CN108473553A - 使用双特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在细胞表面俘获细胞或细胞群分泌的可溶性物质(例如免疫球蛋白)来鉴定、分离和表征细胞或细胞群的方法。这通过对在合并对分泌分子具有的结合特异性与针对该细胞或细胞群具有的表面抗原特异性的结合特异性的进行的异二聚体系连的多特异性蛋白质复合物进行充分检查来实现。该方法可用于研究和实验目的，例如通过鉴定与病理学和/或预后相关的细胞群在准备临床试验或个性化疗法中的患者分层。

Description

使用双特异性抗体的方法
发明领域
本公开涉及在异二聚体系连(tethered)的多特异性蛋白质复合物中合并两种结合特异性以促进细胞将可溶性分子俘获至产生它们的细胞表面并且由此鉴定、分离和表征该细胞或细胞群的方法；所述多特异性蛋白质复合物的文库/多重复合物(multiplex)；以及它们的试剂盒和组合物。本公开进一步涉及所述新型多特异性蛋白质复合物，例如其用于研究和实验目的，例如用于通过鉴定与病理学和/或预后相关的细胞群来表征患者群体的测定中。本公开还扩展至制备所述多特异性复合物的方法。
发明背景
分泌的可溶性分子是细胞功能的关键介体(mediator)，并且理解产生它们的细胞谱系在何种条件下以及何时处于自然界和疾病中的复杂细胞生物学的核心。存在研究来自单细胞的分泌物的方法，但它们都存在局限性。一些需要复杂的技术，例如单细胞成像或微雕刻(Nat.Biotech.2006.24.703-707；Clin.Immunol.2008.129.10-18)。用于通过流式细胞术如双特异性抗体俘获的更简单的方法(Eur.J.Immunol.1999.29.4053-4059)已经被报道并且用于某些细胞/细胞因子组合以商业方式销售(Miltenyi biotech)，但是这些需要具有预先定义的细胞表面标志物和可溶性分子特异性组合的定制试剂的产生。因此，存在对一种简单的模块化系统来将任何细胞表面标志物特异性与任意可溶性分子特异性组合用于研究细胞功能和谱系的需求。
已知(传统)多特异性形式的制备耗时且是劳动密集型的。
典型地，对于单一双特异性抗体构建体，需要将至少两个可变区从发现载体的初始来源(例如噬菌体展示，杂交瘤或单一B细胞克隆)亚克隆入适合的双特异性表达载体中，该双特异性表达载体的每个臂必须被表达且并得到的双特异性抗体被纯化。如果将大量的可变区对合并以试图检查样品，则这种克隆和随后的表达努力将快速地会成为一个显著的实际瓶颈，且存在有大量的功能问题。
例如，如果50个独特的抗体可用于一组10个细胞表面靶标，并且50个独特的抗体可用于一组10个可溶性分子，则总计可能产生2500个双特异性抗体(设想为X-×-Y网格)。通过本领域已知的双特异性抗体形式，这将需要至少100次个体克隆反应(50-X和50-Y)，然后进行2500次抗体表达实验。将起始单克隆抗体的数量增加至100将使克隆反应的最低数量增加到200(100-X和100-Y)，并且将表达数量增加至10,000。
一般而言，这种“表达瓶颈”的根本原因在于上述形式需要最终双特异性构建体的蛋白质链“两半”在同一细胞中的单一表达实验内同时表达。因此，对于许多形式，为了生产2500个双特异性抗体，需要2500次表达实验。
如果双特异性抗体形式是单顺反子的(即克隆并表达为单链蛋白质)，例如单链双抗体，则“表达瓶颈”进一步加剧，因为对于上文给出的数字，克隆实验的次数分别为2500和10,000。
此外，表达后，可能需要充分的纯化来分离期望的构建体。
一些双特异性方法在双特异性构建体中使用共同的轻链以减少克隆的量，不过，这不减少表达实验的次数。此外，使用共同链，例如共同轻链，使抗体发现的难度更大，因为找到起始抗体可变结构域更困难，因为抗体需要通过一条链例如重链以足够高的亲和力单独结合其抗原。
目前已经开发出许多有前景的双特异性抗体形式，其可以作为包括DVD-Ig(Abbvie)、DuoBodies(Genmab)、旋钮入孔(Knobs-in-Holes)(Genentech)、共同轻链(Merus)在内的成功治疗剂发挥作用。然而，在每种情况下，这些形式都不是理想地适用于分析和/或表征来自患者的细胞群，例如在大规模临床试验中。
新的药物治疗(新药)通常只对患者亚群有效。但是，为了鉴定这样的人群，需要采集大量的数据，以便可以鉴定任何潜在的模式。
通常以转录组学信息的形式采集数据，这些信息给出了有关一组基因的上调和下调的证据。虽然该信息是有价值的，但它并不指示这些变化是如何反映在蛋白质水平上的。
由于蛋白质水平的变化反映出许多输入的结果，例如基因转录、表观遗传调节、蛋白质转录、蛋白质翻译、蛋白质修饰和代谢功能方面的变化，所以它们代表了细胞健康和功能的更综合的量度。因此，蛋白质的分析与所指示的原因更相关，此外可以用于灵敏区分健康和疾病中的细胞群和亚群。虽然细胞亚群的表征可以通过定量细胞表面蛋白来确定，但目前细胞分泌产物(其可以包括但不限于蛋白质、脂质、核酸等)不能用作细胞标识物，除非将细胞保持在固体或半固体基质中。因此，需要一种优化的系统来俘获分泌的细胞产物，其也可以在例如血液或间质液的水性环境中测定。此外，还需要一种技术，其可以在复杂的细胞混合物中工作，并且仅俘获产生它的细胞而不是由邻近的其它细胞产生的分泌产物。
我们提出，不是设计和测试有限选择的双特异性或多特异性抗体，其衔接细胞靶标和可溶性靶标上的给定表位，而是仅通过能够灵活地组合大的双特异性或多特异性抗体或蛋白质配体的多种组合组来实现鉴定产生可溶性分子的细胞的真实潜能。为了有利于这一点，需要能够产生大量不同多特异性蛋白质的形式和方法，所述蛋白质可以容易地构建和筛选以便将分泌的分子俘获到产生它们的细胞表面并因此鉴定该细胞。这种方法进一步允许生物学机制和/或细胞亚群的偶然发现鉴定。
因此，产生和筛选具有不同特异性组合的结合结构域的大量多特异性蛋白质复合物将是有用的。具体而言，能够以快速且有效的方式筛选具有大量不同多特异性蛋白质复合物的样品将是有用的。
存在用于产生抗体药物缀合物和体内靶向技术的偶联和缀合技术。一种这样的方法为化学交联，然而，这是劳动密集型的，因为相关蛋白质可能需要从同二聚体和其它不期望的副产物中纯化。另外，化学修饰步骤可以改变蛋白质的完整性，由此导致稳定性差或生物功能改变。作为结果，通过化学交联产生双特异性抗体通常是低效的，并且也可能导致抗体活性的丧失。
制造双特异性抗体的另一种方法是通过细胞融合(例如杂交杂交瘤)，其中改造的细胞表达随机组装的两条重链和两条轻链抗体链。由于存在4种可能的变体可供选择，所以这导致产生10种可能的双特异性抗体组合，其中仅期望一些(在许多情况下，仅需要一种)组合。因此，通过细胞融合产生双特异性抗体导致产量低，并且还需要额外的纯化步骤以从所产生的其它双特异性抗体中分离期望的双特异性抗体。这些缺点增加了时间和费用。
重组DNA技术也用于产生双特异性抗体。例如，重组DNA技术也用于产生“旋钮入孔”双特异性抗体。'旋钮入孔'技术涉及在CH3结构域界面处在多聚化结构域中改造空间互补突变(参见例如，Ridgway等人,Protein Eng.9:617-621(1996)；Merchant等人,Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998)；另外参见美国专利5,731,168和7,183,076)。这种策略的一个限制在于两个亲代抗体的轻链必须相同，以防止在相同细胞中表达时错配和形成不期望的和/或无活性的分子。每个双特异性抗体(其重链和轻链)必须在单个细胞中表达，且蛋白质产物通常包含约20％的同二聚体，其随后通过纯化除去。
其它方法基于全长IgG4分子中的链的自然交换(Genmab Dubody)。然而，这种方法也有困难，因为它不允许在没有Fc区的情况下制备构建体。由于Fc区可有助于生物活性，因此当在复杂功能测定中测试此类分子时，如果观察到的活性基于可变区的组合，则Fc或在包含Fc的双特异性分子的两者中可能难以确定。此外，交换是一个动态的过程，并且这可能会导致与给定样本中的活性物质有关的困难。
因此，需要解决上述技术问题和允许以优化的方式基于其分泌的产物物质鉴定细胞群的新方法。
发明概述
因此，提供了鉴定或表征细胞群、例如涉及由细胞分泌的可溶性分子的方法，其中该方法使用式A-X:Y-B的异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X是第一种融合蛋白；
Y-B是第二种融合蛋白；
X:Y是异二聚体系链；
:是X与Y之间的结合相互作用；
A是选自抗体或其结合片段或抗原(包括例如蛋白质配体)的双特异性蛋白质复合物的第一种蛋白质成分；
B是选自抗体或结合片段或抗原(包括例如蛋白质配体)的多特异性蛋白质复合物的第二种蛋白质成分；
X是独立地选自抗原或抗体或其结合片段的结合对的第一种结合配偶体；且
Y是独立地选自抗原或抗体或其结合片段的结合对的第二种结合配偶体；
其中A对细胞表面蛋白例如细胞表面标志物具有特异性，且
B俘获(例如结合)分泌自细胞的感兴趣的可溶性分子，
条件是当X是抗原，Y是对X表示的抗原具有特异性的抗体或其结合片段时，且当Y是抗原，X是对Y表示的抗原具有特异性的抗体或其结合片段时，所述方法包含下列步骤：
i)向细胞中导入用于分析的未复合形式或异二聚体系连的双特异性蛋白复合物形式的融合蛋白A-X和B-Y的组合，和
ii)检测成分A或B对感兴趣的可溶性分子的俘获(例如结合)。
在本公开内，融合蛋白的术语“A-X”和“Y-B”可以类似地表示为“X-A”或“B-Y”。这同样适用于在本文中的术语异二聚体系链“X:Y”，其也可以表示为“Y:X”。
在一个实施方案中，由B俘获的感兴趣的可溶性分子选自包含以下的组的激素，细胞因子，趋化因子，化学引诱物，白三烯，前列腺素，血管活性胺，酶，补体和补体片段，脂质，鞘脂，第二信使成分(例如；一氧化氮，cAMP等)，维生素，矿物质，阳离子，阴离子，糖，凝血因子，急性期蛋白，γ球蛋白(包括免疫球蛋白)，白蛋白，可溶性细胞膜受体，细胞表达蛋白的剪接变体，核酸，小膜囊泡(例如外来体，微泡，脂质体等)，分泌肽，免疫复合物和来自死亡或垂死细胞的胞内蛋白质。
细胞可以分泌一种或多种细胞因子。因此，在一个实施方案中，细胞因子是，例如IL-1a、IL-1b、IL-1Ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-3、IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36b、IL-36g、IL-37a、IL-37、IL-38,TNSF1、TNFSF2、TNFSF3、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13b、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、IFNa、IFNb、IFNe、IFNk、IFNw、IFNg、IFNl1、IFNl2、IFNl2、CSF1、CSF2、CSF3、TGFb1、TGFb2、TGFb3、CLC、CNTF、瘦素、OPG、LIF、Neuropoietin、制癌素M、NGF、BDNF、NT-3、PAI-1、RBP4、脂联素、Apelin、嵌合素、内脂素、硬骨素和DKK-1。
本公开的双特异性复合物可用于检测产生细胞因子的细胞，用于分离、检测、中和、靶向和/或调节细胞功能或健康。这具有许多应用，例如认为一些产生细胞因子的细胞在肺部疾病例如哮喘中具有有害功能，例如通过分泌选自IL-17、IL-13和IL-5的一种或多种细胞因子。
在一个实施方案中，感兴趣的可溶性分子是趋化因子，例如选自包含CCL1、2、3、4、5、6、7、8、9/10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、CXCL 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、XCL1、XCL2和CX3CL1的组。
在一个实施方案中，可溶性分泌分子是免疫球蛋白，例如免疫球蛋白的特定同种型，例如B对细胞分泌的免疫球蛋白的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区具有特异性。因此，在一个实施方案中，B对例如选自包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE IgM及其片段的组的特定抗体同种型具有特异性。
一般而言，如果B对细胞分泌的免疫球蛋白具有特异性，例如B是对分泌的免疫球蛋白恒定区(例如CL或CH1)中的表位具有特异性的抗体或结合片段，则A通常将针对除特定免疫球蛋白以外的细胞表面标志物(或对其具有特异性)。
因此，本公开内容的方法可以用于检测和/或定量分泌的免疫球蛋白的类别(例如区分IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)或其片段，例如重链或轻链成分。这可以允许使用A-X：B-Y复合物来计数和检测浆细胞。
因此，本发明的方法可以用于分离免疫球蛋白亚类特异性应答，例如特异性俘获IgG4以排除IgG的其它亚类，这可以证明可用于检测患有IgG4相关(link)疾病的患者人群。
或者，B可以是能够特异性结合从细胞分泌的免疫球蛋白的结合结构域的抗原，例如它是特异性结合由细胞分泌的免疫球蛋白的抗原。在一个实施方案中，B是选自包含但不限于自身抗原、肿瘤抗原、病原体、半抗原或载体的组的抗原，其包括完整蛋白质或其肽片段。
本方法也可用于检测产生抗体的细胞以进行分离、检查或靶向，例如产生自身抗体或病原体特异性的抗体的浆细胞(特别是在表面IgG阴性细胞的情况下)。
在一个实施方案中，A结合选自包含稳定表达的细胞谱系标志物和在非谱系细胞(即未被抗原针对谱系标志物染色的细胞)上稳定表达的标志物的细胞表面标志物。
在一个实施方案中，细胞标志物选自表征感兴趣的细胞群或亚群的任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
在一个实施方案中，细胞标志物选自用于分泌抗体的细胞(例如B细胞，包括浆细胞)的标志物或T细胞标志物。
在一个实施方案中，B细胞标志物独立地选自包含以下的组：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD27、CD35、CD38、CD40、B220(也称作CD45)、CD43、CD81、CD138、CXCR4、BCMA和IL-6R，例如CD38、CD138、CD45、CD27、CD19或CD20，例如CD38或CD138。
在一个实施方案中，在B细胞表面上表达的免疫球蛋白被用作抗体分泌细胞的标志物(例如B细胞标志物和/或浆细胞标志物)，例如B细胞标志物是抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，其作为细胞表面上的免疫球蛋白的一部分表达。
因此，在一个实施方案中，A对例如选包含自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM及其片段的组的特定抗体同种型具有特异性。这些标志物可以特别地用于鉴定类别转换抗体。
通常，A和B二者不会都对一种双特异性蛋白质复合物内的免疫球蛋白同时具有特异性。
因此，在一个实施方案中，该方法使用将A-X对接到细胞表面标志物，而使用另一个臂B-Y来俘获分泌的免疫球蛋白。
因此，在另一个实施方案中，在非谱系细胞上稳定表达的细胞表面标志物是例如CD45并且蛋白质成分A-X通过A部分对CD45具有特异性的，而另一个臂B-Y中的B用于俘获分泌的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，A对T细胞表面标志物具有特异性，所述T细胞表面标志物例如选自包含CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD25、CD127 CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD62L、CD69和CD45的组。
T细胞可以基于表面标志物的不同表达水平分类为不同群体，所述表面标志物例如CD3、CD4、CD8、CD25、CD127和CD196(CCR6)及其组合。然而，关于T细胞状态的重要信息可以通过分析标志物CD197(CCR7)、CD62L、CD69和CD45中的一个或多个的表面表达来获得。
T淋巴细胞通常至少对CD45和CD3是阳性的。
细胞毒性T细胞可以对标志物CD45、CD3和CD8是阳性的。
调节性T细胞可以对标志物CD4、CD25和Foxp3是阳性的。
T辅助细胞可以对CD45、CD3和CD4是阳性的。
因此，本公开中关注：使用本公开的双特异性蛋白质复合物(或其成分)，例如使用对选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD25、CD127 CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD62L、CD69和CDRO的标志物具有特异性的A进行第一次筛选；和使用本公开的双特异性蛋白质复合物，例如使用对选自CD197(CCR7)、CD62L、CD69和CD45的标志物具有特异性的A进行第二次筛选。
自然杀伤细胞可以对标志物CD16、CD56、CD31、CD30、CD38 CD94、CD96、CD158、CD159、CD162R、CD223、CD244是阳性的并且对CD3是阴性的。
在这类细胞上表达的单核细胞/骨髓细胞或单核细胞/骨髓细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小的肽)可以是但不限于CDw12、CD13、CD14、CD33、CD64、CD11、CD112、CD115、CD163、CD204等。
在这类细胞上表达的树突细胞或树突亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小的肽)可以是但不限于CD85、CD205、CD209等。
在这类细胞上表达的嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小的肽)可以是但不限于CD66a、CD66c、CD170等。
在这类细胞上表达的嗜碱性粒细胞或嗜碱细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小的肽)可以是但不限于表面IgE、CD123、CD203e、FceR1a等。
在这类细胞上表达的嗜酸性粒细胞或嗜酸性粒细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小的肽)可以是但不限于siglec-8、CD294等。
在这类细胞上表达的肥大细胞或肥大细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的小肽)可以是但不限于表面IgE、FceR1a、CD117等。
在这类细胞上表达的血小板/巨核细胞或血小板/巨核细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小肽)可以是但不限于CD41、CD42a/b/c/d、CD51、CD110等。
在这类细胞上表达的造血祖细胞或造血祖细胞亚群抗原(作为整个蛋白质或整个蛋白质的较小肽)可以是但不限于CD34、CD46、CD55、CD90、CD100、CD117、CD123、CD127、CD243、CD338、SSEA-3、SSEA-5、TRA-1-81、TRA-2-49、TRA-2-54等。
包括脑/神经系统，内分泌系统，血液/免疫系统，肝脏，肾脏，心脏和骨骼肌肉，皮肤/骨骼/关节，胃肠道，肺，男性组织和女性组织的所有组织或细胞亚群上的表面标志物。
其中细胞表达肿瘤抗原的表面标志物，例如选自包括erbB-2、CEA、NCAM、GD2、CD33、CD44、CD70、EpCAM、CD19、CD20、KDR、Tag-72等的列表。
在一个实施方案中，采用多于两个的选择。
在一个实施方案中，在进行第二选择之前进行第一选择(即，依次进行选择)。
在一个实施方案中，第一选择和第二选择同时进行，例如作为多重复合物，并且不同的标记，例如不同的荧光团被用于两个或更多个选择。有利的是，当作为多重复合物进行选择时，可以基本上在一个步骤中分离期望的细胞群。
