WO2006123724A1 - 抗hla抗体を利用した新規医薬品 - Google Patents

抗hla抗体を利用した新規医薬品 Download PDF

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WO2006123724A1
WO2006123724A1 PCT/JP2006/309890 JP2006309890W WO2006123724A1 WO 2006123724 A1 WO2006123724 A1 WO 2006123724A1 JP 2006309890 W JP2006309890 W JP 2006309890W WO 2006123724 A1 WO2006123724 A1 WO 2006123724A1
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cells
hla class
interferon
cell
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Toshio Matsumoto
Shuji Ozaki
Masahiro Abe
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The University Of Tokushima
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to enhancement of the action of anti-HLA class I antibodies by interferon.
  • the HLA class I antigen is formed by a 45 KD ⁇ chain composed of three domains ( ⁇ 1, ⁇ 2 and a 3) and a 12 KD ⁇ 2 microglobulin heterodimer.
  • the main role of the HLA molecule is to present to the CD8 + T cells an antigenic peptide consisting of about 8 to 10 amino acids that is made in the cell, and the immune response and tolerance induced thereby. It plays a very important role.
  • HLA is classified into class I and class II. Class I is known for the existence of HLA-A, B, C, etc. (hereinafter HLA-A is also referred to as “HLA class IA”).
  • HLA class IA antigen antibodies have been observed in lymphocytes to suppress cell proliferation and induce cell death, suggesting the possibility of HLA molecules as signaling molecules. It has been.
  • Non-patent Documents 1 and 2 There is a report that cell growth is suppressed.
  • MoAb90 and YTH862 two types of antibodies against one domain, MoAb90 and YTH862, have been reported to induce apoptosis on activated lymphocytes.
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 4
  • antibody 5H7 against the a3 domain of human HLA class IA (Non-patent document 5) and antibody RE2 (non-patent document 6) against mouse MHC class I serodomain 2 are also found in activated lymphocytes. It has been reported to induce death.
  • Monoclonal antibody 2D7 obtained by immunization of human myeloma cells is also an antibody that recognizes HLA class I.
  • 2D7 By making 2D7 into a low molecular weight (diabody), human myeloma cell line versus It has been reported that severe cell death is induced in a short time. 2D7 diabody exhibits strong cell death-inducing activity against various human myeloma cell lines and activated lymphocyte cells, and is also significant in multiple myeloma model mice transplanted with human myeloma cell lines.
  • Patent documents 1, 2, non-Patent Document 7 noted Patent Document 2 are unpublished at the time of filing the basic application.) 0 this If further development of treatment using cell death induction involving HLA class I such as is expected to develop highly effective drugs for myeloma, etc., anti-HLA class I molecule antibodies There are no reports on the above-mentioned new drugs for cell death induction except for preparation and low molecular weight! ,.
  • Patent Document 1 WO2004 / 033499
  • Patent Document 2 WO2005 / 056603
  • Non-Patent Document 2 Genestier et al., Blood 90: 3629-3639 (1997)
  • Non-Patent Document 3 Genestier et al, Blood 90: 726-735 (1997)
  • Non-Patent Document 4 Genestier et al., J. Biol. Chem. 273: 5060-5066 (1998)
  • Non-Patent Document 5 Woodle et al., J. Immunol. 158: 2156-2164 (1997)
  • Non-Patent Document 6 Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181: 2007-2015 (1995)
  • Non-Patent Document 7 Kimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 325: 1201-1209 (20
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to create a novel pharmaceutical agent using an anti-HLA class I antibody.
  • interferon cell surface expression of HLA class I is enhanced by stimulation with interferon (hereinafter also referred to as “IFN”).
  • IFN interferon
  • 2D7-DB antibody 2D7-Diabody antibody, Non-patent document 7, referred to below as 2D7-Diabody antibody
  • 2D7-DB 2D7-Diabody antibody
  • IFN y IFN y
  • a pharmaceutical composition comprising an interferon and an anti-HLA class I antibody as active ingredients,
  • a pharmaceutical composition comprising an anti-HLA class I antibody as an active ingredient, characterized by being used in combination with interferon,
  • a pharmaceutical composition comprising an anti-HLA class I antibody as an effective component, characterized by being administered simultaneously with interferon,
  • a pharmaceutical composition comprising an anti-HLA class I antibody as an active ingredient, which is administered after interferon administration,
  • a cell death inducer comprising an interferon and an anti-HLA class I antibody as active ingredients
  • a pharmaceutical composition containing interferon characterized by being used in combination with an anti-HLA class I antibody
  • a pharmaceutical composition containing interferon characterized by being administered simultaneously with an anti-HLA class I antibody
  • a pharmaceutical composition containing interferon which is administered before administration of an anti-HLA class I antibody,
  • a method for treating and / or preventing tumor comprising a step of simultaneously administering an anti-HLA class I antibody and interferon,
  • a method for treating and / or preventing tumor comprising a step of administering an anti-HLA class I antibody and a step of administering interferon;
  • a method for the treatment and Z or prevention of autoimmune disease comprising the step of simultaneously administering an anti-HLA class I antibody and interferon,
  • a method for treating and Z or preventing an autoimmune disease comprising a step of administering an anti-HLA class I antibody and a step of administering an interferon.
  • a method for inducing cell death comprising using an anti-HLA class I antibody and interferon in combination,
  • FIG. 1 shows the effect of IFN on 2D7-DB-mediated cytotoxicity.
  • A shows the effect of IFN on HLA-A expression in myeloma cells. IM-9 cells were treated with IFN-a (100 U / ml) or IF ⁇ - ⁇ (100 U / ml) for 48 hours. By flow cytometry, HLA-A cell surface expression was analyzed using 2D7. The staining characteristics of IFN-treated cells are indicated by bold lines, and untreated cells are indicated by solid lines. Negative control staining is indicated by a dotted line.
  • B A graph showing the enhancement of 2D7-DB-mediated cytotoxicity by IFN.
  • IM-9 cells were treated with IFN- ⁇ (100 U / ml) or IFN- ⁇ (100 U / ml) for 48 hours and then cultured with 2D7-DB (0.1 or 1 ⁇ g / ml) for 24 hours.
  • Cell viability was determined by WST-8 Atsey. Data show mean SD of triplicate measurements (number of damaged cells / total number of cells) (* p 0.05).
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression pattern of HLA-A in bone marrow cells derived from multiple myeloma (MM) patients.
  • BMMC from patient number 17 was analyzed by flow cytometry using FITC-labeled 2D7 mAb and PE-labeled anti-CD38 mAb. After gating the cells (R1, CD38 positive MM cells; R2, myeloid cells; and R3, lymphocytes), each cell population was evaluated for HLA-A expression.
  • B BMMCs from 22 MM patients were analyzed for HLA-A expression. Data are presented as geometric mean fluorescence intensity (Geo MFI) for each cell population.
  • FIG. 3 is a graph showing the cytotoxic activity of anti-HLA class I antibodies in MM cells.
  • A A graph of the results of examining the effects of various anti-HLA class I mAbs on MM cells. Purify MM cells from IM-9 cells or patient number 13 together with anti-HLA-A class I mAbs such as 2D7, W6 / 32, B9.12.1, and JOAN-1 at 10 ⁇ g / ml F (ab ' In addition to goat anti-mouse IgG antibody
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of 2D7-DB on bone marrow cells.
  • A Shows how 2D7-DB eradicate MM cells in patients. All BMMCs derived from patient number 12 were cultured for 48 hours in the presence or absence of 2D7_DB (1 ⁇ g / ml). After culturing the cells, the population of MM cells was determined by flow cytometry using FITC-labeled anti-HLA-ABC mAb and PE-labeled anti-CD38 mAb. The MM cell region (R1) was gated according to the side scattered light (SS) profile and CD38 expression.
  • B BMMC from the same patient, 207- ⁇ (1 For 48 hours in the presence or absence of.
  • FIG. 5 shows the therapeutic efficacy of 2D7-DB in a human myeloma xenograft model. They were inoculated with ARH- 77 cells (6xl0 6 / mouse) intravenously SC ID mice. On days 1, 2, and 3, groups of 7 mice were treated by intravenous injection of 2D7-DB or PBS.
  • A On day 24, the serum concentration of HgG was measured by ELISA. The data shows the mean value SD of 7 mice (* p ⁇ 0.05).
  • FIG. 6 shows cytotoxic activity after adding 2D7-DB to myeloma cell line RPMI8226 pretreated with various signal transduction inhibitors.
  • Treatment with Rho GTP inhibitor (Clostridium diffic ile toxin B) and actin polymerization inhibitor almost completely suppressed the cytotoxic activity of 2D7-DB.
  • B A photograph showing the result of observing the localization of 2D7-DB and actin after treating the tumor cell line with 2D7-DB.
  • FIG. 7 shows the results of examination of signal transduction related to cytotoxicity of 2D7-DB by Western blotting.
  • cell lines RPMI8226, KM102, Jurkat
  • phosphate FAK was detected in the KM102 cell line.
  • B shows the results of examination of signal transduction related to 2D7-DB cytotoxicity by Western blotting.
  • cell lines RPM 18226, KM 102
  • phosphorylated Akt was observed in KM102.
  • C Signal transduction related to cytotoxicity of 2D7-DB examined by Western blotting.
  • the present invention relates to a combined use of interferon and anti-HLA class I antibody.
  • the present inventors have shown for the first time that the combined use of interferon enhances the action of anti-HLA class I antibodies.
  • interferon is a general term for proteins or glycoproteins having antiviral action induced by animal cells by viruses, double-stranded RNA, lectins, and the like. In addition to antiviral action, it has cell growth inhibitory action and immunomodulatory action. It is classified into several types according to the production cell, the ability to bind to a specific receptor, and the biological 'physicochemical properties. The main ones are a, j8, and ⁇ , but this force, IFN CO, IFN The existence of T is known. Furthermore, interferon ⁇ is known to have more than 20 subtypes.
  • various genetically modified preparations such as PEGylated and consensus interferon have been developed and put on the market. For example, an example of an interferon preparation is Pegasys (Roche), which is a preparation of PE G-interferon at 2a.
  • the interferon in the present invention may be any of the above types, but is preferably a or ⁇ .
  • the interferon in the present invention is a natural type, an artificially mutated gene recombinant type, a naturally occurring mutant, a fusion protein, or a fragment thereof as long as it enhances cell death induction by an anti-HLA class I antibody. Any of .
  • the origin of the interferon in the present invention for example, human, chimpanzee, orangutan, inu, horse, hidge, goat, ronoku, pig, cat, mouse, monoremot, rat, rabbit, etc. However, it is not limited to these, and other mammals can be derived. Preferably it is human-derived interferon.
  • the amino acid sequence of human interferon ⁇ or ⁇ is known.
  • the amino acid sequence described in GenBank: NM_0240013 can be used for interferon ⁇
  • GenBank: NM_000619 for interferon ⁇ .
  • the amino acid sequence of interferon ⁇ is shown in SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of interferon ⁇ is shown in SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence of the same ⁇ is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the interferon can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • human-derived interferon-producing cell strength is also prepared by preparing mRNA by well-known means to produce a cDNA library, and from the cDNA library, all or part of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • the cDNA can be prepared by selecting a cDNA that hybridizes with the probe having the nucleotide sequence ability under stringent conditions, expressing the cDNA using an appropriate host / vector system, and purifying the obtained protein.
  • the host 'vector system may be used in the following examples of host * vector systems that can be used for antibody production.
  • a primer is designed on the basis of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and human-derived interferon-producing cell force-adjusted mRNA is used as a saddle, and RT-PCR is performed using the primer.
  • the obtained cDNA can also be expressed and prepared.
  • Those skilled in the art can appropriately select the stringent hybridization conditions. For example, in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 X SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 X Denhardt's solution, 20 g / ml denatured salmon sperm DNA After prehybridization at 42 ° C, add a labeled probe and incubate overnight at 42 ° C for hybridization.
  • the cleaning solution and temperature conditions in the subsequent cleaning are about ⁇ lxSSC, 0.1% SDS, 37 ° C '', and more severe conditions are about ⁇ 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C ''.
  • a polypeptide encoded by a polynucleotide isolated using such hybridization technology usually has high homology in amino acid sequence with the polypeptide identified by the present inventors.
  • High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more (e.g. , 98-99%) sequence homology.
  • the identity of the amino acid sequence can be determined, for example, by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993 by Karlin and Altschul.
  • BLASTX Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990.
  • wordlength 3.
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov.).
  • a polypeptide similar to the interferon having the above sequence can be suitably used in the present invention as long as the cell death induction by the anti-HLA class I antibody is enhanced.
  • a polypeptide a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or Z and inserted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, wherein the anti-HLA class I antibody A polypeptide having an effect of enhancing cell death induction, which is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added, or Z and inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, wherein the anti-HLA A polypeptide having a class I antibody cell death induction enhancing action, encoded by a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions A polypeptide comprising an amino acid sequence that is encode
  • polypeptides can be prepared by methods well known to those skilled in the art. For example, using the whole or part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 as a probe, select a clone that is the center of hybridization of a cDNA library prepared from interferon-producing cells, and prepare it by expressing it. be able to.
  • a site-specific or random mutation may be introduced into the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 by performing a gene modification method well known to those skilled in the art, such as PCR-based mutagenesis or cassette mutagenesis.
  • a gene modification method well known to those skilled in the art, such as PCR-based mutagenesis or cassette mutagenesis.
  • HLA class I-expressing cells can be contacted with a test polypeptide, and the cell viability of the cells can be determined by WST-8 assay or trypan blue exclusion test. Specifically, it can be examined by the method described in Reference Example 2 of this specification.
  • an anti-HLA class I antibody is an antibody that recognizes a molecule classified as HLA class I.
  • HLA means human leukocyte antigen.
  • HLA molecules are classified into Class I and Class II. Class I includes HLA-A, B, C, E, F, G, H, and J, and Class II includes HLA-DR and DQ. DP, etc. are known.
  • the antigen recognized by the anti-HLA class I antibody is not particularly limited as long as it is a molecule classified as HLA class I, but is preferably HLA-A.
  • leukocytes are blood cells involved in biological defense.
  • leukocytes include lymphocytes (B cells, helper T cells, suppressor T cells, killer T cells, NK cells), monocytes (macrophages), granulocytes (neutrophils, eosinophils, basophils), etc. Is included.
