CN1756768A - 诱导持久t细胞应答的三聚体多肽构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供三聚体多肽构建体，其中该三聚体多肽构建体的每种单体由两个或三个结构域组成，并且其中第一个结构域为4－1BBL的胞外结构域或者其部分，第二个结构域由位于第一个结构域N－末端的抗原相互作用位点组成和任选地，第三个结构域通过肽接头结合所述第一个和第二个结构域，其中所述肽接头不含有任何聚合活性。此外，本发明提供编码所述多肽构建体的核酸分子、用于表达该三聚体多肽构建体的载体和宿主系统。此外，本发明提供设想为药物组合物的组合物和它们在疾病治疗中的用途。

Description

诱导持久T细胞应答的三聚体多肽构建体
本发明涉及三聚体多肽构建体，其中该三聚体多肽构建体的每个单体由两个或三个结构域组成，并且其中第一个结构域是4-1BBL的胞外结构域或者其部分，第二个结构域由位于第一个结构域的N-末端的抗原相互作用部位组成并且(任选地)第三个结构域通过肽接头结合所述第一个和第二个结构域，其中所述肽接头不含有任何聚合活性。此外，本发明提供了编码所述多肽构建体的核酸分子、用于表达该三聚体多肽构建体的载体和宿主系统。此外，本发明提供了设想为药物组合物的组合物和它们在疾病的治疗中的用途。贯穿本说明书中引用了多种文献。在此外入所述文献的公开内容作为参考。
T细胞介导的免疫治疗的改进是重要的医学目标。T细胞介导的免疫治疗的一个关键方面是有效的T细胞活化。通过抗原呈递细胞(APC)膜上展示的抗原与多种膜分子动态相互作用而产生必要的细胞内信号，导致T细胞活化。现在普遍认为幼稚T细胞需要若干不同信号以活化并随后增殖成效应细胞。
首先，存在最初信号(信号1)，其通过抗原肽与TCR-CD3复合体相互作用产生(Kuby，2000：Immunology，第四版，Freeman and Company，NewYork，254页)。该最初信号导致T细胞的短期刺激。互补确定区(CDR)决定应答的抗原特异性并且在起始活化中起关键作用。然而，该相互作用自身不足以完全活化幼稚T细胞。最初T细胞刺激后，必须有进一步的独立于抗原的共同刺激信号。
第二种信号由B7.1和T细胞上CD28受体之间的相互作用介导。CD28受体已经在静息/幼稚T细胞上表达并且其介导T细胞增殖和T细胞事实上的致敏。
第三种信号由如4-1BBL之类的辅助因子和其相应受体之间的相互作用产生，所述受体仅在最初刺激后在T细胞上表达。其他辅助因子/受体对为：CD30配体/CD30、Ox40配体/Ox40、GITRL/GITR、CD27配体/CD27。该辅助信号决定了T细胞的存活和命运。上面提到的分子是TNF超家族的一部分。
多数TNF家族成员以前体分子合成，它们要经历加工步骤(Bodmer等，2002，TIBS 27，19-26)。已经详细描述了金属蛋白酶对肿瘤坏死因子前体的加工(Gearing等，1994，Nature 370，555-557)。TNFα最初表达为233个氨基酸的膜锚定前体，其经蛋白酶解加工产生成熟的157aa细胞因子。切割TNFα的加工酶是肿瘤坏死因子α转换酶TACE (Lee，Biochem.J.2003 Jan 30，Becker等，2002，Biol.Chem.383：1921-6)。TACE是一种膜锚定的、多结构域锌金属蛋白酶，其负责强有力的前炎症细胞因子TNFα的释放(Lee，Biochem.J.2003 Jan.30)。已经描述TNFα自身是三聚体蛋白质(Jones等，1990，J.Cell Sci Suppl 13，11-18，Smith和Baglioni，1987，J BiolChem 262，6951-6954；Wingfield等，1987，FEBS 211(2)，179-184)。这是重要的生物学特征，因为一个TNFα三聚体可以结合三个TNFα受体分子，并且该受体簇启动细胞内信号级联(Ameloot等，J.Biol.Chem(2001)276：27098-27103)。除了TNFα自身的三聚化，还描述了TNFα融合蛋白的三聚化。然而，现有技术缺乏对三聚体形成的研究或者研究处于低水平，并且使用了额外的三聚化结构域。例如，Yang等，1995，Mol.Immunol 32，873-81，Scherf等，1996，Clin Cancer Res 9，1523-31，Wüest等，2002，Oncogene 21，4257-4265和Xiang等，1997，J Biotech 53，3-12描述了含有TNFα的成熟细胞外结构域(氨基酸1-157)的构建体的三聚化，Wüest等，2002，Oncogene 21，4257-4265；WO02/22833和WO02/22680描述了含有TNFα或者TNFα同系物TRAIL或者FasL的多肽构建体在额外的三聚体结构域(腱生蛋白或Acrp30)帮助下的三聚化。
人4-1BBL(4-1BBL)是II型膜糖蛋白，其具有细胞外羧基末端结构域(Goodwin等，1993，Eur J Immunol 23，2631-2641)。4-1BBL与其相应受体4.1BB的相互作用诱导活化的胸腺细胞和脾T细胞的增殖(Goodwin等，1993，Eur J Immunol 23，2631-2641)。4-1BBL的胞外结构域显示出与肿瘤坏死因子(TNF)a明显的序列同源性。该所谓的TNF同源结构域(THD)在迄今所知的共18个TNF家成员之间是保守的(Bodmer等，2002，TIBS 27，19-26)。THD是约150个氨基酸长的序列，其含有芳香族和疏水残基的保守框架(Bodmer等，2002，TIBS 27，19-26；Gruss，1996，Int J Clin Lab Res26，143-159)。THDs具有几乎相同的三级折叠并且结合而形成三聚体蛋白质(Jones等，1990，J.Cell Sci Suppl 13，11-18；Smith & Baglioni，1987，JBiol Chem 262，6951-6954；Wingfield等，1987，FEBS 211(2)，179-184)。THDs为β-夹层结构，其采取经典的“果冻卷”(jelly-roll)拓扑结构。根据X射线晶体学，很清楚亚单位围绕三重轴紧密结合，通过β夹层的简单边-面包装(edge-to-face packing)形成实心、圆锥形三聚体(Jones等，1990，J.Cell Sci Suppl 13，11-18)。负责受体结合的氨基酸残基隐藏在THD结构域内(Bodmer等，2002，TIBS 27，19-26)。除了THD结构域，人4-1BBL的细胞外部分(氨基酸50-254)含有约42个氨基酸(氨基酸50～92)的额外的柄结构域。图1显示了与TNFα和TNFα前体蛋白质相比4-1BBL完整结构的示意图。还没有4-1BB配体切割位点的描述(Bodmer等，2002 TIBS 27(1)，19-26)。
4.1BB配体、CD30配体、Ox40配体、GITRL、LIGHT和CD27配体被描述为具有T细胞(共)刺激或者调节功能(Mackay & Kalled，2002，Current Opinion in Immunology 14，783，Granger，2001，J.Immunol.，5122；Akiba，2000，J.Exp.Med.191，375)并且因此形成TNF配体超家族的亚群，区别于作用于B细胞或者树突细胞的配体。关于TNF家族成员的亚群的这些报导受到多重序列比对和系统树分析的进一步支持。4-1BBL位于与Ox40配体和CD27配体相同的系统树分枝上，而TNF和FasL位于不同分枝上(Granger，2001，J.Imminol.，5122；Akiba，2000，J.Exp.Med.191，375)。图2中，已经比较了所有18种TNFα家族成员的胞外结构域(图2)。Treetop程序的拓扑学算法计算序列之间的成对距离(Chumakov &Yushmanov，1988，Mol Genet Microbiol Virusol 3，3-9；Yushmanov &Chumakov，1988，Mol Genet Microbiol Virusol 3，9-15；Brodsky等，1992，Dimacs 8，127-139；Brodsky等，1995，Biochemistry，923-928)。没有根的树似乎分成三个主要分枝(图2B)。在三个分枝之一，4-1BBL组与CD30配体、Ox40配体、GITRL和CD27配体在一组。
仅在T细胞接受所有三种信号后才产生这些T细胞的持续免疫应答。
迄今，T细胞介导的免疫治疗主要集中在提供最初T细胞刺激。实例有双特异性单链抗体构建体，其通过它们的抗-CD3部分产生最初T细胞刺激(Mack等，1995，PNAS 92(15)，7021-5；WO99/54440)，或者OKT3抗体(US5,929,212，WO91/09968)。通过抗-CD3作用的组分的T细胞刺激能力在施用后很快丧失。该特征可用于例如急性治疗背景中。然而，还存在这样的适应症，其中需要持续的T细胞应答，如转移性癌症或者最小残留癌(minimal residual cancer)的治疗中。
为了开发引起持续T细胞应答的免疫治疗，若干方法是公知的。然而，它们中没有一种可用于治疗、减轻或者预防靶组织中的特定病症。
例如，WO99/36093公开了增强T细胞活化的方法，其包括施用有效量人4-1BB配体，以便所述配体与至少一个T细胞接触，从而活化该T细胞。此外，在该方法中明确另一种刺激性分子可以联合4-1BB配体施用。该第二种刺激分子可以是CD3抗体、CD28抗体或者CD28蛋白质。任选地，如果第二种刺激性分子是CD3抗体，WO99/36093的方法可以含有第三种刺激分子，其可以是CD28抗体。具体而言，WO99/36093描述CD28与4-1BB的联合使用促进1型效应T细胞发育和易于受到反复TCR活化诱导凋亡的细胞的长期细胞存活。
在WO94/26290中描述了4-1BB配体的DNA和所编码的氨基酸序列，含有4-1BB配体和Fc结构域的融合蛋白。在WO94/26290中其讨论通过向培养基加入单独的4-1BB-L或结合其他细胞因子(如白介素-2)，可将4-1BB配体用于刺激将用于治疗程序的活化T细胞的增殖和在离体阶段提高CTLs的增殖。
WO98/16249描述了两种抗4-1BB单克隆抗体，其提供了体内免疫抑制和癌症治疗的新方法。
因此，本发明存在的技术难题是提供持久/长时间持续活化T细胞的方法，所述T细胞可用于若干疾病的治疗。
通过提供权利要求书中表征的实施方案解决了所述技术难题。
因此，本发明涉及三聚体多肽构建体，其中三聚体多肽构建体的每个单体由两个或三个结构域组成，并且其中第一个结构域为4-1BBL的胞外结构域或者其部分，第二个结构域由位于第一个结构域的N-末端的抗原相互作用位点组成并且(任选地)第三个结构域通过肽接头结合所述第一个和第二个结构域，其中所述肽接头不含有任何聚合活性。
根据本发明，术语“多肽构建体”定义了可以重组产生的多肽，其由一种或多种基因改造的核酸分子编码。
本文中所用术语“三聚体多肽构建体”指含有三个“单体”多肽构建体的构建体。该三聚体多肽构建体的每个所述单体由至少一条多肽链组成。从而，术语“单体多肽构建体”在本文中仅表示形成“三聚体多肽构建体”的亚单位，尽管所述单体自身可以是多聚体。定义为三聚体构建体的单体的多聚体的一个实例是F(ab)片段，其由两条多肽链组成。优选本发明的三聚体多肽构建体是可溶的多肽构建体，其可以在适宜宿主的胞质溶胶中表达。同样优选本发明的所述多肽构建体通过适宜宿主的分泌途径分泌到特定细胞区室或者上清液中。尤其优选的宿主是真核生物宿主。
本发明多肽构建体的三聚体结构代表基本技术特征，因为已经令人惊奇地发现仅所述三聚体结构就能够诱导允许持续和/或持久的T细胞应答的活化信号。
术语“持久T细胞应答”指已通过TCR或类TCR信号和第二种和/或第三种共同刺激信号使T细胞致敏。涉及根据本发明的持久T细胞应答的所述T细胞表现出延长的存活。不被理论所束缚，所述更长的存活可能是由于针对活化诱导的细胞死亡的保护等等。结果，在本发明上下文中，参与持久T细胞应答的活化T细胞可更长时期地作为它们各自靶标的效应细胞。可通过测量例如来自Bcl-2家族的抗凋亡因子像Bclw、Bcl-2、Bcl-xL或Bfl-1的表达水平的增加，分析对T细胞存活的影响(Jones(2000)J.Exp.Med.191：1721)。
因此，形成本发明三聚体多肽构建体的单体的三聚化为本发明构建体的功能所必需。
本文中所用术语“结构域”描述三聚体多肽构建体的单体的亚单位。所述结构域代表由特定技术特征定义的多肽区域，所述特定技术特征为例如，能够特异结合抗原，促进三聚体结构的形成或者将分开的结构域相互连接。
如上文中描述，4-1BBL是II型跨膜蛋白质，其为TNF超家族的成员。已经描述完整或者全长4-1BBL在细胞表面形成同源三聚体。通过4-1BBL胞外结构域的特定基序使得能够形成同源三聚体。所述基序在本文中称作“三聚化区域”。
术语“4-1BBL的胞外结构域”涉及4-1BBL的胞外结构域的特定基序，其使得能够令人惊奇地形成所描述的4-1BBL同源三聚体。因此，该术语涉及(a)4-1BBL的胞外结构域的三聚化区域，即也涉及所述胞外结构域的部分或者片段。本领域中技术人员可以参照所附实施例的教导后容易地确定4-1BBL的胞外结构域的功能部分或者片段。以能够三聚化定义将功能部分或者片段。
如上文描述，4-1BBL是蛋白质家族的一个成员，该家族以TNF命名并且TNF是首要成员。Xiang等(J.Biotech.(1997)53，3-9)已经描述了TNF融合蛋白的构建，该蛋白质由经转染的哺乳动物细胞仅以二聚体形式分泌；见Xiang等中图2。因此，对于在真核细胞中表达的构建体，4-1BBL的胞外结构域的三聚化区域足以三聚化本发明的构建体尤其令人惊奇。
如附属实施例中证明的，令人惊奇地发现仅4-1BBL的胞外结构域的三聚化区域足够使复杂的融合蛋白定量三聚化(没有检测到单体或者二聚体)。现有技术没有公开或预期这一足够的能力。相比，现有技术推测需要额外的三聚化结构域。已经描述了复杂TNF融合构建体中这些额外的三聚化结构域具有三聚化能力的腱生蛋白或者其他肽接头(WO02/22833)。然而，在本发明的构建体中，不需要这种额外的肽接头来诱导本文中所述的复杂4-1BBL融合蛋白的定量三聚体形成。因此，本发明的构建体由三个单体组成，每个单体由2或3个结构域组成，其中所述结构域之一是4-1BBL的胞外结构域。第二或第三个结构域不是并且不含有任何三聚化结构域或者具有多聚化活性的多肽接头。
根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义了表现出与特定抗原或者特定类群的抗原特异相互作用的能力的多肽基序。所述“抗原相互作用位点”与抗原的“相互作用”是特异的并且以不超过10-9M的高结合常数为特征。相反，与抗原的非特异相互作用的特征是≥10-5M的极低结合常数。抗原相互作用位点与其特定抗原的特异相互作用可以导致引发信号，例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等引发信号。所述结合可以由“锁钥原理”的特异性例证。从而，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序和抗原相互结合是由于它们的一级、二级或三级结构以及所述结构的二级修饰的结果。抗原相互作用位点与其特定抗原的特异相互作用也可以导致所述位点和该抗原的简单结合。
抗原相互作用位点与特定抗原的特异相互作用的实例包括配体对其受体的特异性。所述定义尤其包括当与其特定受体结合时诱导信号的配体的相互作用。相应配体的实例包括细胞因子，它与其特定细胞因子-受体相互作用/结合。所述定义还尤其包括抗原相互作用位点与抗原的相互作用，像选择蛋白家族的抗原、整联蛋白和EGF之类的生长因子家族的抗原。所述相互作用的另一实例是抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合位点的相互作用，这一相互作用也特别包含于所述定义。
第二个结构域位于第一个结构域N-末端。因此，在编码本发明的三聚体多肽的单体的核酸分子中，第二个结构域的编码区是第一个结构域编码序列的5’。
根据本发明，术语“肽接头”定义了一种氨基酸序列，通过该序列本发明的三聚体多肽构建体的单体的第一个结构域和第二个结构域相互连接。这种肽接头的基本技术特征是所述肽接头不含有任何多聚化活性。尤其优选的肽接头以氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即(Gly)4Ser)或者其聚合物(即((Gly)4Ser)x)为特征。所述肽接头的特征(包括不能促进二级结构)是本领域公知的并且描述于例如Dall’Acqua等(Biochem.(1998)37，9266-9273)、Cheadle等(Mol Immunol(1992)29，21-30)和Raag与Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)中。尤其优选含有更少氨基酸残基的肽接头。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头优选含有5个，更优选3个，更优选2个，最优选1个氨基酸。在本文所述“肽接头”中，尤其优选的“单个”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可以由单个氨基酸Gly组成。然而，也设想了其他氨基酸。此外，还优选不促进任何二级结构的肽接头。如上文中提到的，本发明的三聚体多肽构建体中所含的单个单体的所述第一个结构域和所述第二个结构域之间也可以不存在接头。
所述结构域相互的连接可以由例如实施例中描述的基因工程提供。制备融合并有效连接的多肽链并在哺乳动物细胞或者细菌中表达的它们的方法是本领域熟知的(例如Sambrook等，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
根据优选实施方案，4-1BBL的完整胞外结构域用作本发明多肽构建体的单个单体中的“三聚化区域”。
4-1BBL的完整胞外结构域包含称作柄区以及TNF同源结构域(THD)的区域，见图1。人4-1BBL的氨基酸序列已经在Goodwin等(Eur.J.Immunol.(1993)23，2631)中描述。在所述氨基酸序列中，柄区相应于氨基酸残基50到91，THD相应于氨基酸残基92到254。另外，还优选三聚化区域仅由4-1BBL的胞外结构域中促进分子三聚化的片段组成。所述片段可以通过适宜的额外肽接头任意连接。
尽管还没有关于4.1BBL切割位点的描述(Bodmer等，TIBS(2002)27(1)，19-26)，为了增加相对于蛋白酶降解(例如4℃保存期间的蛋白酶降解)的稳定性，在柄结构域中引入突变可能是有利的。
根据进一步优选的实施方案，本发明的三聚体肽构建体的抗原相互作用位点至少含有两个与独立的抗原特异相互作用的结构域。
所述本发明优选实施方案涉及含有一个以上具有不同特异性的抗原相互作用位点的三聚体多肽构建体。所述实施方案还包括含有至少两个结构域的三聚体多肽构建体，所述结构域与一个分子的代表独立的抗原决定簇的分离区域特异相互作用。
更优选地，与独立抗原特异相互作用的所述至少两个结构域通过肽接头结合，其中所述肽接头不含有任何多聚化活性。
肽接头在上文中阐明并且在所述说明性实施例中例举。然而，本领域中公知的其他肽接头可以用于本发明的背景中。还优选含有上述肽接头的重复序列基序的肽接头，只要所述重复结构不含有任何多聚化活性。
根据本发明还优选三聚体多肽构建体的所述抗原相互作用位点特并于一种或多种细胞表面标记。本文中所用的术语“细胞表面标记”指存在于细胞表面的分子。所述细胞表面标记的实例为膜和跨膜蛋白质、适合所述蛋白质或者细胞表面的分子，等等。
根据本发明的进一步优选的实施方案，所述细胞表面标记为肿瘤标记。
所述肿瘤标记的实例为TAG72、PSMA、CD44v6、CEA、Her2-neu、Her-3、Her-4、Lewis Y。
在优选实施方案中，本发明的三聚体多肽构建体的单体的第二个结构域的所述抗原相互作用位点含有至少一个结构域，该结构域为抗体来源的区域。
根据本发明，术语“抗体来源的区域”定义了抗体的至少一种片段或者衍生物，其特征在于其能够与表位特异结合并相互作用。优选地，所述抗体来源的区域含有相应于抗体的至少一个可变区或者至少一个超变区(CDR)的多肽序列。
术语“来源于”在上下文中指该区域来源于抗体的结构域并且可能含有置换、缺失、加入、倒置、重复、重组，等等。
此外，如下文中定义的，“来源于”还设想为抗体的衍生物，像单链抗体，优选scFc或者双特异分子，像双特异scFc。
优选地，作为抗体来源区域的一个结构域含有相应于抗体的至少两个可变区的多肽序列。本发明的尤其优选的分子形式提供多肽构建体，其中抗体来源的区域含有一个VH和一个VL区。
抗体来源的区域可以来源于任何哺乳动物物种的抗体。优选地，所述抗体来源的区域来源于大鼠、小鼠或者人抗体。
为本发明的三聚体多肽构建体的单体提供抗原相互作用位点的抗体可以来源于例如，单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、合成抗体、抗体片段或者衍生物，如Fab、Fv或者scFv片段，等等，或者这些抗体中任一种的化学修饰的衍生物。此外，针对上面提到的抗原的抗体或者其片段可以通过利用例如Harlow和Lane《Antibodies，A Laboratory Manual》，CSH Press，Cold Spring Harbor.1988中描述的方法得到。可以从包括人的若干物种得到抗体。当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，用于BIAcore系统中的表面胞质团共振(surface plasmon resonance)可用于增加结合所希望的表位的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如WO89/09622中。在例如EP-A1 0 239 400和WO90/07861中描述了人源化抗体的生产方法。根据本发明利用的另一种抗体来源是所谓的异种抗体。生产异种抗体(例如在小鼠中产生人抗体)的一般原理描述于例如WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735中。
可以使用本领域公知的常规技术进一步修饰本发明使用的抗体或者它们的相应免疫球蛋白链，例如单独或者联合使用氨基酸缺失、插入、置换、加入、和/或重组和/或本领域公知的任何其他修饰。在编码免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中引入这种修饰的方法是本领域技术人员熟知的；例如，见Sambrook，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所述修饰优选在核酸水平上进行。
在本发明进一步优选的实施方案中，在三聚体多肽构建体的单体第二个结构域的所述抗原相互作用位点至少含有两个抗体来源的区域。
该实施方案包括例如，具有针对两种不同表位的两种不同抗体的特异性的多肽构建体。相应的肽构建体描述于所附实施例。
尤其优选含有双特异性scFv构建体作为抗原相互作用位点的构建体。
本发明的三聚体多肽构建体可以是其中所述抗原相互作用位点含有B7家族成员的胞外结构域或者其片段或者衍生物的构建体，所述包外结构域或其片段或衍生物能够结合BT家族成员特异的受体。
B7家族是一组共刺激分子。所述家族的成员的实例以及相应特异受体描述于例如Coyle和Gutierrez-Ramos(Nature immunology(2001)2(3)；203-209)中。
本文中所用术语B7家族成员的“片段或衍生物”指来源于B7家族成员的胞外部分的多肽，或者二级修饰的多肽，所述多肽能够特异结合它们所来源的B7家族的成员特异结合的受体。
根据本发明，三聚体多肽构建体为其中所述抗原相互作用位点选自scFv、Fab和单个Ig可变区的构建体。
设想可以作为抗原相互作用位点的抗体来源区域优选是嵌合抗体、完整人抗体或者可以任选被人源化的非人来源的抗体、CDR嫁接或者去免疫的抗体。
抗原相互作用位点中的scFv构建体可以选自对EpCAM、NKG2D、CD19、PSMA、MCSP、stn(TAG72)、CD44v6、碳酸酐酶IX(CAIX)、CEA、EGFR、CD33、Wue-1、CD3、Muc-1、CD20、Her2-neu、Her3、Her4和Lewis-Y特异的scFv。
