KR20160090904A

KR20160090904A - 치료 펩티드

Info

Publication number: KR20160090904A
Application number: KR1020167017672A
Authority: KR
Inventors: 카이 더블유. 우처페닝; 글렌 드래노프; 에프. 스티븐 호디; 베티나 프란츠; 케니쓰 에프. 주니어 메이; 크리스토퍼 하비
Original assignee: 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
Priority date: 2013-12-06
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2016-08-01
Also published as: EP3077504B1; CN106029694A; US20170022275A1; ES2755129T3; JP6705746B2; CA2932767A1; MX2016007063A; AU2014360273A1; WO2015085210A1; BR112016012358A2; IL245744A0; EA201691078A1; US10106611B2; MX371187B; JP2017501692A; EP3077504A1

Abstract

본 개시내용은, 부분적으로, MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

치료 펩티드 {THERAPEUTIC PEPTIDES}

관련 출원

본원은 2013년 12월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/913,198 및 2014년 3월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/953,588을 우선권 주장하고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

정부 지원

본 발명은 국립 보건원이 수여한 교부 번호 P01 AI045757 및 P01 CA78378 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

기술 분야

본 발명은 인간 대상체와 관련된 치료 조성물 (예를 들어, 펩티드)에 관한 것이다.

병태 또는 질환에 노출된 인간 대상체는 치료 잠재력이 있는 항체의 공급원을 제공하고, 이러한 항체를 수득하기 위한 일반적 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그러나, 치료 잠재력이 있는 항체를 특이적으로 수득하기 위한 방법은 이러한 항체를 발현하는 B 세포의 낮은 빈도, 느린 증식 속도 및 낮은 항체 분비 수준에 의해 일반적으로 제한된다. 예를 들어, 규정된 특이성을 갖는 기억 B 세포는 전형적으로 백만개의 말초 혈액 단핵 세포 또는 대략 1 밀리리터의 혈액당 오직 1개의 세포만을 차지한다 (Lanzavecchia et al., Curr. Opin. Immunol., 21:298-304 (2009): Yoshida et al., Immunol. Rev., 237:117-139 (2010)). 치료 잠재력을 갖는 항체의 빈도는 암 환자에서 오히려 더 낮을 것이어서, 이러한 세포를 높은 민감도 및 효율로 단리하는 것을 가능하게 하는 신규 접근법의 개발이 필요하다.

통상적인 방법은 시험관내 배양 및/또는 면역화 동물 모델 (예를 들어, 마우스)의 사용에 의한 기억 B 세포의 항체 분비 세포로의 전환에 일반적으로 의존한다 (Crotty et al., J. Immunol., 171:4969-4973 (2003): Fecteau et al., Immunology, 128:e353-e365 (2009): Buisman et al., Vaccine, 28:179-186 (2009): Corti et al., PLoS One, 5:e8805 (2010)). 예를 들어, 최대 1주일의 시험관내 배양 후에, 배양물 상청액에서 항체가 측정될 수 있고, 효소-연결된 면역흡착 스팟 (ELISPOT) 검정을 사용하여 항체 분비 세포의 빈도가 평가될 수 있다. 이러한 방법의 한계가 보고되어 있다 (Henn et al., J. Immunol., 183:31777-3187 (2009): Cao et al., J. Immunol., Methods, 358:56-65 (2010)). 예를 들어, 기억 B 세포의 시험관내 배양은 기억 B 세포 표현형을 별개의 기능적 특성을 갖는 형질 세포를 닮도록 변경시킨다 (Jiang et al., Eur. J. Immunol., 37:2205-2213 (2007): Huggins et al., Blood, 109:1611-1619 (2007): Jourdan et al., Blood, 114:5173-5181 (2009)). 형광 항원-기반 방법의 한계가 또한 보고되어 있다 (Hofer et al., Immunol. Rev., 211:295-302 (2006): Odendahl et al., Blood, 105:1614-1621 (2005); Kunkel et al., Nat. Rev. Immunol., 3:822-829 (2003): Scheid et al., Nature, 458:636-640 (2009): Wu et al., Science, 329:856-861 (2010)).

치료 잠재력을 갖는 항체를 특이적으로 수득하거나 또는 표적화하는 개선된 방법이 요구된다.

MICA는 대부분의 인간 NK 세포, γδ T 세포, 및 CD8+ T 세포 상에서 발현되는 C-유형 렉틴-유사, II형 막횡단 수용체인 NKG2D에 대한 리간드이다. 라이게이션 시, NKG2D는 퍼포린 의존성 세포용해를 유발하도록, 그리고 공-자극을 제공하도록 어댑터 단백질 DAP10을 통해 신호를 전달한다. 인간에서, NKG2D 리간드는 MHC 부류 I 쇄-관련 단백질 A (MICA), 밀접하게 관련된 MICB, UL-16 결합 단백질 (ULBP) 1-4, 및 RAE-1G를 포함한다. 건강한 조직에서는 NKG2D 리간드가 통상적으로 발견되지 않지만, DNA 손상을 비롯한 다양한 형태의 세포 스트레스가 리간드 발현을 상향 조절할 수 있고, 이는 흑색종을 비롯한 다수의 고형 및 혈액 악성종양에서의 이들의 빈번한 검출을 초래한다. 항-NKG2D 차단 항체로 처리된 NKG2D 결핍 및 야생형 마우스가 증진된 종양 감수성을 나타내기 때문에, 리간드 양성 형질전환된 세포를 통한 NKG2D 활성화는 외인성 종양 억제에 기여한다. 그러나, 종양 세포로부터 NKG2D 리간드의 쉐딩에 의해 환자에서 면역 회피가 달성될 수 있고, 이는 표면 NKG2D의 내재화 및 세포독성 림프구의 기능 손상을 유발한다. 가용성 NKG2D 리간드는 Fas 리간드, IL-10, 및 TGF-β를 통한 항종양 세포독성을 길항할 수 있는 조절 NKG2D+CD4+Foxp3- T 세포의 확장을 또한 자극할 수 있다. MICA는 종양 세포로부터 쉐딩된, 즉 세포 표면으로부터 주변 매질 내로 방출된 NKG2D 리간드이고, 암 환자로부터의 혈청은 전형적으로 상승된 수준의 가용성 형태 (sMICA)를 함유한다. MICA 쉐딩은 단백질 디술피드 이소머라제 ERp5와의 상호작용을 통해 부분적으로 달성되고, 이는 중요한 시스테인과 디술피드 결합을 형성하고, 이러한 결합은 α3 도메인의 언폴딩을 초래하여 ADAM-10/17 및 MMP14에 의한 단백질분해에 대해 감수성이게 한다.

면역-기반 암 요법으로서 암 표적을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 새로운 작용제를 확인할 필요가 있다. 이러한 작용제는 종양 발생과 연관된 질환 병태에서의 진단성 스크리닝 및 치료적 개입에 유용할 것이다.

본 개시내용은 치료 잠재력을 갖는 항체에 관한 조성물 및 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA), 또는 그 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 조성물의 펩티드는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 CDR2, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR2, 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 상보성 결정 영역 CDR2, 또는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR2, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 CDR1, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR1, 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 상보성 결정 영역 CDR1, 또는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR1, 또는 둘 다를 포함한다.

일부 측면에서, 펩티드는 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역이 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 150 또는 168 내의 영역이 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 서열 150 또는 168에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역이 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 152 또는 170 내의 영역이 표 1에 제시된 항체 ID 11 또는 12의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 서열 152 또는 170에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 150 또는 168을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 152 또는 170을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 특정한 항체에 의해 인식된 에피토프의 전체 또는 일부를 포함하는 MICA 내의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편인 펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA*009 참조 서열 (서열 185)의 아미노산 181 내지 274에 상응하는 MICA α3 도메인 내의 영역을 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 131을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 133을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 아미노산 서열 GDVLPDGNGTYQTWVATRIC (서열 186)를 포함하거나 그와 중첩되는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산의 MICA의 적어도 하나의 부분을 포함하는 에피토프를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 113을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 115를 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 아미노산 서열 NVETEEWTVP (서열 187)를 포함하거나 그와 중첩되는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산의 MICA의 적어도 하나의 부분을 포함하는 에피토프를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 150을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 152를 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 아미노산 서열 TVPPMVNVTR (서열 188)을 포함하거나 그와 중첩되는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산의 MICA의 적어도 하나의 부분을 포함하는 에피토프를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 168을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 170을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 아미노산 서열 TCRASSFYPR (서열 189)을 포함하거나 그와 중첩되는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산의 MICA의 적어도 하나의 부분을 포함하는 에피토프를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 77을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 79를 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 2를 포함하는 V_H 쇄 및 서열 11을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 서열 96을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 98을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

일부 측면에서, 펩티드에 더하여, 조성물은 1종 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종, 또는 20종 미만)의 항암 치료제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 제약 조성물 (예를 들어, 대상체에게 투여하기 위한)로서 제제화된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA), 또는 그 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 조성물의 핵산은 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H를 코딩한다. 일부 측면에서, 조성물의 핵산은 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_L을 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 1에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 2에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 10에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 11에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 76에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 77에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 78에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 79에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 95에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 96에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 97에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 98에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 112에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 113에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 114에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 115에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 130에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 131에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 132에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 133에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 149에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 150에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 151에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 152에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 168에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 170에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 MICA 및 세포내 T 세포 도메인에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 한 측면에서, CAR에 포함되는 펩티드는, 서열 2에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 2 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 또는 서열 11에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 11 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 2를 포함하는 V_H 쇄 및 서열 11을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

한 측면에서, CAR에 포함되는 펩티드는, 서열 77에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 77 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 또는 서열 79에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 79 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 77을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 79를 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

한 측면에서, CAR에 포함되는 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드는, 서열 96에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 96 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 및 서열 98에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 98 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 96을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 98을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

한 측면에서, CAR에 포함되는 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드는, 서열 113에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 113 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 또는 서열 115에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 115 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 113을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 115를 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

한 측면에서, CAR에 포함되는 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드는, 서열 131에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 131 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 또는 서열 133에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 133 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 131을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 133을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

한 측면에서, CAR에 포함되는 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드는, 서열 150에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 150 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 또는 서열 152에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 152 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 150을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 152를 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

한 측면에서, CAR에 포함되는 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드는, 서열 168에 대해 동일성을 갖는 V_H 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 168 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편; 또는 서열 170에 대해 동일성을 갖는 V_L 쇄를 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 상응하는 영역은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, FR1, FR2, FR3, FR4에 상응하는 서열 170 내의 영역은 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_L의 FR1, FR2, FR3, FR4에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 펩티드는 서열 168을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 170을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 개시내용은 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터)를 제공한다. 한 측면에서, 벡터는 서열 10, 78, 97, 114, 132, 151 또는 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 11, 79, 98, 115, 133, 152 또는 170에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

또 다른 측면에서, 벡터는 서열 1, 76, 95, 112, 130, 149 또는 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 2, 77, 96, 113, 131, 150 또는 168에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

또 다른 측면에서, 벡터는 서열 1, 76, 112, 130, 또는 149에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 2, 77, 96, 113, 131, 또는 150에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 1에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 2에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 10에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 11에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 76에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 77에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 78에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 79에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 95에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 96에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 97에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 98에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 112에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 113에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 114에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 115에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 130에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 131에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 132에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 133에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 149에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 150에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 151에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 152에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 168에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 170에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 대상체에게 본원에 개시된 펩티드 및/또는 핵산 중 1종 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 면역요법 후에 암 환자로부터 인간 항체를 단리하는 방법을 또한 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체를 확인하는 단계, 다량체 형태의 자기 항원을 제공하는 단계, 다량체 형태의 자기 항원을, 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체로부터의 샘플과 접촉시키는 단계, 및 다량체 형태의 자기 항원에 결합된 면역 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 대상체로부터 자기 항원에 대해 지시된 면역 세포를 수득하는 방법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체를 확인하는 단계; 다량체 형태의 자기 항원을 제공하는 단계; 다량체 형태의 자기 항원을, 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체로부터의 샘플과 접촉시키는 단계; 및 다량체 형태의 자기 항원에 결합된 면역 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 자기 항원에 대해 지시된 암 환자로부터의 면역 세포를 수득하는 방법을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. 방법 및 물질이 본 발명에서 사용하기 위해 본원에 기재되어 있고; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 이러한 물질, 방법 및 예는 단지 설명적이고, 제한적으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본 명세서 (정의 포함)가 제어할 것이다.

본 발명의 다른 특징 및 장점이 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1 | 항체 ID 1 (항-MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA) 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 1).
도 2 | 항체 ID 1 (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 2).
도 3 | 항체 ID 1 (항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 10).
도 4 | 항체 ID 1 (항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 11).
도 5A-5F | B-세포로부터 항체를 제조하기 위한 예시적인 방법을 예시한다. (A) 항원이 부위-특이적 비오티닐화 및 형광-표지 스트렙타비딘으로의 사량체화를 위한 BirA 태그와 함께 발현된다. (B) B 세포가 사량체 및 모노클로날 항체의 패널로 염색된다. 사량체⁺, 부류-전환 기억 B 세포가 PCR 스트립 내로 단일-세포 분류된다. (C) T7 RNA 폴리머라제로 mRNA 증폭이 수행된다. (D) 300-400bp PCR 생성물을 사용하여 PCR 생성물의 서열분석이 수행된다. (E) 중첩 PCR이 별개의 벡터 내로 클로닝되는 전장 IgG1 중쇄 및 카파/람다 경쇄 서열의 구축에 사용된다. 완전 인간 재조합 항체의 발현을 위해 벡터가 CHO-S 세포 내로 일시적으로 형질감염된다. (F) 항체가 항원 결합에 대해 시험되고, 잠재적인 치료 특성에 대해 평가된다.
도 6A-6B | 기억 B 세포의 확인을 위한 단량체 및 사량체 항원의 비교를 보여주는 그래프. (A) 모노-비오티닐화 TTCF 또는 CD80 항원이 알렉사(Alexa)-488 형광단으로 직접적으로 표지되었고; 표지되지 않은 스트렙타비딘으로 사량체가 생성되었다. 각각의 공여자로부터의 풍부화된 B 세포를 3개의 분획으로 분할하고, 0.125 μg/mL의 동일한 총 항원 농도의 대조군 CD80 사량체, TTCF 단량체, 또는 TTCF 사량체로 염색하였다. FACS 플롯은 CD19⁺ CD27⁺ IgM^- 부류-전환 기억 B 세포를 도시하고; 게이트 부근의 숫자는 모 게이트의 백분율을 나타낸다. (B) 3개의 상이한 공여자에서 검출된 사량체⁺ 기억 B 세포의 빈도. 수는 1x10⁶개의 CD19⁺ 기억 B 세포당 사량체⁺ 세포로서 계산된다.
도 7A-7B | 형질모구 및 기억 B 세포로부터 생성된 항체에 의한 TTCF의 고친화도 결합을 보여주는 선 그래프. 포화 결합 실험을 수행하여 재조합 항체의 친화도를 결정하였다. TTCF 항원이 유로퓸으로 표지되었고, 이는 킬레이팅 시약과의 인큐베이션 시 615 nm에서 강한 형광 신호를 방출한다. 항체를 96-웰 플레이트에 고정시켰고, TTCF-유로퓸 (100nM 내지 4pM)과 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 615 nm에서의 형광 카운트를 기록하였고, 비-선형 회귀 분석을 사용하여 K_D를 계산하였다. 또한, CHO-S 세포에서 생산된 대조군 항체 (클론 8.18.C5)가 모든 실험에 포함되었다. (A) 재조합 TTCF Ab 1 및 2는 TTCF 사량체⁺ 형질모구 (공여자 1)로부터 생성되었다. (B) TTCF 항체 3, 4, 및 5는 3개의 상이한 공여자의 TTCF 사량체⁺ 기억 B 세포로부터 유래되었다.
도 8 | MICA-코팅 루미넥스 비드에 대한 항-MICA 항체의 결합을 보여주는 막대 차트.
도 9A-9O | MICA-코팅 비드에 대한 항-MICA 항체의 결합을 보여주는 선 그래프.
도 10 | 항체 ID 6 (항-MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA) 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 76).
도 11 | 항체 6 (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 77).
도 12 | 항체 ID 6 (항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 78).
도 13 | 항체 ID 6 (항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 79).
도 14 | 항체 ID 7 (항-MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA) 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 95).
도 15 | 항체 ID 7 (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 96).
도 16 | 항체 ID 7 (항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 97).
도 17 | 항체 ID 7 (항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 98).
도 18 | 항체 ID 8 (항-MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA) 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 112).
도 19 | 항체 ID 8 (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 113).
도 20 | 항체 ID 8 (항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 114).
도 21 | 항체 ID 8 (항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 115).
도 22 | 항체 ID 9 (항-MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA) 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 130).
도 23 | 항체 ID 9 (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 131).
도 24 | 항체 ID 9 (항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 132).
도 25 | 항체 ID 9 (항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 133).
도 26A-G | 재조합 항-MICA 항체에 의한 MICA 대립유전자-특이적 결합의 평가를 보여주는 선 그래프.
도 27 | 항-MICA 항체 CM24002 Ab2에 의한 자가 종양 세포의 표지를 보여주는 선 그래프.
도 28 | 혈청 MICA에 의한 NKG2D의 조절을 보여주는 일련의 FACS 플롯. 인간 NK 세포를 1:10 희석된 환자 CM24002로부터의 대조군 혈청과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 지시된 항체를 10 μg/ml의 농도로 인큐베이션을 시작할 때 첨가하였다. 유동 세포측정법에 의해 CD56+ NK 세포 상에서 NKG2D 발현을 평가하였다.
도 29 | 재조합 MICA에 의한 NKG2D의 조절을 보여주는 일련의 FACS 플롯. 인간 NK 세포를 2 ng/ml 농도의 재조합 MICA와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 지시된 항체를 10 μg/ml의 농도로 인큐베이션을 시작할 때 첨가하였다. 48시간 후에, 유동 세포측정법에 의해 CD56+ NK 세포 상에서 NKG2D 발현을 평가하였다.
도 30 | 항-MICA 항체 CM24002 Ab2에 의한 세포-매개 독성의 증진을 입증하는 선 그래프. 인간 NK 세포를 10 μg/ml의 지시된 항체의 존재 하에 재조합 MICA (2ng/ml)와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 지시된 비로의 4시간 인큐베이션 후의 LDH 방출을 측정함으로써, K562 표적 세포를 사멸시키는 NK 세포 (이펙터)의 능력을 평가하였다.
도 31 | 항-MICA 항체 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29에 의한 세포-매개 독성을 입증하는 막대 그래프. 인간 NK 세포를 10μg/ml의 지시된 항체의 존재 하에 재조합 MICA (2ng/ml)와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션 후의 LDH 방출을 측정함으로써, K562 표적 세포를 사멸시키는 NK 세포 (이펙터)의 능력을 평가하였다. 이펙터 및 표적 세포의 4시간 인큐베이션 동안 NKG2D 차단 항체 또는 Fc 차단 항체를 첨가하여, 세포-매개 독성에 대한 Fc 수용체 및 NKG2D의 기여를 평가하였다.
도 32 | 재조합 항-MICA 항체에 의한 MICA 알파 3 도메인의 결합을 보여주는 일련의 선 그래프. 재조합 MICA 알파 3 도메인을 비오티닐화시키고, 스트렙타비딘-코팅 비드의 표면 상에 포획시켰다. 10 μg/ml의 지시된 항체를 개별적인 재조합 단백질로 코팅된 비드와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 비드를 세척하고, FITC-접합 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 유동 세포측정법에 의해 FITC 형광을 정량화하였다.
도 33 | 항-MICA 항체 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29에 의한 종양 세포의 표지를 입증하는 선 그래프. 유동 세포측정법에 의해 형광을 결정하였다.
도 34 | 루미넥스 검정에 의해 결정된 바와 같은 항-MICA 항체 CM33322 Ab29의 MICA 대립유전자 특이성을 입증하는 막대 그래프.
도 35 | 항체 ID 11 (항-MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA) 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 149).
도 36 | 항체 11 (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 150).
도 37 | 항체 ID 11 (항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 151).
도 38 | 항체 ID 11 (항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 152).
도 39 | 진행성 흑색종을 가진 환자에서의 혈청 MICA 농도를 입증하는 막대 그래프. 혈청 MICA는 상업적으로 입수가능한 샌드위치 ELISA를 사용하여 검출하였다. 혈청은 1:10 희석하여 시험하였다.
도 40 | 항-MICA 항체가 흑색종 환자 혈청과 함께 인큐베이션된 NK 세포에 대한 NKG2D 하향-조절을 차단하는 것을 보여주는 표. PBMC를 대조군 혈청, 또는 가용성 MICA를 단독으로 또는 100ug/ml의 지시된 항체의 존재 하에 함유하는 흑색종 환자 샘플과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간째에, NKG2D 발현을 유동 세포측정법에 의해 NK 세포 (CD3-, CD8-, CD56+) 상에서 결정하였다. 데이터는 NKG2D 양성인 NK 세포의 %로서 나타내어진다.
도 41-43 | 항-MICA 항체가 흑색종 환자 혈청과 함께 인큐베이션된 NK 세포에 의해 K562 표적 세포의 NKG2D-매개 세포독성을 증진시키는 것을 보여주는 일련의 그래프. PBMC를 대조군 혈청, 또는 가용성 MICA를 단독으로 또는 100ug/ml의 지시된 항체의 존재 하에 함유하는 흑색종 환자 샘플과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간째에, 세포를 세척하고, 20:1 이펙터 대 표적 비로 ⁵¹Cr 표지된 K562 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비용해도를 4시간 후에 섬광 계수에 의해 평가하였다.
도 44 | 인간 MICA를 발현시키기 위해 형질도입된 B16 흑색종 세포에 대한 항-MICA 항체 CM33322 Ab29의 결합을 보여주는 그래프. 10ug/ml의 지시된 항체를 B16 흑색종 세포 및 인간 MICA를 발현시키기 위해 형질도입된 B16 흑색종 세포와 함께 인큐베이션하였고, 염색을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
도 45 | B16-MICA 종양이 비장 NK 세포 및 종양-침윤 NK 세포 상에서의 NKG2D 발현을 하향-조절한다는 것을 입증하는 일련의 그래프. NKG2D 발현을 비-종양 마우스의 비장 또는 종양-보유 동물의 비장 및 종양으로부터 단리된 NK 세포 (CD3-, CD8-, CD335+) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
도 46 | 항-MICA 항체 처리가 B16-MICA 종양 보유 마우스에서 혈청-MICA 수준을 감소시킨다는 것을 입증하는 일련의 그래프. B16-MICA 종양 보유 B6 마우스를 1주에 3회 꼬리 정맥 주사를 통해 CM33322 Ab29의 100ug 또는 200ug/용량으로 처리하였다. 초기 처리 후 1주째에, 혈액을 수집하고, 혈청 MICA를 ELISA에 의해 측정하였다.
도 47 | 항-MICA 항체의 투여가 샌드위치 ELISA에 의한 MICA 검출을 방해하지 않는다는 것을 보여주는 그래프. 재조합 MICA를 18시간 동안 회전 하에 1000-배 과량의 항체와 함께 인큐베이션하였다. MICA 농도를 샌드위치 ELISA에 의해 결정하였다.
도 48 | 항-MICA 항체 CM33322 Ab29를 사용한 B16-MICA 종양 보유 마우스의 처리가 종양 성장을 중지시킨다는 것을 입증하는 그래프. B16-MICA 종양 보유 마우스를 종양이 5mm 직경에 도달했을 때 시작하여 200ug/용량의 마우스 IgG2a/κ 이소형 대조군 또는 항-MICA 항체 CM33322 Ab29로 정맥내 처리하였다. 용량을 1주에 3회 투여하고, 종양 부피를 매일 기록하였다. 화살표는 용량 투여를 나타내었다.
도 49 | 종양 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시키는 항-MICA 항체의 능력을 입증하는 일련의 그래프. RPMI-8226 세포를 10ug/ml 이소형 대조군 항체, CM33322 Ab29 또는 CM24002 Ab2의 존재 하에 배양하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, MICA 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하고, 조건화 배지 내 쉐딩된 MICA를 샌드위치 ELISA에 의해 평가하였다.
도 50 | 항체 ID 12 (CM33322 Ab28)(항-MICA 항체)의 가변 중쇄 (V_H)의 핵산 서열 (서열 167).
도 51 | 항체 ID 12 (CM33322 Ab28) (항-MICA 항체)의 V_H 쇄의 아미노산 서열 (서열 168).
도 52 | 항체 ID 12 (CM33322 Ab28)(항-MICA 항체)의 가변 경쇄 (V_L)의 핵산 서열 (서열 169).
도 53 | 항체 ID 12 (CM33322 Ab28)(항-MICA 항체)의 V_L 쇄의 아미노산 서열 (서열 170).
도 54 | 항-MICA 항체 CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 및 CM33322 Ab28에 의한 세포-매개 독성을 입증하는 막대 그래프. ⁵¹Cr 표지된 K562 세포를 30분 동안 지시된 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 30분째에, 전체 PBMC를 20:1 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 비용해도를 4시간 후에 섬광 계수에 의해 평가하였다.
도 55 | 종양 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시키는 항-MICA 항체의 능력을 입증하는 일련의 그래프. RPMI-8226 세포를 이소형 대조군 항체, CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 또는 CM33322 Ab28의 존재 하에 배양하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, MICA 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하고, 조건화 배지 내 쉐딩된 MICA를 샌드위치 ELISA에 의해 평가하였다.
도 56 | 항-MICA 항체가 흑색종 환자 혈청과 함께 인큐베이션된 NK 세포에 의해 K562 표적 세포의 NKG2D-매개 세포독성을 증진시키는 것을 보여주는 선 그래프. PBMC를 대조군 혈청, 또는 가용성 MICA를 단독으로 또는 지시된 항체의 존재 하에 함유하는 흑색종 환자 샘플과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간째에, 세포를 세척하고, 20:1, 10:1 및 5:1 이펙터 대 표적 비로 ⁵¹Cr 표지된 K562 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비용해도를 4시간 후에 섬광 계수에 의해 평가하였다.
도 57 | 혈청 MICA에 의한 NKG2D의 조절을 보여주는 일련의 FACS 플롯. 전체 PBMC를 대조군 혈청 또는 흑색종 혈청 단독과 함께 또는 지시된 항체의 존재 하에 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, NKG2D 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
도 58 | 항-MICA 항체 CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab28에 의한 세포-매개 독성을 보여주는 선 그래프. 전체 PBMC를 지시된 항체, 음성 대조군 항체 (TTCF 특이적) 또는 양성 대조군 항체 (바이오레전드(BioLegend))의 존재 하에 재조합 MICA (rMICA)와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 비용해도를 4시간 후에 ⁵¹Cr 방출에 의해 평가하였다.
도 59 | 재조합 MICA에 의한 NKG2D의 조절을 보여주는 일련의 FACS 플롯. 전체 PBMC를 대조군 혈청 또는 rMICA 단독과 섞은 또는 지시된 항체의 존재 하의 혈청과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, NKG2D 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
도 60A-60D | A. CM33322 Ab29의 에피토프는 MICA*009의 아미노산 서열 (서열 185) 내에 제시되어 있다; B. CM33322 Ab4의 에피토프는 MICA*009의 아미노산 서열 (서열 185) 내에 제시되어 있다; C. CM33322 Ab11의 에피토프는 MICA*009의 아미노산 서열 (서열 185) 내에 제시되어 있다. D. CM33322 Ab23의 에피토프는 MICA*009의 아미노산 서열 (서열 185) 내에 제시되어 있다.
도 61 | MICA*009 참조 구조 상의 CM33322Ab29, CM33322Ab4 및 CM33322Ab28에 대한 에피토프의 맵핑. 에피토프 맵핑을 중첩 펩티드 어레이를 사용하여 수행하였다. 각각의 펩티드는 각각의 펩티드에 대해 10개 아미노산 오프셋을 갖는 20개 아미노산 선형 서열이었다.
도 62a-62c | 항체 CM24002 Ab2, CM33322Ab29 및 CM33322Ab28이 인간 (a) NK 세포 및 (b) CD8 T 세포에 대해 NKGD 수용체 하향조절을 방지하고; (c) CM24002 Ab2 및 CM33322Ab28 항체가 sMICA에 의한 CD8 T 세포 세포독성의 억제를 방지한다는 것 (NY-ESO에 대해 특이적인 클론, ⁵¹Cr 표지된 Mel375 세포, 20:1 E:T 비)을 보여주는 일련의 막대 그래프. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 대표한다.
도 63a-63c | (a) ELISA에 의해 측정된 바와 같이 MICA 항체가 MICA α3 도메인에 결합하고; (b) MICA α3 도메인-특이적 항체가 48시간 인큐베이션 동안 RPMI-8226 세포 상 MICA 표면 수준을 증가시키고; (c) 48시간 인큐베이션 동안 A375 세포에 의한 MICA 쉐딩을 억제한다는 것을 보여주는 일련의 그래프 (sMICA에 대한 상청액의 ELISA). 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 대표한다.
도 64a-64b | 인간 U937 종양 세포가 이식된 SCID 마우스에서, 1주 동안 MICA 항체를 사용한 처리가 (1주에 3x 100μg Ab) (a) 종양 균질물에서 sMICA를 감소시키고 (종양 덩이에 대해 정규화됨); (b) 종양 세포의 표면 상 MICA 발현을 증가시킴 (유동 세포측정법)을 보여주는 일련의 그래프. 데이터는 3개의 독립적 실험의 조합을 나타낸다 (n=10마리 마우스/군/실험).
도 65a-65f | MICA mAb (3x 100μg)로 1주 동안 처리된 U937 종양 보유 SCID 마우스에서 NK 세포 기능의 평가를 보여주는 일련의 그래프. 항체 처리는 종양-침윤 CD45⁺ NK1.1⁺ NK 세포에 의한 NKG2D (a) 및 NKp46 (b)의 표면 수준을 증가시키고, 종양 내 NK 세포 축적을 유도하였다 (c) (1x10⁵개의 CD45⁺ 세포에 대해 정규화됨). 처리는 종양 침윤 CD45⁺ NK1.1⁺ NK 세포에 의한 IFNγ (d) 및 퍼포린 (e) 발현을 증가시켰다. (f) 모든 3종의 인간 MICA 항체는 비장세포에 의한 ⁵¹Cr 표지된 YAC-1 세포의 생체외 사멸을 증진시켰다.

