EA037613B1

EA037613B1 - Гуманизированные антитела против ceacam1

Info

Publication number: EA037613B1
Application number: EA201692148A
Authority: EA
Inventors: Техила Бен-Моше; Яр Сапир; Илана Мендел; Гал Маркел; Якоб Шахтер; Рона Ортенберг; Френсис Джозеф Карр; Роберт Джордж Э. Холгейт; Тимоти Дэвид Джонс
Original assignee: Фэймуэйв Лтд.
Priority date: 2014-04-27
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2021-04-21
Also published as: IL248402B; CA2946262C; SV2016005307A; KR20170003937A; BR112016024972B1; EP3137502B1; EP3137502A4; DOP2016000282A; AP2016009564A0; SG11201608772UA; ES2825080T3; MD20160130A2; IL248402A0; CR20160534A; MX2016014048A; EP3137502A1; PE20170764A1; PH12016502151A1; CN106573977A; CL2016002689A1

Abstract

Предложены гуманизированные антитела, способные к специфическому связыванию с молекулами CEACAM1 человека. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие эти антитела, а также способы их применения для лечения и диагностики злокачественной опухоли и других состояний.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится в основном к гуманизированным антителам, способным специфически связываться с молекулами СЕАСАМ человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам против СЕАСАМ1, содержащим CDR, происходящие из мыши, и гуманизированные области тяжелой и легкой цепей с определенными обратными мутациями.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Родственная карциноэмбриональному антигену молекула клеточной адгезии 1 (СЕАСАМ1), также известная как белок кластера дифференцировки 66a (CD66a), является представителем семейства генов карциноэмбрионального антигена (СЕА) и принадлежит суперсемейству иммуноглобулинов (Ig). Уровень СЕАСАМ1 повышается в Т- и NK-клетках при активации, и его гомофильные взаимодействия приводят к ингибированию цитотоксического эффекта лимфоцитов. Исследования нескольких типов опухолей человека показали, что использование каскада СЕАСАМ1 может обеспечить иммунное ускользание опухолей. Доклинические модели опухолей на животных показали, что блокада взаимодействий СЕАСАМ1 моноклональными антителами (mAb) может усилить иммунный ответ на опухоли. Согласно оценке, в США в 2013 г. наблюдали 1660290 новых случаев злокачественной опухоли и 580350 связанных со злокачественной опухолью смертей.

Было показано, что иммунотерапевтическая блокада точки контроля является перспективным новым направлением лечения злокачественной опухоли. Каскады иммунной точки контроля состоят из диапазона костимулирующих и ингибиторных молекул, которые действуют согласованно для подержания аутотолерантности и защиты тканей от повреждения иммунной системой в физиологических условиях. Опухоли пользуются определенными каскадами точки контроля для ускользания от иммунной системы. Таким образом, ингибирование таких каскадов стало перспективной стратегией лечения злокачественной опухоли (Pardoll, D.M., 2012, Nat Rev Cancer, 12, 252-264). Противоопухолевая иммунотерапия посредством блокады СЕАСАМ1 в принципе не ограничивается каким-либо одним типом опухоли, а может иметь активность усиления терапевтического иммунного ответа на ряд гистологически различающихся опухолей.

Антитело против цитотоксических Т-лимфоцитов 4 (CTLA-4) ипилимумаб (одобренное в 2011 г.) было первым иммунотерапевтическим средством, которое продемонстрировало пользу при лечении пациентов со злокачественной опухолью (Robert et al., 2011, N. Engl. J. Med., Vol. 364, pages 2517-2526). Антитело препятствует ингибиторным сигналам в ходе представления антигена Т-клеткам. Антитело против белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1) пембролизумаб (одобренное в 2014 г.) блокирует отрицательную иммунную регуляторную передачу сигнала рецептора PD-1, экспрессируемого Т-клетками (Hamid, 2013, N. Engl. J. Med., Vol. 2, pages 134-144). Антитела, блокирующие ось PD-1/PLL1, продемонстрировали перспективные результаты в нескольких испытаниях у пациентов с различными типами опухолей (Dolan and Gupta 2014, Cancer Control, Vol. 21, pages 231-237). В 2014 г. для одобрения контролирующих органов было предоставлено дополнительное средство против PD-1 для лечения немелкоклеточного рака легкого (NSCLC). В настоящее время в активном исследовании исследуют многие другие иммунные точки контроля, среди которых ген активации лимфоцитов 3 (LAG3), CD137, ОХ40 (также обозначаемый как CD134), и иммуноглобулинподобные рецепторы киллерных клеток (KIR) (Gelao et al., 2014, Toxins, Vol. 6, pages 914-933).

Гуманизированные антитела представляют собой антитела из не являющегося человеком вида (например, антитела мыши), белковые последовательности которых модифицированы для увеличения их сходства с вариантами антител, продуцируемыми у человека в природе. Процесс гуманизации обычно применяют для моноклональных антител, разработанных для введения человеку, и проводят, когда процесс разработки специфического антитела вовлекает получение в иммунной системе, не являющейся человеческой (такой как у мышей). Белковые последовательности антител, продуцированных таким образом, отличаются от антител, встречающихся у человека в природе, и, таким образом, они являются иммуногенными при введении пациентам-людям. Гуманизированные антитела считаются отличающимися от химерных антител, которые имеют белковые последовательности, сходные с антителами человека, но содержат большие участки не являющегося человеческим белка.

Является возможным получение гуманизированного антитела без получения химерной промежуточной структуры. Прямое получение гуманизированного антитела можно проводить путем встраивания соответствующих кодирующих CDR сегментов (ответственных за желаемые свойства связывания) в каркас антитела человека, что является процессом, известным как пересадка CDR. Как правило, после разработки антитела, которое имеет желаемые свойства у мыши (или другого не являющегося человеком животного), ДНК, кодирующую CDR этого антитела, можно секвенировать. После установления точных последовательностей желаемых CDR, эти последовательности встраивают в конструкцию, содержащую ДНК для каркасной области антитела человека.

В WO 2010/125571 авторов настоящего изобретения описано моноклональное антитело мыши (MRG-1), продуцируемое конкретной гибридомной клеткой. mAb является в высокой степени селективным в отношении СЕАСАМ1 и не реагирует перекрестно с другими представителями семейства СЕАСАМ. В WO 2013/054331 авторов настоящего изобретения описано химерное антитело (СМ-10),

- 1 037613 также в высокой степени селективное в отношении СЕАСАМ1.

Хотя существует прогресс в области иммунотерапии, остается постоянная потребность в новых способах лечения, которые являются более эффективными и более длительными и которые вовлекают новые мишени и могут использоваться либо в качестве отдельных средств, либо в комбинации с известными способами терапии, чтобы в итоге достигнуть длительных ответов у пациентов со злокачественной опухолью. Остается неудовлетворенная потребность в предоставлении гуманизированных антител, распознающих конкретные белки СЕАСАМ, которые являются более безопасными и более эффективными и которые можно использовать в диагностических и терапевтических целях при заболеваниях, вовлекающих экспрессию или активацию белков СЕАСАМ.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, которые распознают СЕАСАМ1. Отдельные гуманизированные антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат многочисленные определенные обратные мутации в их последовательностях вариабельных областей, а именно мутации с гуманизированной последовательности обратно в последовательность мыши. Эти обратные мутации вносят в остатки, важные для поддержания исходной конформации антитела и аффинности связывания, и одновременно имеющие наиболее низкую встречаемость потенциальных Т-клеточных эпитопов, таким образом, минимизируя риск неблагоприятного иммунного ответа на антитела.

Для получения гуманизированного mAb, распознающего СЕАСАМ1, которое имеет определенные последовательности CDR в желаемой ориентации и конформации и каркасную область человека, авторы настоящего изобретения идентифицировали ключевые остатки в каркасной области человека (вне последовательностей CDR), которые влияют на презентацию CDR, и спланировали ряд мутаций в этих ключевых остатках для восстановления правильной презентации CDR, одновременно минимизируя иммуногенность антител. Таким образом, настоящее изобретение относится впервые к высокоаффинному, неиммуногенному, высокоспецифическому гуманизированному антителу против СЕАСАМ1.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу (mAb), которое специфически распознает СЕАСАМ1 человека или его фрагмент, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающий домен, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из (i) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно; и (ii) вариабельной области легкой цепи, содержащей CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно; где по меньшей мере одна из (i) и (ii) содержит 1-25 обратных мутаций аминокислотных остатков с последовательности человека на последовательность мыши.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу (mAb) или его фрагменту, специфически распознающим СЕАСАМ1 человека, которые содержат по меньшей мере одну вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из (i) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательности CDR, указанные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи отличается от SEQ ID NO: 57 на 1-25 аминокислотных остатков в последовательностях каркасных областей; и (ii) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательности CDR, указанные в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи отличается от SEQ ID NO: 58 1-10 аминокислотными остатками в последовательностях каркасной области.

В определенных вариантах осуществления изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу (mAb) или его фрагменту, специфически распознающим СЕАСАМ1 человека, которые содержат: (i) последовательности CDR, указанные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6; (ii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая отличается 3-13 аминокислотными остатками каркасной области от SEQ ID NO: 57; и (iii) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая отличается 3-5 аминокислотными остатками каркасной области от SEQ ID NO: 58.

Согласно определенным вариантам осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи отличается от SEQ ID NO: 57 3-13 аминокислотными остатками в последовательностях каркасной области. Согласно другим вариантам осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи отличается от SEQ ID NO: 58 3-5 аминокислотными остатками в последовательностях каркасной области.

Согласно другим вариантам осуществления настоящее изобретение относится к не полностью гуманизированному моноклональному антителу, содержащему: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно, и аминокислотную последовательность каркасной области, которая отличается 2-9 аминокислотами от аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9; и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6

- 2 037613 соответственно, и амнокислотную последовательность каркасной области, которая отличается 2-4 аминокислотами от аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13; и к его аналогам, производным и антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически распознают СЕАСАМ1 человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность mAb содержит 1-50 обратных мутаций на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления, последовательность mAb содержит 2-30 обратных мутаций на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления последовательность mAb содержит 3-20 обратных мутаций на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления последовательность mAb содержит 4-15 обратных мутаций на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления тяжелая цепь последовательности mAb содержит 1-15 обратных мутаций на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления легкая цепь последовательности mAb содержит 1-15 обратных мутаций на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления тяжелая цепь последовательности mAb содержит 2-9 обратных мутаций на последовательность мыши и легкая цепь последовательности mAb содержит 2-4 обратных мутаций на последовательность мыши.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления гуманизированное mAb содержит 1-25 мутаций в последовательности тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 57, с последовательности человека на последовательность мыши. Согласно некоторым вариантам осуществления тяжелая цепь гуманизированного mAb содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из V11, R38, М48, V68, М70, R72, Т74, S77, R85, R87, Т91, Y95 и Т115 SEQ ID NO: 57. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна обратная мутация в SEQ ID NO: 57 выбрана из группы, состоящей из V11L, R38K, M48I, V68A, M70L, R72A, Т74К, S77N, R85S, R87T, T91S, Y95F и T115S.

Согласно другим некоторым конкретным вариантам осуществления гуманизированное mAb содержит 1-25 мутаций в последовательности легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 58, с последовательности человека на последовательность мыши. Согласно некоторым вариантам осуществления легкая цепь гуманизированного mAb содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из Р44, F71, F73, Р80 и Y87 SEQ ID NO: 58. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна обратная мутация в SEQ ID NO: 58 выбрана из группы, состоящей из P44V, F71Y, F73L, P80Q и Y87F.

Согласно некоторым вариантам осуществления тяжелая цепь гуманизированного mAb содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из V11, R38, М48, V68, М70, R72, Т74, S77, R85, R87, Т91, Y95 и Т115 SEQ ID NO: 57, и легкая цепь гуманизированного mAb содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из Р44, F71, F73, Р80 и Y87 SEQ ID NO: 58. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления тяжелая цепь гуманизированного mAb содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из V68, М70, R72, Т74, S77, R85, R87, Т91 и Y95 SEQ ID NO: 57, и легкая цепь гуманизированного mAb содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из F71, F73, Р80 и Y87 SEQ ID NO: 58. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна обратная мутация в SEQ ID NO: 57 выбрана из группы, состоящей из V11L, R38K, M48I, V68A, M70L, R72A, Т74К, S77N, R85S, R87T, T91S, Y95F и T115S, и по меньшей мере одна обратная мутация в SEQ ID NO: 58 выбрана из группы, состоящей из P44V, F71Y, F73L, P80Q и Y87F. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна обратная мутация в SEQ ID NO: 57 выбрана из группы, состоящей из V68A, M70L, R72A, Т74К, S77N, R85S, R87T, T91S и Y95F, и по меньшей мере одна обратная мутация в SEQ ID NO: 58 выбрана из группы, состоящей из F71Y, F73L, P80Q и Y87F. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит по меньшей мере одну последовательность каркасной области тяжелой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность каркасной области тяжелой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательности каркасной области тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 23. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления

- 3 037613 настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 32.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность каркасной области легкой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность каркасной области легкой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность каркасной области легкой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27; и SEQ ID NO: 14. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 34.

В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело содержит: (i) последовательности каркасной области тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22; и SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 23, и (ii) последовательности каркасной области легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27; и SEQ ID NO: 14. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32; и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 32, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 34.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 28, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 29, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 30, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 31, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 32, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 33.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 28, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 29, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 30, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 31, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 34.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 28, и последовательность вариабельной об

- 4 037613 ласти легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 29, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 30, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 31, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 32, и последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 35.

Согласно некоторым вариантам осуществления тяжелая цепь гуманизированного mAb выбрана из изотипов IgG4 и IgG1. Согласно некоторым вариантам осуществления тяжелая цепь гуманизированного mAb имеет изотип IgG4. Согласно некоторым вариантам осуществления легкая цепь гуманизированного mAb представляет собой изотип к. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления гуманизированное mAb имеет изотип к легкой цепи и изотип IgG4 тяжелой цепи. Согласно другим конкретным вариантам осуществления гуманизированное mAb имеет изотип к легкой цепи и изотип IgG1 тяжелой цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 52. Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 59. Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 52, и тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 53. Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 52, и тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 59.

Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит вариабельную область легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 58, и тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 53. Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит вариабельную область легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 58, и тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 59. Согласно некоторым вариантам осуществления mAb содержит легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 52, и вариабельную область тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 57.

Настоящее изобретение также относится к mAb, содержащему вариабельную область легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 58, и вариабельную область тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 57.

В некоторых вариантах осуществления гуманизированное mAb или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с белком СЕАСАМ1 человека с аффинностью по меньшей мере приблизительно 10^-8 М. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное mAb или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться по меньшей мере с одним из белков СЕАСАМ3 человека и СЕАСАМ5 человека с аффинностью по меньшей мере приблизительно 5х10^-7 М.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогам и/или производным моноклонального антитела, описанного выше, обладающим по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с антигенсвязывающим фрагментом указанного моноклонального антитела.

Фрагменты mAb, распознающие СЕАСАМ1, которые содержат по меньшей мере антигенсвязывающий домен, также входят в объем настоящего изобретения при условии, что они содержат определенные выше последовательности CDR и по меньшей мере одну обратную мутацию последовательности человека на последовательность мыши.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим моноклональное антитело, описанное выше, или его фрагмент, которые специфически распознают СЕАСАМ1 человека.

В некоторых вариантах осуществления выделенная полинуклеотидная последовательность содержит последовательности ДНК, указанные в любой из SEQ ID NO: 44-51, которые кодируют вариабельную область гуманизированного mAb или их аналоги, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления выделенная полинуклеотидная последовательность содержит последовательности ДНК, указанные в SEQ ID NO: 54 или SEQ ID NO: 55, которые кодируют тяжелую цепь гуманизированного mAb, или их аналоги, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления выделенная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность ДНК, указанную в SEQ ID NO: 56, которая кодирует легкую цепь гуманизированного mAb, или ее аналоги, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанными последовательностями.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к плазмиде, содержащей выделенный полинуклеотид, описанный выше.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции,

- 5 037613 содержащей терапевтически эффективное количество моноклонального антитела, описанного выше, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит 1-50 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит основную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит сахар. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит поверхностно-активное вещество. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит основную аминокислоту, сахар и поверхностноактивное вещество. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит: (i) 1-10 мг/мл основной аминокислоты; (ii) 10/100 мг/мл сахара; (iii) 0,01-1 мг/мл поверхностноактивного вещества; (iv) 1-50 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1, 4-6 мг/мл основной аминокислоты, 70-100 мг/мл сахара и 0,1-1 мг/мл неанионного поверхностно-активного вещества; или (v) 10 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1, 4,65 мг/мл L-гистидина, 82 мг/мл сахарозы и 0,20 мг/мл полисорбата 20.

Согласно некоторым вариантам осуществления основная аминокислота выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина и орнитина. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция содержит 1-10, 2-9, 3-7 или 4-6 мг/мл основной аминокислоты. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления сахар выбран из группы, состоящей из: сахарозы, трегалозы, глюкозы, декстрозы и мальтозы. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция содержит 10-200, 10-100, 50-150 или 70-100 мг/мл сахара. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно другим вариантам осуществления композиция содержит полиол, включая, но не ограничиваясь ими, маннит и сорбит. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления поверхностно-активное вещество является неанионным. Согласно некоторым вариантам осуществления поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбатов, сложных эфиров сорбитана и полоксамеров. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления, композиция содержит 0,01-10, 0,01-1, 0,05-5 или 0,1-1 мг/мл поверхностно-активного вещества. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления, фармацевтическая композиция содержит 4-6 мг/мл основной аминокислоты, 70-100 мг/мл сахара и 0,1-1 мг/мл поверхностно-активного вещества.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция находится в жидкой форме и содержит 1-50 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1, содержащего по меньшей мере одну обратную мутацию на последовательность мыши. Согласно другим вариантам осуществления фармацевтическая композиция является лиофилизированной. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит 10 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1, 4,65 мг/мл Lгистидина, 82 мг/мл сахарозы и 0,20 мг/мл полисорбата 20.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно гуманизированное mAb или фрагмент, определенные выше, и дополнительный иммуномодулятор или ингибитор киназы. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно гуманизированное mAb или фрагмент, определенные выше, и фармацевтическую композицию, содержащую дополнительный иммуномодулятор или ингибитор киназы, используют для лечения злокачественной опухоли посредством раздельного введения.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления дополнительный иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из антитела против белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD1), PD-L1 и PD-L2, активированной цитотоксической лимфоцитарной клетки, активирующего лимфоциты средства и ингибитора каскада RAF/MEK. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления дополнительный иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из mAb к PD-1, mAb к PD-L1, mAb к PD-L2, интерлейкина 2 (IL-2), линфокин-активируемой киллерной (LAK) клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гуманизированное mAb, содержащее обратные мутации, как определено выше, или его антигенсвязывающий фрагмент, и к фармацевтической композиции, содержащей mAb по меньшей мере к одному из белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), PD-L1 и PD-L2, или его антигенсвязывающий фрагмент, для применения для лечения злокачественной опухоли посредством раздель- 6 037613 ного введения.

