DE10045592A1 - Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie - Google Patents

Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie

Info

Publication number
DE10045592A1
DE10045592A1 DE10045592A DE10045592A DE10045592A1 DE 10045592 A1 DE10045592 A1 DE 10045592A1 DE 10045592 A DE10045592 A DE 10045592A DE 10045592 A DE10045592 A DE 10045592A DE 10045592 A1 DE10045592 A1 DE 10045592A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
region
tnf
polypeptide according
polypeptide
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10045592A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Wueest
Klaus Pfizenmaier
Dieter Moosmayer
Matthias Grell
Peter Scheurich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE10045592A priority Critical patent/DE10045592A1/de
Priority to KR10-2003-7003738A priority patent/KR20030048041A/ko
Priority to JP2002527275A priority patent/JP2004508828A/ja
Priority to AU2001293819A priority patent/AU2001293819A1/en
Priority to US10/380,438 priority patent/US20040053829A1/en
Priority to PCT/EP2001/010730 priority patent/WO2002022833A1/de
Priority to EP01974261A priority patent/EP1317556A1/de
Priority to EEP200300100A priority patent/EE200300100A/xx
Priority to IL15418501A priority patent/IL154185A0/xx
Priority to BR0113928-2A priority patent/BR0113928A/pt
Priority to CA002422759A priority patent/CA2422759A1/en
Priority to MXPA03002229A priority patent/MXPA03002229A/es
Priority to SK281-2003A priority patent/SK2812003A3/sk
Priority to YU18903A priority patent/YU18903A/sh
Priority to PL36054001A priority patent/PL360540A1/xx
Priority to RU2003106429/13A priority patent/RU2003106429A/ru
Priority to HU0301693A priority patent/HUP0301693A3/hu
Priority to CNB018157645A priority patent/CN1214115C/zh
Publication of DE10045592A1 publication Critical patent/DE10045592A1/de
Priority to BG107613A priority patent/BG107613A/bg
Priority to ZA200302008A priority patent/ZA200302008B/en
Priority to HR20030192A priority patent/HRP20030192A2/hr
Priority to NO20031185A priority patent/NO20031185L/no
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Die vorliegende Erfindung, umfassend ein Polypeptid mit antitumoralen und immunmodulierenden Zytokineigenschaften, welches biologisch inaktiv ist, bevor es nicht in vivo durch die erfindungsgemäßen Regionen entsprechend prozessiert wurde, bestehend aus einer zentralen Region mit spezifischer biologischer Aktivität, an dessen C-terminalem Ende sich eine Region mit einer Prozessierungseinheit und einer Inhibitordomäne, am N-terminalen Ende eine Region, die ein Makromolekül auf einer Zelloberfläche selektiv erkennt, befindet.

