CN103702967A - 用于治疗增殖性病症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征在于通过施用视黄酸化合物来治疗受试者的以升高的Pin1标志物水平和/或减少的Pin1Ser71磷酸化为特征的增殖性病症的方法。另外，本发明的特征在于通过与其它抗增殖化合物联合施用视黄酸化合物来治疗增殖性病症(例如，以升高的Pin1标志物水平为特征的增殖性病症)的方法。最后，本发明的特征也在于用于发现和验证Pin1抑制剂的包括高通量筛选的方法。

Description

用于治疗增殖性病症的方法和组合物
关于联邦资助研究的声明
本发明在授权号NIH GM058556、NIH AG017870和NIH CA122434的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
一般而言，本发明涉及用视黄酸化合物治疗增殖性病症(例如，以升高的Pin1标志物水平为特征的增殖性病症)。
背景技术
在美国和实际上在全球报道的增加的癌症病例数目是一个重大担忧。目前，仅有少数可用于一些特定癌症类型的检测和治疗方法，并且这些方法不会提供绝对的成功保证。为了成为最有效的方法，这些治疗不仅需要恶性肿瘤的早期检测，而且需要恶性肿瘤的严重程度的可靠评估。
显然，肿瘤发展和生长的复杂过程必须涉及多种基因产物。因此，重要的是，解释在肿瘤发展和生长中涉及的特定基因的作用，和鉴别可以充当癌症的诊断、预防和治疗靶标的那些基因和基因产物。
在癌症治疗领域中，经常发生的是，最初对于给定患者有效的治疗剂随着时间的流逝而变得对该患者无效或效力变低。完全相同的治疗剂可能继续对于不同的患者而言在长时间段内有效。此外，至少最初对一些患者有效的治疗剂可以对其它患者而言是完全地无效的或甚至有害的。因此，将有用的是，鉴别出这样的基因和/或基因产物：其代表就一种给定治疗剂或一类治疗剂而言的预后相关基因。然后可能确定哪些患者将受益于特定治疗方案，并且重要的是，确定所述治疗方案何时（如果有的话）开始丧失它对给定患者的有效性。做出这样的预测的能力，将使得在远早于常规措施明显即将丧失它的有效性的时候中断已经丧失它的有效性的治疗方案成为可能。
对肿瘤生成的分子机制的理解的新近进展已经导致令人兴奋的靶向特定分子途径的新药物。这些药物已经转变了癌症治疗，特别是对于由某些特定致癌事件造成的那些癌症而言，诸如用于由HER2/Neu造成的乳腺癌的赫赛汀，和用于由Bcr-Abl造成的慢性髓性白血病的格列卫。但是，已经日益明显的是，在许多单独的肿瘤中，存在大量会破坏多个相互作用的和/或多余的途径的突变基因。因而，在单个途径中的干预可能不是有效的。此外，癌症对分子靶向药物的抗性可以通过次级靶标突变或旁路途径的代偿活化（所谓的“致癌开关”）而发展。因而，仍存在的一个重大挑战是，如何如下同时抑制多个致癌途径：要么使用多种药物的组合，其中每种药物作用于特定途径，要么使用并行地阻断多个途径的单一药物。本文中公开的结果提示，Pin1抑制剂可能对治疗癌症（特别是侵袭性的和/或药物抗性的癌症）具有重大影响。
我们和其他人已经证实，Pin1在人癌症中普遍地过表达，并且高Pin1标志物水平与许多癌症的差临床结果相关联。相比而言，减少Pin1表达的Pin1多态性与人类中降低的癌症风险有关。重要的是，Pin1会活化至少19种癌基因/生长促进剂（包括β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1、NF-κB、c-Jun、c-fos、AKT、A1B1、HER2/Neu、MCl-1、Notch、Raf-1、Stat3、c-Myb、Hbx、Tax和v-rel），并且也会灭活至少12种肿瘤抑制基因/生长抑制剂（包括PML、SMRT、FOXOs、RARα和Smad）(图1A和1B)。尽管Pin1过表达会造成细胞转化和肿瘤发生，Pin1敲低（knockdown）会抑制细胞培养物和小鼠中的癌细胞生长。没有Pin1的小鼠对由癌基因（诸如活化的Ras或HER2/Neu）或肿瘤抑制基因（诸如p53）诱导的肿瘤发生是高度抗性的。因而，Pin1抑制剂可能具有用于治疗癌症，特别是那些侵袭性的和/或药物抗性的癌症的同时抑制众多致癌途径的期望性质。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的增殖性疾病的方法，其中给所述受试者施用足以治疗所述受试者的量的视黄酸化合物(例如，氘化化合物)，其中所述受试者在所述施用之前被确定为具有升高的Pin1标志物(例如，Ser71磷酸化)水平。
在另一个方面，本发明的特征在于一种如下治疗受试者的增殖性疾病的方法：确定得自受试者的样品(例如，肿瘤样品、血液、尿、活组织检查、淋巴、唾液、痰和脓)中的Pin1标志物水平(例如，减少的Ser71磷酸化)，并且如果样品被确定为具有升高的Pin1标志物水平，那么给所述受试者施用视黄酸化合物。
在任一个前述方面，所述方法还可以包括：施用第二种抗增殖化合物(例如，在低剂量)或抗癌化合物(例如，抗血管生成的化合物)。所述第二种化合物可以与所述视黄酸化合物分开施用，或者在单一制剂中施用。所述第二种抗增殖化合物可以是，例如，MK-2206、ON 013105、RTA 402、BI 2536、索拉非尼、ISIS-STAT3Rx、微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、铂类、烷化剂、抗代谢物、紫杉醇、吉西他滨、多柔比星、长春碱、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、卡铂、六甲蜜胺、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、阿扎胞苷、博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、2-氯脱氧腺苷、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、磷酸雌莫司汀、氟尿苷、氟达拉滨、吉妥珠单抗（gentuzumab）、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、喷司他丁、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、托泊替康、曲妥珠单抗、长春新碱、长春地辛和/或长春瑞滨。额外地或可替换地，任一种前述方法可以包括：在施用视黄酸化合物以后，确定样品中的Pin1标志物水平。
在任一个前述方面，所述视黄酸化合物可以选自13-顺式-视黄酸、全反式-视黄酸、视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醛、AC-55649、阿维A或在图2A、图2B、图10A、图10D和表1中列出的任一种化合物。
任一种前述方法中的升高的Pin1标志物水平可以是由于，例如，遗传性状或体细胞突变。
任一种前述方法中的增殖性病症可以是，例如，白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤。具体地，所述增殖性病症可以是，例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、霍奇金病、非霍奇金病、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔曼瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
本发明的特征也在于一种用于鉴别Pin1配体的方法，其包括：(i) 将Pin1蛋白与荧光地标记的探针(例如，HF488-FP或FITC-FP标记的肽探针)一起温育，从而形成Pin1-探针复合物；(ii) 将试验化合物加入所述温育物中；和(iii) 确定所述探针的任何大部分是否被所述试验化合物从Pin1-探针复合物中置换出，这样的置换指示所述试验化合物是Pin1配体。本发明的特征也在于一种用于鉴别Pin1调节化合物的方法，其包括：(i) 温育具有Neu/Erb2基因扩增的人源癌细胞(例如，乳腺癌细胞)；(ii) 将试验化合物施用于所述细胞；和(iii) 确定Neu/Erb2过表达是否减少，其中Neu/Erb2过表达的减少指示所述试验化合物是Pin1调节化合物。
术语“增殖性病症”是指，以细胞群体在组织中的不适当积累(例如，通过异常的细胞生长)为特征的病症。该不适当的积累可以是在所述细胞群体的一个或多个细胞中发生的遗传的或表观遗传的变异的结果。该遗传的或表观遗传的变异会造成所述细胞群体的细胞比周围的正常组织更快地生长、更慢地死亡或更慢地分化。所述细胞群体包括造血组织、上皮组织、内皮组织或实体组织起源的细胞。
本文中使用的术语“异常的细胞生长”意图包括不希望的或不适当的细胞生长。异常的细胞生长也包括不希望的或不适当的增殖(例如，失调的细胞增殖或不希望地快速的细胞增殖)。异常的细胞生长可以是良性的，并产生组织或细胞的良性块或良性肿瘤。许多本领域公知的病况与这样的良性块或良性肿瘤有关，包括糖尿病视网膜病变、晶状体后纤维增生、新生血管性青光眼、银屑病、血管纤维瘤、类风湿关节炎、血管瘤和卡波西肉瘤。异常的细胞生长还可以是恶性的，并产生恶性瘤、组织或细胞的恶性块或恶性肿瘤。许多本领域公知的病况和病症与恶性瘤、恶性块和恶性肿瘤（包括癌症和癌）有关。