如上文中提到的，还优选本发明的三聚体多肽构建体含有这样的单体，其特征是抗原相互作用位点为双特异性scFv。因此，还设想抗原相互作用位点可以与两种不同的抗原结合/相互作用或者检测两种不同的抗原。类似地，所述抗原相互作用位点可以含有一个scFv和另一个抗原相互作用位点，例如B7家族成员或其片段或衍生物。相应的实施方案在下文和所附实施例中阐明。
以上涉及的B7家族成员或者其片段或衍生物可以选自B7.1、B7.2、B7-H3、B7-RP1、B7-DC、PDL1和PDL2。
B7.1、B7.2、B7-RP1、B7-DC、PDL1和PDL2的特异受体在Coyle和Gutierrez-Ramos(Nature immunology(2001)2(3)；203-209)中公开并且为CD28(B7.1/B7.2)、CTLA-4(B7.1/B7.2)、ICOS(B7RP-1)和PD-1(PD-L1/PD-L2)。
在本发明的尤其优选的实施方案中，每个单体的所述第二个结构域含有对EpCAM特异的scFv或者如上文中说明的若干(例如两个)抗原相互作用位点，其中所述位点之一为对EpCAM特异的scFv。表位EpCAM以前已经在例如Raum等，2001，Cancer Immunol Immunother.50(3)，141-150中有所描述。
在本发明的另一优选的实施方案中，形成三聚体多肽构建体的每个单体具有如SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列。
具有如SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列的单体由如SEQ ID NO：19中所示的核酸分子编码。如下文中详细描述的，本发明的优选实施方案涉及编码所述单体的核酸分子，以及编码其单体功能变体的核酸分子。
就本发明而言，注意到不仅设想“同源三聚体构建体”，还设想“异源三聚体构建体”，其在下文中描述。因此，术语“每个单体的所述第二个结构域”不限于由三个相同的单体组成的三聚体多肽构建体。因此，本文中描述的单体还可以组合成“异源三聚体多肽构建体”并且被本发明所设想。
术语三聚体多肽构建体的单体的“功能变体”在本发明山下文中描述能够如上面详细公开的三聚化并且能够通过其抗原相互作用位点与特定抗原结合/相互作用的单体。
如本文中描述的，这里令人惊奇地发现仅三聚化构建体能够激活持久/长期T细胞应答。术语“持久T细胞应答”指已经通过TCR或者TCR样信号加上足够的共同刺激引发的T细胞。所述T细胞由于例如防止了活化诱导的细胞死亡而延长了存活。结果，活化T细胞可用于长期作用于它们的各自靶标的效应细胞。可通过测量例如来自Bcl-2家族的抗凋亡因子(如Bclw、Bcl-2、Bcl-xL或Bfl-1)的表达水平的增加，来分析对T细胞存活的影响(Jones(2000)J.Exp.Med.191：1721)。
功能变体表现出对相同抗原表位的抗原相互作用位点的相同特异性，尽管所述功能变体的具体氨基酸序列不同。因此，所述单体的功能变体由与具体所指的核酸分子的序列不同的核酸序列编码。
在本发明另一特别优选的实施方案中包含单克隆抗体237的scFv。
如本领域中公知的，单克隆抗体检测鼠肉瘤细胞系的表面标记或者与其相互作用。该标记为肿瘤特异的细胞表面抗原(PW237抗体，发表于Ward等，1989，J.Exp.Med.卷170，217-232)。相应的三聚体多肽构建体可以具有如SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。
具有如SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的单体可以由如SEQ IDNO：7中所示的核酸分子编码。本发明还包括编码所述单体的核酸分子，以及编码所述单体的功能变体的核酸分子。
含有scFv抗-237-鼠4-1BBL的该优选的三聚体多肽构建体可以用于小鼠模型系统中定量所引发的持久T细胞应答。将小鼠用致瘤性细胞攻击，所述致瘤性细胞在体外培养并且在它们的表面表达237抗原。通过使用在小鼠中进行肿瘤攻击的相应细胞，进行随后注射scFv抗-237-鼠4-1BBL，并可通过本领域中公知的方法测量对肿瘤生长的影响。
如实施例中阐明的，所述来源于单克隆抗体237的scFv可以与其他/另一抗原相互作用位点(如另一种scFv)组合。还设想了其他组合。因此，本发明还提供如本文定义的其它三聚体构建体，其中每种或至少一种单体含有若干，优选两种scFv，如对EpCAM特异的scFv和对NKG2D特异的scFv。
NKG2D分子在Baur等(Science(1999)285，727-729)中详细描述。
本发明三聚体多肽构建体的相应单体可具有如SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列。
具有如SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列的单体可以由如SEQ IDNO：17中所示的核酸分子编码。本发明还包括编码所述单体的核酸分子，以及编码所述单体的功能变体的核酸分子。
如本文中提到的，在尤其优选的实施方案中，本发明提供了三聚体多肽构建体，其含有至少一个、优选两个或最优选三个单体具有“第二结构域”(即作为抗原相互作用位点)，构建体为双特异性构建体。最优选含有两个scFv或者一个scFv和一个B7家族的成员(或者其部分或片段)。附带了这种构建体的相应实例。
在本发明的备选的特别优选的实施方案中，每个单体含有双特异性scFv构建体，其中所述双特异性scFv构建体的至少一种特异性为对CD3特异。
在这种单体中，所示对CD3特异的scFv具有如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列。
具有如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列的单体可以由SEQ IDNO：21中所示的核酸分子编码。本发明还包括编码所述单体的核酸分子，以及编码所述单体的功能变体的核酸分子。
本发明三聚体构建体的单体的第二个结构域也可以含有对EpCAM特异的scFv和抗原相互作用位点，所述位点是B7.1的胞外结构域或者其片段或者衍生物，其能够结合它的特异受体，即CD28或者CTLA-4。
这种单体可以具有如SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列并且可以由SEQ ID NO：15中所示核酸分子编码。本发明还包括编码所述单体的核酸分子，以及编码所述单体的功能变体的核酸分子。
根据本发明，设想三聚体多肽构建体由至少两种不同的单体组成，其中所述不同单体的特征在于不同的抗原相互作用位点。如上面所指出的，术语“每种单体的第二个结构域”不限于含有相同单体的三聚体多肽构建体，即“同源三聚体构建体”。还设想“异源三聚体构建体”，其中至少一种单体与所述三聚体多肽构建体中所含的其他单体不同。例如，可能三个单体含有不同的抗原相互作用位点和/或仅一个单体含有额外的标签或标记，如HIS-标签。
因此，本发明还提供了通过两种或三种不同的单体形成的三聚体多肽构建体。认为这种构建体是异源三聚体或者异源三聚体构建体。最优选异源三聚体含有这样的单体，其具有或者含有促进所述单体三聚化的第一结构域，其中优选所述三种单体的所述第一结构域相同。然而，在本发明的异源构建体的优选实施方案中，在三聚体多肽构建体的单个单体中设想不同的第二结构域，即，抗原相互作用位点。
此外，根据所述实施方案，两种或三种不同的单体可以通过它们的不同的第二结构域区别。所述第二结构域可以由对一种或多种分子的不同抗原或抗原决定簇具有特异性的一个或多个抗原相互作用位点组成。
优选地，本发明的异源三聚体多肽构建体可以由至少一个具有靶细胞抗原作用位点的单体和至少一个具有对效应细胞上活化分子特异性的抗原相互作用位点的单体组成。
设想三聚体多肽构建体的至少一个单体还含有标签。术语“标签”是本领域中技术人员公知的并且指一种标记，通过其可以鉴定含有标记的多肽。所述标签可以选自：His-标签、Flag-标签、Myc-标签、HA-标签、GST-标签、T100TM、VSV-G、V5、S-标签TM、HSV、CFP、RFP、YFP、GFP、BFP、纤维素结合结构域(CBD)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、NusA-标签、硫氧还蛋白(Trx)、DsbA、DabC和生物素化序列。
最优选地，所述标签为在至少一种单体的C-末端的His-标签。
如上文中提到的，本发明的三聚体多肽构建体优选在真核表达系统中表达。
在下文中详细描述真核表达系统。
本发明还提供了编码本发明三聚体多肽构建体的单体的核酸分子。
从而，本发明涉及含有选自如下核苷酸序列的核酸分子：
(a)编码含有本发明三聚体多肽构建体的单体氨基酸序列，优选如SEQ ID No：20、8、18、22和16中给出的氨基酸序列的蛋白质的成熟形式的核苷酸序列；
(b)含有如SEQ ID No：19、7、17、21和15中给出的DNA序列或者由该序列组成的核苷酸序列；
(c)在严格杂交条件下与如(b)中定义的核苷酸序列的互补链杂交的核苷酸序列；
(d)对通过核苷酸序列(a)或(b)编码的氨基酸序列置换、缺失和/或加入一个或几个氨基酸而衍生的蛋白质的核苷酸编码序列；
(e)编码其氨基酸序列与核苷酸序列(a)或(b)编码的氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸的蛋白质的核苷酸序列；
(f)由于(a)到(e)任一的核苷酸序列的遗传密码简并产生的核苷酸序列。
术语“蛋白质的成熟形式”在本发明的上下文中定义了从其相应mRNA翻译并且任选随后修饰的蛋白质。
本文中所用术语“杂交”指能够与本发明的多核苷酸或者其部分杂交的多核苷酸。因此，所述多核苷酸可根据它们各自的大小分别用作RNA或者DNA制品的RNA或者DNA印迹分析中的探针，或者用作PCR分析中的寡核苷酸引物。优选地，所述杂交多核苷酸具有至少10个，更优选至少15个多核苷酸的长度，而将用作探针的本发明杂交多核苷酸优选具有至少100，更优选至少200，最优选至少500个核苷酸的长度。
本领域中熟知怎样用核酸分子实施杂交实验，即本领域技术人员知道根据本发明使用什么杂交条件。在标准教科书，如《Molecular Cloning ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.中涉及这些杂交条件。根据本发明优选在严格杂交条件下能够与本发明的多核苷酸或者其部分杂交的多核苷酸。
“严格杂交条件”即指在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性、剪切的鲑精DNA的溶液中于42℃过夜孵育，然后在0.1×SSC中约65℃下洗涤滤膜。还考虑了在较低严格杂交条件下与本发明的多核苷酸杂交的核酸分子。主要通过控制甲酰胺浓度(较低百分比的甲酰胺导致较低的严格性)、盐浓度或者温度改变杂交和信号检测严格性。例如，较低严格杂交条件包括在含有6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2MNaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA的溶液中于37℃过夜孵育，然后用1×SSPE，0.1％SDS在50℃洗涤。此外，为了实现甚至更低的严格性，可以在更高盐浓度(例如5×SSC)下进行严格杂交后的洗涤。值得注意的是，可通过包括和/或替换用于抑制杂交实验中背景的封闭试剂改变上面的条件。典型的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA、和通过商业途径可以得到的专利制剂。由于相容性问题，包括特定封闭试剂可能需要修饰上述杂交条件。
本发明的核酸分子可以是例如DNA、cDNA、RNA或者合成产生的DNA或者RNA或者重组产生的嵌合核酸分子，其单独或者组合含有这些多核苷酸的任一种。
本发明还提供了含有上面定义的本发明核酸分子的载体。
许多适宜的载体是分子生物学中技术人员公知的，载体的选择将取决于所需的功能，并且包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程中常规使用的其他载体。本领域中技术人员熟知的方法可用于构建不同的质粒和载体；例如，见Sambrook，《Molecular Cloning A Laboratory Manual》，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，《Current Protocols inMolecular Biology》，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)，(1994)中描述的技术。另外，可以将本发明的多核苷酸和载体重构到脂质体中以递送到靶细胞。如下文中详细讨论的，用克隆载体分离单独的DNA序列。当表达特定多肽需要时，可以将相关序列转移到表达载体。常见的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。常见的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
所述载体中含有的核酸分子是DNA。
设想本发明的载体为表达载体，其中编码本发明的三聚体多肽构建体的单体的核酸分子与一种或多种控制序列有效连接，所述控制序列允许在原核和/或真核宿主中转录和任选地表达。术语“控制序列”指调节性DNA序列，其对于它们所连接的编码序列的表达是必需的。这些控制序列的性质根据宿主生物而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点、和终止子。在真核生物中，通常的控制序列包括启动子、终止子，和在某些情况中的增强子、反式激活蛋白或者转录因子。术语“控制序列”旨在包括至少表达所必需的所有组分，并且还可包括额外的有利组分。
术语“有效连接的”指并列，其中所描述的组分处于能够以设想的方式发挥功能的关系中。与编码序列“有效连接”的控制序列以在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。对于控制序列为启动子的情况，技术人员显然优选使用双链核酸。因此，本发明载体优选为表达载体。“表达载体”为可以用于转化所选宿主并且在所选宿主中提供编码序列的表达的构建体。表达载体可为例如克隆载体、二元载体(binary vector)或者整合载体。表达包括核酸分子转录成可翻译的mRNA。确保在原核和/或真核细胞中表达的调节元件是本领域中技术人员熟知的。对于真核细胞的情况，通常包括确保转录起始的启动子和任选确保转录终止和转录物稳定的聚腺苷酸信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括：例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例为酵母中的AOX1或GAL1启动子或者CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或者哺乳动物和其他动物细胞中的珠蛋白内含子。
除了负责转录启始的元件外，这些调节元件还可以包括转录终止信号，如多核苷酸下游的SV40-聚腺苷酸位点或者tk-聚腺苷酸位点。此外，根据所用的表达系统，可以将能够指导多肽到达细胞区室或者分泌到培养基的前导序加入到本发明多核苷酸的编码序列中并且前导序列是本领域熟知的；也见例如所附实施例。前导序列与翻译、起始和终止序列协调地装配并且优选为能够将所翻译的蛋白质或者其部分导入周质间隙或者胞外培养基的前导序列。任选地，异源序列可以编码包括N-末端识别肽(identification peptide)的融合蛋白，所述N-末端识别肽赋予所希望的特征，例如，稳定或者简化所表达的重组产物的纯化；见上文。在本文中，适宜的表达载体是本领域中公知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等，Cancer ImmunolImmunother(2001)50(3)，141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
优选地，表达控制序列将是能够转化转染的真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但是也可以使用原核宿主的控制序列。一旦载体整合入适宜的宿主，宿主保持在适于所述核苷酸序列高水平表达的条件下，并且如果需要，可以随后收集和纯化本发明的多肽；例如见所附实施例。
可用于表达细胞周期相互作用蛋白质的另一表达系统是昆虫系统。在一种这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa Californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或者Trichoplusia幼虫中表达外源基因。可以将本发明的核酸分子的编码序列克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于多角体蛋白启动子的控制下。所述编码序列的成功插入将使得多角体蛋白基因失活并且产生缺少外壳蛋白包被的重组病毒。然后用该重组病毒感染草地夜蛾细胞或者Trichoplusia幼虫，在其中表达本发明的蛋白质(Smith，J.Virol.46(1983)，584；Engelhard，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91(1994)，3224-3227)。
额外的调节元件可以包括转录以及翻译增强子。有利的是，本发明的上述载体含有选择和/或评分标记。
用于选择转化细胞和，例如植物组织和植物的选择标记基因是本领域技术人员熟知的，并且包括：例如以抗代谢物抗性作为选择基础的dhfr，其赋予氨甲蝶呤抗性(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994)，143-149)；npt，其赋予氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和paromycin抗性(Herrera-Estrella，EMBO J.2(1983)，987-995)；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Marsh，Gene 32(1984)，481-485)。已经描述了额外的可选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂(2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸)抗性，DFMO(McConlogue，1987，In：《Current Communications in Molecular Biology》，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)或者来自土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶，其赋予杀稻瘟菌素S抗性(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)，2336-2338)。
可用的评分标记是本领域中技术人员公知的并且可通过商业途径得到。有利的是，所述标记是编码萤光素酶(Giacomin，Pl. Sci.116(1996)，59-72；Scikantha，J.Bact.178(1996)，121)、绿色荧光蛋白(Gerdes，FEBSLett.389(1996)，44-47)，或者β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson，EMBO J.6(1987)，3901-3907)的基因。该实施方案尤其可用于含有本发明的细胞、组织和生物的简单和快速筛选。
如上文所述，可单独或者作为在细胞中表达本发明的多肽的载体部分使用本发明的核酸分子，用于例如基因治疗。将含有编码上述任一种三聚体多肽构建体的DNA序列的核酸分子或载体导入细胞中，该细胞又产生目的多肽。基于将治疗基因通过先体外后体内或体内技术导入细胞的基因治疗是基因转移最重要的应用之一。体外或者体内基因治疗的适当载体方法或者基因递送系统在文献中有所描述并且是本领域中技术人员公知的；例如见：Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813；Verma，Nature389(1994)，239；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodera，Blood 91(1998)，30-36；Verma，Gene Ther.5(1998)，692-699；Nabel，Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997)，289-292；Verzeletti，Hum.Gene Ther.9(1998)，2243-51；Wang，Nature Medicine 2(1996)，714-716；WO94/29469、WO97/00957、US5,580,859、US5,589,466或Schaper，Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，635-640。可以设计将本发明的核酸分子和载体直接导入细胞或者通过脂质体，或者病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒)导入细胞。优选所述细胞为生殖系细胞、胚胎细胞、或者卵细胞或者从其衍生的细胞，最优选所述细胞为干细胞。胚胎干细胞的实例可以为如在Nagy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，8424-8428中描述的干细胞。
根据上文，本发明涉及载体，特别是基因工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，它们含有编码本发明三聚体多肽构建体的单体的核酸分子。优选所述载体为表达载体和/或基因转移或寻靶载体。来源于病毒(如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或者牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或者载体递送到靶细胞群。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建重组载体；例如见：Sambrook，MolecularCloning：《A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，《Current Protocols in Molecular Biology》，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)中描述的技术。另外，本发明的核酸分子和载体可以重构到脂质体以递送到靶细胞。含有本发明核酸分子的载体可以通过熟知方法转移到宿主细胞，所述方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理或者电穿孔可用于其他细胞宿主；见Sambrook，前文。本发明的载体可以是pEF-DHFR或pEF-ADA。已经在文献，例如Mack等(PNAS(1995)92，7021-7025)和Raum等(Cancer Immunol Immunother(2001)50(3)，141-150)中描述了载体pEF-DHFR和pEF-ADA。
本发明还涉及含有至少一种载体或者本发明的至少一种核酸分子的宿主。
通过将所述至少一种载体或者至少一种核酸分子导入宿主可以产生所述宿主。所述至少一种载体或者至少一种核酸分子在宿主中的存在可以介导编码本发明的三聚体多肽构建体的单体的基因的表达。
存在于宿主中的本发明的核酸分子或者载体可以整合到宿主基因组或者可以保持在染色体外。
宿主可以是任何原核或真核细胞。
