DE69633175T2

DE69633175T2 - Multimere proteine

Info

Publication number: DE69633175T2
Application number: DE69633175T
Authority: DE
Inventors: Peter Pack; Adolf Hoess
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys AG
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-23
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2016-05-24
Also published as: CA2222055A1; EP0827544A2; EP0827544B1; WO1996037621A3; WO1996037621A2; JPH11508126A; DE69633175D1; ATE274064T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft multimere Polypeptide, die zwei oder mehr funktionelle Domänen in einer Struktur, die mindestens zu einer Selbsttrimerisierung befähigt ist, vereinigen und die auf einfache Weise zum Beispiel in rekombinanten Bakterien hergestellt werden können.
Hintergrund der Erfindung
Multivalenz ist eine Voraussetzung für eine Vielzahl von makromolekularen Interaktionen wie die Bindung von Antikörpern oder Lektinen an spezifische Ziele, die Erkennung von Liganden, die Aktivierung oder Hemmung von Rezeptoren ebenso wie die Zelladhäsion.
Die Bindung von Kohlenhydraten durch Lektine wie Conglutinin oder IgE bindendes Protein benötigt Multivalenz (Hsu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 14167–14174; Andersen et al., 1992, J. Struct. Biol. 109, 201–27). Im Vergleich zu einem monovalenten Liganden bindet das trimere Lektin der Leber (Verrey und Drickamer, 1993, Biochem. J. 292, 149–155) den trimeren Liganden mit einer 100- bis 1000-fach höheren Affinität (Lee et al., 1992, Arch. Biochem. Biophys. 299, 129–136).
Die Multimerisierung von Zelloberflächen-Rezeptoren ebenso wie von ihren Liganden bestimmt oft die Spezifität und die Affinität. Die multivalenten Interaktionen von CD2-Rezeptoren von T-Zellen mit ihren Liganden LFA-3 auf dem verwandten Partner sind notwendig für den Zell-Zellkontakt und die Aktivierung der T-Zellen durch stimulierende Zellen (Moingeon et al., 1989, Immunol. Rev. 111, 111–144).
Die multivalente Bindung von Heparin an die Rezeptoren des Fibroblasten-Wachstumsfaktors induziert die Dimerisierung des Rezeptors und führt zu einer mitogenen Signaltransduktion (Pantoliano et al., 1994, Biochemistry 33, 10229–10248). Die konzentrationsabhängige Dimerisierung des Cytokins IL-2 führt zu einer hochaffinen Bindung an den IL2-Rezeptor und zur Erzeugung des hochaffinen Komplexes, der die nachfolgende Signaltransduktion reguliert (Lother et al., 1992, Growth factors 7, 117–129). Die durch multivalente Liganden induzierte Dimerisierung von CD4 ist notwendig, um die intrazelluläre Tyrosinkinase in T-Zellen zu aktivieren (Langedijk et al., 1993, Thromb.-Res. 71, 47–60). Die Hemmung der IgE-Synthese bei allergischen Krankheiten erfordert die Injektion von zumindest bivalenten anti-IgE-Immunglobulinen (Stämpfli et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 2161–2167).
Die Erhöhung schwacher monovalenter Kräfte durch die Vermehrung der Anzahl der Interaktionen wird in zunehmender Weise bei der Herstellung von Proteinen und therapeutischen Anwendungen verwendet. Synthetische Peptide wie die bivalenten Hirudin-Analoga „Hiruloge" hemmen wirksam an Gerinnsel gebundenes Thrombin (Cannon et al., 1993, Am. J. Cardiol. 71, 778–782), wobei eine weitere Optimierung verwandter Thrombin-Inhibitoren durch Trivalenz erreicht wird (Szewczuk et al., 1993, Biochemistry 32, 3396–3404). Multivalente Glycopeptide hemmen die Bindung von Influenzaviren an ihre Zielzellen (Unverzagt et al., 1994, Carbohydr. Res. 251, 285–301). Das multivalente Darbieten von Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Peptiden hemmt in drastischer Weise Lungenmetastasen (Nomizu et al., 1993, Cancer Res. 53, 3459–3461).
Die synergistische Zunahme der Bindungsstärke (funktionelle Affinität oder Avidität) durch multivalente Interaktionen ist am besten für die Bindung von Immunglobulinen an ihre spezifischen Antigene charakterisiert. Die Wirkung der Avidität hängt von der Affinität pro Bindungsstelle, der Flexibilität und Anzahl der assoziierten Bindungsstellen und der Anzahl ebenso wie der Distanz der in Reichweite befindlichen Antigene ab. Grob geschätzt ist die Avidität das Produkt der Affinitäten pro monovalentem Bindungsereignis (Crothers & Metzger, 1972, Immunchemistry 9, 341).
Immunglobuline wie monoclonale Antikörper oder heterolog exprimierte Fragmente gehören zu den viel versprechendsten Kandidaten von „zielgerichteten Waffen" zur Durchmusterung und Bekämpfung von Tumoren und jeglicher Art von Pathogenen in vivo (Colcher et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1191–1197). Die heterologe Expression von so genannten scFv-Antikörperfragmenten, d. h. von durch einen Peptid-Linker verbundenen variablen Domänen von Antikörpern (Bird et al., 1988, Science 242, 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879), vereinigt verschiedene Vorteile.
Die Deletion aller konstanter Immunglobulindomänen und die kovalente Verküpfung der zwei variablen Domänen (Fv) durch einen Peptid-Linker (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879; Bird et al., 1988, Science 242, 423) führt zu einem stabilen Einzelketten-Immunglobulin minimaler Größe mit einer einzelnen, vollständigen Bindungstasche. Die geringe Größe des Einzelketten-Fv-Fragmentes (scFv) ermöglicht verbesserte Expressionsausbeuten (Skerra und Plückthun, 1991, Protein Eng. 4, 971), proteolytische Stabilität, Gewebedurchdringung (Colcher et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1191) und verringert unspezifische Interaktionen oder Immunogenität im Vergleich zu vollständigen Antikörpern. Eine alternative Konstruktion verbindet die zwei variablen Domänen über geschaffene Disulfidbrücken an der VL-VH-Grenzfläche (dsFv; Glockshuber et al., 1990, Biochemistry 29, 1362).
Der Nachteil dieser rekombinanten Fragmente ist jedoch ihre kurze Halbwertszeit in vivo und das Fehlen der Fähigkeit, bivalente Komplexe wie IgG oder höhere Oligomere wie IgM zu bilden, wobei die Bindungstaschen zwei oder mehrere entfernte Antigene gleichzeitig erreichen können. In medizinischen Anwendungen wie dem Abzielen auf Tumoren jedoch bedeutet die Notwendigkeit einer wirksamen Durchdringung des Gewebes und einer starken Bindung, dass eine Immunglobulin basierte Struktur im Idealfall eine relativ geringe Größe mit einer hohen Affinität/Avidität und einer ausreichenden Halbwertszeit vereinigen sollte (Thomas et al., 1989, Cancer Res. 49, 3290–3296). Um die Avidität von ganzen Antikörpern und die längere Halbwertszeit in vivo wiederzuerlangen, wurden vor kurzem verschiedene Techniken entwickelt, um auf kleine dimere und daher bivalente Immunglobuline Zugriff zu haben, obwohl jedes davon grundlegende Nachteile mit sich bringt.
Wenn der Interdomänenlinker zwischen VH und VL in Einzelketten-Fv-Fragmenten (Bird et al., 1988, Science 242, 423–426) ausreichend kurz ist, wird die Bildung von monovalenten scFv-Fragmenten benachteiligt, was zu einer intramolekularen Assoziation von VH- und VL-Domänen von zwei oder mehr Fragmenten führt, um scFv-Dimere oder höhere Oligomere zu bilden. Im so genannten Diabody (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444) erlaubt die starre Struktur und die unmittelbare Nähe der Bindungsstellen keine Flexibilität oder Bindung an entfernte Antigene (Perisic et al., 1994, Structure 2, 1217). Die Bildung von stabilen Dimeren oder höheren Oligomeren hängt in hohem Maße von der VH-VL-Grenzfläche eines bestimmten Fragmentes ab, sodass die Umwandlung eines scFv in einen Diabody nicht für jede gegebene Sequenz möglich und der Grad der Oligomerisierung nicht kontrollierbar ist (Whitlow et al., 1994, Prot. Eng. 7, 1017–1026).
Die direkte in vitro-Verbindung von zwei Fragmenten mit C-terminalen Cysteinen über Oxidation (Carter et al., 1992, Bio/Technology 10, 163) oder über chemisch angeheftete Spacer (Kipriyanov et al., 1994, Mol. Immunol. 31, 1047–1085; Cook und Wood, 1984, J. Immunol. Meth. 171, 227–237) benötigt eine arbeitsaufwendige Isolierung und Zurückfaltung des gereinigten Materials mit schwachen Ausbeuten an funktionellen Immunglobulinen. Da darüber hinaus eine Bildung von gemischten Disulfidbrücken nicht ausgeschlossen werden kann, kann eine Aggregation zu unbestimmten Multimeren stattfinden. Eine nicht-quantitative Bildung von Disulfiden verringert zusätzlich die Gesamtausbeute.
