CN101778637B - 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法 - Google Patents

检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101778637B
CN101778637B CN2008800149150A CN200880014915A CN101778637B CN 101778637 B CN101778637 B CN 101778637B CN 2008800149150 A CN2008800149150 A CN 2008800149150A CN 200880014915 A CN200880014915 A CN 200880014915A CN 101778637 B CN101778637 B CN 101778637B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tubulin
cell
class
iii
ivb
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2008800149150A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101778637A (zh
Inventor
玛丽亚·卡瓦拉里斯
颜佩佩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NewSouth Innovations Pty Ltd
Original Assignee
NewSouth Innovations Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2007901131A external-priority patent/AU2007901131A0/en
Application filed by NewSouth Innovations Pty Ltd filed Critical NewSouth Innovations Pty Ltd
Priority to CN201310140359.4A priority Critical patent/CN103381269B/zh
Publication of CN101778637A publication Critical patent/CN101778637A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101778637B publication Critical patent/CN101778637B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本发明涉及一种筛选肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性的方法，所述方法包括检测肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达，其中II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达表明肿瘤细胞具有对微管蛋白结合剂的抗性或潜在抗性。

Description

检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法
相关申请
本申请要求提交于2007年3月5日的澳大利亚临时专利申请第2007901131号和提交于2007年9月28日的澳大利亚临时专利申请第2007905307号的优先权。本文通过交叉引用引入每个申请的全部内容。
技术领域
本发明涉及基于肿瘤对β微管蛋白的表达的特征来筛选肿瘤对抗有丝分裂剂的敏感性的方法，以及涉及用于调节肿瘤细胞中β微管蛋白，特别是II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达的方法。本发明还涉及用于增强肿瘤细胞对长春花生物碱、紫杉烷和环氧聚微管素等微管蛋白结合剂以及对其它抗癌剂的敏感性的分子和方法。
背景技术
微管是真核细胞中细胞分裂所必需的，并且充当确保染色体分开和隔离的纺锤体的一部分。微管的主要成分是形成异二聚体的α和β微管蛋白。目前为止已鉴定出至少7种不同的β微管蛋白同种型。根据羧基端域的序列将这些同种型划分如下(罗马数字的类别数是指蛋白同种型而括号中为人类基因分类)：I类(HM40)、II类(Hβ9)、III类(Hβ4)、IVa类(H5β)、IVb类(Hβ2)、V类和VI类(Hβ1)。不同的同种型展示出不同的组织表达模式。例如，III类β微管蛋白通常仅在神经元细胞中表达。
微管蛋白结合剂是包括卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、晚期神经母细胞瘤和各种淋巴瘤在内的许多人类癌症的治疗中的重要组成部分。这些重要临床药剂包括如紫杉醇(paclitaxel(Taxol))等的紫杉烷(Taxane)、环氧聚微管素(epothilone)和如长春花碱(vinblastine)等的长春花生物碱(vinca alkaloid)，这些药剂与来自α/β微管蛋白的β微管蛋白结合并干扰微管动力学从而诱导有丝分裂停滞和细胞凋亡。
与微管蛋白结合后，已知紫杉烷和环氧聚微管素会增进微管组装，从而导致有丝分裂中聚合微管的稳定化、异常纺锤体酯和细胞周期的停滞。相反，长春花生物碱是第二类微管蛋白结合剂，这类微管蛋白结合剂通过阻断参与微管蛋白二聚体连接的区域来诱导聚合微管蛋白的去稳定化，从而阻止微管组装。基于铂的DNA损伤剂是结合并修饰DNA的一大类抗癌药，它们对治疗各种不同癌症有效且通常在与微管蛋白结合剂的组合疗法中进行施用。
然而，肿瘤细胞对如紫杉烷、环氧聚微管素和长春花生物碱等微管结合剂的抗性的发展是许多化学治疗方案成功的重大障碍。
肺癌是世界上最常见的癌症，每年诊断出超过一百万例肺癌，且其仍然是男性和女性中癌症死亡的主要原因。晚期非小细胞肺癌(NSCLC)占这些病例中超过80％。超过半数的这些患者在诊断时已发展到肿瘤转移，因此化学疗法仍然是最有效的治疗选择。在上个十年中，如紫杉醇和长春瑞滨等化学治疗剂作为单一药剂或作为组合化学治疗方案的一部分在2期研究中的使用已显示出可观的活性和一年的延长存活率。然而，由于耐药性肿瘤细胞的出现显著限制了这些药物在肺癌治疗中的临床应用，故患者的预后总体而言仍然很差。于是，显然需要对抗和克服这种抗性的方法和途径以保证抗有丝分裂剂在癌症治疗中的连续疗效。
在不同的组织表达和所有物种中高度保守序列的基础上，已提出每种β微管蛋白同种型可以提供在微管中赋予功能性差异的独特特征。尽管在选用于抵抗包括紫杉醇、多烯紫杉醇和雌二醇氮芥在内的抗微管剂的细胞系中已显示出微管蛋白同种型表达的改变，但可用数据仍集中在βIII微管蛋白在抗紫杉醇中的作用。对βIII微管蛋白在细胞对其它类型的微管蛋白结合剂的响应中的相关性或非βIII微管蛋白同种型在对微管蛋白结合剂的响应中的相关性理解得很少。例如，II类β微管蛋白见于正常乳腺组织和肿瘤乳腺组织中，这表明它可能不是这些肿瘤的良好生物标记。此外，尽管DNA损伤剂常用于与长春花生物碱的组合疗法中，但尚未确定βIII微管蛋白表达在这些药剂的疗效上的效果。
耐药性细胞研究的一个特别的难点是确定在抗性细胞中可能观察到的β微管蛋白表达的变化是否促成抵抗表型或作为二级机制出现。对于多药物抗性细胞而言进行多重细胞变化是很平常的，因此它们可能引入不止一种抵抗机制。
鉴于上述，对于治疗性应用而言，需要增强肿瘤对微管蛋白结合剂和/或其它抗有丝分裂剂或DNA损伤剂的敏感性的药剂。另外，理想的是能够对肿瘤进行筛选以在开始用众多微管蛋白结合剂和/或其它抗有丝分裂剂治疗之前和在治疗疗程期间预测它对的这些药物的敏感性或潜在敏感性。
发明内容
本发明人现已证实了在NSCLC细胞和白血病细胞中的II类、III类或IVb类β微管蛋白与这些细胞对各种微管蛋白结合剂的响应的相关性。
于是，在第一方面，本发明提供了筛选用于抵抗或潜在抵抗微管蛋白结合剂的方法，所述方法包括检测由肿瘤细胞表达的II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种，其中II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达表明肿瘤细胞具有对微管蛋白结合剂的抗性或潜在抗性。
在一个实施方式中，微管蛋白结合剂是微管去稳剂。在一个实施方式中，微管蛋白结合剂是微管稳定剂。
在一个实施方式中，所述方法包括检测由肿瘤细胞表达的任何两种II类、III类和IVb类β微管蛋白。在另一个实施方式中，所述方法包括检测由肿瘤细胞表达的II类、III类和IVb类β微管蛋白。
在某些实施方式中，肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达的检测步骤包括检测II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达。
在某些实施方式中，肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达的检测步骤包括检测II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA中的一种或多种的表达。
肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达的检测步骤可包括对微管蛋白的表达水平进行定量。
肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达的检测步骤可包括比较由肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达与由对照细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的一种或多种的表达。对照细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞，例如取自肿瘤周围的组织的细胞。对照细胞可以是对微管蛋白结合剂抵抗的肿瘤细胞。对照细胞可以是对微管蛋白结合剂敏感的肿瘤细胞。对照细胞可以是其中II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达降低的肿瘤细胞。
此外，本发明还提供了评估肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性的方法。所述方法包括检测由肿瘤细胞表达的II类、III类和IVb类β微管蛋白或II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA的量。由此获得受试对象肿瘤细胞微管蛋白量。将受试对象肿瘤细胞微管蛋白量与对照细胞微管蛋白量进行比较从而确定微管蛋白量差异。对照细胞微管蛋白量是对照细胞中II类、III类和IVb类β微管蛋白或II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA中的任何一种或多种各自的量。基于微管蛋白量差异来评估肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性。
上述方法的对照细胞可以是对照非肿瘤细胞。上述方法的对照细胞可以是对照肿瘤细胞。对照肿瘤细胞可以是抵抗微管蛋白结合剂的肿瘤细胞或对微管蛋白结合剂敏感的肿瘤细胞。
在某些实施方式中，对II类、III类和IVb类β微管蛋白量的检测是检测II类、III类和IVb类β微管蛋白的量。在特定实施方式中，对II类、III类和IVb类β微管蛋白量的检测是仅检测III类β微管蛋白的量。
在其它实施方式中，对II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA量的检测是检测II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA的量。在特定实施方式中，对II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA中的任何一种或多种量的检测是仅检测III类β微管蛋白mRNA的量。因而，当检测到“一种”II类、III类和IVb类β微管蛋白或mRNA时，也就检测到了II类、III类和IVb类β微管蛋白或mRNA中的任何一种或多种。
在另一方面，本发明提供了用于增强肿瘤细胞对至少一种微管蛋白结合剂的敏感性的方法，所述方法包括在肿瘤细胞内导入有效量的至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体，其中所述构建体减少了肿瘤细胞中II类、III类和IVb类β微管蛋白的表达。
在另一方面，本发明提供了用于治疗受试对象中的肿瘤的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体和对受试对象施用至少一种微管蛋白结合剂，其中所述核酸构建体减少了肿瘤细胞中II类、III类和IVb类β微管蛋白的表达从而增加了肿瘤对至少一种微管蛋白结合剂的敏感性。
在一个实施方式中，将核酸构建体和至少一种微管蛋白结合剂同时施用。在一个实施方式中，将核酸构建体和至少一种微管蛋白结合剂并行施用。在另一个实施方式中，将核酸构建体在至少一种微管蛋白结合剂之前施用。
在上述方面的一个实施方式中，所述核苷酸序列是反义序列。在另一个实施方式中，所述核苷酸序列是siRNA序列。在另一个实施方式中，所述核苷酸序列是短发夹RNA。在再一个实施方式中，所述核苷酸序列是核酶序列。
在上述任一方面的特定实施方式中，所述核苷酸序列对IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性。在另一个特定实施方式中，所述核苷酸序列对II类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性。在一个特定实施方式中，所述核苷酸序列对III类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性。
在上述任一方面的特定实施方式中，至少一种微管蛋白结合剂可以是至少一种微管去稳剂。所述至少一种微管去稳剂可以选自任何一种或多种长春花生物碱剂、多拉司他汀(dolastatin)、秋水仙碱、念珠藻环肽(cryptophycin)、curacin A、2-甲氧雌二醇和它们的衍生物、类似物或前药。在特定实施方式中，微管去稳剂是长春花生物碱剂。在一个实施方式中，所述长春花生物碱剂选自任何一种或多种长春新碱、长春碱、长春氟宁、长春地辛和长春瑞滨或其衍生物、类似物或前药。
在上述任一方面的特定实施方式中，至少一种微管蛋白结合剂可以是至少一种微管稳定剂。所述至少一种微管稳定剂可以选自任何一种或多种紫杉烷和环氧聚微管素。紫杉烷可以是紫杉醇或多烯紫杉醇。环氧聚微管素可以是环氧聚微管素A、环氧聚微管素β或环氧聚微管素D。在上述方面的特定实施方式中，微管蛋白结合剂是长春花生物碱剂、多拉司他汀、秋水仙碱、念珠藻环肽(cryptophycin)、curacin A、2-甲氧雌二醇或环氧聚微管素。
在特定实施方式中，肿瘤细胞是非小细胞肺癌细胞(NSCLC)。
在特定实施方式中，受试对象是人。
在另一方面，本发明提供了至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体在制备用于增加肿瘤细胞对至少一种微管蛋白结合剂的敏感性的药物中的使用，其中所述构建体能减少肿瘤中II类、III类和IVb类β微管蛋白的表达。
此外，本发明还提供了用于增加肿瘤细胞对至少一种微管蛋白结合剂的敏感性的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体以及药物可接受载体、稀释剂或赋形剂，其中所述构建体能减少肿瘤中II类、III类和IVb类β微管蛋白的表达。
