KR20220145894A - 신규 항체 - Google Patents

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KR20220145894A
KR20220145894A KR1020227033455A KR20227033455A KR20220145894A KR 20220145894 A KR20220145894 A KR 20220145894A KR 1020227033455 A KR1020227033455 A KR 1020227033455A KR 20227033455 A KR20227033455 A KR 20227033455A KR 20220145894 A KR20220145894 A KR 20220145894A
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옥사나 폴리아코바
올리버 누스바우머
아드리안 헤이데이
피에르 반투루트
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감마델타 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

γδ T 세포 수용체(TCR)의 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 감마 가변 2(Vγ2) 사슬에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 단편이 본원에서 제공된다. 상기 항체의 치료 방법 및 기타 용도가 또한 상기 항체를 생산하는 방법과 함께 제공된다.

Description

신규 항체
본 발명은 감마 델타 T 세포의 T 세포 수용체에 대한 항체 및 이의 단편에 관한 것이다.
암에 대한 T 세포 면역치료법에서의 관심 증가는 특히 PD-1, CTLA-4 및 기타 수용체에 의해 발휘되는 억제 경로에 의해 임상적으로 매개된 길항작용에 의해 억제될 때, 암 세포를 인식하고 숙주 보호 기능 잠재력을 매개하는 CD8+ 및 CD4+ 알파 베타(αβ) T 세포 하위세트의 명백한 능력에 초점을 맞추었다. 그러나 αβ T 세포는 이식편 대 숙주 질환을 유발할 수 있는 MHC로 제한되어 있다.
감마 델타 T 세포(γδ T 세포)는 이의 표면 상에 고유한, γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포 하위세트를 나타낸다. 이 TCR은 하나의 감마(γ)와 하나의 델타(δ) 사슬로 구성되며, 각각은 사슬 재배열을 거치지만 αβ T 세포에 비해 제한된 수의 V 유전자를 가지고 있다. Vγ를 암호화하는 주요 TRVG 유전자 절편은 TRGV2, TRGV3, TRGV4, TRGV5, TRGV8, TRGV9 및 비기능적 유전자 TRGV10, TRGV11, TRGVA 및 TRGVB이다. 가장 빈번한 TRDV 유전자 절편은 Vδ1, Vδ2 및 Vδ3에 더하여 Vδ 및 Vα 지정을 모두 갖는 몇몇 V 절편을 암호화한다(Adams et al., 296:30-40 (2015) Cell Immunol.). 특정 γ 및 δ 유형이 하나 이상의 조직 유형에서 배타적이지는 않지만 더 우세하게 세포 상에서 발견되므로, 인간 γδ T 세포는 TCR 사슬에 기반하여 광범위하게 분류될 수 있다. 예를 들어, 대부분의 혈액 잔류 γδ T 세포는 Vδ2 TCR, 일반적으로 Vγ9Vδ2를 발현하는 반면, 이것은 예를 들어 종종 장에서 Vγ4와 쌍을 이루는, 감마 사슬과 쌍을 이루는 Vδ1 TCR을 더 자주 사용하는 피부와 같은 조직 잔류 γδ T 세포에서는 덜 일반적이다.
그러나 현재까지 Vγ4 TCR 및 Vγ2 TCR과 같은 다른 TRGV 패밀리 구성원 간의 높은 상동성으로 인해, Vγ4 TCR만을 표적화할 수 있는 방식은 가능하지 않았다. 따라서 Vγ4 TCR에 특이적으로 결합하거나 이를 조절하는 특이적 항체를 포함하여, Vγ4에 특이적 항체에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, γδ T 세포 수용체(TCR)의 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 감마 가변 2(Vγ2) 사슬에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 이는 동일한 종의 Vγ4 사슬 및 Vγ2에 관한 것임이 이해되어야 한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 모든 측면 및 구현예에 따르면, 종은 호모 사피엔스(인간)이고 따라서 본 발명은 γδ T 세포 수용체(TCR)의 인간 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 인간 감마 가변 2(Vγ2) 사슬에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 예를 들어, 인간 Vγ4 사슬은 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 따른 서열을 가질 수 있고/있거나 인간 Vγ2 사슬은 서열 번호 335에 따른 서열을 가질 수 있다. 다른 종에서, 단리된 항체 또는 이의 단편은 γδ T 세포 수용체(TCR)의 인간 감마 가변 4(Vγ4) 사슬의 종 특이적 오르토로그에 특이적으로 결합하고, γδ TCR의 인간 감마 가변 2(Vγ2) 사슬의 종 특이적 오르토로그에는 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 상응하는 서열을 갖는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 인간 감마 가변 4(Vγ4) 사슬 또는 이의 비-인간 오르토로그에 특이적으로 결합하며 서열 번호 335에 상응하는 서열을 갖는 γδ TCR의 인간 감마 가변 2(Vγ2) 사슬 또는 이의 비인간 오르토로그에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 이러한 맥락에서 오르토로그는 참조 서열에 대해 가장 높은 서열 유사성을 갖는 감마 사슬 서열, 또는 바람직하게는 동일한 기능(예를 들어, 생체내 오르토로그 인지체 리간드와의 상호작용)을 보유하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 마우스에서 Heilig & Tonegave 명명법에 따라 Vγ7로 지정된 단백질은 인간 Vγ4와 기능적으로 가장 밀접하게 관련되어 있다(Barros et al. (2016) Cell, 167:203-218.e17).
이는 이 분야에서 유의한 발전이다. 예를 들어, 인간에서 Vγ4 사슬과 Vγ2 사슬은 매우 상동성(서열 동일성 91%)이며 9개의 아미노산만 상이하다. 이들 9개 변경 중 3개는 CDR1 및 CDR2에 걸쳐 매핑되는 반면, 이러한 9개 변경 중 4개는 프레임워크 영역 3(FR3)의 하위영역-서열 번호 1의 아미노산 67-82에 매핑된다. Vγ4 사슬 및 Vγ2 사슬간 매우 높은 서열 유사성으로 인해, 이전에는 γδ TCR의 인간 Vγ4 사슬과 Vγ2 사슬을 특이적으로 구별할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 개발하는 것이 불가능할 것이라고 생각되었다. 놀랍게도 그리고 당분야의 지배적인 견해와는 반대로, 본 발명자들은 본원에 더 상세히 기재된 방법을 사용하여 이러한 항체를 개발할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 Vγ4-함유 γδ TCR을 특이적으로 조절할 수 있는 항체 및 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 γδ TCR의 인간 Vγ4 사슬의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다:
서열 번호 2-47 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 10 및/또는 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3;
서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 56 및/또는 A9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2; 및/또는
서열 번호 71-116 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 79 및/또는 102와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1.
일부 측면에서, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
서열 번호 2-24 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
서열 번호 48-70 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 56과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2); 및/또는
서열 번호 71-93 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 79와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1).
대안적으로 또는 부가적으로, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
서열 번호 25-47 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3);
서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 A9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는
서열 번호 94-116 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 102와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1).
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 117-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 일부 측면에서, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-139 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 125와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변(VH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 140-162, 바람직하게는 서열 번호 148과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변(VL) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 추가로 제공한다:
(a) 서열 번호 79를 갖는 HCDR1, 서열 번호 56을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 10을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 125를 포함하는 VH; 및
서열 번호 102를 갖는 LCDR1, 서열 A9(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 33을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 148을 포함하는 VL;
(b) 서열 번호 86을 갖는 HCDR1, 서열 번호 63을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 17을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 132를 포함하는 VH; 및
서열 번호 109를 갖는 LCDR1, 서열 A16(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 40을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 155를 포함하는 VL;
(c) 서열 번호 73을 갖는 HCDR1, 서열 번호 50을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 4를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 119를 포함하는 VH; 및
서열 번호 96을 갖는 LCDR1, 서열 A3(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 27을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 142를 포함하는 VL;
(d) 서열 번호 83을 갖는 HCDR1, 서열 번호 60을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 14를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 129를 포함하는 VH; 및
서열 번호 106을 갖는 LCDR1, 서열 A13(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 37을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 152를 포함하는 VL;
(e) 서열 번호 84를 갖는 HCDR1, 서열 번호 61을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 15를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 130을 포함하는 VH; 및
서열 번호 107을 갖는 LCDR1, 서열 A14(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 38을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 153을 포함하는 VL;
(f) 서열 번호 88을 갖는 HCDR1, 서열 번호 65를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 19를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 134를 포함하는 VH; 및
서열 번호 111을 갖는 LCDR1, 서열 A18(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 42를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 157을 포함하는 VL;
(g) 서열 번호 92를 갖는 HCDR1, 서열 번호 69를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 23을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 138을 포함하는 VH; 및
서열 번호 115를 갖는 LCDR1, 서열 A22(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 46을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 161을 포함하는 VL;
(h) 서열 번호 71을 갖는 HCDR1, 서열 번호 48을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 2를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 117을 포함하는 VH; 및
서열 번호 94를 갖는 LCDR1, 서열 A1(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 25를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 140을 포함하는 VL;
(i) 서열 번호 72를 갖는 HCDR1, 서열 번호 49를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 3을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 118을 포함하는 VH; 및
서열 번호 95를 갖는 LCDR1, 서열 A2(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 26을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 141을 포함하는 VL;
(j) 서열 번호 74를 갖는 HCDR1, 서열 번호 51을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 5를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 120을 포함하는 VH; 및
서열 번호 97을 갖는 LCDR1, 서열 A4(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 28을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 143을 포함하는 VL;
(k) 서열 번호 75를 갖는 HCDR1, 서열 번호 52를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 6을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 121을 포함하는 VH; 및
서열 번호 98을 갖는 LCDR1, 서열 A5(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 29를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 144를 포함하는 VL;
(l) 서열 번호 76을 갖는 HCDR1, 서열 번호 53을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 7을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 122를 포함하는 VH; 및
서열 번호 99를 갖는 LCDR1, 서열 A6(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 30을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 145를 포함하는 VL;
(m) 서열 번호 77을 갖는 HCDR1, 서열 번호 54를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 8을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 123을 포함하는 VH; 및
서열 번호 100을 갖는 LCDR1, 서열 A7(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 31을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 146을 포함하는 VL;
(n) 서열 번호 78을 갖는 HCDR1, 서열 번호 55를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 9를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 124를 포함하는 VH; 및
서열 번호 101을 갖는 LCDR1, 서열 A8(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 32를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 147을 포함하는 VL;
(o) 서열 번호 80을 갖는 HCDR1, 서열 번호 57을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 11을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 126을 포함하는 VH; 및
서열 번호 103을 갖는 LCDR1, 서열 A10(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 34를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 149를 포함하는 VL;
(p) 서열 번호 81을 갖는 HCDR1, 서열 번호 58을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 12를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 127을 포함하는 VH; 및
서열 번호 104를 갖는 LCDR1, 서열 A11(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 35를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 150을 포함하는 VL;
(q) 서열 번호 82를 갖는 HCDR1, 서열 번호 59를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 13을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 128을 포함하는 VH; 및
서열 번호 105를 갖는 LCDR1, 서열 A12(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 36을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 151을 포함하는 VL;
(r) 서열 번호 85를 갖는 HCDR1, 서열 번호 62를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 16을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 131을 포함하는 VH; 및
서열 번호 108을 갖는 LCDR1, 서열 A15(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 39를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 154를 포함하는 VL;
(s) 서열 번호 87을 갖는 HCDR1, 서열 번호 64를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 18을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 133을 포함하는 VH; 및
서열 번호 110을 갖는 LCDR1, 서열 A17(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 41을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 156을 포함하는 VL;
(t) 서열 번호 89를 갖는 HCDR1, 서열 번호 66을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 20을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 135를 포함하는 VH; 및
서열 번호 112를 갖는 LCDR1, 서열 A19(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 43을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 158을 포함하는 VL;
(u) 서열 번호 90을 갖는 HCDR1, 서열 번호 67을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 21을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 136을 포함하는 VH; 및
서열 번호 113을 갖는 LCDR1, 서열 A20(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 44를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 159를 포함하는 VL;
(v) 서열 번호 91을 갖는 HCDR1, 서열 번호 68을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 22를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 137을 포함하는 VH; 및
서열 번호 114를 갖는 LCDR1, 서열 A21(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 45를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 160을 포함하는 VL; 및/또는
(w) 서열 번호 93을 갖는 HCDR1, 서열 번호 70을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 24를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 139를 포함하는 VH; 및
서열 번호 116을 갖는 LCDR1, 서열 A23(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 47을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 162를 포함하는 VL.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 163-185 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 233-255 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체가 제공된다. 본 발명의 관련 측면에서, 서열 번호 284-306 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 307-329 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 항-Vγ4 항체가 제공된다.
본 발명은 추가로 γδ T 세포 수용체(TCR)의 Vγ4 사슬에 특이적으로 결합하고 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 γδ T 세포 수용체(TCR)의 Vγ4 사슬에 대한 결합을 경쟁하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 예를 들어, 서열 번호 187-232 중 어느 하나와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 바람직하게는, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 187-232 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 예를 들어, 서열 번호 187-209 중 어느 하나의 VH-암호화 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호 210-232 중 어느 하나의 VL-암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 세포 배양 배지에서 본 발명의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의의 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 맥락에서 상기 세포는 본원에 추가로 정의된 바와 같이 "숙주 세포"로 지칭될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의로 사용 설명서 및/또는 추가 치료 활성제를 포함하는, 본 발명의 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 약제로서 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다. 유사하게, 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 단리된 항-Vγ4 항체 또는 단편 또는 본 발명의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환)를 치료하는 방법이 제공된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 개발 전에는 통상적으로 Vγ4 사슬, 특히 인간 Vγ4에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 개발하는 것이 불가능할 것이라고 여겨졌다. 이것은 γδ TCR의 인간 Vγ4 사슬 및 Vγ2 사슬 간 고도의 서열 유사성(91%) 때문이었다. 이러한 상당한 난제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 특정 항원 및 방법론을 개발하였다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 데 사용하기 위한 서열 번호 256과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원이 제공된다. 항원 제조 과정의 또 다른 중요한 측면은 단백질로의 발현에 적합한 항원을 설계하는 것이었다. γδ TCR은 사슬간 및 사슬내 디설피드 결합이 있는 이종이량체가 관여되는 복합 단백질이다. 류신 지퍼(LZ) 형식 및 Fc 형식을 사용하여 파지 디스플레이 선택에 사용할 가용성 TCR 항원을 생성했다. 따라서, 본 발명은 또한 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 데 사용하기 위한 서열 번호 257 또는 258과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원을 제공한다.
또한, 감마 델타(γδ) T 세포는 CDR3 폴리클론성을 갖는 폴리클론날 세포이다. 생성된 항체가 CDR3 서열에 대해 선택되는 상황을 피하기 위해(CDR3 서열은 TCR 클론과 TCR 클론마다 다를 것이기 때문에), 항원 설계는 상이한 형식으로 일관된 CDR3을 유지하는 것이 관여되었다. 이 설계는 생식계열에서 암호화되므로 모든 클론에서 동일한 감마-4 가변 도메인 내 서열을 인식하는 항체를 생성하여 γδ T 세포의 더 넓은 하위세트를 인식하는 항체를 제공하는 것을 목표로 했다. 또한, 매우 유사한 감마-2 특이적 영역에도 결합하고 정확히 동일한 초가변 CDR3 서열을 포함하는 결합제의 선택해제와 조합된 다중 형식으로 이 감마-4 특이적 영역에 결합하는 항체를 선택하는 이러한 반복적 접근을 통해, 항체는 뛰어난 선택성을 가지고 확인되었다. 특히, 그리고 놀랍게도, 본원에 기재된 바와 같은 일부 경우에, 인간 감마 4 항원 상의 CDR3의 N-말단 영역에는 결합하지만 고도로 관련된 인간 감마 2 항원의 CDR3의 동등 영역 N-말단에는 결합하지 않는 항체가 확인되었다. 이것은 이 두 감마 사슬 사이의 아주 작은 서열 차이가 흩어져 있다는 사실과 조합된 이 영역에서 감마-4와 감마-2 사이의 고도의 상동성을 고려할 때 놀라운 것이었다: 9개의 변경 중 3개는 감마 가면 사슬 CDR1 및 CDR2에 걸쳐 매핑되는 반면, 9개의 변경 중 4개는 감마 가변 사슬 CDR3의 N-말단인 '초가변 영역 4'로 알려진 프레임워크 영역 3(FR3)의 하위영역에 매핑된다.
따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법이 제공된다:
(i) TCR 감마 가변 4(TRGV4) 아미노산 서열을 포함하는 항원 시리즈를 설계하는 단계로서, TRGV4의 CDR3 서열은 시리즈의 모든 항원에 있어서 동일한 단계;
(ii) 단계 (i)에서 설계된 제1 항원을 항체 라이브러리에 노출시키는 단계;
(iii) 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계;
(iv) 단리된 항체 또는 이의 단편을 단계 (i)에서 설계된 제2 항원에 노출시키는 단계; 및
(v) 제1 항원 및 제2 항원 모두에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계.
방법은 다음을 추가로 포함할 수 있다:
제1 항원 및/또는 제2 항원에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편을 TRGV4가 아닌 TCR 감마 가변 아미노산 서열(예를 들어, TCR 감마 가변 2(TRGV2) 또는 TCR 감마 가변 8(TRGV8) 아미노산 서열)을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; 및
제1 항원 및/또는 제2 항원에는 결합하지만 TRGV4가 아닌 TCR 감마 가변 아미노산 서열을 포함하는 항원에는 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계.
TRGV4, TRGV2 및 TRGV8 아미노산 서열은 바람직하게는 각각 인간 TRGV4, TRGV2 및 TRGV8에 상응한다. 인간 TRGV4는 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 상응한다. 인간 TRGV2 및 TRGV8은 각각 서열 번호 335 및 336에 상응하는 아미노산 서열에 상응한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득된 항체가 제공된다.
도 1: 본 발명의 예시적인 항-Vγ4 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 서열. 본 발명의 예시적인 항-Vγ4 항체에 대한 CDR 서열을 나타낸다. 해당 서열 번호를 각 서열의 오른쪽에 나타낸다.
도 2: DELFIA Elisa 검정을 통한 이종이량체 TCR 항원에 대한 항체 특이성. (a) QC 평가(분석용 SEC-HPLC)를 통과하고 또한 인간 Vγ4 사슬에 대한 특이성을 나타낸 모든 항체에 대한 결과가 표시된다. 이들 항체(X-축)를 각각 4개의 상이한 재조합 이종이량체 인간 TCR(DV1-GV4; DV2-GV4; DV1-GV2; DV1-GV8)로의 결합에 대해 시험하였다. 대조군은 이소형 대조군 항-닭 리소자임 D1.3 항체(사내, 맨 왼쪽)와 항-Vδ1 항체 REA173(Miltenyi) 및 TS8.2(Fisher)-맨 오른쪽을 포함한다. (b) (a)에 나타낸 데이터의 정량 및 인간 Vγ2 사슬 대비 인간 Vγ4 사슬에 대한 각각의 예시적인 클론의 결합에서의 증가 변화 배율을 추가로 나타낸다.
도 3: 재조합 항원 또는 재조합 세포 표면 수용체로 제시된 Vγ4Vδ1 TCR에 대한 항체 결합의 비교. (a) Delfia ELISA를 통해 DV1-GV4 항원(Y-축) 또는 JRT3-hu17 세포(X-축)에 결합하는 항체의 정규화되고 로그 변환된 X/Y 그래프. 수직 회색 점선은 이 연구에서 JRT3-hu17 결합에 대해 음성(왼쪽) 및 양성(오른쪽)으로 간주되는 mAbs에 대한 컷오프를 표시한다. X-축 gMFI 신호는 각 구축물 간 TCR 발현의 변화를 설명하기 위해 CD3에 대해 정규화되었다. (b) 음수/양수 컷오프를 추가로 예시하는 흐름 데이터 그래프. 항체 G4_26(중앙 왼쪽 패널)은 음성 그룹 중에서 가장 높은 정규화된 gMFI 값을 나타내고 음성 이소형 대조군(D1.3; 맨 왼쪽 패널)과 유사한 그래프를 나타낸다. G4_15(중앙 패널)는 양성 그룹 중에서 가장 낮은 정규화된 gMFI 값을 가지며 D1.3 이소형 대조군과 비교할 때 약하지만 명확한 염색 향상을 나타낸다. 중간(G4_16; 중앙 오른쪽) 및 강한(G4_18; 맨 오른쪽) 신호의 예도 참조용으로 제공된다.
도 4: 상이한 CDR3 서열을 포함하고/하거나 상이한 델타 사슬과 쌍을 이루는 재조합적으로 발현된 γ4 TCR 패널에 대한 항체 결합. (a) Jurkat 세포 상에서 발현된 재조합 TCR에 대해 생성된 항체 결합 신호의 히스토그램 표시. 순차적 분석은 하기와 같았다: Vγ4Vδ1-hu17에 대한 항체 결합 신호(검정색 막대); Vγ4Vδ1-hu20에 대한 항체 결합 신호(가로선 막대); Vγ4Vδ2 hu20γ-PBδ에 대한 항체 결합 신호(대각선 막대); Vγ4Vδ5-LES에 대한 항체 결합 신호(흰색 막대). JRT3 세포에서 상이한 TCR 구축물 간 TCR 발현의 변화를 설명하기 위해 모든 결합 신호를 CD3에 대해 정규화하였다. (b) 모든 Vγ4 TCR에 대해 양성으로 나타난 예시적인 항체(G4_3) 대 Vγ4 TCR 중 일부에 대해서만 양성으로 나타난 다른 선도 항체(G4_4) 간 차이를 추가로 예시하기 위한 이 연구에서의 2개의 선도 항체에 대한 예시적인 흐름 데이터.
도 5: JRT3 세포 상에서 발현된 키메라 hu17 TCR에 대한 항체 결합 및 에피토프 매핑. (a) 표시된 키메라 hu17 구축물의 생식계열-암호화 가변 감마 영역의 정렬이 제시된다. 공간 제한으로 인해, 성숙 Vγ2/3/4 서열의 처음 10개 아미노산(서열 번호 256의 아미노산 1-10[SSNLEGRTKS])은 생략되지만 모든 구축물에서 동일함을 주지한다. 참조 hu17 서열(야생형 Vγ4 TCR)과 상이한 아미노산이 표시된다. (b) 표시된 키메라 TCR 구축물에 대한 각 항체의 반응성의 요약 표. 결과는 JRT3 세포 상에서 발현된 개별 TCR에 대한 각각의 표시된 항체의 상대 결합 특이성을 강조한다. (c) 이 연구에서 관찰된 차별적 결합 신호를 예시하기 위한 에피토프 매핑의 예시적인 흐름 데이터.
도 6: Vγ4 TCR(hu17) 발현 세포 상의 예시적인 항체 결합 및 부여된 기능. (a) JRT3-hu17 세포에 결합된 모든 예시적인 항체를 나타내는 JRT3-hu17에 대한 항체의 적정된 결합. hu17의 발현이 항체 결합에 필수적임을 실증하는 음성 대조군으로 사용된 형질도입되지 않은 JRT3 세포(TCR 없음). (b) 적정된 항체에 의해 부여된 TCR 하향조절 대 양성 대조군 항체: 항-CD3ε(UCHT-1, Biolegend) 또는 항-범-TCRγδ(B1, Biolegend)에 의해 부여된 하향조절. (c) 적정된 항체에 의한 부여된 CD69 상향조절 대 비교 항체: 항-CD3ε(UCHT-1, Biolegend) 또는 항-범-TCRγδ(B1, Biolegend)에 의해 관찰된 상향조절.