Die Verwendung amphipathischer Helices wie Bündelhelices oder Leucin-Reissverschlüssen, die für eine Dimerisierung in E. coli C-terminal an scFv-Fragmente fusioniert wurden (Pack und Plückthun, 1992, Biochemistry 31, 1579–1584), verschaffte einen Zugang zu dimeren, bivalenten „Mini-Antikörpern" (PCT/EP93/00082). Die Antikörperfragmente setzen sich in vivo ausschließlich zu funktionellen Dimeren zusammen und können in hohen Ausbeuten in einem einzigen Affinitätschromatographieschritt gereinigt werden (Pack et al., 1993, Bio/Technology 11, 1271–1277). Basierend auf artifiziellen Bündelhelices oder nicht-menschlichen Reissverschlusssequenzen ist diese Konstruktion der C-terminal fusionierten „Assoziationsdomänen" möglicherweise durch die Immunogenität solcher Sequenzen erschwert, wenn sie als menschliche Therapeutika angewendet werden. Darüber hinaus sind als Assoziationsdomänen verwendete Bündelhelices nicht in der Lage, fusionierte Antikörperfragmente zu tetramerisieren, da die Assoziationskräfte einzelner Bündelhelices zu schwach sind, um ein Tetramer zu stabilisieren (Pack und Plückthun, 1992, Biochemistry 31, 1579–1584).
Modifizierte und daher „artifizielle" Reissverschlusssequenzen, die mit Antikörperfragmenten fusioniert sind, sind in der Lage, eine Tetramerisierung herbeizuführen, aber Unverträglichkeiten der modifizierten Reissverschlusssequenz mit der Faltung und der Sekretion führen zu einer beträchtlich verringerten Ausbeute an funktionellem tetramerem Material (Pack et al., 1995, J. Mol. Biol. 246, 28–34) und der Komplex enthält nur eine Art Funktion oder funktionelle Domäne, nämlich eine scFv-Spezifität.
Früher sind auch die CH2-CH3-CH4-Domänen der schweren Ketten von Immunglobulin M als Träger einer einzelnen funktionellen Domäne, nämlich von Zelloberflächenrezeptorliganden, verwendet worden (PCT-Anmeldung WO 92/03569). Die resultierenden Fusionsproteine wurden in bestimmten Säugerzellen als Multimere exprimiert.
Aus verschiedenen Gründen birgt die Verwendung von CH2-CH3-CH4-Domänen von schweren Ketten von Immunglobulin M als Multimerisierungsmittel Nachteile.
Erstens ist die Expression solcher Fusionsproteine auf bestimmte Expressionswirte und zelluläre Kompartimente beschränkt. Es wird angenommen, dass die spezifische Glycosylierung der konstanten Domänen von Immunglobulinen für die Zusammensetzung, die Struktur (Rademacher und Dwek, 1984, Prog. Immun. 5, 95–112), die Funktion (Burton, 1985, Mol. Immunol. 22, 161–206) und die proteolytische Stabilität (Leatherbarrow und Dwek, 1983, FEBS Lett. 164, 227–239) der konstanten Domänen der Immunglobuline wichtig ist (Matsuda et al., 1990, Mol. Immunol. 27, 571–579; Dorai et al., 1991, Hybridoma 10, 211–217). Die Veränderung oder Abwesenheit von Glycosylierungsmustern, zum Beispiel wenn ein muriner anstelle eines menschlichen Expressionswirtes verwendet wird, führt zu strukturellen Veränderungen und einem Verlust der Komplementaktivierung (Lund et al., 1990, Mol. Immunol. 27, 1145–1153). Das korrekte menschliche Glycosylierungsmuster in konstanten Domänen von Immunglobulinen ist nur in bestimmten Säugerzellkulturen, nämlich denen menschlichen Ursprungs, erreichbar. Ein unterschiedliches Glycosylierungsmuster durch eine Expression in anderen als menschlichen Zellen würde ebenfalls die Immunogenität in medizinischen Anwendungen erhöhen.
Darüber hinaus leidet die Verwendung von Antikörper basierten Assoziationsdomänen des vorgeschlagenen Typs an dem ernsthaften Nachteil seiner enormen Größe von 343 Resten pro Monomer, was drei verschiedenen Immunglobulin-Faltungsdomänen (CH2, CH3, CH4) pro monomerem Fusionsprotein entspricht, wobei 6 Disulfidbrücken gebildet werden (Dorai und Gillies, 1989, Nucleic Acids Res. 17, 6412–6417) oder 60 in dem dekameren IgM-ähnlichen Komplex. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass Konstrukte dieses Typs in Bakterien hergestellt werden können, und es gibt keinen Bericht über eine funktionelle Expression eines Immunglobulins mit drei korrekt gefalteten konstanten Domänen in Bakterien.
Es ist weithin bekannt, dass die Effizienz der Faltung und die Ausbeute der Expression von rekombinantem löslichem Material von der Länge der Peptidkette, der Anzahl der einzelnen Faltungsdomänen pro Kette ebenso wie von der Anzahl von cis-Prolinen und zu bildenden korrekten Disulfidbrücken abhängt (Jaenicke, 1987, Prog. Biophys. Mol. Biol. 49, 117–237). In prokaryontischen Expressionswirten wie E. coli ist die Abnahme der Ausbeute von größeren rekombinanten Proteinen sogar noch ausgeprägter als in Hefe oder Zellkultur. Als ein Aspekt dieser Beobachtung steigt zum Beispiel besonders in Interdomänensequenzen die Proteolyse von rekombinanten und „fremden" Proteinen mit der Anzahl der Faltungsdomänen pro Kette. Die Bildung von korrekten Disulfidbrücken ist ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt der Faltung (Darby et al., 1992, J. Mol. Biol. 224, 905–911) und eine Voraussetzung für eine stabile Immunglobulinfaltung (Creighton, 1988, BioEssays 8, 57–53; Skerra und Plückthun, 1991, Prot. Eng. 4, 971–979). In reduzierenden Umgebungen wie cytoplasmatischen Kompartimenten konnte die Bildung einer Disulfidbrücke nicht gezeigt werden (Glockshuber et al., 1992, Biochemistry 31, 1270–1279).
Der Selbstzusammenbau von relativ kleinen Fusionsproteinen, vorzugsweise ohne die Notwendigkeit der Glycosylierung oder von Disulfidbrücken in vivo, würde jedoch diese vorstehend erwähnten allgemeinen Probleme bewältigen und zu neuen, gut exprimierten Komplexen führen.
Bakterien wie E. coli liefern schnelle Generationszeiten, billige Fermentationen und gut etablierte molekularbiologische Protokolle wie zum Beispiel einen schnellen Zugriff auf ortsgerichtete Mutationen. Vor kurzem zeigte sich, dass das Darbieten von rekombinanten Proteinen auf Bakteriophagen (Greenwood et al., 1991, J. Mol. Biol. 220, 821–827) in Kombination mit einer zufälligen Mutagenese ein einzigartiges Werkzeug für die Erzeugung von großen Bibliotheken und für die Auswahl der wertvollsten Proteinmutanten ist. Nur kleine und gut exprimierte Multimerisierungsmittel, vorzugsweise peptidische Multimerisierungsmittel, würden die effiziente Konstruktion von multimeren Proteinen, die aus der Bibliothek stammende rekombinante Proteine als funktionelle Domänen enthalten, erlauben.
Ein weiterer Nachteil von WO 92/03569 ist, dass es nicht die Herstellung von Multimeren mit zwei oder mehr verschiedenen funktionellen Domänen pro Fusionsprotein lehrt. In der Tat sorgt WO 92/03569 nur für ein Beispiel eines bestimmten Rezeptorliganden, der in den multimeren Proteinen zusammengesetzt werden soll, wenn er an die CH2-CH3-CH4-Domänen der schweren Kette von Immunglobulin M fusioniert und in bestimmten Säugerzellen exprimiert wird.
Niemand kann nach dem Stand der Technik Substanzen bereitstellen, die die Merkmale einer relativ geringen Größe, einer niedrigen Immunogenität und hohe Ausbeuten an funktionellem Material mit dem Selbstzusammenbau von stabilen multimeren Komplexen, die größer als Dimere sind und mindestens zwei verschiedene Funktionen aufweisen, kombinieren.
Die zusätzliche Fusion einer zweiten funktionellen Domäne C-terminal von einem peptidischen, selbst zusammenbauenden Multimerisierungmittel über einen zweiten flexiblen Linker erweitert den Anwendungsbereich von multimeren Proteinen bedeutend. Der Selbstzusammenbau eines bifunktionellen Fusionsproteins mit Hilfe eines „zentralen" Multimerisierungsmittels (Domäne1-Linker1-Mittel-Linker2-Domäne2) würde zu einem völlig neuen rekombinanten Komplex mit zwei Funktionen vorzugsweise in vielfachen Kopien in einem Komplex führen.
Ein weiter Bereich von Kombinationen von zwei verschiedenen funktionellen Domänen ist jetzt in Reichweite. Das Zusammensetzen von zwei oder mehr verschiedenen Antikörperfragmenten zu multivalenten Komplexen mit Valenzen identisch zu/oder mehr als 3 pro Spezifität ebenso wie die Kombination von unverwandten Domänen wie Enzymen, Toxinen, Cytokinen, Kinasen, Phosphatasen, Lektinen, Peptidhormonen, Zellanheftungsproteinen wie Integrinen, Metall bindenden Domänen, peptidischen Impfstoffen, bioaktiven Peptiden oder löslichen Zelloberflächenproteinen wie die CD-Moleküle von Leukocyten oder Teilen davon in einem multimeren Komplex sind von beträchtlichem Interesse für diagnostische oder therapeutische Anwendungen.
Die mit dem bisherigen Stand der Technik verbundenen Nachteile werden durch die vorliegende Erfindung überwunden, die von der Herstellung von multifunktionellen Proteinen handelt, welche die folgenden Merkmale aufweisen:

(i) sie können unter der Verwendung von rekombinanten Standard-Mikroorganismen hergestellt werden, auch wenn das Molekulargewicht der zusammengesetzten Proteine das der üblicherweise in Bakterien exprimierten Proteine übersteigt,
(ii) eine niedrige Immunogenität in Menschen
(iii) sie liegen als Multimere mit einer Valenz identisch zu/oder größer als drei vor
(iv) sie liefern Proteine, die zwei oder mehr funktionelle Domänen in einer einzelnen multimeren Struktur beinhalten.

Die vorliegende Erfindung stellt überraschenderweise kleine peptidische Multimerisierungsmittel bereit, welche zwei funktionelle Domänen, die sich voneinander unterscheiden können, als N- und C-terminale Fusionen unterstützen, wobei sich alle drei Untereinheiten in funktionelle Formen falten, und welche ohne die Notwendigkeit der Zurückfaltung zum Beispiel in rekombinanten Bakterien produziert werden können.
Innerhalb eines multimeren Proteins der vorliegenden Erfindung, das als einzelne, zusammenhängende monomere Polypeptidkette (Domäne1-Linker1-Multimerisierungsmittel- Linker2-Domäne2) mit posttranslationalem Selbstzusammenbau codiert und translatiert werden kann, darf ein solches peptidisches Multimerisierungsmittel jedoch nicht in starkem Maße mit der Faltung und der Funktion der N- und C-terminal fusionierten Domänen interferieren, und es muss sich in dem sterischen Zusammenhang der fusionierten Domänen an beiden Enden selbst assoziieren, auch wenn die funktionellen Domänen viel größer als die peptidischen Multimerisierungsmittel sind. Peptidische Multimerisierungsmittel der vorliegenden Erfindung weisen diese Eigenschaften auf.
Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass nicht alle Arten von Polypeptiden, d. h. funktionelle Domänen, in ausreichenden Mengen und in ihrer natürlichen Faltung in jedem Expressionswirt produziert werden können. Das beruht auf Unterschieden in der Faltungs- und Sekretionsumgebung und posttranslationalen Modifikationen wie Glycosylierungsmustern und Proteaseaktivitäten. Jedenfalls stellt die vorliegende Erfindung auch eine Lösung bereit, um diese Probleme im Stand der Technik zu beheben. In diesen Fällen muss nämlich eine kombinierte Verwendung von verschiedenen Expressionswirten und/oder von in vitro-Synthese angewendet werden, um multimere Proteine mit einem zentralen peptidischen erfindungsgemäßen Multimerisierungsmittel zu erzeugen.
Eine bestimmte funktionelle Domäne kann zum Beispiel die Faltung in dem Cytoplasma eines prokaryontischen Organismus mit anschließender Rückfaltung benötigen, während die zweite funktionelle Domäne, mit der die erste funktionelle Domäne kombiniert werden soll, sich in dem Cytoplasma eines prokaryontischen Organismus nicht richtig faltet, sondern für eine natürliche Faltung eine Sekretion in einen Säugerwirt mit anschließender Glycosylierung brauchen würde.
Bestimmte funktionelle Domänen oder Teile davon können in vitro in zellfreien Translationssystemen (Nishimura et al., 1995, J. Fermentation and Bioengineering 80, 403–405) oder als vollständig synthetische Polypeptide (Fitzgerald et al., 1995, J. American Chemical Society 117, 11075–11080) hergestellt werden. Polypeptide mit mehr als 100 Aminosäureresten werden zum Beispiel gegenwärtig unter der Verwendung von Fmoc-Chemie auf einer Festphase synthetisiert (Roggero et al., 1995, Molecular Immunology 32, 1301–1309).
Unter der Verwendung von in vitro-Synthese kann entweder ein Teil oder ein vollständiges multimeres erfindungsgemäßes Protein synthetisiert und anschließend z. B. chemisch oder enzymatisch in vitro (z. B. Harris et al., 1973, FEBS Lett. 29, 189–192) oder durch Oxidation zusätzlicher freier Cysteine (Carter et al., 1992, Bio/Technology 10, 163) an die verbleibenden Teile, die separat in einem unterschiedlichen Expressionssystem oder Expressionswirt produziert wurden, gekoppelt werden. Zum Beispiel kann der Multimerisierungskern billig in E. coli synthetisiert werden, wohingegen die Linker und funktionellen Domänen in unterschiedlichen Expressionssystemen wie CHO-Zellen oder die bioaktiven Peptide als funktionelle Domänen durch in vitro-Synthese hergestellt werden können.
Die Vorteile eines erfindungsgemäßen peptidischen Multimerisierungsmittel können unter der Verwendung des Beispiels der scFv-Fragmente als N- und/oder C-terminal fusionierte funktionelle Domänen aufgezeigt werden. Das multimere Protein vereinigt deutlich verbesserte Eigenschaften wie die multivalente Bindung und die Bispezifität mit verlängerter Halbwertszeit in vivo, welche es dadurch besonders geeignet für eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen machen. Während sie die Notwendigkeit der geringen Größe für die Gewebedurchdringung erfüllen, zeigen die monomeren scFv-Fragmente keine Aviditätswirkungen und werden rasch, hauptsächlich über die Nieren, ausgeschieden. Ihre Halbwertszeit t (1/2 alpha) ist etwa zehnmal kürzer als die eines ganzen bivalenten Antikörpers und zwei- bis dreimal kürzer als die eines dimeren scFv-Fragmentes (Haunschild et al., 1995, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 8, 111–127), was die Chance erniedrigt, das spezifische Antigen zu finden und daran zu binden. Es wird erwartet, dass multimere scFv-Fragmente eine deutlich höhere Halbwertszeit und Zirkulationszeit in vivo aufweisen als monomere oder dimere scFv-Fragmente. Darüber hinaus können sie multivalent binden und zwei Spezifitäten in einem multimeren Komplex vereinigen (das N-terminale scFv-Fragment als funktionelle Domäne kann eine unterschiedliche Spezifität als die C-terminale funktionelle Domäne aufweisen).
Die vorliegende Erfindung sorgt für multimere Proteine, die scFv-Fragmente als N- und C-terminale funktionelle Domänen enthalten und die zum Beispiel zwei verschiedene scFv-Fragmente (scFv1-Linker1-Mittel-Linker2-scFv2)_>2 vereinigen. Diese vollständig neue Konstruktion von multivalenten und bispezifischen Immunglobulinen ist für diagnostische und therapeutische Zwecke von enormem Interesse, da sie zum Beispiel das multivalente Abzielen auf Tumorgewebe (Spezifität scFv1) und die Rekrutierung von cytotoxischen T-Zellen (Spezifität scFv2) gegen den Tumor ermöglicht (Perez et al., 1985, Science 316, 354–356).
Überdies sorgt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen für Heterotetramere, die eine Vielzahl von Funktionen in einem Molekül vereinigen. Heterotetramerisierung kann zum Beispiel die Folge der Assoziation von strukturell unterschiedlichen Multimerisierungsmittel sein. In einer anderen Ausführungsform können sie das Resultat von unterschiedlichen funktionellen Domänen sein, die, wie hier nachstehend aufgeführt, N- oder C-terminal (über die gleichen oder unterschiedliche Linker) an die Mittel fusioniert wurden. Die erfindungsgemäße peptidische Multimerisierungsdomäne kann also auf Teilen natürlicher Proteine mit der Fähigkeit zu heteromultimerisieren, wie das Histon (H3/H4)₂-Heterotetramer oder das (TAF_II42/TAF_II62)₂-Heterotetramer (Xie et al., 1996, Nature 380, 316–322), die beide weniger als 80 Reste pro Untereinheit benötigen, um zu heterotetramerisieren, basieren. Als erfindungsgemäße Multimerisierungsmittel verwendet können sich vier verschiedene funktionelle Domänen (zwei Domänen N-terminal und zwei C-terminal über flexible Linker an das Multimerisierungsmittel fusioniert) im Prinzip selbst zu einem multimeren Protein zusammenbauen, in dem vier unterschiedliche funktionelle Domänen zweimal vorkommen.
Überraschenderweise wurde gezeigt, dass das Multimerisierungsmittel, wenn es, wie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung beschrieben, an die Linkersequenzen und die Sequenzen einer funktionellen Domäne fusioniert ist, eine unabhängige Faltung erlaubt (Mack et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7021–7025) und im Wesentlichen gegen einen proteolytischen Angriff resistent ist, was für Konstrukte nach dem Stand der Technik, die eine bestimmte Linkerlänge aufweisen, nicht der Fall ist. Die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Linker sind vorzugsweise nicht länger als 15 Aminosäuren.
Die vorliegende Erfindung sorgt ebenfalls für ein multimeres Protein, in dem die ersten funktionellen Domänen für jedes Monomer und/oder die zweiten funktionellen Domänen für jedes Monomer unterschiedlich sind. In dieser Ausführungsform sorgt die vorliegende Erfindung auch für die Möglichkeiten, dass die erste(n) und zweite(n) funktionelle(n) Domäne(n) gleich oder unterschiedlich ist (sind).
Außerdem sorgt die vorliegende Anmeldung für die Möglichkeit, dass die erste(n) und/oder zweite(n) funktionelle(n) Domäne(n) mit mindestens einer weiteren (funktionellen) Domäne fusioniert ist (sind). Solche Konstrukte können in vorteilhafter Weise Marker als funktionelle Domänen an ihren N- oder C-Termini enthalten, die zum Zweck der Reinigung verwendet werden können.
Die vorliegende Erfidung sorgt im Allgemeinen auch für multimere Proteine synthetischen, semisynthetischen oder rekombinanten Ursprungs, in die an geeigneten Stellen Cysteinreste plaziert wurden, die Cysteinbrücken innerhalb der Multimerisierungsmittel bilden können. Solche Cystinbrücken verleihen solchen multimeren Proteinen eine verbesserte Stabilität. Einem Fachmann ist wohl bewusst, wie solche Cysteine in das Multimerisierungsmittel eingeführt werden und wo sie plaziert werden sollen. Indem zum Beispiel die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in geeigneter Weise manipuliert wird, können bestimmte Aminosäurecodons in Cysteincodons verändert werden. Dementsprechend sind auch auf diese Weise veränderte DNA-Sequenzen in der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die vorliegende Erfindung sorgt ebenfalls für multimere Proteine bzw. für die die monomeren Teile davon codierenden DNA-Sequenzen, die passend gestaltete, zusätzliche Cysteine als Teil der Multimerisierungsmittel oder des (der) Linker(s) enthalten, um eine intermolekulare kovalente Bindung an zusätzliche funktionelle Domänen zu erlauben, die separat in vivo oder in vitro hergestellt und zum Beispiel über Oxidation eines freien Cysteins, was zu einer kovalenten Disulfidbrücke führt, an das multimere Protein gekoppelt werden.
Die vorliegende Erfindung sorgt ebenfalls für Multimerisierungsmittel, die von Bibliotheken zufälliger DNA-Sequenzen stammen ( EP 95 11 3021.0-2110 und EP-A 0 614 989). Solche teilweise oder vollständig zufälligen DNA-Sequenzen können zum Beispiel mit einem Teil des Gens III (gIII) eines filamentösen Phagen in einem geeigneten Phagemid fusioniert werden. Nach der Transformation des Phagemids in E. coli können gIII-Proteine als Fusion mit einem Peptid, das durch einen Bestandteil der Bibliothek codiert wird, hergestellt werden. Nach der Infektion mit einem Helferphagen werden neue Phagen produziert, die das relevante Peptid darbieten und das das gezeigte Peptid codierende Phagemid tragen. Neue Multimerisierungsmittel können durch die Interaktion des dargebotenen Peptides mit einem Zielpeptid identifiziert werden, das zum Beispiel auf einer festen Oberfläche immobilisiert oder mit einem Infektion vermittelnden Teilchen („IMP") fusioniert wurde.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Gegenstand dieser Erfindung ist eine Familie multimerer Proteine, die zwei oder mehr funktionelle Domänen vereinigen. Die multifunktionellen Proteine der vorliegenden Erfindung basieren auf kleinen, vorzugsweise peptidischen Multimerisierungsmitteln, welche mindestens trimerisieren und welche N- und C-terminal mit funktionellen Domänen fusioniert sein können, um neuartige multimere und multifunktionelle Polypeptidkomplexe zu bilden. Die Erfindung stellt ebenfalls DNA-Sequenzen, Vektoren, die die multifunktionellen Proteine codieren, ebenso wie Verfahren für ihre Produktion in vitro und in vivo bereit. Die Erfindung betrifft weiterhin Genkassetten ebenso wie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Protein enthalten.
Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen bereit, die codieren:

(i) eine erste funktionelle Domäne,
(ii) eine erste Linkersequenz,
(iii) ein Multimerisierungsmittel mit einer Länge von vorzugsweise 30–80 und nicht mehr als 110 Aminosäuren, das sich bis zu einem Trimer oder einem Oligomer höherer Ordnung zusammenbauen kann und das vorzugsweise von menschlicher Zusammensetzung ist,
(iv) eine zweite Linkersequenz und
(v) eine zweite funktionelle Domäne.

