직 하나의 영역 또는 장기에서 발견된다. II 단계: (1) 암이 횡경막(호흡을 돕는 폐 아래의 얇은 근육)의 동일한 측면상에 존재하는 둘 이상의 림프절 영역에서 발견되거나, 또는 (2) 암이 상기 림프절 외부의 오직 하나의 영역에서 또는 장기에서, 그리고 그 주위의 림프절에서 발견되거나, 또는 (3) 상기 횡경막의 동일 측면 상에 존재하는 다른 림프절 영역도 암을 가질 수 있다. III 단계: 암은 상기 횡격막의 양 측면상에 존재하는 림프 결절에서 발견된다. 상기 암은 또한 상기 림프절 영역 근처의 한 영역 또는 장기 및/또는 비장으로 번질 수 있다. IV 단계: (1) 암은 상기 림프계 외부의 하나 이상 또는 여러 개의 장기로 번져 있다; 암세포는 이들 장기 근처에서 발견될 수도, 발견되지 않을 수도 있다; 또한 (2) 암은 상기 림프계 외부의 유일한 하나의 장기에 번져 있으나, 상기 장기로부터 멀리 떨어져 있는 림프절이 관련된다.
비호지킨 림프종을 포함하는 B-세포 악성 종양의 현재 치료 옵션은 상기 악성 종양의 종류 및 단계에 종속적이다. 통상적인 치료 요법은 방사선 치료법(외부 빔 치료법으로도 칭함), 화학치료법, 면역치료법 및 이들 치료법의 조합을 포함한다. 희망적인 치료법은 방사선 면역 치료법(RIT)이다. 외부 빔 치료법에서는 제한된 영역의 신체를 조사한다. 화학 치료법은 전신성이며, 흔히 정상 세포에 악영향을 미치며, 심각한 독성 부작용을 유발한다. 표적 RIT는 B-세포 특이 항체가 종양부위에 독성 물질을 운반하는 방법이다. B-세포 NHL을 갖는 환자에 있어서 RIT의 치료 가능성은 CD20, CD19, CD22, 및 HLS-DR10 (Lym-1)을 포함하는 다른 표적을 사용하여 입증이 되었다. 최근에는 병용요법(CMT)이 고형 종양의 치료를 위하여 더 자주 사용되는 방법이 되었으며, 약물에 의한 암세포의 방사선민감, 및 화학 치료법의 직접적인 세포독성 효과를 포함한다. NHL을 치료하기 위한 가장 일반적인 화학 치료법은 시클로포스파미드-히드록시독소루비신-온코빈 (빈크리스틴)-프레드니손 (CHOP) 조합 치료법이다. 공격성이지만 초기 단계의 NHL의 무작위 연구를 통해 CHOP를 단독으로 사용한 치료법보다는 CHOP에 필드 조사법(field radiation)을 더 포함시킨 것이 우수한 결과를 나타내었다. 그 가망성에도 불구하고, 외부 빔 조사를 포함하는 치료법의 단점은, NHL은 대부분 널리 퍼져 있음에도 불구하고, 외부 빔 조사는 신체의 제한된 영역에 높은 방사선량으로만 전달될 수 있다는 것이다. 따라서 CMT가 국소적으로 발전된 악성 종양에 대해 임상적으로 유용함이 입증되었다.
현재의 다른 접근법으로는 병용 방사선 면역 치료법이 있으며, 이는 NHL로의 전신성 조사(예를 들어90Y-DOTA-펩티드-Lym-1)의 특이적 전달과 부가적인 화학 치료제의 전신성 방사선 민감 효과를 결합한 것이다. CMRIT에서 방사선 조사가 연속적으로 전달되므로, 저산소 상태인 암세포는 치료과정에서 다시 산소와 결합하거나, 상기 세포 주기의 방사선 민감성 G2/M 단계를 경험하여 치료를 더욱 가능하게 만들 수 있다. 게다가 CMRIT는 첫째로 Lym-1에 의한 NHL의 특이적 표적화 단계에의해, 둘째로 타이밍에 의하여 특이성을 제공한다. 이는 방사선 민감제가 RIT에 의해 타겟이 된 부위에서만 시너지효과 유발가능성을 증가시켜 효율을 최대화시키고 독성을 최소화시키게 된다. 이전의 몇가지 이종이식(xenograft) 연구를 통해 상기 방사선 민감제(탁솔)가 RIT 이후 24-48시간에 투여된 경우 향상된 시너지 효과를 발생시킴을 알았다.
NHL의 치료를 위하여 CMRIT가 가장 발전된 치료법으로 전망될지라도, 본 발명의 항체는 잘 수용된 라지(Raji) 및 라모스(Ramos) 림프종 이종이식 모델에서 테스트한 경우 암 크기 감소, 치유 속도 및 전체적 생존율의 측면에서 모두 우수한 결과를 보인 것으로 나타났다.
자가면역 질환은 자가-관용(self tolerance)의 고장 및 그로 인한 자신에 대한 면역 반응에 의해 발생하며, 영향 받은 조직에서 자가항체가 생성되고 및 면역글로불린이 축적되는 단계를 포함한다. 자가항체는 보체(complement) 매개 및 Fc-수용체 매개 조직 염증 및 파괴를 일으키는 면역 복합체를 형성한다. B 세포가 자가항체의 기원이므로, 이와 같은 종류의 면역-매개 질환의 치료를 위한 합리적 표적을 이들은 제공한다. 또한 B 세포는 항원을 제시하고, 효과기 T 세포의 발전을 조절할 수 있다. 이들 질환의 병리학적 메카니즘은 복잡하며, 흔히 체액 및 세포 면역 메카니즘의 조합을 포함한다.
대부분의 자가면역 질환은 정상적인 신체 조직과 반응하는 항체의 생성으로 인해 발생하거나, 이들에 의해 악화된다. 항체는 항원 자극 및 활성화에 이어서 B 세포에 의해 생성된다. 그러므로 CD22 기능의 차단은 자가 반응 항체를 포함하여항체의 생성을 억제할 수 있다. 80가지 이상의 자가면역 질환이 규명되었다. 자가면역 질환, 이들의 원인 및 치료법이 국립보건원(National Institute of Health)의 자가면역 질환 조정위원회에 의해 발행되는 문헌(Autoimmune Diseases Research Plan)에서 활발히 토의가 이루어지고 있다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환으로서는 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 괴사성 혈관염, 림프절염, 결절성 동맥주위염 및 전신성 홍반성 루푸스를 유발할 수 있는 것과 같은 면역 복합 장애를 포함하며, 이것에 한정되지는 않는다. 기타 예시적인 자가면역 질환으로는, 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 궤양성 대장염, 전신 경화증, 피부근염/다발성근염, 항-인지질 항체 증후군, 경피증, 퍼피구스 불가리스(perphigus vulgaris), ANCA-관련 혈관염(예를 들어, 바그너씨 육아종증, 현미경적 다발성혈관염), 우루베이티스(urveitis), 쉐그렌 증후군, 크론씨 질환, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 라임 관절염, 길란-바르 증후군, 하시모토 갑상선염 및 심근증을 들 수 있으며, 여기에 한정되는 것은 아니다. 항체 생성과 관련된 기타의 질환은, 다발성 괴사, 아토피 피부염, 혈소판 감소성 자반, 과립세포감소증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 임신기간 동안 태아의 A-B-O 혈액형과 같이 외부 항원에 대한 면역 반응, 중증근무력증, 제 1형 당뇨병, 그레이브씨 병, 및 알러지 반응을 포함하는데, 이것에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법은, 예를 들어, 이식 거부 등을 포함하여, B 세포 또는 항체가 연루된 기타의 장애 또는 질환을 치료하는데 이용할 수 있다.
