CN108264566A - 一种融合抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用 - Google Patents

一种融合抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用。本发明将能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域融合于同一蛋白肽链形成双功能分子，采用真核细胞表达系统生产，表达产物结构单一，纯化工艺简便，蛋白产量高，制备工艺及产品稳定；与抗CD3和抗T细胞正共刺激分子全长抗体联用相比，所述双功能分子对T细胞的体外扩增效果更优，蛋白用量更少，且使用简便，可通过溶液形式直接添加，无需优化两种全长抗体的相对比例。

Description

一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特 异性分子及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用。
背景技术
T淋巴细胞(T lymphocyte)来源于胸腺(Thymus)，故称T细胞。成熟T细胞存在于外周免疫器官的胸腺依赖区，在适应性细胞免疫应答中占据核心地位，同时在胸腺依赖性抗原诱导的体液免疫应答中亦发挥重要的辅助作用。根据功能的不同，T细胞可分为细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)、辅助T细胞(Helper T cell,Th)和调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)。其中CTL表达CD8，是适应性细胞免疫的主要效应细胞，其主要功能是特异性识别靶细胞表面的内源性抗原肽/MHC I类分子复合物，自身活化后可分泌穿孔素(Peforin)、颗粒酶(Granzyme)、颗粒溶素(Granulysin)等物质直接杀伤靶细胞(肿瘤细胞或寄生病原体感染的细胞)，也可通过Fas/FasL信号途径诱导靶细胞凋亡；而Th均表达CD4，通过分泌不同种类的细胞因子以及与其它细胞之间直接的相互作用，调节CTL的细胞活性，间接参与细胞免疫；此外，Treg可通过直接接触抑制靶细胞活化以及分泌IL-10、TGFβ等细胞因子对细胞免疫应答进行负调控，在免疫耐受、自身免疫病、感染性疾病及肿瘤等多种疾病中发挥重要的作用。
CD8阳性T细胞的完全活化与高效扩增是其有效杀伤靶细胞的基础，依赖于双信号传递途径的作用：其中抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)表面的MHC I/内源性抗原肽复合物特异性识别T细胞表达的TCR/CD3复合物，导致CD3与共受体CD8的胞质段相互作用，激活与胞质段尾部相连的蛋白质酪氨酸激酶，使CD3胞质区免疫受体酪氨酸激酶激活模体(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)中的酪氨酸磷酸化，启动信号传导分子级联反应，激活转录因子，使得T细胞初步活化，这是T细胞活化的第一信号；同时，T细胞表面的共刺激分子(Co-stimulatory molecule，例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40、GITR、CD27、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA等)可与APC细胞表面的共刺激分子配体(例如CD80、CD86、4-1BBL、B7RP-1、OX40L、GITRL、CD70、PD-L1、PD-L2、HVEM等)相互作用，产生T细胞活化的第二信号(共刺激信号)：其中CD28、4-1BB、ICOS、OX40、GITR和CD27等属于正共刺激分子，与相应配体(CD80、CD86、4-1BBL、B7RP-1、OX40L、GITRL、CD70等)相互作用所产生的第二信号(正共刺激信号)可导致T细胞的完全活化；而CTLA-4，PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA等属于负共刺激分子，与相应配体(CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、Galectin-9、HVEM等)相互作用所产生的第二信号(负共刺激信号)主要是下调和终止T细胞的活化。
目前针对T细胞活化的第一信号途径，已见报道通过基因工程设计并构建了一系列的抗CD3单克隆全长抗体(Beverley PC等人,Eur J Immunol,11:329-334,1981；Lanzavecchia A等人,Eur J Immunol,17:105-111,1987；Yannelli JR等人,J ImmunolMethods,130:91-100,1990)。已有的实验数据表明，该类单克隆抗体能够特异性识别T细胞表面的CD3分子，产生T细胞活化的第一信号。然而，仅有第一信号传递途径非但不能有效激活T细胞，反而会导致T细胞失能甚至产生激活诱导的T细胞死亡(Activation inducedcell death，AICD)。为了克服CD3单克隆全长抗体的这一缺点，人们设计并构建了抗CD28、抗4-1BB以及抗ICOS等正共刺激分子的激活型单克隆全长抗体(US Patent20100168400A1；US patent20100183621A1；US patent 009193789B2)，通过与抗CD3全长抗体联合使用，可以为T细胞提供完整的双信号活化途径。然而，两种单克隆全长抗体联合使用的方式在具体应用上仍存在一些不足，如明显增加了重组抗体表达与纯化的工作量与生产成本，实际应用于T细胞体外活化与扩增时必须优化两种全长抗体的相对比例。此外，两个全长抗体联合使用时，为促进受体细胞活化，需要添加较高浓度的抗体溶液或将抗体包被到培养板或微球上以增强其对受体细胞的活化效果。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种双功能分子，其结构中包括能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和能够结合并激活T细胞正共刺激分子的第二功能域。
优选地，所述双功能分子能够同时结合并激活T细胞表面CD3分子和T细胞正共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。
优选地，所述第一功能域为抗CD3的抗体，所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。
优选地，所述抗体为小分子抗体。
优选地，所述抗体选自Fab抗体、Fv抗体或单链抗体(scFv)。
优选地，所述第一功能域和所述第二功能域通过连接片段连接。所述连接片段的氨基酸数量可为≥2个。
优选地，所述连接片段选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。
所述G4S具体为GGGGS。所述以G4S为单位的连接片段包括一个或多个G4S单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的G4S单位。本发明的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段连接，所述连接片段含有三个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段可以为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。本发明的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过免疫球蛋白IgD的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述连接片段可通过二硫键相互连接形成二聚体。
优选地，所述第一功能域的C末端与所述第二结构域的N末端连接。
优选地，所述第一功能域为抗CD3的单链抗体，所述抗CD3的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
优选地，所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。
本发明一些实施例中，列举了所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.35所示。
优选地，所述T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域选自4-1BBL胞外区结构域、B7RP-1胞外区结构域、OX40L胞外区结构域、GITRL胞外区结构域或CD70胞外区结构域之任一。
优选地，所述4-1BBL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示。
优选地，所述B7RP-1胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
优选地，所述OX40L胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
优选地，所述GITRL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
优选地，所述CD70胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
本发明一些实施例中，还列举了单体形式的双功能分子的氨基酸序列如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.31之任一所示。二聚体形式的双功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.29或SEQ ID NO.33之任一所示。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码前述双功能分子。
本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。
本发明的第五方面，提供一种制备前述双功能分子的方法，包括：构建含有双功能分子基因序列的表达载体，然后将含双功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的双功能分子。
本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
本发明的第六方面，提供前述双功能分子用于制备T细胞体外扩增剂的用途。
本发明的第七方面，提供一种T细胞体外扩增剂，含有前述双功能分子。
本发明的第八方面，公开了一种体外扩增T细胞的方法，包括将前述双功能分子作用于T细胞。所述方法可以是非治疗目的的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述的双功能分子将能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和T细胞正共刺激分子的配体胞外结构域融合于同一蛋白肽链形成双功能分子，采用真核细胞表达系统生产，表达产物结构单一，纯化工艺简便，蛋白产量高，制备工艺及产品稳定；而抗CD3单克隆全长抗体与抗T细胞正共刺激分子单克隆全长抗体如果联合使用，两个抗体需分别表达纯化，制备工艺更复杂，工作量和生产成本显著增加。
(2)本发明所述的双功能分子为单一蛋白，相对于抗CD3全长抗体与抗T细胞正共刺激分子全长抗体联合使用，对T细胞的体外活化与扩增效果更优，蛋白用量更少，且使用简便，可通过溶液形式直接添加，无需优化两种全长抗体的相对比例。
附图说明
图1：A.单体形式的抗CD3/T细胞正共刺激分子配体BsM的结构图；B.二聚体形式的抗CD3/T细胞正共刺激分子配体BsM的结构图。
图2：A.纯化的CD3-4-1BBL BsM_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-4-1BBL BsM_M；泳道3：非还原性CD3-4-1BBL BsM_M；B.纯化的CD3-4-1BBLBsM_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-4-1BBL BsM_D；泳道3：非还原性CD3-4-1BBL BsM_D。
图3A：CD3-4-1BBL BsM_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc，●包被1μg/ml重组蛋白4-1BB-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图3B：CD3-4-1BBL BsM_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc；●包被1μg/ml重组蛋白4-1BB-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图4：CIK细胞扩增倍数曲线，以外周血PBMC为实验细胞，分别添加CD3-4-1BBLBsM_M、CD3-4-1BBL BsM_D或抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用(Anti-CD3/Anti-CD28)，总计培养30天，以每次计数的细胞数量除以第1天的细胞数量，计数比较细胞扩增倍数，其中对照组：5ug/ml Anti-CD3和5ug/ml Anti-CD28包被细胞培养板；实验组1：溶液状态下添加10ng/ml CD3-4-1BBL BsM_M；实验组2：溶液状态下添加10ng/ml CD3-4-1BBLBsM_D。
图5：A.纯化的CD3-B7RP-1BsM_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-B7RP-1BsM_M；泳道3：非还原性CD3-B7RP-1BsM_M；B.纯化的CD3-B7RP-1BsM_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-B7RP-1BsM_D；泳道3：非还原性CD3-B7RP-1BsM_D。
图6A：CD3-B7RP-1BsM_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc，●包被1μg/ml重组蛋白ICOS-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图6B：CD3-B7RP-1BsM_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc；●包被1μg/ml重组蛋白ICOS-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图7：CIK细胞扩增倍数曲线，以外周血PBMC为实验细胞，分别添加CD3-B7RP-1BsM_M、CD3-B7RP-1BsM_D或抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用(Anti-CD3/Anti-CD28)，总计培养30天，以每次计数的细胞数量除以第1天的细胞数量，计数比较细胞扩增倍数，其中对照组：5ug/ml Anti-CD3和5ug/ml Anti-CD28包被细胞培养板；实验组1：溶液状态下添加10ng/ml CD3-B7RP-1BsM_M；实验组2：溶液状态下添加10ng/ml CD3-B7RP-1BsM_D。
图8：A.纯化的CD3-OX40L BsM_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-OX40L BsM_M；泳道3：非还原性CD3-OX40L BsM_M；B.纯化的CD3-OX40LBsM_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-OX40L BsM_D；泳道3：非还原性CD3-OX40L BsM_D。
图9A：CD3-OX40L BsM_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc，●包被1μg/ml重组蛋白OX40-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图9B：CD3-OX40L BsM_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc；●包被1μg/ml重组蛋白OX40-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图10：CIK细胞扩增倍数曲线，以外周血PBMC为实验细胞，分别添加CD3-OX40LBsM_M、CD3-OX40L BsM_D或抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用(Anti-CD3/Anti-CD28)，总计培养30天，以每次计数的细胞数量除以第1天的细胞数量，计数比较细胞扩增倍数，其中对照组：5ug/ml Anti-CD3和5ug/ml Anti-CD28包被细胞培养板；实验组1：溶液状态下添加10ng/ml CD3-OX40L BsM_M；实验组2：溶液状态下添加10ng/ml CD3-OX40L BsM_D。
图11：A.纯化的CD3-GITRL BsM_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-GITRL BsM_M；泳道3：非还原性CD3-GITRL BsM_M；B.纯化的CD3-GITRLBsM_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-GITRL BsM_D；泳道3：非还原性CD3-GITRL BsM_D。
图12A：CD3-GITRL BsM_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc，●包被1μg/ml重组蛋白GITR-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图12B：CD3-GITRL BsM_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc；●包被1μg/ml重组蛋白GITR-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图13：CIK细胞扩增倍数曲线，以外周血PBMC为实验细胞，分别添加CD3-GITRLBsM_M、CD3-GITRL BsM_D或抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用(Anti-CD3/Anti-CD28)，总计培养30天，以每次计数的细胞数量除以第1天的细胞数量，计数比较细胞扩增倍数。其中，对照组：5ug/ml Anti-CD3和5ug/ml Anti-CD28包板；实验组1：溶液状态下添加10ng/ml CD3-GITRL BsM_M；实验组2：溶液状态下添加10ng/ml CD3-GITRL BsM_D。
图14：A.纯化的CD3-CD70BsM_M SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-CD70BsM_M；泳道3：非还原性CD3-CD70BsM_M；B.纯化的CD3-CD70BsM_D SDS-PAGE分析图，泳道1：分子量蛋白Marker；泳道2：还原性CD3-CD70BsM_D；泳道3：非还原性CD3-CD70BsM_D。
图15A：CD3-CD70BsM_M的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc，●包被1μg/ml重组蛋白CD27-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图15B：CD3-CD70BsM_D的ELISA鉴定结果，图中的曲线分别代表三种检测结果：■包被1μg/ml重组蛋白CD3-hFc；●包被1μg/ml重组蛋白CD27-hFc；不包被任何蛋白的测定结果。
图16：CIK细胞扩增倍数曲线，以外周血PBMC为实验细胞，分别添加CD3-CD70BsM_M、CD3-CD70BsM_D或抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用(Anti-CD3/Anti-CD28)，总计培养30天，以每次计数的细胞数量除以第1天的细胞数量，计数比较细胞扩增倍数。其中，对照组：5ug/ml Anti-CD3和5ug/ml Anti-CD28包板；实验组1：溶液状态下添加10ng/ml CD3-CD70BsM_M；实验组2：溶液状态下添加10ng/ml CD3-CD70BsM_D。
具体实施方式
一、术语和缩略语：
BsM：双特异性分子(Bi-specific Molecule)
Fab：抗原结合片段(Fragement of antigen binding)
Fv：可变区片段(Variable fragment)
scFv：单链可变区片段(Single-chain variable fragment)，又称为单链抗体
VH：重链可变区(Heavy chain variable region)
VL：轻链可变区(Light chain variable region)
Linker：连接片段
Extracellular domain：胞外区
Co-stimulatory molecule：共刺激分子
4-1BBL：T细胞正共刺激分子4-1BB的配体
B7RP-1：T细胞正共刺激分子ICOS的配体
OX4OL：T细胞正共刺激分子OX40的配体
GITRL：T细胞正共刺激分子GITR的配体
CD70：T细胞正共刺激分子CD27的配体
CD3-4-1BBL BsM_M:单体形式的抗CD3/4-1BBL双特异性分子
CD3-4-1BBL BsM_D:二聚体形式的抗CD3/4-1BBL双特异性分子
CD3-B7RP-1BsM_M:单体形式的抗CD3/B7RP-1双特异性分子
CD3-B7RP-1BsM_D:二聚体形式的抗CD3/B7RP-1双特异性分子
CD3-OX40L BsM_M:单体形式的抗CD3/OX40L双特异性分子
CD3-OX40L BsM_D:二聚体形式的抗CD3/OX40L双特异性分子
CD3-GITRL BsM_M:单体形式的抗CD3/GITRL双特异性分子
CD3-GITRL BsM_D:二聚体形式的抗CD3/GITRL双特异性分子
CD3-CD70BsM_M:单体形式的抗CD3/CD70双特异性分子
CD3-CD70BsM_D:二聚体形式的抗CD3/CD70双特异性分子
二、双功能分子
本发明所述的双功能分子，其结构中包括能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和能够结合并激活T细胞正共刺激分子的第二功能域。
进一步地，所述双功能分子能够同时结合并激活T细胞表面CD3分子和T细胞正共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。
