HRP20030192A2 - Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target specific prodrug - Google Patents
Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target specific prodrug Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20030192A2 HRP20030192A2 HR20030192A HRP20030192A HRP20030192A2 HR P20030192 A2 HRP20030192 A2 HR P20030192A2 HR 20030192 A HR20030192 A HR 20030192A HR P20030192 A HRP20030192 A HR P20030192A HR P20030192 A2 HRP20030192 A2 HR P20030192A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- region
- polypeptide according
- tnf
- seq
- amino acid
- Prior art date
Links
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 title description 62
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 title description 62
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 61
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 56
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 31
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 12
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 8
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 6
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 6
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 4
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 claims description 4
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 18
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 15
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 15
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 15
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 12
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 12
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 6
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100425753 Homo sapiens TNFRSF1A gene Proteins 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108010072257 fibroblast activation protein alpha Proteins 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- SYSZENVIJHPFNL-UHFFFAOYSA-N (alpha-D-mannosyl)7-beta-D-mannosyl-diacetylchitobiosyl-L-asparagine, isoform B (protein) Chemical compound COC1=CC=C(I)C=C1 SYSZENVIJHPFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000995861 Arabidopsis thaliana Regulatory protein NPR1 Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 description 1
- 101710144543 Endosialin Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 101000666343 Gallus gallus Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101150071461 HAVCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000666340 Homo sapiens Tenascin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000857304 Mus musculus Glomulin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101000892112 Oxyuranus scutellatus Venom prothrombin activator oscutarin-C catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101150085390 RPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710174842 Tumor necrosis factor soluble receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N chlorotrianisene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)=C(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=C(OC)C=C1 BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010037536 heparanase Proteins 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108091005763 multidomain proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150069091 nae1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000013435 necrotic lesion Diseases 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Predloženi izum odnosi se na polipeptid s povoljnim antitumorskim i/ili imunomodulacijskim citokinskim svojstvima, koji se može aktivirati probavom in vivo, i koji ima središnje područje sa specifičnim biološkim djelovanjem, na čijem C kraju se nalazi područje sa skupinom za probavu i inhibitorskom domenom, dok se na N kraju središnjeg područja nalazi područje koje selektivno prepoznaje jednu makromolekulu na površini stanice ili jednu komponentu vanstaničnog matriksa.
Upotreba rekombinantnog tumorskog nekroznog faktora (TNF) i drugih aktivnih tvari za liječenje, na primjer, tumorskih bolesti smatra se terapijski ograničenom zbog jakih sistemskih sporednih učinaka, i ona se uspješno može provesti samo s posebnim skupim protokolima liječenja (npr. pomoću tzv. "Isolated Limb Perfusion") kod vrlo ograničenih indikacija (metastaze melanom/sarkoma na ekstremitetima). Iz tih kliničkih podataka može se procijeniti da bi za antitumorsku učinkovitost bila potrebna otprilike 10 do 100 puta viša doza TNF-a nego što je MTD (najviša podnošljiva doza, engl. "Maximum Tolerated Dose") kad bi ju dopustili veliki sistemski sporedni učinci.
Zbog toga se predloženi izum temelji na zadatku da se izbjegnu ili spriječe neželjene posljedice liječenja s terapeutski učinkovitim polipeptidnim aktivnim tvarima, kao što su tvari koje sadrže TNF, a da se istovremeno zadrže ili čak pojačaju terapeutska učinkovita npr. antitumorska svojstva aktivnih tvari, kao što je TNF.
Ovaj zadatak je riješen s izvedbenim oblikom naznačenim u patentnim zahtjevima predložene patentne prijave.
U skladu s izumom pripravljen je poseban polipeptid s aminokiselinskom sekvencom, koji od N kraja prema C kraju obuhvaća
(1) područje koje selektivno prepoznaje specifičnu makromolekulu na površini stanice i/ili komponentu vanstaničnog matriksa,
(2) područje koje obuhvaća peptidni linker,
(3) područje s biološkim djelovanjem za specifičnu ciljnu molekulu,
(4) područje koje ima barem jedno probavno mjesto, i
(5) područje koje inhibira biološko djelovanje područja (3) intramolekularnim vezanjem i/ili uzajamnim djelovanjem,
pri čemu se biološko djelovanje područja (3) oslobađa in vivo probavom barem jednog probavnog mjesta u području (4). Polipeptid prema izumu, koji se u nastavku naziva "selektokin", je aktivna tvar koja se može graditi modularno i koja je, u skladu s posebno prednosnim oblikom izvedbe, ponajprije homotrimerni fuzijski protein s jednim citokinom, ponajprije TNF-om, odnosno s njegovim biološki učinkovitim derivatom ili s njegovom biološki učinkovitom mutantom, kao antitumorski učinkovitom tvari, odnosno područjem (3), koji svoje biološko djelovanje oslobađa povezivanjem s daljnjim funkcijskim modulima ciljano u oboljelom tkivu, npr. u području tumora. To se postiže N-terminalnim povezivanjem terapeutski učinkovite tvari, TNF molekule, s targeting-modulom (1) (e. targeting-modul, ciljni modul) koji je specifičan za ciljno tkivo, npr. antitijelo specifično za tumor ili njegov derivat, kao što su antitijela scFv, i C-terminalnim povezivanjem s inhibitorom (5) protiv terapeutski učinkovite tvari, posebno s inhibitorom peptida koji se selektivno dezaktivira u ciljnom tkivu, kao što je tumorsko područje, probavom domene (4), ponajprije se ciljanim proteolitičkim odcjepljenjem odstranjuje iz fuzijskog proteina, i tako nastaje biološki aktivna tvar, npr. TNF koji je selektivno vezan na targeting-modul. Između targeting-modula (npr. fragmenta scFv antitijela) i modula s terapeutskom funkcijom (npr. TNF) nalazi se jedna peptidna linkerska domena (2), ponajprije domena trimerizacije, koja omogućuje gradnju kovalentnih disulfidnih mostova i time pravilnu i postojanu homotrimerizaciju fuzijskog proteina.
S konstruktom, prema izumu mogu se dobiti visoke lokalno učinkovite koncentracije terapeutski učinkovite tvari, npr. TNF-a, bez sistemski povišenih količina terapeutika (npr. TNF-a u serumu) i time terapijski ograničeni sporedni učinci. Istovremeno se, na primjer u slučaju TNF-a kao terapeutski učinkovite domene, s otkrivanjem koje posreduje targeting-modul (npr. antitijelo) postiže učinak da se TNF aktivira ispred mjesta koje odgovara prirodnom membranskom TNF-u, tj. dolazi do koaktiviranja obaju tipova TNF receptora i time do pojačavanja antitumorskih svojstava TNF-a. S izborom specifičnosti targeting-modula može se proizvesti terapeutik koji je specifično prilagođen/optimiran svakom tumoru.
Područja aminokiselinske sekvence, odnosno moduli polipeptida prema izumu opisat će se u nastavku pomoću prednosnih izvedbenih oblika.