  • the leukocytes in the present invention include lymphocytes (B cells, helper T cells, suppressor T cells, killer T cells, NK cells), monocytes (macrophages), granulocytes (neutrophils, eosinophils, basophils). Any white blood cell may be used.
  • the antibody that recognizes HLA class I in the present invention is not particularly limited as long as it recognizes HLA class I! / ⁇ , but is preferably an antibody that specifically recognizes HLA class I.
  • the antibody recognizing HLA class I may be an already known antibody, or may be an anti-HLA class aircraft prepared by a method known to those skilled in the art using HLA class I as an antigen. Specifically, the production of the antibody can be performed, for example, as follows.
  • HLA class I protein or a fragment thereof as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method.
  • Monoclonal antibody-producing cells are screened by the screening method described above.
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using baculovirus (W098 / 46777 etc.).
  • Hypridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3_46).
  • the immunogenicity of the antigen When the immunogenicity of the antigen is low, it may be immunized by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin. Then, the cDNA of the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the mRNA of nobridoma using reverse transcriptase, and the resulting cDNA sequence can be decoded by a known method.
  • an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • anti-HLA class I antibody a mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, Hedge antibody, human antibody and the like, which are not particularly limited as long as they bind to HLA class I, can be appropriately used.
  • recombinant antibodies artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity against humans such as chimeric antibodies and humanized antibodies, can also be used.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is a mammal other than a human, for example, a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and human antibody heavy chain, an antibody that has a constant region of a light chain, and the like, and encodes a variable region of a mouse antibody. It can be obtained by ligating DNA with DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into the host, and producing it.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and a complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, eg, a mouse antibody, is used as the complementarity determining region of a human antibody. It is transplanted and its general genetic recombination technique is also known. Specifically, mouse antibody CDRs and human antibody framework regions (framewor A DNA sequence designed to link k regions (FR) is synthesized by PCR from several oligonucleotides prepared so as to have overlapping portions at the ends. The obtained DNA is ligated with DNA encoding the constant region of a human antibody, and then incorporated into an expression vector and introduced into a host for production (European Patent Application Publication No.
  • CDR complementarity determining region
  • the human antibody FR to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen-binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site! /, (Sato, K. et al "Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells such as U266, and the desired human antibody having activity to bind to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector having the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • Preferred anti-HLA class I antibodies in the present invention include low molecular weight anti-HLA class I antibodies.
  • the low molecular weight antibody is not particularly limited as long as it includes an antibody fragment which is partially lost from a full-length antibody (whole antibody such as whole IgG) and has an ability to bind to an antigen.
  • the antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody. However, it is particularly preferred that it contains a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VL), which is a fragment containing both VH and VL.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • antibody fragments include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), and the like, preferably scFv (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879— 5883, Plickthun, “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994 In order to obtain such antibody fragments, the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or genes encoding these antibody fragments are constructed and used.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • the low molecular weight antibody in the present invention preferably has a smaller molecular weight than the full-length antibody.
  • it may form a multimer such as a dimer, trimer, or tetramer.
  • the molecular weight can be large.
  • the low molecular weight antibody preferably comprises two or more VH and two or more VL of the antibody, and these variable regions are bound directly or indirectly through a linker or the like. It is an antibody.
  • the bond may be covalent or non-covalent, and may be both covalent and non-covalent.
  • a more preferred low molecular weight antibody is an antibody comprising two or more VH-VL pairs formed by binding VH and VL by a non-covalent bond. In this case, an antibody in which the distance force between one VH-VL pair and the other VH-VL pair in the low molecular weight antibody is shorter than the distance in the full-length antibody is preferable.
  • the low molecular weight antibody is Diabody or sc (Fv) 2.
  • Diabody is a dimer formed by linking two fragments (for example, scFv, etc.) in which a variable region and a variable region are linked by a linker, etc. (hereinafter, a fragment constituting Diabody).
  • a fragment constituting Diabody Usually includes two VLs and two VHs.
  • the bonds between the diabody fragments are non-shared Although it may be a bond or a covalent bond, it is preferably a non-covalent bond.
  • Fragments constituting Diabody include VL and VH combined, VL and VL combined, VH and VH combined, etc. Preferably, VH and VL are combined. is there.
  • the linker that binds the variable region to the variable region in the fragment constituting the diabody is not particularly limited, but the linker should be short enough so that non-covalent bonding occurs between the variable regions in the same fragment. Is preferred.
  • the length of such a linker can be appropriately determined by those skilled in the art. Usually, it is 2 to 14 amino acids, preferably 3 to 9 amino acids, particularly preferably 4 to 6 amino acids.
  • VL and VH encoded on the same fragment have a short linker between them, so no non-covalent bond occurs between VL and VH on the same chain, and no single-chain V region fragment is formed.
  • Dimers by non-covalent bonds with other fragments it is also possible to produce antibodies in the form of multimers such as trimers and tetramers by combining three or more of the fragments that constitute Diabody, based on the same principle as in the preparation of Diabody.
  • Diabody having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or one or more amino acid sequences in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 are mutated (substitution, deletion, insertion, A diabody having the amino acid sequence added and Z) or a diabody functionally equivalent to the diabody having the sequence of SEQ ID NO: 5, the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 6, and the SEQ ID NO: :
  • Diabody having an amino acid sequence of 7 CDR (or variable region) or one or more amino acid sequences of CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 6 and CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 7 A diabody having an amino acid sequence mutated (substitution, deletion, insertion, and Z or addition), the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 6 and the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 7.
  • “functionally equivalent” means that the target diabody has the sequence described in SEQ ID NO: 5, or the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 It has an activity equivalent to that of a diabody having the CDR (or variable region) sequence (eg, HLA-A binding activity, cell death inducing activity, etc.).
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids).
  • humanization or chimerization may be performed for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans.
  • 1st to 134th corresponds to the variable region, 50th to 54th force SCDR1, 69th to 85th force CDR2, 118th to 134th force Corresponds to SCDR 3.
  • 1st to 128th corresponds to the variable region, 46th to 55th power CDR1, 71th to 77th CDR2, 110th to 128th CDR3 It corresponds to.
  • sc (Fv) 2 is an antibody in which two heavy chain variable regions ([VH]) and two light chain variable regions ([VL]) are combined with a linker to form a single chain polypeptide. (Hudson et al., J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). sc (Fv) 2 is, for example, two scFv (single chain Fv) (Huston, JS et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the order of the two heavy chain variable regions and the two light chain variable regions to be joined is not particularly limited, and may be arranged in any order.
  • sc (Fv) 2 having an arrangement of [VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL] is preferable.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region or the light chain variable region may be substituted, deleted, added, and Z or inserted. Further, when the heavy chain variable region and the light chain variable region are associated with each other, as long as they have antigen-binding activity, a part thereof may be deleted or another polypeptide may be added.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • the linker that binds the variable region of an antibody may be any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker, such as Protein Engineering, 9 (3), 299-305. , 1996 can be used.
  • a preferred linker in the present invention is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose, but is usually 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30. Amino acids, particularly preferably 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
  • amino acid sequence of the peptide linker examples include the following sequences.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (Succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (Sulfo-DST), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidocarboxy-
  • examples of sc (FV) 2 include the following (a) to (i): is not.
  • sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having CDR1, 2, and 3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11, and 12.
  • sc (Fv) 2 comprising a light chain variable region having CDR1, 2, and 3 having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NOs: 13, 14, and 15.
  • D sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19.
  • SEQ ID NOs: 16 and 17 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of the 2D7 heavy chain variable region, respectively, and the 50th to 54th CDR1 (SEQ ID NO: 10) and 69th to 85th in that region. It corresponds to force SCDR2 (SEQ ID NO: 11), 118th to 123rd force SCDR3 (SEQ ID NO: 12).
  • SEQ ID NOs: 18 and 19 represent the nucleotide sequence and amino acid sequence of the 2D7 light chain variable region, respectively, and the 46th to 55th force CDR1 (SEQ ID NO: 13) and 71st to 77th force SCDR2 in the region.
  • SEQ ID NO: 14 corresponding to the 110th to 118th forces SCDR3 (SEQ ID NO: 15).
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding scFV in which the above heavy chain variable region and light chain variable region are linked by a linker is shown in SEQ ID NO: 20 and the amino acid sequence of scFV is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding sc (FV) 2 is shown in SEQ ID NO: 8 and the amino acid sequence of sc (FV) 2 is shown in SEQ ID NO: 9.
  • sc (Fv) 2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or sc (Fv) 2 having CDR (or variable region) having the amino acid sequence ability set forth in SEQ ID NO: 9
  • sc (Fv) 2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9
  • CDR or variable region
  • “functionally equivalent” means that the target antibody has sc (FV) 2 having the sequence described in SEQ ID NO: 9, or the amino acid sequence capability described in SEQ ID NO: 9. It means having activity equivalent to sc (FV) 2 having CDR (or variable region) (for example, binding activity to HLA-A, cell death-inducing activity, etc.).
  • a method well known to those skilled in the art for preparing a polypeptide functionally equivalent to a certain polypeptide a method for introducing a mutation into the polypeptide is known. For example, a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atom-containing side Amino acids with chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with side-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side Amino acids with chains (H, F, Y, W) can be listed (in parentheses are!
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substance, and toxin. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the above-described antibodies can be produced by methods known to those skilled in the art. Specifically, the DNA of the target antibody is incorporated into an expression vector. In that case, it is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. In that case, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • pGEM-T for the purpose of cDNA subcloning and excision, in addition to the above-mentioned vectors, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • an expression vector is particularly useful.
  • an expression vector for example, for the purpose of expression in Escherichia coli, in addition to the above-mentioned characteristics that the vector is amplified in Escherichia coli, the host is used with Escherichia coli such as JM109, DH5 «, HB101, XLl-Blue.
  • Escherichia coli such as JM109, DH5 «, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 54 4-546; FASEB J.
  • the vector also includes a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out using, for example, the salt calcium method or the electopore method.
  • examples of vectors for producing the polypeptide of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S (Nucleic Acids.
  • insect cell-derived expression vectors eg “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (GIBCO BRL), p BacPAK8), plant-derived Expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit”) (Invitrogen), pNVll, SP-Q01), and Bacillus subtilis-derived expression vectors (for example, pPL608, pK ⁇ 50).
  • plant-derived Expression vectors eg, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • retrovirus-derived expression vectors eg, pZIPneo
  • yeast-derived expression vectors eg, “Pichia Expression Kit”
  • a promoter required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277 108), MMLV-LTR promoter, EF1 alpha promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. It is more preferable to have a gene (eg, a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the gene when the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell, the DHFR gene that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used. And a method of amplifying with methotrexate (MTX), and when transient expression of the gene is intended, a gene that expresses SV40 T antigen
  • a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using COS cells having a chromosome on the chromosome can be mentioned.
  • a vector such as pcD
  • COS cells having a chromosome on the chromosome
  • the replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is used as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydro A folate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydro A folate reductase
  • the combined use of an interferon and an anti-HLA class I antibody means administration or use of an interferon and an anti-HLA class vehicle together (hereinafter simply referred to as "administration").
  • the order of administration of the interferon and anti-HLA class I antibody of the present invention is as follows: administration of anti-HLA class I antibody after administration of interferon, administration of interferon and anti-HLA class I antibody simultaneously, administration of interferon after administration of anti-HLA class I antibody, Preferably, anti-HLA class I antibody is administered after interferon administration or interferon and anti-HLA class I antibody are administered simultaneously, more preferably anti-HLA class I antibody after interferon administration. Is to administer.
  • the administration interval between the interferon and the anti-HLA class vehicle is not particularly limited, and can be set in consideration of factors such as administration route and dosage form.
  • An example of the administration interval is usually 0 hours to 72 hours, preferably 0 hours to 24 hours, and more preferably 0 hours to 12 hours.
  • the action of an anti-HLA class I antibody refers to a biological action that occurs when an antibody binds to an antigen.
  • Specific examples include cell death-inducing action, apoptosis-inducing action, Examples thereof include cell growth inhibitory action, cell differentiation inhibitory action, cell division inhibitory action, cell proliferation inducing action, cell differentiation inducing action, cell division inducing action, and cell cycle regulating action.
  • the activity enhanced by interferon may be any activity as long as the anti-HLA class I antibody has activity, but is preferably a cell death-inducing action or a cell growth-inhibiting action.
  • the cells to be subjected to the above-mentioned actions are not particularly limited, but blood cells and floating cells are preferable.
  • blood cells include lymphocytes (B cells, T cells), neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes (preferably activated peripheral blood mononuclear cells (peripheral blood mononuclear cells (PBMC)), multiple myeloma (myeloma, MM) cells, etc.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • myeloma myeloma, MM cells, etc.
  • Power lymphocytes B cells, T cells
  • myeloma cells are preferred, T cells or B cells (especially active cells) B cells or activated T cells), myeloma cells are most preferred.
  • adherent cells are cells that adhere to the surface of an incubator such as glass or plastic when cells are cultured.
  • an anti-HLA class I antibody is administered in combination with interferon, for example, a tumor such as a blood tumor (hematopoietic tumor)
  • a tumor such as a blood tumor (hematopoietic tumor)
  • hematopoietic tumor specific examples include leukemia and myelodysplastic syndrome.
  • Malignant lymphoma chronic myelogenous leukemia, plasmacytosis (myeloma, multiple myeloma, macroglobulinemia), myeloproliferative disorder (true erythrocytosis, essential blood platelet disease, idiopathic bone marrow fiber )
  • autoimmune diseases specifically examples are rheumatism, autoimmune hepatitis, autoimmune thyroiditis, autoimmune blistering, autoimmune adrenal cortisitis, autoimmune hemolytic anemia, self Immune thrombocytopenic purpura, autoimmune atrophic gastritis, autoimmune neutropenia, autoimmune orchitis, autoimmune ence
  • Preferred indications include hematological tumors, and particularly preferred indications include multiple myeloma.
  • the anti-HLA class I antibody can be combined with interferon into a single pharmaceutical composition. Further, the anti-HLA class I antibody can be used as a pharmaceutical composition characterized by being used in combination with interferon. That is, the anti-HLA class I antibody can be used for the production of a “pharmaceutical composition comprising an anti-HLA class vehicle and a pharmaceutically acceptable carrier, characterized by being used in combination with interferon”. In addition, interferon can be used as a pharmaceutical composition characterized by being used in combination with an anti-HLA class I antibody. That is, interferon can be used for the production of “a pharmaceutical composition comprising interferon and a pharmaceutically acceptable carrier, characterized by being used in combination with an anti-HLA class I antibody”.