In diesem Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „funktionelle Domäne" ein Oligo- oder Polypeptid, das eine oder mehr Funktionen hat wie die Bindung an eine definierte Zielsequenz, das Katalysieren der Reaktion eines definierten Substrates, die Hemmung der Aktivität eines Enzyms, die Bindung an oder das Blockieren einer Rezeptorbindungsstelle oder die Bindung an ein Metallion.
Die vorstehend erwähnten Bestandteile (i) bis (v) sind vorzugsweise zusammenhängend und umfassen einen einzelnen offenen Leserahmen, was die kontrollierbare Expression eines einzelnen multifunktionellen Proteins von einem geeigneten Vektor erlaubt. Die Darstellung des Prinzips der Fusion einer solchen ein bifunktionelles, selbstassoziierendes Protein codierenden DNA-Sequenz ist in 1A gezeigt.
Der Ausdruck „Linkersequenz" ist im Fachgebiet gut bekannt. Der verwendete Linker ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Somit kann in einem Konstrukt ein und die gleiche oder unterschiedliche Sequenzen für die erste und die zweite Linkersequenz verwendet werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist die Verwendung eines peptidischen Multimerisierungsmittels, das auf einem modifizierten C-Terminus des menschlichen p53-Proteins basiert (Clore et al., 1994, Science 265, 386–391; Sakamoto et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8974–8978; Soussi et al., 1990, Oncogene 5, 945–952).
Das Genprodukt des menschlichen p53-Tumorsuppressorgens (Hollstein et al., 1991, Science 253, 49–53) enthält einzelne modulare Sequenzen für trans-Aktivierung (Unger et al., 1992, EMBO J. 11, 1383–1386), DNA-Bindung (Erlandson und Verdine, 1994, Chemistry & Biology 1, 79–84) und Tetramerisierung (Clore et al., 1994, Science 265, 386–391; Sakamoto et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8974–8978). Die für die Tetramerisierung verantwortliche Sequenz von p53 (Reste 319–360; 2) kann in E. coli getrennt exprimiert werden (Studier et al., 1990, Methods Enzymol. 185, 60–64), was zu einem stabilen, symmetrischen 20 kD-Tetramer führt, das sowohl helikale, als auch beta-Strang-Sekundärstrukturen enthält (Jeffrey et al., 1995, Science 267, 1498–1502).
Das besonders bevorzugte p53 basierte Multimerisierungsmittel erlaubt überraschenderweise den Selbstzusammenbau zu einem tetrameren Komplex mit zwei unterschiedlichen an seine Enden fusionierten funktionellen Domänen (Beispiel 1–3), wobei jede der fusionierten funktionellen Domänen mehr als achtmal größer als das Mittel sein kann (Beispiel 2). Überraschenderweise und im Gegensatz zu dem, was Fachleute erwartet hätten, hat das auf menschlichem p53 basierende peptidische Multimerisierungsmittel in einigen Fällen die Sekretion, die unabhängige Faltung und die Funktion der über flexible Linker fusionierten Domänen nicht stark oder bedeutend beeinflusst, da die Eigenschaften beider funktioneller Domänen in dem direkt aus dem Zellextrakt isolierten tetrameren Komplex nachgewiesen werden können (Beispiel 1). Die geringe Größe und der menschliche Ursprung des p53 basierten peptidischen Multimerisierungsmittels ermöglicht eine deutlich verringerte Immunogenität in Menschen im Vergleich zu künstlichen oder nicht-menschlichen selbstassoziierenden Sequenzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das gebildete peptidische Multimerisierungsmittel den selbstassoziierenden modifizierten menschlichen Plättchenfaktor 4 (PF4; Zhang et al., 1994, Biochemistry 33, 8361–8366). PF4 (4) ist ein häufiges menschliches Serumprotein mit einer Länge von 101 Resten, das von Plättchen sekretiert wird. Es kann heterolog in E. coli exprimiert werden und baut sich selbst zu Tetrameren mit antiparallelen beta-Faltblatt-ähnlichen Strukturen zusammen (Zhang et al., 1994, Biochemistry 33, 8361–8366).
Das extrazelluläre menschliche Protein TSP4, das die Basis einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung bildet, ist ein Mitglied der Thrombospondinfamilie, das die Anheftung einer Vielzahl von Zellen moduliert (Lawler et al., 1993, J. Cell. Biol. 120, 1059–1067). Die Reste 209 bis 273 des menschlichen TSP4 (21) zeigen einen hohen Grad an Homologie zu den Resten 20 bis 83 des oligomeren Knorpelproteins (CMP oder CMOP). Dieser homologe Bereich ist verantwortlich für die Pentamerisierung von COMP und TSP4 (Efimov et al., 1994, FEBS Letters 341, 54–58; Jenkins et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 19624–19631). Die Pentamerisierung von funktionellen Domänen kann entsprechend den Beispielen 1 und 2 durch die C- oder N-terminale Fusion mit einem TSP4 basierten peptidischen Multimerisierungsmittel erreicht werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform stammt das Multimerisierungsmittel aus einer Zufalls-DNA-Bibliothek in einem geeigneten Wirt, aus der DNA-Mitglieder durch ihre Fähigkeit, multimerisierende Peptide zu codieren, identifiziert werden. Mittel und Verfahren für eine solche Identifizierung sind Fachleuten gut bekannt; vgl. z. B. EP 95 11 3021.0 oder EP-A 0 614 989, welche hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Die vorliegende Erfindung sorgt ebenfalls für Proteine, vorzugsweise Fusionsproteine, multimere Proteine, die z. B. aus solchen Fusionsproteinen bestehen, ebenso wie für Verfahren zur Produktion der erfindungsgemäßen multimeren Proteine. Ein solches Verfahren betrifft die Produktion eines Proteins umfassend:

a) eine erste funktionelle Domäne,
b) eine erste Linkersequenz,
c) ein vorzugsweise peptidisches Multimerisierungsmittel mit einer Länge von nicht mehr als 110 und vorzugsweise 30–80 Aminosäureresten, das zum Selbstzusammenbau zu einem Trimer oder einem Oligomer höherer Ordnung befähigt ist und das vorherrschend menschlicher Zusammensetzung ist,
d) eine zweite Linkersequenz und
e) eine zweite funktionelle Domäne,

i) rekombinant hergestellt wird und, wenn alle von a) bis e) rekombinant hergestellt werden, mindestens zwei der Bestandteile von unterschiedlichen Wirtszellen hergestellt werden; und/oder
ii) synthetisch hergestellt wird; und/oder
iii) halbsynthetisch hergestellt wird; und/oder
iv) durch in vitro-Translation hergestellt wird; und

Für therapeutische Zwecke ist es oft wünschenswert, dass proteinhaltige Substanzen die geringst mögliche Immunogenität zeigen. Dementsprechend sorgt die vorliegende Erfindung, wie vorstehend beschrieben, für multimere Polypeptide, in denen mindestens eine der Aminosäuresequenzen, funktionellen Domänen oder weiteren (Poly-)Peptide menschlichen Ursprungs ist. Zum Beispiel wird erwartet, dass der extrazelluläre Ursprung des auf Teilen des menschlichen PF4 oder COMP basierenden peptidischen Multimerisierungsmittels für eine niedrige Immunogenität in Menschen sorgt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das peptidische Multimerisierungsmittel Teile der TATA-Boxbindeprotein assoziierten Faktoren (TAFIIs), vorzugsweise menschlichen Ursprungs. dTAFII42 und dTAFII62 von Drosophila können heterotetramere Komplexe bilden, die dem (H3/H4)₂-heterotetrameren Kern des Hühnerhiston-Octamers ähneln (Xie et al., 1996, Nature 380, 316–322). Die menschlichen Homologe von dTAFII42 und dTAFII62 sind hTAFII31 (Hisatake et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8195–8199) und hTAFII80 (Hisatake et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8195–8199; Weinzierl et al., 1993, EMBO J. 12, 5303–5309). Die Reste 13–87 des menschlichen hTAFII31 und die Reste 10 bis 82 des menschlichen hTAFII80 können als erfindungsgemäßes Heterotetramerisierungsmittel verwendet werden. Für identische hTAFII-Proteine kann eine unterschiedliche Nomenklatur existieren, hTAFII80 ist zum Beispiel auch bekannt als hTAFII70 (Hisatake et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8195–8199).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das peptidische Multimerisierungsmittel Teile der Histon H3- und H4-Proteine, vorzugsweise die Reste 67 bis 134 des menschlichen Histons 3 (H3) und die Reste 29 bis 95 des menschlichen Histons 4 (H4) (12a, b). Die menschlichen H3 und H4 sind in hohem Maße homolog zu H3 und H4 von Huhn, welche dem strukturell ähnlichen dTAFII42/dTAFII62-Heterotetramer ähneln (Xie et al., 1996, Nature 380, 316–322).
Um ausreichenden Abstand und Flexibilität zwischen dem peptidischen Multimerisierungsmittel und den fusionierten funktionellen Domänen zu schaffen, wird das peptidische Multimerisierungsmittel über vorzugsweise hydrophile, vorzugsweise flexible, aber Protease-resistente Polypeptidlinker mit den funktionellen Domänen verknüpft. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfassen einer oder beide Linker Proteasestabile Interdomänenlinker von menschlichen Proteinen (Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943–958), welche ausreichend Flexibilität und Hydrophilie bereitstellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Linkersequenz reich an den Aminosäuren Serin, Threonin, Glycin und Prolin, welche eine geweitete Struktur, Rotationsfreiheit, Hydrophilie ebenso wie Stabilität gegen Proteasen bereitstellen (Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943–958). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Linker die Gelenksequenz eines menschlichen Antikörpers, im Besonderen die von dem oberen Gelenkbereich des menschlichen IgG3-Antikörpers stammende TPLGTTTHT-Sequenz (4). In diesem Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck Antikörpergelenksequenz ein Oligopeptid, das CH1- und CH2-Domänen verbindet und verantwortlich ist für die Flexibilität, Rotationsfreiheit und die große Reichweite des Fab-Arms, um gleichzeitig entfernte Antigene zu binden (Dangl et al., 1988, EMBO J. 7, 1989–1994).
Die vorliegende Erfindung sorgt für viele verschiedene Arten von zu multimerisierenden funktionellen Domänen. Sie können also

a) an eine definierte Zielsubstanz binden oder
b) die Umsetzung eines definierten Substrates katalysieren oder
c) die Wirkung eines Enzyms hemmen oder
d) eine Rezeptorbindungsstelle binden oder blockieren oder
e) an ein Metallion binden.