Description

Der Einsatz von rekombinantem Tumornekrosefaktor (TNF) zur Behandlung von Tumorerkrankungen ist bisher wegen starker systemischen Nebenwirkungen, die als therapiebegrenzend anzusehen sind, nur unter speziellen, aufwendigen Behandlungs­ protokollen (isolated limb perfusion) bei sehr begrenzten Indikationen (Melanom/Sarkom- Metastasen der Extremitäten) mit Erfolg durchführbar. Aus diesen klinischen Daten kann man abschätzen, daß etwa eine 10 bis 100-fach höhere TNF-Dosis als die MTD (Max. Tolerated Dose) zur anti-tumoralen Wirksamkeit benötigt würde als es die massiven systemischen Nebenwirkungen zulassen.
Aufgabe der Erfindung ist die unerwünschten Folgen einer Behandlung mit TNF-haltigen Substanzen zu lindern oder zu beseitigen, unter gleichzeitiger Beibehaltung bzw. Verstärkung der anti-tumoralen Eigenschaften von TNF.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Polypeptid mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist ein modular aufgebautes, homotrimeres Fusionsprotein mit dem Zytokin TNF als antitumoralem Prinzip, welches seine biologische Wirkung durch Verknüpfung mit zwei weiteren Funktionsmodulen gezielt im Tumorareal freisetzt. Dies wird erreicht durch N-terminale Verknüpfung des TNF Moleküls mit tumorspezifischen scFv-Antikörper Derivaten und der C-terminalen Verknüpfung mit einem Peptid-Inhibitor, welcher selektiv im Tumorareal durch gezielte proteolytische Abspaltung aus dem Fusionsprotein entfernt wird und so ein am selektiven Zielmolekül gebundenes, bioaktives TNF entsteht. Zwischen dem scFv und dem TNF Modul befindet sich eine Trimerisierungsdomäne, die die Ausbildung von kovalenten Disulfidbrücken und damit eine regelmäßige und stabile Homotrimerisierung des Fusionsproteins gewährleistet. Mit diesem Konstrukt sollen lokal hohe TNF Wirkkonzentrationen erreicht werden, ohne dass es zu systemisch erhöhten TNF Spiegeln (z. B. im Serum) und damit therapielimitierenden Nebenwirkungen kommt. Gleichzeitig wird durch die Antikörper vermittelte Präsentation des vor Ort aktivierten TNF eine Wirkung erzielt, die der des natürlichen Membran-TNF entspricht, d. h. es kommt zur Coaktivierung beider TNF Rezeptor Typen und damit zur Potenzierung der antitumoralen Eigenschaften von TNF. Durch Auswahl der Spezifität des scFv Targeting Moduls kann ein auf die jeweilige Tumorentität spezifisch abgestimmtes/optimiertes Therapeutikum hergestellt werden.
Prinzip
Die Prodrug TNF-Selektokin ist ein rekombinantes, homotrimeres Fusionsprotein prinzipiell bestehend aus einer definierten Abfolge der folgenden Strukturelemente (Monomer): N terminal- 1 - ein murines, humanisiertes oder humanes Einzelkettenantikörperfragment (scFv) definierter Antigenspezifität bestehend aus VH-linker- VL; 2 - einem Peptidlinker mit intrinsischen Trimerisierungs-Eigenschaften; 3 - der humanen extrazellulären Domäne des TNF (mature 17 kDa Form, AA 1-157, Swissprot P01375); 4 - ein variables Linkerpeptid mit spezifischen Protease Spaltstellen, 5 ein spezifisch TNF bindendes Protein bzw. Peptid-C terminal.
Das Targeting Modul (1) besteht vorzugsweise aus einem typischen, nach dem Stand der Technik hergestellten Einzelkettenantikörperfragment (scFv) murinen, durch CDR grafting humanisierten oder vollständig humanen Ursprungs mit Spezifität für ein im Tumorgewebe selektiv bzw. dominant exprimiertes Antigen, wobei dies prinzipiell auf den malignen Zellen selbst exprimiert sein kann, vorzugsweise aber im nichtmalignen Anteil des Tumors, den Stromazellen oder dem Tumorendothel, exprimiert wird. Derartige Antigene nichtmaligner Gewebeanteile eines soliden Tumors (Karzinoms) sind einerseits genetisch invariant, andererseits bei unterschiedlichsten Tumorentitäten vorkommend und damit universelle Tumormarker. Beispielsweise seien hier der VEGFR bzw. der VEGFR/VEGF Komplex sowie das Integrin αvβ3, das Endosialin und die Fibronektin Isoform bFn als weitgehend selektive Zielstrukturen des Tumorendothels und das Fibroblast activation protein (FAP) als selektiver Marker des Tumorstromas genannt, die mit spezifischen, hochaffinen scFv wirksam erfasst werden können.
Das Trimerisierungsmodul (2) besteht vorzugsweise aus einer Domäne des Tenascin Moleküls (AA # 110-139, Swiss Prot. # P10039, Huhn; oder Swissprot # P24821, Mensch) oder einem anderen, natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Linker Peptid mit intrinsischen Trimerisierungseigenschaften. Es stellt die Verbindung zwischen scFv (1) und TNF (3) Molekül her und gewährleistet gleichzeitig die kovalente, homotrimere Verknüpfung des Fusionsproteins während der Biogenese.
Das TNF Modul (3) besteht aus einem TNF Vorläuferprotein oder vorzugsweise einem dem prozessierten, reifen Wildtyp TNF Molekül (AA 1-157, s. o.) identischen Protein, oder daraus abgeleiteten Mutanten mit selektiven Rezeptorbindungseigenschaften oder Mutanten, die hinsichtlich ihrer spezifischen Bioaktivität oder anderer Eigenschaften (Stabilität, Proteaseresistenz) optimiert wurden.
