KR20190020297A - 항-gitr 항체 및 그것의 사용 - Google Patents

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Abstract

본원에는 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편, 및 그것을 사용하여 치료하는 방법을 포함하여, 그것의 사용 방법이 제공된다.

Description

항-GITR 항체 및 그것의 사용
본 발명은 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor) (GITR)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편 및 그것의 사용 방법에 관한 것이다.
글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 (TNFRSF)의 구성원이다. GTIR 발현은 조절 T 세포에 대해서는 본질적으로 높고, 나이브 T 세포, NK 세포 및 과립구에 대해서는 낮거나/중간이며, 활성화시에는 유도될 수 있다. GTIR은 그것의 리간드인 GITRL과 상호작용하는데, 그것은 주로 항원-제공 세포에서 발현된다. GITR 수용체 활성화는 이펙터 T-세포 증식 및 기능을 증대시킬뿐만 아리라 조절 T 세포에 의해 유도된 억제를 약화시킬 수 있다. 따라서, GITR 활성의 조절은 암 면역요법 및 면역 장애에 대한 기초로서 작용할 수 있다. 그러므로, 예컨대 GITR의 활성을 조절하는 작용제들에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 발명의 항체는 무엇보다도, 면역 세포, 예컨대 이펙터 T-세포, 조절 T-세포, 및 GITR을 발현하는 NK 세포의 표적화에 유용하다.
발명의 항체는 전장(full-length)이거나 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 또는 단지 항원-결합 부분만을 포함할 수 있고 (예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편), 기능성에 영향을 미치기 위하여, 예컨대 잔류하는 이펙터 기능을 제거하기 위하여 변형될 수 있다 (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
본 발명의 예시의 항-GITR 항체는 본원의 표 1 및 2에서 열거된다. 표 1은 예시의 항-GITR 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR), 경쇄 가변 영역 (LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 나타낸다. 표 2는 예시의 항-GITR 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 나타낸다.
본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열들 중 임의의 서열과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 서열을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시의 항-GITR 항체들 중 임의의 항체 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 98/106; 162/170; 194/202; 242/250; 290/298; 338/402; 및 346/402로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 3에 열거된 HCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 3에 열거된 LCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시의 항-GITR 항체들 중 임의의 항체 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 104/112; 168/176; 200/208; 248/256; 296/304; 344/408; 및 352/408로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 예시의 항-GITR 항체들 중 임의의 항체 내에 함유된 6개의 CDR 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 100-102-104-108-110-112; 164-166-168-172-174-176; 196-198-200-204-206-208; 244-246-248-252-254-256; 292-294-296-300-302-304; 340-342-344-404-406-408; 및 348-350-352-404-406-408로 구성되는 군으로부터 선택된다.
관련된 구체예에서, 본 발명은 표 1에 열거된 예시의 항-GITR 항체들 중 임의의 것에 의해 규정된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 98/106; 162/170; 194/202; 242/250; 290/298; 338/402; 및 346/102로 구성되는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기법들은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 개시된 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위해 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하기 위해 사용될 수 있는 예시의 관례들은, 예컨대 Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 들 수 있다. 일반적으로, Kabat 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, AbM 정의는 Kabat과 Chothia 접근법 사이의 절충안이다. 예컨대 Kabat, "서열 of 단백질s of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989) 참조. 공공의 데이터베이스 또한 항체 내의 CDR 서열들을 확인하기 위해 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 항-GITR 항체 또는 그것의 부분을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR1 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR2 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR3 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR1 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR2 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR3 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 3개의 CDR 세트 (즉 HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시의 항-GITR 항체들 중 임의의 것에 의해 규정된다.
본 발며은 또한 LCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 LCVR은 3개의 CDR 세트 (즉 LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시의 항-GITR 항체들 중 임의의 것에 의해 규정된다.
본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열들 중 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 발명의 이 측면에 따르는 특정 구체예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하고, HCVR 및 LCVR은 둘 다 표 1에 열거된 동일한 항-GITR 항체로부터 유래된다.
본 발명은 또한 항-GITR 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제고안다. 예를 들어, 본 발명은 상기 언급된 핵산 분자들, 즉 표 1에 나타낸 것과 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자들 중 임의의 것을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 또한 본 발명의 범주에는, 그런 벡터가 도입된 숙주 세포, 뿐만 아니라 그 숙주 세포를 항체 또는 항체 단편들의 생성을 허용하는 조건 하에서 배양하고, 그렇게 생성된 항체 및 항체 단편들을 회수함으로써 항체 또는 그것의 부분을 제조하는 방법이 포함된다.
본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 가지는 항-GITR 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 예를 들어 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 기능을 증가시키기 위하여, 바람직하지 못한 글리코실화 부위, 또는 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 없는 항체를 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있다 (Shield et al. (2002) JBC 277:26733 참조). 다른 적용에서, 갈락토실화의 변형이 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 변형시키기 위하여 이루어질 수 있다.
다른 측면으로, 발명은 GITR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 단편 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물 을 제공한다. 관련된 측면으로, 발명은 항-GITR 항체 및 제 2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 제 2 치료제는 항-GITR 항체와 유익하게 조합된 임의의 작용제이다. 본 발명은 또한 세포독성제에 콘쥬게이트된 항-GITR 항체를 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC)를 제공한다. 본 발명의 항-GITR 항체를 포함하는 예시의 조합 요법, 공동-제제, 및 ADC가 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 측면으로, 발명은 발명의 항-GITR 항체 또는 항체의 항원-결합 부분을 사용하여, 종양 세포를 사멸하기 위한 또는 종양 세포 성장을 억제 또는 약화시키기 위한 치료 방법, 또는 그렇지 않으면 암에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 발명의 이 측면에 따르는 치료 방법은 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 GITR을 표적화함으로써 및/또는 T-세포 증식 또는 기능을 증가시킴으로써 및/또는 조절 T 세포에 의해 유도된 억압 활성을 억제함으로써 개선, 완화, 억제 또는 예방되는 임의의 질환 또는 상태이다.
또 다른 측면으로, 발명은 항-GITR 항체 또는 항-GITR 항체의 항원-결합 부분과 항-PD1 항체 또는 항-PD1 항체의 항원-결합 부분의 조합을 사용하여, 종양 세포를 사멸하기 위한 또는 종양 세포 성장을 억제 또는 약화시키기 위한 치료 방법, 또는 그렇지 않으면 암에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 발명의 이 측면에 따르는 치료 방법은 항-GITR 및 항-PD1 항체 또는 항원-결합 단편 조성물의 조합을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 GITR 및 PD1을 모두 표적화함으로써 개선, 완화, 억제 또는 예방되는 임의의 질환 또는 상태이다.
다른 구체예들은 이어지는 상세한 설명의 개관으로부터 나타나게 될 것이다.
도 1은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 종양 도전 후 경과일에 대해 도표화된 각각의 치료 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3 ± SEM)를 도시한다. 마우스들은 어느 하나의 아이소타입 항체 (빈 원형, ○), 항-PD-1 항체 (빈 사각형, □), 항-GITR 항체 (빈 삼각형, △), 또는 항-PD-1과 항-GITR의 조합 (채워진 역삼각형, ▼)으로 치료되었다.
도 2는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 항-마우스 GITR 및 항-마우스- PD1 항체의 조합으로 치료된 MC38 포함 마우스의 생존 분석을 도시한다. 마우스들은 어느 하나의 아이소타입 항체 (빈 원형, ○), 항-PD-1 항체 (빈 사각형, □), 항-GITR 항체 (빈 삼각형, △), 또는 항-PD-1 및 항-GITR의 조합 (빈 역삼각형, ▽)으로 치료되었다.
도 3은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 MC38 또는 B16.F10.9 종양 세포로 도전된 종양이 없거나 또는 나이브 대조군 마우스의 개별적인 종양 성장 곡선을 도시한다.
도 4는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 상이한 고갈 항체로 치료된 마우스들에 대한 평균 종양 부피를 도시한다.
도 5는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 종양내 CD8/Treg, CD4 Teff/Treg 비율의 FACS 분석 결과를 도시한다.
도 6은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 종양의 T 세포 하위세트들의 백분율 및 세포 수/mm3 종양을 도시한다.
도 7은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 종양 도전 후 경과일에 대해 도표화된 각 치료 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3 ± SEM)를 도시한다.
도 8은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 항-인간 GITR- 및 항-마우스 PD1-항체의 조합으로 치료된 MC38 포함 GITR/GIRL 인간화 마우스의 생존 분석을 도시한다.
도 9는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 CD8 T 세포의 종양내 및 비장 백분율, Treg 세포의 백분율, 및 CD8/Treg 비율의 FACS 분석을 도시한다.
도 10은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 종양 도전 후 경과일에 대해 도표화된 각 치료 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3 ± SEM)를 도시한다.
도 11은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 항-마우스 GITR- 및 항-인간 PD1-항체의 조합으로 치료된 MC38 포함 PS1/PDL1 인간화 마우스의 생존 분석을 도시한다.
도 12는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 MC38-포함 마우스들의 종양 성장 곡선을 도시한다. Y-축은 세제곱 밀리미터의 종양 부피를 나타내고 X-축은 종양 도전 후 경과일의 시간을 나타낸다. 빈 기호들 (□, ○)은 아이소타입 항체로 먼저 치료된 마우스들을 나타낸다 (대조군). 채워진 기호들 (■, ●)은 항-CD226 항체로 먼저 치료된 마우스들을 나타낸다. 다음에 아이소타입 항체로 치료된 마우스들은 원형 (○, ●) 및 실선으로 표시된다. 다음에 항-GITR 및 항-PD-1 조합으로 치료된 마우스들은 사각형 (□, ■) 및 점선으로 나타낸다.
도 13은 실시예 7에서 기술된 것과 같이 MC38-포함 마우스들의 생존 곡선을 도시한다. Y-축은 %생존을 나타내고 X-축은 종양 도전 후 경과일의 시간을 나타낸다. 빈 기호들 (□, ○)은 아이소타입 항체로 먼저 치료된 마우스들을 나타낸다 (대조군). 채워진 기호들 (■, ●)은 항-CD226 항체로 먼저 치료된 마우스들을 나타낸다. 다음에 아이소타입 항체로 치료된 마우스들은 원형 (○, ●) 및 실선으로 표시된다. 다음에 항-GITR 및 항-PD-1 조합으로 치료된 마우스들은 사각형 (□, ■) 및 점선으로 나타낸다.
도 14는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 아이소타입 IgG로 치료된 MC38-포함 야생형 마우스 (다이아몬드형 [◇, ◆]에 의해 표시됨) 또는 TIGIT 녹아웃 마우스 (삼각형 [△, ▲]에 의해 표시됨)의 종양 성장 곡선을 도시한다. Y-축은 세제곱 밀리미터의 종양 부피를 나타내고 X-축은 종양 도전후 경과일의 시간을 나타낸다. 빈 기호들과 점선은 먼저 아이소타입 항체로 치료된 마우스들을 나타낸다 (대조군). 채워진 기호들과 실선은 먼저 항-CD226 항체로 치료된 마우스들을 나타낸다.
도 15는 실시예 7에서 기술된 것과 같이 아이소타입 IgG로 치료된 MC38-포함 야생형 마우스 (원형 [○, ●]에 의해 표시됨) 또는 TIGIT 녹아웃 마우스 (역삼각형 [▽, ▼]에 의해 표시됨)의 종양 성장 곡선을 도시한다. Y-축은 세제곱 밀리미터의 종양 부피를 나타내고 X-축은 종양 도전후 경과일의 시간을 나타낸다. 빈 기호들과 점선은 먼저 아이소타입 항체로 치료된 마우스들을 나타낸다 (대조군). 채워진 기호들과 실선은 먼저 항-CD226 항체로 치료된 마우스들을 나타낸다.
도 16은 전체 (패널 A), 클론 연장된 (패널 B), 또는 연장되지 않은 (패널 C) CD8+ T 세포의 조합 치료에 의한 CD226의 상향조절된 발현을 나타내는 누적 분포 함수 (CDF) 도표들을 포함한다. X-축은 로그2(RPKM)(Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads, 백만 개의 지도화된 판독당 전사물의 킬로염기당 판독수)의 CD226 발현을 나타내고 Y-축은 누적 빈도를 나타낸다. 적색 선은 항-GITR / 항-PD1 치료를 나타내고; 흑색 선은 아이소타입 항체 치료를 나타내며; 청색 선은 항-GITR 치료를 나타내고; 자주색 선은 항-PD1 치료를 나타낸다.
도 17은 PD-1 농도의 함수로서 인산-CD3ζ 및 인산-CD226의 상대적인 발현을 도시하는 웨스턴 블롯이다.
도 18, 패널 A 내지 D는 야생형 (빈 막대) 및 CD226 녹아웃 마우스 (채워진 막대)에서 생성된 T-세포 유형의 수의 막대 그래프를 도시한다. 패널 A는 흉선에서의 T 세포 발달의 FACS 분석 (세포의 수)을 나타내는 막대 그래프이다 (Tconv, 종래의 T 세포; DP, CD4/CD8 이중 포지티브; SP, 단일 포지티브; DN, CD4/CD8 이중 네거티브). 패널 B는 야생형 및 CD226-/- 동물에서 T 세포 하위세트의 집단의 FACS 확인 (세포의 수)을 나타내는 막대 그래프이다. 패널 C는 PD1을 발현하는 비장 및 혈액에서 T 세포 하위세트의 FACS 분석 (MFI, 평균 형광 세기)을 나타내는 막대 그래프이다. 패널 D는 GUTR을 발현하는 비장 및 혈액에서 T 세포 하위세트의 FACS 분석 (MFI)을 나타내는 막대 그래프이다. 패널 E 내지 I는 항-CD3 + 항-CD28 Ab로 16시간 동안 비장세포를 생체외 TCR 자극할 때 밀리리터당 피코그램으로의 염증성 사이토카인 분비를 나타내는 막대 그래프이다. CD226-/- (채워진 막대) 또는 야생형 (WT) (빈 막대) 마우스로부터의 비장세포가 항-CD3 + 항-CD28 Ab로 16시간 동안 자극되었다. 패널 E = IFN-γ; 패널 F = IL-2; 패널 G = TNF-α; 패널 H = IL-6; 및 패널 I = IL-5.
도 19는 종양 도전 후 겨과일의 시간의 함수로서 % 동물 생존을 나타내는 선 그래프이다. 패널 A는 MC38 종양 세포로 도전되고 항-GITR + 항-PD-1 Ab (채워진 원형 및 사각형) 또는 아이소타입 Abs (빈 원형 및 사각형) 중 어느 하나로 치료된 CD226 KO 마우스 (장미색 선) 또는 야생형 한배새끼 (흑색 선)를 도시한다. 패널 B 내지 D는 (B) 항체 차단 CD28 신호전달로 치료된 동물 (10 mg/kg CTLA-4-Ig; 패널 B, 녹색 선); (C) 항체 차단 OX40 신호전달로 치료된 동물 (10 mg/kg OX40L 차단 항체; 패널 C); 및 (D) 항체 차단 4-1BB 신호전달로 치료된 동물 (10 mg/kg 4-1BBL 차단 항체; 패널 D)을 나타낸다.
도 20은 아이소타입 (빈 원형 및 흑색 선), 항-PD1 (빈 사각형, 적색 선), 항-GITR (빈 삼각형 및 녹색 선), 및 항-GITR / 항-PD1 조합 요법 (빈 역삼각형 및 청색 선)으로 치료된 마우스들에 대한 종양 도전 후 경과일의 함수로서의 종양 크기 (세제곱 밀리미터)를 나타내는 선 그래프이다. 패널 A는 CD155를 발현하지 않는 MC38 종양을 나타낸다. 패널 B는 CD155를 발현하는 MC38 종양을 나타낸다.
도 21은 CD155를 과잉 발현하는 MC38 종양 세포 (채워진 막대) 및 CD155를 발현하지 않는 MC38 종양 세포 (빈 막대)로 도전된 동물로부터의 CD226 (패널 A), 4-1BB (패널 B), 및 IFN-γ (패널 C)를 발현하는 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 22는 항-PD-1 Ab 치료의 함수로서의 CD226 RNA 발현을 보여주는 (log2[RPKM]로) 암환자 종양 생검의 점 도표 RAN-서열 분석을 도시한다.
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건이 달라질 수 있기 때문에 그것들에 제한되지 않는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어들은 단지 특정 구체예들을 기술할 목적에 대한 것이고, 본 발명의 범주가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 의도가 아니라는 것이 인지되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 통상적으로 인지되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 사용되는 요어 "약"은, 특히 언급된 수치와 관련하여 사용될 때, 값이 그 인용된 값으로부터 1%를 넘지 않게 달라질 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 것과 같이, "약 100"이라는 표현은 99와 100 및 그 사이의 모든 값 (예컨대 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 등)을 포함한다.
비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 공개물은 본원에 전문이 참조로 포함된다.
정의
본원에서 사용되는 표현, 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체, "GITR," 등은 SEQ ID NO: 413 (NCBI 기탁 #NP_004186.1)에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 인간 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체를 나타낸다. 표현 "GITR"은 모노머 및 멀티머 GITR 분자를 모두 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 표현 "모노머 인간 GITR"은 임의의 멀티머화 도메인을 함유하거나 갖지 않는 및 정상적인 조건 하에서 다른 GITR 분자와 직접적인 물리적 연결이 없는 단일한 GITR 분자로서 존재하는 GITR 단백질 또는 그것의 부분을 의미한다. 예시의 모노머 GITR 분자는 본원에서 SEQ ID NO: 409의 아미노산 서열을 포함하는 "hGITR.mmh"로서 언급된 분자이다 (예컨대 실시예 3 참조). 본원에서 사용되는 표현 "다이머 인간 GITR"은 링커, 공유 결합, 비공유 결합을 통해, 또는 항체 Fc 도메인과 같은 멀티머화 도메인을 통해 서로 연결된 2개의 GITR 분자를 포함하는 구성물을 의미한다. 예시의 다이머 GITR 분자는 각각 SEQ ID NO: 410 및 SEQ ID NO: 411의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 "hGITR.mFc" 및 "hGITR.hFc"로서 언급된 분자들을 포함한다 (예컨대 실시예 3 참조).
본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은 비-인간 종으로부터 유래된 것으로서 분명하게 명시되지 않는 한 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 나타내는 것으로 의도된다. 그러므로, 표현 "GITR"은 비-인간 종으로부터 유래된 것, 예컨대 마우스 GITR", "원숭이 GITR" 등으로 명시되지 않는 한 인간 GITR을 의미한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 표현 "세포 표면-발현된 GITR"은 시험관내에서 또는 생체내에서 세포 표면에 발현되어서, GITR 단백질의 적어도 일부가 세포 막의 세포외 측에 노출되고 항체의 항원-결합 부분에 접근 가능하게 되는 하나 이상의 GITR 단백질(들), 또는 그것의 세포외 도메인을 의미한다. "세포 표면-발현된 GITR"은 정상적으로 GITR 단백질을 발현하는 세포의 표면에서 발현된 GITR 단백질을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 다르게는, "세포 표면-발현된 GITR"은 그것의 표면에서는 정상적으로 인간 GITR을 발현하지 않지만 그것의 표면에서 GITR을 발현하도록 인공적으로 엔지니어링되어 있는 세포의 표면에서 발현된 GITR 단백질을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 표현 "항-GITR 항체"는 일가 및 단일 특이성을 가진 단일특이적 이가 항체, 뿐만 아니라 GITR에 결합하는 제 1 아암(arm) 및 제 2 (표적) 항원에 결합하는 제 2 아암을 포함하는 이중특이적 항체를 포함하며, 여기서 항-GITR 암은 본원의 표 1에 나타낸 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 임의의 것을 포함한다. 표현 "항-GITR 항체"는 또한 약물 또는 독소 (즉 세포독성제)에 콘쥬게이트된 항-GITR 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC)를 포함한다. 표현 "항-GITR 항체"는 또한 방사성 핵종에 콘쥬게이트된 항-GITR 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-방사성 핵종 콘쥬게이트 (ARC)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 항원 (예컨대 GITR)과 특이적으로 결합하는 또는 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 무거운 (H) 사슬 및 2개의 가벼운 (L) 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 그것들의 멀티머 (예컨대 IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 추가로 보다 보존되고, 프레임워크 영역 (FR)으로 언급되는 영역이 사이에 배치되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 언급되는, 초가변성의 영역으로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 다음 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 발명의 상이한 구체예에서, 항-GITR 항체 (또는 그것의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식선 서열에 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 나란한 (side-by-side analysis) 분석을 기초로 규정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편들을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어, 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편", 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생적인, 효소적으로 얻을 수 있는, 합성, 또는 유전자 엔지니어링된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예컨대 단백질 가수분해성 소화 또는 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 엔지니어링 기법과 같은 임의의 적합한 표준 기법들을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 그러한 DNA는 알려져 있거나 및/또는 예컨대 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예컨대 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 쉽게 이용할 수 있거나, 또는 합성될 수 있다. DNA는 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 형태로 배열하기 위하여, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키기 위하여, 그밖의 것을 위하여 서열분석되고 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용함으로써 조작될 수 있다.
