BR112019019745A2 - Anticorpo anti-ceacam1 ou fragmento do mesmo, agente anticâncer, adjuvante anticâncer, composição para tratar câncer e usos terapêuticos do dito anticorpo ou fragmento domesmo - Google Patents
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Abstract
a presente invenção fornece anticorpos anti-ceacam1 com capacidades de ligação melhoradas específicas para ceacam1 e um uso dos mesmos. os anticorpos anti-ceacam1, de acordo com a presente invenção, exibem capacidades de ligação superiores específicas para ceacam1 e, além disso, ativam as funções imunológicas anticâncer de células t citotóxicas e células matadoras naturais e, assim, podes ser eficazmente usados como um agente anticâncer e como uma composição para tratar câncer.
Description
“ANTICORPO ANTI-CEACAM1 OU FRAGMENTO DO MESMO, AGENTE ANTICÂNCER, ADJUVANTE ANTICÂNCER, COMPOSIÇÃO PARA TRATAR CÂNCER E USOS TERAPÊUTICOS DO DITO ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO”
CAMPO TÉCNICO [001 ]A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-CEACAM1 que se liga especificamente a CEACAM1 e ao uso do mesmo.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [002]A molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 1 (em seguida, referida como CEACAM1), uma glicoproteína transmembranar, pertence à família do antígeno carcinoembrionário (CEA). Entre os membros da família CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8 são expressados em seres humanos. Mais significantemente, CEACAM1 é o único membro da família CEA expressado em populações de linfócitos, incluindo células T ativadas e células NK (natural killer). CEACAM1 foi relatado altamente expressado em células de câncer. Além disso, baixos níveis de expressão de CEACAM1 também foram observados em células epiteliais, células endoteliais e mielócitos. Sobre a superfície de linfócitos, CEACAM1 desempenha um papel na regulação de respostas imunes. Especificamente, CEACAM1 revelou ser um receptor inibitório para células T ativadas, incluindo aquelas contidas no epitélio intestinal humano (Gray-Owen & Bloomberg, Nat. Rev. Immunol. 2006; 6:433 a 446; Morales et al., J. Immunol, 1999; 163: 1363 a 1370).
[003]Em particular, CEACAM1 é reconhecido como uma molécula de ponto de verificação imune similar à PD-1 e CTLA-4, desempenhando um papel crucial na modulação da ativação de células T. As vias de ponto de verificação imunológico protegem os tecidos contra danos imunomediados sob condições fisiológicas não inflamatórias. Quando CEACAM1 é ativado em linfócitos T, principalmente após o
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2/59 acoplamento trans-homofílico CEACAM1-CEACAM1, CEACAM1 sinaliza para inibir as vias inflamatórias mediadas por TCR por meio do recrutamento de fosfatases para seu próprio motivo ITIM citoplasmático (Chen et al., J. Immunol. 2008; 180: 6085 a 6093). Assim, a supressão das vias de ponto de verificação imunológico no contexto do câncer emergiu como uma estratégia de tratamento anticâncer promissora.
[004]Estudos sobre vários tipos de tumores humanos relataram que os tumores podem evitar a imunidade por meio da indução de CEACAM1. Além disso, em modelos de tumor animal pré-clínico, foi mostrado que o bloqueio de interações CEACAM1 usando anticorpos monoclonais (mAbs) pode acentuar as respostas imunes contra tumores, promovendo a supressão do tumor (Ortenberg et al., Mol. Cancer Ther. 2012; 11 (6):1300 a 1310).
[005]Um dos maiores problemas com fármacos anticâncer convencionais é que o tratamento apresenta efeitos colaterais prejudiciais em comparação a suas eficácias anticâncer limitadas com altas taxas de recorrência. Por outro lado, uma abordagem recentemente destacada, assim chamada bloqueio de ponto de verificação imunológico, elimina o câncer por meio da reativação das células T exauridas reativas ao tumor ao invés de matar diretamente as células de câncer. Este tipo de abordagem parece relativamente seguro e eficaz, pelo fato de que utiliza funções imunológicas do hospedeiro para eliminar o câncer, sendo capaz de manter células normais irrelevantes intocadas. No caso de nivolumabe alvejante de PD-1 a partir da Bristol-Myers Squibb, o perfil de toxicidade está na faixa gerenciável em comparação àquela de fármacos anticâncer convencionais, enquanto seus efeitos anticâncer são dramaticamente maiores do que aqueles dos fármacos convencionais. Em um estudo fase III de comparativo entre nivolumabe e dacarbazina, um agente quimioterápico padrão, no tratamento de pacientes com melanoma metastático, publicado em 2015, por exemplo, nivolumabe mostrou 40 % de taxa de resposta objetiva (Cl 95 %, 33,3 a 47,0) em comparação a ORR 13,9 % (Cl 95 %, 9,5 a 19,4)
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3/59 por dacarbazina. A sobrevida livre de progressão mediana foi de 5,1 meses no grupo nivolumabe versus 2,2 meses no grupo dacarbazina. O perfil de toxicidade também convenceu a superioridade de nivolumabe à dacarbazina (Robert et al., New Engl. J. Med. 2015; 372:320 a 330).