도 7: 1차 Vγ4 양성 세포의 예시적인 항체 표적화 및 조절. (a) 본 발명의 모든 예시적인 항체가 용량 의존적 방식으로 1차 피부 유래 Vγ4+ T 세포에 결합할 수 있음을 나타내는, 2명의 개별 공여자의 피부로부터 증식된 1차 Vγ4+ T 세포에 대한 항-Vγ4 항체의 저정된 결합. 예시적인 항체의 Vγ4에 대한 특이성을 실증하는 음성 대조군으로서 이소형 대조군이 사용되었다. (b) 본 발명의 실질적으로 모든 예시적인 항체가 1차 혈액 유래 Vγ4+ T 세포에 결합할 수 있음을 나타내는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유래된 Vγ4+ T 세포에 대한 항-Vγ4 항체의 결합. RSV 이소형 대조군이 음성 대조군으로 사용되었다. (c) 이 세포 집단에 대한 3개의 예시적인 항체 모두의 결합을 나타내는, 결장직장암(CRC) 환자로부터의 장 유래 상피내 림프구(IEL)에 대한 항-Vγ4 항체 G4_3, G4_12 및 G4_18의 결합. 세포는 단일, 살아있는, γδ+, IgG1+(Vγ4)+로 관문화되었다. (d) 예시적인 항체 G4_18이 Vγ4+ 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는, 항-Vγ4 항체로의 자극 전 장 소화물에서 Vγ4+ γδ T 세포의 표현형 분석. 살아있는, 단일 세포의 1.4%는 Vδ1+였다. 이들 중 44.2%가 Vγ4와 쌍을 이루었고, 이들은 조직 잔류 마커(CD69+ CD103+)를 디스플레이했다. (e) 대표적인 FACS 그래프가 동반되는, 예시적인 항체, 각각 G4_12 및 G4_18에 의해 부여된 TCR 하향조절 대 이소형 음성 대조군에 의해 부여된 하향조절.
도 8: 1차 인간 Vγ4 T 세포수를 증가시키기 위한 Vγ4-특이적 항체의 용도. (a) IL-2 또는 IL-2 + IL-15의 존재 하에, 이소형 대조군 대비 플레이트-결합 항-Vγ4 클론 G4_12와 PBMC의 14일 배양 후 Vγ4 T 세포(클론 G4_18로의 염색에 의해 결정됨)의 증가를 예시하기 위한 예시적인 흐름 데이터. (b) IL-2 또는 IL-2 + IL-15의 존재 하에, 이소형 대조군 대비 플레이트-결합 항-Vγ4 클론 G4_12와 2명의 공여자로부터의 PBMC의 7일(상부열) 및 14일(하부열) 배양 후 Vγ4 T 세포(클론 G4_18로의 염색에 의해 결정됨)의 증가 요약.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 아래에 부여된 의미를 갖는다.
감마 델타(γδ) T 세포는 이의 표면 상에 고유한, 정의하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포의 작은 하위세트를 나타낸다. 이 TCR은 하나의 감마(γ) 및 하나의 델타(δ) 사슬로 구성된다. 각 사슬은 가변(V) 영역, 불변(C) 영역, 막횡단 영역 및 세포질 꼬리를 포함한다. V 영역은 항원 결합 부위를 포함한다. 인간 γδ T 세포에는 두 가지 주요 하위유형이 있다: 하나는 말초 혈액에서 우세하고 다른 하나는 비조혈 조직에서 우세하다. 두 개의 하위유형은 세포 상에 존재하는 δ 및/또는 γ의 유형에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, 대부분의 혈액 잔류 γδ T 세포는 Vδ2 TCR, 예를 들어 Vγ9Vδ2를 발현하는 반면, 이는 예를 들어 피부에서 Vδ1을, 그리고 장에서 Vγ4를 더 자주 사용하는, 조직 잔류 γδ T 세포에서는 덜 일반적이다. "Vγ4 T 세포"에 대한 언급은 Vγ4 사슬을 갖는 γδ T 세포, 즉 Vγ4+ 세포를 지칭한다.
"감마 가변 4"에 대한 언급은 Vγ4 또는 Vg4로도 지칭될 수 있다. 감마 가변 4 폴리펩티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 단백질 복합체는 "TRGV4"로 지칭될 수 있다. γδ TCR의 Vγ4 사슬과 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 모두 Vγ4에 결합하는 효과적인 항체 또는 이의 단편이고 "항-TCR 감마 가변 4 항체 또는 이의 단편" 또는 "항-Vγ4 항체 또는 이의 단편"으로 지칭될 수 있다. 인간 Vγ4 폴리펩티드에 대한 언급은 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 이 99개의 아미노산 서열은 또한 서열 번호 334에 상응한다. 따라서, 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 대한 본원의 언급은 본 발명의 모든 측면 및 구현예에 따라 서열 번호 334에 대한 언급과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82에 대한 본원의 언급은 서열 번호 334의 아미노산 영역 67-82와 동등하며 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"델타 가변 1"에 대한 언급은 Vδ1 또는 Vd1로도 지칭될 수 있다. 델타 가변 1 폴리펩티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 단백질 복합체는 "TRDV1"으로 지칭될 수 있다. γδ TCR의 Vδ1 사슬과 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 모두 Vδ1에 결합하는 효과적인 항체 또는 이의 단편이고 "항-TCR 델타 가변 1 항체 또는 이의 단편" 또는 "항-Vδ1 항체 또는 이의 단편"으로 지칭될 수 있다. 인간 Vδ1 폴리펩티드에 대한 언급은 서열 번호 337에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
"감마 가변 2"에 대한 언급은 Vγ2 또는 Vg2로도 지칭될 수 있다. 감마 가변 2 폴리펩티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 단백질 복합체는 "TRGV2"로 지칭될 수 있다. γδ TCR의 Vγ2 사슬과 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 모두 Vγ2에 결합하는 효과적인 항체 또는 이의 단편이며 "항-TCR 감마 가변 2 항체 또는 이의 단편" 또는 "항-Vγ2 항체 또는 이의 단편"으로 지칭될 수 있다. 인간 Vγ2 폴리펩티드에 대한 언급은 서열 번호 335에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
"감마 가변 8"에 대한 언급은 Vγ8 또는 Vg8로도 지칭될 수 있다. 감마 가변 8 폴리펩티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드, 또는 이 영역을 포함하는 TCR 단백질 복합체는 "TRGV8"로 지칭될 수 있다. γδ TCR의 Vγ8 사슬과 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 모두 Vγ8에 결합하는 효과적인 항체 또는 이의 단편이고 "항-TCR 감마 가변 8 항체 또는 이의 단편" 또는 "항-Vγ8 항체 또는 이의 단편"으로 지칭될 수 있다. 인간 Vγ8 폴리펩티드에 대한 언급은 서열 번호 336에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
용어 "항체"는 적어도 하나의 항원 결합 부위(ABS)를 포함하는 적어도 하나의 항체 가변 도메인을 포함하는 임의의 항체 단백질 구축물을 포함한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 유형의 면역글로불린(뿐만 아니라 이의 하위유형)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 2개의 동일한 중(H)쇄 및 2개의 동일한 경(L)쇄 폴리펩티드로부터 조립된 면역글로불린 G(IgG) 항체의 전체 구조는 잘 확립되어 있고 포유류에서 고도로 보존되어 있다(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169-217).
통상적인 항체 또는 면역글로불린(Ig)은 4개의 폴리펩티드 사슬: 즉 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 단백질이다. 각 사슬은 불변 영역 및 가변 영역으로 나뉜다. 중쇄(H) 가변 도메인은 본원에서 VH로 약칭되고, 경쇄(L) 가변 도메인은 본원에서 VL로 약칭된다. 이들 도메인, 이와 관련된 도메인 및 이로부터 유래된 도메인은 본원에서 면역글로불린 사슬 가변 도메인으로 지칭될 수 있다. VH 및 VL 도메인(VH 및 VL 영역으로도 지칭됨)은 "프레임워크 영역"("FR")으로도 불리는 더 보존된 영역이 산재되어 있는, "상보성 결정 영역"("CDR")으로 불리는 영역으로 더 세분화될 수 있다. 프레임워크 및 상보성 결정 영역은 정확하게 정의되었다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition U.S. Department of Health and Human Services, (1991) NIH Publication Number 91-3242). CDR 서열에 대한 대안적인 넘버링 관례, 예를 들어 Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883에 제시된 것들이 또한 존재한다. 통상적인 항체에서, 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카복시 말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄의 통상적인 항체 사량체는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 예를 들어 디설피드 결합에 의해 상호 연결되고 중쇄가 유사하게 연결되어 형성된다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인이다. 항체의 불변 영역은 전형적으로 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다.
본원에 사용된 바와 같은 항체의 단편("항체 단편", "면역글로불린 단편", "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 폴리펩티드"로도 지칭될 수 있음)은 표적, γδ T 세포 수용체의 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하는 항체(또는 상기 부분을 포함하는 구축물)의 일부(예를 들어, 하나 이상의 면역글로불린 사슬이 전장이 아니지만 표적에 특이적으로 결합하는 분자)를 지칭한다. 용어 항체 단편에 포괄되는 결합 단편의 예는 다음을 포함한다:
(i) Fab 단편(VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편);
(ii) F(ab')2 단편(힌지 영역에서 디설피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 구성되는 2가 단편);
(iii) Fd 단편(VH 및 CH1 도메인으로 구성됨);
(iv) Fv 단편(항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성됨);
(v) 단일쇄 가변 단편, scFv(재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 도메인으로 구성됨);
(vi) VH(VH 도메인으로 구성되는 면역글로불린 사슬 가변 도메인);
(vii) VL(VL 도메인으로 구성되는 면역글로불린 사슬 가변 도메인);
(viii) 도메인 항체(VH 또는 VL 도메인으로 구성되는, dAb);
(ix) 미니바디(CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 scFv 단편으로 구성됨); 및
(x) 디아바디(작은 펩티드 링커에 의해 또 다른 항체의 VL 도메인에 연결된 한 항체의 VH 도메인으로 구성되는 scFv 단편의 비공유 이량체로 구성됨).
"인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 상기 인간 항체가 투여된 인간 대상체는 상기 항체 내에 포함된 1차 아미노산에 대해 교차-종 항체 반응(예를 들어, HAMA 반응 - 인간-항-마우스 항체로 불림)을 생성하지 않는다. 상기 인간 항체는 예를 들어, CDR, 특히 CDR3에, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 이 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상으로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체 또는 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱이 관여되는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체는 "재조합 인간 항체"로도 지칭될 수 있다.
비-인간 면역글로불린 가변 도메인의 프레임워크 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 인간 가변 도메인으로부터의 상응하는 잔기로 치환하는 것은 "인간화"로 지칭된다. 가변 도메인의 인간화는 인간에서 면역원성을 감소시킬 수 있다.
"특이성"은 특정 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정기의 수를 지칭한다. 항체의 특이성은 특정 항원을 고유한 분자 실체로 인식하고 이를 또 다른 항원과 구별하는 항체의 능력이다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당분야에서 잘 이해되는 용어이다. 분자가 대안적 표적보다 특정 표적 항원 또는 에피토프와 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하는 경우, 이는 "특이적 결합"을 나타낸다고 한다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합하는 경우, 이는 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다". 항체(또는 이의 단편)는 결합이 관련 없는 결합제와 비교하여 통계적으로 유의한 경우 표적에 특이적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
항원과 항원 결합 폴리펩티드(KD)의 해리에 대한 평형 상수로 표시되는 "친화도"는 항원 결정기 및 항체(또는 이의 단편) 상 항원 결합 부위 간 결합 강도의 척도이다: KD 값이 작을수록 항원 결정기 및 항원 결합 폴리펩티드 간 결합 강도가 강하다. 대안적으로, 친화도는 1/KD인 친화도 상수(KA)로 표현될 수도 있다. 친화도는 특정 관심 항원에 따라, 알려진 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어 KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
10-6 미만의 임의의 KD 값은 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 항원 또는 항원 결정기에 대한 항체 또는 이의 단편의 특이적 결합은 예를 들어 스캐차드 분석 및/또는 방사성면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정과 같은 경쟁적 결합 검정, 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 또는 분광법(예를 들어, 형광 검정 사용) 및 당분야에 알려진 이의 상이한 변화를 포함하는 임의의 적합한 알려진 방식으로 결정될 수 있다.
"결합력"은 항체 또는 이의 단편 및 관련 항원 간 결합 강도의 척도이다. 결합력은 항원 결정기 및 항체 상의 그 항원 결합 부위 간 친화도 및 항체 상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 모두와 관련이 있다.
"인간 조직 Vγ4+ 세포", 및 "조혈 및 혈액 Vγ4+ 세포" 및 "종양 침윤 림프구(TIL) Vγ4+ 세포"는 각각 인간 조직 또는 조혈 혈액계 또는 인간 종양에 포함되거나 이로부터 유래된 Vγ4+ 세포로 정의된다. 모든 상기 세포 유형은 이의 (i) 위치 또는 이들이 유래된 곳 및 (ii) Vγ4+ TCR의 발현에 의해 확인될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 단편(즉, 폴리펩티드)은 단리된다. "단리된" 폴리펩티드는 그 원래 환경으로부터 제거된 것이다. 용어 "단리된"은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Vγ4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편은 Vγ4 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 용어 "단리된"은 또한 단리된 항체가 약학 조성물의 활성 성분으로 제형화될 때 치료적으로 투여하기 충분히 순수하거나, 적어도 70-80%(w/w) 순수하거나, 보다 바람직하게는 적어도 80-90%(w/w) 순수하거나, 훨씬 더 바람직하게는 90-95% 순수하고; 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(w/w) 순수한 조제물을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드가 단리된다. "단리된" 폴리뉴클레오티드는 그 원래 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 발생 폴리뉴클레오티드는 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전체로부터 분리되는 경우 단리된다. 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 그 자연 환경의 일부가 아닌 벡터 내로 클로닝되거나 cDNA 내에 포함되는 경우, 이는 단리된 것으로 간주된다.
항체 또는 이의 단편은 자연 발생 대립유전자 변이체 뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비-자연 발생 변이체를 또한 포함하는 "기능적 활성 변이체"일 수 있다. 당분야에 알려진 바와 같이, 대립유전자 변이체는 본질적으로 폴리펩티드의 생물학적 기능을 변경하지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것을 특징으로 하는 (폴리)펩티드의 대안적 형태이다. 비제한적인 예로서, 상기 기능적 활성 변이체는 CDR을 포함하는 프레임워크가 변형될 때, CDR 자체가 변형될 때, 상기 CDR이 대안적 프레임워크에 이식될 때, 또는 N- 또는 C-말단 연장부가 포함될 때 여전히 기능할 수 있다. 또한, CDR-함유 결합 도메인은 또 다른 항체와 공유되는 것과 같은 상이한 파트너 사슬과 쌍을 이룰 수 있다. 소위 '공통' 경쇄 또는 '공통' 중쇄와의 공유 시, 상기 결합 도메인은 여전히 기능할 수 있다. 추가로, 상기 결합 도메인은 다량체화될 때 기능할 수 있다. 추가로, '항체 또는 이의 단편'은 또한 VH 또는 VL 또는 불변 도메인이 상이한 정규 서열(예를 들어, IMGT.org에 나열됨)과 멀리 또는 가까이 변형되고 여전히 기능하는 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
2개의 밀접하게 관련된 폴리펩티드 서열을 비교하기 위해, 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열 간 "서열 동일성%"는 폴리펩티드 서열에 대한 표준 설정(BLASTP)을 사용하여 NCBI BLAST v2.0을 사용해서 계산될 수 있다. 2개의 밀접하게 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 비교하기 위해, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열 간 "서열 동일성%"는 뉴클레오티드 서열에 대한 표준 설정(BLASTN)을 사용하여 NCBI BLAST v2.0을 사용해서 계산될 수 있다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 이의 전체 길이에 걸쳐 100% 서열 동일성을 공유하는 경우, 다른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 같거나 "동일한" 것으로 언급된다. 서열의 잔기는 왼쪽에서 오른쪽으로, 즉 폴리펩티드의 경우 N-말단에서 C-말단으로; 폴리뉴클레오티드의 경우 5'에서 3' 말단으로 번호가 매겨진다.
일부 구현예에서, 서열의 임의의 특정된 서열 동일성%는 항체의 모든 6개 CDR의 서열 없이 계산된다. 예를 들어, 항-Vγ4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특정된 가변 중쇄 영역 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 갖는 가변 중쇄 영역 서열 및/또는 특정된 가변 경쇄 영역 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 가변 경쇄 영역 서열을 포함할 수 있고, 임의의 아미노산 변이는 가변 중쇄 및 경쇄 영역 서열의 프레임워크 영역에서만 발생한다. 이러한 구현예에서, 특정 서열 동일성을 갖는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 상응하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편의 전체 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 보유한다.
서열 간 "차이"는 제1 서열과 비교하여 제2 서열의 위치에서의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭한다. 2개의 폴리펩티드 서열은 1개, 2개 이상의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 다르게는 제1 서열과 동일한(100% 서열 동일성) 제2 서열에서의 삽입, 결실 또는 치환은 서열 동일성(%)을 감소시킨다. 예를 들어, 동일한 서열이 9개 아미노산 잔기 길이인 경우, 제2 서열에서의 하나의 치환은 88.9% 서열 동일성을 초래한다. 제1 및 제2 폴리펩티드 서열이 9개 아미노산 잔기 길이이고 6개의 동일한 잔기를 공유하는 경우, 제1 및 제2 폴리펩티드 서열은 66% 초과의 동일성을 공유한다(제1 및 제2 폴리펩티드 서열은 66.7% 동일성을 공유함).
대안적으로, 제1 참조 폴리펩티드 서열을 제2 비교 폴리펩티드 서열과 비교하기 위해, 제2 서열을 생산하기 위해 제1 서열에 수행된 부가, 치환 및/또는 결실의 수가 확인될 수 있다. "부가"는 하나의 아미노산 잔기의 제1 폴리펩티드의 서열 내로의 추가이다(제1 폴리펩티드의 어느 한 말단에서의 추가 포함). "치환"은 제1 폴리펩티드의 서열에서 하나의 아미노산 잔기의 하나의 상이한 아미노산 잔기로의 치환이다. 상기 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있다. "결실"은 제1 폴리펩티드의 서열로부터 하나의 아미노산 잔기의 결실이다(제1 폴리펩티드의 어느 한쪽 말단에서의 결실 포함).
세 글자 및 한 글자 코드를 사용하여, 자연 발생 아미노산은 하기와 같이: 글리신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 류신(L 또는 Leu), 이소류신(I 또는 Ile), 프롤린(P 또는 Pro), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 티로신(Y 또는 Tyr), 트립토판(W 또는 Trp), 라이신(K 또는 Lys), 아르기닌(R 또는 Arg), 히스티딘(H 또는 His), 아스파르트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 아스파라긴(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gln), 시스테인(C 또는 Cys), 메티오닌(M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser) 및 트레오닌(T 또는 Thr)으로 지칭될 수 있다. 잔기가 아스파르트산 또는 아스파라긴일 수 있는 경우, 기호 Asx 또는 B가 사용될 수 있다. 잔기가 글루탐산 또는 글루타민일 수 있는 경우, 기호 Glx 또는 Z가 사용될 수 있다. 맥락에서 달리 특정되지 않는 한, 아스파르트산에 대한 언급은 아스파르테이트를 포함하고, 글루탐산은 글루타메이트를 포함한다.
"보존적" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 화학 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되고 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 기타 생물학적 특성에 거의 영향을 미치지 않을 것으로 예상되는 아미노산 치환이다. 이러한 보존적 치환은 적합하게는 하기 그룹 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내로부터의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다:
Figure pct00001
적합하게는, 소수성 아미노산 잔기는 비극성 아미노산이다. 더 적합하게는, 소수성 아미노산 잔기는 V, I, L, M, F, W 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 서열의 넘버링 그리고 CDR 및 FR의 정의는 Kabat 시스템에 따라 정의된 바와 같다(Kabat et al., 1991, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 제1 및 제2 폴리펩티드 서열 간 "상응하는" 아미노산 잔기는 제2 서열의 아미노산 잔기와 Kabat 시스템에 따른 동일한 위치를 공유하는 제1 서열의 아미노산 잔기인 반면, 제2 서열의 아미노산 잔기는 제1 서열로부터와 정체가 상이할 수 있다. 적합하게 상응하는 잔기는 프레임워크 및 CDR이 Kabat 정의에 따라 동일한 길이인 경우 동일한 수(및 문자)를 공유한다. 정렬은 수동으로 또는 예를 들어 표준 설정을 사용하여 NCBI BLAST v2.0(BLASTP 또는 BLASTN)과 같은 서열 정렬을 위한 알려진 컴퓨터 알고리즘을 사용해서 달성될 수 있다.
본원에서 "에피토프"에 대한 언급은 항체 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 결합되는 표적의 부분을 지칭한다. 에피토프는 또한 "항원 결정기"로 지칭될 수 있다. 항체는 이들이 둘 다 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인식할 때, 또 다른 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 두 항체가 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 경쟁 검정이며, 이는 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하는 여러 상이한 형식(에를 들어, 방사성 또는 효소 표지를 사용하는 웰 플레이트, 또는 항원-발현 세포 상의 유세포 분석)으로 구성될 수 있다. 항체는 둘 다 동일한 에피토프를 인식할 때(즉, 항원 및 항체 간 모든 접촉점이 동일함) 또 다른 항체와 "동일한 에피토프"에 결합한다. 예를 들어, 항체는 항체/항원 가교-커플링 MS, HDX, X선 결정학, 저온-EM 또는 돌연변이유발과 같은 특성화 방법의 보조로 항원의 특정된 영역에 걸쳐 모든 접촉점이 동일한 것으로 확인될 때 또 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
또한, 이러한 특성화 방법의 도움으로, 동일한 접촉점의 전부는 아니지만 일부를 인식함으로써 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 특성화하는 것도 가능하다. 구체적으로, 이러한 항체는 특정 항원 영역에서 충분한 수의 동일한 접촉점을 공유하여 광범위하게 동등한 기술적 효과 및/또는 동등한 항원 상호작용 선택성을 전달할 수 있다. 추가로, 항체가 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고 광범위하게 동등한 기술적 효과 및/또는 상호작용 선택성을 부여하는 일부 경우에, 가장 N-말단 항원 접촉점에서 가장 C-말단 항원 접촉점까지를 포함하는 전체 항원 접촉에 의해 에피토프 결합 발자국(footprint)을 정의하는 것도 유용할 수 있다.
단백질 표적 상에서 발견되는 에피토프는 "선형 에피토프" 또는 "입체형태 에피토프"로 정의될 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 항원에서 연속적인 아미노산 서열에 의해 형성된다. 입체형태 에피토프는 단백질 서열에서는 불연속적이지만 단백질이 그 3차원 구조로 접힐 때 함께 모이는 아미노산으로 형성된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 추가 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 및 효모 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터, 및 또한 박테리오파지 및 파지미드 시스템을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라, 예를 들어, 이러한 세포의 자손이 세포주 또는 세포 은행을 만드는 데 사용되고 임의로 보관, 제공, 판매, 전달되는 경우, 또는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 제조하기 위해 사용되는 경우, 상기 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다.
"대상체", "환자" 또는 "개체"에 대한 언급은 치료받을 대상체, 특히 포유류 대상체를 지칭한다. 포유류 대상체는 인간, 비인간 영장류, 농장 동물(예컨대 소), 스포츠 동물, 또는 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트 또는 마우스와 같은 애완 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대안적 구현예에서, 대상체는 마우스와 같은 비인간 포유류이다.
용어 "충분한 양"은 원하는 효과를 생산하기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료 유효량"은 질환 또는 장애의 증상을 완화하는 데 효과적인 양이다. 예방이 치료법으로 간주될 수 있으므로, 치료 유효량은 "예방 유효량"일 수 있다.
질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 중증도, 대상체가 경험하는 이러한 징후 또는 증상의 빈도, 또는 둘 모두가 감소되는 경우, 질환 또는 장애는 "완화"된다.
본원에 사용된 바와 같은 "질환 또는 장애의 치료"는 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 및/또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "암"은 세포의 비정상적인 성장 또는 분열을 지칭한다. 일반적으로 암세포의 성장 및/또는 수명은 정상 세포 및 그 주변 조직의 성장 및/또는 수명을 초과하며 이와 조율되지 않는다. 암은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있다. 암은 다양한 세포 및 조직에서 발생한다.
"염증"은 염증이 있는 세포, 세포 유형, 조직 또는 기관을 초래하는 면역계의 만성 또는 급성 유발을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 특정된 값보다 최대 10% 더 크고 최대 10% 더 작은, 적합하게는 특정된 값보다 최대 5% 더 크고 최대 5% 더 작은, 특히 특정된 값을 포함한다. 용어 "사이"는 특정된 경계 값을 포함한다.