Согласно другим вариантам осуществления предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая гуманизированное mAb к СЕАСАМ, определенное выше, или его антигенсвязывающий фрагмент, и активированную цитотоксическую лимфоцитарную клетку. В определенных вариантах осуществления активированная цитотоксическая лимфоцитарная клетка выбрана из группы, состоящей из клетки LAK, клетки CIK и любой их комбинации. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения. В определенных вариантах осуществления активированная цитотоксическая лимфоцитарная клетка представляет собой лимфокин-активируемую киллерную (LAK) клетку.

В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит гуманизированное mAb к СЕАСАМ1 или его антигенсвязывающий фрагмент, и активирующее лимфоциты средство или его фрагмент, их аналог или слитый белок. В определенных вариантах осуществления активирующее лимфоциты средство выбрано из группы, состоящей из IL-2, ZFNy, антитела против CD3 и их фрагментов, аналогов или слитых белков. В определенных вариантах осуществления активирующее лимфоциты средство представляет собой IL-2 или его фрагмент, аналог или слитый белок. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит ингибитор киназы, выбранной из группы, состоящей из мутантной киназы B-Raf, киназы MEK1 и киназы MEK2, и гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 человека, определенного выше, или его антигенсвязывающего фрагмента.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления ингибитор киназы B-Raf ослабляет или предупреждает фосфорилирование MEK1 или MEK2 мутантной киназой B-Raf. В определенных вариантах осуществления ингибитор киназы B-Raf ослабляет или препятствует димеризации мутантной киназы B-Raf. В определенных вариантах осуществления ингибитор киназы MEK1 ослабляет или препятствует фосфорилированию MAPK киназой MEK1. В определенных вариантах осуществления ингибитор киназы MEK2 ослабляет или препятствует фосфорилированию MAPK киназой MEK2.

Кроме того, настоящее изобретение относится согласно другим вариантам осуществления к ингибитору киназы, выбранному из группы, состоящей из мутантной киназы B-Raf, киназы MEK1 и киназы MEK2, и к гуманизированному mAb к СЕАСАМ1 человека или его антигенсвязывающему фрагменту для применения для лечения злокачественной опухоли. Два активных ингредиента могут быть частью одной или отдельных фармацевтических композиций, которые можно вводить одновременно или посредством отдельных введений.

Гуманизированное mAb к СЕАСАМ1 в соответствии с настоящим изобретением и дополнительный иммуномодулятор могут содержаться в одной фармацевтической композиции или в отдельных композициях для одновременного или отдельного введения.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, ассоциированных с экспрессией, активацией или функцией представителя семейства белков СЕАСАМ, включая, но не ограничиваясь ими, СЕАСАМ1. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, ассоциированных с экспрессией, активацией или функцией СЕАСАМ1. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой клеточнопролиферативное заболевание или нарушение. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления клеточнопролиферативное заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль.

Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, рака ободочной и прямой кишки, мочевого пузыря, легкого, немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC), немелкоклеточной аденокарциномы легкого (NSCLA), желудочнокишечного рака, рака поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, щитовидной железы, желудка, яичника, меланомы и рака тела матки. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к диагностической композиции, содержащей по меньшей мере одно гуманизированное mAb или его фрагмент, которые специфически распознают СЕАСАМ1 человека, как описано выше.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предупреждения, смягчения или лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией, активацией или функцией белка СЕАСАМ1, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой инфекцию, например вирусную инфекцию.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело, содержащееся в фармацевтической композиции, связано с цитотоксической частью.

В определенных вариантах осуществления способ, описанный выше, включает введение индиви

- 7 037613 дууму по меньшей мере одной дозы гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 в диапазоне от 0,01 до 10 мг/кг массы тела. В определенных вариантах осуществления способ, описанный выше, включает введение (i) множества идентичных или различающихся доз гуманизированного mAb; (ii) множества возрастающих доз или (iii) фармацевтической композиции один раз в неделю, один раз в 2 недели, один раз в 3 недели, один раз в 4 недели или один раз в 5 недель. В определенных вариантах осуществления способ, описанный выше, включает 1-10 курсов введения, причем каждый курс включает 2-5 инфузий каждые 14 недели гуманизированного mAb, а затем 2-8 недель между курсами.

В определенных вариантах осуществления способ, описанный выше, кроме того, включает введение лимфоцитарной клетки или множества лимфоцитарных клеток. В некоторых вариантах осуществления способ, описанный выше, кроме того, включает введение индивидууму экспрессирующих СЕАСАМ1 лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты включают Т-клетки, NKклетки или инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL). Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления лимфоцитарная клетка экспрессирует СЕАСАМ1, PD-1 или оба из них. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В определенных таких вариантах осуществления лимфоцитарная клетка экспрессирует СЕАСАМ1 и PD-1. В некоторых вариантах осуществления лимфоцитарная клетка выбрана из группы, состоящей из инфильтрирующей опухоль лимфоцитарной (TIL) клетки, лимфокин-активируемой киллерной (LAK) клетки, цитокин-индуцируемой киллерной (CIK) клетки, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и любой их комбинации. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В определенных таких вариантах осуществления лимфоцитарная клетка выбрана из группы, состоящей из инфильтрирующей опухоль лимфоцитарной (TIL) клетки и лимфокин-активируемой киллерной (LAK) клетки. В определенных таких вариантах осуществления лимфоцитарная клетка представляет собой инфильтрирующую опухоль лимфоцитарную (TIL) клетку или множество клеток TIL. В определенных таких вариантах осуществления лимфоцитарная клетка представляет собой лимфокин-активируемую киллерную (LAK) клетку или множество LAK-клеток. В определенных вариантах осуществления лимфоцитарная клетка является активированной. В некоторых вариантах осуществления лимфоцитарная клетка является цитотоксической для злокачественной клетки. В некоторых вариантах осуществления злокачественная клетка экспрессирует СЕАСАМ1, PD-L1, PD-L2 или любую их комбинацию. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления злокачественная клетка экспрессирует СЕАСАМ1, PD-L1 или оба из них. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления злокачественная клетка экспрессирует СЕАСАМ1, PD-L2 или оба из них. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В определенных таких вариантах осуществления злокачественная клетка экспрессирует СЕАСАМ1 и PD-L1 и PD-L2.

В определенных вариантах осуществления способы, описанные выше, кроме того, включают введение индивидууму средства, активирующего лимфоциты. Согласно некоторым вариантам осуществления средство, активирующее лимфоциты, выбрано из группы, состоящей из IL-2, IFNy и антитела против CD3. В определенных вариантах осуществления способы, описанные выше, кроме того, включают введение индивидууму дополнительной композиции против злокачественной опухоли.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу иммуномодулирования, причем способ включает приведение в контакт экспрессирующего СЕАСАМ1 лимфоцита с антителами или их фрагментами, описанными выше.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования миграции экспрессирующей СЕАСАМ1 опухолевой клетки, причем способ включает приведение в контакт указанной экспрессирующей СЕАСАМ1 опухолевой клетки с антителами или их фрагментами, описанными выше, тем самым ингибируя миграцию указанной экспрессирующей СЕАСАМ опухолевой клетки.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования гомотипического или гетеротипического белок-белкового взаимодействия СЕАСАМ1, причем способ включает приведение экспрессирующего СЕАСАМ1 лимфоцита в контакт с антителами или их фрагментами, описанными выше, тем самым ингибируя гомотипическое или гетеротипическое белок-белковое взаимодействие СЕАСАМ1.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения продолжительности или прогрессирования ответа или выживаемости индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включающему введение индивидууму эффективных количеств композиции, содержащей моноклональное антитело, как описано выше, и антинеопластической композиции, где указанная антинеопластическая композиция содержит по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство, причем совместное введение антитела и антинеопластической композиции эффективно увеличивает продолжительность или прогрессирование выживаемости.

Способ по настоящему изобретению может включать введение фармацевтической композиции, определенной выше, вместе с дополнительной композицией против злокачественной опухоли. Согласно конкретному варианту осуществления композиция против злокачественной опухоли содержит по мень- 8 037613 шей мере одно химиотерапевтическое средство. Согласно другим конкретным вариантам осуществления композиция против злокачественной опухоли содержит иммуномодулирующее средство. Средство против злокачественной опухоли, которое можно вводить совместно с антителом в соответствии с настоящим изобретением или отдельно, может включать любое такое средство, известное в данной области, проявляющее активность против злокачественной опухоли.

Согласно некоторым вариантам осуществления предусматривается способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей гуманизированное антитело, которое распознает СЕАСАМ1 и содержит обратные мутации на последовательность мыши, и фармацевтической композиции, содержащей дополнительный иммуномодулятор или ингибитор киназы.

Согласно некоторым вариантам осуществления иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из mAb к PD-1, mAb к PD-L1, mAb к PD-L2, интерлейкина 2 (IL-2), лимфокин-активируемой киллерной (LAK) клетки, и ингибитор киназа представляет собой ингибитор B-Raf/MEK.

В некоторых вариантах осуществления способ включает введение двух или более фармацевтических композиций. В некоторых вариантах осуществления введение двух или более фармацевтических композиций проводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления способа введение двух или более фармацевтических композиций проводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления способа дополнительный иммуномодулятор вводят до гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 человека или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления способа, иммуномодулятор вводят одновременно с mAb к СЕАСАМ1 человека или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления способа иммуномодулятор вводят после гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 человека или его антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления способ включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело к СЕАСАМ1 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, и фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело к PD-1 человека или его антигенсвязывающий фрагмент. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно другим вариантам осуществления способы лечения пациента, имеющего злокачественную опухоль, описанную выше, включают стадию введения пациенту фармацевтической композиции, содержащей ингибитор киназы, выбранной из группы, состоящей из мутантной киназы B-Raf, киназы MEK1 и киназы MEK2, и фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело к СЕАСАМ1 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, где злокачественные клетки экспрессируют мутантную киназу B-Raf, тем самым осуществляя лечение злокачественной опухоли.

В некоторых вариантах осуществления способы лечения злокачественной опухоли, описанные выше, кроме того, включают стадию введения указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей лимфоцитарную клетку. В некоторых вариантах осуществления введение фармацевтической композиции, содержащей лимфоцитарную клетку, проводят одновременно по меньшей мере с одной из фармацевтических композиций, содержащих антитела. В некоторых вариантах осуществления способа введение двух или более фармацевтических композиций проводят последовательно.

В некоторых вариантах осуществления лимфоцитарную клетку предварительно инкубируют с гуманизированным mAb к СЕАСАМ1 человека с его антигенсвязывающим фрагментом или с дополнительным иммуномодулятором. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить любыми подходящими способами, такими как интраназально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, внутрисуставным путем, внутрь очага повреждения, перорально или местным путем. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят парентерально. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления используют внутривенное (в/в) введение.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения злокачественной опухоли или другого ассоциированного с СЕАСАМ1 заболевания или нарушения в соответствии с настоящим изобретением включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, по меньшей мере одной дозы гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 в диапазоне от 0,01 до 10 мг/кг массы тела.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна доза выбрана из группы, состоящей из 0,01-0,1 мг/кг; 0,1-1 мг/кг; 1-10 мг/кг и 10-50 мг/кг.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает введение множества доз гуманизированного mAb, где множество доз являются идентичными или различаются. Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает введение множества возрастающих доз. Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает по меньшей мере один курс введения в течение по меньшей мере 12 недель.

Согласно другим вариантам осуществления продолжительность лечения составляет 12-50 недель. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления продолжительность лечения выбрана из группы, состоящей из 12-20 недель, 20-30 недель и 30-50 недель. Согласно другим вариантам осуществ- 9 037613 ления режим лечения включает несколько курсов введения, каждый из которых длится по меньшей мере недель.

Согласно некоторым вариантам осуществления режим лечения включает 1-8 курсов, причем каждый курс включает 4 инфузии гуманизированного mAb против СЕАСАМ в течение по меньшей мере 4 недель. Согласно некоторым вариантам осуществления режим лечения включает 2-6 курсов.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение проводят один раз в неделю, один раз в 2 недели, один раз в 3 недели, один раз в 4 недели или один раз в 5 недель. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления режим лечения включает 1-10 курсов, причем каждый курс включает 2-5 инфузий каждые 1-4 недели, гуманизированного mAb согласно изобретению, а затем 2-8 недель между курсами.

Согласно некоторым вариантам осуществления предусматривается режим увеличения дозы, включающий введение, начинающееся с 0,01 мг/кг и продолжающееся до 0,03 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг, 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг. Согласно другим вариантам осуществления режим лечения включает 6 курсов по 4 инфузии в каждом, проводимые каждые 2 недели.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающемуся в этом, причем способ включает приведение биологического образца, происходящего или полученного от указанного индивидуума, в контакт с диагностической композицией, описанной выше, где образование комплекса за пределами заданного порогового значения указывает на злокачественную опухоль у указанного индивидуума.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу определения экспрессии СЕАСАМ1, причем способ включает приведение биологического образца в контакт с антителами или их фрагментами, описанными выше, и измерение уровня образования иммунных комплексов. Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает сравнение указанного уровня иммунного комплекса со стандартной кривой, полученной на основе известных количеств СЕАСАМ1.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией белка СЕАСАМ, включающему стадии инкубации биологического образца с моноклональным антителом, как описано выше; обнаружение связанного белка СЕАСАМ с использованием поддающегося обнаружению зонда; сравнение количества связанного белка СЕАСАМ со стандартной кривой, полученной для эталонных образцов, содержащих известные количества белка СЕАСАМ; вычисление количества белка СЕАСАМ в биологическом образце, исходя из стандартной кривой; и сравнение количества белка СЕАСАМ с нормальным количеством белка СЕАСАМ.

Согласно некоторым вариантам осуществления гуманизированное mAb согласно изобретению используют в качестве прогностического биомаркера, ассоциированного с лечением, направленным против СЕАСАМ1, исходя из уровней экспрессии СЕАСАМ1 в образцах опухоли до лечения. Уровни экспрессии СЕАСАМ1 определяют с использованием способов, известных в данной области, с использованием гуманизированного mAb согласно изобретению.

Кроме того, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, как описано выше, для диагностики, предупреждения или лечения клеточно-пролиферативного или связанного с ангиогенезом заболевания или нарушения или инфекции.

Кроме того, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, как описано выше, для получения лекарственного средства для лечения нарушения или заболевания, ассоциированных с экспрессией или активацией белка СЕАСАМ.

Кроме того, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, как описано выше, для получения диагностической композиции для диагностики клеточнопролиферативного или связанного с ангиогенезом заболевания или нарушения или инфекции.

Кроме того, в одном аспекте настоящее изобретение относится к частично гуманизированному моноклональному антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области, указанную в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SeQ ID NO: 20, sEq ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22, или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области, указанную в SEQ ID N0: 25, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27.

Следующие варианты осуществления и полный объем применимости настоящего изобретения станут очевидными из подробного описания, приведенного далее. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают на предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации сущности и объема изобретения станут понятными специалистам в данной области из этого подробного описания.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена структурная модель V-областей химерного антитела против СЕАСАМ-1 (СМ-10) вид сверху (А) и пространственно-боковой вид (В), полученные с использованием программы моделирования по гомологии белковой структуры Swiss PDB.

На фиг. 2 представлен окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE с антителами, очищенными с

- 10 037613 использованием белка А. Приблизительно 2 мкг каждого образца наносили на гель NuPage 4-12% BisTris (каталожный номер Invitrogen № NP0322BOX) и разделяли при 200 В в течение 40 мин. (А) Варианты IgG1 с пересаженными CDR; (В) варианты IgG4 (S241P) с пересаженными CDR. В качестве стандарта молекулярной массы использовали Fermentas Pageruler Plus (SM1811) (содержащий эталонные полосы на уровне 10, 25 и 70 кДа). Образцы были пронумерованы следующим образом:____________

№	1	2	3	4	5	6	7	8
V_H/	VH1/	VH1/	VH1/	VH2/	VH2/	VH2/	VH3/	VH3/
v_L	VK1	VK2	VK3	VK1	VK2	VK3	VK1	VK2

№	9	10	11	12	13	14	15	16
VH/ VL	VH3/ VK3	VH4/ VK1	VH4/ VK2	VH4/ VK3	VH5/ VK1	VH5/ VK2	VH5/VK3	Химерный IgG

На фиг. 3 показана графическая иллюстрация результатов конкурентных анализов связывания ELISA для рекомбинантного СЕАСАМ-1 человека. Различные концентрации очищенных вариантов гуманизированного IgG-антитела подвергали конкуренции с постоянной концентрацией биотинилированного IgG против СЕАСАМ-1 (химерный IgG1 CM-10): (А) варианты IgG1; и (В) варианты IgG4 (S241P). Обнаружение связанного биотинилированного химерного СМ-10 проводили с использованием стрептавидин-HRP и субстрата ТМВ.

На фиг. 4 представлены синергичные эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на цитотоксичность клеток TIL человека против клеток меланомы человека. Клетки TIL инкубировали с различными концентрациями гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 человека (пунктирная черная линия, сферический символ), mAb к PD-1 человека (сплошная серая линия, прямоугольный символ) или комбинации обоих антител (сплошная черная линия, треугольный символ). Обработанные IFN-γ клетки меланомы добавляли для инкубации в течение ночи. Результаты соответствуют среднему значению % цитотокcu4hoctu±SE при определении с использованием классического анализа высвобождения LDH в трех экземплярах лунок на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с моноклональным антителом к СЕАСАМ1 человека отдельно.