因此，在一个实施方案中，本公开的双特异性蛋白质复合物可以用于基于其分泌表型来鉴定细胞群。这样的一个实例是俘获CD4阳性T细胞上的IL-17以鉴定或分离与自身免疫的发作和维持有关的T辅助细胞17。
不希望受理论束缚，认为CD4和CXCR3和/或CD4和CXCR5表达可能在自身免疫疾病中被扭曲。CD4和CCR6表达可能在器官特异性自身免疫性疾病中被扭曲。CD8表达可能在GVHD中被扭曲。CD4、CCR4、Crth2表达可能在变态反应和哮喘中被扭曲。
本公开的抗体形式使得双特异性蛋白质复合物可以容易地组装，并且这些可以用于筛选患者(和来自其中的离体样品，例如血样)以获得对疾病机制和/或预后以及/或定义的患者亚群的洞察和/或将患者分配给亚群。
可以快速地制备本公开的抗体复合物，其包括单一结构域抗体sdAb作为对细胞表面标志物具有特异性的A(通过所述细胞表面标志物将所述复合物锚定在必需细胞的表面上)与另一个sdAb作为对如下具有特异性的B的组合：
·分泌自细胞的可溶性因子，或
·抗原。
因此，根据本公开的双/多特异性形式可用于细胞和细胞群的检测、鉴定、分离(isolation)、分离表征(separation characterisation)和/或定量。
在一个实施方案中，A独立地选自抗原，配体，受体，全长抗体，Fab片段，Fab'片段，sdAb，VH，VL和scFv，例如全长抗体，Fab片段，Fab'片段，sdAb，VH，VL和scFv，特别是Fab，scFv或sdAb。
在一个实施方案中，蛋白质成分A是蛋白质，例如在细胞表面表达的受体的配体。
优选地，A是scFv或Fab片段。
在一个实施方案中，蛋白质成分B独立地选自抗原，配体，受体，全长抗体，Fab片段，Fab'片段，sdAb，VH，VL和scFv，例如全长抗体，Fab片段，Fab'片段，sdAb，VH，VL和scFv，特别是Fab，scFv或sdAb。
应当理解，本方法也可用于当由蛋白质成分A或B代表的抗体或结合片段结合也由细胞分泌的感兴趣的可溶性分子结合的抗原的情况下，例如如图3和4所示的。
优选地，B是scFv或Fab片段。
在一个实施方案中，蛋白质成分B是蛋白质，例如配体或可溶性受体。
在一个实施方案中，成分B是可以直接俘获感兴趣的可溶性分子的抗原，例如如图7所示。
在一个实施方案中，X任选通过接头融合至蛋白质成分A的C末端，例如融合至抗体或其结合片段的重链的C末端，例如由A表示的Fab片段或Fab'片段中的重链C末端。
在一个实施方案中，X任选地通过接头融合至抗体或其结合片段、例如由A表示的Fab片段或Fab'片段的轻链的C末端。
在一个实施方案中，X通过接头、特别是本文公开的接头连接。
在一个实施方案中，Y任选地通过接头融合至蛋白质成分B的C末端，融合至抗体或其结合片段的重链的C末端，例如由B代表的Fab片段或Fab'片段中的重链。
在一个实施方案中，Y任选地通过接头融合至由B表示的Fab片段或Fab'片段中的轻链的C末端。
在一个实施方案中，X任选地通过接头与Fab片段或Fab'片段中的scFv的N末端或重链的N末端融合，无论哪一个由A表示。
在一个实施方案中，Y任选地通过接头与由B代表的scFv的N末端融合。
在一个实施方案中，变量X是抗体结合片段，例如Fab片段，Fab'片段，scFv，Fv，VH，VL或sdAb(特别是Fab，scFv或sdAb)，并且Y变量是抗原，例如肽。
在一个实施方案中，变量Y是抗体结合片段，例如Fab片段，Fab'片段，scFv，Fv，VH，VL或sdAb(特别是Fab，scFv或sdAb)，并且X是抗原，例如肽。
在一个实施方案中，变量X或Y是Fab片段，Fab'片段，scFv或sdAb，而另一个变量是肽，例如对肽GCN4(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的氨基酸1-38)具有特异性的Fab片段，Fab'片段，scFv或sdAb。
在一个实施方案中，变量X或Y是scFv或sdAb，而另一个变量是肽。在一个实施方案中，X或Y是scFv 52SR4(SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3、99或100的氨基酸1-243，如表1A中所示)。可以理解，当X或Y是结合GCN4的Fab或Fab'片段时，其可以包含来自scFv 52SR4的VH和VL区。
在一个实施方案中，X独立地选自scFv、sdAb和肽，条件是当X是肽时，Y是抗体或其结合片段，例如scFv或sdAb，并且当X是scFv或sdAb时，则Y是抗原，如肽。
在一个实施方案中，Y独立地选自scFv、sdAb和肽，条件是当Y是肽时，X是抗体或结合片段，例如scFv或sdAb，并且当Y是scFv或sdAb时，则X是抗原，如肽。
在一个实施方案中，X或Y是肽GCN4(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的氨基酸1-38)或其表位片段。编码根据SEQ ID NO：1的GCN4肽的核苷酸序列在SEQ ID NO：1A中显示为SEQID NO：2(表1A)。
表1A
GCN4肽的其他变体如表1B中所示(SEQ ID NO:75-97)，其中粗体形式的氨基酸是任选的且斜体形式的氨基酸形成接头的序列。
表1B
应当理解，A-X和Y-B融合物可以以各种方向产生，这意味着编码这类融合物的多核苷酸构建体可以被设计为在两个方向上表达X或A(A-X，其中A的C末端融合到X的N末端，或X-A，其中X的C末端融合到A的N末端)。这同样适用于Y-B融合物。
与A、X、Y或B是否位于融合物的N末端无关，产生这类融合物的多核苷酸序列将包含设计用于编码在融合物的极N末端信号肽序列的核苷酸序列，以便辅助胞外释放。信号肽最终从成熟融合物中切割下来。表1A中显示了具有SEQ ID NO：101-104的优选的信号肽序列。
在一个实施方案中，X通过接头、特别是本文公开的接头连接。
在一个实施方案中，Y通过接头、特别是本文公开的接头连接。
在一个实施方案中，接头选自AAASGGG SEQ ID NO:74、ASGGG SEQ ID NO:73、ASGGGG SEQ ID NO:71、SGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:18和SGGGGSGGGGSGGGGSGGGS SEQID NO:75。
当A或B是Fab且相应的X或Y是肽时，各自X或Y的接头可以为例如ASGGG或ASGGGG或AAASGGG SEQ ID NO:72。
当A或B是scFv且相应的X或Y是肽时，接头可以为例如ASGGG或ASGGGG或AAASGGG。
当A或B是scFv且相应的X或Y是scFv或sdAb时，接头可以例如选自SGGGGSGGGGSGGGGS和SGGGGSGGGGSGGGGSGGGS。
在一个实施方案中，X或Y是长为5至25个氨基酸的肽。
在一个实施方案中，X与Y之间的结合亲和力为5nM或更强，例如900pM或更强，例如800、700、600、500、400或300pM。
本公开的双特异性蛋白质复合物适用于筛选，因为不存在表达单位A-X或单位B-Y的困难。每个单位(A-X或B-Y)表达后所需的纯化量最小或实际上是不必要的。双特异性复合物可以通过简单混合相关单位而以1:1摩尔比形成，即不依赖于缀合和偶联化学。结合配偶体X和Y驱动平衡，有利于形成必需的异二聚体双特异性复合物。此外，在异二聚化后形成复合物后，几乎不需要或无需纯化。因此可以容易地制备和组合大量的A-X和B-Y。
在一个实施方案中，A和/或B包含Fc区。
在一个实施方案中，本公开的构建体中的A和/或B缺乏Fc区。
在一个实施方案中，用于根据本公开的双特异性蛋白质复合物中的一种或多种scFv是二硫化物稳定的。
制备和筛选缺乏Fc片段CH2-CH3的双特异性复合物的能力还确保所观察到的生物学活性实际上仅归因于复合物中的可变区对。本发明的双特异性复合物的简单性及其制备方法在表征、分离目的等的快速和充分筛选的情况下是巨大的优势。
在一个实施方案中，使用标记的蛋白质检测蛋白质成分B对感兴趣的可溶性分子的俘获。标记蛋白质可以是抗原、抗体或其结合片段，例如全长抗体。
在一个实施方案中，在将复合物导入细胞用于分析之前，通过体外混合A-X和B-Y制备异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物A-X：Y-B。因此在一个实施方案中，该方法包括使A-X和B-Y接触的体外混合步骤。
在一个实施方案中，将成分A-X和B-Y作为分开的融合蛋白导入，但几乎同时被导入细胞以用于分析并且在它们添加到细胞样品之后一起形成复合物A-X:Y-B。
在一个实施方案中，首先将A-X或B-Y添加到细胞中用于分析，然后分别添加相应的试剂B-Y和A-X。时间差可以是例如15分钟至24小时。只有在加入第二种融合蛋白后，复合物A-X:Y-B才形成。
在一个实施方案中，平行使用根据本公开的多个双特异性蛋白质复合物，例如A可以具有固定的特异性并且使用蛋白质成分B中具有不同特异性的多种B-X。或者，B可以具有固定的特异性，并且A的特异性可以变化。或者，A和B二者都可以变化。
在一个实施方案中，本公开的方法以网格形式进行。
在一个实施方案中，本公开的方法以多重复合物形式进行。
在一个实施方案中，本公开的方法是离体/体外的。
因此，在一个实施方案中，融合蛋白A-X和B-Y不在同一细胞中共表达。这是有利的，因为其允许例如100个融合蛋白表达和任选纯化，并且随后以各种排列(permutation)混合100个融合蛋白能够提供10,000个异二聚体系连的双特异性蛋白复合物，其中5,000个是独特的对。
相反，某些现有技术方法需要双特异性的共表达，因此对于10,000个复合物，需要10,000次转染、表达和纯化。
然而，技术上更具挑战性的明显替代方案包括在同一个细胞中表达A-X和B-Y。
有利地，这意味着融合蛋白A-X和Y-B能够通过简单地将融合蛋白混合在一起而容易地组装成双特异性蛋白复合物。因此，本公开的双特异性蛋白复合物具有模块化结构，其允许两种不同的蛋白质容易组装，以便以例如网格样方式产生具有抗原结合特异性的不同组合的双特异性蛋白质复合物的大组排列。这允许有效和系统地筛选大量的双特异性蛋白质复合物以检测附加、协同或新型生物学功能。
鉴于X和Y是彼此特异性的，这显著降低了形成同二聚体的能力。X和Y在本文中统称为结合对或结合配偶体。在一个实施方案中，X对其它X不具有高亲和力。在一个实施方案中，Y对其它Y不具有高亲和力。有利地，X和Y不形成同二聚体，这防止不期望的单特异性蛋白质复合物的形成，提高期望双特异性蛋白质复合物的产率，并且消除了对繁琐的纯化步骤以去除单特异性蛋白质复合物的需求。
这允许具有不能通过大多数现有技术方法有效获得的产率和/或纯度的双特异性蛋白质复合物的快速组装，特别是现有技术方法通常需要充分的纯化步骤。在本发明中双特异性复合物的产率典型地为75％或更高。
此外，可以平行研究给定抗原或表位的多个结合区(例如可变区)以鉴定生物学功能中的细微差别。这允许针对给定的一对抗原的可变区序列的组合进行研究和优化。
有利地，X和Y成分允许包含由融合蛋白的不同排列构成的双特异性蛋白质复合物的多重复合物来迅速且容易地组装。
本方法不依赖关于生物功能的预先设想的理念。另外，本方法在俘获感兴趣的可溶性分子时可以诱导或阻止对检测到的细胞的后续生物学功能，例如抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡。
附图描述
图1显示与肽-Fab(图中Y-B相应标记的Fab-Y)复合的Fab-scFv(图中A-X相应标记的Fab-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)，且Fab B结合从细胞分泌的免疫球蛋白(对其具有特异性)，并且检测系统是结合例如从细胞分泌的免疫球蛋白的恒定区的标记抗体。
图2显示与scFv-Fab(图中Y-B相应标记的Fab-Y)复合的Fab-肽(图中A-X相应标记的Fab-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)，且Fab B结合从细胞分泌的免疫球蛋白(对其具有特异性)，并且检测系统是标记抗体，例如从细胞分泌的免疫球蛋白的恒定区。
图3显示与肽-Fab(图中Y-B相应标记的Fab-Y)复合的Fab-scFv(图中A-X相应标记的Fab-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)并且Fab B结合也由细胞分泌的免疫球蛋白结合的抗原(对其具有特异性)，并且检测系统是标记抗体。Fab B和分泌的免疫球蛋白结合抗原上的不同表位。
图4显示与scFv-Fab(相应的Y-B)复合的Fab-肽(相应的A-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)并且Fab B结合也由细胞分泌的免疫球蛋白结合的抗原(对其具有特异性)。Fab B和分泌的免疫球蛋白结合抗原上的不同表位。
图5显示与肽-Fab(相应的Y-B)复合的Fab-scFv(相应的A-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)并且Fab B结合从细胞分泌的免疫球蛋白(对其具有特异性)，并且检测系统是结合也由细胞分泌的免疫球蛋白结合的抗原(也是任选标记的)的标记抗体。即标记的抗体间接标记分泌的免疫球蛋白。
图6显示与scFv-Fab(相应的Y-B)复合的Fab-肽(相应的A-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)并且Fab B结合从细胞分泌的免疫球蛋白(对其具有特异性)，并且检测系统是结合也由细胞分泌的免疫球蛋白结合的抗原(也是任选标记的)的标记抗体。即标记的抗体间接标记分泌的免疫球蛋白。
图7显示与肽-抗原(相应的Y-B)复合的Fab-scFv(相应的A-X)，其中Fab A与细胞表面受体结合(对其具有特异性)，并且由细胞分泌的免疫球蛋白特异性地结合抗原B，并且检测系统是标记的抗体，其结合例如分泌的免疫球蛋白的恒定区。
图8显示与scFv-抗原(相应的Y-B)复合的Fab-肽(相应的A-X)，其中Fab A与细胞表面受体结合(对其具有特异性)，并且由细胞分泌的免疫球蛋白特异性地结合抗原B，并且检测系统是标记的抗体，其结合例如分泌的免疫球蛋白的恒定区。
图9A显示与肽-Fab(相应的Y-B)复合的Fab-scFv(分别为A-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)并且抗原B特异性地结合由细胞分泌的分子，并且检测系统是结合可溶性分子的标记的抗体。Fab B和检测标记抗体结合可溶性分子上的不同表位。
图9B显示与scFv-Fab(相应的Y-B)复合的Fab-肽(分别为A-X)，其中Fab A结合细胞表面受体(对其具有特异性)并且抗原B特异性地结合由细胞分泌的分子，并且检测系统是结合可溶性分子的标记的抗体。Fab B和检测标记抗体结合可溶性分子上的不同表位。
图10是显示根据本发明的双特异性蛋白质复合物的一般结构和组装的示意图。
图11是显示形成根据本发明双特异性蛋白质复合物的卡通图，其中A是在其C末端融合有由52SR4scFv表示的X的Fab，且B是在其C末端融合有由GCN4肽(7P14P)表示的Y的Fab。
图12抗体复合物结合的流式细胞术检测。
图13 52RS4scFv的针对GNC4肽的SPR亲和力测定。
图14纯化的Fab-X(VR4247)和纯化的Fab-Y(VR4248)的尺寸排阻色谱图。
图15显示纯化的Fab-X(VR4130)和Fab-Y(VR4131)的尺寸排阻色谱图。
图16在500μg/ml、50μg/ml和5μg/ml浓度下一对一混合物的Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131)的尺寸排阻色谱图。
图17人IgG结合。
图18抗CD138结合浆细胞。
图19模拟转染的细胞是实心黑色条，仅CD138转染的细胞是垂直黑色线，仅IgG转染的细胞是水平黑色线，且双重转染的(CD138和IgG)细胞是具有黑色点的条。
图20CD138 Fab-Y显示为实心黑色条，且CD45 Fab-Y显示为斜条纹条。单独的二抗显示为白色条。
图21白色条显示T细胞IgG俘获，而实心黑色条显示浆细胞俘获。
关注这些图的变化形式，其中检测是标记的蛋白质，例如结合部分蛋白质成分A或B的抗体。
关注这些图的变化形式，其中检测是标记的蛋白质，例如在图6中，其中使用标记的抗原且然后必然使用进一步标记的抗体。
详细描述
如本文中使用的“双特异性蛋白质复合物”是指包含两种蛋白质(分别为双特异性物质的在本文中称为双特异性成分、在本文中也称为第一种蛋白质成分和第二种蛋白质成分的A和B)的分子，它们通过异二聚体系链彼此保持在一起。在一个实施方案中，所述蛋白质的一种或两种具有结合结构域，例如所述蛋白质的一种或两种是抗体或其片段(特别是Fab或Fab'片段)。
如本文所用的“融合蛋白”包含与结合配偶体X或Y融合的蛋白质成分A或B(如果适合)。在一个实施方案中，融合蛋白是通过重组技术从遗传构建体表达、例如在宿主中从DNA构建体表达的翻译蛋白。在本公开的上下文中，融合蛋白的关键特征之一在于其能够表达为来自细胞的“单一蛋白质/单位”(当然，在包含Fab/Fab'片段的融合蛋白的情况下将是两条链，但为了本说明书的目的，这将被认为是具有一条链的单一蛋白质，如果适合，典型地重链在其C末端任选地通过如下文所述的接头与X或Y融合)。
异二聚体系链X：Y的功能在于保持蛋白质A和B彼此靠近，使得能够例如采用本文所述的方法实现或鉴定A和B的协同功能。
如本文所用的“异二聚体系链”是指包含两个不同的结合配偶体X和Y的系链，其在彼此之间形成具有足以将两个结合配偶体保持在一起的总体亲和力的相互作用:(例如结合)。在一个实施方案中，X和/或Y不适合形成同二聚体。
异二聚体系连和异二聚体系链在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，如本文所用的“不适合形成同二聚体”是指形成X-Y异二聚体比一旦形成同二聚体更为优选，例如更稳定，例如热力学稳定。在一个实施方案中，X和Y之间的结合相互作用是单价的。
在一个实施方案中，X-Y相互作用比X-X或Y-Y相互作用更有利。当混合融合蛋白A-X和B-Y时，这减少了同二聚体X-X或Y-Y的形成。典型地，以1:1摩尔比混合后形成大于75％的异二聚体。
如果期望，则可使用例如柱色谱法的纯化步骤(特别是一步纯化)，例如来纯化根据本公开的融合蛋白和/或双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，尽管通常聚集水平低，还是在表达每种融合蛋白后提供纯化步骤。因此，在一个实施方案中，在体外混合之前，融合蛋白以基本上纯的形式提供。如本文所用的基本上纯的形式是指其中融合蛋白是90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的单体。
在一个实施方案中，不进行一种或多种融合蛋白的纯化。
在一个实施方案中，每种融合蛋白单位在不同的表达实验/运行中表达。
在一个实施方案中，在混合产生双特异性蛋白质复合物之前不进行融合蛋白的纯化。在一个实施方案中，在混合之前和/或之后不进行融合蛋白的纯化。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物形成后不需要纯化。
在一个实施方案中，在混合并且通常不经进一步纯化之后，组合物的至少50％是期望的双特异性蛋白质复合物，例如组合物的至少60、65、70、75、80％是所需的双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，本方法的体外混合步骤中使用的融合蛋白之比为A-X比B-Y是0.8:1至3:1，例如1.5:1或2:1。
在一个实施方案中，在本方法的体外混合步骤中使用的融合蛋白之比为B-Y比A-X是0.8:1至3:1，例如1.5:1或2:1，特别是摩尔比。
在一个实施方案中，在体外混合步骤中使用的A-X与B-Y之比为1:1，特别是1:1的摩尔比。
本公开还扩展至制备根据本公开的双特异性复合物的方法，包含将融合蛋白A-X和B-Y例如以1:1的摩尔比混合。