  • the above-mentioned pharmaceutically acceptable carrier means a pharmaceutically acceptable material that itself does not have the above-mentioned activity and can be administered together with the above-mentioned drug.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are used, for example, as stabilizers, buffers, stabilizers, preservatives, excipients, suspending agents, emulsifiers, solubilizing agents, and the like.
  • a stabilizer about 0.2% of gelatin dextran, 0.1-1.0% sodium glutamate, or about 5% lactose or about 2% sorbitol can be used. Is not to be done.
  • As a preservative the ability to use about 0.01% thimerosal or about 0.1% betapropionolaton is not limited to these.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a preservative, etc. are added as necessary, and a subcutaneous, intramuscular or intravenous injection is prepared by a conventional method.
  • the injection may be a solid preparation or a preparation prepared at the time of use by lyophilization after storing the solution in a container.
  • One dose may be stored in a container, or a dose may be stored in the same container.
  • Administration in the present invention may be either oral or parenteral.
  • Oral administration can include administration in the form of oral preparations, and oral dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions are selected. can do.
  • parenteral administration include administration in the form of injections, and examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, and the like.
  • local administration may be performed by targeting a part of the target organism (one tissue such as an organ) as a target, or by administration to a blood vessel, the whole organism may be administered.
  • the antibody of the present invention may be circulated.
  • administration to multiple targets may be performed simultaneously.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene encoding the antibody to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • Techniques for introducing and expressing a gene encoding a protein that brings about the effects of the method of the present invention into a living body are known.
  • the antibody of the present invention can be locally administered to a region where treatment is desired. For example, it can be administered by local injection during surgery, the use of a catheter, or targeted gene delivery of a sequence that codes for a therapeutic agent.
  • the dose varies depending on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient contained in the pharmaceutical composition, but usually per adult, A single dose can be administered in the range of O.lmg to lOOOmg. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required. All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • IFN-a 100 U / ml, OHIF 2.5 million IU, Otsuka Pharmaceutical
  • IFN- ⁇ 100 U / ml, Ogamma 100, Otsuka Pharmaceutical
  • SEQ ID NO: 4 The amino acid sequence of IFN-a is shown in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of IFN- ⁇ is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Flow cytometry applications demonstrated that HLA-A expression was up-regulated after stimulation with IFN o; or IFN y ( Figure 1A).
  • IM-9 cells were treated with IFN-a (100 U / ml) or IFN- ⁇ (100 U / ml) for 48 hours, then cultured with 2D7-DB (1 ⁇ g / ml) for 24 hours. Cell viability was determined by -8 atsey. As a result, cell death activity was increased by the combination of 2D7-DB and IFN o; or IFN y (FIG. 1B).
  • the tumor cell line used was prepared as follows. Myeloma cell line RPMI 8226, B lymphoblastic cell line (IM-9, Raji, HS-Sultan, and Daudi), T lymphoblastic cell line CEM, chronic myeloid leukemia cell line K562, lung adenocarcinoma cell Strain 549, colon adenocarcinoma cell line COLO 201, and gastric adenocarcinoma cell line MKN-1 were obtained from Health Science Resources Bank (Osaka, Japan).
  • EBV-transformed B cell line YN was distributed by Dr. Yasuhiko Nishioka (University of Tokushima). These cell lines were cultured in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Grand Island, NY) and penicillin (100 U / ml). The cells were cultured at 37 ° C in a humidified atmosphere of 5% CO.
  • Patient MM cells were prepared as follows. First, according to Durie and Salmon classification (Dune, Bu, and bE Salmon. 1975.A clinical staging system for multiple myel oma.Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, re sponse to treatment, and survival. : 842-854), diagnosed and clinical staging of MM patients. Bone marrow samples were collected from patients after obtaining informed consent with the approval of the Tokushima University Ethics Committee. Bone marrow mononuclear cells (BMMC) were separated by centrifugation at FicoU-Hypaque (density 1.077). Patient MM cells were further purified from BMMC using CD138 microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.).
  • BMMCs from MM patients were incubated with 2% gamma globulin dissolved in PBS for 15 minutes on ice to gate myeloma cells for FITC-labeled 2D7 mAb and PE-labeled anti-CD38 mAb (BD Bioscience, CA, San Jose). Cells were then washed twice with PBS and analyzed with an EPICS XL flow cytometer (Beckman Coulter, Japan). In some experiments, cells were stimulated with IFNa or IFNy for 48 hours before analyzing HLA class I expression. HLA class I expression levels were assessed as Geo MFI using CellQuest software (BD Biosciences).
  • MM cell lines such as ARH-77, YN, IM-9, RPMI 8226, and U226, and B lymphoblastic cell lines have 2D7 mAb or anti-HLA-ABC consensus region.
  • HLA class I recognized by mAb was expressed at a high level. The level of HLA class I expression was relatively low in T cell lines and other lineage cancer cell lines. Because K562 cells lack the HLA-A and HLA-B genes (Johnson, DR 2000. Differential expression of human major histocompativility class I loci: HLA-A, —B, and—C. Hum Immunol.
  • HLA-A 2D7 antigen
  • Daudi cells do not produce j8 2-microglobulin (Rosa, F., M. Fellous, M. Dron, M. Tovey, and M. Revel. 1983. Presence of an abnormal beta 2— microglobulin mRNA in Daudi cells : induction by interferon. Immunogenetics 17: 125—131.), and expressed HLA Kufus I on the surface of the Itoda vesicle.
  • HLA-A expression in BMMC of MM patients was tested.
  • FITC labeled 2D7 mAb and BMMC were stained with phycoerythrin (PE) labeled anti-CD38 mAb.
  • PE phycoerythrin
  • Cells were gated according to CD38 expression and side scatter profile, and each cell population including myeloma cells, myeloid cells, and lymphocytes was analyzed by HLA-A expression. As shown in FIG. 2A, HLA-A expression levels were higher in myeloma cells compared to normal myeloid cells and lymphocytes.
  • HLA-A HLA-A in myeloma cells as indicated by geometric mean fluorescence intensity (Geo MFI, 1309 ⁇ 1130 [mean value SD]) (201 ⁇ 209) or lymphocytes (91 ⁇ 44) were significantly higher than those (Fig. 2B).
  • the expression of HLA-A in MM cells was strongly related to the clinical stage of MM.
  • Cytotoxic activity was performed as follows. First, the patient's MM cells (2xl0 6 cells / ml) or cell lines (5xl0 5 cells / ml) were prepared in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS at various concentrations of 2D7, W6 / 32 , B9.12.1, and JOAN-1 and other anti-HLA class I mAbs for 30 minutes at 37 ° C, followed by 10 ⁇ g / ml F (ab) jack mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearc
  • Anti-HLA class I mAbs such as W6 / 32, B9.12.1, and JOAN-1 alone had no effect on cell viability (data not shown).
  • these anti-HLA class I mAbs are MM cell lines, B lymphoblastic cell lines (AR H-77, IM-9, and U266), and Aggregation of patient MM cells was induced in a dose-dependent manner. Confirmed by cell agglutination by WST-8 Atsey or Trypan Blue exclusion test Cell death was brought about.
  • FIG. 3A The cell viability of IM-9 cells and patient MM cells 24 hours after cross-linking these anti-HLA class I mAbs with secondary antibody is shown in FIG. 3A.
  • 2D7 mAB inhibited IM-9 cell viability more efficiently than W6 / 32, B9.12.1, and JOAN-1.
  • Cell viability of freshly isolated MM cells was also inhibited by 2D7 mAb in the presence of secondary antibody. This cell aggregation and cell death occurred rapidly within 1 hour and reached a maximum after 6 hours, as previously reported (7).
  • cytotoxic effect of 2D7 mAb single-chain Fv (2D7-DB) on MM cell lines and patient MM cells was then tested. Cytotoxic activity was basically performed as described above, but tested without the addition of a secondary goat anti-mouse IgG antibody.
  • SCID mice were injected intraperitoneally with 10 / z L of Usagi anti-gascia GM1 antiserum (Wako Chemicals, Osaka, Japan) one day before inoculating the tumor.
  • ARH-77 cells (6xl0 6 cells) were inoculated into the SCID mice by intravenous injection via the tail vein, and divided into 2 groups each having 7 mice.
  • SCID by intravenous injection of 8 mg / kg 2D7-DB or phosphate buffered saline (PBS) twice a day, 1 day, 2 days, and 3 days after inoculation with ARH-77 cells Mice were treated and the duration of survival was monitored. Serum levels of human M protein were measured on day 24 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • 2D7-DB bound to HLA class IA may be caused by disruption of the intracellular actin skeleton.
  • Patent Document 1 The present inventors further examined the anti-tumor mechanism of 2D7-DB. First, various signal transduction inhibitors were pretreated for 60 minutes, and the effects of 2D7-DB (1 ⁇ g / mL) on the cytotoxicity of myeloma cell line RPMI 8226 were examined (Fig. 6A). ).
  • Interferon is thought to exert cytotoxic effects by inducing apoptosis, and signal transduction molecules such as Jak-Stat, MAP kinase, and P13 kinase are reported to be involved in this process.
  • signal transduction molecules such as Jak-Stat, MAP kinase, and P13 kinase are reported to be involved in this process.
  • 2D7-DB destroys target cells by actin aggregation, as shown in Fig. 7, it was confirmed that there was no activity of molecules involved in signal transduction.
  • the cytotoxic mechanism induced by 2D7-DB and interferon was different, and it was considered that the enhancement effect was observed in these combination therapies.
  • a novel pharmaceutical composition comprising an anti-HLA class I antibody.
  • the pharmaceutical composition of the present invention strongly enhances the action of anti-HLA class navigation such as cell death induction by the combined use of anti-HLA class I antibody and interferon.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can exhibit higher efficacy due to the action of anti-HLA class aircraft.