[006]Por enquanto, anticorpo bloqueador de CEACAM1 atua sobre CEACAM1 expressado sobre a superfície de células T citotóxicas e de células NK, interagindo com moléculas de CEACAM1 superexpressadas em células tumorais. Portanto, no caso de tumores que superexpressam CEACAM1, espera-se que o anticorpo alvejante de CEACAM1 bloqueie a interação supressiva homofílica CEACAM1CEACAM1 entre células T/NK e células tumorais, desse modo, reativando as respostas de células T/NK antitumor. O anticorpo alvejante de CEACAM1 atualmente em desenvolvimento (um experimento clínico fase 1 foi prematuramente terminado em Fevereiro de 2017) reconhece CEACAM3 e CEACAM5, além de CEACAM1. Tal propriedade de reconhecimento fora do alvo deste clone de BMS pode ser devida a estas sequências de epítopo no domínio N que são altamente homólogas entre CEACAM1, CEACAM3 e CEACAM5 humanos.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
PROBLEMA TÉCNICO [007]Portanto, de modo a desenvolver um anticorpo anti-CEACAM1 que se liga especificamente a CEACAM1, os presentes inventores se esforçaram para descobrir que um anticorpo anti-CEACAM1 se liga ao domínio N de CEACAM1 e não reage de maneira cruzada com CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 ou CEACAM8, e concluíram a presente invenção.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA [008]De acordo com um objetivo da presente invenção, é fornecido um anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo compreendendo: CDR1 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a
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4/59 partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 1 a 8; CDR2 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 9 a 16; CDR3 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 17 a 29; CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 30 a 38; CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 39 a 46; e CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 47 a 55.
[009]De acordo com outro objetivo da presente invenção, é fornecido um anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo compreendendo: CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 23, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[010]Além disso, de acordo com outro objetivo da presente invenção, é fornecido um agente anticâncer compreendendo o anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo descrito acima como um ingrediente ativo.
[011]Além disso, de acordo com outro objetivo da presente invenção, é fornecido um adjuvante anticâncer compreendendo o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima como um ingrediente ativo.
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5/59 [012]Além disso, de acordo com outro objetivo da presente invenção, é fornecida uma composição para tratar câncer compreendendo o adjuvante anticâncer descrito acima e um agente terapêutico celular.
[013]Além disso, de acordo com outro objetivo da presente invenção, é fornecido um método para tratar câncer compreendendo administrar a um indivíduo linfócitos contatados com o anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo descrito acima.
[014]Além disso, de acordo com outro objetivo da presente invenção, é fornecido um método para inibir a proliferação de células tumorais que expressam CEACAM1, o qual compreende contatar as células tumorais que expressam CEACAM1 com o anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO [015]Um anticorpo anti-CEACAM1, de acordo com a presente invenção, se liga especificamente a CEACAM1 e, desse modo, ativa as funções imunológicas anticâncer de células T citotóxicas e células NK e, assim, pode ser eficazmente usado como um agente anticâncer, e uma composição para tratar câncer.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [016]A Fig. 1 é um diagrama esquemático da estrutura de CEACAMI recombinante preparado, de acordo com uma forma de realização.
[017]A Fig. 2 mostra a capacidade de ligação de anticorpos anti-CEACAM1 dependendo dos domínios constitutivos do CEACAM1 recombinante.
[018]A Fig. 3 ilustra resultados comparativos da ligação de C25 a CEACAMI recombinante, dependendo das concentrações de C25.
[019]A Fig. 4 demonstra a ligação de anticorpos anti-CEACAM1 a CEACAM1, dependendo das concentrações de anticorpos anti-CEACAM1.
