DE602004006871T2

DE602004006871T2 - Zusammensetzungen und verfahren, die multimere und oligomere lösliche fragmente des tweak-rezeptors betreffen

Info

Publication number: DE602004006871T2
Application number: DE602004006871T
Authority: DE
Inventors: Steven R. Seattle WILEY
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2024-07-24
Also published as: AU2004259355B2; WO2005010045A1; EP1648936B1; EP1648936A1; JP2007527224A; CA2531526A1; DE602004006871D1; US7482430B2; ATE364050T1; JP4823060B2; CA2531526C; ES2287773T3; US20050054047A1; AU2004259355A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Angiogenese is ein vielschrittiger Entwicklungsprozeß, welche in der Ausbildung neuer Blutzellen aus existierenden Zellen heraus resultiert. Dieser räumlich und zeitlich regulierte Prozess involviert das Aufweichen von Matrixkontakten sowie von Unterstützerzell-Wechselwirkungen in den existierenden Gefäßen durch Proteasen, gefolgt von koordinierter Bewegung, morphologischer Veränderung und Proliferation der glatten Muskel- und Endothelzellen des existierenden Gefäßes. Die entstandenen Zellen erstrecken sich dann in das Zielgewebe gefolgt von Zell-Zell-Wechselwirkungen, in welchen die Endothelzellen Röhren ausbilden, welche die glatten Muskelzellen umgeben. In einer koordinierten Art und Weise werden extrazelluläre Matrixproteine der Gefäße sekretiert und peri-endotheliale Unterstützerzellen werden rekrutiert, um destrukturelle Integrität zu stützen und aufrechtzuerhalten (siehe z.B. Daniel et al., Ann. Rev. Physiol. 2000(62):649, 2000). Angiogenese spielt eine bedeutende Rolle sowohl in der normalen als auch in der pathologischen Physiologie.
Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Angiogenese involviert in die fötale und embrionische Entwicklung, das Heilen von Wunden, die Regeneration von Organen und weibliche reproduktive Remodellierungsvorgänge, welche die Ausbildung von Endometrium, Corpus luteum und Placenta einschließen. Angiogenese wird streng reguliert unter normalen Bedingungen, speziell in erwachsenen Tieren und eine Störung der regulären Steuerungen kann zur pathologischen Angiogenese führen.
Pathologische Angiogenese wurde in der Manifestation und/oder Progression von Entzündungserkrankungen impliziert, bestimmten Augenerkrankungen und Krebs. Insbesondere gibt es einige Beweisführungen, welche das Konzept unterstützen, das Angiogenese essentiell für das Wachstum und das Fortbestehen fester Tumore und ihrer Metastasen essentiell ist (siehe z.B. Folkman, N. Engl. J. Med. 285:1182, 1971; Folkman et al., Nature 339:58, 1989; Kim et al., Nature 362:841, 1993; Hori et al., Cancer Res., 51:6180, 1991). Angiogenese-Inhibitoren sind daher bedeutsam für die Prävention (beispielsweise Behandlung von prä-bösartigen Bedingungen), Intervention (beispielsweise von kleinen Tumoren) und Regression (z.B. Behandlung von großen Tumoren) von Krebs (siehe beispielsweise Bergers et al., Science 284:808; 1999).
Es besteht ein Bedarf für weitere Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren der Angiogenese für die Prävention, das Abfragen und die Mitigation der Erkrankung.
Das TWEAK-Protein, welches auch TREPA und Apo3L genannt wird, ist ein Mitglied der Tumornekrosefaktor (TNF, tumor necrosis factor)-Familie und wird in einer großen Vielzahl von menschlichen Geweben exprimiert (Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272(51):32401, 1997; siehe auch Wiley, PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 98/35061 , 13. August 1998). Wie die meisten TNF-Familienmitglieder, ist TWEAK eub Typ II Membranprotein mit einer extrazellulären C-terminalen Domäne. Obwohl TWEAK ursprünglich beschrieben wurde als schwacher Inducer der Apoptose, wurde später gezeigt, dass diese Induktion des Zelltodes indirekt ist (Schneider et al., Eur. J. Immunol. 29:1785, 1999).
Lynch et al. demonstierten, dass TWEAK direkt die Endothelzell-Proliferation und Angiogenese induziert (J. Bio. Chem., 274(13):8455, 1999); picomolare Konzentrationen von rekombinatem löslichem TWEAK induzieren die Proliferation in multiplen Endothelzelllinien und in Aorta-glatten Muskelzellen und Reduzieren die Notwendigkeit für Serum und Wachstumsfaktoren in Kultur. Darüber hinaus induziert TWEAK eine starke angiogenetische Antwort in einem Ratten-Cornea-Taschen-Assay (rat corneal pocket assay). Da TNF-Familienmitglieder biologische Antworten induzieren durch Signalgebung über Elemente der TNF-Rezeptorfamilie, besteht ein großes Interesse am Identifizieren und Charakterisieren des TWEAK-Rezeptors.
Marsters et al. berichteten, dass TWEAK an einen Todesdomänen enthaltenden Rezeptor bindet und über ihn Signale sendet, welcher verschiedentlich bekannt ist als DR3, Apo3, WSL-1, TRAMP oder LARD (Marsters et al., Current Biology 8(9):525, 1998). Schneider et al., zeigten jedoch, dass TWEAK an Kym-1-Zellen bindet und über sie Signale sendet, dass Kym-1-Zellen jedoch den Rezeptor DR3 nicht exprimieren (Schneider et al., Eur. J. Immunol. 29:1785, 1999), Wiley identifizierte nachfolgend den primären TWEAK-Rezeptor und beschrieb bestimmte lösliche Fragmente und Varianten von selbigen, welche den Wildtyp TWEAK-Rezeptor antagonisieren (PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 01/45730 ).
Da TWEAK-Angiogenese in vivo induziert, besteht eine spezielle Notwendigkeit nach Antagonisten des hauptsächlich funktionellen TWEAK-Rezeptors. Solche TWEAK-Antagonisten waren bedeutsam von Angiogenese zum Behandeln von menschlichen Erkrankungen, einschließend Krebs und entzündliche Erkrankungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung und Charakterisierung von Polypeptiden, welche multimere lösliche Fragmente umfassen des hauptsächlichen funktionellen TWEAK-Rezeptors (TWEAKR) und eine Oligomerisierungsdomäne. Überraschenderweise haben diese Polypeptide eine höhere Bindungsaffinität für TWEAK und/oder sind bessere Kompetitoren für TWEAK-Binden als man aus dem TWEAK-Binden und kompetitiven Eigenschaften von Polypeptiden erwarten würde, welche lösliche monomere TWEAKR-Fragmente und eine Oligomerisierungsdomäne umfassen, oder welche lösliche multimere TWEAK-Fragmente ohne Oligomerisierungsdomäne umfassen.
Die Erfindung stellt auch beispielsweise Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung zum Inhibieren der Angiogenese in einem Säugetier, welches einer solchen Behandlung bedarf, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge einer Zusammensetzung umfassend einen TWEAK-Rezeptor-Antagonisten. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger und das Säugetier ist vorzugsweise ein Mensch.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid zur Verfügung, umfassend ein erstes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors, ein zweites lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors und eine Oligomerisierungsdomäne, wobei besagtes Polypeptid an TWEAK bindet und besagtes erstes lösliches Fragment aus einer Sequenz besteht, welche zumindest 90% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer Ausführungsform besteht das besagte erste lösliche Fragment aus einer Sequenz, welche zumindest 95% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform besteht besagtes erstes lösliches Fragment aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment und besagtes zweites lösliches Fragment jeweils unabhängig aus einer Sequenz, welche zumindest zu 90% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment und besagtes zweites lösliches Fragment jeweils unabhängig aus einer Sequenz, welche zumindest zu 90% identisch ist mit einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In noch einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragmentes und besagtes zweites lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid ein drittes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors. In einer weiteren Ausführungsform besteht besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment und besagtes drittes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zumindest zu 90% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment und besagtes drittes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zumindest zu 95% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment und besagtes drittes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid ein viertes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment und besagtes viertes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 90% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment und besagtes viertes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 95% identisch ist zu einer Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment und besagtes viertes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid ein fünftes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment und besagtes fünftes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 90% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäure sequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment und besagtes fünftes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 95% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment und besagtes fünftes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid ein sechstes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment, besagtes fünftes lösliches Fragment und besagtes sechstes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 90% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment, besagtes fünftes lösliches Fragment und besagtes sechstes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 95% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Frag ment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment, besagtes fünftes lösliches Fragment und besagtes sechstes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid ein siebentes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment, besagtes fünftes lösliches Fragment, besagtes sechstes lösliches Fragment und besagtes siebentes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 90% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment, besagtes fünftes lösliches Fragment, besagtes sechstes lösliches Fragment und besagtes siebentes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz, welche zu zumindest 95% identisch ist zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7. In einer weiteren Ausführungsform bestehen besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment, besagtes drittes lösliches Fragment, besagtes viertes lösliches Fragment, besagtes fünftes lösliches Fragment, besagtes sechstes lösliches Fragment und besagtes siebtes lösliches Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Reste 29 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 28 bis 79 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; Reste 30 bis 73 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7; und Reste 30 bis 70 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid einen Linker. In einer weiteren Ausführungsform verbindet besagter Linker besagtes erstes lösliches TWEAKR-Fragment und besagtes zweites lösliches TWEAKR-Fragment. In einer weiteren Ausführungsform verbindet besagter Linker besagtes zweites lösliches TWEAKR-Fragment und besagte Oligomerisierungsdomäne. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid einen ersten Linker und einen zweiten Linker, wobei besagte erste Linker besagtes erstes lösliches TWEAKR-Fragment und besagtes zweites lösliches TWEAKR-Fragment miteinander verbindet und besagter zweiter Linker besagtes zweites lösliches TWEAK-Fragment und besagte Oligomerisierungsdomäne miteinander verbindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagter Linker die Aminosäuresequenz GGGGG (SEQ ID NO:45).
In einer weiteren Ausführungsform werden besagtes erstes lösliches Fragment und besagtes zweites lösliches Fragment miteinander verbunden, ohne eine dazwischenliegende Polypeptidsequenz. In einer weiteren Ausführungsform sind besagtes erstes lösliches Fragment und besagtes Oligomerisierungsdomäne miteinander verbunden, ohne eine dazwischenliegende Polypeptidsequenz. In einer weiteren Ausführungsform sind besagtes erstes lösliches Fragment, besagtes zweites lösliches Fragment und besagte Oligomerisierungsdomäne miteinander verbunden, ohne eine dazwischenliegende Polypeptidsequenz in einem linearen und zusammenhängenden Polypeptid.
In einer weiteren Ausführungsform ist besagte Oligomerisierungsdomäne N-terminal mit besagtem ersten löslichen TWEAKR-Fragment verbunden und mit besagtem zweiten löslichen TWEAKR-Fragment. In einer weiteren Ausführungsform ist besagte Oligomerisierungsdomäne C-terminal bezogen auf besagtes erstes lösliches TWEAKR-Fragment und bezüglich auf besagtes zweites lösliches TWEAKR-Fragment. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagte Oligomerisierungsdomäne einen Leucin-Zipper. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagte Oligomerisierungsdomäne ein Fragment eines Antikörpers. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Fragment eines Antikörpers eine Fc-Domäne.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Polypeptid eine Sequenz, welche zu zumindest 90% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:43 und SEQ ID NO:44. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt besagtes Polypeptid eine Sequenz, welche zu zumindest 95% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:43 und SEQ ID NO:44. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt besagtes Polypeptid eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:43 und SEQ ID NO:44.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein zur Verfügung umfassend ein erstes besagtes Polypeptid und ein zweites besagtes Polypeptid, wobei besagte erste und zweite Polypeptide miteinander oligomerisiert sind. In einer weiteren Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz von besagtem ersten Polypeptid identisch zu der Aminosäuresequenz von besagtem zweiten Polypeptid. In einer weiteren Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz in besagtem ersten Polypeptid nicht identisch zu der Aminosäuresequenz von besagtem zweiten Polypeptid.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Inhibieren eines TWEAK-Rezeptors in einem Subjekt umfassend das Verabreichen von besagtem Polypeptid an besagtes Subjekt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Inhibieren von Angiogenese in einem Subjekt umfassend das Verabreichen einer therapeutisch effizienten Menge einer Zusammensetzung umfassend besagtes Polypeptid. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagte Zusammensetzung desweiteren einen pharmazeutisch verträglichen Träger. In einer weiteren Ausführungsform ist besagtes Subjekt ein Säugetier. In einer weiteren Ausführungsform ist besagtes Säugetier ein Mensch. In einer weiteren Ausführungsform hat besagtes Subjekt eine Krankheit oder einen Zustand mediatisiert oder verschlimmert durch Angiogenese. In einer weiteren Ausführungsform wird besagte Erkrankung oder besagter Zustand charakterisiert durch okulare Neovaskularisierung. In einer weiteren Ausführungsform ist besagte Krankheit oder besagter Zustand ein fester Tumor. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Verfahren desweiteren das Behandeln von besagtem Subjekt mit Strahlung. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Verfahren desweiteren das Behandeln von besagtem Subjekt mit einem zweiten chemotherapeutischen Agens. In einer weiteren Ausführungsform ist besagtes zweites chemotherapeutisches Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem alkylierenden Agens, einem Antimetaboliten, einem Vinca-Alkaloid, einem pflanzlichen Chemotherapeutikum, einem Nitroso-Hamstoff, einem Antitumor-Antibiotikum, einem Antitumor-Enzym, einem Topoisomeraseinhibitor, einem Platinanalog, einem Adrenocortical-Suppressant, einem Hormon, einem Hormon-Agonisten, einem Hormon-Antagonisten, einem Antikörper, einem Immunotherapeutikum, einem Blutzellfaktor, einem Radiotherapeutikum und einem biologischen Antwort-Modifier. In einer weiteren Ausführungsform ist besagtes zweites chemotherapeutisches Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechloretamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluorouracil, 5-Fluorodeoxyuridin, Methotrextrat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, Vinblastin, einem Lymphokin, einem Cytokin, einem Interleukin, einem Interferon, Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Delta-Interferon, TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyharnstoff, Methylhydrazin, Mitotan, Tamoxifen, und Fluoxymesteron. In einer weiteren Ausführungsform ist besagte Krankheit oder besagter Zustand eine entzündliche Erkrankung oder ein entzündlicher Zustand. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes Verfahren das Behandeln von besagtem Subjekt mit einem zweiten therapeutischen Agens. In einer weiteren Ausführungsform inhibiert besagtes zweites therapeutisches Agens ein Cytokin oder einen Cytokinrezeptor, welcher die Entzündung vorantreibt. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagtes zweites therapeutisches Agens ein lösliches Fragment von besagtem Cytokinrezeptor einen Antikörper, welcher besagtes Cytokin bindet oder einen Antikörper, welcher besagten Cytokinrezeptor bindet. In einer weiteren Ausführungsform aktiviert besagtes zweites therapeutisches Agens einen Rezeptor, welcher die Entzündung inhibiert. In einer weiteren Ausführungsform ist besagtes zweites therapeutisches Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem FIt3-Liganden, CD40-Liganden, Interleukin-2, einem Interleukin-4-Antagonisten, einem IL-13 Antagonisten, Interleukin-12, 4-IBB-Ligand, einem Anti-4-IBB Antikörper, einem TNF-Antagonisten, einem TNF-Rezeptor-Antagonisten, TRAIL, einem CD148 Agonisten, einem VEGF-Antagonisten, einem VEGF Rezeptor-Antagonisten, einem IgE-Antagonisten, und einem Tek-Antagonisten.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure oder ihr Komplement, umfassend eine Sequenz, welche besagtes Polypeptid codiert. In einer weiteren Ausführungsform hybridisiert besagte Nukleinsäure oder ihr Komplement unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer zweiten Nukleinsäure und besagte zweite Nukleinsäure umfasst eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 und SEQ ID NO:42. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagte Nukleinsäure oder ihr Komplement, eine Sequenz, welche zumindest zu 90% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 und SEQ ID NO:42. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagte Nukleinsäure oder ihr Komplement eine Sequenz, welche zu zumindest 95% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 und SEQ ID NO:42. In einer weiteren Ausführungsform umfasst besagte Nukleinsäure, oder ihr Komplement, eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 und SEQ ID NO:42. In einer weiteren Ausführungsform codiert besagte Nukleinsäure eine Polypeptidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:43 und SEQ ID NO:44. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegenden Erfindung einen Vektor zur Verfügung umfassend besagte Nukleinsäure. In einer weiteren Ausführungsform ist besagter Vektor ein Expressionsvektor.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle zur Verfügung, umfassend besagte Nukleinsäure.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Herstellen eines Polypeptids umfassend das Kultivieren von besagter Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression von besagtem Polypeptid vorantreiben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Sequenzalignment der menschlichen und murinen TWEAK-Rezeptor-Polypeptidsequenz. Die ganz oben gelegene Sequenz ist das murine TWEAK-Polypeptid (SEQ ID NO:5) und die ganz unten gelegene Sequenz ist das menschliche TWEAK-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO:5).
2 zeigt den Effekt von TWEAKR-Fc auf PMA-induzierte HRMEC-Wund-Verschließung.
3 zeigt den Effekt von TWEAKR-Fc auf EGF-induzierte HRMEC-Wund-Verschließung.
4 zeigt den Effekt von menschlichem TWEAKR-Fc auf TWEAK-induzierte (100 ng/ml) HUVEC-Proliferation.
5 zeigt den Effekt von menschlichem TWEAKR-Fc auf FGF-2-induzierte (10 ng/ml) HUVEC-Proliferation.
6 zeigt das Binden von TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7; "Monomer"); TWEAKR:DR5:Fc (SEQ IS NO:9, "DR5"), di-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:11, "Dimer"), sowie tri-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:13, "Trimer") an TWEAK-FLAG in einem ELISA Bindungsassay.
7 zeigt die Fähigkeit von TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7; "hu+eu"), TWEAKR:DR5:Fc (SEQ ID NO:9, "DR5+eu"), di-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:11, "di+eu"), und tri-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:11), "di+eu"), sowie tri-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:13, "tri+eu"), mit Europium-gelapeltem TWEAKR hinsichtlich des Bindens an TWEAK in einem kompetitiven Bindungsassay in Wettbewerb zu treten.