본 개시내용은, 부분적으로, 질환에서 중요한 치료 표적에 대해 지시된 항체가 질환에 노출된 인간 대상체로부터 사량체 형태의 관심 항원으로 B 세포를 표지하는 것에 의해 수득될 수 있다는 관찰을 기초로 한다. 상기 배경 섹션에서 기재된 바와 같이, 이전의 방법은 적어도 이들이 인간 대상체에서 적절한 B 세포를 확인하는데 비효율적이라는 점에서 및/또는 이들이 임의의 포획된 B 세포가 표현형 변화를 겪도록 야기하여 그의 가치를 감소시키기 때문에 제한된다. 대조적으로, 특이적 질환-관련 항원에 대해 지시된 희귀 기억 B 세포의 포획을 허용하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 하기에 기재된 바와 같이, 이러한 방법은 질환-관련 항원의 사량체화를 필요로 하고, 이러한 프로세스는 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 적절한 기억 B 세포의 확인을 증진시킨다. 구체적으로, 본원의 방법은 항원에 대한 대상체의 최초 노출 후에 증가된 기간 동안 적절한 기억 B 세포의 더욱 효율적인 포획을 허용한다. 본원의 방법은 본원에 개시된 방법을 사용하여 포획된 기억 B 세포로부터 수득된 유전 물질을 사용하여 생성된 항체 (및 이러한 항체의 서열로부터 생성된 펩티드)를 또한 포함한다.

MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 대한 인간 항체가 본원에 기재되어 있다. MICA에 대한 이들 인간 항체는 사량체 항원의 사용을 수반하는 방법에 의해 세포-기반 암 백신 (GM-CSF가 형질도입된 자가 종양 세포)을 제공받은 환자로부터 확인되었다.

일부 경우에, 본 개시내용은 선택된 인간 대상체로부터 치료 잠재력이 있는 항체를 특이적으로 수득하거나 표적화하는 방법, 및 이로부터 생성된 치료 조성물을 제공한다. 이러한 방법은 인간 대상체로부터 예를 들어 B 세포 및/또는 기억 B 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역 세포를 수득하거나 표적화하는 단계, 수득 또는 표적화된 면역 세포로부터 유전 물질 (예를 들어, DNA 및/또는 mRNA)을 단리 또는 정제하는 단계, 및 단리 또는 정제된 유전 물질을 사용하여 치료 조성물, 예를 들어 본원에 개시된 치료 조성물을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법의 추가적인 설명이 하기 표제 "방법" 섹션 하에 제공된다.

일부 경우에, 본 개시내용은 병태 또는 질환에 걸려 있거나 걸렸었고 이러한 병태 또는 질환에 대해 양성 면역 반응을 나타낸 대상체 내에 존재하는 항체에 관련된 치료 조성물 (예를 들어, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 및/또는 항체 접합체를 비롯한 치료 펩티드를 포함함)을 제공한다.

치료 조성물

일부 경우에, 본원의 치료 조성물은 질환 또는 병태에 관련된 결합 파트너 (예를 들어, 면역원(들), 항원(들), 및/또는 에피토프(들))와 상호작용할 수 있고 (예를 들어, 결합하고/거나, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함), 여기서 치료 조성물과 결합 파트너 사이의 상호작용은 이러한 병태 또는 질환에 대한 양성 면역 반응 (예를 들어, 대상체에서의 질환 또는 그의 증상의 수준에서의 감소)을 생성한다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 가변 중쇄 (V_H) 및/또는 가변 경쇄 (V_L)의 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6개)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 (예를 들어, 이러한 영역을 포함하거나, 이러한 영역으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이러한 영역으로 이루어진) 펩티드를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 가변 중쇄 (V_H) 및/또는 가변 경쇄 (V_L)의 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6개)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고 (예를 들어, 이러한 영역을 포함하거나, 이러한 영역으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이러한 영역으로 이루어지고), MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA (예를 들어, 유니진(UniGene) Hs.130838)) (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)) (이들의 에피토프 포함)와 상호작용하는 (예를 들어, 결합하고/거나, 특이적으로 결합하고/거나, 면역특이적으로 결합하는) 펩티드를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 펩티드는 적어도 2개의 CDR을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 2개의 CDR은 상이한 항체에 대해 표 1에 제시된 CDR이다. 다시 말해서, 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12에 대해 표 1에 제시된 CDR (및 FR 및/또는 AA 서열)이 상호교환가능하고, 펩티드가 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합하는 한 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합하는 한) 펩티드가 생성되도록 조합될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9 및/또는 11의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 2, 77, 96, 113, 131, 150 또는 168 중 1개 및/또는 서열 11, 79, 98, 115, 133, 152 또는 170 중 1개를 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 예를 들어 약 10 nM일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 1의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 1의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 1의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 1의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 2 및/또는 서열 11을 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 예를 들어 약 10 nM일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 6의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 6의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 6의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 6의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 77 및/또는 서열 79를 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 약 50 nM 내지 200 nM, 또는 1nM 내지 20 nM, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.10 nM 이하일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 7의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 7의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 7의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 7의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 96 및/또는 서열 98을 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 약 50 nM 내지 200 nM, 또는 1nM 내지 20 nM, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.10 nM 이하일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 8의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 8의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 8의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 8의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 113 및/또는 서열 115를 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 약 50 nM 내지 200 nM, 또는 1nM 내지 20 nM, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.10 nM 이하일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 9의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 9의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 9의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 9의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 131 및/또는 서열 133을 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 약 50 nM 내지 200 nM, 또는 1nM 내지 20 nM, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.10 nM 이하일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 11의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 11의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 11의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 11의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 150 및/또는 서열 152를 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 약 50 nM 내지 200 nM, 또는 1nM 내지 20 nM, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.10 nM 이하일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합함). 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H 및 V_L의 CDR3 및 항체 ID 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1 및/또는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 항체 ID 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 표 1에 제시된, 항체 ID 12의 V_H 및/또는 V_L의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 항체 ID 12의 V_H 및/또는 V_L의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 중 적어도 1개를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 펩티드는 서열 168 및/또는 서열 170을 포함한다. 각 경우에, 펩티드는 MICA (예를 들어, 인간 MICA (예를 들어, 가용성 MICA (sMICA)))에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합하고/거나 면역특이적으로 결합할 수 있음). 일부 경우에, 펩티드와 MICA 사이의 결합 친화도는 약 0.1nM 내지 1μM, 약 50 nM 내지 200 nM, 또는 1nM 내지 20 nM, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.10 nM 이하일 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 서열 2 및/또는 서열 11; 서열 77 및/또는 서열 79; 서열 96 및/또는 서열 98; 서열 113 및/또는 서열 115; 서열 131 및/또는 서열 133; 서열 150 및/또는 서열 152; 및 서열 168 및/또는 170을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.

<표 1>

^* 서열은 제시된 서열에 대해 (예를 들어, 적어도) 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, 및/또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 변이체를 포함한다.

^** 서열은 1, 2, 3, 4, 5개, 5개 미만, 또는 10개 미만의 보존적 아미노산 변형을 포함할 수 있다.

^# 서열은, 예를 들어 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4에 상응하는 영역 내에서 제시된 서열에 대해 (예를 들어, 적어도) 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, 및/또는 100% 서열 동일성을 갖고/거나 CDR 1, 2 및/또는 3에 상응하는 영역 내에서 1, 2, 3, 4, 5개, 5개 미만, 또는 10개 미만의 보존적 아미노산 변형을 갖는 서열 또는 변이체를 포함한다.

^## 서열은 제시된 서열에 대해 (예를 들어, 적어도) 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, 및/또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 변이체를 포함하며, 여기서 서열은 상응하는 AA를 코딩한다.

A.A.^#은 V_H 또는 V_L 아미노산 서열을 나타낸다.

핵산 ^##은 V_H 또는 V_L 핵산 서열을 나타낸다.

CDR 및 FR 영역이 상기에 제시된 한편, 이러한 영역은 또한 카바트(Kabat) (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991))에 따라 정의될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 넘버링은 또한 카바트에 따른다.

"펩티드"는 쇄의 길이에 대한 상한치 없이, 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질 내 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형 예컨대, 비제한적으로, 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합 형성을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 "폴리펩티드" 및 "단백질"과 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

일부 경우에, 치료 조성물은 예를 들어 항체 (전장 및/또는 무손상 항체 포함) 또는 항체 단편을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다. "항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는, 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 또한 포함한다. 항체는 임의 부류, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)의 항체를 포함하고, 항체가 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM인 이뮤노글로불린의 5개의 주요 부류가 있고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형상이 널리 공지되어 있다.

예시적인 항체 및 항체 단편은 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 상이한 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 낙타화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 Fv (scFv), 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분), 디술피드-연결 Fv (dsFv), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 인트라바디, 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 항체 단편 또는 인간화 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 비-자연 발생 항체, 예컨대 자연 발생 항체에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 차이 (예를 들어, 치환, 부가, 또는 결실)를 포함하는 항체이다. 1개 이상의 아미노산 차이는 경쇄 내 및/또는 중쇄 내에 존재할 수 있고, CDR 중 1개 이상 내, 프레임워크 영역 내 또는 불변 영역 내, 예를 들어 CL, CH1, 힌지, CH2 또는 CH3 내에 존재할 수 있다.

항체는 전형적으로, 10^-5 내지 10^-11 M 또는 그 미만의 해리 상수 (K_D)에 의해 반영되는 고친화도로 그의 동족 항원과 특이적으로 결합한다. 약 10^-4 M보다 큰 임의의 K_D는 일반적으로, 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같은, 항원과 "특이적으로 결합하는" 항체는 이러한 항원 및 실질적으로 동일한 항원과 고친화도로 결합하지만 (이는 10^-7M 이하, 바람직하게는 10^-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10^-9M 이하, 가장 바람직하게는 10^-8 M 내지 10^-10 M 또는 그 미만의 K_D를 갖는 것을 의미함), 무관한 항원과는 고친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 항원이 주어진 항원에 대해 고도의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 예를 들어 주어진 항원의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 경우에, 이러한 항원은 주어진 항원과 "실질적으로 동일하다". 예로서, 인간 MICA에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 특정 영장류 종으로부터의 MICA 항원 (예를 들어, 시노몰구스 MICA)과 교차-반응성을 가질 수 있지만, 다른 종으로부터의 MICA 항원과는, 또는 MICA 이외의 항원과는 교차-반응하지 않을 수 있다.

항체의 단편은 이들이 전장 항체의 항원-결합 부분을 함유하고 전장 항체의 목적 친화도 및 특이성을 보유하는 한 제공된 방법에서 사용하기에 적합하다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, 인간 MICA)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 이러한 "단편"은, 예를 들어 약 8 내지 약 1500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10 내지 약 50 또는 100개 아미노산 길이이다. 따라서, 항-MICA 항체의 단편은 Fv 부분에서 MICA 각각에 결합하는 능력 및 FC 부분에서 수지상 세포, 대식세포, 호중구, B-세포 및 NK 세포 상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 이러한 단편은 상응하는 전장 항-MICA 항체와 유사한 특성을 특징으로 하며, 즉 단편은 각각 인간 세포의 표면 상에 발현된 인간 MICA 항원 또는 배지 내로 쉐딩된 상응하는 sMICA 항원에 특이적으로 결합할 것이다.

항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) V_L, V_H, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_H 및 V_L 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) V_H 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H는 별개 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해서 재조합 방법으로 연결될 수도 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.

Fv 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단하게 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어지고, 예를 들어 scFv에서 사실상 공유적일 수 있다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 집합적으로, 6개의 CDR 또는 그의 하위세트가 항원 결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 통상적으로 더 낮은 친화도이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 가질 수 있다.

단일-쇄 Fv (scFv) 또는 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, V_H와 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.

Fab 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 한 쌍의 Fab 단편을 포함하고, 이는 일반적으로 이들의 카르복시 말단 근처에서 이들 사이의 힌지 시스테인에 의해 공유적으로 연결된다. 항체 단편의 또 다른 화학적 커플링이 관련 기술분야에 또한 공지되어 있다.

"이중특이적" 또는 "이중기능적 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조한다.

디아바디는, 단편이 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H 및 V_L) 내의 V_L에 연결된 V_H를 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편이다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다.

선형 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 절편 (V_H-CH1-V_H-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 목적하는 이펙터 기능 또는 혈청 반감기를 제공하도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다. 일부 경우에, Fc 영역이 혈청 반감기를 증가시키기 위해 PEG 또는 알부민에 접합될 수 있거나, 또는 일부 다른 접합이 목적하는 효과를 생성한다. 대안적으로, 부작용 또는 치료 합병증을 최소화하도록 이펙터 기능을 제거하거나 감소시키는 것이 바람직한 경우에, 특정의 다른 Fc 영역이 사용될 수 있다.

인간 및 인간화 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 (또는 이로부터 유래된 것과 아미노산 서열이 동일한) 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 인간 항체는, 예를 들어 CDR, 특히 CDR3 내에, 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합된 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 배선 유전자에 의해 코딩되지만, 예를 들어 항체 성숙 동안 발생하는 후속적 재배열 및 돌연변이를 포함하는 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 이용하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 관련 기술분야 (예를 들어, 문헌 [Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125] 참조)에 공지된 바와 같이, 가변 영역은, 재배열되어 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하는 다양한 유전자에 의해 코딩된 항원 결합 도메인을 포함한다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 다중 단일 아미노산 변화 (체세포 돌연변이 또는 과돌연변이로 지칭됨)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원 (즉, 이소형 전환)에 대해 추가로 반응하여 변화할 것이다. 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 코딩하는, 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 원래 핵산 분자와 서열 동일성을 갖지 않을 수 있지만, 그 대신에 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다 (즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).

"인간" 항체 (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프트된 항체를 포함하는 것으로 의도되는 것은 아니다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로 사용된다.

"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 전체가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 인간화 형태의 항체의 한 실시양태에서, CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 전체는 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 아미노산으로 치환된 반면, 1개 이상의 CDR 영역 내의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 전체는 변화되지 않는다. 특정한 항원에 결합하는 항체의 능력을 무효화시키지 않는 한, 아미노산의 작은 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 허용가능하다. "인간화" 항체는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.

"키메라 항체"는, 가변 영역은 한 종으로부터 유래되고, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 것인 항체, 예컨대 가변 영역은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 결합할 수 있는 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기로 이루어지고, 통상적으로 특정한 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비-인접 아미노산 (예를 들어, 입체형태적 에피토프) 또는 인접 아미노산 (예를 들어, 비-입체형태적 에피토프) 둘 다로부터 형성될 수 있다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 상실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 특유한 공간 입체형태로 포함한다. 어떠한 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지 결정하는 방법 (즉, 에피토프 맵핑)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 이뮤노블롯팅 및 면역침전 검정을 포함하고, 여기서 중첩 또는 인접 펩티드 (예를 들어, MICA로부터)는 주어진 항체 (예를 들어, 항-MICA 항체)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지된 기술 및 본원에 기재된 것들, 예를 들어 X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).

용어 "에피토프 맵핑"은 항체-항원 인식을 위한 분자 결정기의 확인의 방법을 지칭한다.

항체 또는 항체 단편과 관련하여 용어 "에피토프에 결합한다" 또는 "에피토프를 인식한다"는 항원 내 아미노산의 연속 또는 불연속 절편을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 용어가 항체 또는 항체 단편이 에피토프 서열 내 모든 아미노산과 직접 접촉하고 있는 것을 반드시 의미하지는 않는 것으로 이해한다.

2개 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합한다"는 항체가 아미노산의 동일한, 중첩 또는 포괄적 연속 또는 불연속 절편에 결합한다는 것을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어구 "동일한 에피토프에 결합한다"는 항체가 동일한 아미노산에 결합하거나 그와 정확하게 접촉한다는 것은 반드시 의미하지는 않는 것으로 이해한다. 항체가 접촉하는 정확한 아미노산은 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 항체는 제2 항체에 의해 결합된 아미노산의 절편에 의해 완전히 포괄되는 아미노산의 절편에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 제1 항체는 제2 항체에 의해 결합된 1개 이상의 절편과 유의하게 중첩되는 아미노산의 1개 이상의 절편에 결합한다. 본원의 목적상, 이러한 항체는 "동일한 에피토프에 결합하는" 것으로 간주된다.

따라서, 또한, 본원에 기재된 특정한 항체에 의해 인식된 에피토프 (예를 들어, 동일한 또는 중첩 영역 또는 영역 사이에 또는 영역에 걸쳐있는 영역)의 전체 또는 일부 (예를 들어, 연속 또는 불연속 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산)를 포함하는 MICA의 에피토프에 결합하는 항체가 본 발명에 의해 포괄된다.

본원에 기재된 항체를 사용하여 "MICA 상의 동일한 에피토프"에 결합하는 항체를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 손실은 종종 에피토프 성분의 지표인 것으로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력에 의존한다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 본보기로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해, 입체형태적 불연속 에피토프를 맵핑하는 것을 보여주는 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되어 있다.

MICA에의 결합을 본원에 개시된 항체와 경쟁하는 항체가 또한 본 발명에 의해 포괄된다. 동일한 에피토프를 인식하거나 또는 결합에 대해 경쟁하는 항체는 상용 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어, 하나의 항체가 또 다른 항체의 표적 항원에의 결합을 차단하는 능력을 보여주는 면역검정, 즉 경쟁적 결합 검정을 포함한다. 경쟁적 결합은 시험 하에 이뮤노글로불린이 공통 항원, 예컨대 MICA에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에서 결정될 수 있다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정이 공지되어 있고, 예를 들어 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)] 참조); 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., Virology 176:546 (1990)]); 및 직접 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)])이다. 전형적으로, 이러한 검정은 비표지 시험 이뮤노글로불린 및 표지된 참조 이뮤노글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 이뮤노글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 이뮤노글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우에, 이는 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 그 초과로 억제할 것이다.

본원에 사용된 용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 재조합 MICA를 분석물로서 및 상기 항체를 리간드로서 사용하는 비아코어(BIACORE) 2000 기기로 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정 시, 대략 10^-7 M 미만, 예컨대 대략 10^-8 M, 10^-9M 또는 10^-10 M 미만 또는 심지어 더 낮은 평형 해리 상수 (K_D)로 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접 관련 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2-배 더 큰 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 따라서, "인간 MICA에 특이적으로 결합하는" 항체는 10^-7 M 이하, 예컨대 대략 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 심지어 더 낮은 K_D로 인간 MICA에 결합하는 항체를 지칭한다. "시노몰구스 MICA와 교차-반응하는" 항체는 10^-7 M 이하, 예컨대 대략 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 심지어 더 낮은 K_D로 시노몰구스 MICA에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 종으로부터의 MICA와 교차-반응하지 않는 항체는 표준 결합 검정에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출불가능한 결합을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "k_assoc" 또는 "k_a"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "k_dis" 또는 "k_d"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "K_D"는 k_a에 대한 k_d의 비 (즉, k_d/k_a)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 K_D 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하는 것이다.