在另一方面，本发明提供了用于评估肿瘤对微管蛋白结合剂的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体，其中所述构建体被用于检测肿瘤中的II类、III类和IVb类β微管蛋白表达。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种微管蛋白结合剂。在特定实施方式中，对肿瘤对微管蛋白结合剂的敏感性的诊断是体外诊断。在另一个实施方式中，本发明提供了用于评估肿瘤对微管蛋白结合剂的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种对任何一种II类、III类和IVb类β微管多肽具有特异性的抗体，其中所述抗体被用于检测肿瘤中的II类、III类和IVb类β微管蛋白表达。
在另一方面，本发明提供了用于治疗肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括(i)包含至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体以及药物可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，和任选的(ii)一种或多种微管蛋白结合剂。
本发明还提供了用于增加肿瘤对一种或多种微管蛋白结合剂的敏感性的兽医组合物，所述兽医组合物包含至少一种包含对II类、III类和IVb类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核苷酸序列的核酸构建体以及可接受载体、稀释剂或赋形剂。
在另一方面，本发明提供了对干扰与II类、III类和/或IVb类β微管蛋白相关的微管动力学的药剂进行筛选的方法，所述方法包括将疑为干扰与II类、III类或IVb类β微管蛋白相关的微管动力学的候选药剂对表达至少一种II类、III类或IVb类β微管蛋白的第一细胞暴露并检测所述细胞对候选药剂的响应，将候选药剂暴露于其中细胞内至少一种II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达降低的相同类型的第二细胞并检测第二细胞对候选药剂的响应，并比较第一细胞和第二细胞对候选药剂的响应，其中，与第一细胞的响应相比改变的第二细胞的响应象征了候选药剂在干扰与II类、III类和/或IVb类β微管蛋白相关的微管动力学中的活性。在特定实施方式中，细胞的响应是凋亡率的增加或降低。
缩写
β2M     β-2微球蛋白
FITC     异硫氰酸荧光素
GAPDH    甘油醛-3-磷酸脱氢酶
NSCLC    非小细胞肺癌
shRNA    短发夹RNA
siRNA    短干扰RNA
定义
在本说明书的上下文中，术语“特异”在与反义、核酶、shRNA或siRNA构建体的核苷酸序列相关使用时意味着基本特异但不必为专有特异。即，当对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因产物特异时，核苷酸序列也可与其它β微管蛋白同种型基因产物序列以足以抑制其表达的量交叉杂交。可能优选的是，所述核苷酸序列不减少非II类、III类和/或IVb类β微管蛋白同种型的表达，或其使其它同种型的表达减少的比例小于使II类、III类和/或IVb类β微管蛋白同种型的表达减少的比例。此外，例如，siRNA构建体的核苷酸序列可能展示出小于100％的与II类、III类或IVb类β微管蛋白基因的序列一致性然而却保留了其特异性。术语“特异”在与对II类、III类和/或IVb类β微管多肽特异的抗体相关使用时意在涵盖能例如在ELISA或Western印迹测试中将这类微管多肽同种型中的一种与其它微管多肽同种型区分开的抗体。在对IVb类β微管多肽“特异”的抗体的情形中，所述抗体将识别IV类β微管蛋白同种型的多肽，而不识别II类或III类β微管蛋白同种型。对IVb类β微管蛋白同种型特异的抗体不必能够区分IVa类和IVb类β微管多肽。
本文所用术语“有效量”在其含义内包括了提供期望治疗或预防效果的药剂或化合物的足够的量。所需确切量会根据如待治疗物种、受试对象的年龄和一般状况、待治疗的病况的严重性、待施用的具体药剂和施用模式等因素而对不同受试对象有所不同。因而，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定情况，本领域普通技术人员可以仅用常规实验来确定适当的“有效量”。优选的是，有效量在对肿瘤有毒性的同时对受试对象基本无毒。
如本文所用，“减少”细胞中II类、III类和/或IVb类β微管蛋白的“表达”的构建体意在不仅涵盖这些基因中任何一种、任何两种或所有三种的表达的完全抑制，而且涵盖足以增加细胞对一种以上的微管蛋白结合剂的敏感性的微管蛋白基因产物或多肽表达的减少。因而，考虑了与未暴露于所述构建体的细胞相比至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％细胞中II类、III类和/或IVb类β微管蛋白mRNA或多肽的表达的减少。可优选的是，细胞中II类、III类和/或IVb类β微管蛋白表达的减少足以获得细胞对一种以上的微管去稳剂的敏感性的最大增加。可以理解，所述构建体对II类、III类和/或IVb类β微管蛋白的表达的减少可能是永久性的，例如当所述构建体被稳定引入其所暴露的体细胞(如肿瘤细胞)的基因组内时，或可能仅是临时性的。
在本发明的上下文中，术语“包含”是指“包含但不必仅包含”。此外，如“包含”一词的变化形式具有相应变化的含义。
在整个说明书中，对于“一个”要素的指代不排除复数，除非上下文另外确定。例如，对“一个核酸构建体”的指代不应被解读为排除多个拷贝的这种核酸构建体的可能性。相似地，在整个说明书中对“一个肿瘤细胞”的指代意在解读为包括单个肿瘤细胞或多个肿瘤细胞，例如获自肿瘤的细胞集合。
术语“II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种”意在涵盖II类β微管蛋白、III类β微管蛋白、IVb类β微管蛋白、II类和III类β微管蛋白、II类和IVb类β微管蛋白、III类和IVb类β微管蛋白以及II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种。
在肿瘤细胞与微管蛋白结合剂或DNA损伤剂之间的相互作用的背景下，术语“敏感性”和如“灵敏”等对应术语意在涵盖肿瘤细胞对微管蛋白结合剂或DNA损伤剂的抗有丝分裂活性和/或细胞毒性活性的响应。因而，带有对微管蛋白结合剂的增强的敏感性的肿瘤细胞可能显示出更大的有丝分裂抑制程度，和/或可能在暴露于微管蛋白结合剂时比更不灵敏的肿瘤细胞显示出更大的细胞死亡程度。
替代性地或除此以外，具有对于微管蛋白结合剂增加的或增强的敏感性的肿瘤细胞可能响应于其此前不响应的微管蛋白结合剂的抗有丝分裂活性和/或细胞毒性活性。
另外或替代性地，具有对于微管蛋白结合剂增加的或增强的敏感性的肿瘤细胞可能在暴露于微管蛋白结合剂时显示出对电离辐射和/或DNA损伤剂的增加的敏感性。
具有对于微管蛋白结合剂增加的或增强的敏感性的肿瘤细胞也可能比更不灵敏的细胞在更低的微管蛋白结合剂浓度下响应于微管蛋白结合剂的抗有丝分裂活性和/或细胞毒性活性。在体外或原位肿瘤细胞的背景下，对于一种或多种微管蛋白结合剂增强的敏感性可能表现为培养物中或原位活细胞数量减少地更多、肿瘤增大进程减少地更多或在用一种或多种微管蛋白结合剂治疗时肿瘤尺寸减少地更多。相反，术语“抵抗”和诸如“抗性”等类似术语具有与“灵敏”对应但相反的含义。
可以通过本领域内可利用的各种方法来直接评估肿瘤细胞对微管蛋白结合剂或DNA损伤剂的抗性。这类技术的实例包括将肿瘤细胞暴露于一系列微管蛋白结合剂或DNA损伤剂的稀释溶液并确定观察到50％死亡时的浓度、或凋亡率增加时的浓度或细胞的克隆生长的抑制或者细胞分裂速率降低时的浓度。合适的测试描述于例如Verrills等(2003)Chemistry and Biology 10：597-607和Gan等(2007)CancerResearch 67：(19)9356-9363中，此处通过引用引入其内容。类似地，当描述肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的“响应”时，考虑到该响应可能包括肿瘤细胞凋亡的出现或者肿瘤细胞分裂速率的降低或停止的任何一种或两种。
术语“微管蛋白结合剂”意在包括调节细胞内的微管蛋白聚合和/或解聚动力学的分子，并且包含微管去稳剂和微管稳定剂。
术语“微管蛋白去稳剂”意在广泛涵盖与微管蛋白二聚体结合并使微管蛋白二聚体形成为微管去稳定化的化合物类别。微管蛋白和微管由于其功能常常在许多癌症类型中失调而经常被化学疗法作为靶标。
靶向微管蛋白或微管的试剂由目前用于延长患有晚期疾病的受试对象的生存时间的抗癌剂中最有效的化学治疗剂类别组成。通常，微管去稳剂可以结合微管蛋白的长春花域或秋水仙碱域。包括各种微管去稳剂的与微管蛋白相互作用的各种抗有丝分裂剂描述于Hamel(1996)Med.Res.Rev.16：207-231中，此处通过引用引入其全部内容。微管去稳剂可以是长春花生物碱剂、多拉司他汀、秋水仙碱、念珠藻环肽(cryptophycin)、curacin A、2-甲氧雌二醇和它们的衍生物、类似物或前药。术语微管去稳剂并非意在涵盖如紫杉烷(包括紫杉醇和多烯紫杉醇)和环氧聚微管素等结合微管聚合物并稳定微管的化合物。
术语“长春花生物碱剂”意在广泛涵盖最初源自长春花属的植物的生物碱化合物类别，这类化合物拥有抗微管活性并且充当有丝分裂抑制剂。这类化合物的成员包括但不限于长春碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛和长春瑞滨及其半合成或合成类似物或衍生物。
术语“微管稳定剂”意在涵盖与聚合的微管相结合并抑制聚合的微管的解聚的那些化合物。微管稳定剂化合物包含但不限于紫杉烷和环氧聚微管素。
附图说明
现在将仅通过实施例的方式并参考附图对本发明的一个或多个优选实施方式进行描述，其中：
图1显示了针对(directed against)βII或βIVb微管蛋白的siRNA特异性抑制了其各自的表达。图IA展示了在以25nM和100nM的量分别针对βII和βIVb的siRNA进行转染后48h时通过半定量逆转录PCR聚丙烯酰胺凝胶确定的βII(Hβ9)和βIVb(Hβ2)在两个NSCLC细胞系Calu-6和H460中的基因产物(mRNA)表达。将表达水平相对恒定的管家基因β-2微球蛋白(β2M)用于将各个微管蛋白mRNA的表达水平标准化。图IB展示了转染后72h通过蛋白印迹鉴定的βII和βIVb微管蛋白的表达。将GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)多肽的表达作为加载对照同时检测。M：模拟转染；C：对照siRNA转染；βII：II类β微管蛋白siRNA转染；βIVb：IVb类β微管蛋白siRNA转染；β2M：β2微球蛋白对照。
图2显示了所用siRNA的特异性，如蛋白印迹中所示。图2A展示了βII siRNA特异性。图2B展示了βIVb siRNA特异性。对βII或βIVb敲弱(knockdown)细胞中的其它β微管蛋白同种型没有观察到蛋白表达水平的显著变化。
图3显示了II类β微管蛋白敲弱在两个NSCLC细胞系Calu-6和H460对微管蛋白结合剂的敏感性上的影响。在模拟转染细胞(实心圆，实线)、对照siRNA转染细胞(空心方块，实线)和βII siRNA转染细胞(实心菱形，虚线)上进行克隆(clonogenic)测试。该图显示了以存活分数表达的暴露于A)长春新碱、B)紫杉醇和C)环氧聚微管素的克隆存活细胞。数据表示了至少4个独立实验的平均值±SEM。
图4显示了IVb类β微管蛋白敲弱在两个NSCLC细胞系Calu-6和H460对微管蛋白结合剂的敏感性上的影响。在模拟转染细胞(实心圆，实线)、对照siRNA转染细胞(空心方块，实线)和βIVb siRNA转染细胞(实心菱形，虚线)上进行克隆测试。该图显示了以存活分数表达的暴露于A)长春新碱、B)紫杉醇和C)微管稳定剂环氧聚微管素B的克隆存活细胞。数据表示了至少4个独立实验的平均值±SEM。
图5提供了培养的肿瘤细胞系Calu-6的菌落的照片，显示了Calu-6转染细胞对长春新碱(左列)和紫杉醇(右列)的剂量响应。转染24h后，将各个转染细胞群的约600个细胞接种至含有递增浓度的微管蛋白结合剂的6孔板内。当形成可见菌落时用结晶紫对板进行染色。转染使得用βIVb siRNA转染的细胞对长春新碱过分敏感，但与对照相比转染对紫杉醇敏感性没有影响。
图6提供了显示模拟转染的、对照siRNA转染的以及βIVb siRNA转染的Calu-6和H460细胞中[3H]长春新碱的细胞摄取和保留的图。βIVb敲弱细胞与对照细胞在胞内[3H]长春新碱含量上没有显著差异。空心柱形：模拟和对照siRNA转染的细胞；实心柱形：βIVb siRNA转染细胞。所显示值是至少4次单独实验的平均值±SEM。
图7提供了显示在用长春新碱或紫杉醇处理时βII或βIVb敲弱在微管网络上的影响的显微照片。siRNA转染后72小时用α微管蛋白固定并染色Calu-6细胞。βII和βIVb转染物都展示出正常的微管细胞骨架。图7A展示出长春新碱处理在βII或βIVb siRNA转染细胞的微管上的效果。当用10nM长春新碱处理时βII和βIVb转染物与对照相比都显示出微管的极大破坏。图7B展示了紫杉醇在βII转染物的微管上的效果。在与10nM紫杉醇温育后，βII转染物的微管网络与对照相当。
图8显示了βII和βIVb转染的H460细胞在暴露于长春新碱后的细胞周期分析。将转染细胞与5nM或40nM的长春新碱温育24h；用碘化丙啶固定并染色并通过流式细胞仪分析。图8A展示出βII转染物显示与对照相当的G2-M积聚。图8B展示出在以更高浓度的长春新碱处理后βIVb耗竭终止了G2-M中的细胞积聚，并反而促进了细胞的亚G1组分的增加。所示直方图表示进行的3个实验。
图9A显示了βIII微管蛋白siRNA在25nmol/L(Calu-6)或100nmol/L(H460)转染48h后通过RT-PCR对βIII微管蛋白基因表达的分析。β2微球蛋白(β2M)“管家”基因的表达充当内部对照。图9B显示了βIII微管蛋白转染后72h的βIII微管蛋白的蛋白表达。将“管家”GAPDH多肽的表达用作加载对照。图9C显示了βIII微管蛋白siRNA的特异性。在I类、II类和IV类β微管蛋白同种型以及总的β微管蛋白在蛋白水平的表达上没有观察到显著变化。M，模拟；C，对照siRNA；βIII，βIII微管蛋白siRNA。
图10显示了与10nmol/L紫杉醇(中)和10nmol/L长春新碱(右)温育1h的siRNA转染Calu-6细胞中的微管形态。微管通过α微管蛋白免疫荧光染色而显示。当用紫杉醇或长春新碱处理βIII转染物时出现了极大的微管破坏。带有异常形态的细胞用箭头标出。
图11显示了在微管结合剂或DNA损伤剂存在下的克隆测试结果。用模拟(实心圆，实线)、对照siRNA(空心方块，实线)和βIII转染细胞(实心菱形，虚线)进行克隆测试。图11A显示了以存活分数表达的用紫杉醇处理的克隆存活情况。图11B显示了以存活分数表达的用长春新碱处理的克隆存活情况。图11C显示了以存活分数表达的用如顺铂(上)、阿霉素(中)和足叶乙甙(下)等DNA损伤剂处理的克隆存活情况。图11D显示了以存活分数表达的用长春瑞滨对Calu-6(上)和H460细胞(下)处理的克隆存活情况。各数据点表示至少4次单独测试的平均值。线段表示平均值的标准差。通过比较各个药物浓度下siRNA处理细胞与模拟转染细胞的存货分数来计算统计数据。*，P＜0.05；**，P＜0.005；***，P＜0.005。
图12显示了用紫杉醇(A)或长春新碱(B)处理的βIII微管蛋白耗竭的H460细胞的细胞周期分析。在药物处理24h后收集细胞并随即通过流式细胞仪对其DNA含量进行测试。显示了多次试验的代表图。