여기서 항-CD22 항체는, 일반적으로 모든 제약 화학자들에게 주지된 약제학적 제형의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어,Remington's Pharmaceutical Sciences, (15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975)), 특히 Plaug, Seymour에 의한 87장을 참조. 상기 제형으로는, 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 무수 흡수 기제, 수중유 또는 유중수 유탁액, 유탁제 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 겔, 및 카르보왁스를 포함하는 반고형 혼합물이 포함된다. 일반적인 투여 형태는, 정맥 내(i.v.) 경로를 통한 투여에 적절한, 멸균, 등장, 수계 용액이다. 약제학적 제형에서 본 발명의 항체 농도는 아주 다양할 수 있다. 다시 말하면, 0.1 중량% 미만에서부터, 보통 약 2 중량% 이상, 20 중량% 내지 50 중량% 이상까지일 수 있으며, 기본적으로는 선택된 구체적 투여 방법에 따라, 액체 부피, 점성 등에 의해 선택될 것이다.
본 발명의 항체는 리포좀을 통하여 투여될 수도 있다. 리포좀은 유탁액, 포말, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라 층 등을 포함한다. 상기 제제에서, 운반하고자하는 본 발명의 조성물은, 단독으로, 또는 항체와 같은 원하는 표적에 결합하는 분자와 함께, 또는 기타의 치료 조성물 또는 면역 조성물과 함께 리포좀의 일부로 통합시킨다. 본 발명에 사용되는 리포좀은, 일반적으로 중성 및 음전하의 인지질과 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는, 표준 소포-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로 예를 들어, 리포좀 크기, 혈류 내에서 리포좀의 안정성 및 산 불안정성과 같은 고려사항에 의해 정해진다. 리포좀 제조에 이용할 수 있는 다양한 방법들은, 예를 들어, Szoka 외,Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 9:467 (1980), 미국 특허 제 4,235,871호, 제 4,501,728호, 제 4,837,028호, 제 5,019,369호에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 단독으로 혹은 다른 치료요법과 병행하여 투여될 수 있다. 예를 들어 B-세포 악성 종양의 경우, 상기 요법 또는 치료법은 화학치료법, 방사선 면역 요법(RIT), 화학치료 및 외부 빔 조사(병용 요법, CMT), 병용 방사선 면역요법(CMRIT), 또는 시토카인 단독 혹은 병용요법 등을 예로 들 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 상기 항-CD22 항체는 비호지킨 림프종을 치료하기 위한 대부분의 화학치료요법, CHOP(시클로포스파미드-히드록시독소루비신-온코빈(빈크리스틴)-프레드니솔론)을 병행할 수 있다. 더욱이 상기 항-CD22 항체는 항-CD19, 항-CD20 및 기타 항-CD22 항체(예를 들어 LymphoCideTM(임뮤노메딕스 주식회사) 또는 LymphoCide Y-90)와 같은 다른 항체와 결합하여 투여될 수 있다. 참조예(Stein 등,Drugs of the Future18:997-1004 (1993); Behr 등,Clinical Cancer Research5:3304s-33314s, 1999 (suppl.); Juweid 등,Cancer Res. 55:5899s-5907s, 1995; Behr 등,Tumor Targeting3:32-40 (1998), 및 미국특허 6,183,744, 6,187,287, 및 6,254,868)
본 발명의 치료법은 또한 자가면역 질환을 위한 다른 치료법과 병행하여 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 환자는 항-CD20 항체(예를 들어 등록명 Rituxan, IDEC 제약) 및/또는 소염제(예를 들어 코르티코스테로이드) 뿐만 아니라 본 발명의 항체로 처리된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 처리된 환자는 악성 종양 B 세포상에발현된 CD22를 갖게 된다. 상기 CD22 항원의 존재는 표준 기술(면역조직화학, FACS, 표지된(예를 들어 방사선 표지된) 항-CD22 항체로써 결합측정 등)에 의해 확인할 수 있다.
상기 본 발명의 항체 조성물은 통상적인 투여 방법을 사용하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복막내, 경구, 림프관내, 근육내, 진피내, 피하, 및 비내 투여 방법을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 투여 경로는 일정 시간에 걸친 연속 주입 또는 볼루스(bolus) 형태이며, 예를 들어 일주일에 1회 혹은 2회 연속 혹은 볼루스 주입 형태이다. 다른 바람직한 구현예에서, 투여 경로는 피하 주사이다. 투여량은 표적 B 세포 악성 종양 또는 자가면역 질환의 성질, 형태 및 단계, 환자의 성, 나이, 상태, 치료전 경과, 다른 치료의 이용, 및 통상의 읜사에 의해 일반적으로 생각될 수 있는 기타 요인에 따라 달라진다. 예를 들어, 비-호지킨 림프종 환자 또는 자가면역질환 환자는 약 50 내지 약 150 mg/m2/주, 구체적으로 약 100 내지 약 1000 mg/m2/주, 더욱 구체적으로는 약 150 내지 약 500 mg/m2/주의 양으로 본 발명의 항-CD22 항체를 투여 받을 수 있다.
환자는 B-세포 악성 종양 또는 특정 자가면역 질환의 임상 징후에 따라서, 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, B-세포 악성 종양의 경우, 항-CD22 항체를 이용하여, 종양 관해(예를 들어, 고형 종양의 경우에는 종양 사이즈), 순환 B-세포 또는 생검 조직의 표현형을 모니터할 수 있다.
본 발명이 인간 치료에 대하여 주로 논의하였지만, 본 발명의 항체는 수의학에서도 사용가능할 수 있다. 예를 들어 고양이의 악성 림프종이 가정의 고양이에서 흔히 발명하며, 인간 비호지킨 림프종과 유사한 특징을 나타낸다(참조: Bertone 등,Am. J. Epidemiol .156:268-73 (2002)). 마찬가지로 개도 다양한 림프종을 보이는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 본 발명의 항체는 고양이 및 개의 악성 림프종을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 자가 면역 질환의 동물 모델도 종래 기술에 알려져 있다. 투여량, 및 투여 경로는 치료받을 동물 종류에 종속적이며, 이와 같은 결정은 수의학 분야의 당업자에게는 자명하다.