본원에 사용된 IgG 항체에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대해 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10^-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10^-10 M 이하의 K_D를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형의 경우에 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 10^-8 M 이하의 K_D를 갖는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "EC50"은 시험관내 또는 생체내 검정에서 최대 반응의 50%, 즉 최대 반응과 기준선의 중간인 반응을 유도하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 농도를 지칭한다.

용어 "고정된 MICA에 결합한다"는, 예를 들어 세포의 표면 상에 발현되거나 또는 고체 지지체에 부착된 MICA에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "교차-반응한다"는 상이한 종으로부터의 MICA에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 MICA에 결합하는 본 발명의 항체는 또한 또 다른 종의 MICA (예를 들어, 시노몰구스 MICA)에 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 교차-반응성은 결합 검정 (예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출하거나, 또는 MICA에 결합시키거나, 또는 달리 이를 생리학상 발현하는 세포와 기능적으로 상호작용시킴으로써 측정된다. 교차-반응성을 결정하는 방법은, 예를 들어 비아코어™ 2000 SPR 기기 (비아코어 AB, 스웨덴 웁살라)를 사용하는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석에 의한 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 검정, 또는 유동 세포측정 기술을 포함한다.

가변 도메인의 "CDR"은 카바트, 코티아(Chothia), 카바트와 코티아 둘 다의 누적, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법의 정의에 따라 확인되는 초가변 영역 내의 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카바트 등이 최초로 정의한 초가변 영역으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 코티아 등이 최초로 기재한 구조적 루프 구조로서 또한 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883]을 참조한다. CDR 확인에 대한 다른 접근법은 카바트와 코티아 사이의 절충안이고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 엑셀리스(Accelrys)®)를 사용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 기재된, 관찰된 항원 접촉을 기초로 하는 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피 기여를 이루는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 특정 잔기 또는 잔기들의 군 또는 심지어 전체 CDR이 유의하게 항원 결합에 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 견지에서 짧아지거나 길어질 수는 있더라도, 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 경우에, CDR은 접근법들의 조합을 비롯하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의되는 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태에서, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.

일부 경우에, 본원에 개시된 펩티드의 아미노산 서열은, 예를 들어 비변형된 펩티드와 비교하여 펩티드 변이체의 항원 결합 성질이 유지되거나 또는 개선되는 한, 펩티드 변이체 (예를 들어, 본원에 개시된 펩티드에 대한 규정된 서열 상동성이 있는 펩티드)가 생성되도록 변형 및 변경될 수 있다 (임의의 변형된 펩티드의 항원 결합 특성은 본원에 기재된 시험관내 및/또는 생체내 검정 및/또는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 평가할 수 있음).

펩티드 변이체는 일반적으로 아미노산 수준에서 관찰되고 논의되지만, 실제 변형은 전형적으로 핵산 수준에서 도입되거나 수행된다. 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 기술 (예를 들어, 클로닝 기술) 및/또는 본원에 개시된 것을 사용하여, 서열 1, 10, 76, 78, 95, 97, 112, 114, 130, 132, 149, 151, 167 및/또는 169 또는 그의 부분/단편을 코딩하는 핵산을 변형시킴으로써 표 1에 제시된 펩티드에 대해 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체를 생성할 수 있다.

아미노산 서열 변형은 전형적으로 3종의 부류 중 1종 이상에 속한다: 치환, 삽입 또는 결실 변형. 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 아미노 및/또는 말단 융합, 뿐만 아니라 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 통상적으로 아미노 또는 카르복실 말단 융합의 것보다 더 작은 삽입, 예를 들어 1 내지 4개 정도의 잔기일 것이다. 결실은 단백질 서열로부터의 1개 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로, 약 2 내지 6개 이하의 잔기가 단백질 분자 내의 임의의 한 부위에서 결실된다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이지만, 다수의 상이한 위치에서 한 번에 일어날 수 있고; 삽입은 통상적으로 약 1 내지 10개 정도의 아미노산 잔기일 것이고; 결실은 약 1 내지 30개의 잔기 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 인접한 쌍에서 이루어질 수 있고, 즉 2개의 잔기의 결실 또는 2개의 잔기의 삽입이 이루어질 수 있다. 치환, 결실, 삽입 또는 그의 임의의 조합이 최종 구축물에 도달하도록 조합될 수 있다. 돌연변이는 서열을 리딩 프레임 밖에 놓지 않아야 하고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생산할 수 있는 상보적 영역을 생성시키지 않을 것이다. 치환 변형은 적어도 1개의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것이다. 일부 경우에, 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 일부 경우에, 본원의 펩티드는 표 1에 제시된 펩티드에 비해 1종 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 표 1에 제시된 펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-30, 30-40, 또는 40-50개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변이체는 표 1에 제시된 펩티드에 비해 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 일반적으로 하기 표 2에 따라 이루어지고, 보존적 치환으로서 지칭된다. 단백질 변형에 대한 허용성을 예측하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210 (2004)] 참조)

<표 2> 보존적 아미노산 치환

일부 경우에, 치환은 보존적이지 않다. 예를 들어, 표 1에 제시된 펩티드 내의 아미노산이 펩티드의 일부 성질 또는 측면을 변경시킬 수 있는 아미노산으로 대체될 수 있다. 일부 경우에, 펩티드의 결합 특성을 변화시키기 위해 (예를 들어, 항원에 대한 펩티드의 결합 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 및/또는 항원에 대한 펩티드의 결합 특이성을 변경시키거나, 증가시키거나 또는 감소시키기 위해), 예를 들어 펩티드의 구조를 변화시키도록 비-보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.

일부 경우에, 펩티드 및/또는 펩티드 변이체는 표 1에 제시된 펩티드의 단편을 포함할 수 있거나 또는 이러한 단편일 수 있다. 이러한 단편은, 예를 들어 단편이 전장 펩티드의 결합 특성의 적어도 일부 (예를 들어, 전장 펩티드의 결합 특성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%)를 보유하는 한, 표 1에 제시된 CDR, FR, 및/또는 AA보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50-100, 101-150개 더 적은 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에서 펩티드의 아미노-말단, 카르복시-말단, 및/또는 펩티드 내에서 말단절단이 이루어질 수 있다.

일부 경우에, 예를 들어 비변형된 펩티드에 비해 펩티드 변이체의 결합 특성을 변경시키거나 (예를 들어, 증가 또는 감소시키거나), 보존하거나, 또는 유지하도록, 펩티드 변이체의 상호작용 면은 비변형된 펩티드와 동일 (예를 들어, 실질적으로 동일)할 수 있다. 펩티드의 상호작용 면을 확인하는 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Gong et al., BMC: Bioinformatics, 6:1471-2105 (2007); Andrade and Wei et al., Pure and Appl. Chem., 64(11):1777-1781 (1992); Choi et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 77(1):14-25 (2009); Park et al., BMC: and Bioinformatics, 10:1471-2105 (2009).

관련 기술분야의 통상의 기술자는 2개의 폴리펩티드 (예를 들어, 비변형된 펩티드 및 펩티드 변이체)의 동일성을 결정하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 동일성이 최고 수준이도록 2개의 서열을 정렬한 후에 동일성을 계산할 수 있다. 동일성을 계산하는 또 다른 방식은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482 (1981)]의 국부 동일성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 동일성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해, 이러한 알고리즘의 전산화된 구현 (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 검사에 의해, 비교를 위한 서열의 최적 정렬을 수행할 수 있다.

동일한 유형의 동일성을, 예를 들어 문헌 [Zuker, Science 244:48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-10 (1989); Jaeger et al., Methods Enzymol. 183:281-306 (1989)]에 개시된 알고리즘에 의해, 핵산에 대해 수득할 수 있고, 이러한 문헌은 적어도 핵산 정렬에 관한 자료에 대해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 방법이 전형적으로 사용될 수 있는 것으로, 그리고 특정 경우에 이들 다양한 방법의 결과가 상이할 수 있는 것으로 이해되지만, 통상의 기술자는 이들 방법 중 적어도 1종으로 동일성이 확인되면, 서열이 언급된 동일성을 갖고 본원에 개시된다고 언급되는 것으로 이해한다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 그 서열이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 # / 위치의 총 # x 100)이다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능함) 중의 GAP 프로그램으로 결정할 수 있다. PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)]의 알고리즘을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성이 또한 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능함)에 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해, 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드길이 = 12로 수행하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭형성 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.

일부 경우에, 하기 방법 섹션에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 방법을 사용하여 수득된 면역 세포 (예를 들어, 기억 B 세포를 포함하는 B 세포)로부터 단리 및/또는 정제된 유전 물질 (예를 들어, DNA 및/또는 mRNA)을 사용하여 본원에 개시된 치료 조성물이 생산될 수 있다. 일단 이러한 유전 물질이 수득되면, 이를 사용하여 본원에 개시된 치료 조성물을 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고/있거나 하기에 요약된다.

일부 경우에, 펩티드는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "표지"는 표지가 부착된 펩티드의 검출을 가능하게 하는 적어도 1개의 원소, 동위원소, 또는 관능기가 모이어티 내로 혼입되어 있는 모이어티를 지칭한다. 표지는 직접적으로 부착될 수 있거나 (즉, 결합을 통해), 또는 링커 (예를 들어, 예컨대 예를 들어 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형, 치환 또는 비치환된 알킬렌; 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형, 치환 또는 비치환된 알케닐렌; 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형, 치환 또는 비치환된 알키닐렌; 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌; 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형, 치환 또는 비치환된 헤테로알케닐렌; 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형, 치환 또는 비치환된 헤테로알키닐렌; 치환 또는 비치환된 아릴렌; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌; 또는 치환 또는 비치환된 아실렌, 또는 링커를 구성할 수 있는 그의 임의의 조합)에 의해 부착될 수 있다. 표지는 검출될 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 특징을 방해하지 않는 임의의 위치에서 펩티드에 부착될 수 있다.

표지는 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ⁶⁷Ga, ⁹⁹mTc (Tc-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹⁶⁹Yb, 및 ¹⁸⁶Re를 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사성 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동원원소 모이어티를 함유하는 표지; 효소 (예를 들어, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제)에 결합될 수 있는 면역 또는 면역반응성 모이어티 (항체 또는 항원일 수 있음)를 포함하는 표지; 유색, 발광성, 인광성이거나, 또는 형광 모이어티를 포함하는 표지 (예를 들어, 예컨대 형광 표지 FITC); 1종 이상의 광친화성 모이어티를 갖는 표지; 1종 이상의 공지된 결합 파트너를 갖는 리간드 모이어티를 갖는 표지 (예컨대 비오틴-스트렙타비딘, FK506-FKBP 등)를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 표지는 생물계 내의 분자간 상호작용의 직접적 규명을 위한 1종 이상의 광친화성 모이어티를 포함할 수 있다. 디아조 화합물, 아지드, 또는 디아지린의 니트렌 또는 카르벤으로의 광변환을 대부분 기초로 하는 다양한 공지된 발광체를 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bayley, H., Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology (1983), Elsevier, Amsterdam]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 특정 실시양태에서, 사용된 광친화성 표지는 4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조산을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 1개 이상의 할로겐 모이어티로 치환된 o-, m- 및 p-아지도벤조일이다.

표지는 또한 영상화제일 수 있거나 또는 영상화제로서의 역할을 할 수 있다. 예시적인 영상화제는 양전자 방출 단층촬영 (PET), 컴퓨터 보조 단층촬영 (CAT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영, X선, 형광투시법, 및 자기 공명 영상화 (MRI)에서 사용되는 것들; 항구토제; 및 조영제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 진단제는 형광 모이어티, 발광 모이어티, 자기 모이어티; 가돌리늄 킬레이트 (예를 들어, DTPA, DTPA-BMA, DOTA 및 HP-DO3A와의 가돌리늄 킬레이트), 철 킬레이트, 마그네슘 킬레이트, 망가니즈 킬레이트, 구리 킬레이트, 크로뮴 킬레이트, CAT 및 X선 영상화에 유용한 아이오딘-기반 물질, 및 방사성핵종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 방사성핵종은 ¹²³I,¹²⁵I, ¹³⁰I, ¹³¹I, ¹³³I, ¹³⁵I, ⁴⁷Sc, ⁷²As, ⁷²Se, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ⁹⁷Ru, ¹⁰⁰Pd, ¹⁰¹mRh, ¹¹⁹Sb, ¹²⁸Ba, ¹⁹⁷Hg, ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ¹⁰⁹Pd, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Cu, ⁷⁵Br, ⁷⁷Br, ⁹⁹mTc, ¹⁴C, ¹³N, ¹⁵0, ³²P, ³³P, 및 ¹⁸F를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

형광 및 발광 모이어티는 "염료", "표지" 또는 "지시약"으로 통상적으로 지칭되는 다양한 상이한 유기 또는 무기 소분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예는 플루오레세인, 로다민, 아크리딘 염료, 알렉사 염료, 시아닌 염료 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 형광 및 발광 모이어티는 다양한 자연 발생 단백질 및 그의 유도체, 예를 들어 유전자 조작된 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화 GFP, 적색, 청색, 황색, 청록색 및 사파이어색 형광 단백질, 산호초 형광 단백질 등을 포함한다. 발광 단백질은 루시페라제, 에쿼린 및 그의 유도체를 포함한다. 수많은 형광 및 발광 염료 및 단백질이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 2004/0067503; 문헌 [Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002; 및 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9th edition, 2002] 참조).

본원에 사용된 용어 "정제된" 또는 "단리된"은 확인되어 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 다른 분자, 예를 들어 폴리펩티드, 핵산 분자를 지칭한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이들이 그의 자연 환경의 1종 이상의 성분으로부터 분리된 경우에 정제된 항체이다.

핵산 조성물

일부 경우에, 본 개시내용은 개시된 펩티드 (예를 들어, 표 1에 개시됨)에 상응하는 (예를 들어, 이를 코딩하는) 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 서열은 개시된 펩티드에 관련된 모든 축중성 서열, 즉 하나의 특정한 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 모든 핵산 및 그의 변이체 및 유도체를 포함한다. 따라서, 각각의 특정한 핵산 서열이 본원에 기재되지 않을 수 있지만, 개시된 폴리펩티드 서열을 통해 각각의 모든 서열이 실제로는 본원에 개시되고 기재된 것으로 이해된다.

일부 경우에, 개시된 핵산은 발현 벡터를 포함할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 플라스미드, 인공 염색체, 예컨대 BAC, YAC, 또는 PAC, 및 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

제공된 벡터는, 예를 들어 복제 기점 및/또는 마커를 또한 포함할 수 있다. 마커 유전자는 선택가능한 표현형, 예를 들어 항생제 내성을 세포에 부여할 수 있다. 마커 생성물은 벡터가 세포에 전달되었는지, 그리고 전달되었으면 발현되고 있는지를 결정하는데 사용된다. 포유동물 세포에 대한 선택 마커의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 히그로마이신, 퓨로마이신, 및 블라스티시딘이다. 이러한 선택 마커가 포유동물 숙주 세포 내로 성공적으로 전달된 경우, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택 압력 하에 놓여도 생존할 수 있다. 다른 마커의 예는, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) lacZ 유전자, 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 루시페라제를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출 (예를 들어, 정제 또는 국재화)을 용이하게 하도록 디자인된 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열, 예컨대 GFP, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 폴리히스티딘, c-myc, 헤마글루티닌, 또는 FLAG™ 태그 (코닥(Kodak); 코네티컷주 뉴헤이븐) 서열은 전형적으로 코딩된 폴리펩티드와의 융합물로서 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 비롯하여 폴리펩티드 내의 어느 곳에든 삽입될 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용은 본원에 개시된 핵산 (예를 들어, 벡터) 및/또는 펩티드를 포함하는 세포를 포함한다. 세포는, 예를 들어 진핵 및/또는 원핵 세포를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에 사용될 수 있는 세포는, 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20108 버지니아주 매너서스 우편 사서함 1549)으로부터 상업적으로 입수가능하다. 문헌 [F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (1998)]을 또한 참조한다. 본원에 개시된 세포의 생성에 유용한 형질전환 및 형질감염 방법은, 예를 들어 문헌 [F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (1998)]에 기재되어 있다.

벡터-매개 유전자 전달은 항체의 표적화 전달을 조작하는 것으로 밝혀졌다. (Balazs et al., Nature. 2011 Nov 30;481(7379):81-4) 따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 바이러스를 사용하여 관심 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표적 세포에 전달하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 유전자 요법과 관련하여, MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 또는 아데노-연관 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 바이러스 벡터)를 통해 세포 내에 전달될 수 있다. 예를 들어, 특정한 세포 표면 분자에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편과 같은 단백질은 바이러스의 표면에 부착되어 바이러스가 특이적 세포를 표적화하도록 할 수 있다. 추가로, 바이러스는 핵산 서열, 예컨대 프로모터를 함유하도록 조작되어 바이러스가 단지 특정한 세포, 예컨대 암세포에서만 기능하도록 할 수 있다.

일부 경우에, 개시된 치료 조성물은 MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터)를 포함할 수 있다. 한 측면에서, MICA에 면역특이적으로 결합하는 펩티드는 MICA에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 본원에 기재된 바와 같이, 항체 및 항체 단편은 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 상이한 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 낙타화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 Fv (scFv), 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분), 디술피드-연결된 Fv (dsFv), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 인트라바디, 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 서열 1, 76, 95, 112, 130, 149 또는 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 2, 77, 96, 113, 131, 150 또는 167에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 벡터는 서열 10, 78, 97, 114, 132, 151 또는 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 서열 11, 79, 98, 115, 133, 152 또는 169에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드, 예를 들어 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산은 자연 발생 핵산이 아니다. 비-자연 발생 핵산은 예를 들어, 자연 발생 핵산에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 차이 (예를 들어, 치환, 부가, 또는 결실)를 포함할 수 있다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 1에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 2에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 10에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 11에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 76에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 77에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 78에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 79에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 95에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 96에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 97에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 98에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 112에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 113에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 114에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 115에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 130에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 131에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 132에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 133에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 149에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 150에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 151에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 152에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 서열 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 168에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 서열은 서열 170에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩한다.

본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.

단리된 핵산은, 예를 들어 DNA 분자일 수 있으며, 단 자연-발생 게놈 내에서 그 DNA 분자에 바로 플랭킹하는 것으로 통상적으로 발견되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 부재한다. 따라서, 단리된 핵산은, 비제한적으로, 다른 서열에 독립적으로 별개의 분자로서 존재하는 DNA 분자 (예를 들어, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생산되는 cDNA 또는 게놈 DNA 단편), 뿐만 아니라 벡터, 자율 복제 플라스미드, 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 헤르페스 바이러스) 내로 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입된 DNA를 포함한다. 또한, 단리된 핵산은 조작된 핵산, 예컨대 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 재조합 DNA 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한 소화물을 함유하는 겔 슬라이스 내의, 수백 내지 수백만개의 다른 핵산 중에 존재하는 핵산은 단리된 핵산으로 고려되지 않는다.

퍼센트 서열 동일성을 계산하는데 있어서, 2개의 서열을 정렬하고, 2개의 서열 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 동일한 매치의 수를 결정한다. 동일한 매치의 수는 정렬된 영역의 길이 (즉, 정렬된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수)에 의해 나눠지고 100을 곱하여 퍼센트 서열 동일성 값에 이른다. 정렬된 영역의 길이는 가장 짧은 서열의 전장 크기까지 하나 또는 둘 다의 서열의 일부일 수 있는 것으로 인지될 것이다. 단일 서열이 1개 초과의 다른 서열과 정렬될 수 있으며, 따라서 각각의 정렬된 영역에 걸쳐 상이한 퍼센트 서열 동일성 값을 가질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 퍼센트 동일성 값은 통상적으로 반올림될 수 있음을 유의한다. 예를 들어, 78.1%, 78.2%, 78.3% 및 78.4%는 78%로 반내림되는 한편, 78.5%, 78.6%, 78.7%, 78.8% 및 78.9%는 79%로 반올림된다. 또한, 정렬된 영역의 길이는 항상 정수임을 유의한다.

본원에 사용된 용어 "퍼센트 서열 동일성"은 임의의 주어진 질의 서열 및 대상 서열 사이의 동일성 정도를 지칭한다. 또 다른 대상 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 임의의 질의 핵산 또는 아미노산 서열, 예를 들어 전사 인자의 퍼센트 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다.

핵산은 전세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 공지된 다른 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수한" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.

종종 천연 서열 (변형된 제한 부위 등 제외)의 cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터 본 발명의 핵산 조성물은 유전자 서열을 제공하기 위해 표준 기술에 따라 돌연변이될 수 있다. 코딩 서열의 경우에, 이들 돌연변이는 원하는 만큼 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 천연 V, D, J, 불변, 전환 및 본원에 기재된 다른 상기 서열과 실질적으로 상동성이거나 이들로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다 ("유래된"은 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 이로부터 변형된다는 것을 나타냄).

핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 되도록 배치되는 경우에, 이러한 핵산은 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동가능하게 연결된이란 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 2개의 단백질 코딩 영역을 결합시키는 것이 필요한 경우에 연속적이고 동일 리딩 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우에, 작동가능하게 연결된이란 서열이 전환 재조합할 수 있는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산 서열을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 측면에서, 발현 벡터가 이용된다. 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 전달된 핵산 서열의 발현을 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자이다. 발현은 전사, 번역, 및 인트론이 존재할 경우의 스플라이싱과 같은 과정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 바이러스 벡터가 이용된다 (예를 들어, 특히 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스). 많은 이러한 바이러스 벡터가 관련 기술분야에서 이용가능하다는 것이 관련 기술분야에서 이해된다. 또 다른 측면에서, 비-바이러스성 플라스미드 벡터가 또한 본 발명을 실시하는데 있어서 적합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 널리 이용 가능한 표준 재조합 기술을 사용하여 구축될 수 있다. 이러한 기술은 통상의 분자 생물학 참고문헌, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]에서 발견될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 그 내부에 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지도 지칭하는 것으로 의도됨을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.

키메라 항원 수용체

일부 경우에, 본 발명은 MICA 및 세포내 T 세포 수용체 신호전달 도메인에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 2011 Aug 10;3(95)) 일부 측면에서, CAR은 MICA, 세포외 힌지 도메인, T 세포 수용체 막횡단 도메인 및 세포내 T 세포 수용체 신호전달 도메인에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 추가 실시양태는 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단, 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 및 본 발명의 CAR과 관련되는 제약 조성물을 제공한다.

키메라 항원 수용체 (CAR)는 T-세포 신호전달 도메인에 연결된 항체 (scFv)의 항원 결합 도메인을 함유하는 인공적으로 구축된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 2011 Aug 10;3(95)) 칼로스(Kalos) 등은 CD19를 표적화하는 CAR T 세포의 생성을 기재하고, 만성 림프구성 백혈병 환자에서의 CAR 변형된 T-세포 매개된 강력한 항암 효과를 입증한다. CAR의 조작된 T-세포 특징은 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 T-세포 특이성 및 반응성을 재지시하는 그의 능력을 포함하며, 모노클로날 항체의 항원-결합 특성을 활용한다. CAR-변형된 T-세포는 생체내에서 복제하는 잠재력을 가지며, 장기간 지속성은 지속된 종양 제어를 가능하게 하고 항체의 반복된 주입에 대한 필요성을 제거한다. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 2011 Aug 10;3(95)) 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에게 항원 프로세싱과 독립적인 항원을 인식하는 능력을 제공하며, 따라서 종양 회피의 주요 메카니즘을 우회한다. 더욱이, T-세포에서 발현되는 경우에, CAR은 유리하게는 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체화하지 않는다. CAR-변형된 T 세포는 US2003/022450 및 US2010/0261269에서 및 문헌 [Milone et al. 2009 Mol. Ther. 17:1453]에서 상세히 기재되어 있다.

제약 제제

일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 암의 치료에서 사용되는 다른 화합물, 약물 및/또는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 화합물, 약물 및/또는 작용제는, 예를 들어 화학요법 약물, 소분자 약물, 또는 주어진 암에 대한 면역 반응을 자극하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료 조성물은, 예를 들어 1종 이상의 본원에 개시된 펩티드, 및 항-CTLA-4 항체 또는 펩티드, 항-PD-1 항체 또는 펩티드, 항-PDL-1 항체 또는 펩티드, 항-OX40 (또한 CD134, TNFRSF4, ACT35 및/또는 TXGP1L로 공지됨) 항체 또는 펩티드, 항-GITR (또한 TNFRSF18, AITR, 및/또는 CD357로 공지됨) 항체 또는 펩티드, 항-LAG-3 항체 또는 펩티드, 및/또는 항-TIM-3 항체 또는 펩티드 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 1종 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 10종 미만)의 화합물과 조합될 수 있다.