8 zeigt das Binden von TWEAKR:Gly5:Fc (SEQ ID NO:15; schwarze Kreise), TWEAKR:1 KPEG:Fc (SEQ ID NO:17, Sterne), TWEAKR:1KPEG; TWEAKR:Gly5:Fc (SEQ ID NO:18; schwarze Kreise) und TWEAKR:Gly5:TWEAKR:Gly5:Fc (SEQ ID NO:19, weisse Kreise) an TWEAK unter Verwendung eines ELISA-artigen Assays.
9 zeigt einen Vergleich von TWEAKR-Fc-Oligomeren, welche an lösliches TWEAK bei 50 ng/ml binden, unter Verwendung von huTWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7) (schwarze Quadrate), TWEAKR 43 Monomer (SEQ ID NO:31) (weiße Quadrate), TWEAKR 43 Dimer (SEQ ID NO:33) (weiße Dreiecke), TWEAKR 43 Trimer (SEQ ID NO:35) (Kreuze), TWEAKR 43 Tetramer (SEQ ID NO:37) (weiße Rauten) und TWEAKR 43 Pentamer (SEQ ID NO:39) (weiße Kreise).
10 zeigt einen Vergleich von TWEAKR-Fc-Oligomeren, welche an lösliches TWEAK bei 50 ng/ml binden, unter Verwendung von TWEAKR 43 Tetramer (SEQ ID NO:37) (weiße Rauten), TWEAK 43 Pentamer (SEQ ID NO:39) (weiße Kreise), TWEAKR 43 Hexamer (SEQ ID NO:41) (weiße Dreiecke), und TWEAKR 43 Heptamer (SEQ ID NO:43) (Sterne).
11 zeigt einen Vergleich von TWEAKR-Fc-Oligomeren, welche an lösliches TWEAK bei 33 ng/ml binden, unter Verwendung von CHO TANDEM (SEQ ID NO:19, exprimiert in stabil-transfizierten CHO-Zellen), TWEAKR 43 Pentamer (SEQ ID NO:39) (weiße Kreise), TWEAKR 43 Hexamer (SEQ ID NO:41) (weiße Dreiecke) und TWEAKR 43 Heptamer (SEQ ID NO:43) (Sterne).
12 zeigt einen Vergleich von TWEAKR-Fc-Oligomeren, welche an lösliches TWEAK bei 50 ng/ml binden, unter Verwendung von huTWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7) (schwarze Quadrate), TWEAKR 40 Monomer (SEQ ID NO.21) (weiße Quadrate), TWEAKR 40 Dimer (SEQ ID NO:23) (weiße Dreiecke), TWEAKR 40 Trimer (SEQ ID NO:25) (Kreuze), TWEAKR 40 Tetramer (SEQ ID NO:27) (weiße Rauten), und TWEAKR 40 Pentamer (SEQ ID NO:29) (weiße Kreise).
13 zeigt einen Vergleich von TWEAKR-Fc-Oligomeren, vs. Europium-TWEAKR, welche an immobilisiertes TWEAK bei 50 ng/mg binden, unter Verwendung von huTWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7) (schwarze Quadrate), TWEAKR 40 Monomer (SEQ ID NO:21) (weiße Quadrate), TWEAKR 40 Dimer (SEQ ID NO:23) (weiße Dreiecke), TWEAKR 40 Trimer (SEQ ID NO:25) (Kreuze), TWEAKR 40 Tetramer (SEQ ID NO:27) (weiße Rauten), TWEAKR 40 Pentamer (SEQ ID NO:29) (weiße Kreise).
14 zeigt einen Vergleich von TWEAKR-Oligomeren vs. Europium-TWEAKR, welche an immobilisiertes TWEAK bei 50 ng/ml binden, unter Verwendung von huTWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7) (schwarze Quadrate), TWEAKR 43 Monomer (SEQ ID NO:31) (weiße Quadrate), TWEAKR 43 Dimer (SEQ ID NO:33) (weiße Dreiecke), TWEAKER 43 Trimer (SEQ ID NO:35) (Kreuze), TWEAKR 43 Tetramer (SEQ ID NO:37) (weiße Rauten)m TWEAKR 43 Pentamer (SEQ ID NO:39) (weiße Kreise), TWEAK 43 Hexamer (SEQ ID NO:41) (vertikale Linien) und TWEAKR43 Heptamer (SEQ ID NO:43) (Sterne).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung, welche sich auf Polypeptide beziehen, die Multimere von löslichen Fragmenten von TWEAKR umfassen und eine Oligomerisierungsdomäne.
Abkürzungen und Terminologie, verwendet in der Beschreibung

"4-IBB" und "4-IBB Liganden" (4-1BB-L) sind Polypeptide, welche unter anderem beschrieben werden in U.S. Patent No. 5,674,704 einschließend lösliche Formen davon.
"bFGF" is basic fibroblast growth factor.
"BSA" is bovine serum albumin.
"CD40 Ligand" (CD40L) ist ein Polypeptid, welches unter anderem beschrieben wird in U.S. Patent No. 5,716,805 einschließend lösliche Formen davon.
"CHO" ist eine chinesische Hamster-Ovar-Zelllinie.
"DMEM" ist Dulbecco's Modified eagle Medium, ein kommerziell verfügbares Zellkulturmedium.
"ELISA" ist der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.
"FIt3L" ist der FIt3-Ligand, ein Polypeptid, welches unter anderem beschrieben wird in U.S. Patent No. 5,554,512 einschließend lösliche Formen davon.
"HRMEC" sind primäre menschliche mikrovaskuläre Nieren-Endothelzellen.
"HUVEC" ist eine Linie aus menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen.
"PBS" ist Phosphat-gepufferte Salzlösung.
"PMA" ist Phorbol-12-Myristate-13-Acetat.
"RTKs" sind Rezeptor-Tyrosinkinasen.
"Tek", wird auch bezeichnet als Tie2 und ork, und ist ein RTK, das in erster Linie exprimiert wird in vaskulärem Endothelium. Das molekulare Klonen von menschlichem Tek (ork) wurde bislang beschrieben von Ziegler, U.S. Patent No. 5,447,860 , "Tek Antagonisten" werden beschrieben unter anderem in Cerretti et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 00/5323 , 14. Dezember 2000.
"TNFR" ist ein Tumor-Nekrose-Faktorrezeptor, einschließend lösliche Formen davon. "TNFR/Fc" ist ein Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Fc-Fusionspolypeptid.
"TRAIL" ist ein TNF-verwandter Apoptose-Induktionsligand, ein sogenanntes Typ II Transmembran-Polypeptid in der TNF-Familie, welches beschrieben wird u.a. in U.S. Patent No. 5,763,223 , einschließend lösliche Formen davon.
"VEGF" ist der vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor), auch bekannt als VPF oder vaskulärer Permeabilitätsfaktor (vascular permeability factor).

Lösliche TWEAK-Rezeptor-Polypeptide
Native menschliche TWEAK-Rezeptor cDNA weist die Sequenz SEQ ID NO:3 auf, welche ein Polypeptid mit 129 Resten codiert (SEQ ID NO:4). Die Untersuchung der DNA Sequenz schlägt ein Polypeptid vor mit einer extrazellulären Aminosäuredomäne von ungefähr 78 Aminosäuren (Reste 1-78 von SEQ ID NO:4 einschließend das Signalpeptid), eine ungefähr 23 Aminosäure lange Transmembrandomäne (Reste 79-101 von SEQ ID NO:4) und eine ungefähr 28 Aminosäure lange intrazelluläre Domäne (Reste 102-129 von SEQ ID NO:4). Die TWEAK Rezeptorsequenz wurde auch beschrieben von Kato et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/55508 , 10. Dezember 1998 und von Incyte, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/61471 , 2. Dezember 1999. Wie hier verwendet, schließt "TWEAKR" Polypeptide ein mit diesen Sequenzen und insbesondere solche, welche die Aminosäuren 28-79 von SEQ ID NO:7 umfassen, wie auch natürlich vorkommende Varianten davon.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid verwendet, welches ein lösliches TWEAK Rezeptorfragment umfasst sowie eine Oligomerisierungsdomäne, als ein TWEAKR Antagonist, um die Angiogenese zu inhibieren und/oder das Binden eines TWEAK-Liganden an TWEAKR.
Lösliche Polypeptide sind in der Lage, aus den Zellen sekretiert zu werden, in welchen sie exprimiert werden. Die Verwendung von löslichen Formen von Polypeptiden ist für bestimmte Anwendungen von Vorteil. Aufreinigen der Polypeptide aus rekombinanten Wirtszellen wird ermöglicht, da die Polypeptide sekretiert werden und lösliche Proteine sind im allgemeinen geeignet zur parenteralen Verabreichung. Ein sekretiertes lösliches Polypeptid kann identifiziert werden (und unterschieden werden von seinem nicht löslichen membrangebundenen Widerparten). Durch Abtrennen von intakten Zellen, welche das gewünschte Polypeptid exprimieren, aus dem Kulturmedium, beispielsweise durch Zentrifugation und Testen des Mediums (des Überstandes) auf das Vorliegen des gewünschten Polypeptids. Das Vorliegen des gewünschten Polypeptids in dem Medium zeigt an, dass das Polypeptid aus den Zellen sekretiert wurde und folglich eine lösliche Form des Polypeptids darstellt. Lösliche Polypeptide können hergestellt werden durch irgendeine einer Vielzahl von herkömmlichen Techniken. Eine DNA Sequenz, welche ein gewünschtes lösliches Peptid codiert, kann subkloniert werden in einen Expressionsvektor zur Erzeugung des Polypeptids, oder das gewünschte kodierende DNA Fragment kann chemisch synthetisiert werden.
Lösliche TWEAKR-Polypeptide umfassen die gesamte oder einen Teil der extrazellulären TWEAKR-Domäne, ihnen fehlt im allgemeinen aber die Transmembrandomäne oder ein Fragment davon, welche die Retention des Polypeptids an der Zelloberfläche verursachen würde. Lösliche Polypeptide können ein Teil der Transmembrandomäne oder die die gesamte oder einen Teil der cytoplastischen Domäne einschließen, solange das Polypeptid aus der Zelle sekretiert wird, in welche es produziert wird. Lösliche TWEAKR-Polypeptide umfassen in vorteilhafter Art und Weise ein natives oder heterologes Signalpeptid, wenn sie erstmals synthetisiert werden, um die Sekretion aus der Zelle voranzutreiben, jedoch wird die Signalsequenz beim Sekretieren abgeschnitten. Der Begriff "extrazelluläre TWEAKR-Domäne" soll die gesamte oder einen Teil der nativen extrazellulären TWEAKR-Domäne umfassen, wie auch verwandte Formen, einschließend, jedoch nicht limitiert auf: (a) Fragmente, (b) Varianten, (c) Derivate und (d) Fusionspolypeptide. Die Fähigkeit dieser verwandten Formen, Angiogenese zu inhibieren, oder andere TWEAKR-mediatisierte Antworten kann in vitro oder in vivo bestimmt werden unter Verwendung von Verfahren, wie diejenigen, die unten exemplarisch dargebracht werden, oder unter Verwendung anderer Assays, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispiele von löslichen TWEAKR Polypeptiden werden unten dargelegt.
Multimere TWEAKR-Fragmente sind Dimere, Trimere, Tetramere, Pentamere, Hexamere, Heptamere, Octamere, Nonamere, Decamere oder höhere Multimere eines lösliches Fragmentes von TWEAKR. Multimere können miteinander verbunden sein durch irgendwelche in dem Stand der Technik bekannten Mittel. Beispielsweise können sie Teil einer kontinuierlichen Polypeptidkette sein, wobei jedes Monomer verknüpft sein kann mit seinem oder (seinen) benachbartem(n) Monomer(en), direkt über Peptidbindung(en) oder indirekt durch eine oder mehrere dazwischenliegende Aminosäure- sowie Peptidbindungen, beispielsweise durch einen Linker. Multimere können auch miteinander verbunden sein, beispielsweise durch einen Linker. Multimere können auch verbunden sein miteinander beispielsweise durch andere Typen von kovalenten Bindungen, beispielsweise durch Disulfid-Bindungen, ausgebildet zwischen Cystein-Resten auf unterschiedlichen löslichen TWEAKR-Polypeptiden.
Oligomerisierungs-Domänen sind Polypeptide, welche verursachen, dass Polypeptide, welche sie umfassen, oligomerisieren, d.h. kovalente und/oder nicht-kovalente Assotiationen ausbilden mit einem anderen Polypeptid umfassend eine korrespondierende Oligomerisierungsdomäne. Folglich werden zwei oder mehr Polypeptide "oligomerisiert", falls sie aneinander über ihre Oligomerisierungsdomänen gebunden werden. Jegliche Oligomerisierungsdomäne, die im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden. Beispiele schließen Leucin-Zipper sowie bestimmte Polypeptide, abgeleitet aus Antikörpern, beispielsweise Fc-Domänen, ein, wie in größeren Details unten beschrieben wird. Die Polypeptide in einem Oligomer können identische Polypeptidsequenzen aufweisen, ähnliche Polypeptidsequenzen oder unterschiedliche Polypeptidsequenzen. In speziellen Ausführungsformen umfassen die oligomerisierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung von 4-14 lösliche TWEAKR-Fragmente.
In einigen Ausführungsformen wird ein Polypeptid, welches ein multimeres lösliches TWEAKR-Fragment umfasst, und eine Oligomerisierungsdomäne, hergestellt unter Verwendung von Polypeptiden, abgeleitet aus Immunoglobulinen. Die Herstellung von Fusionsproteinen umfassend bestimmte heterologe Polypeptide, fusioniert an verschiedene Abschnitte von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließend die Fc-Domäne) wurde beschrieben beispielsweise von Ashkenazi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344;677, 1990); und Hollenbaugh and Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, Seiten 10.19.1-10.19.11, 1992).
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist gerichtet auf ein TWEAKR-Fc-Oligomer, welches zwei Polypeptide umfasst, wobei jedes Polypeptid zwei lösliche TWEAKR-Fragmente umfasst und eine Fc-Domäne (diTWEAKR-Fc). Ein Polynukleotid, welches das diTWEAKR-Fc-Polypeptid codiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert. diTWEAKR-Polypeptide werden in Wirtszellen exprimiert, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert sind und man ermöglicht es, dass sie sehr ähnlich, wie Antikörpermoleküle, eine Anordnung binden, wobei dabei Disulfidbrücken zwischen Ketten sich zwischen den Fc-Gruppen ausbilden, um ein tetravalentes lösliches TWEAKR zu ergeben. Der Begriff "Fc-Polypeptid", wie hier verwendet, schließt native und muteine Formen von Polypeptiden ein, abgeleitet von der Fc-Region eines Antikörpers. Trunkierte Formen von solchen Polypeptiden, welche die Hinche-Region umfassen, welche die Dimerisierung vorantreibt, sind auch eingeschlossen.
Ein geeignetes Fc-Polypeptid, beschrieben in der PCT-Anmeldung WP 93/10151, ist ein einzelkettiges Polypeptid, welches sich von der N-terminalen Hinche-Region bis zum nativen C-Terminus der Fc-Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers erstreckt. Ein weiteres geeignetes Fc-Polypeptid ist das Fc-Mutein, beschrieben im US-Patent Nr. 5,457,035 und von Baum et al., EMBO J. 13:3992, 1994. Die Aminosäuresequenz dieses Muteins ist identisch zu derjenigen der nativen Fc-Sequenz offenbart in WO 93/10151 , abgesehen davon, dass die Aminosäure Nr. 19 verändert wurde von Leu nach Ala, die Aminosäure 20 verändert wurde von Leu nach Glu und die Aminosäure 22 verändert wurde von Gly nach Ala. Das Mutein zeigt reduzierte Affinität für Fc-Rezeptoren. Fusionspolypeptide, welche Fc-Gruppen umfassen sowie Multimere, ausgebildet daraus liefern den Vorteil, die Aufreinigung durch Affinitätschromatographie über Protein A- oder Protein G-Säulen zu ermöglichen und Fc-Fusionspolypeptide können größere in vivo Halbwärtsdauer zur Verfügung stellen, was in therapeutischen Anwendungen sinnvoll ist, bezogen auf unmodifizierte Polypeptide.
In anderen Ausführungsformen kann ein multimeres lösliches TWEAKR-Fragment substituiert sein, anstelle des variablen Abschnitts einer schweren oder leichten Antikörperkette. Falls Fusionsproteine mit sowohl schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers erzeugt werden, ist es möglich, ein lösliches TWEAKR-Oligomer auszubilden, mit acht oder mehr löslichen TWEAKR-Fragmenten.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Oligomerisierungsdomäne eine Leucin-Zipperdomäne. Leucin-Zipperdomänen sind Peptide, welche die Oligomerisierung der Proteine, in welchen die zu finden sind, vorantreiben. Leucin-Zipper fanden sich ursprünglich in verschiedenen DNA-bindenden Proteinen (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988) und haben sich seither in einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen gefunden. Unter den bekannten Leucin-Zippern sind natürlich auftretende Peptide und Derivate davon, welche dimerisieren oder trimerisieren. Beispiele von Leucin-Zipper-Domänen, geeignet zum Erzeugen von löslichen multimeren Proteinen werden beschrieben in der PCT-Anmeldung WO 94/10308 bzw. sind der Leucin-Zipper, abgeleitet vom lung surfactant Protein D (SPD) beschrieben in Hoppe et al. FEBS Lett. 344:191, 1994). Die Verwendung eines modifizierten Leucin-Zippers, welches die stabile Trimerisierung eines heterologen Proteins ermöglicht, welches daran fusioniert ist, wird beschrieben in Fanslow et al., Semin. Immunol. 6:267, 1994. Rekombinante Fusionsproteine umfassend ein lösliches TWEAKR Polypeptid, fusioniert an ein Leucin-Zipper-Peptid werden exprimiert in geeigneten Wirtszellen und das lösliche TWEAKR-Multimer, das sich ausbildet, wird von dem Kulturüberstand zurückgewonnen.
