CN110698563A - 多价抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种多价抗体及其制备方法。所述多价抗体包含多个抗原结合部位，所述抗原结合部位连接于人源抗体核心片段；所述抗原结合部位至少包括与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位以及与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位。该多价抗体通过基因工程的方式改造获得，可以将免疫细胞结合到癌细胞上以激发免疫细胞对癌细胞的攻击。相对于现有的CAR‑T治疗方法，该多价抗体具有广谱性，不需要依赖于患者自身的T细胞，可以大量生产。而且，没有等待的时间，可以立即制备使用。依托于成熟的抗体生产技术，可以通过GMP等方式，消除其他病原感染的危险，并且有较低的治疗费用。

Description

多价抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多价抗体及其制备方法。
背景技术
癌症的传统治疗方法包括手术、放疗、化疗和靶向治疗。但这些传统的治疗方法均具有不同程度的局限性，只能延缓而无法从根本上阻止病情的发展。
例如，手术治疗只适用于肉眼可见的肿瘤组织，放疗与化疗能杀死大量的肿瘤细胞，但特异性不足，会破坏大量的正常组织细胞而产生很强的副作用。靶向药物虽然治疗效果明显，见效快，但较易产生耐药性和肿瘤细胞的异质性，并不能发挥长期抗肿瘤功效。
为了克服传统治疗方法的局限性，现有提出了肿瘤免疫治疗的新方式。肿瘤免疫治疗是通过增强患者自身免疫力来治疗肿瘤，具有反应快、副作用小、疗效持久的特点。此外机体免疫系统具有良好的记忆型免疫机制，在防止肿瘤复发方面具有显著优势。
例如，CAR-T技术是将针对肿瘤抗原抗体的scFv片段连接到T细胞受体(如CD3,CD28 or 4-1BB)上,再通过病毒(Retrovirus or lentivirus)将该嵌合抗原受体转到体外纯化的病人T细胞中。
转化了嵌合受体的T细胞经体外大量扩增和活化后，再输入到患者的体内，通过scFv识别肿瘤细胞，分泌消化酶，起到杀死肿瘤细胞的作用。
在实现本发明过程中，发明人发现相关技术存在以下问题：癌症病人在经历了多次的放疗和化疗后，免疫系统非常脆弱，特别是T细胞量低于正常水平。但CAR-T治疗又需要患者自身大量的T细胞，使得没有足够的T细胞或者患者体质较弱而不能进行免疫治疗。
而且，T细胞的体外纯化，病毒感染和扩增需要很长时间(几周到几个月)，癌症病人特别是晚期患者无法承受时间过长的治疗流程。T细胞在体外纯化，培养扩增和体内输入过程中可能造成各种病原体污染，特别是长期培养更容易带来支原体，病毒或致病病原污染，输入患者体内后造成多重感染。
另外，CAR-T细胞能开启巨大的细胞因子释放，可能招致免疫系统的其他细胞加入到对肿瘤细胞的攻击中，同时也会对患者带来极端高烧，疲劳，呼吸困难或心跳骤停等危险情况。由于需要体外纯化，培养，病毒感染，扩增和输入等多种步骤，CAR-T治疗的花费非常高，常需50-100万美元左右，普通病人难以承受。
发明内容
针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种多价抗体及其制备方法，以解决现有肿瘤免疫治疗方法中所存在一系列缺陷，无法很好的进行推广应用的问题。
本发明实施例的第一方面提供一种多价抗体。所述多价抗体包含多个抗原结合部位，所述抗原结合部位连接于人源抗体核心片段；所述抗原结合部位至少包括与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位以及与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位。
可选地，所述与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位由抗CD19单链抗体提供；所述与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位由抗CD3单链抗体、抗CD28单链抗体或抗PD-1单链抗体提供。
可选地，所述抗CD19单链抗体连接到人抗体重链的CH2和CH3区。
可选地，所述多价抗体还包括T细胞生长因子；所述T细胞生长因子连接在所述人抗体重链的CH3区。
可选地，所述T细胞生长因子连接到所述抗CD3单链抗体以及抗CD28单链抗体上。
可选地，所述T细胞生长因子连接到所述抗PD-1单链抗体上。