이하의 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예에서 언급되는 상업적으로 구입 가능한 시약은 다르게 기재되어 있지 않다면 판매자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예에서 개시된 바와 같은 제조 외에, 하이브리도마 생성 단클론 항체 HB22-7(ATCC Accession No. HB11349)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, Rockville, MD)에서 입수할 수 있다.
실시예 1
항- CD 22 단클론 항체의 제조
Engel 외,J Immunol15:4710 (1993) 및 미국 특허 제 5,484,892호의 방법에 따라서, 단클론 항체(mAbs) HB22-7(IgG2b), HB22-23(IgG2a), HB22-33(IgM), HB22-5(IgG2a), HB22-13(IgG2a), HB22-22(IgA), 및 HB22-196를 제조하였다. 그러나, 다른 방법도 사용가능하다. 간략하게 설명하면, HB22 mAbs는, 면역원으로서, 온길이 CD22 cDNA로 안정적으로 형질감염된 마우스 전-B세포주 300.19를 이용하는 하이브리도마 기술을 통하여 제조하였다. 더욱 상세하게 설명하면, 온길이 CD22 cDNA로 안정적으로 형질감염된 마우스 전-B세포주 300.19로 3번 면역처리한 Balb/c 마우스로부터 취한 비장 세포와 NS-1 골수종 세포를 융합함으로써, CD22에 반응성을 갖는 33 mAbs를 제조하였다. CD22 cDNA로 형질감염된 마우스 L 세포에 반응성을 갖지만 형질감염되지 않은 세포에는 반응성을 갖지 않는 mAb를 생산하는 하이브리도마를 두 번 클로닝하여 상징액 또는 복수액을 만드는데 사용했다. 마우스 단클론 항체 이소토핑 키트 (Amersham, Arlington Heights, Ill.)를 사용하여 mAbs 이소토프를 측정하였다. Affi-Gel Protein A MAPS TT Kit (Bio-Rad, Richmond, Calif.)를 사용하여 IgGmAb를 정제하였다. 증류수에 대한 광범위(extensive) 투석에 의하여, 복수액의 진정글로불린 부분을 포함하는 HB22-33 mAb (IgM)를 침전시켰고, SDS-PAGE 분석에 의하여 본질적으로 순수한 mAb임이 나타났다. 미국특허 제 5,484,892호의 표 II에 개시된 바와 같이, mAbs HB22-7, HB22-22, HB22-23, 및HB22-33은,CD22 형질감염된 COS 세포에 대한 Daudi, Ragi 및 Jurkat 세포의 결합을 완전히(80-100%) 차단하였다. mAbs HB22-5, HB22-13, HB22-24, 및 HB22-28은 결합을 부분적으로 차단(20-80%)하였다.
CD22 상의 5개의 다른 에피토프를 확인하는 mAb 패널과, "Workshop" CD22-차단 mAb를 이용하는 mAb 교차-억제 연구를 통하여, CD22 상의 리간드 결합을 매개하는 부분을 특징화하였다(에피토프 A, B, C, D 및 E(Schwartz-Albiez 외., "CD22 항원의 탄화수소 모이어티를, 글리코실레이션 경로의 억제를 통하여 조절하였다." Workshop mAb의 결합 특이성은 도 3에 그림으로 도시하였다. 백혈구 유형 IV. 백혈구 분화 항원, Knapp 외, eds., Oxford University Press, Oxford, p. 65 (1989)). 단클론 항체 중 3개, HB22-7, HB22-22, 및 HB22-23는 CD22 상의 매우 근접한 또는 동일한 에피토프에 결합한다는 사실이 밝혀졌다. 상기의 그리고 기타의 차단 항체의 에피토프 매핑 결과는 Tedder 외,Annu . Rev. Immunol. 15:481-504 (1997)에 개시되어 있다. 치료를 위해 제안된 기타의 항-CD22 항체와는 달리, 본 발명의 차단 항체는 hCD22 아미노산 서열의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인 내의 에피토프에 결합한다.
실시예 2
Raji 및 Ramos 림프종 이종이식 실험
본 실시예에서는, 우리의 독립된 Raji 및 Ramos 림프종 이종이식 실험의 결과를 기재한다. 누드 마우스 이종이식은 임상전 실험을 위한 중요한 도구이다. 림프종 세포주 Raji 및 Ramos를 이용한 인간 비호지킨 림프종 (NHL) 이종이식편을포함하는 누드 마우스가 NHL의 치료에 대한 효능을 평가하는데 유용하다는 것이 밝혀졌다. (Buchsbaum 외,Cancer Res. 52(23):6476-6481 (1992) 및 Flavell 외,Cancer Res. 57:4824-4829 (1997))
재료 및 방법
시약.
담체 없는90Y(Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA) 및111In(Nordion, Kanata, Ontario, Canada)를 묽은 HCl에 포함된 염화물 형태로 구매하였다. Lym-1(Techniclone, Inc Tustin, CA)은 인간 버킷 림프종 세포 핵으로 면역처리된 쥐로부터 나온 IgG2amAb이다. Lym-1은 악성종양 B 세포 상의 세포 표면 31-35kD 항원을 인식하고, 80%를 초과하는 인간 B 세포 NHL과 반응한다. Lym-1 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여, 95% 이상의 순수한 단량체 IgG를 요구하는 상세항목에 따라 평가하였다.
90Y-DOTA-펩티드-Lym-1을 상술한 바와 같이 제조하였다(O'Donell 외,Cancer. Biother . Radiopharm. 13:251-361 (1998)). HPLC, TLC 및 셀룰로스 아세테이트 전기영동에 의한 평가를 통하여,90Y-DOTA-펩티드-Lym-1이, 응집물 함량이 5% 미만인 98%의 방사화학적 순도로 제조되었음을 나타났다.
항-CD22 mAb, HB22-7을 Protein A Sepharose 고속 칼럼(Pharmacia)을 사용하여, 상술한 바와 같이 제조하였다(Tuscano 외,Blood94:1382-1392 (1999)).HB22-7 순도는 HPLC 및 유세포분석법(flow cytometry)에 의해 측정하였고, 95% 보다 큰 것으로 나타났다. 생리학적 성질은 유세포분석법에 기초한 세포자살 유도 분석(Apo-Tag, Pharmacia)에 의하여 측정하였는데, 이전에 발표된 결과(상기한 Tuscano 외) 와 일치하는 것으로 나타났다. 내독소제거는 ActiClean ETOX 칼럼(Sterogene)을 사용하여 수행하였고, 최종 내독소 수준은 0.15 내독소단위(EU)/mg mAb (Bio Whitaker) 미만인 것으로 측정되었다. Lym-1 및 HB22-7 mAbs는, 쥐, 바이러스, 미코플라스마, 곰팡이 및 세균 감염에 대한 MAP (마우스 항체 생산) 지침서를 충족시켰을 뿐만 아니라, 내독소, 피로젠 및 DNA의 함량 및 동물 안전시험을 만족시켰다.
