JP2023514437A - Ｅｘ ｖｉｖｏガンマデルタｔ細胞集団 - Google Patents

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Abstract

本発明は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶγ４鎖に特異的に結合し、γδＴＣＲのガンマ可変２（Ｖγ２）鎖には結合しない抗体またはその断片を使用してガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。前記方法によって産生されたＶγ４Ｔ細胞の増殖された集団の治療方法及び他の使用もまた提供される。【選択図】図２Ａ

Description

本発明は、抗ＴＣＲガンマ可変４（抗Ｖγ４）抗体と接触したガンマデルタＴ細胞の集団に関する。
がんに対するＴ細胞免疫療法への関心の高まりは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋アルファベータ（αβ）Ｔ細胞のサブセットががん細胞を認識し、特にＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及び他の受容体により発揮される抑制経路の臨床的媒介拮抗作用によって抑制が解除された場合、宿主保護機能性を媒介する明らかな能力に焦点を当てている。しかし、αβＴ細胞は、移植片対宿主病を引き起こし得るＭＨＣ拘束性である。
ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）は、表面に別個の典型的なγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞のサブセットを表す。このＴＣＲは１つのガンマ（γ）鎖と１つのデルタ（δ）鎖で構成されており、鎖のそれぞれは鎖の再構成を受けるが、αβＴ細胞と比較してＶ遺伝子の数が限られている。Ｖγをコードする主なＴＲＶＧ遺伝子セグメントは、ＴＲＧＶ２、ＴＲＧＶ３、ＴＲＧＶ４、ＴＲＧＶ５、ＴＲＧＶ８、ＴＲＧＶ９、ならびに非機能遺伝子ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ１１、ＴＲＧＶＡ及びＴＲＧＶＢである。最も頻度の高いＴＲＤＶ遺伝子セグメントはＶδ１、Ｖδ２及びＶδ３をコードし、更にＶδ及びＶαの両方の名称を持ついくつかのＶセグメントをコードする（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２９６：３０－４０（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。ヒトγδＴ細胞はＴＣＲ鎖に基づいて大まかに分類できる。これは、特定のγ型及びδ型が、１つ以上の組織型において排他的ではないがより一般的に細胞で見いだされるためである。例えば、ほとんどの血液に存在するγδＴ細胞は、Ｖδ２ＴＣＲ、一般的にはＶγ９Ｖδ２を発現するが、これは、γ鎖と対になる、例えば腸内ではしばしばＶγ４と対になるＶδ１ＴＣＲをより頻繁に使用する皮膚などの組織に存在するγδＴ細胞においてはあまり一般的ではない。
しかしながら、現在に至るまで、Ｖγ４ＴＣＲとＶγ２ＴＣＲなどの他のＴＲＧＶファミリーメンバーとの間の高い相同性のために、Ｖγ４ＴＣＲのみを標的とし得るモダリティは不可能だった。したがって、Ｖγ４ＴＣＲに特異的に結合またはＶγ４ＴＣＲを特異的に調節するような特異性抗体を含む、Ｖγ４に特異的な抗体に対する未だ満たされていない必要性がある。
本発明の第１の態様によれば、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶγ４鎖に特異的に結合しかつγδＴＣＲのガンマ可変２（Ｖγ２）鎖には結合しない抗体またはその断片を、Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法が提供される。これは、同じ種からのＶγ４鎖及びＶγ２に関していることが理解されるべきである。好ましくは、本明細書に記載のすべての態様及び実施形態によれば、前記種はホモサピエンス（ヒト）であり、したがって本発明はまた、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のヒトガンマ可変４（Ｖγ４）鎖に特異的に結合しかつγδＴＣＲのヒトガンマ可変２（Ｖγ２）鎖には結合しない抗体またはその断片を投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法も提供する。例えば、ヒトＶγ４鎖は、配列番号１のアミノ酸１～９９による配列を有し得、及び／またはヒトＶγ２鎖は、配列番号３３５による配列を有し得る。他の種では、抗体またはその断片は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のヒトガンマ可変４（Ｖγ４）鎖の種特異的オルソログに特異的に結合し、γδＴＣＲのヒトガンマ可変２（Ｖγ２）鎖の種特異的オルソログには結合しない。したがって、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸１～９９に対応する配列を有するγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のヒトガンマ可変４（Ｖγ４）鎖またはその非ヒトオルソログに特異的に結合し得、配列番号３３５に対応する配列を有するγδＴＣＲのヒトガンマ可変２（Ｖγ２）鎖またはその非ヒトオルソログには結合しない可能性がある。この文脈におけるオルソログとは、参照配列に対して最も高い配列類似性を有するガンマ鎖配列、または好ましくは同じ機能（例えばｉｎ ｖｉｖｏでオルソロガスな同族リガンドとの相互作用）を有するものを意味し得る。例えば、マウスにおいて、Ｖγ７としてＨｅｉｌｉｇ＆Ｔｏｎｅｇａｖｅ命名法の下で指定されたタンパク質は、機能的にヒトＶγ４と最も密接に関連している（Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ，１６７：２０３－２１８．ｅ１７）。
これは、この分野にとって大きな進歩である。例えば、ヒトにおいて、Ｖγ４鎖とＶγ２鎖は、９つのアミノ酸が違うだけで相同性が高い（９１％の配列同一性）。これらの９つの変異のうちの３つはＣＤＲ１及びＣＤＲ２にまたがってマッピングし、一方でこれらの９つの変異のうち４つはフレームワーク領域３（ＦＲ３）のサブ領域－配列番号１のアミノ酸６７～８２－にマッピングする。Ｖγ４鎖とＶγ２鎖の間の配列の類似性が非常に高いため、γδＴＣＲのヒトＶγ４鎖とヒトＶγ２鎖の間を特異的に区別できる抗体またはその断片を開発することは不可能であると以前は考えられていた。驚くべきことに及び当技術分野における一般的な見解とは異なり、本発明者らは、本明細書でより詳細に記載される方法を使用してこのような抗体を開発することができた。したがって、本発明は、Ｖγ４含有γδＴＣＲを特異的に調節することができる抗体及びその断片を使用するｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。
本明細書に記載の抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上のアミノ酸残基を含むγδＴＣＲのヒトＶγ４鎖のエピトープに結合し得る。
本発明の更なる態様によれば、
配列番号２～４７のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０及び／または配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号４８～７０及び配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つ、好ましくは配列番号５６及び／またはＡ９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または、
配列番号７１～１１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号７９及び／または配列番号１０２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む、抗Ｖγ４抗体またはその断片を、
Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含むガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法が提供される。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
配列番号２～２４のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
配列番号４８～７０のいずれか１つ、好ましくは配列番号５６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、及び／または、
配列番号７１～９３のいずれか１つ、好ましくは配列番号７９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）のうちの１つ以上を含み得る。
あるいはまたは加えて、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
配列番号２５～４７のいずれか１つ、好ましくは配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、
配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つ、好ましくは配列番号Ａ９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び／または、
配列番号９４～１１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１１７～１３９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１２５と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）アミノ酸配列を含み得る。あるいはまたは加えて、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１４０～１６２のいずれか１つ、好ましくは配列番号１４８と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）アミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
（ａ）配列番号７９を有するＨＣＤＲ１、配列番号５６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２５を含むＶＨと、
配列番号１０２を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ９（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４８を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号８６を有するＨＣＤＲ１、配列番号６３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３２を含む、ＶＨと、
配列番号１０９を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１６（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５５を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号７３を有するＨＣＤＲ１、配列番号５０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１９を含むＶＨと、
配列番号９６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４２を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号８３を有するＨＣＤＲ１、配列番号６０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２９を含むＶＨと、
配列番号１０６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５２を含むＶＬ、
（ｅ）配列番号８４を有するＨＣＤＲ１、配列番号６１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３０を含むＶＨと、
配列番号１０７を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１４（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５３を含むＶＬ、
（ｆ）配列番号８８を有するＨＣＤＲ１、配列番号６５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３４を含むＶＨと、
配列番号１１１を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１８（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５７を含むＶＬ、
（ｇ）配列番号９２を有するＨＣＤＲ１、配列番号６９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３８を含むＶＨと、
配列番号１１５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６１を含むＶＬ、
（ｈ）配列番号７１を有するＨＣＤＲ１、配列番号４８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１７を含むＶＨと、
配列番号９４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４０を含むＶＬ、
（ｉ）配列番号７２を有するＨＣＤＲ１、配列番号４９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１８を含むＶＨと、
配列番号９５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４１を含むＶＬ、
（ｊ）配列番号７４を有するＨＣＤＲ１、配列番号５１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２０を含むＶＨと、
配列番号９７を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ４（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４３を含むＶＬ、
（ｋ）配列番号７５を有するＨＣＤＲ１、配列番号５２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２１を含むＶＨと、
配列番号９８を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ５（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４４を含むＶＬ、
（ｌ）配列番号７６を有するＨＣＤＲ１、配列番号５３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２２を含むＶＨと、
配列番号９９を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ６（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４５を含むＶＬ、
（ｍ）配列番号７７を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２３を含むＶＨと、
配列番号１００を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ７（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４６を含むＶＬ、
（ｎ）配列番号７８を有するＨＣＤＲ１、配列番号５５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２４を含むＶＨと、
配列番号１０１を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ８（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４７を含むＶＬ、
（ｏ）配列番号８０を有するＨＣＤＲ１、配列番号５７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２６を含むＶＨと、
配列番号１０３を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１０（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４９を含むＶＬ、
（ｐ）配列番号８１を有するＨＣＤＲ１、配列番号５８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２７を含むＶＨと、
配列番号１０４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５０を含むＶＬ、
（ｑ）配列番号８２を有するＨＣＤＲ１、配列番号５９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２８を含むＶＨと、
配列番号１０５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５１を含むＶＬ、
（ｒ）配列番号８５を有するＨＣＤＲ１、配列番号６２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３１を含むＶＨと、
配列番号１０８を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１５（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５４を含むＶＬ、
（ｓ）配列番号８７を有するＨＣＤＲ１、配列番号６４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３３を含むＶＨと、
配列番号１１０を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１７（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５６を含むＶＬ、
（ｔ）配列番号８９を有するＨＣＤＲ１、配列番号６６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３５を含むＶＨと、
配列番号１１２を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１９（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５８を含むＶＬ、
（ｕ）配列番号９０を有するＨＣＤＲ１、配列番号６７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３６を含むＶＨと、
配列番号１１３を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２０（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５９を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号９１を有するＨＣＤＲ１、配列番号６８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３７を含むＶＨと、
配列番号１１４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６０を含むＶＬ、
及び／または、
（ｗ）配列番号９３を有するＨＣＤＲ１、配列番号７０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３９を含むＶＨと、
配列番号１１６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６２を含むＶＬ、のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１６３～１８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号２３３～２５５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。関連する実施形態において、抗Ｖγ４抗体は、配列番号２８４～３０６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０７～３２９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶγ４鎖に特異的に結合し、本明細書で定義される抗体またはその断片によるγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶγ４鎖への結合に競合する。
本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義されるｅｘ ｖｉｖｏ方法によって得られるＶγ４Ｔ細胞集団が提供される。
本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義されるＶγ４Ｔ細胞集団を含む組成物が提供される。
本発明の更なる態様によれば、任意選択で薬学的に許容される希釈剤または担体と共に、本明細書で定義されるＶγ４Ｔ細胞集団を含む医薬組成物が提供される。
本発明の更なる態様によれば、薬剤として使用するための本明細書で定義される本発明の医薬組成物が提供される。同様に、治療上有効な量の本発明の抗Ｖγ４Ｔ細胞集団または本明細書で定義される本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の疾患または障害（例えば、がん、感染性疾患または炎症性疾患）を治療する方法が提供される。
例示的な抗Ｖγ４抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列。本明細書に記載の例示的な抗Ｖγ４抗体のＣＤＲ配列が示される。対応する配列番号を各配列の右側に示す。 ＤＥＬＦＩＡ Ｅｌｉｓａアッセイによるヘテロ二量体ＴＣＲ抗原に対する抗体特異性。（Ａ）ＱＣ評価（分析用ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）に合格し、ヒトＶγ４鎖に対する特異性も示したすべての抗体の結果を示す。これらの抗体（Ｘ軸）は、それぞれ４つの異なる組換えヘテロ二量体のヒトＴＣＲ（ＤＶ１－ＧＶ４、ＤＶ２－ＧＶ４、ＤＶ１－ＧＶ２、ＤＶ１－ＧＶ８）に対する結合について試験した。対照には、アイソタイプ対照抗ニワトリリゾチームＤ１．３抗体（自社製、左端）に加えて、抗Ｖδ１抗体ＲＥＡ１７３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＴＳ８．２（Ｆｉｓｈｅｒ）－右端が含まれる。（Ｂ）（Ａ）に示したデータの定量化、更に各例示のクローンのヒトＶγ４鎖対ヒトＶγ２鎖への結合の倍数変化の増加を示す。 組換え抗原または組換え細胞表面受容体のいずれかとして示されるＶγ４Ｖδ１ＴＣＲに結合する抗体の比較。（Ａ）Ｄｅｌｆｉａ ＥＬＩＳＡを介したＤＶ１－ＧＶ４抗原（Ｙ軸）またはＪＲＴ３－ｈｕ１７細胞（Ｘ軸）のいずれかに結合する抗体の正規化及び対数変換Ｘ／Ｙプロット。垂直の灰色の点線は、この実験のＪＲＴ３－ｈｕ１７結合について陰性（左）及び陽性（右）とみなされたｍＡｂのカットオフを示す。Ｘ軸のｇＭＦＩシグナルは、各構築物間のＴＣＲ発現の変動を説明するためにＣＤ３に正規化した。（Ｂ）陰性／陽性カットオフを更に示すフローデータプロット。抗体Ｇ４＿２６（中央左の図）は陰性群の中で最も高い正規化されたｇＭＦＩ値を示し、陰性アイソタイプ対照（Ｄ１．３、左端の図）と同様のプロットを示す。Ｇ４＿１５（中央の図）は、陽性群の中で最も低い正規化されたｇＭＦＩ値を有し、Ｄ１．３アイソタイプ対照と比較した場合、弱いながらも明確な染色の増強を示す。中間（Ｇ４＿１６、中央右）及び強力（Ｇ４＿１８、右端）なシグナルの例も参照用に提供されている。 異なるＣＤＲ３配列を含有する及び／または異なるデルタ鎖と対になった組換え発現γ４ＴＣＲの図に対する抗体結合。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞で発現した組換えＴＣＲに対して作製された抗体結合シグナルのヒストグラム表現。系列分析は以下のように示された。Ｖγ４Ｖδ１－ｈｕ１７に対する抗体結合シグナル（黒い棒）、Ｖγ４Ｖδ１－ｈｕ２０に対する抗体結合シグナル（横縞の棒）、Ｖγ４Ｖδ２ｈｕ２０γ－ＰＢδに対する抗体結合シグナル（斜めのストライプの棒）、Ｖγ４Ｖδ５－ＬＥＳに対する抗体結合シグナル（白い棒）。ＪＲＴ３細胞内の異なるＴＣＲコンストラクト間のＴＣＲ発現の変動を説明するために、ＣＤ３に正規化されたすべての結合シグナル。（Ｂ）すべてのＶγ４ＴＣＲに対して陽性を示した例示の抗体（Ｇ４＿３）対一部のＶγ４ＴＣＲに対してのみ陽性を示した別のリード抗体（Ｇ４＿４）の間の違いを更に説明するための、この実験における２つのリード抗体のフローデータの例。 ＪＲＴ３細胞で発現したキメラｈｕ１７ＴＣＲに対する抗体結合及びエピトープマッピング。（Ａ）示されたキメラｈｕ１７構築物の生殖細胞系列にコードされたガンマ可変領域のアラインメントが提示されている。スペースの制限により、成熟Ｖγ２／３／４配列の最初の１０のアミノ酸（配列番号２５６のアミノ酸１～１０［ＳＳＮＬＥＧＲＴＫＳ］）は省略されているが、すべての構築物で同一であることに留意されたい。参照ｈｕ１７配列とは異なるアミノ酸（野生型Ｖγ４ＴＣＲ）が示されている。（Ｂ）示されたキメラＴＣＲ構築物に対する各抗体の反応性をまとめた表。結果は、ＪＲＴ３細胞で発現した個々のＴＣＲに対する示された各抗体の相対的な結合特異性を強調している。（Ｃ）この実験で観察された異なる結合シグナルを説明するためのエピトープマッピングのフローデータの例。 Ｖγ４ＴＣＲ（ｈｕ１７）発現細胞の抗体結合及び付与された機能の例。（Ａ）ＪＲＴ３－ｈｕ１７細胞に結合したすべての例示の抗体を示すＪＲＴ３－ｈｕ１７への抗体の滴定結合。ｈｕ１７の発現が抗体結合に必須であることを示す、陰性対照として使用された非形質導入ＪＲＴ３細胞（ＴＣＲなし）。（Ｂ）滴定抗体によって付与されたＴＣＲ下方制御対陽性対照抗体：抗ＣＤ３ε（ＵＣＨＴ－１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗ｐａｎ－ＴＣＲγδ（Ｂ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって付与された下方制御。（Ｃ）滴定抗体によって付与されたＣＤ６９上方制御対比較抗体：抗ＣＤ３ε（ＵＣＨＴ－１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗ｐａｎ－ＴＣＲγδ（Ｂ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって観察された上方制御。 初代Ｖγ４陽性細胞の抗体標的化及び調節の例。（Ａ）すべての例示的な抗体が用量依存的に初代皮膚由来Ｖγ４＋Ｔ細胞に結合できることを示す、２人の個別のドナーの皮膚から増えた初代Ｖγ４＋Ｔ細胞への抗Ｖγ４抗体の滴定結合。アイソタイプ対照を、例示の抗体のＶγ４に対する特異性を示す陰性対照として使用した。（Ｂ）実質的にすべての例示の抗体が初代血液由来Ｖγ４＋Ｔ細胞に結合できることを示す、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来Ｖγ４＋Ｔ細胞への抗Ｖγ４抗体の結合。ＲＳＶアイソタイプ対照を陰性対照として使用した。（Ｃ）この細胞集団に３つの例示の抗体すべてが結合することを示す、抗Ｖγ４抗体Ｇ４＿３、Ｇ４＿１２及びＧ４＿１８の結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者からの腸由来上皮内リンパ球（ＩＥＬ）への結合。細胞を、単一の生γδ＋、ＩｇＧ１＋（Ｖγ４）＋としてゲーティングした。（Ｄ）例示の抗体Ｇ４＿１８を使用してＶγ４＋細胞を同定できることを示す、抗Ｖγ４抗体で刺激する前の腸消化物中のＶγ４＋γδＴ細胞の表現型。単一の生細胞の１．４％はＶδ１＋である。これらのうち、４４．２％がＶγ４と対になっており、これらは組織残留のマーカーを表示した（ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋）。（Ｅ）代表的なＦＡＣＳプロットで示す、例示の抗体Ｇ４＿１２及びＧ４＿１８それぞれによって付与されたＴＣＲ下方制御対アイソタイプ陰性対照によって付与された下方制御。 初代ヒトＶγ４Ｔ細胞の数を増やすためのＶγ４特異的抗体の使用。（Ａ）ＩＬ－２またはＩＬ－２＋ＩＬ－１５の存在下で、アイソタイプ対照と比較したプレート結合抗Ｖγ４クローンＧ４＿１２とＰＢＭＣの１４日間の培養後、Ｖγ４Ｔ細胞の増加を説明するための例示のフローデータ（クローンＧ４＿１８で染色することによって決定）。（Ｂ）ＩＬ－２またはＩＬ－２＋ＩＬ－１５の存在下で、アイソタイプ対照と比較したプレート結合抗Ｖγ４クローンＧ４＿１２と２人のドナーからのＰＢＭＣの培養の７日後（上段）及び１４日後（下段）のＶγ４Ｔ細胞の増加のまとめ（クローンＧ４＿１８で染色することによって決定）。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、下記のそれぞれ与えられる意味を有する。
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、表面に別個の典型的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞のサブセットを表す。このＴＣＲは、１つのガンマ（γ）鎖及び１つのデルタ（δ）鎖から構成されている。各鎖には、可変（Ｖ）領域、定常（Ｃ）領域、膜貫通領域、及び細胞質尾部が含まれている。Ｖ領域には、抗原結合部位が含まれている。ヒトγδＴ細胞には２つの主要なサブタイプがあり、１つは末梢血で優勢であり、もう１つは非造血組織で優勢である。２つのサブタイプは、細胞に存在するδ及び／またはγの種類によって定義され得る。例えば、血液に存在するγδＴ細胞の多くはＶδ２ＴＣＲ、例えばＶγ９Ｖδ２を発現するが、これは組織に存在するγδＴ細胞ではあまり一般的ではなく、例えば皮膚ではＶδ１を、腸ではＶγ４をより頻繁に使用する。「Ｖγ４Ｔ細胞」とは、Ｖγ４鎖を有するγδＴ細胞、すなわちＶγ４＋細胞を指す。
「ガンマ可変４」とは、Ｖγ４またはＶｇ４とも称され得る。ガンマ可変４ポリペプチド、またはこの領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、「ＴＲＧＶ４」と称され得る。γδＴＣＲのＶγ４鎖と相互作用する抗体またはその断片はすべて、事実上、Ｖγ４に結合する抗体またはその断片であり、「抗ＴＣＲガンマ可変４抗体またはその断片」または「抗Ｖγ４抗体またはその断片」と称され得る。ヒトＶγ４ポリペプチドとは、配列番号１のアミノ酸１～９９に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し得る。この９９のアミノ酸配列は、配列番号３３４にも対応する。したがって、配列番号１のアミノ酸１～９９への本明細書での言及は、本発明のすべての態様及び実施形態にしたがって配列番号３３４への言及と交換可能に使用され得ることを理解されたい。例えば、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２への本明細書での言及は、配列番号３３４のアミノ酸領域６７～８２と同等であり、本明細書で交換可能に使用され得る。
「デルタ可変１」とは、Ｖδ１またはＶｄ１とも称され得る。デルタ可変１ポリペプチド、またはこの領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、「ＴＲＤＶ１」と称され得る。γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片はすべて、事実上、Ｖδ１に結合する抗体またはその断片であり、「抗ＴＣＲデルタ可変１抗体またはその断片」または「抗Ｖδ１抗体またはその断片」と称され得る。ヒトＶδ１ポリペプチドとは、配列番号３３７に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し得る。
「ガンマ可変２」とは、Ｖγ２またはＶｇ２とも称され得る。ガンマ可変２ポリペプチド、またはこの領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、「ＴＲＧＶ２」と称され得る。γδＴＣＲのＶγ２鎖と相互作用する抗体またはその断片はすべて、事実上、Ｖγ２に結合する抗体またはその断片であり、「抗ＴＣＲガンマ可変２抗体またはその断片」または「抗Ｖγ２抗体またはその断片」と称され得る。ヒトＶγ２ポリペプチドとは、配列番号３３５に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し得る。
「ガンマ可変８」とは、Ｖγ８またはＶｇ８とも称され得る。ガンマ可変８ポリペプチド、またはこの領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、「ＴＲＧＶ８」と称され得る。γδＴＣＲのＶγ８鎖と相互作用する抗体またはその断片はすべて、事実上、Ｖγ８に結合する抗体またはその断片であり、「抗ＴＣＲガンマ可変８抗体またはその断片」または「抗Ｖγ８抗体またはその断片」と称され得る。ヒトＶγ８ポリペプチドとは、配列番号３３６に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し得る。
「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位（ＡＢＳ）を含む、少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む、任意の抗体タンパク質構築物を含む。抗体には、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（及び、そのサブタイプ）の免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されない。２つの同一の重鎖（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの同一の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドから組み立てられた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の全体的な構造は十分に確立されており、哺乳動物で高度に保存されている（Ｐａｄｌａｎ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９－２１７）。
従来の抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。各鎖は、定常領域と可変ドメインに分割される。重（Ｈ）鎖可変ドメインは本明細書ではＶＨと略され、軽（Ｌ）鎖可変ドメインは本明細書ではＶＬと略される。これらのドメイン、それに関連するドメイン及びそれに由来するドメインは、本明細書では免疫グロブリン鎖可変ドメインと称され得る。ＶＨドメイン及びＶＬドメイン（ＶＨ領域及びＶＬ領域とも称される）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される領域に更に分割され得る。フレームワーク領域及び相補性決定領域は、明確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ９１－３２４２）。ＣＤＲ配列について別の番号付け規則もある。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７－８８３に記載。従来の抗体において、各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。２つの重免疫グロブリン鎖及び２つの軽免疫グロブリン鎖の従来の抗体四量体は、例えばジスルフィド結合によって相互接続された重免疫グロブリン鎖及び軽免疫グロブリン鎖、ならびに同様に接続された重鎖で形成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインである。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。
本明細書で使用する場合、抗体の断片（「抗体断片」、「免疫グロブリン断片」、「抗原結合断片」または「抗原結合ポリペプチド」とも称され得る）は、標的に特異的に結合する抗体の一部（または前記一部を含有する構築物）、γδＴ細胞受容体のガンマ可変４（Ｖγ４）鎖（例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが標的に特異的に結合する分子）と称される。抗体断片という用語に含まれる結合断片の例には、以下が含まれる。
（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂ断片からなる二価の断片）、
（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる）、
（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一群のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、
（ｖ）一本鎖可変断片ｓｃＦｖ（組換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって１価の分子を形成する１本のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーによって結合したＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、
（ｖｉ）ＶＨ（ＶＨドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉ）ＶＬ（ＶＬドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉｉ）ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかからなる）、
（ｉｘ）ミニボディ（ＣＨ３ドメインを介して結合されているｓｃＦｖ断片の対からなる）、
（ｘ）ダイアボディ（小さなペプチドリンカーによって別の抗体からのＶＬドメインに接続された１つの抗体からのＶＨドメインからなる、ｓｃＦｖ断片の非共有結合二量体からなる）。