图13A和13B是显示紫杉醇处理后(图13A)和顺铂处理后(图13B)对照siRNA转染H460细胞(白色柱形)和βIII微管蛋白siRNA转染H460细胞(黑色柱形)中的细胞凋亡诱导。与药物温育48h后收集细胞并随即通过流式细胞仪用膜连蛋白V-FITC染色对细胞凋亡诱导进行测试。各个柱形表示至少3次独立实验的平均值，同时线段表示平均值的标准差，*，P＜0.05；**，P＜0.01。
图14显示了在微管蛋白结合剂环氧聚微管素的存在下的克隆测试结果。在模拟(实心圆，实线)、对照siRNA(空心方块，实线)和βIII转染的细胞(空心菱形，虚线)上进行克隆测试。图11显示了以存活分数表达的用环氧聚微管素处理H460细胞(上)或Calu-6细胞(下)的克隆存活情况。
图15显示了用于敲弱βIII微管蛋白表达的两种不同27聚体siRNA的特异性，如蛋白印迹所示。对βIII H460敲弱细胞中的其它β微管蛋白同种型没有观察到蛋白表达水平的显著变化。
图16显示了在微管蛋白结合剂紫杉醇(上)或长春新碱(下)存在下H460细胞的克隆测试结果。在模拟(实心三角，实线)、对照siRNA(空心方块，实线)和使用不同27聚体siRNA(seq 8——实心菱形，虚线；seq 11——实心方块，实线)的βIII转染细胞上进行克隆测试。图16显示了以存活分数表达的克隆存活情况。对各个βIII 27聚体siRNA与模拟转染细胞的ID50值的比较显示出对于指向III类β微管蛋白的不同27聚体siRNA的对两种微管蛋白结合剂的敏感性的增加。**，P＜0.005；***，P＜0.0005。
图17显示了导入H460细胞内以产生其中稳定敲弱了βIII微管蛋白表达的3个克隆体(克隆体4、59和60)的短发夹RNA的特异性。如蛋白印迹所示，对于βIII H460敲弱克隆体中的其它β微管蛋白同种型没有观察到蛋白表达水平的显著变化。观察到这些稳定敲弱克隆体中βIII微管蛋白的蛋白表达量的一定程度的改变。
图18显示了在微管蛋白结合剂紫杉醇(上)或DNA损伤剂顺铂(下)的存在下其中稳定敲弱了βIII微管蛋白表达H460细胞克隆体的克隆测试结果。在对照siRNA(实心方块或实心三角，实线)和3个不同的βIII稳定转染克隆体(克隆体4：实心朝下三角，虚线；克隆体59：实心菱形，实线；克隆体60：实心方块，虚线)上进行克隆测试。图18显示了以存活分数表达的克隆存活情况。在稳定敲弱了βIII微管蛋白的各个不同克隆体中观察到了对紫杉醇和DNA损伤剂的敏感性的增加。带有最大量的βIII微管蛋白敲弱的克隆体(如图17所示)似乎显示出对各个药剂的敏感性的最大增加。
图19显示了选用于抵抗2-甲氧基雌二醇的3种不同白血病细胞亚系(7R、14R、28R)的相对微管蛋白同种型表达。将蛋白印迹中所示蛋白表达对母细胞系的对照表达水平标准化并作图。所有抗性细胞都展示出II类β微管蛋白表达的增加。
图20显示了II类β微管蛋白敲弱后H460细胞的II类β微管蛋白表达水平的变化(A)，和在2-甲氧基雌二醇或秋水仙碱存在下其中敲弱了II类β微管蛋白的H460细胞的克隆测试结果(B)。II类β微管蛋白的敲弱极大增加了H460细胞对2-甲氧基雌二醇或秋水仙碱的敏感性。
具体实施方式
在一方面，本文提供了对肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性进行筛选的方法。该方法包括检测由肿瘤细胞表达的II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种，其中由肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白的表达对于对微管结合剂的抗性或潜在抗性具有预测性。
此外，本发明还提供了评估肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性的方法。所述方法包括检测由肿瘤细胞表达的II类、III类和IVb类β微管蛋白或II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA的量。由此获得对象肿瘤细胞微管蛋白量。将受试对象肿瘤细胞微管蛋白量与对照细胞微管蛋白量进行比较从而确定微管蛋白量差异。对照细胞微管蛋白量是对照细胞中的II类、III类和IVb类β微管蛋白或II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA中的任何一种或多种各自的量。基于微管蛋白量差异来评估肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性。
“受试对象肿瘤细胞”仅为源自作为抗性评估的受试对象的样品肿瘤的肿瘤细胞。且如上所述，对象肿瘤细胞微管蛋白量仅为在所述方法中检测到的II类、III类和IVb类β微管蛋白或II类、III类和IVb类β微管蛋白mRNA中的任何一种或多种的量。
“对照细胞”是带有已知量的II类、III类和/或IVb类β微管蛋白或II类、III类和/或IVb类β微管蛋白mRNA以及已知的对微管蛋白结合剂的抗性水平的细胞。在某些实施方式中，对照细胞是下文讨论的对照肿瘤细胞。对照细胞可以获自生物(或器官)或使用本发明的方法进行衍生化。对照细胞可以是通过使细胞暴露于多种不同剂量的微管蛋白结合剂而产生的剂量响应曲线的一部分。而且，肿瘤细胞的抗性评估方法本身可以用于产生这种剂量响应曲线。在某些实施方式中，对照细胞是哺乳动物对照细胞，如人对照细胞。
对照细胞微管蛋白量是对应于对象肿瘤细胞微管蛋白量的II类、III类和/或IVb类β微管蛋白或II类、III类和/或IVb类β微管蛋白mRNA的量。例如，当对象肿瘤细胞微管蛋白量是从对象肿瘤细胞检测到的II类和III类β微管蛋白的量时，对照细胞微管蛋白量是对照细胞内的II类和III类β微管蛋白的量。
从肿瘤细胞抗性评估方法的上述说明中显而易见，“微管蛋白量差异”仅为受试对象肿瘤细胞微管蛋白量与对照细胞微管蛋白量之间的差异。
从本文所述方法的说明中显而易见，当受试对象肿瘤细胞微管蛋白量大于对照细胞微管蛋白量时，在某些实施方式中，将受试对象肿瘤细胞评估为具有比对照细胞更大的对微管蛋白结合剂的抗性。例如，当受试对象肿瘤细胞III类微管蛋白量大于对照细胞微管蛋白量时，将受试对象细胞评估为对长春花生物碱、紫杉烷、环氧聚微管素或DNA损伤剂具有更大的抗性(和更小的敏感性)。例如，当受试对象肿瘤细胞II类微管蛋白量大于对照细胞微管蛋白量时，将受试对象细胞评估为对长春花生物碱或2-甲氧基雌二醇具有更大的抗性(和更小的敏感性)。例如，当受试对象肿瘤细胞IVb类微管蛋白量大于对照细胞微管蛋白量时，将受试对象细胞评估为对长春花生物碱具有更大的抗性(和更小的敏感性)而对环氧聚微管素具有更小的抗性(和更大的敏感性)。
相反，当受试对象肿瘤细胞微管蛋白量小于对照细胞微管蛋白量时，在某些实施方式中，可以将受试对象肿瘤细胞评估为具有比对照细胞更小的对微管蛋白结合剂的抗性(和更大的敏感性)。例如，当受试对象肿瘤细胞III类微管蛋白量小于对照细胞微管蛋白量时，将受试对象细胞评估为对长春花生物碱、紫杉烷、环氧聚微管素或DNA损伤剂具有更小的抗性(和更大的敏感性)。例如，当受试对象肿瘤细胞II类微管蛋白量小于对照细胞微管蛋白量时，将受试对象细胞评估为对长春花生物碱或2-甲氧基雌二醇具有更小的抗性(和更大的敏感性)。例如，当受试对象肿瘤细胞IVb类微管蛋白量小于对照细胞微管蛋白量时，将受试对象细胞评估为对长春花生物碱具有更小的抗性(和更大的敏感性)而对环氧聚微管素具有更大的抗性(和更小的敏感性)。
对药剂有已知抗性的对照肿瘤细胞可以是例如从在用所述药剂治疗成功之前的个体分离的肿瘤细胞。可以例如从分离自一组用所述药剂治疗成功和治疗失败之前的个体的肿瘤细胞来集合在对药剂的抗性范围内的一系列对照肿瘤细胞。
如本文所示，肿瘤细胞中某些类别的微管蛋白的存在促进了肿瘤细胞对抗有丝分裂剂(如微管蛋白结合剂)或DNA损伤剂的使用的响应性。于是，对肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达的评估为肿瘤细胞对于不同微管蛋白结合剂或DNA损伤剂的微管蛋白依赖性响应提供了指导，并提供了可以用于选择治疗肿瘤的药剂的方法。
肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抵抗可以为完全抵抗或部分抵抗。如果肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的施用没有响应，则可将其视为对微管蛋白结合剂“抵抗”。不响应的肿瘤细胞可以在暴露于其浓度对非肿瘤细胞或对微管蛋白结合剂敏感的肿瘤细胞有细胞毒性的微管蛋白结合剂时展示出例如不变的细胞分裂速率、不变的凋亡速率或不变的细胞形态。
肿瘤细胞可能抵抗体外施用的微管蛋白结合剂。肿瘤细胞可能抵抗原位施用的微管蛋白结合剂。
在某些实施方式中，如果肿瘤细胞与对微管蛋白结合剂有已知抗性的对照肿瘤细胞相比展示出对于微管蛋白结合剂的施用降低的响应，则可将该肿瘤细胞视为对微管蛋白结合剂“抵抗”。
为了提供用于比较目的的对照细胞，可以产生带有对微管蛋白结合剂的抗性范围和微管蛋白表达范围的来自单一肿瘤的对照肿瘤细胞。通过例如取已知对所述药剂抵抗的对照肿瘤细胞、将所述细胞分组并用例如本文所述的siRNA或shRNA方法来稳定调节各细胞组中II类、III类和IVb类β微管蛋白中至少一种的表达可以产生带有敏感性范围的细胞。如本文所示，通过产生其中以受控方式使II类、III类和IVb类中的至少一种的表达稳定减少的不同细胞组，可以产生具有对微管蛋白结合剂的敏感性范围的来自单一肿瘤的细胞。
可以参考在人类受试对象中治疗性使用的微管蛋白结合剂的浓度来评估肿瘤的抗性。
在某些实施方式中，如果肿瘤细胞展示出与对微管蛋白结合剂有已知抗性的对照肿瘤细胞的响应相似的对微管蛋白结合剂的响应，则将该肿瘤细胞视为对微管蛋白结合剂“抵抗”。可以例如从用微管蛋白结合剂治疗失败之前的受试对象中分离出对微管蛋白结合剂有已知抗性的对照肿瘤。替代性地，可以通过用微管蛋白结合剂以造成大于90％细胞死亡的浓度对原发性肿瘤细胞或体外肿瘤细胞系治疗至少一次并选择在治疗中存活的细胞来从原发性肿瘤细胞或体外肿瘤细胞系产生抗性对照肿瘤细胞。
如果肿瘤细胞疑似对微管结合剂抵抗或开始抵抗，则其为“潜在抗性”。
所述方法包括“检测”肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达。在某些实施方式中，对肿瘤细胞中由特定技术检测到的特定微管蛋白的存在的鉴定可能足以将肿瘤评估为对微管蛋白结合剂抵抗，而反之，对肿瘤细胞中由特定技术检测到的特定微管蛋白的缺乏的鉴定可能足以将肿瘤评估为对微管蛋白结合剂敏感。在这些实施方式中，可能不必为了评估肿瘤细胞的抗性而进行对肿瘤细胞表达的微管蛋白量的确定。在其它实施方式中，肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达的检测将涉及对肿瘤细胞表达的任何一种或多种这类微管蛋白量与至少一种抗性已知的细胞表达的任何一种或多种这类微管蛋白量的比较。在特定实施方式中，所述比较是与有不同已知抗性的多个对照细胞表达的微管蛋白量的比较。如本文提供的实施例中所示，在至少某些实施方式中，肿瘤细胞的程度或抗性可能与肿瘤细胞表达的微管蛋白量成正比(例如，III类β微管蛋白和的长春花生物碱的情形)或反比(例如，IVb类β微管蛋白和环氧聚微管素的情形)。于是，可以对从例如多个对照肿瘤细胞产生的剂量响应曲线来进行比较。
因而，检测肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达可以包括检测肿瘤细胞中微管蛋白mRNA的存在或缺乏或者微管多肽的存在或缺乏。
替代性地，检测肿瘤细胞对II类、III类和IVb类β微管蛋白中的任何一种或多种的表达可以包括确定肿瘤细胞表达的微管蛋白mRNA的相对量或微管多肽的相对量。
所述相对量可以是与已知敏感性对照肿瘤的细胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的丰度的比较。所述相对量可以是与已知抗性对照肿瘤的细胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的比较。所述相对量可以是与有敏感性范围的对照肿瘤细胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的比较。所述相对量可以是与取自肿瘤周围组织的非肿瘤细胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的比较。所述相对量可以为归一化量或通过如下确定：
可以使用对任何一种II类、III类和IVb类β微管蛋白特异的一种或多种探针或引物通过RT-PCR、定量PCR、半定量PCR或严格条件下原位杂交中的任何一种或多种来检测微管mRNA的存在、缺乏或相对量。可用于RT-PCR或半定量PCR技术的多核苷酸的实例描述于Kavallaris等(1997)J Clin Invest 100，1282-1293中，本文通过参考引入其全部内容。在特定实施方式中，使用RT-PCR例如采用Kavallaris等(1997)J Clin Invest 100，1282-1293中所述的方法学和特定引物来检测mRNA的存在或缺乏。
当需要测定微管蛋白mRNA的相对量时，可以采用如实时逆转录酶聚合酶链式反应等已知技术来逆转录RNA然后用实时PCR对所得cRNA进行定量。在Ding和Cantor(2004)J Biochem Mol Biol 37(1)：1-10和Bustin等，(2005)Journal of Molecular Endocrinology 34：579-601中对用于评估RNA表达的定量技术进行了综述，此处通过参考引入其全部内容。
可以使用蛋白印迹、ELISA或本领域中可利用的其它标准定量或半定量技术中的任何一种或多种或者鉴定特定多肽的现有技术的组合来检测微管多肽的存在、缺乏或相对量。在例如Hirsch等，(2004)Am JPhysiol Lung Cell MoI Physiol 278：L1-L23中对众多定量和半定量蛋白组学技术进行了综述，本文通过参考引入其全部内容。特别考虑了依赖于一种或多种微管蛋白同种型多肽的抗体识别的技术。在一个特定实施方式中，可以用包含半定量蛋白印迹的技术(例如，使用本文所述实施例2中所述蛋白印迹技术)对微管多肽的存在、缺乏或相对丰度进行检测。在其它特定实施方式中，可以用包含微管多肽的抗体捕获与所捕获多肽的电泳拆分的组合的技术(例如，使用IsonosticTM测试(Target Discovery，Inc.))对微管多肽的存在、缺乏或相对丰度进行检测。
在特定实施方式中，经检测为表达β-III微管蛋白的肿瘤细胞据预测对长春花生物碱、紫杉烷、环氧聚微管素或DNA损伤剂有抗性。
在特定实施方式中，经检测为表达β-II微管蛋白的肿瘤细胞据预测对长春花生物碱或2-甲氧基雌二醇有抗性。
在特定实施方式中，经检测为表达β-IVb微管蛋白的肿瘤细胞据预测对长春花生物碱有抗性并且对环氧聚微管素敏感。
在某些实施方式中，微管蛋白结合剂是微管稳定剂，如紫杉烷或环氧聚微管素。
在某些实施方式中，微管蛋白结合剂是微管去稳剂，如长春花生物碱或2-甲氧基雌二醇。
本文所述的筛选或评估肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的抗性的方法可以在施用抗癌剂之前进行以便确定肿瘤细胞是否会对一种或多种微管蛋白结合剂响应，或可在治疗疗程期间进行以便确定肿瘤细胞是否发展出对微管蛋白结合剂的抗性。
在另一个方面，本发明涉及在肿瘤中导入包含对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核酸序列的核酸构建体，其中所述核酸构建体减少了II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达。