Das Protease sensitive Linkerpeptid (4) ist in Aminosäurezusammensetzung und Gesamtlänge so beschaffen, dass er die durch das Trimerisierungsmodul und TNF selbst bewirkte Homo-Trimerisierung des Fusionsproteins zulässt, gleichzeitig aber auch eine hochaffine, stabile Bindung des im Molekül C-terminal befindlichen TNF Inhibitors (z. B. die extrazelluläre TNF Rezeptordomäne) an den TNF Anteil erlaubt, sodass hierdurch die Bindung des TNF Moduls an zellexprimierte TNF Rezeptoren verhindert wird. Der Linker ist weiterhin so beschaffen, dass er mindestens eine, vorzugsweise mehrere selektive Spaltstellen für solche extrazellulären oder zellassozierten Proteasen enthält, die vorzugsweise selektiv im Tumorgewebe nachgewiesen werden; beispielsweise könnte der Linker Spaltstellen für Urokinase Typ Plasminogenaktivator (uPA), Gewebsplasminogen­ aktivator (tPA), den aktivierten Gerinnungsfaktor VIIa, Matrix Metalloproteasen wie MMP2 oder für die hochselektiv im Stroma des Tumors membranständig exprimierte Protease FAP enthalten. Die Struktur des Linkers ist so zu wählen, dass die Protease Erkennungssequenz frei zugänglich ist, d. h. eine effektive Prozessierung durch spezifische Proteasen möglich ist, und nach Spaltung des Fusionsproteins evtl. am TNF Molekül verbleibende Aminosäuren des Linkers die Bioaktivität des TNF nicht negativ beeinflussen.
Das TNF inhibierende Modul (5) besteht vorzugsweise aus der vollständigen oder partiellen extrazellulären Domäne eines humanen TNF Rezeptors, z. B. insbesondere des hu TNFR1 (synomym p55/60TNFR; Swissprot P19438, AA 1-190; bzw. Fragmente dieses Moleküls, beispielsweise AA 1-157 bzw. AA 60-120). Andere, spezifisch TNF bindende Proteine, etwa die extrazelluläre Domäne des huTNFR2 (genEMBL M32315) oder Proteine viralen Ursprungs wie z. B. das T2 Protein, sowie jeweils davon abgeleitete synthetische Peptide, die TNF Bindungseigenschaft besitzen und mit der TNF Bindung an Zellmembran­ ständige TNF Rezeptoren interferieren, sind prinzipiell auch geeignet. Damit ist das Fusionsprotein in diesem Zustand biologisch inaktiv, d. h. es befindet sich in der Proform.
Zur vereinfachten Reinigung des Proteins und in vitro Analytik kann C-terminal am TNFR Fragment ein aus dem Vektor POPE entnommener myc-His6-Tag angefügt werden.
Wirkprinzip
Ein TNF-Selektokin ist ein kovalent verküpftes, homotrimeres Molekül bestehend aus der oben im Detail erläuterten Fusion von drei Funktionsdomänen, dem tumorspezifischem Antikörpermodul, TNF und dem blockierendem TNF-Bindeprotein (extrazelluläre Rezeptordomäne oder davon abgeleitetes Peptid) sowie dazwischenliegenden funktionellen Linkem mit Trimerisierungseigenschaften bzw. spezifischen Protease-Spaltstellen, welches in diesem kompletten Zustand in Bezug auf die TNF Wirkung inaktiv ist. Das Selektokin wird nach in vivo Verabreichung durch den Antikörper Anteil zunächst spezifisch im Tumorareal angereichert und dort durch die vom Tumor selbst oder das reaktive Tumorstroma/Tumorgefäßsystem gebildete Proteasen (z. B. FAP, uPA, tPA, MMP2, Faktor VIIa) prozessiert, d. h. das inhibierende Peptid wird abgespalten. Nach selektiver proteolytischer Spaltung dissoziiert das TNFR Fragment/Inhibitorpeptid vom trimeren TNF Molekül, letzteres wird somit bioaktiv; das prozessierte TNF bindet nun bevorzugt an zellständige TNF-Rezeptoren, da diese, als homomultimere Moleküle, eine wesentlich höhere Affinität besitzen als die monomeren, löslichen Rezeptor-Fragmente. Die Selektivität der TNF Wirkung wird mit dem vorliegenden Selektokin also durch zwei Maßnahmen erreicht: Einerseits über die scFv vermittelte selektive Anreicherung der inaktiven Prodrug im Tumor und deren Retention auch nach proteolytischer Aktivierung, andererseits über die ortsspezifische Umwandlung der Prodrug durch Proteasen, welche ausschließlich im Tumorareal in signifikanter Aktivität nachweisbar sind. Durch die scFv vermittelte Bindung des TNF an membranständige Antigene wird darüberhinaus eine weitere bevorzugte Wirkung des Selektokins erreicht, nämlich eine gegenüber dem löslichen TNF Molekül verbesserte biologische Wirkung, die der des natürlichen Membran-TNF Moleküls ähnlich ist: Durch die scFv vermittelte Fixierung des TNF wird das Dissoziationsgleichgewicht am TNFR2 hin zu einer stabileren Bindung verschoben und damit dessen Aktivierung erreicht. Es ist bekannt, dass die simultane Aktivierung beider TNFR zu einem kooperativen Signalmechanismus und daraus resultierend verstärkten zellulären Reaktionen, insbesondere Aktivierung von Endothelzellen und Induktion von Apoptose in Tumorzellen, die diesbezüglich resistent gegenüber löslichen TNF sind, führen kann.