本发明对于第一功能域和第二功能域并无特殊限制，只要能够同时结合并激活T细胞表面CD3分子和T细胞正共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号即可。例如，所述第一功能域可以是抗CD3的抗体，所述第二功能域可以是T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。所述抗体可以是任意形式。但无论是何种形式的抗体，其抗原结合部位均含有重链可变区和轻链可变区。所述抗体优选地可以是小分子抗体。所述小分子抗体是分子量较小的抗体片段，其抗原结合部位包括重链可变区和轻链可变区。所述小分子抗体的分子量虽小但保持了亲本单抗的亲和力，具有亲本单抗一样的特异性。所述小分子抗体的种类主要包括Fab抗体、Fv抗体、单链抗体(scFv)等。Fab抗体由完整的轻链(可变区VL和恒定区CL)和重链Fd段(可变区VH和第一恒定区CH1)通过二硫键连接形成。Fv抗体仅由轻链和重链的可变区通过非共价键连接，是抗体分子保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体(scFv)是重链可变区和轻链可变区通过连接片段连接而成的单一蛋白肽链分子。
所述第一功能域和所述第二功能域通过连接片段连接。本发明对于连接顺序没有特殊要求，只要不限制本发明的目的即可。例如，所述第一功能域的C末端可以与所述第二结构域的N末端连接。所述连接片段的氨基酸数量优选≥2个。本发明对于连接片段也没有特殊的限制，只要是不限制本发明的目的即可。
进一步地，所述连接片段选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。
所述G4S具体为GGGGS。所述以G4S为单位的连接片段包括一个或多个G4S单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的G4S单位。本发明的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段连接，所述连接片段含有三个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段可以为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。本发明的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过免疫球蛋白IgD的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述连接片段可通过二硫键相互连接形成二聚体。
在本发明的较佳实施例中，所述双功能分子的结构示意图如图1所示。所述双功能分子可以是单体形式也可以是二聚体形式。本发明的单体形式的双功能分子的结构示意图如图1中A所示，所述双功能分子的结构中含有一个与CD3抗原结合的第一功能域和一个与任一T细胞正共刺激分子结合的T细胞正共刺激分子配体胞外区结构域。本发明的二聚体形式的双功能分子的结构示意图如图1中B所示，所述双功能分子的结构中含有两个与CD3抗原结合的第一功能域和两个与任一T细胞正共刺激分子结合的T细胞正共刺激分子配体胞外区结构域。本发明的二聚体形式的双功能分子的抗原结合效价是单体形式的二倍以上，体外扩增T细胞的效果更优。
进一步地，所述T细胞正共刺激分子可以是人类4-1BB(UniProt ID：Q07011)，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其配体为人类4-1BBL(UniProt ID：P41273)，氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
SEQ ID NO.5：
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
SEQ ID NO.6：
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE。
所述T细胞正共刺激分子可以是人类ICOS(UniProt ID：Q9Y6W8)，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其配体为人类B7RP-1(UniProt ID：O75144)，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
SEQ ID NO.7：
EINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL。
SEQ ID NO.8：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAATWSILAVLCLLVVVAVAIGWVCRDRCLQHSYAGAWAVSPETELTGHV。
所述T细胞正共刺激分子可以是人类OX40(UniProt ID：P43489)，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其配体为人类OX40L(UniProt ID：P23510)，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
SEQ ID NO.9：
LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI。
SEQ ID NO.10：
MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL。
所述T细胞正共刺激分子可以是人类GITR(UniProt ID：Q9Y5U5)，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其配体为人类GITRL(UniProt ID：Q9UNG2)，氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。
SEQ ID NO.11：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV。
SEQ ID NO.12：
MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS。
所述T细胞正共刺激分子可以是人类CD27(UniProt ID：P26842)，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，其配体为人类CD70(UniProt ID：P32970)，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
SEQ ID NO.13：
ATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP。
SEQ ID NO.14：
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP。
具体地，所述第一功能域为抗CD3的单链抗体。所述抗CD3的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。进一步地，所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。
所述T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域可以是4-1BBL胞外区结构域、B7RP-1胞外区结构域、OX40L胞外区结构域、GITRL胞外区结构域或CD70胞外区结构域。
所述4-1BBL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示。
所述B7RP-1胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
所述OX40L胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
所述GITRL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。
所述CD70胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
在本案的较佳案例中，单体形式的双功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、SEQID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.31之任一所示。二聚体形式的双功能分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.29或SEQ IDNO.33之任一所示。但不限于本发明较佳案例中所列举的具体形式。
三、编码双功能分子的多核苷酸
本发明的编码所述双功能分子的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本发明的编码所述双功能分子的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸PCR法。
在本发明的较佳实施例中，编码所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。编码所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.45所示。编码所述抗CD3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。
编码所述4-1BBL胞外区结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示。
编码所述B7RP-1胞外区结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示。
编码所述OX40L胞外区结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。
编码所述GITRL胞外区结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示。
编码所述CD70胞外区结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示。
编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，编码单体形式的双功能分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.32之任一所示。编码二聚体形式的双功能分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.30或SEQID NO.34之任一所示。
四、表达载体
本发明的所述表达载体含有编码所述双功能分子的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
五、制备双功能分子的方法
本发明的制备前述双功能分子的方法，包括：构建含有双功能分子基因序列的表达载体，然后将含双功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的双功能分子。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
六、双功能分子的用途
本发明的双功能分子可用于制备T细胞体外扩增剂。本发明较佳实施例中，通过试验证明单体和二聚体形式的双功能分子均具有与CD3重组抗原和相应正共刺激分子重组蛋白的体外结合活性，可应用于T细胞体外活化与扩增，其中二聚体较单体具有更好的效果。
七、体外扩增T细胞的方法
本发明的体外扩增T细胞的方法，包括将前述双功能分子作用于T细胞。所述方法可以是非治疗目的的。本发明较佳实施例中，通过试验证明单体和二聚体形式的双功能分子均具有与CD3重组抗原和相应正共刺激分子重组蛋白的体外结合活性，可应用于T细胞体外活化与扩增，其中二聚体较单体具有更好的效果。
本发明针对抗CD3和抗T细胞正共刺激分子全长抗体联合应用的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法构建能够同时识别并激活CD3和任何一个T细胞正共刺激分子的双功能分子，该双功能分子不仅具有上述双抗体联合使用的特性，同时在制备工艺和实际应用方面具有明显的优势，以溶液形式添加时能够达到甚至优于两个抗体联合添加或包被培养板的效果，大大提高了体外活化与扩增T细胞的功效，增加了使用的方便性。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1：CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D真核表达载体的构建
在本发明中，融合抗T细胞表面人类CD3蛋白scFv结构域和T细胞正共刺激分子配体4-1BBL胞外区结构域的双特异性分子被命名为CD3-4-1BBL BsM。
一、CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D构建方案设计
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M具体构建方案为：抗CD3scFv和4-1BBL胞外区序列之间通过(GGGGS)3Linker相连。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D具体构建方案为：抗CD3scFv和4-1BBL胞外区序列之间通过IgD铰链区作为Linker相连。
为使双特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD3scFv，4-1BBL胞外区及连接片段(Linker)的序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD3scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGC。
具体地，抗CD3scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，具体为：
GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG。
具体地，抗CD3scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG。
具体地，4-1BBL胞外区的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，具体为：
GCCTGCCCCTGGGCCGTGAGCGGCGCCCGCGCCAGCCCCGGCAGCGCCGCCAGCCCCCGCCTGCGCGAGGGCCCCGAGCTGAGCCCCGACGACCCCGCCGGCCTGCTGGACCTGCGCCAGGGCATGTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGACGGCCCCCTGAGCTGGTACAGCGACCCCGGCCTGGCCGGCGTGAGCCTGACCGGCGGCCTGAGCTACAAGGAGGACACCAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTCCAGCTGGAGCTGCGCCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCAGCGGCAGCGTGAGCCTGGCCCTGCACCTGCAGCCCCTGCGCAGCGCCGCCGGCGCCGCCGCCCTGGCCCTGACCGTGGACCTGCCCCCCGCCAGCAGCGAGGCCCGCAACAGCGCCTTCGGCTTCCAGGGCCGCCTGCTGCACCTGAGCGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTGCACCTGCACACCGAGGCCCGCGCCCGCCACGCCTGGCAGCTGACCCAGGGCGCCACCGTGCTGGGCCTGTTCCGCGTGACCCCCGAGATCCCCGCCGGCCTGCCCAGCCCCCGCAGCGAG。
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
GCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTG。
为使双特异性分子在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示，具体为：
MTRLTVLALLAGLLASSRA。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示，具体为：
ATGACCCGCCTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCCGGCCTGCTGGCCAGCAGCCGCGCC。
二、CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D真核表达载体构建
本发明双特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的双特异性分子，分别设计了如表1所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD3-4-1BBL BsM_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-4-1BBL-F和pcDNA3.1-4-1BBL-R扩增出抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker、4-1BBL胞外区的基因序列；针对CD3-4-1BBL BsM_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-4-1BBL-F和pcDNA3.1-4-1BBL-R扩增出抗CD3scFv、IgD铰链区、4-1BBL胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式双特异性分子全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上。目的载体转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M和二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGCCTGCCCCTGGGCCGTGAGCGGCGCCCGCGCCAGCCCCGGCAGCGCCGCCAGCCCCCGCCTGCGCGAGGGCCCCGAGCTGAGCCCCGACGACCCCGCCGGCCTGCTGGACCTGCGCCAGGGCATGTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGACGGCCCCCTGAGCTGGTACAGCGACCCCGGCCTGGCCGGCGTGAGCCTGACCGGCGGCCTGAGCTACAAGGAGGACACCAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTCCAGCTGGAGCTGCGCCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCAGCGGCAGCGTGAGCCTGGCCCTGCACCTGCAGCCCCTGCGCAGCGCCGCCGGCGCCGCCGCCCTGGCCCTGACCGTGGACCTGCCCCCCGCCAGCAGCGAGGCCCGCAACAGCGCCTTCGGCTTCCAGGGCCGCCTGCTGCACCTGAGCGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTGCACCTGCACACCGAGGCCCGCGCCCGCCACGCCTGGCAGCTGACCCAGGGCGCCACCGTGCTGGGCCTGTTCCGCGTGACCCCCGAGATCCCCGCCGGCCTGCCCAGCCCCCGCAGCGAG。
具体地，二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGGCCTGCCCCTGGGCCGTGAGCGGCGCCCGCGCCAGCCCCGGCAGCGCCGCCAGCCCCCGCCTGCGCGAGGGCCCCGAGCTGAGCCCCGACGACCCCGCCGGCCTGCTGGACCTGCGCCAGGGCATGTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGACGGCCCCCTGAGCTGGTACAGCGACCCCGGCCTGGCCGGCGTGAGCCTGACCGGCGGCCTGAGCTACAAGGAGGACACCAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTCCAGCTGGAGCTGCGCCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCAGCGGCAGCGTGAGCCTGGCCCTGCACCTGCAGCCCCTGCGCAGCGCCGCCGGCGCCGCCGCCCTGGCCCTGACCGTGGACCTGCCCCCCGCCAGCAGCGAGGCCCGCAACAGCGCCTTCGGCTTCCAGGGCCGCCTGCTGCACCTGAGCGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTGCACCTGCACACCGAGGCCCGCGCCCGCCACGCCTGGCAGCTGACCCAGGGCGCCACCGTGCTGGGCCTGTTCCGCGTGACCCCCGAGATCCCCGCCGGCCTGCCCAGCCCCCGCAGCGAG。
表1.CD3-4-1BBL双特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例2：CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D的表达与纯化
一、CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例1中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTMMAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图2所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D重组蛋白的纯度均>95％；其中CD3-4-1BBL BsM_M重组蛋白的理论分子量为48.8kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该双特异性分子为单体形式(图2A)；CD3-4-1BBL BsM_D重组蛋白的理论分子量为56.6kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(图2B)，说明两个蛋白分子可通过二硫键相互连接，因此该双特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD3-4-1BBL BsM_M为单体形式，CD3-4-1BBL BsM_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE。