本文中使用的术语“肿瘤”意图包括在身体的任意器官中形成的体外和体内肿瘤。肿瘤可以与良性异常细胞生长(例如，良性肿瘤)或恶性细胞生长(例如，恶性肿瘤)有关。本文中描述的肿瘤优选地对本发明的Pin1抑制剂敏感。意图被本发明包括的肿瘤类型的例子包括与下述癌症有关的那些肿瘤：乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌。
本文中使用的术语“Pin1标志物”表示，能够指示本发明的样品中的Pin1活性水平的标志物。Pin1标志物包括：与一些或全部Pin1基因相对应的核酸分子(例如，mRNA、DNA)，与一些或全部Pin1蛋白相对应的肽序列(例如，氨基酸序列)，与Pin1基因序列同源的核酸序列，与Pin1肽序列同源的肽序列，针对Pin1蛋白的抗体，Pin1蛋白的底物，Pin1蛋白的结合配偶体和Pin1的活性。
“升高的Pin1标志物水平”是指，发生改变从而指示升高的Pin1活性的Pin1标志物水平。“升高的Pin1标志物水平”包括这样的水平：其比在正常的、无疾病的受试者或组织中测得的标志物水平大至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%，或小5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。
术语“视黄酸化合物”是指这样的化合物：其是(a) 二萜视黄酸或其衍生物，或(b)具有结构R1-Ar1-L1Ar2-L2-C(=O)R3 (式(I))的化合物。本文中描述的示例性的视黄酸化合物(包括其衍生物)包括在图2A、2B、10A、10D和表1中鉴别出的化合物。术语“二萜视黄酸”包括视黄酸的任意立体异构体(例如，所述视黄酸可以处于全反式构型(ATRA)，或者一个或多个双键可以处于顺式构型(例如，13-顺式视黄酸(13cRA))。二萜视黄酸的衍生物包括还原形式，诸如视黄醛、视黄醇和视黄醇乙酸酯。在式(I)中，Ar1和Ar2中的每一个独立地是任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；R1是H、任选地被取代的烷基、任选地被取代的烯基或任选地被取代的炔基；L1和L2中的每一个独立地选自共价键、任选地被取代的C1-10亚烷基、任选地被取代的C2-10亚烯基(例如，-CH=CH-、-COCH=CH-、-CH=CHCO-、二烯基基团或三烯基基团)、任选地被取代的C2-10亚炔基(例如，-C≡C-)或-(CHR4)nCONR5-、-NR5CO-，其中n是0或1，R4是H或OH，且R5是H或任选地被取代的烷基；且R3是H、OR4或N(R4)2，其中每个R4独立地选自H、任选地被取代的烷基或任选地被取代的杂烷基。
如果本文中描述的任意化学基团、官能团或取代基具有-H的话，所述化学基团、官能团或取代基可以被氘化。如在本文中使用的，当本发明的化合物中的特定位置被指示为“氘化的”或“具有氘”时，应当理解，所述位置含有氘或包括氘(元素氘在化学结构和式中用字母“D”表示，且在根据Boughton系统的化学名称中用小写字体“d”指示)。当任意位置被氘化时，应当理解，氘在该位置的丰度大幅大于氘的天然丰度（其为0.015%）。在某些实施方案中，本发明的组合物具有至少5 (0.075% 氘掺入)、例如至少10 (0.15% 氘掺入)的最小同位素富集因子。在其它实施方案中，组合物具有至少50 (0.75% 氘掺入)、至少500 (7.5% 氘掺入)、至少2000 (30% 氘掺入)、至少3000 (45% 氘掺入)、至少4000 (60% 氘掺入)、至少4500 (67.5% 氘掺入)、至少5000 (75% 氘掺入)、至少5500 (82.5% 氘掺入)、至少6000 (90% 氘掺入)或至少6600 (99% 氘掺入)的同位素富集因子。
本文中使用的术语“同位素富集因子”表示组合物中的同位素丰度与指定同位素的天然丰度之比。例如，氘具有0.015%的天然丰度。与氘的天然丰度相比，在指定位置具有例如45%氘掺入的化合物在该位置具有3000的同位素富集因子。
表1. 在结构上与视黄酸类似的化合物的列表
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本文中使用的术语“芳基”表示单-或二-环C6-C14基团，其具有[4n + 2]个共轭π电子，且其中n是1、2或3。芳基也包括这样的环系：其中具有[4n + 2] 个π电子的环系与非芳族环烷基或非芳族杂环基稠合。苯基是其中n为1的芳基。芳基可以是未被取代的，或被例如1、2、3或4个本文中定义的取代基取代。其它示例性的芳基包括、但不限于：萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、芴基、茚满基和茚基。
除非另外指出，否则本文中使用的术语“环烷基”表示3-10个碳的单价饱和的或不饱和的非芳族环状烃基，且其例子为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、二环[2.2.1.]庚基等。在某些实施方案中，所述环烷基是多环的(例如，金刚烷基)。环烷基可以是未被取代的，或被例如1、2、3或4个本文中定义的取代基取代。
本文中使用的术语“杂芳基”表示，含有1、2、3或4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的芳族(即，在环系内含有4n+2个π电子) 5-或6-元环，以及这样的二环、三环和四环基团：其中任一个芳族环与1、2或3个杂环或碳环(例如，芳基环)稠合。示例性的杂芳基包括、但不限于：呋喃、噻吩、吡咯、噻二唑(例如，1,2,3-噻二唑或1,2,4-噻二唑)、噁二唑(例如，1,2,3-噁二唑或1,2,5-噁二唑)、噁唑、异噁唑、异噻唑、吡唑、噻唑、三唑(例如，1,2,4-三唑或1,2,3-三唑)、吡啶、嘧啶、吡嗪、吡嗪、三嗪(例如，1,2,3-三嗪1,2,4-三嗪或1,3,5-三嗪)、1,2,4,5-四嗪、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并噁唑基。杂芳基可以是未被取代的，或被例如1、2、3或4个本文中定义的取代基取代。
除非另外指出，否则本文中使用的术语“杂环基”表示，含有1、2、3或4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的非芳族5-、6-或7-元环。杂环基可以是未被取代的，或被例如1、2、3或4个本文中定义的取代基取代。
在基团被取代的情况下，所述基团可以被1、2、3、4、5或6个取代基取代。任选的取代基包括、但不限于：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、卤素(-F、-Cl、-Br或-I)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、酰氧基(-OC(=O)R’)、酰基(-C(=O)R’)、烷氧基(-OR’)、酰氨基(-NR’C(=O)R”或-C(=O)NRR’)、氨基(-NRR’)、羧酸(-CO2H)、羧酸酯(-CO2R’)、氨甲酰基(-OC(=O)NR’R”或-NRC(=O)OR’)、羟基(-OH)、氧代(=O)、异氰基(-NC)、磺酸酯(-S(=O)2OR)、磺酰胺(-S(=O)2NRR’或-NRS(=O)2R’)或磺酰基(-S(=O)2R)，其中每个R或R’独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳基或杂芳基。在某些实施方案中，所述取代基本身可以进一步被例如1、2、3、4、5或6个本文中定义的取代基取代。例如，C1-6烷基、芳基或杂芳基可以进一步被1、2、3、4、5或6个如本文中所述的取代基取代。
本发明的视黄酸化合物会抑制Pin1活性(例如，如通过本文中描述的基于荧光偏振的置换测定或PPIase测定所确定的)。该抑制可以是，例如，大于20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更大。
措辞“抗增殖化合物”意图包括这样的化学试剂：其抑制增殖中的细胞或组织的生长，其中这样的细胞或组织的生长是不希望的。化学治疗剂是本领域众所周知的(以及本文中描述的)，且通常被用于治疗肿瘤疾病、肿瘤和癌症。
本文中使用的“治疗”被定义为，给患者应用或施用治疗剂(例如，视黄酸化合物)，或者给得自患者（其具有疾病、疾病的症状或患疾病的倾向）的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，目的是：治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或患疾病的倾向，或者减慢疾病的进展。
本文中使用的术语“样品”和“生物样品”包括，得自含有Pin1的哺乳动物或受试者的样品，其可以用于本文所述的方法中，例如，分离自受试者的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者内部的组织、细胞和流体。得自受试者的典型样品包括组织样品、肿瘤样品、血液、尿、活组织检查、淋巴、唾液、痰、脓等。
“低剂量”或“低浓度”是指，比特定化合物的最低标准推荐剂量或最低标准推荐浓度低至少5%(例如，至少10%、20%、50%、80%、90%或甚至95%)，所述特定化合物被配制用于给定的施用途径，用于治疗任何人疾病或病症。例如，被配制用于口服施用的抗增殖化合物的低剂量将不同于被配制用于静脉内施用的抗增殖化合物的低剂量。
附图说明
图1A的示意图显示了Pin1和指定的基因的活性之间的关联。