세포주 및 스캐차드(Scatchard) 분석.
Raji 및 Ramos 버킷 림프종 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Gathersberg, MD)로부터 구입하였다. 상술한 바와 같이(상기한 Tuscano 외), HB22-7 mAb를 이용하는 유세포분석법에 의한 CD22 발현을 위하여 상기 두 세포주를 염색하였다. 10% 우태아 혈청이 0.5 x 106세포/ml의 농도로 보충된 RPMI 1640 내에서 상기 세포주를 유지시켰다. Raji 및 Ramos 세포를 이용한 스캐차드 분석을 상술한 바와 같이 행하였다(Scatchard, G.,Ann. of NY Acad Sci. 51:660 (1947)). 간략하게 말하면, HB22-7을 클로라민 T 법에 의하여125I로 표지하였다(1.1μCi/㎍). 연속하여 희석된 비표지 HB22-7을 이용하여 경쟁 결합법을 행하였다.
마우스 시험.
7-9주령의 암컷 무흉선 BALB/c nu/nu 마우스 (Harlan Sparague-Dawley)를, 캘리포니아 대학, 데이비스의 동물 보호 지침서에 따라, 일반적인 임의의 사료로 병원균이 없는 조건에서 보존하였다. 케이지마다 5마리의 마우스를 넣었다. 대수 증식기에서 Raji 및 Ramos 세포를 회수하고; 2.5-5.0 X 106세포를, 각 마우스의 복부의 양쪽으로 피하 주사하였다. 실험은, 이식한지 3주 후, 종양이 28-328 mm3일 때 시작하였다. 그룹은, 비치료군, 125μCi RIT 단독치료군, 1.4mg HB22-7 단독치료군 또는 RIT와 HB22-7의 병행치료군(HB22-7은 RIT 치료 24시간 전, RIT 치료와 동시에, 또는 24시간 후에 투여함)으로 하였다. 주변의 복사를 최소화하기 위하여,90Y-DOTA-펩티드-Lym-1로 처리한 후 1 주일 동안은 베딩을 매일 바꾸었고, 그 이후에는 일주일에 2번씩 바꾸었다.
종양세포치사 효과.
종양 크기는 헤미엘립소이드(hemiellipsoids)에 대한 식에 의해 기재된 것처럼 계산하였다(DeNardo 외,Clin . Cancer Res. 3:71-79 (1997)). 초기 종양 크기는, 치료하기 전날의 크기로 정하였다. 평균 종양 크기는 매 측정일마다 각 군에 대하여 계산하였고; 완전 관해된 종양은 0의 부피를 갖는 것으로 하였다. 종양 반응은 다음과 같이 분류하였다: C, 치유(종양이 사라지고 84일의 시험 마지막까지 다시 증식하지 않았다); CR, 완전 관해(종양이 적어도 7일간 사라졌으나, 나중에 재발); PR, 불완전관해(종양 크기가 적어도 7일 동안 50% 이상 감소하였으나, 그 후 재발).
통계학적 분석.
치료군들 간의 반응의 차이를, 반응없음, PR, CR, 및 치료로 순위 매겨서, Kruskall Walis 순위합검정을 이용하여 평가하였다. 생존 시간 역시 Kruskall Walis 검정을 이용하여 평가하였다. 종양 크기는 3개의 시점:1달째(26일-29일), 2달째(54일-57일) 및 실험의 종말시(84일)에서 비교하였다. 만약 동물이 종양관련 원인으로 희생되었다면, 최종 크기를 앞쪽으로 옮겨서 그후 시점에서의 분석에 사용하였다. 치료군들간의 차이를 검정하기 위하여 편차 분석을 사용하였다. P 값은 양쪽꼬리 검정이며, 명목상 p-값을 나타낸다. 통계적으로 유의차가 있는 것으로 밝혀진 군들의 부분집합 내에서만 검정함으로써, 다중 비교에 대한 보호를 제공한다.
결과
스캐차드 분석.
HB22-7의 결합친화도와, Ramos 및 Raji 세포 상의 CD22 수용체의 수를 평가하기 위하여, 스캐차드 분석을 이용하였다. 최대 결합 백분율(Bmax), 해리 상수(Ka) 및 세포 당 결합 항체의 수에 대하여 세포를 검사하였다. 표 1에 나타난 결과는 두 실험값의 평균치이다.
I. 파라미터 세포주
세포주 Raji Ramos
Bmax 53.5±0.9% 21.0±1.3%
R2 0.954 0.926
Ka 1.3±0.08X109 5.95±1.0X108
항체/세포 118,000 43,000
스캐차드 분석(표 1)을 볼 때, Raji 세포 대 Ramos 세포에 있어서, 세포당 결합한 HB22-7 항체 수 및 Bmax는 거의 2.5 배 증가하였으며, Ka는 2배 각각 증가하였음을 알 수 있다.
전신 자기방사촬영(Whole Body Autoradiography)
HB22-7-특이적 종양 표적화를 검사하기 위하여,111In-2IT-BAD-항-CD22(HB22-7)을 주사한 종양에 걸린 누드 마우스의 전신 자기방사촬영을 행하였다. 상술한 바와 같이(DeNardo 외, Cancer 3:71-79 (1997)), 주사한지 48시간 후에 마우스를 죽여서 절개하고 자기방사촬영을 하였다(도 2). 자기방사촬영 결과, Raji-종양 마우스에서는 강한 종양 국재성을 나타낸 반면, Ramos-종양 마우스에서는 완화된 국재성을 나타내었다. 이러한 표적화 연구는, Raji에 비하여 Ramos 세포가 세포 당 더 작은 HB22-7 결합을 나타낸다는 스캐차드 분석과 일치한다. 그러나 Ramos 종양의 빠른 증식 및 가능한 중심성 괴사가, Ramos의 명백히 열등한 표적화에 기여할 수도 있다.
RIT 및 CMRIT의 효능
초기 시험(081500)은, 125 μCi의90Y-DOTA-펩티드-Lym-1를 단독으로, 또는 HB22-7(1.4mg)와 병행(RIT 24시간 전, 또는 동시에, 또는 24시간 후에)하여 이용하였다(도 3). 이 시험에서, 한 그룹 당 마우스는 5마리로 하되, 단, RIT 단독치료군은 예외적으로 9마리로 하고 치료하지 않은 대조구 5마리를 포함시킨다(마우스 수는 표 2에 나타나 있음).