尽管本文所述的包含核苷酸序列的核酸构建体实例是siRNA或shRNA序列，显然可以理解的是使用如反义序列、siRNA序列、shRNA序列和核酶序列等选择性靶向并抑制II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因表达的任何分子都可以实现对II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因的靶向破坏。II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因的“表达”意在涵盖II类、III类和/或IVb类β微管蛋白序列的转录和/或翻译。于是，对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核酸序列也意在涵盖对II类、III类或IVb类β微管蛋白mRNA的至少一部分具有特异性的核酸序列。
“检测...表达”意在不仅涵盖检测II类、III类或IVb类β微管蛋白mRNA或蛋白的存在也在某些实施方式中涵盖了II类、III类或IVb类β微管蛋白mRNA或蛋白的量。
“检测”II类、III类或IVb类β微管蛋白mRNA或蛋白的“量”意在包括检测所述mRNA或蛋白的绝对水平，或在某些实施方式中包括所述mRNA或蛋白的相对量。所述相对量是相对于一种或多种其它细胞蛋白或mRNA，如细胞中的其它微管蛋白或mRNA或者管家基因蛋白或mRNA。因而在某些实施方式中，相对其它细胞蛋白或mRNA对所述量进行标准化。
用于设计、合成和输送反义核酸的方法是本领域内公知的。反义分子可以为DNA、RNA或者其部分或完全合成类似物。可以产生从其长度上至所讨论的基因区至少基本互补的反义构建体。反义构建体与其互补细胞序列的结合可能干扰转录、RNA加工、运输、翻译和/或mRNA稳定性。
合适的反义寡核苷酸可以通过本领域技术人员公知的方法来制备。通常会在自动合成仪上合成反义寡核苷酸。合适的反义寡核苷酸可以包含设计来改善其细胞内输送、其进入细胞后的稳定性和/或其与适当靶标的结合的修饰。例如，可以通过添加一个或多个硫代磷酸键或在主链内加入一个或多个吗啉环来修饰反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以具有10～30个碱基对的长度且将是II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因的靶标域。在一个实施方式中，反义寡核苷酸序列将具有不超过90％的与其它已知微管蛋白同种型的序列一致性。
就实际问题而言，任何特定核酸分子是否具有不超过90％的与例如其它已知微管蛋白同种型的核苷酸序列的一致性可以用如Bestfit程序(威斯康辛序列分析包，Unix用第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)等已知计算机程序来常规确定。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法来寻找两个序列之间的最佳同源性片段(Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981))。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否具有例如90％的与参考序列的一致性时，设定参数从而在参考核苷酸序列的全长上计算一致性百分比并且允许最多达参考序列中核苷酸总数的5％的同源性间隔。可以使用基于Brutlag及其同事的算法(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的FASTDB计算机程序来确定用于确定查询序列与目标序列之间的最佳总体匹配的优选方法(也称作全局序列比对)。在序列比对中，查询序列与目标序列都是DNA序列。可以通过将U转换为T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以百分比一致性表示。计算百分比一致性的DNA序列的FASTDB比对中所用优选参数为：矩阵＝一元，k-tuple＝4，错配惩罚＝1，连接惩罚＝30，随机化组长度＝0，截留评分＝1，间隔惩罚＝5，间隔尺寸惩罚＝0.05，窗口尺寸＝500或目标核苷酸序列的长度中较短者。
如果目标序列因5′或3′缺失而非内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行手动校正。这是因为FASTDB程序在计算百分比一致性时不考虑目标序列的5′或3′截短。对于在5′或3′末端截短的目标序列而言，通过计算未经匹配/比对的作为目标序列的5′和3′的查询序列的碱基数在查询序列的总碱基中的百分比来校正百分比一致性。通过FASTDB序列比对的结果来确定核苷酸是否经匹配/比对。然后从用指定参数通过上述FASTDB程序计算的百分比一致性中减去该百分比以得到最终的百分比一致性评分。为了手动调整百分比一致性评分的目的，仅计算未与查询序列匹配/比对的、由FASTDB比对所显示的目标序列的5′和3′碱基之外的碱基。
如果待靶向的特定序列对于II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因序列独特时可能有利。这些人类β微管蛋白同种型的氨基酸序列描述于Verdier-Pinard等，(2005)Biochemistry 44：15858-15870中，本文通过参考引入其全部内容。对应cDNA和/或基因组DNA序列也是已知的。本领域技术人员将能容易地确定给定序列是否对II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因序列特异。
小干扰RNA(siRNA)序列是通常为双链的小RNA寡核苷酸，例如长度为21、27或29个碱基且带或不带突出端的双链RNA寡核苷酸，siRNA与感兴趣的RNA序列特异性杂交并充当RNA诱导的沉默复合物的底物。可以合成其中一条链与待沉默的mRNA转录物的特定区域相同的双链RNA分子，且可以将该双链RNA直接导入。替代性的是，可以采用对应的dsDNA，该dsDNA一旦出现在细胞内则被转化为dsRNA。合成用于RNA干扰(RNAi)和实现后转录基因沉默的合适siRNA分子的方法是本领域技术人员已知的，且现在已有设计和制备siRNA的商业性服务。
本领域技术人员可以理解，可以不用进行实验而使用本领域技术人员已知的常规程序基于对受讨论的基因序列的认识来鉴定和产生能够抑制II类、III类和/或IVb类β微管蛋白表达的多种合适的siRNA构建体。如本文所示，指向特定β微管蛋白的不同非重叠区的各种siRNA或stiRNA序列能影响该微管蛋白在细胞中的表达。本领域技术人员可以理解，在靶标序列与siRNA序列之间不必有100％的核苷酸序列匹配。对错配的容忍力极大依赖于序列内错配的位置。在某些情况下，2个或3个核苷酸错配是可接受的，但在其它情况下单个核苷酸错配足以抵消siRNA的有效性。可以不用进行实验而用本领域技术人员已知的常规程序来确定特定siRNA分子的适用性。
尽管反义核酸和siRNA在对RNA或蛋白表达的特异性抑制上的最大效果相当，siRNA通常会产生更持久的效果。可以通过载体将siRNA导入细胞内(例如通过如腺相关病毒载体等病毒介导的输送机制)，或可以将siRNA外源性输送(例如作为脂质体复合物的一部分进行输送)。在Akhtar和Benter(2007)J.CHn.Invest 117：3623-3632中对用于合成siRNA的体内非病毒输送的技术进行了综述，本文通过参考引入其全部内容。已对用于对小鼠(Yano et al，(2004)Clinical CancerResearch 10：7721-7726)、对灵长类(Zimmermann et al，(2006)Nature441(7089)：111-114)和对人类(Nogawa等(2006)J Clin Invest115：978-985)局部或系统性施用siRNA序列的技术进行了描述(见例如，Akhtar和Benter(2007)J Clin Invest 117：3623-3632的综述)，这些文献表明这类分子可以用于减少靶标基因的体内表达。本文通过参考引入每篇引用文献的全部内容。设想了如胆固醇-siRNA偶联物、包括阳离子纳米颗粒、阳离子脂质体、阳离子聚合物或肽输送系统的阳离子输送系统或壳聚糖-siRNA偶联物等siRNA输送系统的使用。
已显示siRNA的系统性使用可造成siRNA在包括肝和肺的网状内皮组织系统中的积聚，因而这在施用siRNA用于治疗肺肿瘤时可能有利。
如锤头或发夹核酶等核酶能定向催化切割和剪接包括mRNA和基因组RNA序列的特定RNA序列。在例如Vaish，Kore和Eckstein(1998)Nucleic Acids Research 26：5237-5242；Lieber和Strauss(1995)Mol.Cell.Biol.15：540-551；以及Usman和Blatt(2000)J Clin Invest 106：1197-1202中对用于输送核酶的设计和方法进行了综述，本文通过参考引入其全部内容。在本领域中描述了核酶靶向特定肿瘤和使其退化的应用，例如Zhang等(2000)Gene Ther 7：2041-2050。
通常，当诸如通过静脉内途径、作为丸剂或通过皮下持续释放技术等对人类或动物受试对象系统性施用时，或当对肿瘤细胞直接施用或者注射至肿瘤内或肿瘤周围时，每种这类分子都受到良好耐受。
特别对于肺肿瘤而言，还考虑了以包含可吸入型多核苷酸构建体的制剂向肺输送。用于治疗呼吸道合胞体病毒感染而通过雾化器将siRNA作为气溶胶的施用目前在临床试验中(Alnylam ALN-RSV01，Bitco等，(2005)Nat Med 11：50-55)，并且已表现出安全性、耐受性和抗病毒活性的疗效。于是，考虑了将siRNA向肺输送以调节肺肿瘤中特定的微管蛋白表达。
可以将适当的多核苷酸序列孤立地或在核酸构建体中施用。所述构建体可以是质粒载体、病毒载体或经改造用于插入外来序列并导入真核细胞内的任何其它合适的载器。所述载体可以是能将DNA序列的转录导入RNA内的表达载体。病毒表达载体包括例如，基于艾伯斯坦-巴尔病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体。
在一个实施方式中，所述载体是游离的。合适的游离载体的使用提供了将靶标细胞中的多核苷酸序列维持在染色体外高拷贝数的方法，从而消除了染色体整合的潜在影响。
在本发明的背景下，可优选将所述多核苷酸构建体以使其永久性并入其施用到的体细胞的基因组内的形式施用，以允许暂时控制对II类、III类和/或IVb类β微管蛋白表达的抑制。
在整个说明书中，当提及如多核苷酸构建体或核酸序列等多核苷酸时，可以理解其意在涵盖非天然存在的多核苷酸和核酸，条件是它们保留了在细胞中特异性相互作用的能力同时拥有低毒性。例如，某些非天然存在的核酸的使用提供了增加的对核酸酶消化的抵抗，这反过来可以增加核酸在施用后的半衰期。例如，在目前正在进行临床试验的核酶“ANGIOZYME”中已展示出减少核酸酶消化的化学稳定化。
当要将外源性多核苷酸构建体输送至孤立细胞或受试对象时，可以将它们配制在如盐水等适当稀释剂中。为了促进核酸构建体转运至细胞质内，可以将所述构建体封装在脂质体中和/或与促进对期望靶标细胞的识别和/或对质膜的渗透的配体或靶向分子偶联。例如，与细胞渗透肽偶联的siRNA的使用已显示出可增加siRNA的细胞摄取(Veldhoen等(2006)Nucleic Acids Res 34：6561-6573)。本领域内已知的用于增加施用核酸的转染效率的其它技术包括生化方法，如DEAE-葡聚糖的使用、siRNA与纳米颗粒的偶联、磷酸钙转染法和/或如直接显微注射、电穿孔或基因枪输送等物理转染方法。
如本文所述的多核苷酸构建体的导入涵盖了聚阳离子试剂的使用，聚阳离子试剂是能用于将siRNA输送至癌细胞的化合物。如本文所公开，可以将聚阳离子试剂低分子量化合物聚乙烯亚胺(PEI)用作输送核酸构建体的输送载器。PEI具有通过首先将siRNA压缩为带正电的颗粒而将siRNA输送至细胞的能力，所述颗粒能与细胞表面的阴离子蛋白多糖相互作用并促进通过胞吞进入细胞。其次，siRNA与PEI的非共价络合有效地稳定了siRNA并对给定浓度而言提供了更高的作用效率。
如本文所示，特定的β微管蛋白同种型带来了改变的对微管蛋白结合剂和DNA损伤剂的敏感性。可以将此信息用来利用不同细胞类型之间的同种型组成的天然差异以便将特定药物靶向特定肿瘤。可能因微管及其相关蛋白中的修饰而由增强的细胞凋亡途径和由缺陷性有丝分裂造成细胞的过敏性，因而增强了这些细胞对微管蛋白结合剂的敏感性。
尽管本文描述了包含对II类和/或IVb类β微管蛋白基因具有特异性的多核苷酸序列的核酸构建体用于增强特定NSCLC细胞系和白血病细胞系对微管蛋白结合剂的敏感性的使用，但由于所述核酸构建体的作用模式的特异性，据预期表达II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因的任何其它肿瘤细胞类型在以相同方式治疗时也将展示出对至少一种微管去稳剂的敏感性增强。例如，抗紫杉醇的卵巢肿瘤可以表达增加的II类和/或IVb类β微管蛋白水平，成神经细胞瘤细胞可以表达高水平的II类β微管蛋白，而白血病细胞和乳腺癌细胞也可表达II类和/或IVb类β微管蛋白。如本文所用，肿瘤细胞是赘生细胞，且意在不仅涵盖见于固体肿瘤中的细胞而且还涵盖孤立赘生细胞或如白血病细胞等循环赘生物。
在本领域中可以利用许多方法来确定任何特定肿瘤细胞是否表达II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因，所述方法包括施用商购微管蛋白同种型特异性抗体和/或同种型特异性核酸引物和/或探针。
当暴露于核酸构建体时，肿瘤细胞可以在体外、在从受施对象移除的肿瘤中的原位或体内。肿瘤细胞可以源自哺乳动物，且在一个实施方式中源自人类。
在一个实施方式中，在开始用一种或多种微管去稳剂治疗之前将核酸构建体序列导入。核酸构建体序列的导入时机取决于所述构建体的施用途径和相关靶标的II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因的抑制动力学。可以例如用活组织检查标本和对II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因表达具有特异性的实时PCR来监测II类、III类和/或IVb类β微管蛋白基因表达的水平。对于siRNA的细胞施用而言，最大基因抑制发生在siRNA进入细胞后约72h，且此时细胞对所述一种或多种微管去稳剂具有最大敏感性。于是，可以优选在任何时间开始施用微管去稳剂从而在肿瘤细胞的II类和/或IVb类β微管蛋白基因表达被最大地抑制时所述药剂存在。
本发明设想了涉及使用包含本文所述的核酸构建体的组合物和包含所述核酸构建体的药物组合物的治疗方法。
通常，可以根据本领域普通技术人员已知的方法和步骤来制备根据本发明的方法使用的合适组合物，因而所述组合物可以包含药物可接受载体、稀释剂和/或佐剂。
可以通过标准途径施用所述组合物。通常，可以通过胃肠外(例如，静脉内、脊柱内、皮下或肌内)、口服或局部途径施用所述组合物。可以进行系统性、区域性或局部施用。在任何给定情况下所用的特定施用途径将取决于多种因素，包括待治疗的病况性质、病况的严重性和程度、待输送的具体化合物的所需剂量和所述化合物的潜在副作用。
通常，可以根据本领域普通技术人员已知的方法制备合适的组合物，且所述组合物可以包含药物可接受稀释剂、佐剂和/或赋形剂。就与组合物中的其它成分的相容性而言，所述稀释剂、佐剂和赋形剂必须“可接受”，且不能对其接受者有害。