可选地，所述抗CD19单链抗体的基因序列如SEQ ID 1所示。
可选地，所述抗CD3单链抗体的基因序列如SEQ ID 2所示。
可选地，所述多价抗体为三价的双特异性抗体；所述抗原结合部位由抗ErbB2单链抗体以及抗CD19的人源抗体的可变区提供；所述抗ErbB2单链抗体设置有两个，分别连接到所述人源抗体的CH1区和CL区。
本发明实施例的第二方面提供了一种上所述的多价抗体的制备方法。所述制备方法包括：
制备针对不同抗原的单克隆抗体，所述单克隆抗体上包含与所述抗原特异性结合的抗原结合部位；根据所述单克隆抗体，组装对应的表达载体；在预设的表达体系内诱导表达，生成与所述表达载体对应的多价抗体；纯化所述多价抗体。
本发明实施例提供的技术方案中，通过基因工程的方式改造获得可以两种或以上抗原特异性结合的多价抗体，可以将免疫细胞结合到癌细胞上以激发免疫细胞对癌细胞的攻击。相对于现有的CAR-T治疗方法，该多价抗体具有广谱性，不需要依赖于患者自身的T细胞，可以大量生产。而且，没有等待的时间，可以立即制备使用。依托于成熟的抗体生产技术，可以通过GMP等方式，消除其他病原感染的危险，并且有较低的治疗费用。
附图说明
图1为本发明实施例的多价抗体的一个实施例示意图；
图2为本发明另一实施例的多价抗体的一个实施例示意图；
图3为本发明实施例的多价抗体的制备方法的一个实施例示意图；
图4为本发明实施例的表达载体构建过程的一个实施例示意图；
图5为本发明实施例的三价双特异性抗体在BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE检测结果的一个实施例示意图。
图6为本发明实施例的纯化的三价双特异性抗体的SDS-PAGE检测结果的一个实施例示意图。
图7为本发明实施例的抗ErbB2 scFv-Fc、抗CD19 scFv-Fc的一个实施例示意图。
图8为本发明实施例的ELISA分析HG2细胞上清中，抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白表达量的一个实施例示意图。
图9为本发明实施例的ELISA分析细胞上清中抗人CD19 scFv-Fc融合蛋白表达量的一个实施例示意图。
图10为本发明实施例的纯化的融合蛋白的SDS-PAGE检测结果的一个实施例示意图。
图5中，各泳道依次为：1为全菌；2为第二次超声后上清；3为第三次超声后上清；4为第一次超声后上清；5为蛋白质标准品(protein marker)。
图6中，各泳道依次为：1为BsAb 2M尿素；2为BsAb 8M尿素(1)；3为BsAb TE洗10μl；4为抗CD19 scFv-Fc；5为抗ErbB2 scFv-Fc；6为BsAb TE洗20μl；7为标准品(Marker)；8为BsAb 8M尿素(2)；9为BSA 2μg。
图7中，A为抗ErbB2 scFv-Fc；B为抗CD19 scFv-Fc。
图8中，A为标准蛋白(standard protein)；B为抗ErbB2 scFv-Fc。
图9中，A为标准蛋白(standard protein)；B为Spinner System纯化获得的抗CD19scFv-Fc；C为烧瓶培养获得的抗CD19 scFv-Fc。
图10中，各泳道依次为：1为抗CD19 scFv-Fc；2为抗ErbB2 scFv-Fc；3为BSA 1.6μg；4为BSA 2μg；5为蛋白质标准品(protein marker)。
SEQ ID 1为所述抗CD19单链抗体的基因序列。
SEQ ID 2为所述抗CD3单链抗体的基因序列。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”、“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
免疫检测点(checkpoint)是免疫系统识别自身和外来抗原的关键点。其阻止了免疫细胞识别并攻击自身的细胞。但是，其经常被肿瘤细胞使用而导致免疫细胞无法对肿瘤细胞发起有效的免疫反应。因此，如何能够阻止免疫检测点的调控功能是激发免疫细胞对肿瘤细胞的有效杀伤的前提。
本发明实施例提供了一种多价抗体。该多价抗体包含多个抗原结合部位，所述抗原结合部位连接于人源抗体核心片段；所述抗原结合部位至少包括与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位以及与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位。该人源抗体核心片段主要是指抗体中的恒定区部分，作为抗体的主体结构。