抗CD3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。
抗CD3scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS。
抗CD3scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，具体为：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。
4-1BBL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，具体为：
ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE。
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
GGGGSGGGGSGGGGS。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
ASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGV。
实施例3：ELISA检测CD3-4-1BBL BsM_M和CD3-4-1BBL BsM_D的CD3抗原及正共刺激分子4-1BB结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类CD3-hFc与人类4-1BB-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24g NaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔，37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的双特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD3-4-1BBL BsM_M或CD3-4-1BBL BsM_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值。
ELISA结果如图3A和图3B所示：图3A说明CD3-4-1BBL BsM_M与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子4-1BB-hFc均具有体外结合活性，其中4-1BB结合活性较CD3结合活性更高；图3B说明CD3-4-1BBL BsM_D与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子4-1BB-hFc同样具有体外结合活性，其中4-1BB结合活性更高。
实施例4：CD3-4-1BBL双特异性分子介导的CIK(Cytokine induced killer)细胞增殖
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的双特异性分子CD3-4-1BBL BsM_M、二聚体形式的双特异性分子CD3-4-1BBL BsM_D、以及抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联用(Anti-CD3/Anti-CD28)分别作用于同一供体来源的人血PBMC，细胞培养后进行计数，比较扩增倍数。
1.PBMC的分离：取抗凝血，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，分别设计以下3个实验组：对照组(Anti-CD3 5ug/ml和Anti-CD285ug/ml包被细胞培养板)；实验组1(溶液状态下添加双特异性分子CD3-4-1BBL BsM_M10ng/ml)；实验组2(溶液状态下添加双特异性分子CD3-4-1BBL BsM_D 10ng/ml)。此外，3组实验细胞同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2-3天计数并用添加500U/ml IL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代。照此方法培养30天，最终统计细胞的扩增倍数，绘制生长曲线；
检测结果如图4所示，单体和二聚体形式的CD3-4-1BBL双特异性分子单一使用对CIK细胞的增殖效果均优于抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用，培养18天后，Anti-CD3/Anti-CD28联用出现大量细胞死亡，细胞扩增倍数显著下降；而添加单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M或二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D均未出现细胞死亡，只是细胞扩增速度相对放缓。因此本发明制备的两种形式的CD3-4-1BBL双特异性分子均可有效扩增和延长CIK细胞的生存期，其中二聚体形式效果更好。
实施例5：CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D真核表达载体的构建
在本发明中，融合抗T细胞表面人类CD3蛋白scFv结构域和T细胞正共刺激分子配体B7RP-1胞外区结构域的双特异性分子被命名为CD3-B7RP-1BsM。
一、CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D构建方案设计
单体形式的CD3-B7RP-1BsM_M具体构建方案为：抗CD3scFv和B7RP-1胞外区序列之间通过(GGGGS)3Linker相连。
二聚体形式的CD3-B7RP-1BsM_D具体构建方案为：抗CD3scFv和B7RP-1胞外区序列之间通过IgD铰链区作为Linker相连。
为使双特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD3scFv，B7RP-1胞外区及连接片段(Linker)的序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD3scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
具体地，抗CD3scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
具体地，抗CD3scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。
具体地，B7RP-1胞外区的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示，具体为：
GACACCCAGGAGAAGGAGGTGCGCGCCATGGTGGGCAGCGACGTGGAGCTGAGCTGCGCCTGCCCCGAGGGCAGCCGCTTCGACCTGAACGACGTGTACGTGTACTGGCAGACCAGCGAGAGCAAGACCGTGGTGACCTACCACATCCCCCAGAACAGCAGCCTGGAGAACGTGGACAGCCGCTACCGCAACCGCGCCCTGATGAGCCCCGCCGGCATGCTGCGCGGCGACTTCAGCCTGCGCCTGTTCAACGTGACCCCCCAGGACGAGCAGAAGTTCCACTGCCTGGTGCTGAGCCAGAGCCTGGGCTTCCAGGAGGTGCTGAGCGTGGAGGTGACCCTGCACGTGGCCGCCAACTTCAGCGTGCCCGTGGTGAGCGCCCCCCACAGCCCCAGCCAGGACGAGCTGACCTTCACCTGCACCAGCATCAACGGCTACCCCCGCCCCAACGTGTACTGGATCAACAAGACCGACAACAGCCTGCTGGACCAGGCCCTGCAGAACGACACCGTGTTCCTGAACATGCGCGGCCTGTACGACGTGGTGAGCGTGCTGCGCATCGCCCGCACCCCCAGCGTGAACATCGGCTGCTGCATCGAGAACGTGCTGCTGCAGCAGAACCTGACCGTGGGCAGCCAGACCGGCAACGACATCGGCGAGCGCGACAAGATCACCGAGAACCCCGTGAGCACCGGCGAGAAGAACGCCGCCACC。
单体形式的CD3-B7RP-1BsM_M连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
二聚体形式的CD3-B7RP-1BsM_D连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为使双特异性分子在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示。
二、CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D真核表达载体构建
本发明双特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的双特异性分子，分别设计了如表2所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD3-B7RP-1BsM_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-B7RP-1-F和pcDNA3.1-B7RP-1-R扩增出抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker、B7RP-1胞外区的基因序列；针对CD3-B7RP-1BsM_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-B7RP-1-F和pcDNA3.1-B7RP-1-R扩增出抗CD3scFv、IgD铰链区、B7RP-1胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式双特异性分子全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上。目的载体转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD3-B7RP-1BsM_M和二聚体形式的CD3-B7RP-1BsM_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD3-B7RP-1BsM_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACACCCAGGAGAAGGAGGTGCGCGCCATGGTGGGCAGCGACGTGGAGCTGAGCTGCGCCTGCCCCGAGGGCAGCCGCTTCGACCTGAACGACGTGTACGTGTACTGGCAGACCAGCGAGAGCAAGACCGTGGTGACCTACCACATCCCCCAGAACAGCAGCCTGGAGAACGTGGACAGCCGCTACCGCAACCGCGCCCTGATGAGCCCCGCCGGCATGCTGCGCGGCGACTTCAGCCTGCGCCTGTTCAACGTGACCCCCCAGGACGAGCAGAAGTTCCACTGCCTGGTGCTGAGCCAGAGCCTGGGCTTCCAGGAGGTGCTGAGCGTGGAGGTGACCCTGCACGTGGCCGCCAACTTCAGCGTGCCCGTGGTGAGCGCCCCCCACAGCCCCAGCCAGGACGAGCTGACCTTCACCTGCACCAGCATCAACGGCTACCCCCGCCCCAACGTGTACTGGATCAACAAGACCGACAACAGCCTGCTGGACCAGGCCCTGCAGAACGACACCGTGTTCCTGAACATGCGCGGCCTGTACGACGTGGTGAGCGTGCTGCGCATCGCCCGCACCCCCAGCGTGAACATCGGCTGCTGCATCGAGAACGTGCTGCTGCAGCAGAACCTGACCGTGGGCAGCCAGACCGGCAACGACATCGGCGAGCGCGACAAGATCACCGAGAACCCCGTGAGCACCGGCGAGAAGAACGCCGCCACC。
具体地，二聚体形式的CD3-B7RP-1BsM_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGGACACCCAGGAGAAGGAGGTGCGCGCCATGGTGGGCAGCGACGTGGAGCTGAGCTGCGCCTGCCCCGAGGGCAGCCGCTTCGACCTGAACGACGTGTACGTGTACTGGCAGACCAGCGAGAGCAAGACCGTGGTGACCTACCACATCCCCCAGAACAGCAGCCTGGAGAACGTGGACAGCCGCTACCGCAACCGCGCCCTGATGAGCCCCGCCGGCATGCTGCGCGGCGACTTCAGCCTGCGCCTGTTCAACGTGACCCCCCAGGACGAGCAGAAGTTCCACTGCCTGGTGCTGAGCCAGAGCCTGGGCTTCCAGGAGGTGCTGAGCGTGGAGGTGACCCTGCACGTGGCCGCCAACTTCAGCGTGCCCGTGGTGAGCGCCCCCCACAGCCCCAGCCAGGACGAGCTGACCTTCACCTGCACCAGCATCAACGGCTACCCCCGCCCCAACGTGTACTGGATCAACAAGACCGACAACAGCCTGCTGGACCAGGCCCTGCAGAACGACACCGTGTTCCTGAACATGCGCGGCCTGTACGACGTGGTGAGCGTGCTGCGCATCGCCCGCACCCCCAGCGTGAACATCGGCTGCTGCATCGAGAACGTGCTGCTGCAGCAGAACCTGACCGTGGGCAGCCAGACCGGCAACGACATCGGCGAGCGCGACAAGATCACCGAGAACCCCGTGAGCACCGGCGAGAAGAACGCCGCCACC。
表2.CD3-B7RP-1双特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例6：CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D的表达与纯化
一、CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例5中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTMMAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图5所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D重组蛋白的纯度均>95％；其中CD3-B7RP-1BsM_M重组蛋白的理论分子量为53.7kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于B7RP-1胞外区结构域存在翻译后N-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该双特异性分子为糖基化的单体形式(图5A)；CD3-B7RP-1BsM_D重组蛋白的理论分子量为61.6kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图5B)，说明两个蛋白分子可通过二硫键相互连接，因此该双特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD3-B7RP-1BsM_M为单体形式，CD3-B7RP-1BsM_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD3-B7RP-1BsM_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSDTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAAT。
二聚体形式的CD3-B7RP-1BsM_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVDTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAAT。
抗CD3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
抗CD3scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。
抗CD3scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。
B7RP-1胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，具体为：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAAT。
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例7：ELISA检测CD3-B7RP-1BsM_M和CD3-B7RP-1BsM_D的CD3抗原及正共刺激分子ICOS结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类CD3-hFc与人类ICOS-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24g NaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔，37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的双特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD3-B7RP-1BsM_M或CD3-B7RP-1BsM_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值。
ELISA结果如图6A和图6B所示：图6A说明CD3-B7RP-1BsM_M与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子ICOS-hFc均具有体外结合活性，其中CD3结合活性较ICOS结合活性更高；图6B说明CD3-B7RP-1BsM_D与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子ICOS-hFc同样具有体外结合活性，其中CD3结合活性更高。
实施例8：CD3-B7RP-1双特异性分子介导的CIK(Cytokine induced killer)细胞增殖
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的双特异性分子CD3-B7RP-1BsM_M、二聚体形式的双特异性分子CD3-B7RP-1BsM_D、以及抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联用(Anti-CD3/Anti-CD28)分别作用于同一供体来源的人血PBMC，细胞培养后进行计数，比较扩增倍数。
1.PBMC的分离：取抗凝血，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，分别设计以下3个实验组：对照组(Anti-CD3 5ug/ml和Anti-CD285ug/ml包被细胞培养板)；实验组1(溶液状态下添加双特异性分子CD3-B7RP-1BsM_M10ng/ml)；实验组2(溶液状态下添加双特异性分子CD3-B7RP-1BsM_D 10ng/ml)。此外，3组实验细胞同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2-3天计数并用添加500U/ml IL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代。照此方法培养30天，最终统计细胞的扩增倍数，绘制生长曲线；
检测结果如图7所示，单体和二聚体形式的CD3-B7RP-1双特异性分子单一使用对CIK细胞的增殖效果均优于抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用，培养18天后，Anti-CD3/Anti-CD28联用出现大量细胞死亡，细胞扩增倍数显著下降；而添加单体形式的CD3-B7RP-1BsM_M或二聚体形式的CD3-B7RP-1BsM_D均未出现细胞死亡，只是细胞扩增速度相对放缓。因此本发明制备的两种形式的CD3-B7RP-1双特异性分子均可有效扩增和延长CIK细胞的生存期，其中二聚体形式效果更好。
实施例9：CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D真核表达载体的构建
在本发明中，融合抗T细胞表面人类CD3蛋白scFv结构域和T细胞正共刺激分子配体OX40L胞外区结构域的双特异性分子被命名为CD3-OX40L BsM。
一、CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D构建方案设计
单体形式的CD3-OX40L BsM_M具体构建方案为：抗CD3scFv和OX40L胞外区序列之间通过(GGGGS)3Linker相连。
二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D具体构建方案为：抗CD3scFv和OX40L胞外区序列之间通过IgD铰链区作为Linker相连。
为使双特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD3scFv，OX40L胞外区及连接片段(Linker)的序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD3scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
具体地，抗CD3scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
具体地，抗CD3scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。
具体地，OX40L胞外区的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示，具体为：
CAGGTGAGCCACCGCTACCCCCGCATCCAGAGCATCAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAGGAGAAGGGCTTCATCCTGACCAGCCAGAAGGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGATCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAGGTGAACATCAGCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAGCCCCTGTTCCAGCTGAAGAAGGTGCGCAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCGTGCTG。