Die Expression des Fusionsproteins erfolgt in geeigneten Expressionssystemen, vorzugsweise als sezerniertes Produkt selektionierbarer, stabiler Transfektanden der Zell Linie CHO DG44 oder nach transienter expression in COS7 Zellen (siehe Beispiele). Andere, dem Stand der Technik entsprechende eukariontische Expressionssysteme, z. B. Pichia pastoris, Insekten oder Säugerzellen, mit den für das jeweilige Zellsystem für Sekretion geeigneten Expressionsvektoren, z. B. wie in Brocks et al (Immunotechnology 3: 173-184, 1997) für Säuger und Insektenzellen beschrieben bzw. pPICZalpha Vektoren (INVITROGEN) zur Expression und Sekretion in der Hefe Pichia pastoris, sind prinzipiell ebenso geeignet.
Beispiel eines TNF-Selektokins Beispiele der Sequenz eines TNF- Selektokins mit multiplen Schnittstellen im Linker und verschiedenen Rezeptorfragmenten
  • 1. scFv-TDTenascin-huTNF (AS 1-157)-linker-huTNFR1 (AS 1-190).
  • 2. scFv-TDTenascin-huTNF (AS 1-157)-linker-huTNFR1 (AS 60-120).
Alternativ ist eine Variante vorgesehen, bei der potentielle, endogene Schnittstellen im huTNF Molekül durch Aminosäureaustausch entfernt wurden (TNFmut I83F, R131Q) unter Beibehaltung der scFV, Linker- und Rezeptorsequenz wie oben exemplarisch dargestellt. Schema der Konstrukte.
Als Trimerisierungsdomäne ist die bei verschiedenen Spezies hochkonservierte coiled-coil Domäne von Tenascin-C (AS 110-139) vorgesehen: Beispiel der AS-Sequenz:
Huhn: ACGCAAAPIVKDLLSRLEELEGLVSSLREQ (swissprot #P10039)*
Mensch: ACGCAAAPDVKELLSRLEELENLVSSLREQ (swissprot #P24821)#
*Nies, D. E., Hemesath, T. J., Kim, J. H., Gulcher, J. R. and Stefansson, K. The complete cDNA sequence of human hexabrachion (Tenascin). A multidomain protein containing unique epidermal growth factor repeats. J. Biol. Chem. 266 (5), 2818-2823 (1991)
# Spring, J., Beck, K. and Chiquet-Ehrismann, R. Two contrary functions of tenascin: dissection of the active sites by recombinant tenascin fragments. Cell 59 (2), 325-334 (1989)
Beispiel einer Linker Sequenz mit den Proteasespaltstellen Thrombin, tPA, Factor VIIa, uPA
SEQUENZPROTOKOLL ANMELDER
NAME: Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier
STRASSE: Seehausstraße 7
ORT: Tiefenbronn
POSTLEITZAHL: 75233
AKTENZEICHEN: 100 45 592.1
TELEFON: 07 11/6 85 69 86
TELEFAX: 07 11/6 85 74 84
BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG
Selektokin
ANZAHL DER SEQUENZEN
2 DNA Sequenzen
2 Proteinsequenzen
COMPUTERLESBARE FASSUNG
DATENTRÄGER: Diskette
COMPUTER: PC
BETRIEBSSYSTEM: MS DOS
SOFTWARE: Windows NT
Sequenzbeschreibung 1
Kodierende DNA Sequenz (unten, nur kodierender DNA Strang, Nukleotid (NT) 1-1977) und translatierte Aminosäuresequenz (oben, Einzelbuchstaben Kodierung der Aminosäuren (AS) 1-658) eines erfindungsgemäßen Selektokins am Beispiel einer TNF Selektokin-Prodrug pW24.
Merkmale von pW24
Leitpeptidsequenz:
NT 1-57, AS 1-19
Antikörper-Modul: FAP spezifischer scFvOS4
(in Mersmann, (2000), Dissertation Uni Stuttgart, Verlag Grauer, Stuttgart, ISBN 3-86186-335-9:
NT 58-855, AS 20-285
Trimerisierungsdomäne: AS 110-139 des Tenascins vom (Huhn):
NT 856-945, AS 286-315
Linker:
NT 946-963, AS 316-321
TNF-Modul: N-terminale Deletion von AS 1-56 und 78-89 (TNFdelta 1-56, 78-89
) des humanen TNF Präkursors (26 kDa Membranform), i. e. Deletion der cytoplasmatischen Domäne, der Transmembrandomäne und der TACE Spaltstelle des TNF Präkursors:
NT 964-1458, AS 322-486
Linker mit Proteasespaltstellen:
NT 1459-1536, AS 487-512
Inhibitor-Modul: TNFR-Fragment AS 12-138 des humanen TNF-R1 wie in Himmler et al (1990) (DNA and Cell Biology 9: 705-715) beschrieben:
NT 1537-1917, AS 513-639
Myc-Tag:
NT 1918-1956, AS 640-652
His-Tag:
NT 1957-1974, AS 653-658
Stop:
NT 1975-1977
Sequenzbeschreibung 2 pW 33
Kodierende DNA Sequenz (unten, nur kodierender DNA Strang, Nukleotid (NT) 1-1806) und translatierte Aminosäuresequenz (oben, Einzelbuchstaben Kodierung der Aminosäuren (AS) 1-601) eines erfindungsgemäßen Selektokins am Beispiel der TNF Selektokin-Prodrug pW 33.
Merkmale von pW 33
pW-33 (Sequenz2) besitzt gleiche funktionelle Eigenschaften wie pW24 (Sequenz 1), unterscheidet sich von diesem durch ein verkürztes TNFR Fragment und einen verlängerten Protease-sensitiven Linker zwischen TNF und TNFR Fragment.
Leitpeptidsequenz:
NT 1-57, AS 1-19
Antikörper-Modul: FAP spezifischer scFvOS4
(in Mersmann, (2000), Dissertation Uni Stuttgart, Verlag Grauer, Stuttgart, ISBN 3-86186-335-9:
NT 58-855, AS 20-285
Trimerisierungsdomäne: AS 110-139 des Tenascins vom (Huhn):
NT 856-945, AS 286-315
Linker:
NT 946-963, AS 316-321
TNF-Modul: N-terminale Deletion von AS 1-56 und 78-89 (TNFdelta 1-55, 78-89) des humanen TNF Präkursors (26 kDa Membranform), i. e. Deletion der cytoplasmatischen Domäne, der Transmembrandomäne und der TACE Spaltstelle des TNF Präkursors:
NT 964-1458, AS 322-486
Linker mit Proteasespaltstellen:
NT 1459-1560, AS 487-520
Inhibitor-Modul: TNFR-Fragment AS 54-115 des humanen TNF-R1 wie in Himmler et al (1990) (DNA and Cell Biology 9: 705-715) beschrieben:
NT 1561-1746, AS 521-582
Myc-Tag:
NT 1747-1785, AS 583-595
His-Tag:
NT 1786-1803, AS 596-601
Stop:
NT 1804-1806.