图1B的示意图显示了Pin1在指定的信号转导途径中的作用。
图2A是13-顺式-视黄酸和全反式视黄酸的化学结构的示意图。
图2B的示意图显示了其它视黄酸化合物。
图3的一对图显示了在温育指定的时间量以后，不同浓度的13-顺式-视黄酸和全反式视黄酸与荧光-标记的Pin1肽抑制剂探针BIKL-488竞争结合Pin1的能力。
图4的一对图显示了指定浓度的顺式-视黄酸和反式-视黄酸对Pin1的抑制。
图5的照片指示顺式和反式视黄酸都可以结合Pin1并竞争除去DAPK，所述DAPK结合Pin1催化结构域。
图6A的图显示了Pin1活性部位中对于与检测性探针BIKL-488相互作用而言重要的特定残基。
图6B的图显示了Pin1活性部位中对于与视黄酸相互作用而言重要的特定残基。
图7A的一对图显示了指定细胞系的细胞生存力随着顺式-视黄酸或反式-视黄酸的浓度而变化。
图7B的一系列蛋白质印迹显示了在指定细胞系中用顺式-视黄酸或反式-视黄酸处理过的细胞中的指定蛋白的表达。
图8A的照片指示了在有指定化合物存在下产生的Pin1或GAPDH mRNA的量，所述量在RT-PCR实验中测得。
图8B的蛋白质印迹显示了在用指定化合物处理过的细胞中的Pin1和微管蛋白蛋白质水平。
图8C的蛋白质印迹显示了在用放线菌酮和指定化合物处理过的细胞中的Pin1和微管蛋白蛋白质水平。
图9A的一对图显示了细胞生存力随着指定细胞类型中的所有反式-视黄酸的浓度而变化。
图9B的蛋白质印迹显示了指定细胞类型中的Pin1蛋白质水平。
图9C的蛋白质印迹显示了用13cRA或ATRA处理过的指定细胞类型中的Pin1蛋白质水平。
图10A的一系列示意图显示了指定视黄酸化合物和β-胡萝卜素。
图10B的图显示了游离Pin1颗粒的浓度随着指定化合物的浓度而变化。
图10C的表总结了图10B的结果。
图10D的一系列示意图显示了调控视黄酸受体的化合物。
图11A是全反式视黄酸和阿维A的化学结构的示意图。
图11B的图显示了游离Pin1颗粒的浓度随着指定化合物的浓度而变化。
图11C的蛋白质印迹显示了用不同浓度的指定化合物处理过的细胞中的Pin1和微管蛋白蛋白质水平。
图11D的图显示了细胞生存力随着指定化合物的浓度而变化。
图12的图显示了细胞数目随着指定化合物或化合物组合的浓度而变化。对于与化合物组合相对应的数据点，所述浓度值对应于该组合中的每种单独化合物的浓度。
图13A的蛋白质印迹显示了为了抑制Pin1而用siRNA处理过的人乳腺癌细胞中的Pin、Her2和肌动蛋白蛋白质水平。
图13B的图显示了细胞数目随着siRNA对细胞中的Pin1的抑制而变化。
具体实施方式
一般而言，本发明的特征在于通过施用视黄酸化合物来治疗受试者的以升高的Pin1标志物水平为特征的增殖性病症的方法。另外，本发明的特征在于治疗增殖性病症(例如，以升高的Pin1标志物水平为特征的增殖性病症)的方法，其中与一种或多种额外的抗增殖化合物或其它抗癌疗法联合施用视黄酸化合物。
Pin1的抑制剂(例如，视黄酸化合物)可用于治疗增殖性病症(例如，以增加的Pin1活性为特征的病症)。此外，因为Pin1在几种不同的致癌途径中起作用，预期Pin1抑制将会与许多抗增殖化合物协同地起作用。
I. Pin1
对丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序的磷酸化会抑制顺/反脯氨酰异构化，且也会产生必需蛋白Pin1的结合位点。Pin1会结合确定的磷蛋白子集和调节其活性，以及参与有丝分裂进展的定时（timing）。结构和功能分析已经指示，Pin1含有结合磷蛋白的磷酸丝氨酸/苏氨酸结合模块以及将磷酸化的磷酸丝氨酸苏氨酸-脯氨酸（phosphoserinelthreonine-proline）特异性地异构化的催化活性。这两种Pin1活性都是Pin1在体内实现它的功能所必需的。
Pin1在人癌症样品中过表达，且Pin1的水平与肿瘤的侵袭性相关联。我们已经发现，具有未知机制的有效抗癌试剂会有效地和可逆地抑制Pin1异构酶活性。此外，通过不同方案（包括Pin1抑制剂、Pin1反义多核苷酸或遗传耗尽（genetic depletion））对Pin1的抑制会通过诱导过早的有丝分裂进入和细胞凋亡而杀死人和酵母分裂细胞。因而，在磷酸化后，Pin1插入在磷蛋白上并扭曲靠近脯氨酸的肽键，所述肽键调节磷蛋白的功能和参与控制有丝分裂进展的定时。
Pin1是高度保守的，且含有蛋白相互作用模块（被称作WW结构域）和催化活性的肽基-脯氨酰异构酶(PPIase)。Pin1在结构上和在功能上不同于2个其它充分表征的PPIase家族的成员（亲环蛋白和FKBP）。PPIase是普遍存在的酶，其催化蛋白的通常缓慢的脯氨酰异构化，从而实现局部的能量上不利的构象状态的松弛。对紧靠在Pro前面的Ser/Thr残基的磷酸化不仅会改变脯氨酰异构化速率，而且会产生Pin1的WW结构域的结合位点。所述WW结构域充当新颖的磷酸丝氨酸结合模块，其将Pin1靶向高度保守的磷蛋白子集。此外，Pin1展示独特的磷酸化依赖性的PPIase，所述PPIase将磷酸化的Ser/Thr-Pro键特异性地异构化并调节磷蛋白的功能。
这些结果共同地指示，Pin1亚家族的酶是以失控的细胞增殖为特征的疾病（主要是恶性肿瘤）的诊断和治疗靶标。
II. PIN1标志物水平的测量
本发明涉及使用视黄酸化合物治疗增殖性疾病，所述增殖性疾病被鉴别为与升高的Pin1标志物水平有关。在某些方面，本发明的特征在于受试者中的Pin1标志物水平的确定；其中在确定Pin1标志物水平升高的情况下，在受试者中施用视黄酸。在其它方面，本发明的特征也可以在于视黄酸化合物施用以后的Pin1标志物水平的测量，以便评价治疗增殖性病症的治疗的进展。
因此，本发明的一个方面涉及诊断测定，其用于测量生物样品(例如，肿瘤样品、血液、尿、活组织检查、淋巴、唾液、痰和脓)背景下的Pin1标志物水平以及Pin1活性，由此确定个体是否是视黄酸化合物治疗的候选者。本发明的特征在于表现出增殖性病症症状的受试者和处于发展增殖性病症的风险中的个体的治疗。
诊断测定
一种示例性的用于检测Pin1蛋白或核酸在生物样品中的存在与否的方法包括：从试验受试者获得生物样品，和使所述生物样品与能够检测Pin1蛋白或编码Pin1蛋白的核酸(例如，mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，从而检测Pin1蛋白或核酸在所述生物样品中的存在。用于检测Pin1 mRNA或基因组DNA的一种优选试剂是能够与Pin1 mRNA或DNA杂交的标记的核酸探针。所述核酸探针可以是，例如，Pin1核酸或对应核酸，诸如能够在严格条件下与Pin1 mRNA或基因组DNA特异性地杂交的长度为至少15、30、50、100、250或500个核苷酸的寡核苷酸。本文中描述了用于本发明的诊断测定中的其它合适的探针。
用于检测Pin1标志物的一种优选试剂是能够结合Pin1蛋白的抗体，优选具有可检测标记物的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选地是单克隆的。可以使用完整抗体或其片段(例如，Fab或F(ab')2)。就探针或抗体而言，术语“标记的”意图包括：通过将可检测的物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)而对探针或抗体的直接标记，以及通过与被直接标记的另一种试剂的反应性而对探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括：使用荧光地标记的第二抗体检测第一抗体，和用生物素对DNA探针进行末端标记使得它可被荧光地标记的抗生蛋白链菌素检测出。
就基于抗体的检测技术而言，本领域技术人员使用不超过例行实验即可以产生针对适当的免疫原诸如分离的和/或重组的Pin1或其部分或片段(包括合成的分子，诸如合成的肽)的抗-Pin1抗体。可以设计合成的肽并用于免疫动物，诸如兔和小鼠，用于抗体生产。Pin1的核酸和氨基酸序列是已知的(Hunter等人, WO 97/17986 (1997)；Hunter等人, 美国专利号5,952,467和5,972,697，它们全部的教导特此通过引用整体并入)，且可以用于设计核酸构建体，用于生产在免疫接种中或核酸检测方法中使用的蛋白、或用于合成在免疫接种中使用的肽。
将抗体与试验样品一起温育所用的条件可以随组织或细胞类型而变化。温育条件可以取决于在测定中采用的形式、采用的检测方法、以及在测定中使用的抗体的类型和性质。本领域技术人员会认识到，可以容易地改进通常可利用的免疫学测定形式(诸如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定、底层扩散平板（diffusion based Ouchterlony）或火箭免疫荧光测定)中的任一种，以采用本发明的抗体。这样的测定的例子可以参见：Chard, “An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques”, Elsevier Science Publishers, 阿姆斯特丹, 荷兰(1986)；Bullock等人, “Techniques in Immunocytochemistry”，Academic Press, Orlando, Fla. 第1卷(1982), 第2卷(1983), 第3卷(1985)；Tijssen, “Practice and Theory of enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”，Elsevier Science Publishers, 阿姆斯特丹, 荷兰(1985)。