일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 히스톤 데아세틸라제 억제제 ("HDAC") 억제제를 비롯한 다른 화합물을 포함할 수 있다. HDAC 억제제의 예는, 예를 들어 히드록삼산, 보리노스타트(Vorinostat) (졸린자(Zolinza)); 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA) (머크(Merck)), 트리코스타틴 A(Trichostatin A) (TSA), LAQ824 (노파르티스(Novartis)), 파노비노스타트(Panobinostat) (LBH589) (노파르티스), 벨리노스타트(Belinostat) (PXD101) (큐라젠(CuraGen)), ITF2357 이탈파르마코(Italfarmaco) SpA (시니셀로(Cinisello)), 시클릭 테트라펩티드; 뎁시펩티드 (로미뎁신(romidepsin), FK228) (글로우세스터 파마슈티칼스(Gloucester Pharmaceuticals)), 벤즈아미드; 엔티노스타트(Entinostat) (SNDX-275/MS-275) (신닥스 파마슈티칼스(Syndax Pharmaceuticals)), MGCD0103 (셀진(Celgene)), 단쇄 지방족 산, 발프로산, 페닐 부티레이트, AN-9, 피바넥스(pivanex) (티탄 파마슈티칼(Titan Pharmaceutical)), CHR-3996 (크로마 테라퓨틱스(Chroma Therapeutics)), 및 CHR-2845 (크로마 테라퓨틱스)를 포함한다.

일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 보르테조밉(Bortezomib) (밀레니엄 파마슈티칼스(Millennium Pharmaceuticals)), NPI-0052 (네레우스 파마슈티칼스(Nereus Pharmaceuticals), 카르필조밉(Carfilzomib) (PR-171) (오닉스 파마슈티칼스(Onyx Pharmaceuticals)), CEP 18770, 및 MLN9708을 예를 들어 포함하는 프로테아솜 억제제를 포함하는 다른 화합물을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 알킬화제, 예컨대 메팔란 및 토포이소머라제 억제제, 예컨대 MICA 발현을 증가시키는 것으로 나타난 아드리아마이신 (독소루비신)을 포함할 수 있고, 이는 항-MICA 모노클로날 항체의 효능을 증진시킬 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은, 예를 들어 본원에 기재된 1종 이상의 펩티드 및 1종 이상의 다른 작용제, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 시토카인, 케모카인 및 다른 생물학적 신호전달 분자, 종양 특이적 백신, 세포성 암 백신 (예를 들어, GM-CSF 형질도입된 암 세포), 종양 특이적 모노클로날 항체, 자가 및 동종 줄기 세포 구출 (예를 들어, 이식편 대 종양 효과를 증대시키기 위함), 다른 치료 항체, 분자 표적화 요법, 항혈관신생 요법, 치료 의도를 갖는 감염원 (예컨대 종양 국재화 박테리아) 및 유전자 요법을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은, 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 본원에 개시된 바와 같은 항-MICA 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 하나 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 MICA에 결합하는 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 펩티드, 항체, 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

예를 들어, 제약 조성물은 표적 항원 상에서 상이한 에피토프에 결합하거나, 또는 보체 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 조성물은 MICA*009 서열 (서열 185) 내 아미노산 229 내지 248을 수반하거나 그와 중첩되는 에피토프와 상호작용하는 1종 이상의 항체 또는 항체 단편, MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 아미노산 179 내지 188을 수반하거나 그와 중첩되는 에피토프와 상호작용하는 항체 또는 항체 단편, MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 아미노산 119 내지 128을 수반하거나 그와 중첩되는 에피토프와 상호작용하는 항체 또는 항체 단편, 및/또는 MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 아미노산 199 내지 208을 수반하거나 그와 중첩되는 에피토프와 상호작용하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 치료 조성물은 MICA에 결합하고 V_H CM33322 mAb4의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및/또는 CM33322 mAb4의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 펩티드, 항체 또는 항체 단편을, 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9 또는 12의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9 또는 12의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 1종 이상의 펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편과 조합하여 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료 조성물은 MICA에 결합하고 V_H CM33322 mAb28의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및/또는 CM33322 mAb28의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 펩티드, 항체 또는 항체 단편을, 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 1종 이상의 펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편과 조합하여 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 제약 조성물로서 또는 제약 조성물에서 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 경로, 예를 들어 미국 식품 의약품국 (FDA)이 승인한 임의의 경로를 통해 대상체에게 투여하기 위해 제제화 또는 개조될 수 있다. 예시적인 방법이 FDA의 CDER 데이터 표준 매뉴얼(Data Standards Manual), 버전 번호 004 (fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm에서 입수가능함)에 기재되어 있다.

담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100 퍼센트를 기준으로, 이 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분의 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트, 바람직하게는 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 활성 성분의 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트 범위일 것이다.

일부 경우에, 제약 조성물은 유효량의 1종 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "치료에 효과적인"은 그의 투여 정황에서 의도된 효과 또는 생리학적 결과를 생성하는데 효과적인 기간 (급성 또는 만성 투여 및 주기적 또는 연속적 투여 포함) 동안의 본원에 개시된 1종 이상의 펩티드 (예를 들어, MICA에 결합하는 항체 또는 항체 단편)의 양 또는 농도를 지칭한다.

일부 경우에, 제약 조성물은 1종 이상의 펩티드 및 임의의 제약상 허용되는 담체, 아주반트 및/또는 비히클을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 제약은 1종 이상의 추가의 치료제를 질환 또는 질환 증상의 조정을 달성하는데 효과적인 양으로 추가로 포함할 수 있다.

용어 "제약상 허용되는 담체 또는 아주반트"는 본 발명의 펩티드와 함께 환자에게 투여될 수 있고, 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며, 치료적 양의 화합물을 전달하는데 충분한 용량으로 투여된 경우에 비독성인 담체 또는 아주반트를 지칭한다.

본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 담체, 아주반트 및 비히클은 이온 교환체, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 자기-유화 약물 전달 시스템 (SEDDS), 예컨대 d-I-토코페롤 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트, 제약 투여 형태로 사용되는 계면활성제, 예컨대 트윈(Tween) 또는 다른 유사 중합체 전달 매트릭스, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소브르산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로덱스트린, 예컨대 I-,

- 및 K-시클로덱스트린이 또한 본원에 기재된 제제의 화합물의 전달을 증진시키기 위해 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 임의의 통상적인 비-독성의 제약상 허용되는 담체, 아주반트 또는 비히클을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 제제화된 화합물 또는 그의 전달 형태의 안정성을 증진시키기 위해 제제의 pH가 제약상 허용되는 산, 염기 또는 완충제로 조정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 비경구는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

제약 조성물은 흡입 및/또는 비강 투여를 위한 용액 또는 분말의 형태일 수 있다. 적합한 분산제 또는 습윤제 (예컨대, 예를 들어 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 이러한 조성물을 제제화할 수 있다. 또한 멸균 주사가능한 제제는, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액으로서, 비경구로 허용되는 비-독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 만니톨, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 무자극 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 그의 글리세리드 유도체가 주사제의 제조에 유용하고, 천연 제약상 허용되는 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 피마자 오일도 특히 그의 폴리옥시에틸화 버전에서 그러하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 또는 카르복시메틸 셀룰로스 또는 에멀젼 또는 현탁액과 같은 제약상 허용되는 투여 형태의 제제화에 통상적으로 사용되는 유사한 분산제를 또한 함유할 수 있다. 다른 통상적으로 사용되는 계면활성제, 예컨대 트윈 또는 스팬(Span) 및/또는 제약상 허용되는 고체, 액체 또는 다른 투여 형태의 제조에 통상적으로 사용되는 다른 유사한 유화제 또는 생체이용률 증진제가 제제화 목적으로 또한 사용될 수 있다.

제약 조성물은 캡슐, 정제, 에멀젼 및 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 경구로 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘이 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 에멀젼이 경구 투여되는 경우에, 활성 성분은 유화제 및/또는 현탁화제와 조합되어 유성 상 내에 현탁 또는 용해될 수 있다. 원하는 경우에, 특정 감미제 및/또는 향미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 제약 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제 관련 기술분야에 널리 공지된 기술에 따라 제조되고, 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 증진시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본, 및/또는 관련 기술분야에 공지된 다른 용해제 또는 분산제를 사용하여, 염수 내의 용액으로서 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 방법에서 본원에 개시된 펩티드 또는 제약 조성물 (하기에 'X'로 나타내어짐) 중 임의의 1종 이상을 사용하는 방법을 제공한다:

본원에 개시된 1종 이상의 질환 또는 병태 (예를 들어, 하기 예에서 'Y'로 지칭되는 암)의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 물질 X. Y의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 물질 X의 용도; 및 Y의 치료에서 사용하기 위한 물질 X.

일부 경우에, 본원에 개시된 치료 조성물은 미국에서의 판매, 미국으로의 수입 및/또는 미국으로부터의 수출을 위해 제제화될 수 있다.

방법

일부 경우에, 방법은 병태 또는 질환에 걸려 있거나 걸렸었고 이러한 병태 또는 질환에 대해 양성 면역 반응을 나타내거나 나타내었던 인간 대상체의 선택을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적합한 대상체는, 예를 들어 병태 또는 질환에 걸려 있거나 걸렸었지만, 질환 또는 그의 측면이 해소되었고/되었거나, (예를 들어, 동일한 병태 또는 질환의 다른 대상체 (예를 들어, 대다수의 대상체)에 비해) 감소된 질환 증상을 나타내고/내거나, 예를 들어 (예를 들어, 동일한 병태 또는 질환의 다른 대상체 (예를 들어, 대다수의 대상체)에 비해) 무증상 상태로, (예를 들어, 동일한 병태 또는 질환의 다른 대상체 (예를 들어, 대다수의 대상체)에 비해) 병태 또는 질환이 있으면서 장기간 동안 생존하고 있는 대상체를 포함한다. 일부 경우에, 대상체가 병태 또는 질환에 대해 백신접종된 적이 있는 경우 (예를 들어, 기존에 백신접종되었고/되었거나 백신접종되고 재-백신접종됨 (예를 들어, 부스터 백신을 받음))에 대상체가 선택될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 동물을 지칭한다. 일부 경우에, 대상체는 포유동물이다. 일부 경우에, 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 (예를 들어, 남성, 여성, 또는 소아)을 지칭한다. 방법에 사용하기 위한 샘플은, 예를 들어 선택된 대상체로부터 수득된, 혈청 샘플을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 대상체 선택은 대상체 (예를 들어, 후보 대상체)로부터 샘플을 수득하는 단계 및 대상체가 선택에 적합하다는 적응증에 대해 샘플을 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상체는, 예를 들어 건강 관리 전문가에 의해 병태 또는 질환에 걸렸었거나 걸려 있는 것으로 확증 또는 확인될 수 있다. 일부 경우에, 병태 또는 질환에 대한 양성 면역 반응의 표현이 환자 기록, 가족력, 및/또는 양성 면역 반응의 지표를 검출하는 것으로부터 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 여러 관계자가 대상체 선택에 포함될 수 있다. 예를 들어, 제1 관계자가 후보 대상체로부터 샘플을 수득할 수 있고, 제2 관계자가 샘플을 시험할 수 있다. 일부 경우에, 의료 진료의 (예를 들어, 일반 진료의)가 대상체를 선택 및/또는 조회할 수 있다. 일부 경우에, 대상체 선택은 선택된 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계 및 샘플을 저장하는 단계 및/또는 본원에 개시된 방법에서 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은, 예를 들어 세포 또는 세포 집단을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 면역 세포를 수득 또는 표적화하는 것은 예를 들어, 표적 면역 세포에 결합할 수 있는 (예를 들어, 특이적으로 결합할 수 있는) 사량체 면역원을 수득하거나 제공하는 단계; 사량체 면역원을 샘플과 접촉시키는 단계; 사량체 면역원을 검출하는 단계; 사량체 면역원이 표적 면역 세포에 결합되는지 여부를 결정하는 단계; 및 사량체 면역원이 표적 면역 세포에 결합되는 경우에, 표적 면역 세포를 수득하는 단계 중 1개 이상 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

사량체 면역원은, 병태 또는 질환에 관련되고/되거나 표적 면역 세포에 결합하는 (예를 들어, 특이적으로 결합하는) 면역원을 포함할 수 있고, 예를 들어 여기서 이러한 표적 면역 세포는 선택된 병태 또는 질환과 관련된다. 병태 또는 질환에 관련된 면역원 및 표적 면역 세포는, 예를 들어 특정 병태 또는 질환이 있는 대상체에 존재하지만 이러한 병태 또는 질환이 없는 대상체에는 존재하지 않는 면역원 또는 면역 세포; 및/또는 특정 병태 또는 질환이 있는 대상체에서 이러한 병태 또는 질환이 없는 대상체와 비교하여 변경된 수준 (예를 들어, 증가된)으로 존재하는 면역원 또는 면역 세포를 포함한다. 일부 경우에, 면역원 또는 면역 세포는 암 특이적일 수 있다. 면역원은 가용성일 수 있다. 사량체 면역원은 사량체 (예를 들어, 사량체화된 단량체, 이량체 및/또는 삼량체 포함) 항원 면역원 (예를 들어, 항원 및/또는 에피토프)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 사량체 면역원은 유사한 조건 하에 세포에 대한 비-사량체 형태의 면역원의 결합 수준에 비해 세포에 대한 결합이 증가된다. 일부 경우에, 사량체 항원은 검출가능한 모이어티, 예를 들어 스트렙타비딘 모이어티를 포함한다. 사량체화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 개시된다.

관련 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 개시된 방법을 사용하여 사량체 면역원을 검출하는 것 및/또는 사량체 면역원이 표적 세포에 결합되는지 여부를 결정하는 것을 수행할 수 있다. 예를 들어, 방법은 유동 세포측정법을 포함할 수 있다. 분류 및 게이팅 방법을 비롯하여, 유동 세포측정법에 대한 최적화 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 개시된다. 일부 경우에, 방법은 표적 면역 세포에 결합된 사량체 면역원의 결합, 결합 친화도, 및/또는 결합 특이성의 수준의 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사량체 면역원과 표적 면역 세포 사이의 미리 결정된 수준의 결합이 결정되는 경우에 (예를 들어, 이러한 경우에만), 표적 면역 세포가 수득될 수 있다. 미리 결정된 결합 수준은 특정 수준일 수 있고/있거나 상대 수준일 수 있다. 표적 면역 세포를 수득하는 것은 표적 면역 세포의 수득, 제공, 확인, 선택, 정제 및/또는 단리를 포함할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 세포 분류 방법, 세포 풍부화, 및/또는 배경 감소를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 자기 항원에 대해 지시된 면역 세포를 수득하는 것은, 예를 들어 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체를 확인하는 단계; 다량체 형태의 자기 항원을 수득하거나 제공하는 단계; 다량체 형태의 자기 항원을, 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체로부터의 샘플과 접촉시키는 단계; 다량체 형태의 자기 항원에 결합된 면역 세포를 수득하는 단계 중 1개 이상 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 방법은 암 환자로부터 자기 항원에 대해 지시된 면역 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있고, 예를 들어 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체를 확인하는 단계; 다량체 형태의 자기 항원을 제공하는 단계; 다량체 형태의 자기 항원을, 자기 항원에 대한 양성 면역 반응을 나타내는 대상체로부터의 샘플과 접촉시키는 단계; 및 다량체 형태의 자기 항원에 결합된 면역 세포를 수득하는 단계 중 1개 이상 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

다량체 형태의 자기 항원은, 병태 또는 질환에 관련되고/되거나 표적 면역 세포에 결합하는 (예를 들어, 특이적으로 결합하는) 자기 항원을 포함할 수 있고, 예를 들어 여기서 이러한 표적 면역 세포는 선택된 병태 또는 질환과 관련된다. 병태 또는 질환에 관련된 자기 항원 및 표적 면역 세포는, 예를 들어 특정 병태 또는 질환이 있는 대상체에 존재하지만 이러한 병태 또는 질환이 없는 대상체에는 존재하지 않는 항원 또는 면역 세포; 및/또는 특정 병태 또는 질환이 있는 대상체에서 이러한 병태 또는 질환이 없는 대상체와 비교하여 변경된 수준 (예를 들어, 증가된)으로 존재하는 면역원 또는 면역 세포를 포함한다. 일부 경우에, 병태 또는 질환은 암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 폐암, 유방암, 신장암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 교모세포종, 간암, 및 결장 암종, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 경우에, 자기 항원 또는 면역 세포는 암 특이적일 수 있다. 자기 항원은 가용성일 수 있다. 다량체 형태의 자기 항원은 사량체 형태 (예를 들어, 사량체화된 단량체, 이량체 및/또는 삼량체 항원 포함)의 자기 항원 (예를 들어, 항원 및/또는 에피토프)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 다량체 형태의 자기 항원은 검출가능한 모이어티, 예를 들어 스트렙타비딘 모이어티를 포함한다. 다량체화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 개시된다.

수득된 표적 면역 세포로부터 유전 물질 (예를 들어, DNA 및/또는 mRNA)을 단리 또는 정제하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 예시된다. 일단 이러한 유전 물질이 수득되면, 이를 사용하여 본원에 개시된 치료 조성물을 생산하는 방법은 널리 공지되어 있고/있거나 하기에 요약된다. 상기 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 펩티드 변이체를 생성하기 위해 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 유전 물질을 변경시킬 수 있다.

표적 세포 내에 함유되었거나 표적 세포로부터 수득된 핵산 (예를 들어, cDNA)으로부터 펩티드를 생성하는 것은, 예를 들어 표적 면역 세포 (예를 들어, 단일 또는 단리된 확인된 표적 면역 세포)로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 분석, 예를 들어 서열분석을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 완전 인간 항체, 또는 그의 단편 (예를 들어, 상기 논의된 바와 같음)를 생성하는 것, 및 비-인간 항체의 인간화를 포함할 수 있다. 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써), 수득된 면역 세포로부터 DNA를 쉽게 단리 및/또는 서열분석할 수 있다.

일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내에 놓을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.

항체 또는 그의 변이체의 재조합 발현은 일반적으로 이러한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 필요로 한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 그의 부분, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터가 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,981,216; 5,591,639; 5,658,759 및 5,122,464 참조), 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 둘 다의 발현을 위해 항체의 가변 도메인이 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일단 발현 벡터가 통상적인 기술에 의해 숙주 세포 내로 전달되면, 형질감염된 세포를 통상적인 기술에 의해 배양하여 항체가 생산된다. 따라서, 본 발명은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 부분, 또는 본 발명의 단일 쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중-쇄 항체의 발현을 위한 특정 실시양태에서, 하기에 상술된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 벡터가 전체 이뮤노글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포 내에서 공동-발현될 수 있다.

재조합 항체의 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수가능한 다수의 불멸화 세포주를 포함한다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특정한 메카니즘을 갖는다. 발현된 항체 또는 그의 부분의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 1차 전사체의 적합한 프로세싱, 글리코실화, 및 유전자 산물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0 (어떠한 기능성 이뮤노글로불린 쇄도 내인성으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), SP20, CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 인간 림프구를 불멸화시킴으로써 개발된 인간 세포주를 사용하여 재조합에 의해 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 세포주 PER.C6. (크루셀(Crucell), 네덜란드)을 사용하여 재조합적으로 모노클로날 항체를 생산할 수 있다.

일부 경우에, 본원에 개시된 펩티드가 합성적으로 생성될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드를 합성하는데 유용한 합성 화학 변환 및 보호기 방법론 (보호 및 탈보호)이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)] 및 그의 후속판에 기재된 것들을 포함한다.

통상의 기술자에게 널리 공지된 화학적 합성 방법에 의해 펩티드를 또한 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77]을 참조한다. 따라서, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈((Applied Biosystems) 펩티드 합성기 모델 430A 또는 431 상에서, 측쇄가 보호된 아미노산을 사용하여 t-Boc 또는 Fmoc 화학에 의해 α-NH₂를 보호하면서, 고체 상 합성의 자동화된 메리필드(Merrifield) 기술을 사용하여 펩티드를 합성할 수 있다.

본원에 기재된 펩티드를 제조하는 한 방식은 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)을 사용하는 것이다. C-말단 아미노산은 링커 분자와 함께 산 불안정성 결합을 통해 가교된 폴리스티렌 수지에 부착된다. 이러한 수지는 합성에 사용되는 용매에 불용성이어서, 과량의 시약 및 부산물을 세척하는 것을 상대적으로 간단하고 신속하게 한다. 산에서는 안정적이지만 염기에 의해 제거되는 Fmoc 기로 N-말단이 보호된다. 염기에 안정한 산 불안정성 기로 임의의 측쇄 관능기가 보호된다.

천연 화학 라이게이션을 사용하여 개별적인 합성 펩티드를 결합시킴으로써 더 긴 펩티드를 제조할 수 있다. 대안적으로, 더 긴 합성 펩티드가 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. 이러한 기술은 상세한 프로토콜과 함께 널리 공지된 표준 매뉴얼에서 제공된다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 유전자를 구축하기 위해, 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 대해 최적인 코돈으로, 아미노산 서열을 역번역하여 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 수득한다. 다음으로, 전형적으로는 펩티드 및 필요하다면 임의의 조절 요소를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것에 의해, 합성 유전자를 제조한다. 이러한 합성 유전자를 적합한 클로닝 벡터 내에 삽입하고, 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 그 후, 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적절한 적합한 조건 하에 펩티드를 발현시킨다. 펩티드를 정제하고, 표준 방법에 의해 특징화한다.

고-처리량의 조합형 방식으로, 예를 들어 어드밴스드 켐테크(Advanced Chemtech)로부터 입수가능한 고-처리량 다중 채널 조합형 합성기를 사용하여 펩티드를 제조할 수 있다.

예를 들어, 펩티드의 생리학적 안정성을 증가시키기 위해, 레트로-인버소 결합 (C(O)-NH); 환원된 아미드 결합 (NH-CH₂); 티오메틸렌 결합 (S-CH₂ 또는 CH₂-S); 옥소메틸렌 결합 (O-CH₂ 또는 CH₂-O); 에틸렌 결합 (CH₂-CH₂); 티오아미드 결합 (C(S)-NH); 트랜스-올레핀 결합 (CH=CH); 플루오로 치환된 트랜스-올레핀 결합 (CF=CH); 케토메틸렌 결합 (C(O)-CHR) 또는 CHR-C(O) (여기서, R은 H 또는 CH₃임); 및 플루오로-케토메틸렌 결합 (C(O)-CFR 또는 CFR-C(O) (여기서, R은 H 또는 F 또는 CH₃임)으로 펩티드 결합이 교체될 수 있다.

아세틸화, 아미드화, 비오티닐화, 신나모일화, 파르네실화, 플루오레세인화, 포르밀화, 미리스토일화, 팔미토일화, 인산화 (Ser, Tyr 또는 Thr), 스테아로일화, 숙시닐화 및 술푸릴화에 의해 펩티드가 추가로 변형될 수 있다. 상기 나타내어진 바와 같이, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 알킬 기 (예를 들어, C1-C20 직쇄형 또는 분지형 알킬 기); 지방산 라디칼; 및 그의 조합에 펩티드가 접합될 수 있다.

일부 경우에, 이뮤노글로불린 분자의 정제를 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 (특히 특정 항원에 대한 친화도에 의한 것), 단백질 A 또는 단백질 G, 및 크기결정 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 펩티드가 정제될 수 있다. 또한, 상기에 기재되어 있거나 또는 정제를 용이하게 하는 것으로 관련 기술분야에 달리 공지되어 있는 이종 폴리펩티드 서열 (본원에서 "태그"로 지칭됨)에 본 발명의 항체 또는 그의 단편이 융합될 수 있다.

방법의 예시적인 비제한적 개관이 도 5A-5F에 제시된다. 순서는 함축되지 않는다.

일부 경우에, 본 개시내용은 또한 목적하는 기능적 MICA 결합 특성을 보유하는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 및/또는 경쇄 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 항체 또는 항체 단편은 상기 기재된 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 서열 2, 77, 96, 113, 131, 150 또는 168 및 11, 79, 98, 115, 133, 152 또는 170 각각의 V_H 및 V_L 영역과 높은 (즉, 80% 이상) 상동성을 갖는 V_H 및 V_L 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편은 서열 77, 96, 113, 131, 150 또는 168 및/또는 79, 98, 115, 133, 152 또는 170을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해, 이어서 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유된 기능 (즉, 1종 이상의 기능, 예컨대 MICA의 알파 3 도메인에 결합하는 기능; MICA 쉐딩을 차단하는 기능; MICA에 결합하는 NGKD의 결합을 억제하지 않는 기능; 가용성 MICA 유도된 NGKD 하향조절 및 감소된 NK 세포 세포독성을 차단하는 기능)에 대해 코딩된 변경된 항체를 시험함으로써 수득될 수 있다.