На фиг. 5А-В представлены синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на уровни гранзима В и цитотоксичность TIL-клеток человека в отношении клеток меланомы человека, когда антитела против PD-1 добавляли перед добавлением антител против СЕАСАМ1. Клетки меланомы человека выращивали в присутствии IFN-α для индукции экспрессии PD-L1.

TIL-клетки человека инкубировали со средой отдельно (черный), неспецифическим IgG-антителом (белый), различными концентрациями моноклонального антитела к СЕАСАМ1 человека (вертикальные линии), моноклональным антителом к PD-1 человека (горизонтальные линии) или комбинацией обоих антител (точки).

(А) Результаты соответствуют среднему значению % цитотоксичности±SE при определении с использованием классического анализа высвобождения LDH в трех экземплярах лунок на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с PD-1 отдельно.

(В) Результаты соответствуют уровням гранзима B±SE при определении с использованием коммерческого набора ELISA для гранзима В в трех экземплярах лунок на обработку.

На фиг. 6 представлены синергичные эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на цитотоксичность LAK-клеток человека против клеток меланомы человека, когда антитела против PD-1 добавляли до добавления антител против СЕАСАМ1. Клетки меланомы человека выращивали в присутствии IFN-α для индукции экспрессии PD-L1. LAK-клетки человека, полученные посредством активации РВМС от здорового донора-человека посредством IL-2, инкубировали со средой отдельно (белый), неспецифическим IgG-антителом (черный), различными концентрациями моноклонального антитела к СЕАСАМ1 человека (вертикальные линии), моноклональным антителом к PD-L1 человека (горизонтальные линии) или комбинацией обоих антител (точки). Результаты соответствуют среднему значению % цитотоксичности±SE при определении с использованием классического анализа высвобождения LDH в трех экземплярах лунок на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с PD-L1 отдельно. Показатель аддитивности вычисляли, как описано выше.

На фиг. 7 показано, что обработка антителами против СЕАСАМ1 повышает экспрессию PD-L1 на злокачественных клетках-мишенях. NK-клетки (NK92MI) инкубировали с СМ-24 (10 мкг/мл) или без него, а затем добавляли клетки меланомы человека (SKMEL28).

Клетки инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч и уровни PD-L1 измеряли в каждый момент времени посредством FACS-анализа. Представлено среднее соотношение для антитела против PD-L1 по сравнению с соответствующим изотипическим контролем для указанных обработок в различные моменты времени.

На фиг. 8 представлены синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на про- 11 037613 грессирование опухоли у иммунокомпетентных мышей. Клетки лимфомы мыши имплантировали подкожно в область живота мышей BALB/C (1 cenrb). На 10, 15 и 20 сутки мышам внутривенно вводили либо PBS (пунктирная черная линия, незакрашенные круги), либо антитело против СЕАСАМ1 мыши (сплошная серая линия, серые прямоугольники), либо антитело против PD-1 мыши (сплошная серая линия, серые треугольники), либо комбинацию обоих антител (сплошная черная линия, черные сферы).

На фиг. 9 показано, что антитела против СЕАСАМ1 повышают цитотоксичность LAK-клеток человека в отношении клеток меланомы человека. LAK-клетки человека инкубировали с СМ-24 в различных концентрациях в течение 30 мин при 37°C. Злокачественные клетки меланомы человека (SKMEL28) добавляли для инкубации в течение 24 ч. Результаты соответствуют среднему значению % цитотоксичноctu±SE при определении с использованием классического анализа высвобождения LDH в трех экземплярах лунок на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с эффекторами + клетки-мишени со средой отдельно.

На фиг. 10 показано, что антитела против СЕАСАМ1 повышают цитотоксичность LAK-клеток человека против клеток рака поджелудочной железы человека T3M4. LAK-клетки человека инкубировали с СМ-24 в различных концентрациях в течение 30 мин при 37°C. Клетки рака поджелудочной железы человека T3M4 добавляли для инкубации в течение 24 ч. Результаты соответствуют среднему значению % цитотоксичности±SE при определении с использованием классического анализа высвобождения LDH в трех экземплярах лунок на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с эффекторами + клетки-мишени со средой отдельно.

На фиг. 11 показано, что антитела против СЕАСАМ1 усиливают секрецию IFN-γ LAK-клетками человека в присутствии злокачественных клеток человека. LAK-клетки человека инкубировали с СМ-24 в различных концентрациях в течение 30 мин при 37°C. Клетки рака легкого человека Н358 (11A) или Н460 (11В) добавляли для инкубации в течение 24 ч. Секрецию IFN-γ измеряли посредством ELISA. Результаты соответствуют среднему значению±SE для величин высвобождения гранзима В для 3 повторов на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с эффекторами + клетки-мишени со средой отдельно.

На фиг. 12А и 12В представлена корреляция между экспрессией типов СЕАСАМ1: СЕАСАМ1длинный (А) и СЕАСАМ1-короткий (В), и устойчивость к ингибиторам мутантов B-Raf в злокачественных клетках.

На фиг. 13А представлены пиктограммы легких, извлеченных из мышей, которым были пересажены клетки меланомы и которых лечили в соответствии с группами лечения, указанными на чертеже; на фиг. 13В представлена средняя масса опухоли в каждой группе лечения; и на фиг. 13С представлено количество очагов повреждения на мышь в каждой группе лечения.

На фиг. 14 представлена столбиковая диаграмма, на которой показан процент занятости рецептора СЕАСАМ1 в TIL-клетках, выделенных в модели очагов повреждения легкого.

На фиг. 15А и 15В представлены аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей подвергнутого обратной мутации гуманизированного mAb против СЕАСАМ1, обозначаемого как СМ-24, в настоящее время проходящего клинические испытания. На фиг. 15А представлена последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 52), где аминокислотные остатки 1-107 представляют собой вариабельную область, включающую CDR, и аминокислотные остатки 108-214 (полужирным шрифтом) представляют собой константную область легкой цепи к. На фиг. 15В, на которой показана последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 53), аминокислотные остатки 1-120 представляют собой вариабельную область, аминокислотные остатки 121-447 (полужирным шрифтом) представляют собой константную область тяжелой цепи IgG4, и спрогнозированный участок N-гликозилирования (аспарагин 297) подчеркнут. На фиг. 15С, на которой показана последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 59), аминокислотные остатки 1-121 представляют собой вариабельную область, аминокислотные остатки 122-450 (полужирным шрифтом) представляют собой константную область тяжелой цепи IgG1, и спрогнозированный участок N-гликозилирования (аспарагин 300) подчеркнут.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к не полностью гуманизированным моноклональным антителам, которые распознают СЕАСАМ1. Преимущественно антитела по изобретению являются практически полностью гуманизированными, таким образом, избегая риска неблагоприятного иммунного ответа на антитела, и, таким образом, являются безопасными для применения in vivo у человека. Антитела по изобретению характеризуются наличием уникальной последовательности CDR и новых не полностью гуманизированных последовательностей и конструкции каркасной области. Уникальные свойства моноклональных антител по настоящему изобретению расширяют их терапевтическую применимость для лечения и диагностики дополнительных типов злокачественных опухолей и различных инфекций. Более конкретно моноклональные антитела, предоставленные в рамках настоящего изобретения, имеют конкретные комбинации CDR и не полностью гуманизированные последовательности каркасной области и обладают уникальными свойствами и улучшенной безопасностью и эффективностью относительно известных не являющихся человеческими антител человека против СЕАСАМ1.

- 12 037613

Уникальные свойства антител, предоставленных в рамках настоящего изобретения, обеспечивают несколько преимуществ для применения этих антител у человека, в частности в применениях, требующих длительного или повторяющегося введения, когда другие, не являющиеся человеческими, антитела не могут быть введены ввиду опасений индукции иммуногенного ответа на сами по себе не являющиеся человеческими антитела. Избегание такого иммунного ответа становится более важным, когда подвергаемым лечению индивидуумом является пациент, страдающий заболеванием, где следует избегать дальнейшего ухудшения здоровья пациента. Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к не полностью гуманизированному моноклональному антителу, содержащему: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно, и аминокислотную последовательность не CDR (каркасная область), которая отличается 2-9 аминокислотами от аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9; и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно, и аминокислотную последовательность не CDR, которая отличается 2-4 аминокислотами от аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13; и к его аналогам, производным и антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически распознают СЕАСАМ1 человека.

Для ясности следует подчеркнуть, что вариабельные области антител, предоставленных в рамках настоящего изобретения, содержат: (a) последовательности CDR, ранее описанные авторами настоящего изобретении, и (b) последовательности каркасной области, также обозначаемые в настоящем описании как последовательности не CDR, по меньшей мере одна из которых отличается по меньшей мере одним остатком от соответствующей полностью человеческой последовательности каркасной области.

В определенных вариантах осуществления выражение последовательность, которая отличается от другой последовательности, как используют в рамках изобретения, означает последовательность, которая содержит замену по меньшей мере одной аминокислоты, вставку по меньшей мере одной аминокислоты, делецию по меньшей мере одной аминокислоты или любую их комбинацию по сравнению с соответствующей последовательностью. В определенных вариантах осуществления выражение последовательность, которая отличается от другой последовательности, как используют в рамках изобретения, означает последовательность, которая содержит замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с соответствующей последовательностью. Термин последовательность не CDR, как используют в рамках изобретения, относится к последовательности каркасной области, а именно к любой аминокислотной последовательности, содержащейся в вариабельной области антитела, которая не является последовательностью CDR, идентифицированной в рамках настоящего изобретения. Примеры последовательности не CDR включают последовательности, предшествующие или соседние с CDR1, последовательности между CDR1 и CDR2, последовательности между CDR2 и CDR3 и последовательности после или соседние с CDR3.

Поскольку вариабельные области антител, предоставленных в рамках настоящего изобретения, отличаются по меньшей мере одной аминокислотой от вариабельных областей полностью человеческих антител, их также называют не полностью гуманизированными и не полностью человеческими антителами.

Термин СЕАСАМ1 используют для обозначения белкового продукта гена СЕАСАМ1, например, NP_001020083.1, NP_001703.2. У человека на настоящий момент обнаружено 11 различных вариантов СЕАСАМ1 по сплайсингу. Индивидуальные изоформы СЕАСАМ1 отличаются количеством внеклеточных иммуноглобулинподобных доменов (например, СЕАСАМ1 с четырьмя внеклеточными иммуноглобулинподобными доменами известен как СЕАСАМ1-4), заякориванием на мембране и/или длиной их цитоплазматической хвостовой части (например, СЕАСАМ1-4 с длинной цитоплазматической хвостовой частью известен как CEACAM1-4L, и СЕАСАМ1-4 с короткой цитоплазматической хвостовой частью известен как CEACAM1-4S). N-концевой домен СЕАСАМ1 начинается непосредственно после сигнального пептида и его структура считается структурой IgV-типа. Например, в аннотации Р13688 для СЕАСАМ1, N-концевой домен IgV-типа состоит из 108 аминокислот, от аминокислоты 35 до аминокислоты 142. Этот домен был идентифицирован как ответственный за гомофильную активность связывания (Watt et al., 2001, Blood. 98, 1469-79). Все варианты, включая эти варианты по сплайсингу, включены в термин СЕАСАМ1.

Термины антитело против СЕАСАМ1, антитело, которое распознает СЕАСАМ1, антитело против СЕАСАМ1 и антитело к СЕАСАМ1 являются взаимозаменяемыми, и их используют в настоящем описании для обозначения антитела, которое связывается с белком СЕАСАМ1 с достаточной аффинностью и специфичностью.

Термин антиген, как используют в рамках изобретения, относится к молекуле или части молекулы, способной индуцировать образование антител и связываться антителом. Антиген может иметь один или более одного эпитопа. Специфическая реакция, упоминаемая выше, указывает на то, что антиген реагирует высокоселективным образом с соответствующим антителом и не реагирует с множеством других антител, которые могут индуцироваться другими антигенами. Антиген в соответствии с настоящим

- 13 037613 изобретением представляет собой белок СЕАСАМ1 или его фрагмент.

Термин антигенная детерминанта или эпитоп, как используют в рамках изобретения, относится к области молекулы антигена, которая специфически реагирует с конкретным антителом. Пептидные последовательности, происходящие из эпитопа, можно использовать, отдельно или совместно с частьюносителем, применяя способы, известные в данной области, для иммунизации животных и для получения дополнительных поликлональных или моноклональных антител. Выделенные пептиды, происходящие из эпитопа, можно использовать в диагностических способах для обнаружения антител и в качестве лекарственных средств, когда требуется ингибирование указанных антител.

Антитела, или иммуноглобулины, содержат две тяжелых цепи, связанных вместе дисульфидными связями, и две легких цепи, причем каждая из легких цепей связана с соответствующей тяжелой цепью дисульфидными связями в Y-образной конфигурации. Протеолитическое расщепление антитела обеспечивает домены Fv (фрагмент вариабельный) и Fc (фрагмент кристаллический).

Антигенсвязывающие домены, Fab, включают области, в которых полипептидная последовательность варьируется. Термин F(ab')2 соответствует двум плечам Fab', связанным вместе дисульфидными связями. Центральную ось антитела называют Fc-фрагментом. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов (CH). Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) на одном конце и константный домен (CL) на ее другом конце, вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи, и константный домен легкой цепи расположен параллельно первому константному домену тяжелой цепи (СН1). Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий центр. Домены на легкой и тяжелой цепях имеют одинаковую общую структуру и каждый домен содержит четыре каркасных области, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных тремя гипервариабельными доменами, известными как определяющие комплементарность области (CDR 1-3). Эти домены вносят вклад в специфичность и аффинность антигенсвязывающего центра. Изотип тяжелой цепи (γ, α, δ, ε или μ) определяет класс иммуноглобулина (IgG, IgA, IgD, IgE или IgM соответственно). Легкая цепь представляет собой любой из двух изотипов (каппа, к, или лямбда, λ), встречающихся во всех классах антител.

Термин антитело используют в наиболее широком значении, и он включает моноклональные антитела (включая полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), и фрагменты антител, достаточно длинные для того, чтобы они проявляли желаемую биологическую активность.

Антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере антигенсвязывающую часть антитела. Антитело или антитела согласно изобретению включают интактные антитела, такие как поликлональные антитела или моноклональные антитела (mAb), a также их протеолитические фрагменты, такие как фрагменты Fab или F(ab')2. Одноцепочечные антитела также входят в объем настоящего изобретения.

Фрагменты антител содержат только часть интактного антитела, обычно включающую антигенсвязывающий центр интактного антитела и, таким образом, сохраняющую способность связывать антиген. Примеры фрагментов антител, охватываемых настоящим определением, включают:

(i) Fab-фрагмент, имеющий домены VL, CL, VH и CH1;

(ii) Fab'-фрагмент, который представляет собой Fab-фрагмент, имеющий один или несколько остатков цистеина на С-конце домена CH1;

(iii) Fd-фрагмент, имеющий домены VH и СН1;

(iv) Fd'-фрагмент, имеющий домены VH и СН1, и один или несколько остатков цистеина на С-конце домена CH1;

(v) Fv-фрагмент, имеющий домены VL и VH одного плеча антитела;

(vi) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 1989, 341, 544-546), который состоит из VH-домена;

(vii) выделенные области CDR;

(viii) F(ab')₂-фрагменты, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab'-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области;

(ix) одноцепочечные молекулы антител (например, одноцепочечный Fv; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; и Huston et al., PNAS (USA) 1988, 85, 5879-5883);

(x) диантитела с двумя антигенсвязывающими центрами, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной полипептидной цепи (см., например, ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6444-6448);

(xi) линейные антитела, содержащие пару тандемных Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; и патент США № 5641870).

Одноцепочечные антитела могут представлять собой одноцепочечные составные полипептиды, обладающие способностью связывать антиген и содержащие аминокислотные последовательности, гомо- 14 037613 логичные или аналогичные вариабельным областям легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, т.е. связанным VH-VL или одноцепочечному Fv (scFv).

Термин нейтрализующее антитело, как используют в рамках изобретения, относится к молекуле, имеющей антигенсвязывающий центр к конкретному рецептору или лиганду-мишени, способным снижать или ингибировать (блокировать) активность или передачу сигнала через рецептор при определении с использованием анализов in vivo или in vitro согласно спецификации.

Термин моноклональное антитело, как используют в рамках изобретения, относится к антителу, получаемому из совокупности, по существу, однородных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие совокупность, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, будучи направленными против одного антигена. Более того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение моноклональные не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом.

Моноклональные Ab можно получать способами, известными специалистам в данной области. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, можно получать способом гибридом, впервые описанным Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, или их можно получать способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также можно выделять из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al., Nature 1991, 352, 624-628 или Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597.

mAb по настоящему изобретению могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE или IgA. Гибридому, продуцирующую mAb, можно культивировать in vitro или in vivo. Высокие титры mAb можно получать посредством продуцирования in vivo, где клетки из отдельных гибридом инъецируют внутрибрюшинно стимулированных пристином мышей Balb/c для получения асцитной жидкости, содержащей высокие концентрации желаемых mAb. Моноклональные Ab изотипа IgM или IgG можно очищать из таких асцитных жидкостей или из культуральных супернатантов с использованием способов колоночной хроматографии, хорошо известных специалистам в данной области.

Термин антитело человека, как используют в рамках изобретения, относится к антителу, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемой у человека и/или полученной с использованием любого из способов получения антител человека, как описано в настоящем описании. Это определение антитела человека, в частности, не включает гуманизированное антитело, содержащее не являющиеся человеческими антигенсвязывающие остатки. Антитела человека можно получать с использованием различных способов, известных в данной области.

Термины молекула, имеющая антигенсвязывающую часть антитела и антигенсвязывающие фрагменты, как используют в рамках изобретения, включает не только интактные молекулы иммуноглобулинов любого изотипа и продуцированные любой клеточной линией животного или микроорганизмом, но также их антигенсвязывающую реакционноспособную фракцию, включающую, но не ограничивающуюся ими, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, вариабельную часть их тяжелой и/или легкой цепей, миниантитела Fab (см. WO 93/15210, патентная заявка США 08/256790, WO 96/13583, патентная заявка США 08/817788, WO 96/37621, патентная заявка США 08/999554, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки), димерные биспецифические миниантитела (см. Muller et al., 1998) и одноцепочечные антитела, включающие такую реакционноспособную фракцию, а также любой другой тип молекулы, в которую такая реактивная часть антитела физически встроена. Такие молекулы могут быть предоставлены посредством любого известного способа, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные способы.