Alternativ umfassen die Polypeptide der Erfindung Peptid-Linker (Spacer). Ein Linker ist eine Sequenz von einer oder mehreren Aminosäuren, deren aminoterminales Ende Peptid-gebunden ist an ein erstes Polypeptid und dessen Carboxy-terminales Ende Peptid-gebunden ist an ein zweites Polypeptid, so dass das erste Polypeptid, der Linker und das zweite Polypeptid eine durchgängige Sequenz von Aminosäuren ausbilden. Solch ein Linker wird gemeinhin bezeichnet als einer, der das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid miteinander verbindet, im Gegensatz zu einem ersten Polypeptid, welche aneinander verbunden sind, ohne eine dazwischen liegende Polypeptidsequenz, (d.h. ohne einen Linker). Unter den geeigneten Peptid-Linkern sind diejenigen beschrieben in U.S. Patenten 4,751,180 , 4,935,233 , und 5,073,627 . Eine DNA-Sequenz, welche einen gewünschten Peptid-Linker codiert, kann insertiert werden zwischen und in den gleichen Leserahmen, wie beispielsweise die DNA-Sequenzen, welche für TWEAKR-Fragmente kodieren und/oder zwischen den Polynukleotidsequenzen, welche die TWEAKR-Fragmente kodieren und die Oligomerisierungsdomäne unter Verwendung von konventionellen Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise kann ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, welches den Linker codiert, ligiert sein, zwischen Sequenzen, welche lösliche TWEAKR-Fragmente kodieren. In besonderen Ausführungsformen umfasst ein Polypeptid der Erfindung von zwei bis vier lösliche TWEAKR-Fragmenten, abgetrennt durch Peptidlinker sowie eine Oligomerisierungsdomäne.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von verschiedenen Formen von oligomerisierten löslichen TWEAKR-Multimeren, welche Angiogenese inhibieren und/oder anderen TWEAKR-mediatisierten Antworten. Der Begriff "oligomerisiertes lösliches TWEAKR-Multimer" soll auch oligomerisierte Multimere umfassen, welche die vollständige oder einen Teil der nativen extra zellulären TWEAKR-Domäne umfassen, wie auch verwandte Formen, einschließend, jedoch nicht limitiert auf oligomerisierte Multimere von Fragmenten, Varianten, Derivate und Fusionspolypeptiden von löslichem TWEAKR. Die Fähigkeit dieser verwandten Formen, Angiogenese zu inhibieren oder andere TWEAKR-mediatisierte Antworten kann bestimmt werden in vitro oder in vivo unter Verwendung von Verfahren, wie z.B. diejenigen, welche exemplarisch in den Beispielen dargelegt sind, oder unter Verwendung von irgendwelchen bekannten Assays, die dem Stand der Technik bekannt sind.
Unter den Polypeptiden, Multimeren und Oligomeren, bedeutsam bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, welche TWEAKR-Varianten umfassen, welche die Fähigkeit aufrechterhalten, Liganden zu binden und/oder Angiogenese zu inhibieren oder andere TWEAKR-mediatisierte Antworten. Solche TWEAKR-Varianten schließen Polypeptide ein, welche substantiell homolog sind mit nativem TWEAKR, welche aber eine Aminosäuresequenz aufweisen, die unterschiedlich ist von derjenigen eines nativen TWEAKR, aufgrund von einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen. Spezielle Ausführungsformen schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf TWEAKR-Polypeptide, welche von einer bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäurereste umfassen im Vergleich zu einer nativen TWEAKR-Sequenz. Eingeschlossen als Varianten von TWEAKR-Polypeptiden sind diejenigen Varianten, welche natürlich vorkommen, beispielsweise allele Formen sowie alternativ gesplicte Formen, sowie auch Varianten, welche konstruiert wurden durch Modifizieren der Aminosäuresequenz eines TWEAKR-Polypeptids oder der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure, welche ein TWEAKR-Polypeptid codiert.
Im allgemeinen sollten Substitutionen anstelle von einer oder mehreren Aminosäuren, vorliegend in dem nativen Polypeptid konservativ durchgeführt werden. Beispiele konservativer Substitutionen schließen Substitutionen von Aminosäuren ein, die außerhalb der aktiven Domäne(n) liegen sowie Substitutionen von Aminosäuren, welche die sekundäre und/oder teritiäre Struktur von TWEAKR nicht verändern. Weitere Beispiele schließen das Substituieren eines aliphatischen Restes anstelle eines anderen ein, wie Z.B. Ile, Val, Leu oder Ala untereinander oder Substitutionen eines polaren Restes ge gen einen anderen, beispielsweise eine Substitution zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn, oder Substitutionen von einem aromatischen Rest anstelle eines anderen, wie z.B. Phe, Trp oder Tyr für einen anderen. Andere solche konservative Substitutionen, beispielsweise Substitutionen von vollständigen Region mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften sind dem Stand der Technik bekannt.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die TWEAKR-Variante zumindest zu ungefähr 70% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von nativem TWEAKR; in einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die TWEAKR-Variante zu zumindest 80% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von nativem TWEAKR. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die TWEAKR-Varianten zumindest zu ungefähr 90% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von nativem TWEAKR; in einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die TWEAKR-Variante zu zumindest 95% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von nativem TWEAKR. In einigen am meisten bevorzugten Ausführungsformen ist die TWEAKR-Varianten zumindest zu ungefähr 98% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von nativem TWEAKR; in einigen am meisten bevorzugten Ausführungsformen ist die TWEAKR-Variante zu zumindest 99% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von nativem TWEAKR. Prozent-Identität, sowohl im Fall von Polypeptiden als auch Nukleinsäuren, kann bestimmt werden durch visuelle Inspektion. Prozent-Identität kann auch bestimmt werden unter Verwendung des Aligment-Verfahrens von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970) in der überarbeiteten Fassung von Smith and Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Vorzugsweise wird die Prozent-Identität bestimmt unter Verwendung eines Computerprogramms, beispielsweise des GAP-Computerprogramms 10.x verfügbar von der Genetics Group (GCG; Madison, WI, siehe also Deveraux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, 1984). Die bevorzugten voreingestellten Parameter für das GAP-Programm schließen ein: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff, eds. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979 für Aminsoäuren; (2) eine Strafe von 30 (Aminosäuren) oder 50 (Nukleotide) für jede Lücke (penalty gap) und weiteren 1 (Aminosäuren) oder 3 an Strafe für jedes Symbol in jeder Lücke; (3) keine Strafe für End-Lücken; und (4) keine maximale Strafe für lange Lücken. Andere Programme, verwendet durch einen Fachmann auf dem Gebiet des Sequenzvergleichs können auch verwendet werden. Für Fragmente von TWEAKR wird die Prozent-Identität berechnet basierend auf dem Abschnitt von TWEAKR, der in dem Fragment vorliegt.
Die vorliegende Erfindung umfasst des weiteren die Verwendung von löslichen TWEAKR-Polypeptiden mit oder ohne assoziierte native Muster-Glykoselierung. TWEAKR, exprimiert in Hefe oder in Säugetier-Expressionssystemen (COS-1 oder COS-7 Zellen) kann ähnlich sein, oder signifikant unterschiedlich sein von einem nativen TWEAKR-Polypeptid hinsichtlich Molekulargewicht und Glykoselierungsmuster, abhängend von der Wahl des Expressionssystems. Expression von TWEAKR-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie z.B. E. coli, liefert nicht-glykoselierte Moleküle. Unterschiedliche Wirtszellen können auch Polypeptide differentiell verarbeiten, was in heterogenen Mischungen von Polypeptiden resultiert mit variablen N- oder C-Termini.
Die primäre Aminosäurestruktur von löslichen TWEAKR-Polypeptiden kann modifiziert werden, um Derivate zu erzeugen, durch Ausbilden von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit anderen chemischen Gruppen, wie z.B. Glycosylgruppen, Lipidenphosphat, Acetylgruppen u. dgl. Kovalente Derivate von TWEAKR können hergestellt werden durch Verknüpfen spezieller funktioneller Gruppen von TWEAKR-Aminosäureseitenketten oder am N-Terminus oder am C-Terminus eines TWEAKR-Polypeptides.
Fusionspolypeptide von löslichem TWEAKR, welche bedeutsam sind beim Durchführen der Erfindung schließen auch kovalente oder aggregative Konjugate von TWEAKR-Polypeptid mit anderen Polypeptiden ein, ergänzt, um neue poly-funktionelle Entitäten.
Rekombinante Produktion von TWEAK-Rezeptor-Polypeptiden
TWEAKR-Polypeptide, welche lösliche TWEAKR-Polypeptide, Fragmente und Fusionspolypeptide einschließen, und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können hergestellt werden unter Verwendung eines rekombinanten Expressionssystems. Wirtszellen, transformiert mit einem rekombinanten Expressionsvektor ("rekombinante Wirtszellen"), welche das TWEAKR-Polypeptid kodieren, werden kultiviert unter Bedingungen, welche die Expression von TWEAKR vorantreiben und das TWEAKR wird zurückgewonnen. Das TWEAKR-Polypeptid kann auch erzeugt werden in transgenen Pflanzen oder Tieren oder durch chemische Synthese.
Die Erfindung umfasst Nukleinsäuremoleküle, welche die TWEAKR-Polypeptide kodieren, die in der Erfindung verwendet werden, einschließend: (a) Nukleinsäuren, welche Reste 29-79 von SEQ ID NO:7 kodieren sowie Fragmente davon, welche an TWEAK binden; (b) Nukleinsäuren, welche zu zumindest 70, 80, 90, 95, 98 oder 99% identisch zu einer Nukleinsäure von (a) sind, und welche ein Polypeptid kodieren, das in der Lage ist, an TWEAK zu binden; und (c) Nukleinsäuren, welche bei einer moderaten Stringenz an ein Nukleinsäure von (a) binden und welche ein Polypeptid kodieren, das in der Lage ist, an TWEAK zu binden.
Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes kann es eine merkliche Variation in den Nukleinsäuresequenzen geben, welche die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Eingeschlossen als Ausführungsformen der Erfindung sind Nukleinsäuren, die in der Lage sind, unter moderat-stringenten Bedingungen (beispielsweise Vorab-Waschungslösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC, über Nacht) an die DNA-Sequenzen, welche TWAEKR kodieren, binden. Der Fachmann auf dem Gebiet kann weiteren Kombinationen von Salzen und Temperatur bestimmen, welche moderate Hybridisierungsstringenz konstituieren (siehe auch Sambrook, Molecular Clonging: A Laborstory Manual Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989; Maniatis, Molecular Cloning, a Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1982; und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1989 sowie spätere Versionen, welche hier per Verweis eingeschlossen sind). Bedingungen höherer Stringenz schließen höhere Temperaturen für Hybridisierung und Post-Hybridisierungs-Waschung ein und/oder geringere Salzkonzentration. Prozentidentität von Nukleinsäuren kann bestimmt werden unter Verwendung der Verfahren, die oben beschrieben werden für Polypeptide, d.h. durch Verfahren, welche die visuelle Inspektion einschließen und die Verwendung von Computerprogrammen, wie z.B. GAP. Irgendwelche geeignete Expressionssysteme können für die Herstellung von rekombinantem TWEAKR eingesetzt werden.
Jegliches geeignete Expressionssystem kann eingesetzt werden für die Produktion von rekombinantem TWEAKR. Rekombinante Expressionsvektoren schließen DNA ein, welche ein TWEAKR-Polypeptid codiert, operabel verknüpft an irgendwelche geeignete transkriptionelle und translatorische und regulatorische Nukleotidsequenzen, wie z.B. diejenigen, abgeleitet von einem Säugetier-, mikrobiellen, viralen oder Insektengen. Nukleotidsequenzen sind operabel verknüpft, wenn die regulatorische Sequenz sich funktionell auf die TWEAKR-DNA-Sequenz bezieht. Folglich ist eine Promotor- Nukleotidsequenz operabel an eine TWEAKR-DNA-Sequenz verknüpft, falls die Promotor-Nukleotid-Sequenz die Transkription der TWEAKR-Sequenz steuert. Beispiele von regulatorischen Sequenzen schließen transkriptionelle Promotoren, Operatoren oder Enhancer ein, eine mRNA-Ribosomen-Bindungsstelle und geeignete Sequenzen, welche Transkription und Translationsinitiation sowie Termination steuern. Eine Sequenz, welche ein geeignetes Signalpeptid codiert (native oder heterologe) kann in Expressionsvektoren eingebracht sein. Eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (bezeichnet durch eine Vielzahl von Namen, einschließend sekretorische Leadersequenz, Leaderpeptid oder Leader) können „in frame" fusioniert werden an die TWEAKR-Sequenz, so dass das TWEAKR-Polypeptid initial als eine Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid umfasst. Ein Signalpeptid, das funktionell in den gewünschten Wirtszellen ist, treibt die extrazelluläre Sekretion des TWEAKR-Polypeptids voran. Das Signalpeptid wird von dem TWEAKR-Polypeptid abgeschnitten nach Sekretion von TWEAKR aus den Zellen.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von TWEAKR-Polypeptiden schließen Prokaryonten ein, Hefe oder höhere Eurkaryontenzellen, einschließend Insekten- und Säugetier-Zellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit bakteriellen, Pilz-, Hefe-, Insekten- und Säugetier-zellulären Wirten werden beschreiben, beispielsweise in Pouwels et al Cloning Vectors: A Laborstory Manual, Elsevier, New York, 1985.
Prokaryonten schließen Gramm-negative oder Gramm-positive Organismen ein, beispielsweise E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryontische Wirtszellen zur Transformation schließen beispielsweise ein E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium sowie verschiedene andere Spezies innerhalb der Genera Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus. In einer prokaryontischen Wirtszelle, wie z.B. E. coli, können TWEAKR-Polypeptide einen N-terminalen Methionin-Rest einschließen, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryontischen Wirtszelle zu bewirken. Das N-terminale Met kann abgeschnitten werden von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryontischen Wirtszellen schließen im allgemeinen eine oder mehrere phenotypische auswahlbare Markergene ein. Ein phenotypisches auswählbares Markergen ist beispielsweise ein Gen, welches ein Protein codiert, das eine Antibiotikum-Resistenz verleiht, oder welches eine autotrophe Anforde rung überträgt. Beispiele von geeigneten Expressionsvektoren für prokaryontische Wirtszellen schließen diejenigen ein, die von kommerziell verfügbaren Plasmiden abgeleitet werden, wie z.B. dem Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 3701). pBR322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und liefert folglich einfache Mittel zum Identifizieren von transformierten Zellen. Ein geeigneter Promotor und eine TWEAKR-DNA-Sequenz werden in den pBR322 Vektor insertiert. Andere kommerziell verfügbare Vektoren schließen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein.
Promotor-Sequenzen, die allgemein verwendet werden für rekombinante prokaryontische Wirtszell-Expressionsvektoren schließen β-Lactamase (Penicillinase), Lactose-Promotor-System (Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), Tryptophan (trp) Promotor System (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; EP-A-36776) und Tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982) ein. Ein besonders geeignetes prokayontisches Wirtszell-Expressionssystem setzt einen Phagen-λ P_L-Promotor und eine cl857ts thermolabile Repressorsequenz ein. Plasmidvektoren, verfügbar von der American Type Culture Collection, welche Derivate des λ P_L-Promotors sind, schließen das Plasmid pHUB2 (welches in E. coli Stamm JM69, ATCC 37092) vorliegt und pPLc28 (resistent in E. coli RR1, ATCC 53082) ein.
TWEAKR-Polypeptide können auch exprimiert werden in Hefewirtszellen, vorzugsweise vom Genus Saccharomyces (beispielsweise S. cerevisiae). Andere Genera von Hefe, wie z.B. Pichia oder Kluyveromyces, können auch eingesetzt werden. Hefevektoren werden oft eine Sequenz des Ursprungs der Replikation von einem 2μ-Hefe-Plasmid enthalten, eine autonom-replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für die Polyadenylierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein auswahlbares Markergen. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen u.a. ein, Promotoren für Rhetallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978) wie z.B. Enolase, Glyceraldehyde-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat, Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphateisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phospho-Glukoseisomerase und Glukokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden weiter beschrieben in Hitzeman, EPA-73,657. Eine weitere Alternative ist der Glukose repressible ADH2 Promotor, beschrieben von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Shuttlevektoren, replizierbar sowohl in Hefe als auch E. coli können konstruiert werden durch Insertieren von DNA-Sequenzen von pBR322 zur Auswahl und Replikation in E. coli (Amp^r-Gen und Ursprung der Replikation) in die oben beschriebenen Hefevektoren.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann eingesetzt werden, um die Sekretion von rekombinanten Polypeptiden zu lenken. Die α-Faktor-Leadersequenz wird häufig zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz insertiert. Siehe beispielsweise Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Andere Leadersequenzen, geeignet zum Ermöglichen der Sekretion von rekombinantem Polypeptid aus Hefewirten sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eine Leadersequenz kann modifiziert werden in der Nähe des 3'-Endes, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies wird die Fusion der Leadersequenz an das strukturelle Gen ermöglichen.
Hefe-Transformationsprotokolle sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Ein solches Protokoll wird beschrieben von. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. Das Hinnen et al.-Protokoll wählt hinsichtlich Trp⁺ in einem selektiven Medium aus, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefenitrogenbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glukose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, transformiert durch Vektoren, welche eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können kultiviert werden zum Induzieren der Expression in einem "reichen" Medium. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist eines, welches aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose besteht, angereichert mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil. Die Derepression des ADH2-Promotors tritt auf, wenn Glukose aus dem Medium erschöpft ist.
Insekten-Wirtskultursysteme können auch eingesetzt werden, um rekombinante TWEAKR-Polypeptide zu exprimieren, einschließend lösliche TWEAKR-Polypeptide. Bacculovirus-Systeme zur Erzeugung von heterologen Polypeptiden in Insektenzellen werden in einem Review von Luckow and Summers, Bio/Technologie 6:47, 1988) darstellt.
Säugetierzellen sind insbesondere bevorzugt für die Verwendung als Wirtszellen. Beispiele geeigneter Säugetier-Wirtszelllinien schließen ein die COS-7 Linie der Affen- Nierenzellen (ATCC CRL 1651), (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), chinesische Hamster Ovarzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10) Zellinien sowie die CV1/ERNA-Zelllinie sowie die Zelllinie, abgeleitet von der African Green Affen-Nieren-Zelllinie (CV1 (ATCC CCL 70), die beschrieben wird von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991). Für die Produktion von therapeutischen Polypeptiden ist es insbesondere von Vorteil, Säugetier-Wirtszelllinien zu verwenden, welche eingesetzt wurden, um in Medien zu wachsen, welche keine tierischen Proteine enthalten.