在一个实施方案中，混合发生在体外。
在一个实施方案中，混合发生在含有用于分析的细胞的样品中，即在导入个体融合蛋白后融合蛋白A-X和B-Y彼此相互作用。
在一个实施方案中，混合发生在体内，即融合蛋白A-X和B-Y在受试者体内彼此相互作用以形成异二聚体系链，并因此形成双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，X和Y彼此完全具有特异性，并且不与细胞内或受试者体内的任何其它肽/蛋白质结合。这可以通过例如确保X和Y不天然存在于靶细胞或靶受试者体内来实现。这可以通过例如将X或Y选择为来自与受试者不同的物质或实体(例如酵母蛋白)并确保其它变量对其是特异性的来实现。有利地，这防止融合蛋白A-X和/或B-Y与不期望的靶标结合并由此产生不需要的脱靶效应。
在一个实施方案中，结合配偶体之一(或至少一个)不能形成同二聚体，例如突变结合配偶体的氨基酸序列以消除或最小化同二聚体的形成。
在一个实施方案中，两个结合配偶体都不能形成同二聚体，例如突变肽结合配偶体的氨基酸序列以消除或最小化同二聚体的形成，并且使用对其具有特异性的sdAb。
本文所用的不能形成同二聚体或聚集体是指形成同二聚体或聚集体的低或零倾向。如本文所用，低是指例如在混合或表达或纯化后5％或更少，例如4、3、2、1、0.5％或更少的聚集体。
融合蛋白中的少量聚集体或异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物中的残余物通常对本公开的筛选方法具有最低限度的影响。因此，在一个实施方案中，本方法中不使用融合蛋白和/或双特异性蛋白质复合物的纯化，特别是在混合步骤之后。
在一个实施方案中，：是基于吸引力(例如范德华力)的结合相互作用，例如氢键合和静电相互作用，特别是基于对抗原(例如肽)的抗体特异性。
在一个实施方案中，：是由特定化学相互作用(例如点击化学)形成的共价键。在一个实施方案中，：不是共价键。在一个实施方案中，不使用缀合/偶联化学来制备本公开的双特异性蛋白质复合物。
如本文所用，“形成复合物”是指包括结合相互作用或化学反应的相互作用，当融合蛋白成分A-X和B-Y在组装复合物的适当条件下接触且融合蛋白保持在一起时，所述相互作用是充分特异性的和强烈的。
本文使用的“保持在一起”是指将成分(融合蛋白)保持在彼此附近，使得在X：Y结合之后，可以将处理复合物，如同其为一个分子，并且在许多情况下表现为并像单一分子一样起作用。在一个实施方案中，保持使复合物适用于本文公开的方法，即适用于至少一种功能性筛选。
本文采用的特异性是指，其中例如相互作用中的配偶体，例如，X：Y或A与抗原或B与抗原仅识别彼此或与非配偶体相比具有显著更高的彼此亲和力，例如是与结合无关非配偶体蛋白质的背景水平的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍的亲和力。
如本文所用的关于X和Y的特异性指其中与非配偶体相比，相互作用中的结合配偶体X和Y仅彼此识别或具有显著更高的彼此亲和力，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上的亲和力。
在一个实施方案中，所述结合相互作用是可逆的。在一个实施方案中，所述结合相互作用是基本上不可逆的。
如本文所用，基本上不可逆是指抗体或结合片段的缓慢的解离速率(解离常数)。
在一个实施方案中，X与Y之间的结合相互作用具有低解离常数。
低解离常数的实例包括1-9×10-2s-1或以下，例如1-9×10-3s-1、1-9×10-4s-1、1-9×10-5s-1、1-9×10-6s-1或1-9×10-7s-1。特别适合的解离常数包括2×10-4s-1或以下，例如1×10-5s-1、1×10-6s-1或1×10-7s-1。
尽管不希望受理论束缚，但认为低解离常数(也称为解离速率)允许分子足够稳定以使双特异性蛋白质复合物有用、特别是应用于功能性筛选测定中。
在一个实施方案中，X和Y彼此的亲和力为5nM或更强，例如900pM或更强，例如800、700、600、500、400、300、200、100或50pM或更强。
亲和力是根据实体的结合和解离速率计算的值。如本文所使用的，术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如肽)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子对其结合配偶体的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测定，包括本文所述的那些，例如表面等离子体共振方法，特别是BIAcore。
然而，将复合物保持在一起的能力不仅关乎亲和力。虽然不希望受到理论的束缚，但我们推定实际上存在三种重要成分：结合速率，解离速率和亲和力。亲和力的计算基于结合速率和解离速率。因此，如果结合速率低并且解离速率快，则亲和力将很低并且会不足以将双特异性蛋白质复合物保持在一起。但是，缓慢的结合速率可以通过缓慢的解离速率来补偿，从而得到总体适合的亲和力。在一些实施方案中，高结合速率可能足以将复合物保持在一起。
如果复合物中使用的结合配偶体(X和Y)具有缓慢的结合速率，则在混合所述成分以允许复合物形成之后可能需要额外的时间。
如果结合配偶体之间的亲和力足够高，则即使双特异性蛋白质复合物的蛋白质(A和B)的亲和力仅与它们的靶标弱结合，双特异性蛋白质复合物也可能执行其期望的生物学功能。相反，如果蛋白质(A和B)能够与其靶标强力结合，则即使结合配偶体(X和Y)彼此的亲和力较低，也可能实现相同的生物学功能。换言之，存在“三位一体”关系，使得结合配偶体之间的较高亲和力可以补偿对靶标的较低亲和力，且反之亦然。
在一个实施方案中，重链中的恒定结构域(例如CH1)与轻链中的恒定结构域(例如Cκ)之间的相互作用有助于根据本公开的双特异性复合物的形成和/或稳定性。因此，在本公开的双特异性复合物的某些实施方案中使用Fab或Fab'片段是有益的。
在一个实施方案中，本公开的双特异性复合物不包含具有效应功能的成分，例如该复合物不包含除CH1和Cκ或Cλ外的恒定结构域，特别是不包含独立地选自包含CH2、CH3、CH4及其组合的组的恒定结构域。在一个实施方案中，本公开的双特异性复合物缺乏Fc区。
细胞表面标志物是部分(moiety)，例如在细胞表面上表达的蛋白质，其可以单独使用或与其它表面标志物组合使用来鉴定和/或分离细胞。所述标志物可以与细胞的谱系或细胞的活化状态、细胞表达的分子等相关。
本文使用的感兴趣的可溶性分子是指由细胞分泌的分子，其中分泌后所述分子不发生体内沉淀。由细胞分泌的可溶性分子的实例在本文中提供，并且包括激素，细胞因子，趋化因子，化学引诱物，白三烯，前列腺素，血管活性胺，酶，补体和补体片段，脂质，鞘脂，第二信使成分(例如；一氧化氮，cAMP等)，维生素，矿物质，阳离子，阴离子，糖，凝血因子，急性期蛋白质，γ球蛋白(包括免疫球蛋白)，白蛋白，可溶性细胞膜受体，细胞表达蛋白质的剪接变体，核酸，小膜囊泡(例如外来体，微泡，脂质体等)，分泌肽，免疫复合物和来自死亡或垂死细胞的胞内蛋白质。
如本文所用，“多重复合物”指基本上同时在同一锅(pot)中组合本公开的多个双特异性蛋白质复合物，例如使得要求来自相同分析的读数需要进行解卷积。
在一个实施方案中，同时指的是伴随分析，其中信号输出基本上同时被仪器分析。该信号可能需要解卷积来解释所获得的结果。
有利地，测试多个双特异性蛋白质复合物允许更有效地筛选大量的双特异性蛋白质复合物，用于鉴定分泌分子的细胞以及因此鉴定新的和令人感兴趣的生物学机制。
在一个实施方案中，所述多重复合物包含2至数十万个异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物，例如2至500,000个所述复合物，例如2至100,000个或2至10,000个，特别是通过在网格中混合2至100个第一种和第二种融合蛋白(A-X和B-Y)产生的复合物。在一个实施方案中，多重复合物包含例如2至1,000，例如2至900、2至800、2至700、2至600、2至500、2至400、2至300、2至200、2至100、2至90、3至80、4至70、5至60、6至50、7至40、8至30、9至25、10至20个或15个双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，该多重复合物中异二聚体系连的双特异性蛋白质的数目是n2，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多。
在一个实施方案中，该方法在网格或阵列中进行，例如微量滴定板，其中微孔板的每个孔可以含有不同的双特异性蛋白质复合物。所述双特异性蛋白质复合物可以被系连在固体支持物表面上，例如附着到珠上，或者它们可以悬浮在液体(例如溶液或介质)形式中，例如在孔内或在液滴内。
在一个实施方案中，多重复合物中的每个“A”都是不同的蛋白质，优选与靶抗原结合的抗体或其结合片段，并且每个“B”是不同的蛋白质，优选与靶抗原结合的抗体或其结合片段。
在一个实施方案中，如下面讨论的在网格中提供多重复合物，例如分别等于64、256或320个样品的8×8、16×16或16×20。
本文使用的“网格”是指二维图或阵列，其中一个变量例如(在A-X中的)蛋白质A沿着一个轴(例如X轴(水平轴))变化，而另一个变量例如(在B-Y中的)蛋白质B沿着另一个轴(例如Y轴(垂直轴))变化。这种排列(arrangement)有助于系统地评估变量的各种组合(排列(permutation))。
在一个实施方案中，将阵列提供在96孔板上，且分析的样品可以是其倍数，即96、192、384等。
有利地，网格排列对于有效筛选根据本公开的双特异性蛋白质复合物的生物学功能是特别有利的。图3显示了这类网格的一个实例，其中4个第一种融合蛋白可以容易地与4个第二种融合蛋白组合以产生16个双特异性蛋白复合物。
筛选网格的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的，例如第一种融合蛋白(A-X)中的第一种蛋白质(A)可保持恒定，而第二种融合蛋白(B-X)中的第二种蛋白质(B)是可变的。这对于快速筛选大量不同的第二种蛋白质与预先选择的第一种蛋白质的协同作用功能是有用的。
在另一个实施方案中，通过改变蛋白质A的抗体可变区使得蛋白质A沿着一条轴变化，使得每个抗体变体对相同抗原具有特异性，但具有可变区的不同组合。蛋白质B可以保持恒定，或者也可以以相同的方式变化，或使得对B蛋白质的抗原特异性改变而变化(横穿网格或沿网格向下)。
在一个实施方案中，根据本公开的“共同”第一种融合蛋白(A-X)可存在于每个孔内。然后可以将根据本公开的一系列不同的第二种融合蛋白(B-Y)分配到每个孔中。随后，两个结合配偶体(X和Y)的特异性结合相互作用以物理方式使两种融合蛋白彼此在一起形成双特异性蛋白质复合物。这产生包含双特异性蛋白质复合物的阵列，所述双特异性蛋白质复合物全部结合第一种靶细胞抗原(通过A结合)，但也能够结合第二种可溶性靶抗原(通过B结合)，这对于每个双特异性蛋白质复合物可以不同。
在一个实施方案中，A-X融合蛋白包含针对相同的细胞表面靶抗原不同的可变区，从而当与A-X中的可变区组合时允许优化B结合的给定靶抗原的可变区和/或表位。
在一个实施方案中，B-Y融合蛋白包含针对相同的可溶性靶抗原不同的可变区，从而当与A-X中的可变区组合时允许优化B结合的给定靶抗原的可变区和/或表位。
本领域技术人员也知晓上述的不同变化，使得可以容易地控制多重复合物中每个位置处的双特异性蛋白质复合物的期望特异性。当这种多重复合物用于结合和功能测定时，这允许有效筛选双特异性蛋白质复合物的不同组合。在一个实施方案中，采用因子设计来定义网格中采用的变量。
在一个实施方案中，本公开的方法有助于高通量分析。
在一个实施方案中，平行或基本上同时测试多种双特异性蛋白质复合物。
可以使用例如FACS、磁珠、微流体或本领域可用的另一种方法的技术来分选通过本公开的方法鉴定的细胞。
在一个实施方案中，结合对的第一种结合配偶体X和第二种结合配偶体Y中的至少一种独立地选自肽和蛋白质；例如第一种结合配偶体或第二种结合配偶体是肽。
合适的肽包括包含GCN4、Fos/Jun(人和鼠Fos分别具有Uniprot编号P01100和P01101以及人和鼠jun分别具有Uniprot编号05412和05627)、相当于人流感血凝素的氨基酸98至106的HA-标签、聚组氨酸(His)、c-myc和FLAG的组。其它肽也被认为适合用于本公开，并且特别适合的肽是适用于蛋白质纯化的亲和标签，因为这类肽具有以高亲和力与其相应的结合配偶体结合的趋势。
在一个实施方案中，所述肽不是E5B9。
如本文所用，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物，其中所述肽含有2至100个氨基酸，例如5至99个，例如6至98个，7至97个，8至96个或5至25个。在一个实施方案中，本公开中使用的肽是具有50个氨基酸残基或更少，例如40、30、20、10或更少的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述蛋白质是抗体或抗体片段。
如本文所使用的术语“抗体”是指能够经由位于免疫球蛋白分子的可变区中至少一个抗原识别位点(本文中也称作本文的结合位点)与靶抗原例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、肽等特异性结合的免疫球蛋白分子。
如本文所用，“抗体分子”包括抗体及其结合片段。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”是指天然存在的或人造的抗体的片段，包括但不限于Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、单一结构域抗体(sdAb)、scFv、二、三或四价抗体、双-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任意的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于生成和制造这些抗体片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Verma等人,1998,Journal of ImmunologicalMethods,216:165-181)。用于本公开的其它抗体片段包括国际专利申请WO05/003169、WO05/003170和WO05/003171中所述的Fab和Fab’片段。多价抗体可以包含多特异性，例如双特异性，或可以为单特异性(参见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。
如本文所用，“抗原结合片段”是指能够以足够的亲和力结合靶肽或抗原的片段，以便将所述片段表征为对所述肽或抗原具有特异性。
如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段(包含轻链(CL)的VL(可变轻链)结构域和恒定结构域)以及重链的VH(可变重链)结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。在一个实例中，Fab片段的重链序列在CH1的链间半胱氨酸处“终止”。在一个实施方案中，本公开的融合蛋白(诸如A-X和/或B-Y)中使用的Fab片段是单价的。
如本文所用的Fab'片段是指还包含全部或部分铰链区的Fab片段。在一个实施方案中，本公开的融合蛋白(诸如A-X和/或B-Y)中使用的Fab'片段是单价的。
如本文所用，术语“单链Fv”或缩写为“scFv”是指包含经连接(例如通过肽接头)以形成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在该形式中省略重链和轻链的恒定区。本文使用的单链Fv包括其二硫键稳定的形式，其中除了肽接头以外，在可变区之间还存在二硫键。
二硫键稳定的scFv可以消除一些可变区动态呼吸的倾向，这涉及可变区分开并再次聚集在一起。
如本文所用，术语“单结构域抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的实例包括VH或VL或sdAb。
如本文所用的术语“sdAb”或“单一结构域抗体”是指包含单一抗原结合结构域的分子。它们可以是人造的或天然存在的，并且包括但不限于仅VH，仅VL，骆驼科VHH，人结构域抗体，鲨鱼衍生的抗体例如IgNAR。
在一个实施方案中，抗体结合片段和/或双特异性抗体复合物不包含Fc区。如本文所用的“不包含Fc区”是指不存在较低的恒定结构域，诸如CH2、CH3和CH4。然而，可以存在恒定结构域，诸如CH1、Cκ/Cλ。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，并且抗体轻链包含CL结构域(κ或λ)。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且抗体轻链包含CL结构域(κ或λ)。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物的第一种蛋白质A和/或第二种蛋白质B是抗体或抗体片段。此类双特异性蛋白质复合物可被称为双特异性抗体复合物。
双特异性蛋白质复合物包含能够结合细胞表面的蛋白质和能够结合从细胞分泌的可溶性分子的蛋白质，它们通过X和Y系连在一起。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物是双特异性抗体复合物。
在一个实施方案中，如本文使用的“双特异性抗体复合物”是指包含至少两个抗体结合部位的双特异性蛋白质复合物，其中成分抗体、片段或两者通过异二聚体系链复合在一起。
如本文使用的复合通常是指其中A-X和B-Y通过相互作用X:Y系连在一起。
如本文所用的未复合是指其中A-X和B-Y是分开的分子。
在一个实施方案中，B和用于检测的标记抗体(例如抗体、片段或抗体和片段的组合)靶向相同的抗原，例如结合相同靶抗原上的两个不同表位。在另一个实施方案中，B和用于检测的标记抗体(例如抗体、片段或抗体与片段的组合)可以具有不同的抗原特异性，例如结合两种不同的靶抗原。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物中采用的每种抗体或片段包含一个结合位点，即每个结合位点对于每种靶抗原是单价的。
本文所用的抗原是指在适当条件下刺激机体产生抗体的分子，所述抗体针对所述分子。抗原通常是肽，蛋白质，糖蛋白，多糖，脂质和合成或天然存在的化学化合物或其组合。如本文所用，术语“抗原”优选指蛋白质，如糖蛋白或蛋白质与脂质的复合物，例如膜脂，且特别是指CD45和免疫球蛋白。用于融合蛋白(A-X或B-Y)的全长抗体或抗体片段可以是单特异性的、单价的、多价的或双特异性的。
有利地，使用两种双特异性抗体或抗体片段允许本公开的双特异性抗体复合物潜在地对至多4种不同抗原具有特异性(即复合物可以是四特异性的)。这允许研究亲合力类型效应。
在一个实施方案中，用于第一种融合蛋白(A-X)的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，特别是单价Fab、Fab'、scFv、Fv、sdAb或类似物。
在一个实施方案中，用于第二种融合蛋白(B-Y)的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，特别是单价Fab、Fab'、scFv或类似物。
如本文所用，“单特异性”是指仅结合一种靶抗原的能力。
如本文所用，“单价”是指具有单一结合位点并因此仅结合靶抗原仅一次的抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，用于第一种融合蛋白(A-X)的抗体或抗体片段是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，用于第二种融合蛋白(B-Y)的抗体或抗体片段是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，用于第一种融合蛋白(A-X)的抗体或抗体片段是单价的，并且用于第二种融合蛋白(B-X)的抗体或抗体片段是单价的。