본원에 기재된 특정한 항-MICA 항체 (예를 들어, 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 및 12)와 MICA에의 결합에 대해 경쟁 (예를 들어, 교차-경쟁)하는 항체 및 항체 단편이 또한 제공된다. 이러한 경쟁 항체는 표준 MICA 결합 검정에서 항체에의 MICA의 결합을 경쟁적으로 억제하는 그의 능력을 기반으로 하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 MICA 단백질이 플레이트 상에 고정되고, 항체 중 1종이 형광 표지되고, 표지된 항체의 결합과 경쟁하는 비-표지된 항체의 능력이 평가되는 표준 ELISA 검정이 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 비아코어 분석이 교차-경쟁하는 항체의 능력을 평가하기 위해 사용될 수 있다. MICA에의 항-MICA 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 MICA에 결합하는 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증한다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 FACS에 의한 측정 시, 활성화된 T 세포 상에서의 MICA에 대한 본원에 기재된 항-MICA 항체의 결합을 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 억제하는 항-MICA 항체를 제공한다. 예를 들어, 항-MICA 항체와 경쟁하는 후보에 의한 항-MICA 항체의 결합의 억제는 실시예에 기재된 바와 같은 조건 하에 평가될 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용은 본원에 기재된 항-MICA 항체 (예를 들어, 항체 ID 8, 9, 11 및 12)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-MICA 항체를 제공한다. 실시예 14에 추가로 논의된 바와 같이, 항체 ID 8 (CM33322 mAb11)은 MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 잔기 119 내지 128을 수반하는 에피토프에 결합하고; 항체 ID 9 (CM33322 mAb29)는 MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 잔기 229 내지 248을 수반하는 에피토프에 결합하고; 항체 ID 11 (CM33322 mAb4)은 MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 잔기 179 내지 188을 수반하는 에피토프에 결합하고; 항체 ID 12 (CM33322 mAb28)는 MICA*009 아미노산 서열 (서열 185) 내 잔기 199 내지 208을 수반하는 에피토프에 결합한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 MICA*009의 아미노산 181 내지 274에 상응하는 α3 영역 내 아미노산 잔기에 결합하는 항-MICA 항체 또는 항체 단편을 제공한다.

본원에 기재된 항체를 사용하여 "MICA 상의 동일한 에피토프"에 결합하는 항체를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 손실은 종종 에피토프 성분의 지표인 것으로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑에 대한 컴퓨터 조합 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력에 의존한다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 본보기로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되어 있고, 이는 입체형태적 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 밝혀졌다.

예를 들어, 마우스는 본원에 개시된 바와 같은 인간 MICA, 생산된 하이브리도마, 및 MICA에의 결합에 대해 mAb4 또는 mAb28과 경쟁하는 능력에 대해 스크리닝된 생성된 모노클로날 항체로 면역화될 수 있다. 마우스는 또한 mAb4 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프를 함유하는 MICA의 보다 작은 단편에 의해 면역화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994]의 방법은 원형적인 모노클로날 항체에 대해 동일한 에피토프 및 따라서 유사한 특성을 갖는 모노클로날 항체의 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다. 파지 디스플레이를 이용하여, 첫째로 원형적인 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄의 레퍼토리와 쌍형성하여 MICA-결합 모노클로날 항체를 선택한 다음, 새로운 경쇄를 (바람직하게는 인간) 중쇄의 레퍼토리와 쌍형성하여 원형적인 모노클로날 항체와 동일한 에피토프를 갖는 (바람직하게는 인간) MICA-결합 모노클로날 항체를 선택한다. 대안적으로 원형적인 모노클로날 항체 (예를 들어, mAb4, ID 11 또는 mAb28, ID 12)의 변이체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.

예를 들어, 문헌 [Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 관심 에피토프에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발", 또는 MICA 또는 MICB 내의 아미노산 잔기의 일부 다른 형태의 점 돌연변이유발을 또한 사용하여 본 발명의 항-MICA 또는 MICB 항체에 대한 기능적 에피토프를 결정할 수 있다. 그러나, 돌연변이유발 연구를 통해 MICA 또는 MICB의 전체 3차원 구조에는 중요하지만 항체-항원 접촉에는 직접 관여하지 않는 아미노산 잔기가 규명될 수 있고, 따라서 상기 방법을 사용하여 결정된 기능적 에피토프를 확인하기 위해 다른 방법이 필요할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 경쟁 검정을 또한 사용하여 항체가 또 다른 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는지" 여부를 결정할 수 있다. 전형적으로, 제2 항체가 과량이고 제1 항체가 모든 부위를 포화시키는 조건 하에 제2 항체에 의해 에피토프와 상호작용하는 것으로 공지된 항체의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예컨대 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 경쟁은 항체가 "동일한 에피토프에 결합하는" 항체인 것을 나타내는 것이다. 2개의 항체 사이의 경쟁의 수준을 평가하기 위해, 예를 들어, 방사선면역검정 또는 항체에 대해 다른 표지를 사용하는 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, MICA 또는 MICB 항원은 동일한 양의 제2의 비표지된 항-MICA 항체의 존재 하에 표지된 화합물 (예를 들어, ³H, ¹²⁵I, 비오틴, 또는 루비듐)에 접합된 제1 항-MICA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 포화 양과 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 비표지된 차단 항체의 존재 하에 항원에 결합된 표지된 항체의 양이 평가되고 비표지된 차단 항체의 부재 하에서의 결합과 비교된다. 경쟁은 차단 항체의 부재와 비교하여 비표지된 차단 항체의 존재 하에서의 결합 신호의 백분율 변화에 의해 결정된다. 따라서, 차단 항체의 부재 하에서의 결합과 비교하여 차단 항체의 존재 하에서의 표지된 항체의 결합의 50% 억제가 존재하는 경우에, 2개의 항체 사이의 50%의 경쟁이 존재한다. 따라서, 제1 항체와 제2 항체 사이의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예컨대 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 경쟁에 대한 언급은 제1 항체가 (제1 항체의 부재 하에서의 제2 항체에 의한 항원의 결합과 비교하여) 항원에 대한 제2 항체의 결합 (또는 그 반대의 경우)을 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과로 억제하는 것을 의미한다. 따라서, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 제2 항체에 의한 항원에 대한 제1 항체의 결합의 억제는 2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다.

자연 발생 항체에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 차이 (예를 들어, 치환, 부가, 또는 결실)를 포함하는 조작된 재조합 항체가 또한 제공된다. 1개 이상의 아미노산 차이는 경쇄 내 및/또는 중쇄 내에 존재할 수 있고, CDR 중 1개 이상 내, 프레임워크 영역 내 또는 불변 영역 내, 예를 들어 CL, CH1, 힌지, CH2 또는 CH3 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, (1) 본원에 기재된 V_H CDR 영역의 1개 이상을 포함하는 V_H 서열 및 본원에 기재된 V_L CDR 영역의 1개 이상을 포함하는 V_L 서열, 및 (2) 이종 프레임워크 영역을 포함하는 조작된 재조합 항체가 제공된다. 이종 프레임워크 영역은 CDR 영역의 천연 공급원이 아닌 항체, 세포 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 동일한 CDR을 포함하는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 1의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 1로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 6의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 6으로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 7의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 7로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 8의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 8로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 9의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 9로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 11의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 11로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 12의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 12로부터 유래하지 않은 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

(1) 본원에 기재된 V_H CDR 영역의 1개 이상을 포함하는 V_H 서열 및 본원에 기재된 V_L CDR 영역의 1개 이상을 포함하는 V_L 서열, 및 (2) 이종 불변 영역을 포함하는 조작된 재조합 항체가 또한 제공된다. 이종 불변 영역은 CDR 영역의 천연 공급원이 아닌 항체, 세포 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 CDR이 수득된 인간이 아닌 인간으로부터의 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 1의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 1의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 1로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 6의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 6의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 6으로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 7의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 7의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 7로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 8의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 8의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 8로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 9의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 9의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 9로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 11의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 11의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 11로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 항체 ID 12의 V_H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 항체 ID 12의 V_L의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 항체 ID 12로부터 유래하지 않은 불변 영역을 포함할 수 있다.

(1) 본원에 기재된 V_H CDR 영역의 1개 이상을 포함하는 V_H 서열 및 본원에 기재된 V_L CDR 영역의 1개 이상을 포함하는 V_L 서열, 및 (2) 이종 Fc 영역을 포함하는 조작된 재조합 항체가 또한 제공된다. 이종 Fc 영역은 CDR 영역의 천연 공급원이 아닌 항체, 세포 또는 인간으로부터 유래될 수 있다.

변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 개시된 V_H 및/또는 V_L 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있는 조작되고 변형된 항체가 또한 제공되며, 여기서 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, V_H 및/또는 V_L), 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프트된, 특이적 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.)) 참조).

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 4, 81, 100, 117, 135, 154 및 172, 서열 84, 102, 119, 137, 156 및 174, 및 서열 8, 86, 103, 121, 139, 158 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 13, 88, 106, 124, 142, 161 및 179, 서열 90, 108, 126, 144, 163 및 181, 및 서열 17, 92, 110, 128, 146, 165 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 표 1에 제시된 모노클로날 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H 및 V_L CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.

이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수가능) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836] (이들 각각의 내용은 본원에 명백하게 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 항체에 사용하기 위한 예시적인 프레임워크 서열은 본원에 기재된 항체에 의해 사용된 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들을 포함한다. V_H CDR1, 2 및 3 서열, 및 V_L CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 그라프트될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 1종 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 그라프트될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).

또 다른 유형의 가변 영역 변형은 V_H 및/또는 V_L CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 1종 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키기 위한 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에서 제공되는 것과 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4, 81, 100, 117, 135, 154 및 172로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 4, 81, 100, 117, 135, 154 및 172와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR1 영역; (b) 서열 6, 84, 102, 119, 137, 156 및 174로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 6, 84, 102, 119, 137, 156 및 174와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR2 영역; (c) 서열 8, 86, 103, 121, 139, 158 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 8, 86, 103, 121, 139, 158 및 176과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR3 영역; (d) 서열 13, 88, 106, 124, 142, 161 및 179로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 13, 88, 106, 124, 142, 161 및 179와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR1 영역; (e) 서열 15, 90, 108, 126, 144, 163 및 181로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 15, 90, 108, 126, 144, 163 및 181과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2 영역; 및 (f) 서열 17, 92, 110, 128, 146, 165 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 17, 92, 110, 128, 146, 165 및 183과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-MICA 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다.

항체의 CDR의 메티오닌 잔기는 산화되어, 항체의 효력에서 잠재적 화학적 분해와 결과적인 환원을 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 산화성 분해를 겪지 않는 아미노산 잔기로 대체된 중쇄 및/또는 경쇄 CDR에서 1개 이상의 메티오닌 잔기를 갖는 항-MICA 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 CDR의 메티오닌 잔기는 산화성 분해를 겪지 않는 아미노산 잔기로 대체된다.

본 발명의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 V_H 및/또는 V_L 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이" 항체도 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1종 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다.

Fc는 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 비롯한 이뮤노글로불린, 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 도메인을 포함한다. 적합한 이뮤노글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 다른 부류, 예컨대 IgA, IgD, IgE 및 IgM을 포함한다. 이뮤노글로불린의 불변 영역은 자연-발생 또는 합성-생산 폴리펩티드일 수 있고, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CH4 도메인을 개별적으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.

이뮤노글로불린의 불변 영역은 Fc 수용체 (FcR) 결합 및 보체 고정을 비롯한 많은 중요한 항체 기능을 담당한다. IgA, IgG, IgD, IgE, IgM으로서 분류되는, 중쇄 불변 영역의 5종의 주요 부류가 존재하며, 이들 각각은 이소형에 의해 지정된 특징적인 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 알려진 4종의 하위부류로 분류된다. 본원에 언급된 Fc는 중쇄 불변 영역의 임의의 부류 또는 하위부류를 포함할 수 있다.

Ig 분자는 세포 수용체의 다중 부류와 상호작용한다. 예를 들어 IgG 분자는 항체의 IgG 부류에 특이적인 Fcγ 수용체 (FcγR)의 3종의 부류, 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII과 상호작용한다. FcγR 수용체에 대한 IgG의 결합을 위한 중요한 서열은 CH2 및 CH3 도메인에 위치하는 것으로 보고되었다. 항체의 혈청 반감기는 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 항체의 능력에 의해 영향을 받는다. 유사하게, IgFc의 혈청 반감기는 또한 이러한 수용체에 결합하는 능력에 의해 영향을 받는다 (Gillies S D et al., (1999) Cancer Res. 59:2159-66). 본원에 언급된 Fc는 이들 수용체 중 1종 이상에 결합할 수 있다.

본원에 개시된 항체는 이뮤노글로불린 중쇄의 카르복시-말단의 적어도 일부를 포함하는 Fc를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc는 다음을 포함할 수 있다: CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, CH2-CH3 도메인, CH2-CH4 도메인, CH2-CH3-CH4 도메인, 힌지-CH2 도메인, 힌지-CH2-CH3 도메인, 힌지-CH2-CH4 도메인, 또는 힌지-CH2-CH3-CH4 도메인. Fc 도메인은 임의의 이뮤노글로불린 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM, 또는 임의의 IgG 항체 하위부류, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 속하는 항체로부터 유래될 수 있다. Fc 도메인은 천연 대립유전자 또는 스플라이스 변이체를 비롯한, 자연 발생 Fc 서열일 수 있다. Fc 도메인은 2종 이상의 다양한 Ig 이소형, 예를 들어 IgG2/IgG4 하이브리드 Fc 도메인으로부터의 Fc 도메인의 일부를 포함하는 하이브리드 도메인일 수 있다. 예시적 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된다. Fc 도메인은 마우스, 래트, 토끼, 낙타, 라마, 단봉낙타 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-인간 동물로부터의 Fc 도메인의 인간화 또는 탈면역화 버전일 수 있다.

특정 실시양태에서, Fc 도메인은 변이체 Fc 서열, 예를 들어, 모 Fc 서열 (예를 들어, 변이체를 생성하기 위해 후속적으로 변형된 미변형된 Fc 폴리펩티드)에 비해 변형 (예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의함)되어 바람직한 구조적 특색 및/또는 생물학적 활성을 제공하는 Fc 서열이다.

예를 들어, (a) 증가 또는 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); (b) 증가 또는 감소된 보체 매개 세포독성 (CDC); (c) C1q에 대한 증가 또는 감소된 친화도 및/또는 (d) 모 Fc에 비해 Fc 수용체에 대한 증가 또는 감소된 친화도를 갖는 Fc 변이체를 생성하기 위해 Fc 영역에서 변형시킬 수 있다. 이러한 Fc 영역 변이체는 일반적으로 Fc 영역에서 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함할 것이다. 아미노산 변형의 조합이 특히 바람직한 것으로 고려된다. 예를 들어, 변이체 Fc 영역은, 예를 들어 본원 (도면 포함)에 확인된 특정한 Fc 영역 위치의, 내부에 2, 3, 4, 5개 등의 치환을 포함할 수 있다.

변이체 Fc 도메인은 디술피드 결합 형성에 관여하는 부위가 제거된 서열 변경을 포함할 수 있다. 이러한 제거는 본 발명의 분자를 생산하는데 사용되는 숙주 세포 내에 존재하는 다른 시스테인-함유 단백질과의 반응을 회피할 수 있다. 이 목적을 위해, N-말단에서의 시스테인-함유 절편은 말단절단될 수 있거나 또는 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산 (예를 들어, 알라닐, 세릴)으로 치환될 수 있다. 심지어 시스테인 잔기가 제거되는 경우에, 단일 쇄 Fc 도메인은 함께 비-공유적으로 유지되는 이량체 Fc 도메인을 여전히 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 천연 Fc 도메인은 선택된 숙주 세포와 보다 더 상용성이도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 프롤린 이미노펩티다제와 같은 이. 콜라이 내 소화 효소에 의해 인식될 수 있는 전형적인 천연 Fc의 N-말단 가까이의 PA 서열을 제거할 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인 내 1개 이상의 글리코실화 부위는 제거될 수 있다. 전형적으로 글리코실화되는 잔기 (예를 들어, 아스파라긴)는 세포용해 반응을 부여할 수 있다. 이러한 잔기는 결실되거나 미글리코실화된 잔기 (예를 들어, 알라닌)로 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 보체와의 상호작용에 관여하는 부위, 예컨대 C1q 결합 부위는 Fc 도메인으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 EKK 서열이 결실되거나 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체에의 결합에 영향을 미치는 부위, 바람직하게는 샐비지 수용체 결합 부위 이외의 부위는 제거될 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 ADCC 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. ADCC 부위는 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, IgG1 내 ADCC 부위에 관해 문헌 [Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)]을 참조한다. 변이체 Fc 도메인의 구체적 예는, 예를 들어, WO 97/34631 및 WO 96/32478에 개시되어 있다.

한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 1종 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입되어, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖게 된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이 중 1종 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.

특정 실시양태에서, Fc는 하기 제시된 바와 같은 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다:

말단의 글리신 및 리신은 임의적임을 이해하여야 한다. 특정 실시양태에서, Fc는 (서열 171)에 대해 적어도 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc는 (서열 171)의 적어도 50, 100 또는 150개의 인접 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc는 (서열 171)의 50-100, 50-150 또는 100-150개의 인접 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc는 1-5, 1-10, 1-15, 1-20 또는 1-25개의 치환 또는 보존적 치환을 갖는 (서열 171)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 인간 야생형 γ1 불변 영역 서열은 최초로 문헌 [Ellison et al., Nucl. Acids Res. 10:4071 (1982)]에서 레로이 후드(Leroy Hood) 그룹에 의해 기재되었다. EU 인덱스 위치 356, 358 및 431은 G1m γ1 반수체형을 규정한다.

추가의 Fc 변이체는 하기 기재된다. 본 개시내용의 Fc 영역은 문헌 [Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)]에서와 같은 EU 인덱스에 따른 넘버링 스킴을 포함하는 것으로 이해된다.

본 개시내용은 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시킴으로써 변경된 Fc 영역을 갖는 펩티드를 포괄한다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다, Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 또는 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 예에서, Fc 영역은 하기 위치에 있는 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있으며, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 나타났다. 추가적으로, 하기 조합 돌연변이체가 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A. 예시적인 치환은 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, 및 332E를 포함한다. 예시적인 변이체는 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, 및 267E/268F/324T를 포함한다. FcyR 및 보체 상호작용을 증진시키기 위한 다른 변형은 치환 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051, 및 396L을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에 검토되어 있다.

Fc 감마 수용체에 대한 결합을 증가시키는 Fc 변형은 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 임의의 1개 이상에서의 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다 (WO00/42072).

Fc에 이루어질 수 있는 다른 Fc 변형은 FcyR 및/또는 보체 단백질에 대한 결합을 감소시키거나 제거함으로써 Fc-매개된 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및 CDC를 감소 또는 제거하는 것들이다. 예시적인 변형은 위치 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 및 328에서의 치환, 삽입 및 결실을 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 예시적인 치환은 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L 및 328R을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. Fc 변이체는 236R/328R을 포함할 수 있다. FcyR 및 보체 상호작용을 감소시키기 위한 다른 변형은 치환 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P 및 234V, 뿐만 아니라 돌연변이적 또는 효소적 수단에 의한 또는 단백질을 글리코실화하지 않는 유기체, 예컨대 박테리아에서의 생산에 의한 위치 297에서의 글리코실화의 제거를 포함한다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에서 검토되어 있다.

임의로, Fc 영역은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 추가 및/또는 대안적 위치에서의 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 6,194,551; 7,317,091; 8,101,720; PCT 특허 공개 WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 및 WO 06/020114 참조).

억제 수용체 FcyRllb에 대한 친화도를 증진시키는 Fc 변이체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어 B 세포 및 단핵구를 비롯한, FcyRl lb⁺ 세포와 관련된 면역조정 활성을 갖는 Fc를 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 변이체는 1종 이상의 활성화 수용체와 관련하여 FcyRllb에 대한 선택적으로 증진된 친화도를 제공한다. FcyRl lb에 대한 결합을 변경시키기 위한 변형은 EU 인덱스에 따른, 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 및 332로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 1종 이상의 변형을 포함한다. FcyRl lb친화도를 증진시키기 위한 예시적인 치환은 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 및 332E를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 치환은 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, 및 328Y를 포함한다. FcyRl lb에 대한 결합을 증진시키기 위한 다른 Fc 변이체는 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, 및 267E/328F를 포함한다.

Fc 영역의 그의 리간드에 대한 친화도 및 결합 특성은 관련 기술분야에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법 (생화학적 또는 면역학적 기반 검정), 예를 들어 비제한적으로 평형 방법 (예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사선면역검정 (RIA)) 또는 동역학적 (예를 들어, 비아코어 분석), 및 다른 방법, 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 억제 검정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과)에 의해 결정될 수 있다. 이들 및 다른 방법은 조사되는 1종 이상의 성분 상의 표지를 이용하고/하거나, 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 상세한 설명은 문헌 [Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾아볼 수 있으며, 여기서 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘다.

Fc는 또한 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 이는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 하기 잔기 중 1개 이상이 돌연변이 될 수 있다: 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같은, 252, 254, 256, 433, 435, 436.

FcRn에 대한 결합을 증가시키고/거나 약동학적 특성을 개선시키는 다른 예시적인 Fc 변이체는, 예를 들어 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y 및 434M을 비롯한, 위치 259, 308, 428 및 434에서의 치환을 포함한다. FcRn에 대한 Fc 결합을 증가시키는 다른 변이체는 다음을 포함한다: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001 , 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171 -5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281 :23514-23524). FcRn 결합을 조절하기 위한 다른 변형은 문헌 [Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671]에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 특정한 생물학적 특성을 갖는 하이브리드 IgG 이소형이 사용될 수 있다. 예를 들어, lgG1 /lgG3 하이브리드 변이체는 CH2 및/또는 CH3 영역에서의 lgG1 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서의 lgG3으로부터의 아미노산으로 치환함으로써 구축될 수 있다. 따라서 1개 이상의 치환, 예를 들어, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R 및 436F를 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, lgG1/lgG2 하이브리드 변이체는 CH2 및/또는 CH3 영역에서의 lgG2 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서의 lgG1로부터의 아미노산으로 치환함으로써 구축될 수 있다. 따라서 1개 이상의 치환, 예를 들어 하기 아미노산 치환: 233E, 234L, 235L, -236G (위치 236에서의 글리신의 삽입을 지칭함) 및 327A 중 1개 이상을 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결핍됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내에서 글리코실화 중 1개 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 생성하는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어져, 그에 의해 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 대안적으로, Fc 영역에 공유 부착된 올리고사카라이드는, 예를 들어 조작된, 다양한 유기체 또는 세포주 또는 그외 (예를 들어, Lec-13 CHO 세포 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 IgG를 발현시킴으로써, 글리코실화 경로에 관여하는 효소 (예를 들어, FUT8 [a1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III [GnTIII])를 조절함으로써, IgG가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형함으로써, 또는 효소적 억제제로서 푸코스 유사체의 존재 하에 Fc 융합 단백질을 발현시킴으로써 변화될 수 있다. Fc의 당형태를 변형하기 위한 다른 방법은 효모의 당조작된 균주 (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), 이끼 (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8), 및 식물 (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7)을 사용하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, Fc 융합체는 시알릴화의 수준을 변경시키기 위해 당조작된다. Fc 분자에서의 높은 수준의 시알릴화 Fc 글리칸은 기능성에 불리한 영향을 미칠 수 있고 (Scallon et al., 2007, Mol Immunol. 44(7): 1524-34), Fc 시알릴화의 수준에서의 차이는 변형된 항염증 활성을 생성시킬 수 있다 (Kaneko et al., 2006, Science 313:670-673).

Fc 분자의 글리코실화의 수준은 또한 특정 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 위치 297 또는 299에서의 돌연변이는 위치 297에서의 글리코실화를 제거한다. 사용될 수 있는 다른 Fc 변형은 WO88/07054, WO88/07089, US 6,277,375, WO99/051642, WO01/058957, WO2003/074679, WO2004/029207, US 7,317,091 및 WO2004/099249에 기재된 것들을 포함한다.