本发明的检测方法可以用于检测体外以及体内生物样品中的Pin1 mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，用于检测Pin1 mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。用于检测Pin1蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫荧光或定量测序反应。用于检测Pin1基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。可以使用Pin1 (或影响Pin1标志物水平的其它基因)中的基因组突变的检测来鉴别遗传突变或体细胞突变。此外，用于检测Pin1蛋白的体内技术包括：在受试者中引入标记的抗-Pin1抗体。例如，可以用放射性标志物标记抗体，所述放射性标志物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术进行检测。
在另一个实施方案中，所述生物样品含有得自试验受试者的蛋白分子。可替换地，所述生物样品可以含有得自试验受试者的mRNA分子或得自试验受试者的基因组DNA分子。一种优选的生物样品是通过常规方式从受试者分离出的血清样品。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括：从对照受试者得到对照生物样品，使所述对照样品与能够检测Pin1标志物的化合物或试剂接触，从而检测Pin1标志物在所述生物样品中的存在，和将Pin1标志物在对照样品中的存在与Pin1标志物在试验样品中的存在进行对比。
本发明的免疫学测定试验样品可以包括细胞、细胞的蛋白或膜提取物、血液或生物流体诸如腹水液或脑流体(例如，脑脊液)。在上述的方法中使用的试验样品是基于测定形式、检测方法和组织的性质、用作要测定的样品的细胞或提取物。用于制备细胞的蛋白提取物或膜提取物的方法是本领域众所周知的，且可以容易地改进，以便得到能够与系统一起使用的样品。本发明还包括用于检测Pin1在生物样品中的存在的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含：能够检测生物样品中的Pin1蛋白或mRNA的被标记的化合物或试剂；用于确定样品中的Pin1的量的装置/工具；和用于将样品中的Pin1的量与标准进行对比的装置/工具。所述化合物或试剂可以被包装在合适的容器中。所述试剂盒可以进一步包含关于使用试剂盒来检测Pin1蛋白或核酸的说明书。
还可以在被设计用于评价一组靶基因的测定（例如，微阵列或多路测序反应）中测量Pin1标志物水平。在本文中描述的本发明的实施方案中，可以互换使用众所周知的生物分子方法，诸如RNA印迹分析、RNA酶保护测定、DNA印迹分析、蛋白质印迹分析、原位杂交、组织切片或细胞扩散的免疫细胞化学操作和核酸扩增反应(例如，聚合酶链式反应)。本领域技术人员能够执行用于本发明的方法中的这些很好地建立的方案(参见，例如，Ausubel, 等人, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1999))。
诊断测定可以在例如被诊断出增殖性病症或处于增殖性病症风险中的受试者中进行。这样的病症包括、但不限于，白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤诸如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔曼瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
预后测定
此外，本文中描述的诊断方法可以用于鉴别这样的受试者：其具有与异常的Pin1表达或活性有关的疾病或病症，或处于发展所述疾病或病症的风险中。例如，本文中描述的测定，诸如上述诊断测定或下述测定，可以用于鉴别这样的受试者：其具有与Pin1标志物有关的病症(例如，增殖性病症)，或处于发展所述病症的风险中。因而，本发明提供了一种用于鉴别与异常的Pin1表达或活性有关的疾病或病症的方法，其中从受试者得到试验样品，并检测Pin1蛋白或核酸(例如，mRNA、基因组DNA)，其中Pin1蛋白或核酸的存在是这样的受试者的诊断：所述受试者具有Pin1-相关病症或处于发展Pin1-相关病症的风险中，并因此对视黄酸化合物治疗敏感。
此外，本发明提供了用于确定用视黄酸化合物是否可以有效地治疗受试者的与异常的Pin1表达或活性有关的病症的方法，其中得到试验样品，并检测Pin1蛋白或核酸表达或活性(例如，其中Pin1蛋白或核酸表达或活性的丰度是可以给其施用试剂以治疗Pin1-相关病症的受试者的诊断)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于确定Pin1翻译后修饰的方法。例如，肿瘤抑制基因DAPK1对催化活性部位中的Ser71上的Pin1的磷酸化会完全地抑制Pin1的促进癌发生的催化活性和细胞功能。更重要的是，催化活性部位中的Ser71上的Pin1的磷酸化也会阻止视黄酸化合物与Pin1活性部位的结合和诱导Pin1降解以及抑制Pin1功能。因此，通过使用我们已经制备的磷酸-特异性的Pin1抗体检测减少的Ser71磷酸化，可以是选择患者进行RA治疗和解释某些患者可能对RA没有应答的方法。因为异常增殖的细胞表现出减少的Ser71磷酸化，所以与正常细胞相比，这些细胞对RA治疗更敏感。
本发明的方法也可以用于检测Pin1基因中的遗传改变，由此确定具有改变的基因的受试者是否处于与Pin1基因有关的病症的风险中，且因此是视黄酸治疗的候选者。在优选的实施方案中，所述方法包括：在得自受试者的细胞样品中，检测遗传改变的存在与否或Pin1基因的错误表达，所述遗传改变的特征在于影响编码Pin1-蛋白的基因的完整性的改变中的至少一种。例如，这样的遗传改变可以通过确定下述至少一项的存在来检测：1) 一个或多个核苷酸从Pin1基因中的缺失；2) 一个或多个核苷酸向Pin1基因的添加；3) Pin1基因的一个或多个核苷酸的置换；4) Pin1基因的染色体重排；5) Pin1基因的信使RNA转录物水平的改变，6) Pin1基因的异常修饰，诸如基因组DNA的甲基化模式的异常修饰，7) Pin1基因的信使RNA转录物的非野生型剪接模式的存在，8) Pin1-蛋白的非野生型水平，9) Pin1基因的等位基因丢失，和10) Pin1-蛋白的不适当的翻译后修饰。如本文中所述，存在大量本领域已知的可以用于检测Pin1基因中的改变的测定技术。一种优选的生物样品是通过常规方式从受试者分离出的组织或血清样品，例如，心脏组织样品。
在某些实施方案中，改变的检测包括探针/引物在聚合酶链式反应(PCR) (参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202)（诸如锚定PCR或RACE PCR）中或者可替换地在连接链式反应(LCR) (参见，例如，Landegran等人(1988) Science 241:1077-1080；和Nakazawa等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364)中的应用，所述连接链式反应可以特别有用地用于检测Pin1-基因中的点突变(参见Abravaya等人(1995) Nucleic Acids Res 0.23:675-682)。该方法可以包括下述步骤：从患者收集样品，从所述样品分离核酸(例如，基因组、mRNA或二者)，使所述核酸样品与一种或多种引物接触（所述引物在使得Pin1-基因(如果存在的话)的杂交和扩增发生的条件下与Pin1基因特异性地杂交），和检测扩增产物的存在与否或检测扩增产物的大小，和将所述长度与对照样品进行对比。预见到，PCR和/或LCR可以合乎需要地与本文中描述的任意的用于检测突变的技术结合地用作初步扩增步骤。
可替代的扩增方法包括：自我持续序列复制(self sustained sequence replication)(Guatelli, J. C. 等人, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh, D. Y. 等人, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi, P. M. 等人(1988) Bio-Technology 6:1197)或任意其它核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果这样的分子以非常低的数目存在，这些检测方案对于核酸分子的检测而言是特别有用的。
在一个可替代的实施方案中，通过限制性酶切割模式的改变，可以鉴别来自样品细胞的Pin1基因的突变。例如，将样品和对照DNA分离，扩增(任选地)，用一种或多种限制性内切核酸酶消化，通过凝胶电泳确定片段长度大小，和进行对比。样品和对照DNA之间的片段长度大小差异指示样品DNA中的突变。此外，可以使用序列特异性的核酶(参见，例如，美国专利号5,498,531)，用于通过核酶切割位点的形成或丢失来对特定突变的存在评分。