在一个实施方案中，用于第一种融合蛋白(A-X)的抗体或抗体片段是单价的，并且用于第二种融合蛋白(B-Y)中的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，用于第一种融合蛋白(A-X)的抗体或抗体片段是多价的，并且用于第二种融合蛋白(B-Y)中的抗体或抗体片段是单价的。
在一个实施方案中，用于第一种融合蛋白(A-X)的抗体或抗体片段是多价的，并且用于第二种融合蛋白(B-Y)的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，A-X或B-Y不是包含两个scFv(一个对抗原CD33具有特异性并且一个对抗原CD3具有特异性)的融合蛋白，或不是可选择地对这两种抗原具有特异性的双特异性复合物形式。
在一个实施方案中，A-X或B-Y不是包含对与肽E5B9连接的CD3具有特异性的scFv(或备选另一种抗体形式)的融合蛋白。
本文使用的“结合结构域或位点”是接触抗原/表位并参与其结合相互作用的抗体部分。在一个实施方案中，结合结构域含有至少一个可变结构域或其衍生物，例如一对可变结构域或其衍生物，例如可变结构域的同源对或其衍生物。
在一个实施方案中，结合结构域包含3个CDR，特别是其中结合结构域是结构域抗体，例如VH、VL或sdAb。在一个实施方案中，结合结构域包含两个可变结构域和6个CDR和框架，并且这些元件一起有助于抗体或结合片段与抗原/表位的结合相互作用的特异性。
本文使用的“同源对(cognate pair)”是指作为预先形成的一对(couple)从宿主分离的重链和轻链对。该定义不包括从文库中分离的可变结构域，其中不保留来自宿主的原始配对。同源对可能是有利的，因为它们通常在宿主中亲和力成熟，因此可能对它们对其具有特异性的抗原具有高亲和力。
如本文所用的“天然存在结构域的衍生物”意指天然存在的序列中的1、2、3、4或5个氨基酸已经被替换或缺失，例如以诸如通过消除不期望的性质优化结构域的性质，但其中保留了结构域的表征特征。修饰的实例是去除糖基化位点、GPI锚或溶剂暴露的赖氨酸的那些修饰。这些修饰可通过用保守氨基酸取代替换相关的氨基酸残基来实现。
在一个实施方案中，加工本公开的双特异性抗体复合物或其抗体/片段组分以提供改善的对靶抗原的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟操作方案获得，包括突变CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)，大肠杆菌(E.coli)的增变株的使用(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等(同上)讨论了这些亲和力成熟的方法。
在一个实施方案中，第一种抗体或抗体片段(A)对第一种抗原具有特异性，并且第二种抗体或抗体片段(B)对第二种抗原具有特异性，并且通常第一种和第二种抗原是不同的。这提供了抗体复合物结合两种不同抗原的可能性，每种抗原位于不同的实体上，从而使两个实体彼此紧密物理接近。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物的第一种抗体/片段(A)、第二种抗体/片段(B)或第一种和第二种抗体/片段两者都可以是Fab。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物的第一种抗体/片段(A)、第二种抗体/片段(B)或第一和第二种抗体/片段两者都可以是Fab'。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物的第一种抗体/片段(A)、第二种抗体/片段(B)或第一和第二种抗体/片段两者都可以是scFv。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物的第一(A)或第二(B)抗体/片段或第一和第二种抗体/片段两者都是sdAb。
为了方便起见，本公开的双特异性蛋白质复合物在本文中被称为A-X:Y-B。A和B以及X和Y是被提及用于辅助解释本技术的标称标签。
如本文所用的“连接”是指经由接头(诸如肽接头，其实例在下文讨论)直接或间接连接。直接连接包括融合在一起(例如肽键)或化学缀合。
本文使用的“结合配偶体”是指结合对的一个组成部分。
在一个实施方案中，结合配偶体的亲和力是高的，5nM或更强，例如900、800、700、600、500、400、300pM或更强。
如本文所用，“结合对”是指彼此特异性结合的两个结合配偶体。结合对的实例包括肽和抗体或对其具有特异性的结合片段，或酶和配体，或酶和该酶的抑制剂。
在一个实施方案中，第一种结合配偶体(X)选自：全长抗体、Fab、Fab'、Fv、dsFv、scFv，其中sdAb的实例包括VH或VL或sdAb。
当X是抗体或其结合片段时，则Y是蛋白质或肽，特别是肽。
在一个实施方案中，第二个配偶体(Y)选自：全长抗体、Fab、Fab'、Fv、dsFv、scFv和sdAb，其中sdAb的实例包括VH或VL或sdAb。
当Y是抗体或其结合片段时，则X是蛋白质或肽，特别是肽。
在一个实施方案中，其中A是抗体或其片段，第一种结合配偶体(X)连接至第一种抗体或抗体片段的重链或轻链的C末端，例如第一种结合配偶体(X)连接至第一种抗体或抗体片段(A)的重链的C末端。
在另一个实施方案中，其中B是抗体或其片段，第二种结合配偶体(Y)连接至第二种抗体或抗体片段的重链或轻链的C末端，例如第二种结合配偶体(Y)连接至第二种抗体或抗体片段(B)的重链的C末端。
在一个实施方案中，X连接至抗体或片段(蛋白质A)的重链的C末端，并且Y连接至抗体或片段(蛋白质B)的重链的C末端。
在一个实施方案中，X通过接头(例如ASGGGG SEQ ID NO:71或ASGGGGSG SEQ IDNO:72或ASGGG SEQ ID NO:73或AAASGGG SEQ ID NO:74)或本领域已知或下文描述的任意其它适合的接头连接至抗体或片段(蛋白质A)的重链的C末端，并且Y通过接头(例如ASGGGGSEQ ID NO:71或ASGGGGSG SEQ ID NO:72或ASGGG SEQ ID NO:73或AAASGGG SEQ ID NO:74)连接至抗体或片段(蛋白质B)的重链的C末端。
适合的结合对(X或Y)的实例可以包括GCN4(SEQ ID NO:1或缺少HIS标签的SEQ IDNO:1的氨基酸1-38)或其变体(例如SEQ ID NO:76-98所示的任意序列)和52SR4(SEQ IDNO:3或缺少HIS标签的SEQ ID NO:3的氨基酸1-243)或其变体，其是对GCN4具有特异性的scFv。
在一个实施方案中，第一种结合配偶体(标称为X)是GCN4(例如如SEQ ID NO：1中所示)或其片段或变体(例如没有His标签或SEQ ID NO：76-98所示的任何序列)和第二种结合配偶体(标称为Y)是对GCN4具有特异性的scFv或sdAb(例如如SEQ ID NO：3、99或100中所示)或其变体。
在一个实施方案中，第一种结合配偶体(标称为X)是对GCN4具有特异性的sFv或sdAb(例如如SEQ ID NO：3、99或100所示)或其变体，并且第二种结合配偶体(标称为Y)是GCN4(例如如SEQ ID NO：1所示)或其片段或变体(例如SEQ ID NO：76-98所示的任何序列)。
GCN4变体包括与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％或98％或99％同一性的氨基酸序列。GCN4变体还包括与核苷酸序列SEQ IDNO：2编码的序列或在严格条件下与SEQ ID NO：2杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸。
对GCN4具有特异性的适合的scFv是52SR4(SEQ ID NO：3)或其变体(SEQ ID NO：99或100)。52SR4的变体包括与SEQ ID NO：3具有至少80％或85％或90％或95％或98％或99％的同一性的氨基酸序列。52SR4变体还包括与核苷酸序列SEQ ID NO：4编码的序列或在严格条件下与SEQ ID NO：4杂交的由核苷酸序列编码的序列具有至少80％或85％或90％或95％或98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明人已经发现单链抗体52SR4和肽GCN4是适用于本公开的双特异性蛋白质复合物的结合对。
或者，可以使用任何合适的抗体/片段和抗原(例如肽)作为X和Y。当A-X和Y-B以1:1的摩尔比组合时，优选地，这样的X和Y对产生大于75％的异二聚体。
在一个实施方案中，第一种结合配偶体(X)和第二种结合配偶体(Y)是蛋白质。
在一个实施方案中，第一种结合配偶体(X)是酶或其活性片段，并且第二种结合配偶体(Y)是配体，或反之亦然。
在一个实施方案中，第一种结合配偶体(X)是酶或其活性片段，第二种结合配偶体(Y)是该酶的抑制剂，或反之亦然。
本文使用的“活性片段”是指氨基酸片段，其小于实体的全部氨基酸序列并且保持基本上相同的生物学活性或相关生物学活性，例如大于50％的活性，例如60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一个实施方案中，第一种结合配偶体X是谷胱甘肽(GSH)，并且第二种结合配偶体Y是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X是Fos并且Y是Jun，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X是His并且Y是抗His，或反之亦然。
在另一个实施方案中，结合对是钙调蛋白(clamodulin)结合肽，且Y是钙调蛋白，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X是麦芽糖结合蛋白，且Y是抗麦芽糖结合蛋白或其片段，或反之亦然。
其它酶-配体组合也考虑用于结合配偶体。本领域已知用于蛋白质纯化的亲和标签也是适合的，因为它们具有以高亲和力与其相应的结合配偶体结合的趋势。
如本文所用，“同一性”表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文所用，“相似性”表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间具有相似类型。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。通常能够彼此取代的其它氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可以容易地计算同一性和相似性程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991,购自NCBI的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656,)。
在一个实施方案中，第一种或第二种结合配偶体(X或Y)是蛋白质或肽。
接头可以是有用的且能够连接融合蛋白的任意的结构成分。在一个实施方案中，第一种和第二种融合蛋白包含一个或多个肽接头。接头可以并入融合蛋白的不同位置。例如，可以在结合配偶体和与之连接的蛋白质之间导入接头。
在一个实施方案中，接头是肽接头；或者可以为脂质或糖接头或化学化合物。
如本文所用，术语“肽接头”是指具有氨基酸序列的肽。一系列合适的肽接头将是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物的结合配偶体通过肽接头连接至它们相应的蛋白质。
在一个实施方案中，融合蛋白是翻译融合体，其为在包含从其表达融合蛋白的遗传构建体的宿主细胞中表达的融合蛋白。
在一个实施方案中，通过任选地经由肽接头将A的重链融合至X和/或将B的重链融合至Y来制备融合蛋白。
在一个实施方案中，肽接头长度为50个氨基酸或更少，例如20个氨基酸或更少。
一般地，重组表达融合蛋白会更有效，因此可以由宿主细胞表达的直接肽键或肽接头可能是有利的。
在一个实施方案中，所述接头选自SEQ ID NO：5-72(表2、3和4)或相应于PPP的序列所示的序列。
表2
SEQ ID NO: 序列
5 DKTHTCAA
6 DKTHTCPPCPA
7 DKTHTCPPCPATCPPCPA
8 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
9 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
10 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
11 DKTHTCCVECPPCPA
12 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
13 DKTHTCPSCPA
表3
(S)在序列17至20中是任选的。另一种接头可以为肽序列GS。刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:69)、PPPP(SEQ ID NO:70)和PPP。
表4
SEQ ID NO: 序列
55 DLCLRDWGCLW
56 DICLPRWGCLW
57 MEDICLPRWGCLWGD
58 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
59 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
60 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
61 EDICLPRWGCLWEDD
62 RLMEDICLPRWGCLWEDD
63 MEDICLPRWGCLWEDD
64 MEDICLPRWGCLWED
65 RLMEDICLARWGCLWEDD
66 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
67 RAPESFVCYWETICFERSEQ
68 EMCYFPGICWM
在一个方面，提供了产生本公开的双特异性蛋白质复合物的方法，包括以下步骤：
(a)产生第一种融合蛋白(A-X)，其包含连接至结合对的第一种结合配偶体(X)的第一种蛋白质(A)；
(b)产生第二种融合蛋白(B-Y)，其包含连接至结合对的第二种结合配偶体(Y)的第二种蛋白质(B)；和
(c)将步骤a)和b)中制备的第一种融合蛋白(A-X)和第二种融合蛋白(B-Y)混合在一起。
通常，步骤(c)中A-X和B-Y的混合是以1:1的摩尔比混合。
在一个实施方案中，本公开的复合物中使用的每种融合蛋白通过在表达实验中在宿主细胞中表达产生。
一方面，提供了制备本公开的双特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤：
(a)表达第一种融合蛋白(A-X)，其包含连接于结合对的第一种结合配偶体(X)的第一种蛋白质(A)；
(b)表达第二种融合蛋白(B-Y)，其包含连接于结合对的第二种结合配偶体(Y)的第二种蛋白质(B)；
其中融合蛋白A-X和B-Y从相同的宿主细胞或不同的宿主细胞表达。
如本文使用的不同的宿主细胞是指个体细胞，其包括相同类型的细胞(甚至相同的克隆类型)。
在一个实施方案中，表达是瞬时表达。当与无需求助纯化而产生双特异性复合物的能力组合时，使用瞬时表达是高度有利的。这导致产生双特异性蛋白质复合物的快速方法，因为瞬时转染比稳定转染简单得多并且资源密集程度更低。
在一个实施方案中，表达是稳定表达，即其中编码讨论中的融合蛋白的DNA稳定整合至宿主细胞基因组中。
在一个实施方案中，将编码A-X的多核苷酸和编码相同或不同多核苷酸序列上的B-Y的多核苷酸转染至细胞中作为功能测定的一部分，其中所述蛋白质在细胞中表达和/或从细胞中释放。特别地，将多核苷酸在相同或不同的质粒上瞬时转染。
A-X和B-Y的混合一般在X和Y可以相互作用的条件下进行。在一个实施方案中，将融合蛋白在细胞培养条件下于细胞培养基中孵育，例如将融合蛋白在37℃/5％CO2环境中孵育90分钟。
在一个实施方案中，将本公开的融合蛋白在水性环境中混合，例如可将一种融合蛋白结合至固体表面诸如珠或板，并且可在水溶液/悬浮液中向其引入其它融合蛋白。固相允许容易地洗掉多余的组分和试剂。在一个实施方案中，两种融合都不连接固相，并且简单地在液体/溶液/介质中混合。因此在一个实施方案中，将A-X和B-Y作为游离蛋白质在水性介质中混合。
有利地，本公开的方法可用于制备异源对之间(即在第一种融合蛋白[A-X]与第二种融合蛋白[B-Y]之间)形成的复合物，其中使同源对之间(即两个第一种融合蛋白[A-X]或两个第二种融合蛋白[B-Y]之间)的相互作用最小化。因此，本发明的方法允许制备大量的双特异性蛋白质复合物，同时具有最小或没有同二聚体复合物的污染。本公开的构建体和方法的有利方面是A-X与B-Y的比率由A-X和B-Y的性质控制，并且特别地可以实现1:1的摩尔比。这种控制原理是对某些现有技术方法的显著改进。
如果存在本发明的双特异性抗体复合物或抗体分子的恒定区结构域，则可考虑所提出的复合物或抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的结构域。特别地，当抗体分子意欲用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用如Angal等人，1993,Molecular Immunology,1993,30:105-108中所述的其中241位的丝氨酸已经改变为脯氨酸的IgG4分子。因此，在其中抗体是IgG4抗体的实施方案中，抗体可包括突变S241P。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。频繁的修饰是由于羧肽酶的作用(如Harris，RJ，Journal of Chromatography 705：129-134,1995所述的)而导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的丢失。因此，抗体重链的C末端赖氨酸可以不存在。
本公开还提供了包含如上所述的一种或多种双特异性蛋白质复合物的组合物，其中所述组合物主要包含根据本公开的异二聚体双特异性复合物，例如具有最少或无同二聚体复合物的污染。
在一个实施方案中，组合物中至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％的融合蛋白是双特异性蛋白质复合物形式。
在一个实施方案中，组合物中至少60％的融合蛋白是双特异性蛋白质复合物形式。
在一个实施方案中，形成的复合物不需要进一步的纯化步骤，因此组合物包含未纯化的双特异性复合物。
在一个实施方案中，形成的复合物需要一个纯化步骤，例如柱层析。
在一个实施方案中，所述方法还包括至少一个纯化步骤，例如在根据本公开表达融合蛋白之后且在混合融合蛋白之前。
一方面，本公开涉及如本文所定义的融合蛋白、异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物、包含融合蛋白或所述双特异性蛋白质复合物的组合物、多重组合物(multiple)、阵列、文库。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物在溶液或悬浮液中。
在一个实施方案中，将双特异性蛋白质复合物固定在固体基质表面上。
在一个实施方案中，多重组合物是阵列形式，例如在微量滴定板诸如96或384孔板中。此类阵列可容易地在筛选测定中实施，以鉴定具有所需功能的双特异性蛋白质复合物。
在另一个实施方案中，将双特异性蛋白质复合物缀合至珠。
如上定义的融合蛋白是根据本公开的双特异性蛋白质复合物的组分。在一个方面，本公开涉及本文所述的融合蛋白。
在另一方面，提供了包含两个或更多个如上定义的融合蛋白的文库。