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Abstract

インターフェロンが細胞のHLA-Aの発現および抗HLAクラスI抗体による細胞障害にどのような効果を及ぼすかについて、抗HLAクラスI抗体として2D7-DB抗体を用い、IM-9細胞株を対象に試験を行った結果、IFNαまたはIFNγにより、HLA-Aの発現が上方制御されることが実証された。さらに、WST-8アッセイにより、インターフェロンと抗HLAクラスI抗体を併用した場合の細胞生存度を検討ところ、2D7-DBとIFNαまたはIFNγとの組み合わせにより、細胞死活性が増大することがわかった。

Description

明 細 書
抗 HLA抗体を利用した新規医薬品
技術分野
[0001] 本発明は、インターフェロンによる、抗 HLAクラス I抗体の作用の増強に関する。
背景技術
[0002] HLAクラス I抗原は、 3つのドメイン（ α 1、 α 2、 a 3)からなる 45KDの α鎖と、 12KD の β 2ミクログロブリンのヘテロダイマーによって形成される。 HLA分子の主な役割は 、細胞の中で作られる 8〜10程度のアミノ酸でできた抗原ペプチドを CD8+T細胞に提 示することであり、これによつて誘導される免疫応答や免疫寛容に非常に重要な役割 を担っている。 HLAはクラス Iとクラス IIに分類される。クラス Iには、 HLA-A、 B、 C等の 存在が知られて!/ヽる（以下にお 、て、 HLA— Aを「HLAクラス IA」とも称する）。
[0003] また、 HLAクラス IA抗原の抗体によるライゲーシヨンで、細胞増殖抑制や細胞死誘 導効果がリンパ球細胞にぉ 、て観察されており、 HLA分子のシグナル伝達分子とし ての可能性も示唆されて 、る。
[0004] すなわち、例えばヒト HLAクラス IAの a 1ドメインに対する抗体 B9.12.1、 a 2ドメイン に対する抗体 W6/32、 α 3ドメインに対する抗体 TP25.99, A1.4は、活性化リンパ球に 対して細胞増殖を抑制するとの報告がある（非特許文献 1, 2)。また、 《1ドメインに 対する二種類の抗体 MoAb90, YTH862は、活性化リンパ球に対してアポトーシスを 誘導することが報告されている（非特許文献 2, 3, 4)。この 2つの抗体によって誘導さ れるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であることが明らかにされており（非特許 文献 4)、このことからリンパ細胞で発現する HLAクラス IA抗原は、アポトーシスの信 号伝達にも関与して 、ると推測されて 、る。
[0005] さらに、ヒト HLAクラス IAの a 3ドメインに対する抗体 5H7 (非特許文献 5)、マウス M HCクラス Iのひ 2ドメインに対する抗体 RE2 (非特許文献 6)も、活性化リンパ球などに 細胞死を誘導することが報告されて 、る。
[0006] ヒト骨髄腫細胞を免疫して得られたモノクローナル抗体 2D7も、 HLAクラス Iを認識す る抗体であり、該 2D7を低分子化 (Diabody化)することにより、ヒト骨髄腫細胞株に対 して短時間で激しい細胞死を誘導することが報告されている。 2D7 diabodyは、各種ヒ ト骨髄腫細胞株、および、活性化リンパ球細胞に対して強い細胞死誘導活性を示し 、マウスにヒト骨髄腫細胞株を移植した多発性骨髄腫モデルマウスにおいても、有意 な延命効果を示したことから、骨髄腫治療薬として開発が進められている (特許文献 1 ,2,非特許文献 7 なお特許文献 2は基礎出願の出願時において未公開である。 )0こ のような、 HLAクラス I関与の細胞死誘導を利用した治療をさらに発展させれば、骨髄 腫等に対する有効性の高い医薬品が開発されるものと期待されるが、抗 HLAクラス I 分子抗体の作製およびその低分子化以外については、上記細胞死誘導利用の新 規医薬品に関する報告がな！、。
[0007] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
特許文献 1： WO2004/033499
特許文献 2： WO2005/056603
非特許文献 l : Fayen et al.， Int. Immunol 10: 1347-1358(1998)
非特許文献 2 : Genestier et al.， Blood 90: 3629-3639 (1997)
非特許文献 3 : Genestier et al, Blood 90: 726-735 (1997)
非特許文献 4 : Genestier et al., J. Biol. Chem. 273: 5060-5066 (1998)
非特許文献 5 :Woodle et al., J. Immunol. 158: 2156-2164 (1997)
非特許文献 6 : Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181: 2007-2015 (1995)
非特許文献 7 : Kimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 325: 1201-1209 (20
04)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗 HLAクラス I 抗体を利用した新規医薬品を創出することである。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を行った。 HLAクラス Iの細胞表 面発現はインターフェロン (以下にお!、て、場合により「IFN」とも記載する)刺激により 亢進されることが知られている。本発明者らは、インターフェロンが細胞の HLA-Aの 発現および抗 HLAクラス I抗体による細胞障害にどのような効果を及ぼすかについて 、抗 HLAクラス I抗体として 2D7-DB抗体 (2D7-Diabody抗体、非特許文献 7、以下に おいて 2D7-Diabody抗体を「2D7-DB」とも称する。）を用い、 IM-9細胞株を対象に試 験を行った。その結果、 IFN o;または IFN yにより、 HLA-Aの発現が上方制御される ことが実証された。さらに、 WST-8アツセィにより、インターフェロンと抗 HLAクラス I抗 体を併用した場合の細胞生存度を検討した。その結果、 2D7-DBと IFN o;または IFN Ύとの組み合わせにより、細胞死誘導活性が増大することがわ力つた。従来、抗 HLA クラス航体の作用増強は抗体の低分子化技術に頼っていたが、この新規知見により 、低分子化とは全く異なる手法によって抗 HLAクラス I抗体の作用を増強することが可 能となった。すなわち本発明は、抗 HLAクラス I抗体による細胞死誘導の増強に関し、 具体的には以下の発明を提供するものである。
(1)インターフ ロン及び抗 HLAクラス I抗体を有効成分とする医薬組成物、
(2)インターフ ロンと併用することを特徴とする、抗 HLAクラス I抗体を有効成分とす る医薬組成物、
(3)インターフ ロンと同時に投与することを特徴とする、抗 HLAクラス I抗体を有効成 分とする医薬組成物、
(4)インターフ ロン投与後に投与することを特徴とする、抗 HLAクラス I抗体を有効 成分とする医薬組成物、
(5)抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、上記（1)から (4)の 、ずれかに記載 の医薬組成物、
(6)抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、上記（1)から（5)の 、ずれかに記載 の医薬組成物、
(7)インターフェロン及び抗 HLAクラス I抗体を有効成分とする細胞死誘導剤、
(8)抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、上記（7)に記載の細胞死誘導剤、
(9)抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、上記（7)または（8)に記載の細胞死 誘導剤、
(10)抗 HLAクラス I抗体と併用することを特徴とする、インターフェロンを含有する医 薬組成物、 (11)抗 HLAクラス I抗体と同時に投与することを特徴とする、インターフェロンを含有 する医薬組成物、
(12)抗 HLAクラス I抗体投与前に投与することを特徴とする、インターフ ロンを含有 する医薬組成物、
(13)インターフ ロンを有効成分とする、抗 HLAクラス I抗体の作用増強剤、
(14)抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンを同時に投与する工程を含む、腫瘍の 治療及び Zまたは予防方法、
(15)抗 HLAクラス I抗体を投与する工程、及びインターフェロンを投与する工程を含 む、腫瘍の治療及び Zまたは予防方法、
(16)抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンを同時に投与する工程を含む、自己免 疫疾患の治療及び Zまたは予防方法、
(17)抗 HLAクラス I抗体を投与する工程及びインターフェロンを投与する工程を含む 、自己免疫疾患の治療及び Zまたは予防方法、
(18)抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、上記（ 14)から（ 17)の!、ずれかに 記載の治療及び Zまたは予防方法、
(19)抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、上記（ 14)から（ 18)の 、ずれかに 記載の治療及び Zまたは予防方法、
(20)上記（1)記載の医薬組成物または上記（7)記載の細胞死誘導剤を製造するた めの、抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンの使用、
(21)抗 HLAクラス I抗体として抗 HLA-A抗体を用いることを特徴とする、上記（20)に 記載の抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンの使用、
(22)抗 HLAクラス I抗体として低分子化抗体を用いることを特徴とする、上記（20)ま たは（21)に記載の抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンの使用、
(23)医薬組成物または細胞死誘導剤が腫瘍の治療及び Zまたは予防用である、上 記（20)から（22)の!、ずれかに記載の抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンの使 用、
(24)医薬糸且成物または細胞死誘導剤が自己免疫疾患の治療及び Zまたは予防用 である、上記（20)から（22)の 、ずれかに記載の抗 HLAクラス I抗体及びインターフエ ロンの使用、
(25)上記（2)から (4)の 、ずれかに記載の医薬組成物を製造するための、抗 HLAク ラス I抗体の使用、
(26)抗 HLAクラス I抗体として抗 HLA-A抗体を用いることを特徴とする、上記（25)に 記載の抗 HLAクラス I抗体の使用、
(27)抗 HLAクラス I抗体として低分子化抗体を用いることを特徴とする、上記（25)ま たは（26)に記載の抗 HLAクラス I抗体の使用、
(28)医薬組成物が腫瘍の治療及び Zまたは予防用である、上記（25)力も (27)の いずれかに記載の抗 HLAクラス I抗体の使用、
(29)医薬組成物が自己免疫疾患の治療及び Zまたは予防用である、上記（25)か ら（27)の 、ずれかに記載の抗 HLAクラス I抗体の使用、
(30)抗 HLAクラス航体を含む細胞死誘導剤の作用増強剤を製造するための、イン ターフェロンの使用、
(31)抗 HLAクラス航体を含む腫瘍の治療および Zまたは予防剤の作用増強剤を製 造するための、インターフェロンの使用、
(32)抗 HLAクラス航体を含む自己免疫疾患治療および Zまたは予防剤の作用増 強剤を製造するための、インターフェロンの使用、
(33)抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、上記（30)から（32)の!、ずれかに 記載のインターフェロンの使用、
(34)抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、上記（30)から（33)の 、ずれかに 記載のインターフェロンの使用、
(35)抗 HLAクラス I抗体及びインターフェロンを併用することを特徴とする、細胞死誘 導方法、
(36)抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、上記（35)に記載の細胞死誘導方 法、
(37)抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、上記（35)または（36)に記載の細 胞死誘導方法、
(38)インターフェロンを投与することを特徴とする、抗 HLAクラス航体の作用増強方 法。
図面の簡単な説明
[図 1]2D7-DB媒介性細胞障害に及ぼす IFNの効果を示す図である。 (A)骨髄腫細胞 の HLA-A発現に及ぼす IFNの効果を示す。 IM-9細胞を IFN- a (100 U/ml)または IF Ν- γ (100 U/ml)で 48時間処理した。フローサイトメトリーにより、 HLA-Aの細胞表面 発現を 2D7を用いて解析した。 IFN処理細胞の染色特性を太線で、未処理のものを 実線で示す。陰性対照染色を点線で示す。 (B) IFNによる 2D7-DB媒介性細胞障害 の亢進を示すグラフである。 IM-9細胞を IFN- α (100 U/ml)または IFN- γ (100 U/ml )で 48時間処理し、次いで 2D7-DB (0.1または 1 μ g/ml)と共に 24時間培養した。 WST -8アツセィにより細胞生存度を決定した。データは三重測定値（障害を受けた細胞数 /全体の細胞数）の平均値士 SDを示す (*pく 0.05)。
[図 2]多発性骨髄腫 (MM)患者由来の骨髄細胞における HLA-Aの発現パターンを示 す図である。（A)患者番号 17由来の BMMCを、 FITC標識 2D7 mAbおよび PE標識抗 C D38 mAbを用いて、フローサイトメトリーにより解析した。細胞にゲートをかけた後（R1 、 CD38陽性 MM細胞; R2、骨髄性細胞；および R3、リンパ球）、各細胞集団を HLA- A 発現について評価した。 (B) 22名の MM患者由来の BMMCを、 HLA-A発現について 解析した。データは、各細胞集団についての幾何平均蛍光強度 (Geo MFI)として示し た。
[図 3]MM細胞における抗 HLAクラス I抗体の細胞障害活性を示す図である。 (A) MM 細胞に及ぼす様々な抗 HLAクラス I mAbの効果を検討した結果のグラフ。 IM-9細胞 または患者番号 13に由来する精製 MM細胞を、 2D7、 W6/32、 B9.12.1、および JOAN -1等の抗 HLA-Aクラス I mAbと共に、 10 μ g/ml F(ab')ャギ抗マウス IgG抗体も加えて
2
24時間培養した。他の実験では、ャギ抗マウス IgG抗体の非存在下で細胞を 2D7-D Bと共に培養した。 WST-8アツセィまたはトリパンブルー排除試験により、細胞生存度 を決定した。データは 3つ組測定値の平均値を示す。 (B) 2D7-DB処理後の骨髄腫細 胞の形態学的所見。患者番号 18由来の精製 MM細胞を、 207-ΟΒ (1
Figure imgf000008_0001
の存在 下または非存在下で 24時間培養した。次いで細胞をスライドグラス上で固定し、ライト •ギムザで染色した (原本の倍率、 xl000) o (C)患者の MM細胞における 2D7-DBの細 胞障害活性を示すグラフ。 CD138陽性 MM細胞を 6名の患者力も精製し、 2D7- DB (0. ほたは 1 μ g/ml)と共に 24時間培養した。トリパンブルー排除試験により細胞生存度 を決定した。データは 2つ組の平均値を示す。
[図 4]骨髄細胞に及ぼす 2D7-DBの効果を示す図である。 (A) 2D7-DBによる患者の MM細胞の根絶の様子を示す。患者番号 12に由来する全 BMMCを、 2D7_DB (1 μ g/ ml)の存在下または非存在下で 48時間培養した。細胞を培養した後、 FITC標識抗 H LA-ABC mAbおよび PE標識抗 CD38 mAbを用いて、 MM細胞の集団をフローサイト メトリーにより判定した。側方散乱光 (SS)プロファイルおよび CD38発現に従って、 MM 細胞領域 (R1)にゲートをかけた。（B)同じ患者由来の BMMCを、 207-ΟΒ (1
Figure imgf000009_0001
の存在下または非存在下で 48時間培養した。次 、で細胞をスライドグラス上で固定し 、ライト'ギムザで染色した (原本の倍率、 x400)。 (C)患者番号 12に由来する BMMC の接着性画分を 24ゥエルプレートで培養した。間質細胞が増殖した後、患者の MM細 胞（lxl06/ml)をそのプレートで 24時間培養し、次いで 2D7- DB (1 μ g/ml)で 48時間処 理した。結果は 3つの独立した実験の代表的なものである。
[図 5]ヒト骨髄腫の異種移植モデルにおける 2D7-DBの治療効力を示す図である。 SC IDマウスの静脈内に ARH- 77細胞（6xl06/マウス）を接種した。 1日、 2日、および 3日 目に、 7匹のマウスの群を、 2D7-DBまたは PBSを静脈内に注射することによって処置 した。（A) 24日目に、 ELISAによりヒ HgGの血清濃度を測定した。データは、 7匹のマ ウスの平均値士 SDを示す（*p〈0.05)。（B)これらの SCIDマウスの生存の力プラン'マイ ヤー解析 (**Pく 0.05)。
[図 6](A)各種シグナル伝達阻害薬で前処理した骨髄腫細胞株 RPMI8226に 2D7-DB を添カ卩した後の細胞傷害活性を示す図である。 Caspase阻害剤（z-VAD-foik)、 MAP キナーゼ阻害剤 (PD98059), PI-3キナーゼ阻害剤 (Wortmannin)による処理は、 2D7 -DBの細胞傷害活性に対し影響を与えなカゝつた。 Rho GTP阻害剤（Clostridium diffic ile toxin B)、ァクチン重合阻害剤による処理は、 2D7-DBの細胞傷害活性をほぼ完 全に抑制した。（B)腫瘍細胞株を 2D7-DBで処理し、 2D7-DBとァクチンの局在を観察 した結果の写真である。骨髄腫細胞株 ARH- 77では、 2D7処理によってァクチン凝集 が起こり、さらに上記ァクチン凝集はァクチン重合阻害剤（Latrunculin A)の前処理に よって抑制された。骨髄ストローマ細胞株 KM102では、 2D7処理によるァクチン凝集 は認められなかった。
[図 7](A)2D7-DBの細胞傷害にかかわるシグナル伝達をウェスタンブロット法で検討 した結果の図である。細胞株（RPMI8226、 KM102, Jurkat)を 2D7-DBで刺激したとこ ろ、 KM102細胞株においてリン酸ィ匕 FAKが検出された。（B)2D7-DBの細胞傷害にか かわるシグナル伝達をウェスタンブロット法で検討した結果の図である。細胞株 (RPM 18226、 KM 102)を 2D7-DBで刺激したところ、 KM102においてリン酸化 Aktが認められ た。（C)2D7-DBの細胞傷害にかかわるシグナル伝達をウェスタンブロット法で検討し た結果の図である。細胞株（RPMI8226、 KM102)を 2D7-DBで刺激し、リン酸ィ匕 ERK1 、リン酸化 ERk2、リン酸ィ匕 MAPKが検出されるかどうか検討した。（D)2D7-DBによるァ ポトーシス誘導の有無を検討した結果の図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、インターフェロンと抗 HLAクラス I抗体の併用に関する。本発明者らによ つて、インターフェロンの併用が抗 HLAクラス I抗体の作用を増強することが初めて示 された。
[0012] 一般に、インターフェロンとは、ウィルス、二本鎖 RNA、レクチンなどによって動物細 胞カゝら誘発される抗ウィルス作用をもったタンパク質または糖タンパク質の総称であ る。抗ウィルス作用の他、細胞増殖抑制作用、免疫調節作用を有する。産生細胞、 特異的受容体との結合能、生物'物理化学的性質から数種のタイプに分類され、主 要なものとしては a、 j8、 γがあるが、このほ力、 IFN CO、IFN Tの存在が知られている 。さらにインターフェロン αには、 20種以上のサブタイプの存在が知られている。現在 、天然型のみならず、 PEG化、コンセンサスインターフェロン等の各種遺伝子組み換 え型の製剤が開発'上市されている。例えば、インターフェロン製剤の一例として、 PE G-インターフェロン at 2aの製剤である、 Pegasys (Roche社)を挙げることができる。
[0013] 本発明におけるインターフェロンは、上記タイプのいずれでもよいが、好ましくは a または γである。また、本発明におけるインターフェロンは、抗 HLAクラス I抗体による 細胞死誘導を増強する限り、天然型、人工的に変異された遺伝子組み換え型、天然 に存在する変異体、融合タンパク質、又はこれらの断片などのいずれであってもよい 。本発明におけるインターフェロンの由来に特に制限はなぐ例えば、ヒト、チンパン ジー、オランウータン、ィヌ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ロノく、ブタ、ネコ、マウス、モノレモット、 ラット、ゥサギなどを由来とすることができるが、これらに限らずその他の哺乳動物を由 来とすることができる。好ましくはヒト由来のインターフェロンである。
[0014] ヒトインターフェロン α又は γのアミノ酸配列は公知であり、例えば、インターフエ口 ン αであれば GenBank:NM_0240013に記載のアミノ酸配列を用いることができ、インタ 一フエロン γであれば GenBank:NM_000619に記載のアミノ酸配列を用いることができ る。インターフェロン αのアミノ酸配列を配列番号 1に、塩基配列を配列番号 2に、ィ ンターフ ロン γのアミノ酸配列を配列番号 3に、同 γの塩基配列を配列番号 4に示 す。上記インターフェロンは、当業者に周知の方法によって調製可能である。例えば 、ヒト由来のインターフェロン産生細胞力も周知手段により mRNAを調製して cDNAライ ブラリーを作製し、該 cDNAライブラリーの中から、配列番号 2または配列番号 4に記 載の塩基配列の全部または一部の塩基配列力 なるプローブとストリンジェントな条 件でハイブリダィズする cDNAを選択し、該 cDNAを適当な宿主 ·ベクター系を用いて 発現させ、得られたタンパク質を精製することにより調製可能である。宿主'ベクター 系は、後述の、抗体の製造に使用可能な宿主 *べクタ一系の例の中力 使用してもよ い。または、配列番号 2または配列番号 4に記載の塩基配列に基づいてプライマーを 設計し、ヒト由来のインターフェロン産生細胞力 調製した mRNAを铸型にして上記プ ライマーを用いて RT-PCRを実施し、得られた cDNAを発現させて調製することもでき る。