항원-결합 단편들의 비-제한적인 실례는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) 　F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기들로 구성되는 최소 인지 단위 (예컨대 분리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드. 다른 엔지니어링된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-고갈된 항체, 키메릭 항체, CDR-이식된 항체, 　다이아바디(디아바디), 트라이아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody) 　(예컨대, 1가 나노바디, 2가 나노바디, 등), 소모듈의 면역약제 (small modular immunopharmaceutical)(SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인이 또한 본원에서 사용되는 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 것일 수 있고 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접한 또는 그것과 프레임에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 가지는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인들은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 상대적인 위치에 있을 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 다이머일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 다이머를 함유한다. 다르게는, 항체의 항원-결합 단편은 모노머 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 찾아볼 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인, 예시의 형태들은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 상기 열거된 예시의 형태들 중 임의의 것을 포함하여, 가변 및 불변 도메인들 중 임의의 형태에서, 가변 및 불변 도메인들은 서로에 직접 연결되거나 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2개 (예컨대 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있고, 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인들 사이에서 가요성 또는 반가요성 결합을 초래한다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 모노머 VH 또는 VL 도메인과 비공유 회합되어 있는 (예컨대 이황화 결합(들)에 의해) 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 중 임의의 것의 동종-다이머 또는 이종-다이머 (또는 다른 멀티머)를 포함할 수 있다.
전체 항체 분자와 같이, 항원-결합 단편은 단일특이적이거나 다중특이적 (예컨대 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이고, 이때 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의의 다중특이적 항체 포맷은, 본원에 개시된 예시의 이중특이적 항체 포맷을 포함하여, 업계에서 활용 가능한 기본적인 기법들을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기에 적합하게 될 수 있다.
본 발명의 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 통하여 기능할 수 있다. "보체-의존성 세포독성" (CDC)은 보체의 존재하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 나타낸다. "항체-의존성 세포-매개된 세포독성" (ADCC)은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예컨대 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 그로써 표적 세포의 용해로 이어지게 되는 세포-매개된 반응을 나타낸다. CDC 및 ADCC는 당업계에 잘 알려져 있고 활용 가능한 검정들을 사용하여 측정될 수 있다 (예컨대 미국 특허 제 5,500,362호 및 5,821,337호, 및 Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 참조). 항체의 불변 영역은 보체를 고정하고 세포-의존성 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 중요하다. 그러므로, 항체의 아이소타입은 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한 것인지의 여부을 기반으로 선택될 수 있다.
발명의 특정 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 발명의 인간 항체는 예를 들어 CDR들에서, 특히 CDR3에서, 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예컨대 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 또는 생체내에서의 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위로 이식되어 있는 항체를 포함하는 것으로 의도되지는 않는다. 용어 "인간 항체"는 자연 발생적인, 미변형된 살아있는 유기체에서, 돌연변이 또는 인간 개입/조작 없이 정상적으로 존재하는 자연 발생적인 분자들을 포함하지 않는다.
발명의 항체는, 일부 구체예에서, 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 분리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 (하기에서 추가로 기술됨)로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리 (하기에서 추가로 기술됨)로부터 분리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입된 동물 (예컨대 마우스)로부터 분리된 항체 (예컨대 Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가진다. 그러나, 특정 구체예에서, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이생성 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자도입된 동물이 사용될 때에는, 생체내 체세포성 돌연변이생성)이 수행되고, 그로써 재조합 항체의 VH 및 VL 영역들의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그것들에 관련되는 한편으로, 생체내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이질성과 결부된 2가지 형태로 존재할 수 있다. 한 가지 형태에서, 면역글로불린 분자는 대략 150 내지 160 kDa의 안정적인 4사슬 구성물을 포함하며, 이때 다이머들은 사슬간 중쇄 이황화 결합에 의해 결합된다. 두 번째 형태에서, 다이머들은 사슬간 이황화 결합을 통해 연결되지 않고 공유 결합된 경쇄 및 중쇄로 구성된 약 75 내지 80 kDa의 분자가 형성된다 (반-항체). 이 형태들은 친화성 정제 후에도, 분리하기가 매우 어려웠다.
다양한 손상되지 않은 IgG 아이소타입들에서 두 번째 형태의 출현 빈도는, 한정하는 것은 아니지만, 항체의 힌지 영역 아이소타입과 결부된 구조적 차이들에 기인한다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역의 단일 아미노산 치환은 두 번째 형태의 출현을 인간 IgG1 힌지를 사용하여 전형적으로 관찰되는 수준으로 유의미하게 감소시킬 수 있다 (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105). 본 발명은, 예를 들어 제조시, 원하는 항체 형태의 수율을 개선하기 위해 바람직할 수 있는 힌지, CH2 또는 CH3 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 가지는 항체들을 포함한다.
발명의 항체는 분리된 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 "분리된 항체"는 그것의 자연적 환경의 적어도 하나의 구성요소로부터 확인된 및 분리된 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 구성요소로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생성되는 조직 또는 세포로부터 분리된 또는 제거된 항체는 본 발명의 목적에 대한 "분리된 항체"이다. 분리된 항체는 또한 재조합 세포 내에 있는 인시튜 항체를 포함한다. 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 분리 단계가 수행된 항체이다. 특정 구체예에 따르면, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 개시된 항-GITR 항체는 항체가 유도된 상응하는 생식선 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역들에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 그러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어, 공공 항체 서열 데이터베이스로부터 활용할 수 있는 생식선 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열들 중 임의의 서열로부터 유도된 항체, 및 그것의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역들 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유도된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존성 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (그러한 서열 변화들은 본원에서 포괄적으로 "생식선 돌연변이"로서 언급된다). 당업자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 이상의 개별적인 생식선 돌연변이 또는 그것들의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, V H 및/또는 V L 도메인들 내에 있는 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유도된 원래의 생식선 서열에서 나타나는 잔기들로 복귀 돌연변이된다. 다른 구체예에서, 단지 특정 잔기들만, 예컨대 FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 나타나는 돌연변이 잔기들만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 나타나는 돌연변이된 잔기들만이 원래의 생식선 서열로 복귀 돌연변이된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)이 상이한 생식선 서열 (즉 항체가 원래 유도된 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기9들)로 돌연변이된다. 나아가, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역들 내에서 둘 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예컨대 특정한 개별적인 잔기들은 특별한 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 원래의 생식선 서열과 상이한 특정한 다른 잔기들은 유지되거나 또는 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 하나 이상의 생식선 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편은, 얻어진 후에는, 하나 이상의 원하는 특성, 예컨대 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 개선된 또는 향상된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성 (경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 쉽게 테스트될 수 있다. 이런 일반적인 방식으로 얻어진 항체 및 항원-결합 단편들은 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 보존성 치환을 가지는 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 임의의 서열의 변종을 포함하는 항-GITR 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원의 표 1에 나타낸 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 임의의 것에 비해 예컨대 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 등의 보존성 아미노산 치환을 가지는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 가지는 항-GITR 항체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 파라토프(paratope)로서 알려져 있는 항체 분자의 가변 영역의 특이적 항원-결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 나타낸다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 그러므로, 상이한 항체가 한 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과를 나타낼 수 있다. 에피토프는 형태적(conformational)이거나 선형일 수 있다. 형태적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 바로 인접한 아미노산들에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기들에 의해 생성되는 것이다. 특정 상황에서, 에피토프는 항원 상의 당류, 포스포릴 기, 또는 설포닐 기의 모이어티들을 포함할 수 있다.
용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 핵산 또는 그것의 단편을 언급할 때, 다른 핵산 (또는 그것의 상보하는 가닥)과 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실로 최적으로 배열될 때, 하기에서 논의되는 것과 같이, 서열 동일성의 임의의 잘 알려져 있는 알고리즘, 예컨대 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해 측정되는 바, 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있는 것을 가리킨다. 기준 핵산 분자에 대해 실질적인 동일성을 가지는 핵산 분자는, 특정 상황에서, 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일한 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용되는 것과 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 두 개의 펩타이드 서열이, 최적으로 배열되었을 때, 예컨대 디폴트 갭 중량을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT을 사용함으로써, 적어도 95% 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존성 아미노산 치환들에 의해 상이하다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예컨대 전하 또는 소수성)을 가진 측쇄 (R 기)를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 실질적으로는 단백질의 기능적 특성을 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환들에 의해 서로 상이한 경우에, % 서열 동일성 또는 유사성 정도는 치환의 보존성 성질을 교정하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이런 조정을 이루기 위한 수단은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예컨대 Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 (본원에 참조로 포함됨) 참조. 유사한 화학적 특성을 가진 측쇄를 가진 아미노산들의 그룹의 예는 다음을 포함한다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 93) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존성 아미노산 치환 기들은 다음과 같다: 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민. 다르게는, 보존성 대체는 Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 포지티브 값을 가지는 임의의 변화이다. "적당히 보존성" 대체는 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 네거티브하지 않은 값을 가지는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 언급되는, 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 유사한 서열을, 보존성 아미노산 치환을 포함하여, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형들에 대해 배정된 유사성의 척도를 사용하여 매치시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련된 폴리펩타이드, 예컨대 상이한 유기체 종으로부터의 상동성 폴리펩타이드 사이, 또는 야생형 단백질과 그것의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위하여 디폴트 파라미터들로 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit와 같은 프로그램들을 포함한다. 예컨대 GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG 버전 6.1의 프로그램인, 디폴트 또는 권장된 파라미터를 사용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA (예컨대 FASTA2 및 FASTA3)는 문제 서열과 연구 서열 사이의 최상 중복 영역들의 배열 및 % 서열 동일성을 제공한다 (Pearson (2000) 상기 동일). 발명의 서열을, 상이한 유기체로부터의 대다수의 서열을 함유한 데이터베이스에 비교할 때 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예컨대 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 참조, 둘 다 본원에 참조로 포함됨.
Fc 변종을 포함하는 항-GITR 항체
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, FcRn 수용체에 대한 항체 결합을, 예컨대 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 향상 또는 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-GITR 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하는 항-GITR 항체를 포함하며, 이때 돌연변이(들)은 산성 환경에서 (예컨대 pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도솜에서) Fc 도메인의 FcRn에 대한 친화도를 증가시킨다. 그러한 돌연변이는 동물에 투여될 때 항체의 혈청 반감기의 증가를 초래할 수 있다. 그런 Fc 변형의 비제한적인 실례로는, 예컨대 위치 250에서의 변형 (예컨대 E 또는 Q); 250 및 428에서의 변형 (예컨대, L 또는 F); 252에서의 변형 (예컨대, L/Y/F/W 또는 T), 254에서의 변형 (예컨대, S 또는 T), 및 256에서의 변형 (예컨대, S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 위치 428 및/또는 433에서의 변형 (예컨대, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434에서의 변형 (예컨대, H/F 또는 Y); 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308에서의 변형 (예컨대, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 들 수 있다. 한 구체예에서, 변형은 428L (예컨대, M428L) 및 434S (예컨대, N434S) 변형; 428L, 259I (예컨대, V259I), 및 308F (예컨대, V308F) 변형; 433K (예컨대, H433K) 및 434 (예컨대, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예컨대, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예컨대, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예컨대, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 기를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-GITR 항체를 포함한다: 250Q 및 248L (예컨대, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예컨대, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예컨대, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F (예컨대, H433K 및 N434F). 전술한 Fc 도메인 돌연변이, 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인들 내에서의다른 돌연변이들의 모든 가능한 조합은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
항-GITR 항체의 생물학적 특징들
본 발명은 고친화도로 모노머 인간 GITR에 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 5.0 nM 미만의 KD로 모노머 인간 GITR (예컨대, hGITR.mmh)에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1.50 nM 미만의 KD로 37℃에서 모노머 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 발명은 또한, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 12분보다 큰 해리성 반감기 (t½)로 모노머 인간 GITR (예컨대, hGITR.mmh)에 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바, 약 12분보다 큰, 약 13분보다 큰, 약 14분보다 큰, 약 15분보다 큰, 또는 그 이상으로 긴 t½로 37℃에서 모노머 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 발명은 또한 고친화도로 다이머 인간 GITR (예컨대, hGITR.mFc)에 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 950 pM 미만의 KD로 다이머 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 900 pM 미만, 약 850 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만의 KD로 37℃에서 다이머 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 발명은 또한 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 7분보다 큰 해리성 반감기 (t½)로 다이머 인간 GITR (예컨대, hGITR.mFc)에 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 예컨대 하기 실시예 3에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바, 약 10분보다 큰, 약 20분보다 큰, 약 30분보다 큰, 약 40분보다 큰, 약 50분보다 큰, 약 60분보다 큰, 약 70분보다 큰, 약 80분보다 큰, 약 90분보다 큰, 약 100분보다 큰, 또는 그 이상으로 긴 t½로 37℃에서 모노머 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 개시는 또한 세포-표면-발현된 GITR에 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 배아 신장 93 (HEK-293) D9 세포로 트랜스펙션된 인간 GITR에 고친화도로 결합하는 항체가 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 예컨대 하기 실시예 4에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 전기화학발광에 의해 측정되는 바 약 260 pM 미만의 EC50으로 배아 신장 93 (HEK-293) D9 세포로 트랜스펙션된 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 예컨대 하기 실시예 4에서 규정되는 것과 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 전기화학발광에 의해 측정되는 바 약 250 pM 미만, 약 240 pM 미만, 약 230 pM 미만, 또는 약 220 pM 미만의 EC50으로 배아 신장 93 (HEK-293) D9 세포로 트랜스펙션된 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 상기 언급된 생물학적 특징들, 또는 그것들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 발명의 항체의 생물학적 특징들의 전술한 목록은 철저한 것이 되도록 의도된 것이 아니다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특징들이 본원의 작업 실시예를 포함한 본 개시의 리뷰로부터 당업자에게 분명해질 것이다.
Fc 고정-의존성 및 고정-독립적인 GITR 활성화 및 GITRL 차단
본 개시는 예컨대 하기 실시예 5 및/또는 실시예 6에서 기술되는 검정 포맷으로, 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷으로 측정되는 바, 인간 GITR을 활성화하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "인간 GITR을 활성화한다"는 것은 그것의 동족체 리간드, GITR 리간드 (GITRL)를 통해 GITR을 활성화하는 것 또는 작용물질 항-GITR 항원 결합 단백질(들)의 GITR에의 결합을 나타낸다. 작용물질 항-GITR 결합 단백질에 의한 GITR의 활성화와 관련하여, "활성화"는 Fc 감마 수용체에 대한 항원-결합 단백질 고정의 존재 또는 부재하에 있을 수 있다. 인간 GITR 활성화는, 한정하는 것은 아니지만, 시험관내 또는 생체내에서의 GITR 신호전달의 유도 또는 향상, 이펙터 T 세포 활성의 조절 T 세포 억제의 감소; 시험관내 또는 생체내에서 순환하는 T reg 수준의 감소, 생체내에서 종양내 T reg의 감소, 시험관내 또는 생체내에서 이펙터 T 세포의 활성화, 시험관내 또는 생체내에서 이펙터 T 세포 증식의 유도 또는 향상, 또는 생체내에서 종양 성장의 억제 또는 감소를 포함하여, 특정한 생물학적 활성들의 발휘로 나타난다.
Fc 고정의 부재시 GITR 활성화
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체 및 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 하기 실시예 5 및/또는 실시예 6에서 기술되는 검정 포맷으로, 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷으로 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "Fc 고정의 부재시에"는 Fc 감마 수용체의 상이한 형태들에 의한 항-GITR 항체의 클러스터링이 없는 GITR 및 GITR-매개된 신호전달의 활성화 또는 GITRL의 차단을 나타내며, 예컨대 세포-표면 결합된 Fc 감마 수용체(들)의 부재시에 시험관내에서 공동 배양된 일차 T-세포의 활성화를 통하여 측정 및 정량될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 약 3 nM 미만의 EC50에서 약 25%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바, NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 약 3 nM 미만의 EC50에서 약 30%보다 큰, 약 40%보다 큰, 약 50%보다 큰, 약 60%보다 큰, 또는 약 65%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 약 2 nM 미만의 EC50에서 약 30%보다 큰, 약 40%보다 큰, 약 50%보다 큰, 약 60%보다 큰, 또는 약 65%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 약 1.5 nM 미만의 EC50에서 약 30%보다 큰, 약 40%보다 큰, 약 50%보다 큰, 약 60%보다 큰, 또는 약 65%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 약 1.4 nM 미만의 EC50에서 약 30%보다 큰, 약 40%보다 큰, 약 50%보다 큰, 약 60%보다 큰, 또는 약 65%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 약 1.3 nM 미만의 EC50에서 약 30%보다 큰, 약 40%보다 큰, 약 50%보다 큰, 약 60%보다 큰, 또는 약 65%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 Fc-고정의 부재시에 GTIR에 결합하고 T-세포 증식 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 Fc-고정의 부재시에 약 8 nM 이하의 EC50으로 GTIR에 결합하고 T-세포 증식 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 Fc 고정의 부재시에 약 22 nM 항체 (또는 항원-결합 단편) 농도에서 배경보다 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 또는 적어도 11배로 GITR에 결합하고 T-세포 증식 활성을 나타낸다.
Fc 고정의 존재하에 GITR 활성화
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 예컨대 하기 실시예 5 및/또는 실시예 6에서 기술되는 검정 포맷으로, 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷으로 측정되는 바, Fc 고정의 존재하에 인간 GITR을 활성화한다. 본원에서 사용되는 "Fc 고정의 존재하에"란 항체의 Fc 영역과 Fc 감마 수용체 (FcgR)의 상이한 형태, 예컨대 FcgRI, FcgRIIa 또는 FcgRIIIa와의 상호작용을 통한 항-GITR 항체의 클러스터링을 통해 GITR 및 GITR 매개된 신호전달의 활성화 또는 GITRL의 차단을 나타내고, 예컨대 세포-표면 결합된 Fc 감마 수용체(들)의 존재하에 시험관내에서 공동배양된 T-세포의 활성화를 통해 측정 및 정량될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 약 33 nM 항체 (또는 항체-결합 단편) 농도에서 배경보다 적어도 약 2배의 Fc 고정의 존재하의 T-세포 증식 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 약 33 nM 항체 (또는 항체-결합 단편) 농도에서 배경보다 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배의 Fc 고정의 존재하의 T-세포 증식 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 약 34 nM 미만의 EC50으로 Fc 고정의 존재하의 T-세포 증식 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 6에서 기술된 것과 같은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 약 34 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 4 nM 미만의 EC50으로 Fc 고정의 존재하의 T-세포 증식 활성을 나타낸다.
GITR 리간드 매개된 수용체 자극을 차단하는 항체
본 개시는 예컨대 하기 실시예 5에서 기술된 검정 포맷으로 측정되는 바, 인간 GITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단하는 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "인간 GITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단한다"는 것은 GITR이 그것의 동족체 리간드인 GITRL에 결합하는 것을 항-GITR 항원 결합 단백질이 차단하는 능력을 나타낸다. GITR 리간드의 차단은 조절 T 세포에 의한 이펙터 T-세포 활성의 억제를 회복시킬 수 있다. GITR 리간드의 차단은 업계에 알려져 있는 다양한 방법들, 이를테면 예를 들어 T-세포 증식 또는 사이토킨 분비의 감소 및 순환하는 조절 T 세포의 수준의 증가를 통해 측정 및 정량될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 예컨대 하기 실시예 5에서 기술된 검정 포맷으로 측정되는 바, GITR 고정의 부재시에 인간 GITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 약 4.0 nM 미만의 IC50에서 약 55%보다 큰 차단 백분율로 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR 리간드-매개된 수용체 자극을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷에 의해 측정되는 바 약 4.0 nM 미만, 약 3.0 nM 미만, 약 2.0 nM 미만, 약 1.0 nM 미만, 약 0.9 nM 미만, 약 0.8 nM 미만, 또는 약 0.7 nM 미만의 IC50에서 약 60%보다 큰, 약 70%보다 큰, 약 80%보다 큰, 또는 약 85%보다 큰 차단 백분율로 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR 리간드-매개된 수용체 자극을 차단한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정되는 바 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하고 약 25% 미만의 차단 백분율로 인간 GITR 리간드-매개된 수용체 자극을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정되는 바 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하고 약 54% 미만의 차단 백분율로 인간 GITR 리간드-매개된 수용체 자극을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정되는 바 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하고 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만의 차단 백분율로 인간 GITR 리간드-매개된 수용체 자극을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예컨대 실시예 5에서 기술된 것과 같은 NFκB 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정되는 바 Fc 고정의 부재시에 적어도 약 50%의 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화하고 약 50%보다 큰 차단 백분율로 hGITR 리간드-매개된 수용체 자극을 차단하지 않는다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 둘 다 인간 GITR을 활성화하고 인간 GITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단한다.
일부 구체예에서, 항체는 예컨대 하기 실시예 5에서 기술된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정으로 측정되는 바, Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하고 인간 GITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단한다. 일부 구체예에서,
(A) 항체 또는 항원-결합 단편은
i. NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 3 nM 미만의 EC50에서 약 25%보다 큰 활성화 백분율로 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하는 특성 및
ii. NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 1.0 nM 미만의 EC50으로 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하는 특성
으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 가지며; 및
(B) 항체 또는 항원-결합 단편은 NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 54%보다 큰 차단 백분율로 Fc 고정의 부재시에 hGITRL-매개된 수용체 자극을 차단한다.
일부 구체예에서,
(A) 항체 또는 항원-결합 단편은 NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 1.5 nM 미만의 EC50에서 약 50%보다 큰 활성화 백분율로 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하고; 및
(B) 항체 또는 항원-결합 단편은 NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 4.0 nM 미만의 IC50에서 약 54%보다 큰 차단 백분율로 Fc 고정의 부재시에 hGITRL-매개된 수용체 자극을 차단한다.