如本文使用，术语“文库”是指本公开的两种或更多种双特异性抗体复合物或本公开的多种融合蛋白，其可以组合以形成根据本公开的至少两种不同的双特异性抗体复合物。如在整个说明书中所描述的，术语“文库”以其最广泛的含义使用，并且还可包括子文库。
有利地，文库可以包含一系列不同的融合蛋白，其具有与其连接的特定结合对的第一种结合配偶体(X)或第二种结合配偶体(Y)。在一个实施方案中，文库的部分包含各自连接至结合配偶体X的蛋白质/抗体/片段，并且文库的其余部分包含各自连接至结合配偶体Y的相同蛋白质/抗体/片段。因此，只要一个融合蛋白具有连接的结合对的第一种结合配偶体并且另一融合蛋白具有连接的结合对的第二种结合配偶体，这允许任何两种融合蛋白易于组合以形成本公开的双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，本发明的双特异性蛋白质复合物适合于治疗应用，并且可提供用于治疗疾病的新型治疗。因此，在另一方面，提供了如上所述的用于治疗的双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，提供了对于本公开的方法获得或可获得的融合蛋白。
在一个实施方案中，提供了从本公开的方法获得或可获得的双特异性抗体复合物。
在一个实施方案中，提供了包含通过根据本公开的方法鉴定的可变区组合的双特异性或多特异性抗体分子。
在一个实施方案中，提供了一种组合物，诸如包含从本公开的方法获得的融合蛋白、双特异性抗体复合物或双特异性/多特异性抗体分子的药物组合物。
组合物中可包括各种不同的组分，包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。任选地，所述组合物可包含能够改变本发明抗体群的特征从而例如降低、稳定、延迟、调节和/或激活抗体功能的其它分子。组合物可以是固体或液体形式，并且尤其可以是粉末、片剂、溶液或气溶胶的形式。
本公开还提供了药物或诊断组合物，其包含本发明的双特异性蛋白质复合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的组合。因此，提供了本发明的双特异性蛋白质复合物用于治疗和制造用于治疗病理性病况或病症的药物的用途。
病理性病况或病症可以例如选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫感染)、与感染相关的内毒素性休克、关节炎诸如类风湿性关节炎、哮喘诸如重症哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨盆炎性疾病、阿尔茨海默病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、阴茎纤维性海绵体炎(Peyronie’s Disease)、腹腔疾病、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、中枢和周围神经系统的免疫介导的炎性病症诸例如多发性硬化、狼疮(诸如系统性红斑狼疮)和吉兰-巴雷综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维性肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、梅尼埃尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、其它自身免疫性疾病、胰腺炎、创伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病，包括缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少(hypochlorhydia)和癌症，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头颈癌、肾癌，特别是肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌和甲状腺癌及其转移形式。
本公开还提供了药物或诊断组合物，其包含本发明的双特异性蛋白质复合物与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或多种的组合。因此，提供本发明的双特异性蛋白质复合物用于治疗和用于制造药物的用途。
组合物通常会作为正常包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，其包括将本发明的抗体分子或双特异性抗体复合物与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或多种一起加入和混合。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的制剂载体、溶液或添加剂，以增强本发明组合物的所需特征。赋形剂是本领域众所周知的，包括缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可被包封在脂质体或可生物降解的微球中。一般使用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的缓冲溶剂溶液，抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液的产生和灭菌，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
药学上可接受的载体本身不应诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生，并且不应是有毒的。合适的载体可以是大的，缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。此类载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以供患者摄取。
可将本发明的双特异性蛋白质复合物分散在溶剂中例如以溶液或悬浮液的形式递送。可将其悬浮在适当的生理溶液例如生理盐水、药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mgNaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH。如上所述，悬浮液可以例如由冻干抗体制备。
药学上可接受的载体的详尽讨论可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中获得。
双特异性抗体复合物(或本公开的双特异性/多特异性抗体分子)可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴随其他活性成分，包括其他抗体成分，例如抗TNF、抗IL-1β、抗T细胞，抗IFNγ或抗LPS抗体，或非抗体成分诸如黄嘌呤。其它合适的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体，例如抗CD3或抗CD4抗体。
在另一个实施方案中，将根据本公开的抗体、片段或组合物与另外的药物活性剂例如皮质类固醇(诸如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(诸如沙丁胺醇、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖的抑制剂(诸如雷帕霉素、环磷酰胺、氨甲蝶呤)或CD28和/或CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂是对靶具有特异性的抗体。
药物组合物合适地包含治疗有效量的本发明的双特异性抗体复合物(或本公开的双特异性/多特异性抗体分子)。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向疾病或病况或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可在细胞培养测定或动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估计治疗有效量。动物模型也可用于确定适当的浓度范围和施用途径。这样的信息然后可以用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。
对于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重度、，受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对治疗的反应敏感性和耐受性/应答。该量可通过常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。通常，治疗有效量会是0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。或者，剂量可以是每天1至500mg，诸如每天10mg至100mg、200mg、300mg或400mg。药物组合物可方便地以含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
组合物可被单独地施用于患者，或者可以与其他试剂、药物或激素组合(例如同时、顺序或分开地)施用。
施用本发明的抗体分子的剂量取决于待治疗的病症的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是被预防性使用还是用于治疗现有病症。
剂量的频率将取决于抗体分子的半寿期和其效应的持续时间。如果抗体分子具有短的半寿期(例如2至10小时)，则可能有必要每天给予一个或多个剂量。或者，如果抗体分子具有长的半寿期(例如2至15天)，则可能仅需要每天给予一次，每周一次或甚至每1或2个月一次剂量。
在本公开中，最终制剂的pH不类似于抗体或片段的等电点的值，因为如果制剂的pH为7，则8-9或更高的pI可能是适当的。尽管不希望受理论束缚，但据认为这可能最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、室内(intraventricular)、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器也可以用于施用本发明的药物组合物。
组合物的直接递送一般通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射，或递送至组织的间隙空间来完成。还可将组合物施用至特定目标组织中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
当产品用于注射或输注时，其可采取在油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，双特异性蛋白质复合物(或本公开的双特异性/多特异性抗体分子)可以是干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。如果组合物通过使用胃肠道的途径来施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解但是一旦其从胃肠道被吸收就释放双特异性蛋白质复合物的试剂。
根据本公开的可雾化制剂可以例如作为包装在箔包封中的单剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积(例如2ml)的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
如本文所用，术语“变体”是指与相应的野生型肽或蛋白质的氨基酸或核苷酸序列相比，含有至少一个氨基酸序列或核苷酸序列改变的肽或蛋白质。变体可包含与相应的野生型肽或蛋白质至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％或99％的序列同一性。然而，变体可以包含小于80％的序列同一性，只要变体表现出与其相应的野生型肽或蛋白质基本相似的功能。
抗原包括细胞表面受体诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、天然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、粘附分子、整联蛋白、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶性分子诸如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素或酶或离子通道、其表位、片段和翻译后修饰形式。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物包含一种或两种细胞表面受体特异性。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物包含一种或两种细胞因子或趋化因子特异性。
可将通过根据本公开的方法鉴定的一对靶的抗体或片段掺入适于用作实验室试剂、测定试剂或治疗剂的任何形式。
因此，在一个方面，本公开延伸至以任何形式作为对的抗体片段或其组合的用途，其实例在上文给出。
本公开还延伸至组合物，诸如包含具有特定抗原特异性的所述新型形式的药物组合物。
在另一方面，本公开包括所述形式和组合物在治疗中的用途。
在一个实施方案中，本公开的双特异性蛋白质复合物可用于功能改变目的抗原的活性。例如，双特异性蛋白质复合物可以直接或间接中和、拮抗或激动所述抗原的活性。
本公开还延伸至试剂盒，例如包含复合或未复合形式的A-X和B-Y，其用于本公开的方法中。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
在又一个实施方案中，试剂盒还包含一种或多种用于进行一种或多种功能测定的试剂。
在一个实施方案中，如本文所述的融合蛋白，双特异性蛋白复合物，多重复合物，网格，文库，组合物等用作实验室试剂。
在另一方面，提供了核苷酸序列，例如编码如上定义的融合蛋白和/或双特异性蛋白质复合物的DNA序列。
在一个实施方案中，提供了核苷酸序列，例如编码根据本公开的双特异性蛋白质复合物的DNA序列。
在一个实施方案中，提供了核苷酸序列，例如编码根据本公开的双特异性或多特异性抗体分子的DNA序列。
本文的公开内容还延伸至包含如上定义的核苷酸序列的载体。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的实例是“质粒”，其是可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在其中导入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。可将其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，其中它们随后与宿主基因组一起被复制。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。
可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员众所周知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York和由Cold Spring Harbor Publishing生产的ManiatisManual。
如本文所用，术语“选择性标志物”是指其表达允许鉴定已经用含有标志物基因的载体转化或转染的细胞的蛋白质。多种选择性标志物是本领域已知的。例如，通常选择性标志物基因赋予已将载体导入其中的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。选择性标志物还可以是视觉上可鉴定的标志物，诸如荧光标志物。荧光标志物的实例包括罗丹明、FITC、TRITC、Alexa Fluor及其各种缀合物。
还提供了包含一个或多个克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包含编码本公开的抗体的一个或多个DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本公开的抗体分子的DNA序列。可使用细菌(例如大肠杆菌)和其他微生物系统，或者也可以使用真核生物(例如哺乳动物)的宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本公开还提供了用于生产根据本公开的融合蛋白的方法，其包括在适于导致从编码本公开的分子的DNA表达蛋白质的条件下培养含有本公开的载体的宿主细胞，并分离该分子。
本公开的双特异性蛋白质复合物可用于诊断/检测试剂盒，其中使用具有抗原特异性的特定组合的双特异性蛋白质复合物。例如，试剂盒可包含对两种抗原具有特异性的双特异性抗体复合物，所述两种抗原都存在于相同的细胞类型上，并且其中只有在成功检测到两种抗原时才可进行阳性诊断。通过使用本公开的双特异性抗体复合物而不是呈非复合形式的两种分开的抗体或抗体片段，可以极大地增强检测的特异性。
在一个实施方案中，将双特异性抗体复合物固定在固体表面上。固体表面可以例如是芯片或ELISA板。
还提供了本公开的双特异性蛋白质复合物用于在样品中检测第一和第二肽的存在的用途，其中所述双特异性复合物用作检测剂。
可以例如将本公开的双特异性抗体复合物缀合至荧光标志物，所述荧光标志物促进结合的抗体-抗原复合物的检测。此类双特异性抗体复合物可用于免疫荧光显微镜术。或者，双特异性抗体复合物也可用于蛋白质印迹或ELISA。
在一个实施方案中，提供了纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的融合蛋白或双特异性蛋白质复合物的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，以使得杂质保留在柱子上，并且抗体保留在未结合级分中。该步骤可以例如在约6-8的pH下进行。
该方法还可包括例如在约4至5的pH下进行的使用阳离子交换层析的初始捕获步骤。
该方法还可包括另外的层析步骤，以确保产物和方法相关的杂质从产物流中适当地消除(resolved)。
纯化方法还可包括一个或多个超滤步骤，诸如浓缩和渗滤步骤。
如上所用的“纯化形式”意指至少90％的纯度，诸如91％w/w、92％w/w、93％w/w、94％w/w、95％w/w、96％w/w、97％w/w、98％w/w、99％w/w或更纯。
在本说明书的上下文中，“包含(comprising)”被解释为“包括(including)”。
包含某些元素的本公开的方面也旨在延伸至“由相关元素组成”或“基本上由相关元素组成”的替代实施方案。
本文使用的积极实施方案可以为排除本公开的某些方面提供基础。
在涉及双特异性复合物的方法的上下文中的公开同样适用于复合物本身，并且反之亦然。
实施例
实施例1本公开的双特异性抗体复合物FabB-GCN4(7P14P):52SR4-FabA的构建
图10和11显示了本公开的代表性双特异性抗体复合物。该双特异性抗体复合物由第一种和第二种融合蛋白组成。
第一种融合蛋白(A-X)包括对可溶性抗原IL-6具有特异性的Fab片段(Fab A(也称为Fab#1)，其通过与Fab片段的CH1结构域和scFv的VL结构域的C末端连接的肽接头ASGGGGSEQ ID NO：71连接至XscFv(克隆52SR4SEQ ID NO：3)。scFv本身还含有位于其VL与VH结构域之间的肽接头。
第二种融合蛋白(B-Y)包括对细胞表面抗原CD3具有特异性的Fab片段(Fab B[也称为Fab#2])。然而，与第一种蛋白质相比，Fab片段通过与Fab片段的CH1结构域连接的肽接头ASGGG SEQ ID NO：73连接至Y肽GCN4(克隆7P14P SEQ ID NO：1)。
scFv即X对结合配偶体Y即GCN4具有特异性和互补性。作为结果，当两种融合蛋白彼此接触时，发生scFv与GCN4肽之间的非共价结合相互作用，从而以双特异性抗体复合物的形式物理地保留了两种融合蛋白。