术语“原核生物”包括可以用DNA或者RNA分子转化或转染以表达本发明蛋白质的所有细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌、S.typhimurium、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核生物的”包括酵母、高等植物、昆虫和优选哺乳动物细胞。根据用于重组生产方法中的宿主，本发明多核苷酸编码的蛋白质可能是糖基化或者非糖基化的。尤其优选使用含有本发明多肽的编码序列并遗传融合有N-末端FLAG-标签和/或C-末端His-标签的质粒或者病毒。优选地，所述FLAG-标签的长度为约4到8个氨基酸，最优选8个氨基酸。本发明的多核苷酸可用于使用本领域技术人员公知的任何技术转化或转染宿主。此外，制备融合的、有效连接的基因并将它们在例如哺乳动物细胞和细菌中表达的方法是本领域熟知的(Sambrook，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在优选实施方案中，宿主为细菌、昆虫、真菌、植物或者动物细胞。
优选地，设想本发明的宿主可以是哺乳动物细胞，更优选人细胞或者人细胞系。尤其优选的宿主细胞包括CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞系，像SP2/0或者NS/0。
本发明另选的实施方案涉及生产本发明的三聚体多肽构建体的方法，所述方法包括在允许表达多肽构建体的条件下培养本发明宿主并从培养物回收所产生的多肽构建体。
所转化的宿主可以在发酵罐中生长并且根据本领域中公知的技术培养以实现最优细胞生长。然后可以从生长培养基、细胞裂解物、或者细胞膜碎片分离本发明的多肽。例如，微生物表达的本发明多肽的分离和纯化可以通过任何常规方法，例如，制备层析分离和免疫学分离(如包括使用针对如本发明多肽标签的单克隆或多克隆抗体)的方法，或者如所附实施例中描述的方法。
本领域中公知允许表达的宿主培养条件取决于宿主系统和方法使用的表达系统/载体。为了实现允许重组多肽表达的条件而修饰的参数是本领域中公知的。从而，本领域中技术人员不用进一步的发明性输入就可以确定适宜的条件。
一旦表达，可以根据本领域中的标准方法纯化本发明的多肽构建体，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等；见，Scopes，″Protein Purification″，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。对于药物用途，优选至少约90到95％均一性的基本上纯的多肽，最优选98到99％或以上的均一性。一旦部分纯化或纯化到如所希望的均一性，可以将多肽用于治疗(包括体外)或者开发和实施测定方法。此外，在所附实施例中详细描述了从培养物回收本发明的三聚体多肽构建体的方法的实例。
优选地，本发明方法中的表达导致三聚化率为至少90％，并从培养物回收所产生的多肽构建体。更优选地，三聚化率为至少95％，最优选至少99％。
测定肽的三聚化率的方法是本领域中公知的。适宜方法的一个实例具体在所附实施例1中描述并且在图6中描绘了这种测定的结果。
本发明还提供了含有本发明三聚体多肽构建体的组合物、通过本发明的方法产生的三聚体多肽构建体、本发明的核酸分子、本发明的载体或者本发明的宿主，任选地，能够提供免疫效应细胞的活化信号的蛋白质化合物。
根据本发明，所述提供免疫效应细胞活化信号的“蛋白质化合物”可以是例如，T细胞的初次活化信号。蛋白质化合物的优选形式包含双特异性抗体和其片段或者衍生物，例如双特异性scFv。优选地，所述T细胞的初次活化信号可以通过T细胞受体(TCR)提供，更优选通过TCR的CD3分子提供。蛋白质化合物可以含有(但不限于)对CD3特异的scFv片段、对T细胞受体特异的scFv片段或者超级抗原。超级抗原以独立于MHC的方式直接结合到T细胞受体可变区的某些亚族，从而介导初次T细胞活化信号。蛋白质化合物可以还提供非T细胞的免疫效应细胞活化信号。非T细胞的免疫效应细胞的实例包括B细胞和NK细胞。
本发明还涉及组合物，其为含有前面提到的本发明的三聚体肽构建体、核酸分子、载体或者宿主和(任选地)所描述的能够提供免疫效应细胞活化信号的蛋白质化合物的药物组合物。
本发明的组合物(其为药物组合物)可以与上面定义的能够提供免疫效应细胞活化信号的蛋白质化合物同时或者非同时施用。
本发明组合物(其为药物组合物)的另一优选实施方案还包括载体、稳定剂和/或赋形剂的适宜制剂。
适宜的药物载体的实例是本领域中熟知的并且包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂，如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液剂，等等。可以通过熟知的常规方法配制含有这些载体的组合物。这些药物组合物可以以适宜的剂量施用于受试者。适宜组合物的施用可以通过不同方法实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或皮内施用。通过主治医生和临床因素确定剂量方案。如医学领域中熟知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、所施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况和同时施用的其他药物。通常，药物组合物的常规施用方案应该在每天1μg到10mg单位的范围内。如果方案为连续灌输，其应该在1μg到10mg单位/千克体重/分钟范围内。然而，连续灌输的更优选的剂量为0.01μg到10mg单位/千克体重/小时范围内。尤其优选的剂量在下文中陈述。可以通过定期评估监测进展。剂量将变化但是优选的DNA静脉内施用剂量为约106到1012拷贝DNA分子。本发明的组合物可以局部或者全身性施用。施用将通常是肠胃外，例如静脉内；还可以将DNA直接施用于靶位点，例如通过生物射弹递送到内部或外部靶位点或者通过导管递送到动脉内部位。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳剂。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇性/水性溶液剂、乳剂或悬浮剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、Ringer氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸Ringer氏，或者固定油类。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于Ringer氏右旋糖的那些)等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。此外，本发明的药物组合物可以含有蛋白质载体，例如血清白蛋白或者免疫球蛋白，它们优选来源于人。此外，设想本发明的药物组合物还可含有生物活性剂，这取决于该药物组合物的计划用途。这些活性剂可以是作用于胃肠道系统的药物、作为细胞抑制剂的药物、防止高尿酸血的药物和/或诸如本领域中公知的T细胞共刺激分子或者细胞因子之类的试剂。
本发明的三聚体构建体施用的可能的适应症为肿瘤疾病，特别是上皮癌，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌或者肺癌或者其他肿瘤疾病，如血液肿瘤、神经胶质瘤、肉瘤或者骨肉瘤。本发明构建体的施用尤其适用于最小残留疾病，其特征在于单个细胞存活导致的肿瘤局部和非局部复发。最小残留疾病的常规治疗(如辅助化学疗法)的问题是仅消灭分裂的细胞。因此，单个肿瘤细胞可以以静息/无变应性状态存活，并且以后可以形成新的生长肿瘤。此外，本发明构建体施用的其他可能的适应症可以包括自身免疫疾病(特别是T细胞介导的自身免疫疾病)、炎性疾病(抗原特异的T细胞活化)、传染病，特别是细菌和真菌感染、病毒疾病(治疗长期疫苗)、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病、移植体排斥。
本发明还设想与其他化合物的共同施用方案，这些化合物例如双特异性抗体构建体、定向毒素或者通过T细胞作用的其他化合物。共同施用本发明化合物的临床方案可以包括施用其他组分同时、之前或之后共同施用。
还可以修饰或者衍生本发明的三聚体构建体。相应的修饰可以包括使用重组DNA技术提高本发明构建体或者它们的单体的结合特异性、亲和力、半寿期等等。还设想减小构建体可能的残留抗原性。
在体内模型(如小鼠)中阐明本发明构建体的功效/活性的可能方法。适宜的模型可以是Ag104A(骨肉瘤)小鼠模型(该细胞系在Wick等，J.Exp.Med.186(2)，7月21日，1997229-238页中描述)。Ag104A是一种鼠纤维肉瘤细胞系，其展示出肿瘤特异的细胞表面抗原(Ward等，1989，J.Exp.Med.卷170，217-232中发表的PW237抗体)。该小鼠模型可用于体内测试受转染的Ag104A细胞肿瘤退化。这种实验可设计来通过背部的皮下注射刺攻击C3H/HeN MMTV-小鼠。
如这里详细描述的，本发明的药物组合物可施用于需要医疗介入的患者(优选人类患者)。药物组合物可以单独或者与其他药物/药物组合物组合施用。这些其他药物/药物组合物可以与本发明的药物组合物同时或者非同时施用。
另外，在优选实施方案中，本发明涉及含有任选地检测手段和方法的诊断组合物。
本发明的另一备选实施方案涉及本发明的或通过本发明方法产生的三聚体多肽构建体、本发明的核酸分子、本发明的载体或者本发明的宿主的用途，用于预防、治疗或者减轻增殖性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫学紊乱、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主疾病或者宿主抗移植物疾病。
其他优选的所述肿瘤疾病为上皮癌或者最小残留癌。
本发明设想使用标准载体和/或基因递送系统和任选可药用载体或者赋形剂，单独或者以任何组合施用本发明的多种三聚体多肽构建体、核酸分子和载体。施用后，所述核酸分子或者载体可以稳定整合到受试者的基因组中。
另一方面，可以使用对某些细胞或组织特异或者坚持存在于所述细胞中的病毒载体。适宜的药物载体和赋形剂是本领域中熟知的。根据本发明制备的药物组合物可以用于预防或治疗或延缓上面鉴定的疾病。
此外，可以在基因治疗中使用含有本发明核酸分子或者载体的本发明药物组合物。适宜的基因递送系统可以包括脂质体、受体介导的递送系统、裸DNA和病毒载体，如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等等。还可以使用biolistic递送系统，如Williams(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)，2726-2729)所描述的递送系统将核酸递送到身体的特定部位用于基因治疗。递送核酸的其他方法包括微粒介导的基因转移，例如，Verma，Gene Ther.15(1998)，692-699中所描述的。
此外，本发明涉及预防、治疗、改善增殖性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫学失调、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主疾病或者宿主抗移植物疾病的方法，其包括对需要这种预防、治疗或改善的受试者施用本发明的或者通过本发明方法产生的三聚体多肽构建体、本发明核酸分子、本发明载体或者本发明宿主的步骤。
优选所述肿瘤疾病为上皮癌或者最小残留癌。这些上皮癌为例如乳腺癌和其他腺癌，其特征在于下面的细胞表面分子的过表达：Her-2(Arteaga，Semin Oncol 2002 Jun；29(3 Suppl 11)：4-10；Wester，Acta Oncol2002；41(3)：282-8)、EpCAM(Naundorf，Int J Cancer 2002 Jul1；100(1)：101-10)、EGFR(Liu，Br J Cancer 2000 Jun；82(12)：1991-9)、CEA(Stewart，Cancer Immunol Immunother 1999 Feb；47(6)：299-306；Durbin，Proc Natl Acad Sci USA 1994 May 10；91(10)：4313-7)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白＝＞sTn抗原)(Kashmiri，Crit Rev Oncol Hematol 2001Apr；38(1)：3-16)、MUC-1(黏蛋白)(Couto，Adv Exp Med Biol1994；353：55-9)、Sonic Hedgehog(Shh)(Lacour，Br J Dermatol 2002Apr；146 Suppl 61：17-9；Tojo，Br J Dermatol 2002 Jan；146(1)：69-73)。其他上皮癌为鳞状上皮细胞癌(如头颈癌)，其特征在于下面分子的过表达：EGFR(Bonner，Semin Radiat Oncol 2002 July；12：11-20；Kiyota，Oncology 2002；63(1)：92-8)、CD44v6(Rodrigo，Am J Clin Pathol 2002Jul；118(1)：67-72；Fonseca，J Surg Oncol 2001 Feb；76(2)：115-20)，前列腺癌，其特征在于下面分子的过表达：PSMA(Fracasso，Prostate 2002 Sep15；53(1)：9-23)、STEAP(Hubert，Proc Natl Acad Sci USA 1999 Dec7；96(25)：14523-8)、PSCA(前列腺干细胞抗原)(Jalkut，Curr Opin Urol2002 Sep；12(5)：401-6)。SCLC(小细胞肺癌)，其特征在于神经节苷脂GD3的过表达(Brezicka，Lung Cancer 2000 Apr；28(1)：29-36；Sheperd，SeminOncol 2001 Apr；28(2Suppl4)：30-7)，卵巢癌，其特征在于mesothelin表达(Scholler，Proc Natl Acad Sci USA 1999 Sep 28；96(20)：11531-6；Brinkmann，Int J Cancer 1997 May 16；71(4)：638-44)，CA-125表达(Hogdall，Anticancer Res 2002 May-Jun；22(3)：1765-8)，Muellerian抑制物(MIS)II型受体表达(Stephen，Clin Cancer Res 2002 Aug；8(8)：2640-6)，胃癌，其特征在于E-钙黏着蛋白新表位的表达(Becker，Surg Oncol 2000Jul；9(1)：5-11)，结肠癌，其特征在于Lewis-Y的表达(Flieger，Clin ExpImmunol 2001 Jan；123(1)：9-14；Power，Cancer Immunol Immunother 2001Jul；50(5)：241-50)和A33抗原表达(Heath，Proc Natl Acad Sci USA 1997Jan 21；94(2)：469-74)，肾细胞癌，其特征在于碳酸酐酶IX(MN/CA IX)的表达(Uemura，Br J Cancer 1999 Oct；81(4)：741-6)，宫颈癌，其特征在于碳酸酐酶IX(MN/CA IX)的表达(Longcaster，Cancer Res 2001 Sep1；61(17)：6394-9)，胰腺癌，其特征在于CA19-9标记的表达(Brockmann，Anticancer Res 2000 Nov-Dec；20(6D)：4941-7)。此外，有许多上皮癌，它们的特征在于Lewis-Y的表达(Power，Cancer Immunol Immunother 2001Jul；50(5)：241-50)。
通过本发明预防、治疗或改善的最小残留疾病为例如，转移病，其特征在于CD44v6的表达(Rodrigo，Am J Clin Pathol 2002 Jul；118(1)：67-72；Fonseca，J Surg Oncol 2001 Feb；76(2)：115-20)。
还优选所提及的受试者为人。
本发明预防、治疗或改善方法可包括对受试者共同施用上面定义的能够为免疫效应细胞提供活化信号的蛋白质化合物。共同施用可以是同时共同施用或者非同时共同施用。
最后，本发明涉及试剂盒，其含有本发明的或者通过本发明方法产生的三聚体多肽构建体、本发明核酸分子、本发明载体或者本发明宿主。还设想本发明的试剂盒含有如上面描述的药物组合物，其单独或者与其他药物组合施用于需要药物治疗或介入的患者。
附图简述
图1：
4-1BBL结构与TNFα前体蛋白质的结构比较的示意图。
ECD＝胞外结构域；THD＝TNF同源结构域；柄＝柄区；aa＝氨基酸。箭头表示肿瘤坏死因子α(TNFα)转换酶(TACE)的蛋白质水解切割位点。点线指向单个氨基酸位置，之字型线代表跨膜结构域。
图2：
系统树分析。(A)Treetop程序计算序列之间的成对距离并给出“自展”值，其暗示树的可再现性。100为最大值。任何更小的值表示再现性的百分数。拓扑学算法使用拓扑学相似原理(Chumakov & Yushmanov，1988，Mol Genet Microbiol Virusol 3，3-9；Yushmanov & Chumakov，1988，MolGenet Microbiol Virusol 3，9-15；Brodsky等，1992，Dimacs 8，127-139；Brodsky等，1995，Biochemistry，923-928)。(B)无根树。
图3：
序列scFv抗-237x鼠4-1BB配体构建体。A)核苷酸序列，B)蛋白质序列，C)构建体的示意图。
图4：
scFv 237x鼠4.1.BBL从SP Sepharose阳离子交换柱上的洗脱模式。用50％缓冲液B1洗脱的蛋白质峰用于进一步纯化。
图5：
来自Ni-螯合His Trap柱的含有scFv抗-237x鼠4-1BBL的蛋白质级分的洗脱模式。绿色线表示含有0.5M咪唑的洗脱缓冲液的理论梯度。来自100％缓冲液B2洗脱步骤的蛋白质级分用于进一步纯化。
图6：
来自Sephadex S200凝胶过滤柱的scFv抗-237x鼠4-1BBL构建体的蛋白质洗脱模式(蓝色线)。蛋白质在约67ml以单峰洗脱并相应于约150kD分子量。在约58ml可以观察到具有较高分子量的小峰肩。单体在83.2ml处蛋白质峰洗脱并且相应于分子量约54kD。
图7：
含有纯化的scFv抗-237x鼠4-1BBL的蛋白质级分的SDS-PAGE分析。将SDS-PAGE用胶体考马斯染色。泳道1：MultiMark分子量标准；泳道2和3：主要峰和肩凝胶过滤级分。
图8：
纯化的scFv抗-237x鼠4-1BBL蛋白质级分的蛋白质印迹分析。将蛋白质印迹与Penta His抗体和碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体孵育。着色剂为BCIP/NBT液体。泳道1：分子量标准；泳道2和3：主要峰和肩凝胶过滤级分。约50kD的主要带含有＞90％的纯化蛋白质。约100kD的小带相应于237scFv x 4.1.BBL的二聚体形式并且是由于超载凝胶。33kD的小带为蛋白质水解切割的片段。
图9：
scFv抗-237x鼠4-1BBL构建体对AG104A细胞系的FACS结合分析。如实施例1第4段中的描述实施FACS染色。填充的直方图代表仅与抗-his抗体和第二步试剂孵育的细胞。开放直方图显示了与构建体、抗-his抗体和第二步抗体孵育的细胞。
图10：
scFv抗-237x鼠4-1BBL构建体的mu4-1BB配体部分结合AG104A细胞的FACS分析。如实施例1第5段中的描述实施FACS染色。填充的直方图代表仅与抗-4-1BB配体抗体和第二步试剂孵育的细胞。开放直方图显示了与构建体、抗-4-1BB配体抗体和第二步试剂孵育的细胞。
图11：
B7.1-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BB配体构建体的序列。A)核苷酸序列，B)蛋白质序列，C)该构建体的示意图。
图12：
B7.1-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BBL构建体对Kato III细胞上EpCAM抗原的FACS结合分析。如实施例1A第4段中的描述实施FACS染色。填充的直方图代表仅与抗-his抗体和第二步试剂孵育的细胞。开放直方图显示了与构建体、抗-his抗体和第二步抗体孵育的细胞。
图13：
B7.1-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BBL构建体的4-1BB配体部分结合Kato III细胞的FACS分析。如实施例1A第5段中的描述实施FACS染色。填充的直方图代表仅与抗-4-1BB配体抗体孵育的细胞。开放直方图显示了与构建体和抗-4-1BB配体抗体孵育的细胞。
图14：
B7.1-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BBL构建体的B7.1部分结合KatoIII细胞的FACS分析。如实施例1A第5段中的描述实施FACS染色。填充的直方图代表仅与抗-B7.1抗体孵育的细胞。开放直方图显示了与构建体和抗B7.1抗体孵育的细胞。
图15：
双特异性scFv(抗-NKG2Dx抗-EpCAM)x人4-1BB配体构建体的序列。A)核苷酸序列，B)蛋白质序列，C)构建体的示意图。
图16：
三功能构建体抗-NKG2D-抗-EpCAM-人4-1BB配体分别对NKG2D+CHO细胞和EpCAM+CHO细胞(粗线)的结合能力。用直方图下面陈述的第二抗体检测结合的构建体。用未转染的CHO细胞作为阴性对照(细线)。与NKG2D+CHO细胞结合的构建体。A)通过4-1BBL抗体检测，B)通过His-标签抗体检测。与EpCAM+CHO细胞结合的构建体。C)通过4-1BB配体抗体检测。
图17：
scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体构建体的序列。A)核苷酸序列，B)蛋白质序列，C)构建体的示意图。
图18：
构建体scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体对EpCAM+CHO细胞(粗线)的结合能力。用直方图下面陈述的第二抗体检测结合的构建体。作为阴性对照，不使用含有分泌的scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体构建体的细胞培养物上清液(细线)。A)通过抗-His-标签抗体检测。B)通过抗4-1BB配体抗体检测。
图19：
FACS分析/T细胞致敏A-I。所有实验数据都在培养6天后采集。A)1.信号：scFv抗EpCAM(M79)x scFv抗-CD3，250ng/ml.B)1.+2.信号：scFv抗EpCAM(M79)x scFv抗-CD3，250ng/ml和B.7-scFv抗EpCAM(4-7)，500ng/ml.C)1.+3.信号：scFv抗EpCAM(M79)x scFv抗-CD3，250ng/ml和scFv抗EpCAM(4-7)x hu4-1BBL，500ng/ml.D)1.信号：scFv抗EpCAM(M79)x scFv抗-CD3，50ng/ml.E)1.+2.信号：scFv抗EpCAM(M79)x scFv抗-CD3，50ng/ml和B.7-scFv抗EpCAM(4-7)，500ng/ml.F)1.+2.+3.信号：scFv抗EpCAM(M79)x scFv抗-CD3，50ng/ml和B.7-scFv抗EpCAM(4-7)-hu4-1BBL，500ng/ml.G)2.信号：B.7-scFv抗EpCAM(4-7)，500ng/ml.H)3.信号：B7.1-scFv抗EpCAM(4-7)，500ng/ml.I)2.+3.信号：B.7-scFv抗EpCAM(4-7)-hu4-1BBL，500ng/ml。
图20：
scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1.BB配体融合蛋白从SP Sepharose阳离子交换柱洗脱的模式。1：以30％的洗脱缓冲液B1洗脱的蛋白质；2：以30％洗脱缓冲液B1洗脱的蛋白质；3：以30％洗脱缓冲液B1洗脱的蛋白质。从50％缓冲液B1洗脱的蛋白质峰用于进一步纯化。
图21：