由此，该多价抗体具有既能够与肿瘤细胞特异性结合，又能够与免疫细胞特异性结合的特性，可以起到抑制检测点(check point)调控的作用，令免疫细胞可以发起对肿瘤细胞的攻击，起到CAR-T免疫治疗的效果。
图1为本发明实施例提供的多价抗体的结构示意图。在本实施例中，其以CD19+的淋巴癌细胞作为靶细胞。如图1所示，所述与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位由抗CD19单链抗体(VH1和CH1)提供；所述与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位由抗CD3单链抗体(VH2和CH2)以及抗CD28单链抗体(VH3和CH3)提供。在另一些实施例中，该抗原结合部位也可以由抗PD-1单链抗体提供。
具体的，所述抗CD19单链抗体用于识别淋巴癌细胞，可以通过linker序列连接到人抗体重链的CH2区和CH3区，两个重链的CH2区则通过S-S二硫键相连接。
在较佳的实施例中，所述多价抗体还可以添加有T细胞生长因子(即IL2基因编码的，用于刺激T细胞扩增的细胞因子)。如图1所示，该T细胞生长因子连接在所述人抗体重链的CH3区，从而起到增强与抗体结合的T细胞扩增的效果，加快T细胞对肿瘤细胞的功能效应。
具体的，所述T细胞生长因子(在图1中以IL2表示)连接到所述抗CD3单链抗体以及抗CD28单链抗体上。当然，在另一些实施例中，所述T细胞生长因子也可以连接到所述抗PD-1单链抗体上，实现相同的，与免疫细胞特异性结合的功能。
“单链抗体”(scFv)是指利用基因工程技术在大肠杆菌等表达体系中表达的人工合成抗体。其只有完整抗体的一条链，能较好地保留其对抗原的亲和活性的同时，具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
在本实施例中，所述抗CD19单链抗体的基因序列如SEQ ID 1所示。所述抗CD3单链抗体的基因序列如SEQ ID 2所示。
当然，本领域技术人员可以理解的是，还可以根据实际情况的需要对上述单链抗体的基因序列进行适当的调整，例如与SEQ ID1和SEQ ID2具有95％或者90％以上的同源性的基因序列。所有的这些调整都是本领域技术人员容易想到的，属于本申请的保护范围。
图2为本发明另一实施例提供的多价抗体。如图2所示，该多价抗体为三价的双特异性抗体。其分别可以与ErbB2和CD19两个抗原特异性结合。
其中，所述抗原结合部位由抗ErbB2单链抗体以及抗CD19的人源抗体的可变区(VH2和CH2)提供。所述抗ErbB2单链抗体(VH1和CH1)设置有两个，分别连接到所述人源抗体的CH1区(重链)和CL区(轻链)。
ErbB2是乳腺癌导向治疗的理想靶分子。CD19是人IgG Fc受体III(FcγRIII)，能介导ADCC作用，杀伤肿瘤细胞等靶细胞。IgG的Fc片段与CD19结合可触发ADCC作用，抗CD19抗体与CD19结合亦可触发ADCC作用。
该双特异性抗体能够与肿瘤靶抗原以双价的单链抗体(scFv)形式结合，而与表达CD19的效应细胞则以单价的Fab形式结合。因此，基于抗ErbB2抗体及抗CD19抗体构建双特异性抗体(BsAb)可成为ErbB2高表达肿瘤及表达CD19的效应细胞之间的良好桥梁，以直接介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明实施例还提供了一种用于制备上述多价抗体的制备方法。图3为本发明实施例提供的多价抗体的制备方法。如图3所示，所述制备方法包括：
S110、制备针对不同抗原的单克隆抗体。所述单克隆抗体上包含与所述抗原特异性结合的抗原结合部位。
单克隆抗体的具体制备过程为本领域技术人员所熟知，在此不作赘述。在一些实施例中，可以使用改进的单克隆抗体筛选技术来缩短制备时间以及简化制备流程，将需要制备的单克隆抗体基因转染到筛选系统共表达细胞中。通过细胞是否有绿色荧光蛋白表达来确定是否有抗体表达。
S120、根据所述单克隆抗体，组装对应的表达载体。
在制备完成所需要的单克隆抗体(如抗CD19,CD3,CD28,PD-1和CTLA4的单链抗体)后，可以将这些抗体的基因片段通过linker组装，构建形成对应的多价抗体(包含恒定区的序列)，并将组合后的基因序列克隆到选定的抗体表达载体中。
具体的，可以选择使用的抗体表达载体为pCMV5.2(含有信号肽和polyHis多肽序列)。
S130、在预设的表达体系内诱导表达，生成与所述表达载体对应的多价抗体。
