JP2022531242A - 抗ｈｖｅｍ抗体およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

ＨＶＥＭに結合し、ＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ相互作用を阻害し、下流のＨＶＥＭシグナル伝達を活性化する薬剤が提供される。それらの薬剤およびそれらの薬剤を含むキットを用いて疾患を治療する方法も提供される。【選択図】図９Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２６日の米国仮特許出願第６２／９６５，９２１号、および２０１９年４月２９日の米国仮特許出願第６２／８３９，８４１号の優先権の利益を主張し、それらの内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は免疫療法の分野にある。

免疫応答を強化するように設計された免疫療法は、免疫療法を活性化すると考えられており、がん治療の最前線にある。現在、免疫チェックポイント阻害療法は、進行性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、転移性黒色腫、および進行性腎細胞がん腫（ＲＣＣ）の治療に成功裏に使用されている。さまざまな企業によって開発および製造されたいくつかのそのような薬剤は、さまざまな種類のがんで大きな期待を示しており、免疫チェックポイントプログラム細胞死タンパク質１受容体（ＰＤ１）、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤＬ１）、および細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に対する抗体など、ＦＤＡ承認を受けている。しかし、治療を受けた患者の通常１０％～４０％だけが恩恵を受け、同時に患者は免疫療法後の治療の副作用に苦しむ可能性があるため、患者奏効率はまだ最適ではない。さらに、これらの薬剤による治療は、追加の免疫チェックポイントのアップレギュレーションを通じて耐性を誘導する可能性がある。黒色腫患者における抗ＰＤ１療法と抗ＣＴＬＡ－４療法の併用は、単剤と比較して高い奏効率（６０％）を示したが、この併用療法には、治療に関連する重篤な副作用も含まれる。したがって、新しい抗腫瘍免疫活性化剤が明らかに必要とされている。

ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）は、造血細胞および非造血細胞を含むさまざまな細胞型の表面に見られるタンパク質である。ＨＶＥＭは、ＬＩＧＨＴおよびＬＴα等の標準的なＴＮＦ関連リガンドの受容体として機能するため、シグナル伝達受容体として機能する。ただし、抑制性受容体ＢＴＬＡおよびＣＤ１６０等の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー分子のリガンドとしても機能する。したがって、双方向のシグナル伝達は、ＨＶＥＭを介したシグナル伝達ネットワークで可能であり、さまざまな状況下で陽性または陰性の免疫反応に関与する可能性がある。このネットワークの調節不全は、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびがんの病因に関与しており、ＨＶＥＭを免疫療法の標的にする。

本発明は、ＨＶＥＭに結合し、ＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ相互作用を阻害し、下流のＢＴＬＡシグナル伝達を阻害し、そして下流のＨＶＥＭシグナル伝達を活性化する薬剤を提供する。それらの薬剤およびそれらの薬剤を含むキットを用いて疾患を治療する方法も提供される。

第１の態様によれば、細胞上のヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）に特異的に結合する薬剤が提供され、
ａ．ＨＶＥＭとＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）の間の相互作用を阻害し、
ｂ．細胞内のＨＶＥＭを介した下流のシグナル伝達を活性化にする。

別の態様によれば、抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１（ＳＹＡＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３（ＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４（ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５（ＧＡＳＳＲＡＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。

別の態様によれば、本発明の薬剤、本発明の抗体またはその抗体結合断片、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む薬学的組成物が提供される。

別の態様によれば、ＨＶＥＭ陽性細胞を特徴とする疾患または状態を治療する方法が提供され、この方法は、本発明の薬学的組成物を投与することを含み、それによって疾患または状態を治療する。

別の態様によれば、ＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する方法が提供され、この方法は、
ａ．ＨＶＥＭとＢＴＬＡの相互作用を阻害することと、
ｂ．免疫細胞、疾患細胞、またはその両方でＨＶＥＭシグナル伝達を活性化することとを含み、
それによってＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する。

別の態様によれば、本発明の方法により治療される対象の適合性を決定する方法であって、対象から疾患試料を取得すること、および試料中のＨＶＥＭレベルを決定することを含み、ＨＶＥＭの陽性発現が、対象が本発明の治療の方法に適していることを示す方法が提供される。

別の態様によれば、試料中のＨＶＥＭを検出する方法が提供され、この方法は、試料を本発明の薬剤、または本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させ、それによってＨＶＥＭを検出することを含む。

別の態様によれば、本発明の薬学的組成物と、
ａ．抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法、
ｂ．本発明の薬学的組成物が抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法で使用するためのものであることを示すラベル、および
ｃ．本発明の薬剤、または本発明の抗体またはその抗原結合断片を検出するための二次検出分子のうちのの少なくとも１つとを含むキットが提供される。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＨＶＥＭと腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）との間の相互作用を実質的に阻害しない。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＨＶＥＭとＣＤ１６０、リンホトキシンアルファ（ＬＴα）、またはその両方との間の相互作用を阻害する。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は、細胞によって発現されるＨＶＥＭに結合する際に、ＨＶＥＭを発現する細胞のアポトーシスを直接誘導しない。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片である。

いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、細胞に対して細胞毒性を有しないＩｇＧ２、ＩｇＧ４または改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。

いくつかの実施形態によれば、ＨＶＥＭを介した下流のシグナル伝達は、活性化Ｂ細胞（ＮＦ－ｋＢ）を介した転写の核因子カッパ－軽鎖エンハンサーを含む。

いくつかの実施形態によれば、ＨＶＥＭを介した下流のシグナル伝達は、ＨＶＥＭを発現する免疫細胞の細胞毒性の増加を含む。

いくつかの実施形態によれば、細胞毒性の増加は、炎症誘導性サイトカインの分泌の増加を含む。

いくつかの実施形態によれば、細胞は免疫細胞であり、シグナル伝達は免疫活性化を誘導する。

いくつかの実施形態によれば、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。

いくつかの実施形態によれば、細胞はがん細胞であり、シグナル伝達は抗腫瘍効果を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、ＨＶＥＭを発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に使用するためのものである。

いくつかの実施形態によれば、疾患は、ＨＶＥＭ陽性のがんまたは前がん性病変である。

いくつかの実施形態によれば、ＨＶＥＭ陽性のがんは、黒色腫、腎がん、子宮頸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、および頭頸部がんから選択される。

いくつかの実施形態によれば、疾患は感染症であり、感染細胞はＨＶＥＭ発現を含む。

いくつかの実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１（ＳＹＡＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３（ＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４（ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５（ＧＡＳＳＲＡＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、配列ＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含む軽鎖を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９）を含む重鎖、および配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１０）を含む軽鎖を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列ＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含む軽鎖を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９）を含む重鎖、および配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１０）を含む軽鎖を含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法を施すことをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、養子細胞療法を施すことをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、養子細胞療法は、養子ＴＩＬ療法を含む。

いくつかの実施形態によれば、養子細胞療法は、免疫細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を投与することを含み、ここで、ＣＡＲは、ＨＶＥＭ発現細胞の表面上の非ＨＶＥＭタンパク質を標的とする。

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１相互作用を阻害することをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、ＨＶＥＭとＴＮＦＳＦ１４との相互作用を実質的に阻害しないことをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、疾患または状態は、ＨＶＥＭ陽性のがんまたは前がん性病変である。

いくつかの実施形態によれば、ＨＶＥＭ陽性がんは、黒色腫および腎細胞がん腫から選択される。

いくつかの実施形態によれば、疾患または状態は感染症であり、感染細胞はＨＶＥＭ発現を含む。

いくつかの実施形態によれば、免疫細胞は、ＴＩＬまたはＰＢＭＣである。

いくつかの実施形態によれば、免疫細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、本発明の薬学的組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態によれば、ＨＶＥＭの陽性発現は、健康な試料または所定の閾値と比較して、上昇したＨＶＥＭレベルを含む。