「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。前記ヒト抗体を投与されたヒト対象は、前記抗体内に含有される一次アミノ酸に対する種間抗体応答（例えば、ＨＡＭＡ－ヒト抗マウス抗体－応答と称される）を生成しない。前記ヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発または体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、前記用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図していない。宿主細胞内に形質転換された組換え発現ベクターを使用して発現した抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入した動物（例えば、マウス）から単離された抗体など組換え手段により調製、発現、作成もしくは単離されたヒト抗体、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含有する任意の他の手段により調製、発現、作成もしくは単離された抗体は、「組換えヒト抗体」とも称され得る。
非ヒト免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域の少なくとも１つのアミノ酸残基をヒト可変ドメインからの対応する残基で置換することは、「ヒト化」と称される。可変ドメインのヒト化は、ヒトの免疫原性を低下させ得る。
「特異性」とは、特定の抗体もしくはその断片が結合できる異なる種類の抗原または抗原決定基の数を指す。抗体の特異性は、特定の抗原を固有の分子実体として認識し、それを別の抗原と区別する抗体の能力である。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野でよく理解されている用語である。分子が、他の標的との反応よりも特定の標的抗原またはエピトープとより頻繁に、より迅速に、より持続的に及び／またはより高い親和性で反応する場合、前記分子は「特異的結合」を示すと言われる。抗体が、他の物質と結合するよりも高い親和性、結合活性で、より容易に及び／または高い持続性で結合する場合、前記抗体は、標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。結合が関連性のない結合剤と比較して統計的に有意である場合、抗体（またはその断片）は、標的に特異的に結合するとみなされ得る。
抗原と抗原結合ポリペプチドとの解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される「親和性」とは、抗原決定基と抗体（またはその断片）上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度である。ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合ポリペプチドとの間の結合強度は強くなる。あるいは、親和性は、親和定数（ＫＡ）、１／ＫＤとして表すこともできる。親和性は、目的の特定の抗原に応じて、既知の方法で決定することができる。例えば、ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定され得る。
１０－６未満の任意のＫＤ値は、結合を示しているとみなされる。抗体またはその断片の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば蛍光アッセイを使用）、ならびに当技術分野で既知のこれらの様々な変形を含む、任意の適切な既知の方法で決定することができる。
「結合活性」は、抗体またはその断片と関連する抗原との間の結合の強さの尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗体上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗体上に存在する適切な結合部位の数の両方に関連している。
「ヒト組織Ｖγ４＋細胞」ならびに「造血及び血液Ｖγ４＋細胞」ならびに「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）Ｖγ４＋細胞」は、それぞれヒト組織もしくは造血血液系もしくはヒト腫瘍に含まれる、またはそれらに由来するＶγ４＋細胞として定義される。すべての前記細胞型は、それらの（ｉ）位置またはそれらが由来する場所、及び（ｉｉ）Ｖγ４＋ＴＣＲのそれらの発現によって同定することができる。
適切には、抗体またはその断片（すなわち、ポリペプチド）は単離される。「単離された」ポリペプチドは、元の環境から取り出されたものである。「単離された」という用語を使用して、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、Ｖγ４に特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、Ｖγ４以外の他の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことができる。「単離された」という用語を使用して、医薬組成物の有効成分として処方された場合、単離された抗体が、治療的に投与されるのに十分な純度である、または少なくとも７０％～８０％（ｗ／ｗ）の純度である、より好ましくは少なくとも８０％～９０％（ｗ／ｗ）の純度である、更により好ましくは９０～９５％の純度である、及び最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％（ｗ／ｗ）の純度である調整剤を指すこともできる。
適切には、本発明で使用されるポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ポリヌクレオチドは、元の環境から除去されたものである。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは、それが天然系で共存する材料のいくつかまたはすべてから分離されている場合に単離されている。ポリヌクレオチドは、例えば、それがその自然環境の一部ではないベクターにクローン化されている場合、またはそれがｃＤＮＡ内に含まれている場合、単離されたとみなされる。
抗体またはその断片は、天然に存在する対立遺伝子変異体及び突然変異体または他の任意の天然には存在しない変異体も含む「機能的に活性な変異体」であり得る。当技術分野で既知なように、対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有することを特徴とする（ポリ）ペプチドの代替形態である。非限定的な例として、ＣＤＲを含有するフレームワークが改変されるとき、ＣＤＲ自体が改変されるとき、前記ＣＤＲが代替のフレームワークにグラフトされるとき、またはＮ末端もしくはＣ末端の伸長が組み込まれるとき、前記機能的に活性な変異体は依然として機能し得る。更に、ＣＤＲ含有結合ドメインは、別の抗体と共有されるものなどの異なるパートナー鎖と対にされ得る。いわゆる「共通の」軽鎖または「共通の」重鎖と共有した場合、前記結合ドメインは依然として機能し得る。更に、前記結合ドメインは、多量体化されたときに機能し得る。更に、「抗体またはその断片」はまた、ＶＨもしくはＶＬもしくは定常ドメインが異なるカノニカル配列（例えば、ＩＭＧＴ．ｏｒｇに記載されているような）から離れてまたはそれに向かって改変され、かつ依然として機能する機能性変異体を含み得る。
２つの密接に関連するポリペプチド配列を比較する目的で、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「％の配列同一性」とは、ポリペプチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＰ）を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴｖ２．０を使用して計算され得る。２つの密接に関連するポリヌクレオチド配列を比較する目的で、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「％の配列同一性」とは、ヌクレオチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＮ）を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴｖ２．０を使用して計算され得る。
ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、それらがその全長にわたって１００％の配列同一性を共有する場合、他のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と同じまたは「同一」であると言われる。配列内の残基は、左から右に、すなわちポリペプチドのＮ末端からＣ末端に、ポリヌクレオチドの５’末端から３’末端に番号が付けられる。
いくつかの実施形態において、配列の任意の特定の％の配列同一性とは、抗体の６つすべてのＣＤＲの配列なしで計算される。例えば、抗Ｖγ４抗体またはその抗原結合断片は、特定の可変重鎖領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する可変重鎖領域配列、及び／または特定の可変軽鎖領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する可変軽鎖領域配列を含み得、任意のアミノ酸変異は、可変重鎖領域配列及び可変軽鎖領域配列のフレームワーク領域でのみ発生する。そのような実施形態において、特定の配列同一性を有する抗Ｖγ４抗体またはその断片は、対応する抗Ｖγ４抗体またはその断片の完全な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２ならびにＣＤＲ３配列を保持する。
配列間の「差異」とは、第１の配列と比較して、第２の配列の位置における単一のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指す。２つのポリペプチド配列は、１つ、２つまたはそれ以上のそのようなアミノ酸の差異を含むことができる。第１の配列と他の点では同一である（１００％の配列同一性）第２の配列の挿入、欠失または置換により、配列同一性の割合が減少する。例えば、同一の配列が９アミノ酸残基長である場合、第２の配列の１つの置換により、８８．９％の配列同一性になる。第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列が９のアミノ酸残基長であり、６の同一の残基を共有する場合、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、６６％を超える同一性を共有する（第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、６６．７％の同一性を共有する）。
あるいは、第１の参照ポリペプチド配列を第２の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第２の配列を生成するために第１の配列に対して行われた付加、置換及び／または欠失の数は確認され得る。「付加」とは、第１のポリペプチドの配列への１つのアミノ酸残基の付加である（第１のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む）。「置換」とは、第１のポリペプチドの配列における１つのアミノ酸残基を１つの異なるアミノ酸残基で置換することである。前記置換は、保存的でも非保存的でもよい。「欠失」とは、第１のポリペプチドの配列からの１つのアミノ酸残基の欠失である（第１のポリペプチドのいずれかの末端での欠失を含む）。
３文字及び１文字の表記を使用して、天然に存在するアミノ酸は以下のように表される。グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）及びスレオニン（ＴまたはＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸またはアスパラギンであり得る場合、記号ＡｓｘまたはＢを使用し得る。残基がグルタミン酸またはグルタミンである得る場合、記号ＧｌｘまたはＺを使用し得る。文脈で別段の定めがない限り、アスパラギン酸への言及にはアスパラギン酸塩が含まれ、グルタミン酸にはグルタミン酸塩が含まれる。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられ、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんど影響を及ぼさないと予想されるアミノ酸置換である。そのような保存的置換は、適切には、以下の群内の１つのアミノ酸が同じ群内からの別のアミノ酸残基によって置換される置換である。

Figure 2023514437000002
適切には、疎水性アミノ酸残基は非極性アミノ酸である。より適切には、疎水性アミノ酸残基は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＣから選択される。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンから選択される。
本明細書で使用する場合、ポリペプチド配列の番号付けならびにＣＤＲ及びＦＲの定義は、Ｋａｂａｔシステムに従って定義されるとおりである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「対応する」アミノ酸残基は、第２の配列のアミノ酸残基とＫａｂａｔシステムに従って同じ位置を共有する第１の配列のアミノ酸残基であり、一方で第２の配列は、第１の配列とは同一性が異なる場合がある。フレームワーク及びＣＤＲがＫａｂａｔの定義に従って同じ長さである場合、適切に対応する残基は同じ番号（及び文字）を共有する。アラインメントは、手動で、または例えば、標準設定を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮ）などの配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用することによって達成することができる。
本明細書での「エピトープ」とは、抗体またはその断片によって特異的に結合される標的の一部を指す。エピトープは「抗原決定基」とも称され得る。抗体は、両方が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、別の抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同一または重複するエピトープに結合するかどうかを判断するために一般的に使用される方法は、競合アッセイである。これは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して複数の様々な形式で構成され得る（例えば、放射性標識もしくは酵素標識を使用したウェルプレート、または抗原発現細胞でのフローサイトメトリー）。抗体は、両方が同一のエピトープを認識する場合（つまり、抗原と抗体の間のすべての接触点が同じである場合）、別の抗体と「同じエピトープ」に結合する。例えば、抗体／抗原架橋結合ＭＳ、ＨＤＸ、Ｘ線結晶解析、クライオ電子顕微鏡、突然変異誘発などの特性評価法を用いて、抗原の特定領域におけるすべての接触点が同じであると同定された場合、抗体は別の抗体と同じエピトープに結合し得る。
更に、このような特性評価法を活用して、同一の接触点のすべてではないがいくつかを認識することによって、本質的に同じエピトープに結合する抗体を特性評価することも可能である。具体的には、このような抗体は、特定の抗原領域において十分な数の同一の接触点を共有して、ほぼ同等の技術的効果及び／または同等の抗原相互作用の選択性を提供し得る。更に、抗体が本質的に同じエピトープを認識し、ほぼ同等の技術的効果及び／または相互作用の選択性を付与するいくつかの場合において、最Ｎ末端の抗原接触点から最Ｃ末端の抗原接触点までを含む抗原接触の全体によってエピトープ結合フットプリントを定義することも有用であり得る。
タンパク質標的に見られるエピトープは、「線状エピトープ」または「配座エピトープ」として定義され得る。線状エピトープは、タンパク質抗原のアミノ酸の連続配列によって形成される。配座エピトープは、タンパク質配列が不連続であるが、タンパク質がその三次元構造に折りたたまれると一緒になるアミノ酸で形成されている。
本明細書で使用する場合「ベクター」という用語は、核酸分子であって、それが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すよう意図されている。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターならびにエピソーム哺乳動物及び酵母ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それらが作動可能に結合された遺伝子の発現を司ることができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、同じ意味で使用され得る。しかしながら、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）、ならびにバクテリオファージ及びファージミド系などの他の形態の発現ベクターも含むことが意図されている。本明細書で使用する場合、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図されている。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、例えば、子孫が、その後任意に保存、提供、販売、譲渡、または本明細書に記載の抗体またはその断片を製造するために利用される細胞株または細胞バンクを作製するために利用される場合、このような細胞の前記子孫を指すことが意図されている。
「対象」、「患者」または「個人」とは、治療される対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（ウシなど）、競技用動物、またはイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラットもしくはマウスなどの愛玩動物が含まれる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。代替の実施形態において、対象はマウスなどの非ヒト哺乳動物である。
「十分な量」という用語は、所望の効果を生成するのに十分な量を意味する。「治療上有効な量」という用語は、疾患または障害の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療とみなすことができるため、治療上有効な量は「予防上有効な量」であり得る。
疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、このような徴候もしくは症状が対象によって経験される頻度、またはその両方が減少した場合、疾患または障害は「改善」されている。
本明細書で使用する場合、「疾患または障害を治療すること」とは、対象が経験した疾患もしくは障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状の頻度及び／または重症度を低減することを意味する。
本明細書で使用する場合、「がん」とは、細胞の異常な増殖または分裂を指す。一般的に、がん細胞の増殖及び／または寿命は、その周囲の正常な細胞及び組織の増殖及び／または寿命を超えており、協調していない。がんは、良性、前悪性または悪性であり得る。がんは、様々な細胞及び組織で発生する。
「炎症」とは、炎症を起こした細胞、細胞型、組織もしくは臓器をもたらす慢性または急性の免疫系の誘発を指す。
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、指定された値より１０％大きいもの及び１０％低いものを含み、好適には指定された値より５％大きいもの及び５％低いものを含み、特に指定された値を含む。「間」という用語には、指定された境界の値が含まれる。
γδＴ細胞を調節する方法
本発明の第１の態様によれば、本明細書で定義される抗Ｖγ４抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４鎖（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法が提供される。抗体またはその断片を「投与する」ことは、Ｖγ４Ｔ細胞と「接触させる」ことを含むことが理解されるであろう。
Ｖγ４Ｔ細胞の調節には、
－例えば、Ｖγ４Ｔ細胞の数を選択的に増加させることまたはＶγ４Ｔ細胞の生存を促進することによる、Ｖγ４Ｔ細胞の増殖、
－例えば、Ｖγ４Ｔ細胞能力を増加させる、すなわち標的細胞殺傷を増加させることによる、Ｖγ４Ｔ細胞の刺激、
－例えば、Ｖγ４Ｔ細胞の持続性を増加させることによる、Ｖγ４Ｔ細胞枯渇の防止、
－Ｖγ４Ｔ細胞の脱顆粒、
－例えば、Ｖγ４ＴＣＲ細胞表面発現の下方制御による、すなわち、Ｖγ４ＴＣＲのインターナリゼーションもしくはＶγ４ＴＣＲタンパク質の発現低下を引き起こすことによる、またはＶγ４ＴＣＲを結合から遮断することによる、Ｖγ４Ｔ細胞の免疫抑制、
－例えば、Ｖγ４Ｔ細胞増殖を抑制することによる、またはＶγ４Ｔ細胞死を誘発することによる（すなわち、Ｖγ４Ｔ細胞を殺傷する）、Ｖγ４Ｔ細胞数の減少が含まれ得る。
Ｖγ４Ｔ細胞のそのような調節には、例えば、Ｖγ４Ｔ細胞の活性化またはＶγ４Ｔ細胞の阻害が含まれ得る。一実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞は、本明細書で定義される抗Ｖγ４抗体またはその断片を投与することによって活性化される。代替的な実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞は、本明細書で定義される抗Ｖγ４抗体またはその断片を投与することによって抑制される。代替的な実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞は、本明細書で定義される抗Ｖγ４抗体またはその断片を投与する際に抑制されない。
一実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞の調節は、抗ＴＣＲガンマ４可変抗体またはその断片を培養中のＶγ４Ｔ細胞に投与することを含む（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）。Ｖγ４Ｔ細胞は、混合細胞集団、例えば、他のリンパ球細胞型（例えば、αβＴ細胞またはＮＫ細胞）を含む細胞集団中に存在し得る。
一実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団は、抗Ｖγ４抗体またはその断片の投与前に単離される（すなわち、本明細書に記載の試料から）。更なる実施形態において、細胞集団は、抗Ｖγ４抗体またはその断片の投与前にＴ細胞を濃縮する。更なる実施形態において、細胞集団は、抗Ｖγ４抗体またはその断片の投与前にγδＴ細胞を濃縮する。
方法はまた、γδＴ細胞の精製された画分を含む細胞集団で実施され得る。そのような実施形態において、細胞集団は、抗Ｖγ４抗体またはその断片の投与前に、試料中に存在するαβＴ細胞及び／またはＮＫ細胞などのγδＴ細胞以外の細胞型が枯渇している。細胞集団は、加えてまたはあるいは、抗Ｖγ４抗体またはその断片の投与前に、Ｔ細胞及び／またはγδ細胞などのＶγ４を含有し得る細胞型が豊富であり得る。例えば、試料を培養する前に、試料は、Ｔ細胞を濃縮するか、またはγδＴ細胞を濃縮するか、またはαβＴ細胞を枯渇させるか、または非γδＴ細胞を枯渇させることができる。一実施形態において、試料は、最初にαβＴ細胞を枯渇させ、次いでＣＤ３＋細胞を濃縮する。濃縮または枯渇は、濃縮する／枯渇させる表現型に関連する細胞表面上の分子に結合する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用するなど、当技術分野で既知の技術を使用して達成することができる。
細胞培養におけるリンパ球以外の細胞型の存在は、Ｖγ４細胞の増殖を抑制し得る。そのような細胞、例えば間質、上皮、腫瘍及び／または支持細胞は、培養前に除去することができる。したがって、一実施形態において、細胞集団は、培養中に間質細胞と直接接触しない。間質細胞の例として、線維芽細胞、周皮細胞、間葉細胞、角化細胞、内皮細胞及び非血液腫瘍細胞が挙げられる。好ましくは、培養中、リンパ球は線維芽細胞と直接接触しない。一実施形態において、細胞集団は、培養中に上皮細胞と直接接触しない。一実施形態において、細胞集団は、培養中に腫瘍細胞及び／または支持細胞と直接接触していない。
一実施形態において、方法は、実質的な間質細胞との接触の非存在下でＶγ４Ｔ細胞を培養することを含む。更なる実施形態において、方法は、実質的な線維芽細胞との接触の非存在下でＶγ４Ｔ細胞を培養することを含む。
一実施形態において、方法は、血清を実質的に含まない培地（例えば、無血清培地または血清代替物（ＳＲ）を含有する培地）でＶγ４Ｔ細胞を培養することを含む。したがって、一実施形態において、方法は、無血清培地で培養することを含む。そのような無血清培地はまた、血清代替培地を含み得、血清代替物は、ヒトまたは動物由来の血清の使用を避けるために化学的に定義された成分に基づく。代替的な実施形態において、方法は、血清（例えば、ヒトＡＢ血清またはウシ胎児血清（ＦＢＳ））を含有する培地で培養することを含む。一実施形態において、培地は血清代替物を含有する。一実施形態において、培地は動物由来の製品を含有しない。
無血清培地で培養された試料は、濾過、沈殿、汚染及び血清の供給に関する問題を回避するという利点を有することが理解されるであろう。更に、動物由来製品は、臨床グレードのヒト治療薬の製造に使用するのに適していない。
一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、可溶性または固定化された形態である。例えば、抗体またはその断片は、可溶型でＶγ４Ｔ細胞に投与され得る。あるいは、抗体またはその断片がビーズまたはプレートなどの表面に結合または共有結合している場合（すなわち、固定化された形態）、抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞に投与することができる。一実施形態において、抗体は、Ｆｃコーティングされたウェルなどの表面に固定化される。あるいは、抗体またはその断片は、細胞の表面に結合される（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に固定化される）。別の実施形態において、細胞集団が抗体と接触するとき、抗体は表面に固定化されない。
抗Ｖγ４抗体またはその断片が接触した細胞集団は、様々な種類の試料から得ることができる（単離方法は以下に更に記載する）。一実施形態において、試料は、非造血組織試料である。本明細書における「非造血組織」または「非造血組織試料」への言及には、皮膚（例えば、ヒトの皮膚）及び腸（例えば、ヒトの腸）が含まれる。非造血組織とは、血液、骨髄、リンパ組織、リンパ節組織または胸腺組織以外の組織である。一実施形態において、非造血組織試料は、皮膚（例えば、ヒトの皮膚）である。いくつかの実施形態において、細胞集団（例えば、γδＴ細胞）は、血液または滑液などの特定の種類の体液の試料から得られない。いくつかの実施形態において、細胞集団（例えば、γδＴ細胞）は皮膚（例えば、ヒトの皮膚）から得られ、これは当技術分野で既知の方法によって得ることができる。例えば、細胞集団は、非造血組織試料からの細胞の放出を容易にするように構成された合成足場上で非造血組織試料を培養することによって、非造血組織試料から得ることができる。あるいは、方法は、消化管（例えば、結腸または腸）、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、膵臓、子宮、膣及び他の皮膚、粘膜または漿膜から得られる細胞集団（例えば、γδＴ細胞）に適用することができる。
代替的な実施形態において、試料は、造血試料またはその画分である（すなわち、細胞集団は造血試料またはその画分から得られる）。本明細書における「造血試料」または「造血組織試料」への言及には、血液（末梢血または臍帯血など）、骨髄、リンパ組織、リンパ節組織、胸腺組織及びこれらの画分または濃縮部分が含まれる。試料は、好ましくは、バフィーコート細胞、白血球除去産物、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）を含む、末梢血または臍帯血またはこれらの画分を含む血液である。いくつかの実施形態において、試料は、ヒト血液またはその画分である。細胞は、密度勾配遠心分離などの当技術分野で既知の技術を使用して、血液試料から得ることができる。例えば、全血を等量のＦＩＣＯＬＬ－ＨＹＰＡＱＵＥ上で層にし、続いて室温にて４００ｘｇで１５～３０分間遠心分離する。界面材料は、培地で収集かつ洗浄されて室温にて２００ｘｇで１０分間遠心分離することができる低密度単核細胞を含む。
細胞集団は、がん組織試料、例えば腸、乳房または前立腺の腫瘍から得ることができる（すなわち、γδＴ細胞はがん組織試料にも存在し得る）。いくつかの実施形態において、細胞集団は、ヒトがん組織試料（例えば、固形腫瘍組織）に由来し得る。他の実施形態において、細胞集団は、ヒトがん組織以外（例えば、実質的な数の腫瘍細胞を含まない組織）の試料に由来し得る。例えば、細胞集団は、近くのまたは隣接するがん組織から離れた皮膚の領域（例えば、健康な皮膚）に由来し得る。したがって、いくつかの実施形態において、細胞集団は、がん組織（例えば、ヒトがん組織）から得られない。
細胞集団は、ヒトまたは非ヒト動物の組織から得ることができる。したがって、方法は、ヒトまたは非ヒト動物の組織から細胞集団を得る工程を更に含み得る。一実施形態において、試料は、ヒトから得られたものである。代替的な実施形態において、試料は、非ヒト動物対象から得られたものである。
γδＴ細胞の増殖
一実施形態において、調節は、Ｖγ４Ｔ細胞の活性化、特にＶγ４Ｔ細胞の増殖を含む。したがって、本発明の一態様によれば、本明細書で定義される抗Ｖγ４抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を増殖させるｅｘ ｖｉｖｏ方法が提供される。そのようなＶγ４Ｔ細胞の増殖は、Ｖγ４Ｔ細胞数の選択的な増加によって及び／またはＶγ４Ｔ細胞の生存の促進によって達成され得る。一実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞の増殖は、抗ＴＣＲガンマ４可変抗体またはその断片を培養中のＶγ４Ｔ細胞に投与することを含む（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）。Ｖγ４Ｔ細胞は、混合細胞集団、例えば、他のリンパ球細胞型（例えば、αβＴ細胞またはＮＫ細胞）を含む細胞集団中に存在し得る。
したがって、本発明は、濃縮されたγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）集団を作成するｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。濃縮された集団は、混合細胞集団またはその精製画分を抗体またはその断片と接触させることを含む方法によって単離された混合細胞集団（例えば、親／ドナーから採取した試料から得た）から作成することができる。前記抗体（またはその断片）は、γδＴＣＲのＶγ４鎖に特異的なエピトープに結合することによりＶγ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる。
また、本明細書で定義する方法に従って得られる増殖したＶγ４Ｔ細胞集団も提供される。本発明のこの態様によれば、Ｖγ４Ｔ細胞のそのような増殖集団が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得られ得る及び／または増殖し得ることが理解されるであろう。一態様において、本明細書で定義される方法に従って得られた増殖したＶγ４集団が提供され、Ｖγ４集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで単離されかつ増殖する。
本明細書に記載の抗体またはその断片は、γδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）を増殖させる方法で使用され得る。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。増殖法がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合、抗体（またはその断片）は、上述のように得られた単離されたγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）に適用され得る。いくつかの実施形態において、γδＴ細胞は、非造血組織試料から単離された細胞集団から増殖される。代替的な実施形態において、γδＴ細胞は、血液試料などの造血組織試料から単離された細胞集団から増殖される。
γδＴ細胞の増殖（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）は、本明細書に記載の抗体またはその断片、及びサイトカインの存在下で試料を培養することを含み得る。サイトカインには、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子及びケモカインが含まれ得る。一実施形態において、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）及び間質細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）からなる群から選択される。本明細書に記載のサイトカインへの言及は、培養中のＶγ４Ｔ細胞に対する同様の生理学的効果を促進する能力に関して前記サイトカインと同じ活性を有する任意の化合物を含み得、模倣物またはその機能的同等物を含むがこれらに限定されない。
一実施形態において、前記サイトカインは、サイトカインの共通サイトカイン受容体ガンマ鎖（γｃ）ファミリーである。更なる実施形態において、γｃサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１またはこれらの混合物から選択される。
使用されるサイトカイン（例えば、インターロイキン）は、ヒトまたは動物由来であってよく、好ましくはヒト由来であり得る。それは、野生型タンパク質、または任意の生物学的に活性な断片もしくは変異体であり得、すなわち、その受容体に結合できるものであり得る。そのような結合は、本発明による方法の条件下でγδＴ細胞の活性化を誘導し得る。より好ましくは、サイトカインは、例えばペプチド、ポリペプチドまたは生物学的に活性なタンパク質などの別の分子と融合または複合体化された可溶型であり得る。好ましくは、ヒト組換えサイトカインが使用される。より好ましくは、インターロイキン濃度の範囲は、１～１００００Ｕ／ｍｌの間、更により好ましくは１００～１０００Ｕ／ｍｌの間で変動し得る。
更なる実施形態において、サイトカインはケモカインである。ケモカインは、γδＴ細胞を得るために使用される試料に応じて変化しかつ選択されることが更に理解されるであろう。
一実施形態において、方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－９及び／またはＩＬ－１５の存在下で細胞集団を培養することを含む。更なる実施形態において、方法は、ＩＬ－２の存在下で細胞集団を培養することを含む。一実施形態において、方法は、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５（すなわち、ＩＬ２、ＩＬ－１５またはこれらの組み合わせ）の存在下で細胞集団を培養することを含む。代替的な実施形態において、方法は、ＩＬ－９及び／またはＩＬ－１５（すなわち、ＩＬ９、ＩＬ－１５またはこれらの組み合わせ）の存在下で細胞集団を培養することを含む。一実施形態において、方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－９及び／またはＩＬ－１５ならびに追加の増殖因子（例えば、ＩＬ－２１）の存在下の細胞集団を含む。他の実施形態において、方法は、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５以外の増殖因子を欠く培地で細胞集団を培養することを含む。代替的な実施形態において、方法は、ＩＬ－９及び／またはＩＬ－１５以外の増殖因子を欠く培地で細胞集団を培養することを含む。更なる実施形態において、方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－９及び／またはＩＬ－１５を補充した基本培地からなる培地で細胞集団を培養することを含む。更なる実施形態において、方法は、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５を補充した基本培地からなる培地で細胞集団を培養することを含む。
一実施形態において、方法は、ＩＬ－１５、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γ、ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）及び間質細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）からなる群から選択される因子の存在下で細胞集団を培養することを含む。
γδＴ細胞の増殖は、少なくとも１つの更なるＴ細胞マイトジェンの存在下で試料を培養することを含み得る。「Ｔ細胞マイトジェン」（「γδＴＣＲアゴニスト」とも呼ばれる）という用語は、これらに限定されないがフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）などの植物レクチンならびに非植物起源のレクチンを含む、ＴＣＲシグナル伝達を介してＴ細胞を刺激することができる任意の薬剤を意味する。一実施形態において、Ｔ細胞マイトジェンは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。他のマイトジェンには、ホルボール１２－ミリステート－１３－アセテート（ＴＰＡ）及びメゼレインなどのその関連化合物、または細菌化合物（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）及び連鎖球菌タンパク質Ａ）が含まれる。Ｔ細胞マイトジェンは可溶性でも固定化されていてもよく、１つを超えるＴ細胞マイトジェンを増殖方法に使用してもよい。
本明細書で使用する場合、「増殖した」または「増殖したγδＴ細胞の集団」への言及は、増殖していない集団よりも大きいか、または増殖していない集団よりも多数の細胞を含有する細胞集団を含む。そのような集団は、集団内の割合もしくは特定の細胞型の増殖を伴う多数集団、少数集団または混合集団であり得る。「増殖方法」という用語は、増殖または増殖した集団をもたらすプロセスを指すことを理解されたい。したがって、増殖または増殖した集団は、増殖工程を行っていない集団または増殖工程の前の集団と比較して、数が多いか、またはより多くの数の細胞を含み得る。増殖を示す（例えば、倍数増加または倍数増殖）ために本明細書で示される任意の数字は、細胞集団の数もしくはサイズまたは細胞数の増加を示し、増殖量を示す。
一実施形態において、方法は、細胞集団を少なくとも５日間（例えば、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１８日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、またはそれ以上、例えば、５日間～４０日間、７日間～３５日間、１４日間～２８日間、１４日間～２１日間または約１４日間）培養することを含む。更なる実施形態において、方法は、細胞集団を少なくとも７日間、例えば、少なくとも１１日間または少なくとも１４日間培養することを含む。
更なる実施形態において、方法は、細胞集団を一定の期間（例えば、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１８日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、またはそれ以上、例えば、５日間～４０日間、７日間～３５日間、１４日間～２８日間、１４日間～２１日間または約１４日間）、増殖したγδＴ細胞集団を産生するのに有効な量で培養することを含む。