除了上述可增加转染效率的试剂以外，药物可接受载体或稀释剂的实例是脱矿水或蒸馏水；盐水溶液；如花生油、红花油、橄榄油、棉花籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油等植物类油；硅油，包括如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷等聚硅氧烷；挥发性硅油；如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷(squalane)等矿物油；如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素等纤维素衍生物；低级烷醇，例如，乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；如棕榈酸异丙酯、豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯等脂肪酸酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯胶和石油凝胶。通常，载体形成组合物的10重量％～99.9重量％。
本发明的组合物可以为适于通过注射施用的形式、适于口服吞咽的剂型(例如，胶囊、片剂、囊片、酏剂等)、适于局部施用的软膏、乳膏或洗剂形式、适于作为滴眼液输送的形式、适于通过吸入(如鼻内吸入或口腔吸入)施用的气溶胶形式、适于胃肠外施用的形式即皮下、肌内或静脉内注射。
对于作为可注射溶液或悬浮液的施用而言，无毒的胃肠外可接受稀释剂或载体可以包括林格氏液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2-丙二醇。
用于口服使用的合适的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的某些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服制剂可以包含合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，可以用如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯等延迟崩解的化合物涂布胶囊。
佐剂通常包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
用于口服施用的固体形式可以包含人类和兽医药物实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、涂布剂、防腐剂、润滑剂和/或延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙或红莓调味料。合适的涂布剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或谷胶。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉。合适的延迟剂包括甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
用于口服施用的液体形式出上述试剂外可以包含液体载体。合适的液体载体包括水、如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花籽油、红花油、落花生油、椰子油等油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
用于口服施用的悬浮液可以进一步包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰醇。合适的分散剂包括卵磷脂、如硬脂酸等脂肪酸的聚氧化乙烯酯、聚氧化乙烯山梨糖醇单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯等。
用于口服施用的乳化液可以进一步包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上列举的分散剂或如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄蓍胶等天然胶。
用于制备可在胃肠外施用的组合物的方法对本领域技术人员是显而易见的，且在例如Remington的Pharmaceutical Science，15th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pa.中进行了更详细的描述，本文通过参考引入。
本发明的局部制剂包含活性成分以及一种或多种可接受载体，且可选地包含任何其它治疗成分。适于局部施用的制剂包含适于渗透穿过皮肤至需要治疗的位点的液体或半液体制剂，如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂以及适于施用至眼、耳或鼻的滴剂。
在例如美国专利第6,825,174号中描述了反义核苷酸组合物在对肺的施用中的使用以及适于该使用的组合物，本文通过参考引入其全部内容。其中所述方法可以用于制备用于可吸入输送或鼻内输送的适当组合物。
本发明的滴剂可以包含无菌水溶液、油性溶液或悬浮液。这些可以通过将活性成分溶解于杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂的水溶液中来制备，且所述水溶液可选地包含表面活性剂。然后通过过滤使所得溶液澄清，转移至合适的容器并消毒。可以通过过滤、接着通过无菌技术转移至容器进行消毒。适于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和乙酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、稀释的醇和丙二醇。
本发明的洗剂包括适于对皮肤或眼睛施用的那些洗剂。洗眼剂可以包含可选地含有杀菌剂的无菌水溶液并且可以通过与制备滴剂有关的上述方法相似的方法来制备。用于对皮肤施用的洗剂或搽剂还可包含如醇或丙酮等加速干燥并冷却皮肤的试剂和/或如甘油等增湿剂、或如蓖麻油或落花生油等油。
本发明的乳膏、软膏或糊剂是用于外部施用的活性成分的半固体制剂。它们可以通过将细分或粉末形式的活性成分单独混合或在具有油脂性或非油脂性基底的水性或非水性流体的溶液或悬浮液中混合而制成。所述基底可以包含如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂等烃类；胶浆；如杏仁油、玉米油、落花生油、蓖麻油或橄榄油等源自天然的油；羊毛脂或其衍生物，或者与如丙二醇或聚乙二醇等醇混合的如硬脂酸或油酸等脂肪酸。
所述组合物可以并入如阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂(如脱水山梨糖醇酯或其聚氧化乙烯衍生物)任何合适的表面活性剂。其中还可包含如天然胶、纤维素衍生物等悬浮剂或如硅酸盐质(silicaceous)氧化硅等无机材料以及如羊毛脂等其它成分。
可以将所述组合物以脂质体的形式对靶标细胞施用或输送。脂质体通常源自磷脂或其它脂类物质，并且由分散于水性介质中的单层或多层水化液晶形成。用于将组合物施用或输送至靶标细胞的脂质体的具体实例是摩尔比分别为55∶20∶10∶15或48∶20∶2∶30的合成胆固醇(Sigma)、磷脂1，2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC；Avanti PolarLipids)、PEG脂3-N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1，2-二豆蔻酰氧基-丙胺(PEG-cDMA)和阳离子酯1，2-二-o-十八酰氧基-3-(N，N-二甲基)氨基丙烷(DODMA)或1，2-二亚油酰氧基-3-(N，N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA)，PEG-cDMA、DODMA和DLinDMA。可以使用任何无毒、生理学可接受且可代谢的能形成脂质体的脂类。脂质体形式的组合物可以包含稳定剂、防腐剂和赋形剂等。优选的脂类是天然及合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。用于形成脂质体的方法是本领域内已知的，且与此有关具体参考：Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，VolumeXIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，p.33et seq.，本文通过参考引入其内容。
还考虑了DOTAP和/或其它阳离子脂类介导的核酸输送系统的使用。DOTAP已被用于基因间接用siRNA的系统性输送，例如，Sorenson等，(2003)J.Mol.Biol.327：761-766，本文通过参考引入其全部内容。
可以将所述组合物与聚阳离子试剂偶联以将所述组合物输送至细胞内。聚阳离子试剂的一个实例是聚(乙烯酰亚胺)，或PEI。PEI是将如siRNA等短核酸链压缩为与细胞的阴离子表面相互作用的带正电的颗粒的低分子量化合物。PEI可以单独使用或进而与PEG偶联使用。聚阳离子试剂在将组合物输送至细胞中的使用是本领域内已知的，且与此有关具体参考Judge等(2005).Nature 25：457-462，本文通过参考引入其内容。
也可以将所述组合物以微粒的形式施用。从聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和ε-己内酯形成的可生物降解的微粒已被广泛用作药物载体以增加质粒半衰期并从而延长疗效(Kumar，M.，2000，JPharm Pharmaceut Sci.3(2)234-258)。已将微粒配制用于输送包括疫苗、抗生素和DNA的许多候选药物。而且，已将这些制剂发展用于包括胃肠外皮下注射、静脉内注射和吸入的各种输送途径。
所述组合物可以包含纳米颗粒。已据显示如含PEG纳米颗粒等纳米颗粒因其尺寸而可轻易被细胞摄取。当本文所述组合物例如通过所述组合物和纳米颗粒表面上的互补电荷而与纳米颗粒相关时，可以通过由纳米颗粒提供的细胞输送性质来增进所述组合物在细胞内的输送。
所述组合物可以包含由乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)和有机溶剂或有机溶剂混合物组成的控释基质。可以向载器添加聚合物添加剂作为释放调节剂以进一步增加粘度并减缓释放速率。SAIB是公知的食品添加剂。它是非常疏水的、以6个异丙酯基：2个乙酯基的普通比例完全酯化的蔗糖衍生物。作为混合酯，SAIB不会结晶但作为澄清粘稠液体存在。将SAIB与如乙醇或苄醇等药物可接受有机溶剂混合使混合物的粘度降低至足可用于注射。可以向SAIB输送载器添加活性药物成分以形成SAIB溶液或悬浮液制剂。当将所述制剂在皮下注射时，溶剂从基质扩散从而使得SAIB-药物或SAIB-药物-聚合物混合物能建立在原位形成的贮库。
出于本发明的目的，可以将分子和药剂作为组合物对受试对象进行治疗性或预防性施用。在治疗性应用中，将组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的量对已患有疾病的患者施用。所述组合物应该提供足以有效治疗患者的量的分子或药剂。
对于任何特定患者的治疗有效剂量水平取决于各种因素，这些因素包括：待治疗病症和该病症的严重性；所采用的分子或药剂的活性；所采用的组合物；患者的年龄、体重、普通健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；所述分子或药剂的隔离速率(rate of sequestration)；治疗持续时间；与治疗组合或同时使用的药物，以及医学领域公知的其它相关因素。
本领域技术人员将能通过常规实验确定治疗可适用的疾病和病况所需的有效、无毒的药剂或化合物量。
可以理解，确定肿瘤细胞对微管去稳剂的敏感性是否得到增强的方法可以包括检验任何一种或多种细胞凋亡标记、肿瘤缩小程度和肿瘤细胞在暴露于微管去稳剂时的代谢活动变化。可以将包括阳性TUNEL标记的细胞凋亡标记的存在或DNA梯带的存在用于确定肿瘤中的细胞是否经历了凋亡。
可以使用如射线数字成像、包括X射线乳腺摄影的X射线技术、磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、γ相机成像、超声成像、内窥成像和临床评估等临床医师容易利用的技术来确定肿瘤尺寸的改变。也可以使用肿瘤特定抗体或通过采用特定探针的原位杂交来评估循环系统中或活检组织中肿瘤特定标记的存在或水平。例如，可以使用正电子发射断层扫描来测定原位肿瘤代谢活性。
实施例
所述实施例意在用于说明本发明而不应被视为对整个说明书中描述的公开的一般性质的限制。
统计分析用GraphPad Prism程序完成。当出现统计分析时，结果以至少3次独立实验的平均值±SEM来表达。将双尾Student测试用于确定各个实验组与对照组之间的统计差异，并将P＜0.05认为是统计显著的。
实施例1.细胞培养和siRNA转染
将人NSCLC细胞系Calu-6和H460(ATCC：Calu6目录号HTB-56，NCI-H460目录号HTB-177)作为单层培养物分别保持在Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)和RPMI中，所述培养基中补充有10％的胎牛血清(FCS)和2mM的L-谷氨酰胺。细胞在37℃的带有5％CO2的湿润氛围中生长。
在本文所述的实施例中使用了各种siRNA或shRNA。
III类β微管蛋白
(正式代号：TUBB3)，也称作MCIR；TUBB4；β-4SMARTpool，人TUBB4，NM_006086(III类β微管蛋白)Dharmacon RNA Technologies
III类β微管蛋白序列1
正义序列：GGGCGGAGCUGGUGGAUUCUU(SEQ ID NO：1)
(327～245位，346～347位处错配)
反义序列：5Phos-GAAUCCACCAGCUCCGCCCUU(SEQ IDNO：2)
III类β微管蛋白序列2
正义序列：GUACGUGCCUCGAGCCAUUUU(SEQ ID NO：3)
(174～192位)
反义序列：5Phos-AAUGGCUCGAGGCACGUACUU(SEQ IDNO：4)
III类β微管蛋白序列3
正义序列：GCGGCAACUACGUGGGCGAUU(SEQ ID NO：5)
(98～116位)
反义序列：5Phos-UCGCCCACGUAGUUGCCGCUU(SEQ IDNO：6)
III类β微管蛋白序列4
正义序列：AGGAGUAUCCCGACCGCAUUU(SEQ ID NO：7)
(470～488位)
反义序列：5Phos-AUGCGGUCGGGAU ACUCCUUU(SEQ IDNO：8)
III类β微管蛋白序列5
正义序列：CAAGGUGCGUGAGGAGUAUUU(SEQ ID NO：9)
(459～477位)
反义序列：5Phos-AUACUCCUCACGCACCUUGUU(SEQ IDNO：10)
靶标序列为该正义序列，以T代替U。
27聚体βIII siRNA序列
Integrated DNA Technologies(IDT)
27聚体βIII siRNA序列8
AGACAGAGACAGGAGCAGCUCACACGU(SEQ ID NO：11)
5Phos-GUGUGAGCUGCUCCUGUCUCUGUCT(SEQ ID NO：12)(靶标序列，以T代替U；1521～1545位)
27聚体βIII siRNA序列11
UCUCACUCCAGCUGCGAGCAGCUUCAC(SEQ ID NO：13)
5Phos-GAAGCUGCUCGCAGCUGGAGUGAGA(SEQ ID NO：14)(靶标序列，以T代替U；1352～1376位)
βIII shRNA表达pRS载体
Origene