Также изобретение относится к консервативным аминокислотным вариантам молекул антител согласно изобретению. Также можно получать варианты согласно изобретению, которые сохраняют общую молекулярную структуру кодируемых белков. Учитывая свойства индивидуальных аминокислот, содержащих описанные белковые продукты, некоторые рациональные замены будут понятны квалифицированному специалисту. Аминокислотные замены, т.е. консервативные замены можно вносить, например, исходя из сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфифильной природы вовлеченных остатков. Термин аналог антитела, как используют в рамках изобретения, относится к антителу, полученному из другого антитела посредством одной или нескольких консервативных замен.

Термин вариант антитела, как используют в рамках изобретения, относится к любой молекуле, содержащей антитело по настоящему изобретению. Например, слитые белки, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связаны с другой химической структурой, считаются вариантами антител.

Термин не полностью гуманизированное моноклональное антитело, как используют в рамках изо- 15 037613 бретения, относится к моноклональному антителу, имеющему вариабельные домены тяжелой цепи и/или легкой цепи, в которых аминокислотные последовательности, фланкирующие и/или непосредственно соседние с CDR, не являются полностью человеческими, т.е. не являются идентичными каким-либо гомологичным или соответствующим последовательностям, взятым из природных антител человека.

В фармацевтических и лекарственных составах активное вещество предпочтительно используют месте с одним или несколькими фармацевтически приемлемым носителем(ями) и необязательно любыми другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(и) должен быть фармацевтически приемлемым с точки зрения совместимости с другими ингредиентами состава, и не должен быть чрезмерно вредоносным для их реципиента. Активное вещество предоставляют в количестве, эффективном для достижения желаемого фармакологического эффекта, как описано выше, и в количестве, подходящем для достижения желаемой суточной дозы.

Как правило, молекулы по настоящему изобретению, содержащие антигенсвязывающую часть антитела или содержащие другой полипептид, включающий пептидный миметик, суспендируют в стерильном солевом растворе для терапевтических применений. Альтернативно, фармацевтические композиции можно составлять для контроля высвобождения активного ингредиента (молекула, содержащая антигенсвязывающую часть антитела) или для продления его присутствия в системе пациента. Многочисленные подходящие системы доставки лекарственных средств известны и включают, например, имплантируемые системы высвобождения лекарственных средств, гидрогели, гидроксиметилцеллюлозу, микрокапсулы, липосомы, микроэмульсии, микросферы и т.п. Препараты с контролируемым высвобождением можно получать с использованием полимеров для комплексообразования или адсорбции молекулы в соответствии с настоящим изобретением. Например, биосовместимые полимеры включают матриксы из сополимера этилена и винилацетата и матриксы из полиангидридного сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты. Скорость высвобождения молекулы в соответствии с настоящим изобретением, т.е. антитела или фрагмента антитела, из такого матрикса зависит от молекулярной массы молекулы, количества молекул в матриксе и размера диспергированных частиц.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любыми подходящими способами, такими как перорально, местным путем, интраназально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, внутрисуставным путем, внутрь очага повреждения или парентерально. Обычно используют внутривенное (в/в) введение.

Специалистам в данной области будет очевидно, что терапевтически эффективное количество молекулы в соответствии с настоящим изобретением зависит, среди прочего, от схемы введения, единичной дозы вводимый молекулы, введения молекулы в комбинации с другими лекарственными средствами, иммунного статуса и здоровья пациента, терапевтической активности вводимой молекулы и мнения лечащего врача. Как используют в рамках изобретения, терапевтически эффективное количество относится к количеству молекулы, требуемому для смягчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, подвергаемым лечению в течение периода времени.

Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае злокачественной опухоли терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать количество злокачественных клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или смягчать до некоторой степени один или несколько симптомов, ассоциированных с нарушением. Если лекарственное средство может предупреждать и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии злокачественной опухоли эффективность in vivo можно, например, измерять путем оценки продолжительности выживания, времени до прогрессирования заболевания (ТТР), частоты ответа (RR), длительности ответа и/или качества жизни.

Термин сахар относится к моносахаридам, дисахаридам и полисахаридам. Примеры сахаров включают, но не ограничиваются ими, сахарозу, трегалозу, декстрозу и другие.

Молекулы по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов растворяют, диспергируют или примешивают к эксципиенту, который является фармацевтически приемлемым и совместимым с активным ингредиентом, как хорошо известно. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер (PBS), декстроза, глицерин, этанол и т.п. и их комбинации.

Специалистам в данной области хорошо известны другие подходящие носители. Кроме того, если желательно, композиция может содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, рН-буферные средства.

Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить вместе с антинеопластической композицией. Согласно конкретному варианту осуществления антинеопластическая композиция содержит по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство. Химиотерапевтическое средство, которое можно вводить вместе с антителом в соответствии с настоящим изобретением или

- 16 037613 отдельно, может содержать любое такое средство, известное в данной области, которое проявляет активность против злокачественной опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, митоксантрон, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка, нарушающие веретено деления винбластин, винкристин, винорелбин (таксол), паклитаксел, доцетаксел; алкилирующие средства мехлорэтамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, мелфалан, ифосфамид; метотрексат; 6-меркаптопурин; 5-фторурацил, цитарабин, гемцитабин; подофиллотоксины этопозид, иринотекан, топотекан, дакарбазин; антибиотики: доксорубицин (адриамицин), блеомицин, митомицин; нитрозомочевину кармустин (BCNU), ломустин, эпирубицин, идарубицин, даунорубицин; неорганические ионы цисплатин, карбоплатин; интерферон, аспарагиназу; гормоны тамоксифен, леупролид, флутамид и магестрола ацетат.

Согласно конкретному варианту осуществления химиотерапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из алкилирующих средств, антиметаболитов, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пиримидинов, аналогов пуринов и родственных ингибиторов, алкалоидов барвинка, эпиподофиллотоксинов, антибиотиков, L-аспарагиназы, ингибитора топоизомеразы, интерферонов, координационных комплексов платины, антрацендион-замещенной мочевины, производных метилгидразина, адренокортикального супрессивного средства, адренокортикостероидов, прогестинов, эстрогенов, антиэстрогенов, андрогенов, антиандрогенов и аналогов гонадотропин-рилизинг фактора. Согласно другому варианту осуществления химиотерапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из 5-фторурацила (5-FU), лейковорина (LV), иринотекана, оксалиплатина, капецитабина, паклитаксела и доксетаксела. Два или более химиотерапевтических средств можно использовать в коктейле для введения в комбинации с введением антитела против СЕАСАМ1.

Термин лечение, как используют в рамках изобретения, относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают индивидуумов, которые уже имеют нарушение, а также индивидуумов, у которых нарушение намереваются предупредить.

Термины злокачественная опухоль и злокачественный относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают меланому, рак легкого, щитовидной железы, молочной железы, толстого кишечника, предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки, шейки матки, поджелудочной железы, лейкоз, лимфому, миелоидную злокачественную опухоль, рак яичника, рак матки, саркому, рак желчных путей или рак эндометрия.

Термин антинеопластическая композиция относится к композиции, пригодной для лечения злокачественной опухоли, содержащей по меньшей мере одно активное лекарственное средство, способное ингибировать или предупреждать рост или функцию опухоли, и/или вызывать разрушение опухолевых клеток. Лекарственные средства, пригодные в антинеопластической композиции для лечения злокачественной опухоли, включают, но не ограничиваются ими, химиотерапевтические средства, радиоактивные изотопы, токсины, цитокины, такие как интерфероны, и антагонистические средства, нацеленные на цитокины, рецепторы цитокинов или антигены, ассоциированные с опухолевыми клетками. Предпочтительно лекарственное средство представляет собой химиотерапевтическое средство.

Термин диагностика, как используют в рамках изобретения, относится к определению присутствия или отсутствия патологии, классификации патологии или симптома, определению тяжести патологии, мониторингу прогрессирования патологии, прогнозированию исхода патологии и/или определению перспектив к выздоровлению.

Термин мутация аминокислотного остатка, как используют в рамках изобретения, относится к замене, вставке или делеции одного аминокислотного остатка. Термин обратная мутация аминокислотного остатка, как используют в рамках изобретения, относится к замене одного аминокислотного остатка, встречающегося в каркасной области антитела человека, на соответствующий аминокислотный остаток, встречающийся в каркасной области антитела мыши.

Следующие примеры предоставлены для более подробной иллюстрации некоторых вариантов осуществления изобретения. Однако их никоим образом не следует истолковывать как ограничивающие широкий объем изобретения.

Примеры

Таблица 1 Последовательности CDR

Гуманизированное mAb в соответствии с настоящим изобретением содержит следующие шесть CDR

CDR3 V_L	CDR2 V_L	CDR1 V_L	CDR3 V_H	CDR2 V_H	CDR1 V_H
QQGKSLPRT SEQ ID NO: 6	YTSRLHS SEQ ID NO: 5	RTSQDIGNYLN SEQ ID NO: 4	GDYYGGFAVDY SEQ ID NO: 3	VINPGSGDTNYNEKF KG SEQ ID NO: 2	GYAFTNNLIE SEQ ID NO: 1

- 17 037613

Таблица 2

Последовательности не CDR вариабельных областей полностью мыши и полностью человека

CDR3-X	CDR2-X-CDR3	CDR1-X-CDR2	X-CDR1	Цепь
WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 39) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10) FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 43)	KATLTADKS SNTAYM QLSSLTSDDSAVYFC AR (SEQ ID NO: 38) RVTMT RDT SIS TAYM ELSRLRSDDTAVYYC AR (SEQ ID NO: 9) GVPSRFSGSGSGTDY SLTISNLEQEDIATY FC (SEQ ID NO: 42)	WVKQRPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 37) WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 8) WYQQKPDGTVKLLI Y (SEQ ID NO: 41)	QVQLQQSGAELVRPG TSVKVSCKAS (SEQ ID NO: 36) QVQLVQSGAEVKKPG ASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 7) DIQMTQTTSSLSASL GDRVTISC (SEQ ID NO: 40)	H мыши H человека L мыши
FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)	GVPSRFSGSGSGTDF TFTISSLQPEDIATY YC (SEQ ID NO: 13)	WYQQKPGKAPKLLI Y (SEQ ID NO: 12)	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITC (SEQ ID NO: 11)	L человека

Таблица 3

Последовательности не CDR гуманизированных подвергнутых обратной мутации вариабельных областей тяжелой цепи

CDR3-X	CDR2-X-CDR3	CDR1-X-CDR2	X-CDR1	Вариант
WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 23)	RATLTADKSINTAYMELS SLTS DDSAVYFCAR (SEQ ID NO: 18)	WVKQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 16)	QVQLVQSGAELKKP GASVKVSOKAS (SEQ ID NO: 15)	VH1
WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10)	RATLTADKSINTAYMELS RLRSDDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 19)	WVKQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 16)	QVQLVQSGAEVKKP GASVKVSOKAS (SEQ ID NO: 7)	VH2
WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10)	RATLTADKSINTAYMELS RLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 20)	WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 17)	QVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 7)	VH3
WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10)	RATLTADKSIS TAYMEL S RLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 21)	WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 17)	QVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 7)	VH4
WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10)	RVTMT ADKSIS TAYMEL S RLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 22)	WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 17)	QVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 7)	VH5

*Выделенные полужирным шрифтом и подчеркнутые аминокислоты с обратными мутациями на последовательность мыши.

- 18 037613

Таблица 4

Последовательности CDR подвергнутых обратной мутации гуманизированных вариабельных областей легкой цепи

CDR3-X	CDR2-X-CDR3	CDR1-X- CDR2	X-CDR1	Вариант
FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)	GVPSRFSGSGSGTDYT LTISSLQ2EDIATYFC (SEQ ID NO: 25)	WYQQKPGKAV KLLIY (SEQ ID NO: 24)	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITC (SEQ ID NO: 11)	VL1
FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)	GVPSRFSGSGSGTDYT LTISSLQPEDIATYFC (SEQ ID NO: 26)	WYQQKPGKAV KLLIY (SEQ ID NO: 24)	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITC (SEQ ID NO: 11)	VL2
FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)	GVPSRFSGSGSGTDYT FTISSLQPEDIATYFC (SEQ ID NO: 27)	WYQQKPGKAV KLLIY (SEQ ID NO: 24)	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITC (SEQ ID NO: 11)	VL3

Таблица 5

Последовательности не CDR подвергнутых обратной мутации гуманизированных _________________________вариабельных областей_________________________

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность	Вариабельные области
	SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 1 - SEQ ID	Вариабельная
28	NO: 16 - SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 18 -	область тяжелой
	SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 23	цепи #1
	SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1 - SEQ ID	Вариабельная
29	NO: 16 - SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 19 -	область тяжелой
	SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 10	цепи #2
	SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1 - SEQ ID	Вариабельная
30	NO: 17 - SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 20 -	область тяжелой
	SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 10	цепи #3
	SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1 - SEQ ID	Вариабельная
31	NO: 17 - SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 21 -	область тяжелой
	SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 10	цепи #4
	SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1 - SEQ ID	Вариабельная
32	NO: 17 - SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 22 -	область тяжелой
	SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 10	цепи #5
	SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 4 - SEQ ID	Вариабельная
33	NO: 24 - SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 25 -	область легкой
	SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 14	цепи #1
	SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 4 - SEQ ID	Вариабельная
34	NO: 24 - SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 26 -	область легкой
	SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 14	цепи #2
	SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 4 - SEQ ID	Вариабельная
35	NO: 24 - SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 27 -	область легкой
	SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 14	цепи #3

Эталонная полностью гуманизированная последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 57), в которую вносят обратные мутации, состоит из QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 7) GYAFTNNLIE (SEQ ID NO: 1) - WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 8) -VINPGSGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 2) - RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 9) - GDYYGGFAVDY (SEQ ID NO: 3) - WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10).

- 19 037613

Эталонная полностью гуманизированная последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 58), в которую внесены обратные мутации, состоит из DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 11)RTSQDIGNYLN (SEQ ID NO: 4) - WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 12) -YTSRLHS (SEQ ID NO: 5) GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 13) - QQGKSLPRT (SEQ ID NO: 6) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14).

Пример 1. Конструирование последовательностей вариабельной области антитела с пересаженными CDR.

Структурные модели V-областей химерного антитела против СЕАСАМ-1 получали с использованием Swiss PDB и анализировали для идентификации аминокислот в каркасных областях V-области, которые могут быть важными для связывающих свойств антитела (фиг. 1). Эти аминокислоты устанавливали для включения в один или несколько вариантов антител с пересаженными CDR. Как последовательности V_H, так и последовательности V_K CM-10 содержат типичные остатки каркасной области, и мотивы CDR 1, 2 и 3 сравнимы с многими антителами мыши. CDR были получены непосредственно из последовательности мыши. Затем модели Swiss PDB анализировали вместе с гомологией мышь/человек в ключевых положениях для установления каркасных областей и индивидуальных остатков, которые потенциально могли влиять на представление CDR.

Конструирование вариантов.

Аминокислотную последовательность V-области тяжелой и легкой цепей сравнивали против базы данных последовательностей V-области человека эмбрионального типа для идентификации последовательностей тяжелой и легкой цепей человека с наибольшей степенью гомологии для применения в качестве каркасных областей V-области. Затем конструировали серию V-областей тяжелой и легкой цепей путем пересадки CDR в каркасные области и, если необходимо, путем обратной мутации на последовательность мыши остатков, идентифицированных выше в качестве потенциально важных для сохранения эффективности связывания химерного антитела. Было определено, что небольшое количество остатков мыши должно быть сохранено в каждом варианте. Затем последовательности вариантов с наиболее низкой встречаемостью потенциальных Т-клеточных эпитопов выбирали с использованием собственной технологии Antitope in silico, iTope™ и TCED™ (база данных Т-клеточных эпитопов) (Perry et al. 2008, Bryson et al. 2010). Количество обратных мутаций определяли, начиная с последовательности мыши. Из структурного анализа было идентифицировано максимум 13 положений в V_H и 5 положений было идентифицировано в VK в качестве остатков, которые могли быть структурно важными. Им отдавали предпочтения и конструировали варианты, которые включали различные их количества. Хотя отсутствует теоретический предел количества обратных мутаций, чем больше включено обратных мутацией, тем менее человеческой может быть последовательность. Пять VH-цепей и три VK-цепи конструировали с последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 28-35.

iTope™ и TCED™.

Программное обеспечение iTope™ прогнозирует благоприятные взаимодействия между боковыми цепями аминокислот пептида и определенными связывающими карманами (в частности, положения карманов; p1, р4, p6, р7 и р9) в связывающих бороздках 34 аллелей МНС класса II человека. Определение положения ключевых связывающих остатков осуществляется посредством получения in silico 9-мерных пептидов, которые перекрываются на одну аминокислоту, охватывающих исследуемую белковую последовательность. Внутрилабораторное сравнение с физическими экспериментами по связыванию МНС класса II показало, что iTope™ можно использовать для успешного различения с высокой точностью пептидов, которые либо связывают, либо не связывают молекулы МНС класса II. Однако результаты следует оценивать ввиду того факта, что все прогнозирующие способы для связывания МНС класса II имманентно избыточно прогнозируют количество Т-клеточных эпитопов, поскольку они не допускают других важных процессов в процессе представления антигена, таких как процессинг белка/пептида, распознавание Т-клеточным рецептором или толерантность Т-клеток к пептиду.

TCED™ содержит последовательности всех пептидов, ранее подвергунтых скринингу в анализах картирования Т-клеточных эпитопов EpiScreen™. TCED™ используют для поиска любой исследуемой последовательности против большой (>10000 пептидов) базе данных пептидов посредством поиска в BLAST для специфической селекции сегментов, для которых ранее было показано, что они не стимулируют Т-клеточные ответы. Кроме того, какие-либо области со значительной гомологией с Т-клеточными эпитопами в базе данных были исключены.

Конструирование вариантов с пересаженными CDR.

Все гены вариантов областей VH и VK с пересаженными CDR для СМ-10 синтезировали с использованием серии перекрывающихся олигонуклеотидов, которые были подвергнуты отжигу, лигированы и амплифицированы способом ПЦР для получения полноразмерных синтетических V-областей. Затем собранные варианты клонировали непосредственно в экспрессирующую векторную систему VH-цепей и VKцепей как для IgG1, так и для IgG4 (S241P). Все конструкции подтверждали секвенированием.