本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。

ＨＶＥＭを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞へのｓｃＦｖを含む溶解物の結合：ヒトＨＶＥＭ（ＣＨＯ－Ｋ１ ｈｒＨＶＥＭ）、マウスＨＶＥＭ（ＣＨＯ－Ｋ１ ｍｒＨＶＥＭ）、カニクイザルＨＶＥＭ（ＣＨＯ－Ｋ１ ｃｒＨＶＥＭ）を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞または対照としての空のベクター（ＣＨＯ－Ｋ１ 空）を、ＨＩＳタグ付きｓｃＦｖ１－６または対照溶解物を含む５μｇ／ｍｌの溶解物とともに氷上で１時間インキュベートした後、抗ＨＩＳ ＡＰＣ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）またはアイソタイプ対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）で染色した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）を使用したフローサイトメトリーおよびＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳ）を使用したデータ分析によって発現を評価した。黒い実線はＣＨＯ－Ｋ１空細胞のバックグラウンド染色（すなわちアイソタイプ対照抗体）を表し、灰色の点線はＣＨＯ－Ｋ１空細胞の特異的抗体染色を表し、黒い点線はＣＨＯ－Ｋ１ ｈｒＨＶＥＭ細胞の特異的抗体染色を表し、灰色の実線ＣＨＯ－Ｋ１ ｍｒＨＶＥＭ細胞の特異的抗体染色を表し、黒い破線はＣＨＯ－Ｋ１ ｃｒＨＶＥＭ細胞の特異的抗体染色を表す。 ６つのｓｃＦｖの存在下での（２Ａ）ｈｒＢＴＬＡおよび（２Ｂ）ｈｒＬＩＧＨＴへのｈｒＨＶＥＭ結合－ＥＬＩＳＡの棒グラフである。 ｓｃＦｖ２－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析：精製タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左パネル）およびウエスタンブロット（右パネル）で分析し、分子量および純度を測定した。レーンＭ１およびＭ２はタンパク質マーカーを示す。レーン１および２は、それぞれ還元条件と非還元条件を示している。レーンＰは、陽性対照としてのヒトＩｇＧ１－ｋを示している。 （４Ａ）ＥＬＩＳＡで測定した、ｈｒＨＶＥＭに結合する本発明のｍＡｂの棒グラフである。（４Ｂ）本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体のｈｒＨＶＥＭ、ｍｒＨＶＥＭおよびｃｒＨＶＥＭへの結合のヒストグラムである。ＣＨＯ－Ｋ１細胞で発現。黒と灰色の実線は、それぞれ、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と本発明のｍＡｂのバックグラウンド染色（すなわち、二次抗ビオチンＦＩＴＣ抗体）を表す。灰色の点線および黒色の破線は、それぞれ、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体および本発明のｍＡｂの特異的抗体染色（すなわち、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃビオチン抗体＋抗ビオチンＦＩＴＣ抗体）を表す。 （５Ａ）本発明のｍＡｂを用いた健康なヒト結腸および脾臓組織試料のＨＶＥＭ染色の顕微鏡写真である。（５Ｂ）２つの異なる黒色腫患者の初代細胞試料への市販の抗ＨＶＥＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ３５６）の結合のヒストグラムである。黒の実線と灰色の線は、それぞれバックグラウンド染色（すなわち、二次抗マウスＡＰＣ抗体）と特異的抗体染色を表している。（５Ｃ）３つの異なる黒色腫患者の初代細胞試料への本発明のｍＡｂの結合のヒストグラムである。実線と破線は、それぞれバックグラウンド染色（すなわち、二次抗ビオチンＦＩＴＣ抗体）と特異的抗体染色（すなわち、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃビオチン抗体＋抗ビオチンＦＩＴＣ抗体）を表す。（５Ｄ）５Ｂと同じ染色のヒストグラムであるが、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）患者の細胞である。（５Ｅ）５Ｃと同じ染色のヒストグラムであるが、ＲＣＣ患者の細胞である。（５Ｆ）本発明のｍＡｂを使用して決定された様々な健康なおよび腫瘍試料におけるＨＶＥＭ発現の表である。「ＮＡ」：組織コアが存在しない／破壊されたため、「該当なし」。 （６Ａ）ｈｒＢＴＬＡ、および（６Ｂ）本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体の存在下でのｈｒＬＩＧＨＴ、（６Ｃ）市販の抗ＨＶＥＭ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３５６）、および（６Ｄ）ＭＡＢ３５６またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下でのｈｒＢＴＬＡの存在下でのｈｒＨＶＥＭ結合ＥＬＩＳＡの棒グラフである。 空のＣＨＯ－Ｋ１細胞、ｈｒＢＴＬＡを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞、および細胞なしのコインキュベーションに続く、本発明のｍＡｂ（左）および対照ｈＩｇＧ４（右）とのプレインキュベーション後のｈｒＨＶＥＭおよびＮＦ－ｋＢルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞からのルシフェラーゼ出力の棒グラフである。 本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照とプレインキュベートされた２人の別々の患者からの黒色腫細胞との共培養後のＴＩＬによるＩＦＮγ分泌を示す棒グラフである。 （９Ａ－Ｂ）。（９Ａ）第一の初代患者試料、（９Ｂ）第２の初代患者試料、および（９Ｃ）自己ＴＩＬとの共インキュベーションのさまざまな時点での初代患者試料からのＲＣＣ細胞、からの黒色腫細胞の特異的死滅の線グラフである。黒丸、白四角、黒三角および黒菱形線は、それぞれ、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体、本発明のｍＡｂ、抗ＰＤ１ ｍＡｂまたは本発明のｍＡｂ＋抗ＰＤ１ ｍＡｂとのインキュベーションを表す。（９Ｄ－Ｅ）自家ＴＩＬとの共インキュベーションの様々な時点での（９Ｄ）本発明のｍＡｂまたは（９Ｅ）ＭＡＢ３５６とプレインキュベートされた初代患者試料からの黒色腫細胞の特異的死滅の線グラフである。黒丸と白四角は、それぞれアイソタイプ対照抗体とｍＡｂとのインキュベーションを表している。 （１０Ａ）健康なドナーからの非自家ＰＢＭＣとの共インキュベーション中の様々な時点での初代患者試料からの黒色腫細胞の特異的死滅の線グラフである。黒丸はｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を表し、白四角は本発明のｍＡｂを表す。（１０Ｂ）単独でまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体または本発明のｍＡｂとともにインキュベートされた黒色腫細胞とともに培養されたＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌の棒グラフである。 本発明のｍＡｂおよびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照とともにインキュベートされた２つの初代試料からの黒色腫細胞のアポトーシスを反映する、１５時間のインキュベーション後の黒色腫細胞の総数からのカスパーゼ３／７陽性事象のパーセントを示す棒グラフである。 （１２Ａ）活性化の尺度としてのＴ細胞における４１ＢＢ ＦＡＣＳ染色のヒストグラムである。太い黒の実線は、バックグラウンド染色（すなわち、ＡＰＣ結合アイソタイプ対照抗体）を表し、黒の点線は、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を含む培地でインキュベートしたＴＩＬの４１ＢＢ染色を表し、細い黒の実線は、本発明のｍＡｂを含む培地でインキュベートしたＴＩＬの４１ＢＢ染色を表し、灰色の点線は、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照とプレインキュベートされた黒色腫細胞とインキュベートされたＴＩＬの４１ＢＢ染色を表し、細い灰色の実線は、本発明のｍＡｂとプレインキュベートされた黒色腫細胞とインキュベートされたＴＩＬの４１ＢＢ染色を表す。（１２Ｂ－Ｃ）黒色腫患者からのＴＩＬを、（１２Ｂ）本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体および、（１２Ｃ）ＭＡＢ３５６またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照、と２０時間インキュベートした後に観察されたＴ細胞クラスターの平均数の棒グラフである。（１２Ｄ）様々な時点で顕微鏡検査によって測定された、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照または本発明のｍＡｂとプレインキュベートされた黒色腫細胞とともに培養されたＰＢＭＣ上での４１ＢＢの発現である。 本発明のｍＡｂおよび２つの市販の抗体を用いたサイトカイン放出アッセイ後のサイトカイン分泌の表である。 ヒト黒色腫細胞を移植し、ヒト自己ＴＩＬで治療したマウスの様々な時点からの平均腫瘍体積の線グラフである。黒丸、白四角、黒三角および黒菱形線は、それぞれ、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体、本発明のｍＡｂ、抗ＰＤ１ ｍＡｂまたは本発明のｍＡｂ＋抗ＰＤ１ ｍＡｂとのインキュベーションを表す。

本発明は、いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭに結合し、ＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ相互作用を阻害し、そしてＨＶＥＭのアゴニストでもある薬剤を提供する。本発明はさらに、ＨＶＥＭ陽性疾患を治療する方法およびこれらの薬剤を含むキットに関する。

ＨＶＥＭ陽性のがんは、免疫細胞の表面にＢＴＬＡを結合することにより、免疫監視を回避できることはよく知られている。ＢＴＬＡの関与は、免疫細胞内に抑制性シグナルを生成し、Ｔ細胞の増殖を低減し、がんの生存率を高める。ＨＶＥＭに結合する抗体またはＢＴＬＡに結合する抗体でこのシグナル伝達を阻害することが知られている。本発明は、ＨＶＥＭに特異的に結合し、ＨＶＥＭシグナル伝達を活性化する抗体が、がんとの闘いに別の利益（免疫細胞活性化の増加）を提供するという驚くべき発見に基づいている。ＨＶＥＭは免疫細胞の表面にも発現しているが、その役割はよくわかっていない。本発明の抗体は、病原性細胞にＨＶＥＭを結合することによってＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ相互作用を遮断し、免疫細胞を阻害から解放するだけでなく、免疫細胞上のＨＶＥＭに結合し、それらの免疫細胞においてＮＦ－ｋＢシグナル伝達を誘導し、活性化特性を増強する。

第１の態様によって、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）に結合し、ＨＶＥＭとＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）との間の相互作用を阻害する薬剤が提供される。

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭを介して下流のシグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＢＴＬＡを介した下流のシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭを介した下流シグナル伝達を活性化し、ＢＴＬＡを介した下流シグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用を阻害することは、ＢＴＬＡを介した下流のシグナル伝達を阻害する。

いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、哺乳動物ＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、齧歯類ＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、サルＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、ヒトＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、マウス、サル、およびヒトのＨＶＥＭのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、膜結合ＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、細胞上のＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、細胞表面上のＨＶＥＭである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、可溶性ＨＶＥＭである。

いくつかの実施形態において、細胞は、病原性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、がん性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、病原体の細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、真菌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、病原体に感染した真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細菌に感染した細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ウイルスに感染した細胞である。いくつかの実施形態において、病原体は、細菌、ウイルス、および真菌から選択される。

いくつかの実施形態において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性およびＣＤ４陽性Ｔ細胞から選択される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、またはその両方である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、末梢血免疫細胞ではない。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、好中球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、樹状細胞、ＭＤＳＣおよびマクロファージから選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージから選択される。

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、免疫細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ－ＮＫ細胞である。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ」という用語は、少なくとも１つの目的のタンパク質（例えば、ＨＶＥＭ発現細胞によって発現されるタンパク質）に対して特異性を有し、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）にグラフトされる操作された受容体を指す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞にグラフトされたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞にグラフトされたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球および調節性Ｔ細胞から選択される。ＭＡＲＴ１は、標的細胞上でＨＶＥＭと共発現する標的タンパク質の例である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＨＶＥＭ発現細胞によって発現されるタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＨＶＥＭではない。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＨＶＥＭ発現細胞の表面上のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗体を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、本発明の抗体を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞毒性抗体を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗体定常ドメインを標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｆｃドメインを標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ療法は、ＨＶＥＭ発現細胞を標的とする抗体を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態、実施形態において、ＣＡＲによって標的化される抗体は、本発明の抗体ではない。

ＣＡＲ－ＴおよびＣＡＲ－ＮＫ細胞ならびにそれらのベクターは、当技術分野で周知である。そのような細胞は、受容体が結合するタンパク質を標的とし、細胞毒性を示す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、少なくとも１つのがんタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、複数のがんタンパク質を標的とする。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築は、当技術分野で周知である。１つの非限定的な例では、がんタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製することができ、その後、抗体をコードするベクターが構築され得る。ベクターはまた、共刺激シグナル領域を含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル領域は、既知のＴ細胞またはＮＫ細胞刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのうちの少なくとも１つから選択される。いくつかの実施形態において、ベクターはまた、ＣＤ３Ｚシグナル伝達ドメインも含む。次いで、このベクターは、例えばレンチウイルス感染によって、Ｔ細胞にトランスフェクトされる。

いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭはＣＤ２７０である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、ＢＴＬＡの受容体である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭはＢＴＬＡのリガンドである。いくつかの実施形態において、ＢＴＬＡはＣＤ２７２である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の受容体である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、ＴＮＦＳＦ１４のリガンドである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＳＦ１４は、ＬＩＧＨＴである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＳＦ１４はＣＤ２５８である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、ＣＤ１６０の受容体である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、ＣＤ１６０のリガンドである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、リンホトキシンアルファ（ＬＴα）の受容体である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭは、ＬＴαのリガンドである。いくつかの実施形態において、ＬＴαはＴＮＦ－βである。

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭ以外の他のタンパク質に結合しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭの細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭのリガンド結合ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭのＢＴＬＡ結合ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭのＢＴＬＡ結合ドメインを閉塞する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用を遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭ媒介性のＢＴＬＡ誘導性免疫抑制を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤はＨＶＥＭに結合し、結合したＨＶＥＭがさらにＢＴＬＡに結合することを禁止する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＢＴＬＡを介した下流のシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＢＴＬＡを介した下流のシグナル伝達を減少させた。

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＴＮＦＳＦ１４との間の相互作用を阻害しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＴＮＦＳＦ１４との間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＳＦ１４は、膜性ＴＮＦＳＦ１４（ｍＴＮＦＳ１４）である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＳＦ１４は、可溶性ＴＮＦＳＦ１４（ｓＴＮＦＳ１４）である。いくつかの実施形態において、その薬剤は、ＨＶＥＭとｍＴＮＦＳ１４およびｓＴＮＦＳ１４のうちの１つとの間の相互作用を阻害しないが、他方との相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、その薬剤は、ｍＴＮＦＳ１４とｓＴＮＦＳ１４の両方とＨＶＥＭとの間の相互作用を阻害しない。いくつかの実施形態において、阻害は実質的な阻害である。いくつかの実施形態において、阻害は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９９または１００％の減少である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＴＮＦＳＦ１４との間の相互作用を遮断しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＴＮＦＳＦ１４との間の相互作用を実質的に遮断しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＴＮＦＳＦ１４媒介性シグナル伝達を遮断／阻害しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＴＮＦＳＦ１４媒介細胞生存を遮断／阻害しない。

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭを介したシグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭアゴニストである。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭを介してシグナル伝達を誘導する。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭを介したシグナリングは、ＨＶＥＭの下流シグナル伝達である。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞上のＨＶＥＭに結合し、細胞内でＨＶＥＭシグナル伝達を活性化／誘導する。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭシグナル伝達は、活性化されたＢ細胞（ＮＦ－ｋＢ）シグナル伝達の核因子カッパ－軽鎖エンハンサーの活性化を含む。いくつかの実施形態において、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達は、それらのプロモーターにＮＦ－ｋＢ応答エレメントを有する遺伝子の制御を含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達は、細胞の細胞毒性の増加を含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達は、薬剤が接触したＨＶＥＭを発現する細胞の細胞毒性の増加を含む。いくつかの実施形態において、細胞毒性の増加は、炎症誘導性サイトカインの分泌の増加を含む。いくつかの実施形態において、炎症誘導性サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＭＣＰ１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３およびＣＭ－ＣＳＦから選択される。いくつかの実施形態において、炎症誘導性サイトカインは、ＩＦＮγである。いくつかの実施形態において、増加は、本発明の薬剤が接触していない細胞と比較した場合である。いくつかの実施形態において、増加は、少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００％の増加である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞であり、シグナル伝達は免疫活性化を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ガンマ／デルタＴ細胞ではない。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ガンマ／デルタＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭシグナル伝達を活性化することは、免疫細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、増殖の増加を含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、細胞毒性の増加を含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、遊走の増加を含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、増加したホーミングを含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、増加した細胞クラスタリングを含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、Ｔ細胞活性化である。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、Ｔｈ１ Ｔ細胞の数の増加を含む。いくつかの実施形態において、増加は、Ｔｈ２ Ｔ細胞と比較した相対的な増加である。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、Ｔ制御性細胞の減少を含む。いくつかの実施形態において、免疫活性化は、４１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ、ＨＬＡ－ＤＲおよびサイトカインの分泌から選択されるマーカーの発現の増加を含む。いくつかの実施形態において、サイトカインは、炎症誘導性サイトカインである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞クラスタリングの増加を含む。

いくつかの実施形態において、細胞はがん性細胞であり、シグナル伝達は抗腫瘍効果を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、アポトーシスの増加を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、増殖の減少を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、化学療法感受性の増加を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、運動性の低下を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、浸潤の減少を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、転移の減少を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、自己複製の減少を含む。いくつかの実施形態において、効果は、本発明の薬剤によって接触されなかったよりもがん細胞と比較される。いくつかの実施形態において、減少は、少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５、９７、９９または１００％の減少である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態において、薬剤は、アポトーシスを誘導しない。いくつかの実施形態において、アポトーシスを誘導することは、アポトーシスを直接誘導することである。いくつかの実施形態において、薬剤は、直接アポトーシスを誘導しない。本明細書で使用される場合、「直接誘導」は、薬剤の結合の即時の結果として生じる結果を指し、結合した細胞内の下流のシグナル伝達を特徴としない。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞毒性ではない。いくつかの実施形態において、薬剤はそれ自体では細胞毒性ではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導しない。いくつかの実施形態において、薬剤は細胞毒性部分を含まない。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞によって発現されるＨＶＥＭの結合時に、ＨＶＥＭを発現する細胞のアポトーシスを誘導しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、別の細胞との相互作用を介してアポトーシスを誘導しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭを発現する細胞の死滅を直接誘導しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、死滅のための細胞を標的としない。いくつかの実施形態において、薬剤は、間接的なアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態において、間接アポトーシスは、アポトーシスをもたらすＨＶＥＭ受容体を介した下流のシグナル伝達によって誘導されるアポトーシスである。いくつかの実施形態において、間接アポトーシスは、シグナル伝達を必要とするアポトーシスである。いくつかの実施形態において、間接アポトーシスは、第２の細胞の関与を必要としないアポトーシスである。いくつかの実施形態において、薬剤は、免疫細胞においてアポトーシスを誘導しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、がん細胞においてアポトーシスを誘導する。

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＣＤ１６０との間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＬＴαとの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭと単純ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ（ＨＳＶ１－ｇＤ）との間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭと、ＣＤ１６０、ＨＳＶ１－ｇＤおよびＬＴαのうちの少なくとも２つとの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＣＤ１６０との間の相互作用を遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＬＴαとの間の相互作用を遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭとＨＳＶ１－ｇＤとの間の相互作用を遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭと、ＣＤ１６０、ＨＳＶ１－ｇＤおよびＬＴαのうちの少なくとも２つとの間の相互作用を遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭと、ＣＤ１６０、ＨＳＶ１－ｇＤおよびＬＴαのすべてとの間の相互作用を阻害／遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＨＶＥＭと、ＣＤ１６０、ＨＳＶ１－ｇＤおよびＬＴαのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を阻害または遮断しない。

いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ｆａｂ断片である。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、遮断抗体である。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチドの群を指す。抗体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアを含む四量体形態を有し、各ペアは１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗体は、単独または他のアミノ酸配列との組み合わせた、オリゴクローナル、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ラクダ化、ＣＤＲグラフト、多特異性、二重特異性、触媒性、ヒト化、完全ヒト型、抗イディオタイプ、および可溶または結合型で標識できる抗体、ならびに、エピトープ結合断片、その変異体または誘導体を含む断片であってもよい。抗体は、いかなる種からのものであってもよい。抗体という用語には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）を含むがそれらに限定されない結合断片も含まれる。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含む分子が含まれる。抗体断片は、Ｆｃ領域またはその断片を含むがそれらに限定されない別の免疫グロブリンドメインに融合されてもよく、または融合されなくてもよい。当業者には、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）－Ｆｃ融合およびｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合を含むがそれらに限定されない他の融合産物が生成され得ることがさらに理解される。

免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４を含む。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ２を含む。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ４を含む。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ１を含む。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、毒性が低減された改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。

自然に発生する抗体構造の基本単位は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成され、非共有結合およびジスルフィド結合の両方で結合されている。各重鎖および軽鎖には、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋もある。５つのヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）が存在し、これらのクラス内のさまざまなサブクラスは、単一の抗体分子内の免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の違い等の構造の違いに基づいて認識される。抗体のクラスおよびサブクラスは、そのアイソタイプである。

重鎖および軽鎖のアミノ末端領域は、カルボキシ末端領域よりも配列が多様であり、したがって可変ドメインと呼ばれる。抗体構造のこの部分は、抗体の抗原結合特異性を付与する。重可変（ＶＨ）ドメインおよび軽可変（ＶＬ）ドメインは一緒に単一の抗原結合部位を形成し、したがって基本的な免疫グロブリン単位には２つの抗原結合部位がある。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１－６３（１９８５）、Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ４５９２－４５９６）。

重鎖および軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬを形成する。これらのドメインの多様性ははるかに低いが、動物種ごとに違いがあり、さらに同じ個体内でそれぞれ異なる機能を有するいくつかの異なる抗体のアイソタイプがある。

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義される超可変領域アミノ酸残基以外の、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。

免疫グロブリン可変ドメインは、ＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を使用して分析し、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを特定することもできる。例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊ６：Ｗ５０３－５０８（２００８）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列がヒト抗体との類似性を高めるように改変されている非ヒト種由来の抗体を指す。ヒト化抗体は、ヒト抗体に類似する配列により囲まれた非ヒト抗体のＣＤＲをコードする組換えＤＮＡの生成により生成され得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化は、本発明のＣＤＲをヒト抗体足場または骨格に挿入することを含む。ヒト化抗体は、当技術分野で周知であり、本発明のＣＤＲを保持するそれらを生成する任意の方法が使用され得る。

「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の生成中に生じ得る可能な変異体を除いて同一であり、および／または同じエピトープに結合し、そのような変異体は一般に少量存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の調製方法によって生成されると解釈されるべきではない。本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。

本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養され得る。高力価のｍＡｂは、個々のハイブリドーマからの細胞を本来のプライミングされたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の目的のｍＡｂを含む腹水を生成するｉｎ ｖｉｖｏ生成で得ることができる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、このような腹水から、または培養上清から精製することができる。