来自Ni-螯合His trap柱的蛋白质洗脱模式(粗线)。上样含于用50％缓冲液B1从前述SP Sepharose阳离子交换柱洗脱的蛋白质峰的蛋白质级分的ScFv抗-EpCAM(M79)-人4-1.BB配体融合蛋白。虚线表示含有0.5M咪唑的洗脱缓冲液的理论梯度。从30％缓冲液B2洗脱步骤得到的蛋白质级分用于进一步纯化。
图22：
Sephadex S200凝胶过滤柱的蛋白质洗脱模式(粗线)。scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1.BB配体融合蛋白在约68ml时以单峰洗脱并且相应于约150kDa的分子量。
图23：
如图22中所示的含有纯化的scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1.BB配体的蛋白质级分的SDS-PAGE分析。将SDS-PAGE用胶体考马斯染色。泳道1：MultiMark分子量标准；泳道2和3：主峰和肩的凝胶过滤级分。
图24：
纯化的scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1.BB配体融合蛋白级分的蛋白质印迹分析。将蛋白质印迹与Penta His抗体和碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体孵育。着色剂为BCIP/NBT液体。泳道1：MultiMark分子量标准；泳道2和3：不同浓度的68ml时主峰凝胶过滤级分。约50kDa的主要带含有＞90％的纯化蛋白质。21kDa时的次要带为蛋白质水解切割的片段。
图25：
含有scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM(4.7)-人41BBL融合蛋白的蛋白质级分从Ni-螯合His Trap柱洗脱的模式(粗线)。灰色线表示洗脱缓冲液的理论梯度。来自100％缓冲液B2洗脱步骤(555ml处的峰)的蛋白质级分用于进一步纯化。
图26：
Sephadex S200凝胶过滤柱的蛋白质洗脱模式(粗线)。scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM(4.7)-人41BBL融合蛋白在约607ml以单峰洗脱并相应于约220kD分子量。点线表示基线。
图27：
含有纯化的scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM(4.7)-人41BBL融合蛋白的蛋白质级分的SDS-PAGE(A)和蛋白质印迹(B)分析。SDS-PAGE用胶体考马斯染色。蛋白质印迹与Penta His抗体和碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体孵育。着色剂为BCIP/NBT液体。泳道1：MultiMark分子量标准；泳道2：细胞培养物上清液，泳道3：IMAC穿过液，泳道4：IMAC洗涤峰，泳道5：IMAC洗脱峰，泳道7：60ml处峰的凝胶过滤级分。约72kD的主带含有＞50％纯度的蛋白质。
图28：
scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM(4.7)-人41BBL融合蛋白对Kato III细胞上EpCAM抗原的FACS结合分析。如实施例1A第4段中的描述实施FACS染色。点线代表对照，其中细胞仅与抗-his抗体和第二步试剂孵育。粗线显示了与来自细胞培养物上清液的scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM(4.7)-人41BBL融合蛋白孵育的细胞。细线代表阳性对照，其中细胞与抗-EpCAM抗体mab 3B10孵育。
图29：
NKG2D结合测定：(A)未染色NK对照；(B)NK对照检测抗体；(C)NKNKG2D(1D11)mab；(D)NK NKG2D(11B2D10)mab；(E)NK细胞培养物上清液；(F)NK CD16mab。在所有情况中x轴为荧光2(FL2-H)。在所有情况中y轴为侧向散射(SSC-H)。现在将参考以下的生物学实施例描述本发明，这些实施例仅是阐明性的并且不应被理解为限制本发明范围。
实施例1
scFv抗-237-鼠4-1BB配体构建体的产生
从鼠脾细胞分离鼠4-1BB配体的cDNA。根据标准方案(Sambrock，《Molecular Cloning；A Laboratory Manual》，第二版，Cold SpringHarbour laboratory Press，cold Spring Harbour，New York(1989))实施总RNA的分离和通过随机引发的逆转录合成cDNA。用PCR(第一循环：93℃变性5分钟，58℃退火1分钟，72℃延长1分钟；后30循环：93℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；最后延伸：72℃5分钟)扩增鼠4-1BB配体的胞外结构域的编码序列。设计用于PCR的引物(5’鼠4-1BB配体：CGGGATCCCGCACCGAGCCTCGG(SEQ ID 1)；3’鼠4-1BB配体：GGATCCGGATTCCCATGGGTTGTCGGGTTTC(SEQ ID2))，以在编码鼠4-1BB配体胞外部分(SEQ ID 3和4)的cDNA的起始和末端导入限制性位点。所导入的限制性位点(BamHI和BspEI)用于下面的克隆操作中。然后将扩增的编码鼠4-1BB配体的胞外部分的cDNA通过BamHI和BspEI克隆到称作BSCTI的质粒中，以将编码6个连续组氨酸残基的聚组氨酸标签连接到序列的C-末端，其后跟着终止密码子(BSCTI在Kufer等Cancer immunity卷1，10页(2001年11月12日)中描述)。在该步骤中，cDNA的BspEI位点融合到质粒的XmaI位点，从而破坏了两个位点。通过克隆到BSCTI，还将编码甘氨酸-丝氨酸接头[(Ser-Gly4-Ser)1]的序列连接到4-1BB配体序列的N-末端。通过根据标准方案(Sambrock，《Molecular Cloning；A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbour laboratory Press，cold Spring Harbour，New York(1989))测序确定不同克隆的序列。然后将修饰和验证的cDNA序列克隆到称作pEFDHFR的质粒(pEFDHFR在Mack等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025中有所描述)。与最初的pEFDHFR不同，该质粒已经含有编码237单链抗体的cDNA序列(亲本抗-237抗体在Ward等，1989，J.Exp.Med.卷170，217-232；SEQID 5 & 6中公开为PW237)，该单链抗体结合称作AG104A的鼠肉瘤细胞系(该细胞系在Wick等，J.Exp.Med.Volume 186，Number 2，7月21日，1997229-238中有所描述)上的肿瘤特异细胞表面抗原。以允许在真核细胞中分泌表达而将237cDNA序列置于质粒中。为了将鼠4-1BB配体的cDNA克隆到pEFDHFR，使用限制酶BspEI和SalI。在修饰的4-1BB配体序列中，BspEI的识别序列位于前面提到的甘氨酸-丝氨酸接头的开端，而SalI的识别位点位于聚组氨酸标签后的终止密码子之后。通过所述克隆步骤，鼠4-1BB配体胞外部分的cDNA与237单链抗体的cDNA的3’末端融合。该质粒现在含有双功能构建体，其包含编码抗-237单链抗体的cDNA序列和后面的编码鼠4-1BB配体的胞外部分的序列(图3)。SEQ ID NO：7和8显示了没有His-标签的构建体的序列。所有克隆步骤以产生双功能构建体的完整读框而设计。
scFv抗-237-鼠4-1BB配体构建体的表达
将具有编码双功能构建体的序列的质粒转染到DHFR缺陷的CHO细胞中以真核表达构建体(pEFDHFR在Mack等Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025中有所描述，并且如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中描述的实施DHFR缺陷CHO细胞中真核生物蛋白质表达)。通过使MTX的浓度增加到终浓度500nM MTX，诱导构建体的基因扩增。然后扩增所转染的细胞，并且所产生的上清液用于纯化。
纯化scFv抗-237-鼠4-1BB配体构建体
在三步纯化方法中从细胞培养物上清液分离抗-237scFv-4-1BB配体构建体蛋白质，所述纯化方法包括阳离子交换层析(图4)、固定金属亲和层析(IMAC)(图5)和凝胶过滤(图6)。_kta FPLC系统和GradiFrac(Pharmacia，Tennenlohe，德国)和Unicorn软件用于层析。所有化学药品都是研究级并购自Sigma(Deisenhofen，德国)或Merck(Darmstadt，德国)。
在用缓冲液A1(20mM MES pH5.5)平衡的SP Sepharose柱(Pharmacia，Tennenlohe，德国)上实施阳离子交换层析。将细胞培养物上清液用缓冲液A1以1∶3稀释并应用于柱子(柱床大小300ml，根据生产商的方案填充在XK柱(Pharmacia)中)，4℃，流速为20ml/分钟。用缓冲液A1洗除未结合的样品，并用2CV体积的25％、50％和100％三步梯度的缓冲液B1(20mM MES pH5.5，1M NaCl)洗脱结合的蛋白质。合并来自50％B1步骤的洗脱蛋白质级分，用于进一步纯化(图4)。
根据生产商的方案，用预装NiSO4的HisTrap 5ml柱(Pharmacia，Tennenlohe，德国)实施IMAC。用缓冲液A2(20mM NaPP pH7.2、0.4MNaCl)平衡柱子。将样品应用于柱子，流速为1ml/min，并用缓冲液A2洗涤柱子以除去未结合的样品。用三步梯度的缓冲液B2(20mM NaPP pH7.0、0.4M NaCl、0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白质，步骤1：10％缓冲液B2，步骤2：30％缓冲液B2，步骤3：100％缓冲液B2，每一步4个柱体积。合并来自第三步的洗脱蛋白质级分，用于进一步纯化(图5)。
在用PBS(Gibco Invitrogen Corp.，Carlsbad，USA)平衡的SephadexS200HiPrep柱(Pharmacia，Tennenlohe，德国)上实施凝胶过滤层析(图6)。为用于分子量测定而事先标定柱子(分子量标准试剂盒MW GF-200，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，德国)。将洗脱的蛋白质样品(流速1ml/min)进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测。用280nm的吸收值结合摩尔吸光系数确定蛋白质浓度。终产物在SDS-PAGE(图7)和蛋白质印迹(图8)上具有约50kDa的表观分子量。
用预制4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)实施还原条件下的SDS-PAGE。根据生产商的方案实施样品制备和应用。用MultiMark蛋白质标准(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)测定分子量。根据Invitrogen方案用胶体考马斯染色凝胶。
用BioTrace膜(Pall Life Sciences)和Invitrogen Blot Module根据生产商的方案实施蛋白质印迹。所用抗体为Penta His(Quiagen)和山羊抗小鼠-碱性磷酸酶(Goat-anti-Mouse-Ap)(Sigma)，着色剂为BCIP/NBT液体(Sigma)。
总之，用凝胶过滤观察到的峰分子量为150kDa。这相当于单体三倍的分子量，用SDS PAGE(图7)和蛋白质印迹(图8)观察到单体的分子量为50kDa。150kD分子量相应于抗-237scFv-4-1BB配体构建体的三聚体形式。这些结果清楚地表明本发明的多肽构建体是三聚体。
通过SDS-PAGE(图7)确定所分离的蛋白质的纯度为＞95％。所纯化蛋白质的终得率为约5.5mg/l细胞培养物上清液。
scFv抗-237结合Ag104A细胞的FACS测定
用FACS测定法测试纯化的双功能构建体对Ag104A细胞系上肿瘤特异细胞表面抗原的结合。为此，将2.5×105的细胞与含有2％FCS的50μlPBS中的10μg/ml构建体孵育。用含有2％FCS的50μl PBS中的2μg/ml抗-His抗体(Penta-His抗体，无BSA，从Quiagen GmbH，Hilden，FRG得到)检测构建体的结合。将以1∶100在含有2％FCS(从Dianova，Hamburg，FRG得到)的50μl PBS中稀释的R-藻红蛋白缀合的亲和纯化的F(ab’)2片段——山羊抗小鼠IgG Fc-γ片段特异抗体用作第二步试剂。以FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)测量样品。可以清楚地检测到抗原结合(图9)。
构建体4-1BB配体部分的检测
通过基于FACS的测定证明构建体的4-1BB配体部分的存在。为此，使用没有表现出表面表达鼠4-1BB配体的AG104A细胞系。将2.5×105的细胞与含有2％FCS的50μl PBS中的10μg/ml构建体孵育。用含有2％FCS的50μl PBS中的5μg/ml抗-鼠4-1BB配体抗体(从BD biosciences，Heidelberg，FRG得到的纯化的大鼠抗-小鼠4-1BB配体单克隆抗体)检测4-1BB配体部分的存在。将以1∶100在含有2％FCS(从Dianova，Hamburg，FRG得到)的50μl PBS中稀释的R-藻红蛋白缀合的亲和纯化的F(ab’)2片段——山羊抗小鼠IgG Fc-γ片段特异抗体用作第二步试剂。以FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)测量样品。可以清楚地检测到构建体结合导致AG104A细胞上存在4-1BB配体抗原(图10)。
实施例2
克隆人4-1BB配体
通过用GM-CSF和IL-4刺激从分化成树突细胞的人单克隆细胞分离人4-1BB配体的cDNA(如de Baey等Eur J Immunol 2001 Jun；31(6)：1646-55中所述)。根据标准方案(Sambrock，《Molecular Cloning；ALaboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbour laboratory Press，coldSpring Harbour，New York(1989))实施总RNA的分离和通过随机引发的逆转录合成cDNA。用PCR(第一循环：96℃变性5分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；后30循环：96℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；最后延伸：72℃5分钟)扩增人4-1BB配体胞外结构域的编码序列。设计用于PCR  的引物(5’人4-1BB配体：CGGGATCCCTCGCCTGCCCCTGGGCC(SEQ ID 9)；3’人4-1BB配体：GGATCCGGATTCCGACCTCGGTGAAGGGAG(SEQ ID 10))以在编码人4-1BB配体胞外部分(SEQ ID 11和12)的cDNA的起始和末端导入限制性位点。所导入的限制性位点(BamHI和BspEI)用于下面的克隆操作。然后将扩增的编码人4-1BB配体的胞外部分的cDNA通过BamHI和BspEI克隆到称作BSCTI的质粒中，以将编码6个连续组氨酸残基的聚组氨酸标签连接到序列的C-末端，其后跟着终止密码子(BSCTI在Kufer等Cancer immunity卷1，10页(2001年11月12日)中描述)。在该步骤中，cDNA的BspEI位点融合到质粒的XmaI位点，从而破坏了两个位点。通过克隆到BSCTI，还将编码甘氨酸-丝氨酸接头[(Ser-Gly4-Ser)1]的序列连接到4-1BB配体序列(接头序列)的N-末端。通过根据标准能方案(Sambrock，《Molecular Cloning；A Laboratory Manual》，第二版，ColdSpring Harbour laboratory Press，cold Spring Harbour，New York(1989))测序确定不同克隆的序列。
产生B7.1-抗-EpCAM scFv(4-7)-人4-1BB配体构建体
然后将修饰和验证的编码人4-1BB配体的cDNA序列克隆到称作B7.1/4-7pEFDHFR的质粒(在Kufer等Cancer immunity卷1，10页(2001年11月12日)中有所描述)以代替4-7片段。为此，使用限制酶BspEI和SalI。在修饰的4-1BB配体序列中，BspEI的识别序列位于前面提到的甘氨酸-丝氨酸接头的开端，而SalI的识别序列位于聚组氨酸标签后的终止密码子之后。质粒B7.1/4-7pEFDHFR含有编码人B7.1分子胞外部分的cDNA序列。以允许在真核细胞中表达而将该序列置于质粒中。通过所述克隆步骤，人4-1BB配体胞外部分的cDNA与B7.1的cDNA融合。现在在B7.1和4-1BB配体序列之间的BspEI位点中插入另一序列，其编码结合EpCAM抗原的胞外部分的4-7单链抗体。为此，用PCR(第一循环：93℃变性5分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；后30循环：93℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；最后延伸：72℃5分钟)修饰编码4-7单链抗体的序列。为该PCR产生的引物对(5’scFv4-7：CATTTTCCTGATAACTCCGGAGGTGG(SEQ ID 13)；3’scFv4-7：AAGTCCGGATTTGATCTCAAGCTTGGTCCC(SEQ ID 14))经设计以产生两个侧翼BspEI位点。在PCR中，保留了模板中存在的连接4-7单链抗体的N-末端甘氨酸-丝氨酸接头[(Ser-Gly4-Ser)1]编码序列。然后将扩增的序列克隆到前述BspEI位点。通过根据标准方案(Sambrock，《Molecular Cloning；A Laboratory Manual》，第二版，Cold SpringHarbour laboratory Press，cold Spring Harbour，New York(1989))测序验证插入片段的方向和序列。该质粒现在含有三功能构建体，其含有与编码4-7单链抗体的序列融合的人B7.1胞外部分，随后是编码人4-1BB配体胞外部分的序列。设计所有克隆步骤以产生三功能构建体的完整读框(图11)而设计。SEQ ID NO：15和16显示了没有His-标签的构建体的序列。在CHO细胞中表达B7.1-抗-EpCAM scFv(4-7)-人4-1BB配体构建体
将具有编码三功能构建体的序列的质粒转染到DHFR缺陷CHO细胞中以真核表达构建体(pEFDHFR在Mack等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025中有所描述，并且如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中描述的实施DHFR缺陷CHO细胞中真核生物蛋白质表达)。通过使MTX的浓度增加到终浓度100nM MTX，诱导构建体的基因扩增。然后扩增所转染的细胞，并且产生了10升上清液。最终从培养物上清液中纯化构建体(如Kufer等Cancer immunity卷1，第10页(2001年11月12日)中描述的实施纯化)。
EpCAM结合的测定
用FACS测定法测试纯化的三功能构建体对EpCAM抗原的胞外部分的结合。为此，使用EpCAM阳性人胃癌细胞系Kato III(从美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，VA 20108 USA得到，ATCC号：HTB-103)。根据供应商的推荐培养细胞并将2.5×105数量的细胞与含有2％FCS的50μl PBS中的10μg/ml构建体孵育。用含有2％FCS的50μl PBS中的2μg/ml抗-His抗体(Penta-His抗体，无BSA，从Quiagen GmbH，Hilden，FRG得到)检测构建体的结合。将以1∶100在含有2％FCS(从Dianova，Hamburg，FRG得到)的50μl PBS中稀释的R-藻红蛋白缀合的亲和纯化的F(ab’)2片段——山羊抗小鼠IgG Fc-γ片段特异抗体用作第二步试剂。以FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)测量样品。可以清楚地检测到EpCAM结合(图12)。
检测构建体的4-1BB配体部分和B7.1部分
通过基于FACS的测定法证明存在构建体的4-1BB配体部分和B7.1部分。为此，使用没有表现出表面表达人B7.1和人4-1BB配体的EpCAM阳性人胃癌细胞系Kato III(从ATCC得到，见上文)。将2.5×105的细胞与含有2％FCS的50μl PBS中的10μg/ml构建体孵育。用在含有2％FCS的50μl PBS中以1∶10稀释的R-藻红蛋白缀合的小鼠抗人4-1BB配体抗体(BD biosciences，Heidelberg，FRG)检测4-1BB配体部分的存在。以FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)测量样品。可以清楚地检测到构建体的结合导致Kato III细胞上存在4-1BB配体抗原(图13)。为了检测B7.1部分，实施相同条件的测定，只是使用在含有2％FCS的50μl PBS中以1∶10稀释的藻红蛋白缀合的小鼠抗人B7.1抗体(BD biosciences，Heidelberg，FRG)。可以清楚地检测到构建体的结合导致Kato III细胞上存在B7.1抗原(图14)。
实施例3
产生双特异性scFv-4-1BB配体构建体：抗-NKG2D-抗-EpCAM-人4-1BB 配体
如实施例2中描述的现有构建体是产生第二种双特异性构建体：抗-NKG2D-抗-EpCAM-4-1BB配体的基础，该构建体在图15C中图示描述。该构建体具有不同的作用模式：其将NKG2D阳性CTLs和NK细胞的细胞毒性转向EPCAM阳性癌细胞。
在专利申请WO0171005(含有NKG2D受体复合体表位的结合位点的多功能多肽)中描述了特异识别NKG2D受体复合体的胞外表位的结合位点的分离。如WO0171005的实施例3中描述的，NKG2D结合位点两侧为限制酶BsrGI/BspEI，其用于将NKG2D scFv-片段克隆到哺乳动物表达载体pEF-DHFR，所述载体已含有抗-EpCAM特异性4-7和4.1BB配体的编码序列。根据实施例2在CHO细胞中转染和表达具有VL抗-NKG2D (11B2D10)-VH抗-NKG2D(11B2D10)-VH抗-EpCAM(4-7)-VL抗-EpCAM(4-7)-胞外结构域4.1BB配体结构域排列的所得抗体构建体(SEQ ID 17和18)。如所描述的(Kufer等，2001，Cancer Immunity，10)实施纯化。该构建体的序列和示意图在图15中显示。SEQ ID NO：17和18显示了没有His-标签的构建体的序列。抗-NKG2D-抗-EpCAM-人4-1BB配体构建体的流式细胞术结合分析
为了检验构建体关于结合能力的功能，实施FACS分析。为此，产生了分别表达NKG2D和EpCAM抗原胞外结构域的CHO转染子。将200,000的NKG2D+CHO细胞和200,000的EpCAM+CHO细胞分别与用抗-NKG2D-抗-EpCAM-4.1BB配体构建体转染的CHO细胞的50μl纯细胞培养物上清液在冰上孵育30分钟。随后将细胞在PBS中洗涤两次。之后以两种不同的方法检测构建体的结合：用以1∶20在含有2％FCS的50μlPBS中稀释的鼠FITC缀合的抗-His-标签抗体(Dianova，Hamburg，FRG，DIA920)通过构建体的C-末端组氨酸标签整体检测该构建体。用以1∶10在含有2％FCS的50μl PBS中稀释的R-藻红蛋白缀合的鼠抗人4-1BB配体抗体(BD biosciences，Heidelberg，FRG)检查4.1BB配体结构域的正确表达(粗线)。用未转化的CHO细胞作为阴性对照(细线)。通过在FACS-扫描(Becton Dickinson，Heidelberg)上用流式细胞术分析细胞。如《CurrentProtocols in Immunology》(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中描述的实施FACS染色和荧光强度测量。