추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hanai et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 숙주 세포에서 발현된 항체를 저푸코실화시키는 변이체 CHO 세포주, Lec13 세포를 기재한다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 조작된 세포주 내에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내고, 이는 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).

더욱이, 특정한 Fc 변이체는 γ1 힌지 영역을 함유하는 Fc4 변이체를 포함하나, Arg 218은 클로닝을 용이하게 하는 Bg1II 제한 효소 인식 서열을 포함하도록 힌지 영역에 도입되었고, 쌍형성되지 않은 술프히드랄 기의 잠재적 존재로 인해 유해 효과를 방지하는 Cys 잔기 치환을 위한 Ser을 포함한다. Fc4의 CH2 영역은 γ1 CH2를 기초로 하고 Fc γ 수용체 I (FcγRI) 결합을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 이들은 EU 인덱스 위치 234, 235 및 237에서의 치환이다. 이들 치환은 문헌 [Duncan et al., Nature 332:563 (1988)]에서 그레그 윈터(Greg Winter) 그룹에 의해 기재되었고, FcγRI에 대한 결합을 감소시키는 것으로 그 논문에서 제시되었다. 또한, 보체 C1q 결합 부위에서의 2개의 아미노산 치환은 보체 고정을 감소시키기 위해 도입되었다. 이들은 EU 인덱스 위치 330 및 331에서의 치환이다. 보체 C1q 결합의 위치 330 및 331에서의, 중요성 또는 관련성 (또는 보체 고정 또는 활성화의 결여)가 문헌 [Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) 및 Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)]에서 쉐리 모리슨(Sherie Morrison) 그룹에 의해 기재되어 있다. Fc4 변이체 내 CH3 영역은 야생형 γ1 Fc와 동일하게 남아있다.

Fc5는 힌지 영역에서의 Arg 218 치환이 야생형 Lys 218 잔기로 복귀된 Fc4의 변이체이다. Fc5는 또한 Fc4와 동일한 Cys 220에서 Ser로의 치환 뿐만 아니라 야생형 γ1 Fc와 동일한 CH2 영역으로의 동일한 CH2 치환을 함유한다. Fc6 변이체는 Fc5와 동일한 힌지 영역 치환을 함유하고, Fc4와 동일한 CH2 치환을 포함한다. Fc6 CH3 영역은 카르복실 말단 리신 잔기를 함유하지 않는다. 이러한 특정한 Lys 잔기는 지정된 EU 인덱스 번호를 갖지 않는다. 이러한 리신은 성숙한 이뮤노글로불린으로부터 다양한 정도로 제거되고, 따라서 순환성 항체에서 우세하게 발견되지 않는다. 재조합 Fc 상에서의 이러한 잔기의 부재는 보다 균질한 생성물을 생성할 수 있다. Fc7 변이체는 힌지 영역에서의 야생형 γ1 Fc와 동일하다. 그의 CH2 영역은 γ1 CH2를 기초로 하나, 잔기 Asn-297에서의 N-연결된 탄수화물 부착 부위는 Gln로 변화되어 탈글리코실화 Fc를 생산한다. (예를 들어, 문헌 [Tao and Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595-2601] 참조). CH3 영역은 야생형 γ1 Fc와 동일하다. Fc8 변이체는 Fc4와 동일한 힌지 영역을 갖고, CH2 영역 및 CH3 영역 둘 다는 상응하는 야생형 γ1 Fc 영역과 동일하다. Fc9 변이체는 경쇄에 대한 디술피드 연결에 관여하는 Cys 잔기에 대해 바로 카르복시-말단인 Asp 잔기에서 출발하는 단축된 γ1 힌지를 함유한다. 잔류하는 힌지 서열은 야생형 γ1 힌지와 동일하다. CH2 영역 서열 및 CH3 영역 서열 둘 다는 야생형 γ1 Fc에 대한 상응하는 영역과 동일하다. Fc10 변이체는 Fc5와 동일한 힌지 영역 치환을 포함한다. CH2 영역 서열 및 CH3 영역 서열 둘 다는 야생형 γ1 Fc에 대한 상응하는 영역과 동일하다. Fc11 변이체는 Fc5와 동일한 힌지 영역 치환을 포함한다. 그의 CH2 도메인은 γ1 CH2를 기초로 하나, Fcγ 수용체 결합을 감소시키는 치환 (EU 인덱스 위치 234, 235 및 237에서의 치환)을 함유한다. Fc11은 C1q 결합과 보체 고정에 대해 야생형이다. Fc11의 CH3 도메인은 야생형 γ1 CH3과 동일하다. Fc12 변이체는 Cys 220 Ser, Cys 226 Ser 및 Cys 229 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, Fc5의 것과 동일한 CH2 도메인을 갖고, 야생형 γ1 CH3 도메인을 갖는다. Fc13 변이체는 Cys 220 Ser, Cys 226 Ser 및 Cys 229 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, Fc5의 것과 동일한 CH2 도메인을 갖고, Tyr 407 Gly 치환을 갖는 야생형 γ1 CH3을 갖는다. Fc14 변이체는 Cys 220 Ser, Cys 226 Ser 및 Cys 229 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, 야생형 γ1 CH2를 갖고, Tyr 407 Gly 치환을 갖는 야생형 γ1 CH3을 갖는다. Fc15 변이체는 IgG4 "Fab 교환"을 감소시키는 Ser 228 Pro 치환을 갖는 γ4 힌지를 함유하고, 야생형 γ4 CH2 및 CH3 도메인을 갖는다. Fc16 변이체는 Cys 220 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, γ1 CH2와 동일한 CH2 도메인을 갖고, 야생형 γ4 CH3과 동일한 CH3 도메인을 갖는다. Fc17 변이체는 Cys 220 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, Phe 243 Ala 치환을 갖는 γ1 CH2 도메인을 갖고, 야생형 γ1 CH3 도메인과 동일한 CH3 도메인을 갖는다. Fc18 변이체는 Cys 220 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, 야생형 γ1 CH2 도메인과 동일한 γ1 CH2 도메인을 갖고, His 435 Ala 치환을 갖는 γ1 CH3을 함유한다. Fc19 변이체는 Fc5와 동일한 힌지를 함유하고, Fc5와 동일한 CH2 도메인을 가지며, 단 잔기 Asn-297에서의 N-연결된 탄수화물 부착 부위가 Gln으로 변화되어 탈글리코실화 Fc를 생산하고, 야생형 γ1 CH3 도메인과 동일한 CH3 도메인을 갖는다. Fc21 변이체는 Cys 220 Ser, Cys 226 Ser 및 Cys 229 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, Fc5와 동일한 CH2 도메인을 갖고, Phe 405 Ala 및 Tyr 407 Gly 치환을 갖는 γ1 CH3을 갖는다. Fc22 변이체는 Cys 220 Ser, Cys 226 Ser 및 Cys 229 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, Fc1과 동일한 CH2 도메인을 갖고, Phe 405 Ala 및 Tyr 407 Gly 치환을 갖는 γ1 CH3을 갖는다. Fc23 변이체는 Cys 220 Ser 치환을 갖는 γ1 힌지를 함유하고, Leu 234 Ala, Leu 235 Glu, Pro 331 Ser 치환을 갖는 γ1 CH2 도메인, 및 야생형 γ1 Fc와 동일한 CH3 도메인을 갖는다.

본 발명에서 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 PEG화이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 전형적으로 항체 또는 그의 단편을, 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행한다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.

사용 방법

일부 경우에, 본 개시내용은 본원에 개시된 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물을 치료 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 펩티드는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_H의 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 표 1에 제시된 항체 ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12의 V_L의 CDR3을 포함하는 것인, 대상체에서 암 또는 암의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 암은 MICA의 과다발현과 연관된 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 폐, 유방, 신장, 난소, 전립선, 췌장, 위 및 결장 암종, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 형질 세포 악성종양, 예를 들어 다발성 골수종 (MM) 또는 형질 세포의 전암성 병태이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암에 걸린 것으로 또는 암에 걸리기 쉬운 것으로 진단되었다.

일부 경우에, 본 개시내용은 MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포함하는 조성물을 치료 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 항체는 서열 2, 77, 96, 113, 131, 150 또는 168의 V_H 서열에 제시된 바와 같은 V_H CDR1, V_H CDR2, 및 V_H CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 서열 11, 79, 98, 113, 133, 152 또는 170의 경쇄 가변 영역 (V_L) 서열을 포함하는 것인, 대상체에서 암 또는 암의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

암의 증상은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, 비통상적 모반 특색, 비대칭, 경계, 색 및/또는 직경을 비롯한 모반 외관의 변화, 새롭게 침착된 피부 부위, 비정상적 모반, 손발톱 밑의 거무스름한 부위, 유방 종괴, 유두 변화, 유방 낭, 유방 통증, 사망, 체중 감소, 허약, 과도한 피로, 섭식 곤란, 식욕 상실, 만성 기침, 호흡곤란 악화, 객혈, 혈뇨, 혈변, 오심, 구토, 간 전이, 폐 전이, 골 전이, 복부 포만감, 복부팽창, 복강액, 질 출혈, 변비, 복부 팽만, 결장 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 통증, 토혈, 다한, 열, 고혈압, 빈혈, 설사, 황달, 어지럼증, 오한, 근육 연축, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 간 전이, 골 전이, 신장 전이, 및 췌장 전이, 삼킴 곤란 등을 포함한다.

본원에 개시된 방법은 광범위한 종, 예를 들어 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이), 말, 소, 돼지, 양, 사슴, 엘크, 염소, 개, 고양이, 족제비, 토끼, 기니 피그, 햄스터, 래트, 및 마우스에 적용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"는 대상체가 앓고 있는 질환 또는 병태의 발병, 진행 또는 그의 적어도 1종의 증상 또는 생물학적 지표의 재발을 부분적으로 또는 완전히 경감시키고/시키거나, 억제하고/거나, 호전시키고/시키거나, 해소시키는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 치료는 대상체가 앓고 있는 질환 또는 병태의 계속된 부재를 생성할 수 있다.

용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 용어 "치료 유효 용량"은 질환을 이미 앓고 있는 환자에서 질환 및 그의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 치료될 질환의 중증도 및 환자 고유의 면역계의 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다.

약물 또는 치료제, 예컨대 본 발명의 Fc 융합 단백질의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로, 또는 또 다른 치료제와 조합하여 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소로 입증되는 질환 퇴행, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간 증가, 또는 질환 고통에 기인한 손상 또는 장애 예방을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료 유효량 또는 투여량은 "예방 유효량" 또는 "예방 유효 투여량"을 포함하며, 이는 질환이 발생될 위험에 있거나, 질환이 재발될 위험에 있는 대상체에게 단독으로, 또는 또 다른 치료제와 조합하여 투여되는 경우에, 질환의 발생 또는 재발을 억제시키는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측케하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 상기 치료제의 활성을 검정함으로써 평가할 수 있다.

예로서, 항암제는 대상체에서 암 퇴행을 촉진한다. 바람직한 실시양태에서, 약물의 치료 유효량은 암을 제거하는 지점까지 암 퇴행을 촉진한다. "암 퇴행을 촉진하는" 것은 유효량의 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 조합하여 투여함으로써 환자에서 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 적어도 하나의 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간 증가, 질환 고통에 기인한 손상 또는 장애 예방, 또는 다르게는 질환 증상의 호전을 유도하는 것을 의미한다. 또한, 치료와 관련한 용어 "유효한" 및 "유효성"은 약리학적 유효성과 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약리학적 유효성은 환자에게서 암 퇴행을 촉진하는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물의 투여로부터 비롯되는, 세포성, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 다른 불리한 생리학적 효과 (유해 효과), 또는 독성의 수준을 지칭한다.

종양 치료에 대한 예로서, 치료 유효량 또는 투여량의 약물은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 미치료 대상체와 비교하여 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량 또는 투여량의 약물은 세포 성장 또는 종양 성장을 완전히 억제하고 즉, 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 100% 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 하기 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 이러한 억제는 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 20일, 보다 바람직하게는 적어도 약 40일, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60일의 기간 동안 관찰되고 지속될 수 있다.

일반적으로, 방법은 병태 또는 질환의 위험에 처한 또는 병태 또는 질환이 있는 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 대상체의 병태 또는 질환이 본원에 개시된 제약 조성물로 치료될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 방법은 예를 들어 암에 걸린 대상체를 선택하는 단계를 포함하고, 이때 대상체의 암은 MICA 및/또는 안지오포이에틴-2 중 하나 또는 둘 다를 표적화하는 것에 의해 치료될 수 있다.

일부 경우에, 치료 방법은 대상체가 앓고 있는 질환 또는 병태의 예방 또는 치료에 필요한 바와 같은 단일 투여, 다중 투여, 및 반복 투여를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료 방법은 치료 전에, 치료 동안에, 및/또는 치료 후에 대상체에서 질환 수준을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상체에서의 질환 수준의 감소가 검출될 때까지 치료가 계속될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "투여하다", "투여하는" 또는 "투여"는 본 발명의 펩티드를, 형태와 관계없이, 이식하거나, 흡수하거나, 섭취하거나, 주사하거나, 또는 흡입하는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 펩티드 중 1종 이상이 대상체에게 국소로 (예를 들어, 비강으로) 및/또는 경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원의 방법은 유효량의 화합물 또는 화합물 조성물을 투여하여 목적하는 효과 또는 언급된 효과를 달성하는 것을 포함한다. 임의의 특정한 환자에 대한 구체적 투여량 및 치료 요법은 사용된 구체적 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합물, 질환의 중증도 및 경과, 병태 또는 증상, 질환에 대한 환자의 경향, 병태 또는 증상, 및 치료 의사의 판단을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.

예를 들어, 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 "투여 단위 형태"는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 (a) 활성 화합물의 특유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에 존재하는 제한사항에 의해 지시되고 이에 직접적으로 좌우된다.

항-MICA 항체 또는 항체 단편의 투여를 위해, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg/kg 숙주 체중 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 1-10 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 항-MICA 항체에 대한 바람직한 투여 요법은 정맥내 투여를 통해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하며, 여기서 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg 체중.

일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2종 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우에 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 통상적으로 다수회 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매월, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 μg/ml, 일부 방법에서 약 25-300 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.

대안적으로, 제약 조성물은 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법을 투여할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력 및 의학 기술분야에 널리 공지된 유사 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인에 따라 달라될 것이다.

투여 후에, 대상체의 질환 수준을 검출하거나, 판단하거나 또는 결정하기 위해 대상체를 평가할 수 있다. 일부 경우에, 대상체에서의 질환 수준의 변화 (예를 들어, 감소)가 검출될 때까지 치료가 계속될 수 있다.

환자의 병태의 개선 (예를 들어, 대상체에서의 질환 수준의 변화 (예를 들어, 감소)) 시, 필요하다면 유지 용량의 본 발명의 화합물, 조성물 또는 조합물이 투여될 수 있다. 이어서, 증상에 따라, 개선된 병태가 유지되는 수준으로 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 다가 감소될 수 있다. 그러나, 질환 증상의 임의의 재발 시 장기적으로 환자가 간헐적인 치료를 필요로 할 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용은 인간 대상체로부터 면역 세포, 예를 들어 B 세포 및/또는 기억 B 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 이러한 방법은, 예를 들어 이벤트 후에, 인간 대상체에서 면역 세포, 예를 들어 B 세포 및/또는 기억 B 세포의 수준을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 이벤트는 질환, 감염의 검출; 본원에 개시된 치료 조성물의 투여, 치료제 또는 치료 요법의 투여, 백신 투여, 면역 반응의 유도를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법은 임상적으로 및/또는 연구용으로 사용될 수 있다.

실시예

하기 실시예에서 본 발명이 추가로 설명되고, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

제한된 양의 말초 혈액으로부터 규정된 항원 특이성을 갖는 희귀 기억 B 세포의 민감하고, 특이적이고, 신뢰가능한 검출을 가능하게 하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 방법은 항원이 소거되고 나서 수개월 내지 수년 후에 기억 B 세포의 가시화 및 단리를 가능하게 하였다.

문헌 [Franz et al., Blood, 118(2):348-357 (2011)] (본원에 전문이 참조로 포함됨)에서 상세하게 보고된 바와 같이, 파상풍 독소 C-단편 (TTCF)의 사량체를 사용하여 본원에 기재된 방법에 대한 원리 증명이 확립되었다.

대다수의 개체가 파상풍 톡소이드 백신접종을 받았고, 백신에 의해 지속적인 IgG 항체 역가가 유도되기 때문에, TTCF (즉, TTCF의 52 kDa의 비-독성 C-말단 단편)가 모델 항원으로서 선택되었다 (문헌 [Amanna et al., N. Engl. J. Med., 357:1903-1915, 2007]). 따라서, TTCF의 사용은 본원에 개시된 방법이 검증될 수 있는 대상체의 대형 풀을 제공하였다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 방법이 일상적인 기술을 사용하여 임의의 질환-관련 항원을 포함하도록 개조될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 암-관련 항원인 MICA 및 안지오포이에틴-2에 대해 지시된 항체의 획득을 통해 이러한 개조가 제시되었다.

실시예 1: 항원 발현 및 사량체 형성

하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이, TTCF를 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰고, BirA 부위를 BirA 효소에 의한 부위-특이적 모노-비오티닐화를 위해 N-말단에 부착시켰다. 가요성 링커가 단백질과 비오티닐화 부위 사이에 놓여, 항체 결합의 입체 장애를 방지하였다. TTCF를 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, BirA로 비오티닐화시키고, 겔 여과 크로마토그래피에 의해 유리 비오틴 및 BirA로부터 분리하였다. 형광 태그부착된 스트렙타비딘을 1:4의 몰비로 비오티닐화 TTCF 항원과 함께 인큐베이션함으로써 TTCF 사량체가 생성되었다. 그 후, 이러한 사량체를 파상풍 톡소이드 특이적 기억 B 세포의 확인을 위해 mAb의 패널과 함께 사용하였다.

pET-15b (노바젠(Novagen))에서 TTCF를 클로닝하였다. 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 4시간 동안 28℃에서 BL21(DE3) 에스케리키아 콜라이에서 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 세척하고, 용해시키고, 생성된 상청액을 수집하였다. HIS-셀렉트(HIS-Select) 친화도 칼럼 (시그마(Sigma))을 사용하여 TTCF를 정제하였다. 단백질분해로 His-태그를 제거하였다. 유사한 방법을 사용하여 뮤린 CD80 막 인접 도메인을 생산하였다. 단백질을 모노-비오티닐화시켰다. 특정 실험에 대해, 알렉사-488 염료 분자 (몰레큘라 프로브스(Molecular probes))를 비오티닐화 TTCF 또는 CD80 상의 1급 아민에 연결시켰다.

4:1의 몰비로 비오티닐화 항원을 프리미엄 등급의 PE 표지 스트렙타비딘 (몰레큘라 프로브스)과 함께 적어도 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션함으로써 항원 사량체를 제조하였다. 사용 전에, 사량체 제제를 원심분리하여 응집체를 제거하였다. 일부 실험에서, 4:1 비의 알렉사-플루오르-488 태그부착된 항원 및 비-형광 스트렙타비딘으로 사량체가 형성되었다.

실시예 2: 확인 방법

문헌 [Franz et al., Blood, 118(2):348-357 (2011)]에 기재된 바와 같이 방법을 수행하였다. BD FACS Aria II 세포 분류기에서 세포를 분류하였다. 세포를 단일-세포 분류하였다. 먼저 샘플을 배제 마커 (CD3, CD14, CD16, 7AAD)의 패널에 대해 음성인 CD19⁺ 세포에 대해 게이팅한 후, 높은 수준의 CD27 및 중간 수준의 CD19 발현으로 확인되는 형질모구에 대해 게이팅하고, 마지막으로 사량체⁺ CD19⁺ 세포에 대해 게이팅하였다.

기억 B 세포의 낮은 빈도로 인해, 배경을 가능한 많이 주의하여 감소시키는 것이 필요하였다. 먼저 B 세포를 음성 선택 (CD2, CD3, CD14, CD16, CD56 및 글리코포린 A에 대한 항체의 칵테일)에 의해 강화시켜, 사량체에 비-특이적으로 결합할 수 있는 대부분의 세포를 제거하였다. 강화된 세포를 균일하게 분할하고, TTCF 또는 대조군 사량체로 염색한 후, CD19, CD27 및 IgM으로 표지하여, 부류-전환 기억 B 세포를 특이적으로 선택하였다. 이러한 게이팅 전략은 CD19 발현, 배제 마커 (CD3, CD14, CD16, 7AAD)의 패널로의 표지화의 결여, 기억 마커 CD27의 발현, 및 IgM 발현의 결여를 부류 전환의 증거로 간주하였다. 관심 대상인 항원 특이성이 있는 기억 B 세포의 가시화를 위해 사량체 염색을 CD27 염색에 대해 플롯팅하였다. 사량체-양성 B 세포가 3 μl mRNA 추출 완충제를 함유하는 PCR 스트립 내로 직접적으로 분류되었다.

분류하는 동안 튜브를 차갑게 유지시켰고, 분류된 세포를 동결시키고, -80℃에서 저장하였다. CD19+ CD27+ IgM- B 세포가 양성 대조군으로서 사용되었다.

기존에 보고된 네스트 PCR 프로토콜을 사용하여 중쇄 및 경쇄 가변 절편을 증폭시켰다 (문헌 [Wang et al., J. Immunol. Methods., 244:217-225, 2000]). 오염을 최소화하는데 적합한 조건 하에 mRNA 증폭을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기를 포함하였다:

네스티드 RT-PCR을 문헌 [Franz et al., Blood, 118(2):348-357 (2011)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

오염에 대해 모니터링하고 경계하기 위해 음성 대조군이 포함되었다. TTCF 사량체로 표지된 총 35개의 단일 세포로부터, 32개의 중쇄 및 30개의 경쇄 절편이 증폭되었고, 겔-정제 PCR 생성물로부터 직접적으로 서열분석되었으며, 이는 89%의 전체적인 PCR 효율에 상응하였다. 서열 분석은 TTCF 사량체⁺ 세포가, 하나의 특정한 유전자 절편이 우세하지 않으면서, 다양한 상이한 V_HD-J_H 유전자 절편을 사용하였음을 나타냈다. 관찰된 서열은 클론이 체성 과다돌연변이에 의해 다양화된 세포를 나타냈음을 지지하였다.

항체 생산 및 정제는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 DNA를 소 프로락틴 신호 펩티드 서열, 뿐만 아니라 전장 IgG1 중쇄 또는 카파 경쇄 불변 도메인을 함유하는 개별적인 pcDNA3.3 발현 벡터 내로 클로닝하는 것을 포함하였다. 8% CO₂, 37℃의 100ml 스피너 플라스크에서 8mM 글루타맥스(Glutamax) (깁코(Gibco))가 보충된 CHO-S 배지 (인비트로젠(Invitrogen))에서 항체가 발현되었다. 형질감염 1일 전에, 세포를 6x10⁵개의 세포/ml로 분할하였다. 형질감염일에, 세포를 1x10⁶개의 세포/ml로 조정할 필요가 있었다. 25 μg의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 MAX 형질감염 시약 (인비트로젠)을 사용하여 공동-형질감염시키고, 형질감염된 세포를 6-8일 동안 배양하였다. 단백질 G 세파로스 비드를 사용하여 단백질을 수득하고, 100mM 글리신 pH 2.5를 사용하여 항체를 용리시키고, 스핀-X(Spin-X) 원심분리 튜브를 사용하여 비드로부터 분리하였다. 정제된 항체를 마이크로 바이오-스핀(Micro Bio-Spin) 칼럼 (바이오라드(BioRad))을 사용하여 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내로 교환시켰다. 280nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도를 평가하였다.

포화 결합 검정을 위해, 비오티닐화되지 않은, 모노큐(MonoQ) 정제된 TTCF를 유로퓸으로 표지하고, 유리 유로퓸을 제거하였다. 96-웰 편평 바닥 플레이트를 pH 9.6의 100mM NaHCO₃ 완충제 내의 웰당 20ng의 항체로 밤새 코팅하였다. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 소 감마 글로불린이 보충된 검정 완충제로 차단을 수행하였다. TTCF-유로퓸을 검정 완충제에서 희석하고 (100nM 내지 4pM), 웰당 200μl를 3중으로 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 200 μl 세척 완충제 (50mM 트리스(Tris) pH 8, 150mM NaCl, 20μM EDTA, 0.05% 트윈)로 3회 세척하였다. 100 μl 강화 용액을 각각의 웰에 첨가하였고, 615nm에서 빅터³(Victor³) 플레이트 판독기를 사용하여 형광 카운트를 측정하였다.