一実施形態において、細胞集団は、少なくとも７～４５日間、７～２１日間、７～１８日間または７～１４日間など５～６０日の期間培養される。方法が単離培養期間（例えば、１４～２１日間などの１～４０日間）を含む場合、単離及び増殖工程は、いくつかの実施形態において、２１日～３９日の間続くことができる。
方法は、培養中に抗Ｖγ４抗体またはその断片及び／または増殖因子の定期的な添加を含み得る。例えば、抗Ｖγ４抗体またはその断片及び／または増殖因子は、２～５日ごと、より好ましくは３～４日ごとに添加することができる。一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片及び／または増殖因子は、培養の７日後に添加され、その後２～３日ごとに添加される。
増殖方法は、参照集団よりも数が多い増殖したγδＴ細胞集団を提供する。いくつかの実施形態において、増殖したγδＴ細胞集団（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）は、増殖工程前のγδＴ細胞の単離された集団よりも数が多い（例えば、増殖工程前のγδＴ細胞の単離された集団と比較して、数が少なくとも２倍、数が少なくとも５倍、数が少なくとも１０倍、数が少なくとも２５倍、数が少なくとも５０倍、数が少なくとも６０倍、数が少なくとも７０倍、数が少なくとも８０倍、数が少なくとも９０倍、数が少なくとも１００倍、数が少なくとも２００倍、数が少なくとも３００倍、数が少なくとも４００倍、数が少なくとも５００倍、数が少なくとも６００倍、数が少なくとも１，０００倍またはそれ以上）。一実施形態において、増殖したγδＴ細胞集団（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）は、抗体またはその断片の存在なしで同じ時間培養した集団よりも数が多くなる。いくつかの実施形態において、増殖したγδＴ細胞集団（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）は、ヒトＩｇＧ１などのアイソタイプ対照の存在下で同じ時間培養した集団よりも数が多くなる。
増殖方法は、参照集団よりも高い割合のＶγ４Ｔ細胞を有する増殖したＶγ４Ｔ細胞集団を提供する。いくつかの実施形態において、増殖したＶγ４Ｔ細胞集団は、約５０％を超えるＶγ４Ｔ細胞、例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超えるＶγ４Ｔ細胞を含有する。更なる実施形態において、増殖したＶγ４Ｔ細胞集団は、約７０％を超えるＶγ４Ｔ細胞など約６０％を超えるＶγ４Ｔ細胞を含有する。
γδＴ細胞の増殖に使用するのに適した多数の基礎培地が利用可能であり、特に血清または血漿の存在下で、ＡＩＭ－Ｖ、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地及びＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＸＶＩＶＯ－１０、ＥＸＶＩＶＯ－１５またはＥＸＶＩＶＯ－２０（Ｌｏｎｚａ）が利用可能である。培地には、血清、血清タンパク質及び抗生物質などの選択剤など本明細書で定義される他の培地因子を補充することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＰＭＩ－１６４０培地は、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、非必須アミノ酸（例えば、１００μＭのＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ及びＳｅｒ、１ＸＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））及び／または１０μｌ／Ｌのβ－メルカプトエタノールを含有する。いくつかの実施形態において、培地は、５％のヒトＡＢ血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０を含む。代替的な実施形態において、ＡＩＭ－Ｖ培地にＣＴＳ免疫血清代替物及びアムホテリシンＢを補充することができる。特定の実施形態において、培地に更に、本明細書に記載のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９及び／またはＩＬ１５を補充することができる。好都合なことに、細胞は、単離及び／または増殖中、適切な培地で５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気で３７℃にて培養される。
γδＴ細胞の増殖培養における他の因子の添加もまた使用され得る。一実施形態において、そのような因子は、γδＴ細胞の増殖を選択的に促進する増殖において使用される。例えば、増殖は、インターロイキンなどの外因性サイトカインの増殖培養への添加を更に含み得る。そのような増殖は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下でγδＴ細胞を培養することを含み得る。あるいは、増殖は、ＩＬ－９及びＩＬ－１５の存在下でγδＴ細胞を培養することを含み得る。任意の増殖工程は、増殖したγδＴ細胞集団を産生するのに有効な期間にわたって実施されることが理解されよう。
γδＴ細胞を増殖させる方法は、５日未満（例えば、４．５日未満、４．０日未満、３．９日未満、３．８日未満、３．７日未満、３．６日未満、３．５日未満、３．４日未満、３．３日未満、３．２日未満、３．１日未満、３．０日未満、２．９日未満、２．８日未満、２．７日未満、２．６日未満、２．５日未満、２．４日未満、２．３日未満、２．２日未満、２．１日未満、２．０日未満、４６時間未満、４２時間未満、３８時間未満、３５時間未満、３２時間未満）の集団倍加時間を含み得る。
γδＴ細胞を単離する方法
本明細書に記載されるように、抗体（またはその断片）は、培養中のγδＴ細胞、すなわち、試料から得られたγδＴ細胞に適用され得る。一実施形態において、細胞集団は、抗Ｖγ４抗体またはその断片を投与する前に試料から単離される。したがって、試料から単離されたγδＴ細胞の集団（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団）に、本明細書で定義される抗Ｖγ４抗体またはその断片を投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節する（特に、増殖させる）方法が提供される。
本明細書における細胞、特にγδＴ細胞の「単離」または「単離すること」への言及は、細胞が組織または細胞のプールから除去、分離、精製、濃縮、または別の方法で取り出される方法またはプロセスを指す。そのような言及には、「分離された」、「除去された」、「精製された」、「濃縮された」などの用語が含まれることを理解されたい。γδＴ細胞の単離には、無傷の非造血組織試料からのもしくは非造血組織の間質細胞（例えば、線維芽細胞または上皮細胞）からの細胞の単離、または分離が含まれる。そのような単離は、あるいはまたは加えて、他の造血細胞（例えば、αβＴ細胞または他のリンパ球）からのγδＴ細胞の単離または分離を含み得る。単離は、例えば、組織外植片または生検が単離培養物に置かれた時点から開始し、遠心分離もしくは単離された細胞集団を増殖培養に移すための他の手段などによって細胞が培養物から収集された時点、もしくは細胞が他の目的に使用された時点、または元の組織外植片もしくは生検を培養物から除去した時点で終了する、定義された期間であり得る。単離工程は、少なくとも約３日間～約４５日間であり得る。一実施形態において、単離工程は、少なくとも約１０日間～少なくとも２８日間である。更なる実施形態において、単離工程は、少なくとも１４日間～少なくとも２１日間である。したがって、単離工程は、少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２間日、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、約３５日間、約４０日間、または約４５日間であり得る。細胞増殖は、この単離工程では実質的ではないかもしれないが、必ずしもないとは限らないことが理解できる。実際、当業者であれば、単離された細胞がまた分裂を開始して、試料を含有する単離容器内で複数のそのような細胞を生成し得ることを認識する。
したがって、本明細書における「単離されたγδＴ細胞」、「単離されたγδＴ細胞集団」または「γδＴ細胞の単離された集団」への言及は、細胞が無傷の（非造血組織）試料内に含有される細胞と実質的に接触しないように、元の非造血組織試料などの試料から単離、分離、除去、精製または濃縮されたγδ細胞を指すと理解されるであろう。本明細書における「単離されたＶγ４Ｔ細胞」、「単離されたＶγ４Ｔ細胞集団」、「Ｖγ４Ｔ細胞の単離された集団」、「分離されたＶγ４Ｔ細胞」、「分離されたＶγ４Ｔ細胞集団」または「Ｖγ４Ｔ細胞の分離された集団」への言及は、細胞が無傷の（非造血組織）試料内に含有される細胞と実質的に接触しないように、元の非造血組織試料などの試料から単離、分離、除去、精製または濃縮されたＶγ４Ｔ細胞を指すと理解されるであろう。
非造血組織常在リンパ球は、例えば、確実にピペットで分注することによって皮膚線維芽細胞などの間質細胞から採取及び分離することができる。採取したリンパ球は、処理中に緩んだ可能性のある線維芽細胞凝集体を保持するために、４０μｍのナイロンメッシュを通して更に洗浄し得る。リンパ球はまた、例えばＣＤ４５抗体を使用する蛍光または磁気関連細胞選別を使用して単離することもできる。
γδＴ細胞の単離は、少なくとも１つのサイトカインの存在下で試料を培養することを含み得る。例えば、方法は、少なくともケモカインなどの薬剤の存在下で試料を培養することを含み得る。ケモカインは、単離されるγδＴ細胞に応じて選択されることが更に理解されるであろう。更に、ケモカインは異なり、γδＴ細胞の単離に使用される試料に応じて選択される。
γδＴ細胞の単離は、少なくとも１つのサイトカインの存在下で試料を更に培養することを含み得る。前記サイトカインは、最初の培養で使用されたサイトカインと異なっていてもよい。
単離方法は、試料を培養することを含み得る。本明細書における「培養」への言及は、試料から単離、分離、除去、精製または濃縮された細胞を含む試料を、増殖因子及び／または細胞及び／または試料が必要とする及び／または好む必須栄養素を含む培地に添加することを含む。そのような培養条件は、試料から単離される細胞または細胞集団に従って適合され得るか、または試料から単離及び増殖される細胞または細胞集団に従って適合され得ることが理解されるであろう。
特定の実施形態において、試料の培養は、試料からのγδＴ細胞の単離に十分な期間である。特定の実施形態において、培養期間は少なくとも１４日間である。特定の実施形態において、培養期間は、４５日未満、例えば３０日未満、例えば２５日未満である。更なる実施形態において、培養期間は、１４日間～２１日間の間など１４日間～３５日間の間である。別の更なる実施形態において、培養期間は約２１日間である。
特定の実施形態において、γδＴは、試料の培養後に培養物から収集される。γδＴ細胞の収集には、培養物からのγδＴ細胞の物理的収集、他のリンパ球（例えば、αβＴ細胞及び／またはＮＫ細胞）からのγδＴ細胞の単離、または試料中に存在する他の細胞、例えば線維芽細胞などの間質細胞からのγδＴ細胞の単離及び／または分離が含まれ得る。一実施形態において、γδＴ細胞は、機械的手段（例えば、ピペットで取る）によって収集される。更なる実施形態において、γδＴ細胞は、磁気分離及び／または標識化によって収集される。別の更なる実施形態において、γδＴ細胞は、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー技術によって収集される。したがって、特定の実施形態において、γδＴ細胞は、γδＴ細胞を特異的に標識することによって収集される。γδＴ細胞のそのような収集は、試料の培養物からの物理的除去、別の培養容器への移動、または別のもしくは異なる培養条件への移動を含み得ることが理解されるであろう。
そのようなγδＴ細胞の収集は、試料からγδＴ細胞の単離された集団を得るのに十分な時間の経過後に行われることが理解されるであろう。特定の実施形態において、γδＴ細胞は、試料の培養の少なくとも１週間、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、または少なくとも１４日後に収集される。好適には、γδＴ細胞は、３８日以下、３６日以下、３４日以下、３２日以下、３０日以下、２８日以下、２６日以下または２４日以下など４０日以下後に収集される。一実施形態において、γδＴ細胞は、試料の培養の少なくとも１４日後に収集される。更なる実施形態において、γδＴ細胞は、試料の培養の１４～２１日後に収集される。
一実施形態において、試料は、実質的に血清を含まない培地（例えば、無血清培地または血清代替物（ＳＲ）を含有する培地）で培養される。したがって、一実施形態において、試料は無血清培地で培養される。そのような無血清培地はまた、血清代替培地を含み得、血清代替物は、ヒトまたは動物由来の血清の使用を避けるために化学的に定義された成分に基づく。一実施形態において、培地は動物由来の製品を含まない。代替的な実施形態において、試料は、血清（例えば、ヒトＡＢ血清またはウシ胎児血清（ＦＢＳ））を含有する培地で培養される。
培地には、γδＴ細胞の成長及び増殖を助けることができる他の成分が更に含まれ得る。添加され得る他の成分の例としては、血漿または血清、アルブミンなどの精製タンパク質、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）などの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイドならびに細胞増殖及び／または生存を補助または促進する任意の他の栄養補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体またはその断片
γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のガンマ可変４（Ｖγ４）鎖に特異的に結合する単離された抗体またはその断片が、本明細書に提供される。特に、抗体またはその断片は、γδＴＣＲのガンマ可変２（Ｖγ２）鎖に結合（または、それと交差反応）しない。これは、同じ種からのＶγ４鎖及びＶγ２に関していることが理解されるべきである。好ましくは、前記種はホモサピエンス（ヒト）であり、したがって抗体またはその断片は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のヒトガンマ可変４（Ｖγ４）鎖に特異的に結合し得、γδＴＣＲのヒトガンマ可変２（Ｖγ２）鎖には結合し得ない。例えば、ヒトＶγ４鎖は、配列番号１のアミノ酸１～９９による配列を有し得、及び／またはヒトＶγ２鎖は、配列番号３３５による配列を有し得る。他の種では、抗体またはその断片は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のヒトガンマ可変４（Ｖγ４）鎖の種特異的オルソログに特異的に結合し、γδＴＣＲのヒトガンマ可変２（Ｖγ２）鎖の種特異的オルソログには結合しない。したがって、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸１～９９に対応する配列を有するγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のヒトガンマ可変４（Ｖγ４）鎖またはその非ヒトオルソログに特異的に結合し得、配列番号３３５に対応する配列を有するγδＴＣＲのヒトガンマ可変２（Ｖγ２）鎖またはその非ヒトオルソログには結合しない可能性がある。この文脈におけるオルソログとは、参照配列に対して最も高い配列類似性を有するガンマ鎖配列、または好ましくは同じ機能（例えばｉｎ ｖｉｖｏでオルソロガスな同族リガンドとの相互作用）を有するものを意味し得る。例えば、マウスにおいて、Ｖγ７としてＨｅｉｌｉｇ＆Ｔｏｎｅｇａｖｅ命名法の下で指定されたタンパク質は、機能的にヒトＶγ４と最も密接に関連している（Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ，１６７：２０３－２１８．ｅ１７）。
この展開は深遠である。例えば、ヒトにおいて、Ｖγ４鎖とＶγ２鎖は、９１％の配列同一性を共有している（９つのアミノ酸が異なるだけである）。したがって、これにより、（ヒト）Ｖγ４に結合しかつ（ヒト）Ｖγ２に結合しない抗体を得ることが困難であり、このような抗体を作成することが可能であるとは当技術分野では予想されていなかった。
γδＴＣＲのＶγ４鎖に特異的に結合する抗体またはその断片に言及する場合、これは一般に、抗体またはその断片のＶγ４鎖への結合が陰性対照抗体及び／または陰性対照抗原と比較して統計的に有意に増加することを意味する（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、任意選択でＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイ、またはＳＰＲでの結合を介して測定されるように）。陰性対照抗体及び／または陰性対照抗原に関して検出されたレベルは、当業者であれば十分に理解するようにアッセイ系における「ノイズ」を表す、使用するアッセイのバックグラウンドレベルとみなされ得る。特定の実施形態において、バックグラウンドレベルに対して所定の閾値を超えるシグナルレベルは、結合の検出を表すとみなされ得る（例えば、バックグラウンドレベルの約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍以上）。例えば、ＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイでは、バックグラウンドレベルの５倍以上のシグナルレベルは、抗体の抗原への結合を示しているとみなされ得る。当業者であれば、使用されているアッセイ系に基づいて適切な閾値を決定することが十分に可能である。逆に、γδＴＣＲのＶγ２鎖に結合しない（または、それと交差反応しない）抗体またはその断片に言及する場合、これは一般に、抗体またはその断片のＶγ２鎖への結合が陰性対照抗体及び／または陰性対照抗原と比較して統計的に有意に増加しないことを意味する（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、任意選択でＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイ、またはＳＰＲでの結合を介して測定されるように）。これは、例えば図２Ａに示され、実施例４で説明されている。本明細書に開示される本発明のすべての態様及び実施形態によれば、この特性はまた、抗体またはその断片及びＶγ４鎖対抗体またはその断片及びＶγ２鎖の間で検出された結合レベル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、任意選択でＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイ、またはＳＰＲでの結合を介して測定されるように）における倍率変化差としても表され得る。例えば、抗体またはその断片は、Ｖγ２鎖への結合と比較して、Ｖγ４鎖への結合において少なくとも約５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１００００倍、１５０００倍、２５０００倍、５００００倍、７５０００倍、９５０００倍以上の増加を示すことができる。これは、例えば図２Ｂに示され、実施例４で説明されている。ただし、このような倍増は、制御を超えるすべてのＶγ２シグナルがバックグラウンドノイズでないと仮定して計算されているため、保存的であると考えられる。しかし、前述のように、当業者であれば、代わりに、アッセイノイズとしてこのようなＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイにおいてバックグラウンドを超える低シグナルを除外することができる（例えば、バックグラウンドレベルの約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍以上）ので、これらの閾値を下回るシグナルを非特異的なバックグラウンド結合とみなすことができる。
一実施形態において、抗体またはその断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、可変ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ダイアボディ、ミニボディまたはモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、抗体またはその断片はｓｃＦｖである。別の特定の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
本明細書に記載の抗体は、任意の種類、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはこれらのアイソタイプであり得、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含むことができる。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、アイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうちの少なくとも１つである。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１である。更なる実施形態において、抗体は、エフェクター機能を低下させる、半減期を延長する、ＡＤＣＣを変更する、またはヒンジ安定性を改善するために変異したＦｃを有するなど所望の特性を与えるように改変されたＩｇＧ型などの形式であり得る。このような改変は当技術分野では周知であり、例示的な実施形態が本明細書に記載されている。例えば、抗体またはその断片は、配列番号３３２または配列番号３３３によるアミノ酸配列を含むＩｇＧ１定常ドメインを含み得る。
一実施形態において、抗体またはその断片はヒトである。したがって、抗体またはその断片は、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）配列に由来し得る。抗体（またはその断片）のＣＤＲ、フレームワーク及び／または定常領域は、ヒトＩｇ配列、特にヒトＩｇＧ配列に由来し得る。ＣＤＲ、フレームワーク及び／または定常領域は、ヒトＩｇ配列、特にヒトＩｇＧ配列について実質的に同一であり得る。ヒト抗体を使用する利点は、ヒトでの免疫原性が低いか、まったくないことである。
抗体またはその断片はまた、キメラ、例えばマウス－ヒト抗体キメラであり得る。
あるいは、抗体またはその断片は、マウスなどの非ヒト種に由来する。このような非ヒト抗体は、ヒトにおいて自然に生成される抗体変異体との類似性を高めるように改変することができ、したがって、抗体またはその断片は、部分的または完全にヒト化され得る。したがって、一実施形態において、抗体またはその断片はヒト化されている。
エピトープを標的とする抗体
γδＴＣＲのＶγ４鎖のエピトープに結合する抗体（またはその断片）が、本明細書で提供される。Ｖγ４鎖上のエピトープの結合は、任意選択で、活性化または阻害などのγδＴＣＲ活性に影響を及ぼし得る。抗体（またはその断片）は、別の抗体もしくは分子の結合または相互作用を阻止することによって遮断効果を有し得る。抗体は、γδＴＣＲのＶγ４鎖に特異的であり、本明細書で定義されるように、γδＴＣＲのＶγ２鎖またはγδＴＣＲのＶγ８鎖などの他の抗原のエピトープに結合しない。
一実施形態において、エピトープは、γδＴ細胞の活性化エピトープであり得る。「活性化」エピトープは、例えば、ＴＣＲ下方制御、細胞の脱顆粒、細胞毒性、増殖、動員、生存の延長または消耗に対する耐性、細胞内シグナル伝達、サイトカインもしくは成長因子分泌、表現型の変化、または遺伝子発現の変化などのＴＣＲ関連機能の調節を含み得る。例えば、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞集団、好ましくはＶγ４＋Ｔ細胞集団の拡大（すなわち、増殖）を刺激し得る。したがって、これらの抗体を使用して、γδＴ細胞の活性化を調節し、それによって免疫応答を調節することができる。したがって、一実施形態において、活性化エピトープの結合は、γδＴＣＲを下方制御する。追加のまたは代替の実施形態において、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する。更なる追加のまたは代替の実施形態において、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞を活性化して、標的細胞（例えば、がん細胞）を死滅させる。
一実施形態において、抗体またはその断片は、Ｖγ４を遮断し、ＴＣＲ結合を阻止する（例えば、立体障害を介して）。Ｖγ４を遮断することにより、抗体は、ＴＣＲの活性化及び／またはシグナル伝達を阻止することができる。したがって、エピトープは、γδＴ細胞の抑制性エピトープであり得る。「抑制性」エピトープは、例えば、ＴＣＲ機能を遮断し、それによってＴＣＲ活性化を抑制することを含み得る。
エピトープは、好ましくは、γδＴＣＲのＶγ４鎖の少なくとも１つの細胞外、可溶性、親水性、外部または細胞質部分からなる。
特定の実施形態において、エピトープは、γδＴＣＲのＶγ４鎖の非生殖系コード化領域、特にＶγ４鎖のＣＤＲ３で見いだされるエピトープを含まない。好ましい実施形態において、エピトープは、フレームワーク領域３の超可変４領域であり得る、γδＴＣＲのＶγ４鎖のフレームワーク領域内にある。このような結合により、Ｖγ４鎖間で大きく変動するＴＣＲの配列（特にＣＤＲ３）に制限されることなく、Ｖγ４鎖全般を特異的に認識できることが理解されよう。したがって、任意のＶγ４鎖を含むγδＴＣＲは、γδＴＣＲの特異性に関係なく、本明細書で定義される抗体またはその断片を用いて認識され得ることが理解されよう。
γδ受容体は、様々な調節リガンドに、独立して及び空間的に異なるドメインを介して結合することができる。このようなマルチモードのリガンド結合と一致して、Ｍｅｌａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１３５２－１３６５による最近の研究は、内因性ＢＴＮＬ３リガンドへのヒトＴＣＲの結合が、γ４鎖上のＣＤＲ３のＮ末端に位置する個別のドメインを介していることを示している。著者らは、ＢＴＮＬ３結合がＴＣＲのこの特定の生殖系領域を介して媒介されるため、よりＣ末端の体細胞性の組換えＣＤＲ３ループが他のリガンドに独立して自由に結合できることを強調している。更に、フレームワーク領域３（ＦＲ３）のこのサブ領域（「超可変領域４」（ＨＶ４）とも称される）は、４つのアミノ酸がヒトγ２鎖と異なる。しかしながら、特定の抗Ｖγ４抗体はＭｅｌａｎｄｒｉらには開示されておらず、このような抗体をどのように得られるかも示唆されていない。実際、一般的な見解は、ヒトＶγ４鎖とヒトＶγ２鎖の間で共有される有意な配列相同性（９１％の配列同一性）のために、これは不可能であるというものだった。
ＨＶ４領域内で結合する抗体は、γ２よりもγ４に特異的な結合体を提供するという追加の利点と共に、γ４鎖のＣＤＲ３領域が依然として結合するのを可能にし得る。更に、ＨＶ４は生殖系にコードされているため、この領域を標的とするいくつかの抗体は、すべてのＶγ４鎖を認識し、Ｖγ４を認識する他の抗体は特定のＶγ４鎖に特異的であり得る。
本開示は、Ｖγ４鎖のＨＶ４領域に特異的に結合し得る抗体及びその断片を提供する。したがって、一実施形態において、抗体またはその断片は、Ｖγ４鎖のＨＶ４領域のエピトープに結合する。ＨＶ４領域は、配列番号１のアミノ酸６７～８２を含む。したがって、一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上のアミノ酸残基、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３配列の一部ではないＶγ４鎖の一部を含む。そうすることで、抗体またはその断片は、Ｖγ４＋ＴＣＲとＢＴＮＬ３／８の間の相互作用を調節することができる。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域９６～１０６（ＣＤＲ３）内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５０～５７（ＣＤＲ２）内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域２７～３２（ＣＤＲ１）内のアミノ酸残基を含まない。
特定の実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸６７～８２のうちの１つ以上に結合すると、Ｖγ４＋ＴＣＲを活性化することができる。
良好に特性評価されたαβＴ細胞と同様に、γδＴ細胞は、体細胞性に再構成された可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）（β及びδのみ）、結合（Ｊ）及び定常（Ｃ）遺伝子の異なるセットを利用するが、γδＴ細胞には、αβＴ細胞よりも少ないＶ、Ｄ及びＪセグメントが含まれている。一実施形態において、抗体（またはその断片）によって結合されるエピトープは、Ｖγ４鎖のＪ領域に見られるエピトープを含まない。したがって、抗体または断片は、Ｖγ４鎖のＶ領域にのみ結合し得る。したがって、一実施形態において、エピトープは、γδＴＣＲのＶ領域のエピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸残基１～９９）からなる。
エピトープへの言及は、Ｌｕｏｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３９：１０３２－１０４２、及び配列番号１として示されるＲＣＳＢタンパク質データバンクエントリ：４ＭＮＨに記載されているＶγ４配列に関連して行われる。
ＳＳＮＬＥＧＲＴＫＳＶＩＲＱＴＧＳＳＡＥＩＴＣＤＬＡＥＧＳＴＧＹＩＨＷＹＬＨＱＥＧＫＡＰＱＲＬＬＹＹＤＳＹＴＳＳＶＶＬＥＳＧＩＳＰＧＫＹＤＴＹＧＳＴＲＫＮＬＲＭＩＬＲＮＬＩＥＮＤＳＧＶＹＹＣＡＴＷＤＥＫＹＹＫＫＬＦＧＳＧＴＴＬＶＶＴＥＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＡＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＳＲＧＧＬＥＶＬＦＱ（配列番号１）
配列番号１は、Ｖ領域（可変ドメインとも称される）及びＪ領域を含む可溶性ＴＣＲを表す。Ｖ領域はアミノ酸残基１～９９を含み、Ｊ領域はアミノ酸残基１０２～１１６を含み、ＴＣＲβからの定常領域はアミノ酸残基１１７～２５６を含む。Ｖ領域内で、ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸残基２７～３２として定義され、ＣＤＲ２は、配列番号１のアミノ酸残基５０～５７として定義され、ＣＤＲ３は、配列番号１のアミノ酸残基９６～１０６として定義される。
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸Ｋ７６（すなわち、位置７６のリシン）及びＭ８０（すなわち、位置８０のメチオニン）が、（ヒト）Ｖγ４鎖のＨＶ４領域への結合に特に重要であり得ることを確認した（実施例６）。したがって、エピトープは、配列番号１のＫ７６及び／またはＭ８０を含み得る、またはそれからなり得る。
本発明者らは更に、配列番号１のアミノ酸領域７１～７９内のアミノ酸が、（ヒト）Ｖγ４鎖のＨＶ４領域への結合に特に重要であり得ることを確認した。したがって、更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域７１～７９内の１つ以上のアミノ酸残基を含む。
一実施形態において、エピトープは、記載された領域内に２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上など１つ以上のアミノ酸残基を含む。
一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上（例えば５つ以上、例えば１０以上）のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域７１～７９内に１つ以上（例えば３つ以上、例えば５つ以上）のアミノ酸残基を含む。
前記抗体（またはその断片）は、定義された範囲内のすべてのアミノ酸に結合する必要はないことが更に理解されよう。このようなエピトープは、線状エピトープと称され得る。例えば、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する抗体は、前記範囲のアミノ酸残基、例えば、任意選択で範囲内のアミノ酸（すなわち、アミノ酸７１、７３、７５、７６及び７９）を含む、範囲の両端のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸６７及び８２）の１つ以上とのみ結合し得る。
例えば、本発明者らは、配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６及び７９が、抗Ｖγ４抗体またはその断片が結合するエピトープを形成し得ることを見いだした（実施例８）。したがって、一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６及び７９のうちの少なくとも１つを含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６及び７９から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ（特に４つまたは５つ）のアミノ酸を含む。
更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域７１～７９内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。
更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基７１～７９を含むか、または適切には配列番号１のアミノ酸残基７１～７９からなる。更に別の実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６及び７９を含むか、または適切には配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６及び７９からなる。
どのエピトープが抗体によって結合されるかを確定するための様々な技術が、当技術分野で既知である。例示的な技術には、例えば、日常的なクロスブロッキングアッセイ、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析、ペプチド切断分析、結晶学的実験、及びＮＭＲ分析が含まれる。更に、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学修飾などの方法を使用できる。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用できる別の方法は、質量分析によって検出された水素／重水素交換である（実施例８に記載されているように）。一般的な用語において、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識し、その後、抗体を重水素で標識したタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移動し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。その結果、タンパク質／抗体の界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、そのため、界面に含まれていないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断及び質量分析に供され、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。
更にまたはあるいは、抗原のキメラ化＆突然変異誘発実験を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定することができる（実施例６に記載されているように）。一般的な用語において、この方法は、一連の１つ以上のキメラ抗原を作成することを含み、第１の参照抗原のアミノ酸配列は、第１の参照抗原のアミノ酸の１つ以上を第２の参照抗原からのそれぞれのアミノ酸で置換するために、第２の参照抗原のアミノ酸配列に基づいて系統的に変更され得る。この文脈における「それぞれのアミノ酸」とは、その配列をアラインメントした際、第１の参照抗原及び第２の参照抗原の配列内の同等の位置にあるアミノ酸を意味する。第１の参照抗原、第２の参照抗原及び／または一連の１つ以上のキメラ抗原のそれぞれへの試験抗体の結合が、次に測定される。次に、各抗原への結合の喪失／獲得は、第１の参照配列及び／または第２の参照配列に対して行われた特定のアミノ酸の変化に起因し得る。抗体が第１の参照抗原及び／または第２の参照抗原に結合できるかどうかは、既にわかっていることであってもよい。例えば、実施例６に記載されるように、第１の参照抗原はヒトＶγ４鎖であり得、第２の参照抗原はヒトＶγ２鎖であり得、一連のキメラ抗原は、Ｖγ４鎖中のアミノ酸の１つ以上をＶγ２鎖配列内のそれぞれの１つ以上のアミノ酸で置換することによって作製される。
抗体配列
抗Ｖγ４抗体またはその断片は、それらのＣＤＲ配列を参照して記載され得る。
したがって、一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
配列番号２～４７のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０及び／または配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号４８～７０及び配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つ、好ましくは配列番号５６及び／またはＡ９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または、
配列番号７１～１１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号７９及び／または配列番号１０２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む。
一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号２～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号４８～７０及び配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号７１～１１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
配列番号２～２４のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
配列番号４８～７０のいずれか１つ、好ましくは配列番号５６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、及び／または、
配列番号７１～９３のいずれか１つ、好ましくは配列番号７９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）のうちの１つ以上を含み得る。
あるいはまたは加えて、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