如图16中所示，可以明确地检测抗-NKG2D结合结构域和抗-EpCAM结合结构域的结合能力。
通过双功能scFv-4-1BB配体构建体：scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体融合蛋白示范的4-1BB配体三聚体的纯化和分析
以两步纯化方法从细胞培养物上清液分离融合蛋白，所述方法包括固定的金属亲和层析(IMAC)、和凝胶过滤。终产物在SDS PAGE和蛋白质印迹上具有约47kDa(单链融合蛋白)或者70kDa(双特异性单链融合蛋白)的表观分子量。然而，在如PBS中凝胶过滤的非变性条件下，融合蛋白的所检测的分子量为约150kDa(单链融合蛋白)或者220kDa(双特异性单链融合蛋白)。其相应于融合构建体的三聚体形式。如通过SDS-PAGE测定的，分离蛋白的纯度在多数情况下＞95％。纯化蛋白质的终产率为约400μg/l细胞培养物上清液。_kta FPLC系统和GradiFrac(Pharmacia，Tennenlohe，德国)和Unicorn软件用于层析。所有化学药品都是研究级并且购自Sigma(Deisenhofen，德国)或Merck(Darmstadt，德国)。
根据生产商的方案，用预装NiSO4的HisTrap 5ml柱(AmershamBiosciences Europe GmbH，Freiburg，德国)实施IMAC。用缓冲液A2(20mM NaPP pH7.2，0.4M NaCl)平衡柱子。将样品应用于柱子，流速为1ml/min，并用缓冲液A2洗涤柱子以除去未结合的样品。用两步梯度的缓冲液B2(20mM NaPP pH7.0，0.4M NaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白质，步骤1：10％缓冲液B2，步骤2：100％缓冲液B2，每一步5个柱体积。合并来自第二步的洗脱蛋白质级分，用于进一步纯化。
在用PBS(Gibco Invitrogen Corp.，Carlsbad，USA)平衡的SephadexS200 HiPrep柱(Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg，德国)上实施凝胶过滤层析。洗脱的蛋白质样品(流速1ml/min)进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。为用于分子量测定而事先标定柱子(分子量标准试剂盒MWGF-200，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，德国)。用280nm的吸收值结合摩尔吸光系数或者使用Pierce microBCA试剂盒(PierceBiotechnology Inc.，Rockford，IL，USA)确定蛋白质浓度。
用预制4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，USA)实施还原条件下的SDS-PAGE。根据生产商的方案实施样品制备和应用。用MultiMark蛋白质标准(Invitrogen Corp.，Carlsbad，USA)测定分子量。用胶体考马斯(Invitrogen方案)染色凝胶。
用BioTrace膜(Pall Life Sciences，Dreieich，德国)和Invitrogen BlotModule根据生产商的方案实施蛋白质印迹。所用抗体为Penta His(Qiagen，Hilden，德国)和山羊抗小鼠-碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，德国)，染色溶液为BCIP/NBT液体(Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Munich，德国)。
scFv抗-NKG2D-scFv抗-EpCAM-人CD30配体融合蛋白的纯化如图25、26和27所示。根据凝胶过滤和蛋白质印迹数据，很明显构建体以三聚体形式存在。蛋白质印迹数据表明半数纯化蛋白质表现为三聚体，另一半聚集。但是没有检测到单体。三聚体的纯度为约50％。
EpCAM结合的测定
用FACS测定法测试纯化的三功能构建体对EpCAM抗原的胞外部分的结合。为此，使用EpCAM阳性人胃癌细胞系Kato III(从美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，VA 20108USA得到，ATCC号：HTB-103)。根据供应商的推荐培养细胞并将2.5×105数量的细胞与含有2％FCS的50μlPBS中的10μg/ml构建体孵育。用含有2％FCS的50μl PBS中的2μg/ml抗-His抗体(Penta-His抗体，无BSA，从Quiagen GmbH，Hilden，FRG得到)检测构建体的结合。将以1∶100在含有2％FCS(从Dianova，Hamburg，德国得到)的50μl PBS中稀释的R-藻红蛋白缀合的亲和纯化的F(ab’)2片段——山羊抗小鼠IgG Fc-γ片段特异抗体用作第二步试剂。以FACSscan(BDbiosciences，Heidelberg，FRG)测量样品。可以清楚地检测到EpCAM结合(图28)。
NKG2D对新分离的NK细胞的结合研究
通过Ficoll密度离心来自健康供体的250ml外周血制备单核细胞(PBMC)。用NK细胞分离试剂盒II(MACS，Bergisch Gladbach，德国)从健康供体的外周血纯化具有典型表型CD16+CD56+的NK细胞，导致阴性分类的、未接触的新鲜NK细胞。根据生产商的使用说明实施分离操作。用抗-CD16抗体单一染色后，通过流式细胞术控制NK细胞的成功分离(图29F)。证明CD16+NK细胞的纯度为74％。通过用商业途径可获得的抗-NKG2D抗体(1D11)(BD Biosciences Pharmingen，Heidelberg，德国)、为所述构建体内抗-NKG2D单链抗体部分来源的抗-NKG2D mab克隆11B2D10(Micromet AG，Munich，德国，如WO0171005中描述)和scFv抗-NKG2D(11B2D10)-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BBL的细胞培养物上清液的的单一染色相等地实施NKG2D染色的细胞流式术监测。如前面描述的实施FACS结合分析。
多数分离的NK细胞都被抗-NKG2D抗体(1D11)(96％，图29C)、抗-NKG2D mab克隆11B2D10(82％，图29D)和scFv抗-NKG2D(11B2D10)-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BBL三特异性单链构建体的细胞培养物上清液(86％，图29E)结合，表明scFv抗-NKG2D(11B2D10)-scFv抗-EpCAM(4-7)-人4-1BBL三特异性单链构建体的抗-NKG2D部分特异结合NK细胞上的NKG2D。通过未染色NK细胞(图29A)和仅通过二次抗体(图29B)染色的NK细胞描述的FACS分析的对照表现出几乎无染色或10％染色。
实施例4
产生scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体
为了产生由称作M79的抗-EpCAM scFv联合人4-1BB配体组成的另一构建体，实施下面的克隆步骤。用诸如Mack，M.等(1995)Proc Natl AcadSci USA 92，7021-7025中描述的抗-EpCAM scFv M79作为肿瘤靶定部分和该出版物中描述的构建体作为产生抗-EpCAM-4-1BBL构建体的基础。将该构建体的没有Flag序列的变体(Kufer等，1997，Cancer ImmunolImmunother45，193-197)用限制酶BspEI和SalI酶促消化。所得载体(现在没有CD3部分)与如实施例3中描述的含有人4.1BB配体的适宜消化的DNA片段融合。根据实施例2在CHO细胞中转染和表达具有VL抗-EpCAM (M79)-VH抗-EpCAM(M79)-胞外结构域4.1BB配体结构域排列的所得构建体(SEQ ID19和20)。如Kufer等，2001，Caneer immunity卷1，第10页描述的实施纯化。该构建体的序列和示意图在图17中显示。SEQ ID NO：19和20显示了没有His-标签的构建体的序列。
scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体构建体的流式细胞术结合分析
为了检验构建体关于结合能力的功能，实施FACS分析。为此，产生了表达EpCAM抗原的胞外结构域的CHO转染子。将200,000的EpCAM+CHO细胞与用抗-EpCAM-4-1BBL构建体转染的CHO细胞的50μl纯细胞培养物上清液在冰上孵育30分钟。随后将细胞在PBS中洗涤两次。最后，以两种不同的方法检测构建体的结合：用以1∶20在含有2％FCS的50μl PBS中稀释的鼠FITC缀合的抗-His-标签抗体(Dianova，Hamburg，FRG，DIA920)通过构建体的C-末端组氨酸标签整体检测该构建体。用以1∶10在含有2％FCS的50μl PBS中稀释的R-藻红蛋白缀合的小鼠抗人4-1BB配体抗体(BD biosciences，Heidelberg，FRG)检4-1BBL结构域的正确表达(粗线)。作为阴性对照，不使用含有分泌的抗-EpCAM-4-1BBL构建体的细胞培养物上清液(细线)。
通过在FACS扫描(Becton Dickinson，Heidelberg)上用流式细胞术分析细胞。如《Current Protocols in Immunology》(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中描述的实施FACS染色和荧光强度测量。
如图18中所示，可以明确地检测抗-EpCAM结合结构域的结合能力和4-1BBL的存在。
通过scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1BB配体融合蛋白示范的4-1BB配体三聚体的纯化和分析
以三步纯化法从细胞培养物上清液分离scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1BB配体蛋白质，所述纯化方法包括阳离子交换层析(图20)、固定金属亲和层析(IMAC)(图21)和凝胶过滤(图22)。在SDS PAGE(图23)和蛋白质印迹(图24)上终产物具有约50kDa的表观分子量。然而，在如PBS中凝胶过滤的非变性条件下测定的该蛋白的分子量为约150kDa。该150kDa大小相当于scFv抗-EpCAM(M79)-人4-1BB配体的三聚体形式。如通过SDS-PAGE测定的，分离蛋白的纯度＞95％(图23)。纯化蛋白质的终得率为约5.5mg/l细胞培养物上清液。_kta FPLC系统和GradiFrac(Pharmacia，Tennenlohe，德国)和Unicorn软件用于层析。所有化学药品都是研究级并且购自Sigma(Deisenhofen，德国)或Merck(Darmstadt，德国)。
在第一个纯化步骤中，在用缓冲液A1(20mM MES pH5.5)平衡的SPSepharose柱(Pharmacia，Tennenlohe，德国)上实施阳离子交换层析。将细胞培养物上清液用缓冲液A1以1∶3稀释并应用于柱子(柱床大小300ml，根据生产商的方案填充在XK柱，Pharmacia，Tennenlohe，德国，根据生产商方案)，4℃，流速为20ml/分钟。用缓冲液A1洗除未结合的样品并用体积为2个柱体积(CV)的30％、50％和100％的三步梯度缓冲液B1(20mM MES pH5.5，1M NaCl)洗脱结合的蛋白质。合并来自50％B1步骤的洗脱蛋白质级分，用于进一步纯化(图20)。
在第二步纯化中，实施IMAC，用预装NiSO4的HisTrap 5ml柱(Pharmacia，Tennenlohe，德国)根据生产商的方案实施IMAC。用缓冲液A2(20mM NaPP pH7.2，0.4M NaCl)平衡柱子。将样品应用于柱子，流速为1ml/min，并用缓冲液A2洗涤柱子以除去未结合的样品。用缓冲液三步梯度的B2(20mM NaPP pH7.0，0.4M NaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白质。步骤1：10％缓冲液B2，步骤2：30％缓冲液B2，步骤3：100％缓冲液B2，每一步包括4个柱体积。合并来自第三步的洗脱蛋白质级分用于进一步纯化。
在第三步纯化中，在用PBS(Gibco Invitrogen Corp.，Carlsbad，USA)平衡的Sephadex S200HiPrep柱(Pharmacia，Tennenlohe，德国)上实施凝胶过滤层析。洗脱的蛋白质样品(流速1ml/分钟)用于SDS-PAGE和蛋白质印迹，以检测双特异性scFv抗体(scFv抗-EpCAM-scFv抗-CD3)。为用于分子量测定而事先标定柱子(分子量标准试剂盒MW GF-200，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，德国)。用280nm的吸收值结合摩尔吸光系数确定蛋白质浓度。
用预制4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)实施还原条件下的SDS-PAGE。根据生产商的方案制备和应用样品。用MultiMark蛋白质标准(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)测定分子量。根据Invitrogen方案用胶体考马斯染色凝胶。
用BioTrace膜(Pall Gelman GmbH，Dreieich，德国)和InvitrogenBlot Module根据生产商的方案实施蛋白质印迹。所用抗体为Penta His(Qiagen，Hilden，德国)和山羊抗小鼠-碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Munich，德国)，着色剂为BCIP/NBT液体(Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Munich，德国)。
实施例5
用B7.1-scFv抗-EpCAM-人4-1BB配体构建体实施致敏测定
用4-1BBL-抗-EpCAM scFv-B7.1构建体研究幼稚人CD4+T细胞的直接致敏。
用实施例2中描述的构建体将共刺激分子4-1BBL特异靶向上皮细胞粘着分子(EpCAM)——成功用作最小残留结肠癌的抗体治疗靶标的表面抗原。通过CD45同种型表达的流式细胞术分析监测T细胞致敏。
纯化幼稚T细胞
从健康供体的外周血纯化具有典型CD45RA+RO-表型的幼稚CD4+和CD8+T淋巴细胞。从健康供体的500ml外周血Ficoll密度离心制备单核细胞(PBMC)。使用通过商业途径可获得的细胞分离试剂盒(R&D Systems，HCD4C-1000and HCD8C-1000 respectively，Wiesbaden，德国)通过阴性选择分离CD4+和CD8+T细胞。每个CD4+或CD8+T细胞柱上样已与生产商的抗体混合物预孵育的2×108个PBMC，此外CD8+T细胞混合物补加1μg单克隆抗-CD11b抗体(Coulter，Krefeld，德国)/柱。分别用抗-CD4或抗-CD8单一染色后，通过流式细胞术控制CD4+和CD8+T细胞的成功分离。通过用抗-CD28抗体的单一染色证实CD8+T细胞制品中没有CD11b+细胞，因为公知CD11b+CD8+T细胞是CD28-并且反之亦然。
通过与鼠单克隆抗-CD45RO抗体UCHL-1，31301(PharMingen，Heidelberg，德国)孵育，然后使用缀合多克隆绵羊抗小鼠Ig抗体(Dynal，Hamburg，德国)的磁珠分离，从纯化的CD4+或CD8+T细胞除去CD45RO+细胞。为了消除残留的抗原呈递细胞(例如，树突细胞)，将纯化的CD4+或CD8+T细胞与针对CD45RO和HLA-DR、DP、DQ的鼠单克隆抗体(PharMingen，Heidelberg，德国)共同孵育，之后与磁性抗-小鼠Ig珠孵育。如用抗-CD45RA和抗-CD45RO双染色后通过细胞流式术所测定的，剩余幼稚CD4+或CD8+T细胞的纯度为95到97％。幼稚T细胞的得率为每500ml外周血2到3×107个(CD4)和5×106个(CD8)。
流式细胞术
通过用PE缀合的单克隆抗-CD45RA抗体(Coulter，Krefeld，德国)和FITC缀合的单克隆抗-CD45RO抗体UCHL-1，F 0800(DAKO，Hamburg，德国)在冰上对1×105个细胞双染色30分钟，实施CD45同种型表达的流式细胞术分析。通过Tricolor缀合的单克隆抗-CD4抗体(MHCD0406)、Tricolor缀合的单克隆抗-CD8抗体(MHC0806)和FITC-缀合的单克隆抗-CD28抗体(MHCD2801)(都来自Medac(Hamburg，德国))的单一染色相等地实施T细胞纯化的流式细胞术监测。
致敏测定
从健康供体的外周血纯化具有典型CD45RA+RO-表型的幼稚CD4+T淋巴细胞，并将其与作为刺激细胞的辐射处理的EpCAM-转染CHO细胞孵育(根据Kufer等，2001，Cancer Immunity 1，10)。
通过双特异性单链抗体(bscAb)EpCAM(M79)x CD3(Kufer等，1997，Cancer Immunol Immunother45，193-197)介导初次信号，所述单链抗体模拟通过TCR的特异抗原识别；第二或者共同刺激信号通过EpCAM特异B7.1构建体(B7.1-scFv抗EpCAM，Kufer等，2001，Cancer Immunity 1，10)介导。在第6天通过流式细胞术通过同时测量CD45RA和CD45RO的表达监测T细胞引发。
在浓度为250ng/ml(图19A)和浓度为50ng/ml(图19D)的双特异性单链抗体(bscAb)EpCAM(M79)x CD3的存在下，保持未致敏的细胞显示出CD45RA+RO-表型。在EpCAM-特异B7.1构建体(500ng/ml)和bscAbEpCAM x CD3(250ng/ml)都存在时，在6天内，幼稚T细胞的几乎全部群体的CD45表型都改变成致敏的T细胞的表型，即CD45RA-RO+(图15B)。在次优浓度的双特异性单链抗体(bscAb)EpCAM(M79)x CD3(50ng/ml)和500ng/ml EpCAM特异B7.1构建体(B7.1-scFv抗EpCAM，Kufer等，2001，Cancer Immunity 1，10)下，6天内幼稚T细胞的小部分群体(5.7％)的CD45表型改变成致敏T细胞的表型，即CD45RA-RO+(图19E)。
然而，加入浓度为500ng/ml的实施例2的B7.1-scFv抗-EpCAM-hu4-1BB配体构建体与50ng/ml的次优浓度的双特异性单链抗体(bscAb)EpCAM(M79)x CD3，在6天内将幼稚T细胞的群体的基本增加的部分(24％)的CD45表型改变成致敏的T细胞的表型，即CD45RA-RO+(图19F)。该结果表明用B7.1-scFv抗-EpCAM-4-1BB配体构建体致敏比用B7.1-scFv抗-EpCAM构建体(Kufer等，2001，CancerImmunity 1，10)致敏更佳。
重要的是，缺少B7.1共同刺激时，scFv抗-EpCAM-4-1BB配体(见实施例4)构建体和bscAb EpCAMx CD3的组合不能充分诱导CD45同种型表达的改变(图19C)。
单独试验了所有构建体自身对T细胞的致敏，但是在6天内没有一种表现出从幼稚T细胞的CD45表型改变成致敏T细胞的表型，即CD45RA-RO+(图19G、H、I)：B7.1-scFv抗-EpCAM构建体(图19G)、scFv抗-EpCAM-4-1BB配体构建体(图19H)、或者B7.1-scFv抗-EpCAM-hu4-1BB配体构建体(图19I)都没有。
对于所有致敏实验，在37℃和6％CO2中实施细胞培养。
序列表
<110>麦克罗梅特股份公司
<120>持久T细胞应答
<130>H1048PCT
<140>待获得
<141>2003-02-06
<160>22
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5′鼠4-1BBL引物
<400>1
cgggatcccg caccgagcct cgg                                              23
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3′鼠4-1BBL引物
<400>2
ggatccggat tcccatgggt tgtcgggttt c                                     31
<210>3
<211>625
<212>DNA
<213>小鼠
<400>3
cccgcaccga gcctcggcca gcgctcacaa tcaccacctc gcccaacctg ggtacccgag    60
agaataatgc agaccaggtc acccctgttt cccacattgg ctgccccaac actacacaac    120
agggctctcc tgtgttcgcc aagctactgg ctaaaaacca agcatcgttg tgcaatacaa    180
ctctgaactg gcacagccaa gatggagctg ggagctcata cctatctcaa ggtctgaggt    240
acgaagaaga caaaaaggag ttggtggtag acagtcccgg gctctactac gtatttttgg    300
aactgaagct cagtccaaca ttcacaaaca caggccacaa ggtgcagggc tgggtctctc    360
ttgttttgca agcaaagcct caggtagatg actttgacaa cttggccctg acagtggaac    420
tgttcccttg ctccatggag aacaagttag tggaccgttc ctggagtcaa ctgttgctcc    480
tgaaggctgg ccaccgcctc agtgtgggtc tgagggctta tctgcatgga gcccaggatg    540
catacagaga ctgggagctg tcttatccca acaccaccag ctttggactc tttcttgtga    600
aacccgacaa cccatgggaa tccgg                                          625
<210>4
<211>208
<212>PRT
<213>小鼠
<400>4
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
            20                  25                  30
Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
    50                  55                  60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
                85                  90                  95
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
            100                 105                 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
        115                 120                 125