Polipeptid prema izumu (selektokin) predstavlja novu vrstu tehnologije predlijekova i on je konstrukt koji prema prednosnom obliku izvedbe odgovara rekombinantnom, homo-trimernom fuzijskom proteinu, koji načelno u definiranom nizu obuhvaća slijedeće strukturne elemente (u monomeru) (od N kraja prema C kraju):
(1) mišji, humanizirani ili humani jednolančani fragment antitijela (scFv) definirane antigenske specifičnosti koji se sastoji iz VH-linker-VL;
(2) peptidni linker s prirodnim svojstvima trimerizacije;
(3) TNF molekulu, koja odgovara na primjer divljem tipu TNF-a ili vanstaničnu domenu TNF-a (zreli oblik od 17 kDa, AA 1-157, Swissprot #P01375) ili biološki aktivne varijante koje su derivirane iz njih; (4) varijabilan linkerski peptid sa specifičnim mjestima cijepanja proteaze, (5) protein, odnosno peptid, koji specifično veže TNF«.
Targeting modul (1) je specifičan ponajprije za molekulu na površini stanice, koja se eksprimira u tumorskim lezijama i/ili u proliferirajućim endotelnim stanicama, a koje su povezane s procesom angiogeneze. Prema prednosnom obliku izvedbe targeting-modul (1) je specifičan za jednu komponentu vanstaničnog matriksa, koja je prisutna u tumorskim lezijama i/ili u područjima angiogeneze patoloških lezija. Prema daljnjem prednosnom obliku targeting-modul (1) je specifičan samo za jednu komponentu maligne tumorske stanice. Ponajprije područje, odnosno modul (1) obuhvaća antitijelo (npr. mišje, humanizirano ili humano) ili njegov fragment, npr. jedan Fab fragment ili jednolančani scFv mišji fragment antitijela (scFv) proizveden postupkom prema stanju tehnike, koji je humaniziran CDR graftingom, ili je u cjelosti humanog porijekla, sa specifičnošću za npr. antigen, ponajprije selektivno, odnosno dominanto eksprimiran u tumorskom tkivu, pri čemu se on sam načelno može eksprimirati na malignim stanicama, međutim ponajprije se eksprimira u ne-malignom dijelu tumora, u staničnoj stromi ili u endotelnom tumoru. Takovi antigeni ne-malignog dijela tkiva tvrdog tumora (karcinoma) su s jedne strane genetski invarijantni, a s druge strane su prisutni kod različitih vrsta tumora i stoga su univerzalni tumorski markeri. Ovdje se mogu navesti, na primjer, VEGFR, odnosno kompleks VEGFR/VEGF (kao primjer kompleksa receptora i liganda) kao i integrin αυβ3, endosialin i izo-oblik fibronektina bFn kao selektivne ciljne strukture tumorskog endotela, i takozvani Fibroblast Activation Protein (FAP) kao selektivan marker za komponentu vanstaničnog matriksa, koji je prisutan u tumorskoj stromi, koji se mogu učinkovito uhvatiti, na primjer, sa specifičnim visoko afinitetnim scFv. Daljnji primjeri za prikladne targeting-module su peptidi, umjetna antitijela i njihovi zrcalni izomeri.
Područje peptidnog linkera (2) je ponajprije modul trimerizacije i veže ciljno područje (1) s terapeutski učinkovitim područjem (3). Prema posebno prednosnom obliku izvedbe, modul trimerizacije obuhvaća prirodno nastali ili sintetički peptid s prirodnim svojstvima trimerizacije. Posebno prikladan primjer takovog peptida je domena tenascinske molekule (AA 110-139, Swissprot #P10039, (kokošja) ili Swissprot #P24821 (ljudska)). Ona stvara spoj između targeting-modula (1) (npr. scFv) i terapeutika (3) (npr. TNF) i tijekom biogeneze omogućuje istovremeno kovalentno, homotrimerno povezivanje fuzijskog proteina.
Kako je ranije navedeno, terapeutski učinkovit modul (3) sadrži ponajprije aminokiselinsku sekvencu citokina ili njegovog terapeutski učinkovitog fragmenta. Ponajprije, područje (3) sadrži aminokiselinsku sekvencu TNF-a, još bolje protein koji prethodi TNF-u i ponajbolje sekvencu probavljenog proteina identičnog sa zrelim divljim tipom TNF molekule AA 1-157, Swissprot #P01375), ili derivate koji su dobiveni od njega, ili mutante sa svojstvima selektivnog vezanja receptora ili mutante, odnosno derivate koji su bili optimirani u pogledu njihove specifične biološke aktivnosti ili drugih svojstava (postojanost, otpornost prema proteazi).
Modul procesiranja (4) je, na primjer, osjetljiv na proteazu (tj. mjesto probave odgovara sekvenci prepoznavanja proteaze) i što se tiče aminokiselinskog sastava i ukupne duljine napravljen je ponajprije tako da dopušta homotrimerizaciju fuzijskog proteina uzrokovanu s modulom za trimerizaciju i sa samim TNF-om, ali istovremeno također omogućuje visoko afinitetno postojano vezanje inhibitora TNF-a koji se nalazi u C kraju molekule (npr. vanstanične domene TNF receptora) dijela TNF-a, tako da se time inhibira vezanje TNF modula na TNF receptore koje ekpsrimiraju stanice. Linker je napravljen, nadalje, ponajprije tako da on sadrži najmanje jedno, ponajprije više selektivnih mjesta cijepanja za takove ekstracelarne ili sa stanicom povezane proteaze, za koje je dokazano da su povoljno selektivne u tkivu tumora. Primjeri prikladnih mjesta cijepanja su mjesta za aktivator plazminogena tipa urokinaze (uPA) , za aktivator plazminogena tkiva (tPA), za aktivirani faktor zgrušavanja Vila, za matriksne metalo-proteaze, kao MMP-2 i MMP-9, i za FAP proteaze koje su visoko selektivne eksprimirane u stromi tumora i stoje na membrani. Posebno prednosna mjesta cijepanja, koja su osjetljiva na proteazu, su ona koja su u procesu metastaziranja i angiogeneze spojena s matriksnom metalo-proteazom (npr. sekvenca koja prepoznaje MMP-9 Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys; SEQ ID NO 18), od heparanaze, od enzima, koji se pojavljuju ponajprije u nekrotičnim lezijama kao i od enzima, koji su povezani s rakom prostate (npr. PSMA, PSA, modul procesiranja koji se može odcijepiti glutaril-(4-hidroksipropil)-Ala-Ser-cikloheksaglicil-Gln-Ser-Leu-COOH) . struktura linkera se bira tako da je slobodan pristup sekvenci koja prepoznaje proteazu, tj . da je moguća učinkovita probava sa specifičnom proteatom, i da nakon cijepanja fuzijskog proteina prema potrebi na TNF molekuli zaostale amino kiseline linkera ne djeluju negativno na biološku aktivnost terapeutski učinkovitog područja.
Inhibitorski modul (5) prema prednosnom obliku izvedbe polipeptida prema izumu je receptor za citokin ili njegov fragment. Nadalje, inhibitorski modul ima ponajprije najmanje jedno mjesto vezanja za terapeutski učinkovito područje (3). U slučaju upotrebe TNF-a, inhibitorski modul obuhvaća ponajprije u području (3) cjelovite ili djelomične vanstanične domene humanog TNF receptora, npr. hu TNFR1 (sinomim za p55/60TNFR; Swissprot #P19438, AA 1-190; odnosno fragmente te molekule, na primjer AA 1-157 odnosno AA 60-120) o Drugi proteini, koji su također prikladni i koji specifično vežu TNF, imaju eventualno vanstanične domane iz huTNFR2 (EMBL banka podataka, #M32315) ili proteine virusnog porijekla kao npr. protein T2, kao i u svakom slučaju sintetičke peptide koji su derivirani od njega, a koji imaju svojstvo vezanja TNF-a i sprečavaju vezanje TNF-a na TNF receptore koji stoje na staničnoj membrani. Zbog vezanja, odnosno zbog uzajamnog djelovanja inhibitora s terapeutski učinkovitim modulom, fuzijski protein prema izumu je u tom stanju biološki inaktivan, tj. on se nalazi u pred-obliku (predlijek).