配列番号２５～４７のいずれか１つ、好ましくは配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、
配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つ、好ましくは配列番号Ａ９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び／または、
配列番号９４～１１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）のうちの１つ以上を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～４７のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号４８～７０及び配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号７１～１１６のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～４７のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号４８～７０及び配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ２を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号７１～１１６のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ１を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
本明細書で「少なくとも８０％」または「８０％以上」と言及している実施形態は、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％など８０％以上のすべての値の配列同一性を含むと理解されるであろう。一実施形態において、抗体または断片は、指定された配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
配列同一性の割合の代わりに、諸実施形態はまた、１つ以上のアミノ酸変化、例えば、１つ以上の付加、置換及び／または欠失で定義され得る。一実施形態において、配列は、最大５つのアミノ酸変化、例えば最大３つのアミノ酸変化、特に最大２つのアミノ酸変化を含み得る。例えば、配列は、最大５つのアミノ酸置換、例えば最大３つのアミノ酸置換、特に最大１つまたは２つのアミノ酸置換を含み得る。例えば、抗体またはその断片のＣＤＲ３は、配列番号２～４７のいずれか１つと比較して、２つ以下、より適切には１つ以下の置換（複数可）を有する配列を含み得るか、またはより適切にはそれからなり得る。
適切には、配列番号２～１１６及び配列Ａ１～Ａ２３のそれらの対応する残基とは異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の任意の残基は、それらの対応する残基に関して保存的置換である。例えば、配列番号２～４７のそれらの対応する残基とは異なるＣＤＲ３の任意の残基は、それらの対応する残基に関して保存的置換である。
一実施形態において、抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
（ｉｉ）配列番号４８～７０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域、
（ｉｉｉ）配列番号７１～９３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域、
（ｉｖ）配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
（ｖ）配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域、及び／または、
（ｖｉ）配列番号９４～１１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
（ｉｉ）配列番号４８～７０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域、及び
（ｉｉｉ）配列番号７１～９３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を備えた重鎖を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
（ｉｉ）配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域、及び、
（ｉｉｉ）配列番号９４～１１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を備えた軽鎖を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１０、４、１４、１５、１７、１９または２３など配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号５６、５０、６０、６１、６３、６５または６９など配列番号４８～７０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号７９、７３、８３、８４、８６、８８または９２など配列番号７１～９３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号５６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１０の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号５６の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号７９の配列からなる。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号５０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７３の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号４の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号５０の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号７３の配列からなる。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１４の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号６０の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号８３の配列からなる。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１５の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号６１の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号８４の配列からなる。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１７の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号６３の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号８６の配列からなる。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６５の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１９の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号６５の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号８８の配列からなる。
一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号２３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２３の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号６９の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号９２の配列からなる。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号３３、２７、３７、３８、４０、４２または４６など配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列Ａ９、Ａ３、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１８またはＡ２２など配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１０２、９６、１０６、１０７、１０９、１１１または１１５など配列番号９４～１１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む（または、それからなる）。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号３３の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号３３の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ９の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号１０２の配列からなる。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号２７の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２７の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ３の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号９６の配列からなる。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号３７の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号３７の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ１３の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号１０６の配列からなる。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号３８の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１４の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号３８の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ１４の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号１０７の配列からなる。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号４０の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号４０の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ１６の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号１０９の配列からなる。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号４２の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号４２の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ１８の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号１１１の配列からなる。
一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号４６の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ２２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１５の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号４６の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ２２の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号１１５の配列からなる。
一実施形態では、抗体またはその断片は、図１に記載されるように１つ以上のＣＤＲ配列を含む。更なる実施形態において、抗体またはその断片は、図１に記載されるようにクローン１１４０＿Ｐ０１＿Ｇ０８［Ｇ４＿１２］またはクローン１１３９＿Ｐ０１＿Ａ０４［Ｇ４＿０３］の１つ以上（例えば、すべて）のＣＤＲ配列を含む。
したがって、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
（ａ）配列番号７９を有するＨＣＤＲ１、配列番号５６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２５を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０２を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ９（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４８を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｂ）配列番号８６を有するＨＣＤＲ１、配列番号６３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３２を含むまたなそれからなるＶＨと、
配列番号１０９を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１６（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５５を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｃ）配列番号７３を有するＨＣＤＲ１、配列番号５０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１９を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号９６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４２を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｄ）配列番号８３を有するＨＣＤＲ１、配列番号６０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２９を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５２を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｅ）配列番号８４を有するＨＣＤＲ１、配列番号６１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３０を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０７を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１４（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５３を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｆ）配列番号８８を有するＨＣＤＲ１、配列番号６５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３４を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１１を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１８（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５７を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｇ）配列番号９２を有するＨＣＤＲ１、配列番号６９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３８を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６１を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｈ）配列番号７１を有するＨＣＤＲ１、配列番号４８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１７を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号９４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４０を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｉ）配列番号７２を有するＨＣＤＲ１、配列番号４９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１８を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号９５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４１を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｊ）配列番号７４を有するＨＣＤＲ１、配列番号５１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２０を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号９７を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ４（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４３を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｋ）配列番号７５を有するＨＣＤＲ１、配列番号５２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２１を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号９８を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ５（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４４を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｌ）配列番号７６を有するＨＣＤＲ１、配列番号５３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２２を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号９９を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ６（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４５を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｍ）配列番号７７を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２３を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１００を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ７（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４６を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｎ）配列番号７８を有するＨＣＤＲ１、配列番号５５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２４を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０１を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ８（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４７を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｏ）配列番号８０を有するＨＣＤＲ１、配列番号５７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２６を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０３を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１０（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４９を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｐ）配列番号８１を有するＨＣＤＲ１、配列番号５８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２７を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５０を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｑ）配列番号８２を有するＨＣＤＲ１、配列番号５９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２８を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５１を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｒ）配列番号８５を有するＨＣＤＲ１、配列番号６２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３１を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１０８を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１５（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５４を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｓ）配列番号８７を有するＨＣＤＲ１、配列番号６４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３３を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１０を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１７（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５６を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｔ）配列番号８９を有するＨＣＤＲ１、配列番号６６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３５を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１２を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１９（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５８を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｕ）配列番号９０を有するＨＣＤＲ１、配列番号６７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３６を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１３を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２０（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５９を含むまたはそれからなるＶＬ、
（ｖ）配列番号９１を有するＨＣＤＲ１、配列番号６８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３７を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６０を含むまたはそれからなるＶＬ、
及び／または、
（ｗ）配列番号９３を有するＨＣＤＲ１、配列番号７０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３９を含むまたはそれからなるＶＨと、
配列番号１１６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６２を含むまたはそれからなるＶＬ、のうちの１つ以上を含み得る。
適切には、上述のＶＨ領域及びＶＬ領域はそれぞれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つのフレームワーク領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つのフレームワーク領域と少なくとも９５％、９７％または９９％など少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つの配列を含むフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つの配列からなるフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。
本明細書に記載の抗体は、それらの完全な軽鎖可変配列及び／または重鎖可変配列によって定義され得る。したがって、一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１１７～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１３９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１３９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。更なる実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１２５、１１９、１２９、１３０、１３２、１３４または１３８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１２５、１１９、１２９、１３０、１３２、１３４または１３８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１４０～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１４０～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１４８、１４２、１５２、１５３、１５５、１５７または１６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１４８、１４２、１５２、１５３、１５５、１５７または１６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１３９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１４０～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１３９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１４０～１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２５（１１４０＿Ｐ０１＿Ｇ０８）［Ｇ４＿１２］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２５のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１４８（１１４０＿Ｐ０１＿Ｇ０８）［Ｇ４＿１２］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１４８のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２５のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１４８のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１９（１１３９＿Ｐ０１＿Ａ０４）［Ｇ４＿３］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１９のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１４２（１１３９＿Ｐ０１＿Ａ０４）［Ｇ４＿３］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１４２のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１１９のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１４２のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２９（１２４８＿Ｐ０２＿Ｄ１０）［Ｇ４＿１６］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２９のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５２（１２４８＿Ｐ０２＿Ｄ１０）［Ｇ４＿１６］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５２のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２９のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１５２のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３０（１２５４＿Ｐ０１＿Ｈ０４）［Ｇ４＿１８］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３０のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５３（１２５４＿Ｐ０１＿Ｈ０４）［Ｇ４＿１８］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５３のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３０のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１５３のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３２（１２５４＿Ｐ０２＿Ｇ０２）［Ｇ４＿２０］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３２のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５５（１２５４＿Ｐ０２＿Ｇ０２）［Ｇ４＿２０］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５５のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３２のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１５５のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３４（１２５３＿Ｐ０３＿Ｈ０５）［Ｇ４＿２３］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３４のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５７（１２５３＿Ｐ０３＿Ｈ０５）［Ｇ４＿２３］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１５７のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３４のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１５７のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３８（１２４８＿Ｐ０２＿Ｃ１０）［Ｇ４＿２７］のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３８のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１６１（１２４８＿Ｐ０２＿Ｃ１０）［Ｇ４＿２７］のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１６１のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１３８のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号１６１のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。
ＶＨ領域及びＶＬ領域の両方を含む断片の場合、これらは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合またはリンカーを介して）または非共有結合のいずれかで結合することができる。本明細書に記載の抗体断片は、ｓｃＦｖ、すなわち、リンカーによって結合されたＶＨ領域及びＶＬ領域を含む断片を含み得る。一実施形態において、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、（例えば、合成）ポリペプチドリンカーによって結合されている。ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーを含み得、ｎ＝１～８、例えば、２、３、４、５または７である。ポリペプチドリンカーは、［（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ３ＡｌａＳｅｒ）ｍ］ｐリンカーを含み得、ｎ＝１～８、例えば、２、３、４、５または７であり、ｍ＝０～８、例えば、０、１、２または３であり、及びｐ＝１～８、例えば、１、２または３である。更なる実施形態において、リンカーは配列番号１８６を含む。更なる実施形態において、リンカーは配列番号１８６からなる。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１６３～１８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１６３～１８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１７１、１６５、１７５、１７６、１７８、１８０または１８４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１６３～１８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１６３～１８５のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。更に別の実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１７１、１６５、１７５、１７６、１７８、１８０または１８４のアミノ酸配列からなる。
本明細書に記載されるように、抗体は任意の形式であり得る。好ましい実施形態において、抗体はＩｇＧ１型である。したがって、一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２３３～２５５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２３３～２５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２３５、２４１、２４５、２４６または２５４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２３３～２５５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２３３～２５５のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。更に別の実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号２３５、２４１、２４５、２４６または２５４のアミノ酸配列からなる。