[0015] 上記ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者であれば、適宜選択 することができる。一例を示せば、 25%ホルムアミド、より厳しい条件では 50%ホルム アミド、 4 X SSC、 50mM Hepes pH7.0、 10 Xデンハルト溶液、 20 g/ml変性サケ精子 DNAを含むハイブリダィゼーシヨン溶液中、 42°Cで一晚プレハイブリダィゼーシヨンを 行った後、標識したプローブを添加し、 42°Cで一晩保温することによりハイブリダィゼ ーシヨンを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「lxSSC、 0.1% SD S、 37°C」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、 0.1% SDS、 42°C」程度で、さらに 厳しい条件としては「0.2xSSC、 0.1% SDS、 65°C」程度で実施することができる。このよ うにハイブリダィゼーシヨンの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性 を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記 SSC、 SDSおよび温度の条 件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジ エンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ 、ノ、イブリダィゼーシヨン反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様の ストリンジエンシーを実現することが可能である。
[0016] このようなハイブリダィゼーシヨン技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコー ドするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列 において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 40%以上、好ましくは 60 %以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは少な くとも 95%以上、さらに好ましくは少なくとも 97%以上 (例えば、 98から 99%)の配列の 相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリ ズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づい て、 BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215: 403-410, 1990)。 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は たとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用 いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の 具体的な手法は公知である (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0017] また上記配列のインターフェロンに限らず、上記配列のインターフェロンに類似する ポリペプチドも、抗 HLAクラス I抗体による細胞死誘導を増強する限り、本発明におい て好適に用いることができる。このようなポリペプチドとして、配列番号 1記載のァミノ 酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、付加または Zおよび挿入され たアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、抗 HLAクラス I抗体細胞死誘導増強作用 を有するポリペプチド、配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数のァミノ 酸が欠失、置換、付加または Zおよび挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドで あって、抗 HLAクラス I抗体細胞死誘導増強作用を有するポリペプチド、配列番号 2 記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列によりコードさ れるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、抗 HLAクラス I抗体細胞死誘導増強作 用を有するポリペプチド、配列番号 4記載の塩基配列とストリンジ ントな条件でノ、ィ ブリダィズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、 抗 HLAクラス I抗体細胞死誘導増強作用を有するポリペプチドを挙げることができる。
[0018] このようなポリペプチドは、当業者に周知の方法によって調製することができる。例 えば、配列番号 2または 4に記載の塩基配列の全部または一部をプローブとし、イン ターフェロン産生細胞から調製した cDNAライブラリーの中力 ハイブリダィズするクロ ーンを選択し、発現させることで調製することができる。または、配列番号 2または 4記 載の塩基配列に、 PCRによる変異導入法やカセット変異法などの当業者に周知の遺 伝子改変方法を施し、部位特異的にまたはランダムに変異を導入することによって、 調製することができる。または配列番号 2または 4記載の塩基配列に変異を導入した 配列を、市販の核酸合成装置によって合成することも可能である。
[0019] このようにして調製したポリペプチド力 抗 HLAクラス I抗体による細胞死誘導を増強 するかどうかについては、公知方法によって検討することができる。例えば、 HLAクラ ス I発現細胞を被検ポリペプチドと接触させ、該細胞の細胞生存度を WST-8アツセィ やトリパンブルー排除試験等により求めることができる。具体的には、本明細書の参 考例 2に記載の方法によって検討可能である。
[0020] 本発明にお 、て、抗 HLAクラス I抗体とは、 HLAクラス Iに分類される分子を認識する 抗体である。本発明において、 HLAとは、ヒト白血球抗原を意味する。 HLA分子はク ラス Iとクラス IIに分類され、クラス Iとしては HLA-A、 B、 C、 E、 F、 G、 H、 Jなどが知られ ており、クラス IIとしては HLA- DR、 DQ、 DPなどが知られている。本発明において、抗 HLAクラス I抗体が認識する抗原は、 HLAクラス Iに分類される分子であれば特に制限 されないが、好ましくは HLA-Aである。本発明において、白血球は生体防御に関係 する血液細胞である。一般に、白血球にはリンパ球 (B細胞、ヘルパー T細胞、サプ レッサー T細胞、キラー T細胞、 NK細胞）、単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球、 好酸球、好塩基球)などが含まれる。本発明における白血球としては、リンパ球 (B細 胞、ヘルパー T細胞、サプレッサー T細胞、キラー T細胞、 NK細胞）、単球（マクロフ ァージ）、顆粒球 (好中球、好酸球、好塩基球)等いかなる白血球でもよい。 [0021] 本発明において HLAクラス Iを認識する抗体は、 HLAクラス Iを認識する限り特に限 定されな!/ヽが、特異的に HLAクラス Iを認識する抗体であることが好ま ヽ。
[0022] HLAクラス Iを認識する抗体は、既に公知の抗体でもよぐ又、 HLAクラス Iを抗原とし 、当業者に公知の方法により作製された抗 HLAクラス航体でもよい。抗体の作製は、 具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。
[0023] HLAクラス Iタンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の 免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知 の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞 (ハイプリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウ ィルスを用いた方法 (W098/46777など）等に準じて行うことができる。ハイプリドーマ の作製は、たとえば、ミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C, Methods En zymol. (1981) 73: 3_46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合に は、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その 後、ノ、イブリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域)の cD NAを合成し、得られた cDNAの配列を公知の方法により解読すればょ 、。
[0024] 抗 HLAクラス I抗体は、 HLAクラス Iと結合する限り特に由来に制限はなぐマウス抗 体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ヒッジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒ トに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組 換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric)抗体、ヒトイ匕（Humanized)抗体なども使用でき る。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖 、軽鎖の定常領域力 なる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードする DNAを ヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿 主に導入し産生させることにより得ることができる。
[0025] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえば マウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region)をヒト抗 体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知ら れている。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framewor k region ;FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部 分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得ら れた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次 、で発現ベクターに組み 込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 E P 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照)。 CDRを介して連結されるヒト 抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される 。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成する ように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ!/、 (Sato, K.et al" Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
[0026] また、ヒト抗体の取得方法も知られて 、る。例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の 抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞 、例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもで きる（特公平 1-59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトラ ンスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することがで きる（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94 /25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パン-ングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領 域を一本鎖抗体 (scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現さ せ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子 を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定す ることができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を有 する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は 既に周知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
[0027] 本発明にお ヽて好ま 、抗 HLAクラス I抗体として、低分子化抗 HLAクラス I抗体を 挙げることができる。低分子化抗体とは、全長抗体 (whole antibody,例えば whole IgG 等)の一部分が欠損して ヽる抗体断片を含み、抗原への結合能を有して ヽれば特に 限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されな いが、重鎖可変領域 (VH)又は軽鎖可変領域 (VL)を含んでいることが好ましぐ特に 好ましいのは VHと VLの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば 、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv、 scFv (シングルチェイン Fv)、などを挙げることができるが、 好ましくは scFv (Huston, J. S. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879— 5883、 Plickthun,「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies] Vol.113, Resenburg 及び Moore編， Springer Verlag, New York, pp.269- 315, (1994》である。このような抗 体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片 を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現べク ターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、 Co, M. S. et al, J . Immunol. (1994) 152, 2968—2976； Better, M. and Horwitz, A. H" Methods Enzym ol. (1989) 178, 476—496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 1 78, 497-515； Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663； Rousseaux, J. e t al" Methods Enzymol. (1986) 121, 663—669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Tren ds Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参照）。
[0028] 本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好まし いが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、 全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
[0029] 本発明にお 、て好ま 、低分子化抗体は、抗体の VHを 2つ以上及び VLを 2つ以上 含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカ一等を介して間接的に結合した抗体 である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよぐまた、共有結合と非共有結合の 両方でもよい。さらに好ましい低分子化抗体は、 VHと VLが非共有結合により結合し て形成される VH-VL対を 2つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体 中の一方の VH-VL対と他方の VH-VL対との間の距離力 全長抗体における距離よ りも短くなる抗体が好まし 、。
[0030] 本発明にお!/、て特に好まし!/、低分子化抗体は Diabody又は sc(Fv)2である。 Diabod yは、可変領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメント (例えば、 scFv等）（以 下、 Diabodyを構成するフラグメント）を 2つ結合させて二量体ィ匕させたものであり、通 常、 2つの VLと 2つの VHを含む。 Diabodyを構成するフラグメント間の結合は非共有 結合でも、共有結合でもよいが、好ましくは非共有結合である。
[0031] Diabodyを構成するフラグメントは、 VLと VHを結合したもの、 VLと VLを結合したもの 、 VHと VHを結合したもの等を挙げることができる力 好ましくは VHと VLを結合したも のである。 Diabodyを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合す るリンカ一は特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合 がおこらな 、程度に短 、リンカ一を用いることが好まし 、。そのようなリンカ一の長さ は当業者が適宜決定することができる力 通常 2〜14アミノ酸、好ましくは 3〜9アミノ 酸、特に好ましくは 4〜6アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされる V Lと VHとは、その間のリンカ一が短いため、同一鎖上の VLと VHの間で非共有結合が おこらず、単鎖 V領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの非共有結合 による二量体を形成する。さらに、 Diabody作製と同じ原理で、 Diabodyを構成するフ ラグメントを 3つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体ィ匕させた抗体を作 製することも可能である。
[0032] 本発明における Diabodyとしては、配列番号： 5に記載のアミノ酸配列を有する Diabo dyまたは配列番号： 5に記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が 変異 (置換、欠失、挿入、および Zまたは付加）したアミノ酸配列を有する Diabodyで あって、配列番号： 5に記載の配列を有する Diabodyと機能的に同等な Diabodyや、配 列番号: 6の CDR (又は可変領域)および配列番号： 7の CDR (又は可変領域)のアミ ノ酸配列を有する Diabodyまたは配列番号： 6の CDR (又は可変領域)および配列番 号： 7の CDR (又は可変領域)のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が 変異 (置換、欠失、挿入、および Zまたは付加）したアミノ酸配列を有する Diabodyで あって、配列番号： 6の CDR (又は可変領域)および配列番号： 7の CDR (又は可変領 域）の配列を有する Diabodyと機能的に同等な Diabodyを例示できる力 これらに限定 されるものではない。
[0033] ここで「機能的に同等」とは、対象となる Diabodyが、配列番号： 5に記載の配列を有 する Diabody、または配列番号： 6の CDR (又は可変領域）および配列番号： 7の CDR ( 又は可変領域)の配列を有する Diabodyと同等の活性 (例えば、 HLA-Aへの結合活 性、細胞死誘導活性など)を有することを意味する。 [0034] 変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましく は 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内）であ ると考免られる。
[0035] また、配列番号： 5に記載のアミノ酸配列を有する Diabodyまたは、配列番号： 6の C DR (又は可変領域)および配列番号： 7の CDR (又は可変領域)の配列を有する Diab odyを、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的としてヒト化、キメラ化しても よい。
[0036] 配列番号: 6に記載されているアミノ酸配列で、 1番目〜134番目が可変領域に相当 し、 50番目〜54番目力 SCDR1、 69番目〜85番目力 CDR2、 118番目〜134番目力 SCDR 3に相当する。配列番号： 7に記載されているアミノ酸配列で、 1番目〜 128番目が可 変領域に相当し、 46番目〜55番目力 CDR1、 71番目〜77番目が CDR2、 110番目〜1 28番目が CDR3に相当する。
[0037] sc(Fv)2は、 2つの重鎖可変領域（[VH] )及び 2つの軽鎖可変領域（[VL] )をリンカ 一等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である（Hudson et al.， J Immunol. Me thods 1999 ; 231 : 177-189)。 sc(Fv)2は、例えば、 2つの scFv (シングルチェイン Fv) (H uston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plickthun,「 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies J Vol.113, Resenburg及び Moore編, Sp ringer Verlag, New York, pp.269- 315, (1994》をリンカ一等で結合することにより作製 することが可能である。リンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意のぺプチ ドリンカ一、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1 996に開示されるリンカ一等を用いることができる力 本発明においてはペプチドリン カーが好ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、 目的に応じて当業者が 適宜選択することが可能である力 通常、 1〜100アミノ酸、好ましくは 5〜30アミノ酸、 特に好ましくは 12〜18アミノ酸 (例えば、 15アミノ酸)である。