Ebenfalls bevorzugt sind Fälle, in denen die Sequenzen von mindestens einer der mit dem Multimerisierungsmittel fusionierten C- oder N-terminalen funktionellen Domänen zumindest einen Teil eines Mitglieds der Immunglobulin-Superfamilie umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die funktionelle Domäne ein Antikörper-scFv-Fragment. Dieser erfindungsgemäße Aspekt stellt multivalente Antikörper-ähnliche Moleküle bereit, was von Nutzen sein kann, wenn eine gleichzeitige multivalente Interaktion mit dem Antigen die Voraussetzung für die Erkennung und die stabile Bindung an das spezifische Antigen ist. Dies ist zum Beispiel bei Kohlenhydrat-Antigenen auf einer Zelloberfläche der Fall, denen gegenüber einzelne Antikörperbindungsstellen eine schwache Affinität zeigen.
Ebenfalls bevorzugt sind Fälle, in denen eine oder mehrere mit dem peptidischen Multimerisierungsmittel fusionierte funktionelle Domänen eine andere biologische Aktivität besitzen als die eines Mitgliedes der Immunglobulin-Superfamilie. Als Beispiel sorgt die vorliegende Erfindung für die zielgerichtete Multimerisierung von Enzymen, Toxinen, Cytokinen, Kinasen, Phosphatasen, Lektinen, Peptidhormonen, Zelladhäsionsproteinen wie Integrinen, Metall bindenden Domänen, Peptidimpfstoffen, bioaktiven Peptiden oder löslichen Zelloberflächenproteinen wie die CD-Moleküle von Leukocyten oder Teilen davon in einem multimeren Komplex.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung betrifft Konstrukte, in denen die funktionellen Domänen bioaktive Peptide sind. Bestimmte von amphipathischen Schleifenstrukturen von LPS bindenden Proteinen stammende Peptide (Hoess et al., 1993, EMBO J. 12, 3351–3356) können Endotoxin neutralisieren. LPS kommt oft in multimeren Formen vor und es ist daher wünschenswert, Zugang zu multivalenten Formen von kurzen (10–15 Reste) LPS bindenden Peptiden zu haben, um eine wirksame Bindung und Neutralisierung von Endotoxin sicherzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um einige mit dem Multimerisierungsmittel fusionierte, kurze Peptide (16) zu exprimieren und zu multimerisieren. Die Peptide können über Peptidlinker entweder mit dem N- oder mit dem C-Terminus (17, 18) der Zusammensetzungsdomäne fusioniert werden. Eine Fusion mit beiden Enden z. B. eines p53 basierten Multimerisierungsmittels führt zu einem sich selbst zusammenbauenden octavalenten Komplex bioaktiver Peptide. In einer anderen Ausführungsform kann eine Kombination mit anderen funktionellen Domänen durch ihre Fusion mit dem gegenüber liegenden Terminus des peptidischen Multimerisierungsmittels erreicht werden, was in einem sich selbst zusammenbauenden Komplex resultiert, der vier bioaktive Peptide und vier weitere funktionelle Domänen darbietet.
Die Erfindung ermöglicht die Konstruktion von komplexen multimeren und multifunktionellen Polypeptiden. Als Beispiel kann die zweite mit dem peptidischen Multimerisierungsmittel fusionierte funktionelle Domäne aus der Liste der Cytokine, Toxine, Enzyme, Kinasen, Phosphatasen, Lektine, Peptidhormone, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Metall bindenden Domänen, Reinigungsvorrichtungen, im besonderen Peptide, die an eine unabhängige Bindungseinheit binden können, Peptidimpfstoffe, bioaktiven Peptide, vorzugsweise mit einer Länge von 5 bis 15 Aminosäurereste, löslichen Zelloberflächenproteine wie die CD-Moleküle von Leukocyten, DNA bindenden Domänen, Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren oder Teile davon ausgewählt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist die Verwendung von Decorsin als funktionelle Domäne. Decorsin ist ein Protein von 39 Resten aus dem Blutegel Macrobdella decora (13). Es wirkt als ein starker Antagonist des Plättchen-Glycoproteins IIb–IIIa (Seymour et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 10143–10147). Gemäß Beispiel 2 kann das Decorsin C- oder N-terminal mit dem peptidischen Multimerisierungsmittel fusioniert (3, 11, 12, 20, 22) und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden. Bei arteriellen thrombotischen Erkrankungen kann der translatierte sich selbst zusammenbauende multivalente Decorsin-Komplex als starkes antithrombotisches Mittel wirken. Gegebenenfalls kann die N-terminale Fusion des anti-Fibrin-Antikörperfragmentes mit einem peptidischen Multimerisierungsmittel, das ein C-terminal fusioniertes Decorsin trägt, zu einem Lenken des multimeren Komplexes zu Blutgerinnsel führen.
Die vorliegende Erfindung sorgt für ein standardisiertes System von Genkassetten, die funktionelle Domänen, Linker und peptidische Multimerisierungsmittel codieren. Modulare Genkassetten können auf einfache Weise über einmalige Restriktionsenzyme zu einem Cistron vereinigt werden (1A). Das Cistron codiert ein sich selbst zusammenbauendes Protein, in dem jede monomere Untereinheit aus einer optionalen Signalsequenz für die Sekretion, einer ersten funktionellen Domäne, einer ersten Linkersequenz, einer Zusammensetzungssequenz mit einer Länge von 30–110 Aminosäuren, einer zweiten Linkersequenz und einer zweiten funktionellen Domäne besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Genkassetten als Cistron direkt in Standard-Expressionsvektoren cloniert, was die Replikation unter einem regulierbaren Promotor, die Translation und gegebenenfalls die Sekretion des Cistron codierten Proteins ermöglicht. Wirtszellen, die mit mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen Vektorkassette transfomiert wurden, können für die Herstellung des multimeren Polypeptides verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Säuger-, vorzugsweise eine menschliche, eine Hefe-, eine Pflanzen- oder eine bakterielle, vorzugsweise eine E. coli-Zelle.
Die Erfindung sorgt weiterhin für Verfahren zur Produktion des multifunktionellen Proteins, wobei die Verfahren das Züchten einer erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten Medium und die Gewinnung des durch die Wirtszelle produzierten multimeren Polypeptides umfassen.
Die Erfindung sorgt weiterhin für Verfahren für die separate Produktion von Teilen des multimeren Proteins wie von der peptidischen Multimerisierungsdomäne oder/und von einer oder von beiden funktionellen Domänen und von multimeren Proteinen und von durch das Verfahren produzierten Monomeren davon, wobei die Verfahren mindestens eines aus der Liste Peptidsynthese, in vitro-Translation, Expression in anderen Wirten als denen, in denen der restliche Teil des multimeren Proteins produziert wird (z. B. durch Art-, Zell-, ionische oder Stamm-Unterschiede), und Zurückfaltung mit chemischer Kopplung, z. B. nachfolgend oder enzymatisch, an den separat produzierten restlichen Teil des funktionellen Proteins, um zu einem Polypeptid zu kommen, dass sich zu einem erfindungsgemäßen multimeren Protein zusammenbaut.
Die Erfindung sorgt weiterhin für die Einführung von in geeigneter Weise plazierten zusätzlichen Cysteinen, um eine kovalente intermolekulare Bindung des Multimerisierungsmittels während oder nach dem Selbstzusammenbau zu erlauben.
Die Erfindung sorgt weiterhin für die Einführung von in geeigneter Weise platzierten zusätzlichen Cysteinen, um die Bindung weiterer funktioneller Domänen zum Beispiel durch die Oxidierung zu intermolekularen Disulfidbrücken zu erlauben.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sorgt die vorliegende Erfindung für Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehend beschriebenen multimeren Polypeptide umfassen, und Arzneimittel, die möglicherweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Letztlich sorgt die Erfindung für einen Kit, der eine oder mehrere Vektorkassetten, die bei der Herstellung der multimeren Polypeptide von Nutzen sind, umfasst.
Die Erfindung wird nun durch den Bezug auf die folgenden Beispiele dargestellt, welche nur zum Zweck der Darstellung bereitgestellt werden und den Rahmen der Erfindung nicht beschränken sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Erzeugung eines tetrameren Komplexes, der vier Kopien anti-Le^Y-scFv-Antikörperfragmente und vier Kopien einer Metall bindenden Domäne durch die Fusion der zwei unterschiedlichen funktionellen Domänen über flexible Linker mit den 5'- und 3'-Termini eines kleinen, auf dem menschlichen p53 basierenden Tetramerisierungsmittels enthält.
Das peptidische Multimerisierungsmittel dieses Beispiels basiert auf einem modifizierten C-Terminus des menschlichen p53 (Soussi et al., 1990, Oncogene 5, 945–952; Clore et al., 1994, Science 265, 386–391; 2). Eine durch rekursive PCR (Prodromou und Pearl, 1992, Protein Eng. 5, 827–829) synthetisierte Genkassette (3) codiert die Reste 319–360 des menschlichen p53, flankiert durch ein SG-Peptid, das eine im Leserahmen befindliche, einmalige 5'-Restriktionsstelle (MroI) einführt, und einen kurzen C-terminalen GGSGGAP-Linker, der eine im Leserahmen befindliche AscI-Restriktionsstelle am 3'-Terminus der Genkassette, die das peptidische Multimerisierungsmittel codiert, einführt. Die synthetische modulare MroI-AscI-Genkassette wird 5'-seitig an eine EcoRI-MroI-Kassette, die das obere Gelenk des menschlichen IgG3 codiert, ligiert (Dangl et al., 1988, EMBO J. 7, 1989–1994; 4). Das Ligierungsprodukt, eine das Tetramerisierungsmittel codierende EcoRI-HindIII-Genkassette, kann für 5'-(N-terminal) ebenso wie für 3'-(C-terminal) Fusionen mit Genen verwendet werden, die rekombinante Proteine oder funktionelle Domänen wie Cytokine, Toxine, Immunglobuline, Enzyme, Kinasen, Phosphatasen, Lektine, Peptidhormone, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Metall bindende Domänen, Reinigungsvorrichtungen, im besonderen Peptide, die an eine unabhängige Bindungseinheit binden können, Peptidimpfstoffe, bioaktive Peptide, vorzugsweise mit einer Länge von 5 bis 15 Aminosäurereste, lösliche Zelloberflächenproteine wie die CD-Moleküle von Leukocyten, DNA bindende Domänen, Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren (vgl. weitere Beispiele) codieren.
Ein Cistron des Fusionsproteins dieses Beispiels wird durch die Ligierung der folgenden modularen Genkassetten (5' -> 3') an ein Cistron unter einem lac-Promotor/Operator-System in einem geeignetem E. coli-Expressionsplasmid konstruiert (6a; Ge et al., 1995, Antibody Engineering 2. Ausgabe, C. A. K. Borrebaeck, Hrsg. Oxford University Press, S. 229–266; Glockshuber et al., 1990, Biochemistry 29, 1362–1367; Skerra et al., 1991, Bio/Technology 9, 273–278):