あるいは、配列番号２８４～３０６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０７～３２９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。したがって、配列番号２８４～３０６のいずれか１つによる重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０７～３２９のいずれか１つによる軽鎖アミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。特定の実施形態において、配列番号２９２による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３１５による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１２）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。更なる実施形態において、配列番号２８６による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０９による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿３）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。更なる実施形態において、配列番号２９６による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３１９による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１６）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。更なる実施形態において、配列番号２９７による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３２０による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１８）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。更なる実施形態において、配列番号２９９による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３２２による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２０）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。更なる実施形態において、配列番号３０１による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３２４による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２３）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。更なる実施形態において、配列番号３０５による重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３２８による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２７）を含むもしくはそれからなる、抗体またはその断片が提供される。他の実施形態において、抗体またはその断片は、
（ａ）配列番号２８４による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３０７による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１）、
（ｂ）配列番号２８５による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３０８による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２）、
（ｃ）配列番号２８７による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１０による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿４）、
（ｄ）配列番号２８８による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１１による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿５）、
（ｅ）配列番号２８９による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１２による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿６）、
（ｆ）配列番号２９０による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１３による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿７）、
（ｇ）配列番号２９１による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１４による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１０）、
（ｈ）配列番号２９３による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１６による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１３）、
（ｉ）配列番号２９４による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１７による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１４）、
（ｊ）配列番号２９５による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３１８による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１５）、
（ｋ）配列番号２９８による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２１による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿１９）、
（ｌ）配列番号３００による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２３による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２２）、
（ｍ）配列番号３０２による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２５による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２４）、
（ｎ）配列番号３０３による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２６による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２５）、
（ｏ）配列番号３０４による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２７による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２６）、
もしくは、
（ｐ）配列番号３０６による重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２９による軽鎖アミノ酸配列（クローンＧ４＿２８）を含む、またはそれからなる。
競合抗体
一実施形態において、γδＴＣＲのＶγ４鎖に特異的に結合しかつγδＴＣＲのＶγ２鎖には結合しない抗体またはその断片は、本明細書で定義されるもしくは例示される抗体もしくはその断片と同じ、もしくは本質的に同じエピトープに結合する、またはそれと競合する。当技術分野で既知の日常的な方法を使用することにより、抗体が参照抗Ｖγ４抗体と同じエピトープに結合するか、または結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本明細書に記載の参照抗Ｖγ４抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を、飽和条件下でＶγ４タンパク質またはペプチドに結合させることができる。次に、Ｖγ４鎖に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗Ｖγ４抗体との飽和結合に続いてＶγ４に結合することができる場合、試験抗体は、参照抗Ｖγ４抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗Ｖγ４抗体との飽和結合後に試験抗体がＶγ４鎖に結合できない場合、試験抗体は、参照抗Ｖγ４抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
本開示はまた、本明細書で定義される抗体もしくはその断片、もしくは本明細書に記載の例示的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体とＶγ４への結合について競合する、抗Ｖγ４抗体またはその断片を含む。例えば、どのタンパク質、抗体及び他のアンタゴニストが抗体とのＶγ４鎖への結合について競合するか及び／またはエピトープを共有するかを決定するために、本明細書に記載の抗体を用いて競合アッセイを実施することができる。これらのアッセイは、当業者には容易に知られている。当業者は、タンパク質、例えばＶγ４上の限られた数の結合部位についてのアンタゴニストまたはリガンド間の競合を評価する。抗体（またはその断片）は競合の前後に固定化または不溶化され、Ｖγ４鎖に結合した試料は、例えば、デカント（抗体が事前に不溶化された場合）または遠心分離（抗体が競合反応後に沈殿した場合）によって非結合試料から分離される。また、競合結合は、タンパク質への抗体の結合または結合の欠如によって機能が変化するかどうか、例えば抗体分子が、例えば標識の酵素活性を阻害するかまたは増強するかどうかによって決定され得る。当技術分野で既知でありかつ本明細書に記載されているように、ＥＬＩＳＡ及び他の機能アッセイを使用することができる。
２つの抗体は、それぞれが他方の標的抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍以上過剰な１つの抗体は、競合結合アッセイで測定した場合、他方の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％までも阻害する。あるいは、一方の抗体の結合を低下または排除する標的抗原の本質的にすべてのアミノ酸変異が、他方の結合も低下または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。
次に、追加の日常的な実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実行して、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものかどうか、または立体遮断（または、別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認できる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な他の任意の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
抗体配列の改変
抗体及びその断片は、既知の方法を使用して改変することができる。本明細書に記載の抗体分子への配列改変は、当業者であれば容易に取り入れることができる。以下の例は非限定的である。
ファージライブラリからの抗体の探索及び配列回復の間に、所望の抗体可変ドメインは、サブクローン化によって完全長ＩｇＧに再編成され得る。プロセスを加速するために、可変ドメインは制限酵素を使用して移されることがよくある。これらの制限部位は付加的／代替的なアミノ酸を導入し、カノニカル配列から離れ得る（このようなカノニカル配列は例えばｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ［ＩＭＧＴ］情報システムで見いだされ得る。参照ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。これらは、カッパまたはラムダ軽鎖配列改変として導入され得る。
カッパ軽鎖の改変
カッパ軽鎖の可変配列は、完全長ＩｇＧに再編成する際に制限部位（例えばＮｈｅ１－Ｎｏｔ１）を用いてクローン化することができる。より具体的には、カッパ軽鎖のＮ末端に、クローン化をサポートするために追加のＡｌａ－Ｓｅｒ配列が導入された。好ましくは、この追加のＡＳ配列は、その後、カノニカルＮ末端配列を作製するような更なる開発の間に除去される。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の抗体を含有するカッパ軽鎖は、それらのＮ末端にＡＳ配列を含まない。すなわち、配列番号１４０～１４７及び１５６～１５８は最初のＡＳ配列を含まない。この実施形態は、この配列を含有する本明細書に含まれる他の配列にも適用されることが理解されよう。
クローン化をサポートするために、追加のアミノ酸変更が行われ得る。例えば、本明細書に記載の抗体の場合、カッパ軽鎖可変ドメイン／定常ドメイン境界で、バリンからアラニンへの変更は、完全長の配列を調製する際のクローン化をサポートするために導入された。これにより、カッパ定常ドメインが改変された。具体的には、これにより、定常ドメインは
Figure 2023514437000003
（ＮｏｔＩ制限部位から）ではじまることになる。好ましくは、この配列は、
Figure 2023514437000004
ではじまるカノニカルカッパ軽鎖定常領域を作製するために、更なる開発中に改変され得る。このような改変は、抗体の機能性を変更しない。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の抗体を含有するカッパ軽鎖は、配列ＲＴＶではじまる定常ドメインを含有する。したがって、一実施形態において、配列番号２３３～２４０、２４９～２５１、３０７～３１４及び３２３～３２５の配列
Figure 2023514437000005
は、配列
Figure 2023514437000006
で置き換えられる。好ましいカッパ軽鎖定常ドメインアロタイプを含む好ましい実施形態において、カッパ軽鎖定常ドメインは配列番号３３０によるアミノ酸配列を有し、本明細書に開示される任意の軽鎖可変ドメインと組み合わせることができる。
ラムダ軽鎖の改変
上述のカッパの例と同様に、ラムダ軽鎖可変ドメインも、完全長ＩｇＧに再編成する際に制限部位（例えばＮｈｅ１－Ｎｏｔ１）を導入することによりクローン化され得る。より具体的には、ラムダ軽鎖のＮ末端に、クローン化をサポートするために追加のＡｌａ－Ｓｅｒ配列が導入され得る。好ましくは、この追加のＡＳ配列は、その後、カノニカルＮ末端配列を作製するような更なる開発の間に除去される。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の抗体を含有するラムダ軽鎖は、それらのＮ末端にＡＳ配列を含まない。すなわち、配列番号１４８～１５５及び１５９～１６２は最初のＡＳ配列を含まない。この実施形態は、この配列を含有する本明細書に含まれる他の配列にも適用されることが理解されよう。
別の例として、本明細書に記載の抗体の場合、ラムダ軽鎖可変ドメイン／定常ドメイン境界で、リシンからアラニンへの変更は、完全長の配列を調製する際のクローン化をサポートするために導入された。これにより、ラムダ定常ドメインが改変された。具体的には、これにより、定常ドメインは
Figure 2023514437000007
（ＮｏｔＩ制限部位から）ではじまることになる。好ましくは、この配列は、
Figure 2023514437000008
で開始するカノニカルラムダ軽鎖定常領域を作製するように、更なる開発中に改変され得る。このような改変は、抗体の機能性を変更しない。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の抗体を含有するラムダ軽鎖は、配列ＧＱＰＫではじまる定常ドメインを含有する。したがって、一実施形態において、配列番号２４１～２４８、２５２～２５５、３１５～３２２及び３２６～３２９の配列
Figure 2023514437000009
は、配列
Figure 2023514437000010
で置き換えられる。好ましいラムダ軽鎖定常ドメインアロタイプを含む好ましい実施形態において、ラムダ軽鎖定常ドメインは配列番号３３１によるアミノ酸配列を有し、本明細書に開示される任意の軽鎖可変ドメインと組み合わせることができる。
ラムダ軽鎖及びカッパ軽鎖の改変
配列番号１４０～１６２として本明細書で開示されるラムダ及び／またはカッパ軽鎖可変ドメインからのＮ末端ＡＳ残基の除去に関する上述の開示を考慮して、単離された抗Ｖγ４抗体または断片は、Ｎ末端ＡＳ残基を欠いた配列番号１４０～１６２に対応する配列番号２６１～２８３のいずれか１つによる軽鎖可変（ＶＬ）アミノ酸配列を含み得る。したがって、配列番号１４０～１６２の１つ以上によるＶＬアミノ酸配列への本明細書における任意の言及は、それぞれ、配列番号２６１～２８３によるＶＬアミノ酸配列で置き換えることができ、このようなすべての実施形態はここに開示される。例示として、配列番号１４８（クローンＧ４＿１２に由来）による軽鎖可変ドメインに対する本明細書での言及は、配列番号２６９への言及と置き換えることができる。
重鎖の改変
通常、ヒト可変重鎖配列は、塩基性グルタミン（Ｑ）または酸性グルタミン酸（Ｅ）のいずれかではじまる。しかし、そのような配列は両方とも、酸性アミノ酸残基であるピログルタミン酸（ｐＥ）に変換されることが知られている。ＱからｐＥへの変換により抗体の電荷が変化するが、ＥからｐＥへの変換は抗体の電荷を変化させない。したがって、経時的な電荷変化の変動を回避するための１つのオプションは、最初に開始重鎖配列をＱからＥに改変することである。したがって、一実施形態において、重鎖のＮ末端にＱ残基を有する本明細書に記載の抗体の重鎖は、Ｎ末端にＱからＥへの改変を含有し得る。特に、配列番号１１８、１２０、１２４、１２６、１３２、１３３、１３５、１３７、１３８及び／または１３９のいずれかの最初の残基は、ＱからＥへ改変し得る。この実施形態はまたは、この配列を含有する本明細書に含まれる他の配列にも適用されることが理解されるであろう（すなわち、これらの配列を、例えば完全長抗体またはその断片に組み込む任意の実施形態）。いくつかの実施形態において、重鎖のＮ末端のＥ残基をＱ残基に置換することが有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、任意の１つの配列番号１１７、１１９、１２１～１２３、１２５、１２７～１３１、１３４及び／または１３６のＮ末端のＥ残基は、Ｑ残基で置換され得る。
更に、ＩｇＧ１定常ドメインのＣ末端はＰＧＫで終わる。しかしながら、更に末端の塩基性リシン（Ｋ）は、発現中にしばしば切断される（例えば、ＣＨＯ細胞で）。これにより、Ｃ末端のリシン残基が様々に失われることにより抗体の電荷が変化する。したがって、１つのオプションは、最初にリシンを除去して、ＰＧで終わる均一かつ一貫した重鎖Ｃ末端配列をもたらすことである。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、そのＣ末端から除去された末端Ｋを有する。特に、抗体は、末端リシン残基が除去されている配列番号２３３～２５５または２８４～３０６のいずれか１つを含み得る。
任意のアロタイプの改変
抗体の発見中に、特定のヒトアロタイプを使用し得る。任意選択で、抗体は、開発中に異なるヒトアロタイプに切り替えることができる。非限定的な例として、カッパ鎖には、３つのＫｍ対立遺伝子を定義するＫｍ１、Ｋｍ１，２及びＫｍ３と呼ばれる３つのヒトアロタイプがある（アロタイプ番号付けを使用）。Ｋｍ１はバリン１５３（ＩＭＧＴ Ｖ４５．１）及びロイシン１９１（ＩＭＧＴ Ｌ１０１）と相関し、Ｋｍ１，２はアラニン１５３（ＩＭＧＴ Ａ４５．１）及びロイシン１９１（ＩＭＧＴ Ｌ１０１）と相関し、Ｋｍ３はアラニン１５３（ＩＭＧＴ Ａ４５．１）及びバリン１９１（ＩＭＧＴ Ｖ１０１）と相関する。したがって、任意選択で、標準的なクローン化アプローチによって、１つのアロタイプから別のアロタイプに配列を改変することができる。例えばＬ１９１Ｖ（ＩＭＧＴ Ｌ１０１Ｖ）を変更すると、Ｋｍ１，２アロタイプがＫｍ３アロタイプに変換される。このようなアロタイプの詳細については、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）ＭＡｂｓ１（４）：３３２－８を参照し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、一実施形態において、本明細書に記載の抗体は、同じ遺伝子の別のヒトアロタイプに由来するアミノ酸置換を含有する。更なる実施形態において、抗体は、ｃドメインをｋｍ１，２からｋｍ３アロタイプに変換するためのカッパ鎖へのＬ１９１Ｖ（ＩＭＧＴ Ｌ１０１Ｖ）置換を含有する。
好ましいカッパ軽鎖定常ドメインアロタイプを含む好ましい実施形態において、カッパ軽鎖定常ドメインは配列番号３３０によるアミノ酸配列を有し、本明細書に開示される任意の軽鎖可変ドメインと組み合わせることができる。好ましいラムダ軽鎖定常ドメインアロタイプを含む代替の好ましい実施形態において、ラムダ軽鎖定常ドメインは配列番号３３１によるアミノ酸配列を有し、本明細書に開示される任意の軽鎖可変ドメインと組み合わせることができる。
抗体結合
抗体またはその断片は、表面プラズモン共鳴によって測定される３．０×１０－７Ｍ（すなわち、３００ｎＭ）未満または１．５×１０－７Ｍすなわち、１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶγ４鎖に結合し得る。更なる実施形態において、ＫＤは、１．３×１０－７Ｍ（すなわち、１３０ｎＭ）以下、例えば１．０×１０－７Ｍ（すなわち、１００ｎＭ）以下である。更に別の実施形態において、ＫＤは、６．０×１０－８Ｍ（すなわち、６０ｎＭ）未満、例えば５．０×１０－８Ｍ（すなわち、５０ｎＭ）未満、４．０×１０－８Ｍ（すなわち、４０ｎＭ）未満、３．０×１０－８Ｍ（すなわち、３０ｎＭ）未満または２．０×１０－８Ｍ（すなわち、２０ｎＭ）未満である。更なる実施形態において、ＫＤは、１．０×１０－８Ｍ（すなわち、１０ｎＭ）以下、例えば５．０×１０－９Ｍ（すなわち、５ｎＭ）以下、４．０×１０－９Ｍ（すなわち、４ｎＭ）以下、３．０×１０－９Ｍ（すなわち、３ｎＭ）以下、２．０×１０－９Ｍ（すなわち、２ｎＭ）以下または１．０×１０－９Ｍ（すなわち、１ｎＭ）以下であり得る。例えば、一実施形態において、（例えば、ヒト）抗Ｖγ４抗体は、表面プラズモン共鳴によって測定される１．５×１０－７Ｍ（すなわち、１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶγ４鎖に結合する。
一実施形態において、抗体またはその断片は、表面プラズモン共鳴によって測定される４．０×１０－８Ｍ（すなわち、４０ｎＭ）未満、３．０×１０－８Ｍ（すなわち、３０ｎＭ）未満または２．０×１０－８Ｍ（すなわち、２０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶγ４鎖に結合する。
一実施形態において、抗体またはその断片の結合親和性は、抗体またはその断片を直接または間接的に（例えば、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃによる捕捉によって）センサーの表面上（例えば、アミン高容量チップまたは同等物）にコーティングすることによって確立され、抗体またはその断片によって結合された標的（すなわち、γδＴＣＲのＶγ４鎖）は、結合を検出するためにチップ上を流れる。代替の実施形態において、抗原は、その上を試験抗体またはその断片が流される、センサーの表面に直接または間接的にコーティングされ得る。当業者であれば、適切な試験条件を十分に決定することができる。例えば、適切には、ＭＡＳＳ－２装置（Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ－３２とも呼ばれる）を、ＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０泳動緩衝液中で３０μｌ／分の速度で２５°Ｃにて使用できる。他の適切な実施形態において、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ４ＳＰＲ装置を、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で流速２５μｌ／分で室温（例えば２５℃）にて使用できる。
抗体の機能特性
抗体機能を定義するために使用され得るアッセイが、本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載の抗体またはその断片は、γδＴＣＲの関与、例えば、抗体結合時のγδＴＣＲの下方制御及び／または抗体結合時のＣＤ６９表面発現の上方制御を測定することによって評価され得る。抗体またはその断片の適用（任意選択で細胞の表面に提示される）後にγδＴＣＲまたはＣＤ６９の表面発現を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。
本明細書に記載の抗体またはその断片はまた、γδＴ細胞の脱顆粒を測定することによっても評価することができる。例えば、γδＴ細胞への抗体またはその断片の適用（任意選択で細胞の表面に提示される）後に細胞脱顆粒のマーカーであるＣＤ１０７ａの発現は、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。本明細書に記載の抗体またはその断片はまた、γδＴ細胞媒介性死滅活性を測定することによって評価することができる（抗体がγδＴ細胞の死滅活性に影響を与えるかどうか、すなわち直接または間接的に標的細胞を死滅させるためγδＴ細胞を誘導する抗体の能力を試験するため）。例えば、標的細胞は、抗体またはその断片の存在下（任意選択で細胞の表面に提示される）でγδＴ細胞と共にインキュベートされ得る。インキュベーション後、培養物を細胞生存率色素で染色して、生きている標的細胞と死んでいる標的細胞を区別することができる。次に、死細胞の割合を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。
本明細書に記載されるように、アッセイで使用される抗体またはその断片は、表面、例えば、Ｆｃ受容体を含む細胞などの細胞の表面に提示され得る。例えば、抗体またはその断片は、ＴＩＢ－２０２（商標）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能）などのＴＨＰ－１細胞の表面に提示され得る。あるいは、抗体またはその断片は、アッセイで直接使用され得る。
このような機能アッセイにおいて、「ＥＣ５０」または「５０％有効濃度」とも称される最大濃度の半分を計算することによって、出力を測定できる。「ＩＣ５０」という用語は、阻害濃度を指す。ＥＣ５０及びＩＣ５０の両方は、フローサイトメトリー法などの当技術分野で既知の方法を使用して測定することができる。誤解を避けるために、本出願におけるＥＣ５０の値は、ＩｇＧ１型抗体を使用して提供されている。このような値は、抗体形式の分子量に基づいて、以下のように同等の値に簡単に変換できる。
（μｇ／ｍｌ）／（ｋＤａ中のＭＷ）＝μＭ
本明細書ではミリリットルを「ｍｌ」または「ｍＬ」と表記し、同義的に使用できる。
抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御のＥＣ５０は、０．５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．４μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０５μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１型で測定された場合のものである。例えば、ＥＣ５０γδＴＣＲ下方制御値は、フローサイトメトリーを使用して測定できる。
抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒のＥＣ５０は、０．０５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌまたは０．００８μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１型で測定された場合のものである。例えば、γδＴ細胞脱顆粒ＥＣ５０値は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１０７ａ発現（すなわち、細胞脱顆粒のマーカー）を検出することによって測定できる。一実施形態において、ＣＤ１０７ａ発現は、抗ヒトＣＤ１０７ａＢＶ４２１（クローンＨ４Ａ３）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用して測定される。
抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞媒介性死滅のＥＣ５０は、０．５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．４μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０７μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１型で測定された場合のものである。例えば、ＥＣ５０γδＴ細胞媒介性死滅値は、抗体、γδＴ細胞及び標的細胞のインキュベーション後にフローサイトメトリーを使用して死細胞の割合を検出することによって（つまり、細胞生存率色素を使用して）測定できる。一実施形態において、標的細胞の死は、細胞生存率色素であるＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定される。
これらの態様で説明されるアッセイにおいて、抗体またはその断片は、ＴＨＰ－１細胞、例えばＴＩＢ－２０２（商標）（ＡＴＣＣ）などの細胞の表面に提示され得る。ＴＨＰ－１細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの色素で任意選択で標識されている。
ポリヌクレオチド及び発現ベクター
本明細書に記載の抗Ｖγ４抗体または断片をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１８７～２３２と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。一実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１８７～２０９のＶＨ領域を含む発現ベクターによってコードされる。別の実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号２１０～２３２のＶＬ領域を含む発現ベクターによってコードされる。更なる実施形態において、抗Ｖγ４抗体またはその断片は、配列番号１８７～２３２を含む、またはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。更なる実施形態において、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡが提供される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１９５、１８９、１９９、２００、２０２、２０４、２０８、２１８、２１２、２２２、２２３、２２５、２２７または２３１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる。一実施形態において、発現ベクターは、配列番号１９５、１８９、１９９、２００、２０２、２０４または２０８のＶＨ領域を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号２１８、２１２、２２２、２２３、２２５、２２７または２３１のＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１９５、１８９、１９９、２００、２０２、２０４、２０８、２１８、２１２、２２２、２２３、２２５、２２７または２３１、特に配列番号１９５及び／または２１８、または配列番号１８９及び／または２１２を含む、またはそれからなる。更なる実施形態において、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡが提供される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３をコードする配列番号１８７～２３２の部分のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３をコードする配列番号１９５、１８９、１９９、２００、２０２、２０４、２０８、２１８、２１２、２２２、２２３、２２５、２２７または２３１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４をコードする配列番号１８７～２３２の部分のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４をコードする配列番号１９５、１８９、１９９、２００、２０２、２０４、２０８、２１８、２１２、２２２、２２３、２２５、２２７または２３１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる。
抗体またはその断片を発現させるために、本明細書に記載の部分長または完全長の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドを、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に結合されるように、発現ベクター内に挿入される（それは、当技術分野でよく理解されているように「発現カセット」と称され得る）。したがって、本明細書で定義されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターもまた記載される。一実施形態において、発現ベクターは、配列番号１９５、１８９、１９９、２００、２０２、２０４または２０８のいずれか１つなど配列番号１８７～２０９のいずれか１つのＶＨ配列を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号２１８、２１２、２２２、２２３、２２５、２２７または２３１のいずれか１つなど配列番号２１０～２３２のいずれか１つのＶＬ領域を含む。このような発現ベクターまたはカセットは、本明細書に開示される抗体を提供する様々なアミノ酸配列の対化に従って、重鎖可変配列及び軽鎖可変配列を適切に対化して、対で使用され得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１８７～２０９（可変重領域をコードする）のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、及び配列番号２１０～２３２（可変軽領域をコードする）のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性または１００％の同一性を有する配列を更に含む。ここでも、配列は、本明細書に記載の抗体をコードするために本明細書に記載されるように特定の対で提供され得る。
ポリヌクレオチド及び発現ベクターはまた、コードされたアミノ酸配列を参照して記載され得る。したがって、一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１～１８６、２３３～２６０のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む、またはそれからなる。
ポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが特定の宿主における翻訳のための好ましいコドンを提供するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡに、突然変異を起こすことができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ならびに哺乳動物、特にヒトにおける核酸の翻訳のための好ましいコドンが知られている。
ポリペプチドの突然変異は、例えば、ポリペプチドをコードする核酸への置換、付加または欠失によって達成することができる。ポリペプチドをコードする核酸への置換、付加または欠失は、例えば、エラープローンＰＣＲ、混合、オリゴヌクレオチド指定突然変異、アセンブリＰＣＲ、ＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰アンサンブル突然変異誘発、指数アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構築、人工遺伝子合成、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、またはこれらの方法の組み合わせを含む多くの方法によって導入され得る。核酸への修飾、付加または欠失はまた、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有テンプレート突然変異誘発、ギャップ二重鎖突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射性突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限精製突然変異誘発、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸多量体作製、またはこれらの組み合わせを含む方法によって導入され得る。
特に、人工遺伝子合成を使用することができる。ポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、固相ＤＮＡ合成によって合成的に生成することができる。前駆体テンプレートＤＮＡを必要とせずに、遺伝子全体をｄｅ ｎｏｖｏに合成することができる。所望のオリゴヌクレオチドを得るために、構成要素は、生成物の配列によって必要とされる順序で、成長するオリゴヌクレオチド鎖に連続的に結合される。鎖構築が完了すると、生成物は固相から溶液に放出され、脱保護され、収集される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生成物を単離し、所望のオリゴヌクレオチドを高純度で得ることができる。
発現ベクターには、例えば、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来エピソームが含まれる。ベクター内の転写及び翻訳制御配列がポリヌクレオチドの転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ポリヌクレオチドをベクターにライゲーションする。発現及び／または制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、コード配列の５’側の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル及び終止コドンを含み得る。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。したがって、合成リンカー（配列番号１８６をコードする）によって結合されたＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、配列番号１６３～１８５のいずれか１つによる本発明の一本鎖可変フラグメントをコードするヌクレオチド配列もまた記載される。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、またはその両方（任意選択でリンカーを含む）を含み得ることが理解されるであろう。したがって、ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを別々のベクターに挿入することができ、あるいは両方の領域をコードする配列を同じ発現ベクターに挿入する。ポリヌクレオチド（複数可）は、標準的な方法（例えば、ポリヌクレオチド及びベクターの相補的制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。