Etablierte Verfahren zum Einbringen von DNA in Säugetierzellen wurden beschrieben (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69). Weitere Protokolle unter Verwendung, zell-verfügbarer Reagenzien, wie z.B. Lipofectamine (Gibco/BRL) oder Lipofectamine-Plus können verwendet werden, um Zellen zu transfizieren (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987). Darüber hinaus kann die Elektroporation verwendet werden, um Säugetierzellen zu transfizieren unter Verwendung von konventionellen Prozeduren, wie z.B. diejenigen in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989). Die Auswahl von stabilen Transformaten kann durchgeführt wurden unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie z.B. Resistenz-gegencytotoxische Wirksubstanzen. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487, 1990, beschreiben mehrere Selektionsschematas, wie z.B. die Dihydrofolatreductase (DHFR)-Resistenz. Ein geeigneter Wirtsstamm für die DHFR-Selektion kann der CHO-Stamm DX-B11 sein, welcher defizitär hinsichtlich DHFR ist (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980). Ein Plasmid, welches die DHFR cDNA exprimiert, kann eingebracht werden in dem Stamm DX-B11 und nur Zellen, welche das Plasmid enthalten, können in dem geeigneten selektiven Medium wachsen. Andere Beispiele von auswählbaren Markern, welche in den Expressionsvektor eingebracht werden können, schließen cDNAs ein, welche Resistenz gegen Antibiotika verleihen, wie z.B. G418, und Hygromycin B. Zellen, welche den Vektor beherbergen, können ausgewählt werden auf der Basis der Resistenz gegen diese Verbindungen.
Transkriptionelle und translatorische Steuersequenzen für Säugetier-Wirtszellen-Expressionsvektoren können aus den viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Endhancersequenzen werden abgeleitet von Polyom-Virus, Adeno-Virus 2, Simian-Virus 40 (SV40), und menschlichem Cytomegalovirus. DNA-Sequenzn, abgeleitet von dem viralen V40 Genom, beispielsweise vom SV40 Ur sprung, dem frühen und späten Promotor, Enhancer-, Splice- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für Expression einer strukturellen Gensequenz in einer Säugetier-Wirtszelle zur Verfügung zu stellen. Frühe virale und späte Promotoren sind besonders bedeutsam, da beide leicht erhalten werden können von einer viralen Genom in Form eines Fragmentes, welches auch einen viralen Ursprung der Replikation enthalten kann (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Kleinere oder größere SV40 Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt die ungefähr 250 bp-Sequenz, welche sich von der Hind II-Stelle in Richtung der BgI I-Stelle erstreckt, lokalisiert in dem viralen SV40 Ursprung der Replikationsstelle ist eingeschlossen.
Weitere Steuersequenzen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Expression von heterologen Genen von Säugetier-Expressionsvektoren verbessern, schließen solche Elemente ein, wie das Expressions-Anreicherungssequenz-Element (EASE, expression augmenting sequence element), abgeleitet aus CHO-Zellen (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534) und die dreiteilige Leader (TPL) und VA-Gen RNAs des Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475, 1982). Die innere Ribosom-Eintrittsstellen (IRES)-Sequenzen des viralen Ursprungs ermöglichen, dass die dicistronischen mRNAs effizient translatiert werden können (Oh und Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24:2697, 1996). Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischen mRNA, gefolgt von einem Gen für den auswählbaren Marker (beispielsweise DHFR) verbessern – wie gezeigt wurde – die Transfizierbarkeit des Wirts und die Expression der heterologen cDNA (Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Exemplarische Expressionsvektoren, welche dicistronische mRNAs einschließen, sind pTR-DC/GFP, beschrieben von Mosser et al., Biotechniques 22:150, 1997, und p2A5I, beschrieben in Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534.
Ein bedeutsamer starker Expressionsvektor, pCAVNOT, wurde beschrieben von Mosley et al., Cell 59:335, 1989. Andere Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugetier-Wirtszellen können konstruiert werden gemäß Offenbarung von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Ein bedeutsames System für die stabile Expression auf hohem Niveau von Säugetier-cDNAs in C127 Maus-Säugetier-Epithelzellen kann konstruiert werden substantiell nach der Beschreibung von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Ein bedeutsamer starker Expressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984 wurde hinterlegt als ATCC 39890. Weitere bedeutsame Säugetier-Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt.
Was Signalpeptide anbelangt, welche beim Erzeugen von TWEAKR-Polypeptiden eingesetzt werden können, kann das native TWEAKR-Signalpeptid verwendet werden oder es kann ersetzt werden durch ein heterologes Signalpeptid oder eine Leader-Sequenz, falls dies gewünscht wird. Die Wahl des Signalpeptids oder der Leader-Sequenz kann von Faktoren abhängig sein, wie z.B. dem Typ der Wirtszellen, in welchen das rekombinante TWEAKR erzeugt werden soll. Beispiele heterologer Signalpeptide, welche funktionell sind in Säugetier-Wirtszellen schließen die Signalsequenz für Interleukin 7 (IL-7) ein, die beschrieben wird im US-Patent Nr. 4,965,195 , sowie die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, die beschrieben wird in Cosman et al., Nature 312:768 (1984); das Interleukin-4-Rezeptor-Signal-Peptid, das beschrieben wird in EP 367,566 ; das Typ I Interleukin-1-Rezeptor-Signal-Peptid, das beschrieben wird in EP 4,968,607 ; und das Typ II Interleukin-1-Rezeptor-Signal-Peptid, das beschrieben wird in EP 460,846 .
Unter Verwendung der Techniken von rekombinanter DNA, welche Mutagenese einschließen und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann der Fachmann auf dem Gebiet DNA-Sequenzen erzeugen, welche TWEAKR-Polypeptide kodieren, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder Sequenzen umfassen oder Deletionen von terminalen oder internalen Resten oder Sequenzen, einschließend TWEAKR-Fragmente, Varianten, Derivate und Fusionspolypeptide.
Transgene Tiere, einschließend Mäuse, Ziegen, Schafe und Schweine sowie transgene Pflanzen, einschließend Tabak, Tomaten, Legumen, Gräser und Getreide können auch als Bioreaktoren für die Produktion von TWEAKR-Polypeptiden eingesetzt werden, einschließend diejenige von löslichen TWEAKR-Polypeptiden. Im Fall von transgenen Tieren ist es insbesondere von Vorteil, eine chimäre DNA zu erzeugen, einschließend eine TWEAKR-Codierungssequenz, welche operabel verknüpft ist mit regulatorischen Sequenzen, die cis wirkt, was die Expression des löslichen TWEAKR in Milch und/oder anderen Körperflüssigkeiten vorantreiben (siehe beispielsweise U.S. Patent 5,843,705 ; U.S. Patent Nr. 5,880,327 ). In dem Fall von transgenen Pflanzen ist es besonders vorteilhaft TWEAKR in einem speziellen Zelltyp zu erzeugen, einem speziellen Gewebe oder Organ (siehe beispielsweise U.S. Patent 5,639,947 ; U.S. Patent No. 5,889,189 ).
Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass die Prozedur zum Aufreinigen von exprimierten löslichen TWEAKR-Polypeptiden entsprechend dem eingesetzten Wirtssys tem variieren wird und davon abhängt, ob das rekombinante Polypeptid sekretiert wird oder nicht. Lösliche TWEAKR-Polypeptide können aufgereinigt werden unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließend einen oder mehrere von Konzentrations-, Aussalz-, Ionenaustausch-, hydrophobe Interaktion-, Affinitätsaufreinigungs-, HPLC- oder Größenausschluß-Chromatografie-Schritten. Fusionspolypeptide, welche FC-Gruppen umfassen (und Multimere, die daraus ausgebildet werden), liefern den Vorteil, eine Aufreinigung durch Affinitätschromatografie über Protein A- oder Protein G-Säulen zu ermöglichen.
Behandlungsverfahren
Unten beschrieben werden Verfahren und Zusammensetzungen, welche den TWEAK-Rezeptor oder Liganden einsetzen oder die Gene, welche den TWEAK-Rezeptor oder Liganden kodieren, um Angiogenese in einem Zielgewebe oder einer Gruppe von Zellen voranzutreiben oder zu unterdrücken. Der Begriff "behandeln", "Behandeln", "Behandlung", "Therapie", "therapeutisch" und dergleichen, sollen präventive Therapie, prophylaktische Therapie, lindernde Therapie und heilende Therapie einschließen.
Die offenbarten Polypeptide, Zusammensetzungen und Verfahren werden verwendet, um Angiogenese zu inhibieren oder andere TWEAKR-mediatisierte Antworten in einem Säugetier, das einer solchen Behandlung bedarf. Der Begriff "TWEAKR-mediatisierte Antwort" schließt jegliche zelluläre, physiologische oder andere biologische Antworten ein, die ausgelöst werden zumindest zum Teil durch das Binden des TWEAK-Liganden an TWEAKR oder welche inhibiert oder unterdrückt werden können vollständig oder teilweise durch das Blockieren von TWEAK gegen das Binden des TWEAKR. Die Behandlung wird in vorteilhafter Art und Weise verabreicht, um das Einschalten (den Beginn) oder das Wiederauftreten einer Erkrankung oder eines Zustandes, mediatisiert durch Angiogenese, zu verhindern oder um ein Säugetier zu behandeln, welches eine Erkrankung oder einen Zustand aufweist, die durch Angiogenese mediatisiert sind. Erkrankungen und Zustände mediatisiert durch Angiogenese schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Augenerkrankungen, bösartige und metastatische Zustände sowie entzündliche Erkrankungen.
Unter den Augenerkrankungen, welche behandelt werden können gemäß der vorliegenden Erfindung sind Augenerkrankungen, welche durch okulare Neovaskularisierung charakterisiert sind, einschließend, jedoch nicht limitiert auf diabetische Retinopathie (eine der Hauptkomplikationen von Diabetes), Retinopathie der Pubertät (dieser abbauende Augenzustand, der häufig zu chronischen Sehproblemen führt und ein hohes Risiko zur Erblindung trägt, ist eine ernsthafte Komplikation bei der Behandlung von pubertierenden Jugendlichen), neovaskuläres Glaukom, Retinoblastom, retrolentale Fibroplasie, Rubeosis, Juveitis, makulare Degeneration und Cornea-Graft-Neovaskularisierung. Andere entzündliche Augenerkrankungen, okulare Tumore und Erkrankungen, assoziiert mit choroidaler oder Iris-Neovaskularisierung können auch entsprechend der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um bösartige sowie Metastasenzustände zu behandeln, wie z.B. feste Tumore. Feste Tumore schließen sowohl primäre als auch metastatische Sarkome und Karzinome ein.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um Entzündungserkrankungen zu behandeln, einschließend jedoch nicht limitiert auf Arthritis, Rheumatismus und Psoriasis.
Andere Erkrankungen und Zustände, die behandelt werden können entsprechend der vorliegenden Erfindung, schließen gutartige Tumore sowie prä-neoplastische Zustände, myocardiale Angiogenese, hämophile Verknüpfungen, Skleroderma, vaskuläre Adhäsionen, atherosklerotische Plaque-Neovaskularisation, Telangiectasie und Wundgranulation sein.
Erkrankungszustände, welche Angiogenese-abhängig sind, schließen koronare und peripherale Atherosklerose sowie Ischämie jeglicher Gewebe oder Organe ein, einschließend das Herz, die Leber, das Gehirn u. dgl. Diese Typen von Erkrankungen können durch Zusammensetzungen behandelt werden, welche Angiogenese vorantreiben.
Die Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung können getestet werden in in vivo Tiermodellen, um die gewünschte prophylaktische oder therapeutische Aktivität zu bestätigen, wie auch, um die optimale therapeutische Dosierung zu bestimmen, vor Verabreichung an Menschen.
Die Menge eines partikularen TWEAKR-Antagonisten, die effizient sein wird in einem speziellen Verfahren der Behandlung hängt vom Alter ab, vom Typ oder der Ernsthaftigkeit des zu behandelnden Zustandes, vom Körpergewicht, der gewünschten Dauer der Behandlung, dem Verfahren der Verabreichung und von anderen Parameter. Effektive Dosierungen werden bestimmt durch einen Mediziner oder andere qualifizierte medizini sche Fachkräfte. Typische effektive Dosierungen sind bei ungefähr 0,01 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg Körpergewicht. In einigen bevorzugten Ausführungsformen liegt die Dosierung bei ungefähr 0,1 bis 50 mg/kg. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosierung bei 0,5 bis 10 mg/kg. Die Dosierung für die lokale Verabreichung ist typischerweise geringer als für die systemische Verabreichung. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung ausreichend; in einigen Ausführungsformen wird der TWEAKR-Antagonist in Form von multiplen Dosen über einen oder mehrere Tage verabreicht.
Die TWEAKR-Antagonisten werden typischerweise verabreicht in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend einen oder mehrere pharmakologischen verträglichen Träger. Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Adjuvanzien, Hilfsstoffe und Vehikel ein, welche pharmazeutisch akzeptabel sind für den Weg der Verabreichung und sie können wässrige oder ölige Suspensionen sein, formuliert unter Verwendung von geeigneten dispergierenden, benetzenden und suspendierenden Agentien.
Pharmazeutisch verträgliche Träger sind im allgemeinen sterile und pyrogenfreie Wirksubstanzen und können Wasser, Öle, Lösungsmittel, Salze, Zucker und andere Kohlenhydrate einfließen sowie emulgierende Agentien, Pufferungsagentien, anti-mikrobielle Agentien und gelatbildende Agentien. Der spezielle pharmazeutisch verträgliche Träger und das Verhältnis der aktiven Wirksubstanz zum Träger werden bestimmt durch die Löslichkeit und die chemischen Eigenschaften der Zusammensetzung, die Art der Verabreichung und die herkömmlich pharmazeutische Praxis.
Die Zusammensetzungen, wie hier beschrieben, können enthalten sein in einer Phiole, einer Flasche, einer Tube, einer Spritze, einem Inhalator oder einem anderen Container zur einzelnen oder multiplen Verabreichung. Solche Container können aus Glas oder einem Polymermaterial bestehen, wie z.B. Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, um einige Beispiele zu nennen. Bevorzugte Container können ein Versiegelungs- oder ein anderes Verschlußsystem einschließen, wie z.B. einen Gummistopfen, der durch eine Nadel durchdrungen werden kann, um eine Einzeldosis herauszuziehen und anschließend erneut versiegelt zu werden, nach Entfernung der Nadel. All solche Container für injizierbare Flüssigkeiten, lyophilisierte Formulierungen, rekonstituierte lyophilisierte Formulierungen und rekonstituierbare Pulver zur Injektion, die im Stand der Tech nik bekannt sind, oder für die Verabreichung von Aerosol-Zusammensetzungen sind für die Verwendung in den hier offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren angedacht.
Die TWEAKR-Antagonisten werden verabreicht an den Patienten in einer Art und Weise, die geeignet ist für die Indikation. Folglich kann ein TWEAKR-Antagonist oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon verabreicht werden durch intravenöse transdermale, intradermale, intraperitoneale, intramuskuläre, intranasale, epidurale, orale, topikale, subkutane, Intrakavitäts-verzögerte Freisetzung aus Implantat-Techniken sowie über perestaltische Wege oder durch irgendeine geeignete Technik. Parenterale Verabreichung ist bevorzugt.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die Behandlung des weiteren das Behandeln des Säugetiers mit einem oder mit mehreren weiteren chemotherapeutischen Wirksubstanzen. Die weiteren chemotherapeutischen Wirksubstanz(en) können verabreicht werden vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des TWEAKR-Antagonisten. Die Verwendung von mehr als einem chemotherapeutischen Agens ist insbesondere von Vorteil, wenn das Säugetier, das zu behandeln ist, einen festen Tumor aufweist. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die Behandlung des weiteren das Behandeln des Säugetier mit Strahlung. Strahlung einschließend Brachy-Therapie und Tele-Therapie, kann verabreicht werden vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des (der) zweiten therapeutischen Agens (Agenzien) und/oder des TWEAKR-Antagonisten.
Wenn das Säugetier, das behandelt werden soll, einen festen Tumor aufweist, schließt das Verfahren vorzugsweise die Administration – zusätzlich zu einem TWEAKR-Antagonisten – von einem oder mehreren chemotherapeutischen Wirksubstanzen ein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus alkylierenden Wirksubstanzen, Antimetaboliten, Vinca-Alakaloiden und anderen Pflanzen-abgeleiteten Chemaotherapeutika, Nitroso-Harnstoffen, Antitumor-Antibiotika, Antitumor-Enzymen, Topoisomerase-Inhibitoren, Platinanaloga, adrenokortikalen Auppressanten, Hormonen, Hormon-Agonisten und Antagonisten, Antikörpern, Immunotherapeutika, Blutzellfaktoren, Radiotherapeutika sowie biologischen Antwort-Moulatoren.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren die Verabreichung- zusätzlich zu einem TWEAKR-Antagonisten – ein von einer oder mehreren chemotherapeutischen Wirksubstanzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechloretamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluorouracil, 5-Fluorodeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, und Vinblastin, Lyphokinen und Cytokinen, wie z.B. Interleukinen, Interferonen (einschließend Alpha, Beta oder Delta) sowie TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Decarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Oxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyurea, Methylhydracin, Mitotan, Tamoxifen und Fluoxymesteron.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren ein die Verabreichung von – zusätzlich zu einem TWEAKR-Antagonisten – von einem oder mehreren chemotherapeutischen Wirksubstanzen, einschließend verschiedene lösliche Formen davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem FIt3-Liganden, CD40-Liganden, Interleukin-2, Interleukin-12, 4-1BB-Liganden, Anti-4-1BB-Antikörpern, TNF-Antagonisten und TNF-Rezeptor-Antagonisten, TRAIL, VEGF-Antagonisten, VEGF-Rezeptor (einschließend VEGF-R1 und VEGF-R2, auch bekannt als FIt1 oder KDR)-Antagonisten, Tek-Antagonisten und CD148 (auch bezeichnet als DEP-1, ECRTP und PTPRJ, siehe Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10:2135-45, 1999)-Agonisten. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die TWEAKR-Antagonisten der Erfindung verwendet als eine Komponente von oder in Kombination mit "Metronom-Therapie", wie sie beispielsweise beschrieben wird Browder et al, und Klement et al. (Cancer Research 60:1878, 2000; J. Clin. Invest. 105(8):R15, 2000; siehe auch Barinaga, Science 288:245, 2000).