중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 IMGT/V-퀘스트(V-Quest) 및 JIONSOLVER 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 유동 세포측정법 데이터를 플로우조(FlowJo) 분석 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 독립표본 t-검정을 사용하여 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5) 소프트웨어를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 항체 K_D 값을 결정하기 위해, 비-선형 회귀 분석을 사용하여 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 사용하여 포화 결합 데이터를 피팅하였다.

실시예 3: 다량체화가 기억 B 세포의 확인을 증진시킨다

사량체 및 단량체 TTCF를 비교하였다. TTCF를 알렉사-488로 형광-표지한 후, 단량체 형태로 사용하거나, 또는 표지되지 않은 스트렙타비딘을 사용하여 사량체로 전환시켰다 (상기 참조). 그 후, 강화된 B 세포를 동일한 농도의 사량체 또는 단량체 TTCF-알렉사-488과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 단백질 (CD80 막 인접 도메인)이 동일한 방식으로 표지되었고, 또한 사량체로서 사용되었다.

도 6A 및 6B에 제시된 바와 같이, TTCF가 일부 기억 B 세포를 표지하였지만, 3개의 공여자로부터의 세포를 사용하여 사량체로 확인된 빈도가 실질적으로 더 컸다 (1.6-7.3배). 3개의 공여자 중 하나에서, TTCF 특이적 기억 B 세포가 사량체로 검출될 수 있었지만, 단량체로는 그렇지 않았다.

이러한 결과는 항원 사량체가 기억 B 세포가 말초 혈액에서 매우 희귀함에도 불구하고, 그의 BCR의 항원 특이성을 기초로 이러한 세포의 민감한 검출을 가능하게 한다는 것을 입증한다. TTCF에 대해 특이적인 부류-전환 기억 B 세포가 적절한 사량체 TTCF 항원에 의해 밝게 표지된 반면, 대조군 사량체로의 배경 표지화는 일관적으로 낮았다.

실시예 4: 방법/항체 검증

중첩 PCR을 통해 IgG 중쇄 및 카파 쇄의 불변 영역을 단리된 가변 절편에 연결시킴으로써 완전 인간 항체가 생성되었다. 6-8일의 기간 동안 CHO-S 세포를 사용하여 일시적인 무혈청 포유동물 발현 시스템에서 항체가 발현되었다. 단백질 G 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 항체를 정제하였다.

도 7A-7B에 제시된 바와 같이, TTCF-특이적 형질모구로부터 단리된 항체가 2.2 nM (TTCF Ab 1) 및 323 pM (TTCF Ab 2)의 K_D로 TTCF 항원에 대한 높은 결합 친화도를 나타냈다 (도 7B). 기억 B 세포로부터 단리된 항체는 또한 다른 항체 (TTCF Ab 3, 4, 및 5)에 대해 382 pM, 228 pM, 및 1.4 nM의 K_D로 높은 결합 친화도를 나타냈다 (도 7B).

이들 데이터는 본원에 개시된 방법의 특이성을 지지한다. 또한, 3개의 상이한 공여자로부터의 5개의 항-TTCF 항체의 구축에 의해 본원의 방법의 특이성이 입증되었고, 이들 모두 고친화도로 TTCF에 결합하였다.

본원의 데이터는 항원 사량체가 숙주로부터 항원이 소거되고 나서 오래 후에 기억 B 세포의 민감한 검출을 가능하게 한다는 것을 또한 입증한다.

실시예 5: 항-MICA 항체의 수득

MICA에 면역특이적으로 결합하는 항체가 본원의 방법을 사용하여 개발되었다.

간략하게, MICA 항원 (유니진 Hs.130838)이 항원의 모노-비오티닐화를 가능하게 하는 C-말단 BirA 태그 (GLNDIFEAQKIEWHE (서열 148))와 함께 발현되었다. 항원을 R-피코에리트린 (PE)으로 표지된 스트렙타비딘 (SA)으로 4 MICA: 1 SA의 몰비로 사량체화하였다. GM-CSF 발현 벡터가 형질도입된 자가 종양 세포로 백신접종되었고 (GVAX) (PNAS 103: 9190, 2006), 이어서 항-CTLA-4 모노클로날 항체 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)™ (브리스톨 마이어스 스큅(Bristol Myers Squib)으로부터 입수가능함))으로 치료된 진행 병기 흑색종 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포를 신속하게 해동시키고, 세척하고, 2% 소 태아 혈청이 보충된 포스페이트 완충 염수 (pH 7.2)에 5x10⁶개로 재현탁시키고, 30분 동안 얼음 상에서 약 0.1ug/ml 사량체로 염색하였다. 부류-전환, 기억 B-세포 (CD19⁺, CD27⁺, 및 IgM^-)를 확인하기 위해 항체를 첨가하였다. T-세포, 자연 킬러-세포, 대식세포 및 사멸 세포를 표지하는 배제 항체의 패널이 배경 사량체 염색을 감소시키기 위해 포함되었다 (CD3, CD14, CD16, 7-AAD). MICA 사량체에 결합한 단일 B 세포가 BD FACS 아리아(Aria) II를 사용하여 8-튜브-PCR 스트립 내로 분류되었다. 하기에 제시된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 에피센터 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies)로부터의 상업용 키트 (카탈로그 번호: MBCL90310)를 사용하여 B-세포 수용체 (BCR) mRNA를 증폭시켰다:

mRNA 증폭

PCR 1

PCR 2

문헌 [Wang and Stollar et al., journal of immunological methods, 2000]으로부터 PCR 1 및 PCR 2에서 사용된 프라이머 및 PCR 사이클링 조건이 개조되었다.

잠재적으로 상기 프라이머 세트에 의해 충분히 포괄되지 않는 중쇄 가변 영역 서열을 포괄하기 위해 대안적인 중쇄 가변 영역 정방향 프라이머 세트가 개발되었다. 하기의 대안적인 프라이머가 생성되었다:

PCR 1

PCR 2

간략하게, mRNA 증폭을 통해 생성된 2ul cDNA가 하기의 사이클링 조건으로 제1 라운드 PCR을 위한 주형으로서 사용되었다: 3회의 사전증폭 사이클 (94℃/45초, 45℃/45초, 72℃/105초); 30회의 증폭 사이클 (94℃/45초, 50℃/45초, 72℃/105초); 72℃에서 10분 최종 연장.

3ul의 제1 라운드 PCR 생성물이 제2 라운드의 네스티드 PCR을 위한 주형으로서의 역할을 하였다. 제1 라운드의 PCR에 대한 것과 동일한 사이클링 조건이 사용되었지만, 3회의 사전증폭 사이클은 생략되었다. 둘 다의 PCR 단계를 클로닝된 Pfu 폴리머라제 AD (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 뉴클레오티드 300-400개 크기의 생성물을 지모클린(Zymoclean) DNA 겔 회수 키트 (지모 리서치(Zymo Research))를 사용하여 단리하였다. 제2 라운드 네스티드 PCR에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 서열분석을 수행하였다. 2-단계 네스티드 PCR은 중쇄 및 경쇄의 BCR 가변 도메인을 증폭시킨다 (상기 참조). GM-CSF 발현 벡터가 형질도입된 자가 종양 세포로 백신접종된 (GVAX) 진행 병기 흑색종 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 수득하였다 (PNAS 103: 9190, 2006). 일시적인 CHO-S 발현 시스템에서 전장 IgG1 항체로서 항체가 발현되었다.

항-MICA 항체가 MICA에 결합하는 것의 검증을 2개의 독립적인 비드-기반 검정을 사용하여 수행하였다. 제1 검정은 다양한 MICA 대립유전자에 대해 반응성인 항-MICA 항체의 검출을 위해 설계된 상업적으로 입수가능한 용액 기반 비드 검정 키트를 사용하였다 (원 람다(One Lambda), 카탈로그 번호 LSMICA001). 다양한 농도의 MICA 항체를 비드와 함께 인큐베이션한 후, 세척하고, 피코에리트린과 접합된 항-인간 IgG 항체와 함께 인큐베이션하였다. 제2 세척 단계 후, 비드를 루미넥스 기계 상에서 분석하였다. 음성 대조군은 비드를 피코에리트린과 접합된 항-인간 IgG 항체 단독과 함께 인큐베이션하는 것으로 이루어졌다 (항-MICA 항체 없음). 양성 대조군은 비드를 피코에리트린에 직접적으로 접합된 상업적으로 입수가능한 항-MICA/MICB 모노클로날 항체 (클론 6D4) (바이오레전드 카탈로그 #320906)와 함께 인큐베이션하는 것으로 이루어졌다. 제2 검정은 스트렙타비딘과 접합된 폴리스티렌 비드를 사용하여 내부적으로 개발되었다. 비드를 모노비오티닐화 MICA 단백질로 코팅하고, 다양한 농도의 항-MICA 항체, 항-TTCF 항체 (이소형 음성 대조군), 또는 피코에리트린에 직접 접합된 바이오레전드 항-MICA/MICB 항체 (양성 대조군)와 함께 인큐베이션하였다. 항-MICA 항체 또는 항-TTCF 항체와 함께 인큐베이션된 비드를 세척한 후, 알렉사488과 접합된 항-인간 IgG 항체와 함께 인큐베이션하였다. 비드에 대한 배경 결합을 결정하기 위해, 비교용으로 MICA 단백질로 코팅되지 않은 스트렙타비딘-접합 비드를 사용하여 동일한 인큐베이션을 수행하였다. FACS 캘리버(Caliber) 유동 세포측정기 상에서 항체에 결합하는 것에 대해 비드를 분석하였다.

도 8 및 9A-9O에 제시된 바와 같이, 항-MICA 항체 (MICA-Ab12 및 MICA-Ab20)가 MICA에 고친화도로 결합한다. MICA-Ab20은 표 1에 기재된 항-MICA 항체 ID 1에 상응한다.

실시예 6: 항-MICA 항체

임상적으로 관련된 생물학적 특성을 갖는 추가의 항-MICA 항체가 본원의 방법을 사용하여 개발되었다. 공통 대립유전자에 반응성인 MICA-특이적 항체가 세포성 암 백신 (GM-CSF 형질도입된 암 세포, GVAX로 지칭됨) 및 T 세포 상의 억제성 CTLA-4 수용체를 차단하는 항체인 이필리무맙 (예르보이™ (브리스톨 마이어스 스큅으로부터 입수가능함))을 제공받은 적이 있는 환자에서 확인되었다. 그 후, MICA 사량체를 사용하여, 혈청 MICA 반응성이 가장 높은 환자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 B 세포를 단리하였다. 실시예 5에 약술된 바와 같이, 단일 세포 PCR에 의해 이러한 B 세포로부터 중쇄 및 경쇄 서열을 결정하였다. 이러한 노력으로 북미인 집단에서 공통 대립유전자를 인식하는 항체가 확인되었다.

CM24002 Ab2 (표 1에 기재된 항-MICA 항체 ID 6)는, GVAX + 이필리무맙 조합 요법에 대해 유의한 임상 반응이 입증되었고 혈장이 MICA와 강하게 반응하는, 급성 골수성 백혈병 (AML) 환자로부터 단리된 항체이다. CM24002 Ab2 경쇄 (도 12 및 13) 및 중쇄 (도 10 및 11) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제시되고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄로 표시된다. 강한 결합의 추가의 항체가 동일한 환자로부터 수득되었고, 이는 CM24002 Ab4 (표 1에 기재된 항-MICA 항체 ID 7)로 표지된다. CM24002 Ab4 경쇄 (도 16 및 17) 및 중쇄 (도 15 및 14) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제시되고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄로 표시된다.

CM33322 Ab11 (표 1에 기재된 항-MICA 항체 ID 8), CM33322 Ab4 (표 1에 기재된 항-MICA 항체 ID 11), 및 CM33322 Ab28 (표 1에 기재된 항-MICA 항체 ID 12)는 GVAX + 이필리무맙 조합 요법에 대한 장기 반응자인 전이성 흑색종 환자로부터 단리된 항체이다. CM33322 Ab11 경쇄 (도 20 및 21) 및 중쇄 (도 18 및 19) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제시되고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄로 표시된다. CM33322 Ab29 경쇄 (도 24 및 25) 및 중쇄 (도 22 및 23) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제시되고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄로 표시된다. CM33322 Ab4 경쇄 (도 37 및 38) 및 중쇄 (도 35 및 36) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제시되고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄로 표시된다. CM33322 Ab28 경쇄 (도 52 및 53) 및 중쇄 (도 50 및 51) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제시되고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄로 표시된다. 이러한 환자의 장기 임상 반응으로 인해, 이러한 항체가 특히 흥미롭다.

관심 항체의 최초의 확인, 클로닝 및 발현 후, 상이한 MICA 대립유전자에 대한 이러한 항체의 특이성을 세포측정 비드 검정으로 결정하였다. 간략하게, 단일 BirA 비오티닐화 부위를 갖는 가용성 재조합 MICA 대립유전자 002, 008, 009 및 MICB를 발현시키고, 정제하고, 스트렙타비딘 비드 상에 포획시켰다. 그 후, 지시된 항-MICA 항체를 다양한 농도로 재조합 MICA로 코팅된 비드와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, FITC-표지 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 제2 세척 단계 후, 비드-결합 FITC 형광의 정량화를 유동 세포측정법에 의해 완료하였다. MICA 대립유전자 002, 008, 009, 뿐만 아니라 관련된 MICB 단백질은 북미인 집단에서의 이들의 유병률을 기초로 선택되었다 (도 26A-G). 중요하게, CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29가 모든 MICA 대립유전자, 뿐만 아니라 MICB에 강하게 결합하였다. 다른 2개의 항체는 대립유전자의 하위세트에 결합하였다: CM24002 Ab4는 MICA*009 및 MICB에 고도로 결합하였고, CM33322 Ab11은 MICA*002, MICA*008, 및 MICB에 고도로 결합하였다 (도 26A-G). 동일한 기술로 생성된 음성 인간 대조군 항체 (파상풍 톡소이드 C-말단 단편 (TTCF)에 대해 특이적임) 및 MICA에 대한 양성 대조군 항체 (MICA에 대해 지시된 바이오레전드로부터의 상업용 뮤린 항체)를 사용하여 특이성이 기록되었다. 이러한 연구로, CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29가 임상 용도를 위한 잠재적인 후보로서 확인되었다.

CM33322 Ab28의 결합은 ELISA (HRP 판독)에 의해 3종의 통상적인 대립유전자 (MICA*002, MICA*008, MICA*009)에 의해 코딩된 재조합 MICA에 대해 2종의 항체 농도 (500ng/ml 및 1μg/ml)에서 시험하였다. 결과는 CM33322 Ab28이 모든 3종의 대립유전자에 결합한다는 것을 입증하였고, 이는 이러한 항체가 또한 임상 용도를 위한 후보임을 나타낸다.

실시예 7: 자가 종양 세포에 대한 항-MICA 항체의 결합

자가 종양 세포에 결합하는 단리된 항-MICA 항체 CM24002 Ab2의 능력을 유동 세포측정법으로 검사하였다 (도 27). 환자 CM24002로부터 골수를 수득하고, CM24002 Ab2에 의한 종양 세포에 대한 결합을 시험하였다. 그 후, 종양 세포가 이러한 골수 샘플로부터 CD33+ CD34+ 세포로서 확인되었다. 그 후, 종양 세포를 10 μg/ml의 항-MICA 항체 CM24002 Ab2, 양성 대조군인 상업용 MICA 항체 (바이오레전드) 또는 음성 대조군 항체 (TTCF 특이적)로 염색하였다. 도 27에 제시된 바와 같이, CM24002 Ab2가 이러한 세포에 강하게 결합하였다. CM24002 Ab2는 비-종양 세포 (CD16+ 및 CD3+ 세포)에 대한 결합을 나타내지 않았고, CD14+ 세포에 대해서는 오직 배경 결합만 있었으며, 이는 항종양 특이성을 입증한다 (데이터는 제시되지 않음).

실시예 8. NK 세포 상의 NKG2D 수용체의 항-MICA 항체 억제.

동족 수용체인 NKG2D의 가용성 MICA-매개 하향-조절을 방지하는 단리된 항-MICA 항체 CM24002 Ab2의 능력을 시험하였다. 환자 CM24002로부터의 혈청을 1:10 희석하여 사용하였고, 48시간의 기간 동안 인간 NK 세포와 함께 인큐베이션하였다. CM24002 Ab2 (10 μg/ml의 농도), 양성 대조군인 상업용 MICA 항체 (바이오레전드) 또는 음성 대조군 항체 (TTCF 특이적)를 이러한 배양물에 첨가하였다. 48시간째에 유동 세포측정법에 의해 NKG2D 발현을 평가하였다 (도 28). 환자 CM24002로부터의 혈청은 NKG2D의 발현을 강하게 하향-조절하였다 (따라서, 이러한 수용체의 기능을 불가능하게 함). CM24002 Ab2 및 양성 대조군 MICA 항체는 NK 세포에 의한 NKG2D 표면 발현을 부분적으로 회복시켰다. 특이성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 세포를 환자 혈청 대신 2ng/ml의 재조합 MICA와 함께 인큐베이션함으로써 상기 실험을 반복하였다 (도 29). CM24002 Ab2는 NKG2D 발현의 MICA-매개 하향-조절을 완전히 방지한 한편, 음성 대조군 항체 (TTCF에 대해 특이적)는 효과가 없었다 (도 29). 이들 데이터는 인간 MICA 항체가 인간 NK 세포 상의 중요한 NKG2D 수용체의 억제를 방지할 수 있다는 것을 입증한다.

NKG2D의 가용성 MICA-매개 하향-조절을 방지하는 단리된 항-MICA 항체의 능력을 추가로 조사하기 위해, 상기 실험을 다중 혈청 샘플 및 추가의 단리된 항-MICA 항체를 사용하여 반복하였다. 도 29에 제시된 바와 같이, 진행성 흑색종을 갖는 환자로부터의 20개 혈청 샘플 중 15개는 유의한 수준의 쉐딩된 MICA를 함유하였다. PBMC를 대조군 혈청, 또는 가용성 MICA를 단독으로 또는 100ug/ml의 지시된 항체의 존재 하에 함유하는 선택된 흑색종 환자 샘플과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간째에, NKG2D 발현을 유동 세포측정법에 의해 NK 세포 (CD3-, CD8-, CD56+) 상에서 결정하였다 (도 40; 데이터는 NKG2D 양성인 NK 세포의 %로 제시됨). 이들 데이터는 인간 MICA 항체가 혈청 샘플에서 NKG2D 하향-조절을 차단하고, 시험된 모든 혈청 샘플에서 NKG2D-매개 세포독성을 회복시키고, 인간 NK 세포 상에서 중요한 NKG2D 수용체의 억제를 방지할 수 있는 것으로 추가로 입증한다.

NKG2D의 가용성 MICA-매개 하향-조절을 방지하는 단리된 항-MICA 항체의 능력을 추가로 조사하기 위해, 상기 실험을 추가의 단리된 항-MICA 항체 (예를 들어, CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11, 또는 CM33322 Ab28)를 사용하여 반복하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, NKG2D 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 도 59에 제시된 바와 같이, 여러 항-MICA 항체가 rMICA-유도된 NKG2D 하향-조절을 차단하였다.

NKG2D의 흑색종 혈청 유도된 하향-조절을 방지하는 단리된 항-MICA 항체의 능력을 조사하기 위해, 상기 실험을 다중 혈청 샘플 및 추가의 단리된 항-MICA 항체를 사용하여 반복하였다. 전체 PBMC를 대조군 혈청 또는 흑색종 혈청 단독과 함께 또는 지시된 항체의 존재 하에 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, NKG2D 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 도 57에 제시된 바와 같이, 여러 항-MICA 항체가 흑색종 혈청 유도된 NKG2D 하향-조절을 차단하였다.

실시예 9: 항-MICA 항체 세포-매개 세포독성

CM24002 Ab2가 세포-매개 세포독성을 가능하게 하는지를 결정하기 위해, 인간 NK 세포 (이펙터 세포)를 CM24002 Ab2, 음성 대조군 항체 (TTCF 특이적) 또는 양성 대조군 항체 (바이오레전드) (모두 10 μg/ml)의 존재 하에 48시간 동안 재조합 MICA (2ng/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, 4시간 동안 20:1, 10:1, 및 5:1의 이펙터:표적 비로 K562 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. NK 세포에 의한 표적 세포의 비용해도를 K562 종양 세포로부터의 시토졸 단백질 (LDH)의 방출에 의해 결정하였다. MICA 항체의 부재 하에서는, NK 세포에 의한 K562 종양 세포의 사멸이 없었다. 그러나, CM24002 Ab2는 K562 종양 세포의 NK 세포 매개 용해를 매우 증진시켰고, 모든 이펙터:표적 비에서 양성 대조군인 뮤린 MICA 항체보다 더욱 효과적이었다 (도 30). K562 종양 세포의 사멸이 실제로 (Fc 수용체보다는) NKG2D 경로에 의해 매개되었다는 것이 추가로 입증되었다. 2개의 실험 군을 추가하여 상기 실험을 반복하였다: NKG2D에 대한 차단 항체 및 인간 Fc 차단. 또한, CM33322 Ab29도 시험하였다. 데이터는 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29의 첨가가 NK 세포 매개 세포독성을 가능하게 하였음을 나타낸다. 차단 NKG2D 항체가 첨가된 경우에 K562 세포의 사멸이 발생하지 않은 한편, Fc 차단 시약은 효과가 거의 없었다 (도 31). 이들 데이터는 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29가 NKG2D 경로의 항종양 기능을 회복시킨다는 것을 나타낸다.

추가의 단리된 항-MICA가 세포-매개 세포독성을 가능하게 하는지를 결정하기 위해, 전체 PBMC를 CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab28, 음성 대조군 항체 (TTCF 특이적) 또는 양성 대조군 항체 (바이오레전드)의 존재 하에 48시간 동안 재조합 MICA (rMICA)와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후, 세포를 세척하고, 4시간 동안 20:1, 10:1, 및 5:1의 이펙터:표적 비로 ⁵¹Cr 표지된 K562 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비용해도는 4시간 후에 ⁵¹Cr 방출에 의해 평가하였다. 도 58에서 입증된 바와 같이, NK 세포 사멸 활성은 재조합 sMICA의 존재 하에 항-MICA 항체에 의해 증진되었다. 단리된 항-MICA 항체가 세포-매개 세포독성을 가능하게 하는지를 추가로 결정하기 위해, 인간 NK 세포 (이펙터 세포)를 흑색종 환자 혈청과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. PBMC를 대조군 혈청, 또는 가용성 MICA를 단독으로 또는 100ug/ml의 지시된 항체의 존재 하에 함유하는 흑색종 환자 샘플과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다 (음성 이소형 대조군 항체 (TTCF 특이적) 또는 양성 대조군 항체 (바이오레전드)). 48시간째에, 세포를 세척하고, 20:1 이펙터 대 표적 비로 ⁵¹Cr 표지된 K562 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비용해도를 4시간 후에 섬광 계수에 의해 평가하였다. (도 41-43 및 62) 이들 데이터는 CM24002 Ab2, CM33322 Ab29, CM33322 Ab4 및 CM33322 Ab28이 NKG2D 경로의 항종양 기능을 회복시킨다는 것을 추가로 보여주었다.

전체 PBMC를 대조군 혈청 또는 단독으로 또는 CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11, 및 CM33322 Ab28의 존재 하에 흑색종 혈청과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. (도 56) 48시간 후, 세포를 세척하고, 지시된 이펙터 대 표적 비로 ⁵¹Cr 표지된 K562 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비용해도는 4시간 후에 ⁵¹Cr 방출에 의해 평가하였다. 도 56에서 입증된 바와 같이, NK 세포 사멸 활성은 흑색종 혈청의 존재 하에 항-MICA 항체에 의해 증진되었다.

추가의 예에서, CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab28은 K562 종양 세포의 NK 세포 매개 용해를 고도로 증진시켰고, 모든 이펙터:표적 비에서 양성 대조군인 뮤린 MICA 항체보다 더 효과적이었다 (도 54).

추가의 실험에서, CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 및 CM33322 Ab29는 sMICA⁺ 환자 혈청과의 48시간 인큐베이션 동안 NK 세포 및 CD8 T 세포에 대해 NKG2D 수용체 하향조절을 방지하였다 (도 62a-b). 이들 MICA 항체는 또한 sMICA에 의한 CD8 T 세포 세포독성의 억제를 방지하는 것 (NY-ESO에 대해 특이적인 클론, ⁵¹Cr 표지된 Mel375 세포, 20:1 E:T 비)으로 나타났다 (도 62c).