Конструирование, экспрессия и очистка антител.

Гены химерных антител и все комбинации V_H- и VK-цепей с пересаженными CDR (т.е. всего 15 пар

- 20 037613 для каждого из IgG1 и IgG4 (S241P)) временно трансфицировали в клетки HEK293-EBNA (каталожный номер АТСС № CRL-10852) с использованием фосфата кальция. Смеси для временной трансфекции инкубировали в течение вплоть до пяти суток перед сбором супернатантов.

Химерные антитела и варианты СМ-10 с пересаженными CDR очищали из супернатантов временной культуры клеток на колонке с белком А-сефарозой (GE Healthcare cat. no. 110034-93), подвергали замене буфера на 1X PBS рН 7,4, и количественно определяли по OD_{280 нм} с использованием коэффициента экстинкции на основе спрогнозированной аминокислотной последовательности (E_c(₀,₁%)=~1,37-1,40 для химерного антитела СМ-10 и его вариантов). Химерные антитела и лидирующие гуманизированные варианты анализировали посредством восстанавливающего SDS-PAGE. Наблюдали полосы, соответствующие спрогнозированным размерам цепей VH и VK, без признаков какой-либо контаминации (фиг. 2).

Пример 2. Конкурентное связывание очищенных антител с СЕАСАМ-1 человека.

Связывание очищенного химерного антитела СМ-10, а также химерных антител и каждым из вариантов с пересаженными CDR, с рекомбинантным СЕАСАМ-1 человека оценивали в конкурентном ELISA. Серии разведений (трехкратных) химерных или гуманизированных антител от 20 мкг/мл до 0,009 мкг/мл предварительно смешивали с постоянной концентрацией биотинилированного химерного СМ-10 (0,005 мкг/мл, конечная концентрация), а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на 96-луночном планшете для микротитрования с плоским дном Nunc Immuno MaxiSorp (Fisher, каталожный номер № DIS-971-030J), предварительно покрытым 0,5 мкг/мл рекомбинантного СЕАСАМ-1 человека (R&D Systems, каталожный номер 2244-СМ-050), разбавленного 1X PBS, рН 7,4. Обнаружение связывания биотинилированного антитела проводили с использованием стрептавидин-HRP (Sigma, каталожный номер № S5512) и субстрата ТМВ (Invitrogen, каталожный номер № 00-2023). Реакцию останавливали 3М HCl, считывали поглощение при 450 нм на устройстве для считывания планшетов Dynex Technologies MRX ТС II и кривые связывания наносили на график.

Все гуманизированные варианты обеспечили сходные профили связывания с химерным СМ-10, кривые связывания для которых показаны на фиг. 3. Эти данные использовали для вычисления величин IC₅₀ для каждого антитела и их нормализовывали к IC₅₀ химерного СМ-10, как было включено в каждый ELISA и как показано в табл. 6 и 7.

Таблица 6 Величины IC₅₀ для гуманизированных вариантов против СЕАСАМ-1

Конструкция	1С₅₀ [IgG], мкг/мл
Варианты IgGl	Варианты IgG4 (S241P)
VH1/VK1	0,78	0,78
VH1/VK2	0,70	0,70
VH1/VK3	0,77	0,54
VH2/VK1	0, 68	0,43
VH2/VK2	0,78	0,76
VH2/VK3	0,76	0,71
VH3/VK1	0, 69	0,71
VH3/VK2	0, 85	0,77
VH3/VK3	0,86	0,73
VH4/VK1	0,73	0, 69
VH4/VK2	0,78	0, 69
VH4/VK3	0, 99	0, 63
VH5/VK1	0,77	0,74
VH5/VK2	0,72	0,70
VH5/VK3	0,74	0,70

- 21 037613

Таблица 7

Вычисленные относительные величины IC50 для гуманизированных вариантов _________________антител против СЕАСАМ-1__________________

Конструкция	1С₅₀, приведенная к СМ-10
Варианты IgGl	Варианты IgG4
VH1/VK1	1,46	1,52
VH1/VK2	1,32	1,36
VH1/VK3	1,44	1,05
VH2/VK1	1,29	0, 84
VH2/VK2	1,24	1,26
VH2/VK3	1,21	1,16
VH3/VK1	1, 10	1,16
VH3/VK2	1,36	1,26
VH3/VK3	1,37	1,23
VH4/VK1	1, 15	1,15
VH4/VK2	1,24	1,17
VH4/VK3	1,56	1,06
VH5/VK1	1,17	1,23
VH5/VK2	1, 09	1,16
VH5/VK3	1,12	1,17

Нормализованные данные IC50 продемонстрировали диапазон от 0,84 до 1,56 для всех исследованных вариантов, что указывает на то, что эффективность связывания всех антител с пересаженными CDR с СЕАСАМ-1 человека была сравнимой с эффективностью связывания химерного СМ-10.

Пример 3. Комбинирование гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 и антител против PD-1/PD-L.

А. Были продемонстрированы синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на цитотоксичность TIL-клеток человека против клеток меланомы человека. Злокачественные клетки меланомы человека (MALME 3M) выращивали в присутствии IFN-α для индукции экспрессии PD-L1. TILклетки человека (TIL14) инкубировали с моноклональным антителом к СЕАСАМ1 человека (СМ-24) (0,01 мкг/мл, 0,05 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл), моноклональным антителом к PD-1 человека (клон Е12,2Н7) или с комбинацией обоих антител (0,005, 0,025, 0,05 и 0,25 мкг/мл каждого антитела) в течение 30 мин при 37°C. Обработанные IFN-α злокачественные клетки меланомы человека добавляли для инкубации в течение ночи перед оценкой цитотоксичности. На фиг. 4 продемонстрировано, что как антитела против СЕАСАМ1, так и антитела против PD-1, были способны связывать их соответствующие мишени на лимфоцитах человека, таких как клетки TIL, и что это связывание значительно увеличивало токсичность TIL-клеток человека против злокачественных клеток человека относительно монотерапии отдельно. Таким образом, было сделано заключение, что защита лимфоцитов от иммунодепрессивных сигналов злокачественных клеток-мишеней приводит к значительной цитотоксичности в отношении этих злокачественных клеток.

В. Также показаны синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на уровни гранзима В и цитотоксичность TIL-клеток человека против клеток меланомы человека, когда антитела против PD-1 добавляли перед добавлением антител против СЕАСАМ1: злокачественные клетки меланомы человека (MALME 3M) выращивали в присутствии IFN-α для индукции экспрессии PD-L1. TILклетки человека (TIL14) инкубировали со средой отдельно (черный), неспецифическим IgG-антителом (0,8 мкг/мл, белый), различными концентрациями (0,05 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл) СМ-24, mAb к PD-1 человека (клон Е12.2Н7) или комбинацией обоих антител (0,05 мкг/мл каждого, 0,1 мкг/мл каждого, 0,2 мкг/мл каждого, 0,4 мкг/мл каждого, 0,8 мкг/мл каждого). Сначала добавляли моноклональное антитело к PD-1 человека в течение 30 мин при 37°C, а затем добавляли mAb к СЕАСАМ1 человека. Добавляли обработанные IFN-α злокачественные клетки меланомы человека для инкубации в течение ночи перед оценкой цитотоксичности. Был вычислен показатель аддитивности (CI), составивший 0,15. В том же анализе оценивали уровень цитотоксического белка гранзима В, который секретируется при активации цитотоксических клеток, с использованием коммерческого набора ELISA для гранзима В. На фиг. 5 продемонстрировано, что антитела против СЕАСАМ1 и антитела против PD-1 способны связывать их соответствующие мишени на лимфоцитах человека, таких как TIL-клетки, и что это связывание повышает секрецию гранзима В и токсичность TIL-клеток человека против злокачественных клеток человека. На фиг. 5 вновь указано, что защита лимфоцитов от иммунодепрессивных сиг-

- 22 037613 налов злокачественных клеток-мишеней приводит значительной цитотоксичности в отношении злокачественных клеток-мишеней, и предполагается, что выбор времени мог быть ключевым фактором в комбинированной терапии.

С. Оценивали синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-L1 на уровне гранзима В и цитотоксичность TIL-клеток человека против клеток меланомы человека, когда антитела против PD-L1 добавляли перед добавлением антител против СЕАСАМ1 (данные не представлены). Клетки меланомы человека (MALME 3M) выращивали в присутствии IFN-α для индукции экспрессии PD-L1. TIL-клетки человека (TIL14) инкубировали со средой отдельно (черный), неспецифическим IgGантителом (0,8 мкг/мл, белый), различными концентрациями (0,05 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл) моноклонального антитела к СЕАСАМ1 человека (СМ-24), моноклональным антителом к PD-L1 человека (клон 29E.2A3) или комбинацией обоих антител (0,05 мкг/мл каждого, 0,1 мкг/мл каждого, 0,2 мкг/мл каждого, 0,4 мкг/мл каждого, 0,8 мкг/мл каждого). Антитело против PD-L1 добавляли сначала в течение 30 мин при 37°C, а затем добавляли моноклональное антитело к СЕАСАМ1 человека. Обработанные IFN-α злокачественные клетки меланомы человека добавляли для инкубации в течение ночи перед оценкой цитотоксичности. Был вычислен показатель аддитивности (CI), составивший 0,67. Результаты соответствуют среднему значению % цuтотоксuчности±SE при определении с использованием классического анализа высвобождения LDH в трех экземплярах лунок на обработку. *Р<0,05, парный Т-критерий по сравнению с антителом против PD-L1 отдельно. В том же анализе оценивали уровни цитотоксического белка гранзима В, который секретируется при активации цитотоксических клеток, посредством коммерческого набора ELISA для гранзима В. Результаты соответствуют среднему уровню гранзима В в трех экземплярах лунок на обработку. Результаты демонстрируют, что антитела против СЕАСАМ1 и антитела против PD-L1 способны связывать их соответствующие мишени на лимфоцитах человека (таких как TIL-клетки) и на злокачественных клетках человека (таких как клетки меланомы), и что это связывание увеличивает секрецию гранзима В и токсичность TIL-клеток человека против злокачественных клеток человека. Кроме того, было продемонстрировано, что блокирование взаимодействий PD-1/PD-L1 и СЕАСАМ1/СЕАСАМ1 может приводить к синергичному эффекту и что защита лимфоцитов от иммуносупрессивного сигнала pD-1^{лимфоцит}/pD-лиганд^{злокачественная клетка} приводит к значительной цитотоксичности в отношении этих злокачественных клеток, независимо от антигенамишени: PD-1, PD-L1 или PD-L2.

D. Оценивали синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на цитотоксичность LAK-клеток человека против клеток меланомы человека, когда антитела против PD-1 добавляли перед добавлением антител против СЕАСАМ1. Клетки меланомы человека (SKMEL28, СЕАСАМ1положительные, PD-Ll-положительные) выращивали в присутствии IFN-α для индукции экспрессии PDL1. LAK-клетки (лимфокин-активируемые киллерные клетки) человека, полученные путем активации РВМС от здорового донора-человека посредством IL-2 (500 единиц/мл) в течение 7 суток инкубировали со средой отдельно (белый), неспецифическим IgG-антителом (0,8 мкг/мл, черный), различными концентрациями (0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл) моноклонального антитела к СЕАСАМ1 человека (СМ-24), моноклональным антителом к PD-1 человека (клон Е12.2Н7) или комбинацией обоих антител (0,1 мкг/мл каждого, 0,2 мкг/мл каждого, 0,4 мкг/мл каждого, 0,8 мкг/мл каждого). Сначала добавляли моноклональное антитело к PD-1 человека в течение 30 мин при 37°C, а затем добавляли моноклональное антитело к СЕАСАМ1 человека. Обработанные IFN-α клетки меланомы человека добавляли для инкубации в течение 24 ч перед оценкой цитотоксичности. На фиг. 6 продемонстрировано, что антитела против СЕАСАМ1 и антитела против PD-1 способны связывать их соответствующие мишени на активированных лимфоцитах человека, таких как LAK-клетки, и что это связывание увеличивает токсичность LAK-клеток человека против злокачественных клеток человека. Был вычислен показатель аддитивности (CI), составивший <0,8. Кроме того, на фиг. 6 продемонстрировано, что связывание этих антител с клетками LAK в некоторой степени взаимосвязано, что обосновывает дальнейшее исследование их механизма связывания, и что этот механизм присутствует в различных активированных лимфоцитах.

Е. Обработка антителами против СЕАСАМ1 повышает экспрессию PD-L1 на злокачественных клетках-мишенях. NK-клетки человека (NK92MI) инкубировали с моноклональным антителом к СЕАСАМ1 человека (10 мкг/мл СМ-24) или без него, а затем добавляли злокачественные клетки меланомы человека (SKMEL28). Клетки инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч и уровни PD-L1 измеряли в каждый момент времени с использованием FACS-анализа. Средние уровни соотношения антитела против PD-L1 и соответствующего изотипического контроля для указанных обработок в различные моменты времени показаны на фиг. 7, демонстрируя, что экспрессия СЕАСАМ1 и PD-L1 на злокачественных клетках действительно взаимосвязана. Добавление антител против СЕАСАМ1 приводит к увеличению экспрессии PD-L1 на выживших злокачественных клетках, таким образом, обеспечивая дополнительное подтверждение для комбинированного лечения обоими средствами. Может быть полезным лечение злокачественной опухоли путем введения сначала антител против СЕАСАМ1, а затем дальнейшего введения антител против PD-L1 и/или против PD-L2, поскольку количество белков PD-L1 на злокачественных клетках остается относительно высоким, что делает клетки более чувствительными к обработке антите-

- 23 037613 лами против PD-1/PD-L1, что подразумевает, что комбинированная терапия может улучшить клинический исход. Введение различных антител в различные моменты времени, а не одновременно, максимизирует цитотоксический эффект лимфоцитов против злокачественных клеток. Без связи с какой-либо теорией или механизмом, это открытие может быть связано с другим неожиданным открытием по настоящему изобретению, согласно которому обработка антителами против СЕАСАМ1 повышает экспрессию PD-L1 на злокачественных клетках-мишенях. Гипотетически это может служить в поддержку необходимости в множестве антител для достижения увеличенной эффективности цитотоксических лимфоцитов. Можно предусмотреть, что введение антител против PD-1 сначала блокирует молекулы PD-1 на лимфоцитах, последующее введение антител против СЕАСАМ1 блокирует молекулы СЕАСАМ1 на лимфоцитах и/или злокачественных клетках-мишенях и увеличивает экспрессию лигандов PD-1 на злокачественных клетках-мишенях. Однако поскольку молекулы PD-1 на лимфоцитах уже блокированы, повышенные уровни экспрессии лигандов PD-1 на клетках-мишенях не препятствуют эффективности проявления лимфоцитами их полного цитотоксического потенциала.

F. Синергические эффекты антител против СЕАСАМ1 и против PD-1 на прогрессирование опухоли у иммунокомпетентных мышей. Клетки лимфомы мыши (5х10⁶, А20) подвергали аллотрансплантации в область живота мышей Balb/C посредством подкожной инъекции на 1 сутки. На 10 сутки опухоли достигали среднего объема 45 мм³, и мышей случайным образом распределяли на 4 отдельных группы (11-12 мышей на группу), и им внутривенно вводили либо PBS, либо СС-1 (антитело мыши против СЕАСАМ1, 6 мг/кг), либо PRM-1 (антитело против PD-1 мыши, 6 мг/кг), либо комбинацию СС-1 и PRM-1 (6 мг/кг каждого). Введение повторяли на 15 и 20 сутки. Наблюдали эффект моноклонального антитела к СЕАСАМ1 человека отдельно, моноклонального антитела к PD-1 человека отдельно и комбинации обоих антител на ингибирование роста опухоли. Для этого эксперимента выбирали иммунокомпетентных мышей Balb/C, чтобы иметь возможность оценки биологической активности антител против СЕАСАМ1 мыши и против PD-1 мыши у мышей с интактной иммунной системой и для оценки реакции всей иммунной системы против злокачественных клеток мыши. В целом, эта модель имитирует способы терапии у человека, при которых пациентам со злокачественной опухолью вводят комбинации антител против СЕАСАМ1 человека и против PD-1/PD-L1/PD-L2 человек. Без связи с какой-либо теорией или механизмом полагают, что комбинация антител против СЕАСАМ1 и против PD-1/PD-L1/PD-L2 может препятствовать ускользанию злокачественных клеток от активации и цитотоксичности иммунной системы пациента, таким образом, вызывая значительный ответ против злокачественной опухоли. На фиг. 8 продемонстрировано, что антитела против СЕАСАМ1 и антитела против PD-1/PD-L1/PD-L2 способны связывать их соответствующие мишени на опухолевых клетках и/или иммунных клетках in vivo, и что это комбинированное связывание значительно ослабляет прогрессирование опухоли по сравнению с каждой монотерапией. Этот результат является в высокой степени важным, поскольку он подтверждает эффективность и потенциал применения комбинированных антител против СЕАСАМ1 и против PD-1/PD-L1/PDL2 даже при развернутых опухолях значительных объемов, которые имитируют клинические условия, когда лечат пациентов с развившимися опухолями.

Пример 4. Комбинированное лечение гуманизированным mAb к СЕАСАМ1 и LAK-клетками.

A. Антитела против СЕАСАМ1 увеличивают цитотоксичность LAK-клеток человека против клеток меланомы человека: клетки РВМС выделяли от здорового донора, а затем проводили активацию посредством IL-2 (500 или 1000 ед./мл) в течение 3 суток с получением популяции LAK-клеток человека. Затем LAK-клетки человека инкубировали с 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл или 10 мкг/мл антитела против СЕАСАМ1 (СМ-24) в течение 30 мин при 37°C. Добавляли клетки меланомы человека (SKMEL28) для инкубации в течение 24 ч, после чего определяли цитотоксичность. На фиг. 9 продемонстрировано, что хотя LAK-клетки человека сами по себе являются цитотоксичными для злокачественных клеток меланомы человека (см., например, два левых столбика), добавление антител против СЕАСАМ1 значительно повышает цитотоксичность в отношении этих злокачественных клеток меланомы человека дозозависимым образом.