Die Polypeptide, Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden als eine erstmalige Behandlung, für die Behandlung von verbleibenden Erkrankungen folgend auf die primäre Therapie oder als eine Zusatzmaßnahme zu anderen Therapien, einschließend Chemotherapie, Operation, Bestrahlung sowie andere therapeutische Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
Wenn die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung entsprechend den Verfahren, die hier offenbart werden, verabreicht werden, ist es von Vorteil, einen Zufuhrmechanismus einzusetzen, so dass die Sequenzen in eine Zelle zur Expression eingebracht werden. Zufuhrsysteme, welche in vorteilhafter Weise eingesetzt werden können, in den ins Auge gefassten Verfahren schließen beispielsweise ein, die Verwendung von viralen Zufuhrsystemen, wie z.B. retroviralen und adeno-viralen Vektoren, wie auch nicht-virale Zufuhrsysteme. Solche Zufuhrsysteme sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Verfahren zum Screenen
Der TWEAK-Rezeptor, wie hier beschrieben, kann verwendet werden in einer Vielzahl von Verfahren zum Screenen, um beispielsweise TWEAKR-Agonisten und Antagonisten zu isolieren. TWEAKR-Agonisten sind Verbindungen, welche die biologische Aktivität von TWEAKR vorantreiben und TWEAKR-Antagonisten sind Verbindungen, welche die biologische Aktivität von TWEAKR inhibieren. Verbindungen, identifiziert über die folgenden Screening-Assays können verwendet werden in Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren von Angiogenese, um eine Vielzahl von Erkrankungszuständen zu behandeln. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zum Screenen für Verbindungen, welche (1) die Expression des TWEAKR-Rezeptors oder Liganden-Gens in einem Zielgewebe oder einer Zelle modulieren (2) die TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen modulieren, um die Angiogenese zu regulieren; (3) an den TWEAK-Rezeptor oder Liganden binden, um die Angiogenese zu beeinflussen; oder (4) den gebundenen TWEAK-Rezeptor-Ligandenkomplex-Einfluss auf stromabwärts gelegene Ereignisse, wie z.B. Angiogenese wechselwirkend beeinflussen oder regulieren.
Die vorliegende Erfindung fasst auch die Verwendung von Assays ins Auge, welche konzipiert sind, um die Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität eines TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gens modulieren (d.h. das Niveau von TWEAK-Genexpression modulieren und/oder das Niveau der TWEAK-Gen-Produkt-Aktivität modulieren). Assays können zusätzlich eingesetzt werden, welche Verbindungen identifizieren, welche an regulatorische TWEAK-Gen-Sequenzen binden (beispielsweise Promotor-Sequenzen; siehe beispielsweise Platt, 1994, J. Biol. Chem. 269, 28558-28562) und welche das Niveau der TWEAK-Gen-Expression modulieren können.
Solch ein Assay kann beispielsweise die Verwendung eines Steuerungssystems einschließen, in welchem Transkription und Translation des TWEAK-Rezeptors – oder Liganden-Gens auftritt, im Vergleich zu einem System, welches eine Testverbindung einschließt, von der man erwartet, dass sie die normale Transkritption oder Translation eines TWEAK-Gens beeinflusst. Beispielsweise könnte man die Rate des TWEAK-Rezeptor-RNA bestimmen, die durch Herzzellen erzeugt wird und dies dazu verwenden, zu bestimmen, ob eine Testverbindung die Rate beeinflusst. Um den Einfluss einer Testverbindung zu bestimmen, von der man erwartet, dass sie diese normale Transkriptionsrate beeinflusst, würde man als erstes die Rate der Produktion der TWEAK- Rezeptor RNA in einer Herzzellkultur bestimmen, beispielsweise durch Northern-Blotten. Man könnte dann die Testverbindung einer Herzzellkultur unter ansonsten identischen Verbindungen, wie bei der Kontrollkultur verabreichen. Anschließend könnte die Rate der TWEAK-Rezeptor-RNA in der Kultur, behandelt mit der Testverbindung bestimmt werden, beispielsweise durch Northern-Blotten und verglichen werden mit der Rate der TWEAK-Rezeptor-RNA, erzeugt durch die Kontrollkulturzellen. Eine Zunahme in der TWEAK-Rezeptor-RNA in den Zellen, welche mit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, relativ zu den Kontrollzellen ist ein Hinweis auf einen Stimulator der TWEAK-Rezeptor Gen-Transkription und/oder Translation in Herzzellen, wohingegen eine Abnahme ein Hinweis ist für einen Inhibitor der TWEAK-Rezeptor-Gentranskription und/oder Translation in Herzzellen.
Es gibt eine Vielzahl von anderen Verfahren, welche verwendet werden können, um den Grad der TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Genexpression zu bestimmen und diese können weiter verwendet werden in Assays, um den Einfluss einer Testverbindung auf das Niveau des TWEAK-Rezeptors oder die Liganden-Genexpression zu bestimmen. Beispielsweise kann RNA aus einem Zelltyp oder einem Gewebe, die bekannt sind, oder von denen man annimmt, dass sie einen TWEAK-Rezeptor oder ein Liganden-Gen exprimieren, wie z.B. Herzzellen, isoliert werden und getestet werden unter Verwendung von Hybridisierung oder PCR-Techniken. Die isolierten Zellen können aus der Zellkultur oder aus einem Patienten gewonnen werden. Die Analyse von Zellen, welche aus Kulturen genommen wurden, kann ein notwendiger Schritt in der Beurteilung von Zellen sein, welche als Teil einer Zell-basierten Gentherapietechnik eingesetzt werden, oder – alternativ-, um den Effekt von Verbindungen auf die Expression des TWEAK-Rezeptor oder Liganden-Gens zu testen. Solche Analysen können sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte des Expressionsmusters des TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gens zu Tage fördern, einschließend die Aktivierung oder Inaktivierung der TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Expression.
In einer Ausführungsform eines solchen Detektionsschemas wird ein cDNA-Molekül synthetisiert aus einem RNA-Molekül von Interesse (beispielsweise durch reverse Transpriktion des RNA-Moleküls in cDNA). Eine Sequenz innerhalb der cDNA wird dann als das Templat verwendet für eine Nukleinsäureamplifikations-Reaktion, wie z.B. eine PCR-Amplifikationsreaktion od. dgl.. Die Nukleinsäurereagentien, welche verwendet werden als Synthese-Initiationsreagenzien (beispielsweise Primer) in den Schritten der reversen Transkription in Nukleinsäureamplifikation dieses Verfahren werden ausge wählt unter den TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Nukleinsäure-Segmenten, wie oben beschrieben. Die bevorzugte Länge solcher Nukleinsäure-Reagentien ist zumindest 9-30 Nukleotide. Für den Nachweis des amplifizierten Produktes kann die Nukleinsäure-Amplifikation durchgeführt werden unter Verwendung von radioaktiv oder nicht radioaktiv gelabelten Nukleotiden. Alternativ könnte ein genügend amplifiziertes Produkt erzeugt werden, so dass das Produkt visualisiert werden kann durch herkömmliches Ethidiumbromid-Färben oder durch Einsetzen irgendeines anderen geeigneten Nukleinsäure-Färbeverfahrens.
Desweiteren ist es möglich, solch einen TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Expressions-Assay "in situ", d.h. direkt auf den Gewebsschnitten (fixiert und/oder eingefroren) von Patientengewebe, erhalten aus Biopsien oder Resektionen durchzuführen, so dass keine Nukleinsäureaufreinigung notwendig ist. TWEAK-Rezeptor oder Liganden-Gen-Nukleinsäure-Segmente, wie oben beschrieben, können eingesetzt werden als Sonden und/oder Primer für solche in situ-Prozeduren (siehe beispielsweise Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY).
Verbindungen, die über Assays identifiziert werden, wie diejenigen, die hier beschrieben werden, können bedeutsam sein beispielsweise beim Modulieren von Angiogenese, beeinflusst durch die TWEAK-Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen. Solche Verfahren zum Stimulieren oder Inhibieren der TWEAK-beeinflussten Angiogenese werden hier diskutiert.
Alternativ können Assay-Systeme konzipiert werden, um Verbindung zu identifizieren, welche in der Lage sind, den TWEAK-Rezeptor zu binden oder Ligand-Polypeptide der Erfindung und dadurch die Angiogenese zu beeinflussen, welche aus dieser Wechselwirkung resultiert. Verbindungen, die identifiziert werden, können bedeutsam sein, beispielsweise beim Modulieren der Vaskularisation der Targetgewebe oder Zellen, können eingesetzt werden in Screeningverfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche normale TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung zerstören, oder können selbst solche Wechselwirkungen zerstören.
Das Prinzip der Assays, verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, welche der TWEAK-Rezeptor oder Liganden binden, involviert das Herstellen einer Reaktionsmischung des TWEAK-Rezeptors und der Testverbindung unter Bedingungen sowie über einen hinreichenden Zeitraum, um zu ermöglichen, dass die beiden Komponenten miteinander Wechselwirken und aneinander binden und so ein Komplex ausgebildet wird, der entfernt werden kann und/oder in der Reaktionsmischung nachgewiesen werden kann. Diese Assays können durchgeführt werden in einer Vielzahl von Wegen. Beispielsweise wäre ein Verfahren, solch einen Assay durchzuführen, das Screenen nach Verbindungen, welche den TWEAK-Rezeptor binden und dieses würde das Ankern des TWEAK-Rezeptors oder der Testverbindung an einer feste Phase involvieren und den Nachweis der TWEAK-Rezeptor/Testverbindungskomplexe, verankert auf der festen Phase am Ende der Reaktion. In einer Ausführungsform eines solchen Verfahrens kann der TWEAK-Rezeptor auf einer festen Oberfläche verankert sein und die Testverbindung, welche nicht verankert ist, kann entweder direkt oder indirekt gelabelt sein. Alternativ könnten diese Verfahren verwendet werden, um nach Testverbindungen zu screenen, welche den TWEAK-Liganden und nicht den Rezeptor binden.
In der Praxis können in geeigneter Art und Weise Mikrotiterplatten eingesetzt werden als die feste Phase. Die verankerte Komponente kann immobilisiert sein durch nicht kovalente oder kovalente Anbindungen. Nicht kovalente Anbindung kann realisiert werden durch einfaches Überziehen der festen Oberflächen mit einer Lösung des Proteins und Trocken. Alternativ kann ein immobilisierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, spezifisch für das Protein, welches immobilisiert werden soll, verwendet werden, um das Protein an die feste Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können im Voraus hergestellt werden und gelagert werden.
Um den Assay durchzuführen, wird die nicht immobilisierte Komponente zur überzogenen Oberfläche hinzugefügt, welche die verankerte Komponente enthält. Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten entfernt (beispielsweise durch Waschen unter Bedingungen, so dass jegliche Komplexe, die ausgebildet wurden, immobilisiert auf der festen Oberfläche bleiben). Der Nachweis von Komplexen, verankert auf der festen Oberfläche, kann realisiert werden auf eine Vielzahl von Wegen. Wo die zuvor nicht immobilisierte Komponente prä-gelabelt ist, zeigt der Nachweis von Label, immobilisiert auf der Oberfläche, dass Komplexe ausgebildet wurden. Wo die zuvor nicht immobilisierte Komponente nicht prä-gelabelt wurde, kann ein indirekter Label verwendet werden, um Komplexe nachzuweisen, die auf der Oberfläche verankert sind; beispielsweise unter Verwendung eines gelabelten Antikörpers, der spezifisch ist für die zuvor nicht immobilisierte Komponente (der Antikörper wiederum kann direkt gelabelt oder indirekt gelabelt sein mit einem gelabelten Anti-Ig-Antikörper).
Alternativ kann eine Reaktion durchgeführt werden in einer flüssigen Phase, wobei die Reaktionsprodukte von nicht umgesetzten Komponenten getrennt sind, und die Komplexe nachgewiesen werden; beispielsweise erfolgt dies unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers spezifisch für den TWEAK-Rezeptor oder den Liganden, oder die Testverbindung, um jegliche Art von Komplexen, ausgebildet in Lösung, zu verankern und eines gelabelten Antikörper, spezifisch für die andere Komponente des möglichen Komplexes, um verankerte Komplexe nachzuweisen.
Diese Verbindungen, identifiziert als Bindungsagenzien, entweder für den TWEAK-Rezeptor oder dem TWEAK-Liganden können des weiteren ausgewertet werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit dem TWEAK-Rezeptor-Liganden zu Wechselwirken, wie dies unten beschrieben werden wird, und dadurch die Angiogenese zu unterdrücken oder voranzutreiben, was wiederum aus der TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung resultiert. Solche Verbindungen können dann therapeutisch eingesetzt werden, um die Angiogenese zu inhibieren oder zu stimulieren.
Die TWEAK-Rezeptor- und Liganden-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden in einem Screening-Assay, um Verbindungen und kleine Moleküle zu identifizieren, welche spezifisch mit dem offenbarten TWEAK-Rezeptor oder Liganden Wechselwirken, um entweder die Wechselwirkung zwischen diesen Molekülen zu inhibieren (Antagonisten) oder verstärken (Agonisten). Folglich können Polypeptide der Erfindung beispielsweise verwendet werden, um Antagonisten und Angonisten aus Zellen, zellfreien Präparationen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktmischungen zu identifizieren. Die Antagonisten und Agonisten können natürliche oder modifizierte Substrate, Liganden, Enzyme, Rezeptoren etc. der Polypeptide der vorliegenden Erfindung sein oder können strukturell oder funktionelle Mimetika der Polypeptide sein. Potentielle Antagonisten der TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung können kleine Moleküle einschließen, Peptide und Antikörper, welche an eine Bindungsstelle des Polypeptids binden und diese besetzen, was auslöst, dass jene sind der Interaktion nicht zugänglich und folglich ihre normale Fähigkeit, Angiogenese zu modulieren, verhindern. Andere potentielle Antagonisten sind Antisensemoleküle, welche an mRNA in vivo hybridisieren können und die Translation der mRNA in die Polypeptide der vorliegenden Erfindung blockieren können. Potentielle Agonisten schließen kleine Moleküle ein, Peptide und Antikörper, welche an die vorliegenden TWEAK-Polypeptide binden und die Angiogenese beeinflussen, wie dies verursacht wird durch die offenbarten Wechselwirkungen der TWEAK-Polypeptide der vorliegenden Erfindung.
Kleine Molekül-Agonisten und Antagonisten sind üblicherweise weniger als 10K an Molekulargewicht und können eine Vielzahl von physiochemischen und pharmakologischen Eigenschaften aufweisen, um die Zellpenetration zu verstärken, dem Abbau zu widerstehen und die physiologischen Halbwärtszeiten zu verlängern (Gibbs, "Pharmaceutical Research in Molecular Oncology", Cell, Vol. 79, (1994)). Antikörper, welche intakte Moleküle einschließen, wie auch Fragmente, wie z.B. Fab und F(ab')2-Fragmente können verwendet werden, um an Polypeptide der vorliegenden Erfindung zu binden, oder diese zu inhibieren durch Blockieren der Übertragung der Signalkaskade. Es ist bevorzugt, dass die Antikörper humanisierte Antikörper sind und mehr bevorzugt, dass die Antikörper menschliche Antikörper sind. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch irgendeine der Vielzahl von wohl bekannten Verfahren.
Spezifisches Screenverfahren sind im Stand der Technik bekannt und viele werden extensiv eingebracht in high throughput test Systeme, so dass eine große Vielzahl von Testverbindungen gescreent werden kann innerhalb eines kurzen Zeitraumes. Die Assays können durchgeführt werden in einer Vielzahl von Formaten, einschließend Protein-Proteinbindungs-Wechselwirkungen, biochemische Screening-Assays, Immuno-Assays, zellbasierte Assays, etc.. Diese Assayformate sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Screening-Assays der vorliegenden Erfindung sind geeignet für das Screenen von chemischen Bibliotheken und geeignet für die Identifizierung von Klein-Molekül-Wirksubstanz-Kandidaten, Antikörpern, Peptiden und anderen Antagonisten und Agonisten.
Eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Identifizieren von Molekülen, welche TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung antagonisieren, involviert das Hinzufügen eines Kandidatenmoleküls zu einem Medium, welches Zellen beinhaltet, das die Polypeptide der vorliegenden Erfindung exprimiert; Verändern der Bedingungen von besagtem Medium, so dass trotz des Vorliegens des Kanditaten-Moleküls die Polypeptide Wechselwirken würden; und Beobachten des Bindens und der Inhibition der Angiogenese. Das Binden des TWEAK-Rezeptors und des Liganden kann bestimmt werden entsprechend einem kompetitiven Bindungsassay, wie oben angegeben und wie er im Stand der Technik wohl bekannt ist. Der Angiogenese-Effekt des Bindens kann bestimmt werden über einen Zellproliferationsassay, wie z.B. Zelldichte-Assays oder andere Zellproliferationsassays, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Die Aktivität von Zellen, die in Kontakt sind mit dem Kandidatenmolekül kann dann verglichen werden mit den identischen Zellen, welche nicht in Kontakt damit waren und Agonisten und Antagonisten der TWEAK-Polypeptid-Wechselwirkungen der vorliegenden Erfindung können identifiziert werden. Die Messung der biologischen Aktivität kann durchgeführt werden durch eine Vielzahl von wohl bekannten Verfahren, wie z.B. Messen der Menge an vorliegenden Protein (beispielsweise eine ELISA- oder der Protein-Aktivität). Eine Abnahme in der biologischen Stimulation oder Aktivierung würde einen Antagonisten anzeigen. Eine Zunahme würden einen Agonisten anzeigen.
Screening-Assays können des weiteren konzipiert werden, um Moleküle zu finden, welche die biologische Aktivität nachahmen, die aus den TWEAK-Polypeptid-Wechselwirkungen der vorliegenden Erfindung resultiert. Moleküle, welche die biologische Aktivität eines Polypeptids nachahmen, können bedeutsam sein zum Verstärken der biologischen Aktivität des Polypeptids. Um Verbindungen zu identifizieren, die geeignet sind als therapeutisch aktive Wirksubstanzen, welche die biologische Aktivität eines Polypeptids nachahmen, muss zunächst bestimmt werden, ob ein Kandidatenmolekül an das Polypeptid bindet. Ein Binden des Kandidatenmoleküls wird anschließend zu einem biologischen Assay hinzugegeben, um seinen biologischen Effekt zu bestimmen. Die biologischen Effekte des Kandidatenmoleküls werden dann verglichen mit denjenigen des Polypeptids.