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser
    130                 135                 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
                165                 170                 175
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
            180                 185                 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Ser Gly
        195                 200                 205
<210>5
<211>732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>scFv抗237核酸序列
<400>5
gatatccagc tgacccagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc    60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg    120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240
agcagcgtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc    300
acgttcggag gggggaccaa gctcgagatc aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc    360
tccggtggtg gtggttctca ggtgcaactg cagcagtctg gaggtggctt ggtgcaacct    420
ggaggatcca tgaaaatctt ttgtgctgct tctggattca cttttagtga tgcctggatg    480
gactgggtcc gccagtctcc agagaagggg cttgagtggg ttgctgaaat tagaaacaaa    540
gctaataatc atgaaacata ttatgctgag tctgtgaaag ggaggttcac catcacaaga    600
gatgattcca aaagtagaat gtccctgcaa atgaacagct taagagctga agacactggc    660
atttattact gttcgggggg gaaggtacgg aatgcttact ggggccaagg gaccacggtc    720
accgtctcct cc                                                        732
<210>6
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>scFv抗237氨基酸序列
<400>6
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met
    130                 135                 140
Lys Ile Phe Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met
145                 150                 155                 160
Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu
                165                 170                 175
Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Glu Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
            180                 185                 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Met Ser
        195                 200                 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Gly Gly Lys Val Arg Asn Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225                 230                 235                 240
Thr Val Ser Ser
<210>7
<211>1449
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>scFv抗237-4-1BBL核酸序列
<400>7
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt acactccgat    60
atccagctga cccagtctcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc    120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac    180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct    240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc    300
agcgtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttcccacg    360
ttcggagggg ggaccaagct cgagatcaaa ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc    420
ggtggtggtg gttctcaggt gcaactgcag cagtctggag gtggcttggt gcaacctgga    480
ggatccatga aaatcttttg tgctgcttct ggattcactt ttagtgatgc ctggatggac    540
tgggtccgcc agtctccaga gaaggggctt gagtgggttg ctgaaattag aaacaaagct    600
aataatcatg aaacatatta tgctgagtct gtgaaaggga ggttcaccat cacaagagat    660
gattccaaaa gtagaatgtc cctgcaaatg aacagcttaa gagctgaaga cactggcatt    720
tattactgtt cgggggggaa ggtacggaat gcttactggg gccaagggac cacggtcacc    780
gtctcctccg gaggtggtgg atcccgcacc gagcctcggc cagcgctcac aatcaccacc    840
tcgcccaacc tgggtacccg agagaataat gcagaccagg tcacccctgt ttcccacatt    900
ggctgcccca acactacaca acagggctct cctgtgttcg ccaagctact ggctaaaaac    960
caagcatcgt tgtgcaatac aactctgaac tggcacagcc aagatggagc tgggagctca    1020
tacctatctc aaggtctgag gtacgaagaa gacaaaaagg agttggtggt agacagtccc    1080
gggctctact acgtattttt ggaactgaag ctcagtccaa cattcacaaa cacaggccac    1140
aaggtgcagg gctgggtctc tcttgttttg caagcaaagc ctcaggtaga tgactttgac    1200
aacttggccc tgacagtgga actgttccct tgctccatgg agaacaagtt agtggaccgt    1260
tcctggagtc aactgttgct cctgaaggct ggccaccgcc tcagtgtggg tctgagggct    1320
tatctgcatg gagcccagga tgcatacaga gactgggagc tgtcttatcc caacaccacc    1380
agctttggac tctttcttgt gaaacccgac aacccatggg aatccgggca tcatcaccat    1440
catcattag                                                            1449
<210>8
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>scFv抗237-4-1BBL氨基酸序列
<400>8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met
    130                 135                 140
Lys Ile Phe Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met
145                 150                 155                 160
Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu
                165                 170                 175
Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Glu Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
            180                 185                 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Met Ser
        195                 200                 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Gly Gly Lys Val Arg Asn Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225                 230                 235                 240
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala
                245                 250                 255
Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala
            260                 265                 270
Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln
        275                 280                 285
Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser
    290                 295                 300
Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser
305                 310                 315                 320
Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu
                325                 330                 335
Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu
                340                 345                 350
Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser
            355                 360                 365
Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala
        370                 375                 380
Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp
    385                 390                 395
Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser
400                 405                 410                 415
Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp
                420                 425                 430
Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val
            435                 440                 445
Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Ser Gly
        450                 455
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5′人4-1BBL引物
<400>9
cgggatccct cgcctgcccc tgggcc                                           26
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3′人4-1BBL引物
<400>10
ggatccggat tccgacctcg gtgaagggag                                       30
<210>11
<211>629
<212>DNA
<213>智人
<400>11
ggatccctcg cctgcccctg ggccgtgtcc ggggctcgcg cctcgcccgg ctccgcggcc    60
agcccgagac tccgcgaggg tcccgagctt tcgcccgacg atcccgccgg cctcttggac    120
ctgcggcagg gcatgtttgc gcagctggtg gcccaaaatg ttctgctgat cgatgggccc    180
ctgagctggt acagtgaccc aggcctggca ggcgtgtccc tgacgggggg cctgagctac    240
aaagaggaca cgaaggagct ggtggtggcc aaggctggag tctactatgt cttctttcaa    300
ctagagctgc ggcgcgtggt ggccggcgag ggctcaggct ccgtttcact tgcgctgcac    360
ctgcagccac tgcgctctgc tgctggggcc gccgccctgg ctttgaccgt ggacctgcca    420
cccgcctcct ccgaggctcg gaactcggcc ttcggtttcc agggccgctt gctgcacctg    480
agtgccggcc agcgcctggg cgtccatctt cacactgagg ccagggcacg ccatgcctgg    540
cagcttaccc agggcgccac agtcttggga ctcttccggg tgacccccga aatcccagcc    600
ggactccctt caccgaggtc ggaatccgg                                      629
<210>12
<211>208
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
            20                  25                  30
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
        35                  40                  45
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
    50                  55                  60
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
65                  70                  75                  80
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
                85                  90                  95
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
            100                 105                 110
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
        115                 120                 125
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
    130                 135                 140
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
                165                 170                 175
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
            180                 185                 190
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Ser Gly
        195                 200                 205
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5′scFv抗-EpCAM(4-7)引物
<400>13
cattttcctg ataactccgg aggtgg                                           26
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3′scFv抗-EpCAM(4-7)引物
<400>14
aagtccggat ttgatctcaa gcttggtccc                                       30
<210>15
<211>2160
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B7.1-scFv抗EpCAM-hu4-1BBL核酸序列
<400>15
atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt    60
cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag    120
gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca    180
caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac    240
atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc    300
attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag    360
tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct    420
gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata    480
atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa    540
gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt    600
agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat    660
ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct    720
gataactccg gaggtggtgg atccgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg    780
gcgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcacaaac    840
tatggtttaa gctgggtgaa gcagaggcct ggacaggtcc ttgagtggat tggagaggtt    900
tatcctagaa ttggtaatgc ttactacaat gagaagttca agggcaaggc cacactgact    960
gcagacaaat cctccagcac agcgtccatg gagctccgca gcctgacctc tgaggactct    1020