单体形式的CD3-OX40L BsM_M连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为使双特异性分子在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示。
二、CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D真核表达载体构建
本发明双特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的双特异性分子，分别设计了如表3所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD3-OX40L BsM_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-OX40L-F和pcDNA3.1-OX40L-R扩增出抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker、OX40L胞外区的基因序列；针对CD3-OX40LBsM_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-OX40L-F和pcDNA3.1-OX40L-R扩增出抗CD3scFv、IgD铰链区、OX40L胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式双特异性分子全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上。目的载体转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD3-OX40L BsM_M和二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD3-OX40L BsM_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGAGCCACCGCTACCCCCGCATCCAGAGCATCAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAGGAGAAGGGCTTCATCCTGACCAGCCAGAAGGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGATCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAGGTGAACATCAGCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAGCCCCTGTTCCAGCTGAAGAAGGTGCGCAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCGTGCTG。
具体地，二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGGTGAGCCACCGCTACCCCCGCATCCAGAGCATCAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAGGAGAAGGGCTTCATCCTGACCAGCCAGAAGGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGATCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAGGTGAACATCAGCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAGCCCCTGTTCCAGCTGAAGAAGGTGCGCAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCGTGCTG。
表3.CD3-OX40L双特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例10：CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D的表达与纯化
一、CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例9中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTMMAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图8所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D重组蛋白的纯度均>95％；其中CD3-OX40L BsM_M重组蛋白的理论分子量为42.7kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于OX40L胞外区结构域存在翻译后N-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该双特异性分子为糖基化的单体形式(图8A)；CD3-OX40L BsM_D重组蛋白的理论分子量为50.6kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图8B)，说明两个蛋白分子可通过二硫键相互连接，因此该双特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD3-OX40L BsM_M为单体形式，CD3-OX40L BsM_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD3-OX40L BsM_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL。
二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL。
抗CD3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
抗CD3scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。
抗CD3scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。
OX40L胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，具体为：
QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL。
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。实施例11：ELISA检测CD3-OX40L BsM_M和CD3-OX40L BsM_D的CD3抗原及正共刺激分子OX40结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类CD3-hFc与人类OX40-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24g NaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔，37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的双特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD3-OX40L BsM_M或CD3-OX40L BsM_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值。
ELISA结果如图9A和图9B所示：图9A说明CD3-OX40L BsM_M与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子OX40-hFc均具有体外结合活性，其中OX40结合活性较CD3结合活性更高；图9B说明CD3-OX40L BsM_D与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子OX40-hFc同样具有体外结合活性，其中OX40结合活性更高。
实施例12：CD3-OX40L双特异性分子介导的CIK(Cytokine induced killer)细胞增殖
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的双特异性分子CD3-OX40L BsM_M、二聚体形式的双特异性分子CD3-OX40L BsM_D、以及抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联用(Anti-CD3/Anti-CD28)分别作用于同一供体来源的人血PBMC，细胞培养后进行计数，比较扩增倍数。
1.PBMC的分离：取抗凝血，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，分别设计以下3个实验组：对照组(Anti-CD3 5ug/ml和Anti-CD285ug/ml包被细胞培养板)；实验组1(溶液状态下添加双特异性分子CD3-OX40L BsM_M10ng/ml)；实验组2(溶液状态下添加双特异性分子CD3-OX40L BsM_D 10ng/ml)。此外，3组实验细胞同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2-3天计数并用添加500U/ml IL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代。照此方法培养30天，最终统计细胞的扩增倍数，绘制生长曲线；
检测结果如图10所示，单体和二聚体形式的CD3-OX40L双特异性分子单一使用对CIK细胞的增殖效果均优于抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用，培养18天后，Anti-CD3/Anti-CD28联用出现大量细胞死亡，细胞扩增倍数显著下降；而添加单体形式的CD3-OX40L BsM_M或二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D均未出现细胞死亡，只是细胞扩增速度相对放缓。因此本发明制备的两种形式的CD3-OX40L双特异性分子均可有效扩增和延长CIK细胞的生存期，其中二聚体形式效果更好。
实施例13：CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D真核表达载体的构建
在本发明中，融合抗T细胞表面人类CD3蛋白scFv结构域和T细胞正共刺激分子配体GITRL胞外区结构域的双特异性分子被命名为CD3-GITRL BsM。
一、CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D构建方案设计
单体形式的CD3-GITRL BsM_M具体构建方案为：抗CD3scFv和GITRL胞外区序列之间通过(GGGGS)3Linker相连。
二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D具体构建方案为：抗CD3scFv和GITRL胞外区序列之间通过IgD铰链区作为Linker相连。
为使双特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD3scFv，GITRL胞外区及连接片段(Linker)的序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD3scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
具体地，抗CD3scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
具体地，抗CD3scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。
具体地，GITRL胞外区的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示，具体为：
CAGCTGGAGACCGCCAAGGAGCCCTGCATGGCCAAGTTCGGCCCCCTGCCCAGCAAGTGGCAGATGGCCAGCAGCGAGCCCCCCTGCGTGAACAAGGTGAGCGACTGGAAGCTGGAGATCCTGCAGAACGGCCTGTACCTGATCTACGGCCAGGTGGCCCCCAACGCCAACTACAACGACGTGGCCCCCTTCGAGGTGCGCCTGTACAAGAACAAGGACATGATCCAGACCCTGACCAACAAGAGCAAGATCCAGAACGTGGGCGGCACCTACGAGCTGCACGTGGGCGACACCATCGACCTGATCTTCAACAGCGAGCACCAGGTGCTGAAGAACAACACCTACTGGGGCATCATCCTGCTGGCCAACCCCCAGTTCATCAGC。
单体形式的CD3-GITRL BsM_M连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为使双特异性分子在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示。
二、CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D真核表达载体构建
本发明双特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的双特异性分子，分别设计了如表4所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD3-GITRL BsM_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-GITRL-F和pcDNA3.1-GITRL-R扩增出抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker、GITRL胞外区的基因序列；针对CD3-GITRLBsM_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-GITRL-F和pcDNA3.1-GITRL-R扩增出抗CD3scFv、IgD铰链区、GITRL胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式双特异性分子全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上。目的载体转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD3-GITRL BsM_M和二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD3-GITRL BsM_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGCTGGAGACCGCCAAGGAGCCCTGCATGGCCAAGTTCGGCCCCCTGCCCAGCAAGTGGCAGATGGCCAGCAGCGAGCCCCCCTGCGTGAACAAGGTGAGCGACTGGAAGCTGGAGATCCTGCAGAACGGCCTGTACCTGATCTACGGCCAGGTGGCCCCCAACGCCAACTACAACGACGTGGCCCCCTTCGAGGTGCGCCTGTACAAGAACAAGGACATGATCCAGACCCTGACCAACAAGAGCAAGATCCAGAACGTGGGCGGCACCTACGAGCTGCACGTGGGCGACACCATCGACCTGATCTTCAACAGCGAGCACCAGGTGCTGAAGAACAACACCTACTGGGGCATCATCCTGCTGGCCAACCCCCAGTTCATCAGC。
具体地，二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGCTGGAGACCGCCAAGGAGCCCTGCATGGCCAAGTTCGGCCCCCTGCCCAGCAAGTGGCAGATGGCCAGCAGCGAGCCCCCCTGCGTGAACAAGGTGAGCGACTGGAAGCTGGAGATCCTGCAGAACGGCCTGTACCTGATCTACGGCCAGGTGGCCCCCAACGCCAACTACAACGACGTGGCCCCCTTCGAGGTGCGCCTGTACAAGAACAAGGACATGATCCAGACCCTGACCAACAAGAGCAAGATCCAGAACGTGGGCGGCACCTACGAGCTGCACGTGGGCGACACCATCGACCTGATCTTCAACAGCGAGCACCAGGTGCTGAAGAACAACACCTACTGGGGCATCATCCTGCTGGCCAACCCCCAGTTCATCAGC。
表4.CD3-GITRL双特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例14：CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D的表达与纯化
一、CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例13中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTMMAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图11所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D重组蛋白的纯度均>95％；其中CD3-GITRL BsM_M重组蛋白的理论分子量为41.8kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于GITRL胞外区结构域存在翻译后N-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该双特异性分子为糖基化的单体形式(图11A)；CD3-GITRL BsM_D重组蛋白的理论分子量为49.7kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图11B)，说明两个蛋白分子可通过二硫键相互连接，因此该双特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD3-GITRL BsM_M为单体形式，CD3-GITRL BsM_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD3-GITRL BsM_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS。
二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS。
抗CD3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
抗CD3scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。
抗CD3scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。
GITRL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，具体为：
QLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS。
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。实施例15：ELISA检测CD3-GITRL BsM_M和CD3-GITRL BsM_D的CD3抗原及正共刺激分子GITR结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类CD3-hFc与人类GITR-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24g NaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔，37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的双特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD3-GITRL BsM_M或CD3-GITRL BsM_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值。
ELISA结果如图12A和图12B所示：图12A说明CD3-GITRL BsM_M与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子GITR-hFc均具有体外结合活性，其中GITR结合活性较CD3结合活性更高；图12B说明CD3-GITRL BsM_D与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子GITR-hFc同样具有体外结合活性，其中GITR结合活性更高。
实施例16：CD3-GITRL双特异性分子介导的CIK(Cytokine induced killer)细胞增殖
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的双特异性分子CD3-GITRL BsM_M、二聚体形式的双特异性分子CD3-GITRL BsM_D、以及抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联用(Anti-CD3/Anti-CD28)分别作用于同一供体来源的人血PBMC，细胞培养后进行计数，比较扩增倍数。
1.PBMC的分离：取抗凝血，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，分别设计以下3个实验组：对照组(Anti-CD3 5ug/ml和Anti-CD285ug/ml包被细胞培养板)；实验组1(溶液状态下添加双特异性分子CD3-GITRL BsM_M10ng/ml)；实验组2(溶液状态下添加双特异性分子CD3-GITRL BsM_D 10ng/ml)。此外，3组实验细胞同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2-3天计数并用添加500U/ml IL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代。照此方法培养30天，最终统计细胞的扩增倍数，绘制生长曲线；