에피토프 지도화 및 관련된 기술
본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 GITR 단백질의 3개 이상 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상)의 아미노산의 단일한 연속적인 서열로 구성될 수 있다. 다르게는, 에피토프는 GITR의 복수의 비연속성 아미노산 (또는 아미노산 서열)로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 에피토프는 GITR의 GITRL-결합 도메인에 또는 그것에 가깝게 위치한다. 다른 구체예에서, 에피토프는 GITR의 GITRL-결합 도메인 외부에, 예컨대 항체가 그런 에피토프에 결합될 때 GITR에 대한 GITRL 결합을 간섭하지 않는 GITR의 표면상의 위치에서 위치한다.
당업자들에게 알려져 있는 다양한 기법들이 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는"지의 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예시의 기법들은, 예컨대 기술된 Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), 알라닌 주사 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석 (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), 및 펩타이드 절단 분석과 같은 기본적인 교차-차단 검정들을 포함한다. 이에 더불어, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법들이 사용될 수 있다 (Tomer, 2000, 단백질 Science 9:487-496). 항체와 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산들을 확인하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 질량 분광분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로 말하면, 수소/중수소 교환 방법은 관심의 단백질을 중수소로 표지화하고, 이어서 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시키는 것을 포함한다. 다음에, 단백질/항체 복합체는 항체에 의해 보호된 잔기들 (중수소-표지된 상태를 유지함)을 제외하고 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 일어나는 것을 허용하기 위해 물로 옮겨진다. 항체의 분리 후에, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분광분석 분석이 수행되고, 그로써 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산들에 상응하는 중수소-표지된 잔기들이 드러난다. 예컨대 Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A 참조.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 특이적인 예시의 항체들 (예컨대 본원의 표 1에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함하는 항체들) 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 본원에 기술된 특이적인 예시의 항체들 (예컨대 본원의 표 1에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함하는 항체들) 중 임의의 것과 GITR에의 결합에 대해 경합하는 항-GITR 항체를 포함한다.
당업자는 항체가 당업계에 알려져 있는 및 본원에서 예시된 기본적인 방법들을 사용함으로써 항체가 기준 항-GITR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 기준 항-GITR 항체와 결합에 대해 경합하는지를 쉽게 측정할 수 있다. 예를 들어, 테스트 항체가 발명의 기준 항-GITR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위하여, 기준 항체는 GITR 단백질에 결합하도록 허용된다. 다음에, 테스트 항체의 GITR 분자에 결합하는 능력이 평가된다. 만약 테스트 항체가 기준 항-GITR 항체와의 포화 결합 후에 GITR 에 결합할 수 있다면, 테스트 항체는 기준 항-GITR 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. 다른 한편으로, 만약 테스트 항체가 기준 항-GITR 항체와의 포화 결합 후에 GITR 분자에 결합할 수 없다면, 테스트 항체는 발명의 기준 항-GITR 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 것이다. 다음에 관찰된 테스트 항체의 결합의 결핍이 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지 또는 입체적인 차단 (또는 다른 현상)이 관찰된 결합의 결핍의 원인인지를 확인하기 위해 추가적인 기본 실험 (예컨대, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 이런 종류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유동 세포분석 또는 당업계에서 활용할 수 있는 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 따라, 두 항체는 만약, 예컨대 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 과잉량의 한 항체가 다른 항체의 결합을, 경합 결합 검정으로 측정되는 바 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제한다면 동일한 (또는 중복되는) 에피토프에 결합한다 (예컨대 Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502 참조). 다르게는, 두 항체는, 한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거한다면 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 여겨진다. 두 항체는, 한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원의 아미노산 돌연변이의 하위세트가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거한다면 "중복되는 에피토프"를 가지는 것으로 여겨진다.
항체가 기준 항-GITR 항체와 결합에 대해 경합하는지 (또는 결합에 대해 교차-경합하는지)를 측정하기 위하여, 상기 기술된 결합 방법론을 두 방향으로 수행한다: 첫 번째 방향으로, 기준 항체가 포화 조건 하에 GITR 단백질에 결합되도록 허용된 후에 테스트 항체의 GITR 분자에의 결합이 평가된다. 두 번째 방향으로, 테스트 항체가 포화 조건 하에 GITR 단백질에 결합되도록 허용된 후에 기준 항체의 GITR 분자에의 결합이 평가된다. 만약, 두 방향에서 모두, 제 1 (포화) 항체가 GITR 분자에만 결합할 수 있다면, 테스트 항체 및 기준 항체는 GITR에 대한 결합에 경합하는 것으로 결론지어진다. 당업자에 의해 인지될 것과 같이, 기준 항체와 결합에 대해 경합하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합하지는 않지만, 중복하는 또는 인접한 에피토프에의 결합에 의해 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
인간 항체의 제조
본 발명의 항-GITR 항체는 전체적으로 인간 항체일 수 있다. 전체 인간 단클론성 항체를 포함하여, 단클론성 항체를 생성하기 위한 방법은 업계에 알려져 있다. 임의의 그러한 방법들이 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조하기 위하여 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
예를 들어 VELOCIMMUNETM 기술, 또는 전체 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 임의의 다른 유사한 공지 방법을 사용하여, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 가지는, GITR에 대한 고친화도 키메릭 항체가 초기에 분리된다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 항체는 특성화되고 친화도, 리간드 차단 활성, 선택성, 에피토프, 등을 포함한 바람직한 특성에 대해 선택된다. 필요에 따라, 마우스 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4로 대체되어 전체 인간 항-GITR 항체가 생성된다. 선택된 불변 영역은 특이적 용도, 고친화도 항원-결합 및 가변 영역에 있는 표적 특이성 특징에 따라 달라질 수 있다. 특정 경우에, 전체 인간 항-GITR 항체는 항원-포지티브 B 세포로부터 직접 분리된다.
생물학적 동등물
본 발명의 항-GITR 항체 및 항체 단편들은 기술된 항체의 아미노산 서열과 다르지만 인간 GITR에 결합하는 능력을 보유한 아미노산 서열을 가지는 단백질들을 포함한다. 그러한 변종 항체 및 항체 단편들은 모(parent) 서열과 비교할 때 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체의 것과 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항-GITR 항체-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 발명의 항-GITR 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항-GITR 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열들을 포함한다. 그러한 변종 아미노산 및 DNA 서열의 예시는 상기에서 논의된다.
두 항원-결합 단백질, 또는 항체는 만약, 예를 들어 그것들의 흡수 속도 및 정도가 유사한 실험 조건 하에서, 단일 용량이거나 다중 용량에서, 동일한 분자 용량으로 투여되었을 때 유의미한 차이를 나타내지 않는 제약학적 동등물 또는 제약학적 대체물이라면, 그것들은 생물학적으로 동등한 것으로 여겨진다. 일부 항체는 그것들이 흡수 정도에서는 동등하지만 흡수 속도에서는 그렇지 않다면 동등하거나 제약학적인 대체물로 여겨지겠고, 그러한 흡수 속도에서의 차이는 의도적인 것이고 라벨링에서 반영되며, 예컨대 만성 사용시 효과적인 체내 약물 농도의 달성에는 본질적이지 않고, 연구된 특정 약물 제품에 의학적으로 유의미하지 않게 여겨지기 때문에, 여전히 생물학적 동등물인 것으로 여겨질 수 있다.
한 구체예에서, 두 항원-결합 단백질은 안전성, 순도, 및 효능에서 임상적으로 의미있는 차이가 없다면 생물학적으로 동등하다.
한 구체예에서, 두 항원-결합 단백질은, 환자가 전환이 없는 지속적인 요법과 비교하여, 면역원성의 임상적으로 유의미한 변화, 또는 감소된 유효성을 포함하여, 예상된 부작용의 위험의 증가 없이 기준 생성물과 생물학적 생성물 사이에서 1회 이상 전환할 수 있다면 생물학적으로 동등하다.
한 구체예에서, 두 항원-결합 단백질은 만약 그것들이 둘 다 사용 조건 또는 조건들에 대해 공통되는 작용 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해, 그런 메커니즘에 알려진 정도로 작용한다면 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 생체내 및 시험관내 방법들에 의해 증명될 수 있다. 생물학적 동등성은, 예컨대, (a) 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 테스트, 이때 항체 또는 그것의 대사산물의 농도는 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체에서 측정되는 테스트; (b) 인간 생체내 생체 이용률 데이터와 상관되어 있고 그것으로 타당하게 예측할 수 있는 시험관내 테스트; (c) 항체의 적절한 급성 약물학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체 이용률 또는 생물학적 동등성을 수립하는 잘 제어된 임상 실험을 포함한다.
발명의 항-GITR 항체의 생물학적으로 동등한 변종들은 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만듦으로써 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구성될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기들은 복원(renaturation)시 불필요한 또는 부정확한 분자내 이황화 가교의 형성을 방지하기 위하여 결실되거나 다른 아미노산들로 대체될 수 있다. 다른 맥락으로, 생물학적으로 동등한 항체는 항체의 글리코실화 특징을 변형시키는 아미노산 변화, 예컨대 글리코실화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 항-GITR 항체 변종을 포함할 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
본 발명은, 특정 구체예들에 따르면, 인간 GITR에 결합하지만 다른 종으로부터의 GITR에는 결합하지 않는 항-GITR 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 GITR에 및 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 예를 들어, 발명의 항-GITR 항체는 인간 GITR에 결합할 수 있고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌 쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 카멜, 시노몰로구스 (cynomolgus) 원숭이, 마모셋 (marmoset) 원숭이, 붉은털 원숭이 (rhesus) 또는 침팬지 GITR 중 하나 이상에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 본 발명의 특정한 예시의 구체예에 따르면, 인간 GITR 및 시노몰로구스 원숭이 (예컨대 Macaca fascicularis) GITR에 특이적으로 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다. 발명의 다른 항-GITR 항체는 인간 GITR에 결합하지만 시노몰로구스 원숭이 GITR에는 결합하지 않거나, 단지 약하게 결합한다.
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 단일특이적이거나 다중특이적 (예컨대 이중특이적)일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프들에 대해 특이적이거나 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항원-결합 도메인들을 함유할 수 있다. 예컨대 Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244 참조. 본 발명의 항-GITR 항체는 다른 기능성 분자, 예컨대 다른 펩타이드 또는 단백질과 결합되거나 또는 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그것의 단편은 제 2 결합 특이성을 가지는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생성하기 위하여 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 결합될 수 있다 (예컨대 화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 것에 의해).
본 발명은 면역글로불린의 한 아암이 인간 GITR에 결합하고, 면역글로불린의 다른 아암이 제 2 항원에 특이적인, 이중특이적 항체를 포함한다. GITR-결합 아암은 본원의 표 1에 나타낸 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, GITR-결합 아암은 인간 GITR에 결합하고 GITR에 대한 GITRL 결합을 차단한다. 다른 구체예에서, GITR-결합 아암은 인간 GITR에 결합하지만 GITR에 대한 GITRL 결합을 차단하지 않는다. 일부 구체예에서, GITR 결합 아암은 인간 GITR에 결합하고 GITR 신호전달을 활성화한다. 다른 구체예에서, GITR 결합 아암은 GITRL 매개된 수용체 자극을 차단한다. 본 발명은 또한 항체의 한 아암이 인간 GITR의 제 1 에피토프에 결합하고, 상기 항체의 다른 아암이 인간 GITR의 제 2의 구별되는 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시의 이중특이적 항체 포맷은 제 1 면역글로불린 (Ig) CH3 도메인 및 제 2 Ig CH3 도메인의 사용을 포함하며, 이때 제 1 및 제 2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체에 비교하여 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 구체예에서, 제 1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제 2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이를 함유한다. 제 2 CH3은 추가로 Y96F 변형 (IMGT에 의해; EU에 의하면 Y436F)을 포함할 수 있다. 제 2 CH3에서 발견할 수 있는 추가의 변형은 IgG1 항체의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우 N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 의하면 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I)를 포함한다. 상기 기술된 이중특이적 항체 포맷에 대한 변화는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시의 이중특이적 포맷은, 제한 없이, 예컨대 예컨대, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 콰드로마 (Quadroma), 놉-인투-홀 (knobs-into-holes), 공통 경쇄 (예컨대, 놉-인투-홀을 가진 공통 경쇄, 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼 (leucine zipper), 듀오바디 (Duobody), IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷을 포함한다 (예컨대, 전술한 포맷의 리뷰를 위해 Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 및 여기에 인용된 참고문헌들 참조). 이중특이적 항체는 또한, 예컨대 직교의 화학적 반응성을 가진 비천연 아미노산들이 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트를 생성하기 위해 사용되고 그것은 다음에 규정된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 가진 멀티머 복합체로 자체 조립되는, 펩타이드/핵산 콘쥬게이션을 사용하여 구성될 수 있다 (예컨대 Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012] 참조).
치료적 제제 및 투여
발명은 본 발명의 항-GITR 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 발명의 제약학적 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 저항력 등을 제공하는 다른 작용제들과 함께 제제화된다. 다수의 적절한 제제는 모든 제약학적 화학자들에게 알려져 있는 공식집: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA에서 찾아볼 수 있다. 이 제제들은, 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포를 함유한 지질 (양이온성 또는 음이온성)(예컨대 LIPOFECTINTM, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 콘쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수-중-유 및 유-중-수 에멀션, 에멀션 카보왁스 (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스를 함유한 반고체 혼합물을 포함한다. 또한 Powell et al. "Com펜dium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311 참조.
환자에게 투여된 항체의 용량은 환자의 연열 및 크기, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 성인 환자에서, 본 발명의 항체를 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정상적으로 정맥내로 투여하는 것이 유익할 수 있다. 상태의 심각성에 따라, 치료의 빈도 및 기간이 조정될 수 있다. 항-GITR 항체를 투여하기 위한 유효 투여량 및 스케줄은 실험적으로 측정될 수 있다; 예를 들어, 환자 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있고, 용량이 따라서 조정될 수 있다. 더욱이, 투여량의 종내 규모화(interspecies scaling)가 당업계에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 수행될 수 있다 (예컨대, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
다양한 전달 시스템이 알려져 있고 발명의 제약학적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐 내의 캡슐화, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포 이물 흡수를 들 수 있다 (예컨대, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조). 도입 방법으로는, 한정하는 것은 아니지만, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 구강 경로를 포함한다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 라이닝 (예컨대 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국지적일 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기로 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 이에 더불어, 피하 전달과 관련하여, 펜(펜) 전달 장치가 본 발명의 제약학적 조성물을 전달하는 데 쉽게 적용된다. 그러한 펜 전달 장치는 재사용이 가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 제약학적 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 활용한다. 일단 카트리지 내의 모든 제약학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지는 쉽게 폐기될 수 있고 제약학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 교체된다. 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체 가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장고에 보유된 제약학적 조성물로 사전에 채워진다. 일단 저장고의 제약학적 조성물이 비워지면, 전체 장치가 폐기된다.
많은 재사용 가능한 펜 및 자기주사기(autoinjector) 전달 장치가 본 발명의 제약학적 조성물의 피하 전달에서 사용된다. 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 몇 가지 예로, AUTOPENTM (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONICTM 펜 (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25TM 펜, HUMALOGTM 펜, HUMALIN 70/30TM 펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPENTM I, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIORTM (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BDTM 펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPENTM, OPTIPEN PROTM, OPTIPEN STARLETTM, 및 OPTICLIKTM (사노피-아벤티스(sanofi-aventis), Frankfurt, Germany)을 들 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물의 피하 전달에 사용되는 일회용 펜 전달 장치의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 몇 가지 예로, SOLOSTARTM 펜 (사노피-아벤티스), FLEXPENTM (Novo Nordisk), 및 KWIKPENTM (Eli Lilly), SURECLICKTM 자기주사기 (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), 및 HUMIRATM 펜 (Abbott Labs, Abbott Park IL)을 들 수 있다.
특정 상황에서, 제약학적 조성물은 제어된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, 상기 동일; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 참조). 다른 구체예에서, 폴리머 물질이 사용될 수 있다; Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida 참조. 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 조성물의 표적에 근접하게 배치될 수 있고, 그로써 단지 전신적 용량의 부분만을 필요로 한다 (예컨대 Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 동일, vol. 2, pp. 115-138 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 Langer, 1990에 의해 Science 249:1527-1533에서 리뷰로 논의된다.
주사 가능한 조제물은 정맥내, 피하, 피부내 및 근육내 주사, 드립 주입 등을 위한 투여량 형태를 포함할 수 있다. 이 주사 가능한 조제물들은 공공연하게 알려져 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 조제물들은 예컨대 상기 기술된 항체 또는 그것의 염을 주사액을 위해 종래로 사용되는 멸균된 수성 매질 또는 유성 매질에 용해, 현탁 또는 에멀션화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사액용 수성 매질로서는, 예를 들어 생리 식염수, 글루코오스 및 다른 보조제들을 함유하는 등장성 용액 등을 들 수 있고, 그것들은 알코올 (예컨대 에탄올), 다가알코올 (예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 [예컨대 폴리소르베이트 80, 수소첨가된 캐스터유의 HCO-50 (폴리옥시에틸렌 (50 mol) 부가물] 등과 같은 적절한 가용화제와 함께 사용될 수 있다. 유성 매질로서는, 예컨대 참깨 기름, 대두유 등이 사용되고, 그것들은 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 함께 사용될 수 있다. 그렇게 제조된 주사액은 바람직하게는 적절한 앰플에 채워진다.
유익하게, 상기 기술된 경구 또는 비경구 사용을 위한 제약학적 조성물은 활성 성분의 용량을 맞추기 위해 적합한 단위 용량의 투여 형태로 제조된다. 그러한 단위 용량의 투여 형태는, 예를 들어, 정제, 환, 캡슐, 주사제 (앰플), 좌제, 등을 포함한다. 함유된 상기 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 투여 형태당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제의 형태에서는, 상기 항체는 약 5 내지 약 100 mg으로 함유되고 다른 투여 형태의 경우 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항체의 치료적 사용
본 발명은 항-GITR 항체 (예컨대, 본원의 표 1에 나타낸 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열들 중 임의의 것을 포함하는 항-GITR 항체)를 포함하는 치료용 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료용 조성물은 본원에 개시된 항-GITR 항체, 그것의 항원-결합 단편, 또는 ADC 들 중 임의의 것, 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
발명의 항체는 무엇보다도, GITR 발현 또는 활성과 결부된 또는 그것들에 의해 매개된, 또는 GITR과 GITRL 사이의 상호작용을 차단함으로써, 및/또는 GITR 활성 및/또는 신호전달을 억제 또는 자극함으로써 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 개선하기에 유용하다. 예를 들어, 본 개시의 항체 및 항원-결합 단편은, 예컨대 GITR 활성화가 있긴 하지만, 면역 반응을 조절함으로써 면역 또는 증식성 질환 또는 장애, 예컨대 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 항체 및 항원-결합 단편은 면역 반응을 향상시킴으로써 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시는 본원에 기술된 항-GITR 항체 또는 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 T 조절 세포에 의한 T 이펙터 세포의 억제 활성을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 본 개시의 항체 또는 항원-결합 단편은 치료 유익에 도움이 되는 종양내 T 이펙터/T 조절 세포 비율을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 본 개시의 항체 또는 항원-결합 단편은 T 세포 생존율을 촉진한다.
항체 및 항원-결합 단편들에 의해 치료될 수 있는 예시의 질환 또는 장애로는 면역 및 증식성 질환 또는 장애, 예컨대 암을 들 수 있다. 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편들은 뇌 및 뇌막, 인두 중앙부(oropharynx), 폐 및 기관지, 위장관, 남녀 생식관, 근육, 뼈, 피부 및 부속기관, 연결 조직, 비장, 면역계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 뇨관, 및 눈과 같은 특수 감각 기관들에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 항체 및 항원-결합 단편은 고형 또는 혈액-유래 종양을 치료하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 본 개시의 항체는 다음의 암 중 하나 이상을 치료하기 위해 사용된다: 콩팥 세포 암종, 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 대장암, 위암 (예컨대 MET 증폭을 포함한 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암, 소세포 폐암, 비-소세포 페암, 활막 육종, 갑상선암, 유방암, 흑색종, 고환암, 신장암, 식도암, 자궁암, 자궁 내막암, 또는 간암.
특정 구체예에서, 발명의 항체는 자가면역 질환, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 원형 탈모(alopecia areata), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 셀리악병(celiac disease), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 염증성 근병증(inflammatory myopathies), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 원발성 담즙 간경변(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 피부 경화증(scleroderma), 쇠그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erthyematosus), 백반증(vitiligo), 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 자가면역 두드러기(autoimmune urticaria), 자가면역 혈소판감소성 자반병(autoimmune thrombocytopenic purpura), 크론병(Crohn's disease), 제 1형 당뇨병(diabetes type I), 호산구성 근막염(eosinophilic fasciitis), 호산구성 담낭염(eosinophilic enterogastritis), 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 류머티스열(rheumatic fever), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 혈관염(vasculitis) 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 치료하기에 유용하다.
본원에 기술된 치료 방법의 맥락에서, 항-GITR 항체는 단일요법으로서 (즉 유일한 치료제로서) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제 (이것의 예시는 본원의 다른 곳에서 기술됨)와 함께 투여될 수 있다.
조합 치료법 및 제제
본원에는 또한 본 개시의 항-GITR 항체 및 본 개시의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 유익하게 조합될 수 있는 임의의 추가적인 치료제를 활용하는 조합 치료법이 제공된다.