便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものであり、本明細書に記載されるように、任意のＶＨ配列またはＶＬ配列を容易に挿入及び発現できるように操作された適切な制限部位を備える。発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体（またはその断片）の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドが抗体のアミノ末端にインフレームで結合されるようにベクターにクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
宿主細胞は、抗体またはその断片の軽鎖をコードする第１のベクター、及び抗体またはその断片の重鎖をコードする第２のベクターを含み得る。あるいは、重鎖及び軽鎖の両方は、宿主細胞内に導入された同じ発現ベクター上にコードされ得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、抗体またはその断片に融合された膜アンカーまたは膜貫通ドメインをコードし、抗体またはその断片は宿主細胞の細胞外表面に提示される。
形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法によることができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、形質導入、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）の封入、遺伝子銃注射、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。更に、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入され得る。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、及び他の多くの細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ及びハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって選択される。使用できる他の細胞株は、Ｓｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞及び真菌細胞などの昆虫細胞株である。ｓｃＦｖ断片及びＦｖ断片などの抗体の抗原結合断片は、当技術分野で既知の方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉで単離及び発現させることができる。
抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって作成される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収され得る。
本明細書に記載の抗体（または断片）は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０１２）４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに開示されている技術を使用して取得及び操作することができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、特定の抗体産生Ｂ細胞を、組織培養で増殖する能力及び抗体鎖合成の欠如のために選択された骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と融合させることによって生成され得る。
決定された抗原に対するモノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ハイブリドーマを形成するために、決定された抗原で、不死細胞で及び好ましくは骨髄腫細胞で以前に免疫化された動物の末梢血から得られたリンパ球を不死化することと、
ｂ）形成された不死化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を回収することと、によって得ることができる。
あるいは、ハイブリドーマ細胞を使用する必要はない。本明細書に記載の標的抗原に結合することができる抗体は、例えばファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または当技術分野で既知の哺乳動物ディスプレイ技術を使用して、日常業務を介して適切な抗体ライブラリから単離することができる。したがって、モノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ベクターに、特にファージ及びより具体的には糸状バクテリオファージ、リンパ球、特に動物の末梢血リンパ球から得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列（適切には決定された抗原で免疫されている）へクローン化することと、
ｂ）抗体の産生を可能にする条件で、上記のベクターで原核細胞を形質転換することと、
ｃ）抗体を抗原親和性選択にかけることにより、抗体を選択することと、
ｄ）所望の特異性を有する抗体を回収することと、の工程を含むプロセスによって得ることができる。
医薬組成物
本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される方法によって得られるＶγ４Ｔ細胞集団を含む組成物が提供される。一実施形態において、Ｖγ４Ｔ細胞集団は、増殖したＶγ４Ｔ細胞集団である。そのような実施形態において、組成物は、細胞を任意選択で他の賦形剤と組み合わせて含み得る。１つ以上の追加の活性剤（例えば、本明細書に記載の疾患を治療するのに適した活性剤）を含む組成物も含まれる。
医薬組成物は、本明細書に記載のＶγ４Ｔ細胞、特に増殖したＶγ４Ｔ細胞を、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化物質；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含むことができる。本発明の医薬組成物に使用できる凍結保存溶液には、例えばＤＭＳＯが含まれる。組成物は、例えば静脈内投与用に製剤化することができる。
一実施形態において、医薬組成物は、例えばエンドトキシンまたはマイコプラズマなどの汚染物質を実質的に含まない、例えば、汚染物質は検出可能なレベルで存在しない。
好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、髄腔内）である。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、組成物は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
このような疾患の治療に通常使用される他の確立された治療の補助として、またはそれと組み合わせて、本明細書に記載の疾患の治療のための治療方法において本発明の医薬組成物を使用することは、本発明の範囲内である。
本発明の更なる態様において、細胞集団、組成物または医薬組成物は、少なくとも１つの活性剤と共に、連続的に、同時にまたは別々に投与される。
細胞集団を用いた治療方法
本発明の更なる態様によれば、薬剤として使用するための本明細書で定義される方法によって得られる細胞集団が提供される。本発明の更なる態様によれば、薬剤として使用するための本明細書で定義される増殖した細胞集団が提供される。本明細書における、薬剤としてまたは治療で「使用するための」細胞集団への言及は、対象への細胞集団の投与に限定される。そのような使用には、患者への抗体またはその断片の直接投与、すなわち前記抗体が治療薬として使用される場合は含まれない。
一実施形態において、細胞集団は、がん、感染症または炎症性疾患の治療に使用するためのものである。更なる実施形態において、細胞集団は、がんの治療に使用するためのものである。
一実施形態において、薬剤として使用するための細胞集団は、５０％を超えるＶγ４Ｔ細胞、例えば、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超えるまたは９９％を超えるＶγ４Ｔ細胞を含む。更なる実施形態において、薬剤として使用するための細胞集団は、Ｖγ４Ｔ細胞からなる。
本発明の更なる態様によれば、薬剤として使用するための本明細書で定義される細胞集団を含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、細胞集団を含む医薬組成物は、治療に使用するためのものであり、特にがん、感染症または炎症性疾患の治療に使用するためのものである。更なる実施形態において、細胞集団を含む医薬組成物は、がんの治療に使用するためのものである。
本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される治療上有効な量の細胞集団を投与することを含む、それを必要とする対象の免疫応答を調節する方法が提供される。
本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される治療上有効な量の細胞集団を投与することを含む、それを必要とする対象のがん、感染症または炎症性疾患を治療する方法が提供される。あるいは、治療上有効な量の細胞集団を含む医薬組成物が投与される。
本発明の更なる態様によれば、例えばがん、感染症または炎症性疾患の治療において、薬剤の製造のために本明細書で定義される細胞集団の使用が提供される。
養子Ｔ細胞療法
本発明の増殖方法によって得られたガンマデルタＴ細胞は、例えば養子Ｔ細胞療法のための薬剤として使用され得る。これには、患者へのγδＴ細胞の移植が含まれる。療法は自家移植であり得る、すなわち、γδＴ細胞は、それを得たのと同じ患者に再び移植され得る、または療法は同種異系であり得る、すなわち、あるヒトからのγδＴ細胞が別の患者に移植され得る。同種移植を含む場合、γδＴ細胞は、αβＴ細胞を実質的に含まなくてもよい。例えば、αβＴ細胞は、例えば増殖後に、当技術分野で既知の任意の適切な手段を使用して（例えば、磁気ビーズを使用する陰性選択によって）、γδＴ細胞集団から枯渇させ得る。治療方法には、ドナー個人から得られた試料（例えば、非造血組織試料）を提供することと、本明細書に記載のように試料から得られたγδＴ細胞を培養して、例えば増殖集団を生成することと、γδＴ細胞の集団をレシピエント個人に投与することと、が含まれる。
治療される患者または対象は、好ましくは、ヒトがん患者（例えば、固形腫瘍の治療を受けているヒトがん患者）またはウイルス感染患者（例えば、ＣＭＶ感染患者またはＨＩＶ感染患者）である。場合によっては、患者は、固形腫瘍の治療を受けている、及び／または固形腫瘍を治療中である。それらは通常、非造血組織に存在するため、組織に存在するＶγ４Ｔ細胞はまた、全身の血液に存在する対応物よりも腫瘍塊に戻り、保持される可能性が高く、これらの細胞の養子移植は、固形腫瘍及び潜在的に他の非造血組織関連免疫病理を標的とした場合により効果的である可能性が高い。
γδＴ細胞は非ＭＨＣ拘束性であるため、それらは、移植先の宿主を外来として認識せず、移植片対宿主病を引き起こしにくいことを意味する。これは、それらを「既製品」で使用でき、例えば同種養子Ｔ細胞療法のために任意のレシピエントに移植できることを意味する。
本明細書に記載の方法によって得られるγδＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄを発現し、悪性腫瘍と強く関連しているＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＭＩＣＡ）に応答する。それらはまた、活性化されていない状態でも細胞傷害性プロファイルを発現し得、したがって、腫瘍細胞を殺傷する場合に効果的である可能性がある。例えば、本明細書に記載のように得られたγδＴ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ４、ＩＬ－１３、グラヌリシン、グランザイムＡ及びＢ、ならびにパーフォリンのうちの１つ以上、好ましくはすべてを活性化されていない状態でも発現し得る。ＩＬ－１７Ａは、発現していなくてもよい。
いくつかの実施形態において、腫瘍を有する個人の治療方法は、ドナー個人から得られた前記腫瘍の試料を提供することと、上述のように試料から得られたγδＴ細胞を培養することと、γδＴ細胞の集団を腫瘍を有する個人に投与することと、を含み得る。更なる実施形態において、非造血組織中に腫瘍を有する個人の治療方法は、ドナー個人から得られた前記非造血組織の試料を提供することと、上述のように試料から得られたγδＴ細胞を培養することと、γδＴ細胞の集団を腫瘍を有する個人に投与することと、を含み得る。
場合によっては、上記の方法のいずれかによって得られた治療上有効な量のγδＴ細胞を、治療上有効な量で対象に投与することができる（例えばがんの治療のために、例えば固形腫瘍の治療のために）。場合によっては、治療上有効な量のγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）は、１０ｘ１０１２細胞／用量未満（例えば、９ｘ１０１２細胞／用量未満、８ｘ１０１２細胞／用量、７ｘ１０１２細胞／用量未満、６ｘ１０１２細胞／用量未満、５ｘ１０１２細胞／用量未満、４ｘ１０１２細胞／用量未満、３ｘ１０１２細胞／用量未満、２ｘ１０１２細胞／用量未満、１ｘ１０１２細胞／用量未満、９ｘ１０１１細胞／用量未満、８ｘ１０１１細胞／用量未満、７ｘ１０１１細胞／用量未満、６ｘ１０１１細胞／用量未満、５ｘ１０１１細胞／用量未満、４ｘ１０１１細胞／用量未満、３ｘ１０１１細胞／用量未満、２ｘ１０１１細胞／用量未満、１ｘ１０１１細胞／用量未満、９ｘ１０１０細胞／用量未満、７．５ｘ１０１０細胞／用量未満、５ｘ１０１０細胞／用量未満、２．５ｘ１０１０細胞／用量未満、１ｘ１０１０細胞／用量未満、７．５ｘ１０９細胞／用量未満、５ｘ１０９細胞／用量未満、２．５ｘ１０９細胞／用量未満、１ｘ１０９細胞／用量未満、７．５ｘ１０８細胞／用量未満、５ｘ１０８細胞／用量未満、２．５ｘ１０８細胞／用量未満、１ｘ１０８細胞／用量未満、７．５ｘ１０７細胞／用量未満、５ｘ１０７細胞／用量未満、２．５ｘ１０７細胞／用量未満、１ｘ１０７細胞／用量未満、７．５ｘ１０６細胞／用量未満、５ｘ１０６細胞／用量未満、２．５ｘ１０６細胞／用量未満、１ｘ１０６細胞／用量未満、７．５ｘ１０５細胞／用量未満、５ｘ１０５細胞／用量未満、２．５ｘ１０５細胞／用量未満、または１ｘ１０５細胞／用量未満）である。
いくつかの実施形態において、治療上有効な量のγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）は、治療期間中で１０ｘ１０１２細胞未満（例えば、治療期間中で、９ｘ１０１２細胞未満、８ｘ１０１２細胞未満、７ｘ１０１２細胞未満、６ｘ１０１２細胞未満、５×１０１２細胞未満、４×１０１２細胞未満、３×１０１２細胞未満、２×１０１２細胞未満、１×１０１２細胞未満、９×１０１１細胞未満、８ｘ１０１１細胞未満、７ｘ１０１１細胞未満、６ｘ１０１１細胞未満、５ｘ１０１１細胞未満、４ｘ１０１１細胞未満、３ｘ１０１１細胞未満、２×１０１１細胞未満、１×１０１１細胞未満、９×１０１０細胞未満、７．５×１０１０細胞未満、５×１０１０細胞未満、２．５×１０１０細胞未満、１ｘ１０１０細胞未満、７．５ｘ１０９細胞未満、５ｘ１０９細胞未満、２．５ｘ１０９細胞未満、１ｘ１０９細胞未満、７．５ｘ１０８細胞未満、５ｘ１０８細胞未満、２．５×１０８細胞未満、１×１０８細胞未満、７．５×１０７細胞未満、５×１０７細胞未満、２．５×１０７細胞未満、１ｘ１０７細胞未満、７．５ｘ１０６細胞未満、５ｘ１０６細胞未満、２．５ｘ１０６細胞未満、１ｘ１０６細胞未満、７．５ｘ１０５細胞未満、５ｘ１０５細胞未満、２．５ｘ１０５細胞未満、または１ｘ１０５細胞未満）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）の用量は、約１ｘ１０６、１．１ｘ１０６、２ｘ１０６、３．６ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７、１．８ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、または５ｘ１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）の用量は、最大約１ｘ１０６、１．１ｘ１０６、２ｘ１０６、３．６ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７、１．８ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、または５ｘ１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、γδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）の用量は、約１．１ｘ１０６～１．８ｘ１０７細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、γδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）の用量は、約１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、または５ｘ１０９細胞を含む。いくつかの実施形態において、γδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）の用量は、少なくとも約１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、または５ｘ１０９細胞を含む。いくつかの実施形態において、γδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）の用量は、最大約１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、または５ｘ１０９細胞を含む。
一実施形態において、対象は、対象の体重１ｋｇあたり１０４～１０６個のγδＴ細胞（例えば、Ｖγ４Ｔ細胞）を投与される。一実施形態において、対象は、γδＴ細胞の集団の初回投与を受け（例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４～１０６個のγδＴ細胞、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４～１０５個のγδＴ細胞）、γδＴ細胞の１回以上（例えば、２、３、４または５回）のその後の投与（例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４～１０６個のγδＴ細胞、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４～１０５個のγδＴ細胞）を受ける。一実施形態において、１回以上のその後の投与は、前回の投与後の１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２日未満、例えば、前回の投与後の４、３または２日未満に投与される。一実施形態において、対象は、γδＴ細胞集団の少なくとも３回の投与の期間中で、対象の体重１ｋｇあたり合計約１０６個のγδＴ細胞を受け、例えば、対象は、１ｘ１０５γδＴ細胞の最初の投与、３ｘ１０５γδＴ細胞の２回目の投与及び６ｘ１０５γδＴ細胞の３回目の投与を受け、例えば、各投与は、前回の投与後の４、３または２日未満に投与される。
いくつかの実施形態においては、１つ以上の追加の治療薬は、対象に投与され得る。追加の治療薬は、免疫療法剤、細胞毒性剤、増殖阻害剤、放射線療法剤、抗血管新生剤、及びこれらの複数の薬剤の組み合わせからなる群より選択され得る。追加の治療薬は、γδＴ細胞の投与と同時に、投与前に、または投与後に投与することができる。追加の治療薬は、対象の体内の標的（例えば、対象自身の免疫系）及び／または移植されたγδＴ細胞に作用し得る免疫治療薬であり得る。
組成物の投与は、任意の簡便な方法で行うことができる。本明細書に記載の組成物は、患者に、経動脈内、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内に静脈内注射によって、または腹腔内に、例えば皮内注射もしくは皮下注射によって投与し得る。γδＴ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射することができる。
遺伝子操作
本発明の方法によって得られたγδＴ細胞はまた、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法などのために治療特性を増強するために遺伝子操作され得る。これには、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の生成が含まれ、新しい特異性（例えば、モノクローナル抗体の特異性）でＴ細胞を再プログラムする。操作されたＴＣＲは、Ｔ細胞を悪性細胞に特異的にし得、したがってがん免疫療法に有用であり得る。例えば、Ｔ細胞は、対象組織からの正常な体細胞によって発現されない腫瘍関連抗原などの腫瘍抗原を発現するがん細胞を認識し得る。したがって、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、例えばがん患者の養子Ｔ細胞療法に使用することができる。
抗体またはその断片の他の使用
本発明の更なる態様によれば、γδＴ細胞（特にＶγ４Ｔ細胞）の抗原認識、活性化、シグナル伝達または機能を研究するために、本明細書に記載の抗Ｖγ４抗体またはその断片の使用が提供される。本明細書に記載されるように、抗体は、γδＴ細胞機能を調査するために使用することができるアッセイにおいて活性であることが示されている。このような抗体は、γδＴ細胞の増殖を誘導するのにも有用であり得、したがってγδＴ細胞（Ｖγ４Ｔ細胞など）を増殖させる方法で使用することができる。
Ｖγ４鎖に結合する抗体は、γδＴ細胞を検出するために使用できる。例えば、抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識され得るか、または試料中のＶγ４Ｔ細胞を選択的に検出及び／または分離するための捕捉リガンドとして使用され得る。標識抗体は、例えば、免疫組織化学やＥＬＩＳＡといった当技術分野で既知の多くの方法で使用されている。
検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５ｌなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光部位または化学発光部位、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。次に、本発明の抗体に適用される蛍光標識は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）法で使用され得る。
本明細書に記載のすべての実施形態は、本発明のすべての態様に適用できることが理解されるであろう。
条項
本発明及びその好ましい態様を定義する条項のセットは以下のとおりである。
１．γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶγ４鎖に特異的に結合しかつγδＴＣＲのガンマ可変２（Ｖγ２）鎖には結合しない抗体またはその断片を、Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
２．前記γδＴＣＲのＶγ４鎖がヒトＶγ４であり、前記γδＴＣＲのＶγ２鎖がヒトＶγ２である、条項１に定義される方法。
３．前記抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上のアミノ酸残基を含む前記γδＴＣＲのＶγ４鎖のエピトープに結合する、条項１または２に定義される方法。
４．前記抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸領域７１～７９内の１つ以上のアミノ酸残基を含む前記γδＴＣＲのＶγ４鎖のエピトープに結合する、条項１～３のいずれか１つに定義される方法。
５．前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６、７９のうちの少なくとも１つを含む、条項４に定義される方法。
６．前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上のアミノ酸残基からなる、条項１～５のいずれか１つに定義される方法。
７．前記エピトープは、配列番号１のＫ７６及び／またはＭ８０を含むかまたはそれからなる、条項１～６のいずれか１つに定義される方法。
８．前記エピトープはγδＴ細胞の活性化エピトープである、条項１～７のいずれか１つに定義される方法。
９．前記活性化エピトープの結合は、（ｉ）前記γδＴＣＲを下方制御する、（ｉｉ）前記γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する、（ｉｉｉ）γδＴ細胞を介した死滅を活性化する、及び／または（ｉｖ）Ｖγ４鎖を介した細胞シグナル伝達を活性化または増加させる、条項８に定義される方法。
１０．前記抗体またはその断片は、γδＴＣＲのＶγ４鎖のＶ領域のエピトープにのみ結合する、条項１～９のいずれか１つに定義される方法。
１１．前記抗体またはその断片は、γδＴＣＲのＶγ４鎖のＣＤＲ３に見られるエピトープに結合しない、条項１～１０のいずれか１つに定義される方法。
１２．配列番号２～４７のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０及び／または配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号４８～７０及び配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つ、好ましくは配列番号５６及び／または配列Ａ９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または、
配列番号７１～１１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号７９及び／または配列番号１０２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む、抗Ｖγ４抗体またはその断片を、
Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
１３．前記抗体またはその断片は、配列番号１０、４、１４、１５、１７、１９または２３など配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む、条項１２に定義される方法。
１４．前記抗体またはその断片は、配列番号５６、５０、６０、６１、６３、６５または６９など配列番号４８～７０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域を含む、条項１２または条項１３に定義される方法。
１５．前記抗体またはその断片は、配列番号７９、７３、８３、８４、８６、８８または９２など配列番号７１～９３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１４のいずれか１つに定義される方法。
１６．前記抗体またはその断片は、配列番号１０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号５６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
１７．前記抗体またはその断片は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号５０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７３の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
１８．前記抗体またはその断片は、配列番号１４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
１９．前記抗体またはその断片は、配列番号１５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
２０．前記抗体またはその断片は、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
２１．前記抗体またはその断片は、配列番号１９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６５の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
２２．前記抗体またはその断片は、配列番号２３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号６９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む、条項１２～１５のいずれか１つに定義される方法。
２３．前記抗体またはその断片は、配列番号３３、２７、３７、３８、４０、４２または４６など配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２２のいずれか１つに定義される方法。
２４．前記抗体またはその断片は、配列Ａ９、Ａ３、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１８またはＡ２２など配列Ａ１～Ａ２３（図１の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２３のいずれか１つに定義される方法。
２５．前記抗体またはその断片は、配列番号１０２、９６、１０６、１０７、１０９、１１１または１１５など配列番号９４～１１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２６のいずれか１つに定義される方法。
２６．前記抗体またはその断片は、配列番号３３の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
２７．前記抗体またはその断片は、配列番号２７の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
２８．前記抗体またはその断片は、配列番号３７の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
２９．前記抗体またはその断片は、配列番号３８の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１４の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
３０．前記抗体またはその断片は、配列番号４０の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
３１．前記抗体またはその断片は、配列番号４２の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
３２．前記抗体またはその断片は、配列番号４６の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ２３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１５の配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む、条項１２～２５のいずれか１つに定義される方法。
３３．配列番号１１７～１６２または２６１～２８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗Ｖγ４抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
３４．前記抗体またはその断片は、配列番号１１７～１３９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、条項３３に定義される方法。
３５．前記ＶＨ領域は、配列番号１２５、１１９、１２９、１３０、１３２、１３４または１３８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項３４に定義される方法。
３６．前記抗体またはその断片は、配列番号１４０～１６２または２６１～２８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３５のいずれか１つに定義される方法。
３７．前記ＶＬ領域は、
（ａ）配列番号１４８、１４２、１５２、１５３、１５５、１５７もしくは１６１、または、
（ｂ）配列番号２６９、２６３、２７３、２７４、２７６、２７８もしくは２８２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項３６に定義される方法。
３８．前記抗体またはその断片は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１４８または２６９のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
３９．前記抗体またはその断片は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１４２または２６３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
４０．前記抗体またはその断片は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５２または２７３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
４１．前記抗体またはその断片は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５３または２７４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
４２．前記抗体またはその断片は、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５５または２７６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
４３．前記抗体またはその断片は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１５７または２７８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
４４．前記抗体またはその断片は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号１６１または２８２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項３３～３７のいずれか１つに定義される方法。
４５．（ａ）配列番号７９を有するＨＣＤＲ１、配列番号５６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２５を含む前記ＶＨと、
配列番号１０２を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ９（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４８または２６９を含む前記ＶＬ、
（ｂ）配列番号８６を有するＨＣＤＲ１、配列番号６３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３２を含む前記ＶＨと、
配列番号１０９を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１６（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５５または２７６を含む前記ＶＬ、
（ｃ）配列番号７３を有するＨＣＤＲ１、配列番号５０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１９を含む前記ＶＨと、
配列番号９６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４２または２６３を含む前記ＶＬ、
（ｄ）配列番号８３を有するＨＣＤＲ１、配列番号６０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２９を含む前記ＶＨと、
配列番号１０６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５２または２７３を含む前記ＶＬ、
（ｅ）配列番号８４を有するＨＣＤＲ１、配列番号６１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３０を含む前記ＶＨと、
配列番号１０７を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１４（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５３または２７４を含む前記ＶＬ、
（ｆ）配列番号８８を有するＨＣＤＲ１、配列番号６５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３４を含む前記ＶＨと、
配列番号１１１を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１８（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５７または２７８を含む前記ＶＬ、
（ｇ）配列番号９２を有するＨＣＤＲ１、配列番号６９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３８を含む前記ＶＨと、
配列番号１１５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６１または２８２を含む前記ＶＬ、
（ｈ）配列番号７１を有するＨＣＤＲ１、配列番号４８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１７を含む前記ＶＨと、
配列番号９４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４０または２６１を含む前記ＶＬ、
（ｉ）配列番号７２を有するＨＣＤＲ１、配列番号４９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１８を含む前記ＶＨと、
配列番号９５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４１または２６２を含む前記ＶＬ、