该表达体系可以是任何合适类型的细菌等生物体(如大肠杆菌等)。具体诱导表达的方式可以由技术人员根据实际情况的需要进行设置，为本领域技术所熟知。
S140、纯化所述多价抗体。
多价抗体被诱导表达以后，可以进一步的通过一系列的纯化操作步骤对多价抗体进行纯化，获得纯的多价抗体用于肿瘤治疗。
以下结合具体实例，详细描述图2所示的双特异性抗体的诱导表达和纯化过程。应当说明的是，该诱导表达和纯化过程仅用于示例性说明，而不用于限制本申请的保护范围。本领域技术人员可以根据实际情况的需要，基于本申请实施例公开的方法步骤进行相应的调整。
1)所使用的材料：
CG5细胞(稳定表达抗人CD19 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株)、HG2细胞(稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株)及转化重组载体pET22b(+)/BsAb的大肠杆菌BL21(DE3)为本室构建保存；无血清培养基HyQSFM4CHO为HyClone公司产品；DMEM培养基为Sigma公司产品；羊抗人IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG及人IgG购自北京中山生物技术公司；G418购自GIBCO公司；IPTG为SIGMA公司产品；rProtein A Sepharose FastFlow亲和层析柱购于Amersham Bioscience公司；Spinner System为IBS IntegraBiosciences公司产品。
2)表达载体的构建：
选择pET22b(+)作为表达载体，根据VL、CL、scFv、核糖体结合位点(RBS)、细菌信号肽(pelB)、VH和CH1基因序列及pET22b(+)载体中的多克隆位点设计引物。
其中，具体构建过程如图4所示，VL和CL，VH和CH1间采用重叠延伸PCR法进行连接。RBS和pelB通过引物P7、P8、P9融合于VH的5′端构建三价BsAb双顺反子表达载体。
3)抗ErbB2×抗CD19三价双特异性抗体的表达：
将构建的重组载体pET22b(+)/BsAb转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约为0.4，加入IPTG至终浓度分别为0.2mmol/L和0.5mmol/L，室温，130rpm震荡培养3h。
每个样品取1ml，10000r离心15min收获细菌菌体，重悬菌体于200ul PBS中，反复冻融三次后，超声波破菌，4℃10000r离心15min，分别收集上清和沉淀，沉淀用150ul 1×SDS凝胶加样缓冲液重悬。
分别取上清(10ul+10ul 2×SDS凝胶加样缓冲液)和重悬沉淀(20ul)进行10％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，保存菌种。
4)抗ErbB2×抗CD19三价双特异性抗体的纯化：
取一高压灭菌的螺旋管，加入5ml LB培养基和5μl氨苄青霉素(100mg/ml)，按1％的量加入50μl菌液，37℃下120rpm震荡培养12～16h。
按0.5％的量将4ml活化的菌液加入到800ml LB培养基中(内含800μl氨苄青霉素)，37℃下130rpm震荡培养至OD600≥0.5，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L,28℃下130rpm继续培养6h。
将培养物在4℃下8000rpm离心20min,弃上清。用PBS重悬，4℃下12000rpm离心15min，用5ml平衡缓冲液(20mM PB，500mM NaCl)重悬沉淀。
将悬液置于液氮内使其在1min内快速冷冻，然后在室温融化，重复3次。在冻融后的5ml菌液内加入35ml平衡缓冲液，超声破菌(脉冲60％，45s/次×10)，然后在4℃下12000rpm离心20min收集上清，以上步骤重复3次。
通过10％SDS-PAGE检测上清内有无目的蛋白表达及表达量。用TE+0.5％Triton-100 20ml重悬超声后的沉淀，超声破菌4次，4℃下12000rpm离心20min收集上清(第一次上清)；用TE 20ml重悬沉淀，超声破菌4次，4℃下12000rpm离心20min收集上清(第二次上清)。