본 발명은 본원에 기술된 항-GITR 항체들 중 임의의 것을 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 구성요소와 조합하여 포함하는 조성물 및 치료 제제, 및 그것을 필요로 하는 대상체에게 그런 조합을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 항체는 암, 이를테면, 예를 들어, 신장 세포 암종, 대장암, 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 두경부의 편평 세포 암종, 비-소세포 폐암, 결장암, 난소암, 선암종, 전립선암, 신경교종, 및 흑색종을 치료하기 위해 사용된 하나 이상의 항암 약물 또는 치료법과 상조적으로 조합될 수 있다. 본원에서는 종양 성장을 억제하고, 및/또는 암 환자의 생존율을 향상시키기 위하여, 발명의 항-GITR 항체를 면역자극성 및/또는 면역억제성 치료법과 조합하여 사용하는 것이 고려된다. 면역자극성 치료법은 억제된 면역 세포 상에서 "브레이크를 풀어줌"에 의해 또는 면역 반응을 활성화하기 위해 "가스 상에서 스테핑(stepping)"에 의해 면역 세포 활성을 증대시키기 위한 직접적인 면역자극 치료법을 포함한다. 예시로는 다른 체크포인트 수용체, 백신접종 및 보조제의 표적화를 포함한다. 면역억제 양상은 면역원성 세포 사망, 염증을 촉진함으로써 종양의 항원성을 증가시킬 수 있거나 항-종양 면역 반응을 촉진하는 다른 간접적인 효과를 가질 수 있다. 예시로는 방사선요법, 화학요법, 혈관형성 억제제, 및 수술을 포함한다.
본 개시는 종양 파괴를 촉진하기 위하여 활성화 수용체에 대항하는 하나 이상의 작용성 항체 및 T-세포 자극을 향상시키는 억제성 수용체에 대항하는 하나 이상의 차단 항체와 조합된 항-GITR 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항-종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함한다.
본 개시는 본원에 기술된 항-GITR 항체 또는 항원-결합 단편을 제 2 T-세포 활성화 수용체 (즉 GITR 이외의 수용체)에 결합하는 하나 이상의 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 제 2 T-세포 활성화 수용체는 CD28, OX40, CD137, CD27, 또는 VEM이다. 본 개시는 또한 본원에 제공된 항-GITR 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 및 상기 제 2 T-세포 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제제들을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 항체는 PD-L1에 대한 항체, PD-1에 대한 항체 (예컨대 니볼루맙(nivolumab)), LAG-3 억제제, CTLA-4 억제제 (예컨대, 이필리무맙(ipilimumab)), TIM3 억제제, BTLA 억제제, TIGIT 억제제, CD47 억제제, 또 다른 T-세포 공동-억제제 또는 리간드의 길항제 (예컨대, CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 또는 VISTA에 대한 항체), 인돌아민-2,3-다이옥시게나제 (IDO) 억제제, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제 [예컨대, "VEGF-Trap", 예컨대 아플리버셉트(aflibercept) 또는 US 7,087,411에 나타난 것과 같은 다른 VEGF-억제 융합 단백질, 또는 항-VEGF 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 (예컨대, 베바시주맙(bevacizumab), 또는 라니비주맙(ranibizumab)) 또는 VEGF 수용체의 소분자 키나아제 억제제 (예컨대, 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 또는 파조파닙(pazopanib)], Ang2 억제제 (예컨대, 네스바쿠맙(nesvacumab)), 변형 성장 인자 베타 (TGFβ) 억제제, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제 (예컨대, 에를로티닙(erlotinib), 세툭시맙(cetuximab)), 공동-자극 수용체에 대한 작용물질 (예컨대, 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질에 대한 작용물질), 종양-특이적 항원 (예컨대, CA9, CA125, 흑색종-관련 항원 3 (MAGE3), 암배아 항원 (CEA), 비멘틴(vimentin), 종양-M2-PK, 전립선-특이적 항원 (PSA), 뮤신-1, MART-1, 및 CA19-9)에 대한 항체, 백신 (예컨대, 바실루스 Calmette-Guerin, 암 백신), 항원 제공을 증가시키기 위한 보조제 (예컨대, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자), 이중특이적 항체 (예컨대, CD3xCD20 이중특이적 항체, PSMAxCD3 이중특이적 항체), 세포독소, 화학요법제 (예컨대, 다카르바진(dacarbazine), 테모졸로미드(temozolomide), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 겜시타빈(gemcitabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토크산트론(mitoxantrone), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 빈크리스틴(vincristine)), 사이클로포스파미드, 방사선요법, IL-6R 억제제 (예컨대, 사릴루맙(sarilumab)), IL-4R 억제제 (예컨대, 두필루맙(dupilumab)), IL-10 억제제, 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, IL-21, 및 IL-15, 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC) (예컨대, 항-CD19-DM4 ADC, 및 항-DS6-DM4 ADC), 항-염증성 약물 (예컨대, 코르티코스테로이드류, 및 비-스테로이드성 항-염증 약물), 식이 보충제, 예컨대 항-산화제 또는 암 치료를 위한 임의의 완화제와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항-GITR 항체는 항-종양 반응을 증대시키기 위하여, 수지상 세포 백신, 종양세포붕괴성 바이러스, 종양 세포 백신 등을 포함하는 암 백신과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 항-GITR 항체와 조합하여 사용될 수 있는 암 백신의 실례는 흑색종 및 방광암의 경우 MAGE3, 유방암의 경우 MUC1 백신, 뇌암 (다형성 교모세포종을 포함함)의 경우 EGFRv3 (예컨대, 린도페피무트(Rindopepimut)), 또는 ALVAC-CEA (CEA+ 암의 경우)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 항-GITR 항체는 하나 이상의 항-PD1 항체, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만 미국 특허 공보 2015/0203579 (그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에 기술된 것들과 조합하여 투여된다. 일부 구체예에서, 항-GITR 항체는 H1H14536P2 또는 H2aM14536P2이다. 일부 구체예에서, 항-PD1 항체는 REGN 2810 (또한 미국 특허 공보 2015/0203579에서 개시된 바와 같이 H4H7798N으로서도 알려짐), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 또는 니볼루맙(nivolumab)이다.
특정 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 암 환자들의 장기간 작용성 항-종양 반응을 생성하고 및/또는 생존율을 향상시키기 위한 방법에서 방사선 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 암 환자에 대한 방사선 요법의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여될 수 잇다. 예를 들어, 방사선 요법은 종양 병변에 하나 이상의 용량으로 투여된 후에 발명이 항-GITR 항체의 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 방사선 요법은 환자의 종양의 국소 면역원성을 향상시키기 위하여 (보조 방사선(adjuvinating radiation)) 및/또는 종양 세포를 사멸하기 위하여 (절제 방사선(ablative radiation)) 종양 병변에 국소적으로 투여된 후에 발명의 항-GITR 항체가 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 두개내 방사선은 뇌암 (예컨대 다형성 교모세포종) 환자에게 발명의 항-GITR 항체의 전신적 투여와 조합되어 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 방사선 요법 및 화학요법제 (예컨대 테모졸로미드) 또는 VEGF 길항제 (예컨대, 아플리버셉트)와 조합되어 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 LCMV, HIV, HPV, HBV 또는 HCV에 의해 유발된 만성 바이러스 감염을 치료하기 위하여 하나 이상의 항-바이러스 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 항-바이러스 약물의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 지도부딘(zidovudine), 라미부딘(lamivudine), 아바카비어(abacavir), 리바비린(ribavirin), 로피나비어(lopinavir), 에파비렌즈(efavirenz), 코비시스타트(cobicistat), 테노포비어(tenofovir), 릴피비린(rilpivirine) 및 코르티코스테로이드를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 LAG3 억제제, CTLA-4 억제제 또는 만성 바이러스 감염을 치료하기 위한 다른 T-세포 공동-억제제의 임의의 길항제와 조합하여 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 발명의 항-GITR 항체는 자가면역 질환의 치료를 위해 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 항체와 연합될 수 있다. 한 구체예에서, 발명의 항체 또는 그것의 단편은 자가면역 조직에 특이적인 항원에 표적화된 항체 또는 항원-결합 단백질과 조합되어 투여된다. 특정 구체예에서, 발명의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 -세포 수용체 또는 B-세포 수용체, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, Fcα (예컨대, CD89), Fc 감마 (예컨대, CD64, CD32, CD16a, 및 CD16b), CD19, 등에 대해 표적화된 항체 또는 항원-결합 단백질과 조합되어 투여된다. 발명의 항체 또는 그것의 단편은 자가면역 질환 또는 장애, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 원형 탈모, 자가면역 간염, 셀리악병, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근병증, 다발성 경화증, 원발성 담즙 간경변, 건선, 류머티스성 관절염, 피부 경화증, 쇠그렌 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기, 자가면역 혈소판감소성 자반, 크론병, 제 1형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 담낭염, 굿파스쳐 증후군, 중증 근무력증, 건선성 관절염, 류머티스열, 궤양성 대장염, 혈관염 및 베게너 육아종증을 치료하기 위하여 당업계에 알려져 있는 임의의 약물 또는 치료법 (예컨대 코르티코스테로이드류 및 다른 면역억제제)과 조합하여 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 항-GITR 항체 또는 항원-결합 단편을 T-세포 억제성 수용체에 결합하는 하나 이상의 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, T-세포 억제성 수용체는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, 또는 LAG-3이다. 본 개시는 또한 본원에 제공된 항-GITR 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 및 상기 T-세포 억제성 수용체에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제제들을 포함한다.
본 개시는 또한 방사선 요법 또는 화학요법과 함께 대상체에게 본원에 기술된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 또는 제제를 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-GITR 항체는 EGFR 길항제 (예컨대, 항-EGFR 항체 [예컨대, 세툭시맙 또는 파니투무맙(panitumumab)] 또는 EGFR의 소분자 억제제 [예컨대, 게피티닙(gefitinib) 또는 에를로티닙]), 다른 EGFR 패밀리, 예컨대 Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4의 길항제 (예컨대, 항-ErbB2 [예컨대, 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 T-DM1 {KADCYLA®}], 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소분자 억제제), EGFRvIII의 길항제 (예컨대, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체), cMET 길항제 (예컨대, 항-cMET 항체), IGF1R 길항제 (예컨대, 항-IGF1R 항체), B-raf 억제제 (예컨대, 베무라페닙(vemurafenib), 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α 억제제 (예컨대, 항-PDGFR-α 항체), PDGFR-α 억제제 (예컨대, 항-PDGFR-α 항체 또는 소분자 키나아제 억제제, 예컨대, 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate) 또는 수니티닙 말레에이트(sunitinib malate)), PDGF 리간드 억제제 (예컨대, 항-PDGF-A, -B, -C, 또는 -D 항체, 앱타머(aptamer), siRNA, 등), VEGF 길항제 (예컨대, VEGF-Trap, 예컨대 아플리버셉트, 예컨대, US 7,087,411 참조 (또한 본원에서 "VEGF-억제 융합 단백질"로도 언급됨), 항-VEGF 항체 (예컨대, 베바시주맙), VEGF 수용체의 소분자 키나아제 억제제 (예컨대, 수니티닙, 소라페닙 ㄸ또는 파조파닙(pazopanib)), DLL4 길항제 (예컨대, US 2009/0142354에서 개시된 항-DLL4 항체, 예컨대 REGN421), Ang2 길항제 (예컨대, US 2011/0027286에서 개시된 항-Ang2 항체, 예컨대 H1H685P), FOLH1 길항제 (예컨대, 항-FOLH1 항체), STEAP1 또는 STEAP2 길항제 (예컨대, 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP2 항체), TMPRSS2 길항제 (예컨대, 항-TMPRSS2 항체), MSLN 길항제 (예컨대, 항-MSLN 항체), CA9 길항제 (예컨대, 항-CA9 항체), 유로플라킨(uroplakin) 길항제 (예컨대, 항-유로플라킨 [예컨대, 항-UPK3A] 항체), MUC16 길항제 (예컨대, 항-MUC16 항체), Tn 항원 길항제 (예컨대, 항-Tn 항체), CLEC12A 길항제 (예컨대, 항- CLEC12A 항체), TNFRSF17 길항제 (예컨대, 항-TNFRSF17 항체), LGR5 길항제 (예컨대, 항-LGR5 항체), 일가 CD20 길항제 (예컨대, 일가 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙), 등으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 구성요소(들)과 함께 공동 제제화되거나 및/또는 조합되어 투여된다. 발명의 항체와 조합되어 유익하게 투여될 수 있는 다른 작용제들로는, 예컨대 타목시펜(tamoxifen), 아로마타제(aromatase) 억제제, 및 사이토카인 억제제, 이를테면 소분자 사이토카인 억제제 및 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같은 사이토카인에, 또는 그것들의 각각의 수용체에 결합하는 항체들을 예로 들 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 화학요법제와 조합된 본원에 기술된 항-GITR 항체들 중 임의의 것을 포함하는 조성물 및 치료 제제를 포함한다. 화학요법제의 실례로는 다음을 포함한다: 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드 (CytoxanTM); 알킬 설포네이트, 예컨대 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan); 아지리딘(aziridines), 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 유레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 이를테면 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포라미드, 트라이에틸렌티오포스포라미드, 트라이에틸렌티오포스포라미드 및 트라이메틸롤로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생물질, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날류, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트라이로스탄; 폴산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토크산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSKTM; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테뉴아존산; 트라이지쿠온; 2,2',2'-트라이클로로트라이에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예컨대 파클리탁셀 ((TaxolTM, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (TaxotereTM; Aventis Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캡토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 아벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 것의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체. 또한 이 정의에는 항-에스트로겐과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 이를테면 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류플롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 어느 것의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
발명의 항-GITR 항체는 또한 항바이러스제, 항생물질, 진통제, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 항산화제, COX 억제제, 심장보호제, 금속 킬레이터, IFN-감마, 및/또는 NSAID와 함께 투여되거나 및/또는 공종-제제화될 수 있다.
추가적인 치료적 활성 구성요소(들), 예컨대, 상기 열거된 작용제들 중 임의의 작용제 또는 그것의 유도체는 본 발명의 항-GITR 항체의 투여 전에, 동시에, 또는 직후에 투여될 수 있다; (본 발명의 목적에 대해, 그러한 투여 양생법은 추가적인 치료적 활성 구성요소와 "조합된" 항-GITR 항체의 투여로 여겨진다). 본 발명은 본 발명의 항-GITR 항체가 본원의 다른 곳에서 기술된 추가적인 치료적 활성 구성요소(들) 중 하나 이상의 것과 공동-제제화되는 제약학적 조성물을 포함한다.
추가적인 치료적 활성 구성요소(들)은 본 발명의 항-GITR 항체의 투여 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제 1 구성요소가 제 2 구성요소의 투여에 앞서 1주 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 정, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 15분 전, 10분 전, 5분 전, 또는 1분 이내에 투여된다면, 제 1 구성요소는 제 2 구성요소 "전에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 구체예에서, 추가적인 치료적 활성 구성요소(들)은 본 발명의 항-GITR 항체의 투여 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제 1 구성요소가 제 2 구성요소의 투여 후 1분 후, 5분 후, 10분 후, 15분 후, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후에 투여된다면, 제 1 구성요소는 제 2 구성요소 "후에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 추가적인 치료적 활성 구성요소(들)은 본 발명의 항-GITR 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. "동시" 투여는, 본 발명의 목적의 경우, 예컨대 항-GITR 항체 및 추가적인 치료적 활성 구성요소가 단일 투여 형태로 (예컨대 공동-제제화됨), 또는 서로 약 30분 이하 이내에 별도의 투여 형태로 대상체에게 투여되는 것을 포함한다. 별도의 투여 형태로 투여되는 경우, 각각의 투여 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있고 (예컨대 항-GITR 항체 및 추가적인 치료적 활성 구성요소 둘 다 정맥내로, 피하로, 등으로 투여될 수 있음); 대안적으로는, 각각의 투여 형태는 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다 (예컨대 항-GITR 항체는 정맥내로 투여될 수 있고, 추가적인 치료적 활성 구성요소는 피하로 투여될 수 있다). 어느 경우든지, 단일 투여 형태로, 동일한 경로에 의해 별도의 투여 형태로, 또는 상이한 경로에 의해 별도의 투여 형태로, 구성요소들을 투여하는 것은 모두, 본 발명의 개시에 대해 "동시 투여"로 여겨진다. 본 발명의 개시에 대해, 추가적인 치료적 활성 구성요소의 투여 "전에", "동시에", 또는 "후에" (상기에서 정의된 용어들과 같음) 항-GITR 항체의 투여는 추가적인 치료적 활성 구성요소"와 조합된" 항-GITR 항체의 투여로 여겨진다.
본 발명은 본 발명의 항-GITR 항체가 본원의 다른 곳에서 기술된 추가적인 치료적 활성 구성요소(들) 중 하나 이상과 다양한 투여 조합을 사용하여 공동-제제화된 제약학적 조성물을 포함한다.
발명의 항-GITR 항체가, 항-GITR 항체 및 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제의 투여를 포함하여, VEGF 길항제 (예컨대, 아플리버셉트와 같은 VEGF trap)와 조합되어 투여되는 예시의 구체예에서, 개별적인 구성요소들은 다양한 투여 조합을 사용하여 대상체에게 투여되거나 및/또는 공동-제제화될 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg, 5.0 mg, 6.0 mg, 7.0 mg, 8.0 mg, 9.0 mg, 및 10.0 mg으로 구성되는 군으로부터 선택된 양으로 대상체에게 투여되거나 및/또는 공동-제제에 함유될 수 있고; VEGF 길항제 (예컨대, 아플리버셉트와 같은 VEGF trap)는 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.1 mg, 1.2 mg, 1.3 mg, 1.4 mg, 1.5 mg, 1.6 mg, 1.7 mg, 1.8 mg, 1.9 mg, 2.0 mg, 2.1 mg, 2.2 mg, 2.3 mg, 2.4 mg, 2.5 mg, 2.6 mg, 2.7 mg, 2.8 mg, 2.9 mg 및 3.0 mg으로 구성되는 군으로부터 선택된 양으로 대상체에게 투여되거나 및/또는 공동-제제에 함유될 수 있다. 조합/공동-제제는 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 투여 양생법, 이를테면 예컨대 주 2회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 등의 양생법에 따라 대상체에게 투여될 수 있다.
투여 양생법
본 발명의 특정 구체예에 따라, 다중 용량의 항-GITR 항체 (또는 항-GITR 항체 및 본원에서 언급된 추가적인 치료적 활성제들 중 임의의 것의 조합을 포함하는 제약학적 조성물)가 규정된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 발명의 이 측면에 따르는 방법은 발명의 항-GITR 항체의 다중 용량을 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 "순차적으로 투여하는"은 각 용량의 항-GITR 항체가 상이한 시점에, 예컨대 일정 간격 (예컨대 시간, 일, 주 또는 개월)에 의해 떨어져 있는 상이한 날에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 본 발명은 단일 초기 용량의 항-GITR 항체를 환자에게 투여한 후, 이어서 하나 이상의 제 2 용량의 항-GITR 항체, 그리고 선택적으로 하나 이상의 제 3 용량의 항-GITR 항체를 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "초기 용량", "제 2 용량", 및 "제 3 용량"은 발명의 항-GITR 항체의 투여의 일시적인 순서를 나타낸다. 그러므로, "초기 용량"은 치료 양생법을 시작할 때 투여된 용량이고 (또한 "기준선 용량"으로도 언급됨); "제 2 용량"은 초기 용량 후 투여된 용량이며; "제 3 용량"은 제 2 용량 후 투여된 용량이다. 초기, 제 2, 및 제 3 용량은 모두 동일한 양의 항-GITR 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 관점에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 특정 구체예에서, 초기, 제 2, 및 제 3 용량에 함유된 항-GITR 항체의 양은 치료 과정 중에 서로 다르다 (예컨대 필요에 따라 상향 또는 하향 조정된다). 특정 구체예에서, 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5)의 용량이 치료 양생법을 시작할 때 "부하 용량"으로서 투여된 후 계속해서 더 적은 빈도를 기준으로 추후 용량 (예컨대 "유지 용량")이 투여된다.
본 발명의 특정 예시 구체예에서, 각각의 제 2 및/또는 제 3 용량은 바로 직전 용량 후 1 내지 26 (예컨대 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½, 또는 그 이상)주 후에 투여된다. 본원에서 사용되는 구절인 "바로 직전 용량"은, 다중 투여의 순서에서, 중간에 다른 용량이 개재되지 않는 순서로, 바로 다음 용량의 투여 전에 환자에게 투여되는 항-GITR 항체의 용량을 의미한다.
발명의 이 측면에 따르는 방법은 항-GITR 항체의 임의의 수의 제 2 및/또는 제 3 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 단지 단일한 제 2 용량만이 환자에게 투여된다. 다른 구체예에서는, 둘 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상)의 제 2 용량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 특정 구체예에서, 단지 단일한 제 3 용량만이 환자에게 투여된다. 다른 구체예에서, 둘 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상)의 제 3 용량이 환자에게 투여된다. 투여 양생법은 특정 대상체의 수명 동안 무한하게, 또는 그런 치료가 더 이상 치료적으로 필요하지 않거나 유익하지 않을 때까지 수행될 수 있다.
다중 제 2 용량을 포함하는 구체예에서, 각각의 제 2 용량은 다른 제 2 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 제 2 용량은 직전의 용량 후 1 내지 2주 후 또는 1 내지 2개월 후에 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 다중 제 3 용량을 포함하는 구체예에서, 각각의 제 3 용량은 다른 제 3 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 제 3 용량은 직전 용량 후 2 내지 12주 후에 환자에게 투여될 수 있다. 발명의 특정 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 양생법의 과정 동안 달라질 수 있다. 투여 빈도는 또한 임상 검사 후 개별적인 환자의 필요에 따라 의사에 의한 치료 과정 중에 조정될 수 있다.