「抗体断片」は、無傷の抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線形抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））、片腕の抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ、またはタンデム（ｄｉ、ｔｒｉ）－ｓｃＦｖ）、ならびにＢｉ特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が含まれるが、これに限定されない。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成され、それぞれ単一の抗原結合部位、および残基「Ｆｃ」断片を有し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が生成される。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、しっかりと非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。ＶＨ－ＶＬ二量体の３つの表面はこの構成にある。総合的に、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。

Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を保持するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ’断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。

任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に区別できるタイプのうちの１つに割り当てることができる。

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。無傷抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、ａ、デルタ、ｅ、ガンマ、およびマイクロと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの考察については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。

「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指す。同じ鎖の２つのドメイン間のペアリングを許可するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアになり、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディの生成は当技術分野で知られており、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）に記載されている。

本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して調製され得る。例には、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ，ｐｇ．７７－９６ ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）に記載のもの等の様々な技術が含まれる。

抗体をインビボで産生する従来の方法に加えて、抗体は、ファージディスプレイ技術を使用してインビトロで生成され得る。そのような組換え抗体の生成は、従来の抗体生成と比較してはるかに速く、それらは膨大な数の抗原に対して生成され得る。さらに、従来の方法を使用する場合、多くの抗原は非免疫原性または非常に毒性があることが判明しているため、動物での抗体の生成には使用できない。さらに、組換え抗体の親和性成熟（すなわち、親和性および特異性の増加）は非常に単純で比較的速い。最後に、特定の抗原に対する多数の異なる抗体が、１回の選択手順で生成され得る。組換えモノクローナル抗体を生成するには、すべてディスプレイライブラリに基づくさまざまな方法を使用して、異なる抗原認識部位を有する抗体の大きなプールが生成され得る。そのようなライブラリはいくつかの方法で作製され得る：合成ＣＤＲ３領域を重鎖生殖細胞系列遺伝子のプールにクローニングすることで合成レパートリーを生成し、さまざまな特異性を有する組換え抗体断片が選択され得る大きな抗体レパートリーを生成することができる。ヒトのリンパ球プールを、抗体ライブラリ構築の出発材料として使用することができる。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築し、したがって多様性の高いヒトライブラリを作成することが可能である。この方法は、さまざまな抗原に対する多数の抗体を選択するために広く成功裏に使用されている。バクテリオファージライブラリの構築および組換え抗体の選択のためのプロトコルは、周知の参考テキストであるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２－２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ １７．１に記載されている。

非ヒト抗体は、当技術分野で知られている任意の方法によってヒト化することができる。１つの方法では、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入される。次いで、抗体フレームワークにさらなる変更を導入して、親和性または免疫原性を調節することができる。

いくつかの実施形態において、抗体およびその一部には、抗体、抗体の断片、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗原結合組換え断片および天然ナノボディが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ_２またはｓｃＦｖ_４断片からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合部分をコードする核酸配列を提供する。

例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖等の免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、典型的には３つの定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ならびに「ヒンジ」領域を含む。いくつかの状況では、定常領域の存在が望ましい。

ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドは、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＣＨＩ等の抗原結合抗体断片を含み、ＣＫまたはＣＬドメインは切除されている。ミニボディは従来の抗体よりも小さいため、臨床／診断における使用での組織浸透性が向上するはずであるが、２価であることから、ｄＡｂ等の１価抗体断片よりも高い結合親和性を保持するはずである。したがって、文脈により別段に示されない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子全体だけでなく、上記で議論したタイプの抗原結合抗体断片も包含する。コードされたポリペプチドに存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。開示されたタンパク質生成物を構成する個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。

適切には、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単離および／または精製され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。

本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせ、またはそれらの文法上の変形は、当業者によって「自然に発生している」と十分に理解されている、あるいは任意の時点で裁判官または行政機関または司法機関によって「自然に発生している」と判断もしくは解釈され得る、物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけの条件語である。

いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１を含まない。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ３を含まない。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含まない。いくつかの実施形態において、抗体は、変異したＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３を含み、ここで、変異は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはその両方の誘導を阻害する。いくつかの実施形態において、変異は、ＦｃＲガンマ結合モチーフにある。

いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１（ＳＹＡＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３（ＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４（ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５（ＧＡＳＳＲＡＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＫＡＢＡＴ番号付けシステムに従っている。

別の態様によれば、抗体またはその抗原結合断片が提供され、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１（ＳＹＡＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３（ＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４（ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５（ＧＡＳＳＲＡＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＫＡＢＡＴ番号付けシステムに従っている。

いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１１（ＧＦＴＦＳＳＹＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１２（ＩＳＧＳＧＧＳＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１３（ＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１４（ＱＳＶＳＳＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１５（ＧＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる。

別の態様によれば、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含む抗体またはその抗原結合部分が提供され、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１１（ＧＦＴＦＳＳＹＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１２（ＩＳＧＳＧＧＳＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１３（ＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１４（ＱＳＶＳＳＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１５（ＧＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号７の配列からなる。いくつかの態様において、抗体は、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９）を含む重鎖を含みる。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号９の配列からなる。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列ＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号８からなる。いくつかの態様において、抗体は、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１０）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号１０の配列からなる。

いくつかの実施形態において、重鎖と軽鎖はリンカーによって結合されている。いくつかの実施形態において、リンカーはアミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４または２５アミノ酸長である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４または２５アミノ酸長である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、リンカーは、１～２５、５～２５、１０～２５、１５～２５、２０～２５、１～２０、５～２０、１０～２０、１５～２０、１～１５、５～１５、１０～１５、１～１０、５～１０または１～５の間のアミノ酸長である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

別の態様によれば、本発明の薬剤を含む薬学的組成物が提供される。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の薬剤である。

本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」、または「アジュバント」という用語は、活性薬剤ではない薬学的組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、封入材料、任意の種類の製剤補助剤、または単に生理食塩水等の無菌水性媒体を指す。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体、粉末化トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；カカオバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油、プロピレングリコール等のグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル、寒天、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸；発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに薬学的製剤で使用される他の非毒性適合性物質である。本明細書において担体として役立ち得る物質のいくつかの非限定的な例には、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、粉末化トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、カカオバター（坐剤基剤）、乳化剤、および他の薬学的製剤で使用される他の非毒性の薬学的適合性物質が含まれる。ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤および滑剤、ならびに着色剤、着香剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤も存在し得る。本明細書で企図される組成物を製剤化するために、任意の非毒性、不活性および有効な担体が使用され得る。これに関して、適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｄａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）、ｔｈｅ ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）、および“Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ“，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔに記載のものがあり、これらすべての内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本組成物において有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例には、蒸留水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、およびＤＭＳＯが含まれる。これらの追加の不活性成分、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野で周知であり、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）等の標準的な教本に記載されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物はまた、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放性粒子、および血清中のペプチドまたはポリペプチドの半減期を増加させる他のビヒクル等の人工的に作製された構造に含まれてもよい。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が含まれる。本明細書に記載のペプチドとともに使用するためのリポソームは、中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロール等のステロールを一般に含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は一般に、リポソームのサイズおよび血液中での安定性等の考慮事項によって決定される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより考察されているように、リポソームを調製するための様々な方法が利用可能であり、また米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号を参照されたい。

担体は、全体で、本明細書に提示される薬学的組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。

「治療有効量」という用語は、哺乳動物の疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。いくつかの実施形態において、治療的に有効な量は、所望の治療的または予防的結果を達成するために、必要な投薬量および時間期間において有効な量である。正確な剤形とレジメンは、患者の状態に応じて医師が決定する。

いくつかの実施形態において、薬剤は、疾患または状態を治療する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、疾患または状態を治療する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＨＶＥＭを発現する細胞によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＶＥＭを発現することを特徴とする疾患細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＶＥＭを過剰発現することによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、過剰発現は、健康な細胞と比較される。いくつかの実施形態において、健康な細胞は、罹患していない細胞である。いくつかの実施形態において、過剰発現は、発現の増加である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＨＶＥＭ陽性の疾患または状態である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＢＴＬＡ陽性の疾患または状態である。

いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＨＶＥＭ陽性のがんである。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＢＴＬＡ陽性のがんである。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＨＶＥＭ陽性の前がん性病変である。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態において、がんは、腎細胞がん腫である。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫、腎臓がん、子宮頸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、および頭頸部がんから選択される。いくつかの実施形態において、腎がんは、腎細胞がん腫である。当業者は、ＨＶＥＭを発現する任意のがんが治療標的となり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、疾患は、炎症性疾患である。いくつかの実施形態において、感染の細胞は、ＨＶＥＭ発現を含む。いくつかの実施形態において、感染した細胞は、ＨＶＥＭ発現を含む。いくつかの実施形態において、感染症は細菌であり、細菌細胞はＨＶＥＭ発現を含む。いくつかの実施形態において、感染症は真菌感染症であり、真菌細胞はＨＶＥＭ発現を含む。いくつかの実施形態において、感染症はウイルスであり、ウイルスに感染した対象細胞は、ＨＶＥＭ発現を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスはヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭ発現は、ＨＶＥＭ過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭ発現は、ＨＶＥＭ発現の増加である。

別の態様では、ＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する方法が提供され、この方法は、ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ相互作用を阻害し、免疫細胞、疾患細胞、またはその両方においてＨＶＥＭシグナル伝達を活性化することを含む。

いくつかの実施形態において、この方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本発明の薬学的組成物を投与することを含む。

別の態様では、ＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する方法が提供され、この方法は、本発明の薬剤を投与することを含む。

別の態様では、ＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する方法が提供され、この方法は、本発明の薬学的組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態において、この方法は、ＨＶＥＭ－ＴＮＦＳＦ１４相互作用を阻害しないことをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＨＶＥＭ－ＴＮＦＳＦ１４相互作用を実質的に阻害しないことをさらに含む。