通过构建并淘选来自用GCN4(7P14P)免疫接种的小鼠的脾的核糖体展示VL-接头-VH scFv文库衍生单链抗体(scFv)52SR4(Hanes J,Jermutus L,Weber-Bornhauser S,Bosshard HR,Plückthun A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14130-14135)。进一步的2004年出版物描述了使用随机文库的核糖体展示再次将52SR4亲和力成熟为报道的5pM(Zhand C,Spinelli S,Luginbuhl B,Amstutz P,Cambillau C,Pluckthun A.(2004)J.Biol.Chem.279,18870-18877)。
通过在7位和14位包含脯氨酸残基而从酵母转录因子GCN4衍生得到GCN4肽，因此GCN4(7P14P)保持在如Berger等的1999年的出版物(Berger C,Weber-Bornhauser S,Eggenberger Y,Hanes J,Pluckthun A,Bosshard H.R.(1999)F.E.B.S.Letters 450,149-153)中所述scFv结合的单体状态。
将编码GCN4肽和52SR4scFv的核苷酸序列在含有CH1并且已经设计来接收抗体VH区的内部重链Fab表达载体下游克隆入两个分开的载体中。
然后将来自抗IL-6抗体和抗CD3抗体的VH区分别克隆入这两个重链载体中。
将编码GCN4肽和52SR4 scFv的核苷酸序列分别克隆入分别在含有CK并且被设计来接收抗体VL区的内部轻链Fab表达载体下游的第一和第二载体中。
将来自抗IL-6抗体和抗CD3抗体的V-L区与CK分开框内克隆在内部轻链表达载体中以与适合的重链载体共表达以表达Fab-scFv和Fab-肽蛋白。
然后对载体进行测序以确认克隆已成功并且随后细胞分开表达分别具有来自抗IL-6抗体和抗CD3抗体的V区的Fab-scFv和Fab-肽蛋白。
实施例2–形成可以同时共同接合细胞表面和可溶性抗原的非共价双特异性抗体的scFv:肽相互作用的流式细胞术证明
图12显示了流式细胞术实验的结果，其证明了使用scFv:肽结合相互作用形成的两种不同双特异性抗体复合物的抗原特异性。
使用以下两种融合蛋白构建第一种双特异性抗体复合物：
1.抗CD3 Fab-scFv(52SR4)；和
2.抗抗原IL-6 Fab-肽(GCN4)
使用以下两种融合蛋白构建第二种双特异性抗体复合物：
1.抗CD3 Fab-肽(GCN4)；和
2.抗抗原IL-6 Fab-scFv(52SR4)
因此，两种双特异性抗体复合物具有相同的Fab片段和相同的结合配偶体(即52SR4和GCN4)。两种双特异性抗体复合物之间的差异是其中Fab片段与哪个结合配偶体连接。
不形成复合物的对照混合物由以下融合蛋白制成：
1.抗CD3 Fab:GCN4；和
2.抗IL-6 Fab:GCN4
为了证明双特异性抗体复合物结合CD3的能力，将该复合物与表达CD3的Jurkat细胞一起孵育。为了证明双特异性抗体复合物与IL-6结合的能力，随后将曾经与Jurkat细胞上的CD3结合的复合物与生物素化的抗原IL-6接触。然后使用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测生物素化的抗原IL-6。
然后使Jurkat细胞运行通过Facscalibur流式细胞仪，其中荧光标记的Jurkat细胞仅在结合于双特异性抗体复合物时才能被标记，由此结合至IL-6，从而指示所述双特异性抗体复合物能够结合细胞表面CD3和可溶性抗原IL-6，可以分离自与能够结合CD3和IL-6的两种融合蛋白一起孵育的Jurkat细胞，两种融合蛋白均与不能形成复合物的肽融合。
图12中的FACS图显示了两种双特异性抗体复合物(超过和高于填充的背景的细线和粗线)的显著偏移，因此证明双特异性抗体复合物可以成功地结合两种靶抗原，并且结合两种靶标的能力抗原被保留，而不论给定的Fab片段是否连接至scFv或肽。
随后俘获C末端相应地与抗IL-6 Fab融合的肽或scFv允许进一步俘获在具有荧光标记的链霉抗生物素蛋白的最终层中检测到的生物素化抗原IL-6。因此，FACS图中描绘的结果显示本公开的双特异性抗体复合物能够同时成功结合细胞表面和可溶性抗原。
实施例3–scFv:肽相互作用的Biacore证实
图13显示了证明scFv:肽(即52SR4:GCN4)相互作用的亲和力的表面等离子体共振迹线。使用Biacore 3000(GE Healthcare)进行表面等离子体共振。在25℃下进行所有实验。链霉抗生物素蛋白(内部产生的)通过胺偶联化学固定在CM5传感器芯片(GEHealthcare)上，最终水平为约1750个应答单位。使用HBS-N缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl；GE Healthcare)作为用于固定和肽捕获的运行缓冲液。使用在HBS-N(10nM，M.W.4360)中的5μl注射的生物素-GCN4肽来在固定的链霉抗生物素蛋白上实现约6RU的捕获。将运行缓冲液转换为HBS-EP+缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20；GE Healthcare)，用于测量抗GCN4(52SR4)scFv结合动力学。将来自30nM或HBS-EP+缓冲液对照的Fab-scFv(内部产生的)的三倍系列稀释液以30μl/min的流速注射到固定的GCN4肽(3分钟缔合，15分钟解离)上。每次注射后，以10μl/min的流速通过两次连续60秒的2M胍-HCl注射来再生表面。按照标准程序，使用3000BIAEval软件(4.1版)分析扣除双参照背景的结合曲线。从拟合1:1结合模型算法确定动力学参数。数据证明scFv具有516pM的对肽的亲和力。
实施例4–用于结合测定的Fab-A(Fab-scFv[A-X])和Fab-B(Fab-肽[B-Y)的生产
克隆策略：通过PCR或基因合成产生抗体可变区DNA，其中在DNA序列中具有侧翼限制性酶切位点。这些位点是可变重链的HindIII和XhoI，可变轻链的HindIII和BsiWI。这使得重链可变区适于连接至两个重链载体(具有FabB-Y的pNAFH和具有FabA-X的pNAFH)中，因为它们具有互补的限制性位点。这将可变区上游(或5')与鼠恒定区和肽Y(GCN4)或scFv X(52SR4)连接，产生整个阅读框。将轻链克隆入标准的内部鼠恒定κ载体(pMmCK或pMmCKS171C)，其再次使用相同的互补限制性位点。如果从兔分离可变区，则使用pMmCK S171C载体。通过使用侧接整个开放阅读框架的引物进行测序来确认克隆事件。
培养CHOS：将悬浮CHOS细胞预先适应补充有2mM(100x)glutamx的CDCHO培养基(Invitrogen)。在振荡培养箱(Kuner AG，Birsfelden，Switzerland)上将细胞维持在对数生长期，以140rpm摇动，并在补充有8％CO2的37℃下培养。
电穿孔转染：在转染之前，使用CEDEX细胞计数器(Innovatis AG，Bielefeld，Germany)测定细胞数和活力，将所需量的细胞(2×108个细胞/ml)转移到离心锥形管中，并以1400rpm离心10分钟。将沉淀的细胞重悬于无菌Earls平衡盐溶液中，并以1400rpm再离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬至所需的细胞密度。
将800μl终浓度为400μg用于2×108个细胞/ml混合物的载体DNA移液至比色杯(Biorad)中，并使用内部电穿孔系统进行电穿孔。
分开转染Fab-A(Fab-scFv[A-X])和Fab-B(Fab-肽[B-Y])。将转染的细胞直接转移至含有富含2mM glutamx和抗生素抗有丝分裂(100X)溶液(1/500)的ProCHO 5培养基的1x3L锥形瓶中，并将细胞在设定为37℃，5％CO2和140rpm摇动的Kuhner振荡培养箱中培养。在转染后24小时添加补料2g/L ASF(AJINOMOTO)，温度降至32℃，再培养13天。在第4天，向培养物中添加3mM的丙酮酸钠(正丁酸钠盐，Sigma B-5887)。
在第14天，将培养物转移到管中，并在4000rpm离心30分钟后将细胞与上清液分离。将保留的上清液通过0.22μmP Millipore，然后0.22μm Gamma金过滤器进一步过滤。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
大规模(1.0L)纯化：使用AKTA Xpress系统和HisTrap Excel预包装镍柱(GEHealthcare)通过亲和捕获纯化Fab-A和Fab-B。将培养物上清液0.22μm无菌过滤，并且如果需要，在上样到柱子上之前用弱酸或碱将pH调节至中性。使用含有15-25mM咪唑的第二洗涤步骤来置换来自镍树脂的任何弱结合的宿主细胞蛋白/非特异性His结合物。用10mM磷酸钠、pH7.4+1M NaCl+250mM咪唑进行洗脱，收集2ml级分。将一个柱体积添加至洗脱液中，将系统暂停10分钟以收紧洗脱峰，并因此减小总洗脱体积。合并最干净的级分并将缓冲液交换至PBS(Sigma)，pH 7.4中以及进行0.22μm过滤。通过A280扫描、SE-HPLC(G3000方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)，并且对于内毒素使用PTS Endosafe系统测定最终汇集物。
实施例5-双特异性复合物的表征
Fab-X和Fab-Y试剂的纯化：在标准CHO表达后，如下纯化Fab-X(Fab-scFv-His)和Fab-Y(Fab-肽-His)的形式。使用1Lstericup将澄清的细胞培养物上清液进行0.22μl无菌过滤。测量pH，并且必要时调节至pH 7.4。将制备的上清液以5ml/min上样到在10mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH 7.4中平衡的5ml HisTrap Nickel Excel(GE Healthcare)柱上。柱子用15mM咪唑、10mM磷酸钠、0.5M NaCl、pH 7.4洗涤，然后用250mM咪唑、10mM磷酸钠、0.5MNaCl、pH 7.4洗脱。洗脱后通过在280nm处的吸光度进行检测，收集洗脱峰。通过在TSKgelG3000SWXL上进行尺寸排阻层析法来分析峰洗脱；5μm、7.8x300mm柱，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH7.0以1ml/min展开(develop)，通过在280nm处的吸光度进行检测。将足够纯度的样品浓缩至>1m/ml，并使用具有10kDa截留分子量膜的Amicon Ultra-15浓缩器和在水平转头中以4000xg离心的方式渗滤入PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中。当产物质量不足时，将镍柱洗脱液浓缩并施加至在PBS、pH 7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的XK16/60或XK16/60Superdex200(GE Healthcare)柱。用等度梯度的PBS、pH 7.4(Sigma AldrichChemicals)分别以1ml/min或2.6ml/min展开。收集级分并通过在TSKgel G3000SWXL上的尺寸排阻层析法进行分析；5μm、7.8x300mm柱子，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH7.0以1ml/min展开，通过在280nm处的吸光度进行检测。合并所选择的级分，使用具有10kDa截留分子量膜的Amicon Ultra-15浓缩器并在水平转头中以4000xg离心浓缩至>1mg/ml。
在溶液中分析双特异性形成
实验1
将纯化的Fab-X(VR4247)和纯化的Fab-Y(VR4248)以1:1的摩尔比混合，总蛋白浓度为500μg/ml，并在环境温度下孵育过夜。对照由混合物的个体部分组成，其浓度与它们在混合物中的浓度相同。将100μl样品和每个对照物注射至TSKgel G3000SWXL上；5μm、7.8x300mm柱，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH 7.0以1ml/min展开。通过在280nm处的吸光度进行检测(参见图14)。
图14中的尺寸排阻层析图显示，Fab-X(VR4247)对照具有92％的总峰面积的主峰，保留时间为8.610公制分钟。Fab-Y(VR4248)对照具有94％的总峰面积的主峰，保留时间为10.767公制分钟。通过使用由在相同条件下运行的BioRad凝胶过滤标准品(151-1901)的保留时间产生的标准曲线，分别将针对Fab-X和Fab-Y对照测量的保留时间转化为95kDa和35kDa的表观分子量。这些表观分子量与Fab-scFv和Fab-肽分子的预期表观分子量一致。Fab-X(VR4247)/Fab-Y(VR4248)混合物的主峰具有9.289公制分钟的保留时间。如上将其转化为187kDa的表观分子量。该表观分子量与一个Fab-X(VR4247)与一个Fab-Y(VR4248)的配对所预期的一致。主峰也是总峰面积的84％，表明大多数Fab-X(VR4247)和Fab-Y(VR4248)已经形成了1:1的双特异性蛋白质复合物。在主峰之后洗脱的小的另外的肩和峰与Fab-X(VR4247)和Fab-Y(VR4248)起始材料一致。
实验2
将纯化的Fab-X(VR4130)和Fab-Y(VR4131)以1:1的摩尔比混合，总蛋白浓度为500μg/ml。然后将该混合物的等分试样用PBS pH 7.4稀释至50μg/ml和5μg/ml的浓度。还建立了由与它们在500μg/ml混合物中的浓度相同浓度的混合物的个体部分组成的对照。将所有混合物和对照在环境温度下孵育过夜。将100μl的所有样品和对照物注射至TSKgelG3000SWXL上；5μm、7.8×300mm柱，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH7.0以1ml/min展开。通过在214nm的吸光度进行检测(参见图15、图16和表1)。
图15中的尺寸排阻层析图显示Fab-X(VR4130)对照具有91％的总峰面积的主峰，保留时间为8.634公制分钟。Fab-Y(VR4131)对照具有97％的总峰面积的主峰，保留时间为9.361公制分钟。通过使用从在相同条件下运行的BioRad凝胶过滤标准品(151-1901)的保留时间产生的标准曲线，分别将对于Fab-X和Fab-Y对照测量的保留时间转化为109kDa和55kDa的表观分子量。这些表观分子量与Fab-scFv和Fab-肽分子的预期表观分子量一致。Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131)混合物的主峰具有8.016公制分钟的保留时间。将其如上转化为198kDa的表观分子量。该表观分子量与一个Fab-X(VR4130)与一个Fab-Y(VR4131)的配对所预期的一致。主峰也是82％的总峰面积，这表明大多数Fab-X(VR4130)和Fab-Y(VR4131)已经形成1:1复合物。在主峰之后洗脱的两个小峰与Fab-X(VR4130)和Fab-Y(VR4131)起始材料一致。
图16中的尺寸排阻色谱图是针对500μg/ml、50μg/ml和5μg/ml浓度的Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131)的1:1混合物的。所有迹线与具有相似保留时间和相似相对峰高度和面积的样品之间的对应峰类似。在表5(500μg/ml、50μg/ml和5μg/ml的Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131)1:1摩尔比混合物的尺寸排阻峰面积数据。在吸光度214nm处检测到峰)中比较了峰面积百分数，其中每个峰的百分数在混合物稀释时保持相当恒定。这表明Fab-X/Fab-Y 1:1复合物在所有测试浓度下保持为复合物。即使当将混合物稀释至5μg/ml时(这相当于40nM的复合物的浓度)，75％的Fab-X和Fab-Y作为1:1的复合物存在。
表5
因此，这些实验的结果表明，高比例的Fab-X和Fab-Y融合蛋白形成期望的双特异性复合物，剩余的单体的比例最小，并且没有同二聚体形成的证据。
实施例6-抗CD138和抗CH1 Fab-X和Fab-Y结合的证实
表达并纯化对人浆细胞上表达的CD138具有特异性的V区和对人CH1-检测分泌的人IgG的V区，并测试个体结合活性预复合物形成以将人IgG俘获至人浆细胞。
通过B细胞培养和分离的抗体发现：
用3个剂量的表达人CD138或纯化的人Fab蛋白的Rab-9细胞免疫接种兔。
使用类似于Zubler等人(1985)描述的方法制备B细胞培养物。简言之，将来自免疫兔的脾或PBMC衍生的B细胞以约2000-5000个细胞/孔的密度在具有200μl/孔RPMI 1640培养基(Gibco BRL)的条形码编码的96孔组织培养板中于37℃，5％CO2气氛中培养7天，所述RPMI 1640培养基补充有10％FCS(PAA laboratories ltd)，2％HEPES(Sigma Aldrich)，1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)，1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)，0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)，3％活化的脾细胞培养物上清液和γ辐照的突变型EL4鼠胸腺瘤细胞(5×104/孔)。
B细胞培养上清液中抗原特异性抗体的存在使用基于均匀荧光的结合测定、使用表达CD138的HEK293细胞或纯化的CD138或Fab蛋白来测定。筛选涉及使用MatrixPlatemate液体处理器将来自条形码化的96孔组织培养板的10ul上清液转移至含有用靶抗原或蛋白质转染的HEK293细胞的条形码编码的384孔黑壁测定板中。用山羊抗兔IgG Fcγ-特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。
为了允许从选择的感兴趣的孔中回收抗体可变区基因，进行去卷积步骤以使得能够鉴定含有异质B细胞群的给定孔中的抗原特异性B细胞。这使用荧光焦点法(Clargo等，2014.Mabs 2014 Jan 1:6(1)143-159；EP1570267B1)来实现。简言之，将来自阳性孔的分泌免疫球蛋白的B细胞与用靶抗原转染的HEK293细胞或用生物素化的靶抗原包被的链霉抗生物素蛋白珠(New England Biolabs)和山羊抗兔Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)的1:1200最终稀释液混合。在37℃下静态孵育1小时后，由于围绕B细胞的荧光晕的存在，可鉴定抗原特异性B细胞。然后用Eppendorf微操作器挑取使用奥林巴斯显微镜鉴定的多个这些个体B细胞克隆并沉积至PCR管中。荧光焦点法也用于从直接来自免疫兔的骨髓的B细胞的异质群体中鉴定抗原特异性B细胞。
使用重链和轻链可变区特异性引物通过逆转录(RT)-PCR从单个细胞中回收抗体可变区基因。进行两轮PCR，巢式二级PCR在3'和5'末端引入限制性位点，从而允许将可变区克隆入小鼠Fab-X和Fab-Y(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。使用Fectin 293(LifeTechnologies)或Expi293细胞，使用Expifectamine(Life Technologies)将Fab-X和Fab-Y表达载体的重链和轻链构建体共转染入HEK-293细胞中，并在6孔组织培养板中在5ml的体积中表达重组抗体。在表达5-7天后，收获上清液。在对用抗原转染的HEK293细胞和包被有重组蛋白或抗原转染的HEK细胞的SuperavidinTM珠(Bangs Laboratories)的基于均匀荧光的结合测定中测试上清液。这样做是为了确认克隆的抗体的特异性。