본 발명은 2 내지 6의 부하 용량이 제 1 빈도로 (예컨대 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 월 1회, 2개월마다 1회, 등) 투여된 후, 둘 이상의 유지 용량이 더 적은 빈도 기준으로 환자에게 투여되는 투여 양생법을 포함한다. 예를 들어, 발명의 이 측면에 따르면, 부하 용량이 월 1회의 빈도로 투여되면, 유지 용량은 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 등으로 투여될 수 있다.
항체의 진단용 용도
본 발명의 항-GITR 항체는 또한 샘플 중의 GITR, 또는 GITR-발현 세포를 검출 및/또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체, 또는 그것의 단편은 GITR의 비정상적인 발현 (예컨대 과잉 발현, 하향 수준의 발현, 발현의 결핍, 등)으로 특징지어지는 상태 또는 질환을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 예시의 GITR에 대한 진단용 검정은, 예컨대 환자로부터 얻어진 샘플을 발명의 항-GITR 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 이때 항-GITR 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-GITR 항체는 자체가 검출 가능하게 표지된 제 2 항체와 함께 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학발광 모이어티, 예컨대 플루오레세인, 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 서양고추냉이 과산화효소, 또는 루피페라제일 수 있다. 샘플 중의 GITR을 검출 또는 측정하기 위해 사용될 수 있는 특수한 예시의 검정은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성 면역검정 (RIA), 면역-PET (예컨대, 89Zr, 64Cu, 등), 및 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 포함한다.
본 발명에 따라 GITR 진단용 검정에 사용될 수 있는 샘플들은 정상적인 또는 병리적인 상태 하에서 검출 가능한 양의 GITR 단백질, 또는 그것의 단편을 함유하는, 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자 (예컨대 비정상적인 GITR 수준 또는 활성과 결부된 질환 또는 상태로 영향을 받지 않는 환자)로부터 얻어진 특정 샘플 중의 GITR의 수준은 GITR의 기준선, 또는 표준 수준을 초기에 수립하기 위해 측정될 것이다. 이 기준선 수준의 GITR은 그 후 GITR 관련 질환 또는 상태를 가진 것으로 추측되는 개체들로부터 얻어진 샘플에서 측정된 GITR의 수준과 비교될 수 있다.
실시예
다음의 실시예들은 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자들에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자들이 그들의 발명으로서 간주한 것의 범주를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자 (예컨대 양, 온도, 등)와 관련하여 정확성을 확실하게 하기 위한 노력들이 기울여졌지만, 일부 실험적 오류 및 편차는 인지되어야 한다. 다르게 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1. 항-GITR 항체의 생성
항-GITR 항체를 VELOCIMMUNE® 마우스 (즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자조작된 마우스)를 인간 GITR의 가용성 다이머 엑토 도메인을 포함하는 면역원으로 면역화함으로써 얻었다. 항체 면역 반응을 GITR-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 여러 개의 전체 인간 항-GITR 항체를, US 2007/0280945A1에서 기술된 것과 같이, 골수종 세포에 대한 융합이 없는 항원-포지티브 B 세포로부터 직접 분리하였다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시의 항-GITR 항체의 특정 생물학적 특성들을 하기의 실시예들에서 상세하게 설명한다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열
표 1은 선택된 발명의 항-GITR 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 식별자들을 나타낸다. 상응하는 핵산 서열 식별자들은 표 2에 나타낸다.
아미노산 서열 식별자
SEQ ID NO:
항체 지정 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H1H14474P 2 4 6 8 10 12 14 16
H1H14486P 18 20 22 24 26 28 30 32
H1H14491P 34 36 38 40 42 44 46 48
H1H14493P 50 52 54 56 58 60 62 64
H1H14495P 66 68 70 72 74 76 78 80
H1H14503P 82 84 86 88 90 92 94 96
H1H14512P 98 100 102 104 106 108 110 112
H1H14520P 114 116 118 120 122 124 126 128
H1H14523P 130 132 134 136 138 140 142 144
H1H14524P 146 148 150 152 154 156 158 160
H4H14469P 162 164 166 168 170 172 174 176
H4H14470P 178 180 182 184 186 188 190 192
H4H14475P 194 196 198 200 202 204 206 208
H4H14476P 210 212 214 216 218 220 222 224
H4H14508P 226 228 230 232 234 236 238 240
H4H14516P 242 244 246 248 250 252 254 256
H4H14521P 258 260 262 264 266 268 270 272
H4H14525P 274 276 278 280 282 284 286 288
H4H14528P 290 292 294 296 298 300 302 304
H4H14530P 306 308 310 312 314 316 318 320
H4H14531P2 322 324 326 328 402 404 406 408
H4H14532P2 330 332 334 336 402 404 406 408
H4H14536P2 338 340 342 344 402 404 406 408
H4H14539P2 346 348 350 352 402 404 406 408
H4H14541P2 354 356 358 360 402 404 406 408
H4H15736P2 362 364 366 368 402 404 406 408
H4H15740P2 370 372 374 376 402 404 406 408
H4H15744P2 378 380 382 384 402 404 406 408
H4H15745P2 386 388 390 392 402 404 406 408
H4H15753P2 394 396 398 400 402 404 406 408
핵산 서열 식별자
SEQ ID NO:
항체 지정 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H1H14474P 1 3 5 7 9 11 13 15
H1H14486P 17 19 21 23 25 27 29 31
H1H14491P 33 35 37 39 41 43 45 47
H1H14493P 49 51 53 55 57 59 61 63
H1H14495P 65 67 69 71 73 75 77 79
H1H14503P 81 83 85 87 89 91 93 95
H1H14512P 97 99 101 103 105 107 109 111
H1H14520P 113 115 117 119 121 123 125 127
H1H14523P 129 131 133 135 137 139 141 143
H1H14524P 145 147 149 151 153 155 157 159
H4H14469P 161 163 165 167 169 171 173 175
H4H14470P 177 179 181 183 185 187 189 191
H4H14475P 193 195 197 199 201 203 205 207
H4H14476P 209 211 213 215 217 219 221 223
H4H14508P 225 227 229 231 233 235 237 239
H4H14516P 241 243 245 247 249 251 253 255
H4H14521P 257 259 261 263 265 267 269 271
H4H14525P 273 275 277 279 281 283 285 287
H4H14528P 289 291 293 295 297 299 301 303
H4H14530P 305 307 309 311 313 315 317 319
H4H14531P2 321 323 325 327 401 403 405 407
H4H14532P2 329 331 333 335 401 403 405 407
H4H14536P2 337 339 341 343 401 403 405 407
H4H14539P2 345 347 349 351 401 403 405 407
H4H14541P2 353 355 357 359 401 403 405 407
H4H15736P2 361 363 365 367 401 403 405 407
H4H15740P2 369 371 373 375 401 403 405 407
H4H15744P2 377 379 381 383 401 403 405 407
H4H15745P2 385 387 389 391 401 403 405 407
H4H15753P2 393 395 397 399 401 403 405 407
항체는 전형적으로 본원에서 다음의 명명법을 따라 언급된다: 표 1 및 2에서 나타난 것과 같이, Fc 접두어 (예컨대 "H1H" "H4H", 등), 이어서 숫자 식별자 (예컨대 "14493", "14495", 등), 이어서 "P" 또는 "P2" 접미어. 그러므로, 이 명명법에 따르면, 항체는 본원에서, 예컨대 " H1H14486P", " H4H14531P2", 등으로 언급될 수 있다. 본원에서 사용된 항체 지정시 H1H, 및 H4H 접두어는 항체의 특별한 Fc 영역 아이소타입을 나타낸다. 예를 들어, "H1H" 항체는 인간 IgG1 Fc를 가지며, "H4H" 항체는 인간 IgG4 Fc를 가지고, H2M은 마우스 IgG2 Fc를 가진다 (모든 가변 영역은 항체 지정에서 처음 'H'에 의해 표시된 것과 같이 전체 인간이다). 당업자에 의해 인지될 것과 같이, 특정 Fc 아이소타입을 가지는 항체는 상이한 Fc 아이소타입을 가지는 항체로 전환될 수 있지만, 어떤 경우든, 가변 도메인 (CDR을 포함하는) - 표 1 및 2에서 나타낸 숫자 식별자에 의해 표시되는 -은 동일하게 유지될 것이고, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질과 관계없이 동일한 또는 실질적으로 유사한 것으로 예상된다.
다음 실시예들에서 사용된 대조군 구성물들
비교 목적의 다음 실험에 대조군 구성물들을 포함시켰다: 항-GITR 대조군 Ab I: WO 2006/ 105021 A2에서 제시된 것과 같은 "클론 6C8"의 상응하는 도메인들의 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 마우스 항-인간 GITR 하이브리도마; 다음의 실시예에서 mIgG1 및 mIgG2a 불변 영역으로 제조됨; 및 항-GITR 대조군 Ab II: US 8709424 B2에서 제시된 것과 같은 "36E5"의 상응하는 도메인들의 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 인간 항-GITR 항체.
실시예 3. 인간 단클론성 항-TNFRSF18 (GITR) 항체의 표면 플라즈몬 공명 유래된 결합 친화도 및 동역학 상수
인간 항-GITR 항체의 결합 친화도 및 동역학 상수를 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (Biacore 4000 또는 T-200)에 의해 측정하였다. 인간 IgG1 또는 IgG4 (즉 "H1H" 또는 "H4H" 지정)로서 표시된 항체를 가용성 모노머 (인간 (h) GITR.mmh; SEQ ID NO: 409 및 마카카 파시큘라리스(Macaca fasicularis) (mf) GITR.mmh; SEQ ID NO: 412) 또는 다이머 (hGITR.hFc; SEQ ID NO: 411 및 hGITRmFc; SEQ ID NO: 410) 상에 포획하였다. GITR 단백질을 센서 표면 위로 30 μL/분의 유량으로 주입하였다. 모든 Biacore 결합 연구를 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20으로 구성된 완충액 (HBS-ET 작동 완충액)에서 수행하였다. 항체-시약 결합을 4분 동안 모니터링하는 한편, HBS-ET 작동 완충액 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4)에서의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 동역학적 결합 (k a) 및 해리 (k d) 속도 상수를 실시간 센서그램을 Scrubber 2.0c 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 맞춤으로써 측정하였다. 결합 해리 평형 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t½)를 동역학적 속도 상수로부터 KD [M] = kd / ka; 및 t1/2 (분) = (ln2/(60*kd)로서 얻었다. 그 결과를 표 3에 요약한다.
37℃에서 인간 Fc mAb의 Biacore 결합 친화도
37℃에서의 결합/ 항체 포획 포맷
항체 분석물 ka (Ms-1) Kd (s-1) KD (Molar) t½ (분)
H1H14503P hGITR.mmh 5.32E+05 7.39E-04 1.39E-09 15.6
hGITR.mFc 1.12E+06 1.54E-04 1.37E-10 75.0
mfGITR.mmh 2.68E+05 5.60E-03 2.09E-08 2.1
H1H14474P hGITR.mmh 5.91E+05 1.16E-03 1.96E-09 9.9
hGITR.mFc 1.21E+06 1.30E-04 1.07E-10 89.2
mfGITR.mmh 3.39E+05 9.51E-03 2.80E-08 1.2
H1H14495P hGITR.mmh 5.17E+05 1.27E-03 2.45E-09 9.1
hGITR.mFc 1.14E+06 1.10E-04 9.68E-11 105.0
mfGITR.mmh 2.96E+05 7.23E-03 2.45E-08 1.6
H1H14486P hGITR.mmh 4.39E+05 1.23E-03 2.79E-09 9.4
hGITR.mFc 9.65E+05 1.53E-04 1.59E-10 75.5
mfGITR.mmh 1.37E+05 1.66E-02 1.22E-07 0.7
H1H14524P hGITR.mmh 4.05E+05 1.47E-03 3.62E-09 7.9
hGITR.mFc 9.22E+05 1.35E-04 1.46E-10 85.6
mfGITR.mmh 1.20E+05 1.89E-02 1.58E-07 0.6
H4H14530P hGITR.mmh 2.72E+05 1.38E-03 5.06E-09 8.4
hGITR.mFc 2.93E+05 1.85E-04 6.30E-10 62.6
mfGITR.mmh 2.40E+05 6.11E-04 2.55E-09 18.9
H1H14491P hGITR.mmh 3.19E+05 1.62E-03 5.06E-09 7.2
hGITR.mFc 8.42E+05 1.69E-04 2.01E-10 68.3
mfGITR.mmh 1.18E+05 8.89E-03 7.53E-08 1.3
H1H14523P hGITR.mmh 2.16E+05 1.86E-03 8.63E-09 6.2
hGITR.mFc 5.55E+05 1.20E-04 2.16E-10 96.3
mfGITR.mmh 1.23E+05 1.09E-02 8.85E-08 1.1
H1H14493P hGITR.mmh 1.86E+05 2.50E-03 1.34E-08 4.6
hGITR.mFc 5.24E+05 1.91E-04 3.65E-10 60.4
mfGITR.mmh 1.00E+04 1.40E-02 1.40E-06 0.8
H4H14532P2 hGITR.mmh 3.48E+05 6.45E-03 1.85E-08 1.8
hGITR.mFc 7.20E+05 2.69E-04 3.73E-10 42.9
mfGITR.mmh 2.60E+05 6.48E-03 2.49E-08 1.8
H4H14521P hGITR.mmh 3.45E+05 7.84E-03 2.27E-08 1.5
hGITR.mFc 1.23E+06 4.79E-04 3.89E-10 24.1
mfGITR.mmh 1.66E+05 3.34E-03 2.01E-08 3.5
H4H14536P2 hGITR.mmh 4.24E+05 9.76E-03 2.30E-08 1.2
hGITR.mFc 1.26E+06 2.19E-04 1.73E-10 52.7
mfGITR.mmh 1.04E+05 1.47E-02 1.42E-07 0.8
H4H14476P hGITR.mmh 3.92E+05 1.23E-02 3.14E-08 0.9
hGITR.mFc 9.06E+05 2.69E-04 2.97E-10 42.9
mfGITR.mmh 1.91E+05 1.07E-02 5.58E-08 1.1
H4H14516P hGITR.mmh 2.25E+05 7.38E-03 3.27E-08 1.6
hGITR.mFc 1.68E+06 1.81E-03 1.08E-09 6.4
mfGITR.mmh 1.90E+05 1.12E-02 5.87E-08 1.0
H4H14508P hGITR.mmh 2.55E+05 9.35E-03 3.66E-08 1.2
hGITR.mFc 1.21E+06 7.19E-04 5.97E-10 16.1
mfGITR.mmh 1.29E+05 5.07E-03 3.93E-08 2.3
H4H14469P hGITR.mmh 2.84E+05 1.22E-02 4.30E-08 0.9
hGITR.mFc 1.20E+06 4.01E-04 3.35E-10 28.8
mfGITR.mmh 5.91E+04 2.43E-03 4.11E-08 4.7
H4H14475P hGITR.mmh 3.07E+05 1.40E-02 4.57E-08 0.8
hGITR.mFc 1.60E+06 1.35E-03 8.47E-10 8.5
mfGITR.mmh 1.83E+05 7.65E-03 4.17E-08 1.5
H4H14528P hGITR.mmh 1.02E+05 5.23E-03 5.13E-08 2.2
hGITR.mFc 1.58E+06 1.77E-03 1.12E-09 6.5
mfGITR.mmh NB NB NB NB
H4H14525P hGITR.mmh 3.17E+05 1.66E-02 5.24E-08 0.7
hGITR.mFc 7.91E+05 3.38E-04 4.27E-10 34.2
mfGITR.mmh 1.33E+05 2.05E-02 1.55E-07 0.6
H1H14520P hGITR.mmh 2.66E+05 1.67E-02 6.30E-08 0.7
hGITR.mFc 1.09E+06 5.83E-04 5.37E-10 19.8
mfGITR.mmh 1.99E+05 1.71E-02 8.59E-08 0.7
H4H14470P hGITR.mmh 2.21E+05 1.43E-02 6.47E-08 0.8
hGITR.mFc 9.04E+05 1.04E-03 1.15E-09 11.1
mfGITR.mmh NB NB NB NB
H4H14539P2 hGITR.mmh 2.14E+05 1.77E-02 8.25E-08 0.7
hGITR.mFc 8.53E+05 4.72E-04 5.54E-10 24.5
mfGITR.mmh 7.23E+04 1.65E-03 2.28E-08 7.0
항-GITR 대조군 Ab I-mIgG1 hGITR.mmh 2.16E+05 2.63E-02 1.22E-07 0.4
hGITR.hFc 3.82E+05 7.80E-03 2.04E-08 1.5
mfGITR.mmh 2.18E+05 4.64E-02 2.13E-07 0.2
항-GITR
대조군 Ab II-hIgG1		 hGITR.mmh 1.94E+05 9.67E-04 4.99E-09 11.9
hGITR.mFc 1.83E+06 1.73E-03 9.48E-10 6.7
mfGITR.mmh 2.31E+05 8.63E-03 3.74E-08 1.3
NB = 사용된 조건 하에서 관찰된 결합이 없음
표 3에서 알 수 있는 것과 같이, 본 발명의 모든 항-GITR 항체는 인간 GITR에 결합하였고, 이때 여러 항체가 다이머 인간 GITR 단백질에 대해 나노몰 이하의 친화도를 나타냈다. 추가적으로, 대부분의 항-GITR 항체는 또한 시노몰구스 GITR 단백질에 대해 교차 반응성을 나타냈다. 설칠 GITR 단백질에 대한 교차 반응성은 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).
실시예 4. 항-GITR 항체는 인간 GITR 발현 세포에 특이적으로 및 강력하게 결합한다
이 실시예에서, 항-GITR 항체가 인간 GITR-발현 세포주에 특이적으로 결합하는 능력을 전자화학발광 (ECL) 기반 검출을 사용하여 측정하였다.
간단히 설명하면, 인간 매아 신장 (HEK)-293-D9 세포를 인간 GITR (아미노산 M1-V241, NCBI 기탁 #NP_004186.1, SEQ ID: 413)로, 리포펙타민 2000-매개된 방법론을 통해 안정적으로 트랜스펙션하였다. 형질전환체들을 적어도 2주 동안 완전 성장 배지 +418에서 선택하였다.
세포 결합 연구를 위해, 인간 GITR을 발현하지 않는, 대략 1x105개의 hGITR/HEK293-D9 또는 모(parental) HEK293-D9 세포를 96-웰 탄소 전극 플레이트 (MULTI-ARRAY, MSD) 상에 1시간 동안 37℃에서 시딩하였다. 비특이적 결합 부위들을 2% BSA (w/v) + PBS로 1시간 동안 실온 (RT)에서 차단하였다. 다음에, 항-GITR 항체의 1.7 pM 내지 100 nM 범위의 연속적인 희석액을 세포에 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 그런 후 플레이트를 세척하여 미결합 항체를 제거하였고 (AquaMax2000 플레이트 세척기, MSD Analytical Technologies) 플레이트-결합된 항체를 SULFO-TAGTM 콘쥬게이트된 항-인간 카파 경쇄 IgG 항체 (Jackson Immunoresearch)로 1시간 동안 실온에서 검출하였다.
세척 후에, 발광 신호를 SECTOR Imager 6000 (MSD) 기기로 기록하였다. 직접적인 결합 신호 (상대 광도 단위(relative light units), RLU)를 항체 농도의 함수로서 분석하였고, 그 데이터를 GraphPad PrismTM 소프트웨어를 사용하여 S자형 (4-모수 로지스틱) 용량-반응 모델과 맞추었다. 최대 결합 신호의 50%가 검출되는 농도로서 규정한, 결합 hGITR/HEK293-D9 세포에 대한 EC50을 측정하여 각 항체의 결합 효능을 나타냈다. 모 세포에 대비한 hGITR 발현 세포에 대한 100nM 항체 결합으로 검출한 신호를 GITR 결합의 세기 및 특이성의 지표로서 기록하였다. 그 결과를 표 4에 요약한다.
표 4에서 요약한 것과 같이, 본 발명의 대부분의 항-GITR 항체는 모 HEK293에 대비하여 인간 GITR 발현 세포에 특이적으로 결합하였고, 이때 EC50은 210 pM 내지 85 nM의 범위였다. 대부분의 항체는 나노몰 이하의 EC50 값으로 인간 GITR-발현 세포에 결합하였다. 아이소타입 대조군 항체는 hGITR-발현 세포 또는 모 세포주에 대한 결합을 나타내지 않았다.