いくつかの実施形態において、この方法は、ＰＤ－１とそのリガンドのうちの１つとの間の相互作用を阻害することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２から選択される。いくつかの実施形態において、この方法は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２を阻害することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＰＤ－１からＰＤ－Ｌ１への相互作用を阻害することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＰＤ－１からＰＤ－Ｌ２への相互作用を阻害することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＰＤ－１からＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２への相互作用を阻害することをさらに含む。いくつかの実施形態において、相互作用の阻害は、ＰＤ－１からＰＤ－Ｌ１への相互作用またはＰＤ－１からＰＤ－Ｌ２への相互作用を阻害する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、相互作用を阻害することは、ＰＤ－１とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を阻害する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは２つのリガンドである。いくつかの実施形態において、相互作用の阻害は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断を含む。いくつかの実施形態において、相互作用の阻害は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２遮断を含む。いくつかの実施形態において、相互作用の阻害は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を含む。いくつかの実施形態において、相互作用の阻害は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２療法を含む。いくつかの実施形態において、療法は免疫療法である。いくつかの実施形態において、相互作用を阻害する薬剤は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、相互作用を阻害する薬剤は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。いくつかの実施形態において、相互作用を阻害する薬剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤である。いくつかの実施形態において、相互作用を阻害する薬剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗体は、遮断抗体である。ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２およびＰＤ－１療法は当技術分野でよく知られており、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ）、ピジリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４およびＰＤＲ００１を含むが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態において、治療の方法は、ＨＶＥＭ発現細胞に対して別の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、他の治療薬は抗がん治療薬である。いくつかの実施形態において、治療薬は非自家免疫細胞である。いくつかの実施形態において、他の治療法は、自家免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ－ＮＫである。いくつかの実施形態において、自家免疫細胞はＴＩＬ療法である。いくつかの実施形態において、非自家免疫細胞は養子細胞療法である。いくつかの実施形態において、自家免疫細胞は養子細胞療法である。いくつかの実施形態において、養子細胞はＣＡＲ細胞である。いくつかの実施形態において、養子細胞はＴＩＬである。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物および別の治療薬は、同時に投与されている。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、別の治療薬の前、後、または同時に投与される。

別の態様によれば、本発明の方法によりされる対象の適合性を決定する方法であって、対象から試料を取得すること、および試料中のＨＶＥＭレベルを決定することを含み、ＨＶＥＭの陽性発現は、対象が本発明の治療の方法に適していることを示す方法が提供される。

別の態様では、試料中のＨＶＥＭを検出する方法が提供され、この方法は、試料を本発明の薬剤、または本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させ、それによってＨＶＥＭを検出することを含む。

いくつかの実施形態において、接触は、ＨＶＥＭに結合するための薬剤または抗体またはその抗原結合断片の結合に適した条件下である。いくつかの実施形態において、条件は、ＨＶＥＭへの特異的結合に適している。いくつかの実施形態において、結合はハイブリダイズすることである。抗体／薬剤の結合条件は試料によって異なり得る。当業者は、組織試料への結合に必要な条件（固定の方法／タイプに依存する）が、全細胞溶解物等の液体溶液中での結合の条件とは異なることを理解するであろう。そのような結合条件は当技術分野で周知であり、当業者は所与の試料に対して適切な条件を選択することができる。

いくつかの実施形態において、試料は、組織試料である。いくつかの実施形態において、試料は、パラフィン包埋試料である。いくつかの実施形態において、試料は、灌流試料である。いくつかの実施形態において、試料は、対象からのものである。いくつかの実施形態において、試料は、健康な試料である。いくつかの実施形態において、試料は、疾患試料である。いくつかの実施形態において、試料は、診断試料である。

いくつかの実施形態において、この方法は、本発明の薬剤、または本発明の抗体またはその抗原結合断片を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、免疫組織化学検出によるものである。いくつかの実施形態において、検出は、免疫蛍光検出によるものである。いくつかの実施形態において、検出は、ＦＡＣＳ検出によるものである。いくつかの実施形態において、検出は、本発明の薬剤または抗体を認識した二次抗体と試料を接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、二次抗体を検出することを含む。いくつかの実施形態において、検出は顕微鏡検査を含む。

いくつかの実施形態において、対象は、疾患または状態に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、疾患または状態に罹患していると疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、疾患または状態を発症するリスクがある。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＶＥＭ発現の増加を含み得る疾患または状態に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＶＥＭ発現の増加を特徴とし得る疾患または状態に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、がんは、第一選択療法に応答しなかったがんである。いくつかの実施形態において、がんは、がん再発である。いくつかの実施形態において、がんは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に応答しなかったがんである。

いくつかの実施形態において、試料は、疾患試料である。いくつかの実施形態において、試料は、生体液である。いくつかの実施形態において、生体液は、血液、血清、血漿、尿、糞便、胆汁、精液、腫瘍液、および脳脊髄液から選択される。いくつかの実施形態において、試料は、血液試料である。いくつかの実施形態において、試料は、細胞試料である。いくつかの実施形態において、試料は、細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料は、疾患細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料は、腫瘍試料である。いくつかの実施形態において、試料は、生検である。

いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭの陽性発現は、ＨＶＥＭ発現を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭの陽性発現は、上昇したＨＶＥＭレベルを含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭの陽性発現は、増加したＨＶＥＭレベルを含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭの陽性発現は、ＨＶＥＭの過剰発現を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭの陽性発現は、健康な試料と比較される。いくつかの実施形態において、健康な試料は、健康な組織および／または疾患組織および／または細胞に隣接する細胞からのものである。いくつかの実施形態において、健康な試料は、感染していない細胞を含む。いくつかの実施形態において、健康な試料は、健康なドナーのためのものである。いくつかの実施形態において、ＨＶＥＭの陽性発現は、所定の閾値と比較される。

別の態様によれば、本発明の薬学的組成物または本発明の薬剤を含むキットが提供される。

いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤ－１ベースの療法をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤ－Ｌ１ベースの療法をさらに含む。いくつかの実施形態において、療法は免疫療法である。いくつかの実施形態において、療法は、抗ＰＤ－１療法である。いくつかの実施形態において、療法は、抗ＰＤ－Ｌ１療法である。いくつかの実施形態において、療法は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断療法である。いくつかの実施形態において、療法は遮断抗体である。いくつかの実施形態において、療法は抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態において、療法は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、遮断抗体である。

いくつかの実施形態において、キットは、本発明の薬学的組成物がＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの療法とともに使用するためのものであることを示すラベルをさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の薬剤がＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１ベースの療法に使用するためのものであることを示すラベルをさらに含む。

いくつかの実施形態において、キットは、二次検出分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出分子は、本発明の薬剤を検出するためのものである。いくつかの実施形態において、二次検出分子は、本発明の薬剤に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、検出分子は、検出可能な部分を含む。検出可能な部分の例には、蛍光部分、タグ、放射性標識、色素、および化学発光部分が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は蛍光部分である。蛍光部分の例には、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＡＰＣ、ＣＹ５、ＣＹ７、およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅが含まれるが、これらに限定されない。二次検出分子は当技術分野で周知であり、本発明の薬剤を検出する任意のそのような分子を使用することができる。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、値と組み合わされたとき、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「一つのポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「そのポリペプチド（ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つ以上のポリペプチドおよび当業者に既知のその等価物などへの言及を含む、などである。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草されてもよいことに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の引用、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独」、「唯一」等の排他的な用語を使用するための先行基準として機能することを意図する。

「Ａ、Ｂ、およびＣ等のうちの少なくとも１つ」に類似する慣例が使用される場合、概して、そのような構成は、当業者がその慣例を理解する意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢ共に、ＡおよびＣ共に、ＢおよびＣ共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣ共になどを有するシステムを含むが、これらに限定されない）。説明、特許請求の範囲、または図面に関わらず、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語および／または語句が、用語のうちの１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。

明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明の特定の特徴がまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の好適な部分的組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさに、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されるかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素の全ての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、まさに、ありとあらゆるそのような部分的組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されるかのように本明細書に開示される。

本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定するように意図されるものではない以下の実施例を調査すると、当業者に明らかになるであろう。加えて、本明細書で先に説明され、以下の特許請求の範囲の節において主張されるような本発明の種々の実施形態および態様の各々は、次の実施例において実験に基づく裏付けを見出す。

上記に記述され、かつ以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的証拠を見出す。

一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、４，６８３，２０２号、４，８０１，５３１号、５，１９２，６５９号、および５，２７２，０５７号に記載された方法論、”Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、”Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ （ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、を参照されたく、これらのすべては参照により取り込まれる。他の一般的な参考文献は、本書全体を通して提供される。

材料および方法
ファージディスプレイによるＨＶＥＭに対するｓｃＦｖの生成：ナイーブヒトｓｃＦｖ ライブラリを、タグ特異的クローンを差し引くために合成／組換えタグとともに、ＣＨＯ－Ｋ１細胞結合クローンを差し引くために対照ＣＨＯ－Ｋ１空細胞とともにインキュベートした。次に、ファージを、ｈｒＨＶＥＭを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞とのインキュベーションを介して３回のバイオパニングラウンドに供した。クローンを選び、ヘルパーファージの助けを借りて救助し、ｈｒＨＶＥＭ、ｍｒＨＶＥＭおよびｃｒＨＶＥＭに対するファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。クローンの配列を決定し、陽性のユニークなクローンをｐＥＴ２５ｂタンパク質発現ベクターにサブクローニングした。溶解物は、２００ｍｌの誘導培養物から調製された。細菌細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、フレンチプレスで溶解した。高速遠心分離により不溶性の破片を除去し、ｓｃＦｖを含む可溶性タンパク質を含む溶解物を収集した。ｓｃＦｖはＨＩＳタグでクローン化された。

トランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞の生成：ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を添加したＬ－グルタミン培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を有するＮｕｔｒｉｅｎｔ ＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２（Ｈａｍ‘ｓ）中の２００Ｋ細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、２μｇのプラスミドＤＮＡを４μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、製造元の指示に従ってトランスフェクトした。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸抗生物質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による選択は、トランスフェクション後の２日目に行い、細胞は抗生物質を添加して通常通りに培養した。

フローサイトメトリー：表面細胞染色は、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．５％ＢＳＡ）で希釈した適切な純粋な特異抗体を含む≦１ｘ１０^５個の細胞に氷上で３０分間実施した。インキュベーション後、細胞を５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を、フルオロフォア結合した適切な二次抗体で氷上に覆って３０分間インキュベートした。フルオロフォア結合一次抗体の場合、二次抗体なしで直接染色を行った。インキュベーション後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析のために２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。