B. Антитела против СЕАСАМ1 увеличивают цитотоксичность LAK-клеток человека против различных клеток рака поджелудочной железы и рака легкого человека. Клетки РВМС выделяли от здорового донора, а затем проводили активацию посредством IL-2 (500 ед./мл) в течение 7 суток для получения популяции LAK-клеток человека. Затем LAK-клетки человека инкубировали с от 0,1 до 10 мкг/мл антитела против СЕАСАМ1 (СМ-24), как указано, в течение 30 мин при 37°C. Добавляли три различных типа клеток рака поджелудочной железы человека: T3M4, SU8686 и PANC2 и два различных типа рака легкого человека: Н358 и Н460 для инкубации в течение 24 ч. На фиг. 10 продемонстрировано, что хотя LAK-клетки человека сами по себе являются цитотоксичными для злокачественных клеток поджелудочной железы человека T3M4, добавление антител против СЕАСАМ1 значительно увеличивает цитотоксичность в отношении этих злокачественных клеток человека дозозависимым образом. Сходные результаты получали для других клеток рака поджелудочной железы и рака легкого.

C. Антитела против СЕАСАМ1 усиливают секрецию гранзима В LAK-клетками человека в присутствии клеток рака поджелудочной железы и рака легкого человека. LAK-клетки человека инкубировали с антителом против СЕАСАМ-1 (СМ-24) в различных концентрациях в течение 30 мин при 37°C. Затем

- 24 037613 добавляли клетки рака поджелудочной железы человека T3M4 (А) или клетки рака легкого человека

Н358 (В) для инкубации в течение 24 ч. Секрецию гранзима В измеряли посредством ELISA. Результаты демонстрируют, что хотя LAK-клетки человека сами по себе продуцируют высокие уровни гранзима В, добавление антител против СЕАСАМ1 значительно повышает уровни гранзима В дозозависимым образом.

D. Антитела против СЕАСАМ1 усиливают секрецию IFN-γ LAK-клетками человека в присутствии злокачественных клеток человека. LAK-клетки человека инкубировали с антителом против СЕАСАМ-1 (СМ-24) в различных концентрациях в течение 30 мин при 37°C. Затем добавляли клетки рака легкого человека Н358 или Н460 для инкубации в течение 24 ч. Секрецию IFN-γ измеряли посредством ELISA. На фиг. 11 продемонстрировано, что хотя LAK-клетки человека сами по себе продуцируют высокие уровни IFN-γ, добавление антител против СЕАСАМ1 значительно увеличивает уровни IFN-γ дозозависимым образом.

Пример 5. Экспрессия СЕАСАМ1 коррелирует с присутствием мутаций B-Raf в злокачественных клетках.

А. Оценка биоптатов 24 пациентов с меланомой в отношении уровней экспрессии СЕАСАМ1 и в отношении генотипа BRAF показала, что существует статистически значимая корреляция между мутацией V600E B-Raf и экспрессией СЕАСАМ1. Более конкретно в то время как только 50% (3/6) клеток меланомы, имеющих B-Raf дикого типа, т.е. валин в положении 600, экспрессировали поддающиеся обнаружению уровни СЕАСАМ1 (Ct 36 и менее), 100% (18/18) клеток меланомы, имеющих мутантный BRaf, т.е. глутаминовую кислоту в положении 600, эспрессировали поддающиеся обнаружению уровни СЕАСАМ1 (Ct 36 и менее).

B. Проводили внеклеточное окрашивание на СЕАСАМ1 злокачественных клеток, обработанных ингибиторами B-Raf или MEK. 1,0x106 клеток из образца клеток B-Raf W.T. (076mel) и двух образцов клеток B-Raf V600E (526mel, 624mel) инкубировали с различными концентрациями вемурафениба или селуметиниба (0,1 мкМ или 1 мкМ) в течение 2-48 ч. В каждый момент времени определяли экспрессию СЕАСАМ1 на клетках посредством FACS. В качестве контроля использовали объемные эквиваленты DMSO (носитель). Результаты продемонстрировали, что хотя 0,1 мкМ и 1 мкМ вемурафениба не имели какого-либо эффекта на уровни экспрессии СЕАСАМ1 на клетках, имеющих W.T. B-Raf (076mel), 0,1 мкМ и 1 мкМ вемурафениба имели дозозависимый эффект на уровни экспрессии СЕАСАМ1 на клетках, имеющих мутантный B-Raf (526mel, 624mel). Кроме того, результаты демонстрируют, что селуметиниб имел сходный эффект с вемурафенибом на клетки, имеющие мутантный B-Raf (526mel, 624mel), и что хотя 1 мкМ селуметиниб значительно снижал уровни экспрессии СЕАСАМ1 на клетках, имеющих W.T. B-Raf, но мутантный N-Ras (sk-mel-2), 1 мкМ вемурафениб не имел эффекта на уровни экспрессии СЕАСАМ1. Эти результаты, кроме того, подтверждают регуляцию СЕАСАМ1 через конститутивно активируемый каскад MAPK, который в этом случае запускается мутантным N-Ras, но не мутантным BRaf.

C. Устойчивые к ингибитору злокачественные клетки демонстрируют увеличение экспрессии СЕАСАМ1 и восстановление активности каскада MAPK. Два чувствительных к вемурафенибу образца клеток B-Raf V600E (526mel, 624mel) и устойчивые к вемурафенибу клеточные линии, происходящие из них, инкубировали в течение 2 суток с 1 мкМ вемурафенибом. Затем клетки анализировали в отношении экспрессии белка СЕАСАМ1 посредством FACS, как описано выше. Устойчивые к вемурафенибу клеточные линии получали путем постепенного увеличения концентрации ингибитора в культуре вплоть до 0,32 мкМ. Было продемонстрировано, что устойчивые к вемурафенибу клеточные линии экспрессировали более высокие уровни СЕАСАМ1, чем чувствительные к вемурафенибу клеточные линии. Активность MAPK измеряли в образцах чувствительных к вемурафенибу и устойчивых к вемурафенибу клеток B-Raf V600E (624mel) путем иммуноблоттинга в отношении фосфорилированной ERK1/2 (pERK, Thr202/Tyr204), тотальной ERK1/2 и актина после воздействия 160 нМ вемурафениба в течение 24 ч. В чувствительных к вемурафенибу клетках B-Raf V600E вемурафениб практически полностью устраняет фосфорилирование ERK1/2, где активность MAPK практически не прерывалась вемурафенибом в устойчивых к вемурафенибу клетках V600E B-Raf.

D. Устойчивые к ингибитору злокачественные клетки повышают экспрессию СЕАСАМ1. Клетки меланомы B-Raf V600E 526mel культивировали в присутствии 1 мкМ вемурафениба.

Культивирование проводили в RPMI 1640, дополненной 1 мМ пируватом Na, 1 мМ Pen-Strep, 1 мМ L-глутамином, 1 мМ неосновными аминокислотами и 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сывороткой. Первоначальная концентрация вемурафениба составляла 0,01 от определенной IC₅₀ (0,64 нМ). Каждую неделю концентрацию удваивали вплоть до 5-кратной IC₅₀ (320 нМ), получая устойчивые к вемурафенибу клетки меланомы. Затем клетки исследовали в отношении экспрессии СЕАСАМ1 с использованием MRG1 (антитело мыши к СЕАСАМ1 человека) в проточной цитометрии, как описано выше. Тотальную РНК экстрагировали TRIZOL и кДНК получали с использованием обратной транскриптазы в соответствии со стандартными протоколами. Хотя вемурафениб подавляет экспрессию СЕАСАМ1 в клетках меланомы В-Raf V600E, уровни экспрессии СЕАСАМ1 в этих клетках повы- 25 037613 шаются, когда они приобретают устойчивость к вемурафенибу. Важно отметить, что уровни СЕАСАМ1 в клетках меланомы B-Raf V600E после приобретения устойчивости к вемурафенибу являются более высокими, чем уровни СЕАСАМ1 в необработанных (наивных по вемурафенибу) клетках меланомы BRaf V600E.

E. Устойчивые к ингибитору злокачественные клетки повышают экспрессию обоих типов СЕАСАМ1. Чувствительные к вемурафенибу и устойчивые к вемурафенибу клетки меланомы B-Raf V600E 526mel, упомянутые выше, исследовали в отношении типа СЕАСАМ1, сверхэкспрессируемого при приобретении устойчивости к вемурафенибу, способом qPCR. Данные, представленные на фиг. 12А и 12В, демонстрируют, что экспрессия обоих типов СЕАСАМ1: СЕАСАМ1-длинного (12А) и CEACAMI-κοροτκογο (12В) приблизительно в три раза повышена в устойчивых к вемурафенибу клетках по сравнению с чувствительными к вемурафенибу клетками.

F. Ингибиторы B-Raf/MEK увеличивают индуцируемую Т-клетками цитотоксичность. Два образца чувствительных к вемурафенибу клеток B-Raf V600E (526mel, 624mel) исследовали в отношении жизнеспособности в присутствии цитотоксических Т-клеток с 1 мкМ вемурафенибом или без него. Клетки меланомы преинкубировали с 1 мкМ вемурафенибом, а затем совместно инкубировали в течение ночи с совпадающими по HLA-A2 совпадающими по антигену Т-клетками в соотношении эффектор:мишень 5:1. Уничтожение клеток определяли по высвобождению LDH. Было продемонстрировано, что вемурафениб значительно повышает чувствительность клеток меланомы к цитотоксическим Т-клеткам. Ингибиторы B-Raf/MEK и антитела к СЕАСАМ1 повышают индуцируемую Т-клетками цитотоксичность к злокачественным клеткам in vitro.

Пример 6. Эффект СМ-24 против злокачественных клеток при различных дозах in vivo.

Мышам SCID-NOD трансплантировали в/в 5х 10⁶ клеток меланомы (клеточная линия MEL526), и их лечили в течение 44 суток в соответствии с группами введения, указанными на фиг. 13. Антитела вводили два раза в неделю посредством в/в инъекции и 10х10⁶ TIL вводили в/в каждые 10 суток. На 49 сутки мышей умерщвляли и легкие извлекали, фотографировали (фиг. 13А), взвешивали (фиг. 13В) и очаги повреждения подсчитывали (фиг. 13С). Фиг. 13А - цифровые фотографии легких мышей непосредственно после сбора. Фиг. 13В - массу опухоли вычисляли путем вычитания массы легкого из средней массы легкого различных групп введения. Результаты соответствуют среднему значению массы опухоли±SE для 7-8 мышей на группу введения. Фиг. 13С - количество очагов повреждения легких у отдельных мышей в различных группах; черные линии соответствуют срединным значениям для групп; легкие с не поддающимися подсчету очагами повреждения оценивали как 100. Для вычисления статистической значимости между группами использовали парный Т-критерий, *Р<0,05, **Р<0,025.

Лечение СМ-24 в присутствии TIL приводило к устойчивому ингибированию роста опухоли, что можно было оценить по морфологии легких (фиг. 13А), массе опухоли (фиг. 13В) и количеству очагов повреждения в легких (фиг. 13С), в то время как мыши, которым вводили контрольный IgG, продемонстрировали массивную опухолевую нагрузку и многочисленные очаги меланомы в легком. В группе, в которой вводили реактивные Т-клетки человека против меланомы с контрольным антителом (TIL + IgG), наблюдали только умеренное ингибирование роста опухоли (TGI 47%), однако когда добавляли СМ-24, была продемонстрирована значительная и зависимая от дозы активность против злокачественной опухоли при всех дозах (TGI 84%, 87%, 90% и 93% в дозах 1,3, 6 и 10 мг/кг соответственно) со статистической значимостью в дозах 6 и 10 мг/кг (фиг. 13В). Цифровые фотографии легких в день завершения анализа (фиг. 13А) продемонстрировали практически нормальную морфологию легких у мышей, которых лечили СМ-24 в присутствии TIL, таким образом, указывая на то, что СМ-24 в присутствии TIL практически полностью устраняет злокачественные клетки.

В группе, в которой вводили TIL и IgG-контроль, также наблюдали некоторый противоопухолевый эффект, как и ожидалось. Однако при сравнении эффекта с мышами, которых лечили СМ-24, в значениях TGI, количества очагов повреждения легких и морфологии легких, наблюдали значительные различия.

Оценка количества очагов повреждения в легких выявила очень низкие количества очагов повреждения в легких у всех мышей, которых лечили TIL и различными дозами СМ-24, и ни в одном из этих легких не было обнаружено более 10 очагов повреждения. С другой стороны, в группах IgG или TIL + IgG несколько животных продемонстрировали высокие количества очагов повреждения (>100) и срединные значения для группы были значительно более высокими, чем у мышей, которых лечили СМ-24 (фиг. 13С) (100 и 45 в группах IgG и TIL + IgG по сравнению с 5, 6, 3 и 2 в группах лечения СМ-24; Р<0,025).

Эти эффекты наблюдали при концентрациях только 1 мг/мл, однако они были статистически значимыми в значениях массы легкого при концентрациях СМ-24 6 и 10 мг/кг.

Особые примечания: 1 мышь из группы IgG продемонстрировала тяжелые клинические проявления, в том числе паралич конечностей, и она была умерщвлена на 33 сутки (была обнаружена массивная опухолевая нагрузка в легком); 1 мышь из группы TIL+ IgG продемонстрировала признаки болезненности и погибла на 49 сутки, в день завершения анализа (было обнаружено несколько очагов повреждения); 1 мышь из группы TIL+ СМ-24 продемонстрировала тяжелые клинические проявления и сниженную массу тела и была умерщвлена на 39 сутки (не было обнаружено признаков очагов повреждения); 3 мыши из

- 26 037613 группы PBS продемонстрировали тяжелые клинические проявления в ходе эксперимента и были умерщвлены на 42 сутки, и другие две мыши были умерщвлены на 48 сутки (у всех мышей была обнаружена массивная опухолевая нагрузка, включающая высокое количество очагов повреждения в легком).

В день завершения исследования использовали проточно-цитометрический анализ в комбинации с набором QuantiBrite KIT для определения занятости рецептора СЕАСАМ1 посредством СМ-24 в TIL человека, выделенных из легких подвергнутых лечению мышей. Величины занятости рецепторов (RO) у мышей, которых лечили различными дозами СМ-24, продемонстрировали (фиг. 14), что RO 50% могла быть приписана концентрациям 1 мг/кг (сывороточный уровень СМ-24 в крови), и >90% RO была продемонстрирована при дозах 3, 6 и 10 мг/кг (сывороточные уровни СМ-24 0,3, 48,5 и 111 мкг/мл соответственно). Исследование величин RO для СЕАСАМ1 проводили с использованием проточноцитометрического анализа с использованием конъюгированного с РЕ антитела СМ-24 и набора QuantiBrite Kit (BD). Результаты соответствуют среднему значению±SE для величин RO на TIL, выделенных из легкого 8-9 мышей на группу лечения. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Kaluza.

Из представленных выше данных очевидно, что значительное ингибирование роста опухоли наблюдали у мышей, которых лечили СМ-24 в присутствии TIL, что приводило практически к полному устранению злокачественных клеток. Хотя все дозы СМ-24 продемонстрировали эффективные ответы против злокачественной опухоли, возрастающие дозы продемонстрировали корреляцию с более высокими величинами ингибирования роста опухоли (TGI 84, 87, 90 и 93, соответствующий дозам 1, 3, 6 и 10 мг/кг соответственно), которые были также статистически значимыми. Результаты RO ex vivo демонстрируют RO>90% в дозах 3, 6 и 10 мг/кг (сывороточные уровни СМ-24 0,3, 48,5 и 111 мкг/мл соответственно), в то время как в дозе 1 мг/кг была выявлена RO 50%. При оценке данных RO для мышей, которых лечили СМ-24 в дозе 1 мг/кг, хотя сывороточные концентрации СМ-24 являются очень низкими, данные RO демонстрируют, что СМ-24 все еще связывается с TIL в легких, подразумевая, что СМ-24 может опосредовать длительный эффект в опухолевом микроокружении in vivo.

Эти результаты подтверждают действие СМ-24 в качестве усилителя цитотоксической активности эффекторных клеток против злокачественных клеток и демонстрируют, что СМ-24 является эффективным средством против злокачественной опухоли.

Пример 7. Обобщение доклинических данных.

СМ-24 представляет собой гуманизированное моноклональное IgG4-антитело против СЕАСАМ1 человека, которое связывает N-концевой домен СЕАСАМ1 и блокирует внутриклеточное взаимодействие через СЕАСАМ1 между активированными лимфоцитами и опухолевыми клетками; таким образом, блокада взаимодействий СЕАСАМ1 посредством СМ-24 предложена для усиления активности уничтожения лимфоцитами и является перспективным направлением иммунотерапии злокачественной опухоли.

СМ-24 демонстрирует высокую аффинность и селективное связывание с СЕАСАМ1 человека, который экспрессируется активированными лимфоцитами или опухолевыми клетками. Данные в иммуномодулирующих моделях in vitro продемонстрировали, что СМ-24 является мощным блокатором внутриклеточных взаимодействий СЕАСАМ1-СЕАСАМ1 и может усиливать цитотоксическое уничтожение различных положительных по СЕАСАМ1 человека опухолевых клеток положительными по СЕАСАМ1 NK и лимфокин-активируемыми киллерными (LAK) клетками и инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL). Усиленная активность уничтожения, индуцируемая СМ-24, может опосредоваться гранзимом В и секрецией IFNy, как продемонстрировано в различных моделях.

СМ-24 усиливает цитотоксическую активность эффекторных клеток в присутствии положительных по СЕАСАМ1 опухолевых клеток и в контексте специфической реакции ограниченных по лейкоцитарному антигену человека (HLA) Т-клеток. СМ-24 не усиливает цитотоксическую активность эффекторных лимфоцитов против положительных по СЕАСАМ1 не являющихся мишенями клеток (нормальные клетки человека). Кроме того, данные показывают, что СМ-24 не имеет лигандподобных агонистических эффектов, связанных с Fc эффекторных функций или прямых эффектов. Связывание СМ-24 с СЕАСАМ1 не индуцирует агонистическую активность, и в отсутствие клеток-мишеней нельзя было наблюдать эффекта СМ-24 на эффекторные клетки, как продемонстрировано в функциональных анализах in vitro. Также ожидается, что СМ-24 не индуцирует антителозависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC), поскольку оно представляет собой IgG4, который неспособен связывать компонент комплемента C1q и медиатор ADCC FcY-RIIIa и не имеет прямого эффекта на скорость пролиферации или жизнеспособность положительных по СЕАСАМ1 первичных клеток (лимфоциты, эпителиальные и эндотелиальные клетки).