인간 GITR 발현 세포에 대한 100 nM에서의 항-GITR 항체 결합 EC 50 및 결합 세기
　 hGITR/HEK293-D9 세포에 대한 결합 hGITR/HEK293-D9 세포에 대한 결합
(100nM에서) 		HEK293-D9 세포에 대한 결합
(100nM에서)
항체 EC50 (M) Average Signal (RLU) Average Signal
(RLU)
H1H14474P 2.80E-10 6230 680
H1H14486P 4.30E-10 5830 280
H1H14491P 4.00E-10 6840 300
H1H14493P 3.00E-10 7220 790
H1H14495P 4.30E-10 6470 340
H1H14503P 2.10E-10 5880 330
H1H14512P 2.50E-10 4620 180
H1H14520P 2.40E-10 6450 1130
H1H14523P 4.00E-10 6350 530
H1H14524P 2.10E-10 5740 500
H4H14469P 2.30E-10 5230 260
H4H14470P 1.40E-09 8390 1580
H4H14475P 8.00E-09 7500 1580
H4H14476P 5.70E-10 8120 1770
H4H14508P 4.50E-10 6870 580
H4H14516P 7.00E-10 10330 2560
H4H14521P 4.30E-10 10080 600
H4H14525P 6.00E-10 8840 1490
H4H14528P 4.50E-10 7310 420
H4H14530P 8.50E-08 4200 520
H4H14532P2 4.30E-10 5740 300
H4H14536P2 3.60E-10 8960 330
H4H14539P2 3.00E-10 4910 300
항-GITR 대조군 Ab II-hIgG1 2.60E-10 13750 10240
아이소타입 대조군 Ab-hIgG4 　NB 750 650
요약하면, 이 실시예는 본 발명의 항-GITR 항체가 인간 GITR-발현 세포주에 대한 특이적이고 강력한 결합을 나타내는 것을 증명한다.
실시예 5. 항-GITR 항체는 Fc 감마 R 항체 고정의 존재 또는 부재시에 NF-κB/루시페라제 리포터 검정에서 부분적인 차단제 및 부분적인 활성화제이다
이 실시예에서, 항-GITR 항체가 Fc 감마 수용체 (Fc 감마 R)에 대한 항체 고정의 존재 또는 부재 하에 hGITR을 활성화하거나 hGITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단하는 능력을 루시페라제-기반 리포터 검정을 통해 평가하였다.
간단히 설명하면, hGITR 및 NF-κB-의존성 루시페라제 리포터가 안정적으로 통합된 Jurkat 세포주를 엔지니어링하였다 ((hGITR/Jurkat/NF-κBLuc). NF-κB 루시페라제 리포터를 Cignal Lenti 리포터 시스템 (SABiosciences)을 사용하여 Jurkat 세포에 도입하였다. hGITR을 발현하는 렌티바이러스를 렌티-X 렌티바이러스 발현 시스템 (Clontech)을 이용하여 HEK293/T17에서 생성시켰다. Jurkat/NF-κB-Luc 세포를 hGITR-발현 렌티바이러스로 폴리브렌-매개된 형질유도를 통해 형질유도하고 2주 동안 500 ug/ml G418에서 선택하였다. 항체 고정 연구를 위해, HEK293 세포를 상기에서 기술한 것과 같이, Fc 감마 RI-발현 렌티바이러스로 형질유도하였다.
먼저, Fc 감마 R 고정의 부재시에 (비-고정 생물학적 검정 포맷) 항-hGITR 항체의 활성화 및 차단 특성을 평가하였다. 대략 4x104개의 Jurkat/NF-κBLuc/hGITR 세포를 PDL 코팅된 96 웰 플레이트에서 OptiMEM + 0.5% FBS에서 밤새 (ON) 시딩하였다.
항체 활성화 능력을 측정하기 위하여, 세포를 6시간 동안 37℃에서, 0.5 pM 내지 100 nM 범위의 농도로 연속적으로 희석된 항 hGITR 항체 또는 hGITRL과 인큐베이션하였다. hGITRL 매개된 수용체 자극의 항체 차단을 평가하기 위하여, 세포를 30분 동안 연속적으로 희석된 항 hGITR 항체 (0.5 pM 내지 100 nM)와 사전-인큐베이션한 후, 불변 용량의 10 nM hGITRL과 6시간 동안 인큐베이션하였다.
다음에, Fc 감마 R 고정의 존재하에 (고정 생물학적 검정 포맷) 선택된 항-hGITR 항체의 활성화 및 차단 특성을 측정하였다. 상기와 유사하게, 2.5x104개의 Jurkat/NfκBLuc/hGITR 세포를 PDL 코팅딘 96 웰 플레이트에서 완전 성장 배지에 시딩하였다.
항체 활성화를 평가하기 위하여, 세포를 1시간 동안 37℃에서, 연속적으로 희석된 항-hGITR mAbs 또는 hGITRL (0.5 pM 내지 100 nM)로 사전-인큐베이션하였다. 그런 후, 1x104개의 hFc 감마 R1/HEK293 세포를 웰에 즉시 첨가하고 6시간 동안 인큐베이션하였다. 차단을 평가하기 위하여, hGITR/Jurkat/NfκBLuc 세포를 1시간 동안 연속적으로 희석된 항-hGITR 항체 (0.5 pM to 100 nM)와 사전-인큐베이션하였다. 1x104개의 hFcγR1/HEK293 세포를 웰에 첨가한 후 불변 용량의 10 nM hGITRL을 첨가하였다.
고정 및 비-고정 생물학적 검정 포맷 둘 다에 대해, 루시페라제 활성을 One glow 시약 (Promega)으로 측정하고 상대 광도 단위 (RLU)를 Victor 광도계 (Perkin Elmer)에서 측정하였다. EC50/IC50 값을 GraphPad Prism을 사용하여 12-점 바응 곡선에 대해 4-모수 로지스틱 방정식으로부터 측정하였다. 그 결과를 표 5 및 표 6에 요약한다. % 차단을 측정하기 위하여, 처리되지 않은 웰로부터의 배경 RLU (상대 광도 단위)를 처리된 웰로부터 빼고, % 차단을 다음 식을 따라 계산한다: [100 - (최대 용량에서의 항체 RLU/불변 리간드 용량 RLU)]*100]. % 활성화를 다음 식을 따라 계산한다: (표준화된 mAb RLU/최대 GITR 리간드 반응)*100; 표준화된 mAb RLU는 미처리된 웰로부터 RLU를 뺌으로써 측정된다. 평균 배수 활성화를 다음과 같이 계산한다: 최대 항체 용량에서의 RLU/미처리된 웰로부터의 배경 RLU.
Figure pct00001
NB = 차단 없음
NA = 활성화 없음
상기 표 5 및 하기 표 6에서 요약된 것과 같이, 테스트된 항체는 비-고정 및 고정 생물학적 검정 포맷에서 모두 부분적인 활성화 및 부분적인 차단 특성을 나타냈다. 비-고정 포맷에서, 항체는 0.4 nM 내지 2.5 nM 범위의 EC50으로 수용체 자극을 매개하였다. 여러 항체, 예컨대 H4H14475P 및 H4H14491P가 각각 70 및 60% 활성화를 나타내는, GITR 수용체의 강력한 활성화제였다. 대부분의 테스트된 항체는 hGITRL 매개된 수용체 자극의 차단을 또한 나타냈는데, 이때 IC50의 범위는 0.6 nM 내지 3.8 nM이었다. 여러 예시의 항체, 예컨대 H1H14512P 및 H4H14536P2가 각각 100% 및 90%의 강력한 차단 활성을 나타냈다. 가장 강력한 활성화제인 H4H14475P는 차단 검정에서 가장 적은 활성을 나타냈다 (% 차단: -2%).
Fc 감마 R 고정의 존재하에 항-GITR 항체의 차단 및 활성화 특성
항체 IC50 (nM) % 차단 EC50 (nM) 기준 신호를 넘는 활성화 배수
H1H14512P 0.10 64 0.02 7.0
H4H14475P 0.20 43 0.04 8.0
H4H14536P2 0.20 73 0.01 5.0
항-GITR 대조군 Ab I-mIgG1 0.20 60 0.10 6.0
항-GITR 대조군 Ab I- mIgG2a 0.01 74 0.20 5.0
항-GITR 대조군 Ab II-hIgG1 0.20 70 0.01 8.0
Fc 감마 R-고정 생물학적 검정 포맷으로 테스트된 선택된 항체는 또한 다양한 활성화 및 차단 특성을 나타냈다. 비-고정 포맷에서 가장 강력한 활성화제인 H4H14475P는 또한 고정 생물학적 검정에서 hGITR을 기준 신호를 넘어 8.0의 활성화 배수로 강력하게 활성화하였다. 비-고정 차단 포맷에서 강력한 차단제, 예컨대 H1H14512P 및 H4H14536P2 또한 고정 검정에서 강력한 차단을 나타냈다 (% 차단: 60% 및 70%).
요약하면, 결과들은 본 발명의 항-GITR 항체가 엔지니어링된 생물학적 검정에서 Fc 감마 R 고정의 부재시에 강력한 GITR 활성화 특성을 나타낼 뿐만 아니라 GITRL 매개된 수용체 자극을 차단하는 능력을 나타내는 것을 증명한다. 예시의 항체, 예컨대 H4H14775P 및 H4H1536P2는 또한, Fc 감마 R 고정의 존재하에, 각각 그것들의 활성화 및 차단 특성을 유지한다.
실시예 6. 항-GITR 항체 H4H14536P2는 Fc 감마 R 고정의 존재 및 부재시에 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정에서 강력한 활성을 증명한다
상기에서 기술된 것과 같이, 항-GITR 항체를 고정 Fc 감마 수용체 (Fc 감마 R)의 존재 또는 부재시에 hGITR을 활성화하는 능력에 대해 엔지니어링된 생물학적 검정으로 테스트하였다. 이 실시예에서, hGITR 활성화에 대한 항체 고정의 영향을 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 일차 생물학적 검정으로 평가하였다. 인간 CD4+ T-세포 시스템은 GITR 복사물 수가 내인성 수준에 있는 반면, 엔지니어링된 시스템은 더 높은 GITR 복사물 수를 가지는 세포를 활용한다는 장점을 가진다.
먼저, 항-GITR 항체를 플레이트-결합된 항-CD3의 존재하에 CD4+ T-세포 증식 능력에 대해 테스트하였다. 간단히 설명하면, 인간 CD4+ T 세포를 건강한 공여자 백혈구로부터 인간 CD4+ T 세포 풍부화 칵테일 (Stemcell Technologies)을 사용하여 분리하였다. 나이브 T 세포를 CD45RO+ 세포를 MACS (Miltenyi Biotech)에 의해 고갈시킴으로써 추가로 풍부화하였다. 대략 5x104개의 T 세포를 최적량에 미치지 못하는 양의 항-CD3 mAb OKT3 (30 ng/mL) 및 적정량 (titrated amounts)의 항-GITR 항체 또는 대조군으로 사전-코팅된 96-웰 U-자형 바닥의 폴리스티렌 플레이트 위에 플레이팅하였다. 자극 후 3일 후에, 삼중수소 티미딘 (웰당 1 μCi, Perkin Elmer Health Sciences NET027001)을 각 마이크로웰에 첨가하고 18시간 동안 펄스하였다(pulsed). 세포를 필터 플레이트 (Unifilter-96 GF/C 6005174) 상에 필터메이트 수득기 (Filtermate Harvester) (Perkin Elmer Health Sciences D961962)를 사용하여 수득하였다. 신틸레이션 액 (Perkin Elmer Health Sciences Microscint20 6013621)을 필터 플레이트에 첨가하고 방사능 수를 플레이트 판독기 (Perkin Elmer Health Sciences Topcount NXT)를 사용하여 측정하였다. 10.6 nM의 항체 농도에서 평균 배수 활성화로 제공되는, 대조군에 비교한 T-세포 증식을 표 7에 나타낸다. 이 검정 포맷에서, 10.6 nM은 T-세포 증식이 용량 반응 곡선에서 안정기에 도달한 지점을 나타냈다.
플레이트-결합된 항-CD3 Ab의 존재하에 10.6 nM의 플레이트-결합된 항-GITR의 T-세포 증식 활성 (배수 활성화)
　 공여자 평균 배수 활성화
항체 1 2 3 4 5 6 7 8
H4H14536P2 3 24 24 25 24 47 26 16 23
H4H14508P 10 4 4 7 4 11 3 2 5
H4H14525P 6 1 1 2 1 3 2 1 2
H4H14469P 3 12 12 15 12 17 11 11 12
H4H14532P2 2 6 6 12 6 19 7 2 8
H4H14470P 0 3 3 4 3 6 4 1 3
H4H14475P 0 2 2 2 2 12 1 0 3
H4H14528P 2 8 8 4 8 31 5 4 8
H4H14539P2 2 12 12 13 12 39 11 6 13
H4H14516P 1 4 4 12 4 14 4 1 5
H4H14521P 1 4 4 5 4 12 3 2 4
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
항-GITR 대조군 Ab 1-mIgG1 6 23 23 40 23 66 25 11 27
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
아이소타입 대조군 1 1 1 1 1 1 1 1 1
표 7에서 결과들이 나타내는 것과 같이, 테스트된 항-GITR 항체는 플레이트-결합된 항-CD3의 존재하에 플레이트-결합될 때 T-세포 증식 능력을 증명하였다. 항-GITR 대조군 Ab I은 아이소타입 대조군보다 27배 높은 증식 활성을 증명하였다. 본 발명의 대부분의 항-GITR 항체는 아이소타입 대조군보다 2 내지 8배 높은 활성화를 나타냈고, 여러 예시 항체, H4H14469P, H4H14539P2, 및 H4H14536P2는 각각 대조군보다 12, 13 및 23배 높은 활성화를 증명하였다. 요약하면, 결과들은 테스트된 항-GITR 항체들이 이 고전 포맷에서 T-세포 증식 활성을 증명한 것을 증명한다.
다음에, 추가적인 검정 포맷을 사용하여 세포-표면 결합된 Fc 감마 R의 존재 또는 부재시에 T-세포를 활성화하는 항-GITR 항체 의 능력을 테스트하였다.
Fc 감마 R1 고정의 존재 하에 T 세포를 활성화하는 항-GITR 항체 능력을 평가하기 위하여, HEK293 세포를 상기에서 기술한 것과 같이, 고친화도 hFc 감마 R1 수용체를 발현하도록 엔지니어링하였다. HEK293/ Fc 감마 RI 세포를 50 ug/mL의 미토마이신 C로 30분 동안 37℃에서 처리하여 증식을 억제하였다. 후속되는 세척으로 미량의 미토마이신 C를 제거한 후, 세포를 300 ng/mL의 항-CD3 항체 OKT3으로 코팅하여 T 세포 활성화를 자극하였다. HEK293/Fc 감마 RI 세포를 인간 나이브 CD4+ T 세포와 1:2 비율로 공동 배양하고 적정량의 항-GITR 항체 또는 대조군을 공동 배양 배지에 첨가하였다.
T 세포 증식을 삼중 수소 티미딘 통합 수준을 측정함으로써 평가하였다. 자극 후 72시간 후에, 삼중 수소 티미딘 (웰당 0.5 μCi, Perkin Elmer Health Sciences)을 각 마이크로웰에 추가로 18시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 세포를 필터 플레이트 (Unifilter-96 GF/C 6005174) 상에 필터메이트 수득기 (Perkin Elmer Health Sciences D961962)를 사용하여 수득하였다. 신틸레이션 액 (Perkin Elmer Health Sciences Microscint20 6013621)을 필터 플레이트에 첨가하고 방사능 수를 플레이트 판독기 (Perkin Elmer Health Sciences Topcount NXT)를 사용하여 측정하였다. 33 nM의 항체 농도에서 평균 배수 활성화로 제공되는, 대조군에 비교한 T-세포 증식을 표 8에 나타낸다. 이 검정 포맷에서, 33 nM은 T-세포 증식이 용량 반응 곡선에서 안정기에 도달한 지점을 나타냈다.
Fc 감마 R 고정의 존재하에 33 nM에서의 항-GITR 항체의 T-세포 증식 활성 (배수 활성화)
항체 공여자 평균 배수 활성화
1 2 3 4 5
H4H14536P2 1.3 6.3 1.5 2.7 15.7 5.5
H4H14508P 1.0 0.7 1.1 1.8 1.3 1.2
H4H14525P 1.2 0.8 1.0 1.5 1.5 1.2
H4H14469P 0.70 1.0 0.9 1.5 1.5 1.1
H4H14532P2 0.80 0.9 1.0 1.7 2.1 1.3
H4H14470P 1.8 1.0 1.4 1.5 2.0 1.5
H4H14475P 1.0 1.3 1.3 1.6 1.5 1.3
H4H14528P 0.9 1.5 1.1 1.9 1.7 1.4
H4H14539P2 0.9 0.7 1.1 1.5 1.5 1.1
H4H14516P 1.2 0.9 1.2 1.3 1.1 1.1
H4H14521P 1.5 1.1 1.1 1.7 0.9 1.2
H4H14476P 0.6 0.20 0.8 0.8 0.1 0.5
　 　 　 　 　 　 　
항-GITR 대조군 mAbs 　 　 　 　 　 　
대조군 I-mIgG1 2.8 2.8 1.4 1.1 1.7 2.0
대조군 I-mIgG2a 1.1 0.1 1.0 1.0 1.2 1.3
대조군 II-hIgG1 0.1 0.6 1.3 0.2 1.2 0.7
　 　 　 　 　 　 　
아이소타입 대조군-hIgG4 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Fc 감마 R 고정의 존재 하에 33 nM에서의 항-GITR 항체의 T-세포 증식 활성 (EC 50 )
항체 공여자 평균 EC 50 (nM)
1 2 3 4 5
H4H14536P2 1.2 0.5 1.3 11.2 1.6 3.2
대조군 I-mIgG1 37.2 NA 42.9 3.5 52.7 34.1
표 8에서 결과들이 요약된 것과 같이, 여러 항체는 1 내지 2배의 범위의 수준으로 대조군보다 높은 활성화를 나타냈다. 그러나, 한 개의 예시 항체, H4H14536P2는 고정 환경에서 강력한 T-세포 증식 활성을 증명하였다. 5.5의 평균 배수 활성화로, H4H14536P2는 항-GITR 비교 항체 (평균 배수 활성화 범위: 0.2 내지 2.0)와 비교하여 더 큰 T-세포 활성화를 자극하였다. H4H14536P2는 가장 강력한 항-GITR 대조군 Ab인, 대조군 I-mIgG에 대한 34.1 nM과 비교하여 3.2 nM의 T-세포 증식의 평균 EC50을 나타냈다 (표 9). 나아가, 이 검정 포맷에서, 상기 기술된 엔지니어링된 생물학적 검정에서 강력한 활성화제인 H4H14475P는 이 일차 생물학적 검정 환경에서 적당한 증식 활성을 증명하였다.
다음에, 항체들을 Fc 감마 R 고정의 부재시에 T-세포 증식 활성에 대해 테스트하였다. 인간 CD4+ T 세포를 상기 기술한 것과 같이 분리하고, 30 ng/mL의 항-CD3 항체, OKT3으로 사전 코팅된 96-웰 U-자형 바닥 폴리스티렌 플레이트에 플레이팅하였다. 상기와 유사하게, 적정 농도의 항-GITR 항체 또는 대조군을 배양 배지에 첨가하였다. T 세포 증식을 삼중 수소 티미딘 통합에 의해 측정하였다. 22 nM 항체 농도에서 4개의 공여자에서 관찰된 T-세포 증식을 표 10에서 아이소타입 대조군에 비교한 배수 활성화로서 표시한다. H4H14536P2의 EC50 (nM)은 표 11에 나타낸다.
고정 검정 포맷에서 관찰된 것과 같이, H4H14536P2는 또한 비-고정 포맷에서 22 nM에서 강력한 T 세포 증식 활성을 나타냈다. H4H14536P2는 11.0의 평균 배수 활성화 및 8.3 nM의 EC50으로 T 세포를 활성화하였다. 이 검정 포맷에서, 대조군 항-GITR 항체 I은 T-세포 증식 능력을 나타내지 않았다.
Fc 감마 R 고정의 부재시에 22 nM에서의 항-GITR 항체의 T-세포 증식 활성 (배수 활성화)
　 공여자 평균 배수 활성화
항체 1 2 3 4
H4H14536P2 6.2 4.2 10.1 23.4 11.0
H4H14508P 0.7 0.9 0.9 1.4 1.0
H4H14525P 0.7 1.0 0.9 1.0 0.9
H4H14469P 0.9 0.8 1.0 0.9 0.9
H4H14532P2 0.7 0.8 1.0 1.1 0.9
H4H14470P 0.7 0.9 1.0 1.7 1.1
H4H14475P 0.7 1.1 0.8 0.8 0.9
H4H14528P 0.6 0.8 0.9 1.0 0.8
H4H14539P2 0.5 0.8 1.1 0.8 0.8
H4H14516P 0.7 1.2 1.0 0.9 0.9
H4H14521P 0.5 1.2 0.8 1.0 0.9
H4H14476P 0.7 0.9 0.9 0.8 0.8
　 　 　 　 　 　
항-GITR 대조군 Ab 　 　 　 　 　
대조군 I- mIgG1 0.7 0.8 1.0 1.0 0.9
　 　 　 　 　 　
아이소타입 대조군 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H4H14536P2의 EC50 (nM)
공여자: 1 2 3 4 평균
H4H14536P2 EC 50 (nM): 12.2 6.4 9.0 5.7 8.3
요약하면, 이 실시예는 한 개의 예시의 항-GITR 항체, H4H14536P2가 hFc 감마 R1 고정의 존재 또는 부재시에 강력한 T-세포 증식 활성을 나타내는 한편, 항-GITR 비교용 항체 대조군 I은 비-고정 환경에서 T-세포 증식 활성을 나타내지 않았음을 증명한다. 그러므로, H4H14536P2가 hFc 감마 R1 고정의 부재시에 T 세포를 활성화하는 능력은 고유한 특성이고, 항체가 활성을 보유하기 위해 생체내에서 Fc 감마 수용체에 대한 내인성 IgG 결합과 경합하지 않을 수 있음을 의미한다. H4H14536P2의 런 고유한 특성은 치료 환경에 장점을 부여할 수 있다.