检测结果如图13所示，单体和二聚体形式的CD3-GITRL双特异性分子单一使用对CIK细胞的增殖效果均优于抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用，培养18天后，Anti-CD3/Anti-CD28联用出现大量细胞死亡，细胞扩增倍数显著下降；而添加单体形式的CD3-GITRL BsM_M或二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D均未出现细胞死亡，只是细胞扩增速度相对放缓。因此本发明制备的两种形式的CD3-GITRL双特异性分子均可有效扩增和延长CIK细胞的生存期，其中二聚体形式效果更好。
实施例17：CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D真核表达载体的构建
在本发明中，融合抗T细胞表面人类CD3蛋白scFv结构域和T细胞正共刺激分子配体CD70胞外区结构域的双特异性分子被命名为CD3-CD70BsM。
一、CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D构建方案设计
单体形式的CD3-CD70BsM_M具体构建方案为：抗CD3scFv和CD70胞外区序列之间通过(GGGGS)3Linker相连。
二聚体形式的CD3-CD70BsM_D具体构建方案为：抗CD3scFv和CD70胞外区序列之间通过IgD铰链区作为Linker相连。
为使双特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗CD3scFv，CD70胞外区及连接片段(Linker)的序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗CD3scFv的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
具体地，抗CD3scFv的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
具体地，抗CD3scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。
具体地，CD70胞外区的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示，具体为：
CAGCGCTTCGCCCAGGCCCAGCAGCAGCTGCCCCTGGAGAGCCTGGGCTGGGACGTGGCCGAGCTGCAGCTGAACCACACCGGCCCCCAGCAGGACCCCCGCCTGTACTGGCAGGGCGGCCCCGCCCTGGGCCGCAGCTTCCTGCACGGCCCCGAGCTGGACAAGGGCCAGCTGCGCATCCACCGCGACGGCATCTACATGGTGCACATCCAGGTGACCCTGGCCATCTGCAGCAGCACCACCGCCAGCCGCCACCACCCCACCACCCTGGCCGTGGGCATCTGCAGCCCCGCCAGCCGCAGCATCAGCCTGCTGCGCCTGAGCTTCCACCAGGGCTGCACCATCGCCAGCCAGCGCCTGACCCCCCTGGCCCGCGGCGACACCCTGTGCACCAACCTGACCGGCACCCTGCTGCCCAGCCGCAACACCGACGAGACCTTCTTCGGCGTGCAGTGGGTGCGCCCC。
单体形式的CD3-CD70BsM_M连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
二聚体形式的CD3-CD70BsM_D连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为使双特异性分子在CHO-S细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示。
二、CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D真核表达载体构建
本发明双特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的双特异性分子，分别设计了如表5所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对CD3-CD70BsM_M的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-(GGGGS)3-CD70-F和pcDNA3.1-CD70-R扩增出抗CD3scFv、(GGGGS)3Linker、CD70胞外区的基因序列；针对CD3-CD70BsM_D的克隆构建，同样首先使用引物pcDNA3.1-Sig-F和Sig-R扩增出信号肽片段，然后分别利用引物Sig-CD3-F和CD3-R、CD3-IgD-F和IgD-R、IgD-CD70-F和pcDNA3.1-CD70-R扩增出抗CD3scFv、IgD铰链区、CD70胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别拼接单体和二聚体形式双特异性分子全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上。目的载体转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于CHO-S细胞的转染。
经测序获知，单体形式的CD3-CD70BsM_M和二聚体形式的CD3-CD70BsM_D的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的CD3-CD70BsM_M的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGCGCTTCGCCCAGGCCCAGCAGCAGCTGCCCCTGGAGAGCCTGGGCTGGGACGTGGCCGAGCTGCAGCTGAACCACACCGGCCCCCAGCAGGACCCCCGCCTGTACTGGCAGGGCGGCCCCGCCCTGGGCCGCAGCTTCCTGCACGGCCCCGAGCTGGACAAGGGCCAGCTGCGCATCCACCGCGACGGCATCTACATGGTGCACATCCAGGTGACCCTGGCCATCTGCAGCAGCACCACCGCCAGCCGCCACCACCCCACCACCCTGGCCGTGGGCATCTGCAGCCCCGCCAGCCGCAGCATCAGCCTGCTGCGCCTGAGCTTCCACCAGGGCTGCACCATCGCCAGCCAGCGCCTGACCCCCCTGGCCCGCGGCGACACCCTGTGCACCAACCTGACCGGCACCCTGCTGCCCAGCCGCAACACCGACGAGACCTTCTTCGGCGTGCAGTGGGTGCGCCCC。
具体地，二聚体形式的CD3-CD70BsM_D的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，具体为：
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCCCGCCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGTGGAGGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCGCCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCTACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGCCAGCAAGAGCAAGAAGGAGATCTTCCGCTGGCCCGAGAGCCCCAAGGCCCAGGCCAGCAGCGTGCCCACCGCCCAGCCCCAGGCCGAGGGCAGCCTGGCCAAGGCCACCACCGCCCCCGCCACCACCCGCAACACCGGCCGCGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAGGAGGAGCAGGAGGAGCGCGAGACCAAGACCCCCGAGTGCCCCAGCCACACCCAGCCCCTGGGCGTGCAGCGCTTCGCCCAGGCCCAGCAGCAGCTGCCCCTGGAGAGCCTGGGCTGGGACGTGGCCGAGCTGCAGCTGAACCACACCGGCCCCCAGCAGGACCCCCGCCTGTACTGGCAGGGCGGCCCCGCCCTGGGCCGCAGCTTCCTGCACGGCCCCGAGCTGGACAAGGGCCAGCTGCGCATCCACCGCGACGGCATCTACATGGTGCACATCCAGGTGACCCTGGCCATCTGCAGCAGCACCACCGCCAGCCGCCACCACCCCACCACCCTGGCCGTGGGCATCTGCAGCCCCGCCAGCCGCAGCATCAGCCTGCTGCGCCTGAGCTTCCACCAGGGCTGCACCATCGCCAGCCAGCGCCTGACCCCCCTGGCCCGCGGCGACACCCTGTGCACCAACCTGACCGGCACCCTGCTGCCCAGCCGCAACACCGACGAGACCTTCTTCGGCGTGCAGTGGGTGCGCCCC。
表5.CD3-CD70双特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例18：CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D的表达与纯化
一、CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D的表达
1.1.CHO-S细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例17中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTMMAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein L亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein L亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein L亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图14所示。从图中可以看出，经Protein L亲和层析柱纯化后，CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D重组蛋白的纯度均>95％；其中CD3-CD70BsM_M重组蛋白的理论分子量为44.4kDa，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于CD70胞外区结构域存在翻译后N-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该双特异性分子为糖基化的单体形式(图14A)；CD3-CD70BsM_D重组蛋白的理论分子量为52.3kDa，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图14B)，说明两个蛋白分子可通过二硫键相互连接，因此该双特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认CD3-CD70BsM_M为单体形式，CD3-CD70BsM_D为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的CD3-CD70BsM_M的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP。
二聚体形式的CD3-CD70BsM_D的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP。
抗CD3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
抗CD3scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。
抗CD3scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。
CD70胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示，具体为：
QRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP。
单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D中连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例19：ELISA检测CD3-CD70BsM_M和CD3-CD70BsM_D的CD3抗原及正共刺激分子CD27结合活性
ELISA操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类CD3-hFc与人类CD27-hFc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(PBS)的配方为：3.58g Na2HPO4，0.24g NaH2PO4，0.2g KCl，8.2g NaCl，950ml H2O，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至7.4，补水至1L；
2.封闭：PBS洗板4次后，加入封闭液PBSA(PBS+2％BSA(V/W))，200μl/孔，37℃封闭1小时；
3.加样：PBS洗板4次后，分别加入纯化的双特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的CD3-CD70BsM_M或CD3-CD70BsM_D作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板4次后，用封闭液PBSA按1/5000稀释HRP标记的显色抗体(购自Abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。PBS洗板4次后，添加显色液TMB(购自KPL公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1M HCl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值。
ELISA结果如图15A和图15B所示：图15A说明CD3-CD70BsM_M与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子CD27-hFc均具有体外结合活性，其中CD27结合活性较CD3结合活性更高；图15B说明CD3-CD70BsM_D与抗原CD3-hFc和T细胞正共刺激分子CD27-hFc同样具有体外结合活性，其中CD27结合活性更高。
实施例20：CD3-CD70双特异性分子介导的CIK(Cytokine induced killer)细胞增殖
以人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的双特异性分子CD3-CD70BsM_M、二聚体形式的双特异性分子CD3-CD70BsM_D、以及抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联用(Anti-CD3/Anti-CD28)分别作用于同一供体来源的人血PBMC，细胞培养后进行计数，比较扩增倍数。
1.PBMC的分离：取抗凝血，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自GE Healthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的PBS缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的X-vivo 15无血清培养基(购自Lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.CIK细胞培养与扩增：将PBMC用CIK基础培养基(90％X-vivo15+10％FBS)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，分别设计以下3个实验组：对照组(Anti-CD3 5ug/ml和Anti-CD285ug/ml包被细胞培养板)；实验组1(溶液状态下添加双特异性分子CD3-CD70BsM_M10ng/ml)；实验组2(溶液状态下添加双特异性分子CD3-CD70BsM_D 10ng/ml)。此外，3组实验细胞同时添加细胞因子IFN-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和IL-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％CO2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500U/ml的IL-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2-3天计数并用添加500U/ml IL-2的CIK基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代。照此方法培养30天，最终统计细胞的扩增倍数，绘制生长曲线；
检测结果如图16所示，单体和二聚体形式的CD3-CD70双特异性分子单一使用对CIK细胞的增殖效果均优于抗CD3/抗CD28单克隆全长抗体联合使用，培养18天后，Anti-CD3/Anti-CD28联用出现大量细胞死亡，细胞扩增倍数显著下降；而添加单体形式的CD3-CD70BsM_M或二聚体形式的CD3-CD70BsM_D均未出现细胞死亡，只是细胞扩增速度相对放缓。因此本发明制备的两种形式的CD3-CD70双特异性分子均可有效扩增和延长CIK细胞的生存期，其中二聚体形式效果更好。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海欣百诺生物科技有限公司
<120> 一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应
用
<130> 164634
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<170> PatentIn version 3.3
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<223> 单体形式的抗CD3/T细胞正共刺激分子配体BsM中连接片段的氨基酸序列
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<223> 单体形式的抗CD3/T细胞正共刺激分子配体BsM中连接片段的核苷酸序列
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<223> 二聚体形式的抗CD3/ T细胞正共刺激分子配体BsM中连接片段的氨基酸序列
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Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys
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Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser
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Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg
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Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu
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Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly
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Val
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<223> 二聚体形式的抗CD3/T细胞正共刺激分子配体BsM中连接片段的核苷酸序列
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Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
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Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
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Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
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Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
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Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
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Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
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Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
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Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
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<223> T细胞正共刺激分子配体人类4-1BBL的氨基酸序列
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Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