Различные модели с ксенотрансплантатом опухоли in vivo демонстрируют, что СМ-24 имеет отчетливую активность против злокачественной опухоли, которая сопровождается увеличением иммунологической активности Т-клеток в опухоли.

Блокада СЕАСАМ1 может смягчать опосредуемое СЕАСАМ1 ингибирование положительных по СЕАСАМ1 инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, встречающих положительные по СЕАСАМ1 злокачественные клетки, в микроокружении опухоли. Ожидается, что иммунологическим эффектом будет

- 27 037613 усиление локального иммунного ответа против опухолевых клеток, которое, как ожидается, приведет к их устранению и последующей клинической регрессии.

Доклиническая оценка безопасности СМ-24 включала оценку эффекта СМ-24 на пролиферацию Т клеток и секрецию провоспалительных цитокинов. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека и цельную кровь от 10 здоровых доноров оценивали, и антитела предоставляли как в растворимой, так и в иммобилизованной форме. Отсутствовала заметная индуцируемая СМ-24 пролиферация и отсутствовала значительная секреция провоспалительных цитокинов в формате стимуляции растворимым или иммобилизованным путем покрытия сухим антителом.

Исследование с повторяющейся дозой в течение 6 недель проводили у макаков-резус для оценки токсичности и токсикокинетики СМ-24. СМ-24 вводили посредством внутривенной (в/в) инфузии (предполагаемый клинический путь введения) раз в две недели на протяжении всего 4 доз (имитирующих предполагаемый курс лечения у пациентов с онкологическими заболеваниями) в дозах, соответствующих 2,5Х (25 мг/кг) и 10Х (100 мг/кг) расчетной максимальной дозе у человека (10 мг/кг). Не наблюдали явных обусловленных введением неблагоприятных реакций, макроскопических или микроскопических патологических данных и смертности. Офтальмоскопия и электрокардиография показали отсутствие данных, связанных с введением. Кроме того, было выявлено, что все тесты крови и мочи макаков-резус находились в нормальных диапазонах. В совокупности, базовое исследование токсикологии с повторяющейся дозой GLP у макаков-резус продемонстрировало отсутствие обусловленной введением токсичности при любом уровне дозы, и уровень без наблюдаемых побочных эффектов (NOEL) был определен как 100 мг/кг. Оценка токсикокинетики продемонстрировала пропорциональное дозе увеличение экспозиции СМ-24 (Cmax, AUC) при введении посредством в/в инфузии. Небольшое увеличение Cmax и AUC на 42 сутки по сравнению с 0 сутками может указывать на потенциал к некоторому накоплению СМ-24 при введении mAb посредством этого ROA и режима дозирования при этих уровнях доз. Только одно животное в группе 2 (25 мг/кг) продемонстрировало положительный ответ антитела против СМ-24, что указывает на то, что ответ ADA, наиболее вероятно, не имел эффекта ни на исследование фармакокинетики, ни на исследование токсичности. Этот результат не соответствует выраженному иммуногенному ответу на повторяющееся дозирование СМ-24.

Безопасная клиническая начальная доза для СМ-24 на основе MABEL, определенная в экспериментах in vivo в моделях с ксенотрансплантатами опухолей на мышах, находится в диапазоне 0,2-1 мг/кг, включая 10-кратный коэффициент безопасности. Базовое токсикологическое исследование с повторяющейся дозой GLP у макаков-резус показало отсутствие связанной с введением токсичности на любом уровне дозой, и уровень без наблюдаемых побочных эффектов (NOEL) был определен как 100 мг/кг (эквивалентная доза для человека (HED) 100 мг/кг в расчете по весу), что отчетливо подтверждает диапазон, определенный посредством оценки MABEL. Результаты анализа пролиферации РВМС и продукции ими провоспалительных цитокинов in vitro/ex vivo продемонстрировали отсутствие значительной обусловленной СМ-24 индукции пролиферации Т-клеток и продукции провоспалительных цитокинов.

Пример 8. Открытое многоцентровое многодозовое исследование фазы 1 с увеличением дозы СМ24 у субъектов с отдельными развернутыми или рецидивирующими злокачественными опухолями.

Для данного исследования было выбрано шесть типов опухолей: меланома, немелкоклеточная аденокарцинома легкого, рак желудка, рак ободочной и прямой кишки, рак мочевого пузыря и рак яичника, поскольку они являются репрезентативными опухолями, для которых существует высокая медицинская потребность в новых способах лечения; опухолями, для которых существует прецедент клинических ответов на другие способы иммунотерапии; и опухолями, для которых существуют подтверждающие корреляционные патологические данные, указывающие на то, что каскад СЕАСАМ1 является важным для прогрессирования опухоли.

Исследование включает 2 фазы: часть с увеличением дозы и часть с расширением выборки. Часть с увеличением дозы длится по меньшей мере 12 недель, начиная с 4 инфузий (курс 1) для каждого индивидуума. Индивидуумов без ограничивающей дозу токсичности (DLT) и демонстрирующих признаки клинической пользы (полный ответ - CR, частичный ответ - PR, стабильное заболевание - SD), а также индивидуумы с прогрессирующим заболеванием - PRD) при визуализирующей оценке, которые в остальном являются клинически стабильными, лечат в течение вплоть до всего 5 дополнительных курсов (продолженный период лечения), которые длятся вплоть до дополнительных 38 недель лечения и по меньшей мере 25 недель наблюдения (всего 75 недель/приблизительно 15 месяцев). Часть с расширением длится вплоть до 46 недель лечения и по меньшей мере 25 недель наблюдения (всего 71 неделя/приблизительно 14 месяцев) у индивидуумов с кожной меланомой.

Первичные задачи.

1) Оценить безопасность и переносимость возрастающих многократных доз СМ-24 (вводимого внутривенно) и

2) определить рекомендованную дозу СМ-24 фазы 2 у субъектов с развернутыми или рецидивирующими злокачественными опухолями, включая меланому, немелкоклеточную аденокарциному легкого, рак желудка, рак ободочной и прямой кишки, рак мочевого пузыря и рак яичника.

Вторичные задачи включают:

- 28 037613

1) характеризация фармакокинетического профиля многократных доз СМ-24,

2) характеризация иммуногенности СМ-24,

3) оценка предварительной эффективности, исходя из объективного ответа опухоли и длительности ответа у субъектов, которых подвергали лечению СМ-24.

Задачи исследования включают:

1) исследование потенциального прогностического биомаркера, ассоциированного с клинической активностью СМ-24, исходя из уровней экспрессии СЕАСАМ1 в образцах опухоли перед лечением,

2) исследование иммуномодулирующей активности СМ-24 на отдельных популяциях иммунных клеток и растворимых факторах в опухолях и периферической крови,

3) оценка общей выживаемости у индивидуумов, которых лечили СМ-24.

Часть с увеличением дозы: дозирование исследуемого лекарственного средства планируют проводить пошаговым путем, начиная с 0,01 мг/кг и продолжая до 0,03 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг, 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг. Индивидуумам будут присваивать уровень дозы для начала исследования. Для первых двух уровней доз (0,01 мг/кг и 0,03 мг/кг) 1 пациента в каждой группе включают по ускоренной схеме, согласно которой единичная обусловленная лекарственным средством токсичность степени 2 приводит к расширению до схемы 3 + 3 при этой дозе и всех последующих дозах. Для индивидуумов в двух группах более низкой дозы (0,01 мг/кг и 0,03 мг/кг) увеличение дозы от первой группы низкой дозы с одним пациентом (0,01 мг/кг) до следующей группы (0,03 мг/кг), и от второй группы с однократной дозой (0,03 мг/кг) до следующей группы (0,1 мг/кг) начинается после окна DLT в течение 6 недель, если не происходит токсичности степени 2 или более. Для уровней доз 0,1 мг/кг и выше по меньшей мере 3 пациентов на группу включают в стандартную схему 3+3, если не происходит DLT, в случае которой группу расширяют до 6 пациентов. Расширение до следующей группы начинается только после окна DLT в течение 8 недель, начинаясь с первого введения исследуемого лекарственного средства первого индивидуума каждой группы.

Период дозирования включает три периода: скрининг, дозирование и наблюдение: 1) 4 повторяющихся дозы, которые включают первый курс, за которым следует период наблюдения в течение 6 недель), 2) продолжающийся период лечения (курсы 2-6) и 3) период наблюдения, включающий оценку общей выживаемости. Каждый курс лечения включает введение 4 доз исследуемого лекарственного средства каждые 2 недели. По меньшей мере 3 индивидуума на группу включают в стандартную схему 3+3. Минимальное планируемое количество индивидуумов, включенных в эту часть, составляет 17, однако оно может возрасти, если возникнет ограничивающая дозу токсичность (DLT). Если DLT возникает при данном уровне дозы, этот уровень дозы расширяют до 6 индивидуумов, таким образом, максимальное количество индивидуумов в части с увеличением дозы составляет 42.

Включенным индивидуумам проводят 4 введения, по одному каждые 2 недели (курс 1), а затем следует период наблюдения в течение 6 недель; после чего индивидуумы входят в период продолжающегося лечения, в ходе которого им проводят дополнительные курсы (2-6). В период продолжающегося лечения индивидуумам проводят клиническую и лабораторную оценку, в том числе физикальное обследование (масса тела, основные показатели жизнедеятельности и насыщаемость кислородом), оценку фармакокинетики и фармакодинамики, лабораторное тестирование набора цитокинов, а также безопасности, и анализы иммунной безопасности, и регистрируют ЭКГ. Всем индивидуумам проводят оценку ответа через одну неделю и пять недель после курса 1 посредством визуализации и клинической оценки. После включения в продолжение исследования проводят дополнительную оценку ответа непосредственно перед началом следующего курса. После последнего курса продолжающегося лечения у индивидуумов проводят наблюдение безопасности, эффективности и выживаемости.

Часть с расширением: вплоть до 20 индивидуумов с метастазирующей кожной меланомой включают и лечат при рекомендованной дозе 2 фазы (RP2D). Она включает 3 периода: скрининг, дозирование и наблюдение. Период дозирования состоит из 6 курсов из 4 введений, которые проводят каждые 2 недели. Период наблюдения включает оценку общей выживаемости.

Включенным индивидуумам вводят рекомендованную дозу 2 фазы каждые 2 недели в каждом курсе. Проводят четыре введения и индивидуумы продолжают лечение вплоть до 6 курсов. В ходе периода дозирования индивидуумам проводят клиническую и лабораторную оценку, как подробно описано выше.

Индивидуумы должны иметь период вымывания из по меньшей мере 4 недель перед первым введением исследуемого лекарственного средства и после предшествующей химиотерапии и экспериментальных средств, за исключением иммуномодуляторов (например, но не ограничиваясь ими: антитела против CTLA4, против PD-L1, против PD-1, IL-2), которые должны иметь период вымывания по меньшей мере 6 недель перед первым введением исследуемого лекарственного средства, и все неблагоприятные явления должны либо возвратиться к исходному уровню, либо стабилизироваться на уровне 1 степени или менее.

Индивидуумы с меланомой, положительной по мутации V600E или V600K B-Raf, должны иметь прогрессирование или должны иметь непереносимость к предшествующей терапии ингибитором B-Raf и/или MEK.

- 29 037613

Часть с увеличением дозы.

Курс 1 состоит из периода повторяющегося дозирования в течение 6 недель (4 дозы, каждая с интервалом 2 недели) и периода наблюдения в течение 6 недель.

Минимум 1 неделя должна пройти между первым введением какому-либо индивидууму в группе введения дозы и первым введением другому индивидууму в этой группе введения дозы.

За индивидуумами тщательно наблюдают в ходе первоначального периода исследования в течение 12 недель. Всем индивидуумам проводят оценку ответа через одну неделю и пять недель после окончания 1 курса для документирования и подтверждения клинической пользы, определяемой как стабильное заболевание (SD), частичный ответ (PR) или полный ответ (CR) к 12 неделе. Индивидуумы с признаками прогрессирующего заболевания (PRD) при визуализации либо на 7 неделе, либо на 11 неделе, после повторного согласия в форме информированного согласия (ICF) могут продолжить участие в исследовании и продолжить лечение СМ-24, если исследователь сочтет это клинически оправданным в соответствии с Правилами остановки Раздела клинического ухудшения, с дальнейшей оценкой на 15 неделе. Если визуализация для наблюдения на 15 неделе подтверждает PRD, индивидуум не продолжает лечение вследствие подтвержденного прогрессирования заболевания.

Всем индивидуумам с DLT, в том числе индивидуумам с отсроченными DLT, прекратят дальнейшее дозирование СМ-24, но они не будут исключены из исследования.

Индивидуумы, которых исключили из исследования до завершения первых 3 введений исследуемого лекарственного средства в первоначальный период исследования (курс 1), заменяют. Индивидуумы, которых исключают по какой-либо другой причине, отличной от отзыва согласия, наблюдают на протяжении 4 посещений для наблюдения в течение шести месяцев.

Курсы 2-6 называют периодом продолжающегося лечения. После первоначального периода исследования индивидуумы с признаками клинической пользы, определяемой как SD, PR или CR в соответствии с модифицированными критериями RECIST 1.1 и без признаков ограничивающей дозу токсичности (DLT) к 12 неделе могут продолжать лечение СМ-24 на том же уровне дозы, который вводили в ходе первоначального периода исследования, в течение 5 дополнительных курсов лечения. Индивидуумы с PRD, который подтвержден, но не является ухудшением и с в остальном стабильным или улучшенным клиническим статусом должны продолжать лечение исследуемым лекарственным средством до дальнейшего прогрессирования или клинического ухудшения.

Каждый полный курс лечения в период продолжающегося лечения включает 4 дозы исследуемого лекарственного средства с интервалом 2 недели, на 1, 15, 29 и 43 сутки. Оценку ответа проводят между 52 и 56 сутками каждого курса лечения. Оценка ответа должна быть завершена до введения первой дозы следующего курса.

В период продолжающегося лечения индивидуумы с PRD, которое подтверждено, но не является ухудшением и с в остальном стабильным или улучшенным клиническим статусом, должны продолжить лечение исследуемым лекарственным средством до дальнейшего прогрессирования или клинического ухудшения.

После последнего введения СМ-24 в период продолжающегося лечения каждого индивидуума наблюдают на протяжении 4 посещений для наблюдения в течение шести месяцев.

Всем индивидуумам с DLT, включая отсроченные DLT, прекращают дальнейшее дозирование СМ24, но их не исключают из исследования.

Всех индивидуумов наблюдают в течение неопределенного срока в отношении выживаемости.

Расширение группы.

Для первых двух уровней доз (0,01 мг/кг и 0,03 мг/кг) 1 пациента в каждой группе включают по ускоренной схеме, согласно которой единичная обусловленная лекарственным средством токсичность степени 2 приводит к расширению до схемы 3+3 при этой дозе и всех последующих дозах. Для индивидуумов в двух группах более низкой дозы (0,01 мг/кг и 0,03 мг/кг) увеличение дозы от первой группы низкой дозы с одним пациентом (0,01 мг/кг) до следующей группы (0,03 мг/кг), и от второй группы с однократной дозой (0,03 мг/кг) до следующей группы (0,1 мг/кг) начинается после окна DLT в течение 6 недель, если не происходит токсичности степени 2 или более. Для уровней доз 0,1 мг/кг и выше по меньшей мере 3 пациентов на группу включают в стандартную схему 3+3, если не происходит DLT, в случае которой группу расширяют до 6 пациентов. Расширение до следующей группы начинается только после окна DLT в течение 8 недель, начинаясь с первого введения исследуемого лекарственного средства первого индивидуума каждой группы.

Если никакой дополнительный индивидуум в группе из 6 индивидуумов не имеет DLT, тогда после изучения данных безопасности для всех индивидуумов Комитетом по безопасности может происходить увеличение дозы.

Если у 2 или более индивидуумов в группе введения дозы из 3 или 6 индивидуумов развивается DLT, увеличение дозы прекращают, и если группа предшествующего уровня дозы еще не расширена до 6 индивидуумов, ее расширяют до 6 индивидуумов, если группа предшествующего уровня дозы уже расширена до 6 индивидуумов, Комитет по безо- 30 037613 пасности после изучения данных по безопасности на текущую дату может определить (предшествующий) уровень дозы как рекомендованную дозу 2 фазы (RP2D), или рекомендовать оценку новой группы при промежуточной дозе.

Рекомендованную дозу 2 фазы (RP2D) определяют как наиболее высокий уровень дозы, при которой не более чем 1 из 6 индивидуумов испытывают DLT.

Увеличение дозы.

Если DLT не возникает в период наблюдения DLT в течение 6 недель для групп с более низкой дозой и для остальных групп в период наблюдения DLT в течение 8 недель, тогда начинают следующую группу и повторяют ту же схему. Между включением индивидуумов в группу каждого уровня дозы существует период ожидания в течение одной недели. Перед увеличением дозы доступные данные по безопасности для всех индивидуумов, которых лечили в исследовании на текущую дату, включая текущую группу, оцениваются Комитетом по безопасности.

Введение (1 курс) в группе следующей дозы начинают только после завершения повторяющегося дозирования (1 курс) для всех индивидуумов в группе предшествующей дозы. Момент времени исследования Комитетом по безопасности основан на данных, указывающих на то, что irAE у пациентов, которых лечат другими иммуномодуляторами, возникают в течение 5-10 недель после введения. Если возникает DLT, требующий расширения группы введения дозы до шести индивидуумов, период DLT расширяют, чтобы он охватывал полное повторяющееся дозирование (курс 1) для всех шести индивидуумов.

Если после увеличения дозы при наличии 2 или более отсроченных DLT при более низкой дозе и если этот АЕ может быть возможным отсроченным DLT, связанным с СМ-24, увеличение дозы временно останавливают и уведомляют Комитет по безопасности в течение 24 ч. Комитет по безопасности быстро оценит явление и соответствующую информацию, в том числе данные РК, и внесет какое-либо необходимое корректирование дозы и/или схемы увеличения дозы. Те же шаги будут предприняты, если 2 или более отсроченных DLT возникнут в ранее исследованной расширенной группе из 6 индивидуумов.

Отсроченные DLT будут рассматриваться Комитетом по безопасности согласно руководствам и решения будут приниматься для каждого случая отдельно. Такие действия могут включать использование стандартных правил увеличения при DLT, возвращение к более низкой или промежуточной дозе или отказ от каких-либо действий, если исследуемое связанной с дозой явление не является достаточно серьезным для остановки увеличения дозы и текущее дозирование не считается имеющим риск для индивидуумов.