Polipeptid prema izumu može obuhvatiti i daljnje domene. Kao primjer se mogu navesti proteini koji se koriste za jednostavnije čišćenje rekombinantno proizvedenih proteina i sekvence za markiranje koje se koriste u in vitro analitici. Tako se može navesti npr. myc-Hise-Tag, C-terminalno na području (5), ponajprije na TNFR fragmentu, koji je deriviran od vektora POPE. Daljnje sekvence za markiranje su stručnjacima poznate.
Prednosni TNF selektokin prema izumu je kovalentno povezana, homotrimerna molekula koja se sastoji iz gore u pojedinostima objašnjene fuzije triju funkcionalnih domena, modula antitijela specifičnog za tumor, TNF-a i blokirajućeg TNF-veznog proteina (vanstanična receptorska domena ili peptid koji je od nje deriviran) kao i funkcionalnih linkera koji se nalaze između njih i koji imaju svojstvo trimerizacije, odnosno specifična mjesta cijepanja proteaze, koji je u ovom potpunom stanju inaktivan u odnosu na djelovanje TNF-a. Selektokin se, nakon in vivo zapljuskivanja, obogaćuje najprije s dijelom antitijela specifičnog u području tumora i tamo se probavljuje sa samim tumorom ili s proteazama koje stvara reaktivan sistem tumorska stroma/tumorske krvne žile (npr. FAP, uPA, tPA, MMP2, faktor Vila), tj. inhibirajući peptid (5) se odcjepljuje. Nakon selektivnog proteolitičkog cijepanja, TNFR-fragment/inhibitorski peptid se disocira od trimerne TNF molekule i time potonja postaje biološki aktivna (tj. biološka aktivnost područja se oslobađa probavom mjesta za probavu u području (4)). Na taj način probavljeni TNF se sada veže ponajprije na TNF receptore koji stoje na stanicama, jer oni kao homomultimerne molekule imaju znatno viši afinitet nego monomerni topivi fragmenti receptora. Selektivnost TNF učinka postiže se sa selektokinom prema izumu dakle pomoću dvije mjere: s jedne strane selektivnim obogaćivanjem inaktivnog predlijeka u tumoru posredstvom scFv-a i također njegovim zadržavanjem nakon proteolitičkog aktiviranja, i s druge strane preko lokalno specifične pretvorbe predlijeka s proteazama koje se u značajnijoj aktivnosti mogu naći isključivo ili ponajprije u području tumora. Vezanjem TNF-a, posredstvom scFv-a, na antigen koji stoji na membrani postiže se nadalje daljnji prednosni učinak selektokina. Naime u usporedbi s topivim TNF molekulama, koje se sada upotrebljavaju, postiže se bolji biološki učinak, koji je sličan onom od prirodnih membranskih TNF molekula. Fiksiranje TNF-a posredstvom scFv-a pomiče ravnotežu disocijacije na TNFR2 prema postojanom vezanju i time se postiže njegovo vezanje. Poznato je da istovremeno aktiviranje obaju TNFR-a može dovesti do kooperativnog signalnog mehanizma i pojačanih staničnih reakcija koje iz toga proizlaze, posebno do aktiviranja endotelnih stanica i indukcije apoptoze u tumorskim stanicama, koje su u tom pogledu rezistente prema (topivom) TNF-u koji se sada upotrebljava.
Posebno prednosni izvedbeni oblici polipeptida prema izumu imaju aminokiselinske sekvence koje su prikazane na slikama l (SEQ ID NO 1) i 5 (SEQ ID NO 3).
Daljnji predmet predloženog izuma odnosi se na nukleinsku kiselinu koja obuhvaća nukleotidnu sekvencu koja kodira za polipeptid prema izumu. Pojam "nukleinska kiselina" znači, prirodnu, polusintetičku, sintetičku ili modificiranu molekulu nukleinske kiseline iz dezoksi-ribonukleotida i/ili ribonukleotida i/ili modificiranih nukleotida. Prednosni izvedbeni oblici nukleinskih kiselina prema izumu sadrže nukleotidne sekvence prikazane na slici l (SEQ ID NO 2) i slici 5 (SEQ ID NO 4).
Nadalje, s izumom je dat vektor koji sadrži gore definiranu nukleinsku kiselinu. Vektor je ponajprije sposoban za ekspresiju i/ili za umnažanje u prokariotskim i/ili eukariotskim stanicama. Zbog toga vektor sadrži ponajprije prikladne regulatorske elemente, kao promotore, pojačivače, krajnje sekvence itd. Vektor se također može upotrijebiti za postojanu integraciju nukleinske kiseline prema izumu u genetički materijal umjetne stanice.
Daljnji predmet izuma odnosi se na umjetnu stanicu koja sadrži gornju nukleinsku kiselinu i/ili gornji vektor. Prikladne umjetne stanice jesu na primjer sve stanice sisavaca, kao što su stanice COS ili stanice CHO.
Predloženim izumom također je dat postupak za pripravu polipeptida prema izumu, koji obuhvaća slijedeće korake:
(a) uzgoj stanica domaćina prema zahtjevu 25 u mediju za kulturu pod prikladnim uvjetima, i
(b) izolaciju polipeptida prema bilo kojem zahtjevu l do 21 iz umjetnih stanica i/ili medija kulture.
Polipeptid prema izumu proizvodi se ponajprije ekspresijom pomoću prikladnih sistema ekspresije, kao što su ponajprije izlučeni proizvodi koji se mogu selekcionirati, stabilni transfektanti stanične linije CHO DG44 ili nakon privremene ekspresije u stanicama COS7. Drugi sistemi eukariotske ekspresije koji odgovaraju stanju tehnike, npr. Pichia pastoris, stanice insekata ili stanice sisavaca, s vektorima ekspresije prikladnim za sekreciju dotičnog staničnog sistema, opisali su za stanice sisavaca i za stanice insekata, npr. Brocks et al. (Immunotechnology 3:173-184, 1997). Za ekspresiju i sekreciju u gljivicama Pichia pastoris također su prikladni vektori pPICZalpha (INVITROGEN).
Polipeptid prema izumu, nukleinska kiselina i/ili vektor mogu se korisno upotrijebiti za pripravu farmaceutskih pripravaka za liječenje bolesnih poremećaja.
Daljnji oblik predloženog izuma odnosi se stoga na farmaceutski pripravak koji sadrži farmaceutski učinkovitu količinu polipeptida prema izumu i/ili nukleinsku kiselinu prema izumu i/ili vektor prema izumu, prema potrebi zajedno s jednom ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih tvari, sredstava za razrjeđivanje i/ili nosača. Farmaceutski pripravak služi ponajprije za terapeutsko liječenje bolesti raka i/ili infekcijskih bolesti i/ili metaboličkih oboljenja. Posebno prednosno područje upotrebe ovih farmaceutskih pripravaka su tumori kao i angiogeneza u patološkim lezijama. Farmaceutski pripravak prema izumu može biti u bilo kojem poznatom obliku koji se smatra prikladnim u stručno predloženom području. On ponajprije ima kruti, tekući ili oblik aerosola.