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Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
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Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
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Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
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Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
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Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
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<223> T细胞正共刺激分子人类ICOS的氨基酸序列
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Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln Phe Lys
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Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr
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Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
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Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
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<223> T细胞正共刺激分子人类OX40的氨基酸序列
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245
<210> 10
<211> 183
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞正共刺激分子配体人类OX40L的氨基酸序列
<400> 10
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 11
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞正共刺激分子人类GITR的氨基酸序列
<400> 11
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys
20 25 30
Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met
35 40 45
Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys
50 55 60
Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys
65 70 75 80
Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser
85 90 95
Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe
100 105 110
Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys
115 120 125
Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val
130 135 140
Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu
145 150 155 160
Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu
165 170 175
Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser
180 185 190
Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys
195 200 205
Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
210 215
<210> 12
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞正共刺激分子配体人类GITRL的氨基酸序列
<400> 12
Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro
20 25 30
Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu
35 40 45
Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser
50 55 60
Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys
65 70 75 80
Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser
85 90 95
Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu
100 105 110
Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn
115 120 125
Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp
130 135 140
Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser
165 170 175
Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu
180 185 190
Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
195
<210> 13
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞正共刺激分子人类CD27的氨基酸序列
<400> 13
Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys
20 25 30
Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro
35 40 45
Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser
50 55 60
Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr
65 70 75 80
Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys
85 90 95
Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr
115 120 125
Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro
145 150 155 160
Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile
165 170 175
Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu
180 185 190
His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu
195 200 205
Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser
210 215 220
Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser
225 230 235 240
Pro
<210> 14
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T细胞正共刺激分子配体人类CD70的氨基酸序列
<400> 14
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1 5 10 15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
20 25 30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65 70 75 80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
85 90 95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
100 105 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
115 120 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180 185 190
Pro
<210> 15
<211> 463
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-4-1BBL BSM_M的氨基酸序列
<400> 15
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly
260 265 270
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
275 280 285
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
290 295 300
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
305 310 315 320
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
325 330 335
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
340 345 350
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
355 360 365
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
370 375 380
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
385 390 395 400
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
405 410 415
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
420 425 430
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
435 440 445
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
450 455 460
<210> 16
<211> 1389
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-4-1BBL BsM_M的核苷酸序列
<400> 16
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaagg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgcctgc 780
ccctgggccg tgagcggcgc ccgcgccagc cccggcagcg ccgccagccc ccgcctgcgc 840
gagggccccg agctgagccc cgacgacccc gccggcctgc tggacctgcg ccagggcatg 900
ttcgcccagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgacg gccccctgag ctggtacagc 960
gaccccggcc tggccggcgt gagcctgacc ggcggcctga gctacaagga ggacaccaag 1020
gagctggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct tccagctgga gctgcgccgc 1080
gtggtggccg gcgagggcag cggcagcgtg agcctggccc tgcacctgca gcccctgcgc 1140
agcgccgccg gcgccgccgc cctggccctg accgtggacc tgccccccgc cagcagcgag 1200
gcccgcaaca gcgccttcgg cttccagggc cgcctgctgc acctgagcgc cggccagcgc 1260
ctgggcgtgc acctgcacac cgaggcccgc gcccgccacg cctggcagct gacccagggc 1320
gccaccgtgc tgggcctgtt ccgcgtgacc cccgagatcc ccgccggcct gcccagcccc 1380
cgcagcgag 1389
<210> 17
<211> 529
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D的氨基酸序列
<400> 17
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu
245 250 255
Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ala
260 265 270
Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn
275 280 285
Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu
290 295 300
Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln
305 310 315 320
Pro Leu Gly Val Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser
325 330 335
Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
340 345 350
Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala
355 360 365
Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp
370 375 380
Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser
385 390 395 400
Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr
405 410 415
Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly
420 425 430
Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
435 440 445
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
450 455 460
Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
465 470 475 480
Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
485 490 495
Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
500 505 510
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
515 520 525
Glu
<210> 18
<211> 1587
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-4-1BBL BsM_D的核苷酸序列
<400> 18
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaagg ccagcaagag caagaaggag atcttccgct ggcccgagag ccccaaggcc 780
caggccagca gcgtgcccac cgcccagccc caggccgagg gcagcctggc caaggccacc 840
accgcccccg ccaccacccg caacaccggc cgcggcggcg aggagaagaa gaaggagaag 900
gagaaggagg agcaggagga gcgcgagacc aagacccccg agtgccccag ccacacccag 960
cccctgggcg tggcctgccc ctgggccgtg agcggcgccc gcgccagccc cggcagcgcc 1020
gccagccccc gcctgcgcga gggccccgag ctgagccccg acgaccccgc cggcctgctg 1080
gacctgcgcc agggcatgtt cgcccagctg gtggcccaga acgtgctgct gatcgacggc 1140
cccctgagct ggtacagcga ccccggcctg gccggcgtga gcctgaccgg cggcctgagc 1200
tacaaggagg acaccaagga gctggtggtg gccaaggccg gcgtgtacta cgtgttcttc 1260
cagctggagc tgcgccgcgt ggtggccggc gagggcagcg gcagcgtgag cctggccctg 1320
cacctgcagc ccctgcgcag cgccgccggc gccgccgccc tggccctgac cgtggacctg 1380
ccccccgcca gcagcgaggc ccgcaacagc gccttcggct tccagggccg cctgctgcac 1440
ctgagcgccg gccagcgcct gggcgtgcac ctgcacaccg aggcccgcgc ccgccacgcc 1500
tggcagctga cccagggcgc caccgtgctg ggcctgttcc gcgtgacccc cgagatcccc 1560
gccggcctgc ccagcccccg cagcgag 1587
<210> 19
<211> 496
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-B7RP-1 BsM_M的氨基酸序列
<400> 19
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp
260 265 270
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn
275 280 285
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr
290 295 300
Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr
305 310 315 320
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe
325 330 335
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His
340 345 350
Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val
355 360 365
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser
370 375 380
Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser
385 390 395 400
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp
405 410 415
Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn
420 425 430
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr
435 440 445
Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln
450 455 460
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp
465 470 475 480
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
485 490 495
<210> 20
<211> 1488
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-B7RP-1 BsM_M的核苷酸序列
<400> 20
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaagg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgacacc 780