結合される 2つの重鎖可変領域と 2つの軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、ど のような順序で並べられていてもよぐ例えば、以下のような配置を挙げることができる
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL] [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
本発明においては、好ましくは、 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]の 配置を有する sc(Fv)2である。
[0038] 重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び Z又は 挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、 抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加し てもよい。又、可変領域はキメラ化ゃヒト化されていてもよい。
[0039] 本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカ一は、遺伝子工学により導入し 得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein Engineerin g, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカ一を用いることができる。
[0040] 本発明において好ましいリンカ一はペプチドリンカ一である。ペプチドリンカ一の長 さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通 常、 1〜100アミノ酸、好ましくは 3〜50アミノ酸、更に好ましくは 5〜30アミノ酸、特に好 ましくは 12〜18アミノ酸 (例えば、 15アミノ酸)である。
[0041] ペプチドリンカ一のアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることが できる。
¾er
ulyber
ulyulyber
bef ulyuly
Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 22)
Ser · Gly · Gly · Gly (配列番号：23)
Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号： 24)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 25) Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：26)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 27)
Gly · Gly Gly · Gly Gly · Gly Ser (配列番号： 28)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 29)
(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser 己列番号： 24] )n
(Ser · Gly Gly · Gly · Gly 己列番号： 25] )n
[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。
[0042] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば、 N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、 ビス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロピオ ネート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、ェチレ ングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スル ホスクシンィミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST) 、ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルポ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン（スルホー BSOCOES)などであり、これらの架橋 剤は市販されている。
[0043] 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となる力 全 て同じリンカ一を用いてもょ 、し、異なるリンカ一を用いてもょ 、。
[0044] 本発明にお 、て、好まし 、sc(FV)2の例としては、以下の (a)〜(i)の 、ずれかに記載 の抗体が挙げられる力 これらに限定されるものではない。
(a) 配列番号： 10、 11、 12に記載のアミノ酸配列からなる CDR1、 2、 3を有する重鎖 可変領域を含む sc(Fv)2。
(b) 配列番号： 13、 14、 15に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽鎖 可変領域を含む sc(Fv)2。
(c) 配列番号： 10、 11、 12に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖 可変領域および配列番号： 13、 14、 15に記載のアミノ酸配列からなる CDR1、 2、 3を 有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。 (d) 配列番号： 17に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(e) 配列番号： 19に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(D 配列番号： 17に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号： 19 に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(g) 配列番号： 21に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
(h) 配列番号： 9に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
(0 (a)〜(！ 1)のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、付加および Zまたは挿入され、かつ本発明の抗体と機能的に同等の活性を有 する sc(Fv)2。
[0045] なお、配列番号： 16、 17はそれぞれ 2D7重鎖可変領域の塩基配列、アミノ酸配列 を示し、当該領域における、 50番目〜54番目力 CDR1 (配列番号： 10)、 69番目〜85 番目力 SCDR2 (配列番号： 11)、 118番目〜123番目力 SCDR3 (配列番号： 12)に相当 する。また、配列番号： 18、 19はそれぞれ 2D7軽鎖可変領域の塩基配列、アミノ酸配 列を示し、当該領域における、 46番目〜55番目力 CDR1 (配列番号： 13)、 71番目〜 77番目力 SCDR2 (配列番号： 14)、 110番目〜118番目力 SCDR3 (配列番号： 15)に相 当する。また、上記重鎖可変領域と軽鎖可変領域をリンカ一でつないだ scFVをコー ドするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号： 20に、 scFVのアミノ酸配列を配列番 号： 21に示し、本発明の sc(FV)2をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号 ： 8に、 sc(FV)2のアミノ酸配列を配列番号： 9に示す。
[0046] また、配列番号： 9に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2または、配列番号： 9に記 載のアミノ酸配列力もなる CDR (又は可変領域)を有する sc(Fv)2を、ヒトに対する異種 抗原性を低下させること等を目的としてヒトイ匕（Humanized)、キメラ（Chimeric)化して もよい。これらの人為的に改変した抗体は、既知の方法を用いて製造することができ る。
[0047] ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が、配列番号: 9に記載の配列を有す る sc(FV)2、または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列力 なる CDR (又は可変領域)を 有する sc(FV)2と同等の活性 (例えば、 HLA-Aへの結合活性、細胞死誘導活性、など )を有することを意味する。 [0048] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知 られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、 当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、 K ramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)などを用いて、本発 明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製す ることができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発 明の抗体のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を 有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
[0049] 変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましく は 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内）であ ると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されて いる別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有 するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及 びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R 、 K、 H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧 内は!、ずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個 のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミ ノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られて いる（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662—5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487—6500、 Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、 Dalbadie - McFarland, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1982) 79, 6409-6413) oまた、抗体の定常領域などのアミノ酸配列は当業者に公 知である。 [0050] 本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等 の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよ 、。このようなコンジュゲート抗体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修 飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれ らのコンジュゲート抗体も包含される。
[0051] 上述の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、 目的 とする抗体の DNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、ェ ンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次 に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。 その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
[0052] ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pC R-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした場 合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。
[0053] 抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクター が有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は 、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 «、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現 できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 54 4-546 ;FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。こ のようなベクターとしては、上記ベクターの他に PGEX-5X-1 (Pharmacia社製）、「QIAe xpress system] (QIAGEN社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリ メラーゼを発現して 、る BL21が好まし 、；)などが挙げられる。
[0054] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生さ せる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 )を使用 すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法を用いて行うことができる。 [0055] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとして は、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (Invitrogen社製）や、 pEGF- BO S (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現べ クタ一（例えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、 p BacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の 発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発現ベクター (例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Inv itrogen社製）、 pNVll、 SP- Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pK ΤΗ50)が挙げられる。
[0056] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持っているこ とが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤 (ネオ マイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ま しい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 p BK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0057] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点 を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、 また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由来の ものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べ クタ一は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジ ンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。 [0058] 本発明においてインターフェロンと抗 HLAクラス I抗体との併用とは、インターフエ口 ンと抗 HLAクラス航体を共に投与または使用（以下、単に「投与」と記載する。）する ことを意味し、投与の順番や投与間隔などで限定されるものではない。本発明のイン ターフェロンと抗 HLAクラス I抗体の投与の順番は、インターフェロン投与後に抗 HLA クラス I抗体を投与、インターフェロンと抗 HLAクラス I抗体を同時に投与、抗 HLAクラス I抗体投与後にインターフェロンを投与、のいずれの順番でもよいが、好ましくはイン ターフェロン投与後に抗 HLAクラス I抗体を投与またはインターフェロンと抗 HLAクラ ス I抗体を同時に投与することであり、さらに好ましくはインターフェロン投与後に抗 HL Aクラス I抗体を投与することである。
[0059] インターフェロン投与後に抗 HLAクラス I抗体を投与する場合、インターフェロンと抗 HLAクラス航体の投与間隔は特に限定されず、投与経路や剤形等の要因を考慮し て設定することができる。あえて投与間隔の一例を挙げるとすれば、通常、 0時間〜 7 2時間であり、好ましくは 0時間〜 24時間であり、さらに好ましくは 0時間〜 12時間であ る。
[0060] 本発明において抗 HLAクラス I抗体の作用とは、抗体が抗原に結合することにより生 じる生物学的作用をいい、具体的な例としては、細胞死誘導作用、アポトーシス誘導 作用、細胞増殖抑制作用、細胞分化抑制作用、細胞分裂抑制作用、細胞増殖誘導 作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作用、細胞周期調節作用などを挙げること ができる。本発明においてインターフェロンにより増強される上記活性は、抗 HLAクラ ス I抗体が有する活性であれば如何なるものでもよ 、が、好ましくは細胞死誘導作用 または細胞増殖抑制作用である。
[0061] 細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限 定されないが、血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。血球系細胞の具体的な例として は、リンパ球 (B細胞、 T細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、単球 (好ましくは活性ィ匕 した末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC))、多発性骨髄腫（ミエ ローマ、 MM)細胞などを挙げることができる力 リンパ球（B細胞、 T細胞）、ミエローマ 細胞が好ましく、 T細胞または B細胞 (特に活性ィ匕した B細胞または活性ィ匕した T細胞 )、ミエローマ細胞が最も好ましい。浮遊細胞は、細胞を培養した際、細胞がガラスや プラスチックなどの培養器の表面に付着することなぐ浮遊状で増殖する細胞である 。これに対し、接着細胞 (付着細胞）とは、細胞を培養した際、ガラスやプラスチックな どの培養器の表面に付着する細胞である。
[0062] 本発明においては、抗 HLAクラス I抗体をインターフェロンと併用して投与することに より、例えば、血液腫瘍 (造血器腫瘍)などの腫瘍 (具体的な例として、白血病、骨髄 異形成症候群、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、形質細胞異常症 (骨髄腫、多発 性骨髄腫、マクログロブリン血症）、骨髄増殖性疾患 (真性赤血球増加症、本態性血 小板血症、特発性骨髄繊維症)など)や自己免疫疾患 (具体的な例として、リウマチ、 自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮 質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性萎 縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、 自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、クローン病、全身性エリテマトーデス、多 発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブド ゥ膜炎、乾癬、ベーチェット病など)のような疾患の治療、予防などをおこなうことが可 能である。好ましい適用症としては、血液腫瘍、特に好ましい適用症としては、多発 性骨髄腫を挙げることができる。
[0063] 抗 HLAクラス I抗体はインターフェロンとともに一つの医薬組成物とすることができる 。また、抗 HLAクラス I抗体は、インターフェロンと併用することを特徴とする、医薬組 成物とすることができる。すなわち、抗 HLAクラス I抗体は、「インターフェロンと併用す ることを特徴とする、抗 HLAクラス航体および製剤上許容しうる担体を含む医薬組成 物」の製造のために使用することができる。また、インターフェロンは、抗 HLAクラス I抗 体と併用することを特徴とする、医薬組成物とすることができる。すなわち、インターフ エロンは、「抗 HLAクラス I抗体と併用することを特徴とする、インターフェロンおよび製 剤上許容しうる担体を含む医薬組成物」の製造のために使用することができる。