실시예 7. 항-PD1 항체와 조합된 항-GITR 항체의 투여는 대조군 종양을 상조적으로 제어하고 근절한다
항-PD1 항체와 조합된 항-GITR 항체의 투여가 종양 성장에 미치는 영향의 평가를 다음의 방법을 사용하여 수행하였다. 평가 결과를 하기에 요약한다.
종양 이식, 치료 양생법 및 성장 측정
MC38 대장암 세포 (ATCC로부터 얻음)를 C57BL/6 마우스에 피하 이식하였다 (3x105 세포/마우스) (0일로 규정함). 제 6일에 (즉 종양 이식 후 6일 후에), 마우스를 4 그룹으로 나누고 (그룹당 5마리 마우스) 각 그룹을 (1) 래트 IgG2a (2A3, Bio X 세포, Cat.# BE0089) (아이소타입 대조군) + 래트 IgG2b (LTF2, Bio X 세포, Cat.# BE0090) (아이소타입 대조군) (2) 항-GITR 단클론성 항체 DTA1 (래트 항-마우스 GITR, Bio X 세포, Cat.# BE0063) + 래트 IgG2a (대조군) (3) 항-PD-1 단클론성 항체 RPM1-14 (래트 항-마우스 PD-1, Bio X 세포, Cat.# BE0146) + 래트 IgG2b (대조군) 또는 (4) 항-GITR 항체 DTA1+ 항-PD-1 항체 RPM1-14로 복강내 (IP) 처리하였다. 항체 주사(들)을 그 후, 제 13일에 투여하였다. 항체 치료를 5 mg/kg의 각 항체로 투여하였다. 종양을 2차원적으로 (길이 x 높이) 측정하고 종양 부피를 계산하였다 (길이 x 폭2 x 0.5). 종양이 지정된 종양 종점 (종양 부피 > 2000mm3 또는 종양 미란)에 도달하였을 때 마우스를 안락사시켰다.
종양 재도전 평가
80일 동안 종양이 없는 채로 유지된, 항-PD-1 항체와 항-GITR 항체의 조합으로 처리된 마우스를, 우측 옆구리에 3 x 105개의 합성 종양 (MC38)으로, 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105개의 동종 이계의 (B16F10.9) 종양 세포주 (흑색종 세포주, ATCC)로 재도전하였다. 종양을 상기 기술된 것과 같이 모니터링하였다.
항체 고갈 실험
마우스를 종양 도전 전 하루 전에 시작하고, 총 8회 용량에 대해 주 2회 제공하는 방식으로 상이한 고갈 mAb (항-CD4, 항-CD8, 항-CD25)를 주사한 마우스를 조합 치료법으로 또는 아이소타입 대조군 IgG로 치료하였다. 고갈 효율을 말초 혈액 샘플의 FACS 분석에 의하여 확인하였다.
종양내 림프구들의 유동 세포분석 (FACS) 분석
마우스들을 상기 기술한 것과 같이 치료하였다. 항체 치료 후 5일 후에, 종양 및 비장을 수집하였다. 종양을 가위로 잘게 다지고 리버라제(Liberase) TL/DNAse I 혼합물을 포함한 단일 세포 현탁액에 분리하였다. 비장을 gentleMACS Octo 분리기로 분리하였다. 세포를 마우스 CD45, CD3, CD4, CD8, CD25 및 FoxP3에 대한 FACS 항체의 패널들로, 뿐만 아니라 활성호 K마커 (PD1, GITR, Ki67, CD160, CTLA4, ICOS, TIM3, LAG3, KLRG1 및 CD44)로 염색하였다. 세포를 BD Fortessa X20 또는 LSR II 상에 획득하고 FlowJo 소프트웨어에 의해 분석하였다.
항-마우스 PD1 항체와 조합된 항-마우스 GITR 항체의 투여는 MC38 포함 마우스에서 상조적으로 종양 퇴행을 유도하고 장기간 종양 차도를 제공한다
상기 기술된 방법에서, 피하 MC38 종양의 대조군에서 항-마우스 PD-1 항체 (클론 RMP1-14, Bio X 세포, Cat.# BE0146)와 조합된 항-마우스 GITR 항체 (클론 DTA-1, Bio X 세포, Cat.# BE0063)의 투여 효능을 평가하였다. 도 1 및 표 12 및 13에서 나타난 것과 같이, PD1 봉쇄 및 항-GITR (DTA-1) 항체의 조합 치료는 항-PD-1 또는 항-GITR mAb 단독 또는 아이소타입 대조군 치료된 마우스와 비교하여, MC38 종양 포함 마우스에서 종양 퇴행을 유의미하게 유도하였다. 나아가, 조합 요법으로 치료된 마우스들은, 100%의 마우스가 120일 동안 종양이 없는 채로 유지된 바, 장기간 종양 차도를 나타냈다 (도 2, 표 14, 15).
항-GITR 및/또는 항-PD-1 Ab 치료 후 각각의 치료 그룹 (mm 3 ± SEM) 및 종양 유리 마우스에 대한 평균 종양 부피
종양 부피 (mm3) 종양 유리 마우스
평균 (SEM)
치료 그룹 제 10일 제 13일 제 17일 제 19일 제 21일 제 21일
아이소타입 (래트 IgG2a + 래트 IgG2b) 196 (44) 232 (46) 802 (869) NA NA 0/5
항-PD1 + 래트 IgG2b 181 (37) 259 (103) 551 (199) 880 (335) 1550 (616) 0/5
항-GITR + 래트 IgG2a 172 (9) 262 (72) 407 (112) 741(269) 882 (307) 0/5
항-GITR + 항-PD1 130 (29) 41 (13) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 5/5
항-GITR 및/또는 항-PD-1 Ab 치료 후 3개의 독립적인 실험의 종양 유리 마우스의 요약
종양 유리 마우스
치료 그룹 제 21일
아이소타입 (래트 IgG2a + 래트 IgG2b) 0/15
항-PD1 + 래트 IgG2b 0/15
항-GITR + 래트 IgG2a 1/15
항-GITR + 항-PD1 10/15
생존 비율 (백분율)
경과일 아이소타입 항-PD-1 항-GITR 항-PD-1 + 항-GITR
0 100 100 100 100
17 80 　 　 　
21 　 40 　 　
24 0 　 60 　
26 　 　 20 　
35 　 20 　 　
52 　 0 0 　
123 　 　 　 100
항-마우스 PD1 항체와 조합된 항-마우스 GITR 항체의 투여는 종양/항원-특이적 면역학적 메모리 반응을 유도한다
항-PD-1 및 항-GITR 항체의 조합된 투여로 치료된 마우스가 종양/항원-특이적 메모리 반응을 나타내는 지를 측정하기 위하여, 생존한 종양-유리 마우스들을 우측 옆구리에 3 x 105개의 유전적 동계의 MC38 결장 암종 세포로 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105개의 동종이계 흑색종 세포주 B16F10.9로 재도전하였다. MC38 종양은 항-PD-1 및 항-GITR 항체 조합으로 치료된 마우스에서 성장하지 않았지만, 동일한 종양이 나이브 대조군 마우스 (어떠한 사전 치료가 없음)에서 성장한 것으로 나타났다 (도 3). 대조적으로, 동종이계 종양 (흑색종)은 두 그룹에서 성장하지 않았고, 항-PD-1 및 항 GITR 항체의 조합된 투여가 동일한 유형의 종양으로의 2차 도전을 제어할 수 있는 종양-항원 특이적 면역학적 메모리 반응을 유도하였음을 증명하였다.
면역 집단 연구
마우스들을 항-PD-1 항체 및 항-GITR 항체 조합 치료 전에 CD4, CD8 및 CD25 고갈 mAb로 치료하였다. CD8+ 세포의 고갈이 완전히 항-종양 효과를 없앤 한편 (MC38 종양), CD4 또는 CD25 T 세포의 고갈은 부분적인 억제를 보인 것으로 나타났다 (도 4, 표 15). 그러므로, MC38 종양에서 조합 치료의 항-종양 효과는 CD8+ T 세포에 대부분 의존성인 것으로 나타난다.
종양 침윤성 림프구 (TIL)에 대한 항-PD-1 항체 및 항-GITR 항체 조합 치료의 영향을 평가하였다. 조합 치료는 단일-요법 치료 (항-PD-1 또는 항-GITR) 또는 아이소타입 대조군 (도 5)과 비교하여 CD8/Treg 비율에 상당한 증가를 유도하였다. CD4/Treg 비율에 대한 조합 치료의 영향은 덜 현저한 것으로 나타났다. 항-PD-1 항체 및 항-GITR 항체 조합 치료는 종양 내 Treg의 백분율을 감소시켰지만 CD8 T 세포는 증가하였다 (도 6). 추가로, 항-PD-1 치료는 단독으로 세포 수의 팽창을 유도하였지만, 항-PD-1/항-GITR 조합 치료는 아이소타입 대조군 치료된 마우스와 비교하여 그것을 상당히 감소시켰다.
CD4, CD8, 또는 CD25 고갈 후의 항-종양 효능
종양 크기 (mm 3 )
평균 (SEM)
면역요법 고갈 항체 Day 8 Day 12 Day 16
아이소타입 대조군 아이소타입 대조군 55 (12) 161 (60) 555 (224)
항-CD4 48 (17) 60 (22) 135 (71)
항-CD8 49 (17) 176 (431) 825 (431)
항-CD25 59 (16) 61 (21) 182 (68)
항-GITR + 항-PD1 아이소타입 대조군 43 (19) 26 (16) 11 (7)
항-CD4 68 (21) 50 (32) 123 (122)
항-CD8 67 (23) 222 (86) 1041 (543)
항-CD25 14 (6) 35 (30) 80 (64)
항-마우스 PD1 항체와 조합된 항-인간 GITR 항체의 투여는 MC38 포함 GITR/GITRL 인간화 마우스에서 유의미하게 종양 퇴행을 유도하고 장기간 종양 차도를 제공한다
피하 MC38 종양의 대조군에서 항-마우스 PD-1 항체 (클론 RMP1-14 Bio X 세포, Cat.# BE0146)와 조합하여 항-인간 GITR 항체 (H2aM14536P2)를 투여하는 것의 효능을 GITR/GITRL 인간화 마우스에서 평가하였다. 항-마우스 PD-1 차단은, 평균 종양 성장 곡선에서 나타난 것과 같이, 항-PD1 (1/7) 또는 항-GITR (1/7) mAb 단독 또는 아이소타입 대조군 (0/7) 치료된 마우스와 비교하여, MC38 종양 포함 마우스에서 항-인간 GITR 항체와 상조적이었고 유의미하게 종양 퇴행을 유도한 것으로 나타났다 (4/6마리 마우스) (도 7, 표 16). 추가로, 조합 치료법으로 치료된 마우스들은, 아이소타입 대조군에 대해 0%이고 항-PD-1 또는 항-GITR 치료 그룹에 대해 10%인 것과 비교하여, 제 50일에 60%를 넘는 마우스가 종양이 없는 채로 유지된 바, 장기간 종양 차도를 나타냈다 (도 8, 표 16).
항-인간 GITR 항체는 종양내 CD8/T reg 비율을 증가시킨다
종양내 및 비장의 T 세포 집단에 대한 항-인간 GITR 항체의 영향을 평가하였다. 항-인간 GITR 항체 H2aM14536P2 및 H1H14536P2를 평가하였다. 두 항-인간 GITR 항체 아이소타입 (mIg2a 및 hIgG1)이 종양내 CD8/Treg 비율의 유의미한 증가를 유도한 것으로 나타났다 (도 9). 동일한 치료는 말초 비장 T 세포 하위세트에 대해 영향을 나타내지 않았다. 인간 IgG1 및 마우스 IgG2a 아이소타입 IgG를 대조군에 대한 검정에 사용하였다.
항-인간 GITR 항체 및 항-마우스 PD1 항체 치료에 의해 매개된 항-종양 효능
종양 크기 (mm 3 )
평균 (SEM)		 종양 유리 마우스
치료 그룹 제 9일 제 13일 제 16일 제 19일 제 51일
아이소타입 대조군 146 (26) 248 (53) 402 (97) 838 (205) 0/7 (0%)
항-mPD1 120 (23) 163 (50) 275 (103) 617 (257) 1/7 (14%)
H2aM14536P2 134 (28) 162 (51) 194 (51) 346 (87) 1/7 (14%)
H2aH14536P2 +항-PD-1 122 (18) 90 (54) 114 (88) 192 (165) 4/6 (67%)
항-인간 PD1 항체와 조합된 항-마우스 GITR 항체의 투여는 MC38 포함 PD1/PDL1 인간화 마우스에서 유의미하게 종양 퇴행을 유도하고 장기간 종양 차도를 제공한다
피하 MC38 종양의 대조군에서 항-인간 PD-1 항체 (REGN2810, 또한 미국 특허 공보 2015/0203579에서 개시된 것과 같이 H4H7798N으로도 알려져 있음)와 조합하여 항-마우스 GITR 항체 (DTA-1)를 투여하는 것의 효능을 PD1/PDL1 인간화 마우스에서 평가하였다. 항-인간 PD-1 차단은, 평균 종양 성장 곡선에서 나타난 것과 같이, 항 PD1 또는 항 GITR mAb 단독 또는 아이소타입 대조군 치료된 마우스와 비교하여, MC38 종양 포함 마우스에서 항-마우스 GITR 항체와 상조적이었고 종양 성장 지연을 유도한 것으로 나타났다 (도 10, 표 17). 추가로, 조합 치료법으로 치료된 마우스들은, 아이소타입 대조군, 항-PD-1 또는 항-GITR 치료 그룹에 대해 0%인 것과 비교하여, 제 45일에 40%를 넘는 마우스가 종양이 없는 채로 유지된 바, 장기간 종양 차도를 나타냈다 (도 11).
항-마우스 GITR + 항-인간 PD1 Ab 치료에 의해 매개된 항-종양 효능
종양 크기 (mm3)
평균 (SEM)
치료 그룹 제 13일 제 17일 제 20일 제 24일
아이소타입 대조군 301 (38) 742 (81) 1392 (104) 2790 (366)
항-PD1(REGN2810) 184 (21) 354 (143) 589 (201) 937 (324)
항-GITR 362 (99) 713 (360) 1199 (563) NA
항-GITR + 항-PD-1 212 (117) 120 (60) 127 (62) 167 (98)
실시예 8: RNA 추출 및 분석
단일-세포 분류 RNA-서열 분석
종양 도전 후 제 8일 및 11일에, 종양의 단일 세포 현탁액을 마우스 종양 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, DE)에 의해 제조하고 비장을 gentleMACSTM Octo 분리기 (Miltenyi Biotec)로 분리하였다. 동일한 치료 그룹으로부터의 종양 및 비장을 모으고 생존할 수 있는 CD8+ T 세포를 FACS에 의해 분류하였다. FACS 분류된 T 세포를 C1 세포 현탁 시약 (Fluidigm, South San Francisco, CA)과 혼합한 후 5- 내지 10-μm의 C1 통합 유체 회로(Integrated Fluidic Circuit) (IFC; Fluidigm) 위에 로딩하였다. LIVE/DEAD 염색 용액을, 2.5 μL의 에티듐 호모다이머-1 및 0.625 μL 칼세인 AM (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 1.25 mL C1 세포 세척 완충액 (Fluidigm)에 첨가함으로써 제조하고 그 중 20 μL를 C1 IFC 위에 로딩하였다. 각각의 포획 부위를 Zeiss 현미경 하에서 명시야, GFP, 및 세포 더블렛(doublets) 및 생존성에 대해 Texas Red 채널에서 조심스럽게 조사하였다. 세포 용해, 역전사, 및 cDNA 증폭을 C1 단일-세포 Auto Prep IFC에 대해, 제조사에 의해 명시된 대로 (프로토콜 100-7168 E1) 수행하였다. SMARTerTM Ultra Low RNA 키트 (Clontech, Mountain View, CA)를 단일 세포로부터의 cDNA 합성에 사용하였다. Illumina NGS 라이브러리를 Nextera XT DNA 샘플 제조 키트 (Illumina)를 사용하여, 제조사의 권고 (프로토콜 100-7168 E1)를 따라 구성하였다. 총 2,222개의 단일 세포를 Illumina NextSeq (Illumina, San Diego, CA) 상에서, 다중화된 단일-판독 작동에 의해 75 사이클을 사용하여 서열화하였다. 가공하지 않은 서열 데이터 (BCL 파일)를 Illumina Casava 1.8.2를 통해 FASTQ 포맷으로 변환하였다. 판독을 그것들의 바코드를 기준으로 암호를 풀었다. 판독 품질을 FastQC (www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하여 평가하였다.
실시예 9: 조합 치료에서 CD226 및 TIGIT의 역할
CD225의 유전자 비활성화 또는 약물학적 억제는 일부 실험에서 항-GITR / 항-PD1 조합 치료에 의해 매개된 종양 퇴행을 반전시켰지만, 다른 TNF-수용체 또는 B7 슈퍼패밀리 구성원들의 억제는 영향을 나타내지 않았다.
CD226 차단 실험
0.5 mg의 항-CD226 (10E5, eBioscience, San Diego, CA) 또는 래트 IgG2b 아이소타입 대조군 IgG (LTF2, Bio X 세포, West Lebanon, NH)를 종양 도전 후 제 5일에 및 면역요법하기 하루 전에 복강내로 (i.p.) 주사하였다. 수직의 종양 직경을 디지털 캘리퍼스 (VWR, Radnor, PA)를 사용하여 주 2 내지 3회 대략 측정하였다. 부피를 식 L × W × 0.5를 사용하여 계산하는데, 식에서 L은 가장 긴 치수이고 W는 그것과 직각의 수치이다. 생존율의 차이를 각 그룹에 대해 Kaplan-Meier 방법에 의해 측정하고, 전체 P 값을 로그-순위 테스트에 의해 PRISM 버전 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)에 의한 생존율 분석을 사용하여 측정하였다. 사건은, 이환율을 최소화하기 위해 종양 덩어리가 최대 종양 부피에서 2000 mm3의 프로토콜-명시된 크기에 도달했을 때 사망으로서 규정하였다.
도 12 및 13에서 나타낸 것과 같이, MC38 종양 포함 마우스를 항-GITR + 항-PD-1 또는 아이소타입 Ab로의 면역치료법 전에 CD226 차단 Ab 또는 아이소타입 Ab (대조군 IgG) 1d 중 어느 하나로 치료하였다. 평균 종양 성장 곡선 (도 12) 및 생존율 곡선 (도 13)을 나타낸다. 데이터는 3회의 실험을 나타내고, n은 그룹당 5마리 마우스이며, 생존율 분석은 로그-순위 테스트에 의해 이루어진다.
야생형 또는 TIGIT KO 마우스를 MC38 종양으로 도전하고, 항-CD226 또는 대조군 IgG로 치료하고 아이소타입 대조군 (도 14) 또는 항-GITR+항-PD-1 조합 치료법 (도 15) 중 하나를 받게 하였다. 제시한 데이터는 2개의 실험을 나타내는 평균 종양 성장 곡선이다 (그룹당 n = 4 내지 5마리 마우스).
CD226 차단 mAb를 사용하여, CD226을 통한 동시 자극성 신호전달은 조합 치료에 의해 매개된 항-종양 면역력에 필요한 것으로 나타났다. 나아가, CD226 신호전달 경로가 TIGIT KO 마우스에서 향상된 종양 감시에 필요하였다 (도 14 및 15).
조합 치료 샘플로부터의 CD8+ T 세포에서 RNA 사인
조합 치료 샘플로부터 클론적으로 팽창된 CD8+ T 세포 (제 11일에 수득된 종양)에서 고유한 유전자 사인을 확인하기 위하여, 상이한 치료 그룹을 교차하는 종합적인 비교를 수행하였다. 조합 치료법으로부터 클론적으로 팽창된 CD8+ T 세포에서 상향조절된 유전자를 아이소타입 치료로부터의 CD8+ T 세포 또는 조합 치료로 팽창되지 않은 CD8+ T 세포의 상향조절된 유전자들과 비교하였다. 열 지도화 분석은 비교 내에서 30개의 유전자 중복을 확인하였다. 2배와 같은 (p < 0.01) RNA 사인 변화를 종양의 항-GITR/항-PD1 조합 치료 후에 30개의 유전자에 대한 팽창된 CD8 T 세포 집단 내에서 관찰하였다. 그 30개의 유전자로는 Id2, S100a11, Ndufb3, Serinc3, Ctsd, S100a4, Ppp1ca, Lbr, Peli1, Lcp2, Ube2h, Cd226, Mapkapk3, Racgap1, Arf3, Mki67, Ergic2, Azi2, Dync1i2, Sik1, Pde4d, Ppp3cc, Nek7, Emc4, Vav1, Dock10, Tmem173, Fam3c, Ppp1cc, 및 Glud1을 들 수 있다.