caggagaagg aggtgcgcgc catggtgggc agcgacgtgg agctgagctg cgcctgcccc 840
gagggcagcc gcttcgacct gaacgacgtg tacgtgtact ggcagaccag cgagagcaag 900
accgtggtga cctaccacat cccccagaac agcagcctgg agaacgtgga cagccgctac 960
cgcaaccgcg ccctgatgag ccccgccggc atgctgcgcg gcgacttcag cctgcgcctg 1020
ttcaacgtga ccccccagga cgagcagaag ttccactgcc tggtgctgag ccagagcctg 1080
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cccgtggtga gcgcccccca cagccccagc caggacgagc tgaccttcac ctgcaccagc 1200
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<210> 21
<211> 562
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-B7RP-1 BsM_D的氨基酸序列
<400> 21
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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225 230 235 240
Glu Leu Lys Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu
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275 280 285
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325 330 335
Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp
340 345 350
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355 360 365
Val Thr Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser
370 375 380
Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly
385 390 395 400
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Thr Asp Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe
485 490 495
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Ala Thr
<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-B7RP-1 BsM_D的核苷酸序列
<400> 22
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<210> 23
<211> 391
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-OX40L BsM_M的氨基酸序列
<400> 23
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-OX40L BsM_M的核苷酸序列
<400> 24
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
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aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-OX40L BsM_D的氨基酸序列
<400> 25
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1 5 10 15
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Glu Leu Lys Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu
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<210> 26
<211> 1371
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 聚体形式的CD3-OX40L BsM_D的核苷酸序列
<400> 26
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-GITRL BsM_M的氨基酸序列
<400> 27
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
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Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
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Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
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Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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385
<210> 28
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-GITRL BsM_M的核苷酸序列
<400> 28
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
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atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
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aacccccagt tcatcagc 1158
<210> 29
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D的氨基酸序列
<400> 29
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu
245 250 255
Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ala
260 265 270
Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn
275 280 285
Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu
290 295 300
Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln
305 310 315 320
Pro Leu Gly Val Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
325 330 335
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
340 345 350
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
355 360 365
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
370 375 380
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
385 390 395 400
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
405 410 415
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
420 425 430
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
435 440 445
Gln Phe Ile Ser
450
<210> 30
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-GITRL BsM_D的核苷酸序列
<400> 30
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaagg ccagcaagag caagaaggag atcttccgct ggcccgagag ccccaaggcc 780
caggccagca gcgtgcccac cgcccagccc caggccgagg gcagcctggc caaggccacc 840
accgcccccg ccaccacccg caacaccggc cgcggcggcg aggagaagaa gaaggagaag 900
gagaaggagg agcaggagga gcgcgagacc aagacccccg agtgccccag ccacacccag 960
cccctgggcg tgcagctgga gaccgccaag gagccctgca tggccaagtt cggccccctg 1020
cccagcaagt ggcagatggc cagcagcgag cccccctgcg tgaacaaggt gagcgactgg 1080
aagctggaga tcctgcagaa cggcctgtac ctgatctacg gccaggtggc ccccaacgcc 1140
aactacaacg acgtggcccc cttcgaggtg cgcctgtaca agaacaagga catgatccag 1200
accctgacca acaagagcaa gatccagaac gtgggcggca cctacgagct gcacgtgggc 1260
gacaccatcg acctgatctt caacagcgag caccaggtgc tgaagaacaa cacctactgg 1320
ggcatcatcc tgctggccaa cccccagttc atcagc 1356
<210> 31
<211> 413
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-CD70 BsM_M的氨基酸序列
<400> 31
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser
260 265 270
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
275 280 285
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
290 295 300
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
305 310 315 320
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
325 330 335
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
340 345 350
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
355 360 365
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
370 375 380
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
385 390 395 400
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro
405 410
<210> 32
<211> 1239
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单体形式的CD3-CD70 BsM_M的核苷酸序列
<400> 32
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaagg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagccagcgc 780
ttcgcccagg cccagcagca gctgcccctg gagagcctgg gctgggacgt ggccgagctg 840
cagctgaacc acaccggccc ccagcaggac ccccgcctgt actggcaggg cggccccgcc 900
ctgggccgca gcttcctgca cggccccgag ctggacaagg gccagctgcg catccaccgc 960
gacggcatct acatggtgca catccaggtg accctggcca tctgcagcag caccaccgcc 1020
agccgccacc accccaccac cctggccgtg ggcatctgca gccccgccag ccgcagcatc 1080
agcctgctgc gcctgagctt ccaccagggc tgcaccatcg ccagccagcg cctgaccccc 1140
ctggcccgcg gcgacaccct gtgcaccaac ctgaccggca ccctgctgcc cagccgcaac 1200
accgacgaga ccttcttcgg cgtgcagtgg gtgcgcccc 1239
<210> 33
<211> 479
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-CD70 BsM_D的氨基酸序列
<400> 33
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe Arg Trp Pro Glu
245 250 255
Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ala
260 265 270
Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn
275 280 285
Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu
290 295 300
Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln
305 310 315 320
Pro Leu Gly Val Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu
325 330 335
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
340 345 350
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
355 360 365
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
370 375 380
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
385 390 395 400
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
405 410 415
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
420 425 430
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
435 440 445
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
450 455 460
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro
465 470 475
<210> 34
<211> 1437
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 二聚体形式的CD3-CD70 BsM_D的核苷酸酸序列
<400> 34
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaagg ccagcaagag caagaaggag atcttccgct ggcccgagag ccccaaggcc 780
caggccagca gcgtgcccac cgcccagccc caggccgagg gcagcctggc caaggccacc 840
accgcccccg ccaccacccg caacaccggc cgcggcggcg aggagaagaa gaaggagaag 900
gagaaggagg agcaggagga gcgcgagacc aagacccccg agtgccccag ccacacccag 960
cccctgggcg tgcagcgctt cgcccaggcc cagcagcagc tgcccctgga gagcctgggc 1020
tgggacgtgg ccgagctgca gctgaaccac accggccccc agcaggaccc ccgcctgtac 1080
tggcagggcg gccccgccct gggccgcagc ttcctgcacg gccccgagct ggacaagggc 1140
cagctgcgca tccaccgcga cggcatctac atggtgcaca tccaggtgac cctggccatc 1200
tgcagcagca ccaccgccag ccgccaccac cccaccaccc tggccgtggg catctgcagc 1260
cccgccagcc gcagcatcag cctgctgcgc ctgagcttcc accagggctg caccatcgcc 1320
agccagcgcc tgacccccct ggcccgcggc gacaccctgt gcaccaacct gaccggcacc 1380
ctgctgccca gccgcaacac cgacgagacc ttcttcggcg tgcagtgggt gcgcccc 1437
<210> 35
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv结构域的氨基酸序列
<400> 35
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv结构域的重链可变区的氨基酸序列
<400> 36
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv结构域的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 38
<211> 205
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 4-1BBL胞外区结构域的氨基酸序列
<400> 38
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 39
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> B7RP-1胞外区结构域的氨基酸序列
<400> 39
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 40
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> OX40L胞外区结构域的氨基酸序列
<400> 40
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
<210> 41
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GITRL胞外区结构域的氨基酸序列
<400> 41
Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu
1 5 10 15
Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys
20 25 30
Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe
50 55 60
Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn
65 70 75 80
Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly
85 90 95
Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn
100 105 110
Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 155
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD70胞外区结构域的氨基酸序列
<400> 42
Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp
20 25 30
Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu
35 40 45
His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly
50 55 60
Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser
85 90 95
Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly
100 105 110
Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr
115 120 125
Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp
130 135 140
Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro
145 150 155
<210> 43
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv结构域的核苷酸序列
<400> 43
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagcgtg 360
gagggcggca gcggcggcag cggcggcagc ggcggcagcg gcggcgtgga cgacatccag 420
ctgacccaga gccccgccat catgagcgcc agccccggcg agaaggtgac catgacctgc 480
cgcgccagca gcagcgtgag ctacatgaac tggtaccagc agaagagcgg caccagcccc 540
aagcgctgga tctacgacac cagcaaggtg gccagcggcg tgccctaccg cttcagcggc 600
agcggcagcg gcaccagcta cagcctgacc atcagcagca tggaggccga ggacgccgcc 660
acctactact gccagcagtg gagcagcaac cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg 720
gagctgaag 729
<210> 44
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv结构域的重链可变区的核苷酸序列
<400> 44
gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggcccgcc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gaagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300
gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagc 357
<210> 45
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗CD3 scFv结构域的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 45
gacatccagc tgacccagag ccccgccatc atgagcgcca gccccggcga gaaggtgacc 60
atgacctgcc gcgccagcag cagcgtgagc tacatgaact ggtaccagca gaagagcggc 120
accagcccca agcgctggat ctacgacacc agcaaggtgg ccagcggcgt gccctaccgc 180
ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagcat ggaggccgag 240
gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg agcagcaacc ccctgacctt cggcgccggc 300
accaagctgg agctgaag 318
<210> 46
<211> 615
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 4-1BBL胞外区结构域的核苷酸序列
<400> 46
gcctgcccct gggccgtgag cggcgcccgc gccagccccg gcagcgccgc cagcccccgc 60
ctgcgcgagg gccccgagct gagccccgac gaccccgccg gcctgctgga cctgcgccag 120
ggcatgttcg cccagctggt ggcccagaac gtgctgctga tcgacggccc cctgagctgg 180
tacagcgacc ccggcctggc cggcgtgagc ctgaccggcg gcctgagcta caaggaggac 240
accaaggagc tggtggtggc caaggccggc gtgtactacg tgttcttcca gctggagctg 300
cgccgcgtgg tggccggcga gggcagcggc agcgtgagcc tggccctgca cctgcagccc 360
ctgcgcagcg ccgccggcgc cgccgccctg gccctgaccg tggacctgcc ccccgccagc 420
agcgaggccc gcaacagcgc cttcggcttc cagggccgcc tgctgcacct gagcgccggc 480
cagcgcctgg gcgtgcacct gcacaccgag gcccgcgccc gccacgcctg gcagctgacc 540
cagggcgcca ccgtgctggg cctgttccgc gtgacccccg agatccccgc cggcctgccc 600
agcccccgca gcgag 615
<210> 47
<211> 714
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B7RP-1胞外区结构域的核苷酸序列
<400> 47
gacacccagg agaaggaggt gcgcgccatg gtgggcagcg acgtggagct gagctgcgcc 60
tgccccgagg gcagccgctt cgacctgaac gacgtgtacg tgtactggca gaccagcgag 120
agcaagaccg tggtgaccta ccacatcccc cagaacagca gcctggagaa cgtggacagc 180
cgctaccgca accgcgccct gatgagcccc gccggcatgc tgcgcggcga cttcagcctg 240
cgcctgttca acgtgacccc ccaggacgag cagaagttcc actgcctggt gctgagccag 300
agcctgggct tccaggaggt gctgagcgtg gaggtgaccc tgcacgtggc cgccaacttc 360
agcgtgcccg tggtgagcgc cccccacagc cccagccagg acgagctgac cttcacctgc 420
accagcatca acggctaccc ccgccccaac gtgtactgga tcaacaagac cgacaacagc 480
ctgctggacc aggccctgca gaacgacacc gtgttcctga acatgcgcgg cctgtacgac 540
gtggtgagcg tgctgcgcat cgcccgcacc cccagcgtga acatcggctg ctgcatcgag 600
aacgtgctgc tgcagcagaa cctgaccgtg ggcagccaga ccggcaacga catcggcgag 660
cgcgacaaga tcaccgagaa ccccgtgagc accggcgaga agaacgccgc cacc 714
<210> 48
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> OX40L胞外区结构域的核苷酸序列
<400> 48
caggtgagcc accgctaccc ccgcatccag agcatcaagg tgcagttcac cgagtacaag 60
aaggagaagg gcttcatcct gaccagccag aaggaggacg agatcatgaa ggtgcagaac 120
aacagcgtga tcatcaactg cgacggcttc tacctgatca gcctgaaggg ctacttcagc 180
caggaggtga acatcagcct gcactaccag aaggacgagg agcccctgtt ccagctgaag 240
aaggtgcgca gcgtgaacag cctgatggtg gccagcctga cctacaagga caaggtgtac 300
ctgaacgtga ccaccgacaa caccagcctg gacgacttcc acgtgaacgg cggcgagctg 360
atcctgatcc accagaaccc cggcgagttc tgcgtgctg 399
<210> 49
<211> 384
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GITRL胞外区结构域的核苷酸序列
<400> 49
cagctggaga ccgccaagga gccctgcatg gccaagttcg gccccctgcc cagcaagtgg 60
cagatggcca gcagcgagcc cccctgcgtg aacaaggtga gcgactggaa gctggagatc 120
ctgcagaacg gcctgtacct gatctacggc caggtggccc ccaacgccaa ctacaacgac 180
gtggccccct tcgaggtgcg cctgtacaag aacaaggaca tgatccagac cctgaccaac 240
aagagcaaga tccagaacgt gggcggcacc tacgagctgc acgtgggcga caccatcgac 300
ctgatcttca acagcgagca ccaggtgctg aagaacaaca cctactgggg catcatcctg 360
ctggccaacc cccagttcat cagc 384
<210> 50
<211> 465
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD70胞外区结构域的核苷酸序列
<400> 50
cagcgcttcg cccaggccca gcagcagctg cccctggaga gcctgggctg ggacgtggcc 60
gagctgcagc tgaaccacac cggcccccag caggaccccc gcctgtactg gcagggcggc 120
cccgccctgg gccgcagctt cctgcacggc cccgagctgg acaagggcca gctgcgcatc 180
caccgcgacg gcatctacat ggtgcacatc caggtgaccc tggccatctg cagcagcacc 240
accgccagcc gccaccaccc caccaccctg gccgtgggca tctgcagccc cgccagccgc 300
agcatcagcc tgctgcgcct gagcttccac cagggctgca ccatcgccag ccagcgcctg 360
acccccctgg cccgcggcga caccctgtgc accaacctga ccggcaccct gctgcccagc 420
cgcaacaccg acgagacctt cttcggcgtg cagtgggtgc gcccc 465
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 分泌表达信号肽的氨基酸序列
<400> 51
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 52
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 分泌表达信号肽的核苷酸序列
<400> 52
atgacccgcc tgaccgtgct ggccctgctg gccggcctgc tggccagcag ccgcgcc 57
<210> 53
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-Sig-F
<400> 53
gtgctggata tctgcagaat tcgccgccac catgacccgg ctgaccgtgc tggccctgc 59
<210> 54
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sig-R
<400> 54
ggccctggag gaggccagca ggccggccag cagggccagc acggtcagc 49
<210> 55
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sig-CD3-F
<400> 55
gctggcctcc tccagggccg acatcaagct gcagcagagc g 41
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-R
<400> 56
cttcagctcc agcttggtgc 20
<210> 57
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-4-1BBL-F
<400> 57
gcaccaagct ggagctgaag ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg 60
gcagcgcctg cccctgggcc gtgagc 86
<210> 58
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-4-1BBL-R
<400> 58
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcac tcgctgcggg ggctgggcag gc 52
<210> 59
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-IgD-F
<400> 59
gcaccaagct ggagctgaag gccagcaaga gcaagaagga g 41
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-R
<400> 60
cacgcccagg ggctgggtgt g 21
<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-4-1BBL-F
<400> 61
gccacaccca gcccctgggc gtggcctgcc cctgggccgt gagc 44
<210> 62
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-B7RP-1-F
<400> 62
cggcaccaag ctggagctga agggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg 60
cggcagcgac acccaggaga aggaggtgc 89
<210> 63
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-B7RP-1-R
<400> 63
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag gtggcggcgt tcttctcgcc 50
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-B7RP-1-F
<400> 64
gccacaccca gcccctgggc gtggacaccc aggagaagga ggtgc 45
<210> 65
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-OX40L-F
<400> 65
cggcaccaag ctggagctga agggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg 60
cggcagccag gtgagccacc gctacccccg 90
<210> 66
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-OX40L-R
<400> 66
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcac agcacgcaga actcgccg 48
<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-OX40L-F
<400> 67
cacacccagc ccctgggcgt gcaggtgagc caccgctacc cccg 44
<210> 68
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-GITRL-F
<400> 68
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagccagc tggagaccgc caaggagc 88
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-GITRL-R
<400> 69
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag ctgatgaact gggggttggc 50
<210> 70
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-GITRL-F
<400> 70
cacacccagc ccctgggcgt gcagctggag accgccaagg agc 43
<210> 71
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD3-(GGGGS)3-CD70-F
<400> 71
ggcaccaagc tggagctgaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 60
ggcagccagc gcttcgccca ggcccagc 88
<210> 72
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pcDNA3.1-CD70-R
<400> 72
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcag gggcgcaccc actgcacgc 49
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IgD-CD70-F
<400> 73
cacacccagc ccctgggcgt gcagcgcttc gcccaggccc agc 43

Claims (17)

1.一种双功能分子，其结构中包括能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和能够结合并激活T细胞正共刺激分子的第二功能域。
2.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述双功能分子能够同时结合并激活T细胞表面CD3分子和T细胞正共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。
3.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述第一功能域为抗CD3的抗体，所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。
4.根据权利要求3所述的双功能分子，其特征在于，所述抗体选自Fab抗体、Fv抗体或单链抗体。
5.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述第一功能域和所述第二功能域通过连接片段连接。
6.根据权利要求5所述的双功能分子，其特征在于，所述连接片段选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。
7.根据权利要求6所述的双功能分子，其特征在于，以G4S为单位的连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；免疫球蛋白IgD的铰链区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述第一功能域为抗CD3的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。
9.根据权利要求8所述的双功能分子，其特征在于，所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域选自4-1BBL胞外区结构域、B7RP-1胞外区结构域、OX40L胞外区结构域、GITRL胞外区结构域或CD70胞外区结构域之任一。
10.根据权利要求9所述的双功能分子，其特征在于，所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述4-1BBL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述B7RP-1胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；所述OX40L胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述GITRL胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；所述CD70胞外区结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
11.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述双功能分子的氨基酸序列如如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.33之任一所示。
12.一种多核苷酸，其编码如权利要求1～11任一项所述双功能分子。
13.一种表达载体，其含有如权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，其被如权利要求13所述的表达载体所转化。
15.如权利要求1～11任一项所述双功能分子的制备方法，包括：构建含有双功能分子基因序列的表达载体，然后将含双功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的双功能分子。
16.如权利要求1～11任一项所述双功能分子用于制备T细胞体外扩增剂的用途。
17.一种体外扩增T细胞的方法，包括将如权利要求1～11任一项所述双功能分子作用于T细胞。
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