在其它实施方案中，通过使样品和对照核酸（例如，DNA或RNA）与含有数百或数千寡核苷酸探针的高密度阵列杂交，可以鉴别Pin1中的基因突变(Cronin, M. T. 等人(1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M. J. 等人(1996) Nature Medicine 2: 753-759)。例如，如Cronin, M. T. 等人（出处同上）所述，可以在含有光产生的DNA探针的二维阵列中鉴别Pin1的基因突变。简而言之，可以使用第一探针杂交阵列来扫描样品和对照中的长DNA区段（stretches），以通过制备连续重叠探针的线性阵列来鉴别序列之间的碱基变化。该步骤允许鉴别点突变。该步骤继之以第二杂交阵列，其允许通过使用更小的与所有被检测的变体或突变互补的专门探针阵列来表征特定突变。每个突变阵列由平行的探针集合组成，一个探针集合与野生型基因互补，另一个探针集合与突变基因互补。
在另一个实施方案中，可以使用本领域已知的多种测序反应中的任一种来对Pin1基因直接测序，并通过将样品Pin1的序列与对应的野生型(对照)序列进行对比来检测突变。测序反应的例子包括以Maxam和Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)或Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)开发的技术为基础的那些。也涵盖当进行诊断测定时可以利用的多种自动化的测序操作中的任一种((1995) Biotechniques 19:448)，包括质谱法测序(参见，例如，PCT国际公开号WO 94/16101; Cohen等人(1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162；和Griffin等人(1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159)。
用于检测Pin1基因中的突变的其它方法包括这样的方法：其中使用针对切割试剂的保护来检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基(Myers等人(1985) Science 230:1242)。一般而言，“错配切割”的巧妙技术通过提供异源双链体来开始，所述异源双链体通过使含有野生型Pin1序列的(标记的) RNA或DNA与从组织样品得到的潜在突变体RNA或DNA杂交而形成。用切割双链体的单链区域（诸如将由于对照和样品链之间的碱基对错配而存在的单链区域）的试剂处理双链的双链体。例如，可以用RNA酶处理RNA/DNA双链体，用S1核酸酶处理DNA/DNA杂交物，以酶促地消化错配区域。在其它实施方案中，可以用羟胺或四氧化锇和用哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体，以便消化错配区域。消化错配区域后，然后通过在变性聚丙烯酰胺凝胶上的大小来分离得到的物质，以确定突变的位点。参见，例如，Cotton等人(1988) Proc. Nat Acad Sci USA 85:4397; Saleeba等人(1992) Methods Enzymol. 217:286-295。在一个优选的实施方案中，可以标记对照DNA或RNA进行检测。
在另一个实施方案中，所述错配切割反应在确定的系统中采用一种或多种识别双链DNA中的错配碱基对的蛋白(所谓的“DNA错配修复”酶)，用于检测得自细胞样品的Pin1 cDNA中的点突变和绘制其图谱。例如，大肠杆菌的mutY酶会切割在G/A错配处的A，得自HeLa细胞的胸苷DNA糖基化酶会切割在G/T错配处的T (Hsu等人(1994) Carcinogenesis 15:1657-1662)。根据一个示例性实施方案，使基于Pin1序列（例如，野生型Pin1序列）的探针与得自试验细胞（一个或多个）的cDNA或其它DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理双链体，并且可以从电泳图谱等检测出切割产物（如果有的话）。参见，例如，美国专利号5,459,039。
在其它实施方案中，将使用电泳迁移率的改变来鉴别Pin1基因中的突变。例如，可以使用单链构象多态性(SSCP)来检测突变型和野生型核酸之间的电泳迁移率差异(Orita等人(1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA: 86:2766, 也参见Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144；和Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79)。使样品和对照Pin1核酸的单链DNA片段变性，并允许其复性。单链核酸的二级结构根据序列而变化，得到的电泳迁移率改变会实现甚至单个碱基变化的检测。可以用经标记的探针标记或检测DNA片段。通过使用其中二级结构对序列变化更敏感的RNA (而不是DNA)，可以增强测定的灵敏度。在一个优选的实施方案中，所述主题方法利用异源双链体分析基于电泳迁移率的变化来分离双链的异源双链体分子(Keen等人(1991) Trends Genet. 7:5)。
在另一个实施方案中，使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)，测定突变型或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(Myers等人(1985) Nature 313:495)。当使用DGGE作为分析方法时，将修饰DNA以确保它没有完全变性，所述修饰例如通过由PCR添加高熔点的富含GC的DNA的大约40个碱基对的GC夹子（clamp）。在另一个实施方案中，使用温度梯度替代变性梯度，以鉴别对照和样品DNA的迁移率的差异(Rosenbaum和Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753)。
用于检测点突变的其它技术的例子包括、但不限于：选择性的寡核苷酸杂交、选择性的扩增或选择性的引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸引物，其中将已知突变置于中央，然后使其与靶DNA在特定条件下杂交，所述条件允许仅在发现完美匹配时才杂交(Saiki等人(1986) Nature 324:163)；Saiki等人(1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230)。使这样的等位基因特异性的寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或许多不同的突变（当所述寡核苷酸被连接至杂交膜并与标记的靶DNA杂交时）杂交。
可替换地，可以与本发明结合使用依赖于选择性的PCR扩增的等位基因特异性的扩增技术。被用作特异性扩增的引物的寡核苷酸可以在分子中央(使得扩增依赖于差示杂交) (Gibbs等人(1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)或在一种引物的尽头3'末端处（在适当的条件下，错配可以阻止或减少聚合酶延伸）(Prossner等人(1993) Tibtech 11:238)携带目标突变。另外，可能合乎需要的是，在突变区域中引入新颖的限制位点以建立基于切割的检测(Gasparini等人(1992) Mol. Cell Probes 6:1)。预见到，在某些实施方案中，也可以使用用于扩增的Taq连接酶进行扩增(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189)。在这样的情况下，只有在5'序列的3'末端处存在完美匹配时才发生连接，从而使得通过寻找扩增的存在与否来检测已知突变在特定位点处的存在成为可能。
可以如下执行本文所述的方法，例如，通过利用包含至少一种本文中描述的探针核酸或抗体试剂的预包装的诊断试剂盒，其可以在例如临床场合中方便地用于诊断表现出涉及Pin1基因的疾病或病症的症状或家族史的患者。
此外，可以在本文中描述的预后测定中利用在其中表达Pin1的任意细胞类型或组织。
与上述的诊断测定一样，可以包括Pin1活性的预后测定作为一组靶基因的一部分。
检测Pin1活性和诊断Pin1相关病症的其它方法公开在美国专利申请公开号2009/0258352、2008/0214470、2006/0074222、2005/0239095、US2002/0025521、美国专利号6,495,376和PCT申请公开号WO02/065091中，它们每篇特此通过引用整体并入。
本发明的特征也在于用于诊断、治疗和监测本文中描述的病症(例如，细胞增殖病症)的进展的方法和组合物，其是通过检测和测量例如处于顺式或反式构象的含有磷酸化的Ser/Thr-Pro基序的Pin1底物(或其任意片段或衍生物)，如在特此通过引用整体并入的美国专利临时申请号61/255,431中所述。所述方法可以包括：使用构象特异性抗体，与正常参照相比，测量处于顺式或反式构象的Pin1底物(其例子列出在表2、3和4中)的绝对水平。例如，小于5 ng/ml、4 ng/ml、3 ng/ml、2 ng/ml或小于1 ng/ml血清或活组织检查的处于顺式或反式构象的Pin1底物的血清水平或活组织检查水平，被视作被诊断出病症(例如，与Pin1活性失调有关的病症)的患者的好结果的预示。大于5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml或50 ng/ml的处于顺式或反式构象的底物的血清水平，被视作已经被诊断出病症（例如，与Pin1活性失调有关的病症）的受试者的差结果的诊断。