ｍＡｂ産生：
ａ．ルシフェラーゼレポーターアッセイ：ルシフェラーゼ活性は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、製造元の指示に従って測定した。簡単に説明すると、ルシフェラーゼアッセイ試薬は、１ボトルのバッファーと１ボトルの基質を組み合わせて混合することによって調製した。等量の試薬と試料を混合し、適切な機器設定を使用して試薬を添加してから３分または１０分後に発光を測定した。
ｂ．プラスミドの調製：ｓｃＦｖ２を、Ｓ２２８Ｐ変異を含む完全なＩｇＧ４抗体に変換した。ターゲットＤＮＡ配列は、設計、最適化、および合成された。完全な配列をｐｃＤＮＡ３．４ベクターにサブクローニングした。トランスフェクショングレードのプラスミドは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のためにマキシ調製された。
ｃ．細胞培養と一過性トランスフェクション：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、無血清Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で培養した。細胞は、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）上で、３７℃、８％ＣＯ２の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）中で維持された。トランスフェクションの１日前に、細胞を適切な密度でコーニング三角フラスコに播種した。トランスフェクションの日に、ＤＮＡとトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、トランスフェクションの準備ができた細胞とともにフラスコに加えた。標的タンパク質をコードする組換えプラスミドを、懸濁液Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養物に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後６日目に収集した細胞培養上清を精製に使用した。

精製と分析：細胞培養液を遠心分離した後、ろ過した。ろ過した細胞培養上清を適切な流速でアフィニティー精製カラムにロードした。洗浄し、適切なバッファーで溶出した後、溶出した画分をプールし、バッファーを最終製剤バッファーに交換した。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング分析によって分子量および純度測定を分析した。濃度はＡ２８０法（抗体）で測定した。

細胞毒性アッセイ：核ＲＦＰで染色された黒色腫細胞を一晩インキュベートするために播種し、付着させた。次に、黒色腫細胞を、２０μｇ／ｍｌの本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）とプレインキュベートし、ＴＩＬを２０μｇ／ｍｌの抗ＰＤ１ ｍＡｂ（ニボルマブ、ＢＭＳ）またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）とプレインキュベートした。プレインキュベートしたＴＩＬまたは抗ＰＤ１またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照ｍＡｂのみを含む培地を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７緑色検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）とともに黒色腫細胞に添加した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ ＺＯＯＭシステム（ＥＳＳＥＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）に配置し、１時間ごとにスキャンした。黒色腫の特定の死滅を反映するカスパーゼ３／７陽性事象がカウントされた。同様のプロトコルが、ＲＣＣ細胞を用いた細胞毒性アッセイ実験およびＭＡＢ３５６を用いた細胞毒性アッセイ実験に使用された。

フローサイトメトリーによるＴ細胞活性化アッセイ：黒色腫細胞または培地のみを、本発明の２０μｇ／ｍｌのｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＴＩＬを黒色腫細胞または培地に添加し、３７℃で４時間共培養した。４時間後、細胞を抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）および抗４１ＢＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）で表面染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）を使用したフローサイトメトリーによって発現を評価し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳ）を使用してデータ分析を行った。

Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ＺＯＯＭシステムによるＴ細胞活性化アッセイ：核ＲＦＰ染色黒色腫細胞を一晩インキュベートするために播種し、付着させた。一晩のインキュベーション後、黒色腫細胞を、本発明の２０μｇ／ｍｌのｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照とともに３７℃で１時間インキュベートした。ＭＡＲＴ－１エレクトロポレーションされたＰＢＭＣまたは培地を、ＦａｂＦｌｏｕｒ－４８８標識試薬（ＥＳＳＥＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で標識された抗４１ＢＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）とともに黒色腫細胞に添加した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ ＺＯＯＭシステムに配置し、１時間ごとにスキャンした。

Ｔ細胞クラスターアッセイ：画像はＩｎｃｕｃｙｔｅ ＺＯＯＭシステムによって取得された。クラスターの数は、イメージＪバージョン１．５２ａを使用した画像分析によって計算された。画像が平滑化され、コントラストが強調されてから、８ビット画像に変換された。画像の２値化後、「閉じる」、「穴を埋める」、「浸食する」コマンドを適用して画像を処理した。次に、「粒子の分析」コマンドを次のパラメータで適用した：サイズ５００ｍｍ＾２－無限大および円形度０．１～１。

実施例１：免疫遮断標的としてのＨＶＥＭの同定
約８，３００個の遺伝子からなるハイスループットゲノムワイド一次ｓｉＲＮＡスクリーニングが、２つの患者由来黒色腫細胞系で実行された。ＬＤＨベースの細胞毒性アッセイを使用して、ＴＩＬと一晩共培養することにより、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの９６時間後に死滅への影響を評価した。陽性対照のノックダウンの成功は、ＦＡＣＳによって評価された。３６０遺伝子からなる確認スクリーンは、一次スクリーンと同じデザインを使用して８つの黒色腫細胞系で検証された。ポジティブヒットは、Ｚスコアと死滅増強の割合に基づいて定義され、増殖におけるｓｉＲＮＡの効果が補正されている。最後に、５４個の遺伝子からなる検証スクリーンが５つの黒色腫細胞系で実行された。ＨＶＥＭは、潜在的な免疫療法の標的としての強力なポジティブヒットとして発見された。

実施例２：ＨＶＥＭに対するｓｃＦｖの選択
がんの治療における治療的免疫遮断の潜在的な標的としてＨＶＥＭを確立した後、ＨＶＥＭに結合できる単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を単離してアッセイした。ｓｃＦｖは、上記のように分離された（材料および方法）。６つの選択されたｓｃＦｖを、組換えヒト、マウス、およびカニクイザル ＨＶＥＭへの結合についてスクリーニングした（表１を参照）。６つのうち５つは、細胞ＥＬＩＳＡで測定したところ、ＣＨＯ－Ｋ１細胞で発現したヒト組換えＨＶＥＭ（ｈｒＨＶＥＭ）への強い結合を示した。ＣＨＯ－Ｋ１空細胞を陰性対照として使用した。これら５つのうち２つは、マウス組換えＨＶＥＭ（ｍｒＨＶＥＭ）に対して非常に強い結合を示したが、他方の３つははるかに弱い結合を示した。５つのうちの１つは、サル（カニクイザル）ＨＶＥＭへの強い結合も示したが、他方の３つははるかに弱い結合を示した。ＦＡＣＳ分析を使用してこれらの結果を確認した。ｓｃＦｖにはＨＩＳタグが含まれており、表面結合の検出には抗ＨＩＳ二次ＡＰＣ結合抗体を使用した。ＥＬＩＳＡによって予測されたように、５つのｓｃＦｖがＣＨＯ－Ｋ１ ＨＶＥＭ過剰発現細胞の表面ｈｒＨＶＥＭに結合することが分かったが、２つのｓｃＦｖは結合が不十分であった（図１）。

表１．ＨＶＥＭを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対するｓｃＦｖを含む溶解物を用いた細胞ＥＬＩＳＡ。数字はＯＤ値を表する。

次に、ｓｃＦｖを、ＨＶＥＭとそのリガンドの２つであるＢＴＬＡおよびＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）との間の相互作用を阻害する能力について確認した。ＥＬＩＳＡプレートを２．５μｇ／ｍｌのｈｒＨＶＥＭでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次にプレートを洗浄し、２％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした。ｓｃＦｖ１－６溶解物と対照溶解物をＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１０分間ブロックした後、さらに洗浄した。ｈｒＢＴＬＡ－ＦｃまたはｈｒＬＩＧＨＴ－ＨＩＳをＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ブロックし、マウス抗ＢＴＬＡビオチンｍＡｂまたはヤギ抗ＬＩＧＨＴ ｐＡｂとともに室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼまたはウシ抗ヤギＨＲＰ抗体とともに室温で３０分間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、ＴＭＢに続いて硫酸停止溶液を添加した。Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーを使用して、４５０ｎＭおよび５７０ｎＭで吸光度を読み取った。予期せぬことに、ｓｃＦｖｓ１、３、４、および６はｈｒＨＶＥＭに結合したが、これらの抗体はＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ結合を阻害しなかった。対照的に、ｓｃＦｖ２はＢＴＬＡ結合をほぼ完全に阻害した（図２Ａ）。特に、どの抗体もＬＩＧＨＴのＨＶＥＭへの結合を有意に阻害しなかった（図２Ｂ）。ヒト、マウス、サルのｒＨＶＥＭに結合し、ＨＶＥＭ－ＢＴＬＡの相互作用をブロックする能力があるため、今後のすべての作業でｓｃＦｖ２が選択された。

実施例３：抗ＨＶＥＭ ＩｇＧ抗体
単鎖抗体ｓｃＦｖ２はＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ相互作用の遮断に効果的であったが、完全なＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ｓｃＦｖ２の軽鎖と重鎖、特にＣＤＲから設計された。ｓｃＦｖ２が配列決定され、Ｓ２２８Ｐ変異を除いて軽鎖と重鎖がＩｇＧ４バックボーンにクローン化された。このｍＡｂの重鎖の完全な配列は配列番号９に示され、軽鎖は配列番号１０に示されている。完全なＩｇＧ抗体の存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって確認された（図３）。

次に、ヒト、マウス、サルの組換えＨＶＥＭへの新しいｍＡｂの結合を以前と同様に評価した。ｈｒＨＶＥＭへの結合は、ＥＬＩＳＡによって以前と同様に評価された。新しいｍＡｂはｈｒＨＶＥＭに強く結合した（図４Ａ）。結合も以前と同様にＦＡＣＳによって評価された。ＣＨＯ－Ｋ１空、ＣＨＯ－Ｋ１ ｈｒＨＶＥＭ、ＣＨＯ－Ｋ１ ｍｒＨＶＥＭ、およびＣＨＯ－Ｋ１ ｃｒＨＶＥＭ細胞を、２０μｇ／ｍｌの抗体またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体とともに氷上で１時間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ ＦＣビオチンおよび抗ビオチンＦＩＴＣで染色した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ機器を使用したフローサイトメトリーおよびＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ソフトウェアを使用したデータ分析によって発現を評価した。新しいｍＡｂは、３つの種すべてのｒＨＶＥＭに強く結合した（図４Ｂ）。