GUGUGAGCUGCUCCUGUCUCUGUCUUAUUTCAAGAGAAUAAGACAGAGACAGGAGCAGCUCACAC(SEQ ID NO：15)
(1521～1549位)
II类β微管蛋白
(正式代号：TUBB2A)，也称作TUBB；TUBB2；dJ40E16.7siGenoME ON-TARGETplus SMARTpool，人TUBB2A，NM_001069Dharmacon RNA Technologies
II类β微管蛋白序列7
正义序列：GCUGGUAACAAAUAUGUACUU(SEQ ID NO：16)
(163～183位；182位处错配)
反义序列：5Phos-GUACAUAUUUGUUACCAGCUU(SEQ IDNO：17)
II类β微管蛋白序列8
正义序列：GAUCAAUCGUGCAUCCUUAUU(SEQ ID NO：18)
(1350～1370位；1369位处错配)
反义序列：5Phos-UAAGGAUGCACGAUUGAUCUU(SEQ ID NO：19)
II类β微管蛋白序列9
正义序列：GAACUUCUGUUGUCCUCAAUU(SEQ ID NO：20)
(1371～1389位；1390～1391位处错配)
反义序列：5Phos-UUGAGGACAACAGAAGUUCUU(SEQ IDNO：21)
II类β微管蛋白序列10
正义序列：GAAAUUCACACUGUUGAUGUU(SEQ ID NO：22)
(1439～1458位；1459位处错配)
反义序列：5Phos-CAUCAACAGUGUGAAUUUCUU(SEQ IDNO：23)
靶标序列为该正义序列，以T代替U。
IVb类β微管蛋白
(正式代号：TUBB2C)，也称作TUBB2
siGenoME双链体，人TUBB2，NM 006088
Dharmacon RNA Technologies
IVb类β微管蛋白序列5
正义序列：GGGCAGUGCGGCAACCAAAUU(SEQ ID NO：24)
(28～47位；48位处错配)
反义序列：5Phos-UUUGGUUGCCGCACUGCCCUU(SEQ IDNO：25)
靶标序列为该正义序列，以T代替U。
对于siRNA转染，在24孔板上接种3×104～5×104细胞/孔并用II类β微管蛋白siRNA ON-Target plus SMARTpool试剂在最高达100nMsiRNA下转染(Dharmacon，Chicago，IL)。
将不带与任何已知人类基因序列的序列同源性的非沉默对照siRNA在所有实验中用作负对照(Qiagen，Valencia，CA)，仅27聚体βIIIsiRNA实验例外。用βIII siRNA转染细胞至最终浓度为25nM(Calu-6)和100nM(H460)。
用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据制造商说明进行转染。对照实验通过用不带与任何已知人类基因序列的序列同源性的非沉默对照siRNA(Qiagen，Valencia，CA)在与靶标siRNA等同浓度下对细胞进行转染来平行完成。除非另外指明，在转染48h～72h后收集细胞用于实验。所有实验都涉及单Lipofectamine对照(模拟转染)和非沉默对照siRNA(负对照)的使用。
实施例2：β微管蛋白同种型的分析
用对β微管蛋白同种型的逆转录-PCR(RT-PCR)分析并通过蛋白印迹来对siRNA转录在β微管蛋白同种型的表达上的影响进行评估。对于逆转录分析而言，用Trizol试剂(Invitrogen)根据制造商说明分离总RNA。将RNA样品用DNA酶处理，并用Kavallaris等(1997)J ClinInvest 100，1282-1293中所述方法和特定引物进行逆转录用于RT-PCR分析，本文通过参考引入其全部内容。对于Hβ9(II类)、H5β(IVa类)和Hβ2(IVb类)基因而言，基于半定量PCR的测试涉及建立两个单独的PCR管以用于靶标(β微管蛋白)和对照(β2微球蛋白)基因序列。将扩增产物在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上进行解析并通过溴化乙锭染色用GelDoc 1000成像系统可视化，并用QuantityOne软件4.0版(Bio-Rad，Hercules，CA)进行数据分析。使用两个独立的cDNA制备物以三等分样品进行PCR扩增。
对于蛋白印迹，将来自转染细胞(10μg)的总细胞蛋白在12％SDS-PAGE上解析并用标准方法电转移至硝酸纤维素膜上。如前所述(Don等(2004)Mol Cancer Ther 3，1137-1146)并细微修改，用I类β微管蛋白的单克隆抗体(1∶5,000；由Dr.R.Luduena，University of Texas，San Antonio，TX惠赠)或替代性地使用抗β-I微管蛋白(AbCam)、抗II类β微管蛋白(1∶1,000，Covance，Richmond，CA)、抗III类β微管蛋白(1∶1,000，Covance)、抗IV类β微管蛋白(1∶500，Sigma ChemicalCo.-Aldrich，St Louis，MO)和抗总β微管蛋白(1∶500，Sigma)进行免疫印迹。用增强化学发光(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)进行检测。将印迹用Typhoon扫描仪扫描并用ImageQuant软件5.2版(MolecularDynamics Inc，Sunnyvale，CA)进行定量。用分离自3次独立提取物的蛋白以三等分试样重复实验。
如图1A所示，当用最优量的siRNA处理时，βII微管蛋白(Hβ9)表达在两个细胞系中在基因水平极大地降低，而在IVb类siRNA转染的细胞中观察到βIVb(Hβ2)表达的完全抑制。在72h时，蛋白印迹分析表明II类β微管蛋白和IV类β微管蛋白的水平分别在用βII或βIVb微管蛋白的siRNA转染的细胞中显著降低，但在对照siRNA中没有降低(图1B)。如图2所述，II类β微管蛋白(图2A)或IVb类β微管蛋白(图2B)的下调没有影响其它β微管蛋白同种型的内源性水平。
实施例3：耐药性克隆测试
将细胞转染24h并将约600个细胞(对Calu-6而言)或150个细胞(对H460而言)接种至6孔板的各孔内并让其附着4h～6h。本研究所用细胞系没有接受预先药物选择，且易于表现出在肺癌中观察到的内在耐药性。
然后用浓度递增的各种抗有丝分裂药物处理细胞。在37℃温育3天后，除去含药培养基并代以新鲜的完整培养基。在7天～10天中每隔3天～4天更换培养基直至形成可见菌落。以类似的培养基变化对对照细胞进行相同处理。将存活菌落同时固定并用0.5％的结晶紫的甲醇溶液染色，用水清洗以除去过量染色并空气干燥过夜。
对各孔中的菌落手动计数，并将结果根据下式以存活分数表示：存活分数计算如下：菌落数/(接种细胞数×平板接种效率)，其中平板接种效率等同于菌落数除以无药培养基中接种的细胞数。对各个药物-细胞系组合作出剂量响应曲线并用GraphPad Prism程序(GraphPadSoftware，第4版，San Diego，CA)从所述曲线中推导出抑制剂量(ID50)值。ID50被定义为将经药物处理的孔中的菌落数减少至相关未经处理的对照孔中的菌落数的50％所需的药物浓度。ID50值是至少4次独立实验的平均值。
本测试的结果表明βII和βIVb微管蛋白的敲出显著增加了长春花生物碱而非紫杉烷的细胞毒性。如图3A～B所示，βII敲弱使两个细胞系对长春新碱而非紫杉醇明显更敏感。令人惊讶的是，βIVb微管蛋白的下调导致用长春新碱处理时存活菌落陡然下降(图4A和图5)。与II类转染物的观察类似，βIVb下调没有显著增加紫杉醇在这些细胞中的细胞毒性(图4B)。
为了排除这些影响可能是由于紫杉醇与特定β微管蛋白同种型的某种独特相互作用的可能性，在分析中包含了另一种微管稳定剂环氧聚微管素B。环氧聚微管素B处理没有引起用βII siRNA转染的H460细胞的药物敏感性的显著变化(图3C)，这与紫杉醇数据一致。相反，IVb类转染物对环氧聚微管素B明显更抵抗(图4C)。此外，还测试了额外的长春花生物碱以确证观察到的长春新碱在II类和IVb类转染物上的过敏效果。这些测试的结果如表1A(βII siRNA)和表1B(βIVbsiRNA)中所示。对所有受测长春花生物碱所获得的结果在两个NSCLC细胞系中均一致，尽管仅显示了H460细胞数据。
尽管可以在基因表达(mRNA)水平对IVa类(H5β)和IVb类(Hβ2)表达进行特异性区分，但目前没有区分IVa类与IVb类蛋白的商购抗体，因此在本研究中没有检验这些多肽的区别表达。期望使用IV类β微管蛋白特异性抗体的亲和捕获和如毛细管区域电泳技术等高分辨电泳技术的组合可以对这两个蛋白进行分辨并可以对其进行区别定量。
在用IVb类siRNA转染的Calu-6细胞中观察到约40％～50％的H5β基因表达的减少，但在H460IVb类转染物中没有观察到显著变化。由于两个细胞系显示出相同的克隆结果，所获药物响应可归因于IVb类而非IVa类抑制。
NSCLC细胞中βII或βIVb的抑制没有显著增强紫杉醇的细胞毒性。这一结果与下述观察一致：用I、II或IVb类β微管蛋白对CHO细胞的转染没有带来对紫杉醇的抵抗。
本研究中所用siRNA导致各个靶向β微管蛋白同种型表达的特异性下调，且没有观察到其它β微管蛋白同种型水平的变化。这些结果突出了各种个体β微管蛋白同种型在确定细胞的化学敏感性中的不同贡献。
基于这些结果，我们提出每种β微管蛋白同种型就药物相互作用而言是独特的，且细胞的同种型组成影响其对抗微管剂的响应。由于βIVb同种型在所有组织中组成性表达，因而在βIVb转染物中观察到的长春新碱敏感性的戏剧性效果令人感兴趣。
可以想象，β微管蛋白组成的差异可能影响微管与细胞骨架网络的其它元件的相互作用并因此决定包括对化学治疗剂的细胞响应的肿瘤细胞行为。对敏感性机制的另一个可能解释是药物结合亲和力的改变；然而，由于长春花生物碱(包括长春新碱、长春花碱和长春瑞滨)与β微管蛋白同种型都以相似的亲和力结合，因而因不同同种型组成而引起的药物结合亲和力的改变不太可能是基础机制。
实施例4：微管蛋白的免疫荧光染色
使转染的Calu-6细胞在无菌室玻片上生长直至60％～70％合流。然后将细胞用10nM的紫杉醇和长春新碱处理1h。将细胞在甲醇中固定并如前所述(Don等(2004)见上，带细微修改)处理用于染色。将固定的细胞用α微管蛋白(5％FCS/PBS中1∶400，Sigma)染色30分钟，接着用Cy2抗小鼠荧光标记抗体(5％FCS/PBS中1∶1,000，GE Healthcare)染色。用DAPI II复染剂(Vysis Inc.，Downers Grove，IL)将玻片安置于盖玻片上。用带Image-Pro Plus 4.1软件(Media Cybernetics，L.P.，SilverSpring，MD)的Zeiss Axioplan 2免疫荧光显微镜(Mannheim，Germany)观察玻片。
如图7A所述，未经处理的βII转染物和βIVb转染物都没有显示出可观察到的微管形态变化。然而，与10nM长春新碱温育后，与对照siRNA相比，βII和βIVb siRNA转染的细胞都显示出极大的微管细胞骨架的破坏。在βII和βIVb siRNA转染的细胞中，微管极大程度地解聚并且大多数细胞仅由零星的剩余微管的残余物围绕。相反，对照细胞的形态受长春新碱的影响较小。尽管在不存在长春新碱时的βII和βIVb转染物中微管形态没有改变，但与对照相比低浓度的长春新碱在这些细胞中造成极大的微管破坏。
也检测了紫杉醇处理在βII转染物上的效果，将βII siRNA转染的细胞在用10nM紫杉醇处理1h后用α微管蛋白染色。与克隆数据一致的是，经βII siRNA处理的细胞的微管没有呈现出与经处理的对照细胞的微管的显著不同(图7B)。
实施例5：长春新碱的胞内积聚的检测
为了确定药物积聚是否有助于药物过敏性，以MRP1阳性MCF7-VP16作为正对照，在βIVb siRNA转染的细胞中测定了[3H]-长春新碱的积聚。用如前所述(Verrills，N.M.，Flemming，C.L.，Liu，M.，Ivery，M.T.，Cobon，G.S.，Norris，M.D.，Haber，M.，and Kavallaris，M.(2003)Chem Biol 10，597-607)并细微修改的放射性标记药物对胞内长春新碱积聚进行定量。简言之，将转染细胞在37℃在[3H]-长春新碱(5.20Ci/mmol；最终浓度为50nmol)(Moravek Biochemicals Inc，California)的存在下温育2h。将细胞洗涤、水解并如前所述对[3H]放射活性进行计数。使用细胞裂解物的等分试样用BCA测试试剂盒(Pierce，Rockford，IL)平行确定细胞蛋白浓度。对二等分样品确定了胞内长春新碱积聚并以pmol长春新碱/mg蛋白表达。将MCF7-VP 16细胞(Schneider等CancerRes.(1994)54(1)：152-8)包括作为正对照，这是因为这些细胞此前已显示出对多种药物抵抗相关蛋白-1(MRP1)的过表达。
MCF7-VP16细胞在[3H]-长春新碱的积聚中显示出显著减少(数据未显示)。在Calu-6和H460中，在βIVb敲弱与对照之间没有胞内[3H]-长春新碱水平的显著差异。这些结果表明长春新碱在βIVb敲弱中的增强的敏感性并非归因于药物积聚的增加。
实施例6：细胞周期分析
通过流式细胞仪确定了βII或βIVb微管蛋白siRNA转染的H460细胞中的DNA含量分布。转染72h后，将转染细胞暴露于浓度为5nM或40nM的长春新碱中24h。在分析当日，收集粘着细胞和流动细胞，用PBS洗涤然后在37℃用含0.4％Triton X-100(Sigma)、50μg/ml碘化丙啶(Sigma)和2μg/ml的无DNA酶的RNA酶(Roche，Indianapolis，IN)的溶液在黑暗中染色15分钟。通过FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Diego，CA)可以测定DNA含量。流速为＜200核/秒且分析了来自各个样品的10,000个细胞。在相同的仪器设定下进行测定。用CellQuest程序对各个细胞周期阶段中的细胞分布进行定量：亚Gi(凋亡细胞)、Gi、S和G2/M。
如图8A和8B所示，与对照相比，仅βII或βIVb微管蛋白的抑制不会显著影响未经处理的H460细胞的细胞周期概况。然而，用5nM长春新碱处理后，βII和βIVb转染物都显示出G2/M和亚Gi群体的增加。在用40nM长春新碱处理时，与对照处理的细胞相似，II类转染物显示出更大的G2/M积聚，而亚Gi群体没有显著差异(图8A)。
另一方面，在用等同浓度的长春新碱处理时，IVb类转染物没有经历G2/M停止并展示出G0-Gi群体的相伴增加(图8B)。尽管有丝分裂的阻断不显著，但细胞展示出由亚Gi群体的增加所表示的凋亡。
实施例7：用于βIII微管蛋白敲弱研究的细胞毒性药物
下列实施例描述了其中研究了βIII微管蛋白敲弱在肿瘤细胞的敏感性上的作用的研究。
制备储备浓度为2mM的紫杉醇(Calbiochem，Merck Biosciences，Nottingham，U.K.)的二甲亚砜(DMSO)溶液。制备储备浓度为2mM的长春新碱(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的盐水(0.9％重量/体积NaCl)溶液；将长春瑞滨(Dr B Hill，Pierre Fabre，France惠赠)以2mM的储备浓度溶解于水中。制备储备浓度为3.45mM的阿霉素(阿霉素盐酸盐；Pfizer，Sydney，Australia)的盐水溶液。制备储备浓度为68mM的足叶乙甙(VP-16；Sigma-Aldrich)的DMSO溶液，并制备储备浓度为3.3mM的顺铂(Pharmacia，Rydalmere，Australia)的盐水溶液。
实施例8：NSCLC细胞系中βIII微管蛋白的沉默