구분 치료 집단
No Tx HB22-7 RIT -24 ＠RIT +24
081500 5 4 9 5 5 5
101600 5 6 5 5 3 5
011601 - 5 4 - 9 7
032701 - 5 2 - 3 12
052401 3 - 3 - - -
060401 5 5 - - - -
071701 7 5 - - - 4
092101 4 - - - - -
102401 13 - - - - -
합계 42 30 23 10 20 33
90Y-2IT-BAD-Lym-1으로 실험한 유사한 Raji 이종이식 연구로부터 예견할 수 있듯이, RIT 단독 치료의 경우는, 21일째까지 최대의 평균 종양 크기 감소가 나타났고, 그 이후로는 종양 크기가 증가하는 결과가 나타났다.90Y-2IT-BAD-Lym-1(RIT) 및 HB22-7(CMRIT)로 치료한 이종이식편의 경우, 더 크고 더 오래 지속되는 평균 종양 크기 감소가 일어났는데, 이것은 HB22-7을 동시에, 그리고 RIT보다 24시간 후에 투여하였을 때 가장 컸다. 놀랍게도, HB22-7을 단독투여했을 때는, 2-3주까지 평균 종양 크기가 안정화되었으며, 그리고 나서 점차 지속적으로 종양크기가 감소하였다.
반복 시험을 몇 번 더 했을 때도 재현성이 높은 결과가 나타났다(표 2). 모든 시험 데이터를 종합하여 그래프로 비교해 본 결과, 초기 실험과 고도로 일치하는 결과가 나타났다(도 4). 초기 종양 크기 감소는, HB22-7을 RIT와 동시에 그리고 24시간 후에 투여했을 때, 대략 21일째에 역시 가장 컸다. HB22-7만 처리한 마우스에서, 처리한 지 2주 후에 시작되어 점차 지속적으로 종양 크기가 감소하는 종양 증식의 안정화 역시 모든 후속 시험에서도 반복되었다. 편차 분석을 이용하여, 30일 째에 모든 치료군을 조사한 결과, 차이는 매우 유의적이었다(P<0.001). 60일 째에 행한 모든 치료군에서의 크기 감소 분석이 유의차를 나타내지 않은 반면(p=0.39), 84일 째에 다시 조사한 결과 유의차가 나타났다(P=0.03). 그래프로 관찰한 결과, RIT/CMRIT 군에서의 크기 감소의 차이는 매우 재현성이 높으며, HB22-7 단독 투여 및 비치료 대조군과는 매우 다른 것으로 나타났다. 그러나, 모든 평가 시점(30일째, 60일째 및 84일째)에서 RIT 단독치료군(CMRIT 포함)에서의 크기 감소 비교는 유의차(p≥0.5)를 보이지 않았다. HB22-7을 RIT 처리 48시간 후 및 72시간 후에 투여함으로써, 추가의 CMRIT 시험을 행하였다. RIT와 HB22-7 투여 사이의 시간 간격을 늘이면, HB22-7를 RIT와 동시에 그리고 RIT 처리한지 24시간 후에 투여한 실험과 비교했을 때, 개선된 종양 크기 감소가 얻어지지 않았다(데이터는 기재하지 않음).
반응 및 치유율은 종양 크기에 미치는 처리의 효과와 일치하였다(도 5).90Y-DOTA-펩티드-Lym-1 단독으로 처리하였더니 48% PR, 13% PR, 그리고 13% 치유 비율의 결과가 나왔다. CMRIT 군에서, 전신 반응 비율은, HB22-7 및 RIT를 동시에 투여하였을 때 최대였으며, 45% PR, 15% CR 및 25% 치유의 결과가 나왔다. 그러나, CMRIT 군에서, HB22-7을 RIT 처리 24 시간 후에 투여하였을 때 치유율(39%)이 최대였으며, 이것은 비치료군(29%), RIT 단독치료군(13%), 24시간 전 치료군(10%), 및 동시치료군(25%)에서 치유율에 필적할 만하다. Kruskal Walis 검정을 이용하여모든 치료군에서의 반응도를 조사했더니(치유, CR, PR의 순위로), 그 차이는 통계적으로 유의했다(P=0.01). 대조구에 대한 개별적인 비교는 모두 통계적으로 유의했으나(p<0.05), 단, RIT 단독 처리 경우(p=0.06) 및 RIT 처리 24시간 전에 투여된 HB22-7 경우(p=0.16)는 그러하지 않았다. 단순한 활성 치료군(RIT 단독, CMRIT, 및 HB22-7)의 비교는 유의차가 없었지만(p=0.18), HB22-7을 동시에 그리고 24시간 후에 처리한 CMRIT 군에서는 가장 우수한 반응 패턴이 관찰되었다. 흥미롭게도, HB22-7의 단독치료군은 가장 높은 치유율(47%)을 가지며, 이것은 비치료 대조구(p<0.05)와 비교했을 때 상당히 개선된 것이었다.
종양 크기 관해 및 치유 비율은 유사한 생존 패턴으로 해석된다. 84일의 실험 기간의 마지막에는, 비치료군 및 RIT 단독치료군은 각각 38% 및 42%가 생존하였다(도 6). CMRIT 치료군에서는, HB22-7을 동시에 그리고 RIT 처리 24시간 후에 투여했을 때, 생존률이 각각 67% 및 50%로 증가하였다. Kruskal Walis를 이용한 생존률 분석은 모든 군들의 비교에 대하여 유의적이었다(p<0.05). 반응 비율 분석과 유사하게, RIT군에서의 생존률 비교만이 유의차를 보이지 않았지만(p=0.41), HB22-7을 동시에 또는 RIT 치료 24시간 후에 투여하였을 때는, 이 군에서의 최고 생존률이 일관되게 관찰되었다.
최고의 총 생존률, 76%는 HB22-7 단독 치료군에서 관찰되었으며, 비치료 대조구와 비교했을 때 유의차가 있었다(p=0.02).
독성
혈액독성 및 비혈액 독성을 혈구계수법 및 마우스 체중으로써 각각 검사하였다(도 7a-c). RIT 치료군에서의 WBC 및 혈소판 최저점은, 각각 14-20 일째, 그리고 10-14일째였다. WBC 및 혈소판 회복은, 각각 치료 대략 28일 째 및 21일째였다. WBC 및 혈소판 최저점은 150uCi의90Y-2IT-BAD-Lym-1을 이용하는 이전 실험에서 관찰한 것과 일치하였다. RIT의 혈액 독성은 HB22-7을 같이 투여할 때도 바뀌지 않았다. HB22-7 단독으로 치료한 마우스에서는 혈액 독성이 검출되지 않았다. 모든 치료군에서 단핵구계수법으로 분석한 결과, HB22-7은 RIT-매개 단핵구 최저점에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(데이터는 기재하지 않음). 마우스 체중의 변화로써 비-혈구 독성을 검사하였는데, 모든 치료군에서 동등하게 나타났다(도 8). 어떠한 치료군에서도 독성으로 인한 사망은 없었다.