Claims (20)

1. Polypeptid umfassend folgende Zusammensetzung,
  • 1. eine Region mit einer biologischen Aktivität für ein spezifisches Zielmolekül
  • 2. C-terminal von Region (1) eine Region, die eine oder mehrere Prozessierungsseiten hat, und
  • 3. C-terminal von Region (2) eine weitere Region, die Region (1) in ihrer biologischen Aktivität mittels intramolekularer Bindung und/oder Wechselwirkung hemmt,
  • 4. N-terminal von Region (1) eine Region, welche ein Peptidlinker ist, und
  • 5. N-terminal von Region (4) eine weitere Region, die ein spezifisches Makromolekül auf einer Zelloberfläche selektiv erkennt,
welches biologisch inaktiv ist, bevor es nicht in vivo innerhalb der Region (2) entsprechend prozessiert wurde.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Region (1) eine Aminosäuresequenz eines Zytokins oder ein Fragment hiervon beinhaltet.
3. Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytokin ein Tumor Nekrose Faktor (TNF, tumor necrosis factor), ein identisches Protein bzw. eine aus TNF abgeleitete Mutante oder ein anderes Mitglied dieser Zytokinfamilie ist.
4. Polypeptid nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Zielmolekül ein Zellmembran gebundener Zytokinrezeptor ist.
5. Polypeptid nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessierungsseite in Region (2) eine Spaltstelle für eine Protease ist.
6. Polypeptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine Urokinase Typ Plasminogenaktivator (uPA), Gewebsplasminogenaktivator (tPA), den aktivierten Gerinnungsfaktor VIIa, Matrix Metalloproteasen wie MMP2 oder eine hochselektiv im Stroma des Tumors membranständig exprimierte Protease FAP ist.
7. Polypeptid nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Region 3 mindestens eine Bindungsstelle für Region (1) aufweist.
8. Polypeptid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Region (3) ein Rezeptor für ein Zytokin oder eines Fragmentes hiervon ist.
9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Rezeptor eine vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines humanen TNF-Rezeptors ist z. B. (hu TNFR1, hu TNRF2) und/oder ein Protein viralen Ursprungs, wie das T2 Protein, sowie von diesen abgeleitete Mutanten oder synthetische Verbindungen, die TNF Bindungseigenschaften besitzen.
10. Polypeptid nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidlinker in Region (3) ein Trimerisierungsmodul ist und Region (5) und Region (1) verbindet.
11. Polypeptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Trimerisierungsmodul aus einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Peptid mit intrinsischen Trimerisierungseigenschaften z. B. einer Domäne des Tenascin Moleküls besteht.
12. Polypeptid nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Region (5) ein murines, humanisiertes oder humanes antigenbindendes Antikörperfragment mit definierter Antigenspezifität ist.
13. Polypeptid nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikörperfragment in verschiedenen Antikörperformaten vorliegen kann z. B. als scFv, Fab oder als komplettes Immunglobulin.
14. Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz codierend für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-13 ganz oder teilweise beinhaltet.
15. Vectormolekül, das eine Nukleinsäure gemäss Anspruch 14 beinhaltet, und die Fähigkeit zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle aufweist.
16. Wirtszelle, die eine Nukleinsäure und/oder ein Vectormolekül nach einem der Ansprüche 14-15 enthält, und die Fähigkeit zur Expression aufweist.
17. Isolierungsprozess, der das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-13 beinhaltet, eingeschlossen sowohl die Kultivierung von Wirtszellen gemäss Anspruch 16, unter geeigneten Bedingungen, als auch die Isolierung des Polypeptids als solches, aus den Wirtszellen und/oder dem Kulturmedium.
18. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-13, zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen/Arzneimitteln für die therapeutische Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Infektionskrankheiten und/oder metabolischen Erkrankungen.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung fest, flüssig oder aerosolartig (z. B. Spray) ist und optional pharmazeutische Hilfsstoffe (z. B. Lösungsvermittler, Träger) verwendet werden.
20. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-13, für eine Methode zur therapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Infektionskrankheiten und/oder metabolischen Erkrankungen mit pharmazeutisch wirksamen Konzentrationen des erfindungsgemäßen Polypeptids.
DE10045592A 2000-09-15 2000-09-15 Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie Withdrawn DE10045592A1 (de)