新しいｍＡｂは組換えヒトＨＶＥＭに結合できるため、健康な細胞とがん細胞の表面にある内因性ＨＶＥＭに結合する能力を試験した。最初の免疫組織化学は、健康なヒトの結腸および脾臓組織に対して本発明のｍＡｂを用いて実施され、そこでは強い染色が観察された（図５Ａ）。次に、ＨＶＥＭを発現することが知られている３つの初代患者試料からの黒色腫細胞（図５Ｂ）を２０μｇ／ｍｌの本発明のｍＡｂとともに氷上で１時間インキュベートし、続いて抗ヒトＩｇＧ ＦＣビオチンおよび抗ビオチンＦＩＴＣで染色した。発現は以前のようにＦＡＣＳによって評価された。新しいｍＡｂは、試験した３つの黒色腫試料すべてに結合した（図５Ｃ）。腎細胞がん腫（ＲＣＣ）患者試料への結合も試験された。この場合も、市販の抗ＨＶＥＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ３５６）を使用して、がん細胞がＨＶＥＭを発現していることを確認した（図５Ｄ）。これらの表面への新しいｍＡｂの結合は、市販の抗体と同等であった（図５Ｅ）。最後に、腫瘍マイクロアレイを本発明のｍＡｂでプローブした（図５Ｆ）。適応症ごとに１つの健康な組織試料と５つの異なる腫瘍試料を含む１２の異なる適応症が試験された。健康な膵臓、肺、乳房、膀胱、卵巣はＨＶＥＭ陰性であった。一方、リンパ節、喉頭／口腔／舌、脳、腎臓、肝臓、胃はすべてさまざまな程度で陽性であった。すべての腫瘍がＨＶＥＭを発現したわけではないが、各臓器タイプからの少なくとも１つの腫瘍試料が陽性であった。

ＨＶＥＭへのＢＴＬＡ結合を阻害する完全なｍＡｂの能力もまた、以前のように評価された。本発明のｍＡｂの存在下では、ＥＬＩＳＡによって測定すると、ＢＴＬＡはＨＶＥＭに結合しなかった（図６Ａ）。アイソタイプ対照ＩｇＧの添加は、ＢＴＬＡがＨＶＥＭに強く結合する陽性対照として機能した。また、ｓｃＦｖで見られるように、ｍＡｂはＬＩＧＨＴのＨＶＥＭへの結合を阻害しなかった（図６Ｂ）。対照的に、市販の抗ＨＶＥＭ ｍＡＢであるＭＡＢ３５６は、予想どおりｈｒＨＶＥＭに強く結合できたが（図６Ｃ）、ＭＡＢ３５６の存在は、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の添加と比較して、ＨＶＥＭとＢＴＬＡの相互作用をわずかに妨害するだけである（図６Ｄ）。したがって、本発明のｍＡｂは、ＢＴＬＡ－ＨＶＥＭ相互作用の阻害に関して、ＭＡＢ３５６よりもはるかに優れている。

次に、ＨＶＥＭを介した下流のシグナル伝達について検討した。リガンド結合によるＨＶＥＭの活性化は、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達を誘導する。本発明のｍＡｂがＨＶＥＭシグナル伝達に及ぼす影響を評価するために、ｈｒＨＶＥＭおよびＮＦ－ｋＢルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、２０μｇ／ｍｌのｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照とともに氷上で１時間プレインキュベートした。細胞を洗浄した後、ＣＨＯ－Ｋ１空、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｒＢＴＬＡ、または細胞なしで３７℃で６時間共培養した。ルシフェラーゼ活性はＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを使用して試験し、発光は試薬添加の１０分後にＳｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーを使用して測定した。ルシフェラーゼは、ＣＨＯ細胞がＢＴＬＡを発現した場合にのみ、対照抗体とプレインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞で誘導された（図７、右）。ＮＦ－ｋＢシグナル伝達はＨＶＥＭのリガンドによってのみ誘導されるべきであるため、これは予想されることである。興味深いことに、本発明のｍＡｂを用いてプレインキュベーションを行った場合、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｒＢＴＬＡ細胞を用いて共インキュベーションを行った場合、ルシフェラーゼの非常に強い誘導は見られなかった（図７、左中央の棒）。これは、ｍＡｂがＨＶＥＭ－ＢＴＬＡの相互作用をブロックしているためである。ただし、ｍＡｂとのプレインキュベーション後のルシフェラーゼのレベルもベースラインではない。むしろ、ｍＡｂ自体がＨＶＥＭおよびＮＦ－ｋＢシグナル伝達の穏やかな活性化を誘導する（図７、左）。ＣＨＯ細胞が共インキュベーションされているかどうかに関係なく、同じレベルの活性化が見られる。これは、この活性化が細胞ではなくｍＡｂ自体によって引き起こされていることを確認している。

実施例４：本発明のｍＡｂは、がん細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を増強する。
ｍＡｂはＨＶＥＭに結合し、ＢＴＬＡへの結合をブロックするため、ＢＴＬＡシグナル伝達がＴ細胞に及ぼす阻害効果を軽減すると理論付けられた。これを試験するために、付着した黒色腫細胞を、２０μｇ／ｍｌの本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を黒色腫細胞に添加し、３７℃で２４時間共インキュベーションした。インキュベーション後、バックグラウンドＩＦＮγ分泌の対照として、共培養試料またはＴＩＬのみの試料から上清を収集した。ＩＦＮγ分泌は、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ Ｍａｘ Ｄｅｌｕｘｅキットを使用したＥＬＩＳＡによって測定された。本発明のｍＡｂとのプレインキュベーションは、１つの黒色腫細胞系におけるＩＦＮγ分泌の量のほぼ２倍をもたらし、なおも重要には、２番目の系では、より低いとはいえ、増加をもたらし（図８）、Ｔ細胞阻害は確かに抗体によって軽減されることを示している。

次に、自家ＴＩＬの存在下での初代患者黒色腫細胞の特異的死滅を測定した。２人の患者からの付着した黒色腫細胞を、本発明のｍＡｂまたはアイソタイプ対照とプレインキュベートした。同時に、ＴＩＬを抗ＰＤ－１抗体またはアイソタイプ対照とプレインキュベートした。次に、黒色腫細胞とＴＩＬをすべての可能な組み合わせで共インキュベーションし、黒色腫細胞の特異的死滅を１時間ごとに１１時間測定した（図９Ａ－Ｂ）。第１の細胞系において、本発明のｍＡｂの添加は、アイソタイプ対照で処理された細胞と比較して、１１時間後の総細胞死滅のほぼ３０％の増加をもたらした。同様のレベルの死滅が抗ＰＤ１治療で観察された（３３％増加）。両方の抗体との併用治療は、全体的な死滅の６０％の相加的増加をもたらした。複合効果は、二人目の患者からの細胞で得られた結果によって強化された。繰り返すが、本発明のｍＡｂと抗ＰＤ１は同様の効果を示し、死滅をそれぞれ６７％と６４％増加させた。予期せぬことに、両方の抗体による併用治療は相乗効果をもたらし、対照の共培養と比較して、総死滅は１８０％増加した。これは、２つの抗体が一緒になって免疫チェックポイント阻害に相乗効果をもたらすことができることを示している。

次に、ＭＡＢ３５６を同じ系で試験した。ＴＩＬによる黒色腫細胞の死滅は、一人目の患者の黒色腫細胞を用いて上記のように試験された。黒色腫細胞を、ＭＡＢ３５６または本発明のｍＡｂまたは適切なアイソタイプ対照とプレインキュベートし、次に自己ＴＩＬと混合した。黒色腫細胞の特異的死滅を１時間ごとに１５時間測定した。本発明のｍＡｂの添加は、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照で処理された細胞と比較して、１５時間後の総細胞死滅の２２％の増加をもたらし（図９Ｄ）、一方、市販のＭＡＢ３５６の添加は、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照で処理された細胞と比較して総細胞死滅の９％の減少をもたらした。（図９Ｅ）。これは、本発明のｍＡｂがＭＡＢ３５６よりも優れていることを明確に示している。

同様の実験がＲＣＣ患者からの細胞で行われた。同じ患者からのＴＩＬと共培養する前に、がん細胞を一晩接着させ、本発明のｍＡｂまたはアイソタイプ対照と１時間プレインキュベートした。がん細胞の細胞死は、カスパーゼ３／７陽性事象によって測定され、２６時間後、本発明のｍＡｂは、アイソタイプ対照と比較して、総細胞死滅を４７％増加させることが見出された（図９Ｃ）。

実施例５：本発明のｍＡｂは、がん細胞に対する非自家免疫細胞の細胞毒性を増強する。
がん患者からのＴＩＬの細胞毒性が本発明のｍＡｂを使用して増強され得ることを示したので、非自己免疫細胞を増強する能力が試験された。健康なドナーからのＰＢＭＣを収集し、ヒトＭＡＲＴ１ ＴＣＲのアルファ鎖とベータ鎖を発現させるようにした。ＭＡＲＴ１を発現する核ＲＦＰ染色黒色腫細胞を一晩接着させ、ＰＢＭＣと共培養する前に本発明のｍＡｂまたはアイソタイプ対照と１時間プレインキュベートした。がん細胞の細胞死は、カスパーゼ３／７陽性事象によって測定され、２６時間後、本発明のｍＡｂは、アイソタイプ対照と比較して、総細胞死滅を２８％増加させることが見出された（図１０Ａ）。

ＰＢＭＣからの炎症誘導性サイトカイン分泌も測定された。具体的には、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）分泌を、本発明のｍＡｂまたはアイソタイプ対照を含む培地で培養した、または本発明のｍＡｂまたはアイソタイプ対照でプレインキュベートした黒色腫細胞で培養したＰＢＭＣからの培地で測定した。培養開始から２４時間後にＩＦＮγレベルを測定した。予想通り、黒色腫細胞とのインキュベーションはＩＦＮγ分泌を大幅に増加させたが、本発明のｍＡｂとプレインキュベートした黒色腫細胞とのインキュベーションは、アイソタイプ対照とプレインキュベートした黒色腫細胞と比較して、分泌をさらに３２％増加させた（図１０Ｂ）。

細胞毒性の増加がＴ細胞死滅の増加によるものではなく、抗体によって直接引き起こされた可能性を排除するために、ｍＡｂの直接的な細胞毒性効果を測定した。核ＲＦＰで染色された付着黒色腫細胞を、２０μｇ／ｍｌの本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７緑色検出試薬を黒色腫細胞に添加した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ ＺＯＯＭシステム（ＥＳＳＥＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）に配置し、１時間ごとに１５時間スキャンした。ｍＡｂとインキュベートした２つの異なる黒色腫細胞では細胞死の増加は観察されなかった（図１１）。これは、抗体自体が細胞傷害性ではなく、最後の実験で観察されたがん死滅の増加はむしろＴ細胞の細胞毒性の増加によるものであることを示している。