– eine XbaI-EcoRV-Kassette, die eine ompA-Signalsequenz codiert
– eine EcoRV-EcoRI-Kassette, die ein LeY-Kohlenhydrat bindendes scFv-Antikörperfragment codiert
– eine EcoRI-MroI-Genkassette, die ein flexibles oberes Gelenk des menschlichen IgG3 codiert (4)
– eine MroI-AscI-Kassette, die ein von menschlichen IgG3-Resten von menschlichem p53 stammendes peptidisches Multimerisierungsmittel und einen flexiblen GGSGGAP-Linker codiert, der die im Leserahmen befindliche AscI-Stelle einführt (3)
– eine AscI-HindIII-Genkassette, die für Reinigungszwecke eine funktionelle Domäne codiert, die Metallionen komplexiert.

Die EcoRV-EcoRI-Kassette, die das LeY-Kohlenhydrat bindende scFv-Antikörperfragment MSL-5 codiert, wurde durch eine PCR-Amplifikation der cDNA einer V-Region eines Hybridoms konstruiert (Bradbury et al., 1995, Antibody Engineering 2. Ausgabe, C. A. K. Borrebaeck, Hrsg. Oxford University Press, S. 295–361), das anti-LeY-Antikörper sekretiert. Geeignete PCR-Primer wurden verwendet, um die EcoRV- und EcoRI-Restriktionsstellen einzuführen und das scFv-Fragment mit einem 15 Reste (Gly₄Ser)₃-Interdomänenlinker in einer VL zu VH-Polarität zu verbinden (Ge et al., 1995, Antibody Engineering 2. Ausgabe; C. A. K. Borrebaeck, Hrsg. Oxford University Press, S. 229–266).
Nach der Transformation des exprimierten Plasmids in einen JM83-Stamm von E. coli und der Induktion des lac-Promotors mit IPTG bei Raumtemperatur in Schüttelkulturen wird das translatierte Fusionsprotein (MSLS-P53-His) in das Periplasma sekretiert und setzt sich zu einem tetrameren Protein dieser Erfindung mit vier scFv-Fragmenten und vier Metall bindenden Domänen in einem Komplex („Vielfachkörperchen") zusammen. Zusätzlich zu Anwendungen wie dem Einbau von radioaktiven Metallionen in einen tetravalenten anti-Tumor-Komplex, kann die Metall bindende Funktion der C-terminalen Domäne auch für Reinigungszwecke verwendet werden. Der Komplex wir zum Beispiel durch immobilisierte Metallionenchromatographie IMAC isoliert (Lindner et al., 1992, Methods: a companion to Methods in Enzymology 4, 41–56; 5). Die Metall bindende Eigenschaft des tetrameren Komplexes wird durch den Erfolg der Reinigungsprozedur demonstriert.
Das peptidische Multimerisierungsmittel ist mit der Sekretion und Faltung des anti- Le^Y bindenden scFv-Fragments kompatibel, sodass keine Reduktion der funktionellen Ausbeute (im Vergleich zu dem monovalenten scFv) zu beobachten ist. Unerwarteterweise zeigte das tetramere und somit tetravalente Fusionsprotein in diesem Beispiel im Vergleich zu dem monomeren scFv ein verbessertes Expressionsverhalten, was wahrscheinlich auf einer verringerten Toxizität beruht.
Die Tetramerisierung des bifunktionellen Fusionsproteins zu einem stabilen Komplex wird durch Größenausschluss bei einer Konzentration von 0,5 mikromolar gezeigt (6B).
Die Charakterisierung der Bindungskinetik zu einer Le^Y beschichteten Biosensoroberfläche wurde durch Oberflächen-Plasmonresonanz auf einem BIAcore durchgeführt (Pharmacia; Pack et al., 1995, J. Mol. Biol. 246, 28–34). Alle Messungen wurden in HBS-Puffer (Pharmacia) mit einer Fliessgeschwindigkeit von 5 μl/min bei 25°C unter der Verwendung einer CMS-Sensorzelle einer Biosensormaschine (BIAcore, Pharmacia) durchgeführt. LeY-BSA wurde auf der Dextran-Matrix eines CMS-Sensorchips unter der Verwendung des Standard-Aminimmobilisierungsverfahrens kovalent immobilisiert. Nach der Aktivierung der Chipoberfläche mit 50 mM N-Hydroxysuccinimid und 200 mM N-(Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbadiimid wurde eine LeY-BSA-Stammlösung (155 μg/ml) in PBS mit dem gleichen Volumen Natriumacetat (1 M, pH 3,0) verdünnt und zwei Mal injiziert, um eine Oberfläche mit hoher Dichte (7000 RU) von immobilisiertem LeY-BSA zu erhalten. Für die Analyse des MSLS-Proteins wurden 20 μl jeder Probe in verschiedenen Konzentrationen injiziert (IgM: 0,3–14 nM; scFv: 0,37–3,75 μM; dimerer Mini-Antikörper: 0,12–2,4 μM und multimeres MSLS-p53-His: 0,08–1,07 μM). Die Dissoziation wurde durch die Injektion des HBS-Puffers induziert. Nach jeder Messung wurde die Chipoberfläche mit 10 μl 2 M Guanidinium-HCl, verdünnt mit dem gleichen Volumen HBS-Puffer, regeneriert.
Die Überlagerungszeichnung der Dissoziationskurven (6c) lässt die zweite Funktion des tetrameren Komplexes erkennen, nämlich die Bindung an ein spezifisches Ziel, und verdeutlicht den Zugewinn an Avidität (funktionelle Affinität) durch die Tetramerisierung des scFv-Antikörperfragmentes. Im Vergleich zu einem monovalenten scFv-Fragment und zu dem dimeren Konstrukt scdHLX (PCT/EP93/00082) zeigt das tetramere und somit tetravalente Protein dieser Erfindung (MSLS-p53-His oder „Vielfachkörperchen") eine deutliche Verbesserung der Bindungsaffinität zu einer mit Le^Y-Antigenen bedeckten Oberfläche. Dieser Zugewinn an Avidität kann deutlich an der Verlängerung der Dissoziationsgeschwindigkeit von Millisekunden (scFv) zu einigen Minuten (MSLS-P53-His, 6C) gesehen werden.
Das modulare System von Genkassetten, die die verschiedenen Assoziationsdomänen codieren, erlaubt die einfache Erzeugung von multivalenten und bifunktionellen Proteinen mit definierter Valenz und sterischen Eigenschaften. Das multimere Protein aus Beispiel 1 mit vier Immunglobulin-Bindungsstellen kann die ideale Konstruktion für Anwendungen sein, bei denen eine schnelle Exkretion und eine schwache funktionelle Affinität eines monovalenten Fragmentes nicht zu einer bedeutsamen, lang andauernden Anreicherung am Ziel führt.
Außerdem wird die Abhängigkeit der Avidität (oder „funktionellen Affinität") von der tatsächlichen Antigendichte (Pack et al., J. Molecular Biology 246, 28–34) eine Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Geweben mit unterschiedlichen Antigendichten erlauben. LeY wird in hohen Dichten auf Dickdarm- und Brustkrebszellen gefunden, aber in niedrigen Dichten auf einer Vielzahl normaler Zellen (Sakamoto et al., 1986, Cancer Res. 46, 1553–1559). Da Antikörper oder Immuntoxine mit höherer intrinsischer Affinität gegenüber LeY und verwandten Antigenen auch an Zelloberflächen mit niedriger Antigendichte binden, wird eine signifikante Bindung an normale Gewebe beobachtet (Trail et al., 1993, Science 261, 212–215). Im Prinzip sind erfindungsgemäße Proteine mit hoher Avidität (durch die Vielzahl der Bindungsereignisse pro Molekül an eine ausreichende Antigendichte), aber vergleichsweise niedrigen intrinsischen Affinitäten (Affinität pro monovalente Interaktion, die auch an niedrigen Dichten stattfinden) nicht in der Lage, an Zellen mit niedrigen Dichten zu binden. Daher werden sie ein selektiveres Ansteuern von Zellen mit überexprimiertem Antigen, die multivalentes Binden begünstigen, zur Folge haben und werden keine unerwünschten Nebeneffekte durch die Bindung an normale Zellen mit niedriger Antigendichte verursachen.
Beispiel 2
Erzeugung eines tetrameren Komplexes, der vier Kopien anti-Phosphocholin-scFv-Antikörperfragmente und vier Kopien eines menschlichen IL2 durch die Fusion der zwei unterschiedlichen funktionellen Domänen über flexible Linker mit den Termini eines auf dem menschlichen p53 basierenden Tetramerisierungsmittels enthält.
Beispiel 1 entsprechend wird ein multimeres Fusionsprotein durch ein Cistron codiert, das modulare Genkassetten umfasst, die eine Signalsequenz, ein scFv-Antikörperfragment als N-terminale funktionelle Domäne, einen ersten auf dem menschlichen IgG3-Gelenk basierenden flexiblen Linker, eine auf dem menschlichen p53 basierende Tetramerisierungsdomäne, einen zweiten Linker und menschliches IL2 als C-terminale funktionelle Domäne codieren (8, 9).
Nach der Translation und Sekretion in einem geeigneten Wirt gemäß Beispiel 1 wird das multimere Protein H11-p53-huIL2 durch die Fähigkeit seiner N-terminalen funktionellen Domäne, spezifisch an das Antigen Phosphocholin auf einer Affinitätssäule zu binden, gereinigt (Glockshuber et al., 1990, Biochemistry 29, 1362–1367). Nach diesem Reinigungsschritt wurde die Funktion seiner C-terminalen Domäne, des menschlichen IL2, in einem Proliferationstest von cytotoxischen T-Lymphocyten (CTLL-A) getestet.
3 × 10⁶ gezüchtete CTLL-A-Zellen, die nur in der Gegenwart von funktionellem IL2 wachsen können, werden intensiv mit IL2-freiem Phosphatpuffer (20 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, pH 7,4) mit 2,5% FCS gewaschen, zentrifugiert und in IL2-freiem Standardmedium mit 10% FCS resuspendiert. Aliquots von ungefähr 1,5 × 10⁴ Zellen in einem Volumen von 50 Mikroliter werden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen pipettiert. Ansteigende Mengen von rekombinantem menschlichem IL2 für die Eichung (0,5–40 U, Sigma) und eine Verdünnungsreihe des Phosphocholinaffinitätsgereinigten H11-p53-huIL2-Proteins (10 ng–150 ng) wurden in Duplikaten für jede Konzentration gemeinsam inkubiert. Nach 24 Stunden bei 37°C wird die Aktivität der aktiven mitochondriellen Dehydrogenase (als Anzeige für die Anzahl der lebenden Zellen) entsprechend Mossmann mit MTT bestimmt (1983, J. Immunological Methods 65, 55–57). Die IL2-Aktivität der C-terminalen funktionellen Domäne des multimeren Proteins (9) wird unter der Verwendung der Eichkurve berechnet.
Die Proliferation der CTLL-A-Zellen in der Anwesenheit des multimeren Proteins, das mit Hilfe des anti-Phosphocholin-scFv als der N-terminalen funktionellen Domäne gereinigt wurde, demonstrierte deutlich die Aktivität des huIL2 als die C-terminale funktionelle Domäne.
Das überraschende Ergebnis, dass die zentrale Multimerisierungsdomäne eine unabhängige natürliche Faltung der einzelnen Domänen mit einem nachfolgenden Selbstzusammenbau erlaubt, verdeutlicht das Potential dieser Erfindung.
Der zentrale Teil (-Linker1-Mittel-Linker2-) des multimeren Proteins dient, abgesehen von seiner Multimerisierungsfunktion, als sehr langer und Protease-stabiler „Spacer", was eine unabhängige Faltung der deutlich (bis zu sechsmal) größeren fusionierten Domänen zulässt. Ein herkömmlicher, extrem langer Linker mit der gleichen Länge wie der zentrale Teil (-Linker1-Mittel-Linker2-), aber ohne dessen Sekundärstruktur ist wahrscheinlich sehr viel sensitiver gegenüber Proteasen, wie es für unstrukturierte Peptide typisch ist, die für die katalytische Tasche der Proteasen gut zugänglich sind (Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943–958).
Beispiel 3
Bildung eines tetrameren und bifunktionellen Komplexes, der vier Kopien von anti-ESL-1-scFv-Antikörperfragmenten und vier Kopien eines Nachweis-Markers, der zusätzlich als Metall bindende Domäne verwendet wird, durch die Fusion der zwei unterschiedlichen funktionellen Domänen über flexible Linker mit den Termini eines kleinen, auf dem menschlichen p53 basierenden Tetramerisierungsmittels enthält.
Das Multimerisierungsmittel dieses Beispiels ist in Beispiel 1 beschrieben.
Ein Cistron dieses Fusionsproteins wird durch die Ligierung der folgenden modularen Genkassetten (5' -> 3') an ein Cistron unter einem lac-Promotor/Operator-System in einem E. coli-Expressionsplasmid gemäß Beispiel 1 konstruiert:

– eine XbaI-EcoRV-Kassette, die eine ompA-Signalsequenz codiert
– eine EcoRV-EcoRI-Kassette, die ESL-1 bindende scFv-Antikörperfragmente codiert
– eine EcoRI-MroI-AscI-Genkassette, die ein flexibles oberes Gelenk des menschlichen IgG3 codiert (4)
– eine MroI-AscI-Kassette, die ein von menschlichen IgG3-Resten von menschlichem p53 stammendes Multimerisierungsmittel und einen flexiblen GGSGGAP-Linker codiert, der die im Leserahmen befindliche AscI-Stelle einführt (3)
– eine AscI-HindIII-Genkassette, die für Reinigungszwecke eine funktionelle Domäne codiert, die Metallionen komplexiert, und zum Zwecke des Nachweises spezifisch durch einen Antikörper erkannt wird (5).

Die ESL-1 bindenden scFv-Antikörper stammten von einer menschlichen kombinatorischen Antikörper-Bibliothek unter der Verwendung von Phagen-Display. Nach drei Runden des Panning-Verfahrens wurden 12 Clone mit unterschiedlicher Sequenz der schweren Kette von CDR3 ausgewählt und über XbaI und EcoRI in einen geeigneten Expressionsvektor cloniert (6a). Die Konstruktion der menschlichen kombinatorischen Antikörper-Bibliothek und das Panning der ESL-1 bindenden Antikörper sind in den EP-Anmeldung 9511 3021.0-2110 „Protein libraries" beschrieben, deren Lehren hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen werden. Nach der Transformation des Expressionsplasmides in den E. coli-Stamm JM83 und der Induktion des lac-Promotors durch IPTG in Schüttelkulturen für 4 Stunden bei 30°C wurden die translatierten Fusionsproteine als selbstassoziierende Tetramere (scFv-Linker1-Mittel-Linker2-Reinigungsdomäne) ohne die Notwendigkeit einer Zurückfaltung oder einer chemischen Quervernetzung in das Periplasma sekretiert. Für die Lyse wurden die Zellen (4 ml) durch Zentrifugation gewonnen, wieder in 800 μl PBS pH 7,4 gelöst und für 90 sec mit Ultraschall behandelt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde der Überstand für Western Blot-Analysen und Bindungsexperimente (ELISA) verwendet. Parallel dazu wurden herkömmliche monomere Fusionsproteine, die aus direkt mit der Reinigungsdomäne fusionierten scFvs bestehen, in entsprechender Weise hergestellt.
Zur Charakterisierung der Mengen an löslichem, sekretiertem Protein wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. 20 μl lysierter bakterieller Überstand wurde auf ein 12,5%-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach Ausführung des Blot-Verfahrens bei dem Gel wurde der Nitrocellulosefilter mit 3% Milchpulver blockiert. Zusätzlich zu der Verwendung der Metall bindenden Funktion der C-terminalen Domäne zu Zwecken der Reinigung wurde die C-terminale Domäne als Nachweis-Marker verwendet, der spezifisch durch einen anti-His-Antikörper erkannt wird (Dianova).
Es wird demonstriert, dass, ähnlich wie in dem Fall mit dem LeY bindenden Antikörper (Beispiel 1), das Multimerisierungsmittel zu der Sekretion und Faltung der anti-ESL-1 bindenden scFv-Fragmente kompatibel ist, sodass in diesem Beispiel keine signifikante Reduktion der funktionellen Ausbeuten zu sehen ist, wie nach den im Western Blot nachgewiesenen Mengen an löslichem Protein abgeschätzt.
Die Charakterisierung der Bindungsaktivität an Oberflächen-gebundenes ESL-1 zeigt die zweite Funktion des tetrameren Komplexes, nämlich die Bindung an ein spezifisches Ziel. In einem ELISA-Experiment wurde zum Beispiel über Nacht bei Raumtemperatur eine Mikrotiterplatte mit dem Antigen (ESL-1, 5 μg/ml) beschichtet. Nach einem Blockieren mit 3% Milchpulver wurde das Antigen für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 200 μl Zelllysat inkubiert, das entweder monomere oder tetramere, an den His-Nachweismarker fusionierte ESL-1 bindende Antikörperfragmente exprimiert. Nach dem Waschen mit PBS pH 7,4 (5 ×) wurde der Nachweis der ESL-1-Bindung geführt, indem mit einem ersten anti-His-Antikörper (Dianova) und einem zweiten mit alkalischer Phosphatase verknüpften und gegen den ersten Antikörper gerichteten Antikörper inkubiert wurde. Jede Messung wurde in Doppelbestimmungen durchgeführt (10).
Die Bindungsexperimente der ESL-1 bindenden Antikörperfragmente zeigen beide Funktionen des tetrameren Komplexes, nämlich die Bindung an ein spezifisches Ziel und den Nachweis des gebundenen Komplexes, und verdeutlicht den Zugewinn an Avidität durch die Tetramerisierung der N-terminalen funktionellen Domäne, nämlich des scFv-Fragment-Antikörperfragmentes. Im Vergleich zu einem monovalenten scFv-Fragment zeigen die erfindungsgemäßen tetravalenten und bifunktionellen Proteine (jedes vier Kopien von anti-ESL-1-scFv-Fragmenten enthaltend) eine signifikante Erhöhung messbarer Bindungsaktivität an eine mit ESL-1-Antigenen bedeckte Oberfläche von bis zu zehn- oder mehrfach (9D5, 9D11, 9D31). In einigen Fällen ist nur die Bindung des erfindungsgemäßen multimeren und bifunktionellen Komplexes nachweisbar (9D7, 9D9, 9D19), was auf der synergistischen Wirkung mehrfach vorhandener Bindungsstellen beruht (Aviditätseffekt).
Beispiel 4
Auf Teilen der menschlichen Histone H3 und H4 basierendes Heterotetramerisierungsmittel.
Ein synthetisches Gen, das die genetische Information für den für die Heterotetramerisierung verantwortlichen Teil der menschlichen Histone H3 (12a) und H4 (12b) enthält, wurde entsprechend der 3, 20 und 22 mit geeigneten Restriktionsstellen für die 5'- und 3'-Ligierungen konstruiert. Die H3- und H4 basierten Mittel können für die Heterotetramerisierung von multimeren Proteinen verwendet werden, die bis zu vier verschiedene funktionelle Domänen wie Cytokine, Toxine, Immunglobuline, Enzyme, Kinasen, Phosphatasen, Lektine, Peptidhormone, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Metall bindende Domänen, Reinigungsvorrichtungen, insbesondere Peptide, die an eine unabhängige Bindungseinheit binden können, Peptidimpfstoffe, bioaktive Peptide, vorzugsweise mit einer Länge von 5 bis 15 Aminosäureresten, lösliche Zelloberflächenproteine wie die CD-Moleküle von Leukocyten, DNA bindende Domänen, Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren enthalten. Die Heterotetramerisierung benötigt entweder die gleichzeitige Expression der zwei Fusionsproteine (Domäne1-Linker1-Mittel1 (z. B. H3)-Linker2-Mittel2 und Domäne3-Linker3-Mittel2 (z. B. H4)-Linker4-Mittel4) unter der Verwendung eines geeigneten dicistronischen Expressionssystems (Ge et al., 1995, Antibody Engineering 2. Ausgabe, C. A. K. Borrebaeck, Hrsg. Oxford University Press, S. 229–266) oder eine separate Expression mit anschließendem Vermischen und Zusammenbau in vitro. Anstelle der menschlichen Histone H3 und H4 kann das Heterotetramerisierungsmittel auf Sequenzen basieren, die von den menschlichen hTAF_II31 und hTAF_II80 stammen (11a, b).
Beispiel 5
Als funktionelle Domäne wird der Plättchenaggregations-Inhibitor Decorsin (13) entweder durch eine N-terminale EcoRV-EcoRI- (14) oder eine C-terminale AscI-HindIII-Genkassette (15) codiert und entsprechend der Beispiele 1, 2 und 3 über flexible Linker mit einem erfindungsgemäßen peptidischen Multimerisierungsmittel fusioniert.
Beispiel 6
Erzeugung von octavalenten anti-LPS-Peptiden (16) durch die Fusion mit einem auf dem menschlichen p53 basierenden Tetramerisierungsmittel.
Die bioaktiven Peptide können entsprechend der Beispiele 1, 2 und 3 über Peptidlinker als Genkassette mit geeigneten Restriktionsstellen entweder mit dem N-Terminus (17) oder mit dem C-Terminus (18) der Zusammensetzungs-Domäne fusioniert werden.
Beispiel 7
Auf dem menschlichen Serumprotein PF4 basierende Tetramerisierungsmittel.
Ein synthetisches Gen, das die genetische Information für PF4 (19) und geeignete Restriktionsstellen für die 5'- und 3'-Ligierungen enthält (20) kann entsprechend der Beispiele 1 bis 3 für die Tetramerisierung von multimeren Proteinen verwendet werden, die funktionelle Domänen wie Cytokine, Toxine, Immunglobuline, Enzyme, Kinasen, Phosphatasen, Lektine, Peptidhormone, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Metall bindende Domänen, Reinigungsvorrichtungen, insbesondere Peptide, die an eine unabhängige Bindungseinheit binden können, Peptidimpfstoffe, bioaktive Peptide, vorzugsweise mit einer Länge von 5 bis 15 Aminosäureresten, lösliche Zelloberflächenproteine wie die CD-Moleküle von Leukocyten, DNA bindende Domänen, Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren beinhalten.
Beispiel 8
Auf menschlichem TSP4 (21) basierendes Pentamerisierungsmittel, das entsprechend der Beispiele 1, 2 und 3 für die Pentamerisierung von multimeren Proteinen verwendet werden kann, die funktionelle Domänen wie Cytokine, Toxine, Immunglobuline, Enzyme, Kinasen, Phosphatasen, Lektine, Peptidhormone, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Metall bindende Domänen, Reinigungsvorrichtungen, insbesondere Peptide, die an eine unabhängige Bindungseinheit binden können, Peptidimpfstoffe, bioaktive Peptide, vorzugsweise mit einer Länge von 5 bis 15 Aminosäureresten, lösliche Zelloberflächenproteine wie die CD-Moleküle von Leukocyten, DNA bindende Domänen, Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren beinhalten.