Priority Applications (22)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10045592A DE10045592A1 (de) 2000-09-15 2000-09-15 Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie
AU2001293819A AU2001293819A1 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
CNB018157645A CN1214115C (zh) 2000-09-15 2001-09-17 由作为靶特异前体药物的抗体－细胞因子－细胞因子抑制剂(选择因子)组成的融合蛋白质
MXPA03002229A MXPA03002229A (es) 2000-09-15 2001-09-17 Proteina de fusion, a partir de un inhibidor de anticuerpos citosina-citosina (selectocina) para utilizarse como prodroga de blanco especifico.
US10/380,438 US20040053829A1 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
PCT/EP2001/010730 WO2002022833A1 (de) 2000-09-15 2001-09-17 Fusionsprotein aus antikörper-zytokin-zytokin inhibitor (selektokin) als zielspezifisches prodrug
EP01974261A EP1317556A1 (de) 2000-09-15 2001-09-17 Fusionsprotein aus antikörper-zytokin-zytokin inhibitor (selektokin) als zielspezifisches prodrug
EEP200300100A EE200300100A (et) 2000-09-15 2001-09-17 Polüpeptiid, selle kodeerivat nukleotiidjärjestust sisaldav nukleiinhape, vektor ja peremeesrakk, meetod polüpeptiidi valmistamiseks ning farmatseutiline kompositsioon
IL15418501A IL154185A0 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
BR0113928-2A BR0113928A (pt) 2000-09-15 2001-09-17 Polipeptìdio com uma sequência de aminoácidos, ácido nucléico, vetor, célula hospedeira, processo para a produção de polipeptìdeo e composição farmacêutica que contém uma quantidade farmaceuticamente efetiva do polipeptìdio
YU18903A YU18903A (sh) 2000-09-15 2001-09-17 Fuzioni proteini od inhibitora protivtela citokin- citokin (selektokin) kao ciljno specifični pro-lek
KR10-2003-7003738A KR20030048041A (ko) 2000-09-15 2001-09-17 표적-특이적 프로드럭으로서 사용하기 위한항체-사이토카인-사이토카인 억제제로 이루어진 융합단백질(셀렉토카인)
SK281-2003A SK2812003A3 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
CA002422759A CA2422759A1 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
PL36054001A PL360540A1 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
RU2003106429/13A RU2003106429A (ru) 2000-09-15 2001-09-17 Слитный белок (селектокин), состоящий из антитела-цитокина-ингибитора цитокина, для применения в качестве пролекарства, специфичного по отношению к мишени
HU0301693A HUP0301693A3 (en) 2000-09-15 2001-09-17 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug
JP2002527275A JP2004508828A (ja) 2000-09-15 2001-09-17 標的−特異的プロドラッグとしての使用のための抗体サイトカイン−サイトカインインヒビター（セレクトカイン）からの融合タンパク質
BG107613A BG107613A (bg) 2000-09-15 2003-03-06 Фузионен протеин от инхибитор на антитяло-цитокин-цитокин като продрога със специфична мишена
ZA200302008A ZA200302008B (en) 2000-09-15 2003-03-12 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target-specific prodrug.
HR20030192A HRP20030192A2 (en) 2000-09-15 2003-03-14 Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target specific prodrug
NO20031185A NO20031185L (no) 2000-09-15 2003-03-14 Fusjonsprotein fra antistoff-cytokin-cytokininhibitor (selektokin) for anvendelse som mål-pesifikt prolegemiddel