実施例６：本発明のｍＡｂは、ＴＩＬの基本的な穏やかな活性化を誘導する。
Ｔ細胞におけるＢＴＬＡ誘導抑制を軽減する一方で、本発明のｍＡｂはまた、Ｔ細胞自体のＨＶＥＭに結合する。ｍＡｂはＨＶＥＭシグナル伝達を介してＮＦ－ｋＢ誘導転写を増加させるため、ｍＡｂの直接結合はＴ細胞の活性化を直接増加させ得る。これを試験するために、ＴＩＬをｍＡｂまたはアイソタイプ対照で単独および自己黒色腫細胞の存在下の両方で刺激し、Ｔ細胞の活性化をモニターした（図１２Ａ）。活性化Ｔ細胞の割合は、黒色腫細胞の有無にかかわらず、ｍＡｂの存在下で増加した。これは、Ｔ細胞上のＨＶＥＭへの抗体の結合がそれ自体で活性化を誘導することを示している。このように、抗体には少なくとも二重の効果があり、両方ともがん細胞の免疫監視回避メカニズムをブロックすると同時に、Ｔ細胞を直接活性化する。

ＨＶＥＭを介したシグナル伝達は、Ｔ細胞クラスタリングを測定することによっても試験された。細胞のクラスタリングは、活性化されたＴ細胞の特徴である。２人の異なる黒色腫患者からのＴＩＬを、本発明のｍＡｂまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照とともに２０時間インキュベートし、次いで、クラスター数を測定した。試験した両方の試料について、本発明のｍＡｂはＴ細胞のクラスタリングを有意に増加させた（図１２Ｂ）。ＭＡＢ３５６を試験した場合、ｍＩｇＧ１対照と比較してＴ細胞クラスタリングへの変化は観察されなかった（図１２Ｃ）。これは、本発明のｍＡｂのＴ細胞上のＨＶＥＭへの結合がシグナル伝達および低レベルの活性化を誘導するが、市販のＭＡＢ３５６の結合は誘導しないことを示している。

黒色腫細胞の存在下でのＰＢＭＣの活性化も測定された。以前のように、ＰＢＭＣは黒色腫細胞を標的とするようにＭＡＲＴ－１特異的ＴＣＲを発現した。これらの非自己細胞についても、細胞での４１ＢＢ発現によって測定されるように、ｍＡｂは活性化を大幅に増加させた（図１２Ｄ）。

免疫チェックポイント阻害剤を投与する場合、サイトカイン放出症候群は常に懸念事項である。上に示したように、本発明のｍＡｂは、がん細胞が存在しない場合でさえ、ＴＩＬの穏やかな活性化を誘導することができる。この活性化の程度をさらに解明するために、サイトカイン放出アッセイを実施した。全血を１０人の健康なドナーから収集し、本発明のｍＡｂを０．１、１、１０および１００ｕｇ／ｍｌの濃度で試験した。２４時間後、試料の５つのサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の発現を測定した。２つの市販の抗がん抗体エルビツクス（ＥＧＦＲ阻害剤）とレムトラダ（抗ＣＤ５２）を対照として使用した。分析の結果を図１３に要約する。強力なサイトカイン応答を誘導したレムトラダとは異なり、本発明のｍＡｂは、エルビツクスに匹敵する穏やかな応答のみを生成した。

実施例７：本発明のｍＡｂによるインビボがん治療。
ヒト黒色腫細胞をＳＣＩＤ－ＮＯＤマウスの脇腹に皮下移植した（０日目）。腫瘍が約４５ｍｍ＾３に達したとき（１７日目）、マウスを４つの治療グループ（３マウス／グループ）に割り当て、ヒト自己ＴＩＬを静脈内投与した。ＴＩＬは３４日目に再び投与された。１７日目に、ＴＩＬ投与と同時に、ｈＩＬ－２を５日間連続して皮下投与し、その後、週に２回投与した。１８日目に、その後週に２回、マウスに、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（黒丸）、本発明のｍＡｂ（白四角）、抗ＰＤ１（黒三角）、または両方の抗体の組み合わせ（黒菱形）を静脈内投与した。本発明のｍＡｂでの治療は、アイソタイプ対照での治療と比較して、３１％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）をもたらしたが、抗ＰＤ１での治療は、わずか１１％のＴＧＩをもたらした。併用治療は相乗効果があり、ＴＧＩは４８％であった（図１４）。どのマウスにも有害な副作用は観察されなかった。これらの結果は、本発明の抗体ががんのインビボ治療に有効であり、抗ＰＤ１抗体との併用治療が治療を増強する相乗効果を有することを実証している。

本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、および変更が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内に入るそのような全ての代替、修正、および変更を包含することが意図されている。

Claims (44)

1. 細胞上のヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）に特異的に結合する薬剤は、
   ａ．前記ＨＶＥＭとＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）との間の相互作用を阻害し、
   ｂ．前記細胞内の前記ＨＶＥＭを介した下流シグナル伝達を活性化する。
2. 前記薬剤が、前記ＨＶＥＭと腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）との間の相互作用を実質的に阻害しない、請求項１に記載の薬剤。
3. 前記薬剤が、前記ＨＶＥＭとＣＤ１６０、リンホトキシンアルファ（ＬＴα）、またはその両方との間の相互作用を阻害する、請求項１または２に記載の薬剤。
4. 前記薬剤が、前記細胞によって発現される前記ＨＶＥＭに結合する際に、ＨＶＥＭを発現する細胞のアポトーシスを直接誘導しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬剤。
5. 前記薬剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬剤。
6. ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、または前記細胞に対して細胞毒性を有しない改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む、請求項５に記載の薬剤。
7. 前記薬剤が単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項５に記載の薬剤。
8. ＨＶＥＭを介した前記下流シグナル伝達が、活性化Ｂ細胞（ＮＦ－ｋＢ）媒介転写の核因子カッパ軽鎖エンハンサーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬剤。
9. ＨＶＥＭを介した前記下流シグナル伝達が、前記ＨＶＥＭを発現する免疫細胞の細胞毒性の増加を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤。
10. 前記増加した細胞毒性が、炎症誘導性サイトカインの分泌の増加を含む、請求項９に記載の薬剤。
11. 前記細胞が免疫細胞であり、前記シグナル伝達が免疫活性化を誘導する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬剤。
12. 前記免疫細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１１に記載の薬剤。
13. 前記細胞ががん細胞であり、前記シグナル伝達が抗腫瘍効果を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の薬剤。
14. ＨＶＥＭを発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の薬剤。
15. 前記疾患が、ＨＶＥＭ陽性のがんまたは前がん性病変である、請求項１４に記載の薬剤。
16. 前記ＨＶＥＭ陽性がんが、黒色腫、腎がん、子宮頸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、および頭頸部がんから選択される、請求項１５に記載の薬剤。
17. 前記疾患が感染症であり、前記感染細胞がＨＶＥＭ発現を含む、請求項１４に記載の薬剤。
18. 前記抗体またはその抗原結合断片が、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１（ＳＹＡＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３（ＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４（ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５（ＧＡＳＳＲＡＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５～１７に記載の薬剤。
19. 配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖を含む、請求項１８に記載の薬剤。
20. 配列ＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含む軽鎖を含む、請求項１８または１９に記載の薬剤。
21. 配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９）を含む重鎖、および配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１０）を含む軽鎖を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の薬剤。
22. 抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ）を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１（ＳＹＡＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２（ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３（ＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４（ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５（ＧＡＳＳＲＡＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６（ＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
23. 配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖を含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
24. 配列ＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含む軽鎖を含む、請求項２２または２３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
25. 配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＤＹＴＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９）を含む重鎖、および配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１０）を含む軽鎖を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
26. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の薬剤、または請求項２２～２５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗体結合断片、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
27. ＨＶＥＭ陽性細胞を特徴とする疾患または状態を治療する方法であって、請求項２６に記載の薬学的組成物を投与することを含み、それによって前記疾患または状態を治療する、方法。
28. 抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法を投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 養子細胞療法を投与することをさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 請求項２９に記載の方法において、前記養子細胞療法が養子ＴＩＬ療法を含む。
31. 前記養子細胞療法が、免疫細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を投与することを含み、前記ＣＡＲが、前記ＨＶＥＭ発現細胞の表面上の非ＨＶＥＭタンパク質を標的とする、請求項２９または３０に記載の方法。
32. ＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する方法であって、
    ａ．ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡの相互作用を阻害することと、
    ｂ．免疫細胞、疾患細胞、またはその両方でＨＶＥＭシグナル伝達を活性化することとを含み
    それによってＨＶＥＭ陽性の疾患または状態を治療する、方法。
33. ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
34. ＨＶＥＭおよびＴＮＦＳＦ１４の相互作用を実質的に阻害しないことをさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
35. 前記疾患または状態が、ＨＶＥＭ陽性のがんまたは前がん性病変である、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記ＨＶＥＭ陽性がんが黒色腫および腎細胞がん腫から選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 前記疾患または状態が感染症であり、前記感染細胞がＨＶＥＭ発現を含む、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記免疫細胞がＴＩＬまたはＰＢＭＣである、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記免疫細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項２９～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 請求項２６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 請求項２７～４０のいずれか一項に記載の方法により治療される対象の適合性を決定する方法であって、前記対象から疾患試料を取得すること、および前記試料中のＨＶＥＭレベルを決定することを含み、ＨＶＥＭの陽性発現が、前記対象が請求項２７～４０のいずれか一項に記載の治療の方法に適していることを示す、方法。
42. ＨＶＥＭの陽性発現が、健康な試料または所定の閾値と比較して上昇したＨＶＥＭレベルを含む、請求項４１に記載の方法。
43. 試料中のＨＶＥＭを検出する方法であって、前記試料を、請求項１～２１のいずれか一項に記載の薬剤、または請求項２２～２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ、それによってＨＶＥＭを検出することを含む、方法。
44. 請求項２６に記載の薬学的組成物と、
    ａ．抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法、
    ｂ．本発明の薬学的組成物が抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースの免疫療法で使用するためのラベルであることを示す、ラベル、および
    ｃ．請求項１～２１のいずれか一項に記載の前記少なくとも１つの薬剤、または請求項２２～２５のいずれか一項に記載の前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片を検出するための二次検出分子のうちの少なくとも１つとを含む、キット。
    
    

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