用TE+2M尿素20ml重悬沉淀，超声破菌4次，4℃下12000rpm离心20min收集上清；用TE+8M1尿素10ml重悬沉淀，超声破菌4次，4℃下12000rpm离心20min收集上清；用TE+8M2尿素10ml重悬沉淀，超声破菌4次，4℃下12000rpm离心20min收集上清。收集第二、三次超声破菌上清、第一上清、第二上清、2M尿素、8M1尿素、8M2尿素超声破菌上清进行透析缓慢复性。第二、三次超声破菌上清和第一上清、第二上清超声破菌上清均用TE在4℃条件下进行透析，每4h更换一次透析液，共透析三次；2M尿素、8M1尿素、8M2尿素超声破菌上清在同一透析体系内透析，透析方案为先用500ml TGE+62.5ml 8M尿素透析，4h后更换为1LTGE+50ml 8M尿素透析，透析4h换为1L TGE+30ml 8M尿素进行透析，4h后更换为1L TGE透析，4h更换为1LTGE(无5％甘油，谷胱甘肽)再透析2～3h，以上透析均在4℃条件下进行。
分别收集透析液，4℃下12000rpm离心15min收集上清待用。通过10％SDS-PAGE对透析后的蛋白进行检测和定量。
5)抗人ErbB2的scFv-Fc融合蛋白的表达：
表达抗ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞(HG2)通过悬浮驯化，培养于无血清HYQSFM4CHO(Hyclone)培养基中，内含200μg/ml G418。待培养上清达到40ml时，采用悬浮培养系统(Spinner System，IBS Integra Biosciences)，经过125ml和250ml悬浮培养瓶依次扩增，在37℃5％CO2条件下，培养至体积达200ml时，停止加培养液，更换培养温度为30℃，继续培养7～8天。每48h取出1ml培养液观察细胞，并离心取培养细胞上清，存于4℃以备检测抗体的表达情况。
6)抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的纯化：
待更换温度、悬浮培养7天后，离心收取培养上清。对上清使用rProteinASepharose FastFlow亲和层析柱进行融合蛋白纯化。纯化中使用起始缓冲液(A)、洗脱液(B)、中和缓冲液(C)三种溶液。
其中，A液：0.15mol/L NaCl,0.1mol/LTris,pH 7.5；B液：0.1mol/L甘氨酸，pH3.0；C液：1mol/L Tris，pH 8.0。
融合蛋白的纯化步骤包括：将细胞悬液平均放入6个50ml高压灭菌塑料离心管内，4℃下3000rpm离心10min，去除沉淀，取上清加入6个新50ml塑料离心管，4℃下10000rpm离心10min，取上清。
使用C液将上清pH值调至7～8之间。用10倍柱体积的A液平衡rProtein ASepharose Fast Flow亲和层析柱，平衡速度1ml/min,共10min。将调整pH值的上清以1ml/min的速度上柱，收取上样流出液。用10倍柱体积的A液洗涤，以去除非特异性结合的蛋白。用B液洗脱结合的融合蛋白，以150μl的C液中和洗脱的蛋白溶液，共收取10管，1ml/管。依次用5倍柱体积(5ml)B液、10倍柱体积(10ml)A液及5倍柱体积(5ml)20％乙醇洗涤。取5μl/管洗脱蛋白，上样走12％SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色。
7)夹心ELISA法检测表达量：
可以将收取的不同时间、不同比例的培养上清用夹心ELISA法检测抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白的表达量。
具体步骤包括：羊抗人IgG(2μg/ml)包被96孔板，放于湿盒内，4℃过夜。甩去包被液，5％牛血清白蛋白(BSA)200μl/孔4℃封闭1h。甩去封闭液，加入待测的HG2细胞培养上清，37℃温育1h。PBST洗板5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1：5000稀释)，37℃温育1h。PBST洗板5次后，OPD显色，2mol/LH2SO4终止反应，测定OD492。
另外，抗人CD19 scFv-Fc融合蛋白表达、纯化表达抗人CD19-scFv融合蛋白的CHO细胞株(CG5)经悬浮培养驯化，培养于50％DMEM+50％无血清HYQ SFM4CHO(Hyclone)培养基，培养液内含200μg/ml G418。培养方法、纯化及夹心ELISA法检测上清抗体表达量的步骤也与上述实施例所揭露的步骤一致。
8)检测结果：
8.1)在上述三价双特异性抗体的构建过程中，使用了带His标签的BsAb表达载体，可以通过镍离子亲和层析来纯化获得可溶性重组蛋白。