Desweiteren kann die Komplexausbildung innerhalb von Reaktionsmischungen, welche die Testverbindungen enthalten, und den normalen TWEAK-Rezeptor oder ein Liganden-Gen-Protein, auch verglichen werden mit der Komplexausbildung innerhalb von Reaktionsmischungen, welche die Testverbindungen einschließen und einen Mutanten-TWEAK-Rezeptor oder ein Liganden-Gen-Protein.
Dieser Vergleich kann wichtig sein in den Fällen, in welchen es wünschenswert ist, Verbindungen zu identifizieren, welche Wechselwirkungen von Mutanten zerstören, jedoch nicht den normalen TWEAK-Rezeptor oder Liganden-Gen-Proteine.
Der Assay für Verbindungen, welche mit der Wechselwirkung des TWEAK-Rezeptors oder Liganden-Gen-Produkts und Bindungspartnern Wechselwirken, kann durchgeführt werden in einem heterogenen oder homogenen Format. Heterogene Assays involvieren das Verankern, entweder des TWEAK-Rezeptors oder Liganden-Gen-Produkts oder des Bindungspartners auf einer festen Phase und den Nachweis von Komplexen, verankert auf der festen Phase am Ende der Reaktion. In homogenen Assays wird die vollständige Reaktion durchgeführt in einer flüssigen Phase. In jedem Ansatz kann die Reihenfolge des Zugebens von Recktanten variiert werden, um unterschiedliche Information zu erhalten hinsichtlich der zu testenden Verbindungen. Beispielsweise können Testverbindungen, welche mit der Wechselwirkung zwischen dem TWEAK-Rezeptor und den Liganden-Gen-Produkten und den Bindungspartnern Wechselwirken, d.h. beispielsweise durch Kompetition, identifiziert werden, durch Durchführen der Reaktion in der Gegenwart der Testverbindung, d.h. durch Zugabe der Testverbindung zur Reaktionsmischung vor oder gleichzeitig mit den TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkten. Alternativ können die Testverbindungen, welche die vorgeformten Komplexe zerstören, beispielsweise Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, welche eine der Komponenten des Komplexes ablösen, getestet werden durch Zugabe der Testverbindung zur Reaktionsmischung, nachdem die Komplexe ausgebildet wurden. Die verschiedenen Formate werden kurz unten beschrieben.
In einem heterogenen Assaysystem ist entweder das TWEAK-Rezeptor- oder das Liganden-Gen-Produkt auf einer festen Oberfläche verankert, während die nicht verankerte Spezies gelabelt ist, entweder direkt oder indirekt. In der Praxis werden konventionellerweise Mikrotiterplatten eingesetzt. Die verankerte Spezies kann immobilisiert sein durch nicht kovalente oder kovalente Anbindungen. Nicht kovalente Anbindung kann realisiert werden, einfach durch Coaten der festen Oberfläche mit einer Lösung des TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkts und Trocknen. Alternativ kann ein immobilisierter Antikörper, der spezifisch ist für die zu verankernde Spezies, eingesetzt werden, um die Spezies auf der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können im Voraus hergestellt werden und gelagert werden.
Um den Assay durchzuführen, wird der Partner der immobilisierten Spezies auf der gecoateten Oberfläche exponiert mit oder ohne die Testverbindung. Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen ist, werden umgesetzte Verbindungen entfernt (beispielsweise durch Waschen) und alle ausgebildeten Komplexe werden immobilisiert auf der festen Oberfläche verbleiben. Der Nachweis der Komplexe, verankert auf der festen Oberfläche kann realisiert werden auf eine Vielzahl von Wegen. Wo die nicht immobilisierte Spezies prä-gelabelt ist, zeigt die Detektion des Labels, immobilisiert auf der Oberfläche an, dass Komplexe ausgebildet wurden. Wo die nicht immobilisierte Spezies nicht prä-gelabelt ist, kann ein indirekter Label verwendet werden, um Komplexe nachzuweisen, die auf der Oberfläche verankert sind; beispielsweise unter Verwendung von gelabeltem Antikörper, spezifisch für die ursprünglich nicht immobilisierte Spezies (der Antikörper wiederum kann direkt gelabelt sein oder indirekt gelabelt sein mit einem gelabelten Anti-Ig-Antikörper). Abhängig von der Reihenfolge der Zugabe von Reaktionskomponenten können Testverbindungen, welche die komplexe Ausbildung inhibieren, oder welche vorgeformte Komplexe zerstören, nachgewiesen werden.
Alternativ kann die Reaktion durchgeführt werden in einer flüssigen Phase in der Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung, die Reaktionsprodukte können von den nicht umgesetzten Verbindungen abgetrennt werden und die Komplexe nachgewiesen werden; dies erfolgt beispielsweise unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers, der spezifisch ist für eine der Bindungskomponenten, um jegliche Arten von Komplexen, ausgebildet in Lösung, zu verankern und eines gelabelten Antikörpers, der spezifisch ist für den anderen Partner, um verankerte Komplexe nachzuweisen. Wiederum kann, abhängig von der Reihenfolge der Zugabe von Recktanten zur flüssigen Phase die Identifikation von Testverbindungen erfolgen, welche Komplexe inhibieren, oder welche vorher geformte Komplexe zerstören.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein homogener Assay eingesetzt werden. In diesem Ansatz wird ein vorgeformter Komplex des TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkt hergestellt, in welchem entweder das TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkt oder sein Bindungspartner gelabelt wird, jedoch das erzeugte Signal durch den Label gequenched wird aufgrund der Komplexausbildung (siehe U.S. Patent No. 4,109,496 von Rubenstein, worin dieser Ansatz für Immunoassays eingesetzt wird). Die Zugabe einer Testsubstanz, welche mit der Spezies des vorher ausgebildeten Komplexes konkurriert, und eine der Spezies entfernt aus dem vorher geformten Komplex wird in der Erzeugung eines Signals oberhalb des Hintergrundes resultieren. Auf diese Art und Weise können Testsubstanzen, welche TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkt-Wechselwirkung zerstören, identifiziert werden.
In einer speziellen Ausführungsform können das TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkt hergestellt werden zur immobilisierung unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken. Beispielsweise können die TWEAK-Rezeptor- oder Ligandenkodierende Region an ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Gen fusioniert werden unter Verwendung eines Fusionsvektors, wie z.B. pGEX-5X-1, und zwar in solch einer Art und Weise, dass ihre Bindungsaktivität in dem resultierenden Fusionsprotein aufrechterhalten wird. Der interaktive Bindungspartner kann aufgereinigt werden und verwendet wer den, um einen monoklonalen Antikörper zu erzeugen und zwar unter Verfahren, welche üblicherweise im Stand der Technik eingesetzt werden. Diese Antikörper können beispielsweise mit dem radioaktiven Isotop <125>I gelabelt werden und zwar mit Hilfe von Verfahren, die üblicherweise im Stand der Technik eingesetzt werden. In einem heterogenen Assay, können beispielsweise das GST-TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Fusions-Protein an Glutathion-Agaraose-Beads verankert werden. Das TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkt können dann in der Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung in einer Art und Weise hinzugefügt werden, welche die Wechselwirkung ermöglicht und ermöglicht, dass das Binden auftritt. Am Ende des Reaktionszeitraumes kann ungebundenes Material ausgewaschen werden, und der gelabelte monoklonale Antikörper kann zu dem System hinzugefügt werden und man ermöglicht es ihm, an die komplexierten Komponenten zu binden. Die Wechselwirkung zwischen dem TWEAK-Rezeptor und Liganden-Gen-Produkten kann bestimmt werden durch Messen der Menge der Radioaktivität, welche assoziiert bleibt und Glutathion-Agarose-Beads. Eine erfolgreiche Inhibierung der Interaktion durch die Testverbindung wird in einer Abnahme der gemessenen Radioaktivität resultieren.
Alternativ können ein GST-TWEAK-Rezeptor-Gen-Fusions-Protein und ein TWEAK-Liganden-Gen-Produkt (oder umgekehrt) in Flüssigkeiten miteinander vermischt werden in der Abwesenheit der festen Glutathion-Agarose-Beads. Die Testverbindung kann hinzugegeben werden, entweder während oder nachdem man ermöglicht hat, dass die Spezies wechselwirken. Diese Mischung kann dann zu den Glutathion-Agarose-Beads hinzugegeben werden und ungebundenes Material wird ausgewaschen. Wiederum kann das Ausmaß der Inhibition des TWEAK-Rezeptor-Liganden-Gen-Produkts detektiert werden durch Zugabe des gelabelten Antikörpers und Messen der Radioaktivität, assoziiert mit den Beads.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die gleichen Technik eingesetzt werden unter Verwendung von Peptidfragmenten, welche mit den Bindungsdomänen des TWEAK-Rezeptor- und/oder Liganden-Protein korrespondieren, anstelle von einem oder mehreren der Volllängenproteine. Jegliche Anzahl von Verfahren, die üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden, kann verwendet werden, um die Bindungsstellen zu identifizieren und zu isolieren. Diese Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Mutagenese des gleichen Gens kodierend eines der Proteine sowie Screenen hinsichtlich Zerstörung des Bindens in einem Co-Immunopräzipitationsassay. Das Kompensieren von Mutationen in dem Gen, welches die zweite Spezies in dem Komplex kodiert, kann dann ausgewählt werden. Sequenzanalyse der Gene, welche die entsprechenden Proteine kodieren, wird die Mutationen zutage fördern, welche mit der Region des Proteins kodieren, die in as interaktive Binden involviert ist. Alternativ kann ein Protein auf einer festen Oberfläche verankert werden unter Verwendung von Verfahren, die in diesem Abschnitt oben beschrieben werden und man kann es ermöglichen, dass das Protein mit einem gelabelten Bindungspartner wechselwirkt, bzw. an diesen bindet, wobei der gelabelte Bindungspartner mit einem proteolytischen Enzym, wie z.B. Trypsin, behandelt worden ist. Nach Waschen kann ein kurzes, gelabeltes Peptid, welches die Bindungsdomäne umfasst, zurückbleiben assoziiert mit dem festen Material, welches isoliert werden kann und identifiziert werden kann durch Aminosäure-Sequenzieren. Desweiteren kann das Gen dann, welches für die Segmente kodiert, konzipiert werden, so dass es Peptidfragmente des Proteins exprimiert, welche dann hinsichtlich Bindungsaktivität getestet werden können und aufgereinigt oder synthetisiert werden können.
Um ein Beispiel zu nennen, ohne dass es sich um eine Einschränkung handelt, kann ein TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Gen-Produkt auf einem festen Material, wie oben beschrieben, verankert werden in diesem Abschnitt durch Erzeugen eines GST-TWEAK-Rezeptor- oder Liganden-Fusions-Protein und durch Ermöglichen, dass es an Glutathion-Agarose-Beads bindet. Der interaktive Bindungspartner, der erhalten wird, kann gelabelt werden mit einem radioaktiven Isotop, wie z.B. <35>S und geschnitten werden mit einem proteolytischen Enzym wie z.B. Trypsin. Schnittprodukte können dann zu dem verankerten GST-TWEAK-Rezeptor-Fusions-Protein hinzugefügt werden, oder dem TWEAK-Liganden-Fusions-Protein und eine Bindung kann ermöglicht werden. Nach dem Wegwaschen von ungebundenen Peptiden, kann gelabeltes gebundenes Material, welches die Bindungspartner-Bindungsdomäne repräsentiert, eluiert werden, aufgereinigt werden und analysiert werden für die Aminosäuresequenz mit Hilfe von wohl bekannten Verfahren. So identifizierte Peptide können synthetisch erzeugt werden oder an geeignete erleichternde Proteine fusioniert werden unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie.
Die WERK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen der Erfindung initiieren in vivo eine Kaskade von Ereignissen, welche entweder die Angiogenese stimulieren oder unterdrücken in einer Targetgruppe von Zellen oder Geweben. Moleküle, wie z.B. Nukleinsäuremoleküle, Proteine oder kleine Moleküle können wiederum die Kaskade beeinflussen. Verbindungen, welche die TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungs-Effekte auf diesem Weg zerstören, können bedeutsam sein beim Regulieren von Angiogenese.
Das grundlegende Prinzip des Assaysystems, das verwendet wird, um Verbindungen zu identifizieren, welche mit Angiogenese- oder Anti-Angiogenese-Effekten der TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung Wechselwirken, involviert das Herstellen einer Reaktionsmischung, welche den TWEAK-Rezeptor enthält und den TWEAK-Liganden und zwar unter Bedingungen und über einen hinreichenden Zeitraum, welche ermöglichen, dass die beiden miteinander Wechselwirken und binden und so einen Komplex ausbilden. Um eine Verbindung auf inhibitorische Aktivität zu testen, hinsichtlich des Effekts dieser Wechselwirkung, wird die Reaktionsmischung hergestellt in der Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung. Die Testverbindung muss ursprünglich in der Reaktionsmischung eingeschlossen sein, oder kann zu einer Zeit hinzugegeben werden, welche nachfolgend zu der Zugabe des TWEAK-Rezeptor-Liganden-Komplexes liegt. Steuerreaktionsmischungen werden inkubiert, ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo. Die Inhibition oder Potentierung irgendeines Effekts des TWEAK-Komplexes auf die Vaskularisation wird dann nachgewiesen. Normale Angiogeneseantwort in der Steuerreaktion, jedoch nicht in der Reaktionsmischung, welche die Testverbindung enthält, zeigt an, dass die Verbindung mit der Kaskade von Ereignissen wechselwirkt, die durch die TWEAK-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung ausgelöst wird. Verstärkte Angiogenese in dieser Testverbindung-enthaltenen Kultur zeigt einen Stimulator des TWEAK-Rezeptor-Liganden-Komplex-Effekts.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, spezielle Ausführungsformen zu illustrieren und nicht den Umfang der Erfindung limitieren.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel präsentiert das Klonen und die Identifizierung des TWEAK-Rezeptors.
A. Expressions-Klonieren von TWEAK-Rezeptor cDNA
Um TWEAK-Rezeptor cDNA zu klonieren, wurde ein Expressionsvektor, welcher eine Wachstumshormon-Leadersequenz kodierte, eine Leucin-Zipper-Multimerisierungsdomäne und die C-terminale extrazelluläre Domäne von menschlichem TWEAK (siehe Chincheportiche et al., J. Biol. Chem. 272(51):32401, 1997) konstruiert. Dieser Expressionsvektor, welcher als pDC409-LZ-TWEAK bezeichnet wurde, umfasste die DNA-Sequenz SEQ ID NO:1 und kodierte das Polypeptid SEQ ID NO:2. pDC409-LZ-TWEAK-konditionierte Überstände wurden erzeugt durch transiente Transfektion in CV1-EBNA-Zellen. Diese Überstände wurden inkubiert mit magnetischen Beads, überzogen mit polyklonalen Ziege-anti-Maus-Antikörpern, welche zuvor inkubiert worden waren mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen den Leucin-Zipper. Kontroll-Beads wurden erzeugt durch Vermischen der überzogenen Beads mit Überständen aus Zellen, transfiziert mit leerem Vektor.
Eine Monoschicht von COS-Zellen, kultiviert in einem T175-Kolben wurde transfiziert mit 15 μg an DNA-Pools einer Komplexität von 100.000 aus einer HUVEC cDNA-Bibliothek. Nach zwei Tagen wurden diese Zellen aus dem Kolben gehoben und in 1,5 ml an Bindungsmedien plus 5% nicht-fette getrocknete Milch für 3 Std. bei 4°C auf einer Rotatorscheibe getrocknet. Zellen wurden vorab geklärt durch Zugabe von Kontroll-Beads und rotiert bei 4°C für zweite 45 Minuten, wonach Bead-gebundene Zellen mit einem Magneten entfernt wurden. Prä-Klärung wurde wiederholt 2-3 Mal und anschließend wurden die TWEAK-überzogenen Beads zu den Zellen hinzugegeben und 30 Minuten bei 4°C rotiert. Zellen, welche an die TWEAK-Beads banden, wurden separiert durch die Verwendung eines Magnets und gewaschen in 4x PBS. Plasmid-DNA wurde extrahiert aus diesen Zellen durch Lyse in 0,1% SDS und Elektroporation der Überstände in DH101 B-Zellen. Kolonien wurden gezüchtet über Nacht auf selektiven Ampicilin-Medien. Transformanten wurden gepoolt und verwendet als eine Quelle von Plasmid-DNA für eine weitere Runde des Schwenkens. Nach 2 Runden Schwenken wurden positive Klone aus dem resultierenden Pool gepickt, basierend auf ihrer Fähigkeit, an TWEAK zu binden und zwar unter Verwendung eines Slide-Bindungsprotokolls ähnlich demjenigen, beschrieben in Teil B, unten.
Die menschliche TWEAK-Rezeptor (auch bezeichnet als TWEAKR) cDNA wurde bestimmt, so dass sie die Sequenz SEQ ID NO:3 aufwies, welche ein Polypeptid von 129 Resten kodiert (SEQ ID NO:4). Die Untersuchung dieser Sequenz schlägt ein Polypeptid vor mit ungefähr 78 Aminosäuren an extrazellulärer Domäne (Reste 1-78 von SEQ ID NO:4, einschließend das Signalpeptid), eine ungefähr 23 Aminosäure lange Transmembrandomäne (Reste 79-101 von SEQ ID NO:4) und eine ungefähr 28 Aminosäure lange intrazelluläre Domäne (Reste 102-129 von SEQ ID NO:4). TWEAKR ist das kleinste bekannte TNF-Rezeptorfamilienmitglied. Es weist eine einzelne Cystein-reiche Repeat-Region in der extrazellulären Domäne auf im Vergleich zu den 3-4 Repeats von anderen TNF-Rezeptorfamilienmitgliedern. Das TWEAKR-Polypeptid wurde bereits zuvor beschrieben als ein Transmembranprotein, welches durch einen menschlichen Leber-cDNA-Klon kodiert wird ( WO98/55508 , siehe auch WO 99/61471 ), wurde jedoch nicht als der TWEAK-Rezeptor identifiziert. Ein Maus-Homolog, das FGF-induzierbare Fn14 (Meighan-Mantha et al., J. Biol. Chem. 274(46):33166, 1999) ist zu ungefähr 82% identisch zu dem menschlichen Protein, wie durch das Alignment in 1 gezeigt wird.
Der neu identifizierte TWEAK-Rezeptor wurde Seite an Seite mit DR3 getestet (letzterer wurde als TWEAK-Rezeptor durch Marsters et al., Current Biology 8:525, 1998) identifiziert und zwar auf die Fähigkeit, an die TWEAK zu binden.