Claims

DNA-Sequenz, codierend: (a) eine erste funktionelle Domäne, (b) eine erste Linkersequenz, (c) ein peptidisches Multimerisierungsmittel mit einer Länge von nicht mehr als 110 und vorzugsweise 30–80 Aminosäuren, das zum Selbstzusammenbau in ein Trimer oder ein Oligomer höherer Ordnung befähigt ist, und das von Säuger- und vorzugsweise von menschlicher Zusammensetzung ist, (d) eine zweite Linkersequenz, und (e) eine zweite funktionelle Domäne.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des menschlichen p53-Proteins umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, in der das peptidische Multimerisierungsmittel die Aminosäuren 319 bis 360 des menschlichen p53-Proteins umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des menschlichen PF4-Proteins umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des menschlichen TSP-4-Proteins umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des menschlichen COMP-Proteins umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des menschlichen Thrombospondins umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des hTAF_II31 umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil des hTAF_II80 umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil von Histon 3, vorzugsweise menschliches Histon 3, umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, in der das peptidische Multimerisierungsmittel zumindest einen Teil von Histon 4, vorzugsweise menschliches Histon 4, umfasst.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11, codierend für passend gestaltete, zusätzliche Cysteine als Teil des Multimerisierungsmittels, um eine intermolekulare kovalente Verknüpfung des Multimerisierungsmittels während oder nach dem Selbstzusammenbau zu erlauben.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 12, codierend für passend gestaltete, zusätzliche Cysteine als Teil des Multimerisierungsmittels oder der Verknüpfung(en), um eine intermolekulare kovalente Verknüpfung mit zusätzlichen funktionellen Domänen zu erlauben, die separat in vivo oder in vitro produziert werden und an das multimere Protein über Oxidation eines freien Cysteins gekoppelt werden, so dass eine kovalente Disulfidbrücke entsteht.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Verknüpfungssequenzen b) und d) die gleichen sind.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Verknüpfungssequenzen b) und d) unterschiedlich sind.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 15, in der die Linker von der menschlichen Interdomänenlinkersequenz sind.
DNA-Sequenz nach Anspruch 16, in der die menschliche Interdomänenlinkersequenz zumindest einen Teil einer menschlichen Antikörpergelenksequenz umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 17, in der die menschliche Interdomänenlinkersequenz zumindest einen Teil einer menschlichen IgG3-Gelenksequenz umfasst.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 18, in der eine oder beide der funktionellen Domänen entweder: a) an eine definierte Zielsubstanz binden, oder b) die Umsetzung eines definierten Substrates katalysieren, oder c) die Wirkung eines Enzyms hemmen, oder d) eine Rezeptorbindungsstelle binden oder blockieren, oder e) an ein Metallion binden.
DNA-Sequenz nach Anspruch 19, in der eine oder beide der funktionellen Domänen zumindest einen Teil eines Mitglieds der Immunglobulin-Superfamilie umfassen.
DNA-Sequenz nach Anspruch 20, in der eine oder beide der funktionellen Domänen ein Einzelketten-Fv-Fragment ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 20, in der eine oder beide der Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie an eine Kohlenhydrat-Zielsubstanz bindet.
DNA-Sequenz nach Anspruch 22, in der eine oder beide der Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie an Lewis-Y-verwandte Kohlenhydratstrukturen bindet.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Multimerisierungsmittel von einer randomisierten DNA-Bibliothek in einem geeigneten Wirt abgeleitet ist, aus der DNA-Mitglieder durch ihre Fähigkeit, multimerisierende Peptide zu codieren, identifiziert werden.
Vektor, vorzugsweise ein Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 24.
Vektor nach Anspruch 25, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die eine Signalsequenz für bakterielle Sekretion codiert, und eine zweite DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 24.
Wirtszelle, umfassend zumindest einen Vektor nach Anspruch 25 oder 26.
Wirtszelle nach Anspruch 27, die von einem Säuger, vorzugsweise Mensch, Hefe, Pflanze, Insekt, vorzugsweise Spodoptera frugiperda, oder bakteriell, vorzugsweise eine E. coli-Zelle, ist.
Protein, vorzugsweise ein Fusionsprotein, umfassend: a) eine erste funktionelle Domäne, b) eine erste Linkersequenz, c) ein peptidisches Multimerisierungsmittel mit einer Länge von nicht mehr als 110 und vorzugsweise 30–80 Aminosäureresten, das zum Selbstzusammenbau in ein Trimer oder ein Oligomer höherer Ordnung befähigt ist, und das von Säuger-, vorzugsweise menschlicher Zusammensetzung ist, d) eine zweite Linkersequenz, und e) eine zweite funktionelle Domäne.
Fusionsprotein, das von der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 24 codiert wird, dem Vektor nach einem der Ansprüche 25 bis 26 oder/und das durch den zellulären Wirt von Anspruch 27 oder 28 hergestellt wird.
Multimeres Protein, das aus den Proteinen und/oder Fusionsproteinen nach Anspruch 29 oder 30 zusammengebaut ist.
Multimeres Protein nach Anspruch 31, das ein homomultimeres Protein ist.
Multimeres Protein nach Anspruch 31, das ein heteromultimeres Protein ist.
Verfahren zur Herstellung des Fusionsproteins nach Anspruch 29 oder 30, wobei das Verfahren das Züchten eines zellulären Wirtes nach Anspruch 27 oder 28 in einem passenden Medium umfasst, wodurch das Fusionsprotein exprimiert wird, und das Isolieren des Fusionsproteins.
Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach Anspruch 29 oder 30, wobei das Verfahren das Züchten eines zellulären Wirtes nach Anspruch 27 oder 28 in einem passenden Medium umfasst, wodurch das Protein exprimiert und in das Periplasma des Wirtes sekretiert wird, und das Isolieren des Proteins aus dem Periplasma, vorzugsweise als ein multimeres Protein.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend: a) eine erste funktionelle Domäne, b) eine erste Linkersequenz, c) ein Multimerisierungsmittel mit einer Länge von nicht mehr als 110 und vorzugsweise 30–80 Aminosäureresten, das zum Selbstzusammenbau in ein Trimer oder ein Oligomer höherer Ordnung befähigt ist, und das von Säuger-, vorzugsweise menschlicher Zusammensetzung ist, d) eine zweite Linkersequenz, und e) eine zweite funktionelle Domäne, wobei zumindest eine von a) bis e) i) rekombinant hergestellt, und, falls alle von a) bis e) rekombinant hergestellt werden, zumindest zwei der Bestandteile von unterschiedlichen Wirtszellen hergestellt werden; und/oder ii) synthetisch hergestellt; und/oder iii) halbsynthetisch hergestellt; und/oder iv) durch in vitro-Translation hergestellt wird; und wobei zumindest zwei von a) bis e) durch enzymatische und/oder chemische Kopplung kombiniert werden, so dass das vollständige Protein, und vorzugsweise das vollständige multimere Protein entsteht.
Verfahren zur Herstellung eines multimeren Proteins, wobei das Verfahren das Assoziieren von zumindest drei Proteinen nach Anspruch 36 umfasst, wobei das Verfahren entweder ein homomultimeres oder ein heteromultimeres Protein entstehen lässt.
Diagnostikmittel, umfassend zumindest ein Fusionsprotein nach Anspruch 29 oder 30 und/oder ein multimeres Protein nach einem der Ansprüche 31 bis 33.
Arzneimittel, umfassend zumindest ein Protein nach Anspruch 29 oder 30, und/oder ein multimeres Protein nach einem der Ansprüche 31 bis 33 gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Genkassette, umfassend zumindest eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 24.
Kit, umfassend zumindest eine Genkassette nach Anspruch 40.