[0064] 上記の製剤上許容しうる担体とは、それ自体は上記の活性を有さな 、材料であつ て、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。製剤上許容 しうる担体は、例えば、安定剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、賦形剤、懸濁化剤、乳 ィ匕剤、溶解補助剤、などとして用いられる。 [0065] 例えば、安定剤としては、 0.2%程度のゲラチンゃデキストラン、 0.1-1.0%のグルタミン 酸ナトリウム、あるいは約 5%の乳糖や約 2%のソルビトールなどを使用することが出来る 力 これらに限定されるものではない。保存剤としては、 0.01%程度のチメロサールや 0 .1%程度のベータプロピオノラタトンなどを使用することが出来る力 これらに限定され るものではない。
[0066] 注射剤を調製する場合、必要により、 pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を 添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に 収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、 一投与量を容器に収納してもよぐまた、投与量を同一の容器に収納してもよい。
[0067] 本発明における投与は、経口的、または非経口的の 、ずれでもよ 、。経口的な投 与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、 散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することがで きる。非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤 としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる 。注射剤を投与する方法としては、対象となる生物体の体内の一部分 (臓器等の一 組織)を標的として局所的に投与を行っても良いし、血管に投与することにより、生物 体全体に本発明の抗体を循環させてもよい。また、複数箇所の標的に同時に投与を 行ってもよい。また、投与すべき抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用い て生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。本発明 の方法の効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させる 手法は公知である。また、本発明の抗体を、処置を施したい領域に局所的に投与す ることもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または治療薬をコ ードする配列の標的化遺伝子送達により投与することも可能である。
[0068] 投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間 、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成 人一人あたり、一回につき O.lmgから lOOOmgの範囲で投与することができる。しかし、 投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合 もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0069] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[実施例 1] 2D7-DB媒介性細胞障害に及ぼすインターフェロン (IFN)の効果
HLAクラス Iの細胞表面発現は IFN刺激により亢進されるため、 HLA-Aの発現およ び 2D7-DBによる細胞障害に及ぼす IFNの効果を、 IM-9細胞を用いて試験した。 IM- 9細胞を IFN- a (100 U/ml、ォーアイエフ 250万 IU、大塚製薬）または IFN- γ (100 U /ml、オーガンマ 100、大塚製薬)で 48時間処理した後、フローサイトメトリーを行った。 上記 IFN- aのアミノ酸配列を配列番号： 1、塩基配列を配列番号： 2、上記 IFN- γの アミノ酸配列を配列番号： 3、塩基配列を配列番号: 4に示す。フローサイトメトリー解 祈から、 IFN o;または IFN yで刺激した後、 HLA-Aの発現が上方制御されることが実 証された（図 1A)。
さらに、 IM-9細胞を IFN- a (100 U/ml)または IFN- γ (100 U/ml)で 48時間処理し、 次いで 2D7-DB (1 μ g/ml)と共に 24時間培養し、 WST-8アツセィにより細胞生存度を 決定した。その結果として、 2D7-DBと IFN o;または IFN yとの組み合わせにより、細胞 死活性が増大した (図 1B)。
[0070] [参考例 1 ]腫瘍細胞株における HLAクラス Iの発現
腫瘍細胞株および多発性骨髄腫患者由来の骨髄腫細胞における 2D7 mAbの反応 性を、フローサイトメトリーにより試験した。
使用した腫瘍細胞株は以下のとおり調製した。骨髄腫細胞株 RPMI 8226、 Bリンパ 芽球性細胞株（IM- 9、 Raji、 HS-Sultan,および Daudi)、 Tリンパ芽球性細胞株 CEM、 慢性骨髄性白血病細胞株 K562、肺腺癌細胞株 Α549、結腸腺癌細胞株 COLO 201、 および胃腺癌細胞株 MKN- 1は、ヒューマンサイエンス資源バンク (Health Science Re sources Bank) (日本、大阪)から入手した。骨髄腫細胞株 U266- Bl、 Bリンパ芽球性 細胞株 ARH-77、 Tリンパ芽球性細胞株 Jurkat、乳癌細胞株 MCF-7、肝細胞癌 HepG 2、腎淡明細胞癌 Caki-2、および悪性黒色腫 MeWoは、アメリカン'タイプ'カルチャー 'コレクション (バージニア州、マナッサス）から入手した。 EBV-形質転換 B細胞株 YN は、 Yasuhiko Nishioka博士（徳島大学）からの分与による。これらの細胞株を、 10%ゥ シ胎仔血清（Gibco BRL、ニューヨーク州、グランドアイランド）およびペニシリン（100 U/ml)を添カ卩した RPMI- 1640培地（Sigma- Aldrich、ミズーリ州、セントルイス）中、 5% COの加湿大気において 37°Cで培養した。
2
[0071] また患者 MM細胞は、以下のとおりに調製した。まず、 Durieおよび Salmon分類に従 つて (Dune, B.u., and b.E. Salmon. 1975. A clinical staging system for multiple myel oma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, re sponse to treatment, and survival. Cancer 36:842-854)、 MM患者の診断および臨床 病期分類を行なった。徳島大学倫理委員会の承認を得てインフォームドコンセントを 行なった後、患者から骨髄検体を採取した。フイコール-ノヽィパーク (FicoU- Hypaque) (密度 1.077)遠心分離により、骨髄単核細胞 (BMMC)を分離した。 CD138マイクロビ ーズ（Miltenyi Biotec、カリフォルニア州、オーバーン）を用いて、 BMMCから患者の M M細胞をさらに精製した。
[0072] フローサイトメトリーによる HLAクラス Iの細胞表面発現解析は、 FITC標識 2D7 mAb または FITC標識抗 HLA-ABC共通領域 mAb (Chemicon、カリフォルニア州、サンディ エゴ)を用いて、以下のとおり行った。細胞 (5 xlO5個）を PBSで 2回洗浄し、 FITC標識 2D7 mAbまたは FITC標識抗 HLA-ABC共通領域 mAbと共に氷上で 40分間インキュ ペートした。 MM患者由来の BMMCは、 PBS中に溶解した 2% γグロブリンと共に氷上 で 15分間インキュベートし、ミエローマ細胞にゲートをかけるため、 FITC標識 2D7 mA bおよび PE標識抗 CD38 mAb (BD Bioscience,カリフォルニア州、サンノゼ）で染色し た。次に細胞を PBSで 2回洗浄し、 EPICS XLフローサイトメーター（Beckman Coulter, 日本）により解析した。いくつかの実験では、 HLAクラス I発現を解析する前に、細胞 を IFN aまたは IFN yで 48時間刺激した。 HLAクラス Iの発現レベルは、 CellQuestソフ トウエア（BD Biosciences)を用いて Geo MFIとして評価した。
[0073] [表 1] 発現 （幾何平均蛍光強度） 2D7 - DBによる 細胞株 系統
2D7 HLA -ABC 細胞障害性（％)
ARH77 Bリンパ芽球性細胞 3727 6148 58
YN EBV-形質転換 B細胞 804 2399 66
IM - 9 Bリンパ芽球性細胞 662 1728 75
RPMI 8226 骨髄腫細胞 509 2194 20
U266 骨髄腫細胞 340 782 29
Raji Bリンパ芽球性細胞 297 1544 5
HS - Sultan Bリンパ芽球性細胞 285 554 6
Jurkat Tリンパ芽球性細胞 111 585 30
COLO 201 結腸腺癌細胞 105 106 4
CEM Tリンパ芽球性細胞 72 166 2
MKN - 1 胃腺癌細胞 49 136 0
A549 肺腺癌細胞 37 302 10
HepG2 肝細胞癌 33 196 0
MCF -7 乳癌細胞 29 5 5
MeWo 悪性黒色腫 21 86 8
Caki -2 腎淡明細胞癌 13 32 0
K562* 慢性骨髄性白血病細胞 11 51 2
Daudi† Bリンパ芽球性細胞 2 5 2
[0074] 表 1に示すように、 ARH- 77、 YN、 IM- 9、 RPMI 8226、および U226等の MM細胞株お よび Bリンパ芽球性細胞株は、 2D7 mAbまたは抗 HLA-ABC共通領域 mAbで認識さ れる HLAクラス Iが高レベルに発現していた。 HLAクラス I発現のレベルは、 T細胞株お よび他の系譜の癌細胞株にぉ 、て比較的低かった。 K562細胞は HLA-Aおよび HLA -B遺伝子を欠いているため (Johnson, D. R. 2000. Differential expression of human major histocompativility class I loci: HLA-A,— B, and— C. Hum Immunol. 6丄： 389— «3 96.)、 2D7抗原 (HLA-A)の発現を示さないが、 HLAクラス Iの低発現を示した。 Daudi細 胞は j8 2-ミクログロブリンを産生せず (Rosa, F., M. Fellous, M. Dron, M. Tovey, and M. Revel. 1983. Presence of an abnormal beta 2— microglobulin mRNA in Daudi cells: induction by interferon. Immunogenetics 17:125—131.)、糸田胞表面に HLAクフス I分ナ を発現しな力つた。
[0075] 次に、 MM患者の BMMCにおける HLA-A発現を試験した。 FITC標識 2D7 mAbおよ びフィコエリトリン (PE)標識抗 CD38 mAbにより、 BMMCを染色した。 CD38発現および 側方散乱光プロファイルに従って細胞にゲートをかけ、骨髄腫細胞、骨髄性細胞、 およびリンパ球を含むそれぞれの細胞集団を HLA-A発現にっ 、て解析した。図 2A に示すように、 HLA-Aの発現レベルは、正常骨髄性細胞およびリンパ球と比較して 骨髄腫細胞において高力つた。 22名の MM患者の BM検体を解析したところ、幾何平 均蛍光強度によって示される骨髄腫細胞における HLA-Aの発現レベルは（Geo MFI 、 1309± 1130 [平均値士 SD])、骨髄性細胞 (201 ±209)またはリンパ球 (91 ±44)それ ぞれと比較して有意に高かった（図 2B)。 MM細胞における HLA-Aの発現は、 MMの 臨床病期とは関連がな力つた。さらに、 2カラーフローサイトメトリーから、末梢血幹細 胞収集物中の CD34+細胞が低レベルで HLA-Aを発現することが示された（Geo MFI 、 109± 16、 n=3)。
[0076] [参考例 2]骨髄腫細胞に及ぼす HLAクラス I抗体の効果
MM細胞株および患者の MM細胞に及ぼす抗 HLAクラス I mAbの細胞障害効果を gi験し 7こ。
以下のとおり細胞障害性アツセィを行った。まず、患者の MM細胞 (2xl06個/ ml)ま たは細胞株（5xl05個/ ml)を、 10% FCSを添カ卩した RPMI 1640培地中、様々な濃度の 2 D7、 W6/32、 B9.12.1、および JOAN-1等の抗 HLAクラス I mAbと共に 37°Cで 30分間ィ ンキュベートし、次に 10 μ g/ml F(ab )ャキ饥マウス IgG抗体 (Jackson ImmunoResearc
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h Laboratories,ペンシルバニア州、ウェストグローブ）と共に 24時間インキュベートし た。細胞株に関しては WST-8アツセィ（Kishida Chemical, 日本、大阪）により、患者由 来の初代 MM細胞に関してはトリパンブルー色素排除試験により、細胞生存度を測 定した。ァネキシン Vおよび PI染色（MEBCYTOアポトーシスキット、 MBL、 日本、名古 屋)のフローサイトメトリー解析により、アポトーシスの誘導を判定した。
[0077] W6/32、 B9.12.1、および JOAN-1等の抗 HLAクラス I mAbは、単独では細胞の生存 度に影響を及ぼさな力つた (データは示さず)。しかし、二次ャギ抗マウス IgG抗体の 存在下では、これらの抗 HLAクラス I mAbは、 MM細胞株、 Bリンパ芽球性細胞株 (AR H-77、 IM-9、および U266)、および患者の MM細胞の凝集を用量依存的様式で誘導 した。細胞の凝集により、 WST-8アツセィまたはトリパンブルー排除試験によって確認 される細胞死がもたらされた。これらの抗 HLAクラス I mAbを二次抗体で架橋してから 24時間後の、 IM-9細胞および患者の MM細胞の細胞生存度を、図 3Aに示した。 2D7 mABは、 W6/32、 B9.12.1、および JOAN-1よりも効率的に IM-9の細胞生存度を阻害 した。新たに単離した MM細胞の細胞生存度もまた、二次抗体の存在下で 2D7 mAb により阻害された。この細胞凝集および細胞死は、以前に報告されたように (非特許 文献 7)、 1時間以内に迅速に起こり、 6時間後に最大に達した。
[0078] [参考例 3]2D7-DBの細胞障害効果
次に、 MM細胞株および患者の MM細胞に及ぼす、 2D7 mAbの一本鎖 Fv型 (2D7-D B)の細胞障害効果を試験した。細胞障害アツセィは基本的に上述と同様に行ったが 、二次ャギ抗マウス IgG抗体を添加せずに試験した。
[0079] IM- 9細胞および患者の MM細胞の両方において、 2D7- DBによって 2D7 mAbよりも さらに著しく細胞生存度が低下した（図 3A)。重要なことには、新たに単離した MM細 胞は、 MM細胞株よりも 2D7-DBに対する感受性が高力つた。形態学的研究から、患 者の MM細胞のほとんどが、 2D7-DB処理をして力も 24時間以内に細胞質空胞変性 を示したことが明らかになった（図 3B)。 6人の患者力も精製した MM細胞に対する 2D7 -DBの効果を解析したところ、 24時間処理した後、細胞生存度は、 0.1 μ g/ml 2D7-D Bでは 51 ± 18.4% (平均値士 SD)まで、 1 μ g/ml 2D7-DBでは 26± 17.6% (平均士 SD)ま で減少した（図 3C)。 2D7-DBの感受性は、患者の MM細胞における HLA-A発現のレ ベルと関連していた。対照的に、正常骨髄性細胞またはリンパ球の細胞生存度は、 以前に報告されたように、これらの用量の 2D7-DBによって影響を受けなかった。
[0080] 他の造血細胞に及ぼす 2D7-DBの影響を判定するため、 MM患者の骨髄中の造血 細胞における HLA-Aの発現、およびこの造血細胞に及ぼす 2D7-DBの影響を試験し た。全 BMMCを 2D7-DBで 24時間処理した後、細胞集団をフローサイトメトリーにより 調べた。図 4Aに示すように、 MM患者の全 BMMC画分から CD38+ MM細胞が選択的 に激減していた。抗 HLA-ABC mAbによりこれらの残存した細胞を解析したところ、 H LAクラス Iを過剰発現する骨髄腫細胞集団のみが選択的に除去されて ヽた（図 4A)。 これらの知見は、 2D7-DB力 正常骨髄性細胞またはリンパ球に影響を及ぼすことな ぐ MM細胞の死を選択的に誘導するという形態学的研究力 も確認された（図 4B)。 [0081] さらに、コロニーアツセィにより、造血前駆細胞に及ぼす 2D7-DBの影響を判定した 。 MethoCultアツセィ（Stem Cell Technologies,カナダ、バンクーバー）を用い、顆粒 球マクロファージコロニー形成単位および赤芽球バースト形成単位を測定した。 2D7
-DB (1 μ g/ml)は、造血前駆細胞アツセィにより、顆粒球マクロファージコロニー形成 単位および赤芽球バースト形成単位の増殖を有意に阻害しな力つた (データは示さ ず)。
[0082] MM細胞の増殖および生存にぉ 、て MM細胞と骨髄微小環境の相互作用が重要な 役割を果たすことから、 MM細胞および骨髄間質細胞に及ぼす 2D7-DBの影響を試 験した。新たに単離した MM細胞を、 24ゥエルプレート中、骨髄間質細胞の存在下で 培養し、次いで 2D7-DBで 24時間処理した。図 4Cに示すように、 2D7-DBで処理する ことにより、骨髄間質細胞に接着した患者の MM細胞は効率的に除去されたが、正常 間質細胞は有意な影響を受けな力 た。同様に、接着性ヒト臍静脈内皮細胞 (HUVE C)においても、 2D7-DBによる細胞障害は認められなかった（データは示さず)。
[0083] [参考例 4] 2D7-DBのインビボ抗腫瘍効果
最後に、ヒト骨髄腫異種移植モデルにおいて、 2D7-DBのインビボ有効性を評価し た。まず、 2D7-DBのインビボ細胞障害活性を評価するため、文献 (Ozaki, S., M. Kos aka, b. Wa atsuki, M. Abe, Y. Koishibara, and T. Matsumoto. 1997. Immunotherap y of multiple myeloma with a monoclonal antibody directed against a plasma cell— spe cific antigen, HM1.24. Blood 90:3179- 3186)の記載と同様にして、重症複合免疫不 全 (SCID)マウスへのヒト骨髄腫異種移植を確立した。残存して ヽるナチュラルキラー 細胞を根絶するため、腫瘍を接種する 1日前に、上記 SCIDマウスに 10 /z Lのゥサギ抗 ァシァ口 GM1抗血清 (Wako Chemicals,日本、大阪）を腹腔内注射した。次に尾静脈 を介した静脈内注射により、 ARH- 77細胞 (6xl06個）を上記 SCIDマウスに接種し、そ れぞれ 7匹のマウス力もなる 2群に分割した。 ARH- 77細胞を接種してから 1日、 2日、 および 3日後に、 1日に 2回、 8 mg/kgの 2D7-DBまたはリン酸緩衝食塩水（PBS)の静 脈内注射により SCIDマウスを処置し、生存の期間をモニターした。酵素結合免疫吸 着測定法 (ELISA)により、 24日目にヒト Mタンパクの血清レベルを測定した。
[0084] 図 5Aに示すように、 2D7-DBで処置したマウスでは、 24日目の血清 Mタンパタレべ ルが対照マウスと比較して（74± 66 /z g/ml)顕著に減少していた (20 ± 19 /z g/ml、平 均値士 SD)。さらに、 2D7-DBでの処置により、散在性 ARH腫瘍を有するマウスの生 存が顕著に長期化した（図 5B)。これらのマウスの体重によって示される、 2D7-DBに よる処置に関連した毒性は見られな力つた。これらの結果から、 2D7-DBはインビボに ぉ 、て抗腫瘍活性を与えることが示唆される。
[参考例 5] 2D7-DBの抗腫瘍機序
低分子型 HLA抗体 (2D7-DB)の抗腫瘍機序については、 HLAクラス IAに結合した 2 D7DBが細胞内ァクチン骨格系を破壊することで引き起こされている可能性が強く示 唆されている（特許文献 1)。今回本発明者らは、 2D7-DBの抗腫瘍機序についてさら に検討を加えた。まず、各種シグナル伝達阻害薬を用いて 60分間前処理をし、 2D7- DB (1 μ g/mL)添加後における骨髄腫細胞株 RPMI 8226の細胞傷害に及ぼす影響 について検討を行った（図 6A)。 Caspase阻害剤（z- VAD- fink, 5 M)や MAPキナー ゼ阻害剤（PD 98059, 10 /z M)、 PI- 3キナーゼ阻害剤 (Wortmannin, 10 M)について は、 2D7-DBの細胞傷害活性に対する作用は認められな力つた。し力しながら、 Rho GTPaseの阻害剤である Clostridium difficile toxin B (TcdB, 10 pM)ゃァクチン重合阻 害剤である cytochalasin D (1 ^ M)と latrunculin A (0.1 μ Μ)は 2D7- DBの細胞傷害活 性をほぼ完全に抑制した。これらの結果から、 2D7-DBによる細胞傷害には Rho GTP aseの活性を介したァクチン重合が関与して 、ることが示唆された。
さらに、細胞のァクチン染色を行い、 2D7-DB (緑）とァクチン（赤）との局在について 検討した（図 6B)。骨髄腫細胞株 ARH- 77細胞を 2D7-DB (1 μ g/mL)で処理した 10分 後には、細胞質におけるァクチンの著明な凝集が観察され、一部の細胞においては 細胞傷害によりァクチンが流出していた。し力しながら、ァクチン重合阻害剤 latruncul in A (0.1 Μ)で 30分間前処理した場合には、 2D7-DBを添カ卩した後もァクチンは細 胞周囲に局在したままで凝集は認められなかった。一方， HLA-Aを発現している骨 髄ストローマ細胞株 KM102においては、 2D7-DBによるァクチン凝集は認められず、 2 D7-DBによるァクチン凝集作用と細胞傷害活性は骨髄腫細胞やリンパ系細胞に特 異的なものであり、 2D7-DBは骨髄腫や自己免疫疾患などに有用である一方で、正 常組織に対する影響は少な 、ものと考えられた。 次に， 2D7-DBの細胞傷害に関わるシグナル伝達について Western blotにより検討 した（図 7ABC)。 KM102細胞においては、 2D7-DB (1 μ g/mL)で刺激した後に FAK や Akt、 ERKのリン酸ィ匕が検出され、これらのシグナル伝達経路が活性ィ匕されたもの と考えられた。一方、 RPMI 8226細胞においては、これらのシグナル伝達経路の活性 化は認められず、 2D7-DBの刺激は細胞種によって異なっていることが明ら力となつ た。また、一般に FAK、 Akt、 ERKは細胞生存に関与するシグナル経路であることから 、 2D7-DBは KM102細胞に対しては細胞増殖に作用する可能性が考えられた。 最後に、 2D7-DBによるアポトーシス誘導の有無について検討した（図 7D)。 RPMI 8 226を 2D7- DBで刺激した場合には、アポトーシスの特徴である caspaseの活性化や P ARPの断片化などは認められなかった。このことより， 2D7-DBによる細胞傷害はいわ ゆるアポトーシスとは異なり、ァクチン凝集という機序によるものと考えられた。