B. Der TWEAK-Rezeptor bindet an TWEAK
Deckgläschen von COS-Zellen wurden transfiziert mit Expressionsvektoren, welche TWEAKR, DR3 oder Vektoren ohne Insert (Kontrolle) enthielten. Nach zwei Tagen wurden die Zellen inkubiert mit konzentrierten Überständen von CV-1-Zellen, transfiziert mit einem Vektor, welcher das Leucin-Zipper-TWEAK Fusionsprotein der extrazellulären Domäne kodierte. Eine Stunde später wurden die Zellen gewaschen und mit einem I-125 gelabelten Antikörper versetzt, der gegen die Leucin-Zipper-Domäne gerichtet war. Die Deckgläschen wurden gewaschen, fixiert und Audio-Radiografie wurde durchgeführt unter Verwendung eines Röntgenstrahlfilms. Die TWEAKR-transfizierten Zellen bannten signifikanten Mengen an TWEAK. TWEAK band nicht an Zellen, transfiziert mit DR3 bzw. die Kontrollzellen. Dieses Experiment bestätigte, dass das TWEAKR-Polypeptid, welches in Teil A, oben identifiziert wurde, und nicht DR3 der hauptsächliche Rezeptor für TWEAK ist. Nach Entdeckung des funktionellen TWEAK-Rezeptors berichteten andere Forscher auch, dass der DR3 nicht der hauptsächliche Rezeptor für TWEAK ist (Kaptein et al., FEBS Lett., 485(2-3):135,2000. Die TWEAK-TWEAKR-Bindungswechselwirkung wurde weiter charakterisiert durch Scatchard-Analyse.
CV-1-Zellen wurden transfiziert mit dem menschlichen Volllängen-TWEAK und vermischt 1:30 mit Raji-Zellen, welche kein TWEAK exprimieren. Die Zellen wurden inkubiert mit seriellen Verdünnungen von menschlichem 125-I-gelabeltem TWEAK-Rezeptor-Fc für 2 Stunden bei 4°C. Freie und gebundene Sonde wurde abgetrennt durch Mikrozentrifugieren der Proben durch Phalat-Öl-Mischung in Plastiktuben. Überstände und Pellets wurden Gamma-gezählt. Scatchard-Analysen des TWEAK-Ligandenbindens des Rezeptors zeigte eine Bindungsaffinitätskonstante (Ka) von ungefähr 4,5 × 10⁸M^-1.
C. Der TWEAK-Rezeptor wird stark exprimiert in Herzgeweben
Um das Expressionsmuster des TWEAK-Rezeptors zu bestimmen, wurden Northern-Blot-Analysen durchgeführt. Multiple menschliche Gewebs-Northern-Blots wurden käuf lich erworben von Clontec (Palo Alto, CA) und untersucht mit P-32 gelabelter, zufällig geprimter DNA aus der TWEAK-Rezeptor-kodierenden Region. Die Blots wurden gewaschen und Audio-Radiografie wurde durchgeführt unter Verwendung eines Röntgenstrahlfilms. Die Ergebnisse zeigten, dass in dem erwachsenen TWEAK stark in Herz, Plazenta und einige Skelettmuskel-Proben exprimiert wird. Starke Expression im Herzgewebe unterstützt des weiteren das Potential des TWEAKR in der Diagnose und die Behandlung von Herzerkrankungen. Im Gegensatz zum Erwachsenen waren die fötalen Gewebe, die TWEAKR-exprimierten, universeller; TWEAKR-Transkripte zeigten sich in der Lunge und der Leber.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt die rekombinante Produktion von löslichen TWEAK-Rezeptor-Fc-(TWEAKR-Fc)-Fusions-Polypeptiden.
Um eine Nukleinsäure zu konstruieren, welche die extrazelluläre TWEAKR-Domäne kodiert, fusioniert an Fc, wurde eine Nukleinsäure, welche die N-terminale 79 Aminosäure lange Kette von TWEAKR kodierte, einschließend der Leader-Sequenz (Signalpeptid), an eine Nukleinsäure gebunden, welche einen Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1 kodierte. Sequenzen für dieses Konstrukt sind dargestellt als SEQ ID NO:6 (Nukleinsäure) und SEQ ID NO:7 (Aminosäure). In SEQ ID NO:7 stellen die Reste 1-27 das vorhergesagte Signalpeptid dar (von dem vorhergesagt wird, dass es nach Sekretion aus der Zelle abgeschnitten wird; die tatsächliche Abschnittstelle wurde identifiziert durch N-terminale Sequenzanalyse, siehe unten), die Reste 28-79 stammen von der extra zelluläre cysteinreichen TWEAKR-Domäne, die Reste 80-81 stammen von einer BglII Klonierungsstelle und der Reste ist der Fc-Abschnitt. Nach Insertion in einem Säugetier-Expressionsvektor und Expression in und Sekretion aus einer Säugetier-Wirtszelle erzeugte dieses Konstrukt, ein Polypeptid, welches bezeichnet wurde als TWEAKR-Fc. Die N-terminale Sequenzanalyse bestimmte, dass das sekretierte Polypeptid mit der Bezeichnung TWEAKR-Fc einen N-Terminus aufwies, welcher mit dem Rest 28 (Glu) von SEQ ID NO:7 korrespondierte. Anti-Angiogene-Aktivität von TWEAKR-Fc wurde demonstriert unter Verwendung von Assays, wie z.B. diejenigen beschrieben in den folgenden Beispielen. Ein analoges Fc-Fusionskonstrukt wurde hergestellt unter Verwendung der murinen TWEAKR-extrazellulären Domäne.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel stellt einen planaren Endothellzell-Migrations (Wundverschluss) Assay dar, der bedeutsam ist, zum Messen der Aktivität von TWEAK-Rezeptor-Antagonisten. In diesem Assay wird die Endothelzellmigration gemessen als die Rate des Verschlusses einer kreisrunden Wunde in einer kultivierten Zellmonoschicht. Die Rate des Wundverschlusses ist linear und dynamisch reguliert durch Wirksubstanzen, welche die Angiogenese in vivo stimulieren bzw. inhibieren.
Primäre menschliche mikrovaskuläre Nieren-Endothelzellen, HRMEC, wurden isoliert, kultiviert und verwendet, in der dritten Passage nach dem Aussehen, wie beschrieben wird in Martin et al., In vitro Cell Dev Biol 33:261,1997. Zirkuläre Replikat-Lesionen, "Wunden", (600-800 μm an Durchmesser) wurden erzeugt in konfluenten HRMEC-Monoschichten unter Verwendung einer Silizium-bestückten Bohrmaschine. Zur Zeit der Wunderzeugung wurde das Medium (DMEM + 1% BSA) angereichert mit 20 ng/ml PMA (Phorbol-12-Mystriat-13-Azetat), EGF (4 ng/ml, und 0,150 bis 5 μg/ml TWEAKR-Fc, oder einer Kombination an 40 ng/ml EGF und 0,150 bis 5 μg/ml TWEAKR-Fc. Die verbleibende Wundschwäche wurde gemessen als eine Funktion der Zeit (0 bis 12 Stunden) unter Verwendung eines Mikroskops und Bildanalyse-Software (Bioquant, Nashville, TN). Die relative Migrationsrate wurde berechnet für jedes Agens und die Kombination von Agentien durch lineare Regression der verbleibenden Wund-Fläche, aufgetragen über die Zeit. Die Ergebnisse sind in den 2 bis 3 dargestellt.
Im Vergleich zu hulgG oder media+BSA, TWEAKR-Fc inhibierte, ist die PMA-induzierte Endothel-Migration eine, die in einer dosisabhängigen Art und Weise erfolgt, was die Rate der Migration auf unstimulierte Niveaus bei 5 μg/ml (2) reduziert. Weder hulgG noch TWEAKR-Fc inhibierten die ursprüngliche (nicht induzierte) Migration. Wenn HRMEC Migration durch EGF induziert wurde, induzierte TWEAKR-Fc die Endothel-Migration in einer dosisabhängigen Art und Weise, was die Rate der Migration auf unstimulierte Niveaus bei 5 μg/ml (3) reduzierte.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel stellt einen Maus-Corneal-Taschen-Assay dar, bedeutsam zum Messen der Aktivität von TWEAK-Rezeptor-Antagonisten. In diesem Assay werden Wirksubstanzen, die auf Angiogenese oder Anti-Angiogenese-Aktivität getestet werden, immobilisiert in einer langsamen Freisetzungsform in einem Hydron-Pellet, welches in Mikrotaschen implantiert ist, erzeugt in Cornea-Epithelium von anesthäsierten Mäusen. Die Vaskularisation wird gemessen als das Auftreten, die Dichte und das Ausmaß von Gefäßeinwachsung aus dem vaskularisierten Cornea-Limbus in die normale avaskuläre Cornea.
Hydron-Pellets, wie sie beschrieben werden in Kenyon et al., Invest Opthamol. & Visual Science 37:1625, 1996, brachten Sucralfat ein mit bFGF (90 ng/Pellet), bFGF und IgG (14 μg/Pellet, Kontrolle), oder bFGF und TWEAKR-Fc (14 μg). Die Pellets wurden chirurgisch implantiert in Corneal-Stromal-Mikrotaschen, erzeugt durch Mikro-Dissektion und zwar 1 mm medial zum lateralen Corneal-Limbus von 6-8 Wochen alten männlichen C57BL Mäusen. Nach fünf Tagen wurden an der Spitze der neo-vaskulären Antwort auf bFGF die Corneas fotografiert unter Verwendung einer Zeiss-Spaltlampe bei einem Einfallswinkel von 35-50° zu der polaren Achse in dem Meridian, welches das Pellet enthielt. Bilder wurden digitalisiert und verarbeitet durch subtraktive Farbfilter (Adobe Fotoshop 4,0), um etablierte Mikrogefäße durch Hämoglobingehalt zu skizzieren. Bildanalyse-Software (Bioquant, Nashville, TN) wurde verwendet, um die Fraktion des Cornealbildes zu berechnen, welche vaskularisiert war, die Gefäßdichte innerhalb der vaskularisierten Fläche und die Gefäßdichte innerhalb der gesamten Cornea.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, inhibierte TWEAKR-Fc (100 pmol) die bFGF (3 pmol)-induzierte Cornea-Angiogenese, wodurch gleichzeitig die vaskuläre Dichte auf 50% reduziert wurde im Vergleich zu derjenigen induziert durch FGF allein oder FGF+IgG. Tabelle 1 Effekt von TWEAKR-Fc auf FGF-indzierte Angiogenese in dem Maus-Cornea-Taschen-Assay

Behandlung Reduktion von mehr als 50% in der Zahl und Länge von Gefäßen n/total n (%)

FGF allein 0/2 (0%)

FGF+IgG 0/2 (0%)

FGF+TWEAKR-Fc 6/9 (67%)
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel liefert einen Endothelzell-Proliferationsassay, bedeutsam zum Messen der Aktivität einer TWEAK-Rezeptor-Angagonisten. In diesem Assay wird eine Endothelzell-Proliferation gemessen nach vier Tagen an Zellwachstum in Mikrotiterwells unter Verwendung eines Zell-Labelingmoleküls, welches Calcein AM genannt wird. Esterasen, exprimiert durch die Zellen schneiden das Calcein und vgerursachen, dass es fluoresziert, wenn es bei 485 nm angeregt wird. Ungeschnittenes Calcein fluoreszierte nicht. Die Menge der Fluoreszenz ist direkt abhängig von der Anzahl der Endothelzellen in dem Kulturwell. Endothelzell-Proliferation wird häufig reguliert durch Wirksubstanzen, welche die Angiogenese in vivo stimulieren und/oder Inhibieren.
Primäre HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) wurden erhalten aus kommerzieller Quelle (Clonetics, Walkersville, MD), kultiviert und in der Passage 2 bis 7 eingesetzt. Replikat-Kulturen wurden angesetzt durch Zugabe von 3000 HUVEC zu jedem Mikrotiterwell in Endothelzell-Ausgangsmedien (EBM, ein Endothelzell-Ausgangsmedium, welches keine Wachstumsfaktoren oder Serum enthält und auf Medienformulierungen basiert, die entwickelt wurden von Dr. Richard Ham an der University of Colorado, Clonetics) plus 0,05% FBS (fetal bovine serum). Zur Zeit des Beginns der Kultur wurden FGF-2 (fibroblast growth factor-2, 10 ng/ml) oder menschliches TWEAK (100 ng/ml) zu den Kulturen hinzugegeben in der Gegenwart von menschlichem IgG (hulgG, Kontrolle) oder menschlichem TWEAKR-Fc bei Konzentrationen im Bereich von 0,08 μg/ml bis 20 μg/ml (0,25 to 20 μg/ml für TWEAK-Induktion und 0,08 bis 6,7 μg/ml für FGF-2-Induktion). Die HUVEC-enthaltenden Kulturen wurden inkubiert für 4 Tage bei 37°C, 5% CO₂. Am vierten Tag der Kultur wurden 4 μM Calcein-AM zu den Kulturen hinzugegeben und 2 Stunden später wurden die Wells evaluiert auf Fluoreszenz. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchschnittsfluoreszenz (485-530 nm)-Count für Replikat-Wells plus oder minus SEM, sind in den 4 und 5 gezeigt.
TWEAKR-Fc inhibierte spezifisch die TWEAK-induzierte HUVEC-Proliferation in einer dosisabhängigen Art und Weise im Vergleich zu hulgG, welches die TWEAK-induzierte Proliferation (4) nicht beeinflusste. Darüber hinaus inhibierte TWEAKR-Fc die grundlegende Proliferation von HUVEC, beobachtet während der Kultur in EBM plus 0,05% FBS, im Vergleich zu hulgG, welches dies nicht tat. Interessanterweise inhibierte TWEAKR-Fc auch die FgF-2 mediatisierte HUVEC-Proliferation bei Konzentrationen von mehr als 2 μg/ml im Vergleich zu hulgG, welches nicht FGF-2 induzierte HUVEC- Proliferationsantwort (5) beeinflusste. Diese Ergebnisse zeigen, dass TWEAKR-Fc die HUVEC-Proliferation, induziert durch die Zugabe von exogenem, rekombinantem menschlichem TWEAK inhibiert, dass TWEAKR-Fc teilweise Serum-induzierte HUVEC-Proliferation inhibiert, zeigt an, dass HUVEC endogenes TWEAK erzeugt, welches das Wachstum/Überleben der EC (Endothelzellen) über das TWEAKR vorantreibt. TWEAKR-Fc-Abschwächung von FGF-2-induzierter Proliferation zeigt, dass zumindest ein Teil der EC-Antwort auf FGF-2 von der endogenen TWEAK/TWEAKR-Wechselwirkung abhängt.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel präsentiert ein murines Herz Ischemie/Anwachungsmodell bedeutsam zum Messen der Aktivität eines TWEAK-Rezeptor-Antagonisten.
Das Überleben von heterotopisch transplantiertem Herzgewebe aus einem Mausdonor an die Haut des Ohres einer anderen genetisch ähnlichen Maus verlangt die adäquate Neovaskularisierung des transplantierten Nerzes sowie des umgebenden Gewebes, um das Überleben und die Energie der Herzmuskelfunktion zu unterstützen. Inadäquate Vaskularisierung an der Transplantationsstelle verursacht exzessive Ischemie für das Herz, Gewebezerstörung und Funktionsfehler des Gewebes bei der Verpflanzung. Wirksubstanzen, welche Faktoren antagonisieren, welche in die Endothelzellen-Migration involviert sind und die Gefäßausbildung, können die Angiogenese an der Transplantationsstelle vermindern, wodurch die Transplant-Gewebsfunktion und ultimativ das Anwachsen selbst limitiert werden. Ein heterotopes Maus-Herz-Isograft-Modell wird verwendet, um die Effekte des TWEAKR-Antagonisten zu demonstrieren, einschließend Antikörper und TWEAKR-Fc auf die Neovaskularisierung.
Weiblichen BALG/c (ungefähr 12 Wochen alt) Empfänger werden neonatale Herztransplante von Donor-Mäusen verabreicht aus dem gleichen Stamm. Das Donor-Herzgewebe wird um die linken Ohrmuscheln der Empfänger am Tag Null eingesetzt und die Mäuse werden in zwei Gruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe empfängt menschliches IgG (hulgG), während die andere Gruppe den TWEAKR-Antagonisten empfängt, und beides erfolgt intraperitoneal. Die Behandlungen werden über fünf nachfolgende Tage aufrechterhalten. Die Funktionalität der Transplante wird bestimmt durch Überwachen der sichtbaren pulsatilen Aktivität an den Tagen 7 und 14 nach der Transplantation. Die Inhibition des funktionellen Anwachsens als eine Funktion der Dosis des TWEAKR-Antagonisten wird bestimmt. Die Histologie der transplantierten Herzen wird untersucht, um die Effekte des TWEAKR-Antagonisten auf Ödeme an der Stelle der Transplantation, wie auch Wirts- und Donor-Gewebsvaskularisierung zu visualisieren (beispielsweise unter Verwendung von Anfärben mit Faktor VIII).
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel liefert ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren mit TWEAK-Rezeptor-Antagonisten. TWEAKR-Antagonisten werden in Tiermodellen von festen Tumoren getestet. Der Effekt des TWEAKR-Antagonisten wird bestimmt durch Messen der Tumorhäufigkeit und des Tumorwachstums.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel präsentiert einen ELISA-basierten Assay, der bedeutsam ist zum Bestimmen der Bindungseigenschaften von TWEAK-bindenden Molekülen, beispielsweise monomeren und multimeren TWEAKR-Fc-Oligomeren. Für dieses Beispiel wurden huTWEAKR-Fc (SEQ ID NO:7), di-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:11), tri-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:13) und TWEAKR:DR5:Fc (SEQ ID NO:9) eingesetzt.
96-Well LINBRO^®/TTTERTEK^TM-Enzym-Immunoassay-Platten (ION Biochemicals, Aurora, OH) wurden überzogen mit TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7) bei einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS, 50 μl/Well, ein Plattenversiegeler wurde aufgebracht und das System wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Jedes Well wurde dreifach gewaschen mit PEST (PBS + 0,1% TWEEN 20; 200 μl/Well) und anschließend inkubiert für eine Stunde bei 37°C in PEST + 3% nicht fetter trockener Milch (NFDM).