γδ T 세포의 생체내 조절 방법
본 발명의 한 측면에 따르면, 환자에 본원에 정의된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 감마 가변 4 사슬(Vγ4) T 세포의 생체내 조절 방법이 제공된다.
Vγ4 T 세포의 생체내 조절은 다음을 포함할 수 있다:
- 예를 들어, Vγ4 T 세포 수의 선택적 증가 또는 Vγ4 T 세포의 생존 촉진에 의한, Vγ4 T 세포의 증식;
- 예를 들어, Vγ4 T 세포의 역가 증가, 즉 표적 세포 사멸의 증가에 의한, Vγ4 T 세포의 자극;
- Vγ4 T 세포의 탈과립.
Vγ4 T 세포의 이러한 조절은, 예를 들어 Vγ4 T 세포 활성화 또는 Vγ4 T 세포 억제를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, Vγ4 T 세포는 본원에 정의된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 투여함으로써 활성화된다. 대안적 구현예에서, Vγ4 T 세포는 본원에 정의된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 투여함으로써 억제된다. 대안적 구현예에서, Vγ4 T 세포는 본원에 정의된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편의 투여 후 억제되지 않는다.
한 구현예에서, 환자에 항-TCR 감마 4 가변 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, Vγ4 T 세포를 조절하는 방법이 제공된다. 한 구현예에서, Vγ4 T 세포의 생체내 조절 방법에서 사용하기 위한 항-TCR 감마 4 가변 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 한 구현예에서, Vγ4 T 세포의 생체내 조절용 약제의 제조에서 항-TCR 감마 4 가변 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공된다.
한 구현예에서, 생체내 조절은 Vγ4 T 세포의 활성화, 특히 Vγ4 T 세포의 생체내 증식을 포함한다. 따라서, 본 발명의 측면에 따르면, 환자에 본원에 정의된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, Vγ4 T 세포의 생체내 증식 방법이 제공된다. Vγ4 T 세포의 이러한 증식은 Vγ4 T 세포수의 선택적 증가를 통해 및/또는 Vγ4 T 세포의 생존 촉진을 통해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 언급 "증식된"은 항체 또는 이의 단편의 투여 전보다 많은 수의 세포를 갖는 환자를 지칭한다.
항체 또는 이의 단편
본 발명의 제1 측면에 따르면, γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 감마 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 특히, 항체 또는 이의 단편은 γδ TCR의 가변 감마 2(Vγ 2) 사슬에 결합(또는 이와 교차 반응)하지 않는다. 이것은 동일한 종으로부터의 Vγ4 사슬 및 Vγ2에 관한 것임이 이해되어야 한다. 바람직하게는, 종은 호모 사피엔스(인간)이고, 따라서 본 발명은 γδ T 세포 수용체(TCR)의 인간 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 인간 감마 가변 2(Vγ2) 사슬에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 예를 들어, 인간 Vγ4 사슬은 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 따른 서열을 가질 수 있고/있거나 인간 Vγ2 사슬은 서열 번호 335에 따른 서열을 가질 수 있다. 다른 종에서, 단리된 항체 또는 이의 단편은 γδ T 세포 수용체(TCR)의 인간 감마 가변 4(Vγ4) 사슬의 종 특이적 오르토로그에 특이적으로 결합하고, γδ TCR의 인간 감마 가변 2(Vγ2) 사슬의 종 특이적 오르토로그에는 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 상응하는 서열을 갖는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 인간 감마 가변 4(Vγ4) 사슬 또는 이의 비인간 오르토로그에 특이적으로 결합하고 서열 번호 335에 상응하는 서열을 갖는 γδ TCR의 인간 감마 가변 2(Vγ2) 사슬 또는 이의 비인간 오르토로그에는 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 이러한 맥락에서 오르토로그는 참조 서열에 대해 가장 높은 서열 유사성을 갖는 감마 사슬 서열, 또는 바람직하게는 동일한 기능(예를 들어, 생체내 오르토로그 인지체 리간드와의 상호작용)을 보유하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 마우스에서 Heilig & Tonegave 명명법에 따라 Vγ7로 지정된 단백질이 기능적으로 인간 Vγ4와 가장 밀접하게 관련되어 있다(Barros et al. (2016) Cell, 167:203-218.e17).
이러한 발전은 통찰력 깊은 것이다. 예를 들어 인간에서, Vγ4 및 Vγ2 사슬은 91% 서열 동일성을 공유한다(9개의 아미노산만 다름). 따라서 이것은 (인간) Vγ4에 결합하고 (인간) Vγ2에는 결합하지 않는 항체를 수득하는 것을 어렵게 만들었고, 본 발명 전에는 이러한 항체를 생산하는 것이 가능할 것으로 당분야에서 예상되지 않았다.
γδ TCR의 Vγ4 사슬에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 언급할 때, 이는 일반적으로 Vγ4 사슬에 대한 항체 또는 이의 단편의 결합이 음성 대조군 항체 및/또는 음성 대조군 항원에 비해 통계적으로 유의하게 증가됨을 의미한다(예를 들어, ELISA 검정, 임의로 DELFIA ELISA 검정 또는 SPR에서 결합을 통해 측정됨). 음성 대조군 항체 및/또는 음성 대조군 항원과 관련하여 검출된 수준은 사용된 검정에 대한 배경 수준으로 간주될 수 있으며, 이는 당업자가 잘 이해할 검정 시스템에서의 "노이즈"를 나타낸다. 특정 구현예에서, 배경 수준에 비해 미리 결정된 역치를 초과하는 신호 수준은 결합의 검출을 나타내는 것으로 간주될 수 있다(예를 들어, 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배 이상 배경 수준 초과). 예를 들어, DELFIA ELISA 검정에서 배경 수준보다 5배 이상 높은 신호 수준은 항원에 대한 항체의 결합을 표시하는 것으로 간주될 수 있다. 당업자는 사용 중인 검정 시스템에 기반하여 적합한 역치를 잘 결정할 수 있다. 역으로, γδ TCR의 Vγ2 사슬에 결합하지 않는(또는 이와 교차 반응하지 않는) 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 언급할 때, 이것은 일반적으로 Vγ2 사슬에 대한 항체 또는 이의 단편의 결합이 음성 대조군 항체 및/또는 음성 대조군 항원에 비해 통계적으로 유의하게 증가됨을 의미한다(예를 들어, ELISA 검정, 임의로 DELFIA ELISA 검정 또는 SPR에서의 결합을 통해 측정됨). 이것은 예를 들어 도 2a에서 실증되고 실시예 4에서 논의된다. 본원에 개시된 본 발명의 모든 측면 및 구현예에 따르면, 이 특징은 또한 항체 또는 이의 단편 및 Vγ4 사슬 대 항체 또는 이의 단편 및 Vγ2 사슬의 검출된 결합 수준(예를 들어, ELISA 검정, 임의로 DELFIA ELISA 검정, 또는 SPR에서의 결합을 통해 측정됨)의 차이 변화 배율로도 표현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 Vγ2 사슬에 대한 결합과 비교하여 적어도 약 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 150배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10000배, 15000배, 25000배, 50000배, 75000배, 95000배 이상의 Vγ4 사슬에 대한 결합 증가를 나타낼 수 있다. 이것은 예를 들어 도 2b에서 실증되고 실시예 4에서 논의된다. 그러나 이러한 증가 배율은 대조군을 초과하는 모든 Vγ2 신호가 배경 노이즈가 아니라고 가정하고 이를 계산한 만큼 보수적인 것으로 간주된다. 그러나, 그리고 이전에 논의된 바와 같이, 당업자는 대신에 검정 노이즈로서 DELFIA ELISA 검정에서와 같은 배경을 초과하는(예를 들어, 배경 수준을 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배 이상 초과하는) 낮은 신호를 제외할 수 있다. 따라서 이러한 역치 아래의 신호를 비특이적 배경 결합으로 간주할 수 있다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 가변 도메인(예를 들어, VH 또는 VL), 디아바디, 미니바디 또는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 scFv이다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 임의의 클래스, 예를 들어 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 또는 이의 이소형일 수 있고, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 항체는 IgG 항체, 예를 들어, 이소형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 적어도 하나이다. 한 구현예에서, 항체는 IgG1이다. 추가 구현예에서, 항체는 효과기 기능을 감소시키거나, 반감기를 연장하거나, ADCC를 변경하거나, 힌지 안정성을 개선하기 위해 Fc를 돌연변이시키는 것과 같이 원하는 특성을 부여하기 위해 변형된 IgG 형식과 같은 형식일 수 있다. 이러한 변형은 당분야에 잘 알려져 있고 예시적인 구현예가 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 332 또는 333에 따른 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 불변 도메인을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 인간이다. 따라서, 항체 또는 이의 단편은 인간 면역글로불린(Ig) 서열로부터 유래될 수 있다. 항체(또는 이의 단편)의 CDR, 프레임워크 및/또는 불변 영역은 인간 Ig 서열, 특히 인간 IgG 서열로부터 유래될 수 있다. CDR, 프레임워크 및/또는 불변 영역은 인간 Ig 서열, 특히 인간 IgG 서열에 대해 실질적으로 동일할 수 있다. 인간 항체를 사용하는 이점은 인간에서 면역원성이 낮거나 없다는 것이다.
항체 또는 이의 단편은 또한 키메라, 예를 들어 마우스-인간 항체 키메라일 수 있다.
대안적으로, 항체 또는 이의 단편은 마우스와 같은 비인간 종으로부터 유래된다. 이러한 비-인간 항체는 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키도록 변형될 수 있으며, 따라서 항체 또는 이의 단편은 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 인간화된다.
에피토프에 표적화된 항체
γδ TCR의 Vγ4 사슬의 에피토프에 결합하는 항체(또는 이의 단편)가 본원에서 제공된다. Vγ4 사슬 상 에피토프의 결합은 임의로 활성화 또는 억제와 같은 γδ TCR 활성에 영향을 미칠 수 있다. 항체(또는 이의 단편)는 또 다른 항체 또는 분자의 결합 또는 상호작용을 방지함으로써 차단 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 항체는 γδ TCR의 Vγ4 사슬에 특이적이며, 본원에 정의된 바와 같이, γδ TCR의 Vγ2 사슬 또는 γδ TCR의 Vγ8 사슬과 같은 다른 항원의 에피토프에는 결합하지 않는다.
한 구현예에서, 에피토프는 γδ T 세포의 활성화 에피토프일 수 있다. "활성화" 에피토프는 예를 들어, TCR 하향조절, 세포의 탈과립, 세포독성, 증대, 동원, 증가된 생존 또는 고갈에 대한 저항성, 세포내 신호전달, 사이토카인 또는 성장 인자 분비, 표현형 변화, 또는 유전자 발현의 변화와 같은 TCR 관련 기능의 조절을 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성화 에피토프의 결합은 γδ T 세포 집단, 바람직하게는 Vγ4+ T 세포 집단의 증식(즉, 증대)을 자극할 수 있다. 따라서, 이들 항체는 γδ T 세포 활성화를 조절하고, 이에 따라 면역 반응을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 활성화 에피토프의 결합은 γδ TCR을 하향조절한다. 추가적 또는 대안적 구현예에서, 활성화 에피토프의 결합은 γδ T 세포의 탈과립을 활성화한다. 추가의 추가적 또는 대안적 구현예에서, 활성화 에피토프의 결합은 표적 세포(예를 들어, 암세포)를 사멸하도록 γδ T 세포를 활성화한다.
한 구현예에서, 본 발명은 Vγ4를 차단하고 TCR 결합을(예를 들어, 입체 장애를 통해) 방지하는 단리된 항체 또는 이의 단편을 제공한다. Vγ4를 차단함으로써, 항체는 TCR 활성화 및/또는 신호전달을 방지할 수 있다. 따라서 에피토프는 γδ T 세포의 억제 에피토프일 수 있다. "억제" 에피토프는 예를 들어 TCR 기능을 차단하여 TCR 활성화를 억제하는 것을 포함할 수 있다.
에피토프는 바람직하게는 γδ TCR의 Vγ4 사슬의 적어도 하나의 세포외, 가용성, 친수성, 외부 또는 세포질 부분으로 이루어진다.
특정 구현예에서, 에피토프는 γδ TCR의 Vγ4 사슬, 특히 Vγ4 사슬의 CDR3의 비-생식계열 암호화 영역에서 발견되는 에피토프를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 에피토프는 γδ TCR의 Vγ4 사슬의 프레임워크 영역 내에 있으며, 이는 프레임워크 영역 3의 초가변 4 영역일 수 있다. 이러한 결합은 Vγ4 사슬(특히 CDR3) 간에 매우 가변적인 TCR의 서열에 대한 제한없이 일반적으로 Vγ4 사슬의 고유한 인식을 허용한다는 것이 이해될 것이다. 이와 같이, 임의의 Vγ4 사슬-포함 γδ TCR은 γδ TCR의 특이성과 무관하게, 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 사용하여 인식될 수 있음이 이해될 것이다.
γδ 수용체가 다양한 조절 리간드에 독립적으로 그리고 공간적으로 구별되는 도메인을 통해 결합할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 다중 모드 리간드 결합과 일치하게, Melandri et al. (2018) Nat. Immunol. 19: 1352-1365에 의한 최근 연구는 내인성 BTNL3 리간드에 대한 인간 TCR 결합이 γ4 사슬 상에서 CDR3의 N-말단에 위치한 별개의 도메인을 통한다는 것을 나타내었다. 저자들은 BTNL3 결합이 TCR의 이 특정 생식계열 영역을 통해 매개되기 때문에, 더 C-말단의, 체세포적으로 재조합된 CDR3 루프가 다른 리간드에 독립적으로 결합할 수 있는 상태로 유지된다는 것을 강조한다. 또한, 프레임워크 영역 3(FR3)의 이 하위영역('초가변 영역 4'(HV4)으로도 지칭될 수 있음)은 4개의 아미노산이 인간 γ2 사슬에서와 상이하다. 그러나 특정 항-Vγ4 항체가 Melandri 등의 문헌에서 개시되지도 않았고 이러한 항체가 어떻게 유도될 수 있는지 제안되지도 않았다. 실제로, 인간 Vγ4 및 Vγ2 사슬(91% 서열 동일성) 간 공유되는 상당한 서열 상동성으로 인해 이것이 가능하지 않을 것이라는 것이 지배적인 견해였다.
HV4 영역 내에서 결합하는 항체는 γ4 사슬의 CDR3 영역이 여전히 결합하도록 할 수 있으며, γ2에 비해 γ4에 특이적인 결합제를 제공하는 추가 이점이 있다. 또한, HV4가 생식계열-암호화되기 때문에, 이 영역을 표적화하는 일부 항체는 모든 Vγ4 사슬을 인식할 수 있는 반면 Vγ4를 인식하는 다른 항체는 특정 Vγ4 사슬에 특이적일 수 있다.
본 발명은 이제 Vγ4 사슬의 HV4 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이의 단편을 제공한다. 따라서, 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 Vγ4 사슬의 HV4 영역의 에피토프에 결합한다. HV4 영역은 서열 번호 1의 아미노산 67 내지 82를 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열의 일부가 아닌 Vγ4 사슬의 일부를 포함한다. 그렇게 함으로써, 항체 또는 이의 단편은 Vγ4+ TCR 및 BTNL3/8 간 상호작용을 조절할 수 있다. 한 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 96-106(CDR3) 내의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 한 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 50-57(CDR2) 내의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 한 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 27-32(CDR1) 내의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 아미노산 67 내지 82 중 하나 이상에 결합 시, Vγ4+ TCR을 활성화할 수 있다.
잘 특성화된 αβ T 세포와 유사한 방식으로, γδ T 세포는 체세포적으로 재배열된 가변(V), 다양성(D)(β 및 δ만), 연결(J) 및 불변(C) 유전자의 고유한 세트를 이용하지만, γδ T 세포는 αβ T 세포보다 적은 V, D 및 J 절편을 포함한다. 한 구현예에서, 항체(또는 이의 단편)에 의해 결합된 에피토프는 Vγ4 사슬의 J 영역에서 발견되는 에피토프를 포함하지 않는다. 따라서 항체 또는 단편은 Vγ4 사슬의 V 영역에만 결합할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 에피토프는 γδ TCR의 V 영역의 에피토프로 구성된다(예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1-99).
에피토프에 대한 참조는 서열 번호 1로 표시된, Luoma et al. (2013) Immunity 39: 1032-1042 및 RCSB 단백질 데이터 뱅크 엔트리: 4MNH에 기재된 Vγ4 서열과 관련하여 수행된다:
SSNLEGRTKSVIRQTGSSAEITCDLAEGSTGYIHWYLHQEGKAPQRLLYYDSYTSSVVLESGISPGKYDTYGSTRKNLRMILRNLIENDSGVYYCATWDEKYYKKLFGSGTTLVVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADSRGGLEVLFQ(서열 번호 1)
서열 번호 1은 V 영역(가변 도메인으로도 지칭됨) 및 J 영역을 포함하는 가용성 TCR을 나타낸다. V 영역은 아미노산 잔기 1-99를 포함하고, J 영역은 아미노산 잔기 102-116을 포함하고, TCRβ로부터의 불변 영역은 아미노산 잔기 117-256을 포함한다. V 영역 내에서, CDR1은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 27 내지 32로 정의되고, CDR2는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 50 내지 57로 정의되고, CDR3은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 96 내지 106으로 정의된다.
본 발명자들은 서열 번호 1의 아미노산 K76(즉, 위치 76의 라이신) 및 M80(즉, 위치 80의 메티오닌)이 (인간) Vγ4 사슬의 HV4 영역에 대한 결합에 특히 중요할 수 있음을 확인하였다(실시예 6). 따라서, 에피토프는 서열 번호 1의 K76 및/또는 M80을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명자들은 서열 번호 1의 아미노산 영역 71-79 내의 아미노산이 (인간) Vγ4 사슬의 HV4 영역에 대한 결합에 특히 중요할 수 있음을 추가로 확인하였다. 따라서, 추가 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 71-79 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 구현예에서, 에피토프는 기재된 영역 내의 하나 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상(예를 들어, 5개 이상, 예컨대 10개 이상)의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가 구현예에서 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 71-79 내의 하나 이상(예를 들어, 3개 이상, 예컨대 5개 이상)의 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 항체(또는 이의 단편)가 정의된 범위 내의 모든 아미노산에 결합할 필요가 없다는 것이 추가로 이해될 것이다. 이러한 에피토프는 선형 에피토프로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체는 상기 범위 내의 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 범위의 각 말단에 있는 아미노산 잔기(즉, 아미노산 67 및 82), 임의로 범위 내의 아미노산(즉, 아미노산 71, 73, 75, 76 및 79)을 포함하는 잔기와만 결합할 수 있다.
예를 들어, 본 발명자들은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76 및 79가 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 결합하는 에피토프를 형성할 수 있음을 발견하였다(실시예 8). 따라서, 한 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76 및 79 중 적어도 하나를 포함한다. 추가 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76 및 79로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개(특히 4 또는 5개) 아미노산을 포함한다.
추가 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 추가 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 영역 71-79 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성된다.
추가 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71-79를 포함하거나, 적합하게는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71-79로 구성된다. 또 다른 추가 구현예에서, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76 및 79를 포함하거나, 적합하게는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76 및 79로 구성된다.
항체에 의해 결합되는 에피토프를 확립하기 위한 다양한 기법이 당분야에 알려져 있다. 예시적인 기법은 예를 들어 일상적인 교차 차단 검정, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석, 펩티드 절단 분석 결정학 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다. 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다(실시예 8에 기재됨). 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법에는 관심 단백질의 중수소 표지 후 중수소-표지 단백질에 대한 항체의 결합이 관여된다. 다음으로, 단백질/항체 복합체는 물로 옮겨지고 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환 가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환 가능한 양성자보다 느린 속도로 중수소에서 수소로의 역교환을 거친다. 결과적으로 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있으므로 계면에 포함되지 않은 아미노산에 비해 상대적으로 더 높은 질량을 나타낼 수 있다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분광법 분석을 거쳐 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지 잔기를 드러낸다.
추가로, 또는 대안으로서, 항원 키메라화 및 돌연변이유발 연구를 사용하여 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 확인할 수 있다(실시예 6에 기재됨). 일반적으로, 이 방법에는 일련의 하나 이상의 키메라 항원의 생성이 관여되며, 제2 참조 항원의 각각의 아미노산으로 제1 참조 항원의 하나 이상의 아미노산을 대체하기 위해 제1 참조 항원의 아미노산 서열은 제2 참조 항원의 아미노산 서열에 기반하여 체계적으로 변경될 수 있다. 본 맥락에서 "각각의 아미노산"은 이의 서열 정렬 시 제1 참조 항원 및 제2 참조 항원의 서열 내에서 동등한 위치에 있는 아미노산을 의미한다. 이어서, 제1 참조 항원, 제2 참조 항원 및/또는 일련의 하나 이상의 키메라 항원 각각에 대한 시험 항체의 결합이 측정된다. 이후 각 항원에 대한 결합의 손실/증가는 제1 참조 서열 및/또는 제2 참조 서열과 관련하여 수행된 특정 아미노산 변화에 기인할 수 있다. 항체가 제1 참조 항원 및/또는 제2 참조 항원에 결합할 수 있는지 여부는 이미 알려져 있을 수 있다. 예를 들어, 실시예 6에 기재된 바와 같이, 제1 참조 항원은 인간 Vγ4 사슬일 수 있고 제2 참조 항원은 인간 Vγ2 사슬일 수 있으며, 일련의 키메라 항원은 Vγ4 사슬 서열의 하나 이상의 아미노산을 Vγ2 사슬 서열의 각각의 하나 이상의 아미노산으로 대체하여 제조된다.
항체 서열
본 발명의 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 이의 CDR 서열을 참조하여 기재될 수 있다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다:
서열 번호 2-47 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 10 및/또는 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3;
서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 56 및/또는 A9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2; 및/또는
서열 번호 71-116 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 79 및/또는 102와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1.
본 발명의 한 측면에 따르면, 서열 번호 2-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 71-116 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다.
일부 측면에서, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
서열 번호 2-24 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
서열 번호 48-70 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 56과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2); 및/또는
서열 번호 71-93 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 79와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1).
대안적으로 또는 부가적으로, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
서열 번호 25-47 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3);
서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 A9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는
서열 번호 94-116 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 102와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1).
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2-47 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 71-116 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2-47 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1)과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR2를 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 71-116 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR1을 포함한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본원에서 "적어도 80%" 또는 "80% 이상"을 언급하는 구현예는 80% 이상의 모든 값, 예컨대 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함함이 이해될 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 특정된 서열과 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
서열 동일성 백분율 대신에, 구현예는 또한 하나 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 하나 이상의 부가, 치환 및/또는 결실로 정의될 수 있다. 한 구현예에서, 서열은 최대 5개의 아미노산 변화, 예컨대 최대 3개의 아미노산 변화, 특히 최대 2개의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열은 최대 5개의 아미노산 치환, 예를 들어 최대 3개의 아미노산 치환, 특히 최대 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 CDR3은 서열 번호 2-47 중 어느 하나와 비교하여 2개 이하, 보다 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 갖는 서열을 포함하거나 보다 적합하게는 이로 구성될 수 있다.
적합하게는 서열 번호 2-116 및 서열 A1-A23의 상응하는 잔기와 상이한 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 임의의 잔기는 상응하는 잔기에 대한 보존적 치환이다. 예를 들어, 서열 번호 2-47의 상응하는 잔기와 상이한 CDR3의 임의의 잔기는 상응하는 잔기에 대한 보존적 치환이다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역;
(ii) 서열 번호 48-70 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역;
(iii) 서열 번호 71-93 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역;
(iv) 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역;
(v) 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역; 및/또는
(vi) 서열 번호 94-116 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 다음을 갖는 중쇄를 포함한다:
(i) 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역;
(ii) 서열 번호 48-70 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역; 및
(iii) 서열 번호 71-93 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 다음을 갖는 경쇄를 포함한다:
(i) 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역;
(ii) 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역; 및
(iii) 서열 번호 94-116 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 10, 4, 14, 15, 17, 19 또는 23과 같은 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함한다(또는 이로 구성됨). 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 56, 50, 60, 61, 63, 65 또는 69와 같은 서열 번호 48-70 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역을 포함한다(또는 이로 구성됨). 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 79, 73, 83, 84, 86, 88 또는 92와 같은 서열 번호 71-93 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함한다(또는 이로 구성됨).