다음에 모두 5개의 그룹 (즉 (i) 아이소타입 치료, (ii) 항-GITR 팽창된 CD8, (iii) 항-GITR/항-PD1 조합 팽창된 CD8, (iv) 항-PD1 팽창된 CD8, 및 (v) 항-GITR/항-PD1 조합 비-팽창 CD8) 전체에서 4-방식 비교를 단일요법 치료에 대비한 조합 치료법시에 특이적으로 조절된 유전자들을 확인하기 위하여 수행하였다. 2개의 중복하는 상향조절된 유전자 (p < 0.01, 발현의 2배 변화와 같음)를 4-방식 분석으로 확인하였다. 항-종양 반응에서 중요한 역할을 하는 동시자극성 분자인 CD226을 상이한 비교 쌍 전체에서 공유된 두 개의 유전자 중 하나로서 확인하였다. 치료 그룹들 (즉 (i) 아이소타입, (ii) 항-GITR, (iii) 항-PD1, 및 (iv) 항-GITR/항-PD1 조합) 전체에서 종양내 CD8+ T 세포의 상이한 하위세트 ((a) 총, (b) 클론적으로 팽창된, 또는 (c) 비-팽창)의 발현 분석은 CD226 mRNA 수준이 클론적으로 팽창된 T 세포에 대한 조합 치료에 의해 유의미하게 증가된 한편 (배수 변화 = 10.7), 이런 차이는 벌크에서 (배수 변화 = 3.5) 및 비-팽창 CD8+ T 세포에서 (유의미하지 않음) 희석되었다. 추가로, CD226 mRNA 수준은 항-PD-1 (배수 변화 = 6.5) 및 항-GITR (배수 변화 = 9.2)과 비교하여 클론적으로 팽창된 CD8 T 세포에 대한 조합 치료에 의해 유의미하게 증가되었다 (도 16).
PD1과 CD226 사이의 회합
다음에 PD1 및 CD226 분자들 사이의 잠재적인 회합을 조사하였다. CD226이 PD1-Shp2 복합체에 의한 탈인산화에 대한 표적인지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 세포-유리 큰 단일층 소포 (LUV) 시스템에서 T 세포 신호전달에 포함된 상이한 구성요소들 (즉, CD3, CD226, 시토졸성 티로신 키나아제 Lck, Zap70, SLP76 52, 및 PI3K (p85a))을 복원하였다. LUV에 대한 PD-1 적정에 대한 반응으로 각 구성요소의 민감성을 포스포티로신 (pY) 면역블롯팅에 의해 측정하였다 (도 17). 본 발명자들은 TCR/CD3ζ이 PD-1-Shp2에 의한 탈인산화의 표적이 아니었던 반면, CD226이 치료 후 30분 후에 용량 의존성 방식으로 PD-1-Shp2에 의해 효과적으로 탈인산화되었다고 확인하였다 (도 17). 이 데이터는 PD-1과 CD226 사이의 회합을 증명하였다.
다음에, PD-1 억제와 CD226 발현 사이의 관계를 임상 환경에서 조사하였다. RNA-서열 분석을 PD-1 표적화된 치료 전 및 후의 43명의 진전된 암 환자들로부터 수집한 종양 생검들에 대해 수행하였다. CD226 발현은 암 환자에서 항-hPD-1 치료의 2회 용량 후에 유의미하게 증가하였다 (도 22). 추가로, The Cancer Genome Atlas (TCGA)로부터의 임상 데이터를, CD226 발현 수준이 전체 T 세포 활성화 강도와 상관이 있고 암 환자에서 더 나은 예후를 예측할 수 잇는지를 조사하기 위하여 심층분석하였다. 실제로, 높은 기준선 CD226 발현을 나타낸 환자들은 평가된 20가지의 상이한 유형의 암 (피부의 흑색종, 폐 선암종, 두경부 편평세포 암종, 자궁 체부 자궁내막 암종, 육종, 직장 선암종, 유방 침습성 암종, 신장 투명 세포 암종, 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁 경내 선암종, 다형성 교모세포종, 결정 선암종, 위 선암종, 방광 요로상피 암종, 갑상성 암종, 전립선 선암종, 췌장 선암종, 뇌 저등급 교종, 폐 편평세포 암종, 신장 유도 세포 암종, 및 난소 장액낭샘암종) 중에서 5개 (피부의 흑색종, 폐 선암종, 두경부 편평세포 암종, 자궁 체부 자궁내막 암종 및 육종 )에서 유의미하게 더 높은 생존 가능성을 나타낸다. 전체적으로, 이 결과들은 최대의 T 세포 활성화를 위해 CD226 신호전달을 고양시키는 한편 동시에 TIGIT를 차단하는 (예컨대 항-GITR 치료를 통해) 면역치료 전략을 지지한다.
CD226의 유전적 비활성화
CD226 차단 mAb를 사용하여, 본 발명자들은 CD226을 통한 동시자극성 신호전달이 조합 치료에 의해 매개된 항-종양 면역력에 필요하였음을 보였다 (도 12, 13). CD226 Ab가 CD8 T 세포의 하위세트에 잠재적 고갈 효과를 나타낼 수 있기 때문에, CD226을 C57BL/6 배경 마우스에서 유전적으로 비활성화하여 그 결과를 확인하였다. CD226-/- 마우스는 T 세포 (CD4+, CD8+, Tregs) 항상성에 결함을 나타내지 않았고 (도 18, 패널 A 내지 D) TCR 활성화에 대해 야생형 마우스와 유사하게 반응하였다 (도 18, 패널 E 내지 I). 본 발명자들은 조합 치료가 더 이상 항-종양 효과 또는 생존 유익을 CD226-/- 마우스에 제공하지 않았고, 그것은 CD226이 조합의 관찰된 항-종양 효과에 필수적이었음을 시사하는 것임을 관찰하였다 (도 19, 패널 A). TNF 수용체 수퍼패밀리의 다른 구성원들 (OX40L 또는 4-1BBL)의 억제 또는 CTLA4-Ig를 사용하는 B7 동시자극성 분자 (CD28)의 차단이 조합 치료법에 의해 매개된 항-종양 효과를 보존하였기 때문에, CD226의 효과는 특이적이다 (도 19, 패널 B 내지 D).
TIGIT Null 동물에서 CD226에 대한 요건
전체 단일-세포 분류 RNA-서열 및 FACS 표현형 데이터는 항-PD-1이 CD226의 발현을 선호하는 한편, 항-GITR 치료는 TIGIT의 표면 발현을 하향 조절하였으며, 항상성 T 세포 기능을 상조적으로 회복시키는 것을 보였다.
본 발명자들은 CD226 신호전달 경로가 TIGIT-/- 마우스에서 향상된 종양 감시에 필요하였음을 보였다 (도 14, 15). 추가적으로, CD226에 대해 주요 리간드인 CD155/PVR6을 과잉발현하는 MC38 종양 세포를 포함하는 마우스들은 MC38-빈 벡터 (MC38-EV) 종양 세포 또는 아이소타입 대조군으로 치료된 마우스와 비교하여 항-PD-1 또는 항-GITR 또는 조합 요법시에 종양 성장의 유의미한 지연을 나타냈다 (도 20). MC38-CD155로 이식된 마우스의 면역 프로파일링 분석은 이식 후에 MC38-CD155 세포상에서 M38-EV (빈 벡터)를 초과하는 지속적인 더 높은 CD155 발현 수준을 확인해주었다. 본 발명자들은 MC38 종양 세포 상에서 CD155 과잉-발현이 CD4+, CD8+ T 및 Tregs 세포 상에서의 감소된 검출 가능한 CD226 발현과 결부되어 있는 한편 (도 21A), 종양내 T 세포 상에서 향상된 IFNγ (Fig. 21B) 및 4-1BB (Fig. 21C) 발현에 의해 나타난 것과 같이 T 세포 활성화를 고양시켰음을 발견하였다. 주변부에서는 아무런 효과도 관찰되지 않았다.
어떠한 이론에 의해 구속되지는 않지만, CD226 발현 수준은 전체적인 T 세포 활성화 강도와 상관되었을 것이고 암 환자들에서 더 나은 예후를 예측할 수 있을 것으로 가설이 세워진다. 실제로, 높은 CD226 발현을 가지는 환자들은 3가지 유형의 암 (피부 흑색종, 폐 선암종 및 육종)에서 유의미하게 더 높은 생존 가능성을 가진다. 이 데이터들은 최대 T 세포 활성화를 위해 CD226 신호전달을 고양하는 한편 동시에 TIGIT를 차단하는 면역요법 전략을 지지한다.
전술한 실험들은 항-PD1 항체와 조합하여 항-GITR 항체를 투여하는 것의 상조적 효과를 증명한다. 특히, 다른 것들 중에서고, 상기 실험들은 항-GITR 항체 및 항-PD1 항체의 조합된 투여가 종양 퇴행을 유도하고, 장기간 종양 차도를 제공하며, 종양/항원-특이적 면역학적 메모리 반응을 유도하는 것을 증명한다.
실시예 10: TCR 분석
TCR 분석을 위해, 본 발명자들은 TCR 서열, 특히 TCR-CDR3 서열을 무작위 준비된 짧은 RNA 서열 판독들로부터 재구성하고 추출하기 위한 새로운 생물정보성 파이프라인 rpsTCR을 개발하였다. rpsTCR은 쌍을 이룬- 및 단일-단부의 짧은 판독을 채택하며 이 판독들을 TCR 유전자좌 및 전사물이 아닌, 마우스 또는 인간 게놈 및 전사체에 대해 디폴트 파라미터 (default parameters)를 포함하는 TopHat (Bioinformatics 25, 1105-1111 (2009))을 사용하여 지도화한다. 지도화된 판독들은 버려지고 지도화되지 않은 판독들은 TCR 서열의 추출을 위해 재순환된다. 지도화되지 않은 판독들에서 저품질의 뉴클레오타이드들을 트리밍하였다. 그런 후 35 bp 미만의 길이를 가지는 판독들을 HTQC 툴키트 (Bioinformatics 14, 33 (2013)를 사용하여 걸러냈다. QC를 통과한 짧은 판독들을 iSSAKE (Bioinformatics 25, 458-464 (2009)) 디폴트 세팅을 사용하여 더 긴 판독들로 조립하였다. TCRklass (J Immunol 194, 446-454 (2015))를 사용하여 디폴트 1.7 내지 2로부터 Scr (보존된 잔기 지지체 점수)을 가지는 CDR3 서열을 확인하였다. 파이프라인에 도입된 추가의 단계들이 TCRklass 단독과 비교하여 더 높은 폴스 양성 또는 폴스 음성 비율을 초래하였는지의 여부를 평가하기 위하여 건강한 인간 PBMC 샘플로부터의 표적화된 TCR-서열 데이터를 포지티브 대조군으로서 사용하였다.
TCRB (64,031) 또는 TCRA (51,448)로부터의 고유한 CDR3 서열들은 대부분 rpsTCR 및 TCRklass 둘 다에 의해 검출되었다. rpsTCR와 TCRklass 사이의 제곱 상관은 TCRB-CDR3 및 TCRA-CDR3에 대해 각각 0.9999 및 0.9365였다. 6가지의 TCR-네거티브 암 또는 비-암 세포주들을 네거티브 대조군으로서 사용하였다. rpsTCR에 의해 검출된 CDR3 서열은 없었던 반면, 일부 CDR 서열은 일부 TCR-네거티브 암 세포주로부터 TCRklass에 의해 추출되었다.
상기 파이프라인의 성능을 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 표적화된 TCR-서열 및 무작위 준비된 RNA-서열 접근법 (200M, 2x100bp)을 사용하여 건강한 마우스 PBMC 샘플을 서열분석하였다. 비록 RNA-서열 데이터로부터 조립된 CDR3 서열의 수가 표적화된 TCR-서열 접근법으로부터의 그것보다 훨씬 더 적었지만, rpsTCR을 사용하여 RNA-서열 데이터로부터 확인된 CDR3 서열의 약 45%가 표적화된 TCR-서열로부터의 CDR3 서열 중에서도 관찰되었다. 표적화된 TCR-서열의 기술적 한계로 인해, 본 발명자들이 RNA-서열 데이터로부터 추출한 CDR3 서열의 분획이 TCR-서열 결과에 존재하지 않았던 것은 놀랍지 않았다. 예를 들어, 표적화된 TCR-서열에 대해 사용한 5' 레이스 어댑터의 효율은 일반적으로 낮고 다양한 PCR은 TCR을 높은 빈도로 증폭시키려는 경향이 있어서, 단지 적은 부분의 TCR만이 표적화될 수 있다. 예상과 같이, rpsTCR을 사용하여 RNA-서열 데이터로부터 확인된 훨씬 높은 퍼센트 (~ 70%)의 CDR3 서열이 또한 표적화된 TCR-서열로부터의 고빈도 CDR3 서열 (>= 0.1%) 중에서 관찰되었던 한편, TCRklass를 사용하면 단지 약 40%만이 추출되었다. 더욱이, 본 발명자들은 50 bp 분절들에서 100 bp 판독 길이를 잘랐고 무작위로 200 M 판독을 선택하였다. 표적화된 TCR-서열 접근법에 의해 등급화된 상위 10개의 CDR3 서열 중에서, 8개의 CDR3 서열이 본 발명자들의 rpsTCR에 의해 검출된 한편, 단지 3개만이 TCRklass에 의해 검출되었다. 본 발명자들은 다음에 본 발명자들의 rpsTCR 파이프라인을 상이한 항체로 치료된 MC38의 종양내 CD8 T 세포로부터 생성된 단일 세포 RNA-서열 데이터로부터 CDR3 서열을 추출하기 위해 적용하였다. 본 발명자들의 CDR3_b베타 및 CDR3_알파 서열 검출 속도는 T 세포의 단일 세포 서열분석으로부터 TCR 서열을 검출하기 위해 표적화된 TCR-서열 접근법을 사용하는 공개된 데이터와 비슷하였다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구체예들에 의해 범주가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기술된 것들에 더불어 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부되는 도면으로부터 당업자들에게 분명해질 것이다. 그러한 변형들은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc <120> Anti-GITR Antibodies and Uses Thereof <130> 238811-34.4 (10206WO01) <150> 62/348,353 <151> 2016-06-10 <150> 62/500,312 <151> 2017-05-02 <150> 62/432,023 <151> 2016-12-09 <150> 62/256,922 <151> 2015-11-18 <160> 413 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tggactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatc ctggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagacgga 300 gaactgggac tggactacta ctccggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 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Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 403 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 403 cagagcatta gcagctat 18 <210> 404 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 404 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 405 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 405 gctgcatcc 9 <210> 406 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 406 Ala Ala Ser 1 <210> 407 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 407 caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30 <210> 408 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 408 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 409 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 409 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Gln Arg Pro 20 25 30 Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly 35 40 45 Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp 50 55 60 Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln 65 70 75 80 Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe 100 105 110 Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His 115 120 125 Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu 130 135 140 Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly 145 150 155 160 Ser Pro Pro Ala Glu Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 165 170 175 Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His 180 185 190 His His <210> 410 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 410 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Gln Arg Pro 20 25 30 Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly 35 40 45 Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp 50 55 60 Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln 65 70 75 80 Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe 100 105 110 Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His 115 120 125 Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu 130 135 140 Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly 145 150 155 160 Ser Pro Pro Ala Glu Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 165 170 175 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 180 185 190 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 195 200 205 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 210 215 220 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 225 230 235 240 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 245 250 255 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 260 265 270 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 275 280 285 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 290 295 300 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 305 310 315 320 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 325 330 335 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 340 345 350 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 355 360 365 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 370 375 380 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 385 390 395 <210> 411 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 411 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Gln Arg Pro 20 25 30 Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly 35 40 45 Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp 50 55 60 Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln 65 70 75 80 Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe 100 105 110 Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His 115 120 125 Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu 130 135 140 Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly 145 150 155 160 Ser Pro Pro Ala Glu Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 165 170 175 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 180 185 190 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 195 200 205 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 210 215 220 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 225 230 235 240 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 245 250 255 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 260 265 270 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 275 280 285 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 290 295 300 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 305 310 315 320 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 325 330 335 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 340 345 350 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 355 360 365 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 370 375 380 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 <210> 412 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 412 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Gln Arg Pro 20 25 30 Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly 35 40 45 Lys Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Pro Thr Arg Cys Cys Arg Asp 50 55 60 Tyr Gln Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Val Cys Val Gln 65 70 75 80 Pro Glu Phe His Cys Gly Asn Pro Cys Cys Thr Thr Cys Gln His His 85 90 95 Pro Cys Pro Ser Gly Gln Gly Val Gln Pro Gln Gly Lys Phe Ser Phe 100 105 110 Gly Phe Arg Cys Val Asp Cys Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Gly His 115 120 125 Asp Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu 130 135 140 Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly 145 150 155 160 Ser Pro Pro Ala Glu Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 165 170 175 Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His 180 185 190 His His <210> 413 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 413 Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg 35 40 45 Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu 50 55 60 Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His 65 70 75 80 Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro 85 90 95 Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys 100 105 110 Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys 115 120 125 Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro 130 135 140 Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala 145 150 155 160 Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys 165 170 175 Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu 180 185 190 Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val 195 200 205 Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu 210 215 220 Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp 225 230 235 240 Val

Claims (31)

  1. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은:
    (i) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 5.0 nM 미만의 KD로 37℃에서 모노머 인간 GITR에 결합하고;
    (ii) 약 12분보다 큰 t½로 37℃에서 모노머 인간 GITR에 결합하며;
    (iii) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 950 pM 미만의 KD로 37℃에서 다이머 인간 GITR에 결합하고;
    (iv) 약 7분보다 큰 t½로 37℃에서 다이머 인간 GITR에 결합하며; 및
    (v) 약 260 pM 미만의 EC50으로 인간 GITR 트랜스펙션된 인간 배아 신장 293 (HEK-293) D9 세포에 결합하는
    특성들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 GITR을 활성화하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 Fc 고정의 부재시에 인간 GITR을 활성화하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제 3 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 3 nM 미만의 EC50에서 약 25%보다 큰 활성화 백분율로 인간 GITR을 활성화하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제 3항 또는 제 4 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 1.0 nM 미만의 EC50으로 인간 GITR을 활성화하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정으로 측정되는 바 Fc 고정의 부재시에 T-세포 증식 활성을 나타내는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제 6 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정으로 측정되는 바 약 8 nM 이하의 EC50으로 Fc 고정의 부재시에 T-세포 증식 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 Fc 고정의 존재하에 인간 GITR을 활성화하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정으로 측정되는 바 배경보다 적어도 약 2배 높게 Fc 고정의 존재하에 T-세포 증식 활성을 나타내는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제 9 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 나이브 인간 CD4+ T-세포 증식 검정으로 측정되는 바 약 34 nM 미만의 EC50으로 Fc 고정의 존재하에 T-세포 증식 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 hGITR 리간드 (hGITRL)-매개된 수용체 자극을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제 11 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 Fc 고정의 부재시에 hGITRL-매개된 수용체 자극을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 NFκB 리포터 검정에 의해 측정되는 바 약 4.0 nM 미만의 IC50에서 약 54%보다 큰 차단 백분율로 Fc 고정의 부재시에 hGITRL-매개된 수용체 자극을 차단하는, 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  14. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 (a) 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 (HCVR)의 상보성 결정 영역들 (CDRs) 및 (b) 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 CDRs를 포함하는, 분리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  15. 제 14 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 HCVR 및 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 LCVR을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  16. 제 14 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 :
    (i) SEQ ID NO: 100, 164, 196, 244, 292, 340, 및 348로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCDR1 도메인;
    (ii) SEQ ID NO: 102, 166, 198, 246, 294, 342, 및 350으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 도메인;
    (iii) SEQ ID NO: 104, 168, 200, 248, 296, 344, 352로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCDR3 도메인;
    (iv) SEQ ID NO: 108, 172, 204, 252, 300, 및 404로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCDR1 도메인;
    (v) SEQ ID NO: 110, 174, 206, 254, 302, 및 406으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 도메인, 및
    (vi) SEQ ID NO: 112, 176, 208, 256, 304, 및 408로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCDR3 도메인
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  17. 제 14 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) SEQ ID NO: 100을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 102를 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 104를 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 108을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 110을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는 LCDR3;
    (ii) SEQ ID NO: 164를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 166을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 168을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 172를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 174를 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 176을 포함하는 LCDR3;
    (iii) SEQ ID NO: 196을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 198을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 200을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 204를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 206을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 208을 포함하는 LCDR3;
    (iv) SEQ ID NO: 244를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 246을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 248을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 252를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 254를 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 256을 포함하는 LCDR3;
    (v) SEQ ID NO: 292를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 294를 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 296을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 300을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 302를 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 304를 포함하는 LCDR3;
    (vi) SEQ ID NO: 340을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 342를 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 344를 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 404를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 406을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 408을 포함하는 LCDR3; 또는
    (vii) SEQ ID NO: 348을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1; SEQ ID NO: 350을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 352를 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 404를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1; SEQ ID NO: 406을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 408을 포함하는 LCDR3.
  18. 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 GITR에 대한 결합에 대해 SEQ ID NOS: 98/106; 162/170; 194/202; 242/250; 290/298; 338/402; 및 346/102로 구성되는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 기준 항체와 경합하는, 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  19. 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NOS: 98/106; 162/170; 194/202; 242/250; 290/298; 338/402; 및 346/102로 구성되는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 기준 항체와 동일한, GITR 상의 에피토프에 결합하는, 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
  21. 제 20 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 GITR에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-종양 면역 반응을 조절하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 제 2 T-세포 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, T-세포 활성화 수용체는 CD28, OX40, CD137, CD27, 또는 HVEM인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 억제성 수용체에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, T-세포 억제성 수용체는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, 또는 LAG-3인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, T-세포 억제성 수용체는 PD1인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, T-세포 수용체에 결합하는 항체는 REGN 2810인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 22 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, GITR에 결합하는 항체는 제 17 항의 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
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