就基于处于特定构象的底物(例如，处于顺式或反式构象的Pin1底物)的相对水平的诊断而言，具有病症(例如，与PPIase活性失调有关的病症) 的受试者将表现出处于例如顺式构象的底物的量的改变(例如，增加了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)。正常参照样品可以是，例如，在病症或提示病症的症状发展之前取自相同受试者的先前样品，取自不具有病症的受试者的样品，取自不具有病症症状的受试者的样品，或在已知正常浓度(即，不指示病症)的处于给定构象的纯化参照多肽的样品。
可以使用标准方法来测量任何体液（包括、但不限于，尿、血液、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊液）中的底物水平。这样的方法包括免疫测定、ELISA、蛋白质印迹法和定量酶免疫测定技术。
对于诊断目的，可以标记构象特异性的抗体。抗体的标记意图包括：通过将可检测的物质与抗体偶联(例如，物理连接)而对所述抗体的直接标记，以及通过使抗体与被直接标记的另一种试剂反应而对所述抗体的间接标记。例如，可以用放射性或荧光标志物标记抗体，所述标志物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术进行检测。
本文中描述的诊断方法可以单独使用，或者与本文中描述的用于更准确地诊断病症(例如，细胞增殖病症或神经学病症)的存在或严重程度的任意其它诊断方法联合使用。用于诊断这样的病症的其它方法的例子包括，例如，检查受试者的健康史、组织的免疫组织化学染色、计算机体层摄影术(CT)扫描或培养物生长。
监测视黄酸治疗的效果和疾病进展
在一个实施方案中，本发明的特征在于一种用于监测视黄酸化合物治疗受试者的有效性的方法，所述方法包括下述步骤：(i) 在施用化合物之前，从受试者得到施用前样品；(ii) 在所述施用前样品中检测Pin1蛋白、在Ser71上的Pin1磷酸化、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(iii) 从受试者得到一个或多个施用后样品；(iv) 在所述施用后样品中检测Pin1蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(v) 将所述施用前样品中的Pin1蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平与一个或多个施用后样品中的Pin1蛋白、mRNA或基因组DNA进行对比；和(vi) 相应地改变视黄酸化合物给所述受试者的施用。根据这样的一个实施方案，即使在没有可观察的表型应答存在下，也可以使用Pin1表达、磷酸化或活性作为视黄酸化合物的有效性的指示。
在另一个实施方案中，本文中描述的诊断方法还可以用于使用构象特异性抗体来测量例如处于顺式或反式构象的具有pSer/Thr-Pro基序的多肽(例如，在表2、3和4中列出的Pin1底物)的水平。所述方法可以包括：使用构象特异性抗体进行重复测量，用于诊断病症和监测所述病症的治疗或控制。为了监测受试者的病症的进展，可以在几个时间点得到受试者样品，并可以使用构象特异性抗体来监测Pin1底物(在表2、3和4中列出)的顺式和反式异构体的水平。例如，可以使用诊断方法来在化学疗法(例如，使用视黄酸化合物或本文中描述的其它试剂的治疗)期间监测受试者。在该实施例中，可以在用化学治疗剂治疗之前从受试者获得血清样品，在用化学治疗剂治疗期间再次获得，并在用化学治疗剂治疗后再次获得。在该实施例中，使用本发明的构象特异性抗体，密切监测受试者中处于顺式构象的具有pSer/Thr-Pro基序的Pin1底物的水平，并且，如果处于顺式构象的具有pSer/Thr-Pro基序的Pin1底物的水平在治疗期间开始增加，可以修改用于治疗所述病症的治疗方案，这由临床医师确定(例如，可以改变治疗剂量，或者可以施用不同的治疗剂)。本发明的监测方法也可以用于，例如，评估特定药物或疗法在受试者中的效力，确定剂量，或评估感染的进展、状态或阶段。
表2. 一般Pin1底物
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表4. 用于促进肿瘤发生的Pin1-靶标
底物 功能 结合部位 作用 活化/灭活
AIB1/SRC3 反式作用子 - 活性 +
Akt 蛋白激酶 pThr92/450-Pro 稳定性 +
Bax 细胞凋亡 pThr167-Pro 活性 -
Bcl-2 抗细胞凋亡蛋白 - 稳定性 -
Btk 酪氨酸激酶 pSer21/115-Pro 稳定性 -
β-连环蛋白 转录因子 pSer246-Pro 局部化、稳定性 +
C/EBP 转录因子 - 活性 -
细胞周期蛋白D1 转录因子 pThr286-Pro 局部化、稳定性 +
Daxx 细胞凋亡 pSer178-Pro 稳定性 -
FAK 酪氨酸激酶 pSer910-Pro 活性 +
c-Fos 转录因子 - 活性 +
FOXO4 转录因子 - 局部化、活性 -
GRK2 G蛋白受体 pSer670-Pro 稳定性 -
Hbx 反式作用子 pSer41-Pro 活性、稳定性 +
c-Jun 转录因子 pSer63/73-Pro 活性、稳定性 +
Mcl-1 细胞凋亡 pThr92/163-Pro 稳定性 +
c-Myb 反式作用子 pSer528-Pro 活性 +
Neu 生长因子受体 - 稳定性 +
NF-κB 转录因子 pThr254-Pro 局部化、稳定性 +
Notch1 生长因子 - 活性 +
p70S6K 核糖体S6激酶 - 活性 +
p53 转录因子 - 活性、稳定性 -*
Plk1 有丝分裂的激酶 - 结合活性 +
PML 转录因子 pSer403/505/518/527-Pro 稳定性 -
Raf-1 蛋白激酶 - 活性 +
RARα 转录调节剂 pSer77-Pro 稳定性 -
V-Rel 转录因子 pThr254-Pro 局部化、稳定性 +
Smad 反式作用子 - 稳定性 -
SMRT 转录辅阻遏物 pSer1241/1469， Thr1445-Pro 稳定性 -
Stat3 转录因子 pSer727-Pro 活性 +
Tax 病毒癌蛋白 pSer160-Pro 活性、稳定性 +
Pin2/TRF1 端粒调节 pThr149-Pro 稳定性 -
III. 治疗方法
本发明提供了用视黄酸化合物治疗处于增殖性病症(例如，与增加的Pin1表达或活性有关的病症)的风险中(或对所述病症易感)的受试者的预防和治疗方法。
本发明的某些实施方案的特征在于用于例如控释或延时释放的视黄酸化合物的制剂。可以遵循许多策略来得到控释和/或延时释放，其中释放速率超过治疗性化合物的代谢速率。例如，通过制剂参数和成分(例如，适当的控释组合物和包衣剂)的适当选择，可以得到控释。例子包括：单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、混悬液、乳剂、微囊、微球、纳米粒、贴剂和脂质体。可以控制释放机制，使得视黄酸化合物以定期间隔释放，所述释放可以是同时的，或者当一种特定试剂的早期释放相对于其它试剂而言为优选时，可以实现组合中的一种试剂的延迟释放。
本发明的某些实施方案的特征在于氘化的视黄酸化合物，其通过使用现有技术(例如，如本文中和www.concertpharma.com所述)用氘替换有一些或所有氢来制备。
预防方法
在一个方面，本发明提供了一种通过给受试者施用视黄酸化合物来预防受试者的增殖性病症的方法。通过例如本文中所述的诊断或预后测定中的任一种或组合，可以鉴别处于由异常的Pin1表达或活性造成或促进的疾病风险中的受试者。视黄酸化合物的施用可以发生在表现出Pin1异常的特征性症状之前，从而预防疾病或病症，或者可替换地，延迟其进展。
联合治疗
抗增殖化合物和其它抗癌化合物(例如，抗血管生成的化合物)可用于与本发明的视黄酸化合物联合治疗增殖性病症。
可以与视黄酸化合物联合使用的抗增殖剂包括、但不限于，微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、铂类、烷化剂和抗代谢药。可用于本发明的方法和组合物中的具体抗增殖剂包括、但不限于，紫杉醇、吉西他滨、多柔比星、长春碱、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、卡铂、六甲蜜胺、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、阿扎胞苷、博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、2-氯脱氧腺苷、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、磷酸雌莫司汀、氟尿苷、氟达拉滨、吉妥珠单抗、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、喷司他丁、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、托泊替康、曲妥珠单抗、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。使用已知的动物模型，可以评估化合物的抑制肿瘤生长的能力。
已知与Pin1信号传递途径所涉及的其它蛋白相互作用的化合物还可以与视黄酸化合物联合使用(参见，例如，表5中的靶标和化合物)。
表5.