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 10의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 56의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 79의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 10의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 56의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 79의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 4의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 50의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 73의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 4의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 50의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 73의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 14의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 60의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 83의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 14의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 60의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 83의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 15의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 61의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 84의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 15의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 61의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 84의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 17의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 63의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 86의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 17의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 63의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 86의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 19의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 65의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 88의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 19의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 65의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 88의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 23의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 69의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 92의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 23의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 번호 69의 서열로 구성되며, CDR1은 서열 번호 92의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 33, 27, 37, 38, 40, 42 또는 46과 같은 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다(또는 이로 구성됨). 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 A9, A3, A13, A14, A16, A18 또는 A22와 같은 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역을 포함한다(또는 이로 구성됨). 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 102, 96, 106, 107, 109, 111 또는 115와 같은 서열 번호 94-116 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함한다(또는 이로 구성됨).
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 33의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A9의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 102의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 33의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A9의 서열로 구성되고, CDR1은 서열 번호 102의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 27의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A3의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 96의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 27의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A3의 서열로 구성되고 CDR1은 서열 번호 96의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 37의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A13의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 106의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 37의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A13의 서열로 구성되고, CDR1은 서열 번호 106의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 38의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A14의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 107의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 38의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A14의 서열로 구성되고, CDR1은 서열 번호 107의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 40의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A16의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 109의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 40의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A16의 서열로 구성되고, CDR1은 서열 번호 109의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 42의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A18의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 111의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 42의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A18의 서열로 구성되고, CDR1은 서열 번호 111의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 46의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A22의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 115의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3은 서열 번호 46의 서열로 구성되고, CDR2는 서열 A22의 서열로 구성되고, CDR1은 서열 번호 115의 서열로 구성된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 도 1에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 도 1에 기재된 바와 같은 클론 1140_P01_G08[G4_12] 또는 클론 1139_P01_A04[G4_03]의 하나 이상의(예컨대 모든) CDR 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
(a) 서열 번호 79를 갖는 HCDR1, 서열 번호 56을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 10을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 125를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 102를 갖는 LCDR1, 서열 A9(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 33을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 148을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(b) 서열 번호 86을 갖는 HCDR1, 서열 번호 63을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 17을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 132를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 109를 갖는 LCDR1, 서열 A16(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 40을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 155를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(c) 서열 번호 73을 갖는 HCDR1, 서열 번호 50을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 4를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 119를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 96을 갖는 LCDR1, 서열 A3(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 27을 갖는 LCDR3을 포함하고 임의로 서열 번호 142를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(d) 서열 번호 83을 갖는 HCDR1, 서열 번호 60을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 14를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 129를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 106을 갖는 LCDR1, 서열 A13(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 37을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 152를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(e) 서열 번호 84를 갖는 HCDR1, 서열 번호 61을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 15를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 130을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 107을 갖는 LCDR1, 서열 A14(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 38을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 153을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(f) 서열 번호 88을 갖는 HCDR1, 서열 번호 65를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 19를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 134를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 111을 갖는 LCDR1, 서열 A18(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 42를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 157을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(g) 서열 번호 92를 갖는 HCDR1, 서열 번호 69를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 23을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 138을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 115를 갖는 LCDR1, 서열 A22(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 46을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 161을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(h) 서열 번호 71을 갖는 HCDR1, 서열 번호 48을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 2를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 117을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 94를 갖는 LCDR1, 서열 A1(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 25를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 140을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(i) 서열 번호 72를 갖는 HCDR1, 서열 번호 49를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 3을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 118을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 95를 갖는 LCDR1, 서열 A2(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 26을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 141을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(j) 서열 번호 74를 갖는 HCDR1, 서열 번호 51을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 5를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 120을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 97을 갖는 LCDR1, 서열 A4(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 28을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 143을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(k) 서열 번호 75를 갖는 HCDR1, 서열 번호 52를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 6을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 121을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 98을 갖는 LCDR1, 서열 A5(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 29를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 144를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(l) 서열 번호 76을 갖는 HCDR1, 서열 번호 53을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 7을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 122를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 99를 갖는 LCDR1, 서열 A6(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 30을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 145를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(m) 서열 번호 77을 갖는 HCDR1, 서열 번호 54를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 8을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 123을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 100을 갖는 LCDR1, 서열 A7(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 31을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 146을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(n) 서열 번호 78을 갖는 HCDR1, 서열 번호 55를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 9를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 124를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 101을 갖는 LCDR1, 서열 A8(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 32를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 147을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(o) 서열 번호 80을 갖는 HCDR1, 서열 번호 57을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 11을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 126을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 103을 갖는 LCDR1, 서열 A10(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 34를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 149를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(p) 서열 번호 81을 갖는 HCDR1, 서열 번호 58을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 12를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 127을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 104를 갖는 LCDR1, 서열 A11(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 35를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 150을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(q) 서열 번호 82를 갖는 HCDR1, 서열 번호 59를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 13을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 128을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 105를 갖는 LCDR1, 서열 A12(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 36을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 151을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(r) 서열 번호 85를 갖는 HCDR1, 서열 번호 62를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 16을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 131을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 108을 갖는 LCDR1, 서열 A15(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 39를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 154를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(s) 서열 번호 87을 갖는 HCDR1, 서열 번호 64를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 18을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 133을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 110을 갖는 LCDR1, 서열 A17(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 41을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 156을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(t) 서열 번호 89를 갖는 HCDR1, 서열 번호 66을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 20을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 135를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 112를 갖는 LCDR1, 서열 A19(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 43을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 158을 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(u) 서열 번호 90을 갖는 HCDR1, 서열 번호 67을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 21을 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 136을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 113을 갖는 LCDR1, 서열 A20(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 44를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 159를 포함하거나 이로 구성되는 VL;
(v) 서열 번호 91을 갖는 HCDR1, 서열 번호 68을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 22를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 137을 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 114를 갖는 LCDR1, 서열 A21(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 45를 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 160을 포함하거나 이로 구성되는 VL; 및/또는
(w) 서열 번호 93을 갖는 HCDR1, 서열 번호 70을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 24를 갖는 HCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 139를 포함하거나 이로 구성되는 VH; 및
서열 번호 116을 갖는 LCDR1, 서열 A23(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 47을 갖는 LCDR3을 포함하고, 임의로 서열 번호 162를 포함하거나 이로 구성되는 VL.
적합하게는 상기 언급된 VH 및 VL 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-162 중 어느 하나의 프레임워크 영역과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-162 중 어느 하나의 프레임워크 영역과 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-162 중 어느 하나의 서열을 포함하는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-162 중 어느 하나의 서열로 구성되는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다.
본원에 기재된 항체는 이의 전체 경쇄 및/또는 중쇄 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 117-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 서열 번호 117-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-139 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-139 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 추가 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 125, 119, 129, 130, 132, 134 또는 138 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, VH 영역은 서열 번호 125, 119, 129, 130, 132, 134 또는 138 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 140-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 140-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다. 추가 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 148, 142, 152, 153, 155, 157 또는 161 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, VL 영역은 서열 번호 148, 142, 152, 153, 155, 157 또는 161 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-139 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 140-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 117-139 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 140-162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1140_P01_G08)[G4_12]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 125의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1140_P01_G08)[G4_12]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 148의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 125의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 148의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1139_P01_A04)[G4_3]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 119의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1139_P01_A04)[G4_3]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 142의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 119의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 142의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1248_P02_D10)[G4_16]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 129의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1248_P02_D10)[G4_16]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 152의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 129의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 152의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1254_P01_H04)[G4_18]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 130의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1254_P01_H04)[G4_18]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 153의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 130의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 153의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1254_P02_G02)[G4_20]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 132의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1254_P02_G02)[G4_20]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 155의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 132의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 155의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1253_P03_H05)[G4_23]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 134의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1253_P03_H05)[G4_23]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 157의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 134의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 157의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다(1248_P02_C10)[G4_27]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 138의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다(1248_P02_C10)[G4_27]. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 161의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 138의 아미노산 서열로 구성되는 VH 영역 및 서열 번호 161의 아미노산 서열로 구성되는 VL 영역을 포함한다.
VH 및 VL 영역 둘 다를 포함하는 단편의 경우, 이들은 공유적으로(예를 들어, 디설피드 결합 또는 링커를 통해) 또는 비공유적으로 연합될 수 있다. 본원에 기재된 항체 단편은 scFv, 즉, 링커에 의해 연결된 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, VH 및 VL 영역은 (예를 들어 합성) 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다. 폴리펩티드 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함할 수 있으며, n은 1 내지 8, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 7이다. 폴리펩티드 링커는 [(Gly4Ser)n(Gly3AlaSer)m]p 링커를 포함할 수 있으며, n = 1 내지 8, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 7이고, m = 0 내지 8, 예를 들어 0, 1, 2 또는 3이고, p = 1 내지 8, 예를 들어 1, 2 또는 3이다. 추가 구현예에서, 링커는 서열 번호 186을 포함한다. 추가 구현예에서, 링커는 서열 번호 186으로 구성된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 163-185 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 163-185 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 171, 165, 175, 176, 178, 180 또는 184의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 163-185 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 163-185 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 171, 165, 175, 176, 178, 180 또는 184의 아미노산 서열로 구성된다.
본원에 기재된 바와 같이, 항체는 임의의 형식일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 IgG1 형식이다. 따라서, 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 233-255 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 233-255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 235, 241, 245, 246 또는 254의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 233-255 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 233-255 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 235, 241, 245, 246 또는 254의 아미노산 서열로 구성된다.
대안적으로, 서열 번호 284-306 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 307-329 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 따라서, 서열 번호 284-306 중 어느 하나에 따른 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 307-329 중 어느 하나에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 292에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 315에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_12). 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 286에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 309에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_3). 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 296에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 319에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_16). 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 297에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 320에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_18). 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 299에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 322에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_20). 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 301에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 324에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_23). 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 305에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 328에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다(클론 G4_27). 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 다음을 포함하거나 이로 구성된다:
(a) 서열 번호 284에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 307에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_1);
(b) 서열 번호 285에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 308에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_2);
(c) 서열 번호 287에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 310에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_4);
(d) 서열 번호 288에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 311에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_5);
(e) 서열 번호 289에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 312에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_6);
(f) 서열 번호 290에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 313에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_7);
(g) 서열 번호 291에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 314에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_10);
(h) 서열 번호 293에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 316에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_13);
(i) 서열 번호 294에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 317에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_14);
(j) 서열 번호 295에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 318에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_15);
(k) 서열 번호 298에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 321에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_19);
(l) 서열 번호 300에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 323에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_22);
(m) 서열 번호 302에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 325에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_24);
(n) 서열 번호 303에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 326에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_25);
(o) 서열 번호 304에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 327에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_26); 또는
(p) 서열 번호 306에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 329에 따른 경쇄 아미노산 서열(클론 G4_28).
경쟁 항체
한 구현예에서, γδ TCR의 Vγ4 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 Vγ2 사슬에는 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편은 본원에 정의되거나 예시된 항체 또는 이의 단편과 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 이와 경쟁한다. 당분야에 알려진 일상적인 방법을 사용하여 항체가 참조 항-Vγ4 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 이와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-Vγ4 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건 하에 Vγ4 단백질 또는 펩티드에 결합하도록 허용된다. 다음으로, Vγ4 사슬에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항-Vγ4 항체와의 포화 결합 후 Vγ4에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 참조 항-Vγ4 항체와 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 반면에, 시험 항체가 참조 항-Vγ4 항체와의 포화 결합 후 Vγ4 사슬에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 본 발명의 참조 항-Vγ4 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 또는 본원에 기재된 임의의 예시적인 항체의 CDR 서열을 갖는 항체와 Vγ4로의 결합에 대해 경쟁하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 어느 단백질, 항체 및 기타 길항제가 본 발명의 항체와 Vγ4 사슬로의 결합에 대해 경쟁하고/하거나 에피토프를 공유하는지를 결정하기 위해 본 발명의 항체를 사용하여 경쟁 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 당업자에게 쉽게 알려져 있으며; 이들은 단백질, 예를 들어, Vγ4의 제한된 결합 부위 수에 대한 길항제 또는 리간드 간 경쟁을 평가한다. 항체(또는 이의 단편)는 경쟁 전후에 고정되거나 불용화되며 Vγ4 사슬에 결합된 샘플은 예를 들어 경사분리(항체가 사전 불용화된 경우) 또는 원심분리(항체가 경쟁 반응 후에 침전된 경우)에 의해, 미결합 샘플로부터 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 기능이 단백질에 대한 항체의 결합 또는 결합의 부재에 의해 변경되는지 여부, 예를 들어 항체 분자가 예를 들어 표지의 효소 활성을 억제하거나 강화하는지 여부에 의해 결정될 수 있다. ELISA 및 기타 기능적 검정이 당분야에 알려지고 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
2개의 항체는 각각이 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 이상 과량의 하나의 항체는 다른 항체의 결합을 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 억제한다. 대안적으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 표적 항원에서의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 또한 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다.
이어서 관찰된 시험 항체의 결합 부재가 참조 항체와 실제로 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합 부재에 관여되는지를 확인하기 위해 추가적인 일상적 실험(예를 들어, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 당분야에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다.
항체 서열 변형
항체 및 이의 단편은 알려진 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 본원에 기재된 항체 분자에 대한 서열 변형은 당업자에 의해 용이하게 포함될 수 있다. 하기 예는 비제한적이다.
항체 발견 및 파지 라이브러리로부터의 서열 회수 동안, 원하는 항체 가변 도메인은 서브-클로닝에 의해 전장 IgG로 재형식화될 수 있다. 이 과정을 가속화하기 위해 가변 도메인은 종종 제한 효소를 사용하여 전달된다. 이러한 제한 부위는 추가/대안적 아미노산을 도입하고 정규 서열에서 멀어질 수 있다(이러한 정규 서열은 예를 들어 국제 ImMunoGeneTics[IMGT] 정보 시스템에서 찾을 수 있음, http://www.imgt.org 참조). 이들은 카파 또는 람다 경쇄 서열 변형으로 도입될 수 있다.
카파 경쇄 변형
카파 경쇄 가변 서열은 전장 IgG로 재형식화하는 동안 제한 부위(예를 들어, Nhe1-Not1)를 사용하여 클로닝될 수 있다. 보다 구체적으로, 카파 경쇄 N-말단에서 클로닝을 지원하기 위해 추가 Ala-Ser 서열이 도입되었다. 바람직하게는, 이후 이 추가 AS 서열은 정규 N-말단 서열을 생성하기 위해 추가 개발 동안 제거된다. 따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 카파 경쇄 포함 항체는 이의 N-말단에 AS 서열을 포함하지 않으며, 즉 서열 번호 140-147 및 156-158은 초기 AS 서열을 포함하지 않는다. 이 구현예가 또한 이 서열을 포함하는 본원에 포함된 다른 서열에 적용된다는 것이 이해될 것이다.
클로닝을 지원하기 위해 추가 아미노산 변경이 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체의 경우, 카파 경쇄 가변 도메인/불변 도메인 경계에서 전장 서열을 제조할 때 클로닝을 지원하기 위해 발린에서 알라닌으로의 변경이 도입되었다. 그 결과 카파 불변 도메인 변형을 생성했다. 특히 이것은 RTAAAPS(NotI 제한 부위로부터)로 시작하는 불변 도메인을 생성한다. 바람직하게는, 이 서열은 RTVAAPS로 시작하는 정규 카파 경쇄 불변 영역을 생성하기 위해 추가 개발 동안 변형될 수 있다. 이러한 변형은 항체의 기능적 특성을 변경하지 않는다. 따라서, 한 구현예에서 본원에 기재된 카파 경쇄 포함 항체는 서열 RTV로 시작하는 불변 도메인을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 서열 번호 233-240, 249-251, 307-314 및 323-325의 서열 RTAAAPS는 서열 RTVAAPS로 대체된다. 바람직한 카파 경쇄 불변 도메인 동종이형을 포함하는 바람직한 구현예에서, 카파 경쇄 불변 도메인은 서열 번호 330에 따른 아미노산 서열을 가지며 본원에 개시된 임의의 경쇄 가변 도메인과 조합될 수 있다.
람다 경쇄 변형
위의 카파 예와 유사하게, 람다 경쇄 가변 도메인은 전장 IgG로 재형식화하는 동안 제한 부위(예를 들어, Nhe1-Not1)를 도입함으로써 클로닝될 수도 있다. 보다 구체적으로, 람다 경쇄 N-말단에서, 클로닝을 지원하기 위해 추가 Ala-Ser 서열이 도입될 수 있다. 바람직하게는, 이후 이 추가 AS 서열은 정규 N-말단 서열을 생성하기 위해 추가 개발 동안 제거된다. 따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 람다 경쇄 포함 항체는 이의 N-말단에 AS 서열을 포함하지 않으며, 즉 서열 번호 148-155 및 159-162는 초기 AS 서열을 포함하지 않는다. 이 구현예가 또한 이 서열을 포함하는 본원에 포함된 다른 서열에 적용된다는 것이 이해될 것이다.
또 다른 예로서, 람다 경쇄 가변 도메인/불변 도메인 경계에서 본원에 기재된 항체의 경우, 전장 서열을 제조할 때 클로닝을 지원하기 위해 라이신에서 알라닌으로의 서열 변경이 도입되었다. 이는 람다 불변 도메인 변형을 초래했다. 특히 이는 GQPAAAPS(NotI 제한 부위로부터)로 시작하는 불변 도메인을 초래한다. 바람직하게는, 이 서열은 GQPKAAPS를 시작하는 정규 람다 경쇄 불변 영역을 생성하기 위해 추가 개발 동안 변형될 수 있다. 이러한 변형은 항체의 기능적 특성을 변경하지 않는다. 따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 람다 경쇄 포함 항체는 서열 GQPK로 시작하는 불변 도메인을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 서열 번호 241-248, 252-255, 315-322 및 326-329의 서열 GQPAAAPS는 서열 GQPKAAPS로 대체된다. 바람직한 람다 경쇄 불변 도메인 동종이형을 포함하는 바람직한 구현예에서, 람다 경쇄 불변 도메인은 서열 번호 331에 따른 아미노산 서열을 갖고 본원에 개시된 임의의 경쇄 가변 도메인과 조합될 수 있다.
람다 및 카파 경쇄 변형
서열 번호 140-162로서 본원에 개시된 람다 및/또는 카파 경쇄 가변 도메인으로부터 N-말단 AS 잔기의 제거에 관한 상기 개시의 관점에서, 본 발명의 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편은 N-말단 AS 잔기가 없는 서열 번호 140-162에 상응하는 서열 번호 번호 261-283 중 어느 하나에 따른 경쇄 가변(VL) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 서열 번호 140-162 중 하나 이상에 따른 VL 아미노산 서열에 대한 본 명세서에서의 임의의 언급은 각각 서열 번호 번호 261-283에 따른 VL 아미노산 서열로 치환될 수 있으며, 이러한 모든 구현예가 본원에 개시된다. 예시로서, 서열 번호 148에 따른 경쇄 가변 도메인(클론 G4_12로부터 유래됨)에 대한 본원의 언급은 서열 번호 269에 대한 언급으로 치환될 수 있다.
중쇄 변형
전형적으로 인간 가변 중쇄 서열은 염기성 글루타민(Q) 또는 산성 글루타메이트(E)로 시작한다. 그러나 이후 이러한 서열은 모두 산성 아미노산 잔기인 피로글루타메이트(pE)로 전환되는 것으로 알려져 있다. Q에서 pE로의 전환은 항체에 대한 전하 변경을 초래하는 반면, E에서 pE로의 전환은 항체의 전하를 변경하지 않는다. 따라서 경시적인 가변 전하 변경을 피하기 위해, 한 가지 옵션은 처음에 Q에서 E로 시작 중쇄 서열을 변형하는 것이다. 따라서, 한 구현예에서, 중쇄의 N-말단에 Q 잔기를 갖는 본원에 기재된 항체의 중쇄는 N-말단에 Q에서 E로의 변형을 포함할 수 있다. 특히, 서열 번호 118, 120, 124, 126, 132, 133, 135, 137, 138 및/또는 139 중 임의의 것의 초기 잔기가 Q에서 E로 변형될 수 있다. 이러한 구현예가 이 서열을 포함하는 본원에 포함된 다른 서열(즉, 이들 서열을 예를 들어 전장 항체 또는 이의 단편 내로 통합하는 임의의 구현예)에 적용된다는 것이 또한 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 중쇄의 N-말단에서 E 잔기를 Q 잔기로 치환하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 서열 번호 117, 119, 121-123, 125, 127-131, 134 및/또는 136 중 어느 하나의 N-말단에서 E 잔기는 Q 잔기로 치환될 수 있다.
또한, IgG1 불변 도메인의 C-말단은 PGK로 끝난다. 그러나 이후 말단 염기성 라이신(K)은 발현 동안 종종 절단된다(예를 들어, CHO 세포에서). 이것은 다시 C-말단 라이신 잔기의 다양한 손실을 통해 항체에 대한 전하 변경을 초래한다. 따라서 한 가지 옵션은 처음에 라이신을 제거하여 PG로 끝나는 균일하고 일관된 중쇄 C-말단 서열을 생성하는 것이다. 따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 그 C-말단으로부터 말단 K가 제거된다. 특히, 본 발명의 항체는 말단 라이신 잔기가 제거된 서열 번호 233-255 또는 284-306 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
임의의 동종이형 변형
항체 발견 동안, 특정 인간 동종이형이 사용될 수 있다. 임의로, 항체는 개발 동안 다른 인간 동종이형으로 전환될 수 있다. 비제한적인 예로서, 카파 사슬에 대해 3개의 Km 대립유전자(동종이형 넘버링 사용)를 정의하는 Km1, Km1,2 및 Km3으로 지정된 3개의 인간 동종이형이 있다: Km1은 발린153(IMGT V45.1) 및 류신 191(IMGT L101)과 상관관계가 있으며; Km1,2는 알라닌 153(IMGT A45.1) 및 류신 191(IMGT L101)과 상관관계가 있고; Km3은 알라닌 153(IMGT A45.1) 및 발린 191(IMGT V101)과 상관관계가 있다. 임의로, 이에 따라 표준 클로닝 접근에 의해 한 동종이형에서 또 다른 동종이형으로 서열을 변형할 수 있다. 예를 들어 L191V(IMGT L101V) 변경은 Km1,2 동종이형을 Km3 동종이형으로 전환할 것이다. 이러한 동종이형에 대한 추가 언급은 본원에 참조로 포함되는 Jefferis and Lefranc (2009) MAbs 1(4):332-8을 참조한다.
따라서 한 구현예에서 본원에 기재된 항체는 동일한 유전자의 또 다른 인간 동종이형으로부터 유래된 아미노산 치환을 포함한다. 추가 구현예에서, 항체는 c-도메인을 km1,2에서 km3 동종이형으로 전환하기 위해 카파 사슬에 대한 L191V(IMGT L101V) 치환을 포함한다.
바람직한 카파 경쇄 불변 도메인 동종이형을 포함하는 바람직한 구현예에서, 카파 경쇄 불변 도메인은 서열 번호 330에 따른 아미노산 서열을 가지며 본원에 개시된 임의의 경쇄 가변 도메인과 조합될 수 있다. 바람직한 람다 경쇄 불변 도메인 동종이형을 포함하는 대안적인 바람직한 구현예에서, 람다 경쇄 불변 도메인은 서열 번호 331에 따른 아미노산 서열을 갖고 본원에 개시된 임의의 경쇄 가변 도메인과 조합될 수 있다.