Predloženi izum obuhvaća time također i postupak za liječenje koji uključuje davanje terapeutski dostatne količine farmaceutskog pripravka pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje. Prikladan način davanja farmaceutskog pripravka je poznat stručnjaku i on obuhvaća, na primjer, oralnu, intravensku, intraarterijsku, intra-muskularnu, nazalnu, rektalnu i površinsku aplikaciju. Intravensku aplikaciju može se provesti npr. u obliku bolus injekcije s vremenskim razmacima između injekcija i/ili u obliku infuzije. S farmaceutskim pripravkom predloženog izuma mogu se liječiti kako ljudi, tako također i životinje. Postupak liječenja primjenjuje se ponajprije kod pacijenata s prethodno navedenim bolestima.
Slike prikazuju:
Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO 1, gore) i odgovarajuću cDNA-nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO 2, dolje) predlijeka W24 selektokina prema izumu.
Na slici 2 prikazana je fotografija gela SDS-PAGE obojenog s Coomassie i odgovarajuće Western Blot-ove nakon inkubacije s anti-c-myc-mAK 9E10. Predlijek W24 je bio eksprimiran u stanicama CHO-DG44 i očišćen pomoću IMAC-e. Očišćeni protein se može obojiti pod redukcijskim (red.) kao također i pod ne-redukcijskim uvjetima.
Na slici 3 prikazana je fotografija Western Blot analize 12%-tnog gela SDS nakon detekcije s anti-c-myc-mAK 9E10. Trag 1: očišćen predlijek W24 nakon inkubacije s PBS-om. Trag 2: očišćen predlijek W24 nakon inkubacije s PBS-om i tPA.
Slika 4 predstavlja grafički prikaz rezultata ispitivanja indukcije apoptoze na stanicama Kiml s predlijekom W24 aktiviranim s tripsinom (■), odnosno s neaktiviranim prodlijekom W24 (▼).
Slika 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO 3, gore) i odgovarajuću cDNA nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO 4, dolje) predlijeka selektokina W33 prema izumu.
Na slici 6 (A) prikazana je fotografija SDS-PAGE gela obojenog sa Coomassie i odgovarajućih Western Blot-ova nakon inkubacije s anti-c-myc-omAK 9E10. Predlijek W32 eksprimiran je u stanicama CHO-DG44 i očišćen pomoću IMAC. Očišćeni protein je obojen pod reducijskim kao i pod ne-redukcijskim uvjetima. (B) predstavlja grafički prikaz rezultata određivanja KD,app. predlijeka W32, odnosno FAP-vezanja pomoću FACS-analize. FAP-pozitivne stanice HT1030#33 (O) i FAP-negativna kontrolne stanice HT1080 (•) su inkubirane s nizom razređenja prodlijeka W32 i udio vezan sa stanicama je utvrđen posredno pomoću intenziteta imunofluorescencije. Dijagram prikazuje koncentraciju predlijeka prema srednjem intenzitetu fluorescencije (m.f.I.).
Na slici 7 (A) su grafički prikazani rezultati ispitivanja indukcije apoptoze na stanicama Kim-1 s neaktiviranim prodlijekom W32 (■), s predlijekom W32 koji je aktiviran s tripsinom (n) ili s divljim tipom TNF (•) . Prikazan je jedan tipičan od tri pokusa. Fotografija prikazuje gelove SDS-PAGE obojene sa Coomassie pod redukcijskim uvjetima i pod ne-redukcijskim uvjetima predlijeka W32 očišćenog s IMAC-om (lijevi trag) i predlijeka W32 očišćenog s IMAC-om nakon aktiviranja s tripsinom (desni trag). Strelica odgovara očekivanoj MW aktiviranog predlijeka W32. (B) predstavlja grafički prikaz rezultata ispitivanja indukcije apoptoze stanica Kym-l u ko-kulturi s predlijekom otkrivenih FAP-pozitivnih stanica (HT108Q#33) kao i s FAP-negativnim kontrolnim stanicama (HT1080). HT1080 + ne-aktivirani prodlijek W32 (∆), HT1080 + s tripsinom aktivirani prodlijek W32 (n), HT1080#33 + neaktivirani prodlijek W32 (▲), HT1080#33 + s tripsinom aktivirani predlijek W32 (■). (C) predstavlja grafički prikaz odgovarajućeg pokusa prikazanog u (B) , međutim ovdje je aktiviranje s tripsinom izvršeno tek nakon vezanja na stanice HT i nakon završnog fiksiranja. HT1080 + neaktivirani predlijek W32 (O), HT1080 + s tripsinom aktivirani predlijek (□), HT1080#33 + ne-aktivirani prodlijek W32 (•), HT1080#33 + s tripsinom aktivirani predlijek W32 (■). U grafičkim prikazima za (B) i (C) prikazan je u svakom slučaju po jedan tipičan od tri pokusa.
Predloženi izum objasnit će se pobliže pomoću slijedećih primjera koji ne ograničavaju sam izum.
PRIMJERI
Primjer 1
Primjer za sekvencu TNF-selektokina
Primjeri sekvence TNF-selektokina s višestrukim mjestima presjeka u linkeru i različitim fragmentima receptora:
1. scFv-TDtenascin-hu TNF (AS1-157)-linker-huTNFR1 (AS1-190).
2. scFv-TDtenascin-hu TNF (AS1-157)-linker-huTNFR1 (AS 60-120).
U daljnjoj inačici moguća mjesta presjeka u molekuli huTNF su odstranjena zamjenom amino kiselina (TNFmut !83F, R131Q) uz zadržavanje scFV, linkerske i receptorske sekvence kako je prikazano u gornjem primjeru.
Kao domena trimerizacije upotrijebljena je domena Coiled-Coil tenascina-C (AS 110-139), koja je visoko konzervirana kod različitih vrsta.
Primjer AS sekvence:
kokoš: ACGCAAAPIVKDLLSRLEELEGLVSSLREO (Swissprot#P10039, SEQ ID NO 5)* ;čovjek: ACGCAAAPDVKELLSRLEELENLVSSLRSQ (Swissprot#P24821, SEQ ID NO 6)# ;*J. Biol. Chem. 266 (5), 2818-2823 (1991), Nies, D.E., Hemesath, T. J., Kim, J.H., Gulcher, J.R. i Stefansson, K., The complete cDNA sequence of human hexabrachion (Tenascin). A multidomain protein containing unigue epidermal growth factor repeats.
#Cel 59 (2), 325-334 (1989), Spring, J., Beck, K. i Chiquet-Ehrismann, R., Two contrary functions of tenascin: dissection of the active sites by recombinant tenascin fragments.