小规模生产Fab A-X和Fab B-Y
将Expi293细胞在Expi293TM表达培养基中常规地继代培养至终浓度为0.5×106个活细胞/mL，并在回转式摇动培养箱(Multitron，Infors HT)中在120rpm，8％CO2和37℃下进行孵育。
在转染当天，使用自动细胞计数器(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。为了达到2.5×106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞悬浮液添加至无菌的250mL锥形摇瓶中，对于每个50ml转染，通过添加新鲜的预温热的Expi293TM表达培养基来达到42.5mL的体积。
为了为每次转染制备脂质-DNA复合物，将总共50μg的重链和轻链质粒DNA在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至总体积为2.5mL，并将135μl的ExpiFectamineTM 293试剂(Life Technologies)在I培养基中稀释至总体积为2.5mL。将所有稀释液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟，然后将每种DNA溶液加入各稀释的ExpiFectamineTM 293试剂中，以获得5mL的总体积。轻轻混合DNA-ExpiFectamineTM293试剂混合物，并在室温下孵育20-30分钟，以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将5mLDNA-ExpiFectamineTM293试剂复合物添加至每个摇瓶中。将摇瓶在回转式摇动培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃进行孵育。
转染后约16-18小时，向每个摇瓶中添加250μl的ExpiFectamineTM 293转染增强剂1(LifeTechnologies)和2.5mL的ExpiFectamineTM 293转染增强剂2(LifeTechnologies)。
转染后7天收获细胞培养物。将细胞转移到50mL旋转管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，然后通过0.22μm Stericup(Merck Millipore)无菌过滤。将澄清和无菌过滤的上清液在4℃下储存。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
小规模(50ml)纯化：使用基于真空的小规模纯化系统通过亲和捕获分别纯化Fab-X和Fab-Y二者。简言之，将50ml培养物上清液进行0.22μm无菌过滤，然后添加500μl NiSepharose珠(GE Healthcare)。然后将上清液珠混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空除去上清液。然后用洗涤液1(50mM磷酸钠、1M NaCl、pH 6.2)和洗涤液2(0.5M NaCl)洗涤珠子。用50mM醋酸钠、pH 4.0+1M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分缓冲液交换至PBS(Sigma)、pH7.4，并进行0.22μm过滤。通过A280扫描、SE-UPLC(BEH200方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)并且对于内毒素使用PTS Endosafe系统测定最终汇集物。
抗人IgG结合测定
将完整人IgG在室温下以在PBS中1μg/ml包被在Nunc ELISA板上过夜。一些孔未包被作为测定的阴性对照。将板在PBS 0.01％Tween中洗涤4次，然后用PBS 1％BSA(每孔200μL)封闭1小时。将板在PBS0.01％Tween中洗涤4次。用在PBS 1％BSA中1μg/ml的1/3系列稀释液滴定抗CH1 Fab’Xds、抗CH1 Fab’Y和抗CD138 Fab’Y(作为阴性对照)，并以每孔100μL加入到hIgG包被的板中。将板孵育2hr。将板在PBS 0.01％Tween中洗涤4次。将过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG在PBS 1％BSA中按照万分之一稀释，以每孔100μL加入并孵育1hr。将板在PBS 0.01％Tween中洗涤4次。向每个孔中加入100μL TMB，将板放置以显色20分钟，然后用50μL TMB终止溶液终止反应。在Synergy2上在450nm处读取孔吸光度。
图17显示了在Fab-X和Fab-Y两种形式中，抗人CH1V区(VR388)能够结合人IgG。
CD138结合测定
将表达高水平CD138的体外分化浆母细胞以5×104/孔铺板在96孔U-形板中，并将细胞与稀释于FACS缓冲液(PBS 5％FCS,2mM叠氮化钠)中的1μg/ml每种抗人CD138 Fab'Y一起在冰上孵育30min。通过向每个孔中加入100μL FACS缓冲液洗涤细胞并以500g旋转5min。抽吸FACS缓冲液并通过加入200μL/孔的FACS缓冲液进行第二次洗涤步骤，接着以500g旋转5min。再次抽吸FACS缓冲液，并通过将平板置于平板振荡器上1400rpm 10秒使细胞沉淀变松散。以1:200稀释于FACS缓冲液中的检测二抗(FITC缀合的抗小鼠IgG JacksonImmunoResearch 115-095-072)以每孔100μL加入到细胞中。将细胞与检测Ab一起在冰上孵育30min并如上所述再洗涤一次。将细胞立即在iQue上获取。在Prism中绘制FL-1的几何平均值。
图18显示Fab-Y构建体与结合至人浆细胞的不同抗CD138 V区的结合。
用于鉴定抗体分泌细胞的方法
A-X结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y通过Fc或Fab'结合分泌的抗体。通过X与Y之间的相互作用将分泌的抗体俘获到细胞表面。然后可以通过向Fc或Fab添加标记的抗抗体试剂来检测细胞俘获的抗体。分泌的抗体上B-Y结合的表位不同于添加的检测抗体所识别的表位。参见例如图1。
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45(包括全部异形体)、抗CD27、抗CD19、抗CD20(最优选抗CD38和CD138)。
B可以独立地选自抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
实施例7–产生总或同种型特异性抗体的细胞
A-Y结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体并且A-Y结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且B-X通过Fc或Fab'结合分泌的抗体。通过X与Y之间的相互作用将分泌的抗体俘获到细胞表面。然后可以通过向Fc或Fab添加标记的抗抗体试剂来检测细胞俘获的抗体。分泌的抗体上B-X结合的表位不同于添加的检测抗体所识别的表位。参见例如图2。
具体实施例：
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45 CD45(包括全部异形体)、抗CD27、抗CD19和抗CD20(例如抗CD38和CD138)。
B可以独立地选自抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
实施例8-产生抗原特异性抗体的细胞
A-Y结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且B-X结合分泌抗体也对其具有特异性的抗原。由此首先通过X与Y之间的相互作用将抗原俘获到细胞表面，然后分泌的抗体与抗原结合并且其本身俘获至细胞表面。然后可以通过向Fc或Fab添加标记的抗抗体试剂来检测现在被细胞俘获的分泌的抗体，并且可以是泛或同种型特异性的。参见例如图3。
具体实施例：
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45、抗CD27、抗CD19、抗CD20(最优选抗CD38和CD138)。
B可以独立地选自感兴趣的加标签的抗原。标签＝生物素、His、Myc。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
所述检测抗体可以独立地选自抗CH1、抗Cκ、抗Cλ,、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
实施例9-产生抗原特异性抗体的细胞
A-X结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合分泌抗体也特异性的抗原。由此首先通过X与Y之间的相互作用将抗原俘获到细胞表面，然后分泌的抗体与抗原结合并且其本身俘获到细胞表面。然后可以通过向Fc或Fab添加标记的抗抗体试剂来检测现在被细胞俘获的分泌的抗体，并且可以是泛或同种型特异性的。参见例如图4。
具体实施例：
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45、抗CD27、抗CD19、抗CD20(最优选抗CD38和CD138).
B可以独立地选自感兴趣的加标签的抗原。标签＝生物素、His、Myc。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
检测抗体＝抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
实施例10-产生抗原特异性抗体的细胞
A-X结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y通过Fc或Fab'结合分泌的抗体。通过X与Y之间的相互作用将分泌的抗体俘获到细胞表面。然后可以通过添加具有标签的抗原且然后使用标记的抗标签抗体试剂来检测抗原特异性的细胞俘获的抗体。
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45 CD45(包括全部异形体)、抗CD27、抗CD19、抗CD20(最优选抗CD38和CD138)。参见例如图5。
B可以独立地选自抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
实施例11-产生抗原特异性抗体的细胞
A-Y结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且B-X通过Fc或Fab'结合分泌的抗体。通过X与Y之间的相互作用将分泌的抗体俘获到细胞表面。然后可以通过添加具有标签的抗原且然后标记的抗标签抗体试剂来检测该抗原特异性的细胞俘获的抗体。参见例如图6。
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45 CD45(包括全部异形体)、抗CD27、抗CD19、抗CD20(最优选抗CD38和CD138)。
B可以独立地选自抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
实施例12-产生抗原特异性抗体的细胞
A-X结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且抗原-Y结合分泌的抗体。通过X与Y之间的相互作用将分泌的抗体俘获到细胞表面。然后可以通过向Fc或Fab添加标记的抗抗体试剂来检测该抗原特异性的细胞俘获的抗体，并且可以是泛或同种型特异性。参见例如图7。
A可以独立地选自抗CD38、抗CD138、抗CD45 CD45(包括全部异形体)、抗CD27、抗CD19、抗CD20(例如抗CD38和CD138)。
B是抗原。
检测抗体可以独立地选自抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
实施例13-产生抗原特异性抗体的细胞
A-Y结合抗体产生细胞上表达的细胞表面受体，并且抗原-X结合分泌的抗体。通过X与Y之间的相互作用将分泌的抗体俘获到细胞表面。然后可以通过向Fc或Fab添加标记的抗抗体试剂来检测该抗原特异性的细胞俘获的抗体，并且可以是泛或同种型特异性。参见例如图8。
A可以是独立选择的抗CD38、抗CD138、抗CD45 CD45(包括全部异形体)、抗CD27、抗CD19、抗CD20(最优选抗CD38和CD138)。
B是抗原。
检测抗体可以是独立选择的抗CH1、抗Cκ、抗Cλ、泛同种型抗Fc、IgG1、2、3、4、IgE或IgA特异性抗Fc。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
实施例14-分泌可溶性分子的细胞的鉴定
根据本公开的双特异性蛋白质复合物用于鉴定产生用于分离、检测或靶向的可溶性分子的细胞的用途。
A-X结合在产生感兴趣的可溶性分子的细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合可溶性分子。通过X与Y之间的相互作用将分泌的可溶性分子俘获到细胞表面。然后可以通过添加对可溶性分子具有特异性的标记抗体来检测细胞俘获的分泌分子(和因此分泌它的细胞)，所述可溶性分子可能需要将在不同的表位上与B-Y靶向的表位结合。参见例如图9A。
A可以独立地选自表征感兴趣的细胞亚群的抗任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
B可以独立地选自抗任意可溶性分子细胞因子、趋化因子、激素等。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
实施例15–分泌可溶性分子的细胞的鉴定
根据本公开的双特异性蛋白质复合物用于鉴定产生用于分离、检测或靶向的可溶性分子的细胞的用途。
A-X结合在产生感兴趣的可溶性分子的细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合可溶性分子。通过X与Y之间的相互作用将分泌的可溶性分子俘获到细胞表面。然后可以通过添加对可溶性分子具有特异性的标记抗体来检测细胞俘获的分泌分子(和因此分泌它的细胞)，可能需要在B-Y所靶向的不同的表位结合所述可溶性分子。参见例如图9B。
A可以独立地选自表征感兴趣的细胞亚群的抗任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
B可以独立地选自抗任意可溶性分子细胞因子、趋化因子、激素等。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
实施例16-筛选细胞以确定哪种细胞类型产生特定的可溶性分子
根据本公开的双特异性蛋白质复合物用于鉴定哪种细胞亚组在混合细胞系统中产生感兴趣的可溶性分子的用途。
A-X结合可能产生感兴趣的可溶性分子的细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合可溶性分子。大量不同的A-X细胞表面特异性可以在不同的测定中与针对选定的可溶性分子的B-Y复合。通过X与Y之间的相互作用将分泌的可溶性分子俘获到细胞表面。然后可以通过添加对可溶性分子具有特异性、但在不同于B-Y靶向的表位结合的标记抗体来检测细胞俘获的分泌分子(和因此分泌它的细胞)。这种使用不同A-X特异性的能力有助于鉴定哪些细胞分泌特定的可溶性分子。
A可以独立地选自表征感兴趣的细胞亚群的抗任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
B可以独立地选自抗任意可溶性分子细胞因子、趋化因子、激素等。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
实施例17-筛选细胞以确定哪些细胞类型产生特定可溶性分子
根据本公开的双特异性蛋白质复合物用于鉴定哪种细胞亚群在混合细胞系统中产生感兴趣的可溶性分子的用途。
A-X结合可能产生感兴趣的可溶性分子的细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合可溶性分子。大量不同的A-X细胞表面特异性可以在不同的测定中与针对选定的可溶性分子的B-Y复合。通过X与Y之间的相互作用将分泌的可溶性分子俘获到细胞表面。然后可以通过添加对可溶性分子具有特异性、但在不同于B-Y靶向的表位结合的标记抗体来检测细胞俘获的分泌分子(和因此分泌它的细胞)。这种使用不同A-X特异性的能力有助于鉴定哪些细胞分泌特定的可溶性分子。
A可以独立地选自表征感兴趣的细胞亚群的抗任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
B可以独立地选自抗任意可溶性分子细胞因子、趋化因子、激素等。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
实施例18–筛选细胞以确定特定类型的细胞形成哪些可溶性分子
根据本公开内容的双特异性蛋白质复合物用于鉴定在混合细胞系统中特定的感兴趣的细胞亚群分泌哪些可溶性分子的用途。
A-X结合可能产生感兴趣的可溶性分子的混合细胞群中细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合可溶性分子。大量不同的B-Y可溶性分子特异性可以与针对选定的细胞表面分子的A-X复合。通过X与Y之间的相互作用将分泌的可溶性分子俘获到细胞表面。然后可以通过添加对可溶性分子具有特异性、但在不同于B-Y靶向的表位结合的标记抗体而检测细胞俘获的分泌性分子。这种易于使用不同B-Y特异性的能力有助于鉴定特定细胞分泌什么样的可溶性分子。
A可以独立地选自表征感兴趣的细胞亚群的抗任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
B可以独立地选自抗抗任意可溶性分子细胞因子、趋化因子、激素等。
X可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
Y可以为结合X的肽(例如GCN4)。
实施例19-筛选细胞以确定特定细胞类型形成哪些可溶性分子
根据本公开的双特异性蛋白质复合物用于鉴定在混合细胞系统中特定的感兴趣的细胞亚组分泌哪些可溶性分子的用途。
A-X结合在可能产生感兴趣的可溶性分子的混合细胞群中细胞上表达的细胞表面受体，并且B-Y结合可溶性分子。大量不同的B-Y可溶性分子特异性可以与针对选定的细胞表面分子的A-X复合。通过X与Y之间的相互作用将分泌的可溶性分子俘获到细胞表面。然后可以通过添加对可溶性分子具有特异性、但在不同于B-Y靶向的表位结合的标记抗体而检测细胞俘获的分泌性分子。这种易于使用不同B-Y特异性的能力有助于鉴定特定细胞分泌什么样的可溶性分子。
A可以独立地选自表征感兴趣的细胞亚群的抗任意细胞表面受体，例如CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR、Lin-1至Lin-3。
B可以独立地选自抗抗任意可溶性分子细胞因子、趋化因子、激素等。
Y可以为抗肽scFv或sdAb，例如52SR4。
X可以为结合Y的肽(例如GCN4)。
实施例20–从抗体分泌细胞的IgG俘获