gcggtctatt tctgtgcaag acggggatcc tacgatacta actacgactg gtacttcgat    1080
gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggtg gtggtggttc tggcggcggc    1140
ggctccggtg gtggtggttc tgagctcgtg atgacccaga ctccactctc cctgcctgtc    1200
agtcttggag atcaagcctc catctcttgc agatctagtc agagccttgt acacagtaat    1260
ggaaacacct atttacattg gtacctgcag aagccaggcc agtctccaaa gctcctgatc    1320
tacaaagttt ccaaccgatt ttctggggtc ccagacaggt tcagtggcag tggatcaggg    1380
acagatttca cactcaagat cagcagagtg gaggctgagg atctgggagt ttatttctgc    1440
tctcaaagta cacatgttcc gtacacgttc ggagggggga ccaagcttga gatcaaatcc    1500
ggaggtggtg gatccctcgc ctgcccctgg gccgtgtccg gggctcgcgc ctcgcccggc    1560
tccgcggcca gcccgagact ccgcgagggt cccgagcttt cgcccgacga tcccgccggc    1620
ctcttggacc tgcggcaggg catgtttgcg cagctggtgg cccaaaatgt tctgctgatc    1680
gatgggcccc tgagctggta cagtgaccca ggcctggcag gcgtgtccct gacggggggc    1740
ctgagctaca aagaggacac gaaggagctg gtggtggcca aggctggagt ctactatgtc    1800
ttctttcaac tagagctgcg gcgcgtggtg gccggcgagg gctcaggctc cgtttcactt    1860
gcgctgcacc tgcagccact gcgctctgct gctggggccg ccgccctggc tttgaccgtg    1920
gacctgccac ccgcctcctc cgaggctcgg aactcggcct tcggtttcca gggccgcttg    1980
ctgcacctga gtgccggcca gcgcctgggc gtccatcttc acactgaggc cagggcacgc    2040
catgcctggc agcttaccca gggcgccaca gtcttgggac tcttccgggt gacccccgaa    2100
atcccagccg gactcccttc accgaggtcg gaatccgggc atcatcacca tcatcattga    2160
<210>16
<211>687
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>B7.1-scFv抗EpCAM-hu4-1BBL氨基酸序列
<400>16
Gly Leu Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu
            20                  25                  30
Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu
        35                  40                  45
Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg
    50                  55                  60
Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu
                85                  90                  95
Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val
            100                 105                 110
Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr
        115                 120                 125
Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu
    130                 135                 140
Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn
145                 150                 155                 160
Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser
                165                 170                 175
Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile
            180                 185                 190
Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr
        195                 200                 205
Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
    210                 215                 220
Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
225                 230                 235                 240
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
                245                 250                 255
Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly
            260                 265                 270
Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
        275                 280                 285
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met
    290                 295                 300
Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
305                 310                 315                 320
Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
                325                 330                 335
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
            340                 345                 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr
        355                 360                 365
Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
    370                 375                 380
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
385                 390                 395                 400
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
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Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
            420                 425                 430
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
        435                 440                 445
Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe
    450                 455                 460
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
465                 470                 475                 480
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
                485                 490                 495
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
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Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
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Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
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Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
545                 550                 555                 560
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
                565                 570                 575
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
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Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
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Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
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Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
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Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
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Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
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Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Ser Gly
        675                 680                 685
<210>17
<211>2214
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗-NKG2D-抗-EpCAM-人4-1BBL核酸序列
<400>17
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gtcaccatca catgtcgagc aagtgggaat attcacaatt atttagcttg gtatcagcag    180
aaacagggaa aatctcctca ggtcctggtc tataatgcaa aaaccttagc agatggtgtg    240
ccatcaaggt tcagtggcag tggatcagga acacaatatt ccctcaagat caacagcctg    300
cagcctgaag attttgggag ttattactgt caacattttt ggagtactac gtggacgttc    360
ggtggaggga ccaagctcga gatcaaaggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt    420
ggtggtggtt ctcaggtcca actgcagcag tctggggctg agctggtgag gcctggggct    480
tcagtgaagc tgtcctgcaa ggcttctggc tacacgttca ccagctactg gatgaactgg    540
gttcagcaga ggcctgagca aggccttgag tggattggaa ggattgatcc ttacgatagt    600
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cctggggctt cagtgaagct gtcctgcaag gcttctggct acaccttcac aaactatggt    900
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agaattggta atgcttacta caatgagaag ttcaagggca aggccacact gactgcagac    1020
aaatcctcca gcacagcgtc catggagctc cgcagcctga cctctgagga ctctgcggtc    1080
tatttctgtg caagacgggg atcctacgat actaactacg actggtactt cgatgtctgg    1140
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc    1200
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ggagatcaag cctccatctc ttgcagatct agtcagagcc ttgtacacag taatggaaac    1320
acctatttac attggtacct gcagaagcca ggccagtctc caaagctcct gatctacaaa    1380
gtttccaacc gattttctgg ggtcccagac aggttcagtg gcagtggatc agggacagat    1440
ttcacactca agatcagcag agtggaggct gaggatctgg gagtttattt ctgctctcaa    1500
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ccacccgcct cctccgaggc tcggaactcg gccttcggtt tccagggccg cttgctgcac    2040
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gccggactcc cttcaccgag gtcggaatcc gggcatcatc accatcatca ttga          2214
<210>18
<211>709
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>抗-NKG2D-抗-EpCAM-人4-1BBL氨基酸序列
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Val Leu Val
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Thr Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
        115                 120                 125
Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys
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Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Gln
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Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr
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Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
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Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Gly Asp Tyr
    210                 215                 220
Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu
                245                 250                 255
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
            260                 265                 270
Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
        275                 280                 285
Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr
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Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp
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Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp
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Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu
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ttctttaaaa tgaacagtct gcaagctaat gacacagcca tatattactg tgccagaatg    660
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<220>
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Glu
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Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
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Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg
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Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
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Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser
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Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
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Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
        355                 360                 365
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
    370                 375                 380
Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
385                 390                 395                 400
Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