Primjer 2
Sekvenca linkera
Probavna sekvenca prema izumu je, na primjer, linker s mjestima cijepanja proteaze za trombin, tPA, faktor Vila i uPA (aminokiselinska sekvenca, dolje, SEQ ID NO 7; cDNA-nukleotidna sekvenca, gore, SEQ ID NO 8):
[image]
Primjer 3
Ekspresija, čišćenje i funkcionalna karakterizacija TNF-selektokinskog predlijeka W24
Prodlijek W24
TNF-selektokinski prodlijek W24 se sastoji iz slijedećih komponenata (od N- prema C-kraju, amino-kiselinski ostaci (AA) se odnose na SEQ ID NO 1) :
1. AA 1-19: sekvenca vodećeg peptida
2. AA 20-285: scFv OS4 (specifičnost: humani FAP; usporedi: Mersmann (2000), Dissertation Universitat Stuttgart, Verlag Grauer, Stuttgart, ISBN 3-86186-335-9; Rippmann 1999, Dissertation Universitat Stuttgart, ISBN 3-86186-281-6);
3. AA 286-315 domena trimerizacije tenascina (Huhn, vidi gore) AA 316-321 linker;
4. AA 322-486: mutirani oblik prirodnog, humanog TNF pred-proteina (26 kDa membranski oblik, Swissprot #P01375, 233 AA) s delecijama N-terminalnih 56 AA i AA 78-89 (TNFΔ1-se,78-89), tj. s delecijom citoplazmatske domene, transmembranske domene i mjesta cijepanja TACE u TNF-pred-polipeptidu;
5. M 487-512: linker s mjestima presjecanja proteaze (usp. primjer 2);
6. AA 513-639: fragment humanog TNFR1 koji sadrži vanstanične domene 1-3 (Swissprot #P19438, AA 12-138; usp. Himmler et al. (1990) DNA and Cel Biology 9, 705-715);
7. AA 640-652: myc-tag;
8. AA 653-658: His-tag.
Aminokiselinska sekvenca (SEEQ ID NO 1) i odgovarajuća kodirajuća DNA-sekvenca (SEQ ID NO 2) su prikazane na slici 1. Izračunata MW proteinskog dijela iznosi 70,3 kDa.
Ekspresija i čišćenje
Predlijek W24 očišćen je iz CHO-supernatanta pomoću IMAC-a u skladu s propisom proizvođača (Pharmacia). Od toga je 400 ng (20 μl) stavljeno na gel SDS-PAGE, obojen s Coomassie, pod redukcijskim i pod ne-redukcijskim uvjetima, u Western-Blotu s anti-c-myc-mAk 9E10 je upotrijebljeno 2 μ1; usporedi sliku 2. Dokazana je ekspresija monomernog, dimernog i trimernog konstrukta.
Cijepanje predlijeka W24 s tPA
Očišćen predlijek W24 (600 ng) inkubiran je u PBS-u (50 μl), odnosno u PBS + tPA (5 μg tPA u 50 μl PBS), 16 sati pri 37°C. Nakon 12% SDS-PAGE (redukcijski) i Western-Blot-a, izvršena je detekcija s anti-c-myc-mAk 9E10, i zatim s alkalijskim, s fosfatazom konjugiranim serumom IgM koza-anti-miš. Pojava trake ispod 33 kDa u visini očekivane veličine odcijepljenog fragmenta TNFR (pribl. 17 kDa), koji nosi C-terminalno jedan myc-tag, u smjesi s tPA, pokazuje djelomičnu probavu predlijeka W24; usp. sliku 3. Aktivirani TNF-selektokin se ne može dobiti ovom metodom dokazivanja.
Proteolitičko aktiviranje predlijeka W24 s tripsinom
20000 stanica Kyml u 50 μl standardnog medija za kulturu (10% PCS) posađeno je dan ranije u pločice s 96 jamica (4-struke vrijednosti) i slijedeći dan je dodano 50 μl razrjeđenja predlijeka W24. Predlijek E24 (2 μg), očišćen pomoći IMAC, aktiviran je s tripsinom u ukupnom volumenu od 50 μl PBS-a, s krajnjom koncentracijom od 100 μg/ml tripsina. Reakcija je zaustavljena nakon 5 minuta inkubacije pri sobnoj temperaturi s 200 μl RPM1/10 % FCS-a. Jednako je obrađen i ne-aktivirani uzorak, ali bez tripsina. Određivanje vitalnosti izvršeno je nakon jednog sata pomoću MTT obojenja. Rezultati (slika 4) pokazuju da ne-probavljeni TNF-selektokin sve do koncentracije od pribl. 2-3 μg/ml nema nikakvog biološkog djelovanja (indukcija apoptoze), dok s tripsinom aktivirani selektokin ima visoko specifično biološko djelovanje koje je slično divljem tipu TNF-a (LD50 = 0,5 ng/ml). Određivanje vrijednosti LD50 pokazuje približno 4000-struko povišenje aktivnosti s probavom.
Primjer 4
Predlijek W33
Konstrukt prodlijeka W33 ima ista funkcionalna svojstva kao i predlijek W24 iz primjera 3, ali se od njega razlikuje po produljenom linkeru koji je osjetljiv prema proteazi (AA 487-520) i po skraćenom TNFR-fragmentu (AA 521-582; Swissprot #P19438, AA 54-115 humanog TNFR1; usp. Himmler et al., (1990) DMA and Cei Biology 9, 705-715). Aminokiselinska sekvenca (SEQ ID NO 3) i kodirajuća cDNA-sekvenca (SEQ ID NO 4) prodlijeka W33 su prikazane na slici 5.
Primjer 5
Ekspresija, čišćenje i funkcionalna karakterizacija TNF-selektokinskog predlijeka W32
Predlijek W32
Proizveden je daljnji konstrukt (predlijek W32) koji funkcionalno odgovara predlijeku W24 iz primjera 3, međutim on kao targeting-modul (1) sadrži drugačiji fragment antitijela (scFv M036), koji je neovisno izoliran iz mišje Ig genske knjižnice i selekcioniran je na unakrsnu reaktivnost humanog/mišjeg FAP-a. Suprotno tome, ciljna specifičnost predlijeka W24 iz primjera 3 temelji se na scFv OS4, koji prepoznaje isključivo humani FAP.
Biokemijska karakterizacija i aktivnost vezanja antigena TNF-selektokinskog prodlijeka W32
Predlijek W32 eksprimiran je kao konstrukt W24 (primjer 3), očišćen je pomoću IMAC-e i analiziran je pomoću SDS-PAGE/Westem Blot-a; usp. sliku 6A. Izvršeno je, nadalje, određivanje vrijednosti KD,app predlijeka W32 za FAP-vezanje pomoću FACS analize; usp. sliku 68. Vrijednost je izračunata iz koncentracije pri kojoj se dobije polovicu od maksimalnog signala. Dobivena je vrijednost od 2,4 x 10-10 M.
TNF-aktivnost predlijeka W32
Aktivirani predlijek W32 u ispitivanju Kym-1-apoptoze (što se tiče provedbe usporedi primjer 3) ima djelovanje slično prirodno nastalom TNF-u, dok ne-probavljeni kontstrukt pokazuje apoptozno djelovanje tek pri vrlo visokim koncentracijama; usporedi sliku 7A.