항체 결합
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 3.0 x 10-7 M(즉, 300 nM) 미만 또는 1.5 x 10-7 M(즉, 150 nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 결합 친화도(KD)로 γδ TCR의 Vγ4 사슬에 결합할 수 있다. 추가 구현예에서, KD는 1.3 x 10-7 M(즉, 130 nM) 이하, 예컨대 1.0 x 10-7 M(즉, 100 nM) 이하이다. 또 다른 구현예에서, KD는 6.0 x 10-8 M(즉, 60 nM) 미만, 예컨대 5.0 x 10-8 M(즉, 50 nM) 미만, 4.0 x 10-8 M(즉, 40 nM) 미만, 3.0 x 10-8 M(즉, 30 nM) 미만 또는 2.0 x 10-8 M(즉, 20 nM) 미만이다. 추가 구현예에서, KD는 1.0 x 10-8 M(즉, 10 nM) 이하, 예컨대 5.0 x 10-9 M(즉, 5 nM) 이하, 4.0 x 10-9 M(즉, 4 nM) 이하, 3.0 x 10-9 M(즉, 3 nM) 이하, 2.0 x 10-9 M(즉, 2 nM) 이하, 또는 1.0 x 10-9 M(즉, 1 nM) 이하일 수 있다. 예를 들어, 한 측면에 따르면, 1.5 x 10-7 M(즉, 150 nM) 미만의 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 결합 친화도(KD)로 γδ TCR의 Vγ4 사슬에 결합하는 (예를 들어, 인간) 항-Vγ4 항체가 제공된다.
본 발명의 한 측면에서, 4.0 x 10-8 M(즉, 40 nM) 미만, 3.0 x 10-8 M(즉, 30 nM) 미만 또는 2.0 x 10-8 M(즉, 20 nM) 미만의 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 결합 친화도(KD)로 γδ TCR의 Vγ4 사슬에 결합하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도는 항체 또는 이의 단편을 센서(예를 들어, 아민 고용량 칩 또는 동등물)의 표면 상에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 항-인간 IgG Fc로의 포획에 의해) 코팅함으로써 확립되며, 항체 또는 이의 단편(즉, γδ TCR의 Vγ4 사슬)에 의해 결합된 표적은 결합을 검출하기 위해 칩 위로 흘려진다. 대안적인 구현예에서, 항원은 센서의 표면 상에 직접적으로 또는 간접적으로 코팅될 수 있고, 이후 그 위에 시험 항체 또는 이의 단편이 흘려진다. 당업자는 적합한 시험 조건을 잘 결정할 수 있다. 예를 들어, 적합하게는 MASS-2 기기(Sierra SPR-32로도 지칭될 수 있음)가 25℃에서 PBS + 0.02% Tween 20 실행 완충액 중 30 μl/분으로 사용될 수 있다. 다른 적합한 구현예에서, Reichert 4SPR 기기가 실온(예를 들어, 25℃)에서 PBS + 0.05% Tween 20 중 25 μl/분의 유속으로 사용될 수 있다.
항체 기능적 특성화
항체 기능을 정의하기 위해 사용될 수 있는 검정이 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편은 γδ TCR 연루에 의해, 예를 들어 항체 결합 시 γδ TCR의 하향조절 및/또는 항체 결합 시 CD69 표면 발현의 상향조절을 측정함으로써 평가될 수 있다. 항체 또는 이의 단편(임의로 세포 표면 상에 제시됨)의 적용 후 γδ TCR 또는 CD69의 표면 발현은 예를 들어 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 이의 단편은 또한 γδ T 세포 탈과립을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 탈과립에 대한 마커인 CD107a의 발현이 항체 또는 이의 단편(임의로 세포 표면 상에 제시됨)의 γδ T 세포로의 적용 후, 예를 들어 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편은 또한 γδ T 세포-매개 사멸 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다(γδ T 세포의 사멸 활성, 즉 항체가 표적 세포를 직접적으로 또는 간접적으로 죽이기 위해 γδ T 세포를 유도하는 항체의 능력에 영향을 미치는지 시험하기 위해). 예를 들어, 표적 세포는 항체 또는 이의 단편(임의로 세포 표면 상에 제시됨)의 존재 하에 γδ T 세포와 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후, 배양은 살아있는 표적 세포와 죽은 표적 세포를 구별하기 위해 세포 생활성 염료로 염색될 수 있다. 그런 다음 죽은 세포의 비율이, 예를 들어 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 검정에 사용된 항체 또는 이의 단편은 표면, 예를 들어 Fc 수용체를 포함하는 세포와 같은 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 TIB 202™ 세포(American Type Culture Collection(ATCC)에서 이용 가능)와 같은 THP-1 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 이의 단편은 검정에서 직접 사용될 수 있다.
이러한 기능적 검정에서, 산출물은 "EC50" 또는 "50%에서의 유효 농도"로도 지칭되는 최대 농도의 절반을 계산하여 측정될 수 있다. 용어 "IC50"은 억제 농도를 지칭한다. EC50 및 IC50 둘 모두는 유세포 분석 방법과 같은 당분야에 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 의혹을 피하기 위해, 본 출원에서 EC50의 값은 IgG1 형식화된 항체를 사용하여 제공된다. 이러한 값은 하기와 같이 동등한 값에 대한 항체 형식의 분자량에 기반하여 쉽게 전환될 수 있다.
(μg/ml) / (MW(kDa)) = μM
밀리리터는 본원에서 "ml" 또는 "mL"로 표시될 수 있고 상호교환적으로 사용될 수 있다.
항체(또는 단편) 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50은 0.5 μg/ml 미만, 예컨대 0.4 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.2 μg/ml, 0.15 μg/ml, 0.1 μg/ml 또는 0.05 μg/ml 미만일 수 있다. 특히, 상기 EC50 값은 항체가 IgG1 형식으로 측정될 때의 값이다. 예를 들어, EC50 γδ TCR 하향조절 값은 유세포 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 탈과립에 대한 EC50은 0.05 μg/ml 미만, 예컨대 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.01 μg/ml 또는 0.008 μg/ml 미만일 수 있다. 특히, 상기 EC50 값은 항체가 IgG1 형식으로 측정될 때의 값이다. 예를 들어, γδ T 세포 탈과립 EC50 값은 유세포 분석을 사용하여 CD107a 발현(즉, 세포 탈과립 마커)을 검출함으로써 측정될 수 있다. 한 구현예에서, CD107a 발현은 항-인간 CD107a BV421(클론 H4A3)(BD Biosciences)과 같은 항-CD107a 항체를 사용하여 측정된다.
항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포-매개 사멸에 대한 EC50은 0.5 μg/ml 미만, 예컨대 0.4 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.2 μg/ml, 0.15 μg/ml 미만, 0.1 μg/ml 또는 0.07 μg/ml 미만일 수 있다. 특히, 상기 EC50 값은 항체가 IgG1 형식으로 측정될 때의 값이다. 예를 들어, EC50 γδ T 세포-매개 사멸 값은 항체, γδ T 세포 및 표적 세포의 인큐베이션 후 유세포 분석을 사용하여 죽은 세포의 비율을 검출함으로써(즉, 세포 생활성 염료를 사용하여) 측정될 수 있다. 한 구현예에서, 표적 세포의 사멸은 세포 생활성 염료인 Viability Dye eFluor™ 520(ThermoFisher)을 사용하여 측정된다.
이들 측면에서 기재된 검정에서, 항체 또는 이의 단편은 THP-1 세포, 예를 들어 TIB-202™(ATCC)와 같은 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. THP-1 세포는 임의로 CellTracker™ Orange CMTMR(ThermoFisher)과 같은 염료로 표지된다.
면역접합체
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 세포독소 또는 화학치료제와 같은 치료적 모이어티에 접합될 수 있다. 이러한 접합체는 면역접합체로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "면역접합체"는 세포독소, 방사성 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 독소, 펩티드 또는 단백질 또는 치료제와 같은 또 다른 모이어티에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 항체 또는 이의 단편은 그 표적에 결합할 수 있는 한, 분자를 따라 임의의 위치에서 세포독소, 방사성 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 독소, 펩티드 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역접합체의 예는 항체-약물 접합체 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 Vγ4에 대한 제2의 상이한 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포에 특이적인 제제에 접합될 수 있다. 항-Vγ4 항체에 접합될 수 있는 치료적 모이어티의 유형은 치료받을 병태 및 달성되기 원하는 치료 효과를 고려할 것이다.
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 단일-특이적일 수 있거나 추가 표적에 결합할 수 있으므로 이중-특이적 또는 다중-특이적일 수 있다. 다중-특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나 하나 초과의 표적 폴리펩티드에 대해 특이적일 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 Vγ4에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다.
제2 결합 특이성은 Vγ4와 동일한 세포 상의 또는 동일한 조직 유형 또는 상이한 조직 유형의 상이한 세포 상의 항원을 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 에피토프는 상이한 T-세포, B-세포, 종양 세포, 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 포함하는 상이한 세포 상에 있을 수 있다. 대안적으로, 표적 에피토프는 동일한 세포 상에 있을 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 항-Vγ4 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 187-232와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 187-209의 VH 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 210-232의 VL 영역을 포함한다. 추가 구현예에서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 187-232를 포함하거나 이로 구성된다. 추가 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 cDNA가 제공된다.
한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204, 208, 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231과 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204, 또는 208의 VH 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231의 VL 영역을 포함한다. 추가 구현예에서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204, 208, 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231, 특히 서열 번호 195 및/또는 218; 또는 서열 번호 189 및/또는 212를 포함하거나 이로 구성된다. 추가 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 cDNA가 제공된다.
본 발명의 한 측면에서, 암호화된 면역글로불린 사슬 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 암호화하는 서열 번호 187-232의 부분 중 어느 하나와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 암호화된 면역글로불린 사슬 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 암호화하는 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204, 208, 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231의 부분 중 어느 하나와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 한 측면에서, 암호화된 면역글로불린 사슬 가변 도메인의 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4를 암호화하는 서열 번호 187-232의 부분 중 어느 하나와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성 갖는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 암호화된 면역글로불린 사슬 가변 도메인의 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4를 암호화하는 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204, 208, 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231의 부분 중 어느 하나와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
항체 또는 이의 단편을 발현하기 위해, 본원에 기재된 바와 같이 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 유전자가 전사 및 번역 제어 서열(이는 당분야에서 잘 이해되는 '발현 카세트'로 명명될 수 있음)에 작동 가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입된다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 한 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204 또는 208 중 어느 하나와 같은 서열 번호 187-209 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231 중 어느 하나와 같은 서열 번호 210-232 중 어느 하나의 VL 영역을 포함한다. 이러한 발현 벡터 또는 카세트는 쌍으로 사용되어, 본원에 개시된 본 발명의 항체를 제공하는 다양한 아미노산 서열의 쌍 형성에 따라 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 적합하게 쌍으로 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 187-209 중 어느 하나(가변 중쇄 영역을 암호화함)와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 추가로 서열 번호 210-232 중 어느 하나(가변 경쇄 영역을 암호화함)와 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다시, 서열은 본 발명의 항체를 암호화하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 특이적 쌍으로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 임의로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 본원에 개시된 임의의 변이체 항체 서열을 포함하는 본원에 개시된 모든 항체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 그리고 발현 벡터 및 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터는 또한 암호화된 아미노산 서열을 참조하여 기재될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 내지 186, 233-260 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
돌연변이는 폴리펩티드의 아미노산 서열로서는 침묵하지만 특정 숙주에서 번역을 위한 바람직한 코돈을 제공하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 cDNA로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 대장균 및 S. 세레비시애(S. cerevisiae)뿐만 아니라 포유류, 특히 인간에서 핵산의 번역을 위해 바람직한 코돈이 알려져 있다.
폴리펩티드의 돌연변이는 예를 들어 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 대한 치환, 부가 또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 대한 치환, 부가 또는 결실은 예를 들어 오류가 발생하기 쉬운 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 어셈블리 PCR, PCR 돌연변이유발, 생체내 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 반복적 앙상블 돌연변이유발, 지수적 앙상블 돌연변이유발, 부위 특이적 돌연변이유발, 유전자 재조립, 인공 유전자 합성, 유전자 부위 포화 돌연변이유발(GSSM), 합성 결찰 재조립(SLR) 또는 이들 방법의 조합을 포함하는 많은 방법에 의해 도입될 수 있다. 핵산에 대한 변형, 부가 또는 결실은 또한 재조합, 반복적 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발, 우라실-함유 주형 돌연변이유발, 갭 포함(gapped) 이중체 돌연변이유발, 점 미스매치 복구 돌연변이유발, 복구-결핍 숙주 균주 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 방사성 돌연변이유발, 결실 돌연변이유발, 제한-선택 돌연변이유발, 제한-정제 돌연변이유발, 앙상블 돌연변이유발, 키메라 핵산 다량체 생성, 또는 이의 조합을 포함하는 방법에 의해 도입될 수 있다.
특히 인공 유전자 합성이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 예를 들어 고상 DNA 합성에 의해 합성적으로 생산될 수 있다. 전체 유전자는 전구체 주형 DNA가 필요 없이 새로 합성될 수 있다. 원하는 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위해, 빌딩 블록은 산물의 서열에 필요한 순서대로 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬에 순차적으로 커플링된다. 사슬 조립의 완료 시, 산물은 고상으로부터 용액으로 방출되고, 탈보호되고, 수집된다. 산물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 단리되어 원하는 올리고뉴클레오티드를 고순도로 수득할 수 있다.
발현 벡터는 예를 들어 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래 에피솜을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 벡터 내에 결찰된다. 발현 및/또는 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 코딩 서열에 대해 5' 시작 코돈(즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 따라서, 본 발명은 합성 링커(서열 번호 186을 암호화함)에 의해 연결된 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는, 서열 번호 163-185 중 어느 하나에 따른 본 발명의 단일쇄 가변 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 VH 영역, VL 영역 또는 둘 모두(임의로 링커를 포함함)를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, VH 및 VL 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 별도의 벡터 내에 삽입될 수 있으며, 대안적으로 두 영역을 모두 암호화하는 서열이 동일한 발현 벡터 내에 삽입된다. 폴리뉴클레오티드(들)는 표준 방법(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내에 삽입된다.
편리한 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위와 함께, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호화하는 벡터이다. 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체(또는 이의 단편)의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드가 항체의 아미노 말단과 같은-프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 숙주 세포)가 제공된다. 세포가 항체 또는 이의 단편의 경쇄를 암호화하는 제1 벡터, 및 항체 또는 이의 단편의 중쇄를 암호화하는 제2 벡터를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄는 모두 세포 내로 도입된 동일한 발현 벡터 상에서 암호화될 수 있다.
한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 항체 또는 이의 단편에 융합된 막 앵커 또는 막횡단 도메인을 암호화하고, 항체 또는 이의 단편은 세포의 세포외 표면 상에 제시된다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 포유류 세포 내에 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 형질도입, 리포솜 내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 생물학적 주입 및 DNA의 핵 내로의 직접적 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포 내로 도입될 수 있다.
발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유류 세포주는 당분야에 잘 알려져 있고, 미국 유형 배양 컬렉션(ATCC)으로부터 이용 가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유류 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 선호되는 세포주는 높은 발현 수준을 갖는 세포주의 결정을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포주, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. scFv 및 Fv 단편과 같은 항체의 항원 결합 단편은 당분야에 알려진 방법을 사용하여 대장균에서 단리 및 발현될 수 있다.
항체는 숙주 세포에서 항체의 발현, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체 분비를 허용하기 충분한 시기 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체(또는 단편)는 예를 들어 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2012) 4th Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시된 기법을 사용하여 수득되고 조작될 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여, 특정 항체-생산 B 세포를 조직 배양에서 성장하는 능력 및 항체 사슬 합성의 부재로 인해 선택된 골수종(B 세포암) 세포와 융합함으로써 생산될 수 있다.
결정된 항원에 대한 모노클로날 항체는 예를 들어 다음 단계에 의해 수득될 수 있다:
a) 하이브리도마를 형성하기 위해, 결정된 항원, 불멸 세포, 바람직하게는 골수종 세포로 이전에 면역화된 동물의 말초 혈액으로부터 수득된 림프구를 불멸화하는 단계,
b) 형성된 불멸화된 세포(하이브리도마)를 배양하고 원하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포를 회수하는 단계.
대안적으로, 하이브리도마 세포를 사용할 필요가 없다. 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원에 결합할 수 있는 항체는 예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 당분야에 알려진 포유류 디스플레이 기술을 사용하여, 일상적인 실행을 통해 적합한 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체는 예를 들어 다음 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다:
a) 벡터, 특히 파지, 보다 특히 사상 박테리오파지 내로, 림프구, 특히 동물의 말초 혈액 림프구(결정된 항원으로 적합하게 이전에 면역화됨)로부터 수득된 DNA 또는 cDNA 서열을 클로닝하는 단계,
b) 항체의 생산을 허용하는 조건에서 상기 벡터로 원핵 세포를 형질전환하는 단계,
c) 항체로 항원-친화도 선택을 거쳐, 항체를 선택하는 단계,
d) 원하는 특이성을 갖는 항체를 회수하는 단계.
임의로, 본원에 기재된 바와 같고 γδ T 세포의 Vγ4 사슬에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 또한 질환의 징후 또는 증상을 완화하기 위한 약제로 사용되기 충분한 양을 만들기 위해 용이하게 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 약제로 사용될 때, 전형적으로 관심 폴리뉴클레오티드는 먼저 대상체 또는 환자에서 상기 항체 또는 이의 단편을 발현하도록 설계된 발현 벡터 또는 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 발현 카세트 및 폴리뉴클레오티드의 전달 방법 또는 때때로 '핵 기반' 약제로 명명되는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. 최근 리뷰는 Hollevoet and Declerck (2017) J. Transl. Med. 15(1): 131을 참조한다.
또한, 본 발명의 숙주 세포를 세포 내부에서 플라스미드 또는 벡터의 암호화 핵산 서열을 발현하는 조건 하에 세포 배양 배지 중에 배양하는 단계를 포함하는, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 생산 방법이 제공된다. 방법은 세포 배양 상청액으로부터 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 변이체를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 수득된 항원 결합 분자는 그 후 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 추가로, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포를 본 발명의 플라스미드 또는 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 상기 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 이어서, 상기 세포는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 생산을 위해 배양될 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 이러한 구현예에서, 조성물은 임의로 다른 부형제와 조합하여 항체를 포함할 수 있다. 또한 하나 이상의 추가 활성제(예를 들어, 본원에 언급된 질환을 치료하기 적합한 활성제)를 포함하는 조성물이 포함된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본 발명의 항체는 대상체로의 투여에 적합한 약학 조성물 내에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약학 조성물은 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 식염수, 염, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상 뿐만 아니라 이의 조합을 포함한다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가 알코올 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 수화제와 같은 약학적으로 허용 가능한 물질 또는 항체 또는 이의 단편의 저장 수명 또는 효과를 향상시키는 수화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 소량의 보조 물질이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이는 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여형, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사 가능한 및 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 적용에 의존한다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액 형태이다.
바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균이고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 질환의 치료에 일반적으로 사용되는 다른 확립된 치료법에 대한 보조로서 또는 이와 함께, 이러한 질환의 치료를 위한 치료 방법에서 본 발명의 약학 조성물을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 추가 측면에서, 항체, 조성물 또는 약학 조성물은 적어도 하나의 활성제와 순차적으로, 동시에 또는 별도로 투여된다.
치료 방법
본 발명의 추가 측면에 따르면, 약제로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 치료법에 사용하기 위한 것이다. 특히, 항체 또는 이의 단편은 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 암 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 약제로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 약학 조성물이 제공된다. 한 구현예에서, 약학 조성물은 치료법에 사용하기 위한, 특히 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약학 조성물은 암 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 다양한 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 것은 γδ T 세포로의 결합 또는 이의 표적화, γδ T 세포의 활성화, γδ T 세포의 증대 유도 또는 증가, γδ T 세포의 증식 유도 또는 증가, γδ T 세포 탈과립 유도 또는 증가, γδ T 세포-매개 사멸 활성 유도 또는 증가를 포함한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 대안적으로, 치료 유효량의 약학 조성물이 투여된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 예를 들어 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에서 약제의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공된다.
항체 또는 이의 단편의 용도
본 발명의 추가 측면에 따르면, γδ T 세포(특히 Vγ4 T 세포)의 항원 인식, 활성화, 신호 전달 또는 기능을 연구하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 항체는 γδ T 세포 기능을 조사하기 위해 사용될 수 있는 검정에서 활성인 것으로 나타났다. 이러한 항체는 또한 γδ T 세포의 증대를 유도하는 데 유용할 수 있으므로, γδ T 세포(예를 들어, Vγ4 T 세포)를 증식시키는 방법에 사용될 수 있다.
Vγ4 사슬에 결합하는 항체는 γδ T 세포를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지되거나 샘플에서 Vγ4 T 세포를 선택적으로 검출 및/또는 단리하기 위한 포획 리간드로 사용될 수 있다. 표지된 항체는 당분야에 알려진 많은 방법, 예를 들어 면역조직화학 및 ELISA에서 사용된다.
검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광 또는 화학발광 모이어티; 또는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 루시퍼라제와 같은 효소일 수 있다. 이어서, 본 발명의 항체에 적용된 형광 표지는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법에 사용될 수 있다.
항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법
항체를 생성하는 데 사용하기 위한 가용성 TCR이 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 개발 전에는, Vγ4 사슬, 특히 인간 Vγ4 사슬에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 개발하는 것이 통상적으로 불가능할 것이라고 여겨졌다. 이것은 γδ TCR의 인간 Vγ4 사슬 및 인간 Vγ2 사슬 간 고도의 서열 유사성(91%) 때문이었다. 이러한 상당한 난제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 특정 항원 및 방법론을 개발하였다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 데 사용하기 위한 서열 번호 256과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원이 제공된다.
항원 제조 공정의 또 다른 중요한 측면은 단백질로의 발현하기 적합한 항원을 설계하는 것이었다. γδ TCR은 사슬간 및 사슬내 디설피드 결합이 있는 이종이량체가 관여되는 복합 단백질이다. 류신 지퍼(LZ) 형식 및 Fc 형식이 파지 디스플레이 선택에서 사용될 가용성 TCR 항원을 생성하기 위해 사용되었다. 따라서, 본 발명은 또한 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 데 사용하기 위한 서열 번호 257 또는 258과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원을 제공한다.
또한, 감마 델타(γδ) T 세포는 CDR3 폴리클론성을 갖는 폴리클론날 세포이다. 생성된 항체가 CDR3 서열에 대해 선택되는 상황(CDR3 서열은 TCR 클론과 TCR 클론마다 다를 것이기 때문에)을 피하기 위해, 항원 설계에는 상이한 형식으로 일관된 CDR3을 유지하는 것이 관여되었다. 이 설계는 생식계열에서 암호화되므로 모든 클론에서 동일한 감마-4 가변 도메인 내 서열을 인식하는 항체를 생성하여 γδ T 세포의 더 넓은 하위세트를 인식하는 항체를 제공하는 것을 목표로 했다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법이 제공된다:
(i) Vγ4의 CDR3 서열이 시리즈의 모든 항원에 대해 동일한, TCR 감마 가변 4(Vγ4) 아미노산 서열을 포함하는 항원 시리즈를 설계하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 설계된 제1 항원을 항체 라이브러리에 노출시키는 단계(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해);
(iii) 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계;
(iv) 단리된 항체 또는 이의 단편을 단계 (i)에서 설계된 제2 항원에 노출시키는 단계; 및
(v) 제1 항원 및 제2 항원 모두에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계.
TRGV4 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 번호 1의 아미노산 1-99에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 인간 TRGV4에 상응한다. 본원에 기재된 항원 시리즈는 또한 상이한 형식의 항원(즉, TCR 감마 가변 4 사슬)을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 항원은 합성/재조합 항원일 수 있다. 예를 들어, 항원은 류신 지퍼 또는 Fc 융합체로 제시될 수 있다. 한 구현예에서, TCR 감마 가변 4(Vγ4) 아미노산 서열은 서열 번호 256을 포함한다. 한 구현예에서, TCR Vγ4 아미노산 서열은 서열 번호 257을 포함한다. 한 구현예에서, TCR Vγ4 아미노산 서열은 서열 번호 258을 포함한다.
항원은 또한 단백질 발현을 돕기 위한 추가 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 재조합 TCR 항원은 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역에 융합될 수 있다(Xu et al. (2011) PNAS 108: 2414-2419 참조).