靶标 靶标类别 代表性的拮抗剂
AKT 激酶 MK-2206
细胞周期蛋白D1 细胞周期蛋白 ON 013105
HER2/Neu (ErbB-2) 激酶 赫赛汀
NF-□F 转录因子 RTA 402
Plk 激酶 BI 2536
Raf-1 激酶 索拉非尼
Stat3 转录因子 ISIS-STAT3Rx
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SIS-STAT		 粘附 在Enzon Program at Santaris中的基于核酸的反应物(Rx)
这样的化合物可以与视黄酸化合物协同地起作用。另外，与视黄酸化合物共同施用可以导致抗增殖化合物在比单独施用所述抗增殖化合物时更低(和因而更安全)剂量(例如，低至少5%(例如，至少10%、20%、50%、80%、90%或甚至95%)的效力。
根据本发明的治疗可以单独进行，或者与另一治疗组合进行，并且可以在家、医生办公室、诊所、医院的门诊部或医院提供。治疗任选地在医院开始，使得医生可以密切观察治疗效果并作出所需的任何调整，或者可在门诊患者基础上开始。治疗的持续时间取决于所治疗的疾病或病症的种类、患者的年龄和状况、患者的疾病的阶段和类型、以及患者对治疗的反应如何。另外，具有发展增殖性疾病的更大危险的人可以接受治疗以抑制或延迟症状的发作。
用于不同实施方案的施用途径包括、但不限于：局部、透皮、鼻和全身性施用(例如，静脉内、肌肉内、皮下、吸入、直肠、含服、阴道、腹膜内、关节内、眼、耳或口服施用)。本文中使用的“全身性施用”表示所有的非真皮施用途径，并且特别排除局部和透皮施用途径。
在联合治疗(例如，视黄酸化合物与第二种抗增殖剂)中，可以独立地控制所述组合中的每种组分的施用剂量和频率。例如，一种化合物可以每天施用3次，而第二种化合物可以每天施用1次。可替换地，一种化合物可以较早地施用，而第二种化合物可以较晚地施用。联合治疗可以以启闭循环的方式进行，所述启闭循环包括休息期，使得患者的身体具有从任何迄今未预见到的副作用恢复的机会。所述化合物也可以一起配制，使得一次施用会递送两种化合物。
所述组合中的每种化合物可以以本领域已知的多种方式进行配制。例如，所述第一种和第二种试剂可以一起或者单独地配制。理想地，所述第一种和第二种试剂一起配制用于同时或接近同时施用所述试剂。这样的共配制组合物可以在相同的丸剂、软膏剂、乳膏剂、泡沫、胶囊剂、液体等中一起包括2种药物。应当理解，当提及本发明的组合的制剂时，采用的制剂技术也可用于配制所述组合以及本发明的其它组合中的单一试剂。通过为不同的试剂使用不同的制剂策略，可以适当地匹配每种试剂的药代动力学分布。
单个地或单独地配制的试剂可以一起包装为试剂盒。非限制性例子包括这样的试剂盒：其含有例如在小瓶中的2种丸剂、一种丸剂和一种粉末、一种栓剂和一种液体，两种局部乳膏剂、软膏剂、泡沫等。所述试剂盒可以包括辅助给患者施用单位剂量的任选组件，诸如用于重构粉末形式的小瓶，用于注射的注射器、定制的静脉内(IV)递送系统、吸入器等。另外，所述单位剂量试剂盒可以含有关于组合物的制备和施用的说明书。所述试剂盒可以制备成用于一位患者的单次使用单位剂量、用于特定患者的多次使用(以恒定剂量，或者其中各种化合物可以随着治疗进展而改变效能)；或者所述试剂盒可以含有适合用于施用给多位患者的多次剂量(“散包装”)。所述试剂盒组件可以被装配在纸板盒、泡罩包、瓶子、管等中。
IV. 实验结果
我们已经鉴别了一系列纳摩尔抑制剂，其仅结合Pin1的催化活性的PPIase结构域。在电穿孔或显微注射后，这些Pin1肽抑制剂会阻断HeLa分裂，且该阻断被共注射的Pin1挽救，从而表明所述化合物是高度特异性的和有效的。使用上述的Pin1肽抑制剂，我们已经开发了一种高通量筛选，其使用单步基于荧光偏振的置换测定(FP-HTS)来鉴别Pin1抑制剂。所述FP-HTS会检测与底物竞争结合催化活性部位的分子，测量在平衡条件下的配体结合，且不会受制于产物抑制。用于FP测定的HF488荧光探针仅含有Bth-L-phos的4个残基核心结构。Thr-Pip-Nal (pTide)（其对Pin1的Kd为258 nM）由Anaspec合成。我们使用Synergy II平板读数器，使用全长Pin1和生产的稳健的FP以384-孔板形式进行了FP-HTS，从而导致极化程度值的6-7倍增加。该新颖的FP-HTS表明稳健的和可再现的性能。所述测定可以耐受至多10% DMSO。Z’是约0.70，且对于每天性能而言是一致的。变动系数是在4-5%范围内。更重要的是，我们已经证实，pTide（在该项目中作为阳性对照的未标记的Pin1肽）和胡桃醌(juglone)（Pin1小分子抑制剂）都从Pin1中置换出HF488探针。尽管难以确定共价的和不可逆的抑制剂胡桃醌的Kd，但是pTide的Kd为约250 nM，其类似于从基于PPIase的测定导出的Kd。
我们使用5 nM探针和200 nM Pin1利用FP-HTS在选定的化学试剂文库集合上进行了初步筛选（pilot screen）。我们得到了产生的潜在阳性命中物，并根据Z-评分（其是低于平均值的标准差的倍数）将它们分成3类。顶部的强化学试剂是临床上使用的药物13-顺式-视黄酸(顺式-RA) (图2A)。由于下述原因，顺式-RA是特别有吸引力的。1) 顺式-RA未在混杂的抑制剂数据库（promiscuous inhibitor databases）中列出；2) 全反式视黄酸(反式-RA，顺式-RA的配对化合物)目前被用作具有急性早幼粒细胞性白血病(AML)的患者的口服处方；3) 顺式-RA和反式-RA都被用作乳腺癌的II/III期临床试验的药物，且更因为它的杀死快速分裂的细胞的能力；和4) 尽管已经报道，RA靶向视黄酸受体(RAR)，但是抗癌作用的确切机制是未知的。所以，我们检验了RA的抗癌作用是否依赖于乳腺癌细胞中的RAR。RARα敲低仅可以部分地挽救顺式-RA介导的细胞死亡，从而指示RA可能具有未鉴别的“脱靶效应”。为了证实RA实际上靶向Pin1，我们在FP测定中检验了顺式-RA和反式-RA，并且令人惊奇地发现，反式-RA表现出比顺式-RA剂量甚至更明显的Pin1抑制，并且顺式-RA最终会在与Pin1一起的长期温育中赶上反式-RA，这可能是由于共振介导的顺式-反式转化(图3)。在PPIase测定中，顺式-或反式-RA以剂量依赖性的方式阻断Pin1活性(图4)。这些数据证实，RA和Pin1之间的相互作用是特异性的，且不是由于聚集。此外，反式和顺式RA都会以剂量依赖性的方式阻断Pin1和DAPK1之间的结合，其中反式更有效(图5)。这些结果指示，RA会结合Pin1 C-端催化结构域，因为已知DAPK1会结合该结构域(Lee等人, 2011 Mol Cell，印刷中)。为了确定Pin1催化结构域中的哪个氨基酸残基对于视黄酸结合而言是重要的，Pin1的点突变（包括K63A、S67E、R68/69A、H59A或S71E）完全地或显著地消除了反式-RA与Pin1的结合(图6A和B)。这些数据一起指示，RA会通过占据Pin1在C-端中的催化性PPIase袋来抑制Pin1，并且Ser67或Ser71的磷酸化会抑制RA与Pin1的结合。
为了进一步辨别RA对Pin1的抗增殖作用之间的原因关联，用不同剂量的顺式-或反式-RA试验了3种乳腺癌细胞系的细胞生存力，其中SKBR3和T47D表现出对RA的优先敏感性，具有在纳摩尔范围内的IC50，而正常细胞系MCF10A保持未受影响(图7A)。细胞系之间的这种不一致与RA的抑制Pin1表达的能力相关联。RA治疗降低了药物-响应性的SKBR3和T47D中的Pin1水平，但是在药物-无响应的正常细胞MCF10A中却没有(图7B)，其中Pin1靶蛋白即细胞周期蛋白D1充当体内Pin1活性的生物标志物。此外，RA没有改变Pin1 mRNA水平，但是确实降低了Pin1蛋白稳定性，这提示，RA会与Pin1相互作用，导致Pin1降解，并随后导致乳腺癌细胞的抗增殖(图8A-C)。为了进一步证实该假设，使用野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT MEF)和Pin1敲除的MEF (Pin1 KO MEF)来试验反式-RA介导的细胞生存力(图9A-C)。如预期的，与WT MEF相比，Pin1 KO MEF由于缺少药物靶标而更耐受反式-RA。另外，稳定地表达WT Pin1的Pin1 KO MEF能够使细胞对反式-RA重新敏化，而W34/K63A Pin1突变体却不能。这些结果指示，RA介导的细胞死亡至少部分地依赖于Pin1。