Istražena je nadalje jukstatropna indukcija apoptoze aktiviranog predlijeka W32 u ko-kulturi sa stanicama koje otkrivaju predlijek. U tu svrhu FAP-negativne kontrolne stanice HT1080 ili FAP-pozitivne stanice HT1080#33 inkubirane su s nizom razrjeđenja predlijeka ili s predlijekom koji je bio aktiviran s tripsinom, zatim su isprane, fiksirane, uzgajane zajedno s Kim-1 i nakon 16 sati im je utvrđena vitalnost; usp. sliku 7B. U daljnjem pokusu je, u inače jednakim reakcijskim smjesama, izvršeno aktiviranje predlijeka s tripsinom tek nakon vezanja na stanice i zatim su stanice fiksirane; usp. sliku 7C. U obadva slučaja dobivena je signifikantna jukstatropna indukcija apoptoze s aktiviranim predlijekom.
Primjer 6
Konstrukcija polipeptida prema izumu selektokina W24 i W33
Fuzijski proteini su proizvedeni kako slijedi:
1. Fragment antitijela jednostrukog lanca (scFv) OS4 (koji se nastavku označava s OS4) je opisan sa "CDR grafting" humaniziranom inačicom FAP specifičnog mAb F19 (Rettig et al., 1988) i u Rippmann J. F. (Dissertation Uni Stuttgart, Verlag Grauer, Stuttgart, 1999), kao i u Rippmann et al. (Appl EnvMicrobiol 64:4862-4869, 1998).
2. U eukariotskom vektoru ekspresije pG1D105 (opisan u EP 0 953 639) s kazetom ekspresije za teški lanac imunglobulina mAb F19, on je pomoću BstE2 i Nae1 zamijenjen s kazetom minitijela OS4 koja se sastoji iz scFv OS4; hinge-CH3 područja jednog hulgGI; myc/his-Tag plazmida pW7 (opisao ga je Wuest, T., Dissertation Uni Stuttgart, 2001). Fragment Fc (Hinge- i CHS-područja u hu IgG1) je selektivno odstranjen probavom s Not1/BamH1.
3. cDNA sekvenca domene trimerizacije (na primjer AA 110-139 kokošjeg tenascina) uvećana je s proof-reading PCR pomoću prajmera 1 (SEQ ID NO 10) i 2 (SEQ ID NO 11), čime su uvedena mjesta presjeka Not1 i Kpn1. Fragment humanog TNF-a uvećan je pomoću prajmera 3 (SEQ ID NO 12) 14 (SEQ ID NO 13) iz ne-odcjepive TNF mutante koja stoji na strani membrane (membranski TNF, TNFdelta1-12, Grell et al., Cei 83:793-802, 1995), čime je na 5'-kraj uvedeno mjesto presjeka Kpn1 i na 3'-kraj su uvedena mjesto presjeka Acc3 i BamH1, a između dijela sekvence koji kodira za tenascinsku i TNF-domenu uvedena je sekvenca koja kodira za peptidni linker TyrGlyGlyGlySer (SEQ ID NO 9). Obadva fragmenta su uvedena upotrebom mjesta presjeka Not1, Kpn1 i BamH1 u probavljeni intermedijat kloniranja Not1/BamH1, koji je opisan pod 2.
4. Kloniranje linkera osjetljivog na proteazu i fragmenta humanog TNF receptora 1 izvršeno je preko više intermedijata. U tu svrhu fragment TNF receptora 1 (domene 1-3 koje su bogate sa cisteinom; AS 12-138; SwissProt #10039) je pomoću PCR uvećan s prajmerima 5 (SEQ ID NO 14) i 6 (SEQ ID NO 15) iz plazmida pADBTNF-R (Himmler et al., DNA-Cell Biol 9:705-715, 1990), i ponovno je uvećan s prajmerima 7 (SEQ ID NO 16) i 6 (SEQ ID NO 15) , čime su uvedena mjesta presjeka Acc3, BamH1 i linker 5' fragmenta TNFR, koji kodira mjesto presjeka proteaze. Taj fragment je kloniran preko mjesta presjeka Acc3/BamH1 u intermedijat opisan u 3.
5. Postupkom PCR uvećavanja s prajmerima 8 (SEQ ID NO 17) i 6 (SEQ ID NO 15) uvedena je jedna modifikacija linkera osjetljivog na proteazu u fragment TNFR1 linkera. Tako dobiven fragment uveden je preko mjesta presjeka Cla1 i BamH1 u intermedijat opisan pod 4, koji zamjenjuje ranije dobiven fragmet linkera TNFR. Tako proizveden eukariotski ekspresijski plasmid pW24 omogućuje ekspresiju TNF-selektokinskog predlijeka W24.
6. U daljnjem obliku izvedbe predlijeka TNF-selektokina, TNF-receptor je PCR uvećan s prajmerima 9 i 10, čime je dobivena sekvenca koja kodira za AA 54-115 humanog TNFR1 s linkerom koji se nalazi na 5'. Taj fragment je uveden preko mjesta presjeka Sai1 i BamH1 u pW24 i tamo je zamijenio postojeći fragment linker-TNFR1. Dobiveni ekspresijski plasmid pW33 omogućuje ekspresiju TNF-selektokinskog predlijeka W33.
7. Za dobivanje TNF-selektokin-predlijeka (W24 i W33) stanice CHO-DG44 s konstruktima opisanim pod 5. i 6. su transficirane s lipofektaminom u skladu s podacima proizvođača (Gibco-BRL) i zatim su selekcionirane pomoću medija CHO-S-SFM (HT-) (Life Technologies), bez hipo-ksantina i timidina, na stabilnu integraciju konstrukta u genom. Porast ekspresije dobiven je s postupnim povećanjem selekcijskog reagenta metotreksata (0,1; 1; 10 μM). Kako W24, tako također i W33 očišćeni su pomoću afinitetne kromatografije s imobiliziranim metalom (e. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)) kako su opisali Rippmann et al. (Appl Env Microbiol 64:4862-4869, 1998) pod sterilnim uvjetima iz supernatanata kultura i do daljnje upotrebe su odloženi su pri 4°C.
Svi koraci kloniranja i PCR-amplifikacije provedeni su u skladu s uobičajenim standardnim postupcima sa slijedećim prajmerima. Svi konstrukti su sekvencirani za verifikaciju cDNA-sekvence. Relevantna mjesta presjeka su otisnuta s masnim slovima.
[image]
[image]
Claims (30)
1. Polipeptid, naznačen time, da ima sekvencu amino kiselina koja od kraja N do kraja C obuhvaća
(1) područje koje selektivno prepoznaje specifičnu makromolekulu na površini stanice i/ili komponentu vanstaničnog matriksa,
(2) područje koje obuhvaća peptidni linker,
(3) područje s biološkim djelovanjem za specifičnu ciljnu molekulu,
(4) područje koje ima barem jedno probavno mjesto, i
(5) područje koje inhibira biološko djelovanje područja (3) intramolekularnim vezanjem i/ili uzajamnim djelovanjem,
pri čemu se biološko djelovanje područja (3) oslobađa in vivo probavom barem jednog probavnog mjesta u području (4).
2. Polipeptid prema zahtjevu 1, naznačen time, da područje (1) sadrži aminokiselinsku sekvencu citokina ili njezin fragment.
3. Polipeptid prema zahtjevu 2, naznačen time, da je citokin tumorski nekrozni faktor (TNF), njegov biološki učinkovit derivat ili njegova biološki učinkovita mutanta.
4. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 3, naznačen time, da je specifična ciljna molekula za područje (3) citokin receptor vezan sa staničnom membranom.