한 구현예에서, 방법은 단리된 항체 또는 이의 단편을 상이한 감마 가변 사슬, 예컨대 감마 가변 2(Vγ2) 또는 감마 가변 8(Vγ8)을 갖는 γδ TCR을 포함하는 제2 항원 시리즈에 노출시키는 단계, 및 이어서 제2 항원 시리즈에도 결합하는 항체 또는 이의 단편을 선택해제하는 단계를 추가로 포함한다. 특히, 방법은 감마 가변 2(Vγ2) 사슬을 갖는 γδ TCR을 포함하는 제2 항원 시리즈에 단리된 항체 또는 이의 단편을 노출시키는 단계 및 제2 항원 시리즈에도 결합하는 항체 또는 이의 단편을 선택해제하는 단계를 포함한다. 이미 주지된 바와 같이, Vγ4 및 Vγ2의 서열 간 높은 동일성 백분율(약 91%)이 있으므로, 이는 Vγ4에 특이적인 항체가 선택되도록 보장한다. 한 구현예에서, 제2 항원 시리즈는 Vγ2 사슬을 갖는 γδ TCR을 포함한다. TRGV2 및 TRGV8 아미노산 서열은 바람직하게는 각각 서열 번호 335 및 336에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 인간 TRGV2 및 TRGV8에 상응한다. TCR 감마 가변 4 사슬와 관련하여 상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 TRGV2 및 TRGV8 항원 시리즈는 또한 상이한 형식의 항원을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 항원은 합성/재조합 항원일 수 있다. 예를 들어, 항원은 류신 지퍼 또는 Fc 융합체 또는 알파/베타 TCR 불변 도메인(예를 들어, TRAC 및 TRBC 도메인)에 대한 융합체로 제시될 수 있다. 따라서, 추가 구현예에서, 제2 항원 시리즈는 서열 번호 259 및/또는 서열 번호 260(Vγ2 가변 도메인을 포함하는 항원)을 포함한다.
추가 구현예에서, 상이한 감마 가변 사슬을 갖는 γδ TCR을 포함하는 제2 항원 시리즈는 제1 항원 시리즈와 동일한 CDR3 서열을 포함한다. 따라서, 모든 항원은 동일한 CDR3 서열(Vγ4로부터의)을 포함한다.
한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 항원 시리즈는 류신 지퍼 및/또는 Fc 융합체로서 제시된다.
한 구현예에서, 항원 시리즈는 이종이량체 및/또는 동종이량체 형식이다.
추가 구현예에서, 항원 시리즈는 표적(즉, TCR 감마 가변 4 사슬)과 함께, 쌍을 이룬 TCR 가변 사슬을 포함한다. 특정 구현예에서, 쌍을 이루는 TCR 가변 사슬은 가변 δ(Vδ) 사슬이다(즉, 항원은 이종이량체 형식임). 한 구현예에서, Vγ4 사슬 및 Vδ 사슬은 적어도 하나의 디설피드 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 추가 구현예에서, Vγ4 사슬 및 Vδ 사슬은 특이적 이종이량체화 상호작용(예를 들어, 류신 지퍼)에 의해 쌍을 이룬다. 대안적 구현예에서, Vγ4 사슬 및 Vδ 사슬은 단일쇄 동일-프레임 융합체를 포함한다. 특정 구현예에서, Vγ4 사슬은 Vδ 사슬의 N-말단이다. 대안적인 구현예에서, Vγ4 사슬은 Vδ 사슬의 C-말단이다. 추가 구현예에서, 단일쇄 동일-프레임 융합체는 내부 링커 서열을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 쌍을 이루는 TCR 가변 사슬은 또 다른 Vγ 사슬이다. 추가 구현예에서, Vγ 사슬은 표적과 동일하다(즉, 항원은 동종이량체 형식임).
실시예 2는 사용될 수 있는 항원 시리즈의 예를 기재한다. (제1) 항원 시리즈는 Vγ4가 존재하는 항원(예를 들어, L1, L4 및 Fc4/4)을 포함하고 제2 항원 시리즈는 Vγ4가 존재하지 않는 항원(예를 들어, L2, L3)을 포함함이 이해될 것이다.
추가 구현예에서, 항원 시리즈는 TCR 불변 영역에 동일-프레임으로 융합된 표적(즉, TCR 감마 가변 4 사슬)을 포함한다. 예를 들어, 상기 TCR 불변 영역은 Vγ4 사슬의 C-말단에 동일-프레임으로 융합될 수 있다. 한 구현예에서, TCR 불변 영역은 인간 TCR 불변 영역일 수 있다. 한 구현예에서, TCR 불변 영역은 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 불변 영역은 TCRγ 불변 영역이다. 또 다른 구현예에서, 항원 시리즈는 추가의 제2 TCR 불변 영역을 포함할 수 있고, 제2 TCR 불변 영역은 쌍을 이룬 TCR 가변 사슬에 동일-프레임으로 융합된다. 추가 구현예에서, 제2 TCR 불변 영역은 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역으로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 불변 영역은 TCRγ 불변 영역이다.
본 발명의 이러한 측면의 방법은 가변 도메인 내 서열을 인식하는 항체(또는 이의 단편)를 단리하는 것을 목표로 하며, 이는 생식계열에서 암호화되어 모든 클론에서 동일하므로, Vγ4 + γδ T 세포의 더 넓은 하위세트를 인식하는 항체를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 항원 시리즈는 가용성 또는 연결된/융합된 형태로 제시되거나 세포막과 연합될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 디스플레이 목적을 위해 항원 시리즈를 무기 또는 유기 물질(예를 들어, 비드, 플레이트, 컬럼 또는 파지)에 융합 또는 연결되거나 세포 표면 상에서 발현될 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예에 따르면, TCR 감마 가변 4(Vγ4) 아미노산 서열을 포함하는 항원 시리즈는 모든 항원에 대해 동일한 Vγ4의 CDR3 서열을 포함한다. 한 구현예에서, CDR3 서열은 RCSB 단백질 데이터 뱅크 엔트리: 4MNH의 CDR3 서열에서 유래된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
(i) Vγ4 가변 도메인 서열을 포함하는 적어도 하나의 제1 단백질을 설계하는 단계;
(ii) Vγ1, Vγ2, Vγ3, Vγ5, Vγ8, Vγ9, Vγ10 또는 Vγ11 가변 도메인 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 단백질을 설계하는 단계; 및
(iii) 제2 단백질과 비교하여 제1 단백질에 대해 더 강한 결합 신호 또는 강도 또는 특성을 나타내는 항체를 선택, 단리 또는 확인하는 단계.
한 구현예에서, 제2 단백질은 Vγ2 가변 도메인 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 방법은 Vγ2 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질 및 Vγ8 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질과 같은 적어도 2개의 제2 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
(i) Vγ4 가변 도메인 서열을 포함하는 적어도 하나의 제1 단백질을 설계하는 단계;
(ii) Vγ2 가변 도메인 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 단백질을 설계하는 단계;
(iii) 항체 라이브러리를 제1 단백질에 노출시켜 제1 서열에 결합하는 항체를 선택하는 단계;
(iv) 선택된 항체의 결합 강도 또는 신호 또는 특성을 제2 단백질과 비교하는 단계; 및
(v) 제2 단백질에 대한 결합 신호 또는 강도 또는 특성에 비해 제1 단백질에 대해 더 강한 결합 강도 또는 신호 또는 특성을 나타내는 항체를 선택, 단리 또는 확인하는 단계.
한 구현예에서, 제1 단백질 및/또는 제2 단백질은 다량체 단백질을 포함한다. 추가 구현예에서, 다량체 단백질은 델타 가변 사슬로부터 유래된 TCR 가변 사슬과 같은 쌍을 이루는 TCR 가변 사슬을 포함한다.
한 구현예에서, 제1 단백질 및/또는 제2 단백질은 가용성 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 제1 단백질 및/또는 제2 단백질은 세포에 결합된다. 대안적인 구현예에서, 제1 단백질 및/또는 제2 단백질은 플레이트에 결합된다.
한 구현예에서, 특성은 더 많은 TCR 수용체 턴오버(turnover)를 유도하는 항체의 능력이다. 또 다른 구현예에서, 특성은 (예를 들어 Vγ2+ 세포와 비교하여) Vγ4+ 세포 상에서 CD69를 상향조절하는 항체의 능력이다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득된 항체가 제공된다.
항목
본 발명 및 그 바람직한 측면을 정의하는 항목 세트는 하기와 같다:
1. γδ T 세포 수용체(TCR)의 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 감마 가변 2(Vγ2) 사슬에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 단편.
2. 항목 1에 있어서, γδ TCR의 Vγ4 사슬이 인간 Vγ4이고 γδ TCR의 Vγ2 사슬이 인간 Vγ2 인, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 γδ TCR의 Vγ4 사슬의 에피토프에 결합하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 영역 71-79 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 γδ TCR의 Vγ4 사슬의 에피토프에 결합하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
5. 항목 4에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76, 79 중 적어도 하나를 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성되는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 K76 및/또는 M80을 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 에피토프가 γδ T 세포의 활성화 에피토프인, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
9. 항목 8에 있어서, 활성화 에피토프의 결합이 (i) γδ TCR을 하향조절하고/거나; (ii) γδ T 세포의 탈과립을 활성화하고/거나; (iii) γδ T 세포-매개 사멸을 활성화하고/거나; (iv) Vγ4 사슬-매개 세포 신호전달을 활성화하거나 증가시키는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, γδ TCR의 Vγ4 사슬의 V 영역에 있는 에피토프에만 결합하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, γδ TCR의 Vγ4 사슬의 CDR3에서 발견되는 에피토프에 결합하지 않는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
12. 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
서열 번호 2-47 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 10 및/또는 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3;
서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 56 및/또는 서열 A9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2; 및/또는
서열 번호 71 내지 116 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 79 및/또는 102와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1.
13. 항목 12에 있어서, 서열 번호 10, 4, 14, 15, 17, 19 또는 23과 같은 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
14. 항목 12 또는 항목 13에 있어서, 서열 번호 56, 50, 60, 61, 63, 65 또는 69와 같은 서열 번호 48-70 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
15. 항목 12 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 79, 73, 83, 84, 86, 88 또는 92와 같은 서열 번호 71-93 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
16. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 10의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 56의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 79의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
17. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 50의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 73의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
18. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 60의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 83의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
19. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 15의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 61의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 84의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
20. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 17의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 63의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 86의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
21. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 19의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 65의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 88의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
22. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 23의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 번호 69의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 92의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
23. 항목 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 33, 27, 37, 38, 40, 42 또는 46과 같은 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
24. 항목 12 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 서열 A9, A3, A13, A14, A16, A18 또는 A22와 같은 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
25. 항목 12 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 102, 96, 106, 107, 109, 111 또는 115와 같은 서열 번호 94-116 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
26. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 33의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A9의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 102의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
27. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 27의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A3의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 96의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
28. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 37의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A13의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 106의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
29. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 38의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A14의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 107의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
30. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 40의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A16의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 109의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
31. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 42의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A18의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 111의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
32. 항목 12 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 46의 서열을 포함하는 CDR3, 서열 A23의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 115의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
33. 항목 16에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 26에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
34. 항목 17에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 27에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
35. 항목 18에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 28에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
36. 항목 19에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 29에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
37. 항목 20에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 30에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
38. 항목 21에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 31에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
39. 항목 22에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역 및 항목 32에 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
40. 서열 번호 117-162 또는 261-283 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
41. 항목 40에 있어서, 서열 번호 117-139 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
42. 항목 41에 있어서, VH 영역이 서열 번호 125, 119, 129, 130, 132, 134 또는 138 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
43. 항목 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 140-162 또는 261-283 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
44. 항목 43에 있어서, VL 영역이 다음 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
(a) 서열 번호 148, 142, 152, 153, 155, 157 또는 161; 또는
(b) 서열 번호 269, 263, 273, 274, 276, 278 또는 282.
45. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 148 또는 269의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
46. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 142 또는 263의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
47. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 152 또는 273의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
48. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 153 또는 274의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
49. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 155 또는 276의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
50. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 157 또는 278의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
51. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 161 또는 282의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
52. 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
(a) 서열 번호 79를 갖는 HCDR1, 서열 번호 56을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 10을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 125를 포함하는 VH; 및
서열 번호 102를 갖는 LCDR1, 서열 A9(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 33을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 148 또는 269를 포함하는 VL;
(b) 서열 번호 86을 갖는 HCDR1, 서열 번호 63을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 17을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 132를 포함하는 VH; 및
서열 번호 109를 갖는 LCDR1, 서열 A16(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 40을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 155 또는 276을 포함하는 VL;
(c) 서열 번호 73을 갖는 HCDR1, 서열 번호 50을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 4를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 119를 포함하는 VH; 및
서열 번호 96을 갖는 LCDR1, 서열 A3(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 27을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 142 또는 263을 포함하는 VL;
(d) 서열 번호 83을 갖는 HCDR1, 서열 번호 60을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 14를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 129를 포함하는 VH; 및
서열 번호 106을 갖는 LCDR1, 서열 A13(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 37을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 152 또는 273을 포함하는 VL;
(e) 서열 번호 84를 갖는 HCDR1, 서열 번호 61을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 15를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 130을 포함하는 VH; 및
서열 번호 107을 갖는 LCDR1, 서열 A14(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 38을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 153 또는 274를 포함하는 VL;
(f) 서열 번호 88을 갖는 HCDR1, 서열 번호 65를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 19를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 134를 포함하는 VH; 및
서열 번호 111을 갖는 LCDR1, 서열 A18(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 42를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 157 또는 278을 포함하는 VL;
(g) 서열 번호 92를 갖는 HCDR1, 서열 번호 69를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 23을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 138을 포함하는 VH; 및
서열 번호 115를 갖는 LCDR1, 서열 A22(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 46을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 161 또는 282를 포함하는 VL;
(h) 서열 번호 71을 갖는 HCDR1, 서열 번호 48을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 2를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 117을 포함하는 VH; 및
서열 번호 94를 갖는 LCDR1, 서열 A1(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 25를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 140 또는 261을 포함하는 VL;
(i) 서열 번호 72를 갖는 HCDR1, 서열 번호 49를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 3을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 118을 포함하는 VH; 및
서열 번호 95를 갖는 LCDR1, 서열 A2(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 26을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 141 또는 262를 포함하는 VL;
(j) 서열 번호 74를 갖는 HCDR1, 서열 번호 51을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 5를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 120을 포함하는 VH; 및
서열 번호 97을 갖는 LCDR1, 서열 A4(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 28을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 143 또는 264를 포함하는 VL;
(k) 서열 번호 75를 갖는 HCDR1, 서열 번호 52를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 6을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 121을 포함하는 VH; 및
서열 번호 98을 갖는 LCDR1, 서열 A5(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 29를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 144 또는 265를 포함하는 VL;
(l) 서열 번호 76을 갖는 HCDR1, 서열 번호 53을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 7을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 122를 포함하는 VH; 및
서열 번호 99를 갖는 LCDR1, 서열 A6(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 30을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 145 또는 266을 포함하는 VL;
(m) 서열 번호 77을 갖는 HCDR1, 서열 번호 54를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 8을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 123을 포함하는 VH; 및
서열 번호 100을 갖는 LCDR1, 서열 A7(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 31을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 146 또는 267을 포함하는 VL;
(n) 서열 번호 78을 갖는 HCDR1, 서열 번호 55를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 9를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 124를 포함하는 VH; 및
서열 번호 101을 갖는 LCDR1, 서열 A8(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 32를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 147 또는 268을 포함하는 VL;
(o) 서열 번호 80을 갖는 HCDR1, 서열 번호 57을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 11을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 126을 포함하는 VH; 및
서열 번호 103을 갖는 LCDR1, 서열 A10(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 34를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 149 또는 270을 포함하는 VL;
(p) 서열 번호 81을 갖는 HCDR1, 서열 번호 58을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 12를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 127을 포함하는 VH; 및
서열 번호 104를 갖는 LCDR1, 서열 A11(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 35를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 150 또는 271을 포함하는 VL;
(q) 서열 번호 82를 갖는 HCDR1, 서열 번호 59를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 13을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 128을 포함하는 VH; 및
서열 번호 105를 갖는 LCDR1, 서열 A12(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 36을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 151 또는 272를 포함하는 VL;
(r) 서열 번호 85를 갖는 HCDR1, 서열 번호 62를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 16을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 131을 포함하는 VH; 및
서열 번호 108을 갖는 LCDR1, 서열 A15(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 39를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 154 또는 275를 포함하는 VL;
(s) 서열 번호 87을 갖는 HCDR1, 서열 번호 64를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 18을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 133을 포함하는 VH; 및
서열 번호 110을 갖는 LCDR1, 서열 A17(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 41을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 156 또는 277을 포함하는 VL;
(t) 서열 번호 89를 갖는 HCDR1, 서열 번호 66을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 20을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 135를 포함하는 VH; 및
서열 번호 112를 갖는 LCDR1, 서열 A19(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 43을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 158 또는 279를 포함하는 VL;
(u) 서열 번호 90을 갖는 HCDR1, 서열 번호 67을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 21을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 136을 포함하는 VH; 및
서열 번호 113을 갖는 LCDR1, 서열 A20(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 44를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 159 또는 280을 포함하는 VL;
(v) 서열 번호 91을 갖는 HCDR1, 서열 번호 68을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 22를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 137을 포함하는 VH; 및
서열 번호 114를 갖는 LCDR1, 서열 A21(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 45를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 160 또는 281을 포함하는 VL; 및/또는
(w) 서열 번호 93을 갖는 HCDR1, 서열 번호 70을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 24를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 139를 포함하는 VH; 및
서열 번호 116을 갖는 LCDR1, 서열 A23(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 47을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 162 또는 283을 포함하는 VL.
53. 항목 40 내지 52 중 어느 하나에 있어서, VH 및 VL 영역이 폴리펩티드 링커와 같은 링커에 의해 연결되는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
54. 항목 53에 있어서, 링커가 (Gly4Ser)n 형식을 포함하고, n = 1 내지 8인, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
55. 항목 53 또는 54에 있어서, 링커가 서열 번호 186을 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
56. 항목 55에 있어서, 링커가 서열 번호 186으로 구성되는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
57. 서열 번호 163-185 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
58. 항목 57에 있어서, 서열 번호 163-185 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
59. 항목 57 또는 항목 58에 있어서, 서열 번호 171, 165, 175, 176, 178, 180 또는 184를 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
60. 서열 번호 233-255 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체.
61. 항목 60에 있어서, 서열 번호 233-255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체.
62. 항목 60 또는 항목 61에 있어서, 서열 번호 235, 241, 245, 246 또는 254를 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체.
63. 서열 번호 284-306 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 307-329 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
64. 항목 63에 있어서, 서열 번호 284-306 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 307-329 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
65. 바람직하게는 항목 1-11 중 어느 하나에 있어서, 항목 12-64 중 어느 하나에 정의된 항체 또는 이의 단편과 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 이와 경쟁하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
66. 항목 1-65 중 어느 하나에 있어서, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 가변 도메인(예를 들어, VH 또는 VL), 디아바디, 미니바디 또는 전장 항체인 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
67. 항목 66에 있어서, scFv 또는 전장 항체인 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
68. 항목 67에 있어서, IgG1 항체와 같은 전장 항체인 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
69. 항목 1-68 중 어느 하나에 있어서, 인간인 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
70. 항목 1-69 중 어느 하나에 있어서, 항체가 Vγ4 T 세포를 조절하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
71. 항목 70에 있어서, 조절이 Vγ4 T 세포의 활성화를 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
72. 항목 70에 있어서, 조절이 Vγ4 T 세포의 억제를 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
73. 항목 70에 있어서, Vγ4 T 세포의 조절이 다음을 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
예를 들어, Vγ4 T 세포 수를 선택적으로 증가시키거나 Vγ4 T 세포의 생존 촉진에 의한, Vγ4 T 세포의 증식;
예를 들어, Vγ4 T 세포 역가 증가, 즉 표적 세포 사멸 증가에 의한, Vγ4 T 세포의 자극; 및/또는
Vγ4 T 세포의 탈과립.
74. 항목 1-73 중 어느 하나의 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
75. 서열 번호 187-232 중 어느 하나와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
76. 서열 번호 187-232 중 어느 하나의 서열을 포함하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
77. 항목 74 내지 76 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
78. 서열 번호 187-209 중 어느 하나의 VH 서열을 포함하는 발현 벡터.
79. 항목 78에 있어서, VH 서열이 서열 번호 195, 189, 199, 200, 202, 204 또는 208을 포함하는, 발현 벡터.
80. 서열 번호 210-232 중 어느 하나의 VL 서열을 포함하는 발현 벡터.
81. 항목 80에 있어서, VL 서열이 서열 번호 218, 212, 222, 223, 225, 227 또는 231을 포함하는, 발현 벡터.
82. 항목 78 또는 항목 79의 VH 서열 및 항목 80 또는 항목 81의 VL 서열을 포함하는 발현 벡터.
83. 항목 74 내지 76 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 항목 77 내지 82 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는 세포.
84. 항목 78 또는 항목 79의 제1 발현 벡터 및 항목 80 또는 항목 81의 제2 발현 벡터를 포함하는 세포.
85. 항목 82의 발현 벡터를 포함하는 세포.
86. 항목 83-85 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터가 항체 또는 이의 단편에 융합된 막 앵커 또는 막횡단 도메인을 암호화하고, 항체 또는 이의 단편은 세포의 세포외 표면 상에 제시되는, 세포.
87. 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물.
88. 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 항체 또는 이의 단편을 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
89. 항목 1 내지 73 중 어느 하나 또는 항목 84에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물.
90. 항목 89에 있어서, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물.
91. 치료 유효량의 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 항목 88의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 방법.
92. 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 데 사용하기 위한 서열 번호 256-258 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원.
93. 다음 단계를 포함하는, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법:
(i) TCR 감마 가변 4(Vγ4) 아미노산 서열을 포함하는 항원 시리즈를 설계하는 단계로서, Vγ4의 CDR3 서열은 시리즈의 모든 항원에 대해 동일한, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 설계된 제1 항원을 항체 라이브러리에 노출시키는 단계;
(iii) 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계;
(iv) 단리된 항체 또는 이의 단편을 단계 (i)에서 설계된 제2 항원에 노출시키는 단계; 및
(v) 제1 항원 및 제2 항원 모두에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계.
94. 항목 93에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 단편을 TCR 감마 가변 2(Vγ2) 또는 TCR 감마 가변 8(Vγ8)과 같은 상이한 감마 가변 사슬을 갖는 γδ TCR을 포함하는 제2 항원 시리즈에 노출시키는 단계, 및 이어서 제2 항원 시리즈에도 결합하는 항체 또는 이의 단편을 선택해제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
95. 항목 93 또는 항목 94에 있어서, 제1 및/또는 제2 항원 시리즈가 류신 지퍼 및/또는 Fc 융합체로 제시되는, 방법.
96. 항목 93-95 중 어느 하나에 있어서, 항원 시리즈가 이종이량체 및/또는 동종이량체 형식인, 방법.
97. 항목 93-96 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 항체.
98. 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 항목 88의 약학 조성물을 포함하고, 임의로 사용 설명서 및/또는 추가의 치료 활성제를 포함하는 키트.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 본원에 제공된 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 다양한 변경 및 변형이 당업자에게 자명해질 것이므로, 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만 단지 예시로서 제공됨이 이해되어야 한다. 본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예를 사용하여 설명될 것이다:
실시예
실시예 1. 물질 및 방법
항원 제조
하기 실시예에서 사용된 TCRα 및 TCR β 불변 영역을 포함하는 가용성 yδ TCR 이종이량체의 설계는 Xu et al. (2011) PNAS 108: 2414-2419에 따라 생성하였다. Vγ 또는 Vδ 도메인을 막횡단 도메인이 결여된 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역에 동일-프레임으로 융합하고, 류신 지퍼 서열 또는 Fc 서열, 및 히스티딘 태그/링커가 뒤따랐다.
발현 구축물은 포유류 EXPI HEK293 현탁 세포에서 일시적으로(이종이량체에 대한 단일 또는 공동-형질감염으로) 형질감염시켰다. 분비된 재조합 단백질을 회수하고 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 정제하였다. 단량체 항원의 우수한 회수를 보장하기 위해, 샘플을 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 추가로 정제했다. 정제된 항원은 SDS-PAGE에 의해 순도 및 분석용 SEC에 의해 응집 상태에 대해 분석하였다.