通过RT-PCR和蛋白印迹评估了βIII微管蛋白siRNA转染在该同种型的基因和蛋白表达上的影响。对于RT-PCR，用Trizol试剂(Invitrogen)根据制造商说明从转染细胞中提取总RNA。将RNA样品用DNA酶处理、用此前详细描述的方法和特定引物(Kavallaris等(1997)JClin Invest 100，1282-1293)进行逆转录以用于RT-PCR分析。将β-2-微球蛋白(β2M)用作内部mRNA对照。如下进行蛋白裂解物的制备和蛋白印迹分析。简言之，将总细胞蛋白在4％～15％的SDS-PAGE上分离并用标准方法电转移至硝酸纤维素膜上。用指向βI微管蛋白(克隆体SAP4G5，Abeam Ltd.，Cambridgeshire，UK)、βII微管蛋白(克隆体7B9，Chemicon，Temecula，CA)、βIII微管蛋白(克隆体TUJ1，Chemicon)和βIV微管蛋白(克隆体ONS 1A6，Sigma-Aldrich)、GAPDH(Abeam Ltd.)的单克隆抗体进行免疫印迹。用山葵过氧化物酶连接的二抗(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)检测一抗，并且用增强化学发光仪(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)进行检测。将印迹用
Figure G2008800149150D00421
扫描仪扫描并用ImageQuant软件5.2版(Molecular Dynamics Inc，Sunnyvale，CA)进行定量。与模拟及对照siRNA转染的细胞相比，用βIII微管蛋白siRNA对H460和Calu-6细胞的处理造成βIII微管蛋白mRNA水平的显著敲弱(图9A)。该结果与在蛋白水平观察到的下降一致(图9B)。如蛋白印迹所示，βIII微管蛋白siRNA特异性靶向βIII微管蛋白并且没有与受测的其它β微管蛋白同种型的交叉反应性(图9C)。另外，βIII微管蛋白的沉默没有导致受测的其它同种型的补偿性变化。
实施例9：III类β微管蛋白沉默在紫杉醇或长春新碱处理时对微管的破坏
为了评估βIII下调在微管组织上的影响，在转染的Calu-6细胞上如下进行免疫荧光染色。简言之，将siRNA转染的细胞平板接种至玻璃室玻片上并让其达到70％合流。然后用10nM的紫杉醇或长春新碱将细胞处理1小时。接着通过用PBS洗涤细胞除去药物并用10％FCS/PBS封闭。对于双重染色而言，首先将细胞用III类β微管蛋白的抗体标记，将其对在37℃的湿润室中温育了30分钟的细胞暴露。在室温用0.1％Tween 20/PBS洗涤后，在湿润室中将玻片与Cy3抗小鼠荧光标记抗体(GE Healthcare)在室温和黑暗中温育40分钟。温育后，再次用0.1％Tween 20/PBS洗涤玻片。此后用α微管蛋白和Cy2抗小鼠荧光标记抗体(GE Healthcare)进行染色。用DAPI II复染剂(Vysis Inc.，Downers Grove，IL)将玻片安置于盖玻片上。进行免疫荧光显微镜观测并用Sensicam电荷耦合装置相机(PCO Imaging，Kelheim，Bavaria，Germany)和Image-Pro Plus 4.1软件(Media Cybernetics，L.P.，SilverSpring，MD)获取图像。
βIII siRNA转染的细胞没有显示出可观察到的微管形态变化。与蛋白印迹数据一致的是，当在相同条件下成像时，与对照siRNA及模拟转染的细胞相比，在βIII微管蛋白siRNA处理的细胞中观察到III类β微管蛋白免疫荧光强度的明显下降。与βIII敲弱相比对照细胞(模拟及对照siRNA转染的细胞)表达了相似水平的III类β微管蛋白，而βIII微管蛋白的表达水平则几乎无法由荧光显微镜检测。
为了检验微管蛋白结合剂在βIII微管蛋白siRNA处理的细胞上的影响，将细胞对10nM紫杉醇或长春新碱暴露1h然后检验细胞形态。如图10所示，与对照处理的细胞相比，βIII siRNA转染的Calu-6细胞显示出微管细胞骨架的极大破坏。大多数βIII siRNA处理的细胞变圆并且许多这些细胞展现出异常细胞形态或核形态(图10箭头所示)。对照处理的细胞偶尔显示出极小的通常与紫杉醇处理相关的微管束集，而与βIII转染物相比圆形细胞的出现频率和微管破坏程度极小。
实施例10：βIII微管蛋白沉默增加对微管蛋白结合剂和DNA损伤剂的敏感性
前述实施例中的数据表明沉默βIII微管蛋白表达可能增加肿瘤细胞对紫杉醇和长春新碱的敏感性。为了对药物敏感性的任何变化进行定量，进行了药物处理的克隆测试。在siRNA转染后24小时，收集细胞并平板接种至6孔板6h，然后添加如图例中指明的各种药物。温育72h后，除去含药培养基并代以完整生长培养基。在7～10天中每3天更换培养基直至形成可见菌落。将菌落同时固定并用0.5％的结晶紫甲醇溶液染色，并手动计数。对各孔中分别染色的菌落计数并如下计算存活分数：菌落数/(接种细胞数×平板接种效率)，其中平板接种效率等同于菌落数除以无药培养基中接种的细胞数。
如前Verrills，等，J Natl Cancer Inst 2006；98：1363-74中所述测定氚代底物[3H]-紫杉醇和[3H]-长春新碱的细胞摄取和保留。简言之，将细胞在12孔板中转染48h。通过在2h中在37℃将[3H]-紫杉醇(14.7Ci/mmol；最终浓度为50nM；Moravek Biochemicals Inc，Brea，CA)和[3H]-长春新碱(7.1Ci/mmol；最终浓度为12.5nM；GE Healthcare)添加至转染细胞来监测药物摄取。如前述实施例所述将细胞洗涤、水解并计数。对三等分样品确定细胞中积聚的氚代药物的量并将其以pmol药物/mg蛋白表达。进行至少3次独立实验。在实验中包括了相关正对照，包括耐长春新碱成神经细胞瘤(BE/VCR10)和耐VP-16乳腺癌细胞(MCF7-VP16)，已知它们分别过表达多种药物抵抗物1(MDR1)和多种药物抵抗相关蛋白1(MRP1)。
与免疫荧光观察一致的是，βIII微管蛋白沉默造成了对紫杉醇和长春新碱的敏感性的显著增加(图11A和11B)。另外，与对照相比，βIII微管蛋白被沉默的细胞展示出对长春瑞滨的增加的敏感性(图11D)。所述增加的敏感性不是由于改变的药物积聚造成，这是因为与模拟和对照siRNA处理的细胞相比，在βIII微管蛋白siRNA处理的Calu-6或H460NSCLC细胞中胞内药物积聚水平没有显著差异(数据未显示)。
此外还用DNA损伤剂、VP-16、顺铂和阿霉素进行了药物处理的克隆测试。有趣的是，βIII微管蛋白沉默造成了对在H460细胞中测试的所有3种DNA损伤剂的敏感性的增加。用Calu-6细胞获得了相似结果。由于H460具有野生型p53而Calu-6细胞带有突变的p53，因而对这些药物的敏感性似乎不依赖于p53基因型。
实施例11：βIII微管蛋白敲弱对紫杉醇及长春新碱诱导的G2/M停滞的废止和对亚G1群体的增加的诱导
为了确定βIII微管蛋白沉默是否影响细胞周期概况，用流式细胞仪进行了细胞周期分析。通过用siRNA转染H460细胞72h并在药物处理后24h收集(粘着的和悬浮的)细胞来确定细胞周期分析。用含0.4％Triton X-100(Sigma-Aldrich)、50μg/ml溴化乙锭(Sigma-Aldrich)和2μg/ml的无DNA酶的RNA酶(Roche，Indianapolis，IN)的溶液在37℃将DNA内含物染色15分钟。然后用FACSCalibur(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)分析细胞的细胞周期扰动。用CellQuest程序对各个细胞周期阶段中的细胞分布进行定量：亚Gi(凋亡细胞)、Gi、S和G2/M。H460细胞的细胞周期概况未受βIII微管蛋白沉默影响。
为了确定微管蛋白结合剂是否影响βIII微管蛋白siRNA转染物的细胞周期概况，用紫杉醇或长春新碱处理细胞。与5nM紫杉醇温育24h后，βIII微管蛋白被沉默的细胞与对照siRNA处理的细胞(p＜0.05)相比具有更高的亚Gi(凋亡细胞)含量(图12A)，尽管与未处理的样品相比βIII微管蛋白siRNA和对照siRNA处理的细胞都具有相似的G2/M含量的增加。用40nM紫杉醇时观察到主要差异，其中对照siRNA处理的细胞显示出显著的G2/M阻断而βIII微管蛋白siRNA处理的细胞在反映凋亡细胞的亚Gi群体中出现显著增加(图12A)。当将siRNA处理的细胞暴露于长春新碱时观察到类似结果(图12B)，表明存在当βIII微管蛋白沉默后增强紫杉烷和长春花生物碱的效果的共有机理。
实施例12：在紫杉醇或顺铂存在下βIII微管蛋白敲弱增加细胞对凋亡的敏感性
进行膜连蛋白V-FITC染色以及随后进行流式细胞仪分析以确定在βIII微管蛋白siRNA处理的细胞中对微管蛋白结合剂的暴露是否与细胞凋亡诱导的增加有关。如前Pasquier等，Mol Cancer Ther 2004；3：1301-10中所述，通过用siRNA转染h460细胞72h并在药物处理后48h收集(粘着的和悬浮的)细胞来确定细胞凋亡诱导。简言之，将1×105个细胞与膜连蛋白V-FITC和溴化乙锭在黑暗中温育15分钟(Becton-Dickinson)，接着立即用FACSCalibur(Becton-Dickinson)进行流式细胞仪分析。用Cell Quest软件进行细胞直方图分析。
将H460细胞与紫杉醇温育48h，以1nM的紫杉醇在βIII微管蛋白siRNA处理的细胞中诱导细胞凋亡并以5nM的紫杉醇在对照siRNA处理的细胞中诱导细胞凋亡(图13A)。而且，在所有受试紫杉醇浓度下(1nM、2nM和5nM)，βIII微管蛋白siRNA处理的细胞中的凋亡细胞百分比明显高于对照siRNA处理的细胞(图13A)。
相似地，在暴露于顺铂48h的βIII微管蛋白siRNA处理的细胞中，与对照相比在0.4μM或1μM顺铂处理的细胞中凋亡细胞数显著增加(图13B)。所述数据共同表明在NSCLC中用微管蛋白结合剂和DNA损伤剂处理后βIII微管蛋白沉默使细胞对凋亡诱导敏感。
实施例13：III类β微管蛋白沉默增加对微管蛋白稳定剂环氧聚微管素的敏感性
如前述实施例中所述进行H460和Calu-6细胞的III类β微管蛋白敲弱，并用微管蛋白稳定剂环氧聚微管素B进行药物处理的克隆测试。这些实验的结果如图14所示。
两个细胞系中的III类β微管蛋白敲弱增加了这些细胞对环氧聚微管素B的敏感性。
实施例14：III类β微管蛋白沉默的替代性siRNA
为了研究由其他siRNA进行的微管蛋白表达的敲弱是否在响应于微管蛋白结合剂时能诱导等价水平的III类β微管蛋白沉默的变化，用称为序列8(SEQ ID NO：11和12)或序列11(SEQ ID NO：13和14)的27聚体siRNA试剂敲弱H460细胞中的III类β微管蛋白表达。这些siRNA识别III类β微管蛋白mRNA序列的不同区域。
这些实验的结果如图15和16以及表2中所示。图15所示蛋白印迹显示每种这些siRNA在不同程度有效敲弱了III类β微管蛋白表达，而同时不会影响其它微管蛋白同种型的表达。图16和表2显示经敲弱的细胞液展示出不同程度的对紫杉醇和长春新碱的灵敏度的增加，表明多种siRNA可以用于成功提高肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的敏感性。
实施例15：用于III类β微管蛋白沉默的短发夹RNA(shRNA)
使用短发夹RNA构建体(SEQ ID NO：15)来试图稳定敲弱H460细胞中的III类β微管蛋白表达。
鉴定出称作克隆体4、克隆体59和克隆体60的3个克隆体，其中观察到稳定的III类β微管蛋白敲弱。如图17所示，每个这些克隆体都显示出不同水平的III类β微管蛋白同种型的敲弱(如标准化蛋白印迹中检测到的III类β微管蛋白的强度变化所示)，而不明显改变其他微管蛋白同种型的表达。当在克隆测试中检验这些经稳定敲弱的克隆体对紫杉醇或DNA损伤剂顺铂(CDDP)的敏感性时(图18和表3)，发现所有克隆体都展现出对每种所述试剂的敏感性增加。各个克隆体的敏感性似乎与III类β微管蛋白的敲弱程度相关，而克隆体4似乎具有最大的敲弱量和最大的对这些试剂的敏感性。
实施例16：白血病细胞中的2-甲氧基雌二醇抵抗性与II类β微管蛋白相关
微管蛋白结合剂2-甲氧基雌二醇(2ME2)与秋水仙碱结合位点附近的β微管蛋白结合、抑制微管聚合并诱导有丝分裂停滞。选择显示出对2ME2增加的抵抗性的CCRF-CEM白血病细胞，并选择4个高度抵抗2ME2的白血病细胞亚系用于详细分析。据发现在3.6μM～28.8μM的2ME2中选择的2ME2细胞的2ME2抵抗性为母系细胞的11～107倍。
2ME2抵抗性细胞对环氧聚微管素B过敏，仅抵抗性最低的亚系CEM/2ME2-3.6R对秋水仙碱和长春新碱交叉抵抗。2ME2抵抗性细胞没有展示出如亲本细胞所示的G2/M细胞周期停滞，并且显示出比亲本细胞更高的聚合微管蛋白水平。对于I类β微管蛋白突变而言，在2ME2抵抗性细胞中检测到S25N、D197N、A248T和L350N。S25N突变在β微管蛋白上的紫杉醇结合位点内，而A248T和L350N在秋水仙碱结合位点内，然而所述抵抗性细胞不对紫杉醇或秋水仙碱交叉抵抗。
这表明所述突变可能在所述结合位点具有诱导的构象改变。另外，据显示2ME2抵抗性亚系已将其II类β微管蛋白的表达上调(图19)。
为了确定II类β微管蛋白的水平是否能预测敏感性并有助于抵抗性，在药物敏感的H460(NSCLC)细胞中进行siRNA介导的II类β微管蛋白敲弱。II类β微管蛋白的敲弱显著增加了H460细胞对2ME2和秋水仙碱的敏感性。
实施例17：对受试对象施用核酸构建体
对诊断或怀疑具有NSCLC肿瘤的受试对象进行肿瘤活组织检查。用本文所述或如前所述(Kavallaris et al.(1997)J Clin Invest 100：1282)的特定商购单克隆抗体或核酸通过RT-PCR检测活检组织以确定肿瘤是否表达βII、βIII或βIVbβ微管蛋白mRNA或蛋白。如果肿瘤表达βII、βIII或βIVbβ微管蛋白，则根据本发明的方法对受试对象进行治疗。
将指向II类、III类或IVb类β微管蛋白的一种或多种siRNA构建体以2×109构建体/注射的剂量直接注射到肿瘤内，每两天进行注射并重复3或5次，其中所注射的siRNA构建体被封装于如前所述的阳离子脂质体中(Nogawa et al.(2005)见上)、与纳米颗粒偶联或悬浮于盐水中并可选地用核酸酶抵抗性化学修饰进行合成。替代性的是将与纳米颗粒偶联的构建体系统性施用，其中利用了纳米颗粒将构建体定位到肺的能力。
为了监测肿瘤中II类、III类或IVb类β微管蛋白表达的抑制，可以在约72小时再进行活组织检查并如上所述检验组织的基因表达。
当肿瘤中II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达基本被抑制后，采用标准施用率对受试对象施用标准剂量的用于所讨论肿瘤类型的微管蛋白结合剂。
表1A.长春花生物碱存在下βIIsiRNA转染的NSCLC H460细胞的克隆存活
*ID50＝杀死50％细胞的药物浓度(ID50)；
Figure G2008800149150D00492
测试(两侧)。
P值通过比较模拟转染的细胞的ID50与siRNA转染的细胞的ID50而确定
表1B.长春花生物碱存在下βIVb siRNA转染的NSCLC H460细胞的克隆存活
Figure G2008800149150D00501
表2.用27聚体βIII siRNA进行βIII沉默后在H460细胞上的药物处理克隆测试
Figure G2008800149150D00511
表3.H460βIII-shRNA稳定细胞的药物处理克隆测试
Figure G2008800149150D00521
1抑制50％的菌落形成所需药物浓度。
2相对敏感性(RS)是与对照克隆1相比的siRNA处理细胞的敏感性倍数。RS通过用对照克隆体1的ID50除以βIII稳定克隆体或对照克隆2的βIII-而确定。NS——不显著
序列表
 