실시예 10: 알파 3 MICA 도메인에 대한 항-MICA 항체의 결합

NKG2D 수용체는 MICA의 상부의 알파 1 및 알파 2 도메인에 결합하고, 이와 동일한 부위에 결합하는 항체는 NKG2D 수용체와 경쟁할 수 있으며, 이에 의해 NK 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 차단할 수 있다. 알파 3 도메인에 결합하는 항체는 이들이 NKG2D 수용체 결합을 차단할 수 없기 때문에 특히 흥미롭다. 동시에, 이러한 항체는 종양 세포 표면으로부터의 MICA의 단백질분해적 절단을 방해할 수 있다. MICA 알파 3 도메인에 대한 항-MICA 항체의 능력을 기존에 기재된 세포측정 비드 검정을 사용하여 평가하였다. 비오티닐화 재조합 단백질을 스트렙타비딘 비드 상에 포획시켰다. 그 후, 비드를 10 μg/ml의 항체 CM24002 Ab2, CM24002 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab29, 음성 대조군 항체 (TTCF 특이적) 또는 양성 대조군 항체 (바이오레전드)에 이어서 FITC-표지 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였고, 유동 세포측정법에 의해 비드-결합 FITC 형광을 정량화하였다 (도 32). 도 32에 제시된 바와 같이, CM33322 Ab29가 MICA 알파 3 도메인에 결합하였고, 따라서 치료 용도로 매우 흥미롭다.

또 다른 실험에서, CM24002 Ab2, CM24002 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab29 및 CM33322 Ab28은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 재조합 MICA α3 도메인에 결합하였다 (도 63a). CM24002 Ab2, CM33322 Ab29 및 CM33322 Ab28은 추가로, 48시간 인큐베이션 동안 RPMI-8226 세포 상 MICA 표면 수준을 증가시키는 것으로 나타났다.

실시예 11: 종양 세포에 대한 항-MICA 항체의 결합

광범위한 암을 표적화하는데 사용될 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29의 잠재력을 평가하였다. 다발성 골수종 (RPMI 8226 및 Xg-1), 난소암 (OVCAR3), 급성 골수성 백혈병 (U937), 흑색종 (K028), 폐암 (1792 및 827), 및 유방암 (MCF7) 세포의 패널을 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29에 의한 표지화에 대해 시험하였다. 종양 세포를 1x10⁶개의 세포/ml의 농도로 PBS + 1% BSA에 재현탁시켰고, 1시간 동안 4℃에서 10 μg/ml 농도의 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29, 뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군 (각각 뮤린 MICA 항체 및 TTCF-특이적 항체) (직접적으로 접합됨)으로 염색하였다. 유동 세포측정법으로 표지화를 평가하였다 (도 33). CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29 둘 다 시험된 모든 종양 세포 유형에 결합하였고, 이때 시험된 세포주 대다수에 대해 표지화가 상업용 양성 대조군보다 더 컸다. Mel526, K029, RPMI-8226 및 MCF-7 종양 세포주에 대해 시험한 경우에, CM3332 Ab28은 또한 종양 세포 상에서 MICA를 검출하는 능력을 입증하였다.

실시예 12: 항-MICA 항체의 MICA 대립유전자 특이성

CM33322 Ab29의 대립유전자 특이성을 상업적으로 입수가능한 루미넥스 검정을 사용하여 평가하였다. 상업용 시험 키트는 루미넥스 비드에 직접적으로 접합된 재조합 MICA 대립유전자 (MICA*001, *002, *007, *012, *017, *018, *027, *004, *009, 및 *015)를 함유하고, 이들 각각은 단일 샘플에서 결합이 평가될 수 있게 하는 고유의 형광 특성을 갖는다. 지시된 MICA 대립유전자로 코팅된 루미넥스 비드를 1시간 동안 10 μg/ml의 CM33322 Ab29, 바이오레전드 양성 대조군, 및 음성 대조군 (TTCF)과 함께 인큐베이션하였고, 이어서 PE-접합 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 지시된 항체와의 60분 동안의 인큐베이션 및 항-인간 PE-접합 2차 항체와의 후속 인큐베이션 후에 루미넥스 200 기기를 사용하여 형광을 결정하였다 (도 34). CM33322 Ab29는 상업용 검정에 존재하는 모든 대립유전자와 결합할 수 있었고, 이는 이것이 MICA 유전자형과 관계없이 환자에서 사용될 수 있음을 나타낸다.

이들 데이터는 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29의 높은 생물학적 활성 및 종양 세포의 NK 세포 매개 용해를 회복시키는 이들의 능력을 입증한다. 이들 데이터는 면역요법에 반응한 암 환자가 NK 세포의 항종양 활성을 회복시키는 MICA 항체를 생산하였다는 것을 입증한다. 이와 함께, 이러한 결과는 암 환자에서 면역 억제를 극복하고 종양 파괴를 촉진하는 항-MICA 항체의 치료 잠재력을 강조한다.

실시예 13. 항-MICA 항체의 시험관내 및 생체내 생물학적 활성

종양 성장에 대한 항-MICA 항체의 영향을 직접 조사하기 위해, 뮤린 B16을 사용한 항-MICA 항체의 시험관내 및 생체내 생물학적 활성은 평가하였다. 이 연구를 위해, B16 뮤린 흑색종 세포를 인간 MICA를 발현하도록 형질도입하였다. 유동 세포측정법을 사용하여 MICA의 세포 B16 표면 발현을 검출하였다 (도 44).

도 45는 B16-MICA 종양이 비장 NK 세포 및 종양-침윤 NK 세포 상에서의 NKG2D 발현을 하향-조절하는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다. NKG2D 발현은 비-종양 마우스의 비장 또는 종양-보유 동물의 비장 및 종양으로부터 단리된 NK 세포 (CD3-, CD8-, CD335+)에 대한 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.

도 46은 항-MICA 항체 처리가 B16-MICA 종양 보유 마우스에서의 혈청-MICA 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. B16-MICA 종양 보유 B6 마우스는 1주에 3회 꼬리 정맥 주사를 통해 CM33322 Ab29의 100ug 또는 200ug/용량으로 처리하였다. 초기 처리 후 1주째에, 혈액을 수집하고, 혈청 MICA를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 47은 항-MICA 항체의 투여가 샌드위치 ELISA에 의해 MICA 검출을 방해하지 않는다는 것을 보여준다. 재조합 MICA는 18시간 동안 회전 하에 항체의 1000-배 과량과 함께 인큐베이션하였다. MICA 농도는 샌드위치 ELISA에 의해 결정하였다.

종양 성장에 대한 항-MICA 항체의 영향을 직접 조사하기 위해, 항-MICA 항체 CM33322 Ab29를 B16-MICA 종양 보유 마우스에 투여하였다. 마우스를 종양이 직경 5mm에 도달할 때 시작하여 마우스 IgG2a/κ 이소형 대조군 또는 항-MICA 항체 CM33322 Ab29의 200ug/용량으로 정맥내로 처리하였다. 용량은 1주에 3회 투여하고, 종양 부피를 매일 기록하였다. 도 48에 제시된 바와 같이, 항-MICA 항체 CM33322 AB29로의 B16-MICA 종양 보유 마우스의 처리는 종양 성장을 중지시켰다. 이들 데이터는 흑색종 세포의 성장 억제를 시험관내 및 생체내 둘 다에서 보여주었고, 항-MICA 항체 처리가 숙주 항종양 반응의 조정 및 종양 세포의 직접 사멸의 결과로서의 잠재적 치료 전략일 수 있다는 것을 보여주었다.

실시예 14. 항-MICA 항체는 종양 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시킨다

종양 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시키는 CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29의 잠재력을 조사하였다. RPMI-8226 세포를 10ug/ml 이소형 대조군 항체 (TTCF-S1C1), CM33322 Ab29 또는 CM24002 Ab2의 존재 하에 배양하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, MICA 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 도 49에서 입증된 바와 같이, CM24002 Ab2 및 CM33322 Ab29는 RPMI-8226 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시켰다.

추가의 예에서, 종양 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시키는 CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 및 CM33322 Ab28의 잠재력을 조사하였다. RPMI-8226 세포는 이소형 대조군 항체 (TTCF-S1C1) 및 CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 또는 CM33322 Ab28의 존재 하에 배양하였다. 48시간 후에, 세포를 세척하고, MICA 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 도 55에서 입증된 바와 같이, CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 및 CM33322 Ab28은 RPMI-8226 세포로부터 MICA 쉐딩을 감소시켰다.

추가의 예에서, CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 및 CM33322 Ab29는 ELISA에 의한 종양 세포 상청액 내 sMICA의 존재에 의해 측정되는 바와 같이 48시간 인큐베이션 동안 A375 세포에 의한 MICA의 쉐딩을 억제하였다 (도 63c).

실시예 15. 인간 항-MICA 항체의 치료 활성

인간 U937 종양 세포가 이식된 SCID 마우스를 CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 및 CM33322 Ab29로 처리하였다 (1주에 3x 100μg Ab). 처리 1주 후에, 모든 3종의 항체는 ELISA에 의해 측정되는 바와 같이 종양 균질물에서 sMICA를 유의하게 감소시켰고 (종양 덩이에 대해 정규화됨), 유동 세포측정법에 의해 측정되는 바와 같이 종양 균질물에서 종양 세포의 표면 상 MICA 발현을 증가시켰다 (도 64a-b).

처리된 마우스에서 NK 세포 기능을 또한 평가하였다. CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 또는 CM33322 Ab29 처리에 의한 처리는 종양-침윤 CD45⁺ NK1.1⁺ NK 세포에 의한 NKG2D 및 NKp46의 표면 수준을 증가시켰고, 종양 내 NK 세포 축적을 유도하였다 (1x10⁵개의 CD45⁺ 세포에 대해 정규화됨). 처리는 또한 종양 침윤 CD45⁺ NK1.1⁺ NK 세포에 의한 IFNγ 및 퍼포린 발현을 증가시켰다. 또한, 모든 3종의 인간 MICA 항체는 비장세포에 의한 ⁵¹Cr 표지된 YAC-1 세포의 생체외 사멸을 증진시켰다. (도 65 a-f).

실시예 16. 항-MICA 항체의 에피토프 맵핑

실험을 CM33322 mAb 29, CM33322 11, CM33322 mAb4 및 CM33322 mAb28에 대한 에피토프 서열을 결정하기 위해 수행하였다. 간략하게, 에피토프 맵핑을 MICA*009 세포외 도메인의 전장에 걸쳐있는 일련의 중첩 펩티드를 함유하는 펩티드 어레이에 의해 수행하였다. 어레이의 각각의 펩티드는 MICA*009 참조 서열 (서열 185)로부터의 20개 아미노산 선형 서열의 길이였고, 각각의 후속 서열은 이전 서열을 갖는 10개 아미노산에 의해 중첩되었다 (10 aa 오프셋을 갖는 20 aa 펩티드). 이들 펩티드를 가요성 링커의 사용을 통해 유리 슬라이드에 결합시켰다. 항체를 슬라이드와 함께 인큐베이션하였고, 항체를 Cy5 접합된 항-인간 IgG 항체로 검출된 펩티드 단편에 결합시켰다. 어레이 스팟에의 결합은 진픽스(GenePix) 마이크로어레이 스캐너로 평가하였다. 결과는 mAb CM33322 mAb 29, CM33322 11, CM33322 mAb4 및 CM33322 mAb28이 인간 MICA 또는 MICB의 알파-3 영역에 결합한다는 것을 보여주었다.

결과는 모든 3종의 항체가 명백하게 상이한 연속 아미노산 서열을 포함하는 인간 MICA의 αF3 영역 내 에피토프와 상호작용한다는 것을 보여주었다. MICA*009 내 CM33322 mAb 29, CM33322 11, CM33322 mAb4 및 CM33322 mAb28에 대한 에피토프의 아미노산 서열은 도 60A-60D에 제시되어 있다. MICA의 3차원 구조 내 CM33322 mAb 29, CM33322 mAb4 및 CM33322 mAb28에 대한 에피토프의 위치는 또한 도 61에 제시되어 있다.

결과는 항체 CM33322 mAb29에 의해 인식된 에피토프가 인간 MICA 서열 185의 아미노산 잔기 229 내지 248에 상응하는 인접 아미노산 서열: GDVLPDGNGTYQTWVATRIC (서열 186)를 포함하는 것을 보여주었다 (도 60A). 항체 CM33322 mAb11에 의해 인식된 에피토프는 인간 MICA 서열 185의 아미노산 잔기 119 내지 128에 상응하는 인접 아미노산 서열: NVETEEWTP (서열 187)를 포함한다 (도 60B). 항체 CM33322 mAb 4에 의해 인식된 에피토프는 인간 MICA 서열 185의 아미노산 잔기 179 내지 188에 상응하는 인접 아미노산 서열: TVPPMVNVTR (서열 188)을 포함한다 (도 60C). 항체 CM33322 mAb28에 의해 인식된 에피토프는 인간 MICA (서열 185)의 아미노산 잔기 199 내지 208에 상응하는 인접 아미노산 서열: TCRASSFYPR (서열 189)을 포함한다.

실시양태

1. MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물이며, 여기서 펩티드는 서열 176에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 서열 183에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L CDR3을 포함하는 것인 조성물.

2. 실시양태 1에 있어서, 펩티드가 서열 176에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR3을 포함하는 것인 조성물.

3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 펩티드가 서열 174에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H CDR2, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2, 또는 둘 다를 포함하는 것인 조성물.

4. 실시양태 3에 있어서, 펩티드가 서열 174에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 CDR2, 또는 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2, 또는 둘 다를 포함하는 것인 조성물.

5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펩티드가 서열 172에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H CDR1, 또는 서열 179에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L CDR1, 또는 둘 다를 포함하는 것인 조성물.

6. 실시양태 5에 있어서, 펩티드가 서열 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 CDR1, 또는 서열 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR1, 또는 둘 다를 포함하는 것인 조성물.

7. MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이며, 여기서 펩티드는 서열 176에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 서열 183에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L CDR3을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

8. 실시양태 7에 있어서, 펩티드가 서열 176에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR3을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

9. 실시양태 7 또는 8에 있어서, 펩티드가 서열 174에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H CDR2, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2, 또는 둘 다를 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

10. 실시양태 9에 있어서, 펩티드가 서열 174에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 CDR2, 또는 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2, 또는 둘 다를 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

11. 실시양태 8 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펩티드가 서열 172에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H CDR1, 또는 서열 179에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L CDR1, 또는 둘 다를 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

12. 실시양태 11에 있어서, 펩티드가 서열 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 CDR1, 또는 서열 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR1, 또는 둘 다를 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

13. 실시양태 7 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펩티드가

서열 168에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환 및 서열 168의 상응하는 FR1, FR2, FR3, FR4 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR1, FR2, FR3, FR4 영역을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H 쇄; 및

서열 170에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환 및 서열 170의 상응하는 FR1, FR2, FR3, FR4 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR1, FR2, FR3, FR4를 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L 쇄

를 포함하는 항체 또는 항체 단편인 키메라 항원 수용체 (CAR).

14. 실시양태 13에 있어서, 펩티드가 서열 168을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 170을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편인 키메라 항원 수용체 (CAR).

15. 실시양태 7 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포외 힌지 도메인, T 세포 수용체 막횡단 도메인, 및 세포내 T 세포 수용체 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).

16. 실시양태 7 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펩티드가 CD137 (4-IBB) 신호전달 도메인 및 CD3-ζ 쇄를 포함하는 것인 키메라 항원 수용체 (CAR).

17. 실시양태 7 내지 16 중 어느 한 실시양태의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 분자.

18. 실시양태 18의 핵산 분자를 보유하는 인간 T 세포.

19. 대상체에게 실시양태 18의 T 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 변형된 자가 T 세포인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.

20. MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA), 또는 그 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이며, 여기서 핵산은 서열 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.

21. MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA), 또는 그 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이며, 여기서 핵산은 서열 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 완전 (100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.

22. 서열 176에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 서열 183에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L CDR3을 포함하는 펩티드를 코딩하는 벡터.

23. 실시양태 22에 있어서, 펩티드가 서열 176에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 (CDR) 3, 및 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR3을 포함하는 것인 벡터.

24. 실시양태 22 또는 23에 있어서, 펩티드가 서열 174에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H CDR2, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2, 또는 둘 다를 포함하는 것인 벡터.

25. 실시양태 24에 있어서, 펩티드가 서열 174에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 CDR2, 또는 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR2, 또는 둘 다를 포함하는 것인 벡터.

26. 실시양태 22 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펩티드가 서열 172에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H CDR1, 또는 서열 179에 제시된 아미노산 서열 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L CDR1, 또는 둘 다를 포함하는 것인 벡터.

27. 실시양태 26에 있어서, 펩티드가 서열 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 상보성 결정 영역 CDR1, 또는 서열 179에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L CDR1, 또는 둘 다를 포함하는 것인 벡터.

28. 실시양태 22 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펩티드가

를 포함하는 항체 또는 항체 단편인 벡터.

29. 실시양태 28에 있어서, 펩티드가 서열 168을 포함하는 V_H 쇄 및 서열 170을 포함하는 V_L 쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편인 벡터.

다른 실시양태

본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 규정되는 본 발명의 범주를 예시하기 위해 의도되는 것이며 이를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내이다.

SEQUENCE LISTING <110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. WUCHERPFENNIG, Kai W. DRANOFF, Glenn HODI, Stephen F. FRANZ, Bettina MAY, Kenneth F., Jr. HARVEY, Christopher <120> THERAPEUTIC PEPTIDES <130> MXI-602PC2 <140> PCT/US2014/068862 <141> 2014-05-12 <150> US 61/953,588 <151> 2013-03-14 <150> US 61/913,198 <151> 2013-12-06 <160> 190 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctggccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg gtccttcact gatcattact ggagttggat ccgtcaggcc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggagaa atcaatcata gtggagtcac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagagcca gttctccctg 240 aggctgacct ctgtgaccgc cgcggacacg gctctgtact actgtgcgaa aactggcctg 300 tattatgatg acgtttgggg gacttttcgt ccacggggcg ggttcgactc ctggggccag 360 ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 2 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Phe Thr 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381 <210> 150 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Gly Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Val Tyr His Thr Gly Ala Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Glu Arg Arg Cys Ile Ile Ser Val Asp Lys Ser Asn Asn Gln Val Ser 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Gly Thr His Cys Asp Gly Asn Arg Cys Tyr Tyr Val 100 105 110 Phe Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Ile Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 151 <211> 341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 151 gatattgtga tgacccagac tccactgtcc tcacctgtca cccttggaca accggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtga aagcctcgta cattgggatg gaaccacgta cttgagttgg 120 tttcaccaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataaggtttc taaccgcttc 180 tctggggtcc cagacagatt 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occurring amino acid <400> 168 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Xaa Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gly Ser Ser Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Phe Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Val Pro Ile Phe Gly Thr Leu Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Phe Asp His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 169 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 169 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gggcattacc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccgctt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 agattcagcg gccgtggatc tgggacagag ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag gtgaataggg 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<211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 178 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 179 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 179 Gln Gly Ile Thr Ser Tyr 1 5 <210> 180 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 180 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 181 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 181 Ala Ala Ser 1 <210> 182 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 182 Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr 35 <210> 183 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 183 Cys Gln Gln Val Asn Arg Gly Ala Ala Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 184 Gly His Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 185 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 185 His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val 1 5 10 15 Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu 20 25 30 Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala 35 40 45 Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu 50 55 60 Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp 65 70 75 80 Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile 85 90 95 His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly 100 105 110 Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Val Glu Thr Glu Glu Trp Thr Val Pro 115 120 125 Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu 130 135 140 Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala 145 150 155 160 Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ser Ser Val Val Leu 165 170 175 Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser 180 185 190 Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg 195 200 205 Asn Ile Thr Leu Thr Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp 210 215 220 Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln 225 230 235 240 Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr 245 250 255 Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser 260 265 270 Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser 275 280 285 Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr 290 295 300 Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu 305 310 315 320 Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Ser Asp His 325 330 335 Arg Asp Ala Thr Gln Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Ala Leu Gly 340 345 350 Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala 355 360 <210> 186 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 186 Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala 1 5 10 15 Thr Arg Ile Cys 20 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 187 Asn Val Glu Thr Glu Glu Trp Thr Val Pro 1 5 10 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 188 Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg 1 5 10 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 189 Thr Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg 1 5 10 <210> 190 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 190 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1 5 10 15 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 35 40 45 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 50 55 60 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 85 90 95 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 100 105 110 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 130 135 140 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 145 150 155 160 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 165 170 175 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 180 185 190 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 195 200 205

Claims

MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)에 면역특이적으로 결합하며, 서열 168의 서열의 V_H에 제시된 바와 같은 V_H CDR1, V_H CDR2, 및 V_H CDR3, 또는 V_H CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 (V_H) 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
제1항에 있어서, 서열 170의 서열의 V_L에 제시된 바와 같은 V_L CDR1, V_L CDR2, 및 V_L CDR3, 또는 V_L CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 (V_L) 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서,
서열 168에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환 및 서열 168의 상응하는 FR1, FR2, FR3, FR4 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR1, FR2, FR3, FR4 영역을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_H 영역; 및
서열 170에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 내에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환 및 서열 170의 상응하는 FR1, FR2, FR3, FR4 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR1, FR2, FR3, FR4를 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L 영역
을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 168에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 V_H를 포함하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 170에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, V_H 영역이
서열 172를 포함하는 V_H CDR1;
서열 174를 포함하는 V_H CDR2; 및
서열 176을 포함하는 V_H CDR3
을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 179를 포함하는 V_L CDR1,
서열 181을 포함하는 V_L CDR2, 및
서열 183을 포함하는 V_L CDR3
을 포함하는 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, V_H 영역이 서열 168에 제시된 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에서 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 170에 제시된 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에서 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)의 아미노산 199 내지 208에 상응하는 서열 TCRASSFYPR (서열 189) 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 TCRASSFYPR (서열 189)을 포함하는 인간 MHC 부류 I 폴리펩티드-관련 서열 A (MICA)의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) MICA α3 도메인에 결합하거나;
(b) sMICA 수준을 감소시키거나;
(c) 종양 세포로부터 MICA의 쉐딩을 억제하거나;
(d) NK 세포 상의 NKG2D 수용체의 sMICA 매개 하향조절을 억제하거나;
(e) 종양 세포의 NK 세포 매개 용해를 증가시키거나; 또는
(f) (a)-(e) 중 1개 이상의 조합인
항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 168의 아미노산 서열을 포함하는 V_H; 및 서열 170의 아미노산 서열을 포함하는 V_L 영역을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체 또는 항체 단편.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 제약 조성물.
제15항에 있어서, 항암 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제15항 또는 제16항에 있어서, 히드록삼산, 보리노스타트, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 트리코스타틴 A (TSA), LAQ824, 파노비노스타트 (LBH589), 벨리노스타트 (PXD101), ITF2357 이탈파르마코 SpA, 시클릭 테트라펩티드, 뎁시펩티드 (로미뎁신, FK228), 벤즈아미드; 엔티노스타트 (SNDX-275/MS-275), MGCD0103, 단쇄 지방족 산, 발프로산, 페닐 부티레이트, AN-9, 피바넥스, CHR-3996, 및 CHR-2845로 이루어진 군으로부터 선택된 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDAC)를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 보르테조밉, NPI-0052, 카르필조밉 (PR-171), CEP 18770, 및 MLN9708로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아솜 억제제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA-4 항체 또는 펩티드, 항-PD-1 항체 또는 펩티드, 항-PDL-1 항체 또는 펩티드, 항-OX40 항체 또는 펩티드, 항-GITR 항체 또는 펩티드, 항-LAG-3 항체 또는 펩티드, 및 항-TIM-3 항체 또는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 작용제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법, 방사선 요법, 시토카인, 케모카인 및 다른 생물학적 신호전달 분자, 종양 특이적 백신, 세포성 암 백신 (예를 들어, GM-CSF 형질도입된 암 세포), 종양 특이적 모노클로날 항체, 자가 및 동종 줄기 세포 구출 (예를 들어, 이식편 대 종양 효과를 증대시키기 위함), 분자 표적화 요법, 항혈관신생 요법, 및 유전자 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 사용되는 1종 이상의 추가의 작용제와의 투여를 위해 제제화된 제약 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편의 V_H 영역을 코딩하는 단리된 핵산.
제21항에 있어서, 서열 167에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
서열 168에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
제2항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편의 V_L 영역을 코딩하는 단리된 핵산.
제24항에 있어서, 서열 169에 대해 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
서열 170에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
제27항에 있어서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 벡터.
제28항에 있어서, 바이러스 벡터가 폭스바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스 및 아데노-연관 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 벡터.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.