선택된 scFv는 상업적으로 이용 가능한 플라스미드를 사용하여 IgG1 프레임워크 내로 서브클로닝하였다. expi293F 현탁 세포를 항체 발현을 위해 상기 플라스미드로 형질감염시켰다. 편의상, 달리 주지되지 않는 한, 이들 실시예에서 특성화된 항체는 scFv로서 파지 디스플레이로부터 선택된 IgG1 형식화된 항체를 지칭한다. 그러나, 본 발명의 항체는 이전에 논의된 바와 같은 임의의 항체 형식일 수 있다.
항체 정제
IgG 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 상청액으로부터 배치 정제하였다. 정제된 IgG의 품질을 ELISA, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC를 사용하여 분석했다.
항원 결합
파지 디스플레이 선택 산출물을 scFv 발현 벡터 pSANG10 내로 서브클로닝하였다(Martin et al. (2006) BMC Biotechnol. 6: 46). 가용성 scFv를 발현시키고 직접 고정된 표적에 대한 해리-증강 란탄족 형광 면역검정(DELFIA)에서 결합에 대해 스크리닝하였다. 히트(hit)는 3000 형광 단위 초과의 DELFIA 신호로 정의되었다.
DELFIA ELISA 결합 방법을 또한 사용하여 항체 상청액 또는 추가 단백질-A 정제 항체의 결합을 평가했다. 간략하게, MaxiSorp 플레이트를 3 μg/ml의 항원 BSA 또는 L1(DV1-GV4), L2(DV1-GV2), L3(DV1-GV8) 또는 L4(DV2-GV4) 재조합 TCR 항원으로 코팅하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS로 세척하고, PBS/탈지유로 차단한 다음 시험 물품을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 플레이트를 PBS-Tween으로 세척하고 DELFIA Eu-N1-항-인간 IgG(Perkin Elmer #1244-330)를 실온에서 1시간 동안 첨가한 후 추가 세척하고, DELFIA 증강 용액(Perkin Elmer #4001-0010)을 첨가하고, Pherastar 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다.
D1.3 hIgG1(England et al. (1999) J. Immunol. 162: 2129-2136에 기재됨)을 음성 대조군으로 사용하였고 REA173(Miltenyi) 및 TS8.2(ThermoFisher, No. TCR1730)를 비교 항체로 사용했다.
재조합 JRT3-TCR 세포를 이용한 항체 연구
항체 결합, TCR 하향조절 및 CD69 상향조절 연구에 사용된 재조합 JRT3-TCR 세포는 이전에 설명되어 있다(Melandri et al. (2018) Nature Immunology 19(12): 1352-1365, 및 Willcox et al. (2019) Immunity 51(5): 813-825.e4 참조).
항체 결합 연구의 경우, 100,000개의 비형질도입 JRT3 대조군 또는 JRT3-TCR 세포의 1차 염색을 PBS 5% FCS 중 4℃에서 30분 동안, 양이 표시되지 않은 경우 표준 1.0 μg/ml로 또는 각 선도 항체의 도 6에서 0.08, 0.4, 2 또는 10 μg/ml과 같이 표시된 양으로 수행했다. 그런 다음 A647 항-인간 IgG(Biolegend)를 사용하여 2차 염색을 수행했다. 추가로 BV421 항-CD3ε(Biolegend) 또는 PE-Cy7 IMMU510 항-γδTCR(Beckman Coulter) 염색을 표시된 대로 수행했다. 그런 다음 세포를 PBS 5% FCS 중에 두 번 세척하고 FACS Canto II 3L 상에서 유세포 분석을 수행했다.
TCR 하향조절/CD69 상향조절 연구의 경우, 96 평탄 웰 플레이트를 먼저 각 웰에 20 μg/ml 2차 항체, 특히 항-인간 IgG-Fc(인간 D1.3 및 Vγ4 항체의 경우) 또는 항-마우스 IgG(뮤린 항-CD3e 또는 항-범 TCRgd의 경우)를 첨가한 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사전-코팅하였다. 표시된 대로 시험 항체를 먼저 0.01, 0.1, 1 및 10 μg/ml 최종 농도로 희석했다. 각 농도의 50 μl를 사전 코팅된 플레이트의 웰에 첨가한 후 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 결합되지 않은 항체를 PBS로 2회 세척한 후 37℃에서 1시간 동안 포화 PBS 5% FCS를 첨가하였다. 웰당 100,000개의 세포를 400 g 회전에 의해 플레이팅하였다. 그런 다음 세포를 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션한 다음 염색을 위해 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 사용된 염색 항체는 1:400으로 희석된 BV421 항-CD3ε(클론 OKT-3 Biolegend); 1:200으로 희석된 PE-Cy7 항-γδTCR(클론 IMMU510 Beckman Coulter); 및 1:200으로 희석된 A647 항-CD69(클론 FN50 Biolegend)를 포함하였다. 모든 염색은 PBS 5% FCS 중 4℃에서 30분 동안 수행하였다.
1차 세포(PBMC)를 이용한 항체 연구
24웰 플레이트를 먼저 각 웰에 20 μg/ml(웰 당 250 μl) 항-인간 IgG-Fc(Biolegend)를 첨가한 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사전-코팅하였다. 미결합 2차 항체를 PBS로 2회 세척하고, 이소형 대조군(인간 IgG1, Biolegend) 또는 항-Vγ4(클론 G4_12)를 먼저 0.1, 1 및 10 μg/ml의 최종 농도로 희석하였다. 이어서 각 농도의 250 μl를 사전 코팅된 플레이트의 웰에 첨가한 후 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후 미결합 항체를 PBS로 2회 세척한 후 37℃에서 1시간 동안 포화 PBS 5% FCS를 첨가하였다. 이어서 완전 배지(5% 열-불활성화 인간 AB 혈청[PAA laboratories], 피루브산나트륨[1 mM] 및 페니실린/스트렙토마이신[ThermoFisher]이 보충된 RPMI) 중에 106 세포/ml로 재현탁된 500,000개 PBMC를 각각의 웰에 첨가하였다. 다음으로 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. IL-2 또는 IL-2 + IL-15(각각 100 U/ml 및 10 ng/ml 최종 농도)를 24시간 후에 첨가하고 IL-2 또는 IL-2 + IL-15가 보충된 신선 완전 배지를 2-3일마다 첨가하였다. 배양 제7일 및 제14일에, 세포를 염색을 위해 96웰 둥근-바닥 플레이트로 옮겼다. 사용된 염색 항체는 1 μg/ml로 희석된 비오틴 항-TCRVγ2/3/4(클론 23D12), 1:100 희석된 PE 스트렙타비딘(Biolegend); 1:400 희석된 BV421 항-CD3ε(클론 OKT-3 Biolegend); 1:200 희석된 PE-Cy7 항-TCRγδ(클론 IMMU510 Beckman Coulter); FITC 항-Vδ2(클론 B6 Biolegend); 및 1 μg/ml로 희석된 A647 항-V 4(클론 G4_18)를 포함하였다. 모든 염색은 4℃에서 30분 동안 PBS 5% FCS 중에 수행하였다.
MS 기반 에피토프 매핑
CovalX '초신속 입체형태/선형 에피토프 매핑' 방법론을 사용하였다. 먼저 단백질 항원 L1(DV1-GV4)과 항체 G4_3(1139_P01_A04)을 모두 고질량 MALDI를 사용하여 단백질 온전성 및 응집 수준에 대해 분석했다. 고분해능으로 L1(DV1-GV4)/G4_3 복합체의 결합 에피토프를 결정하기 위해, 복합체를 중수소화된 가교제와 인큐베이션하고 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신을 사용하여 다중 효소 단백분해를 거쳤다. 가교된 펩티드의 농축 후, 샘플을 고분해능 질량 분광기(nLC-LTQ-Orbitrap MS)에 의해 분석하고 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
γδ T 세포 결합 검정
γδ T 세포에 대한 항체의 결합은 고정된 농도의 정제된 항체를 250000개의 γδ T 세포와 인큐베이션함으로써 시험할 수 있다. 이러한 인큐베이션은 Fc 수용체를 통한 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 huFc 단편 또는 Ig의 첨가와 같은 차단 조건 하에 수행할 수 있다. 검출은 인간 IgG1에 대한 2차, 형광 염료-접합 항체를 첨가하여 수행할 수 있다. 음성 대조군의 경우, 세포를 a) 이소형 항체 단독(재조합 인간 IgG), b) 형광 염료-접합 항-인간 IgG 항체 단독 및 c) a) 및 b)의 조합으로 제조할 수 있다. 완전히 비염색 세포의 대조군 웰도 제조하고 분석할 수 있다. 양성 대조군으로서, 정제된 뮤린 모노클로날 IgG2 항-인간 CD3 항체를 2개의 상이한 농도로 사용하고 형광 염료-접합된 염소 항-마우스 2차 항체로 염색할 수 있다. FITC 채널에서 더 낮은 농도의 양성 대조군 평균 형광 세기가 최고 음성 대조군의 적어도 10배인 경우 검정이 허용될 수 있다.
SPR 분석
아민 고용량 칩이 있는 MASS-2 기기(둘 모두 독일 Sierra Sensors로부터)를 사용하여 SPR 분석을 수행할 수 있다. 15 nM IgG를 단백질 G를 통해 아민 고용량 칩(TS8.2의 경우 100 nM)으로 포획할 수 있다. L1(DV1-GV4) 항원은 다음 매개변수: 180 s 연합, 600 s 해리, 유속 30 μL/분, 실행 완충액 PBS + 0.02% Tween 20을 사용하여 2000 nM부터 15.625 nM까지 1:2 희석 시리즈로 세포 상에 흘릴 수 있다. 모든 실험은 MASS-2 기기 상에서 실온에서 수행하였다. 안정 상태 피팅은 소프트웨어 Sierra Analyzer 3.2를 사용하여 Langmuir 1:1 결합에 따라 결정할 수 있다.
γδ TCR 하향조절 및 탈과립 검정
시험 항체가 로딩되거나 로딩되지 않은 THP-1(TIB-202™, ATCC) 표적 세포를 CellTracker™ Orange CMTMR(ThermoFisher, C2927)로 표지하고 CD107a 항체(항-인간 CD107a BV421(클론 H4A3) BD Biosciences 562623)의 존재 하에 2:1 비로 γδ T 세포와 인큐베이션할 수 있다. 2시간 인큐베이션 후, γδ T 세포 상에서 γδ TCR의 표면 발현(TCR 하향조절을 측정하기 위해) 및 CD107a의 발현(탈과립을 측정하기 위해)을 유세포 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
사멸 검정
감마 델타 T 세포-매개 사멸 활성 및 γδ T 세포의 사멸 활성에 대한 시험 항체의 효과를 유세포 분석에 의해 평가할 수 있다. γδ T 세포와 CellTracker™Orange CMTMR(ThermoFisher, C2927)의 20:1 비로의 4시간 시험관 내 공동 배양 후 표지된 THP-1 세포(항체가 로딩되거나 로딩되지 않음)를 생활성 염료 eFluor™ 520(ThermoFisher, 520 65-0867-14)로 염색하여 살아있는 표적 THP-1 세포와 죽은 표적 THP-1 세포를 구별할 수 있다. 샘플 획득 동안, 표적 세포를 CellTracker™ Orange CMTMR 양성에 대해 관문화하고 생활성 염료의 흡수에 기반하여 세포 사멸을 검사할 수 있다. CMTMR 및 eFluor™ 520 이중 양성 세포는 죽은 표적 세포로 인식될 수 있다. γδ T 세포의 사멸 활성은 죽은 표적 세포%로 제시할 수 있다.
실시예 2. 항원 설계
감마 델타(γδ) T 세포는 CDR3 폴리클론성을 갖는 폴리클론날 세포이다. 생성된 항체가 CDR3 서열에 대해 선택되는 상황(CDR3 서열은 TCR 클론과 TCR 클론마다 다를 것이기 때문에)을 피하기 위해, 항원 설계에는 상이한 형식으로 일관된 CDR3을 유지하는 것이 관여되었다. 이 설계는 가변 도메인 내 서열을 인식하는 항체를 생성하는 것을 목표로 하였으며, 이는 생식계열에서 암호화되어 모든 클론에서 동일하므로 γδ T 세포의 더 넓은 하위세트를 인식하는 항체를 제공한다.
항원 제조 과정의 또 다른 중요한 측면은 단백질로의 발현에 적합한 항원을 설계하는 것이었다. γδ TCR은 사슬간 및 사슬내 디설피드 결합이 있는 이종이량체가 관여되는 복합 단백질이다. 류신 지퍼(LZ) 형식 및 Fc 형식을 사용하여 파지 디스플레이 선택에 사용될 가용성 TCR 항원을 생성했다. LZ 및 Fc 형식은 모두 잘 발현되었고 TCR(특히 이종이량체 TCR, 예를 들어, Vδ1Vγ4)을 성공적으로 디스플레이했다.
γδ TCR에 대한 공개 데이터베이스 엔트리로부터의 CDR3 서열이 단백질로서 잘 발현됨이 발견되었다(RCSB 단백질 데이터 뱅크 엔트리: 4MNH). 따라서 이것을 항원 제조를 위해 선택하였다.
감마 가변 4 사슬을 포함하는 항원을 이종이량체로 LZ 형식으로(즉, 상이한 델타 가변 사슬과 조합하여 - 예를 들어, DV1-GV4, 델타 가변 1 사슬 및 감마 가변 4 사슬로 이루어진 이종이량체["L1"로 명명됨] 및 DV2-GV4, 델타 가변 2 사슬 및 감마 가변 4 사슬로 이루어진 이종이량체["L4"로 명명됨]) 및 이종이량체 또는 동종이량체로 Fc 형식으로 발현시켰다(즉, 또 다른 감마 가변 4 사슬과 조합하여 - GV4-GV4, 두 개의 감마 가변 4 사슬로 이루어진 동종이량체["Fc4/4"로 명명됨]). 항원의 모든 감마 가변 4 사슬은 4MNH CDR3을 포함하였다. 유사한 형식을 사용하는 또 다른 γδ TCR 항원 시리즈를 상이한 감마 가변 사슬(예를 들어, 감마 가변 2 및 감마 가변 8)을 포함하도록 설계하였으며 비특이적 또는 표적외 결합을 갖는 항체를 선택해제하기 위해 사용하였다(예를 들어, DV1-GV2, 델타 가변 1 사슬 및 감마 가변 2 사슬로 이루어진 이종이량체["L2"로 명명됨] 또는 DV1-GV8, 델타 가변 1 사슬 및 감마 가변 8 사슬로 이루어진 이종이량체["L3"으로 명명됨]). 이들 항원을 또한 4MNH CDR3을 포함하도록 설계하여 CDR3 영역에서 결합하는 항체도 선택해제되도록 확실히 하였다.
실시예 3. 파지 디스플레이
파지 디스플레이 선택을 라운드 1 및 2에서 이종이량체 LZ TCR 형식을 사용하여 인간 scFv의 라이브러리에 대해 수행하였고, 두 라운드 모두에서 이종이량체 LZ TCR에 대한 선택해제를 수행하였다. 또는 인간 IgG1 Fc에 대한 선택해제와 함께 동종이량체 Fc 융합 TCR을 사용하여 라운드 1을 수행한 후 이종이량체 LZ TCR에 대한 선택해제와 함께 이종이량체 LZ TCR에 대해 라운드 2를 수행했다(표 1 참조).
Figure pct00002
선택은 100 nM 비오틴화된 단백질을 사용하여 용액상에서 수행하였다. 1 μM 비오틴화 단백질을 사용하여 선택해제를 수행했다.
실시예 4. 항체 선택
실시예 3에서 수득된 히트를 시퀀싱하였다(당분야에 알려진 표준 방법을 사용함). VH 및 VL CDR3의 고유한 조합을 나타내는 130개의 고유한 클론을 확인하였다. 이러한 130개의 고유한 클론 중, 129개는 고유한 VH CDR3을 나타내었고 116개는 고유한 VL CDR3을 나타내었다.
고유한 클론을 재배열하고 특이성을 ELISA(DELFIA)에 의해 분석했다. TRGV4에는 결합하지만 TRGV2 또는 TRGV8에는 결합하지 않는 42개의 고유한 인간 scFv 결합제 패널을 선택으로부터 확인하였다.
전향적인 클론 선택을 돕기 위해 선택한 결합제의 친화도 순위를 포함시켰다. 다수의 결합제가 25 내지 100 nM 비오틴화된 항원(L1)과 반응하여, 나노몰 범위의 친화도를 나타냈다. 소수의 결합제가 5 nM 항원과 강한 반응을 보였으며, 이는 가능한 한 자리 나노몰 친화도를 표시한다. 일부 결합제는 100 nM 항원과 반응을 나타내지 않았으며, 이는 마이크로몰 범위의 친화도를 표시한다.
IgG 전환으로 진행할 클론 선택의 목표는 가능한 한 많은 생식계열 계통과 여러 상이한 CDR3을 포함시키는 것이었다. 또한, 글리코실화, 인테그린 결합 부위, CD11c/CD18 결합 부위, 쌍을 이루지 않은 시스테인과 같은 서열 책임을 피했다. 추가로, 다양한 친화도를 포함시켰다. IgG로 전환되도록 선택된 클론을 도 1에 나타낸다. ELISA 결합으로부터의 결과(형광 단위(FU) 값)를 도 2a에 나타낸다. 결과는 모든 23개의 항체가 파트너 델타 사슬에 관계없이 원하는 감마 4 사슬 특이적 프로파일을 나타냄을 표시한다. 동일한 데이터가 도 2b에도 표현되며, 인간 Vγ2 사슬에 비해 인간 Vγ4 사슬에 대한 각 클론의 결합의 증가 변화 배율을 추가로 나타낸다. 인간 Vγ4 사슬 대 인간 Vγ2 사슬에 대한 결합의 증가 변화 배율은 80배(클론 G4_26) 내지 98387배 증가(클론 G4_18) 범위였다.
항체 결합 연구를 또한 재조합 Jurkat(JRT3-hu17) 세포를 사용하여 수행하였다. ELISA 데이터 및 유세포 분석 데이터로부터의 결과 비교를 도 3a에 나타낸다. Delfia ELISA를 통해 DV1-GV4 항원(Y-축) 및 JRT3-hu17 세포(X-축)에 결합하는 것으로 확인된 항체 클론을 추가 조사를 위해 선택했다.
실시예 5. Vγ4 항체 결합의 조사
상이한 CDR3 서열(hu17 대 hu20, 둘 다 Vγ4Vδ1) 또는 델타 사슬(hu20γ/huPBδ, Vγ4Vδ2; LES, Vγ4Vδ5)를 보유하는 Vγ4 TCR을 염색하는 실시예 4에서 선택된 항체의 능력을 조사하였다. 결과를 도 4a에 나타내며, 시험된 모든 항체가 D1.3 이소형 대조군에 비해 연구에 사용된 Vγ4 TCR 중 하나 이상에 대해 유의하게 증가된 결합을 나타냄을 표시한다. 특히, 5개의 예시적인 항체(G4_3, G4_12, G4_16, G4_18 및 G4_27)는 CDR3 서열 또는 파트너 델타 사슬에 관계없이 이 연구에서 발현된 모든 Vγ4 TCR에 결합하여, D1.3 이소형 대조군 이상으로 현저하게 향상된 결합 신호를 나타낸다. 예를 들어, 이 연구에서 두 개의 항체에 대한 예시적인 흐름 데이터를 도 4b에 나타내며 G4_4 결합(hu17 및 LES 모두에 대해 양성으로 염색되는 반면, hu20[hu17과 비교하여 상이한 CDR3 서열] 및 hu20g/huPBd[Vγ4Vδ2] 둘 모두에 대한 염색은 감소됨) 대비 G4_3 결합(모든 Vγ4 TCR에 대해 양성으로 염색됨) 간 차이를 예시한다.
실시예 6. 키메라 hu17 TCR을 사용한 에피토프 매핑
hu17은 단일 세포 PCR에 의해 BTNL3+8 반응성 인간 결장 상피내 림프구로부터 쌍을 이룬 CDR3 서열이 클로닝된 Vγ4/Vδ1 TCR이다(Melandri et al. (2018) Nat. Immunol. 19: 1352-1365에 기재됨). 상이한 키메라 hu17 TCR 구축물을 도 5a에 요약된 바와 같이 제조하였다. 이들 구축물은 hu17로부터 유래되었으며 모두 Melandri et al. (2018) Nat. Immunol. 19: 1352-1365 및 Willcox et al. (2019) Immunity 51: 813-825에 기재되었다(둘 모두 참조로 본원에 포함됨).
그 다음, JRT3 세포 상에서 발현된 키메라 hu17 TCR에 대한 유세포 분석에 의해 항체 결합을 조사하였다. 표시된 키메라 TCR 구축물에 대한 각 항체의 반응성 요약 표를 도 5b에 나타낸다. 결과는 JRT3 세포 상에서 발현된 개별 TCR에 대한 개별 항체의 상대적 결합 특이성을 강조한다. HV4 영역에서 Vγ2 서열을 포함하는 hu17 TCR 구축물을 사용하는 경우 염색이 관찰되지 않거나 감소된 염색이 관찰되었으므로 항체 G4_3, G4_12, G4_16, G4_18 및 G4_27은 모두 HV4 영역 내 또는 그 주변에 특이적으로 결합하는 것으로 표시되었다.
이 연구에서 관찰된 차별적 결합 신호를 예시하기 위한 에피토프 매핑의 예시적인 흐름 데이터를 도 5c에 나타낸다. 이 경우, 그리고 이 에피토프 매핑 접근의 예로서, 다양한 재조합 키메라 TCR에 결합하는 G4_12를 나타낸다. 첫번째로, G4_12는 시작 hu17 TCR(맨 왼쪽 패널)에 강한 결합을 나타낸다. CDR1+2 서열이 동일-프레임에서 Vγ2 동등 CDR로 교환될 때(중앙 왼쪽 패널) 또는 hu17이 Vγ2 서열 DG>YA로 변형된 HV4일 때(중앙 오른쪽 패널) hu17에 대해 강한 결합이 또한 관찰된다. 그러나 G4_12에 의한 결합의 주목할만한 감소가 대안적인 Vγ4에서 Vγ2로의 아미노산 치환(DGKM>YANL; 중앙 패널) 또는 KM>NL(맨 오른쪽 패널)에서 각각 관찰된다. 따라서 이 경우 G4_12에 의해 인식되는 에피토프는 HV4 영역(서열 번호 1의 아미노산 67-82[KYDTYGSTRKNLRMIL])에 위치하며 밑줄 친 K 및 M 잔기의 Vγ2 HV4 영역의 이 위치에서 발견되는 동등한 잔기로의 변형에 의해 크게 영향을 받는다.
실시예 7. 염색 및 기능적 검정에서 조사된 항체의 적정
JRT3-hu17 세포에 대한 유세포 분석에 의한 염색 및 분석을 위한 조사된 항체의 적정 결과(0.08 내지 10 μg/mL 범위의 농도, 5배 희석 단계)를 도 6a에 나타낸다. 형질도입되지 않은 JRT3 세포(TCR 없음)를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 모든 항체가 Vγ4 TCR을 발현하는 JRT3 세포에 결합할 수 있었음을 나타낸다.
이어서 적정된 항체에 의한 TCR 턴오버 및 CD69 상향조절 대 항-CD3ε 결합 또는 항-범-TCRγδ 항체에 의해 부여된 턴오버를 조사함으로써 기능적 검정을 수행하였다. 5개의 항체에 대한 결과를 도 6b 및 6c에 나타내며 원래 코호트 내에서 보다 광범위한 항체 선택에 대한 결과를 표 2에 요약한다.
Figure pct00003
표 2에 나열된 모든 항체는 γδ TCR의 Vγ4 사슬에 결합함을 나타내었다. 그러나, 표에 나타낸 바와 같이, 이들 항체 중 일부는 Vγ4 TCR 하향조절 및/또는 증가된 CD69 발현을 통해 측정된 바와 같이 Vγ4 TCR을 활성화할 수 있는 반면('+', '++' 또는 '+++'로 표시하며 '+++'가 가장 높은 상대적 활성화 수준을 의미함), 다른 항체는 Vγ4 TCR을 활성화하는 인식 가능한 능력을 나타내지 않았다('-'로 표시됨).