インターフェロンはアポトーシスを誘導することにより細胞傷害作用を発揮するもの と考えられており，この過程には Jak- Statや MAPキナーゼ， P13キナーゼなどのシグナ ル伝達分子が関与していると報告されている（文献 J Interferon Cytokine Res. 2005 Dec;25(12):799-810. Apoptosis. 2003 Jun;8(3):237- 49.)。一方， 2D7- DBはァクチン 凝集により標的細胞を破壊することから，図 7に示したように，これらのシグナル伝達 に関わる分子の活性ィ匕は生じていないことが確認された。このように， 2D7-DBとイン ターフェロンにより誘導される細胞傷害機序は異なっており，これらの併用療法にお いては増強効果が認められたものと考えられた。
産業上の利用可能性
本発明により、抗 HLAクラス I抗体を含む新規医薬組成物が提供された。本発明の 医薬組成物は、抗 HLAクラス I抗体とインターフェロンの併用により、細胞死誘導等の 抗 HLAクラス航体の作用を強く増強する。本発明の医薬組成物は、抗 HLAクラス航 体の作用による一段と高 、薬効を発揮できる。

Claims

請求の範囲
[I] インターフェロン及び抗 HLAクラス I抗体を有効成分とする医薬組成物。
[2] インターフェロンと併用することを特徴とする、抗 HLAクラス I抗体を有効成分とする医 薬組成物。
[3] インターフ ロンと同時に投与することを特徴とする、抗 HLAクラス I抗体を有効成分と する医薬組成物。
[4] インターフ ロン投与後に投与することを特徴とする、抗 HLAクラス I抗体を有効成分 とする医薬組成物。
[5] 抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、請求項 1から 4のいずれかに記載の医薬 組成物。
[6] 抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、請求項 1から 5のいずれかに記載の医薬 組成物。
[7] インターフェロン及び抗 HLAクラス I抗体を有効成分とする細胞死誘導剤。
[8] 抗 HLAクラス I抗体が抗 HLA-A抗体である、請求項 7に記載の細胞死誘導剤。
[9] 抗 HLAクラス I抗体が低分子化抗体である、請求項 7または 8に記載の細胞死誘導剤
[10] 抗 HLAクラス I抗体と併用することを特徴とする、インターフェロンを含有する医薬組成 物。
[II] 抗 HLAクラス I抗体と同時に投与することを特徴とする、インターフェロンを含有する医 薬組成物。
[12] 抗 HLAクラス I抗体投与前に投与することを特徴とする、インターフェロンを含有する 医薬組成物。
[13] インターフェロンを有効成分とする、抗 HLAクラス I抗体の作用増強剤。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008007755A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha inducteur de mort cellulaire
WO2008111597A1 (ja) 2007-03-12 2008-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hlaクラスiを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびその利用
WO2011037160A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 Hlaクラスiを認識する抗体
US8183005B1 (en) 2004-08-11 2012-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical agents for treating HCV infections
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US8957199B2 (en) 2008-11-26 2015-02-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligoribonucleotide or peptide nucleic acid capable of inhibiting activity of hepatitis C virus
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7696325B2 (en) * 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
ATE391174T1 (de) * 2000-10-20 2008-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modifizierter tpo-agonisten antikörper
CN1308447C (zh) * 2000-10-20 2007-04-04 中外制药株式会社 低分子化的激动剂抗体
DE60324700D1 (de) * 2002-10-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Zelltod-induzierender wirkstoff
JP2004279086A (ja) * 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
US20070003556A1 (en) * 2003-03-31 2007-01-04 Masayuki Tsuchiya Modified antibodies against cd22 and utilization thereof
CA2548929A1 (en) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death inducing agent
TW200530266A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
TW200530269A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
WO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
US20080274110A1 (en) * 2004-04-09 2008-11-06 Shuji Ozaki Cell Death-Inducing Agents
FR2987048B1 (fr) * 2012-02-16 2016-12-23 Univ Toulouse 3 Paul Sabatier Immunoglobuline chimerique monoclonale anthi-hla, procede et kit mettant en oeuvre une telle immunoglobuline chimerique monoclonale
US9637538B2 (en) 2012-04-27 2017-05-02 Universite Paul Sabatier Toulouse Iii Anti-HLA monoclonal chimeric immunoglobulin, process and kit employing such a monoclonal chimeric immunoglobulin
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5077216A (en) * 1988-07-06 1991-12-31 The Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies specific for a human mononculear phagocyte-specific antigen
US5223241A (en) * 1990-10-01 1993-06-29 The General Hospital Corporation Method for early detection of allograft rejection
CA2126967A1 (en) * 1992-11-04 1994-05-11 Anna M. Wu Novel antibody construct
CA2150262C (en) * 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
DE69327229T2 (de) * 1992-12-11 2000-03-30 The Dow Chemical Co., Midland Multivalente einkettige Antikörper
US5780021A (en) * 1993-03-05 1998-07-14 Georgetown University Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i
US5747654A (en) * 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
WO1995006748A1 (fr) * 1993-09-03 1995-03-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps monoclonal permettant d'induire une apoptose
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
US5885574A (en) * 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
WO1996004925A1 (en) * 1994-08-12 1996-02-22 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US6451523B1 (en) * 1994-09-14 2002-09-17 Interneuron Pharmaceuticals, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
WO1996026648A1 (en) * 1995-02-28 1996-09-06 The Procter & Gamble Company Preparation of noncarbonated beverage products having superior microbial stability
EP2258726A1 (en) * 1995-06-14 2010-12-08 The Regents of the University of California High affinity human antibodies to c-erbB-2
AU721129B2 (en) * 1996-01-08 2000-06-22 Genentech Inc. WSX receptor and ligands
FR2745008A1 (fr) * 1996-02-20 1997-08-22 Ass Pour Le Dev De La Rech En Recepteur nucleaire de glucocorticoides modifie, fragments d'adn codant pour ledit recepteur et procedes dans lesquels ils sont mis en oeuvre
WO1997032601A1 (fr) * 1996-03-06 1997-09-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de criblage de substances induisant l'apoptose
CA2253971A1 (en) * 1996-05-09 1997-11-13 Pharma Pacific Pty.Ltd. Use of high dose interferon by oralmucosal contact to treat viral infections and neoplastic conditions
US6323000B2 (en) * 1996-12-20 2001-11-27 Clark A. Briggs Variant human α7 acetylcholine receptor subunit, and methods of production and uses thereof
US6183744B1 (en) * 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
AU8296098A (en) * 1997-07-08 1999-02-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US6342220B1 (en) * 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US7531643B2 (en) * 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
HUP0003513A3 (en) * 1997-09-11 2004-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Monoclonal antibody inducing apoptosis
US7081360B2 (en) * 1998-07-28 2006-07-25 Cadus Technologies, Inc. Expression of G protein-coupled receptors with altered ligand binding and/or coupling properties
US7696325B2 (en) * 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
US20020028178A1 (en) * 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20040058393A1 (en) * 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
ATE365749T1 (de) * 2000-05-12 2007-07-15 Gpc Biotech Ag Humane peptide/proteine, die das töten von zellen,einschliesslich lymphoide tumorzellen, herbeiführen oder bewirken
ATE391174T1 (de) * 2000-10-20 2008-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modifizierter tpo-agonisten antikörper
CN1308447C (zh) * 2000-10-20 2007-04-04 中外制药株式会社 低分子化的激动剂抗体
IL161418A0 (en) * 2001-10-15 2004-09-27 Immunomedics Inc Direct targeting binding proteins
KR20050036852A (ko) * 2001-10-15 2005-04-20 기린 비루 가부시키가이샤 항-ｈｌａ-ｄｒ 항체
SI1475101T1 (sl) * 2002-02-14 2011-03-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmacevtski proizvodi iz raztopine, ki vsebuje protitelo
US20040001828A1 (en) * 2002-02-21 2004-01-01 Joseph Tuscano Treatment methods using anti-CD22 antibodies
EP1510943A4 (en) * 2002-05-31 2007-05-09 Celestar Lexico Sciences Inc INTERACTION PREDICTION DEVICE
AU2003243651B2 (en) * 2002-06-17 2008-10-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
WO2004003198A1 (ja) * 2002-06-27 2004-01-08 Genox Research, Inc. アレルギー性疾患の検査方法、および治療のための薬剤
DE60324700D1 (de) * 2002-10-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Zelltod-induzierender wirkstoff
CA2502825A1 (en) * 2002-10-22 2004-05-06 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Stabilized composition
JP2004279086A (ja) * 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
US20070003556A1 (en) * 2003-03-31 2007-01-04 Masayuki Tsuchiya Modified antibodies against cd22 and utilization thereof
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
TW200530266A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
CA2548929A1 (en) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death inducing agent
WO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
KR20070010046A (ko) * 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
US20080274110A1 (en) * 2004-04-09 2008-11-06 Shuji Ozaki Cell Death-Inducing Agents
CA2610987C (en) * 2005-06-10 2013-09-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
TW200718780A (en) * 2005-06-10 2007-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Sc(Fv)2 site-directed mutant
JPWO2008007755A1 (ja) * 2006-07-13 2009-12-10 中外製薬株式会社 細胞死誘導剤
AU2007285217B2 (en) * 2006-08-14 2013-02-07 Forerunner Pharma Research Co., Ltd Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibodies
CL2008000719A1 (es) * 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURRONE O.R. ET AL.: "Stimulation of HLA-A,B,C by IFN-alpha. The derivation of Molt 4 variants and the differential expression of HLA-A,B,C subsets", THE EMBO JOURNAL, vol. 4, no. 11, 1985, pages 2855 - 2860, XP008073499 *
CANGEMI C. ET AL.: "IFN-alpha mediates the up-regulation of HLA class I on melanoma cells without switching proteasome to immunoproteasome", INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 15, no. 12, 2003, pages 1415 - 1421, XP003003881 *
DANIEL D. ET AL.: "Pathway of Apoptosis Induced in Jurkat T Lymphoblasts by Anti-HLA Class I Antibodies", HUMAN IMMUNOLOGY, vol. 65, no. 3, 2004, pages 189 - 199, XP003003880 *
GENESTIER L. ET AL.: "Fas-Independent Apoptosis of Activated T Cells Induced by Antibodies to the HLA Class I alpha1 Domain", BLOOD, vol. 90, no. 9, 1997, pages 3629 - 3639, XP002964772 *
KIMURA N. ET AL.: "2D7 diabody bound to the alpha2 domain of HLA class I efficiently induced caspase-independent cell death against malignant and activated lymphoid cells", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 325, 2004, pages 1201 - 1209, XP004649732 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8183005B1 (en) 2004-08-11 2012-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical agents for treating HCV infections
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
WO2008007755A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha inducteur de mort cellulaire
WO2008111597A1 (ja) 2007-03-12 2008-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hlaクラスiを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびその利用
US8957199B2 (en) 2008-11-26 2015-02-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligoribonucleotide or peptide nucleic acid capable of inhibiting activity of hepatitis C virus
WO2011037160A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 Hlaクラスiを認識する抗体

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