5. Polipeptid prema zahtjevu 3 ili 4, naznačen time, da područje (3) obuhvaća aminokiselinske ostatke 322 do 486 sekvence SEQ IV NO 1.
6. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 5, naznačen time, da barem jedno mjesto probave u području (4) je mjesto cijepanja tog proteina.
7. Polipeptid prema zahtjevu 5, naznačen time, da je proteaza aktivator plazminogena tipa urokinaze (uPA), aktivator tkivnog plazminogena (tPA), aktivirani faktor zgrušavanja VIIa, matriksna metaloproteaza ili FAP proteaza.
8. Polipeptid prema zahtjevu 6 ili 7, naznačen time, da područje (4) obuhvaća aminokiselinski ostatak 487 do 512 iz SEQ ID NO 1 ili aminokiselinski ostatak 487 do 520 iz SEQ ID NO 3.
9. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 8, naznačen time, da područje (5) ima najmanje jedno mjesto vezanja za područje (3).
10. Polipeptid prema zahtjevu 9, naznačen time, da je područje (5) receptor za citokin ili za njegov fragment.
11. Polipeptid prema zahtjevu 10, naznačen time, da receptor obuhvaća cijelu ili djelomičnu vanstaničnu domanu humanog TNF receptora i/ili virusnog proteina koji veže TNF ili njegove mutante ili sintetičkog spoja koji veže TNF.
12. Polipeptid prema zahtjevu 11, naznačen time, da područje (5) obuhvaća aminokiselinski ostatak 513 do 639 iz SEQ ID NO 1 ili aminokiselinski ostatak 521 do 582 iz SEO ID NO 3.
13. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 12, naznačen time, da peptidni linker u području (2) je modul trimerizacije i on povezuje područje (1) s područjem (3).
14. Polipeptid prema zahtjevu 13, naznačen time, da modul trimerizacije obuhvaća prirodno nastali peptid ili sintetički peptid s prirodnim svojstvima trimerizacije.
15. Polipeptid prema zahtjevu 14, naznačen time, da područje (2) obuhvaća aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO 5 ili SEQ ID NO 6.
16. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 15, naznačen time, da je područje (1) specifično za molekulu na površini stanice koja se eksprimira u tumorskim lezijama i/ili proliferirajućim endotelnim stanicama koje su povezane s procesom angiogeneze.
17. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 15, naznačen time, da je područje (1) specifično za jednu komponentu vanstaničnog matriksa koja je prisutna u tumorskim lezijama i/ili u području angiogeneze patoloških lezija.
18. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 15, naznačen time, da je područje (1) specifično za jednu komponentu samih malignih tumorskih stanica.
19. Polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 18, naznačen time, da je područje (1) mišje, humanizirano ili humano antitijelo ili njegov fragment definirane antigenske specifičnosti.
20. Polipeptid prema zahtjevu 19, naznačen time, da fragment antitijela je scFv-fragment ili Fab-fragment.
21. Polipeptid prema zahtjevu 20, naznačen time, da područje (1) obuhvaća aminokiselinski ostatak 20 do 285 iz SEQ ID NO 1.
22. Nukleinska kiselina, naznačena time, da obuhvaća nukleotidnu sekvencu koja kodira za polipeptid prema bilo kojem zahtjevu 1 do 21.
23. Vektor, naznačen time, da sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtjevu 22.
24. Vektor prema zahtjevu 23, naznačen time, da je sposoban za ekspresiju i/ili umnažanje u prokariotskim i/ili eukariotskim stanicama.
25. Stanica domaćin, naznačena time, da sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtjevu 22 i/ili vektor prema zahtjevu 23 ili 24.
26. Postupak za pripravu polipeptida prema bilo kojem zahtjevu 1 do 21, naznačen time, da obuhvaća slijedeće korake:
(a) uzgoj stanica domaćina prema zahtjevu 25 u mediju za kulturu pod prikladnim uvjetima, i
(b) izolaciju polipeptida prema bilo kojem zahtjevu 1 do 21 iz stanica domaćina i/ili iz medija kulture.
27. Farmaceutski pripravak, naznačen time, da sadrži farmaceutski učinkovitu količinu polipeptida prema bilo kojem zahtjevu 1 do 21 i/ili nukleinsku kiselinu prema
28. zahtjevu 22 i/ili vektor prema zahtjevu 23 ili 24, prema potrebi zajedno s jednom ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih tvari i/ili nosača.
29. Upotreba farmaceutskog pripravka prema zahtjevu 27, naznačena time, da se on koristi za terapeutsko liječenje tvrdih tumora i/ili angiogeneze patoloških lezija.
30. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 27 ili 28, naznačen time, da je on u krutom ili tekućem obliku ili je u obliku aerosola.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10045592A DE10045592A1 (de) | 2000-09-15 | 2000-09-15 | Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie |
| PCT/EP2001/010730 WO2002022833A1 (de) | 2000-09-15 | 2001-09-17 | Fusionsprotein aus antikörper-zytokin-zytokin inhibitor (selektokin) als zielspezifisches prodrug |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20030192A2 true HRP20030192A2 (en) | 2005-10-31 |
Family
ID=7656260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20030192A HRP20030192A2 (en) | 2000-09-15 | 2003-03-14 | Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target specific prodrug |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040053829A1 (hr) |
| EP (1) | EP1317556A1 (hr) |
| JP (1) | JP2004508828A (hr) |
| KR (1) | KR20030048041A (hr) |
| CN (1) | CN1214115C (hr) |
| AU (1) | AU2001293819A1 (hr) |
| BG (1) | BG107613A (hr) |
| BR (1) | BR0113928A (hr) |
| CA (1) | CA2422759A1 (hr) |
| DE (1) | DE10045592A1 (hr) |
| EE (1) | EE200300100A (hr) |
| HR (1) | HRP20030192A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0301693A3 (hr) |
| IL (1) | IL154185A0 (hr) |
| MX (1) | MXPA03002229A (hr) |
| NO (1) | NO20031185L (hr) |
| PL (1) | PL360540A1 (hr) |
| RU (1) | RU2003106429A (hr) |
| SK (1) | SK2812003A3 (hr) |
| WO (1) | WO2002022833A1 (hr) |
| YU (1) | YU18903A (hr) |
| ZA (1) | ZA200302008B (hr) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002043773A2 (en) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | The Johns Hopkins University | Tissue specific prodrugs |
| PE20021080A1 (es) * | 2001-04-12 | 2003-02-12 | Boehringer Ingelheim Int | Un anticuerpo especifico fapo bibh1 en el tratamiento del cancer |
| DE10144252A1 (de) | 2001-08-31 | 2003-03-27 | Fraunhofer Ges Forschung | Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF |
| DE10247755B4 (de) * | 2002-10-14 | 2006-01-19 | Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. | Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine |
| CA2515100A1 (en) * | 2003-02-06 | 2004-08-19 | Micromet Ag | Trimeric polypeptide construct to induce an enduring t cell response |
| US7374898B2 (en) * | 2004-10-12 | 2008-05-20 | The Research Foundation Of State University Of New York | Peptide inhibitors against seprase |
| WO2006117910A1 (ja) | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体 |