Часть расширения.

Часть расширения в этом исследование позволяет включение вплоть до 20 индивидуумов с развернутой кожной меланомой. Могут быть открыты другие группы расширения из вплоть до 20 индивидуумов, при условии изменения протокола, при показаниях, ранее исследованных в части увеличения дозы испытания, если ранние признаки эффективности служат основанием для этого. Включенных индивидуумов лечат RP2D в течение вплоть до шести курсов, причем введение проводят на 1, 15, 29 и 43 сутки. Оценку ответа проводят между 52 и 56 сутками. Оценка ответа должна быть завершена до введения первой дозы следующего курса.

Включение в часть с расширением может быть остановлено, если частота DLT составляет >33%. Индивидуумы, для которых исследуемое лекарственное средство является переносимым, не исключаются автоматически из продолжающегося дозирования до изучения Комитетом по безопасности, и они допускаются к продолжающемуся дозированию до тех пор, пока оно не перестанет быть переносимым, если не будет указано обратное в результате изучения безопасности. После анализа безопасности принимают решение, возобновить ли включение и продолжить ли дозирование при текущей дозе или продолжить ли включение дополнительных индивидуумов в группу более низкой дозы. В случае DLT включение останавливают и/или начинают вновь после изучения Комитетом по безопасности.

Руководство по принятию решения о лечении.

Ответ опухоли оценивают с использованием критериев оценки ответа при солидных опухолях (RECIST 1.1). Оценку ответа опухоли в конце курса для всех индивидуумов проводят на 52-56 сутки каждого курса лечения (результаты оценки должны быть изучены и документированы перед первой дозой следующего курса). После каждого (продолжающегося или с расширением) курса лечения решение лечить индивидуума дополнительным курсом СМ-24 основано на оценке опухоли, если у индивидуума не развивается неблагоприятное явление степени >3 (СТСАЕ) или другое неблагоприятное явление, связанное с СМ-24, которое исключает дальнейшее лечение. Индивидуумов лечат до подтвержденного полного ответа (CR) или прогрессирующего заболевания (PRD), оба из которых являются подтвержденными, а затем действуют далее, как описано ниже. Индивидуумы с PRD, которое является подтвержденным, но не является ухудшением и с в остальном стабильным или улучшенным клиническим статусом (т.е. без снижения функционального статуса ECOG) должны продолжить лечение исследуемым лекарственным средством до дальнейшего прогрессирования или клинического ухудшения, как далее указано ниже.

Индивидуумы с наилучшим общим ответом (BOR) CR, PR или SD продолжают получать лечение

- 31 037613

СМ-24 до первого возникновения любого из достижения подтвержденного CR;

клинического ухудшения, указывающего на то, что дальнейшая польза лечения не является вероятной;

удовлетворения критериям прекращения исследуемой терапии (DLT) или иной непереносимости терапии или достижения максимального количества курсов.

Период наблюдения.

Индивидуумов наблюдают в течение периода по меньшей мере шести месяцев, начиная с последней инфузии при лечении. 1-е посещение для наблюдения происходит в течение 7 суток после последнего визуализирующего сканирования. Посещения для наблюдения 2-4 происходят с интервалами 56 суток. Кроме того, статус выживаемости оценивают приблизительно каждые 3 месяца, в течение неопределенного срока, либо посредством телефонного звонка, либо при личном контакте после завершения или прекращения лечения и наблюдения в исследовании. Для любых индивидуумов, которые умерли, сообщают даты смерти. Оценку общей выживаемости проводят до завершения исследования или остановки исследования спонсором. В ходе этих звонков или посещений не получают никаких других данных (например, последующее лечение, функциональный статус и т.д.), отличных от выживаемости.

Когда индивидуум прекращает лечение исследуемым лекарственным средством, дата и причина прекращения лечения исследуемым лекарственным средством должны быть документированы в исходных документах, и индивидуум должен войти в период для наблюдения. Когда индивидуум отказывается от исследования (в период лечения или наблюдения), следует предпринять все усилия, чтобы убедиться, что все оценки, связанные с этим посещением в исследовании, были проведены, и дата и причина прекращения исследования были документированы в исходных документах.

После завершения периодов лечения и наблюдения всех выживших индивидуумов наблюдают в отношении статуса выживаемости каждые 3 месяца в течение неопределенного срока.

Физическое описание исследуемого лекарственного средства СМ-24 предоставляется в одноразовом флаконе объемом 10 мл. Каждый флакон содержит концентрированный раствор с эквивалентом 100 мг СМ-24 (10 мг/мл).

СМ-24 вводят в качестве внутривенной инфузии с встроенным в линию 0,2-микронным фильтром в определяемых протоколом дозах.

Инструкции по приготовлению различных доз.

Для индивидуумов, которым вводят дозы 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг и 1,0 мг/кг, для приготовления используют мешок для в/в вливания с 50 мл 0,9% хлорида натрия. Инфузию следует проводить со скоростью 1,0 мл/мин. Округление при получении дозы следует проводить, только когда это абсолютно необходимо, и его следует проводить только так, чтобы позволить поддержание минимальной концентрации 0,25 мг/мл.

Для индивидуумов, которым вводят дозу 3 мг/кг, для приготовления используют мешок для в/в вливания со 100 мл 0,9% хлорида натрия. Инфузию следует проводить со скоростью 2,0 мл/мин. Округление в процессе приготовления дозы следует проводить, только когда это абсолютно необходимо.

Для индивидуумов, которым вводят дозу 10 мг/кг, для приготовления используют мешок для в/в вливания с 250 мл 0,9% хлорида натрия. Инфузию следует проводить со скоростью 3,0 мл/мин. Округление в процессе приготовления дозы следует проводить, только когда это абсолютно необходимо.

Фармакодинамические (PD) маркеры.

Проводят взятие образцов крови и их исследуют в иммунных анализах и посредством других способов оценки в следующие моменты времени: до введения дозы при 1-м введении исследуемого лекарственного средства, через 48 ч после введения 1-й и 4-й дозы исследуемого лекарственного средства курса 1 и до введения 4-й (последней) дозы каждого полного курса (курсы 2-6 увеличения дозы и все курсы группы расширения), посещения для наблюдения 2-4, и они включают подтипы лимфоцитов (CD4, CD8 и CD56) в комбинации с маркерами активации (CD69, CD107a и HLA-DR), регуляторные Т-клетки посредством сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) экспрессия СЕАСАМ1 в подтипах лимфоцитов, растворимый СЕАСАМ1 и гранзим В в сыворотке, процентная занятость рецептора СЕАСАМ1 посредством СМ-24, супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSCs) (CD14+, HLADR-низкий, CD11b+), белки иммунной точки контроля, например PD-1, TIM-3, LAG, Vista.

Фармакокинетика (PK).

Фармакокинетику первоначально исследуют в части с увеличением дозы в процессе первой инфузии (первая доза 1 курса) и в процессе четвертой инфузии (последняя доза 1 курса). Также перед каждым введением в 1 курсе определяют уровни доз введения дозы. Дополнительных индивидуумов с расширением дозы (вплоть до 6) можно исследовать для оценки PK при предварительном RP2D, если более надежная характеризация PK СМ-24 считается обоснованной.

Профиль PK СМ-24 оценивают в плазме вплоть до 15 суток после первой дозы и 36 суток после

- 32 037613 инфузии четвертой дозы. Следующие параметры PK устанавливают из профилей концентрации в плазме против времени: C_max, t1/₂, Tmax, AUC . и AUC .

Образцы получают при первой и четвертой инфузии в следующие моменты времени: до инфузии (исходный уровень); в конце инфузии и через 1, 4, 8, 24 ч после инфузии. Только для 1-й и 4-й доз: на 3, 5, 8, 15 сутки (или до дозы следующего введения) и для 4-й дозы также на 22 и 36 сутки после инфузии. Уровни до введения дозы будут определять перед каждым введением 1-го курса. Для дальнейшей информации по сбору образцов и транспортировке образцов см. Schedule of Events and the Laboratory Manual.

Свежие биоптаты опухоли.

Размеры опухоли оценивают по следующим показателям: CD4, CD8, CD56, FOXp3, CEACAM1, гранзим В, СМ-24, % занятости рецептора СЕАСАМ1 посредством СМ-24.

Часть с увеличением дозы: индивидуумов просят предоставить необязательно свежий образец биоптата ткани (или сохраненный, если он взят в пределах последних шести месяцев) на исходном уровне и через одну неделю после второго введения 1-го курса.

Часть с расширением: получают два свежих образца опухоли, при скрининге и через одну неделю после 2-го дозирования 1-го курса. Кроме того, индивидуумов просят, но не требуют, предоставить один дополнительный биоптат через одну неделю после четвертого введения 1-го курса.

Результаты эффективности.

Следующие результаты используют для оценки предварительной эффективности, и они взяты из модифицированных критериев RECIST 1.1:

частота объективных ответов (ORR), длительность ответа (DOR), статус ответа опухоли, частота контроля заболевания (DCR), продолжительность ответа (DR), наилучший общий ответ (BOR) - полный ответ (CR), частичный ответ (PR), стабильное заболевание (SD) и прогрессирующее заболевание (PRD), выживаемость без прогрессирования (PFS), время до ответа (TTR), общая выживаемость (OS), процентное изменение опухолевой нагрузки (РСТВ), оцениваемое посредством СТ или MRI.

Перечисленные выше результаты эффективности будут оценивать в группах увеличения дозы:

неделя, через одну неделю после введения четвертой дозы первого курса, неделя, через пять недель после введения четвертой дозы первого курса,

18-19 неделя, 26-27 неделя, 34-35 неделя, 42-43 неделя, 48-49 неделя и 50-51 неделя после пяти дополнительных курсов плюс посещения для наблюдения 2-4.

Группа расширения дозы:

7-8 неделя, 14-15 неделя, 22-23 неделя, 30-31 неделя, 38-39 неделя, 46-47 неделя, плюс посещения для наблюдения 2-4.

Связанные с иммунной системой результаты эффективности. Дополнительная оценка эффективности в исследовании может включать использование критериев обусловленных иммунитетом критериев ответа (irRC) на основе модификаций RECIST 1.1 (обозначаемые как irRECIST), и они включают следующие результаты.

Связанный с иммунитетом наилучший общий ответ (irBOR) с категориями ответа irCR, irPR, irSD, irPD;

связанная с иммунитетом частота объективных ответов (irORR) на протяжении всего периода исследования;

продолжительность ответов ir (DOirR) для индивидуумов с ir-ответами.

Также можно определять исходы irORR на основе irBOR при любом количестве курсов.

Фармакокинетические (PK) результаты.

Фармакокинетику исследуют в части увеличения дозы в следующие моменты времени PK: образцы получают при первой и четвертой инфузиях в следующие моменты времени: до инфузии (исходный уровень); в конце инфузии и через 1, 4, 8, 24 ч после инфузии. Для 1-ой и 4-ой доз: на 3, 5, 8, 15 сутки (до следующего введения дозы) и для 4-й дозы также через 22 и 36 суток после инфузии. Уровни до введения доз получают до каждого введения 1-го курса.

Дополнительных индивидуумов расширения дозы (вплоть до 6) можно исследовать для оценки PK при предварительном режиме RP2D, если более надежная охарактеризация PK СМ-24 считается обоснованной.

Пример 7. Состав.

Иллюстративный состав гуманизированного mAb в соответствии с настоящим изобретением со- 33 037613 держит следующие компоненты:

Концентрация (мг/мл)	Ингредиент
10, 00	Лекарственное вещество СМ-24
4, 65	L-гистидин
82,00	Сахароза
0,20	Полисорбат 20

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Гуманизированное моноклональное антитело (mAb) или его фрагмент, которое специфически распознает СЕАСАМ1 человека, содержащее:

(i) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32; и (ii) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35.
2. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32.
3. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34.
4. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32 и вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34.
5. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее тяжелую цепь, выбранную из группы, состоящей из изотипа IgG4 и изотипа IgG1.
6. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее легкую цепь изотипа к.
7. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее легкую цепь изотипа к и тяжелую цепь, выбранную из группы, состоящей из изотипа IgG4 и изотипа IgG1.
8. Гуманизированное mAb по п.6, содержащее легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 52.
9. Гуманизированное mAb по п.5, содержащее тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 53 и с последовательностью SEQ ID NO: 59.
10. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 52 и тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 53.
11. Гуманизированное mAb по п.1, содержащее легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 52 и тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 59.
12. Выделенный полинуклеотид, кодирующий гуманизированное mAb или его фрагмент по любому из пп.1-11.
13. Выделенная полинуклеотидная последовательность по п.12, содержащая любую последовательность ДНК с SEQ ID NO: 44-51, или ее аналоги с последовательностями, которые по крайней мере на 90% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 44-51.
14. Выделенная полинуклеотидная последовательность по п.12, содержащая любую последовательность ДНК с SEQ ID NO: 54 или SEQ ID NO: 55, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного mAb, или последовательность ДНК с SEQ ID NO: 56, кодирующую легкую цепь гуманизированного mAb.
15. Плазмида, содержащая выделенный полинуклеотид по п.12.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество гуманизированного mAb по любому из пп.1-11 или его фрагмента, которое специфически распознает СЕАСАМ1 человека, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
17. Фармацевтическая композиция по п.16 для лечения заболевания или расстройства, связанного с экспрессией, активацией или функцией белка СЕАСАМ.
18. Фармацевтическая композиция по п.16, где заболевание или расстройство представляет собой клеточно-пролиферативное заболевание или нарушение.
19. Фармацевтическая композиция по п.18, где клеточно-пролиферативное заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака мочевого пузыря, легкого, немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC), немелкоклеточной аденокарциномы легкого (NSCLA), желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, щитовидной железы, желудка, яичника, меланомы и рака тела матки.
20. Фармацевтическая композиция по п.16, содержащая:

(i) 1-10 мг/мл основной аминокислоты;

(ii) 10/100 мг/мл сахара;

- 34 037613 (iii) 0,01-1 мг/мл поверхностно-активного вещества;

(iv) 1-50 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1, 4-6 мг/мл основной аминокислоты, 70-100 мг/мл сахара и 0,1-1 мг/мл неанионного поверхностно-активного вещества или (v) 10 мг/мл гуманизированного mAb к СЕАСАМ1, 4,65 мг/мл L-гистидина, 82 мг/мл сахарозы и

0,20 мг/мл полисорбата 20.
21. Фармацевтическая композиция по п.16, дополнительно содержащая по меньшей мере один дополнительный иммуномодулятор.
22. Фармацевтическая композиция по п.21, где дополнительный иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из антитела против белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), αнтu-PD-L1 человека и aнmи-PD-L2 человека, активированной цитотоксической лимфоцитарной клетки, активирующего лимфоциты средства и ингибитора каскада RAF/MEK.
23. Применение фармацевтической композиции, содержащей гуманизированное mAb по любому из пп.1-21 или его фрагмент, которое специфически распознает СЕАСАМ1 человека, для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией, активацией или функцией белка СЕАСАМ1.
24. Применение по п.23, где фармацевтическая композиция содержит дополнительный иммуномодулятор.
25. Применение по п.23, где дополнительный иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из антитела против белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), анти-PD-Ll человека и антиPD-L2 человека, активированной цитотоксической лимфоцитарной клетки, активирующего лимфоциты средства и ингибитора каскада RAF/MEK.
26. Композиция для диагностики заболевания или расстройства, связанного с экспрессией, активацией или функцией белка СЕАСАМ1, содержащая по меньшей мере один гуманизированный mAb или его фрагмент по любому из пп.1-11.
27. Способ профилактики, ослабления или лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией, активацией или функцией белка СЕАСАМ1, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.16 или 22.
28. Способ по п.27, где заболевание или нарушение представляет собой инфекцию.
29. Способ по п.27, где заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль.
30. Способ по п.29, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака мочевого пузыря, легкого, немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC), немелкоклеточной аденокарциномы легкого (NSCLA), желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, щитовидной железы, желудка, яичника, меланомы и рака тела матки.
31. Способ по п.27, дополнительно включающий введение индивиду лимфоцитарных клеток, активирующего лимфоциты средства или дополнительной композиции против злокачественной опухоли.
32. Способ по п.27, включающий введение индивиду по меньшей мере одной дозы гуманизированного mAb к СЕАСАМ1 в диапазоне от 0,01 до 10 мг/кг массы тела.
33. Способ по п.27, включающий введение индивидууму по меньшей мере одной дозы гуманизированного mAb против СЕАСАМ1 в диапазоне от 10 до 50 мг/кг массы тела.
34. Способ по п.27, включающий введение (i) множества идентичных или различных доз гуманизированного mAb;

(ii) множества возрастающих доз или (iii) фармацевтической композиции один раз в неделю, один раз в 2 недели, один раз в 3 недели, один раз в 4 недели или один раз в 5 недель.
35. Способ по п.33, включающий 1-10 курсов введения, где каждый курс включает 2-5 инфузий каждые 1-4 недели гуманизированного mAb, а затем 2-8 недель между курсами.
36. Способ иммуномодулирования, где способ включает приведение экспрессирующего СЕАСАМ1 лимфоцита в контакт с антителом или его фрагментом, которое специфически распознает СЕАСАМ1 человека, по любому из пп.1-11.
37. Способ ингибирования гомотипического или гетеротипического белок-белкового взаимодействия СЕАСАМ1, где способ включает приведение экспрессирующего СЕАСАМ1 лимфоцита в контакт с антителом или его фрагментом, которое специфически распознает СЕАСАМ1 человека, по любому из пп.1-11, тем самым ингибируя гомотипическое или гетеротипическое белок-белковое взаимодействие СЕАСАМ1.
38. Способ диагностики заболевания или нарушения, связанного с экспрессией, активацией или функцией белка СЕАСАМ1 у индивида, где способ включает приведение биологического образца, происходящего или полученного от указанного индивида, в контакт с диагностической композицией по п.26, где образование комплекса за пределами заданного порога указывает на злокачественную опухоль у указанного индивидуума.
39. Способ определения экспрессии СЕАСАМ1, где способ включает приведение в контакт биологического образца с антителом или его фрагментом, которое специфически распознает СЕАСАМ1 чело-

- 35 037613 века, по любому из пп.1-11 и измерение уровня образования иммунного комплекса.