                405                 410                 415
Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
            420                 425                 430
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
        435                 440                 445
Glu Ser Gly
    450
<210>21
<211>729
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>scFv抗CD3核酸序列
<400>21
gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg    60
tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg    120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac    180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat    300
gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagtc    360
gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagtcga cgacattcag    420
ctgacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc    480
agagccagtt caagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc    540
aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tcccttatcg cttcagtggc    600
agtgggtctg ggacctcata ctctctcaca atcagcagca tggaggctga agatgctgcc    660
acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg    720
gagctgaaa                                                            729
<210>22
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>scFv抗CD3氨基酸序列
<400>22
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
    130                 135                 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145                 150                 155                 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
                165                 170                 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225                 230                 235                 240
Glu Leu Lys

Claims (48)

1.三聚体多肽构建体，其中该三聚体多肽构建体的每种单体由两个或三个结构域组成，并且其中第一个结构域为4-1BBL的胞外结构域或者其部分，第二个结构域由位于第一个结构域N-末端的抗原相互作用位点组成和任选地，第三个结构域通过肽接头结合所述第一个和第二个结构域，其中所述肽接头不含有任何聚合活性。
2.权利要求1的三聚体多肽构建体，其中所述胞外结构域是4-1BBL的完整胞外结构域。
3.权利要求1或2的三聚体多肽构建体，其中所述抗原相互作用位点含有与独立的抗原特异相互作用的至少两个结构域。
4.权利要求3的三聚体多肽构建体，其中所述至少两个结构域通过肽接头结合。
5.权利要求1到4中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述抗原相互作用位点特异于一种或多种细胞表面标记。
6.权利要求5的三聚体多肽构建体，其中所述细胞表面标记为肿瘤标记。
7.权利要求1到6中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述抗原相互作用位点含有至少一个结构域为抗体来源的区域。
8.权利要求1到7中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述抗原相互作用位点含有至少两个抗体来源的区域。
9.权利要求1到8中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述抗原相互作用位点含有B7家族成员的胞外结构域或者其片段或衍生物，所述胞外结构域或者其片段或衍生物能够结合它的特异受体。
10.权利要求1到9中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述抗原相互作用位点选自scFv、Fab、和单一Ig可变区。
11.权利要求10的三聚体多肽构建体，其中所述scFv选自对EpCAM、NKG2D、CD19、PSMA、MCSP、stn(TAG72)、CD44v6、碳酸酐酶IX(CAIX)、CEA、EGFR、CD33、Wue-1、CD3、Muc-1、CD20、Her2-neu、Her3、Her4和Lewis-Y特异的scFv。
12.权利要求9到11中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述B7家族成员或者其片段或衍生物选自B7.1、B7.2、B7-H3、B7-RP1、B7-DC、PDL1和PDL2。
13.权利要求1到12中任一项的三聚体多肽构建体，其中每种单体的所述第二个结构域含有对EpCAM特异的scFv。
14.权利要求13的三聚体多肽构建体，其中每种单体具有如SEQ IDNO：20中所示的氨基酸序列。
15.权利要求1到12中任一项的三聚体多肽构建体，其中每种单体的所述第二个结构域含有来自/或衍生自单克隆抗体237的scFv。
16.权利要求15的三聚体多肽构建体，其中每种单体具有如SEQ IDNO：8中所示的氨基酸序列。
17.权利要求1到12中任一项的三聚体多肽构建体，其中每种单体的所述第二个结构域含有对EpCAM特异的scFv和对NKG2D特异的scFv。
18.权利要求17的三聚体多肽构建体，其中每种单体具有如SEQ IDNO：18中所示的氨基酸序列。
19.权利要求1到12中任一项的三聚体多肽构建体，其中每种单体的所述第二个结构域含有双特异性scFv构建体，其中至少一种scFv对CD3特异。
20.权利要求19的三聚体多肽构建体，其中每种单体中对CD3特异的scFv具有如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列。
21.权利要求7到12中任一项的三聚体多肽构建体，其中每种单体的所述第二个结构域含有对EpCAM特异的scFv和抗原相互作用位点，该作用位点为能够结合其特异受体的B7.1的胞外结构域或者其片段或其衍生物。
22.权利要求21的三聚体多肽构建体，其中每种单体具有如SEQ IDNO：16中所示的氨基酸序列。
23.权利要求1到12中任一项的三聚体多肽构建体，其由至少两种不同的单体组成，其中所述不同单体的特征在于不同的抗原相互作用位点。
24.权利要求1到23中任一项的三聚体多肽构建体，其中至少一种单体还含有标签。
25.权利要求24的三聚体多肽构建体，其中所述标签为位于至少一种单体的C-末端的HIS-标签。
26.权利要求1到25中任一项的三聚体多肽构建体，其中所述多肽构建体在真核表达系统中表达。
27.编码权利要求1到26中任一项的三聚体多肽构建体的单体的核酸分子。
28.含有权利要求27的核酸分子的载体。
29.权利要求28的载体，其中核酸分子为DNA。
30.权利要求28或29的载体，其为表达载体，其中编码权利要求1到26中任一项的三聚体多肽构建体的单体的核酸分子与允许在原核和/或真核宿主中转录和任选表达的一种或多种控制序列有效连接。
31.权利要求30的载体，其为pEF-DHFR或pEF-ADA。
32.含有权利要求28到31中任一项的至少一种载体或者权利要求27的至少一种核酸分子的宿主。
33.权利要求32的宿主，其为细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。
34.权利要求32的宿主，其为哺乳动物细胞。
35.权利要求34的宿主，其为人细胞或人细胞系。
36.产生三聚体多肽构建体的方法，所述方法包括在允许多肽构建体表达的条件下培养权利要求32到35中任一项的宿主，并从培养物回收所产生的多肽构建体。
37.权利要求36的方法，其中所述表达导致至少90％的三聚化率并从培养物中回收所产生的多肽构建体。
38.组合物，其含有权利要求1到26中任一项或者通过权利要求36或37的方法产生的三聚体多肽构建体、权利要求27的核酸分子、权利要求28到31中任一项的载体或者权利要求32到35中任一项的宿主和任选地，能够为免疫效应细胞提供活化信号的蛋白质化合物。
39.权利要求38的组合物，其是药物组合物，还任选地含有载体、稳定剂和/或赋形剂的适宜制剂。
40.权利要求39的组合物，其是诊断组合物，还任选包含检测手段和方法。
41.权利要求1到26中任一项或者通过权利要求36或37的方法产生的三聚体多肽构建体、权利要求27的核酸分子、权利要求28到31中任一项的载体或者权利要求32到35中任一项的宿主的用途，用于制备预防、治疗或减轻增殖性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、传染病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主疾病或者宿主抗移植物疾病的药物组合物。
42.权利要求41的用途，其中所述肿瘤疾病为上皮癌或者最小残留癌。
43.用于预防、治疗或减轻增殖性疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、传染病、病毒性疾病、变态反应、寄生虫反应、移植物抗宿主疾病或者宿主抗移植物疾病的方法，其包括对需要这种治疗、预防或减轻的受试者施用权利要求1到26中任一项或者通过权利要求36或37的方法产生的三聚体多肽构建体、权利要求27的核酸分子、权利要求28到31中任一项的载体或者权利要求32到35中任一项的宿主。
44.权利要求43的方法，其中所述肿瘤疾病为上皮癌或者最小残留癌。
45.权利要求43或44的方法，其中所述受试者为人。
46.权利要求43到45中任一项的方法，其还包括施用能够为免疫效应细胞提供活化信号的蛋白质化合物。
47.权利要求46的方法，其中所述蛋白质化合物与权利要求1到26中任一项或者通过权利要求36或37的方法产生的三聚体多肽构建体、权利要求27的核酸分子、权利要求28到31中任一项的载体或者权利要求32到35中任一项的宿主同时或非同时施用。
48.试剂盒，其含有权利要求1到26中任一项或者通过权利要求36或37的方法产生的三聚体多肽构建体、权利要求27的核酸分子、权利要求28到31中任一项的载体或者权利要求32到35中任一项的宿主。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101698852A (zh) * 2009-10-23 2010-04-28 江苏先声药物研究有限公司 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
CN107207579A (zh) * 2015-03-31 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
CN108264558A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海近岸生物科技有限公司 融合抗cd19、抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的三特异性分子及应用
CN108264561A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海近岸生物科技有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用
CN108264559A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海近岸生物科技有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞正共刺激分子的三功能分子及其应用
CN110088135A (zh) * 2016-12-20 2019-08-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd20/抗cd3双特异性抗体和4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CN111741979A (zh) * 2018-04-13 2020-10-02 豪夫迈·罗氏有限公司 包含4-1BBL的Her2靶向性抗原结合分子
CN112480255A (zh) * 2007-07-09 2021-03-12 健泰科生物技术公司 在多肽的重组生产期间防止二硫键还原
CN114181309A (zh) * 2015-05-21 2022-03-15 鳄鱼生物科学公司 新型多肽

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0425569D0 (en) * 2004-11-19 2004-12-22 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1736482A1 (en) * 2005-06-20 2006-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Recombinant trimeric 4-1BBL
AU2012244244B2 (en) * 2005-08-11 2015-08-27 Arpi Matossian-Rogers TCR-V-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease
AU2013200209B9 (en) * 2007-03-01 2015-07-09 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
DK2356153T3 (en) * 2008-10-01 2016-07-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Bispecific single CHAIN ​​PSMAXCD3 ANTIBODY THAT ARE SPECIFICALLY TO ALL SPECIES
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
WO2014121085A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Pd-l1 and pd-l2-based fusion proteins and uses thereof
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
AU2016215604B2 (en) 2015-02-02 2020-08-13 The University Of Birmingham Targeting moiety peptide epitope complexes having a plurality of T-cell epitopes
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
AU2016341321A1 (en) * 2015-10-23 2018-06-07 Sorrento Therapeutics, Inc. Programmable universal cell receptors and methods of using the same
EP3377103B1 (en) 2015-11-19 2021-03-17 Revitope Limited Functional antibody fragment complementation for a two-components system for redirected killing of unwanted cells
EP3231813A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
JP2019528689A (ja) * 2016-08-11 2019-10-17 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ 免疫調節化合物
EP3579848A4 (en) 2017-02-08 2021-03-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER
AU2018220736A1 (en) 2017-02-20 2019-09-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
LT3606946T (lt) 2017-04-03 2022-10-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-1 antikūno imunokonjugatai su mutantiniu il-2 arba su il-15
KR102346336B1 (ko) 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
CN112368012A (zh) 2018-02-08 2021-02-12 蜻蜓疗法股份有限公司 靶向nkg2d受体的抗体可变结构域
US20220047631A1 (en) * 2018-09-11 2022-02-17 The University Of Chicago Cancer treatment with 237 car-t cell based therapeutics recognizing the tn epitope
KR102503349B1 (ko) 2019-05-14 2023-02-23 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
TW202140561A (zh) * 2020-02-14 2021-11-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd3結合之雙特異性抗體
WO2023137364A2 (en) * 2022-01-14 2023-07-20 The Jackson Laboratory Sars-cov-2 therapies

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7211259B1 (en) * 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
WO1994026290A1 (en) * 1993-05-07 1994-11-24 Immunex Corporation Cytokine designated 4-1bb ligand and human receptor that binds thereto
US6723538B2 (en) * 1999-03-11 2004-04-20 Micromet Ag Bispecific antibody and chemokine receptor constructs
US20040214783A1 (en) * 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
DE10045592A1 (de) * 2000-09-15 2002-03-28 Klaus Pfizenmaier Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112480255A (zh) * 2007-07-09 2021-03-12 健泰科生物技术公司 在多肽的重组生产期间防止二硫键还原
CN101698852A (zh) * 2009-10-23 2010-04-28 江苏先声药物研究有限公司 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
WO2011047631A1 (zh) * 2009-10-23 2011-04-28 江苏先声药物研究有限公司 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
CN107207579A (zh) * 2015-03-31 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
CN107207579B (zh) * 2015-03-31 2022-02-25 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
CN114181309A (zh) * 2015-05-21 2022-03-15 鳄鱼生物科学公司 新型多肽
CN110088135A (zh) * 2016-12-20 2019-08-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd20/抗cd3双特异性抗体和4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CN108264558A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海近岸生物科技有限公司 融合抗cd19、抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的三特异性分子及应用
CN108264561A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海近岸生物科技有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用
CN108264559A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海近岸生物科技有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞正共刺激分子的三功能分子及其应用
CN108264558B (zh) * 2016-12-30 2021-01-15 上海近岸生物科技有限公司 融合抗cd19、抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的三特异性分子及应用
CN111741979A (zh) * 2018-04-13 2020-10-02 豪夫迈·罗氏有限公司 包含4-1BBL的Her2靶向性抗原结合分子

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