| EP1736482A1 (en) * | 2005-06-20 | 2006-12-27 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) | Recombinant trimeric 4-1BBL |
| DE102005036542A1 (de) * | 2005-08-03 | 2007-02-08 | Universität Stuttgart | CTL-Prodrug |
| EP1972350A1 (en) * | 2007-03-20 | 2008-09-24 | Rijksuniversiteit Groningen | Dual targeting system |
| EP2009022A1 (en) * | 2007-06-26 | 2008-12-31 | Apogenix GmbH | Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin) |
| EP3492488A1 (en) | 2007-08-22 | 2019-06-05 | The Regents of The University of California | Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof |
| US8895702B2 (en) | 2008-12-08 | 2014-11-25 | City Of Hope | Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies |
| EP3543256A1 (en) | 2009-01-12 | 2019-09-25 | Cytomx Therapeutics Inc. | Modified antibody compositions, methods of making and using thereof |
| CA2753294A1 (en) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Proproteins and methods of use thereof |
| US20210260163A1 (en) * | 2018-03-09 | 2021-08-26 | AskGene Pharma, Inc. | Novel cytokine prodrugs |
| SG11202011349PA (en) | 2018-05-14 | 2020-12-30 | Werewolf Therapeutics Inc | Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof |
| EP3794022A1 (en) | 2018-05-14 | 2021-03-24 | Werewolf Therapeutics, Inc. | Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof |
| EP3827079A1 (en) * | 2018-07-25 | 2021-06-02 | Askgene Pharma, Inc. | Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof |
| JP7479383B2 (ja) * | 2018-09-27 | 2024-05-08 | エクシリオ デベロップメント， インコーポレイテッド | マスクされたサイトカインポリペプチド |
| CA3137512A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Werewolf Therapeutics, Inc. | Separation moieties and methods and use thereof |
| US11845801B2 (en) | 2019-06-12 | 2023-12-19 | AskGene Pharma, Inc. | IL-15 prodrugs and methods of use thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1981001145A1 (en) * | 1979-10-18 | 1981-04-30 | Univ Illinois | Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs |
| US5502037A (en) * | 1993-07-09 | 1996-03-26 | Neuromed Technologies, Inc. | Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy |
| US5763733A (en) * | 1994-10-13 | 1998-06-09 | Enzon, Inc. | Antigen-binding fusion proteins |
| US5614191A (en) * | 1995-03-15 | 1997-03-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof |
| DE19900709A1 (de) * | 1999-01-11 | 2000-07-13 | Falkenberg Frank W | Eine neue Applikationsform für biologisch wirksame Substanzen zur Anwendung bei Menschen und Tieren |
-
2000
- 2000-09-15 DE DE10045592A patent/DE10045592A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-09-17 IL IL15418501A patent/IL154185A0/xx unknown
- 2001-09-17 AU AU2001293819A patent/AU2001293819A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-17 JP JP2002527275A patent/JP2004508828A/ja active Pending
- 2001-09-17 BR BR0113928-2A patent/BR0113928A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-09-17 CN CNB018157645A patent/CN1214115C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-09-17 YU YU18903A patent/YU18903A/sh unknown
- 2001-09-17 PL PL36054001A patent/PL360540A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-09-17 US US10/380,438 patent/US20040053829A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-17 EE EEP200300100A patent/EE200300100A/xx unknown
- 2001-09-17 MX MXPA03002229A patent/MXPA03002229A/es unknown
- 2001-09-17 KR KR10-2003-7003738A patent/KR20030048041A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-09-17 SK SK281-2003A patent/SK2812003A3/sk unknown
- 2001-09-17 HU HU0301693A patent/HUP0301693A3/hu unknown
- 2001-09-17 CA CA002422759A patent/CA2422759A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-17 RU RU2003106429/13A patent/RU2003106429A/ru not_active Application Discontinuation
- 2001-09-17 WO PCT/EP2001/010730 patent/WO2002022833A1/de active Application Filing
- 2001-09-17 EP EP01974261A patent/EP1317556A1/de not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-03-06 BG BG107613A patent/BG107613A/bg unknown
- 2003-03-12 ZA ZA200302008A patent/ZA200302008B/en unknown
- 2003-03-14 NO NO20031185A patent/NO20031185L/no unknown
- 2003-03-14 HR HR20030192A patent/HRP20030192A2/hr not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL360540A1 (en) | 2004-09-06 |
| EE200300100A (et) | 2005-02-15 |
| HUP0301693A2 (hu) | 2003-08-28 |
| CN1458977A (zh) | 2003-11-26 |
| RU2003106429A (ru) | 2004-08-27 |
| IL154185A0 (en) | 2003-07-31 |
| WO2002022833A1 (de) | 2002-03-21 |
| HUP0301693A3 (en) | 2005-11-28 |
| KR20030048041A (ko) | 2003-06-18 |
| DE10045592A1 (de) | 2002-03-28 |
| EP1317556A1 (de) | 2003-06-11 |
| CA2422759A1 (en) | 2003-03-17 |
| JP2004508828A (ja) | 2004-03-25 |
| BR0113928A (pt) | 2003-07-22 |
| MXPA03002229A (es) | 2005-06-20 |
| AU2001293819A1 (en) | 2002-03-26 |
| SK2812003A3 (en) | 2003-11-04 |
| NO20031185D0 (no) | 2003-03-14 |
| NO20031185L (no) | 2003-05-05 |
| ZA200302008B (en) | 2004-06-25 |
| US20040053829A1 (en) | 2004-03-18 |
| CN1214115C (zh) | 2005-08-10 |
| BG107613A (bg) | 2003-12-31 |
| YU18903A (sh) | 2006-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2095836C (en) | Cytokine immunoconjugates | |
| HRP20030192A2 (en) | Fusion protein from antibody cytokine-cytokine inhibitor (selectokine) for use as target specific prodrug | |
| US5650150A (en) | Recombinant antibody cytokine fusion proteins | |
| US9775913B2 (en) | Method of site specific activation of an antibody by a protease | |
| CA2902830C (en) | Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same | |
| KR101281208B1 (ko) | 피브로넥틴 ｅｄ-ｂ에 대한 항체 ｌ１９ 및 인터루킨１２의 융합 단백질 | |
| Peppel et al. | A tumor necrosis factor (TNF) receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity. | |
| AU2001275246B2 (en) | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof | |
| CA2158322C (en) | Immunoconjugate comprising an anti-egf receptor antibody and interleukin-8 | |
| Gillies et al. | Expression of genetically engineered immunoconjugates of lymphotoxin and a chimeric anti-ganglioside GD2 antibody | |
| WO2007014744A2 (en) | C-terminal tnf-family ligand (ctl) -prodrug | |
| CN115175917A (zh) | 药物缀合物及其应用 | |
| CN112294760A (zh) | 一种液体制剂及其应用 | |
| WO2000030680A1 (en) | Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs | |
| CA2095842A1 (en) | Bridging antibody fusion constructs | |
| CN100393356C (zh) | 用于癌症治疗的经修饰的细胞因子 | |
| Bauer et al. | Structure-activity profiles of Ab-derived TNF fusion proteins | |
| Ren et al. | Facts and hopes on chimeric cytokine agents for cancer immunotherapy | |
| KR100418329B1 (ko) | 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체 | |
| CN116574183A (zh) | 多功能抗体、其制备及其用途 | |
| JPWO2021231447A5 (hr) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20050817 Year of fee payment: 5 |
|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| OBST | Application withdrawn |