90Y-DOTA-펩티드-Lym-1 약동학
HB22-7을 투여한 또는 투여하지 않은 Raji-종양 쥐에서의90Y-DOTA-펩티드-Lym-1의 혈액 및 전체 클리어런스값은 유사하였다(도 9). 혈액의 생물학적 T1/2α는 RIT 단독치료군에 대하여는 1.4 시간이었으며, 24시간 전 치료군, 동시치료군 및 24시간 후 치료군에 대하여는 각각 2.2, 2.4, 및 2.0 시간이었다. 혈액의 생물학적 T1/2β는 RIT 단독치료군에 대하여 127 시간이었고, 24시간 전 치료군, 동시치료군 및 24시간 후 치료군에 대하여는 각각 133, 87 및 103시간이었다. 전체 T1/2는 RIT 단독치료군에 대하여 246 시간이었고, 24시간 전 치료군, 동시치료군 및 24시간 후 치료군에 대하여는 각각 207, 207 및 196 시간이었다. RIT에 HB22-7의 부가가,90Y-DOTA-펩티드-Lym-1의 약동학을 변화시키지는 않았다.
토론
Raji 이종이식 연구는, 항-CD22 mAb(HB22-7)가 RIT와 병행될 때 부가적인 또는 상승의 효과를 발생함으로써, 낮은 투여율 조사에 의해 유도되는 세포 자살 및/또는 DNA 손상을 강화시키는지 여부를 결정하도록 설정하였다. Raji 이종이식 누드 마우스 모델은90Y-2IT-BAD-Lym-1 RIT만을 이용한 RIT 독성 및 효능 검사에 사용하면 유용한 것으로 밝혀진 바 있다(O'Donnell 외, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals 13:351-361 (1998). 이러한 전임상 모델에서의 반응은 인간 임상 시험에서도 상당한 효능을 갖는 것으로 해석된다(O'Donnell 외,Anticancer Res. 20:3647-55 (2000); O'Donnell 외,J.Nucl.Med. 40:216 (1999)(초록)).
본 실시예에 기술된 실험에서,90Y-DOTA-펩티드-Lym-1(125μCi)에 항-CD22 mAb HB22-7을 가하면, 독성에는 변화 없이 RIT의 효능을 강화시킨다. 150 및 200μCi의90Y-2IT-BAD-Lym-1로써 행한 이전의 Raji 이종이식 실험은, 본 실험에서 관찰된 것에 필적할만한 반응 및 치유율을 나타내었다(상기 O'Donnel 외,(1998)).90Y-DOTA-펩티드-Lym-1의 투여량을 125μCi로 선택한 것은 2IT-BAD 링커로써 행한 이전 실험에 기초한 것이다. 2IT-BAD의 이전 연구는 200 μCi 투여량에서 최대 효능을 나타내었지만 125μCi로 선택한 것은, HB22-7이 RIT와 합쳐진 또는 상승적 효과를 나타낼 것이고, 따라서 낮은 투여량으로도 더 나은 효과 측정이 가능할 것이라는가정에 기초한 것이었다. 본 실시예의 실험은, 이전에 림프종 이종이식 모델에서 시험된 바 없는 신규한 링커(DOTA-펩티드)를 이용하였다. DOTA-펩티드 링커는, 비결합 방사성약물의 간 분해를 향상시키고 그럼으로써 더욱 바람직한 체내분산을 유도하는 의도로 사용되었다. 종양 특이적 흡수는 본 실험에서 상세히 측정하지 않았지만, 125μCi의90Y-DOATA-펩티드-Lym-1 단독 처리로써 관찰된 독성 프로필은, 비-치료로 인한 사망률 및 예측가능한 백혈구 및 혈소판 최저점에서 수용가능했다.
HB22-7은 프로-아폽토틱을 설명하고 효과를 나타내는 시험관 내 실험에 기초하여 선택하였다(Tuscano 외,Blood94:1382-1392 (1999)). 사용된 HB22-7의 치료 투여량은 경험적으로 정하기는 했으나, 그것은 시험관 내에서 세포자살을 유도하고 이것을 마우스 모델로 외삽하여 추정하는 데에 유효한 것으로 나타난 양에 기초하였다. 또한, HB22-7의 투여량을 제형화할 때, 인간 임상 시험에서 사용되는 Rituximab(등록명)와 등가(인간 대 마우스의 체표면적 차이에 대해 조정했을 경우)의 투여량을 고려하였다. Rituximab(등록명) 투여량에 대한 근사치를 이용하였는데, 이것은, 이 물질이 림프종 치료에 대한 효능을 나타냈던 유일하게 이용가능한 나(裸)mAb이며, Rituximab(등록명)의 적정 투여량은 현재로서는 정해지지 않았다는 가정에 기초한 것이다.
본 실험의 목적은, HB22-7 단독의 효능, RIT와 HB22-7의 병행의 효능, 그리고 3가지의 다른 순서 조합의 효과를 측정하는 것이다.90Y-DOTA-펩티드-Lym-1 단독치료로써 관찰된 종양 크기 감소는, 시간, 크기 및 반응 지속의 관점에서,90Y-2IT-BAD-Lym-1으로써 행한 이전 실험과 일치하였다(상기 O'Donnel 외, 1998). RIT 단독 처리 결과, 치료 후 14일 째에 종양 크기가 약 50% 감소하였다. 대략적인 최대 크기 감소 시점(21일-30일 째)에서 측정했을 때, RIT에 대한 HB22-7의 첨가는 순서특이적으로 반응의 크기를 상당히 증가시켰다. HB22-7을 RIT 치료 24시간 후에 또는 그와 동시에 투여하였을 때 HB22-7 첨가가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 크기 감소의 특징적인 패턴은 재현성이 아주 높았다. 독립적인 반복 시험은 종양 크기 감소와 유사한 패턴 및 크기를 보였다. 종양 크기 감소의 개선은 우수한 반응 비율 및 생존률로 해석되었다. RIT 단독 치료는 13% CR 및 13% 치유의 결과를 나타냈으며, HB22-7의 첨가는 RIT와 동시에 투여했을 때 치유율을 25% 까지 증가시켰으며, HB22-7을 RIT 치료 24 시간 후에 투여했을 때 치유율을 39%까지 증가하였다.
본 실험은, 2차 단클론 항체를 RIT와 조합시킨 처음 시도이며, 독성의 증가 없이 효능을 증가시킬 수 있는, 잘 정의된 생리학적 성질을 갖는 기타 약제 또는 단클론 항체의 이용 잠재력을 보여준다.
놀랍게도, HB22-7 단독치료 마우스는 다른 모든 치료군들과 비교했을 때 인상적인 종양 크기 감소 및 우수한 치유율 및 생존률을 가졌다. 또한, 몇몇 독립적인 시험은, 지연된 초기 종양 크기 안정화 및 치료 후 14일 째에 대략 시작되는 그 이후의 종양 크기 감소와 상당히 일치된 결과를 발생하였다. 이것은 어떠한 치료군에서 관찰된 것보다도 우수한 치유율 및 총 생존률을 의미한다.
결론적으로, 본 발명의 항체는 단독으로 투여했을 때, 현재 가장 발전된 NHL치료법이라고 생각되는 CMRIT를 포함하는 기타 치료 양생법과 비교하여, 종양 크기 감소, 치유율, 및 총생존률의 관점에서 우수한 결과를 제공하는 것으로 나타났다.