分泌抗体的B细胞的区别之一在于它们从快速分裂细胞转变为非分裂细胞。在这种转变过程中，抗体分泌速速率异常地升高。这种从B细胞转变为浆细胞的标志是细胞表面IgG(也称为B细胞受体(BcR))的完全缺失。细胞表面IgG不仅可以用来表征由细胞产生的免疫球蛋白类型(例如IgG、IgA、IgE等)，而且可以表征其抗原特异性。伴随细胞表面IgG的这种变化还有经典B细胞分化标志物例如CD20、CD22和CD19的进行性缺失，并且伴随新标志物例如CD38和CD138的增加。这些变化的最终结果是浆细胞更难与其它细胞区分，特别是在组织中，并且在没有细胞表面免疫球蛋白的情况下，它们的性质和抗原特异性甚至更难以建立。充其量，目前可用于鉴定这类细胞的方法依赖于对细胞健康有害的处理，例如固定并透化细胞以测定胞内IgG的方案。使用所要求保护的技术，所描述的方法允许将可溶性IgG双重靶向并俘获至产生它的细胞的细胞表面，使得与使用BcR相关细胞的类似应用成为可能。这些包括细胞的表型分型、抗原测定、分离和分选。此外，该方法允许使用任何细胞受体来俘获分泌的IgG，其优点是利用比任何谱系标志物更高密度表达的受体，同时还仍然允许独立检测谱系标志物。这意味着可以在细胞表面俘获更多分泌的IgG，并允许鉴定对抗原具有较弱亲和力的更稀有的亚群或免疫球蛋白。此外，该方法可用于增强已经具有表面BcR的细胞的俘获。该方法在细胞表面结合配偶体和俘获试剂方面灵活且可互换。
以设计用于形成双特异性抗体的要求保护的形式表达抗CD138和抗CH1(IgG重链恒定区1特异性)抗体。为了测试抗CD138和抗CH1是否能够俘获分泌的IgG，首先使用模型系统。使用基于脂质的转染方案用人CD138和人IgG的基因共转染人HEK293细胞。作为对照，用空载体、单独的CD138、单独的IgG转染HEK293细胞或用CD138和IgG共转染。双特异性蛋白质复合物通过将Fab-Y形式(其中Y是GCN4肽或本文所述的任何异形体/衍生物)表达的抗CD138抗体与Fab-X形式(其中X是52SR4，如本文所述)表达的抗CH1抗体的等摩尔混合物混合来制备。将其预先孵育1小时，然后滴定，然后再与细胞一起孵育1小时，然后洗涤掉。如果CD138结合细胞表面并俘获IgG(通过结合CH1)，则可以用与APC缀合的多克隆山羊抗人重链和轻(H+L)链(IgG)特异性抗体检测它。然后可以使用流式细胞仪检测该结合。图19显示使用多克隆抗IgG H+L链特异性抗体只能检测到用CD138和IgG共转染的细胞而不是单独的CD138或IgG转染的细胞。在分开的实验中，使用可商购的抗CD138抗体来测定在转染的HEK293细胞上表达的CD138水平(数据未显示)。为了确定该方法是否可以应用于初级人抗体分泌细胞，根据Jourdan等人(Blood.114(25).pp5173)修改的方案生成人浆母细胞。该方法产生也是CD138阳性的抗体分泌细胞(如通过IgG ELISA测定)。另外，确定这些细胞具有极低水平的表面免疫球蛋白，这也是浆细胞或浆母细胞的另一个标志。图20比较了在加入到培养的人浆细胞中之前使用预先与抗CH1 Fab-X复合的CD138或CD45Fab-Y的用途。1小时后，洗涤细胞并使用多克隆抗H+L APC抗体测定细胞结合的IgG，并使用流式细胞仪检测细胞表面俘获。图20的图表示对于测试的特定构建体，在俘获人浆细胞表面上的IgG时CD45比CD138更成功。
为了确定该技术是否可用于浆细胞和T细胞的混合细胞培养物(以1：1或1：9的浆细胞与T细胞的比例)，将总细胞浓度固定为1×104个细胞/ml。将抗CD45-Y和抗CH-1-X组合一起预孵育1小时，然后将预先形成的双特异性复合物加入含有浆细胞和T细胞混合物的培养物中5分钟，然后洗涤掉。由于两种细胞均表达大致相同水平的CD45，因此，认为T细胞和浆细胞应当够俘获IgG(其只能由浆细胞分泌)。可以使用抗H+L APC缀合的抗体检测在细胞表面俘获的IgG，并且可以分别使用CD138和CD3抗体将浆细胞与T细胞区分开来。然后使用流式细胞仪检测细胞表面IgG结合。图21显示即使比例为1:1(浆细胞比T细胞)，与浆细胞相比，T细胞在其细胞表面俘获的IgG仍然极少。结合浆细胞的相对比率是T细胞的至少10倍。该数据表明，要求保护的技术可以选择性地俘获分泌IgG的细胞、而不是旁观者细胞产生的IgG。
序列表
<110> UCB生物制药私人有限公司
<120> 方法
<130> PF0052_WO01
<150> GB1521383.8
<151> 2015-12-03
<160> 104
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 44
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 26
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 27
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1 5 10 15
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20 25
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 28
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<220>
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<223> Linker
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<223> Linker
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<223> Linker
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<223> Linker
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20
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<223> Linker
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<223> Linker
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<223> Linker
<400> 64
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<223> Linker
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<213> Artificial Sequence
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<223> Linker
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<223> Linker
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Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<220>
<223> Linker
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Ala Ser Gly Gly Gly
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<220>
<223> Linker
<400> 74
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 75
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Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<213> artificial sequence
<220>
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Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Ala
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Ala Lys
20 25 30
Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Gln Lys
20 25 30
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<211> 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 96
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
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His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
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Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
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Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
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210 215 220
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala
225 230 235 240
Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala
245 250 255
Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe
260 265 270
Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys
275 280 285
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Met Gly Trp Ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ser Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser

Claims (48)

1.使用式A-X:Y-B的异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物的方法，其中：
A-X是第一种融合蛋白；
Y-B是第二种融合蛋白；
X:Y是异二聚体系链；
是X与Y之间的结合相互作用；
A是双特异性蛋白质复合物的第一种蛋白质成分，其选自抗体或其结合片段和抗原(包括例如蛋白质配体)；
B是多特异性蛋白质复合物的第二种蛋白质成分，其选自抗体或结合片段或抗原(包括例如蛋白质配体)；
X是结合对的第一种结合配偶体，其独立地选自抗原或抗体或其结合片段；且
Y是结合对的第二种结合配偶体，其独立地选自抗原或抗体或其结合片段；
其中A对细胞表面蛋白质(即细胞表面标志物)具有特异性，且
B俘获(例如结合)分泌自细胞的感兴趣的可溶性分子，
条件是当X是抗原时，Y是对X表示的抗原具有特异性的抗体或其结合片段，并且当Y是抗原时，X是对Y表示的抗原具有特异性的抗体或其结合片段，该方法包含下列步骤：
i)将未复合形式的融合蛋白A-X和B-Y的组合导入细胞用于分析，或加入异二聚体系连的双特异性蛋白质复合物形式的A-X:Y-B，并且
ii)检测A或B成分对感兴趣的可溶性分子的俘获(例如结合)。
2.权利要求1的方法，其中感兴趣的可溶性分子选自包含以下的组：激素，细胞因子，趋化因子，化学引诱物，白三烯，前列腺素，血管活性胺，酶，补体和补体片段，脂质，鞘脂，第二信使成分(例如；一氧化氮，cAMP等)，维生素，矿物质，阳离子，阴离子，糖，凝血因子，急性期蛋白，γ球蛋白(包括免疫球蛋白)，白蛋白，可溶性细胞膜受体，细胞表达蛋白的剪接变体，核酸，小膜囊泡(例如外来体，微泡，脂质体等)，分泌肽，免疫复合物和来自死亡或垂死细胞的胞内蛋白质。
3.权利要求2的方法，其中感兴趣的可溶性分子是细胞因子。
4.权利要求3的方法，其中细胞因子选自包含以下的组:IL-1a、IL-1b,IL-1Ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-3、IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36b、IL-36g、IL-37a、IL-37、IL-38,TNSF1、TNFSF2、TNFSF3、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13b、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、IFNa、IFNb、IFNe、IFNk、IFNw、IFNg、IFNl1、IFNl2、IFNl2、CSF1、CSF2、CSF3、TGFb1、TGFb2、TGFb3、CLC、CNTF、瘦素、OPG、LIF、Neuropoietin、制癌素M、NGF、BDNF、NT-3、PAI-1、RBP4、脂联素、Apelin、嵌合素、内脂素、硬骨素和DKK-1GM。
5.权利要求2的方法，其中感兴趣的可溶性分子是趋化因子。
6.权利要求5的方法，其中所述趋化因子选自包含以下的组：CCL1、2、3、4、5、6、7、8、9/10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、CXCL 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
7.权利要求2的方法，其中感兴趣的可溶性分子是免疫球蛋白。
8.权利要求7的方法，其中B对特定抗体同种型具有特异性，所述抗体同种型选自包含以下的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM及其片段。
9.权利要求8的方法，其中A对免疫球蛋白中的标志物没有特异性。
10.权利要求1至6任一项的方法，其中所述细胞表面标志物选自稳定表达的细胞谱系标志物和在非谱系细胞上稳定表达的标志物，例如，其中所述谱系细胞标志物选自包含以下的组：CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD33、CD38、CD56、CD57、CD64、CD80、CD83、CD86、CD123、CD127、CD137、CD138、CD196、CD209、HLA-DR和Lin-1至Lin-3。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中A对分泌抗体的细胞(包括B细胞和/或浆细胞)的标志物或T细胞标志物具有特异性。
12.权利要求11的方法，其中A对B细胞/浆细胞标志物具有特异性，所述标志物选自包含以下的组：CD38、CD138、CD45(及其所有同种型)、CD27、CD19或CD20(例如CD38或CD138)。
13.权利要求11的方法，其中A对B细胞标志物具有特异性，所述标志物为抗体轻链恒定区(包括其片段)或抗体重链恒定区，它们作为免疫球蛋白的一部分在细胞表面上表达。
14.权利要求13的方法，其中所述标志物对抗体同种型具有特异性，所述抗体同种型选自包含以下的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM及其片段。
15.权利要求14的方法，其中B对抗体同种型没有特异性。
16.权利要求11的方法，其中所述标志物是T细胞标志物，其选自包含以下的组：CD3、CD4、CD8、CD25、CD127CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD62L、CD69和CD45(及其所有异形体)。
17.权利要求1至16任一项的方法，其中A独立地选自全长抗体、Fab片段、Fab’片段、sdAb、VH、VL和scFv。
18.权利要求17的方法，其中A是Fab或Fab’片段，例如Fab。
19.权利要求1至16任一项的方法，其中A是抗原，例如在细胞表面上表达的受体的配体。
20.权利要求19的方法，其中细胞在其表面上表达对所述抗原具有特异性的免疫球蛋白。
21.权利要求1至19任一项的方法，其中B独立地选自抗体、Fab片段、Fab’片段、sdAb、VH、VL和scFv。
22.权利要求21的方法，其中B是Fab或Fab’片段，例如Fab片段。
23.权利要求1至19任一项的方法，其中B是抗原，包括配体。
24.权利要求1至23任一项的方法，其中X任选地通过接头融合至蛋白质成分A的C末端。
25.权利要求24的方法，其中X任选地通过接头融合至抗体或其结合片段的重链的C末端。
26.权利要求1至25任一项的方法，其中Y任选地通过接头融合至蛋白质成分B的C末端。
27.权利要求26的方法，其中Y任选地通过接头融合至抗体或其结合片段的重链的C末端。
28.权利要求1至27任一项的方法，其中X独立地选自scFv、sdAb和肽，条件是当X是肽时，Y是抗体或其结合片段，例如scFv或sdAb，并且当X是scFv或sdAb时，Y是抗原，例如肽。
29.权利要求1至28任一项的方法，其中Y独立地选自scFv、sdAb和肽，条件是当Y是肽时，X是抗体或结合片段，例如scFv或sdAb，并且当Y是scFv或sdAb时，X是抗原，例如肽。
30.权利要求28或29的方法，其中所述肽长为5至25个氨基酸。
31.权利要求1至30任一项的方法，其中X与Y之间的结合亲和力为5nM或更强。
32.权利要求31的方法，其中X与Y之间的结合亲和力为900pM或更强，例如800、700、600、500、400或300pM。
33.权利要求1至31任一项的方法，其中X或Y是对肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1-38)具有特异性的scFv或sdAb。
34.权利要求29的方法，其中scFv是52SR4(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的氨基酸1-243)。
35.权利要求1至34任一项的方法，其中X或Y是肽GCN4(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的氨基酸1-38)。
36.权利要求1至35任一项的方法，其中使用标记的蛋白质检测蛋白质成分B对可溶性分子的俘获。
37.权利要求36的方法，其中标记的蛋白质是抗体或其结合片段，例如全长抗体。
38.权利要求1至37任一项的方法，其中该方法是离体/体外的。
39.权利要求1至37任一项的方法，其中该方法是体内的。
40.权利要求1至38任一项的方法，其中平行使用多个双特异性蛋白质复合物。
41.权利要求40的方法，其中A具有固定的特异性，而B的特异性在所用的多个双特异性蛋白质复合物中是可变的。
42.权利要求40的方法，其中B具有固定的特异性，而A的特异性在所用的多个双特异性复合物中是可变的。
43.权利要求40至42任一项的方法，其中使用网格形式以便平行分析双特异性蛋白质复合物。
44.权利要求40至42任一项的方法，其中使用多重复合物形式以便平行分析双特异性蛋白质复合物。
45.权利要求1至44任一项的方法，其中首先向细胞中加入A-X用于分析。
46.权利要求45的方法，其中随后加入B-Y。
47.权利要求1至46任一项的方法，其中将A-X:B-Y作为预形成的复合物加入到细胞中用于分析。
48.前述权利要求任一项的方法，其中所述俘获诱导或防止所检测细胞上的进一步的生物学功能(例如抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡)。
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