（ｊ）配列番号７４を有するＨＣＤＲ１、配列番号５１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２０を含む前記ＶＨと、
配列番号９７を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ４（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４３または２６４を含む前記ＶＬ、
（ｋ）配列番号７５を有するＨＣＤＲ１、配列番号５２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２１を含む前記ＶＨと、
配列番号９８を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ５（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４４または２６５を含む前記ＶＬ、
（ｌ）配列番号７６を有するＨＣＤＲ１、配列番号５３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２２を含む前記ＶＨと、
配列番号９９を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ６（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４５または２６６を含む前記ＶＬ、
（ｍ）配列番号７７を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２３を含む前記ＶＨと、
配列番号１００を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ７（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４６または２６７を含む前記ＶＬ、
（ｎ）配列番号７８を有するＨＣＤＲ１、配列番号５５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２４を含む前記ＶＨと、
配列番号１０１を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ８（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４７または２６８を含む前記ＶＬ、
（ｏ）配列番号８０を有するＨＣＤＲ１、配列番号５７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２６を含む前記ＶＨと、
配列番号１０３を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１０（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４９または２７０を含む前記ＶＬ、
（ｐ）配列番号８１を有するＨＣＤＲ１、配列番号５８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２７を含む前記ＶＨと、
配列番号１０４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５０または２７１を含む前記ＶＬ、
（ｑ）配列番号８２を有するＨＣＤＲ１、配列番号５９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２８を含む前記ＶＨと、
配列番号１０５を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１２（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５１または２７２を含む前記ＶＬ、
（ｒ）配列番号８５を有するＨＣＤＲ１、配列番号６２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３１を含む前記ＶＨと、
配列番号１０８を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１５（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５４または２７５を含む前記ＶＬ、
（ｓ）配列番号８７を有するＨＣＤＲ１、配列番号６４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３３を含む前記ＶＨと、
配列番号１１０を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１７（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５６または２７７を含む前記ＶＬ、
（ｔ）配列番号８９を有するＨＣＤＲ１、配列番号６６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３５を含む前記ＶＨと、
配列番号１１２を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ１９（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５８または２７９を含む前記ＶＬ、
（ｕ）配列番号９０を有するＨＣＤＲ１、配列番号６７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３６を含む前記ＶＨと、
配列番号１１３を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２０（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５９または２８０を含む前記ＶＬ、
（ｖ）配列番号９１を有するＨＣＤＲ１、配列番号６８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３７を含む前記ＶＨと、
配列番号１１４を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２１（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６０または２８１を含む前記ＶＬ、
及び／または、
（ｗ）配列番号９３を有するＨＣＤＲ１、配列番号７０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３９を含む前記ＶＨと、
配列番号１１６を有するＬＣＤＲ１、配列Ａ２３（図１の）を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６２または２８３を含む前記ＶＬ、のうちの１つ以上を含む抗Ｖγ４抗体またはその断片を、
Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
４６．前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域は、ポリペプチドリンカーなどのリンカーによって結合されている、条項３３～４５のいずれか１つに定義される方法。
４７．前記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ型を含み、ｎ＝１～８である、条項４６に定義される方法。
４８．前記リンカーは配列番号１８６を含む、条項４６または４７に定義される方法。
４９．前記リンカーは配列番号１８６からなる、条項４８に定義される方法。
５０．配列番号１６３～１８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗Ｖγ４抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
５１．前記抗体またはその断片は、配列番号１６３～１８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、条項５０に定義される方法。
５２．前記抗体またはその断片は、配列番号１７１、１６５、１７５、１７６、１７８、１８０または１８４を含む、条項５０または条項５１に定義される方法。
５３．配列番号２３３～２５５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗Ｖγ４抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
５４．配列番号２３３～２５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、条項５３に定義される方法。
５５．配列番号２３５、２４１、２４５、２４６または２５４を含む、条項５３または条項５４に定義される方法。
５６．配列番号２８４～３０６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０７～３２９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む、抗Ｖγ４抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、ガンマ可変４（Ｖγ４）Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
５７．配列番号２８４～３０６のいずれか１つを含む重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０７～３２９のいずれか１つを含む軽鎖アミノ酸配列を含む、条項５６に定義される方法。
５８．前記抗Ｖγ４抗体またはその断片は、条項１２～５７のいずれか１つで定義される抗体もしくはその断片と同じ、もしくは本質的に同じエピトープに結合する、またはそれと競合する、好ましくは条項１～１１のいずれか１つに定義される方法。
５９．前記抗体またはその断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、可変ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ダイアボディ、ミニボディまたは完全長抗体である、条項１～５８のいずれか１つに定義される方法。
６０．前記抗体またはその断片は、ｓｃＦｖまたは完全長抗体である、条項５９に定義される方法。
６１．前記抗体またはその断片は、ＩｇＧ１抗体などの完全長抗体である、条項６０に定義される方法。
６２．前記抗体またはその断片はヒトである、条項１～６１のいずれか１つに定義される方法。
６３．前記調節はＶγ４Ｔ細胞の増殖を含む、条項１～６２のいずれか１つに定義される方法。
６４．前記方法は、約７０％を超えるＶγ４Ｔ細胞など約６０％を超えるＶγ４Ｔ細胞を含有する増殖したＶγ４Ｔ細胞集団を提供する、条項６３に定義される方法。
６５．前記方法は、前記細胞集団を少なくとも５日間培養することを含む、条項１～６４のいずれか１つに定義される方法。
６６．前記方法は、少なくとも１つのサイトカインの存在下で前記細胞集団を培養することを含む、条項１～６５のいずれか１つに定義される方法。
６７．前記サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）またはこれらの混合物から選択される、条項６６に定義される方法。
６８．前記方法は、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５の存在下で前記細胞集団を培養することを含む、条項１～６７のいずれか１つに定義される方法。
６９．前記細胞集団は、培養中に間質細胞及び／または上皮細胞と直接接触しない、条項６５～６８のいずれか１つに定義される方法。
７０．前記細胞集団は、培養中に線維芽細胞と直接接触しない、条項６９に定義される方法。
７１．前記細胞集団は、培養中に腫瘍細胞及び／または支持細胞と直接接触しない、条項６５～７０のいずれか１つに定義される方法。
７２．前記方法は、無血清培地で前記細胞集団を培養することを含む、条項１～７１のいずれか１つに定義される方法。
７３．前記細胞集団は、前記抗体またはその断片の投与前にＴ細胞を濃縮する、条項１～７２のいずれか１つに定義される方法。
７４．前記細胞集団は、前記抗体またはその断片の投与前にγδＴ細胞を濃縮する、条項１～７３のいずれか１つに定義される方法。
７５．前記細胞集団は、前記抗体またはその断片の投与前にαβＴ細胞またはＮＫ細胞を枯渇させる、条項１～７４のいずれか１つに定義される方法。
７６．前記細胞集団は、造血試料またはその画分から得られる、条項１～７５のいずれか１つに定義される方法。
７７．前記造血試料は、末梢血、臍帯血、リンパ組織、胸腺、骨髄、リンパ節組織またはこれらの画分から選択される、条項７６に定義される方法。
７８．前記造血試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）からなる、条項７６または条項７７に定義される方法。
７９．前記細胞集団は、皮膚、結腸、腸、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、膵臓、子宮、膣または他の皮膚、粘膜もしくは漿膜試料などの非造血組織試料から得られる、条項１～７５のいずれか１つに定義される方法。
８０．前記細胞集団は、がん組織試料から得られる、条項１～７５のいずれか１つに定義される方法。
８１．前記細胞集団は、ヒトまたは非ヒト動物組織から得られる、条項１～８０のいずれか１つに定義される方法。
８２．前記細胞集団は、抗Ｖγ４抗体またはその断片を投与する前に試料から単離される、条項１～８１のいずれか１つに定義される方法。
８３．条項１～８２のいずれか１つに定義されるｅｘ ｖｉｖｏ方法により得られるＶγ４Ｔ細胞集団。
８４．条項８３に定義される前記Ｖγ４Ｔ細胞集団を含む組成物。
８５．条項８３に定義される前記Ｖγ４Ｔ細胞集団を、薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む医薬組成物。
８６．薬剤として使用するための、条項８５に定義される医薬組成物。
８７．がん、感染症または炎症性疾患の治療に使用するための、条項８６に定義される医薬組成物。
８８．条項８３に定義される治療上有効な量の前記Ｖγ４Ｔ細胞集団または条項８５に定義される前記医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象のがん、感染症または炎症性疾患を治療する方法。
本発明の他の特徴及び利点は、本明細書に提供される詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、当業者には様々な変更及び修正が明らかになるので、例示のためにのみ与えられていることが理解されよう。次に、本発明を、以下の非限定的な実施例を用いて説明する。
実施例１．材料及び方法
抗原調製
以下の実施例で使用されるＴＣＲα及びＴＣＲβ定常領域を含む可溶性γδＴＣＲヘテロ二量体の設計は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ１０８：２４１４－２４１９に従って作製された。ＶγドメインまたはＶδドメインは、膜貫通ドメインを欠くＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常領域にインフレームで融合され、ロイシンジッパー配列またはＦｃ配列、及びヒスチジンタグ／リンカーが続いた。
発現構築物は、哺乳動物ＥＸＰＩ ＨＥＫ２９３浮遊細胞に一過性に形質導入された（ヘテロ二量体の単一形質導入または同時形質導入として）。分泌された組換えタンパク質は、親和性クロマトグラフィーによって培養上清から回収及び精製された。モノマー抗原の良好な回収を確実にするために、試料は分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して更に精製された。精製された抗原は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度について分析され、分析ＳＥＣによって凝集状態について分析された。
選択したｓｃＦｖは、市販のプラスミドを使用してＩｇＧ１フレームワークにサブクローン化された。ｅｘｐｉ２９３Ｆ浮遊細胞は、抗体発現のために前記プラスミドで形質導入された。便宜上、特に断りのない限り、これらの実施例で特性評価される抗体は、ファージディスプレイからｓｃＦｖとして選択されたＩｇＧ１型抗体を指す。しかしながら、抗体は、前述のように任意の抗体型であり得る。
抗体精製
ＩｇＧ抗体は、タンパク質Ａクロマトグラフィーを使用して上清からバッチ精製した。精製されたＩｇＧの品質は、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して分析した。
抗原結合
ファージディスプレイ選択出力は、ｓｃＦｖ発現ベクターｐＳＡＮＧ１０にサブクローン化された（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４６）。可溶性ｓｃＦｖを発現させ、直接固定化した標的に解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）で結合についてスクリーニングした。ヒットは、３０００蛍光ユニットを超えるＤＥＬＦＩＡシグナルとして定義した。
抗体上清または更にタンパク質Ａ精製抗体との結合を評価するために、ＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡ結合法も採用された。簡単に言えば、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートは、３μｇ／ｍｌの抗原ＢＳＡまたはＬ１（ＤＶ１－ＧＶ４）、Ｌ２（ＤＶ１－ＧＶ２）、Ｌ３（ＤＶ１－ＧＶ８）もしくはＬ４（ＤＶ２－ＧＶ４）組換えＴＣＲ抗原でコーティングした。次にプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／スキムミルクで遮断した後、試験物質を加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ Ｅｕ－Ｎ１－抗ヒトＩｇＧ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２４４－３３０）を室温で１時間加えた後、更に洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃４００１－００１０）を加え、Ｐｈｅｒａｓｔａｒマイクロプレートリーダーで読み取った。
Ｄ１．３ｈＩｇＧ１（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２１２９－２１３６に記載）を陰性対照として使用し、ＲＥＡ１７３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＴＳ８．２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．ＴＣＲ１７３０）を比較抗体として使用した。
組換えＪＲＴ３－ＴＣＲ細胞を用いた抗体実験
抗体結合、ＴＣＲ下方制御及びＣＤ６９上方制御実験で使用される組換えＪＲＴ３－ＴＣＲ細胞は、以前に説明されている（Ｍｅｌａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９（１２）：１３５２－１３６５及びＷｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５１（５）：８１３－８２５．ｅ４を参照）。
抗体結合実験のために、１００，０００の非形質導入ＪＲＴ３対照またはＪＲＴ３－ＴＣＲ細胞のいずれかの一次染色をＰＢＳ５％ＦＣＳ中で３０分間４℃にて、量が示されていない場合は標準１．０μｇ／ｍｌ、または各リード抗体の図６で０．０８、０．４、２もしくは１０μｇ／ｍｌなど示されている量のいずれかで実施した。次に、Ａ６４７抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して二次染色を行った。更に、ＢＶ４２１抗ＣＤ３ε（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＰＥ－Ｃｙ７ＩＭＭＵ５１０抗γδＴＣＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）染色を指示どおり行った。次に細胞をＰＢＳ５％ＦＡＣＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ３Ｌでフロー分析を実施した。
ＴＣＲ下方制御／ＣＤ６９上方制御の実験では、各ウェルに２０μｇ／ｍｌの二次抗体、具体的には抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ヒトＤ１．３及びＶγ４抗体の場合）または抗マウスＩｇＧ（マウス抗ＣＤ３ｅまたは抗ＰａｎＴＣＲｇｄの場合）のいずれかを添加して、９６フラットウェルプレートを最初にプレコーティングし、その後３７℃で２時間インキュベートした。示されている試験抗体は、最初に０．０１、０．１、１及び１０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。次に、各濃度５０μｌをプレコーティングしたプレートのウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートした。次に、未結合抗体をＰＢＳで２回洗浄した後、飽和ＰＢＳ５％ＦＣＳを３７℃にて１時間かけて添加した。次に、ウェルあたり１００，０００の細胞を４００ｇの回転で蒔いた。次に、細胞を３７℃で５時間インキュベートし、５％ＣＯ２を加え、染色のために９６ウェル丸底プレートに移した。使用した染色抗体には、１：４００に希釈したＢＶ４２１抗ＣＤ３ε（クローンＯＫＴ－３Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、１：２００に希釈したＰＥ－Ｃｙ７抗γδＴＣＲ（クローンＩＭＭＵ５１０Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及び１：２００に希釈したＡ６４７抗ＣＤ６９（クローンＦＮ５０Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が含まれた。すべての染色は、ＰＢＳの５％ＦＣＳ中で４℃にて３０分間行われた。
初代細胞（ＰＢＭＣ）を用いた抗体実験
２４ウェルプレートは、最初に各ウェルに２０μｇ／ｍｌ（ウェルあたり２５０μｌ）の抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加することにより予めコーティングしてから、３７℃で２時間インキュベートした。結合していない二次抗体をＰＢＳで２回洗浄し、アイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗Ｖγ４（クローンＧ４＿１２）は、最初に０．１、１及び１０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。次いで、各濃度の２５０μｌを予めコーティングしたプレートのウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートした。次いで、結合していない抗体をＰＢＳで２回洗浄した後、飽和ＰＢＳ５％ＦＣＳを３７℃で１時間かけて加えた。完全培地（５％の熱不活化ヒトＡＢ血清［ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］，ピルビン酸ナトリウム［１ｍＭ］及びペニシリン／ストレプトマイシン［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を補充したＲＰＭＩ）に１０６細胞／ｍｌの割合で再懸濁させた５００，０００のＰＢＭＣを、その後、各ウェルに加えた。次いで、細胞を３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。ＩＬ－２またはＩＬ－２＋ＩＬ－１５（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度）を２４時間後に添加し、ＩＬ－２またはＩＬ－２＋ＩＬ－１５を補充した新鮮な完全培地を２～３日ごとに加えた。培養の７日目と１４日目に、染色のために細胞を９６ウェル丸底プレートに移した。使用した染色抗体には、１μｇ／ｍｌに希釈したビオチン抗ＴＣＲＶγ２／３／４（クローン２３Ｄ１２）、１：１００に希釈したＰＥストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、１：４００に希釈したＢＶ４２１抗ＣＤ３ε（クローンＯＫＴ－３ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、１：２００に希釈したＰＥ－Ｃｙ７抗ＴＣＲγδ（クローンＩＭＭＵ５１０ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＦＩＴＣ抗Ｖδ２（クローンＢ６ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び１μｇ／ｍｌに希釈したＡ６４７抗Ｖγ４（クローンＧ４＿１８）が含まれていた。すべての染色は、ＰＢＳの５％ＦＣＳ中で４℃にて３０分間行われた。
ＭＳ系エピトープマッピング
ＣｏｖａｌＸ「超高速立体配座／線状エピトープマッピング」方法論が採用された。まず、両方のタンパク質抗原Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）及び抗体Ｇ４＿３（１１３９＿Ｐ０１＿Ａ０４）を、高質量ＭＡＬＤＩを使用してタンパク質の完全性及び凝集レベルについて分析した。Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／Ｇ４＿３複合体の結合エピトープを高分解能で測定するために、複合体を重水素化架橋剤とインキュベートし、トリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンを使用した多酵素タンパク質分解に供した。架橋ペプチドを濃縮した後、試料を高分解能質量分析装置（ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ）で分析し、生成されたデータをＸＱｕｅｓｔ及びＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して分析した。
γδＴ細胞結合アッセイ
抗体のγδＴ細胞への結合は、固定濃度の精製抗体を２５００００のγδＴ細胞とインキュベートすることによって試験できる。このインキュベーションは、Ｆｃ受容体を介した抗体の非特異的結合を防ぐためにｈｕＦｃ断片またはＩｇを添加するなどの遮断条件下で実施できる。検出は、ヒトＩｇＧ１に対する二次蛍光色素結合型抗体の添加によって実施できる。陰性対照について、細胞は、ａ）アイソタイプ抗体のみ（組換えヒトＩｇＧ）、ｂ）蛍光色素結合型抗ヒトＩｇＧ抗体のみ、及びｃ）ａ）及びｂ）の組み合わせで調製できる。完全に染色されていない細胞の対照ウェルも調製し、分析できる。陽性対照として、精製されたマウスモノクローナルＩｇＧ２抗ヒトＣＤ３抗体を２つの異なる濃度で使用し、蛍光色素結合型ヤギ抗マウス二次抗体で染色することができる。低濃度の陽性対照のＦＩＴＣチャネルにおける平均蛍光強度が最高濃度の陰性対照の少なくとも１０倍であった場合、アッセイは受け入れることができる。
ＳＰＲ分析
アミン大容量チップを備えたＭＡＳＳ－２機器（両方ともＳｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）を使用して、ＳＰＲ分析を実行できる。１５ｎＭのＩｇＧは、タンパク質Ｇを介してアミン大容量チップ（ＴＳ８．２で１００ｎＭ）に捕捉される。以下のパラメータ、１８０秒の会合、６００秒の解離、流量３０μＬ／分、泳動用緩衝液ＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を使用して、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）抗原は２０００ｎＭ～１５．６２５ｎＭの１：２希釈系列で細胞上を流れ得る。実験はすべて室温にてＭＡＳＳ－２機器で実施した。定常状態のフィッティングは、ソフトウェアＳｉｅｒｒａＡｎａｌｙｚｅｒ３．２を使用したＬａｎｇｍｕｉｒ１：１結合に従って決定できる。
γδＴＣＲ下方制御及び脱顆粒アッセイ
試験抗体を負荷したまたは負荷していないＴＨＰ－１（ＴＩＢ－２０２（商標）、ＡＴＣＣ）標的細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ２９２７）で標識し、ＣＤ１０７ａ抗体（抗ヒトＣＤ１０７ａＢＶ４２１（クローンＨ４Ａ３）ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５６２６２３）の存在下でγδＴ細胞と２：１の比でインキュベートすることができる。２時間のインキュベーション後、フローサイトメトリーを使用して、γδＴ細胞でのγδＴＣＲの表面発現（ＴＣＲ下方制御を測定するため）及びＣＤ１０７ａの発現（脱顆粒を測定するため）を評価できる。
死滅アッセイ
ガンマデルタＴ細胞媒介性死滅活性及びγδＴ細胞の死滅活性に対する試験抗体の効果は、フローサイトメトリーによって入手できる。γδＴ細胞とＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃ２９２７）で標識したＴＨＰ－１細胞を２０：１の比で４時間ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養した後（抗体を負荷してもしなくても）、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５２０ ６５－０８６７－１４）で染色して標的ＴＨＰ－１細胞の生死を区別し得る。試料の取得中に、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ陽性で標的細胞をゲーティングし、ＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅの取り込みに基づいて細胞死を試験することができる。ＣＭＴＭＲ及びｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０二重陽性細胞は、死標的細胞として認識され得る。γδＴ細胞の死滅活性は、死標的細胞の割合として提示される。
実施例２．抗原の設計
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、ＣＤＲ３ポリクローナル性を備えたポリクローナルである。作製された抗体がＣＤＲ３配列に対して選択される状況を回避するために（ＣＤＲ３配列はＴＣＲクローンごとに異なるため）、抗原設計には異なる形式で一貫したＣＤＲ３を維持することが含まれていた。この設計は、生殖細胞系にコードされ、したがってすべてのクローンで同じである可変ドメイン内の配列を認識する抗体を作製し、γδＴ細胞のより広いサブセットを認識する抗体を提供することを目的とした。
抗原調製プロセスの別の重要な態様は、タンパク質としての発現に適した抗原を設計することである。γδＴＣＲは、鎖間及び鎖内にジスルフィド結合を備えたヘテロ二量体を含有する複雑なタンパク質である。ロイシンジッパー（ＬＺ）形式及びＦｃ形式を使用して、ファージディスプレイの選択で使用する可溶性ＴＣＲ抗原を作製した。ＬＺ型及びＦｃ型はどちらも良好に発現し、ＴＣＲ（特にヘテロ二量体ＴＣＲ、例えばＶδ１Ｖγ４）を正常に表示した。
γδＴＣＲの公開データベースエントリからのＣＤＲ３配列は、タンパク質と同様に発現することがわかった（ＲＳＣＢタンパク質データバンクエントリ：４ＭＮＨ）。したがって、これは抗原調製のために選択された。
ガンマ可変４鎖を含有する抗原は、ヘテロ二量体としてＬＺ型で（すなわち、異なるデルタ可変鎖と組み合わせて－例えば、ＤＶ１－ＧＶ４、デルタ可変１鎖及びガンマ可変４鎖からなるヘテロ二量体［「Ｌ１」と称される］ならびにＤＶ２－ＧＶ４、デルタ可変２鎖及びガンマ可変４鎖からなるヘテロ二量体［「Ｌ４」と称される］）、ならびにヘテロ二量体またはホモ二量体としてのＦｃ型（すなわち、別のガンマ可変４鎖との組み合わせ－ＧＶ４－ＧＶ４、２つのガンマ可変４鎖からなるホモ二量体［「Ｆｃ４／４」と称される］）で発現された。抗原のすべてのガンマ可変４鎖は４ＭＮＨ ＣＤＲ３を含んでいた。同様の形式を使用する別の一連のγδＴＣＲ抗原は、異なるガンマ可変鎖（ガンマ可変２及びガンマ可変８など）を含むように設計され、非特異的またはオフターゲット結合を持つ抗体（例えば、ＤＶ１－ＧＶ２、デルタ可変１鎖及びガンマ可変２鎖からなるヘテロ二量体［「Ｌ２」と称される］またはＤＶ１－ＧＶ８、デルタ可変１鎖及びガンマ可変８鎖からからなるヘテロ二量体［「Ｌ３」と称される］）を選択解除するために使用された。これらの抗原はまた、４ＭＮＨ ＣＤＲ３を含むように設計され、ＣＤＲ３領域に結合する抗体も確実に選択解除された。
実施例３．ファージディスプレイ
ファージディスプレイ選択は、過程１及び過程２でヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲ型のいずれかを使用してヒトｓｃＦｖのライブラリに対して実行され、両方の過程でヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲを選択解除した。または、過程１は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃを選択解除したホモ二量体Ｆｃ融合ＴＣＲを使用して実行され、続いてヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲを選択解除したヘテロ二量体ＬＺＴＣＲで過程２が実行された（表１を参照）。
Figure 2023514437000011
選択は、１００ｎＭのビオチン化タンパク質を使用して溶液相で行った。選択解除は、１μＭの非ビオチン化タンパク質を使用して行った。
実施例４．抗体の選択
実施例３で得られたヒットは、（当技術分野で既知の標準的な方法を使用して）配列決定された。１３０の固有なクローンが同定され、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３の固有な組み合わせを示した。これら１３０の固有のクローンのうち、１２９は固有のＶＨＣＤＲ３を示し、１１６は固有のＶＬＣＤＲ３を示した。
固有なクローンを再整列させ、特異性をＥＬＩＳＡ（ＤＥＬＦＩＡ）で分析した。ＴＲＧＶ４に結合するがＴＲＧＶ２またはＴＲＧＶ８には結合しない４２の固有なヒトｓｃＦｖバインダーのパネルが、選択されたものから同定された。
今後のクローンの選択を補助するために、選択したバインダーの親和性ランキングが含まれていた。多数のバインダーはナノモル範囲の親和性を示し、２５～１００ｎＭのビオチン化抗原（Ｌ１）と反応した。少数のバインダーは５ｎＭの抗原との強い反応を示し、１桁のナノモル親和性の可能性を示した。いくつかのバインダーは１００ｎＭの抗原との反応を示さず、マイクロモル範囲の親和性を示した。
ＩｇＧ変換に進むクローンを選択するために、できるだけ多くの生殖細胞系列及びできるだけ多くの異なるＣＤＲ３を含めることが目的であった。更に、グリコシル化、インテグリン結合部位、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８結合部位、対になっていないシステインなどの配列傾向は避けた。更に、様々な親和性が含まれた。ＩｇＧに変換するために選択されたクローンを図１に示す。ＥＬＩＳＡ結合の結果（蛍光単位（ＦＵ）の値）を図２Ａに示す。結果は、２３の抗体すべてが、パートナーのデルタ鎖に関係なく、望ましいガンマ４鎖特異的プロファイルを示すことを示している。同じデータが図２Ｂにも示され、更に、各クローンのヒトＶγ４鎖対ヒトＶγ２鎖への結合の倍数変化の増加が示されている。ヒトＶγ４鎖対ヒトＶγ２鎖への結合の倍数変化の増加は、８０倍（クローンＧ４＿２６）～９８３８７倍に増加（クローンＧ４＿１８）の範囲だった。
抗体結合実験は、組換えＪｕｒｋａｔ（ＪＲＴ３－ｈｕ１７）細胞を使用して実施された。ＥＬＩＳＡデータとフローサイトメトリーデータの結果の比較を図３Ａに示す。Ｄｅｌｆｉａ ＥＬＩＳＡを介してＤＶ１－ＧＶ４抗原（Ｙ軸）とＪＲＴ３－ｈｕ１７細胞（Ｘ軸）の両方に結合することが確認された抗体クローンを、更なる研究のために選択した。
実施例５．Ｖγ４抗体結合の研究
異なるＣＤＲ３配列（ｈｕ１７対ｈｕ２０、両方ともＶγ４Ｖδ１）またはデルタ鎖（ｈｕ２０γ／ｈｕＰＢδ、Ｖγ４Ｖδ２；ＬＥＳ、Ｖγ４Ｖδ５）を有するＶγ４ＴＣＲを染色するための実施例４で選択された抗体の能力を研究した。結果を図４Ａに示し、試験したすべての抗体は、Ｄ１．３アイソタイプ対照と比較して、実験で使用した１つ以上のＶγ４ＴＣＲへの結合が大幅に増加していることを示す。特に、５つの例示的な抗体（Ｇ４＿３、Ｇ４＿１２、Ｇ４＿１６、Ｇ４＿１８及びＧ４＿２７）はこの実験で発現したすべてのＶγ４ＴＣＲに結合し、ＣＤＲ３配列またはパートナーのデルタ鎖に関係なく、Ｄ１．３アイソタイプ対照より著しく増強された結合シグナルを示した。実例として、この実験における２つの抗体のフローデータの例を図４Ｂに示し、Ｇ４＿４結合（ｈｕ１７とＬＥＳの両方で陽性に染色されるが、ｈｕ２０［ｈｕ１７と比較した異なるＣＤＲ３配列］及びｈｕ２０ｇ／ｈｕＰＢｄ［Ｖγ４Ｖδ２］の両方に対する染色は低減される）と比較したＧ４＿３結合（すべてのＶγ４ＴＣＲに対して陽性の染色）の差異を説明する。
実施例６．キメラｈｕ１７ＴＣＲを使用したエピトープマッピング
ｈｕ１７は、ＢＴＮＬ３＋８反応性ヒト大腸上皮内リンパ球からシングルセルＰＣＲにより対になったＣＤＲ３配列をクローン化したＶγ４／Ｖδ１ ＴＣＲである（Ｍｅｌａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１３５２－１３６５に記載）。図５Ａに要約されているように、異なるキメラｈｕ１７ＴＣＲ構築物を調製した。これらの構築物はｈｕ１７に由来し、すべてＭｅｌａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１３５２－１３６５及びＷｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５１：８１３－８２５に記載されている（どちらも参照により本明細書に組み込まれる）。
次に、抗体結合を、ＪＲＴ３細胞で発現されたキメラｈｕ１７ＴＣＲに対するフローサイトメトリーによって研究した。示されたキメラＴＣＲ構築物に対する各抗体の反応性をまとめた表を図５Ｂに示す。結果は、ＪＲＴ３細胞で発現した個々のＴＣＲに対する示された個々の抗体の相対的な結合特異性を強調している。Ｖγ２配列を含有するｈｕ１７ＴＣＲ構築物をＨＶ４領域に使用した場合、染色または染色の低下が観察されなかったため、抗体Ｇ４＿３、Ｇ４＿１２、Ｇ４＿１６、Ｇ４＿１８及びＧ４＿２７はすべてＨＶ４領域内またはその周辺に特異的に結合することが示された。
この実験で観察された異なる結合シグナルを説明するためのエピトープマッピングのフローデータの例を図５Ｃに示す。この例では及びこのエピトープマッピングアプローチの例として、様々な組換えキメラＴＣＲへのＧ４＿１２結合が示されている。初め、Ｇ４＿１２は、開始のｈｕ１７ＴＣＲへの強い結合を示す（左端のパネル）。ＣＤＲ１＋２配列がインフレームでＶγ２と同等のＣＤＲと交換される（中央の左パネル）場合またはｈｕ１７がＶγ２配列ＤＧ＞ＹＡにＨＶ４改変された場合（中央右パネル）、ｈｕ１７に対しても強力な結合が観察される。しかしながら、Ｇ４＿１２による結合における顕著に低下は、代替のＶγ４からＶγ２へのアミノ酸置換（ＤＧＫＭ＞ＹＡＮＬ、中央のパネル）またはＫＭ＞ＮＬ（右端のパネル）でそれぞれ観察された。したがって、この場合、Ｇ４＿１２によって認識されるエピトープは、ＨＶ４領域（配列番号１のアミノ酸６７～８２
Figure 2023514437000012
）に位置し、Ｖγ２ ＨＶ４領域のこの位置で見られる下線が引かれたＫ及びＭ残基を同等の残基に変更することによって大きな影響を受ける。
実施例７．染色及び機能アッセイにおける研究された抗体の滴定