실시예 3
항- CD 22 항체의 서열 분석
V H 및 경사슬 유전자 이용
RNeasy Mini Kit(Qiagen Chatsworth, CA)를 이용하여 1-10 X 105하이브리도마 세포로부터, 세포질 RNA를 추출하였다. 올리고-dT 프라이머(dT18) 및 Superscript Kit(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 세포질 RNA로부터 첫 cDNA 가닥을 합성하였다. cDNA 용액 1 ㎕를 VH유전자의 PCR 증폭에 대한 주형으로 이용하였다. PCR 반응은, 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 ㎛ dNTP(Perkin Elmer, Foster City, CA), 50 pmol의 각 프라이머, 및 5 U의 Taq 폴리머라아제(ISC Bioexpress, Kaysville, UT)로 구성된 반응 혼합물 100-㎕ 부피에서 수행하였다. 증폭은 30 사이클(94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분; Thermocycler, Perkin Elmer)로 하였다. 앞서 기술한 바(Kantor 외,Immunol. 158:1175-86 (1996))와 같은 무작위 센스 5' VH프라이머 (Ms VHE:5' GGG AAT TCG AGG TGC AGC TGC AGG AGT CTG G 3': 서열번호 2) 및 Cμ 코딩 영역에 상보적인 안티센스 프라이머(프라이머 Cμ-in: 5' GAG GGG GAC ATT TGG GAA GGA CTG 3';서열 번호 3) 또는 Cγ 영역에 상보적인 안티센스 프라이머(프라이머 Cγ1:5' GAG TTC CAG GTC ACT GTCACT GGC 3';서열번호 4)를 이용하여 VH유전자를 증폭하였다.
센스 Vκ 프라이머[5' ATG GGC(AT)TC AAG ATG GAG TCA CA(GT)(AT)(CT)(CT)C(AT)G G 3'; 서열번호 5] 및 Cλ 안티센스 프라이머(5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT G 3'; 서열번호 6)를 이용하여 경사슬 cDNA를 증폭하였다.
상이한 센스 Vκ 프라이머(5' ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG 3'; 서열번호 7)을 이용하여 HB22-23 경사슬 서열을 증폭하였다.
증폭된 PCR 산물을 QIAquick 겔 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 아가로스 겔로부터 정제하였고, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 및 초기 PCR 증폭에서와 동일한 프라이머로써, Perkin Elmer Dye Terminator Sequencing 시스템을 이용하여 증폭한 후에, ABI 377 PRISM DNA 서열기를 이용하여 양방향으로 직접 시퀀싱하였다. 센스 및 안티-센스 DNA 가닥 모두에서, 모든 VH및 경사슬 영역을 완전하게 시퀀싱하였다.
항-CD22 단클론 항체 HB22-5, HB22-7, HB22-23, HB22-33, 및 HB22-196에 있어서 VH및 Vκ 아미노산 서열의 정렬은 도 10 및 17에 각각 나타내었다. 도 11 내지 16은, 하이브리도마 HB22-5(서열번호 8 및 9); HB22-7(서열번호 10 및 11); HB22-13(서열번호 12 및 13); HB22-23(서열번호 14 및 15); HB22-33(서열번호 16 및 17); 및 HB22-196(서열번호 18 및 19)로부터의 항-CD22 항체의 중사슬 VH-D-VH연결에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 18 내지 23은, 하이브리도마 HB22-5(서열번호 20 및 21); HB22-7(서열번호 22 및 23); HB22-13(서열번호 24 및 25); HB22-23(서열번호 26 및 27); HB22-33 (서열번호 28 및 29); 및 HB22-196(서열번호 30 및 31)로부터의 항-CD22 항체의 κ 경사슬 V-J-불변 영역 연결에 대한 뉴클레오티드 및 연역추론한 아미노산 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Duke University Tedder, Thomas F. <120> REAGENTS AND TREATMENT METHODS FOR AUTOIMMUNE DISEASES <130> 5405.306WO <140> PCT/US03/05549 <141> 2003-02-21 <150> US 60/420,472 <151> 2002-10-21 <150> US 60/359,419 <151> 2002-02-21 <160> 31 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 847 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu 20 25 30 Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala 35 40 45 Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr 50 55 60 Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr 65 70 75 80 Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly 85 90 95 Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn 100 105 110 Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp 115 120 125 Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His 130 135 140 Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp 165 170 175 Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser 180 185 190 Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro 195 200 205 Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala 210 215 220 Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His 225 230 235 240 Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg 245 250 255 Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys 275 280 285 Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser 290 295 300 Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser 305 310 315 320 Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val 325 330 335 Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu 340 345 350 Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His 355 360 365 Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro 370 375 380 Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn 385 390 395 400 Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln 405 410 415 Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile 420 425 430 Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn 435 440 445 Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu 450 455 460 Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr 465 470 475 480 Thr Ile Ala Cys Ala Arg Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro 485 490 495 Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys 500 505 510 Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln 515 520 525 Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu 530 535 540 Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser 545 550 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atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Leu His Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Gly Arg Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acatgcaccg tctcagggtt ctcattaagc gactatggtg taaactgggt tcgccagatt 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaata atatggggtg atggaaggac agactataat 180 tcagctctca aatccagact gaacatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttcttg 240 aaaatgaaca gtctgaaagc tgatgacaca gccaggtact actgtgccag agcccccggt 300 aatagggcta tggagtactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Pro Gly Asn Arg Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gaggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcatt gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attaaaaaca aatttaatgg ttacacaaca 180 gaatacaata catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300 gggctgggac gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Lys Asn Lys Phe Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Thr 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggg cttggtgcaa cctggagatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt tactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg gattgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagg 300 tatgatggtt cctcccggga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ala Thr Trp Arg 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Ser Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gaggtgcagc tgcaggagtc 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Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu 20 25 30 Val Ser Ala Gly Asp Arg Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Thr Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr 100 105 110 Arg Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 <210> 24 <211> 410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 aagatggagt cacagaccca ggtcttcgta tttctactgc tctgtgtgtc tggtgctcat 60 gggagtattg tgatgaccca gactcccaaa ttcctgcttg tatcagcagg agacagggtt 120 tccataacct gcaaggccag tcagagtgtg actaatgatg taacttggta ccaacagaag 180 ccagggcagt ctcctaaatt gctgatatac tttgcatcca atcgctacac tggagtccct 240 gatcgcttca ctggcagtgg atatgggacg gatttcactt tcaccatcag 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tatcagcagg agacagggtc 120 accataagct gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg tagcttggta ccaacagaag 180 ccagggcagt ctcctaaact gctgatatac tatgcatcca agcgctatac tggagtccct 240 gatcgcctca ctggcagtgg atatgggacg gatttcactt tcaccatcag cactgtgcag 300 gctgaagacc tggcagttta tttctgtcag caggatcata gctatccgtg gacgttcggt 360 ggaggcacca agctggagat caaacgggct gatgctgcac caactgtatc 410 <210> 27 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu 20 25 30 Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Leu Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp His 100 105 110 Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 <210> 28 <211> 419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag ataggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatc 419 <210> 29 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 <210> 30 <211> 410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 aagatggagt cacagaccca ggtcttcata tccatactgc tctggttata tggagctgat 60 gggaacattg taatgaccca atctcccaaa tccatgtcca tgtcagtagg agagagggtc 120 accttgacct gcaaggccag tgagaatgtg gttacttatg tttcctggta tcaacagaaa 180 ccagagcagt ctcctaaact gctgatatac ggggcatcca accggtacac tggggtcccc 240 gatcgcttca caggcagtgg atctgcaaca gatttcactc tgaccatcag cagtgtgcag 300 gctgaagacc ttgcagatta tcactgtgga cagggttaca gctatccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc 410 <210> 31 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30 Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 1

Claims (38)

  1. 자가 면역 질환으로 진단받은 인간 환자의 치료 방법에 있어서,
    (1) 상기 인간 환자에게 유효량의 항-CD22 차단 단클론 항체를 투여하는 단계로서, 상기 항체는, 서열번호 9의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-5 VH서열); 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열 1 내지 97(HB22-7 VH서열); 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-13 VH서열);또는 서열번호 15의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-23 VH서열); 또는 서열번호 17의 아미노산 서열 1 내지 98(HB22-33 VH서열); 또는 서열번호 19의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-196 VH서열)과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH서열을 포함하는 중사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (2) 상기 치료에 대한 자가면역 질환의 반응을 모니터링 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는, 서열 번호 11의 아미노산 서열 1 내지 97(HB22-7 VH서열); 또는 서열번호 15의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-23 VH서열); 또는 서열번호 17의 아미노산 서열 1 내지 98(HB22-23 VH서열)과 약 95% 이상의 서열동일성을 갖는 VH서열을 포함하는 중사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 항체는, 서열 번호 11의 아미노산 서열 1 내지 97(HB22-7 VH서열); 서열번호 15의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-23 VH서열); 및 서열번호 17의 아미노산 서열 1 내지 98(HB22-23 VH서열)로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 자가 면역 질환으로 진단받은 인간 환자의 치료 방법에 있어서,
    (1) 상기 인간 환자에게 유효량의 항-CD22 차단 단클론 항체를 투여하는 단계로서, 상기 항체는, 서열번호 21의 아미노산 서열(HB22-5 Vκ 서열); 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열(HB22-7 Vκ 서열); 또는 서열번호 25의 아미노산 서열(HB22-13 Vκ 서열);또는 서열번호 27의 아미노산 서열(HB22-23 Vκ 서열); 또는 서열번호 29의 아미노산 서열 (HB22-33 Vκ 서열); 또는 서열번호 31의 아미노산 서열(HB22-196 Vκ 서열)과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 Vκ 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (2) 상기 치료에 대한 자가면역 질환의 반응을 모니터링 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는, 서열 번호 23의 아미노산 서열(HB22-7 Vκ 서열); 또는 서열번호 27의 아미노산 서열(HB22-23 Vκ 서열); 또는 서열번호 29의 아미노산 서열 (HB22-33 Vκ 서열)과 약 95% 이상의 서열동일성을 갖는 Vκ 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 항체는, 서열 번호 23의 아미노산 서열(HB22-7 Vκ 서열); 서열번호 27의 아미노산 서열(HB22-23 Vκ 서열); 및 서열번호 29의 아미노산 서열 (HB22-33 Vκ 서열)로 구성된 군으로부터 선택된 Vκ 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 11의 아미노산 1 내지 97(HB22-7 VH서열) 및 서열번호 23의 아미노산 서열(HB22-7 Vκ 서열); 서열번호 15의 아미노산 1 내지 100(HB22-23 VH서열) 및 서열번호 27의 아미노산 서열(HB22-23 Vκ 서열); 및 서열번호 17의 아미노산 1 내지 98(HB22-33 VH서열) 및 서열번호 29의 아미노산 서열(HB22-33 Vκ 서열)로 구성된 군으로부터 선택되는 VH서열 및 Vκ 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 치료 방법은, 자가면역 질환에 대한 다른 어떠한 치료도 동반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 완전 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 항체는 Fab, Fab',F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 항원-특이성을 가지며, CD22 분자의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인에, 또는 서열번호 1의 순수한 인간 CD22(hCD22)의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인 내의 에피토프에 결합하는데 효과적이며, 부가적인 항원-특이성을 더 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 항체는 CD22의 또 다른 에피토프에 부가적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 키메릭인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 인간의 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 정맥 내로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 항체는 주 1 회 정맥 내 주입으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 환자에게 항-CD20 항체를 더 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 7 항에 있어서, 상기 항체는 키메릭인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 7 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 7 항에 있어서, 상기 항체는 인간의 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 4 항에 있어서, 상기 치료는 자가면역 질환에 대한 기타의 치료를 수반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 완전 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 항체는 Fab, Fab',F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 항원-특이성을 가지며, CD22 분자의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인에, 또는 서열번호 1의 순수한 인간 CD22(hCD22)의 처음 두 개의 Ig-유사 도메인 내의 에피토프에 결합하는데 효과적이며, 부가적인 항원-특이성을 더 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 항체는 CD22의 또 다른 에피토프에 부가적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 키메릭인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 인간의 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 정맥 내로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 항체는 주 1 회 정맥 내 주입으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 4 항에 있어서, 상기 인간 환자에게 항-CD20 항체를 더 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 서열번호 9의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-5 VH서열); 또는 서열 번호11의 아미노산 서열 1 내지 97(HB22-7 VH서열); 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-13 VH서열);또는 서열번호 15의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-23 VH서열); 또는 서열번호 17의 아미노산 서열 1 내지 98(HB22-33 VH서열); 또는 서열번호 19의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-196 VH서열)과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH서열을 포함하는 항체 중사슬 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  36. 서열번호 21의 아미노산 서열(HB22-5 Vκ 서열); 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열(HB22-7 Vκ 서열); 또는 서열번호 25의 아미노산 서열(HB22-13 Vκ 서열);또는 서열번호 27의 아미노산 서열(HB22-23 Vκ 서열); 또는 서열번호 29의 아미노산 서열 (HB22-33 Vκ 서열); 또는 서열번호 31의 아미노산 서열(HB22-196 Vκ 서열)과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 Vκ 서열을 포함하는 항체 경사슬 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  37. 서열 번호 11의 아미노산 서열 1 내지 97(HB22-7 VH서열); 또는 서열번호 15의 아미노산 서열 1 내지 100(HB22-23 VH서열); 또는 서열번호 17의 아미노산 서열 1 내지 98(HB22-33 VH서열)로 구성된 군으로부터 선택되는 VH서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  38. 서열 번호 23의 아미노산 서열(HB22-7 Vκ 서열); 서열번호 27의 아미노산 서열(HB22-23 Vκ 서열); 및 서열번호 29의 아미노산 서열 (HB22-33 Vκ 서열)로 구성된 군으로부터 선택된 Vκ 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자.
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