三价双特异性抗体是以人IgG重链第一恒定区(CH1)和κ链恒定区(CL)作为异二聚化结构域,在CH1的N端连接抗CD19抗体的重链可变区(VHCD19),在CH1的C端连接抗ErbB2scFv(scFvErbB2)，形成VHCD19-CH1-scFvErbB2嵌合链。在CL的N端连接CD19抗体的轻链可变区(VLCD19)，在CL的C端连接另一个scFvErbB2，形成VLCD19-CL-scFvErbB2嵌合链。
两条多肽链通过CH1和CL异二聚化可装配成三价双特异性抗体。应用设计的引物PCR扩增各片段。PCR产物经酶切后依次插入pET22b(+)载体中的相应多克隆位点，得到重组载体pET22b(+)/BsAb。
8.2)如图5所示的，用重组载体pET22b(+)/BsAb转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达的SDS-PAGE结果显示，在分子量约55kDa处有新增蛋白条带，但三次超声破菌透析后上清目的蛋白的可溶性表达量均很低，而沉淀中目的蛋白量较大。因此，考虑选择对包涵体进行变性和复性处理。
如图6所示，经2M、8M尿素变性后，沉淀完全溶于8M尿素内，通过逐渐降低透析液内尿素的浓度及谷氨酰胺的作用，使包涵体缓慢复性，获得浓度为1mg/ml的目的蛋白。令人惊喜的发现，通过缓慢降低透析液内尿素含量所获得的蛋白活性较好。
8.3)在本实施例中，还构建了抗ErbB2 scFv-Fc及抗CD19 scFv-Fc的真核表达载体，用于表达纯化抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白和抗人CD19scFv-Fc融合蛋白，从而与三价双特异性抗体进行比较，确定与其不同特异性的亲本抗体的结合活性。
如图7所示，抗人ErbB2 scFv-Fc及抗人CD19 scFv-Fc是鼠源抗ErbB2及抗CD19单链抗体与人IgG1 Fc段的融合蛋白，两者均为单一多肽链，通过Fc段可组装形成同源二聚体。
用表达载体转染CHO细胞，经G418筛选分别获得稳定表达抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白的HG2细胞及稳定表达抗人CD19 scFv-Fc融合蛋白的CG5细胞，并通过逐渐降低培养基中血清浓度实现了工程细胞的悬浮驯化。
应用Spinner System扩增细胞，通过夹心ELISA法实时监测了250ml悬浮培养系统中工程细胞在培养2、4、6、7天时培养上清中融合蛋白的含量。如图8和9所示，在一定时间内(7天)随培养时间的延长，培养上清中融合蛋白的含量也逐步增高，ELISA检测抗ErbB2scFv-Fc的表达水平可达250ng/ml，抗CD19 scFv-Fc的表达水平可达150ng/ml。但进一步延长培养时间，工程细胞的表达水平不再升高，细胞活力进一步降低，随着细胞状态不良和逐渐死亡崩解，会向培养上清中释放一些酶类，所以若培养上清未及时收集，则培养上清中的目的蛋白会因酶类破坏而失去活性。因此，收集培养第7天的上清进行纯化。
应用rProteinASepharose Fast Flow亲和层析柱纯化，获得了纯化的融合蛋白。通过12％SDS-PAGE分析，如图10所示，可见两种scFv-Fc融合蛋白的分子量约为50kDa，纯化蛋白浓度约为2mg/ml。
8.4)对三价双特异性抗体进行三个抗原的亲和实验鉴定和对T细胞的激活和扩增(IL2功能)实验鉴定。
其中，使用CD3,CD4和CD8抗体从人的外周血中纯化T细胞并和三价双特异性抗体共孵育24-48小时，通过流式细胞仪检测表达CD25和CD69表达的细胞以鉴定T细胞的激活程度，通过细胞计数以鉴定对T细胞的扩增活性。
为鉴定三价双特异性抗体对T细胞杀伤功能的作用，共培养CD3+和CD28+的外周血T细胞，然后加入各种浓度的三价抗体，37℃孵育24-48小时。通过流式细胞仪鉴定CD19+leukemia细胞数量，通过DAPI染色鉴定死的细胞数量。
最后，将不同剂量的三价抗体注射到E-myc转基因白血病模型小鼠体内，以鉴定它对体内淋巴癌细胞的杀伤效果。
经过三次小鼠实验，抑瘤率达60％，肿瘤重量与对照组相比平均减少了62％，只剩下0.3g。经方差分析，在治疗肿瘤方面，能显著抑制肿瘤的生长(P<0.01)
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳容金科技有限公司
<120> 多价抗体及其制备方法
<141> 2019-09-17
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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atggaaaccg ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccggg cagcaccggc 60
gcgattcgcc tgaccggcag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcgg cgcggcgacc 120
attagctgca aagcgagcaa cagcgtggat tatgatggcg atagctatct gaactggtat 180
cgccagattc cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg atgcgagcaa cctggtgagc 240
ggcattccgc cgcgctttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaacattcat 300
ccggtggaaa aagtggatgc ggcgacctat cattgcggcc agagcaccga agatccgtgg 360
acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaa 393
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tgcgatgcga gcagcagcgt gagctatatg aactggtatc gctataaaag cggcaccagc 540
ccgaaacgct ggatttatga taccagcaaa gtggcgagcg gcgtgccgta tcgctttagc 600
ggcagcggca gcggcaccag ctatagcctg accattagca gcatggaagc ggaagatgcg 660
gcgacctatt attgcaacca gtggagcagc aacccgctga cctttggcgc gggcaccaaa 720
ctggaactg 729

Claims (10)

1.一种多价抗体，其特征在于，所述多价抗体包含多个抗原结合部位，所述抗原结合部位连接于人源抗体核心片段；
所述抗原结合部位至少包括与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位以及与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位。
2.根据权利要求1所述的多价抗体，其特征在于，所述与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合部位由抗CD19单链抗体提供；
所述与免疫细胞特异性结合的抗原结合部位由抗CD3单链抗体、抗CD28单链抗体或抗PD-1单链抗体提供。
3.根据权利要求2所述的多价抗体，其特征在于，所述抗CD19单链抗体连接到人抗体重链的CH2和CH3区。
4.根据权利要求1所述的多价抗体，其特征在于，所述多价抗体还包括T细胞生长因子；所述T细胞生长因子连接在所述人抗体重链的CH3区。
5.根据权利要求4所述的多价抗体，其特征在于，所述T细胞生长因子连接到所述抗CD3单链抗体以及抗CD28单链抗体上。
6.根据权利要求4所述的多价抗体，其特征在于，所述T细胞生长因子连接到所述抗PD-1单链抗体上。
7.根据权利要求2所述的多价抗体，其特征在于，所述抗CD19单链抗体的基因序列如SEQ ID 1所示。
8.根据权利要求2所述的多价抗体，其特征在于，所述抗CD3单链抗体的基因序列如SEQID 2所示。
9.根据权利要求1所述的多价抗体，其特征在于，所述多价抗体为三价的双特异性抗体；
所述抗原结合部位由抗ErbB2单链抗体以及抗CD19的人源抗体的可变区提供；所述抗ErbB2单链抗体设置有两个，分别连接到所述人源抗体的CH1区和CL区。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的多价抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
制备针对不同抗原的单克隆抗体，所述单克隆抗体上包含与所述抗原特异性结合的抗原结合部位；
根据所述单克隆抗体，组装对应的表达载体；
在预设的表达体系内诱导表达，生成与所述表达载体对应的多价抗体；
纯化所述多价抗体。
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