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10045592A DE10045592A1 (de) 2000-09-15 2000-09-15 Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10045592A1 true DE10045592A1 (de) 2002-03-28

Family

ID=7656260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10045592A Withdrawn DE10045592A1 (de) 2000-09-15 2000-09-15 Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20040053829A1 (de)
EP (1) EP1317556A1 (de)
JP (1) JP2004508828A (de)
KR (1) KR20030048041A (de)
CN (1) CN1214115C (de)
AU (1) AU2001293819A1 (de)
BG (1) BG107613A (de)
BR (1) BR0113928A (de)
CA (1) CA2422759A1 (de)
DE (1) DE10045592A1 (de)
EE (1) EE200300100A (de)
HR (1) HRP20030192A2 (de)
HU (1) HUP0301693A3 (de)
IL (1) IL154185A0 (de)
MX (1) MXPA03002229A (de)
NO (1) NO20031185L (de)
PL (1) PL360540A1 (de)
RU (1) RU2003106429A (de)
SK (1) SK2812003A3 (de)
WO (1) WO2002022833A1 (de)
YU (1) YU18903A (de)
ZA (1) ZA200302008B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003020320A2 (de) * 2001-08-31 2003-03-13 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V. Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem tnf

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7468354B2 (en) 2000-12-01 2008-12-23 Genspera, Inc. Tissue specific prodrugs
PE20021080A1 (es) * 2001-04-12 2003-02-12 Boehringer Ingelheim Int Un anticuerpo especifico fapo bibh1 en el tratamiento del cancer
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
AU2004210088A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-19 Micromet Ag Trimeric polypeptide construct to induce an enduring T cell response
US7374898B2 (en) * 2004-10-12 2008-05-20 The Research Foundation Of State University Of New York Peptide inhibitors against seprase
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
EP1736482A1 (de) * 2005-06-20 2006-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Rekombinanter trimerer 4-1BB Ligand
DE102005036542A1 (de) * 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
EP1972350A1 (de) * 2007-03-20 2008-09-24 Rijksuniversiteit Groningen Duales Targeting-System
EP2009022A1 (de) * 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix GmbH Trimere Todesliganden mit erhöhter Aktivität (Tenascin)
EP3492488A1 (de) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Aktivierbare bindende polypeptide und verfahren zu deren identifikation und anwendung
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
BRPI1006141B8 (pt) * 2009-01-12 2021-05-25 Cytomx Therapeutics Llc composições de anticorpo modificado, métodos para preparar e usar as mesmas
CA2753294A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Proproteins and methods of use thereof
CN113166220A (zh) * 2018-03-09 2021-07-23 奥美药业有限公司 创新细胞因子前药
BR112020023118A2 (pt) 2018-05-14 2021-04-13 Werewolf Therapeutics, Inc. Polipeptídeos de interleucina 12 ativáveis e métodos de uso destes
KR20210021467A (ko) 2018-05-14 2021-02-26 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 활성화가능한 인터루킨-2 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
AU2019347751A1 (en) 2018-09-27 2021-04-29 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
CA3137512A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
KR20220020879A (ko) * 2019-06-12 2022-02-21 에스크진 파마, 아이엔씨. 새로운 il-15 프로드럭 및 이를 사용하는 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19900709A1 (de) * 1999-01-11 2000-07-13 Falkenberg Frank W Eine neue Applikationsform für biologisch wirksame Substanzen zur Anwendung bei Menschen und Tieren