실시예 8. MS 기반 에피토프 매핑
고분해능으로 항원/항체 복합체의 에피토프를 결정하기 위해, 단백질 복합체를 중수소화된 가교제와 인큐베이션하고 다중 효소 절단을 거쳤다. 가교된 펩티드의 농축 후, 샘플을 고분해능 질량 분광기(nLC-LTQ-Orbitrap MS)에 의해 분석하고 생성된 데이터를 XQuest(버전 2.0) 및 Stavrox(버전 3.6) 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
중수소화 d0d12를 단백질 복합체 L1(DV1-GV4)/1139_P01_A04의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신 단백분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석으로 L1(DV1-GV4) 및 항체 1139_P01_A04(G4_3) 간 11개의 가교된 펩티드를 검출하였다. 에피토프 매핑 결과의 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00004
이 에피토프 매핑 데이터는 위의 실험과 상관관계가 있으며, 이 항체가 γ4 사슬의 HV4 영역 내에서 결합함을 표시한다.
실시예 9. 1차 Vγ4-양성 세포의 항-Vγ4 항체 표적화 및 조절.
건강한 및 이환 환자 샘플로부터 유래된 세포를 포함하여 피부, 혈액 및 장으로부터 유래된 1차 Vγ4+ 세포의 항-Vγ4 항체 표적화를 실증하기 위한 추가 연구를 수행하였다.
피부로부터 유래된 1차 Vγ4 + 세포에 대한 결합
먼저, 항-Vγ4 항체를 2명의 개별 공여자의 피부로부터 증식된 1차 Vγ4+ T 세포로의 결합에 대해 시험하였다. 피하 지방을 제거하고 다수의 펀치를 만드기 위해 사용되는 3 mm 생검 펀치로 피부 샘플을 제조했다. 펀치를 탄소 매트릭스 그리드 상에 놓고 G-REX6(Wilson Wolf)의 웰에 배치했다. 각 웰을 AIM-V 배지(Gibco, Life Technologies), CTS 면역 혈청 대체물(Life Technologies), IL-2 및 IL-15를 포함하는 완전 단리 배지로 채웠다. 배양의 처음 7일 동안, 암포테리신 B(Life Technologies)를 포함하는 완전 단리 배지를 사용했다("+AMP"). 상층 배지를 부드럽게 흡인하고 플레이트 또는 생물반응기의 바닥에 있는 세포를 교란하지 않도록 노력하면서 2X 완전 단리 배지(AMP 없음)로 교체함으로써 배지를 매 7일마다 교환하였다. 배양에서 3주 초과부터는 생성된 유출 세포를 신선 조직 배양 용기 및 신선 배지(예를 들어, AIM-V 배지 또는 TexMAX 배지(Miltenyi)) 및 재조합 IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21 내로 계대한 후 수확하였다. 그런 다음 배양 내에 존재하는 αβ T 세포를 Miltenyi에서 제공되는 것과 같은 αβ T 세포 고갈 키트 및 관련 프로토콜의 도움으로 제거했다. 추가 언급은 WO2020/095059를 참조한다.
단리 후, γδ T 세포를 먼저 4℃에서 20분 동안 Fc 블록의 존재하에 생활성 염료로 염색하였다. 그런 다음 γδ T 세포를 고정 농도의 예시적인 항-Vγ4 항체(0.046 - 100 μg/ml) 또는 이소형 대조군(IgG1 항-호흡기 융합 바이러스(RSV) 항체)과 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인간 IgG1(IS11-12E4.23.20)에 대한 2차 형광 염료-접합 항체를 첨가하여 검출을 수행했다. 그런 다음 세포를 고정하고 MACSQuant16 유세포 분석기 상에서 획득했다. 세포를 단일, 살아있는, IgG1(Vγ4)+로 관문화하였다. 나타낸 데이터는 Vγ4+ 세포에 결합하여 검출된 2차 검출 항체의 중앙값 형광 세기(MFI)이다.
결과를 도 7a에 나타낸다. 이들 데이터는 시험된 모든 항-Vγ4 항체가 용량 의존적 방식으로 1차 피부-유래 Vγ4+ T 세포에 결합할 수 있음을 확인시켜 주었다. 이소형 대조군에서는 결합이 관찰되지 않았다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유래된 1차 Vγ4 + 세포에 대한 결합
간략하게, 인간 PBMC(Lonza, 제품 코드 CC-2702)를 먼저 4℃에서 20분 동안 Fc 블록의 존재 하에 생활성 염료로 염색했다. 그런 다음 세포를 10 μg/ml 항-Vγ4 항체 또는 이소형 대조군(RSV)과 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 세척하고 항-Vδ1(REA173), 항-Vδ2(REA771), 항-γδ(REA591) 및 항-인간 IgG1(IS11-12E4.23.20)으로 4℃에서 20분 동안 세포외 염색했다. 이어서 세포를 고정하고 MACSQuant16 유세포 분석기 상에서 획득했다. 세포를 단일, 살아있는, γδ+ Vδ2- IgG1(Vγ4)+로 관문화하였다.
결과를 도 7b에 나타낸다. 나타낸 데이터는 접합된 2차 항-인간 IgG1 항체에 의해 결합된 각각의 개별 항체를 사용하여 검출된 γδ+ Vδ2- 세포의 Vγ4+ 세포%이다. 이들 데이터는 1차 혈액-유래 Vγ4+ T 세포에 결합하는 실질적으로 모든 항-Vγ4 항체의 능력을 강조한다. 가장 강한 신호는 항체 G4_23, G4_3, G4_12, G4_18 또는 G4_20을 사용하여 검출되었다.
결장직장암(CRC) 환자로부터 수득된 장 유래 상피내 림프구(IEL)의 1차 Vγ4 + 세포에 대한 결합
이 연구를 위해 인간 CRC 종양 생검을 신선하게 배송받아 수령 즉시 처리하였다. 생검을 약 2 mm2로 측정되는 조각으로 절단하였고 종양-침윤 림프구(TIL)를 원래 Kupper 및 Clarke에 의해 기재된 방법을 응용하여 수득하였다(Clarke et al., 2006, J. Invest. Dermatol. 126, 1059-1070). 구체적으로, 9 mm x 9 mm x 1.5 mm Cellfoam 매트릭스 상에 최대 4개의 2 mm2 생검을 배치하고, 24웰 플레이트 상에 웰당 하나의 매트릭스를 배치했다. 그런 다음 생검을 4% 인간 혈장, β-메르캅토에탄올(50 μM), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg /ml), 겐타마이신(20 μg/ml), 메트로니다졸(1 μg /ml), 암포테리신 B(2.5 μg /ml), HEPES(10 mM), Na 피루베이트(1 mM), MEM 비필수 아미노산 용액(1X) 및 IL-15(20 ng/ml, Miltenyi Biotech)이 보충된 2 ml 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) 중에 배양했다. 1 ml의 배지를 3일마다 흡인하고 2x 농축된 IL-15를 포함하는 1 ml의 완전 배지로 교체했다. 10일 후에 TIL을 수확하고, 70 μM 나일론 세포 여과기를 통과시키고, 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 표현형분석을 위해 완전 배지 중에 재현탁하였다. TIL을 먼저 4℃에서 20분 동안 Fc 블록의 존재 하에 살아있는/죽은 생활성 염료로 염색하였다. 그런 다음 세포를 4℃에서 30분 동안 10 μg/ml 항-Vγ4 항체 또는 이소형 대조군(RSV)과 인큐베이션한 후, 세척하고 항-Vδ1(REA173), 항-γδ(REA591) 및 항-인간 IgG1(IS11-12E4.23.20)으로 4℃에서 20분 동안 세포외 염색하였다. 이어서 세포를 고정하고 MACSQuant16 유세포 분석기 상에서 획득했다. 세포를 단일, 살아있는, γδ+, IgG1+(Vγ4)+로 관문화하였다.
결과를 도 7c에 나타낸다. 나타낸 데이터는 접합된 2차 항-인간 IgG1 항체를 통해 검출된 1차 장-유래 Vγ4+ 세포에 대한 항-Vγ4 항체, G4_3, G4_12 및 G4_18의 결합을 예시하는 FACS 그래프이다. 데이터는 CRC 종양 조직으로부터 수득된 Vγ4+ 세포에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 실증한다.
항-Vγ4 항체에 의해 부여된 인간 장-유래 γδ T 세포의 검출 및 TCR 하향조절
항-Vγ4 항체에 의해 부여된 인간 장-유래 γδ T 세포의 조절을 탐색하기 위한 추가 연구를 수행하였다. 이러한 연구를 위해 CRC 환자의 결장으로부터의 정상 인접 조직(NAT) 생검을 신선하게 배송받아 수령 시 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 구체적으로, 조직을 약 2 mm2로 측정되는 조각으로 절단하고 최대 1 g의 조직을 관련 세포 표면 분자의 절단을 방지하기 위해 0.2X 농도에서 사용된 효소 R을 제외하고 제조업체에서 권장하는 농도로 Miltenyi 종양 해리 키트로부터의 효소가 포함된 4.7 ml RPMI와 함께 Miltenyi C 튜브 내에 넣었다. C-튜브를 가열 블록이 부착된 GentleMACS™ Octo 해리장치 상에 배치하였다. 연성 종양의 해리를 위해 프로그램 37C_h_TDK_1을 선택하였다. 1시간 후 소화물을 70 μM 필터를 통해 여과하고 4% 인간 혈장을 포함하는 완전 IMDM을 첨가하여 효소 활성을 켄칭하였다. 그런 다음 세포를 두 번 세척하고 계수를 위해 완전 IMDM 중에 재현탁했다. 이 시점에, 세포를 항-Vγ4 항체로의 자극을 위해 플레이팅하거나 표현형분석을 위해 사용하였다.
일련의 실험에서 항-Vγ4 항체로의 자극 전 장 소화물에서의 Vγ4+ γδ T 세포의 표현형을 결정하였다. 간략하게, 세포를 4℃에서 20분 동안 Fc 블록의 존재 하에 살아있는/죽은 생활성 염료로 염색하였다. 그런 다음 세포를 4℃에서 30분 동안 10 μg/ml G4_18 클론과 인큐베이션한 후 세척하고 항-Vδ1(REA173), 항-γδ(REA591), 항-CD69(REA824), 항-CD103(Ber-Act8) 및 항-인간 IgG1(IS11-12E4.23.20)로 4℃에서 20분 동안 세포외 염색했다. 그런 다음 세포를 고정하고 MACSQuant16 유세포 분석기 상에서 획득했다. 도 7d에 나타낸 바와 같이, 살아있는, 단일 세포의 1.4%가 Vδ1+ 이었다. 이들 중 44.2%는 Vγ4와 쌍을 이루었고, 이들 모두는 장으로부터의 γδ T 세포에 대해 예상된 바와 같이 장 조직 잔류 마커(CD69+ CD103+)를 디스플레이했다. 이러한 결과는 본 발명의 항체, 이 경우 항체 G4_18이 인간 장 조직으로부터 단리된 Vγ4+ γδ T 세포를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있음을 확인시켜 준다.
다음 일련의 실험은 항-Vγ4 항체로의 세포 자극 효과를 측정했다. 2x106 세포를 48-웰 플레이트에서 웰 당 플레이팅하고 2 ng/ml 농도의 IL-15의 존재 하에 G4_12, G4_18 또는 RSV IgG1 이소형 대조군 항체로 자극하였다. 효소 소화에 의해 단리된 상피내 림프구(IEL)를 mAb 자극 24시간 후 유세포 분석에 의해 분석하였다. 24시간 자극 후, 세포를 4℃에서 20분 동안 Fc 블록의 존재 하에 생활성 염료로 염색하였다. 그런 다음 세포를 γδTCR(REA591)에 대해 세포외 염색하고, 고정하고, MACSQuant16 유세포 분석기 상에서 획득했다. 살아있는, 단일 세포를 γδTCR+로 관문화하였다. 도 7e는 대표적인 FACS 그래프가 동반되는, RSV 이소형 대조군과 비교하여 G4_12 또는 G4_18 클론으로 24시간 자극 후 부여된 γδTCR 하향조절을 나타낸다. 항-Vγ4 항체인 G4_12 및 G4_18 모두 RSV 이소형 대조군에 비해 γδTCR 하향조절을 유도했으며, G4_12로 가장 큰 하향조절이 관찰되었다.
실시예 10. 본 발명의 예시적인 항-Vγ4 항체의 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된 인간 Vγ4에 대한 결합 친화도(KD)를 측정하는 추가 연구.
또한, scFv 결합제와 관련하여 실시예 4에 기재된 SPR 결합 연구(실시예 1에 기재된 방법)에 대해, 클론이 완전한 IgG1 모노클로날 항체로 발현될 때 인간 Vγ4 사슬에 대한 선택된 예시적인 클론의 결합 친화도를 측정하기 위해 추가 연구를 수행하였다.
간략하게, 표적(즉, γδ TCR의 인간 Vγ4 사슬)에 대한 항체의 결합 친화도를 Reichert 4SPR 기기(Reichert Technologies)를 사용한 SPR 분석에 의해 확립하였다. 항원(L1(DV1-GV4))을 10 ug/ml의 카복시메틸 덱스트란 칩(Reichert Technologies) 상에 커플링하였고, 이는 기준선으로부터 각각 대략 750 uRIU의 증가를 초래했다. 항체를 하기 매개변수: 180초 연합, 300초 해리, 유속 25 μL/분, 실행 완충액 PBS + 0.05% Tween 20을 사용하여 500 nM 내지 31.25 nM의 1:2 희석 시리즈로 세포 상으로 흘렸다. 모든 실험은 실온에서 수행했고, 칩 상으로 흘리기 전에 샘플을 4℃에서 유지하였다. 안정 상태 피팅을 소프트웨어 TraceDrawer(Reichert Technologies)를 사용하여 Langmuir 1:1 결합에 따라 결정하였다.
결과를 표 4에 나타내며 항체 당 2회 실험의 평균을 나타낸다(표시된 경우 제외).
Figure pct00005
예상된 대로, 결합 친화도 범위를 결정하여 필요한 결합 친화도에 따라 특정 상황에 대해 특정 항체를 선택할 수 있게 하였다. 특히, 결합 친화도는 나타낸 바와 같이 대략 260 nM - 2.8 nM 범위였다. 이는 실시예 4에 기재된 scFv 연구와 일치하였다.
실시예 11. 1차 인간 Vγ4 T 세포 수를 증가시키기 위한 Vγ4-특이적 항체의 용도
JRT3-hu17 세포 상에서 가장 높은 자극 활성을 나타내는 항체(클론 G4_12, 도 5b, 5c)를 1차 Vγ4+ T 세포를 자극하는 그 능력에 대해 추가 시험하였다. 이소형 대조군 대비 G4_12로의 플레이트-결합 자극 후 PBMC 배양 중 Vγ4 T 세포 백분율의 증가를 A647-접합 항-Vγ4 클론 G4_18을 포함하는 항체 패널을 사용하여 유세포 분석에 의해 분석하였고 도 8에 나타낸다. 제7일 및 제14일에, G4_12 항체의 존재 하에 Vg4 양성 세포의 비율은 이소형 대조군이 존재한 배양에서보다 컸다.
서열
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SEQUENCE LISTING <110> GammaDelta Therapeutics Limited <120> Novel Antibodies <130> P143080WO <160> 338 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> V gamma 4 chain of RSCB Protein Data Bank entry: 4MNH <400> 1 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Glu Lys Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Val Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 130 135 140 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 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Claims (30)

  1. γδ T 세포 수용체(TCR)의 감마 가변 4(Vγ4) 사슬에 특이적으로 결합하고 γδ TCR의 감마 가변 2(Vγ2) 사슬에는 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, γδ TCR의 Vγ4 사슬이 인간 Vγ4이고 γδ TCR의 Vγ2 사슬이 인간 Vγ2 인, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 영역 67-82 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 γδ TCR의 Vγ4 사슬의 에피토프에 결합하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 아미노산 잔기 71, 73, 75, 76, 79 중 적어도 하나를 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 K76 및/또는 M80을 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 γδ T 세포의 활성화 에피토프인, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  7. 제6항에 있어서, 활성화 에피토프의 결합이 (i) γδ TCR을 하향조절하고/거나; (ii) γδ T 세포의 탈과립을 활성화하고/거나; (iii) γδ T 세포-매개 사멸을 활성화하고/거나; (iv) Vγ4 사슬-매개 세포 신호전달을 활성화하거나 증가시키는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  8. 다음 중 하나 이상을 포함하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
    서열 번호 2-47 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 10 및/또는 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3;
    서열 번호 48-70 및 서열 A1-A23(도 1) 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 56 및/또는 서열 A9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2; 및/또는
    서열 번호 71-116 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 79 및/또는 102와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호 10, 4, 14, 15, 17, 19 또는 23과 같은 서열 번호 2-24 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 서열 번호 33, 27, 37, 38, 40, 42 또는 46과 같은 서열 번호 25-47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  11. 서열 번호 117-162 또는 261-283 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  12. 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
    (a) 서열 번호 79를 갖는 HCDR1, 서열 번호 56을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 10을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 125를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 102를 갖는 LCDR1, 서열 A9(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 33을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 148 또는 269를 포함하는 VL;
    (b) 서열 번호 86을 갖는 HCDR1, 서열 번호 63을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 17을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 132를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 109를 갖는 LCDR1, 서열 A16(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 40을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 155 또는 276을 포함하는 VL;
    (c) 서열 번호 73을 갖는 HCDR1, 서열 번호 50을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 4를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 119를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 96을 갖는 LCDR1, 서열 A3(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 27을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 142 또는 263을 포함하는 VL;
    (d) 서열 번호 83을 갖는 HCDR1, 서열 번호 60을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 14를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 129를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 106을 갖는 LCDR1, 서열 A13(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 37을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 152 또는 273을 포함하는 VL;
    (e) 서열 번호 84를 갖는 HCDR1, 서열 번호 61을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 15를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 130을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 107을 갖는 LCDR1, 서열 A14(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 38을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 153 또는 274를 포함하는 VL;
    (f) 서열 번호 88을 갖는 HCDR1, 서열 번호 65를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 19를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 134를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 111을 갖는 LCDR1, 서열 A18(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 42를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 157 또는 278을 포함하는 VL;
    (g) 서열 번호 92를 갖는 HCDR1, 서열 번호 69를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 23을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 138을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 115를 갖는 LCDR1, 서열 A22(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 46을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 161 또는 282를 포함하는 VL;
    (h) 서열 번호 71을 갖는 HCDR1, 서열 번호 48을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 2를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 117을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 94를 갖는 LCDR1, 서열 A1(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 25를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 140 또는 261을 포함하는 VL;
    (i) 서열 번호 72를 갖는 HCDR1, 서열 번호 49를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 3을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 118을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 95를 갖는 LCDR1, 서열 A2(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 26을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 141 또는 262를 포함하는 VL;
    (j) 서열 번호 74를 갖는 HCDR1, 서열 번호 51을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 5를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 120을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 97을 갖는 LCDR1, 서열 A4(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 28을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 143 또는 264를 포함하는 VL;
    (k) 서열 번호 75를 갖는 HCDR1, 서열 번호 52를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 6을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 121을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 98을 갖는 LCDR1, 서열 A5(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 29를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 144 또는 265를 포함하는 VL;
    (l) 서열 번호 76을 갖는 HCDR1, 서열 번호 53을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 7을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 122를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 99를 갖는 LCDR1, 서열 A6(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 30을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 145 또는 266을 포함하는 VL;
    (m) 서열 번호 77을 갖는 HCDR1, 서열 번호 54를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 8을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 123을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 100을 갖는 LCDR1, 서열 A7(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 31을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 146 또는 267을 포함하는 VL;
    (n) 서열 번호 78을 갖는 HCDR1, 서열 번호 55를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 9를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 124를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 101을 갖는 LCDR1, 서열 A8(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 32를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 147 또는 268을 포함하는 VL;
    (o) 서열 번호 80을 갖는 HCDR1, 서열 번호 57을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 11을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 126을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 103을 갖는 LCDR1, 서열 A10(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 34를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 149 또는 270을 포함하는 VL;
    (p) 서열 번호 81을 갖는 HCDR1, 서열 번호 58을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 12를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 127을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 104를 갖는 LCDR1, 서열 A11(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 35를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 150 또는 271을 포함하는 VL;
    (q) 서열 번호 82를 갖는 HCDR1, 서열 번호 59를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 13을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 128을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 105를 갖는 LCDR1, 서열 A12(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 36을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 151 또는 272를 포함하는 VL;
    (r) 서열 번호 85를 갖는 HCDR1, 서열 번호 62를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 16을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 131을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 108을 갖는 LCDR1, 서열 A15(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 39를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 154 또는 275를 포함하는 VL;
    (s) 서열 번호 87을 갖는 HCDR1, 서열 번호 64를 갖는 HCDR2 및 서열 번호 18을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 133을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 110을 갖는 LCDR1, 서열 A17(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 41을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 156 또는 277을 포함하는 VL;
    (t) 서열 번호 89를 갖는 HCDR1, 서열 번호 66을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 20을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 135를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 112를 갖는 LCDR1, 서열 A19(도 1)를 갖는 LCDR2 및 서열 번호 43을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 158 또는 279를 포함하는 VL;
    (u) 서열 번호 90을 갖는 HCDR1, 서열 번호 67을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 21을 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 136을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 113을 갖는 LCDR1, 서열 A20(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 44를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 159 또는 280을 포함하는 VL;
    (v) 서열 번호 91을 갖는 HCDR1, 서열 번호 68을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 22를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 137을 포함하는 VH; 및
    서열 번호 114를 갖는 LCDR1, 서열 A21(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 45를 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 160 또는 281을 포함하는 VL; 및/또는
    (w) 서열 번호 93을 갖는 HCDR1, 서열 번호 70을 갖는 HCDR2 및 서열 번호 24를 갖는 HCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 139를 포함하는 VH; 및
    서열 번호 116을 갖는 LCDR1, 서열 A23(도 1)을 갖는 LCDR2 및 서열 번호 47을 갖는 LCDR3을 포함하며, 임의로 서열 번호 162 또는 283을 포함하는 VL.
  13. 서열 번호 163-185 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  14. 서열 번호 233-255 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체.
  15. 서열 번호 284-306 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 307-329 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  16. 바람직하게는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 단편과 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 이와 경쟁하는, 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 다음과 같은 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편:
    (i) scFv 또는 전장 항체; 및/또는
    (ii) 인간 항체 또는 이의 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  19. 서열 번호 187-232 중 어느 하나와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  20. 제18항 또는 제19항에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제18항 또는 제19항에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 제20항에 정의된 발현 벡터를 포함하는 세포.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 단편을 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항 또는 제23항에 있어서, 약제로 사용하기 위한 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 단리된 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물.
  26. 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 데 사용하기 위한 서열 번호 256-258 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원.
  27. 다음을 포함하는, 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법:
    (i) TCR 감마 가변 4(Vγ4) 아미노산 서열을 포함하는 항원 시리즈를 설계하는 단계로서, Vγ4의 CDR3 서열이 시리즈의 모든 항원에 대해 동일한, 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 설계된 제1 항원을 항체 라이브러리에 노출시키는 단계;
    (iii) 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계;
    (iv) 단리된 항체 또는 이의 단편을 단계 (i)에서 설계된 제2 항원에 노출시키는 단계; 및
    (v) 제1 항원 및 제2 항원 둘 다에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계.
  28. 제27항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 단편을 TCR 감마 가변 2(Vγ2) 또는 TCR 감마 가변 8(Vγ8)과 같은 상이한 감마 가변 사슬을 갖는 γδ TCR을 포함하는 제2 항원 시리즈에 노출시키는 단계 및 이어서 제2 항원 시리즈에도 결합하는 항체 또는 이의 단편을 선택해제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 정의된 방법에 의해 수득된 항체.
  30. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-Vγ4 항체 또는 이의 단편 또는 제23항의 약학 조성물을 포함하고, 임의로 사용 설명서 및/또는 추가의 치료 활성제를 포함하는 키트.
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