<110>新南创新私人有限公司
 
<120>检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法
 
<130>789531C
 
<150>AU 2007901131
<151>2007-03-05
 
<150>AU 2007905307
<151>2007-09-28
 
<160>25
 
<170>PatentIn version 3.2
 
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>1
gggcggagcu gguggauucu u    21
 
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，有义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>2
gaauccacca gcuccgcccu u    21
 
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>3
guacgugccu cgagccauuu u    21
 
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>4
aauggcucga ggcacguacu u    21
 
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>5
gcggcaacua cgugggcgau u    21
 
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>6
ucgcccacgu aguugccgcu u    21
 
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>7
aggaguaucc cgaccgcauu u    21
 
<210>8
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>8
augcggucgg gauacuccuu u          21
 
<210>9
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>9
caaggugcgu gaggaguauu u          21
 
<210>10
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>10
auacuccuca cgcaccuugu u          21
 
<210>11
<211>27
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>11
agacagagac aggagcagcu cacacgu    27
 
<210>12
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>胸腺嘧啶核苷
 
<400>12
gugugagcug cuccugucuc ugucn      25
 
<210>13
<211>27
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>13
ucucacucca gcugcgagca gcuucac    27
 
<210>14
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成siRNA，反义链
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>14
gaagcugcuc gcagcuggag ugaga     25
 
<210>15
<211>65
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人III类β微管蛋白的合成shRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(29)
<223>胸腺嘧啶核苷
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>n是a、c、g或u
 
<400>15
gugugagcug cuc cugucuc ugucuuauun caagagaaua agacagagac aggagcagcu    60
cacac                                                                 65
 
<210>16
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>16
gcugguaaca aauauguacu u                                               21
 
<210>17
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>17
guacauauuu guuaccagcu u                                               21
 
<210>18
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>18
gaucaaucgu gcauccuuau u                                               21
 
<210>19
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>19
uaaggaugca cgauugaucu u                                               21
 
<210>20
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>20
gaacuucugu uguccucaau u    21
 
<210>21
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>21
uugaggacaa cagaaguucu u    21
 
<210>22
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>22
gaaauucaca cuguugaugu u    21
 
<210>23
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人II类β微管蛋白的合成siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>23
caucaacagu gugaauuucu u    21
 
<210>24
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人IVb类β微管蛋白的合成siRNA
 
<400>24
gggcagugcg gcaaccaaau u    21
 
<210>25
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>针对人IVb类β微管蛋白的合成siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5′磷酸化
 
<400>25
uuugguugcc gcacugcccu u    21

Claims (29)

1.一种DNA损伤剂和一种核酸构建体在制备用于增强肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的敏感性的药物中的应用，所述构建体包含对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自短发夹RNA或siRNA序列，其中所述构建体的表达能减少肿瘤细胞中II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达。
2.一种DNA损伤剂和一种核酸构建体在制备用于治疗肿瘤细胞的药物中的应用，所述核酸构建体包含对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自短发夹RNA或siRNA序列，其中所述核酸构建体能减少肿瘤中II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达从而增强所述肿瘤细胞对微管蛋白结合剂的敏感性。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中将所述核酸构建体和DNA损伤剂同时施用。
4.如权利要求1或2所述的应用，其中将所述核酸构建体和DNA损伤剂并行施用。
5.如权利要求1或2所述的应用，其中将所述核酸构建体在DNA损伤剂之前施用。
6.一种DNA损伤剂和一种核酸构建体在制备用于治疗肿瘤细胞的药物中的应用，所述构建体包含对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自短发夹RNA或siRNA序列，其中所述构建体的表达能减少肿瘤细胞中II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达，并从而增强所述肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性。
7.如权利要求1、2或6中任一项所述的应用，其中所述核苷酸序列对IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性。
8.如权利要求1、2或6中任一项所述的应用，其中所述核苷酸序列对II类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性。
9.如权利要求1、2或6中任一项所述的应用，其中所述核苷酸序列对III类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性。
10.如权利要求1或2所述的应用，其中微管蛋白结合剂是微管去稳剂。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述微管去稳剂选自长春花生物碱、多拉司他汀、秋水仙碱、念珠藻环肽、curacin A、2-甲氧雌二醇。
12.如权利要求1或2所述的应用，其中所述微管蛋白结合剂是微管稳定剂。
13.如权利要求12所述的应用，其中所述微管稳定剂选自紫杉烷和环氧聚微管素。
14.如权利要求1、2或6中任一项所述的应用，其中所述肿瘤细胞是非小细胞肺癌细胞。
15.如权利要求1、2或6中任一项所述的应用，其中所述DNA损伤剂是足叶乙苷(VP-16)、顺铂或阿霉素。
16.如权利要求1、2或6中任一项所述的应用，其中所述肿瘤细胞是人肿瘤细胞。
17.一种核酸构建体在制备用于增加肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性的药物中的应用，所述核酸构建体包含对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因产物的至少一部分具有特异性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自短发夹RNA或siRNA序列，其中所述构建体能减少肿瘤细胞中II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达。
18.如权利要求17所述的应用，其中所述构建体的表达能减少肿瘤细胞中II类β微管蛋白的表达。
19.如权利要求17所述的应用，其中所述构建体的表达能减少肿瘤细胞中III类β微管蛋白的表达。
20.如权利要求17所述的应用，其中所述构建体的表达能减少肿瘤细胞中IVb类β微管蛋白的表达。
21.如权利要求17-20中任一项所述的应用，其中所述核酸构建体的核苷酸序列是短发夹RNA(shRNA)序列。
22.如权利要求17-20中任一项所述的应用，其中所述药物与聚乙烯亚胺(PEI)共同配制用于输送至肿瘤细胞。
23.如权利要求17-20中任一项所述的应用，其中所述肿瘤细胞是非小细胞肺癌细胞。
24.如权利要求17-20中任一项所述的应用，其中所述DNA损伤剂是足叶乙苷(VP-16)、顺铂或阿霉素。
25.一种用于增加肿瘤对微管蛋白结合剂的敏感性的药物组合物，所述药物组合物包含一种DNA损伤剂和至少一种核酸构建体以及药物可接受载体、稀释剂或赋形剂，所述核酸构建体包含对II类、III类或IVb类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自短发夹RNA或siRNA序列，其中所述构建体的表达能减少肿瘤中II类、III类或IVb类β微管蛋白的表达。
26.一种用于增加肿瘤对DNA损伤剂的敏感性的药物组合物，所述药物组合物包含核酸构建体以及药物可接受载体、稀释剂或赋形剂，所述核酸构建体包含对III类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自短发夹RNA或siRNA序列，其中所述构建体的表达能减少肿瘤中III类β微管蛋白的表达。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述对III类β微管蛋白基因的至少一部分具有特异性的核苷酸序列是短发夹RNA(shRNA)序列。
28.如权利要求26或27所述的药物组合物，其中所述组合物包括聚阳离子试剂。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述聚阳离子试剂是聚乙烯亚胺(PEI)。
CN2008800149150A 2007-03-05 2008-03-05 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法 Expired - Fee Related CN101778637B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310140359.4A CN103381269B (zh) 2007-03-05 2008-03-05 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2007901131 2007-03-05
AU2007901131A AU2007901131A0 (en) 2007-03-05 Modulation of beta-tubulin expression in tumour cells
AU2007905307A AU2007905307A0 (en) 2007-09-28 Modulation of B-tubulin expression in tumour cells
AU2007905307 2007-09-28
PCT/AU2008/000298 WO2008106730A1 (en) 2007-03-05 2008-03-05 Methods for detecting and modulating the sensitivity of tumour cells to anti-mitotic agents

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310140359.4A Division CN103381269B (zh) 2007-03-05 2008-03-05 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101778637A CN101778637A (zh) 2010-07-14
CN101778637B true CN101778637B (zh) 2013-05-29

Family

ID=39737694

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310140359.4A Expired - Fee Related CN103381269B (zh) 2007-03-05 2008-03-05 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法
CN2008800149150A Expired - Fee Related CN101778637B (zh) 2007-03-05 2008-03-05 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310140359.4A Expired - Fee Related CN103381269B (zh) 2007-03-05 2008-03-05 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20100159030A1 (zh)
EP (2) EP2644199B1 (zh)
JP (2) JP2010521657A (zh)
CN (2) CN103381269B (zh)
AU (1) AU2008222601B2 (zh)
CA (1) CA2679393A1 (zh)
HK (1) HK1141983A1 (zh)
IL (1) IL200767A (zh)
WO (1) WO2008106730A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012219611C1 (en) * 2011-02-24 2016-07-21 Basilea Pharmaceutica Ag Use of acetylated tubulin as a biomarker of drug response to furazanobenzimidazoles
CN106061981A (zh) * 2013-11-06 2016-10-26 索尔斯蒂斯生物有限公司 具有二硫化物基团的多核苷酸构建体
CA3001364A1 (en) * 2015-10-09 2017-04-13 Genzyme Corporation Improved flare (flow cytometry attenuated reporter expression) technology for rapid bulk sorting
CN110023321A (zh) 2016-08-17 2019-07-16 索尔斯蒂斯生物有限公司 多核苷酸构建体
SG11201903018WA (en) 2016-10-07 2019-05-30 Genzyme Corp Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production
CN106435009B (zh) * 2016-12-27 2019-08-23 北京泱深生物信息技术有限公司 Tubb2a作为血液诊断标志物的用途
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6825174B2 (en) 1995-06-07 2004-11-30 East Carolina University Composition, formulations & method for prevention & treatment of diseases and conditions associated with bronchoconstriction, allergy(ies) & inflammation
AU4413099A (en) * 1999-06-02 2000-12-28 Bristol-Myers Squibb Company Method and markers for prognosticating efficacy of anticancer agents
GB0415606D0 (en) * 2004-07-10 2004-08-18 Koninkl Philips Electronics Nv Lighting fixtures incorporating rf antennae
EP1828776A4 (en) * 2004-12-09 2010-03-17 Eisai R&D Man Co Ltd TUBULINISOTYPE SEARCH IN CANCER THERAPY WITH HEMIASTERLINANALOGES
WO2007057746A2 (en) * 2005-05-27 2007-05-24 Aurelium Biopharma Inc. Focused microarray and methods of diagnosing chemotherapeutic drug resistance in a cancer cell

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M Kavallaris等人.Antisense oligonucleotides to class III b-tubulin sensitize drug-resistant cells to Taxol.《British Journal of Cancer》.1999,第80卷(第7期),摘要，图2、4和表2. *

Also Published As

Publication number Publication date
IL200767A (en) 2015-09-24
EP2644199A1 (en) 2013-10-02
EP2136817A1 (en) 2009-12-30
US20100159030A1 (en) 2010-06-24
AU2008222601B2 (en) 2013-10-03
CN103381269B (zh) 2016-03-30
CA2679393A1 (en) 2008-09-12
EP2644199B1 (en) 2017-10-11
JP2010521657A (ja) 2010-06-24
HK1141983A1 (en) 2010-11-26
IL200767A0 (en) 2010-05-17
EP2136817A4 (en) 2010-08-18
CN103381269A (zh) 2013-11-06
WO2008106730A1 (en) 2008-09-12
CN101778637A (zh) 2010-07-14
JP2013150603A (ja) 2013-08-08
AU2008222601A1 (en) 2008-09-12
US20160175339A1 (en) 2016-06-23
JP5766221B2 (ja) 2015-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101778637B (zh) 检测和调节肿瘤细胞对抗有丝分裂剂的敏感性的方法
Zhang et al. Anibamine, a natural product CCR5 antagonist, as a novel lead for the development of anti-prostate cancer agents
CN102510719B (zh) 用与细胞毒性化学治疗剂组合的内皮素受体抑制剂治疗脑转移
KR101877840B1 (ko) 암 치료용 화합물을 확인하는 방법
Pandey et al. Artemin reduces sensitivity to doxorubicin and paclitaxel in endometrial carcinoma cells through specific regulation of CD24
Shatz et al. Caveolin-1 mutants P132L and Y14F are dominant negative regulators of invasion, migration and aggregation in H1299 lung cancer cells
Xie et al. Long non-coding RNA KCNQ1OT1 contributes to antiepileptic drug resistance through the miR-138-5p/ABCB1 axis in vitro
de Boer et al. Targeting PLK1 as a novel chemopreventive approach to eradicate preneoplastic mucosal changes in the head and neck
Huang et al. Rab1A promotes IL-4R/JAK1/STAT6-dependent metastasis and determines JAK1 inhibitor sensitivity in non-small cell lung cancer
JP2009541304A (ja) 抗癌治療としてのオーロラキナーゼｂのｒｎａ干渉媒介阻害およびその組み合わせ
US10139415B2 (en) Method for predicting responsiveness to compound inhibiting MAPK signal transduction pathway
EP3715475A2 (en) Biomarker composition for diagnosing radiation-resistant cancer or for predicting prognosis of radiation therapy containing pmvk as active ingredient
JP5180084B2 (ja) がん細胞識別マーカー及びがん細胞増殖阻害剤
Senbabaoglu et al. Drug Repositioning Screen on a New Primary Cell Line Identifies Potent Therapeutics for Glioblastoma
KR20190054909A (ko) HIF-2α 활성 억제제를 포함하는 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 조성물
US9062308B2 (en) Compositions and methods for treatment of tamoxifen resistant breast cancer
US11679099B2 (en) Use of HIF-2α inhibitors for treating chondrosarcoma, or preventing recurrence and metastasis thereof
CN118286431A (zh) HIF-1抑制剂britannin在肿瘤干细胞清除及肿瘤治疗中的应用
WO2023181086A1 (en) Micrornas for inhibiting the expression of trf2 in tumors
JP2011111435A (ja) 神経芽腫又は膠芽腫の治療薬

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1141983

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1141983

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130529

Termination date: 20180305

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee