RU2805840C1 - Полипептид, специфичный к муцину-1, и его применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к химерным антигенным рецепторам, специфичным к муцину-1, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Предложены конструкции полипептидов, связывающихся с муцином-1 и включающих пару вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) с определенными комбинациями CDRs. Предложенные полипептиды могут быть получены рекомбинантным путем и включены в состав химерного антигенного рецептора, который экспрессируется на иммунной клетке, для лечения рака. Изобретение позволяет непрерывно оказывать сильное противоопухолевое воздействие на различные виды рака за счет активации иммунной системы в организме. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 19 ил., 6 табл., 6 пр.

Description

Область изобретения

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка основана на патентных заявках Кореи № 10-2020-0183768 и 10-2021-0137757, поданных 24 декабря 2020 г. и 15 октября 2021 г. соответственно, раскрытие которых включено в настоящий документ посредством ссылки здесь во всей их полноте.

Область техники

Настоящее изобретение относится к полипептиду, связывающемуся с муцином-1, выделенному полинуклеотиду, кодирующему его, вектору, содержащему полинуклеотид, и клетке, содержащей вектор. Кроме того, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору, содержащему полипептид, связывающийся с муцином-1, выделенному полинуклеотиду, кодирующему химерный антигенный рецептор, вектору, содержащему полинуклеотид, иммунной клетке, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, и композиции и способу лечения рака, где каждый содержит вышеуказанное.

Уровень техники

Муцин-1 представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, присутствующий в эпителиальных клетках почти всех органов организма. Муцин-1 представляет собой гетеродимерный белок, образованный нековалентным взаимодействием N-концевой субъединицы (MUC1-N) и С-концевой субъединицы (MUC1-C). MUC1-C образует внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост. MUC1-N включает многократные тандемные повторы (TR), содержащие 20 аминокислот (HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA), включая сайты гликозилирования, и взаимодействует с внеклеточным доменом MUC1-C и остается связанным с MUC1-C.

В нормальных эпителиальных клетках муцин-1 экспрессируется на низком уровне, и его экспрессия ограничивается апикальными мембранами эпителия. Однако известно, что муцин-1 сверхэкспрессируется при солидном раке, таком как рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника, рак шейки матки и т. д., и известно, что он беспорядочно экспрессируется на всей клеточной поверхности и аномально гликозилируется. Таким образом, известно, что муцин-1 является пригодным в качестве молекулы-мишени для обнаружения опухолевых образований или в качестве молекулы-мишени для лечения рака.

Техническая задача

В настоящее время имеется много сообщений о применении анти-MUC1 антител для лечения рака. Однако противоопухолевая терапия с использованием антител применима только к опухолевым клеткам, которые имеют антигены, специфически распознаваемые антителами, при этом продолжительность эффекта короткая, и при длительном применении часто возникает резистентность. Следовательно, существует потребность в разработке технологии, способной непрерывно оказывать сильное противоопухолевое воздействие на различные виды рака за счет активации иммунной системы в организме.

Решение технической задачи

Настоящее изобретение относится к полипептиду, связывающемуся с муцином-1.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему муцин-1-связывающий полипептид.

Другой вариант осуществления относится к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке, содержащей вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид.

Еще один вариант осуществления относится к химерному антигенному рецептору, содержащему муцин-1-связывающий полипептид.

Еще один вариант осуществления относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему химерный антигенный рецептор.

Еще один вариант осуществления относится к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор.

Еще один вариант осуществления относится к иммунной клетке, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, или содержащей полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции для лечения рака, содержащей муцин-1-связывающий полипептид,; выделенный полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; химерный антигенный рецептор, содержащий муцин-1-связывающий полипептид; выделенный полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор; вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор; или иммунную клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, или экспрессирующую химерный антигенный рецептор.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 приведены результаты анализа секреции цитокинов для оценки ответных реакций CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 03 и донора 04, против MUC1-положительных опухолевых клеток (T47D, HEK293T-В1).

На фиг. 2 приведены результаты анализа секреции цитокинов для оценки ответных реакций CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 06, против MUC1-положительных опухолевых клеток (T47D).

На фиг. 3 приведены результаты анализа секреции цитокинов для оценки ответных реакций CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 06, против клеток, не экспрессирующих муцин-1 (HEK293T).

На фиг. 4 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 03, против клеточной линии рака молочной железы человека T47D.

На фиг. 5 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 04, против клеточной линии рака молочной железы человека T47D.

На фиг. 6 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 03, против клеток эмбриональной почки человека HEK293T.

На фиг. 7 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 04, против клеток эмбриональной почки человека HEK293T.

На фиг. 8 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 04, против HEK293T-V1, полученных экспрессией экзогенного MUC1-C в линии клеток эмбриональной почки человека.

На фиг. 9 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 05, против клеточной линии рака молочной железы человека T47D.

На фиг. 10 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 06, против клеточной линии рака молочной железы человека T47D.

На фиг. 11 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 07, против линии клеток эмбриональной почки человека HEK293T.

На фиг. 12 приведены результаты тестирования цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, которые были получены с использованием Т-клеток, происходящих от донора 08, против клеточной линии рака молочной железы человека HCC70 (№ 2: 2447_2H08; № 3: 2447_3A01); № 4: 2447_3A08; № 5: 2447_3A09; № 6: 2447_3A12; № 7: 2447_3B07; № 8: 2447_3C08; № 9: 2447_3H02; № 10: 2447_3H08).

На фиг. 13 приведены результаты различной цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, против клеточной линии рака молочной железы человека (HCC70) и клеточной линии нормальной молочной железы человека (MCF10A) при соотношении эффекторная клетка (E):клетка-мишень (Т) 0,3:1 (№ 2: 2447_2H08).

На фиг. 14 приведены результаты различной цитотоксичности CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, против клеточной линии рака молочной железы человека (HCC70) и клеточной линии нормальных молочной железы человека (MCF10A) при соотношении эффекторная клетка (E):клетка-мишень (Т) 0,1:1 (№ 2: 2447_2H08).

На фиг. 15 приведены результаты исследования ингибирования роста опухолей после введения CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, на моделях рака на животных, которым прививали клетки PANC1-v1 (клетки рака поджелудочной железы PANC1, экспрессирующие MUC1).

На фиг. 16 приведены результаты исследования количества иммунных клеток человека (клетки hCD45+) в крови через 14 суток и 28 суток после введения CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, на моделях рака на животных, которым прививали клетки PANC1-v1 (клетки рака поджелудочной железы PANC1, экспрессирующие MUC1).

На фиг. 17 приведены результаты исследования ингибирования роста опухолей после введения двух разных доз CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения на моделях рака на животных, которым прививали клетки PANC1-v1 (клетки рака поджелудочной железы PANC1, экспрессирующие MUC1).

На фиг. 18 приведены результаты исследования ингибирования роста опухолей после введения CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, на моделях рака на животных, которым прививали клетки HCC1954 (клетки рака молочной железы, естественно экспрессирующие MUC1) и

На фиг. 19 приведены результаты исследования количества иммунных клеток человека (hCD45+ клеток) в крови через регулярные промежутки времени после введения CAR-T-клеток в соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, на моделях рака на животных, которым прививали клетки рака молочной железы HCC1954, естественно экспрессирующие MUC1).

Наилучший способ осуществления изобретения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к полипептиду, связывающемуся с муцином-1. В одном предпочтительном варианте осуществления полипептид, связывающийся с муцином-1 по настоящему изобретению, может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, связывающемуся с муцином-1, где полипептид содержит пару вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из следующих VH- и VL-областей:

- VH-области, содержащей определяющие комплементарность участки CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3 представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73, соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 83 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 86 соответственно; и

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 93 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96 соответственно.

Таблица 1
Название клона	CDR
	VH			VL
	CDR1	CDR2	CDR3	CDR1	CDR2	CDR3
2445_1F09	GFTVSSNY (SEQ ID NO: 1)	IYSGGST (SEQ ID NO: 2)	DRGWNHGMDV (SEQ ID NO: 3)	SSEVGSRY (SEQ ID NO: 4)	KND (SEQ ID NO: 5)	AAWDDSLNGYV (SEQ ID NO: 6)
2447_2H08	GYTFTNYG (SEQ ID NO: 11)	ISAYNGNT (SEQ ID NO: 12)	DPHILTGYYRGGWFDP (SEQ ID NO: 13)	SLRTSY (SEQ ID NO: 14)	GKT (SEQ ID NO: 15)	HSRDSNDNYLEVV (SEQ ID NO: 16)
2447_3A01	GFTFDDYA (SEQ ID NO: 21)	ISWNSGSI (SEQ ID NO: 22)	DISSGWYPGTFDY (SEQ ID NO: 23)	SLRSYY (SEQ ID NO: 24)	GKN (SEQ ID NO: 25)	SSRDSSDDVV (SEQ ID NO: 26)
2447_3A08	GYTFTSYG (SEQ ID NO: 31)	ISAYNGNT (SEQ ID NO: 32)	DRATIFGVVTPFDY (SEQ ID NO: 33)	SIRSYS (SEQ ID NO: 34)	GKN (SEQ ID NO: 35)	NSRDSSGNRVV (SEQ ID NO: 36)
2447_3A09	GFTFDDYA (SEQ ID NO: 41)	ISWNSGSI (SEQ ID NO: 42)	DVSSGWYWYAFDI (SEQ ID NO: 43)	SLRSYY (SEQ ID NO: 44)	GKN (SEQ ID NO: 45)	NSRDSGGSVV (SEQ ID NO: 46)
2447_3A12	GYTFTSYG (SEQ ID NO: 51)	ISAYNGNT (SEQ ID NO: 52)	DPHILTGYYRGGWFDP (SEQ ID NO: 53)	SLRSYY (SEQ ID NO: 54)	GKN (SEQ ID NO: 55)	NSRDSSGNHRV (SEQ ID NO: 56)
2447_3B07	GFTFDDYA (SEQ ID NO: 61)	TSWDGGST (SEQ ID NO: 62)	DHSSGWYNGGMDV (SEQ ID NO: 63)	SLRSYY (SEQ ID NO: 64)	GKN (SEQ ID NO: 65)	NSRDSSGNHVV (SEQ ID NO: 66)
2447_3C08	GFTFDDYA (SEQ ID NO: 71)	ISWNSGSI (SEQ ID NO: 72)	DRGSGYEGNYYGMDV (SEQ ID NO: 73)	SLRSYY (SEQ ID NO: 74)	GKN (SEQ ID NO: 75)	NSRDSSGNHYV (SEQ ID NO: 76)
2447_3H02	GFTFDDYA (SEQ ID NO: 81)	ISWDSGSI (SEQ ID NO: 82)	DVSSGWYWYAFDI (SEQ ID NO: 83)	ILRSYY (SEQ ID NO: 84)	GKN (SEQ ID NO: 85)	NSRDSSGNRVV (SEQ ID NO: 86)
2447_3H08	GFTFDDYA (SEQ ID NO: 91)	ISWNSGSI (SEQ ID NO: 92)	DRSSGWYTGSFDY (SEQ ID NO: 93)	SLRSYY (SEQ ID NO: 94)	GKN (SEQ ID NO: 95)	QSRDSSDNRVL (SEQ ID NO: 96)

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, связывающемуся с муцином-1, где полипептид содержит пару вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из следующих VH- и VL-областей:

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; и

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98.

Таблица 2
Название клона	VH	VL
2445_1F09	EVQLLETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGWNHGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7)	QSGLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGSSEVGSRYVSWYQQLPGTAPRLLIYKNDRRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGYVFGTGTKLTVL (SEQ ID NO: 8)
2447_2H08	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPHILTGYYRGGWFDPWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 17)	SYELTQDPAVSVALGQTVTITCQGDSLRTSYAGWLQQKPGQAPVLVLYGKTSRPSGIPDRFSGSTSGNTASLTITGAQAEDEAEYFCHSRDSNDNYLEVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 18)
2447_3A01	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADFVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDISSGWYPGTFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTVTGAQAEDEADYYCSSRDSSDDVVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 28)
2447_3A08	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDRATIFGVVTPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 37)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSIRSYSASWYQQKPGQAPRLVIYGKNNRPSGIPDRVSGSTSGNTASLTVTGAQAEDEADYYCNSRDSSGNRVVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 38)
2447_3A09	EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAATGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTASYYCAKDVSSGWYWYAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 47)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPGRFSGSSSGNTASLTVTGAQAEDEADYYCNSRDSGGSVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 48)
2447_3A12	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLRGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPHILTGYYRGGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 57)	SYELTQDPAVSVVLGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHRVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 58)
2447_3B07	QVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGRGLEWVSLTSWDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDHSSGWYNGGMDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 67)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 68)
2447_3C08	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRGSGYEGNYYGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGTTSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHYVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 78)
2447_3H02	EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWDSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVSSGWYWYAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 87)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDILRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNRVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 88)
2447_3H08	EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSSGWYTGSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 97)	SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYRQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTIIGAQAEDEADYYCQSRDSSDNRVLFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 98)

В рамках настоящего изобретения, термин «антитело» в совокупности относится к белку, который специфически связывается с определенным антигеном, и используется в самом широком смысле, и это может быть белок, продуцированный иммунной системой в ответ на стимуляцию антигеном, или белок, синтезированный химически или полученный рекомбинантно. Тип антител особым образом не ограничивается. В частности, антитело включает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), синтетические антитела (также называемые миметиками антител), химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела или слитые белки антител (также называемые конъюгатами антител), при условии, что такие антитела проявляют желаемую биологическую активность.

Интактное антитело (например, типа IgG) имеет структуру, состоящую из двух полноразмерных легких цепей и двух полноразмерных тяжелых цепей, где каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидными связями. Константная область антитела подразделяется на константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, где тяжелые цепи константной области представляют собой тип гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε) и подкласс гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3), гамма 4 (γ4), альфа1 (α1) или альфа 2 (α2), и легкие цепи константной области представляют собой тип каппа (κ) или лямбда (λ) тип.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту антитела, который способен специфически связываться с антигеном даже при отсутствии, по меньшей мере, части аминокислот, присутствующих в полноразмерной цепи. Такой фрагмент является биологически активным в том смысле, что он связывается с антигеном-мишенью и конкурирует с другими антигенсвязывающими молекулами, включая интактное антитело, за связывание с данным эпитопом. Антигенсвязывающий фрагмент может не включать константный домен тяжелой цепи (т. е. CH2, CH3 и CH4 в зависимости от изотипов антител) в Fc-области интактного антитела. Примеры антигенсвязывающего фрагмента могут включать одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) (например, scFv, (scFv)₂ и т. д.), антигенсвязывающий фрагмент (Fab) (например, Fab, Fab', F(ab')₂ и т.д.), доменные антитела, пептидные антитела, минитела, интратела, диатела, тритела, тетратела или одноцепочечные антитела и т.д., не ограничиваясь этим. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv или слитый полипептид (scFv-Fc), в котором scFv слит с Fc-областью иммуноглобулина (например, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM и т. д.) или слитый полипептид (scFv-Cκ (константная область каппа) или scFv-Cλ (константная область лямбда), в котором scFv слит с константной областью легкой цепи (например, каппа или лямбда), не ограничиваясь этим.

Термин «тяжелая цепь» интерпретируется как имеющий значение, включающее полноразмерную тяжелую цепь, содержащую домен вариабельной V_H-области, включающий аминокислотную последовательность, имеющую последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности к антигену, и три домена константной области, C_H1, C_H2 и C_H3, и шарнир, и их фрагменты. Кроме того, термин «легкая цепь» интерпретируется как имеющий значение, включающее полноразмерную легкую цепь, включающую домен вариабельной V_L-области, включающий аминокислотную последовательность, имеющую последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности к антигену, и домен константной области CL, и их фрагменты.

Термин «определяющий комплементарность участок (CDR)» относится к участку в вариабельной области антитела, который придает специфичность связывания или аффинность связывания с антигеном. Как правило, имеется три CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) в вариабельной области тяжелой цепи и три CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3) в вариабельной области легкой цепи. CDR могут обеспечивать ключевые контактные остатки для связывания антитела или его фрагмента с антигеном или эпитопом. Термин «каркасная область (FR)» относится к не-CDR участкам вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Обычно имеется четыре FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3 и FR-H4) в вариабельной области тяжелой цепи и четыре FR (FR-L1, FR-L2, FR-L3 и FR-L4) в вариабельной области легкой цепи. Точные границы аминокислотной последовательности данных CDR или FR можно легко определить с использованием любой из ряда хорошо известных систем, таких как система нумерации Kabat, система нумерации Chothia, система нумерации Contact, система нумерации IMGT, система нумерации Aho, система нумерации AbM и т.д.

Термин «вариабельная область» относится к домену тяжелой цепи или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL), как правило, имеют одинаковую структуру, и каждый домен включает четыре консервативных каркасных участка (FR) и три CDR.

В конкретном варианте осуществления муцин-1-связывающий полипептид по настоящему изобретению может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), пептидное антитело, антигенсвязывающий фрагмент (Fab), моноклональное антитело, биспецифическое антитело, минитело, доменное антитело, синтетическое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело или слитый белок на основе антитела, не ограничиваясь этим.

В предпочтительном конкретном варианте осуществления муцин-1-связывающий полипептид по настоящему изобретению может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

Термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)» относится к одноцепочечному фрагменту антитела, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) антитела связаны ковалентной связью. VH-область и VL-область могут быть связаны друг с другом непосредственно или через линкер.

Линкер может быть водорастворимым и/или гибким линкером. Например, N-конец VH и C-конец VL или C-конец VH и N-конец VL могут быть связаны друг с другом через линкер. Линкер может представлять собой пептидный линкер, например, имеющий длину от 10 до 30 аминокислот, от 10 до 25 аминокислот, от 10 до 20 аминокислот, от 10 до 15 аминокислот, от 15 до 30 аминокислот, от 15 до 25 аминокислот, от 15 до 20 аминокислот, в частности, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислот, не ограничиваясь этим.

Аминокислотные последовательности, подходящие для линкера, известны в данной области. Например, линкер может представлять собой богатый глицином линкер для обеспечения гибкости и может включать серин (Ser), аспарагин (Asn), аланин (Ala) или треонин (Thr) для обеспечения растворимости. Линкер может состоять в общей сложности из 1-100, 2-50 или 5-25 одной или более аминокислот из группы, состоящей из Gly, Asn, Ser, Thr и Ala. В качестве неограничивающего примера аминокислотная последовательность линкера может представлять собой последовательность, имеющую различное количество повторов GGGS или GGGGS, например, 2, 3, 4 и 5 повторов. Например, линкер может быть GGGGSGGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS или GGGGSGGGGSGGGAS, не ограничиваясь этим.

scFv сохраняет антигенную специфичность исходного антитела, несмотря на удаление константных областей и введение линкера. scFv может экспрессироваться из полинуклеотидов, кодирующих VH-область и VL-область, не ограничиваясь этим.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду scFv, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 99.

В настоящем изобретении варианты, сохраняющие активность, эквивалентную активности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, например, варианты, имеющие примерно 80%, примерно 81%, примерно 82%, примерно 83%, примерно 84%, примерно 85%, примерно 86%, примерно 87%, примерно 88%, примерно 89%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% или более идентичность с аминокислотными последовательностями, представленными в настоящем документе, и сохраняющие эквивалентную им биологическую активность, также включаются в объем настоящего изобретения.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему муцин-1-связывающий полипептид.

В одном предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид может включать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 100. Кроме того, настоящее изобретение может включать выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% или более идентичность с последовательностью и сохраняющий эквивалентную ей активность. В одном варианте осуществления полинуклеотид может быть кодон-оптимизированным для экспрессии у человека.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид.

В векторе полинуклеотид может быть операбельно связан с промотором. Термин «операбельно связанный» относится к функциональной связи между контрольной нуклеотидной последовательностью, регулирующей экспрессию (например, промоторной последовательностью), и другой нуклеотидной последовательностью. Контрольная последовательность может быть операбельно связана с контрольной последовательностью транскрипции и/или трансляции другой нуклеотидной последовательности.

Вектор может быть сконструирован как вектор для типичного клонирования или экспрессии. Вектор экспрессии может представлять собой вектор, обычно используемый в данной области для экспрессии чужеродного белка в растениях, животных или микроорганизмах. Вектор может быть сконструирован различными способами, известными в данной области.

Вектор может быть сконструирован с использованием прокариотической клетки или эукариотической клетки в качестве клетки-хозяина. Например, когда используемый вектор представляет собой вектор экспрессии, и прокариотическая клетка используется в качестве клетки-хозяина, то вектор обычно может включать сильный промотор, способный инициировать транскрипцию (например, промотор pLλ, промотор CMV, промотор trp, промотор lac, промотор tac, промотор T7 и т. д.), сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и последовательность терминации транскрипции/трансляции. Когда эукариотическая клетка используется в качестве клетки-хозяина, то ориджин репликации, который включен в вектор и функционирует в эукариотической клетке, может включать ориджин репликации f1, ориджин репликации SV40, ориджин репликации pMB1, ориджин репликации аденовируса, ориджин репликации AAV, ориджин репликации BBV и т.д., не ограничиваясь этим. Кроме того, промотор, полученный из геномов клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина), или промотор, полученный из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса, промотор вируса коровьей оспы 7.5K, промотор SV40, промотор цитомегаловируса и tk промотор HSV), и последовательность терминации транскрипции может, как правило, представлять последовательность полиаденилирования. При необходимости вектор может дополнительно включать энхансерную последовательность, 5'- и 3'-нетранслируемые области, секреторную сигнальную последовательность, сайт сплайсинга, маркер селекции (например, ген устойчивости к антибиотику) и т. д.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид.

Клетка может быть получена введением вектора в подходящую клетку-хозяин. Клетка-хозяин, содержащая вектор, может быть пригодна для клонирования или экспрессии полинуклеотида, включенного в вектор. Клетка-хозяин представляет собой клетку, способную стабильно и непрерывно клонировать или экспрессировать вектор, и может быть использована любая клетка-хозяин, известная в данной области. Например, прокариотическая клетка может включать, например, E.coli JM109, E.coli BL21, E.coli RR1, E.coli LE392, E.coli B, E.coli X 1776, E.coli W3110, штаммы рода Bacillus, такие как Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, и штаммы семейства энтеробактерий, такие как Salmonella typhimurium, Serratia marcescens и различные виды Pseudomonas. При трансформации в эукариотическую клетку, клетка-хозяин может включать дрожжевую клетку (Saccharomyce cerevisiae), клетку насекомого, клетку растения и клетку животного, например Sp2/0, клетка яичника китайского хомячка (CHO) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, клеточная линия MDCK и т.д., не ограничиваясь этим.

Доставка (введение) полинуклеотида или вектора, содержащего его, в клетку-хозяин может быть осуществлена с использованием способа доставки, широко известного в данной области. В отношении способа доставки, например, когда клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, то можно использовать метод с CaCl₂ или метод электропорации, и когда клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, то можно использовать метод микроинъекции, метод осаждения фосфатом кальция, метод электропорации, метод липосома-опосредованной трансфекции и бомбардировку генной пушкой, не ограничиваясь этим.

Способ селекции трансформированной клетки-хозяина можно легко осуществить с использованием фенотипа, экспрессируемого маркером селекции, в соответствии со способом, хорошо известным в данной области. Например, когда маркер селекции представляет собой специфический ген устойчивости к антибиотику, то трансформант можно легко отобрать культивированием трансформанта в среде, содержащей антибиотик. Трансформированные клетки-хозяева можно культивировать в течение периода времени, достаточного для экспрессии или секреции полипептида, и полипептид можно выделить и очистить с помощью метода, обычно используемого для выделения и очистки белков, например, метода на основе растворимости, такого как высаливание, осаждение растворителем и т. д., метода на основе разности молекулярных масс, такого как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и т. д., метода на основе заряда, такого как ионообменная хроматография или хроматография на гидроксилапатите и т. д., метода на основе специфической аффинности, такого как аффинная хроматография, и т. д., метода на основе разницы гидрофобности, такого как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой, и т. д., метода на основе разницы изоэлектрических точек, такого как изоэлектрический точечный электрофорез и др.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), содержащему муцин-1-связывающий полипептид. Муцин-1-связывающий полипептид пригоден для применения в химерных антигенных рецепторах, поскольку его можно сконструировать таким, чтобы он экспрессировался в виде участка одной цепи вместе с другими компонентами CAR.

Химерный антигенный рецептор обычно может включать внеклеточный домен, содержащий муцин-1-связывающий полипептид; трансмембранный домен; внутриклеточный сигнальный домен или домен активации Т-клеток. Кроме того, внеклеточный домен может дополнительно включать спейсерную область (или шарнирную область) между полипептидом и трансмембранным доменом. Кроме того, химерный антигенный рецептор может дополнительно включать один или более костимулирующих доменов, и предпочтительно костимулирующие домены могут быть помещены между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом.

Соответственно, в одном предпочтительном варианте осуществления химерный антигенный рецептор может включать внеклеточный домен, содержащий муцин-1-связывающий полипептид; шарнирный домен; трансмембранный домен; один или более костимулирующих доменов; и внутриклеточный сигнальный домен. Каждый домен может быть гетерогенным. Другими словами, он может состоять из последовательностей, полученных из разных белковых цепей. Каждый домен может быть связан коротким олиго- или полипептидным линкером, например, линкером, имеющим длину от 2 до 10 аминокислот. Кроме того, химерный антигенный рецептор может состоять из одной полипептидной цепи, в которой соответствующие домены связаны.

Внеклеточный домен включает муцин-1-связывающий полипептид, описанный выше, который распознает муцин-1, экспрессированный на поверхности опухолевой клетки.

Внеклеточный домен может дополнительно включать спейсерную область (или шарнирную область). Спейсерная область может быть помещена между муцин-1-связывающим полипептидом и трансмембранным доменом. Спейсерная область позволяет муцин-1-связывающему полипептиду более гибко распознавать антиген-мишень на заданном расстоянии от клеточной мембраны CAR-T-клетки. Спейсерная область обычно может представлять собой полипептид, имеющий длину от 10 или более аминокислот, например, длину от 10 до 300 аминокислот, длину от 10 до 250 аминокислот, длину от 10 до 200 аминокислот, длину от 10 до 150 аминокислот, длиной от 10 до 100 аминокислот, длиной от 10 до 50 аминокислот, не ограничиваясь этим.

В качестве примера спейсерная область может быть представлена шарнирной областью CD8α или CD28, константной областью иммуноглобулина (IgG) и т. д., и могут быть введены мутации для устранения нецелевых эффектов. Например, константная область иммуноглобулина может быть получена только из шарнира IgG, части или всех доменов СН2 и СН3, например, Fc-области. IgG может предпочтительно представлять собой IgG2 или IgG4. В конкретном варианте осуществления спейсер может представлять собой химерный полипептид, содержащий одну или более шарнирных последовательностей, последовательностей СН2 и СН3, полученных из IgG2, IgG4 и/или IgG2 и IgG4. В конкретном варианте осуществления шарнирный домен может быть представлен последовательностью SEQ ID NO: 112, не ограничиваясь этим.

Трансмембранный домен служит для соединения домена клеточной мембраны и сигнального домена внутри клеточной мембраны, и может быть получен из природных или синтетических источников. При получении из природного источника домен может происходить из любого мембраносвязывающего или трансмембранного белка. Например, трансмембранный домен может представлять собой трансмембранный домен Т-клеточного рецептора с альфа-, бета- или дзета-цепью, CD3-эпсилон, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154, не ограничиваясь этим. В одном предпочтительном варианте осуществления трансмембранный домен может представлять собой трансмембранный домен CD28 или CD8, не ограничиваясь этим. При получении из синтетического источника синтетический трансмембранный домен может включать гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин, и может включать фенилаланин, триптофан и валин на каждом своем конце, не ограничиваясь этим. В одном варианте трансмембранный домен может быть представлен последовательностью SEQ ID NO: 113, не ограничиваясь этим.

Костимулирующий домен представляет собой сайт, на который передаются костимулирующие сигналы, и он представляет собой сайт, который передает сигналы для CAR-T-клеток для индукции иммунного ответа и пролиферации. Костимулирующий домен может быть селективно введен для повышения пролиферации, цитотоксичности, устойчивого ответа и пролонгации существования CAR-T-клеток. Костимулирующий домен может быть одним или более, например, одним, двумя или тремя, выбранными из сигнальных доменов CD28, OX-40 (CD134), 4-1BB (CD137), CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1 (CD11a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc-рецептора гамма, молекулы MHC класса I, белка рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегрина, сигнальной молекулы активации лимфоцитов (SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAMF1 (CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp или CD19a, не ограничиваясь этим. В одном предпочтительном варианте костимулирующий домен может быть одним или более, например, одним, двумя или тремя, выбранными из сигнальных доменов CD28, OX-40 (CD134), 4-1BB (CD137), CD27 или ICOS, не ограничиваясь этим. В одном варианте костимулирующий домен может быть представлен последовательностью SEQ ID NO: 114, не ограничиваясь этим.

Внутриклеточный сигнальный домен представляет собой сайт, который активирует Т-клеточный иммунный ответ на антиген, связанный с муцин-1-связывающим полипептидом. Внутриклеточный сигнальный домен может представлять собой компонент Т-клеточного рецептора (TCR) или может включать сигнальный мотив, известный как мотив активации иммунных рецепторов на основе тирозина (ITAM). Например, внутриклеточный сигнальный домен может быть сигнальным доменом, полученным из TCR или CD3 дзета, FcR гамма, CD3 гамма, CD3 дельта и CD3 эпсилон, не ограничиваясь этим. В предпочтительном примере внутриклеточный сигнальный домен может представлять собой сигнальный домен CD3 дзета, не ограничиваясь этим. Внутриклеточный сигнальный домен может активировать CAR-T-клетки, когда участок муцин-1-связывающего полипептидного внеклеточного домена связывается с мишенью. Например, CAR может стимулировать функцию Т-клеток, например, литическую активность клеток или активность Т-хелперов, и может индуцировать секрецию цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может быть представлен последовательностью SEQ ID NO: 115, не ограничиваясь этим.

В некоторых вариантах осуществления CAR может экспрессироваться в форме, содержащей сигнальную последовательность. Кроме того, CAR может экспрессироваться вместе с дополнительными последовательностями, пригодными для мониторинга экспрессии, например, последовательностью «рибосомного перепрыгивания», такой как пептид 2А или усеченный полипептид клеточной поверхности (tHER2 или tEGFR или усеченный PSMA и т.д.).

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может быть кодон-оптимизированным для экспрессии у человека.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Вектор может быть сконструирован в виде вектора для клонирования гена, вектора для экспрессии белка или вектора для доставки гена. Детали вектора для клонирования или экспрессии описаны выше.

Любой вектор, известный в данной области, может быть подходящим для настоящего изобретения. Например, вектор может быть вирусным вектором. Например, вектор представляет собой ретровирусный вектор, ДНК-вектор, вектор на основе вируса мышиного лейкоза, вектор SFG, плазмиду, РНК-вектор, аденовирусный вектор, бакуловирусный вектор, вектор на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусный вектор, вектор на основе вируса осповакцины, вектор на основе вируса простого герпеса, вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), или лентивирусный вектор, не ограничиваясь этим.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение относится к иммунной клетке, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, содержащий муцин-1-связывающий полипептид.

Иммунная клетка может включать Т-клетки, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), естественные клетки-киллеры (NK), клетки, экспрессирующие TCR, дендритные клетки или NK-T-клетки, не ограничиваясь этим. Кроме того, иммунная клетка может быть происходить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC). Иммунная клетка может быть получена из любого известного источника. Например, иммунная клетка может быть подвергнута дифференцировке in vitro из популяции гемопоэтических стволовых клеток или получена от пациента. Иммунная клетка может быть получена, например, из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцита, плеврального выпота, ткани селезенки и опухоли. Кроме того, иммунная клетка может быть получена из одной или более линий иммунных клеток, доступных в данной области техники.

Иммунная клетка может быть аутологичной или аллогенной. Термин «аутологичные клетки» означает, что клетки получены от пациента, подлежащего лечению. Аллогенные клетки представляют клетки, которые получены от другого субъекта того же вида, что и пациент, который подлежит лечению.

Кроме того, иммунная клетка может быть получена из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC). По сравнению с аутологичными или аллогенными иммунными клетками иммунные клетки, полученные из iPSC, могут самопролиферировать. Таким образом, их массовая пролиферация осуществляется легко, и можно приготовить универсальный препарат для клеточной терапии, применимый для всех людей, и имеются преимущества производства однородного препарата и снижения затрат.

Иммунную клетку можно трансфектировать или трансдуцировать вектором с использованием метода микроинъекции, электропорации, обработки ультразвуком, биолистики (например, с генной пушкой), трансфекции с липидами, трансфекции с полимерами, преципитации фосфатом кальция, слияния протопластов, опосредованной липосомами трансфекции, с наночастицами или полиплексами и т. д., не ограничиваясь этим.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения рака, содержащей муцин-1-связывающий полипептид; выделенный полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; химерный антигенный рецептор, содержащий муцин-1-связывающий полипептид; выделенный полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор; вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор; или иммунную клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, или экспрессирующую химерный антигенный рецептор.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в профилактике или лечении рака, эффективного количества муцин-1-связывающего полипептида; выделенного полинуклеотида, кодирующего муцин-1-связывающий полипептид; вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; клетки, содержащей полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид; химерного антигенного рецептора, содержащего муцин-1-связывающий полипептид; выделенного полинуклеотида, кодирующего химерный антигенный рецептор; вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор; или иммунной клетки, содержащей полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор или экспрессирующий химерный антигенный рецептор.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения рака, содержащей Т-клетки, содержащие химерный антигенный рецептор, содержащий муцин-1-связывающий полипептид.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в профилактике или лечении рака, эффективного количества Т-клеток, содержащих химерный антигенный рецептор, содержащий муцин-1-связывающий полипептид.

Например, рак может представлять собой солидный рак или рак крови. Неограничивающие его примеры могут включать рак молочной железы, рак легких, рак предстательной железы, рак яичника, рак головного мозга, рак печени, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, рак толстого кишечника, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак почки, нефробластому, рак кожи, плоскоклеточный рак ротовой полости, эпидермоидный рак, назофарингеальную карциному, рак головы и шеи, рак кости, рак пищевода, рак мочевого пузыря, лимфому (например, лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому), рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичка, рак щитовидной железы, фолликулярную карциному, меланому, миелому, множественную миелому, мезотелиому, остеосаркому, миелодиспластический синдром, опухоль мезенхимального происхождения, саркому мягких тканей, липосаркому, гастроинтестинальную стромальную саркому, злокачественную опухоль оболочки периферических нервов (MPNST), саркому Юинга, лейомиосаркому, мезенхимальную хондросаркому, лимфосаркома, фибросаркома, рабдомиосаркома, тератокарцинома, нейробластому, медуллобластому, глиому, доброкачественную опухоль кожи или лейкоз. Рак легкого может представлять собой, например, мелкоклеточную карциному легкого (SCLC) или немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). Лейкоз может быть, например, острым миелоидным лейкозом (AML), хроническим миелогенным лейкозом (CML), острым лимфоцитарным лейкозом (ALL) или хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL).

Предпочтительно рак может представлять рак, клетки которого экспрессируют белок MUC1, и он может быть раком молочной железы, раком кожи, раком поджелудочной железы, раком предстательной железы, раком легких, раком щитовидной железы, раком желудка, раком яичника, колоректальным раком, раком печени, раком желчного пузыря, раком почки, раком шейки матки или раком мочевого пузыря, не ограничиваясь этим. Рак может быть первичным или метастатическим раком.

Пациент, подлежащий лечению, может представлять собой пациента, получающего вторичную антигиперпролиферативную терапию. Например, вторичной антигиперпролиферативной терапией может быть химиотерапия, лучевая терапия, иммунотерапия, фототерапия, криотерапия, токсинотерапия, гормональная терапия или хирургическое вмешательство.

Противоопухолевая CAR-T-терапия с использованием Т-клеток, содержащих химерный антигенный рецептор, включающий муцин-1-связывающий полипептид по настоящему изобретению, может быть осуществлена с использованием ряда способов, включающих выделение Т-клеток из крови здорового человека или пациента, подлежащего лечению, генетическое конструирование Т-клеток для экспрессии химерного антигенного рецептора, включающего муцин-1-связывающий полипептид по настоящему изобретению, экспандирование и культивирование сконструированных Т-клеток и введение сконструированных Т-клеток, культивированных таким образом, пациенту.

В предпочтительном варианте стадия выделения Т-клеток из крови здорового человека или пациента, подлежащего лечению, может быть осуществлена выделением Т-клеток после выделения лейкоцитов из крови с использованием лейкафереза или афреза, и обогащением Т-клетками. Т-клетки можно выделить с использованием композиции гранул с конъюгатами специфического антитела или маркерами на уровне CD4/CD8. В качестве альтернативы также можно стабильно получить большое количество Т-клеток посредством дифференцировки из стволовых клеток.

Стадия генетического конструирования выделенных Т-клеток для экспрессии химерного антигенного рецептора, представленного в настоящем описании, может быть осуществлена, например, путем введения нуклеотидной молекулы, сконструированной для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), в Т-клетки с использованием вектора, например, вирусного вектора (лентивирусного вектора, ретровирусного вектора и т.д.). CAR может быть введен в форме ДНК, или CAR может быть введен в форме РНК, затем РНК обратно транскрибируют в ДНК с участием обратной транскриптазы, которая может быть интегрирована в геном Т-клеток. Кроме того, в случае аллогенной клеточной терапии могут дополнительно проводиться генетические манипуляции для удаления или коррекции генов, вызывающих отторжение трансплантата в донорных Т-клетках, для предупреждения отторжения, такого как реакция «трансплантат против хозяина» (GvHD).

Стадия экспандирования и культивирования сконструированных Т-клеток может быть осуществлена культивированием, пролиферацией и экспандированием Т-клеток в соответствии с методикой культивирования, известной в данной области. В связи с этим требуется гарантия безопасности при использовании вирусов и технология отбора хорошо сделанных CAR-T-клеток.

Наконец, стадия введения сконструированных Т-клеток пациенту может быть осуществлена, например, инфузией. В предпочтительном варианте осуществления перед введением CAR-T-клеток пациент может пройти химиотерапию для лимфоистощения циклофосфамидом или флударабином для снижения уровня лейкоцитов. Кроме того, для улучшения персистенции CAR-T-клеток можно вводить вместе цитокины, такие как IL-2.

Сконструированные Т-клетки, введенные пациенту, могут опосредовать иммунные ответы против муцин-1-экспрессирующих опухолевых клеток. Такие иммунные реакции включают активацию Т-клеток, секрецию Т-клетками цитокинов, таких как IL-2 и IFN-гамма, пролиферацию и экспансию Т-клеток, распознающих опухолевые антигены, и опосредованный Т-клетками специфический киллинг (удаление опухоли) мишень-положительных клеток. Например, когда CAR специфически связывается с муцином-1 в CAR-T-клетках, T-клетки активируются посредством фосфорилирования мотива активации иммунных рецепторов на основе тирозина (ITAM) CD3 дзета, и затем может индуцироваться пролиферация T-клеток, их цитотоксичность и/или секреция цитокинов.

Как описано выше, противоопухолевая терапия с использованием CAR-T-клеток существенно активирует иммунную систему пациента и оказывает продолжительное противоопухолевое действие, и, таким образом, она имеет преимущества в том, что отсутствует необходимость в продолжении введения, и возможно персонализированное лечение с использованием собственных Т-клеток пациента.

Введение композиции по настоящему изобретению может вызвать, индуцировать или стимулировать иммунный ответ, который ингибирует, останавливает, задерживает или предупреждает начало или прогрессирование заболевания.

Термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для достижения желаемого результата, например, количеству, эффективному для лечения или профилактики рака, при введении субъектам, включая человека. Эффективное количество может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как способ формуляции, способ введения, возраст пациента, масса тела, пол, тяжесть заболевания, диета, время введения, путь введения, скорость выделения и реакция чувствительности. Доза введения или терапевтическая схема могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа, как должно быть понятно специалистам в данной области.

Терапевтическая схема с терапевтически эффективным количеством может состоять из введения одной дозы или, альтернативно, может включать ряд введений. Продолжительность фазы лечения определяется различными факторами, такими как способ формуляции, режим введения, возраст пациента, масса тела, пол, тяжесть заболевания, диета, время введения, путь введения, скорость экскреции и реакция чувствительности. Также следует понимать, что эффективная доза противоопухолевой композиции, используемой для лечения, может быть увеличена или уменьшена в ходе индивидуального терапевтического режима. Могут возникнуть вариации в дозировке, которые будут очевидны в результате стандартного диагностического анализа, известного в данной области. Композицию по настоящему изобретению в некоторых аспектах можно вводить до, во время или после лечения обычными противоопухолевыми средствами, лучевой терапией, гормональной терапией, биотерапией и/или хирургической резекции опухоли.

Композиция по настоящему изобретению может обеспечиваться вместе с одной или более добавками, выбранными из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и эксципиентов.

Фармацевтически приемлемый носитель, который обычно используют в составе на основе антитела, может представлять собой один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, гуммиарабика, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоат, а пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния, минерального масла и т.д., не ограничиваясь этим. Композиция может дополнительно включать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из разбавителей, эксципиентов, смазывающих веществ, смачивающих агентов, подсластителей, вкусовых добавок, эмульгаторов, суспендирующих агентов, консервантов и т.д., которые обычно используются при приготовлении фармацевтических композиций, в дополнение к вышеперечисленным компонентам.

Композицию можно вводить перорально или парентерально. При парентеральном введении можно использовать внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, эндотелиальное введение, местное введение, интраназальное введение, внутрилегочное введение и ректальное введение. При пероральном введении белки или пептиды расщепляются, и, таким образом, композиции для перорального введения формулируют таким образом, чтобы покрыть активный агент или защитить его от расщепления в желудке. Кроме того, композицию можно вводить с помощью любого устройства, способного транспортировать активное вещество к клетке-мишени.

Клетки можно вводить с использованием стандартных методов введения, составов или устройств. Составы и устройства, такие как шприцы и флаконы для хранения, и введение композиции могут быть использованы надлежащим образом. Введение клеток может быть аутологичным, аллогенным или ксеногенным. Иммунные клетки, полученные из периферической крови, или их потомство (например, полученные in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить посредством введения через катетер, системной инъекции, местной инъекции, внутривенной инъекции или местной инъекции, включая парентеральное введение. При введении иммунных клеточных терапевтических средств, они обычно могут быть приготовлены в виде дозированных форм для инъекций (растворы, суспензии, эмульсии). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток можно вводить парентерально. Составы включают препараты для внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, эндотелиального введения, местного введения, интраназального введения, внутрилегочного введения и ректального введения.

В некоторых вариантах осуществления композиция представлена в виде стерильного жидкого препарата, например, в виде изотонического водного раствора, суспензии, эмульсии, дисперсии или вязкой композиции, которая, в некоторых аспектах, может быть забуферена до выбранного рН. Жидкие препараты обычно легче приготовить, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции особенно удобно вводить путем инъекции. С другой стороны, вязкие композиции могут быть формулированы в пределах соответствующего диапазона вязкости, чтобы обеспечить более длительные периоды контакта с определенной тканью. Жидкие или вязкие композиции могут включать носитель, который может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их соответствующие смеси.

Стерильные растворы для инъекций можно приготовить включением связывающей молекулы в растворитель, такой как смесь с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза и т.п. Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие агенты (например, метилцеллюлоза), рН-буферные агенты, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и т. д., в зависимости от пути введения и желаемого препарата.

Могут быть добавлены различные добавки, повышающие стабильность и стерильность композиций, включая противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и буферы. Профилактика микробного действия может быть обеспечена различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и др. Пролонгированное всасывание инъекционной лекарственной формы можно обеспечить применением средств, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Подробное описание вариантов осуществления

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие иллюстративные варианты осуществления. Однако эти иллюстративные варианты осуществления предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается этими иллюстративными вариантами осуществления.

Пример 1. Получение scFv, связывающегося с муцином-1

Муцин-1 человека (SEQ ID NO: 110) конъюгировали с CD4 (SEQ ID NO: 111) с получением рекомбинантного антигена. Из библиотек scFv отбирали клоны, секретирующие scFv, специфичные к антигену, и отбирали 10 видов scFv, специфически связывающихся с муцином-1. Информация о последовательности 10 выбранных таким образом видов scFv и положительного контроля scFv G03 (положительный контроль, полученный с использованием аминокислотной последовательности антитела G3 из таблицы 6 в WO 2018/174544), использованных в последующих экспериментах, приведена в таблице 3.

Таблица 3
Название клона	Аминокислотная последовательность scFv
2445_1F09	EVQLLETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGWNHGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASQSGLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGSSEVGSRYVSWYQQLPGTAPRLLIYKNDRRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGYVFGTGTKLTVL (SEQ ID NO: 9)
2447_2H08	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPHILTGYYRGGWFDPWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVTITCQGDSLRTSYAGWLQQKPGQAPVLVLYGKTSRPSGIPDRFSGSTSGNTASLTITGAQAEDEAEYFCHSRDSNDNYLEVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 19)
2447_3A01	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADFVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDISSGWYPGTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTVTGAQAEDEADYYCSSRDSSDDVVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 29)
2447_3A08	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDRATIFGVVTPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSIRSYSASWYQQKPGQAPRLVIYGKNNRPSGIPDRVSGSTSGNTASLTVTGAQAEDEADYYCNSRDSSGNRVVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 39)
2447_3A09	EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAATGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTASYYCAKDVSSGWYWYAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPGRFSGSSSGNTASLTVTGAQAEDEADYYCNSRDSGGSVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 49)
2447_3A12	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLRGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPHILTGYYRGGWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVVLGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHRVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 59)
2447_3B07	QVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGRGLEWVSLTSWDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDHSSGWYNGGMDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 69)
2447_3C08	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRGSGYEGNYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGTTSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHYVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 79)
2447_3H02	EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWDSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVSSGWYWYAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDILRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNRVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 89)
2447_3H08	EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSSGWYTGSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYRQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTIIGAQAEDEADYYCQSRDSSDNRVLFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 99)
G03	EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTSYWMHWVQQAPGKGLEWIGYINPGTGYIEYNQKFKDRVTITADKSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSTAPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDIKSYLSWYQQKPGQAPRLLIYYATRLADGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCLQYDESPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 109)

Таблица 4
Название клона	Нуклеотидная последовательность scFv
2445_1F09	GAGGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGCACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGCGGCTGGAACCACGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCCAGTCTGGGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGGGGCAGCTCAGAAGTCGGAAGTAGATATGTGTCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACGGCCCCCAGACTCCTCATCTATAAGAATGATCGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCTCCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 10)
2447_2H08	GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAACTACGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCATATTTTGACTGGTTATTATAGGGGAGGGTGGTTCGACCCCTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGTCAGACAGTCACCATCACGTGCCAAGGAGACAGCCTCAGAACCTCTTATGCAGGCTGGCTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTCGTCCTCTATGGTAAAACCAGCCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCACCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGAGTATTTCTGTCACTCCCGGGACAGCAATGATAACTATCTAGAGGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 20)
2447_3A01	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGTCTATGCGGACTTTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATATTTCAAGTGGCTGGTACCCAGGGACCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCGTCACTGGGGCTCAGGCGGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTAGCTCCCGGGACAGCAGTGATGATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTCCTA (SEQ ID NO: 30)
2447_3A08	GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTACGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGCTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCCGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAGGGAGACAGTATTAGAAGTTATTCTGCCAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTCGCCTTGTTATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGAGTCTCTGGCTCCACTTCAGGAAATACAGCTTCCTTGACCGTCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCGTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTCCTA (SEQ ID NO: 40)
2447_3A09	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTCGTATTACTGTGCAAAAGATGTTAGCAGTGGCTGGTACTGGTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGGCCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCGTCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAATTCCCGGGACAGCGGTGGTTCTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 50)
2447_3A12	GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTATGCACAGAAGCTCCGGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCATATTTTGACTGGTTATTATAGGGGAGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGTCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCGTGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 60)
2447_3B07	CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGTCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAGGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTACTAGTTGGGATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACCGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATCATAGCAGCGGCTGGTACAACGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 70)
2447_3C08	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAGGGGTAGTGGCTACGAAGGAAACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGTACCACCTCAGGAAACACAGCCTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA (SEQ ID NO: 80)
2447_3H02	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGGATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATGTTAGCAGTGGCTGGTACTGGTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACATCCTCAGAAGTTATTATGCAAGTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATTTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCGTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 90)
2447_3H08	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACAGCTGTGTACTACTGTGCGAGAGATCGGAGTAGTGGCTGGTACACGGGGTCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGCTAGCTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCGGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCGGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCATTGGGGCTCAGGCGGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTCAGTCCCGGGACAGCAGTGATAACCGTGTTCTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA (SEQ ID NO: 100)

Аффинность антитела scFv-Fc, включающего scFv к антигену муцину-1, измеряли с использованием Biacore T200 (GE Healthcare). Антитело против человеческого IgG (Fc) (GE Healthcare, номер по каталогу BR-1008-39, конечная концентрация 25 мкг/мл) наносили со скоростью 5 мкл/мин в течение 360 с на сенсорный чип CM5 серии S (GE Healthcare, номер по каталогу BR-1005-30) с использованием набора для сочетания аминов (GE Healthcare, номер по каталогу BR-1000-50) и иммобилизовали примерно при 5000-7000 резонансных единиц. Белок MUC1 человека, который использовали в качестве антигена, инжектировали со скоростью 30 мкл/мин в пяти различных концентрациях в диапазоне от 25 нМ до 400 нМ, и получали значения κ_a и κ_d, как показано в следующей таблице, и на их основе рассчитывали значения K_D. В результате значения K_D (M), указывающие на аффинность связывания с муцином-1, приведены в таблице 5.

Таблица 5
Название клона	K D (M)
2447_2H08	94,8 × 10-9
2447_3A01	51,5 × 10-9
2447_3A08	320,3 × 10-9
2447_3A09	62,1 × 10-9
2447_3A12	13,8 × 10-9
2447_3B07	51,7 × 10-9
2447_3C08	24,0 × 10-9
2447_3H02	58,8 × 10-9
2447_3H08	39,9 × 10-9
G03	27,6 × 10-9

Пример 2. Получение CAR-T-клеток с использованием связывания scFv с муцином-1

2-1. Получение CAR-экспрессирующего лентивирусного вектора переноса

Готовили лентивирусный вектор (вектор переноса или вектор экспрессии), экспрессирующий химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточный домен, содержащий полипептидную последовательность scFv (нуклеотидная последовательность в таблице 4), шарнир (CD8α) (SEQ ID NO: 112), трансмембранный домен (CD28) (SEQ ID NO: 113), костимулирующий домен (CD28) (SEQ ID NO: 114) и внутриклеточный сигнальный домен (CD3 дзета) (SEQ ID NO: 115). Область scFv в CAR выделяли с использованием ПЦР из плазмиды, предоставленной скрининговой компанией, и шарнирный домен, трансмембранный белок и сигнальные домены CD28 и CD3z выделяли из синтезированной плазмиды с помощью ПЦР. Два фрагмента клонировали в вектор pLVX-EF1alpha компании Clonetech с использованием набора для клонирования по технологии In-Fusion HD Takara. Клонированный таким образом лентивирусный вектор трансфектировали в клеточную линию Lenti-X 293T компании Takara (код продукта 632180) вместе с упаковочной плазмидой, входящей в состав экспрессионной системы Lenti-X той же компании (версия EF1a) (код продукта 631253), и через 24 ч, бульон отделяли, и содержащийся в нем лентивирус использовали для дальнейших исследований.

2-2. Получение лентивирусных частиц

Для получения лентивируса, лентивирусный вектор переноса (вектор переноса или вектор экспрессии), приготовленный как описано выше, и смесь упаковочных плазмид трансфектировали в клетки Lenti-X 293T (продукт Takara с номером 632180) с использованием липосомного реагента для трансфекции нуклеиновой кислоты (липофектамин, Gibco). За сутки до трансфекции клетки HEK293T получали при слиянии примерно от 6% до 70% площади культуральной чашки. В качестве среды использовали среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM, Gibco) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FBS, Gibco), и культуральную чашку размером 100 мм или 150 мм. Условия культивирования поддерживали при 37°C, 5% CO₂ и во влажной атмосфере. Вектор переноса, смесь упаковочных плазмид для лентивируса, и липосомный реагент для трансфекции нуклеиновой кислоты смешивали при комнатной температуре, регулируя их соотношение в соответствии с инструкциями производителя, и раскапывали на клетки HEK293T на чашках во время культивирования для трансфекции клеток HEK293T. После трансфекции лентивирусы, продуцированные в клетках HEK293T, извлекали из клеток, и они находились в виде вирусных частиц в культуре клеток. Через 48 ч после трансфекции из культурального планшета удаляли только культуральный клеточный раствор и центрифугировали для получения лентивирусных частиц в виде осадка. Осадок суспендировали с использованием раствора, который затем сразу же использовали или хранили в криогенной морозильной камере. В качестве раствора использовали среду DMEM, использованную выше, или раствор, который готовили путем добавления оптимизатора для экспансии Т-клеток (26 мл) в 1-литровый флакон CTS оптимизатора для экспансии Т-клеток SFM (Gibco), используемого при культивировании Т-клеток, добавляя CTS Innume Cell SR (заменитель сыворотки, Gibo) в конечной концентрации 2%, и затем добавляли добавку CTS GlutaMAX-I 100X (Gibco) в конечной концентрации 1X.

2-3. Получение CAR-T-клеток

Образцы мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) поставлялись по соглашению об исследованиях с Католическим университетом Кореи, и ряд доноров и сбор крови проводили с одобрения Институционального наблюдательного совета Католического университета Кореи. Вся кровь была от здоровых людей. В иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения «донор» относится к донору образца РВМС, использованного в эксперименте, и число, стоящее после слова «донор», означает, что доноры были разными (например, обозначены как «донор 03», «донор 04», «донор 05», «донор 06», «донор 07», «донор 08», «донор 18-09», «донор 20-01» и др.). Для получения CAR-T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR) на поверхности Т-клеток, флаконы с замороженными РВМС оттаивали на водяной бане при 37°С. На следующие сутки после оттаивания замороженных РВМС подсчитывали количество клеток с последующей заменой свежей средой. В то же время Т-клетки активировали с использованием гранул, специфичных для экспансии Т-клеток (Dynabeads Human T-expander CD3/CD28, Gibco), и химерный антигенный рецептор (CAR) в форме лентивируса трансдуцировали обработкой Т-клеток в соответствии с количеством активированных клеток. Для культивирования трансдуцированных Т-клеток добавляли суспензию интерлейкина-2 (Norvatis) в стерилизованной фильтрованием дистиллированной воде в концентрации 100 МЕ/мл в зависимости от количества среды, и в течение последующего периода культивирования суспензию непрерывно добавляли при замене или добавлении среды. Период культивирования клеток составлял в целом от 10 до 11 суток после активации, и культивирование клеток проводили при замене или новом добавлении среды каждые 1-2 суток в зависимости от количества клеток. В конце периода культивирования культивирование клеток было завершено, и получение CAR-T-клеток было также завершено. Полученные CAR-T-клетки использовали сразу или смешивали с раствором для криоконсервации клеток и помещали во флакон для замораживания клеток и хранили в резервуаре с жидким азотом. Уровни экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) полученными CAR-T-клетами и их характеристики анализировали с помощью проточной цитометрии (FACS).

Пример 3. Анализ аффинности растворимого scFv к муцин-1-экспрессирующей клетке

Далее, если не указано иное, то информация о клеточных линиях, используемых в настоящем иллюстративном варианте осуществления, была следующей:

- pANC-1; Корейский банк клеточных линий, 21469

- НСС1954; Корейский банк клеточных линий, 9S1954

- НСС70; Корейский банк клеточных линий, 9S0070

- Т47Д; Корейский банк клеточных линий, 30133

- НЕК293Т; АТСС, CRL-3216

- Huh7; Корейский банк клеточных линий, 60104

- HEPG2; АТСС, HB-8065

- SK-N-SH; Корейский банк клеточных линий, 30011

В целом в примере 3 использовали 4 клеточные линии, и среди них клеточные линии HEK293 (ATCC) и PANC-1 (ATCC) использовали в качестве отрицательного контроля, и HEK293T-v1 (ATCC и трансформированные LG Chem) и T47D (Корейский банк клеточных линий) использовали в качестве положительных контролей. Клеточная линия HEK293T-v1, используемая в качестве положительного контроля, представляет собой клеточную линию, полученную экспрессией С-субъединицы MUC1 в клеточной линии HEK293T, не экспрессирующей муцин-1. Использовали 11 типов scFv, среди них положительным контролем был G03 (таблица 3). Растворимый scFv, полученный в примере 1, разбавляли в 5 раз для получения в общей сложности 8 серийных разведений. Каждое серийное разведение имело концентрацию 380 мкг/мл, 76 мкг/мл, 15,2 мкг/мл, 3,04 мкг/мл, 0,608 мкг/мл, 0,1216 мкг/мл, 0,02432 мкг/мл, 0,004864 мкг/мл. Буфер, используемый для разбавления растворимого scFv и промывки клеток, представлял собой PBS, содержащий 2% FBS и 10 мМ ЭДТА. Четыре вида клеток готовили при плотности 1×10⁶/мл соответственно и помещали в 96-луночный планшет с U-образным дном для культивирования клеток при плотности 1×10⁵/100 мкл/лунку с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Приготовленный ранее растворимый scFv вносили из расчета 50 мкл/лунку. Клетки оставляли при 4°С на 1 ч. К ним добавляли 150 мкл/лунку буфера для промывки клеток и затем перемешивали с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали и добавляли 200 мкл/лунку буфера для промывки клеток и затем перемешивали с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Козье антитело Fc-биотин против IgG человека (Invitrogen, A18821) разбавляли в 500 раз и вносили из расчета 50 мкл/лунку. Клетки оставляли при 4°С на 20 мин. Туда добавляли 150 мкл/лунку буфера для промывки клеток и затем перемешивали с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали и добавляли 200 мкл/лунку буфера для промывки клеток и затем перемешивали с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. PE-стрептавидин (BD Pharmigen, 554061) разбавляли в 1000 раз и вносили из расчета 50 мкл/лунку. Клетки оставляли при 4°С на 20 мин. К клетками добавляли 150 мкл/лунку буфера для промывки клеток и затем перемешивали с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали и добавляли 200 мкл/лунку буфера для промывки клеток и затем перемешивали с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Добавляли 80 мкл/лунку буфера для промывки клеток и перемешивали с последующим анализом проточной цитометрией.

Аффинность растворимого scFv к муцин-1-экспрессирующим клеткам подтверждали значениями PE MFI по результатам проточной цитометрии. Каждую клеточную линию без растворимого scFv окрашивали другим флуоресцентным антителом (козье антитело Fc-биотин против IgG человека, PE-стрептавидин), которое использовали в качестве значения отрицательного контроля, и каждую клеточную линию обрабатывали G03 в концентрации 380 мкг/мл, которое использовали в качестве значения положительного контроля, и значение MFI корректировали следующим образом:

(опытное значение - значение отрицательного контроля)/( значение положительного контроля - значение отрицательного контроля) × 100=поправочное значение для опытного значения.

EC₅₀ рассчитывали с использованием скорректированных значений, и описанные результаты являются результатами для двух клеточных линий, использованных в качестве положительных контролей (таблица 6).

Таблица 6
Название клона	EC 50 (293T-v1) (мкг/мл)	EC 50 (T47D) (мкг/мл)
G03	3,46	3,56
2445_1F09	1,51×107	6,19×107
2447_3A01	4,78	11,14
2447_3A08	1,73	3,76
2447_3A09	1,96	2,2
2447_3A12	1,47	0,75
2447_3C08	1,38	2,04
2447_3H02	1,41	1,6
2447_3H08	2,57	5,6
2447_2H08	21,73	130,4
2447_3B07	3,86	3,47

Пример 4. Анализ секреции цитокинов CAR-T-клетками

Оценивали ответные реакции иммунных клеток (Т-клеток), в которые вводили scFv против MUC1 в виде CAR, на MUC1-положительные опухолевые клетки (T47D, HEK293T-V1). Клетки T47D, естественно экспрессирующие высокие уровни MUC1, и клетки HEK293T-V1, сверхэкспрессирующие С-субъединицу MUC1 человека, сокультивировали с 10 видами иммунных клеток, 2445_1F09, 2447_3A01, 2447_3A08, 2447_3A09, 2447_3A12, 2447_3C08, 2447_3H02, 2447_3H08, 2447_2H08, 2447_3B07, приготовленных в примере 2 (на некоторых фигурах обозначены аббревиатурой 1F09, 3A01, 3A08, 3A09, 3A12, 3C08, 3H02, 3H08, 2H08, 3B07 соответственно), в которые вводили scFv против MUC1 в виде CAR, при соотношении опухолевая клетка:иммунная клетка 1:1,5, в течение 24 ч. Концентрации двух видов цитокинов, т.е. интерферона-гамма (IFNg) и интерлейкина-2 (IL-2), в полученных из них культуральных средах определяли с использованием ELISA. ELISA выполняли таким же образом, как обычно используемый метод, и вкратце следующим образом. Сначала 96-луночный планшет покрывали захватывающим антителом, способным захватывать интерферон-гамма или интерлейкин-2. Через 1 сутки планшет достаточно хорошо промывали промывочным буфером. В каждую лунку добавляли блокирующий буфер и оставляли при комнатной температуре на 1 ч, после чего достаточно хорошо промывали промывочным буфером. Для определения абсолютного значения вместе со стандартным раствором известной концентрации в каждую лунку добавляли образец культурального раствора, оставляли при комнатной температуре на 2 ч и давали возможность прореагировать. Планшет достаточно хорошо промывали промывочным буфером, затем в него добавляли детектирующее антитело и оставляли реагировать при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшет достаточно хорошо промывали промывочным буфером, и затем в каждую лунку добавляли стрептавидин, конъюгированный с HRP, и давали возможность прореагировать при комнатной температуре в течение 20 мин. Планшет достаточно хорошо промывали промывочным буфером, затем добавляли раствор субстрата и оставляли реагировать при комнатной температуре на 20 мин. Реакцию останавливали добавлением стоп-раствора. Концентрацию цитокина в каждой лунке рассчитывали по поглощению в соответствии с реакцией.

На фиг. 1 G03 обозначает положительный контроль, и в качестве отрицательного контроля использовали группу (NO LV), в которую не вводили CAR. Кроме того, на фиг. 1 представлены репрезентативные графики, показывающие результаты независимых экспериментов с использованием в общей сложности двух видов Т-клеток, на которых они обозначались как донор 03 и донор 04 в соответствии с происхождением Т-клеток. В настоящем иллюстративном варианте осуществления термин «донор» относится к донору Т-клеток, используемому в эксперименте, и число после слова «донор» означает, что доноры являются разными. На фиг. 1 приведены графики, на которых поглощение было нормализовано на основе контроля G03, показывая, что тестируемые иммунные клетки секретировали цитокины.

На фиг. 2 приведены результаты анализа секреции цитокинов, оценивающего ответы иммунных клеток, в которые вводили анти-MUC1 scFv в виде CAR, для MUC1-положительных опухолевых клеток(T47D), показывающие, что тестируемые иммунные клетки секретировали цитокины. Т-клетки были получены от донора 06. Группу (контрольные Т-клетки), которой не вводили CAR, использовали в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 3 приведены результаты анализа секреции цитокинов, оценивающие ответы иммунных клеток, в которые вводили scFv против MUC1 в форме CAR, для клеток, не экспрессирующих муцин-1 (HEK293T), показывающие, что иммунные клетки не секретировали цитокин интерферон-гамма, и количество секреции IL-2 достоверно не увеличивалось по сравнению с отрицательным контролем (контрольная Т-клетка). Т-клетки были получены от донора 06. Группу (контрольные Т-клетки), в которую не вводили CAR, использовали в качестве отрицательного контроля.

Пример 5. Анализ цитотоксичности CAR-T-клеток

Клеточные линии рака молочной железы человека (T47D, HCC70, HCC1954), клеточные линии рака печени человека (Huh7, HepG2) и клеточная линия нейробластомы человека (SK-N-SH) были получены из Корейского банка клеточных линий (KCLB, Seoul, Корея), и клеточную линию эмбриональной почки человека (HEK293T) получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA). Клетки T47D, HCC70 и HCC1954 культивировали в среде RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific), и клетки HEK293T, Huh7 и HepG2 культивировали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM, Thermo Fisher Scientific) соответственно. Все среды использовали после добавления 10% (мас./об.) фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием (FBS, Thermo Fisher Scientific). Все клетки культивировали в условиях 37°С и 5% СО₂. CAR-T-клетки, полученные, как описано в примере 2, культивировали в полной среде CTS (CTSβ OpTmizer™ T Cell Expansion SFM (Gibco, A1048501), 2% (мас./об.) CTS™ Immune Cell SR (Gibco, A25961-01), добавка 1X GlutaMAX™ (Gibco, 35050-061)) в условиях 37°C и 5% CO₂.

Для анализа муцин-1-специфической цитотоксичности CAR-T-клеток, оценивали клеточный лизис муцин-1-экспрессирующих клеток (включающих T47D, HCC70, HCC1954, HEK293T-V1 (экзогенные клетки, экспрессирующие MUC1-C) и т. д.), и клеток, не экспрессирующих муцин-1 (включающих HEK293T, HepG2, Huh7, SK-N-SH и др.) следующим методом. В начале, клетки-мишени, экспрессирующие или не экспрессирующие муцин-1, которые окрашивали CellTrace™ CFSE (Invitrogen, C34554), распределяли при плотности примерно 0,15-0,2×10⁶ клеток/150 мкл/лунку и культивировали в течение 1 суток. На те же сутки CAR-T-клетки, замороженные и хранившиеся при -196°C, оттаивали и культивировали при плотности 2 × 10⁶ клеток/мл в течение суток в полной среде CTS, содержащей 30 ЕД/мл IL-2 (Novartis, Proleukin). На следующие сутки измеряли уровень экспрессии CAR во время культивирования CAR-T-клеток окрашиванием конъюгированным с Alexa Fluor 488 фрагментом F(ab')₂ аффинно очищенного козьего анти-человеческого IgG, специфичным для фрагмента F(ab')₂ (Jackson Laboratory, 109-545-097) и APC мышиным антителом против человеческого CD3 (BD Pharmingen™, 561811) и получением процента клеток, положительных для обоих из них, с использованием проточного цитометра (FACS). Каждый тип CAR-T (E, эффекторные клетки), скорректированный таким образом, чтобы иметь одинаковое количество CAR+ T-клеток, исходя из уровня экспрессии CAR, готовили в объеме 100 мкл/лунку с использованием среды для культивирования для каждой клетки-мишени и добавляли пропорционально количеству CFSE-окрашенных клеток, экспрессирующих или не экспрессирующих муцин-1 (Т, клетки-мишени), культивированные накануне. Клетки культивировали в условиях 37°C, 5% CO₂ в течение от 5 ч до 24 ч в зависимости от клеток-мишеней. Затем отбирали все CAR-T-клетки и клетки-мишени и окрашивали красителем для оценки жизнеспособности eFluor™ 450 (eBioscience™, 65-0863-18), APC мышиным антителом против человеческого CD3. Затем с использованием проточного цитометра определяли количество живых клеток-мишеней. В связи с этим количество живых клеток-мишеней определяли по количеству клеток с негативной реакцией на краситель, используемый для оценки жизнеспособности, CFSE-положительных клеток. Активность киллинга (%) рассчитывали по следующему уравнению:

Активность киллинга=100-(количество живых клеток-мишеней в лунке (Т-клетка+клетка-мишень)/количество живых клеток-мишеней в лунке (клетка-мишень) × 100) (%)

Результаты приведены на фиг. 4-8. На фигурах G03 представляет собой положительный контроль, и в качестве отрицательного контроля использовали группу (NO LV), в которую не вводили CAR. Кроме того, на этих фигурах приведены репрезентативные графики, показывающие результаты независимых экспериментов с использованием в общей сложности двух типов Т-клеток, на которых они были обозначены как донор 03 и донор 04 в соответствии с происхождением Т-клеток. Как показано на фиг. 4-8, тестированные иммунные клетки проявляли цитотоксичность в отношении клеток, экспрессирующих муцин-1.

На фиг. 9 и 10 приведены результаты экспериментов по оценке цитотоксичности CAR-T-клеток, полученных с использованием Т-клеток, происходящих от донора 05 и донора 06, против клеточной линии рака молочной железы человека T47D, на фиг. 11 приведены результаты экспериментов по оценке цитотоксичности CAR-T-клеток, полученных с использованием Т-клеток, происходящих от донора 07, против линии клеток эмбриональной почки человека HEK293T, и на фиг. 12 приведены результаты экспериментов по оценке цитотоксичности CAR-T-клеток, полученных с использованием Т-клеток, происходящих от донора 08, против клеточной линии рака молочной железы человека HCC70. Как показано на фиг. 9-12, тестированные иммунные клетки проявляли цитотоксичность в отношении клеток, экспрессирующих муцин-1.

Пример 6. Анализ муцин 1-специфической цитотоксичности CAR-T-клеток

Для исследования того, насколько CAR-T-клетки способны дифференцировать нормальные клетки и опухолевые клетки, в зависимости от разницы в количестве антигена, измеряли клеточный лизис для клеточной линии рака молочной железы (HCC70) и линии нормальных клеток молочной железы человека (MCF10A) следующим образом: сначала клетки HCC70, сверхэкспрессирующие муцин-1, и клетки MCF10A, экспрессирующие низкие уровни муцина-1, окрашивали различными концентрациями CellTrace^TM CFSE (Invitrogen, C34554) и смешивали в различных соотношениях соответственно. Соотношения HCC70:MCF10A составляли 0:0,2, 0,025:0,175, 0,05:0,15, 0,075:0,125, 0,1:0,1, 0,125:0,075, 0,15:0,05, 0,175:0025, 0,2:0. Клетки, смешанные в указанных соотношениях, распределяли с плотностью 0,2 × 10⁶ клеток/500 мкл/лунку и культивировали в течение 1 суток. На те же сутки CAR-T-клетки (Т-клетки, полученные из донора 05, экспрессирующие CAR-содержащий 2447_2H08 scFv), замороженные и хранившиеся при -196°C, оттаивали и культивировали при плотности 2 × 10⁶ клеток/мл в течение 1 суток в полной среде CTS, содержащей 30 ЕД/мл IL-2 (Novartis, Proleukin). На следующие сутки измеряли уровень экспрессии CAR (CAR-содержащий 2447_2H08 scFv) CAR-T-клетами во время культивирования окрашиванием конъюгированным с Alexa Fluor 488 фрагментом F(ab')₂ аффинно очищенного козьего анти-человеческого IgG, специфичным для фрагмента F(ab')₂ (Jackson Laboratory, 109-545-097) и APC мышиным антителом против человеческого CD3 (BD Pharmingen™, 561811) и получением процента клеток, положительных для обоих из них, с использованием проточного цитометра (FACS). Каждый тип CAR-T (E, эффекторные клетки), скорректированный таким образом, чтобы иметь одинаковое количество CAR+ T-клеток, исходя из уровня экспрессии CAR, готовили в объеме 100 мкл/лунку с использованием среды для культивирования для каждой клетки-мишени и добавляли пропорционально количеству CFSE-окрашенных клеток, экспрессирующих или не экспрессирующих муцин-1 (Т, клетки-мишени), культивированные накануне. Клетки культивировали в условиях 37°C, 5% CO₂ в течение 24 ч в зависимости от клеток-мишеней. Затем отбирали все CAR-T-клетки и клетки-мишени и окрашивали красителем для оценки жизнеспособности eFluor™ 450 (eBioscience™, 65-0863-18), APC мышиным антителом против человеческого CD3. Затем с использованием проточного цитометра определяли количество живых клеток-мишеней. В связи с этим количество живых клеток-мишеней определяли по количеству клеток с негативной реакцией на краситель, используемый для оценки жизнеспособности, CFSE-положительных клеток. Активность киллинга (%) рассчитывали, как описано в примере 5.

Результаты приведены на фиг. 13 и 14. На фигурах в качестве отрицательного контроля использовали группу (имитация Т-клеток), в которую не вводили CAR. Как показано на фиг. 13 и 14, CAR-T-клетки, имеющие 2447_2H08 scFv (на фигурах, каждый обозначен #2-CAR-T), проявляли активность киллинга в отношении клеточной линии рака молочной железы (HCC70), сверхэкспрессирующей муцин-1, тогда как они не проявляли цитотоксичности или проявляли существенно более низкую цитотоксичность в отношении линии нормальных клеток молочной железы (MCF10A), экспрессирующей низкий уровень муцина-1.

Пример 7. Анализ противоопухолевой эффективности CAR-T-клеток с использованием модели на животных

7-1. Анализ противоопухолевой эффективности с использованием животной модели рака поджелудочной железы

7-недельным самкам мышей NOG подкожно (п/к) прививали 6×10⁶ клеток PANC1-v1 (клетки рака поджелудочной железы PANC1, экспрессирующие MUC1). Когда объем опухолей достигал 500 мм³, внутривенно (в/в) вводили 1×10⁶ анти-MUC1 CAR-T-клеток (Т-клетки, полученные от донора 18-09, экспрессирующие scFv-содержащий CAR по настоящему изобретению), и затем наблюдали за ростом опухолей. Через 14 суток и 28 суток после введения CAR-T-клеток отбирали кровь и определяли количество иммунных клеток человека (hCD45+ клетки) в крови (n=5 на группу). В качестве отрицательного контроля использовали группу, которой вводили PBS (носитель), и Т-клетки, не экспрессирующие CAR (контрольные Т-клетки).

В результате, как показано на фиг. 15 и 16, было отмечено, что опухоли размером 500 мм³ становились небольшими, и примерно через 20 суток после введения Т-клеток невозможно было визуально определить опухоли. Напротив, в отрицательном контроле размеры опухолей продолжали увеличиваться.

Затем на той же животной модели, когда объем опухолей превышал 1500 мм³ (т. е. через 66 суток после прививки клеток PANC1-v1), внутривенно (в/в) вводили 1 × 10⁶ или 0,5 × 10⁶ анти-MUC1 CAR-T-клеток и затем наблюдали за ростом опухолей (n=2 в группе).

В результате, как показано на фиг. 17, размер опухолей увеличивался на ранней стадии. Однако примерно через 10 суток размер опухолей постепенно уменьшался, и через 30 суток размер опухолей становился слишком маленьким для измерения.

7-2. Анализ противоопухолевой эффективности с использованием животной модели рака молочной железы

9-недельным самкам мышей NOG подкожно (п/к) прививали 4×10⁶ клеток HCC1954 (клеточная линия рака молочной железы, естественно экспрессирующая MUC1). Когда объем опухолей достигал 500 мм³ (23 сутки после прививки клеток), вводили 0,5×10⁶ или 0,1×10⁶ анти-MUC1 CAR-T-клеток (Т-клетки, полученные от донора 20-01, экспрессирующие scFv-содержащий CAR по настоящему изобретению) внутривенно (в/в), после чего наблюдали за ростом опухолей (n=7 в группе). После введения Т-клеток кровь отбирали через регулярные промежутки времени и определяли количество иммунных клеток человека (hCD45+ клетки) в крови (n=3 на группу). В качестве отрицательного контроля использовали группу, которой вводили PBS (носитель), и Т-клетки, не экспрессирующие CAR (имитация Т-клеток).

В результате, как показано на фиг. 18 и 19, опухоли размером 500 мм³ не изменялись в течение 7 суток после введения CAR-T-клеток. Затем размер быстро уменьшался, и опухоли становились слишком маленьким для измерения их размеров через 25 суток. Кроме того, количество hCD45+ клеток в крови мышей имело тенденцию к увеличению и постепенно снижалось примерно через 25 суток. Вероятно, CAR-T-клетки активировались и пролиферировали после распознавания антигена, и, таким образом, количество клеток в крови повышалось.

На основе вышеприведенного описания специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее раскрытие можно осуществить в другой конкретной форме без изменения его технической сущности или основных характеристик. В связи с этим следует понимать, что вышеприведенный вариант осуществления не является ограничивающим, а иллюстративным во всех аспектах. Объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим ей описанием, и, следовательно, все изменения и модификации, попадающие в пределы формулы изобретения, или эквиваленты таких пределов, охватываются формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> LG CHEM, LTD.

<120> ПОЛИПЕПТИД, СПЕЦИФИЧНЫЙ К МУЦИНУ-1, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> OPP20215468KR

<150> KR10-2020-0183768

<151> 2020-12-24

<150> KR10-2021-0137757

<151> 2021-10-15

<160> 115

<170> koPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 HCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 HCDR2

<400> 2

Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 HCDR3

<400> 3

Asp Arg Gly Trp Asn His Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 LCDR1

<400> 4

Ser Ser Glu Val Gly Ser Arg Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 LCDR2

<400> 5

Lys Asn Asp

1

<210> 6

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 LCDR3

<400> 6

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 7

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 VH

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg Gly Trp Asn His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 VL

<400> 8

Gln Ser Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Gly Ser Arg

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 243

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 scFv

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg Gly Trp Asn His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ser Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser

130 135 140

Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser

145 150 155 160

Glu Val Gly Ser Arg Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr

165 170 175

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala

195 200 205

Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala

210 215 220

Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Thr Val Leu

<210> 10

<211> 729

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2445_1F09 scFv

<400> 10

gaggtgcagc tgttggagac tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atattacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatcgcggc 300

tggaaccacg gtatggacgt ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcgctagcc agtctgggct gactcagcca 420

ccctcagcgt ctgggacccc cgggcagagg gtcaccatct cttgttctgg gggcagctca 480

gaagtcggaa gtagatatgt gtcctggtac cagcaactcc caggaacggc ccccagactc 540

ctcatctata agaatgatcg gcggccctca ggggtccctg accgattctc tggctccaag 600

tctggctcct cagcctccct ggccatcagt gggctccggt ccgaggatga ggctgattat 660

tactgtgcag catgggatga cagcctgaat ggttatgtct tcggaactgg gaccaagctg 720

accgtccta 729

<210> 11

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 HCDR1

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 HCDR2

<400> 12

Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 13

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 HCDR3

<400> 13

Asp Pro His Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 14

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 LCDR1

<400> 14

Ser Leu Arg Thr Ser Tyr

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 LCDR2

<400> 15

Gly Lys Thr

1

<210> 16

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 LCDR3

<400> 16

His Ser Arg Asp Ser Asn Asp Asn Tyr Leu Glu Val Val

1 5 10

<210> 17

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 VH

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro His Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Trp Phe

100 105 110

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 18

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 VL

<400> 18

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Ser Tyr Ala

20 25 30

Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr

35 40 45

Gly Lys Thr Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys His Ser Arg Asp Ser Asn Asp Asn Tyr

85 90 95

Leu Glu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 19

<211> 250

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 scFv

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro His Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Trp Phe

100 105 110

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu

130 135 140

Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Ser Tyr Ala Gly Trp Leu Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr Gly Lys Thr Ser

180 185 190

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Asn

195 200 205

Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu

210 215 220

Tyr Phe Cys His Ser Arg Asp Ser Asn Asp Asn Tyr Leu Glu Val Val

225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250

<210> 20

<211> 750

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_2H08 scFv

<400> 20

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatccg 300

catattttga ctggttatta taggggaggg tggttcgacc cctgggggca agggaccacg 360

gtcaccgtct cgagtggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcgctagc 420

tcctatgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggtcagac agtcaccatc 480

acgtgccaag gagacagcct cagaacctct tatgcaggct ggctccagca gaagccagga 540

caggcccctg tactcgtcct ctatggtaaa accagccggc cctcagggat cccagaccga 600

ttctctggct ccacctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggag 660

gatgaggctg agtatttctg tcactcccgg gacagcaatg ataactatct agaggtggtt 720

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 750

<210> 21

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 HCDR1

<400> 21

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 HCDR2

<400> 22

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 23

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 HCDR3

<400> 23

Asp Ile Ser Ser Gly Trp Tyr Pro Gly Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 LCDR1

<400> 24

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 25

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 LCDR2

<400> 25

Gly Lys Asn

1

<210> 26

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 LCDR3

<400> 26

Ser Ser Arg Asp Ser Ser Asp Asp Val Val

1 5 10

<210> 27

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 VH

<400> 27

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Ser Ser Gly Trp Tyr Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 VL

<400> 28

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser Ser Asp Asp Val

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 29

<211> 244

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 scFv

<400> 29

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Ser Ser Gly Trp Tyr Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp

130 135 140

Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln

145 150 155 160

Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Ser Arg Asp Ser Ser Asp Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu

<210> 30

<211> 732

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A01 scFv

<400> 30

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag catagtctat 180

gcggactttg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatt 300

tcaagtggct ggtacccagg gacctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ctcctatgag 420

ctgactcagg accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa 480

ggagacagcc tcagaagcta ttatgcaagc tggtaccagc agaagccagg acaggcccct 540

gtacttgtca tctatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccagaccg attctctggc 600

tccagctcag gaaacacagc ttccttgacc gtcactgggg ctcaggcgga agacgaggct 660

gactattact gtagctcccg ggacagcagt gatgatgtgg tattcggcgg agggacccag 720

ctcaccgtcc ta 732

<210> 31

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 HCDR1

<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 HCDR2

<400> 32

Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 33

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 HCDR3

<400> 33

Asp Arg Ala Thr Ile Phe Gly Val Val Thr Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 LCDR1

<400> 34

Ser Ile Arg Ser Tyr Ser

1 5

<210> 35

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 LCDR2

<400> 35

Gly Lys Asn

1

<210> 36

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 LCDR3

<400> 36

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg Val Val

1 5 10

<210> 37

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 VH

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ala Thr Ile Phe Gly Val Val Thr Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 VL

<400> 38

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Ile Arg Ser Tyr Ser Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Val Ser Gly Ser

50 55 60

Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 39

<211> 246

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 scFv

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ala Thr Ile Phe Gly Val Val Thr Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln

130 135 140

Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys

145 150 155 160

Gln Gly Asp Ser Ile Arg Ser Tyr Ser Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro

180 185 190

Ser Gly Ile Pro Asp Arg Val Ser Gly Ser Thr Ser Gly Asn Thr Ala

195 200 205

Ser Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

210 215 220

Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg Val Val Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Gln Leu Thr Val Leu

245

<210> 40

<211> 738

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A08 scFv

<400> 40

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300

gctacgattt ttggagtggt tacccccttt gactactggg gccaaggaac cctggtcacc 360

gtctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgc tagctcctat 420

gagctgactc aggaccccgc tgtgtctgtg gccttgggac agacagtcag gatcacatgc 480

cagggagaca gtattagaag ttattctgcc agctggtacc agcagaagcc agggcaggcc 540

cctcgccttg ttatctatgg taaaaacaac cggccctcag ggatcccaga ccgagtctct 600

ggctccactt caggaaatac agcttccttg accgtcactg gggctcaggc ggaagatgag 660

gctgactatt actgtaactc ccgggacagc agtggtaacc gtgtggtatt cggcggaggg 720

acccagctca ccgtccta 738

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 HCDR1

<400> 41

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 HCDR2

<400> 42

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 43

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 HCDR3

<400> 43

Asp Val Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Tyr Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 44

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 LCDR1

<400> 44

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 45

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 LCDR2

<400> 45

Gly Lys Asn

1

<210> 46

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 LCDR3

<400> 46

Asn Ser Arg Asp Ser Gly Gly Ser Val Val

1 5 10

<210> 47

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 VH

<400> 47

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Tyr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 VL

<400> 48

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Gly Gly Ser Val

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 49

<211> 244

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 scFv

<400> 49

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Tyr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp

130 135 140

Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln

145 150 155 160

Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Asn Ser Arg Asp Ser Gly Gly Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu

<210> 50

<211> 732

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A09 scFv

<400> 50

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag ccactggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggcctcgt attactgtgc aaaagatgtt 300

agcagtggct ggtactggta tgcttttgat atctggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ctcctatgag 420

ctgactcagg accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa 480

ggagacagcc tcagaagcta ttatgcaagc tggtaccagc agaagccagg acaggcccct 540

gtacttgtca tctatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccaggccg attctctggc 600

tccagctcag gaaacacagc ttccttgacc gtcactgggg ctcaggcgga agatgaggct 660

gactattact gtaattcccg ggacagcggt ggttctgtgg ttttcggcgg agggaccaag 720

ctgaccgtcc ta 732

<210> 51

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 HCDR1

<400> 51

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 HCDR2

<400> 52

Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 53

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 HCDR3

<400> 53

Asp Pro His Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 54

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 LCDR1

<400> 54

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 55

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 LCDR2

<400> 55

Gly Lys Asn

1

<210> 56

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 LCDR3

<400> 56

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Arg Val

1 5 10

<210> 57

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 VH

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro His Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Trp Phe

100 105 110

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 58

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 VL

<400> 58

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Val Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 59

<211> 248

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 scFv

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro His Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Trp Phe

100 105 110

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu

130 135 140

Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Val Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile

145 150 155 160

Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn

180 185 190

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn

195 200 205

Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp

210 215 220

Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Arg Val Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 60

<211> 744

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3A12 scFv

<400> 60

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccggggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatccg 300

catattttga ctggttatta taggggaggg tggttcgacc cctggggcca gggcaccctg 360

gtcaccgtct cgagtggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcgctagc 420

tcctatgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggtct tgggacagac agtcaggatc 480

acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 540

caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 600

ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 660

gatgaggctg actattactg taactcccgg gacagcagtg gtaaccatcg tgtattcggc 720

ggagggacca agctgaccgt ccta 744

<210> 61

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 HCDR1

<400> 61

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 HCDR2

<400> 62

Thr Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 63

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 HCDR3

<400> 63

Asp His Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Gly Gly

1 5 10

<210> 64

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 LCDR1

<400> 64

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 65

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 LCDR2

<400> 65

Gly Lys Asn

1

<210> 66

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 LCDR3

<400> 66

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val

1 5 10

<210> 67

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 VH

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Thr Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp His Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Gly Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 VL

<400> 68

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 69

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 scFv

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Thr Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp His Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Gly Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp

130 135 140

Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln

145 150 155 160

Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 70

<211> 735

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3B07 scFv

<400> 70

caggtgcagc tggtggagtc tgggggagtc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccgtcaagct 120

ccggggaggg gtctggagtg ggtctctctt actagttggg atggtggtag cacatactat 180

gcagactctg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac accgccttgt attactgtgc aaaagatcat 300

agcagcggct ggtacaacgg gggtatggac gtctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360

tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ctcctatgag 420

ctgactcagg accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa 480

ggagacagcc tcagaagcta ttatgcaagc tggtaccagc agaagccagg acaggcccct 540

gtacttgtca tctatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccagaccg attctctggc 600

tccagctcag gaaacacagc ttccttgacc atcactgggg ctcaggcgga agatgaggct 660

gactattact gtaactcccg ggacagcagt ggtaaccatg tggtattcgg cggagggacc 720

aagctgaccg tccta 735

<210> 71

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 HCDR1

<400> 71

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 HCDR2

<400> 72

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 73

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 HCDR3

<400> 73

Asp Arg Gly Ser Gly Tyr Glu Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 74

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 LCDR1

<400> 74

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 75

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 LCDR2

<400> 75

Gly Lys Asn

1

<210> 76

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 LCDR3

<400> 76

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Tyr Val

1 5 10

<210> 77

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 VH

<400> 77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Gly Ser Gly Tyr Glu Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 78

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 VL

<400> 78

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr

50 55 60

Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His

85 90 95

Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105

<210> 79

<211> 247

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 scFv

<400> 79

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Gly Ser Gly Tyr Glu Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr

130 135 140

Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr

145 150 155 160

Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg

180 185 190

Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Thr Ser Gly Asn Thr

195 200 205

Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

210 215 220

Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Tyr Val Phe Gly Thr

225 230 235 240

Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

245

<210> 80

<211> 741

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3C08 scFv

<400> 80

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatagg 300

ggtagtggct acgaaggaaa ctactacggt atggacgtct ggggccaagg aaccctggtc 360

accgtctcga gtggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cgctagctcc 420

tatgagctga ctcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagacagt caggatcaca 480

tgccaaggag acagcctcag aagctattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag 540

gcccctgtac ttgtcatcta tggtaaaaac aaccggccct cagggatccc agaccgattc 600

tctggtacca cctcaggaaa cacagcctcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat 660

gaggctgact attactgtaa ctcccgggac agcagtggta accattatgt cttcggaact 720

gggaccaagg tcaccgtcct a 741

<210> 81

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 HCDR1

<400> 81

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 82

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 HCDR2

<400> 82

Ile Ser Trp Asp Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 83

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 HCDR3

<400> 83

Asp Val Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Tyr Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 84

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 LCDR1

<400> 84

Ile Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 85

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 LCDR2

<400> 85

Gly Lys Asn

1

<210> 86

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 LCDR3

<400> 86

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg Val Val

1 5 10

<210> 87

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 VH

<400> 87

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Tyr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 VL

<400> 88

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ile Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 89

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 scFv

<400> 89

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Tyr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp

130 135 140

Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln

145 150 155 160

Gly Asp Ile Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg Val Val Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 90

<211> 735

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H02 scFv

<400> 90

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttggg atagtggtag cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatgtt 300

agcagtggct ggtactggta tgcttttgat atctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ctcctatgag 420

ctgactcagg accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa 480

ggagacatcc tcagaagtta ttatgcaagt tggtaccagc agaagccagg acaggcccct 540

gtacttgtca tttatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccagaccg attctctggc 600

tccagctcag gaaacacagc ttccttgacc atcactgggg ctcaggcgga agatgaggct 660

gactattact gtaactcccg ggacagcagt ggtaaccgtg tggtattcgg cggagggacc 720

aagctgaccg tccta 735

<210> 91

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 HCDR1

<400> 91

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 92

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 HCDR2

<400> 92

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 93

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 HCDR3

<400> 93

Asp Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 94

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 LCDR1

<400> 94

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 95

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 LCDR2

<400> 95

Gly Lys Asn

1

<210> 96

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 LCDR3

<400> 96

Gln Ser Arg Asp Ser Ser Asp Asn Arg Val Leu

1 5 10

<210> 97

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 VH

<400> 97

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 98

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 VL

<400> 98

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ile Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Ser Ser Asp Asn Arg

85 90 95

Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105

<210> 99

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 scFv

<400> 99

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp

130 135 140

Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln

145 150 155 160

Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Arg Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ile Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Ser Arg Asp Ser Ser Asp Asn Arg Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Val Thr Val Leu

245

<210> 100

<211> 735

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2447_3H08 scFv

<400> 100

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag catagactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acagctgtgt actactgtgc gagagatcgg 300

agtagtggct ggtacacggg gtcctttgac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360

tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ctcctatgag 420

ctgactcagg accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa 480

ggagacagcc tcagaagcta ttatgcaagc tggtaccggc agaagccagg acaggcccct 540

gtacttgtca tctatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccagaccg attctctggc 600

tccagctcgg gaaacacagc ttccttgacc atcattgggg ctcaggcgga agacgaggct 660

gactattact gtcagtcccg ggacagcagt gataaccgtg ttctattcgg cggagggacc 720

aaggtcaccg tccta 735

<210> 101

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 HCDR1

<400> 101

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 102

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 HCDR2

<400> 102

Ile Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Ile

1 5

<210> 103

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 HCDR3

<400> 103

Ser Thr Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 104

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 LCDR1

<400> 104

Gln Asp Ile Lys Ser Tyr

1 5

<210> 105

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 LCDR2

<400> 105

Tyr Ala Thr

1

<210> 106

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 LCDR3

<400> 106

Leu Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 107

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 VH

<400> 107

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Thr Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 108

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 VL

<400> 108

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 109

<211> 238

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G03 scFv

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Thr Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

130 135 140

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile

145 150 155 160

Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu

210 215 220

Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 110

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> муцин-1

<400> 110

Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser

1 5 10 15

Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp

20 25 30

Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly

35 40 45

Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr

50 55 60

Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln

65 70 75 80

Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser

100 105 110

Gly

<210> 111

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический_CD4

<400> 111

Thr Ser Ile Thr Ala Tyr Lys Ser Glu Gly Glu Ser Ala Glu Phe Ser

1 5 10 15

Phe Pro Leu Asn Leu Gly Glu Glu Ser Leu Gln Gly Glu Leu Arg Trp

20 25 30

Lys Ala Glu Lys Ala Pro Ser Ser Gln Ser Trp Ile Thr Phe Ser Leu

35 40 45

Lys Asn Gln Lys Val Ser Val Gln Lys Ser Thr Ser Asn Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Leu Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Leu Gln Ile Pro Gln Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Thr Leu Asp Arg Gly

85 90 95

Ile Leu Tyr Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Lys Val Thr Gln Pro

100 105 110

Asp Ser Asn Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Gly Pro Thr Ser Pro Lys

115 120 125

Met Arg Leu Ile Leu Lys Gln Glu Asn Gln Glu Ala Arg Val Ser Arg

130 135 140

Gln Glu Lys Val Ile Gln Val Gln Ala Pro Glu Ala Gly Val Trp Gln

145 150 155 160

Cys Leu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Val Lys Met Asp Ser Lys Ile Gln

165 170 175

Val Leu Ser Lys Gly Leu

180

<210> 112

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнирный домен

<400> 112

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 113

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен CD28

<400> 113

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 114

<211> 123

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> костимулирующий домен CD28

<400> 114

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 115

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> внутриклеточный сигнальный домен CD3 дзета

<400> 115

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<---

Claims (53)

1. Полипептид, связывающийся с муцином-1, где полипептид содержит пару вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из следующих VH- и VL-областей:

- VH-области, содержащей определяющие комплементарность участки (CDR) 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3 представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76 соответственно;

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 83 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 86 соответственно; и

- VH-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 93 соответственно, и VL-области, содержащей CDR 1, 2 и 3, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96 соответственно.

2. Полипептид по п.1, содержащий пару вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из следующих VH- и VL-областей:

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78;

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88; и

- VH-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, и VL-области, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98.

3. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

4. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), пептидное антитело, антигенсвязывающий фрагмент (Fab), моноклональное антитело, биспецифическое антитело, минитело, доменное антитело, синтетическое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело или слитый белок на основе антитела.

5. Полипептид по п.1, где VH-область и VL-область связаны друг с другом через линкер.

6. Полипептид по п.5, где аминокислотная последовательность линкера представляет собой GGGGSGGGGSGGGAS.

7. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой одноцепочечный вариабельный домен (scFv), и scFv включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 99.

8. Выделенный полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид по любому из пп.1-7.

9. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.8.

10. Клетка, экспрессирующая полипептид, связывающийся с муцином-1, содержащая вектор по п.9.

11. Химерный антигенный рецептор к муцину-1, содержащий муцин-1-связывающий полипептид по любому из пп.1-7.

12. Химерный антигенный рецептор по п.11, содержащий внеклеточный домен, включающий муцин-1-связывающий полипептид; трансмембранный домен; и внутриклеточный сигнальный домен.

13. Химерный антигенный рецептор по п.12, где внеклеточный домен дополнительно включает спейсерную область между муцин-1-связывающим полипептидом и трансмембранным доменом.

14. Химерный антигенный рецептор по п.13, где спейсерная область включает шарнирную область CD8α или CD28, или всю или часть константной области иммуноглобулина (IgG).

15. Химерный антигенный рецептор по п.12, где трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD28 или CD8.

16. Химерный антигенный рецептор по п.12, где внутриклеточный сигнальный домен представляет собой сигнальный домен CD3 дзета.

17. Химерный антигенный рецептор по п.12, дополнительно содержащий один или более костимулирующих доменов.

18. Химерный антигенный рецептор по п.17, где костимулирующий домен расположен между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом.

19. Химерный антигенный рецептор по п.17, где костимулирующий домен представляет собой сигнальный домен CD28, OX-40, 4-1BB (CD137), CD27 или ICOS.

20. Выделенный полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по п.11.

21. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.20.

22. Иммунная клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор к муцину-1, содержащая муцин-1-связывающий полипептид по любому из пп.1-7, или полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по п. 20.

23. Иммунная клетка по п.22, где иммунная клетка представляет собой Т-клетку, инфильтрирующий опухоль лимфоцит (TIL), естественную клетку-киллер (NK), клетку, экспрессирующую TCR, дендритную клетку или NK-T-клетку.

24. Иммунная клетка по п.22, где иммунная клетка представляет собой аутологичную Т-клетку или аллогенную Т-клетку.

25. Композиция для профилактики или лечения рака, содержащая эффективное количество:

муцин-1-связывающего полипептида по любому из пп.1-7;

выделенного полинуклеотида, кодирующего муцин-1-связывающий полипептид по п.8;

вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид по п.9;

клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий муцин-1-связывающий полипептид по п.10;

химерный антигенный рецептор, содержащий муцин-1-связывающий полипептид по любому из пп.11-19;

выделенный полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по п.20;

вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по п.21; или

иммунную клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, или экспрессирующую химерный антигенный рецептор по любому из пп.22-24.