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1981001145A1 (en) * 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US5502037A (en) * 1993-07-09 1996-03-26 Neuromed Technologies, Inc. Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy
US5763733A (en) * 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5614191A (en) * 1995-03-15 1997-03-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19900709A1 (de) * 1999-01-11 2000-07-13 Falkenberg Frank W Eine neue Applikationsform für biologisch wirksame Substanzen zur Anwendung bei Menschen und Tieren

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbankeintrag No.: M23121 v. 28.04.1993 *
Datenbankeintrag No.: X02910 v. 17.02.1997 *
Datenbankeintrag No.: X55313 v. 18.01.1993 *
Datenbankeintrag No.: X56160 v. 04.06.1998 *
RIPPMANN,Jörg F., et.al.: Fusion of the tissue factor extracellular domain to a tumour stroma specific coagulation-promoting molecule. In: Biochem. J., 2000, 349, S.805-812 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003020320A2 (de) * 2001-08-31 2003-03-13 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V. Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem tnf
WO2003020320A3 (de) * 2001-08-31 2003-10-30 Fraunhofer Ges Forschung Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem tnf
US7368295B2 (en) 2001-08-31 2008-05-06 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foderung Der Angewandten Forschung E.V. Nanoparticles comprising biologically active TNF which is immobilized on the same

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0301693A2 (hu) 2003-08-28
HRP20030192A2 (en) 2005-10-31
CN1458977A (zh) 2003-11-26
WO2002022833A1 (de) 2002-03-21
PL360540A1 (en) 2004-09-06
IL154185A0 (en) 2003-07-31
YU18903A (sh) 2006-05-25
ZA200302008B (en) 2004-06-25
MXPA03002229A (es) 2005-06-20
BR0113928A (pt) 2003-07-22
CA2422759A1 (en) 2003-03-17
US20040053829A1 (en) 2004-03-18
KR20030048041A (ko) 2003-06-18
HUP0301693A3 (en) 2005-11-28
EP1317556A1 (de) 2003-06-11
BG107613A (bg) 2003-12-31
EE200300100A (et) 2005-02-15
AU2001293819A1 (en) 2002-03-26
RU2003106429A (ru) 2004-08-27
NO20031185L (no) 2003-05-05
CN1214115C (zh) 2005-08-10
SK2812003A3 (en) 2003-11-04
NO20031185D0 (no) 2003-03-14
JP2004508828A (ja) 2004-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10045592A1 (de) Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie
DE69633175T2 (de) Multimere proteine
EP1317488B1 (de) ORTSSPEZIFISCHE, ANTIKÖRPERVERMITTELTE AKTIVIERUNG PROAPOPTOTISCHER ZYTOKINE: AMAIZe (ANTIBODY-MEDIATED APOPTOSIS INDUCING ZYTOKINE)
Fukunaga et al. Purification and characterization of the receptor for murine granulocyte colony-stimulating factor.
Peppel et al. A tumor necrosis factor (TNF) receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity.
DE60133479T2 (de) Modifizierter tpo-agonisten antikörper
AU618722B2 (en) Recombinant pseudomanas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects
DE69934425T2 (de) Thrombopoietin substitute
DE60203996T2 (de) Concatamere immunadhäsion
DE69534235T2 (de) Cytokin lerk-7
DE60124912T2 (de) Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
DE69631331T2 (de) Cd40l mutein
DE102005036542A1 (de) CTL-Prodrug
US20080166336A1 (en) CD137 agonists to treat patients with IgE-mediated conditions
EA011992B1 (ru) Гибридный белок антитела l19 к фибронектину ed-b и интерлейкина 12
DE10235248B4 (de) Fusionsprotein mit verstärkter in vivo-Aktivität von Erythropoietin
CN102816242A (zh) 在体内具有延长的半衰期和增强的红细胞生成活性的重组人EPO-Fc融合蛋白
EP0467536A2 (de) Basen-Tumorzellen Behandlungsverfahren
DE602004006871T2 (de) Zusammensetzungen und verfahren, die multimere und oligomere lösliche fragmente des tweak-rezeptors betreffen
EP0350690A2 (de) Neutralisation der in vitro- und in vivo-toxischen Eigenschaften von TNF-alfa durch monoklonale Antikörper und die davon abgeleiteten Fragmente
JP2000504586A (ja) ヘテロ二量体を形成するハイブリッドタンパク質
DE10247755B4 (de) Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
US20230072197A1 (en) Ph-sensitive fc variants
Jostock et al. Immunoadhesins of interleukin-6 and the IL-6/soluble IL-6R fusion protein hyper-IL-6
WO2011120859A1 (de) Fusionsprotein und dessen verwendungen

Legal Events

Date Code Title Description
OM8 Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law
8110 Request for examination paragraph 44
8139 Disposal/non-payment of the annual fee