由于反式-RA被选择为当前的先导化合物，重要的是，鉴别出RA在Pin1相互作用中必需的部分，用于进一步先导物优化。试验了许多商购可得的类视黄醇的Pin1抑制。仅具有末端羧基的那些在细胞培养物模型中维持Pin1抑制，它们是顺式-RA、反式-RA、AC-55649和阿维A (图10A、10B、11A和11B)。被代谢成含有末端羧基的其它RA化合物也可能用于治疗增殖性病症(图10D)。另外，调控视黄酸受体的化合物(图10D和11A，和在表1中列出的化合物)也可能用于治疗增殖性病症。
另外，我们已经开发了基于细胞的测定来筛选和验证Pin1抑制剂命中物。我们已经证实，1) Pin1在HER2-阳性的人乳腺癌组织中高度表达；2) Pin1抑制会几乎完全地抑制人HER2+ 乳腺癌细胞系（诸如AU565和SKBR3细胞）的细胞表面上的HER2过表达；3) Pin1抑制会极大地增加HER2+ 乳腺癌细胞对mTOR抑制剂的敏感性，但是不会增加对HER2抑制剂的敏感性，这提示，Pin1可能作用于Her2来调节细胞生长；4) Pin1作用于Neu和在Neu介导的致癌途径中的多种底物；和5) 小鼠中的Pin1敲除会抑制由活化的Her2诱导的乳腺癌发展。因此，Pin1是维持人HER2+ 乳腺癌细胞的HER2过表达和生长所必需的。鉴于以384-孔形式可以容易地测定细胞表面上的HER2表达和细胞生长，我们可以试验命中物的抑制HER2_ AU565和SKBR3细胞的HER2过表达和细胞生长的能力(所述细胞将用Pin1前药或命中物处理)，然后用Alexa 488-抗-HER2单克隆抗体(BioLegend)进行免疫染色，随后进行自动化的显微术。
我们已经进一步证实，包括视黄酸化合物的治疗性化合物的组合可用于治疗癌症，例如，以升高的Pin1活性为特征的癌症。图12显示了如下得到的结果：用ATRA或多柔比星或它们的组合治疗过表达Pin1的乳腺癌细胞，随后计数癌细胞数目。结果表明，ATRA和多柔比星组合显著增加了抗癌效能，并降低了每种药物的抑制癌细胞生长的剂量。因此，ATRA可以显著降低多柔比星和其它化疗药物的剂量和毒性。
我们还已经证实，使用siRNA实现的Pin1抑制会显著减少具有Neu/Erb2基因扩增的人乳腺癌细胞的Neu/Erb2过表达和细胞增殖(图13A和13B)。这给我们提供了通过将试验化合物应用于具有Neu/Erb2基因扩增的人源癌细胞，并确定试验化合物对Neu/Erb2过表达和细胞增殖的影响，从而鉴别Pin1调节化合物的方法。
其它实施方案
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇独立的出版物或专利申请通过引用并入的相同程度。
尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，应该理解，能够进一步修改，并且本申请意图涵盖总体上遵循本发明原理并且包括落入本发明所属领域内的已知或常规实践中的本公开内容的偏离的本发明的任何变异、应用或改进，并且可以应用于前文阐述的基本特征，和遵循权利要求的范围。
其它实施方案是在权利要求书中。
要求保护的内容如权利要求书中所述。

Claims (21)

1. 一种治疗受试者的增殖性疾病的方法，所述方法包括：以足以治疗所述受试者的量，给所述受试者施用视黄酸化合物，其中所述受试者在所述施用之前被确定为具有升高的Pin1标志物水平。
2. 一种治疗受试者的增殖性疾病的方法，所述方法包括：确定得自所述受试者的样品中的Pin1标志物水平，和如果样品被确定为具有升高的Pin1标志物水平，那么给所述受试者施用视黄酸化合物。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包括：施用第二种抗增殖化合物。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Pin1标志物是Pin1的减少的Ser71磷酸化。
5. 根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：在视黄酸化合物的所述施用以后，确定所述样品中的Pin1标志物水平。
6. 根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述视黄酸化合物选自：13-顺式-视黄酸和全反式-视黄酸。
7. 根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述视黄酸化合物选自：视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醛和AC-55640。
8. 根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述视黄酸化合物选自结构上类似于视黄酸的化合物，优选在图2A、2B、10A、10D和表1中列出的那些。
9. 根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述视黄酸化合物被氘化。
10. 根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述样品选自：肿瘤样品、血液、尿、活组织检查、淋巴、唾液、痰和脓。
11. 根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述升高的Pin1标志物水平是由于遗传性状或体细胞突变。
12. 根据权利要求3或5-11中的任一项所述的方法，其中所述第二种抗增殖化合物选自：MK-2206、ON 013105、RTA 402、BI 2536、索拉非尼和ISIS-STAT3Rx。
13. 根据权利要求3或5-11中的任一项所述的方法，其中所述第二种抗增殖化合物选自：微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、铂类、烷化剂和抗代谢药。
14. 根据权利要求3或5-11中的任一项所述的方法，其中所述第二种抗增殖化合物选自：紫杉醇、吉西他滨、多柔比星、长春碱、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、卡铂、六甲蜜胺、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、阿扎胞苷、博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、2-氯脱氧腺苷、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、磷酸雌莫司汀、氟尿苷、氟达拉滨、吉妥珠单抗、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、喷司他丁、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、托泊替康、曲妥珠单抗、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
15. 根据权利要求3或5-14中的任一项所述的方法，其中所述抗增殖化合物以低剂量或在不同时间施用。
16. 根据权利要求3或5-14中的任一项所述的方法，其中所述抗增殖化合物被配制成诸如脂质体制剂或控释制剂。
17. 根据权利要求3或5-14中的任一项所述的方法，其中所述视黄酸化合物和所述抗增殖化合物被一起配制。
18. 前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述增殖性病症选自：白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述增殖性病症选自：急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、霍奇金病、非霍奇金病、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔曼瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
20. 一种用于鉴别Pin1配体的方法，其包括：
(i) 将Pin1蛋白与荧光地标记的探针一起温育，从而形成Pin1-探针复合物；
(ii) 将试验化合物加入温育物中；和
(iii) 确定所述探针的任何大部分是否被所述试验化合物从Pin1-探针复合物中置换出，这样的置换指示所述试验化合物是Pin1配体。
21. 一种用于鉴别Pin1调节化合物的方法，其包括：
(i) 温育具有Neu/Erb2基因扩增的人源癌细胞；
(ii) 将试验化合物施用于所述细胞；和
(iii) 确定Neu/Erb2过表达是否减少，其中Neu/Erb2过表达的减少指示所述试验化合物是Pin1调节化合物。
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