ＪＲＴ３－ｈｕ１７細胞（０．０８～１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度、５倍希釈工程）へのフローサイトメトリーによる染色及び分析のための研究された抗体の滴定結果を図６Ａに示す。非形質導入ＪＲＴ３細胞（ＴＣＲなし）を陰性対照として使用した。結果は、すべての抗体がＶγ４ＴＣＲを発現するＪＲＴ３細胞に結合できたことを示している。
次に、抗ＣＤ３ε結合または抗汎ＴＣＲγδ抗体によって付与されるターンオーバーに対する滴定抗体によるＴＣＲターンオーバー及びＣＤ６９上方制御を研究することにより、機能アッセイを実施した。図６Ｂ及び図６Ｃに５つの抗体の結果を示し、元のコホート内の抗体の幅広い選択の結果を表２にまとめている。
Figure 2023514437000013
表２に記載されているすべての抗体は、γδＴＣＲのＶγ４鎖に結合することが示されている。しかし、表に示されているように、これらの抗体のいくつかは、Ｖγ４ＴＣＲの下方制御及び／またはＣＤ６９発現の増加を介して測定されるようにＶγ４ＴＣＲを活性化することができ（「＋」、「＋＋」または「＋＋＋」として示され、「＋＋＋」は活性化の最高の相対レベルを意味する）、一方で他の抗体はＶγ４ＴＣＲを活性化する明らかな能力を示さない（「－」として示される）。
実施例８．ＭＳに基づくエピトープマッピング
抗原／抗体複合体のエピトープを高分解能で決定するために、タンパク質複合体を重水素化架橋剤とインキュベートし、多酵素切断を行った。架橋ペプチドを濃縮した後、試料を高分解能質量分析装置（ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ）で分析し、作製されたデータをＸＱｕｅｓｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）及びＳｔａｖｒｏｘ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．６）ソフトウェアを使用して分析した。
タンパク質複合体Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１１３９＿Ｐ０１＿Ａ０４を重水素化ｄ０ｄ１２でトリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンタンパク質分解後、ｎＬＣオービトラップ型ＭＳ／ＭＳ分析により、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）と抗体１１３９＿Ｐ０１＿Ａ０４（Ｇ４＿３）の間に１１の架橋ペプチドが検出された。エピトープマッピングの結果を表３に示す。
Figure 2023514437000014
このエピトープマッピングデータは上述の実験と相関しており、この抗体がγ４鎖のＨＶ４領域内に結合することを示している。
実施例９．初代Ｖγ４陽性細胞の抗Ｖγ４抗体標的化及び調節
健康な患者及び病気の患者の試料に由来する細胞を含む、皮膚、血液及び腸に由来する初代Ｖγ４＋細胞を標的とする抗Ｖγ４抗体を実証するために、更なる実験が行われた。
皮膚由来の初代Ｖγ４＋細胞への結合
最初に、２人の個々のドナーの皮膚から増殖させた初代Ｖγ４＋Ｔ細胞への結合について、抗Ｖγ４抗体を試験した。皮膚試料は、皮下脂肪を除去し、複数のパンチを作成するために使用される３ｍｍの生検パンチによって調製した。パンチはカーボンマトリックスグリッド上に配置され、Ｇ－ＲＥＸ６（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）のウェルに置かれた。各ウェルは、ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＴＳ免疫血清置換（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＬ－２及びＩＬ－１５を含有する完全分離培地で満たした。培養の最初の７日間は、アンホテリシンＢ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する完全分離培地を使用した。（「＋ＡＭＰ」）。上方の培地を穏やかに吸引し、２Ｘ完全分離培地（ＡＭＰなし）と交換することにより、培地を７日ごとに交換して、プレートまたはバイオリアクターの底部にある細胞を乱さないようにした。３週間を超えて培養した後、収集前に、得られた放出細胞は次に新しい組織培養容器及び新鮮な培地（例えばＡＩＭ－Ｖ培地またはＴｅｘＭＡＸ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ））に加えて組換えＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１で培養した。その後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉから提供されるものなどのαβＴ細胞枯渇キット及び関連するプロトコルの助けを借りて、培養物内に存在するαβＴ細胞も除去した。詳細については、国際特許第ＷＯ２０２０／０９５０５９号を参照のこと。
単離後、γδＴ細胞を最初にＦｃブロックの存在下で４℃にて２０分間生存色素で染色した。次にγδＴ細胞を固定濃度の例示の抗Ｖγ４抗体（０．０４６～１００μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ１抗呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗体）と４℃にて３０分間インキュベートした。ヒトＩｇＧ１（ＩＳ１１－１２Ｅ４．２３．２０）に対する二次蛍光色素複合化抗体の添加によって検出を行った。次に細胞を固定し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーターで取得した。細胞を、単一の生きたＩｇＧ１（Ｖγ４）＋としてゲーティングした。示されているデータは、Ｖγ４＋細胞に結合して検出された二次検出抗体の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）である。
結果を図７Ａに示す。これらのデータは、試験されたすべての抗Ｖγ４抗体が用量依存的に初代皮膚由来Ｖγ４＋Ｔ細胞に結合できることを確認した。アイソタイプ対照では結合は観察されなかった。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する初代Ｖγ４＋への結合
簡単に説明すると、ヒトＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ、製品コードＣＣ－２７０２）は、最初にＦｃブロックの存在下で４℃にて２０分間、生存率色素で染色した。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌの抗Ｖγ４抗体またはアイソタイプ対照（ＲＳＶ）で４℃にて３０分間インキュベートした後、洗浄し、抗Ｖδ１（ＲＥＡ１７３）、抗Ｖδ２（ＲＥＡ７７１）、抗γδ（ＲＥＡ５９１）及び抗ヒトＩｇＧ１（ＩＳ１１－１２Ｅ４．２３．２０）で４℃にて２０分間細胞外染色した。その後、細胞を固定し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーターで取得した。細胞を、単一の生きたγδ＋Ｖδ２－ＩｇＧ１（Ｖγ４）＋としてゲーティングした。
結果を図７Ｂに示す。示されているデータは、複合化二次抗ヒトＩｇＧ１抗体によって結合された個々の抗体を使用して検出されたγδ＋Ｖδ２－細胞のＶγ４＋細胞の割合である。これらのデータは、初代血液由来の抗Ｖγ４＋Ｔ細胞に結合する、実質的にすべての抗Ｖγ４抗体の能力を強調している。抗体Ｇ４＿２３、Ｇ４＿３、Ｇ４＿１２、Ｇ４＿１８またＧ４＿２０を使用して、最も強いシグナルを検出した。
大腸癌（ＣＲＣ）患者から得られた腸管由来上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の初代Ｖγ４＋細胞への結合
この実験では、ヒトＣＲＣ腫瘍生検は新鮮な状態で出荷され、受領時に処理された。生検は、約２ｍｍ２の大きさの断片に切断され、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、Ｋｕｐｐｅｒ及びＣｌａｒｋｅ（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２６，１０５９－１０７０）が最初に記載した方法の応用を使用して得た。具体的には、最大４つの２ｍｍ２の生検を９ｍｍｘ９ｍｍｘ１．５ｍｍのＣｅｌｌｆｏａｍマトリックスに配置し、２４ウェルプレートのウェルごとに１つのマトリックスを配置した。次に、４％ヒト血漿、β－メルカプトエタノール（５０μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、メトロニダゾール（１μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１Ｘ）及びＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した２ｍｌのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で生検を行った。１ｍｌの培地を３日ごとに吸引し、２×濃縮ＩＬ－１５を含有する１ｍｌの完全培地と交換した。１０日後にＴＩＬを回収し、７０μＭのナイロンセル濾過器に通し、３００ｘｇで５分間遠心分離し、表現型を決定するために完全培地に再懸濁させた。ＴＩＬは、最初にＦｃブロックの存在下で４℃にて２０分間、生／死生存率色素で染色した。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌの抗Ｖγ４抗体またはアイソタイプ対照（ＲＳＶ）で４℃にて３０分間インキュベートした後、洗浄し、抗Ｖδ１（ＲＥＡ１７３）、抗γδ（ＲＥＡ５９１）及び抗ヒトＩｇＧ１（ＩＳ１１－１２Ｅ４．２３．２０）で４℃にて２０分間細胞外染色した。その後、細胞を固定し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーターで取得した。細胞を、単一の生きたγδ＋、ＩｇＧ１＋（Ｖγ４）＋としてゲーティングした。
結果を図７Ｃに示す。示されているデータは、複合化二次抗ヒトＩｇＧ１抗体を介して検出される初代腸由来Ｖγ４＋細胞への抗Ｖγ４抗体Ｇ４＿３、Ｇ４＿１２及びＧ４＿１８の結合を示すＦＡＣＳプロットである。データは、ＣＲＣ腫瘍組織から得られたＶγ４＋細胞に結合する本発明の抗体の能力を示している。
抗Ｖγ４抗体によって付与されたヒト腸由来γδＴ細胞の検出及びＴＣＲ下方制御
抗Ｖγ４抗体によって付与されたヒト腸由来γδＴ細胞の調節を研究するために、更なる実験が行われた。これらの実験では、ＣＲＣ患者の結腸からの正常な隣接組織（ＮＡＴ）生検が新鮮な状態で出荷され、受領時に処理されて単一細胞懸濁液を得た。具体的には、組織を約２ｍｍ２の大きさに細かく刻み、関連細胞表面分子の切断を防ぐために０．２Ｘ濃度で使用された酵素Ｒ以外の製造元が推奨する濃度のＭｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍解離キットの酵素を含む４．７ｍｌのＲＰＭＩと共に最大１ｇの組織をＭｉｌｔｅｎｙｉＣ管に入れた。Ｃ管は、加熱ブロックが取り付けられたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒに配置された。軟性腫瘍の解離のためにプログラム３７Ｃ＿ｈ＿ＴＤＫ＿１を選択した。１時間後、消化物を７０μＭのフィルターを通して濾過し、４％のヒト血漿を含有する完全ＩＭＤＭを加えて酵素活性をクエンチした。次に、細胞を２回洗浄し、計数のために完全ＩＭＤＭに再懸濁させた。この時点で、細胞を抗Ｖγ４抗体による刺激のために蒔くか、または表現型を決定するために使用した。
一連の実験では、抗Ｖγ４抗体で刺激する前の腸消化物中のＶγ４＋γδＴ細胞の表現型を測定した。簡単に説明すると、細胞は、Ｆｃブロックの存在下で４℃にて２０分間、生／死生存率色素で染色した。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌのＧ４＿１８クローンで４℃にて３０分間インキュベートした後、洗浄し、抗Ｖδ１（ＲＥＡ１７３）、抗γδ（ＲＥＡ５９１）、抗ＣＤ６９（ＲＥＡ８２４）、抗ＣＤ１０３（Ｂｅｒ－Ａｃｔ８）及び抗ヒトＩｇＧ１（ＩＳ１１－１２Ｅ４．２３．２０）で４℃にて２０分間細胞外染色した。その後、細胞を固定し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーターで取得した。図７Ｄに示すように、生きている単一細胞の１．４％はＶδ１＋であった。これらのうち、４４．２％がＶγ４と対になっており、腸からのγδＴ細胞について予想されるように、これらはすべて腸組織残留のマーカーを表示した（ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋）。本明細書に記載の抗体、この場合は例示の抗体Ｇ４＿１８は、ヒト腸組織から分離したＶγ４＋γδＴ細胞を特異的に検出するために使用できることを、これらの結果は確認する。
次の一連の実験では、抗Ｖγ４抗体で細胞を刺激することの影響を測定した。２ｘ１０６つの細胞を４８ウェルプレートにウェルごとに蒔いて、２ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－１５の存在下でＧ４＿１２、Ｇ４＿１８またはＲＳＶＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で刺激した。酵素消化によって単離された上皮内リンパ球（ＩＥＬ）は、ｍＡｂ刺激の２４時間後にフローサイトメトリーによって分析した。２４時間の刺激後、細胞を、Ｆｃブロックの存在下で４℃にて２０分間生存率色素で染色した。次に、細胞を細胞外でγδＴＣＲ（ＲＥＡ５９１）について染色し、固定し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーターで取得した。生きている単一細胞をγδＴＣＲ＋としてゲーティングした。図７Ｅは、ＲＳＶアイソタイプコントロールと比較して、Ｇ４＿１２またＧ４＿１８クローンで２４時間刺激した後に付与されたγδＴＣＲ下方制御を代表的なＦＡＣＳプロットと共に示す。両方の抗Ｖγ４抗体、Ｇ４＿１２及びＧ４＿１８は、ＲＳＶアイソタイプ対照と比較してγδＴＣＲの下方制御を誘発し、最大の下方制御はＧ４＿１２で観察された。
実施例１０．本発明の例示的な抗Ｖγ４抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、ヒトＶγ４への結合親和性（ＫＤ）を測定する更なる実験
更に、ｓｃＦｖバインダーに関して実施例４に記載されたＳＰＲ結合実験（実施例１に記載された方法）に加えて、クローンを完全なＩｇＧ１モノクローナル抗体として発現させた場合のヒトＶγ４鎖に対する選択例クローンの結合親和性を測定するために追加の実験が行われた。
手短に言えば、標的（すなわち、γδＴＣＲのヒトＶγ４鎖）に対する抗体の結合親和性は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＳＰＲ分析によって確立された。抗原（Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４））は、カルボキシメチルデキストランチップ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に１０ｕｇ／ｍｌで結合され、その結果、ベースラインからそれぞれ約７５０ｕＲＩＵ増加した。抗体は、５００ｎＭ～３１．２５ｎＭの１：２希釈系で、以下のパラメータ、１８０秒の会合、３００秒の解離、２５μＬ／分の流速、泳動緩衝液ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で細胞上を流れた。すべての実験は室温で行われ、試料はチップ上を流れる前に４℃に保たれた。定常状態のフィッティングは、ソフトウェアＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＬａｎｇｍｕｉｒ１：１結合に従って決定した。
結果を表４に示し、抗体あたり２回の実験の平均を表す（特に明記されている場合を除く）。
Figure 2023514437000015
予想どおり、結合親和性の範囲が決定され、したがって、必要な結合親和性に応じて、特定の状況に対して特定の抗体を選択することが可能になった。特に、示されているように、結合親和性は約２６０ｎＭ～２．８ｎＭの範囲だった。これは、実施例４で説明したｓｃＦｖ実験と一致していた。
実施例１１．初代ヒトＶγ４Ｔ細胞の数を増やすためのＶγ４特異的抗体の使用
ＪＲＴ３－ｈｕ１７細胞に対して最も高い刺激活性を示す抗体（クローンＧ４＿１２、図５のＢ、Ｃ）は、初代Ｖγ４＋Ｔ細胞を刺激する能力について更に試験した。アイソタイプ対照と比較して、Ｇ４＿１２によるプレート結合刺激後のＰＢＭＣ培地におけるＶγ４Ｔ細胞の割合の増加を、Ａ６４７複合化抗Ｖγ４クローンＧ４＿１８を含む抗体のパネルを使用してフローサイトメトリーで分析し、図８に示す。７日目と１４日目のＧ４＿１２抗体の存在下でのＶｇ４陽性細胞の割合は、アイソタイプ対照が存在する培地よりも大きかった。
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Claims (30)

  1. γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のガンマ可変４（Ｖγ４）鎖に特異的に結合しかつγδＴＣＲのガンマ可変２（Ｖγ２）鎖には結合しない抗体またはその断片を、Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  2. 前記γδＴＣＲのＶγ４鎖がヒトＶγ４であり、前記γδＴＣＲのＶγ２鎖がヒトＶγ２である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内の１つ以上のアミノ酸残基を含む前記γδＴＣＲのＶγ４鎖のエピトープに結合する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基７１、７３、７５、７６、７９のうちの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記エピトープは、配列番号１のＫ７６及び／またはＭ８０を含むかまたはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記エピトープは、γδＴ細胞の活性化エピトープである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記活性化エピトープの結合は、（ｉ）前記γδＴＣＲを下方制御する、（ｉｉ）前記γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する、（ｉｉｉ）γδＴ細胞を介した死滅を活性化する、及び／または（ｉｖ）Ｖγ４鎖を介した細胞シグナル伝達を活性化または増加させる、請求項６に記載の方法。
  8. 配列番号２～４７のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０及び／または配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
    配列番号４８～７０及び（図１の）配列Ａ１～Ａ２３のいずれか１つ、好ましくは配列番号５６及び／または配列Ａ９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または、
    配列番号７１～１１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号７９及び／または配列番号１０２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む、抗ガンマ可変４（Ｖγ４）抗体またはその断片を、
    Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  9. 前記抗体またはその断片は、配列番号１０、４、１４、１５、１７、１９または２３など配列番号２～２４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記抗体またはその断片は、配列番号３３、２７、３７、３８、４０、４２または４６など配列番号２５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、請求項８または請求項９に記載の方法。
  11. 配列番号１１７～１６２または２６１～２８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ガンマ可変４（Ｖγ４）抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  12. （ａ）配列番号７９を有するＨＣＤＲ１、配列番号５６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２５を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０２を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ９を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４８または２６９を含む前記ＶＬ、
    （ｂ）配列番号８６を有するＨＣＤＲ１、配列番号６３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３２を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０９を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１６を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５５または２７６を含む前記ＶＬ、
    （ｃ）配列番号７３を有するＨＣＤＲ１、配列番号５０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１９を含む前記ＶＨと、
    配列番号９６を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ３を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４２または２６３を含む前記ＶＬ、
    （ｄ）配列番号８３を有するＨＣＤＲ１、配列番号６０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２９を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０６を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１３を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５２または２７３を含む前記ＶＬ、
    （ｅ）配列番号８４を有するＨＣＤＲ１、配列番号６１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３０を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０７を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１４を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５３または２７４を含む前記ＶＬ、
    （ｆ）配列番号８８を有するＨＣＤＲ１、配列番号６５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３４を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１１を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１８を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５７または２７８を含む前記ＶＬ、
    （ｇ）配列番号９２を有するＨＣＤＲ１、配列番号６９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３８を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１５を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ２２を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６１または２８２を含む前記ＶＬ、
    （ｈ）配列番号７１を有するＨＣＤＲ１、配列番号４８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１７を含む前記ＶＨと、
    配列番号９４を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４０または２６１を含む前記ＶＬ、
    （ｉ）配列番号７２を有するＨＣＤＲ１、配列番号４９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１１８を含む前記ＶＨと、
    配列番号９５を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ２を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４１または２６２を含む前記ＶＬ、
    （ｊ）配列番号７４を有するＨＣＤＲ１、配列番号５１を有するＨＣＤＲ２及び配列番号５を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２０を含む前記ＶＨと、
    配列番号９７を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ４を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２８を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４３または２６４を含む前記ＶＬ、
    （ｋ）配列番号７５を有するＨＣＤＲ１、配列番号５２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２１を含む前記ＶＨと、
    配列番号９８を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ５を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４４または２６５を含む前記ＶＬ、
    （ｌ）配列番号７６を有するＨＣＤＲ１、配列番号５３を有するＨＣＤＲ２及び配列番号７を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２２を含む前記ＶＨと、
    配列番号９９を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ６を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３０を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４５または２６６を含む前記ＶＬ、
    （ｍ）配列番号７７を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２３を含む前記ＶＨと、
    配列番号１００を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ７を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４６または２６７を含む前記ＶＬ、
    （ｎ）配列番号７８を有するＨＣＤＲ１、配列番号５５を有するＨＣＤＲ２及び配列番号９を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２４を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０１を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ８を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３２を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４７または２６８を含む前記ＶＬ、
    （ｏ）配列番号８０を有するＨＣＤＲ１、配列番号５７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２６を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０３を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１０を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１４９または２７０を含む前記ＶＬ、
    （ｐ）配列番号８１を有するＨＣＤＲ１、配列番号５８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２７を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０４を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１１を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５０または２７１を含む前記ＶＬ、
    （ｑ）配列番号８２を有するＨＣＤＲ１、配列番号５９を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１３を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１２８を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０５を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１２を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３６を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５１または２７２を含む前記ＶＬ、
    （ｒ）配列番号８５を有するＨＣＤＲ１、配列番号６２を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１６を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３１を含む前記ＶＨと、
    配列番号１０８を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１５を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３９を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５４または２７５を含む前記ＶＬ、
    （ｓ）配列番号８７を有するＨＣＤＲ１、配列番号６４を有するＨＣＤＲ２及び配列番号１８を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３３を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１０を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１７を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４１を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５６または２７７を含む前記ＶＬ、
    （ｔ）配列番号８９を有するＨＣＤＲ１、配列番号６６を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２０を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３５を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１２を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ１９を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４３を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５８または２７９を含む前記ＶＬ、
    （ｕ）配列番号９０を有するＨＣＤＲ１、配列番号６７を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２１を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３６を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１３を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ２０を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４４を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１５９または２８０を含む前記ＶＬ、
    （ｖ）配列番号９１を有するＨＣＤＲ１、配列番号６８を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２２を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３７を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１４を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ２１を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４５を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６０または２８１を含む前記ＶＬ、
    及び／または、
    （ｗ）配列番号９３を有するＨＣＤＲ１、配列番号７０を有するＨＣＤＲ２及び配列番号２４を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、任意選択で前記ＶＨは配列番号１３９を含む前記ＶＨと、
    配列番号１１６を有するＬＣＤＲ１、（図１の）配列Ａ２３を有するＬＣＤＲ２及び配列番号４７を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、任意選択で前記ＶＬは配列番号１６２または２８３を含む前記ＶＬ、のうちの１つ以上を含む抗ガンマ可変４（Ｖγ４）抗体またはその断片を、
    Ｖγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  13. 配列番号１６３～１８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ガンマ可変４（Ｖγ４）抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  14. 配列番号２３３～２５５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ガンマ可変４（Ｖγ４）抗体をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  15. 配列番号２８４～３０６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号３０７～３２９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む、抗ガンマ可変４（Ｖγ４）抗体またはその断片をＶγ４Ｔ細胞を含む細胞集団に投与することを含む、Ｖγ４Ｔ細胞を調節するｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  16. 前記抗Ｖγ４抗体またはその断片は、
    （ｉ）ｓｃＦｖまたは完全長抗体、及び／または、
    （ｉｉ）ヒト抗体もしくはその断片である、請求項１～１５のいずれ一項に記載の方法。
  17. 前記調節はＶγ４Ｔ細胞の増殖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記方法は、約７０％を超えるＶγ４Ｔ細胞など約６０％を超えるＶγ４Ｔ細胞を含有する増殖したＶγ４Ｔ細胞集団を提供する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記方法は、前記細胞集団を少なくとも５日間培養することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記方法は、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５の存在下で前記細胞集団を培養することを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記細胞集団は、造血試料またはその画分から得られる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記造血試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）からなる、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記細胞集団は、皮膚、結腸、腸、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、膵臓、子宮、膣または他の皮膚、粘膜もしくは漿膜試料などの非造血組織試料から得られる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記細胞集団は、ヒトまたは非ヒト動物組織から得られる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法により得られるＶγ４Ｔ細胞集団。
  26. 請求項２５に記載の前記Ｖγ４Ｔ細胞集団を含む組成物。
  27. 請求項２５に記載の前記Ｖγ４Ｔ細胞集団を、薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む医薬組成物。
  28. 薬剤として使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. がん、感染症または炎症性疾患の治療に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
  30. 請求項２５に記載の治療上有効な量の前記Ｖγ４Ｔ細胞集団または請求項２７に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象のがん、感染症または炎症性疾患を治療する方法。
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