In separaten Reaktionen wurde FLAG-getaggtes TWEAK (TWEAK-FLAG) prä-inkubiert mit jedem der oben genannten TWEAKR-Polypeptide bei Raumtemperatur für 30 Minuten in DMEM+0,5% an niedrigem Ig-Serum, in 96 Well-U-Bodenplatten bei einer letztendlichen Konzentration von TWEAK-Flag von 50 ng/ml und einer letztendlichen Konzentration von jedem TWEAK-Polypeptid von 9000 bis 4 ng/ml in dreifach seriellen Verdünnungen.
Die EIA-Platte wurde erneut gewaschen, dreifach mit PEST + 3% NFDM. 50 ml/Well an Liganden/Rezeptormischung wurden hinzugegeben bei Raumtemperatur für 30 Min. ,inkubiert, anschließend dreifach gewaschen mit PEST + 3% NFDM.
Biotinylierter FLAG-M2 Antikörper, verdünnt 1:500 in PEST + 3% NFDM, wurde bei 50 μl/Well hinzugegeben für 45 Minuten inkubiert bei Raumtemperatur und anschließend dreimal gewaschen mit PEST + 3% NFDM.
SA-HRP, verdünnt 1:2000 in PEST + 3% NFDM wurde hinzugegeben bei 50 μl/Well, anschließend inkubiert für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
Die Platten wurden fünfmal gewaschen, 100 μl/Well 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) wurde hinzugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur für 5-20 Minuten inkubiert.
Die Reaktion wurde angehalten mit 50 μl/Well an 1M H₃PO₄ und eine Absorptionsauslesung erfolgte bei A_40/570.
Wie in 6 gezeigt, zeigte TWEAKR:Fc das schwächste Binden, gefolgt von TWEAKR:DR5:Fc, dann di-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:11), dann tri-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:13). Folglich war die Bindung an TWEAK umso starker, je mehr lösliche TWEAKR-Domänen das Fusionsprotein umfasste. Darüber hinaus war die Zunahme im Binden mehr als additiv, wie durch die Differenz im Binden zwischen TWEAKR:Fc und di-TWEAKR:Fc zeigt.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel zeigt einen kompetitiven Bindungsassay unter Verwendung von Europium-gelabeltem TWEAKR:Fc, bedeutsam zum Bestimmen der Bindungseigenschaften von TWEAK-Bindungsmolekülen, beispielsweise, monomeren und multimeren TWEAKR-Fc-Oligomeren. Für dieses Beispiel wurden huTWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7), di-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:11), tri-TWEAKR:Fc (SEQ ID NO:13) und TWEAKR:DR5:Fc (SEQ ID NO:9) verwendet.
M2 Antiflag-Antikörper wurde verdünnt bei einer Konzentration von 4 μg/ml in 0,1 M NaHCO₃. 1000 μl/Well wurden verwendet, um 96-Well-Platten mit flachem Boden zu coaten. Ein Platten-Versiegeler wurde aufgebracht und die Platten wurden bei 4°C über Nacht inkubiert.
Jedes Well wurde fünffach gewaschen mit PEST (PBS + 0,1% TWEEN 20), anschließend wurden 200 μl/Well an PEST + 3% NFDM hinzugegeben. Die Platten wurden inkubiert für 1 Stunde bei 37°C, anschließend fünffach gewaschen mit PEST.
FLAG-TWEAK wurde verdünnt auf 50 ng/ml in PBS und zu 100 μl/Well hinzugegeben. Die Platten wurden inkubiert bei Raumtemperatur unter Schütteln für eine Stunde. Die Platten wurden fünf mal noch in PEST gewaschen.
Ungelabelte und Europium-gelabelte Rezeptoren wurden vorab gemischt in 96-Well-Platten mit U-Bodenform, verdünnt in PEST + 3% NFDM auf eine letztendliche Konzentration von 35 ng/ml für Europium-gelabeltes TWEAKR; dreifache Verdünnungen von ungelabelten Rezeptoren erfolgten auf letztendliche Konzentrationen von 9000-12 ng/ml.
Zu jedem Well wurden 100 μl an vorab gemischten Rezeptoren hinzugegeben. Platten wurden inkubiert für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln und dann zehnmal gewaschen, wie zuvor. 100 μl/Well an Enhancement-Lösung wurde hinzugegeben und die Platten wurden inkubiert für fünf Minuten unter Schütteln. Absorption wurde gelesen bei A₆₁₅ auf einem Wallac-Plattenlesegerät.
Wie in 7 gezeigt, zeigte monomeres TWEAKR die schwächste Fähigkeit, mit Europium-gelabeltem TWEAKR:Fc hinsichtlich des Bindens an TWEAK in Konkurrenz zu treten, gefolgt von dimerem TWEAKR und trimerem TWEAKR.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel präsentiert einen Assay vom ELISA-Stil bedeutsam zum Bestimmen der Bindungseigenschaften von TWEAK-bindenden Molekülen, beispielsweise monomeren und multimeren TWEAKR-Fc-Oligomeren.
TWEAKR:Gly5:Fc (SEQ ID NO:15) ist ein Fusionsprotein, welches einen N-terminalen Methionin-Rest umfasst, die Reste 29-70 des TWEAK-Rezeptors, fünf Glycinreste und ein Fc-Fragment-abgeleitetes Peptid. TWEAKR:1KPEG:Fc (SEQ ID NO:17) ist ein Fusionsprotein, welches einen N-terminalen Methioninrest umfasst, die Reste 29-70 des TWEAK-Rezeptor, einen Linker und ein Fc-Fragment-abgeleitetes Peptid.
TWEAKR:1KPEG:TWEAKR:Gly5:Fc (SEQ ID NO:18) ist ein Fusionsprotein umfassend einen N-terminalen Methionenrest, die Reste 29-70 des TWEAK-Rezeptors, einen Linker, die Reste 29-70 des TWEAK-Rezeptors, fünf Glycinreste und ein Fc-Fragment, abgeleitetes Peptid.
TWEAKR-Gly5:TWEAKR:Gly5:Fc (SEQ ID NO:19) ist ein Fusionsprotein, welches einen N-terminalen Methioninrest, die Reste 29-70 des TWEAK-Rezeptors, fünf Glycinreste, die Reste 29-70 des TWEAK-Rezeptors, fünf Glycinreste und ein Fc-Fragment abgeleitetes Peptid umfasst.
Unter Verwendung eines Assays vom ELISA-Typ, ähnlich zu demjenigen, der in Beispiel 8 beschrieben wird, wurde bestimmt, dass monomere Oligomere (TWEAKR:Gly5:Fc und TWEAKR:1KPEG:Fc) an TWEAK ungefähr gleich gut binden, jedoch viel schlechter als dimere Oligomer-Konstrukte (TWEAKR:1KPEG:TWEAKR:Gly5:Fc und TWEAKR:Gly5:TWEAKR:Gly5:Fc) (8).
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel stellt die Ergebnisse eines ELISA-basierten TWEAK-Bindungsassay dar unter Verwendung von huTWEAKR:Fc (SEQ ID NO:7), TWEAKR 40mono-3 (SEQ ID NO:21); TWEAKR 40dimer-1 (SEQ ID NO:23), TWEAKR-40trimer-5 (SEQ ID NO:25); TWEAKR 40quad-2 (SEQ ID NO:27), TWEAKR 40quint-1 (SEQ ID NO:29), TWEAKR 43mono-F4 (SEQ ID NO:31), TWEAKR 43 dimer-F2 (SEQ ID NO:33), TWEAKR 43trimer-1 (SEQ ID NO:35), TWEAKR 43quad-2 (SEQ ID NO:37), TWEAKR 43quint-3 (SEQ ID NO:39), TWEAKR 43-hex-1 (SEQ ID NO:41), und TWEAKR 43sept-1 (SEQ ID NO:43). Das Protokoll, das in Beispiel 8 beschrieben wird, wurde verwendet, außer, dass in dem vorliegenden Beispiel BSA weggelassen wurde aus dem Waschpuffern. Die Ergebnisse sind in den 9-12 dargestellt.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiels präsentiert die Ergebnisse eines kompetitiven Bindungsassays unter Verwendung von Europium-gelabelten TWEAKR-Fc, wie es in Beispiel 9 beschrieben wird. In dem vorliegenden Beispiel wurden TWEAKR-Fc (SEQ ID NO:7), TWEAKR 40mono-3 (SEQ ID NO:21), TWEAKR 40dimer-1 (SEQ ID NO:23), TWEAKR 40trimer-5 (SEQ ID NO:25), TWEAKR 40quad-2 (SEQ ID NO:27), TWEAKR 40quint-1 (SEQ ID NO:29), TWEAKR 43mono-F4 (SEQ ID NO:31), TWEAKR 43dimer-F2 (SEQ ID NO:33), TWEAKR 43trimer-1 (SEQ ID NO:35), TWEAKR 43quad-2 (SEQ ID NO:37), TWEAKR 43quint-3 (SEQ ID NO:39), TWEAKR 43hex-1 (SEQ ID NO:41), und TWEAKR 43sept-1 (SEQ ID NO:43) verwendet. Die Ergebnisse werden in den 13 und 14 dargestellt.
SEQUENZLISTE

Claims

Polypeptid umfassend ein erstes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors, ein zweites lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors und eine Oligomerisierungsdomäne, wobei das Polypeptid an TWEAK bindet, und das erste lösliche Fragment aus einer Sequenz besteht, die mindestens 90%, 95% oder 100% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. den Resten 29 bis einschließlich 70 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; b. den Resten 28 bis einschließlich 79 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; c. den Resten 30 bis einschließlich 73 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; und d. den Resten 30 bis einschließlich 70 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das erste lösliche Fragment und das zweite lösliche Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz besteht, die mindestens 90%, 95% oder 100% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. den Resten 29 bis einschließlich 70 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; b. den Resten 28 bis einschließlich 79 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; c. den Resten 30 bis einschließlich 73 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; und d. den Resten 30 bis einschließlich 70 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7.
Polypeptid nach Anspruch 1, weiter umfassend ein drittes, viertes, fünftes, sechstes oder siebtes lösliches Fragment eines TWEAK-Rezeptors.
Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das erste lösliche Fragment, das zweite lösliche Fragment, das dritte lösliche Fragment, das vierte lösliche Fragment, das fünfte lösliche Fragment, das sechste lösliche Fragment und das siebte lösliche Fragment jeweils unabhängig voneinander aus einer Sequenz besteht, die mindestens 90%, 95% oder 100% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. den Resten 29 bis einschließlich 70 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; b. den Resten 28 bis einschließlich 79 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; c. den Resten 30 bis einschließlich 73 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7; und d. den Resten 30 bis einschließlich 70 der Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:7.
Polypeptid nach Anspruch 1, weiter umfassend einen Linker.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei der Linker das erste lösliche TWEAK-Rezeptor-Fragment und das zweite lösliche TWEAK-Rezeptor-Fragment verbindet.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei der Linker das zweite TWEAK-Rezeptor-Fragment und die Oligomerisierungsdomäne verbindet.
Polypeptid nach Anspruch 1, weiter umfassend einen ersten Linker und einen zweiten Linker, wobei der erste Linker das erste lösliche TWEAK-Rezeptor-Fragment und das zweite lösliche TWEAK-Rezeptor-Fragment verbindet, und der zweite Linker das zweite lösliche TWEAK-Rezeptor-Fragment und die Oligomerisierungsdomäne verbindet.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei der Linker die Aminosäurensequenz GGGGG (SEQ ID NO:45) umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das erste lösliche Fragment und das zweite lösliche Fragment ohne eine dazwischen liegende Polypeptidsequenz miteinander verbunden sind.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das erste lösliche Fragment und die Oligomerisierungsdomäne ohne eine dazwischen liegende Polypeptidsequenz miteinander verbunden sind.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das erste lösliche Fragment, das zweite lösliche Fragment und die Oligomerisierungsdomäne ohne eine dazwischen liegende Polypeptidsequenz in einem linearen und zusammenhängenden Polypeptid miteinander verbunden sind.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Oligomerisierungsdomäne N-terminal oder C-terminal des ersten löslichen TWEAKR-Fragments und des zweiten löslichen TWEAK-Rezeptor-Fragments liegt.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Oligomerisierungsdomäne ein Leucin-Zipper oder ein Fragment eines Antikörpers umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 14, wobei das Fragment eines Antikörpers eine Fc-Domäne umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Sequenz umfasst, die mindestens 90%, 95% oder 100% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. SEQ ID NO:9; b. SEQ ID NO:11; c. SEQ ID NO:13; d. SEQ ID NO:15; e. SEQ ID NO:17; f. SEQ ID NO:18; g. SEQ ID NO:19; h. SEQ ID NO:21; i. SEQ ID NO:23; j. SEQ ID NO:25; k. SEQ ID NO:27; l. SEQ ID NO:29; m. SEQ ID NO:31; n. SEQ ID NO:33; o. SEQ ID NO:35; p. SEQ ID NO:37; q. SEQ ID NO:39; r. SEQ ID NO:41; s. SEQ ID NO:43; und t. SEQ ID NO:44.
Protein umfassend ein erstes Polypeptid nach Anspruch 1 und ein zweites Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Polypeptide aneinander oligomerisiert sind.
Protein nach Anspruch 17, wobei die Aminosäurensequenz des ersten Polypeptids identisch mit der Aminosäurensequenz des zweiten Polypeptids ist.
Protein nach Anspruch 17, wobei die Aminosäurensequenz des ersten Polypeptids nicht identisch mit der Aminosäurensequenz des zweiten Polypeptids ist.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Inhibieren eines TWEAK-Rezeptors.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Inhibieren von Angiogenese in einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Subjekt ein Säugetier ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer durch Angiogenese vermittelten oder erschwerten Krankheit oder von durch Angiogenese vermittelten oder erschwerten Beschwerden.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Krankheit oder Beschwerden durch oculare Neovascularisierung gekennzeichnet sind.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Krankheit oder Beschwerden ein fester Tumor ist.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Verwendung ferner das Behandeln des Subjektes mit Bestrahlung umfasst.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Zusammensetzung ferner ein zweites chemotherapeutisches Mittel umfasst.
Die Verwendung nach Anspruch 29, wobei das zweite chemotherapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: einem Alkylierungsmittel, einem Antimetabolit, einem Vinca-Alkaloid, einem von Pflanzen abgeleiteten Chemotherapeutikum, einem Nitroso-Harnstoff, einem Antitumorantibiotikum, einem Antitumorenzym, einem Topoisomerasehemmstoff, einem Platinanalog, einem adrenocorticalen Suppressivum, einem Hormon, einem Hormon-Agonist, einem Hormon-Antagonist, einem Antikörper, einem Immuntherapeutikum, einem Blutzellenfaktor, einem Radiotherapeutikum, einem Modifikator der biologischen Antwort, Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechloretamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluoruracil, 5-Fluordeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, Vinblastin, einem Lymphokin, einem Cytokin, einem Interleukin, einem Interferon, Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Delta-Interferon, TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxy-Harnstoff, Methylhydrazin, Mitotan, Tamoxifen und Fluoxymesteron.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Krankheit oder Beschwerden eine inflammatorische Krankheit ist oder inflammatorische Beschwerden sind.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei die Zusammensetzung ferner ein zweites therapeutisches Mittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Cytokin oder einen Cytokin-Rezeptor hemmt, das bzw. der Entzündung begünstigt.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei das zweite therapeutische Mittel ein lösliches Fragment des Cytokin-Rezeptors, einen Antikörper, der an das Cytokin bindet, oder einen Antikörper, der an den Cytokin-Rezeptor bindet, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das zweite therapeutische Mittel einen Rezeptor aktiviert, der Entzündung hemmt.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das zweite therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus FIt3 Ligand, CD40 Ligand, Interleukin-2, einem Interleukin-4 Antagonist, einem IL-13 Antagonist, Interleukin-12, 4-1BB Ligand, einem Anti-4-1BB Antikörper, einem TNF Antagonist, einem TNF Rezeptor Antagonist, TRAIL, einem CD148 Agonist, einem VEGF Antagonist, einem Antagonist des VEGF Rezeptors, einem IgE Antagonist und einem Tek Antagonist.
Nukleinsäure, oder ihr Komplement, die eine Sequenz umfasst, die das Polypeptid nach Anspruch 1 encodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 37, wobei die Nukleinsäure oder ihr Komplement unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine zweite Nukleinsäure hybridisiert, und die zweite Nukleinsäure eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. SEQ ID NO:10; b. SEQ ID NO:12; c. SEQ ID NO:14; d. SEQ ID NO:16; e. SEQ ID NO:20; f. SEQ ID NO:22; g. SEQ ID NO:24; h. SEQ ID NO:26; i. SEQ ID NO:28; j. SEQ ID NO:30; k. SEQ ID NO:32; l. SEQ ID NO:34; m. SEQ ID NO:36; n. SEQ ID NO:38; o. SEQ ID NO:40; und p. SEQ ID NO:42.
Nukleinsäure nach Anspruch 37, wobei die Nukleinsäure oder ihr Komplement eine Sequenz umfasst, die mindestens 90%, 95% oder 100% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. SEQ ID NO:10; b. SEQ ID NO:12; c. SEQ ID NO:14; d. SEQ ID NO:16; e. SEQ ID NO:20; f. SEQ ID NO:22; g. SEQ ID NO:24; h. SEQ ID NO:26; i. SEQ ID NO:28; j. SEQ ID NO:30; k. SEQ ID NO:32; l. SEQ ID NO:34; m. SEQ ID NO:36; n. SEQ ID NO:38; o. SEQ ID NO:40; und p. SEQ ID NO:42.
Nukleinsäure nach Anspruch 37, wobei die Nukleinsäure eine Polypeptid-Sequenz encodiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. SEQ ID NO:9; b. SEQ ID NO:11; c. SEQ ID NO:13; d. SEQ ID NO:15; e. SEQ ID NO:17; f. SEQ ID NO:18; g. SEQ ID NO:19; h. SEQ ID NO:21; i. SEQ ID NO:23; j. SEQ ID NO:25; k. SEQ ID NO:27; l. SEQ ID NO:29; m. SEQ ID NO:31; n. SEQ ID NO:33; o. SEQ ID NO:35; p. SEQ ID NO:37; q. SEQ ID NO:39; r. SEQ ID NO:41; s. SEQ ID NO:43; und t. SEQ ID NO:44.
Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 37.
Vektor nach Anspruch 41, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 37.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids umfassend Kultivieren der Wirtzelle nach Anspruch 43 unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids begünstigen.