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6/59 [020]A Fig. 5 representa a capacidade de ligação de CEACAM1 expressado sobre a superfície de linhagem de células T CEACAMI-Jurkat, dependendo das concentrações de C25 e clones de anticorpos derivados de C25:
(a) representa a capacidade de ligação a CEACAM1 expressado sobre a superfície de uma linhagem de células T CEACAMI-Jurkat, dependendo das concentrações de C25; e (b) representa a capacidade de ligação a CEACAM1 expressado sobre a superfície de uma linhagem de células T CEACAMI-Jurkat, dependendo das concentrações de clones de anticorpos derivados de C25.
[021 ]A Fig. 6 é uma tabela que mostra a afinidade de anticorpos antiCEACAM1 para CEACAM1. A afinidade foi obtida pela constante de velocidade cinética Kon e KOff e pela constante de dissociação de equilíbrio Kd.
[022]A Fig. 7 é uma fotografia que mostra o ponto isoelétrico de C25. A primeira, segunda e terceira bandas são os resultados com Marcadores IEF 3 a 10, hulgG4 e C25, respectivamente.
[023]A Fig. 8 mostra a ativação das linhagem de células T Jurkat E6.1 por C25 juntamente com o anticorpo anti-CD3 (OKT3; 0,1 pg/ml) através das expressões dos marcadores CD69, CD25 e Ki67. As concentrações de C25 e hulgG4 foram de 10 pg/ml.
[024]A Fig. 9 é um gráfico que mostra o número das células T Jurkat E6.1 ativadas por C25 juntamente com OKT3 (0,1 pg/ml) e os níveis de secreção de IL-2. As concentrações de C25 e hulgG4 foram de 10 pg/ml:
(a) representa o número de células T Jurkat E6.1 proliferadas por C25 juntamente com OKT3; (b) mostra o número de células T ativadas que expressam os marcadores CD69 e Ki67; e (c) mostra os nível de secreção de IL-2 de células T Jurkat E6.1 ativadas por C25.
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7/59 [025]A Fig. 10 ilustra a ativação da linhagem de células T Jurkat E6.1 por C25 juntamente com OKT3 (0,1 pg/ml) através da expressão dos marcadores CD69, CD25 e Ki67. As concentrações de C25 e hulgG4 foram de 25 pg/ml.
[026]A Fig. 11 é um gráfico que mostra o número das células T Jurkat E6.1 ativadas por C25 juntamente com OKT3 (0,1 pg/ml) e os níveis de secreção de IL-2. As concentrações de C25 e hulgG4 foram de 25 pg/ml:
(a) representa o número de células T Jurkat E6.1 proliferadas por C25 juntamente com OKT3; (b) mostra o número de células T ativadas que expressam marcadores CD69 e Ki67; e (c) mostra o nível de secreção de IL-2 de células T Jurkat E6.1 ativadas por C25 juntamente com OKT3. A concentração de OKT3 foi de 0,1 pg/ml.
[027]A Fig. 12 demonstra a ativação da linhagem de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 por C25 juntamente com OKT3 através da expressão dos marcadores CD69, CD25 e Ki67. A concentração de OKT3 foi de 0,1 pg/ml.
[028]A Fig. 13 é um gráfico que mostra o número das células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 e os níveis de secreção de IL-2. As concentrações de OKT3 e C25 ou Ab controle foram de 0,1 pg/ml e 10 pg/ml, respectivamente:
(a) representa o número de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 proliferadas por C25 juntamente com OKT3; (b) mostra o número de células T ativadas que expressam os marcadores CD69 e Ki67; e (c) mostra o nível de secreção de IL-2 de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3.
[029]A Fig. 14 é um gráfico que mostra o número das células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3 e os níveis de secreção de IL-2. As concentrações de OKT3 e C25 ou Ab controle foram de 0,1 pg/ml e 25 pg/ml, respectivamente:
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8/59 (a) representa o número de células T Jurkat Ε6.1 que superexpressam CEACAM1 proliferadas por C25 juntamente com OKT3; (b) mostra o número de células T ativadas que expressam os marcadores CD69 e Ki67; e (c) mostra o nível de secreção de IL-2 de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3.
[030]A Fig. 15 representa a ativação da linhagem de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 por C25 juntamente com OKT3 através da expressão dos marcadores CD69, CD25 e Ki67. A concentração de OKT3 foi de 1 pg/ml.
[031 ]A Fig. 16 é um gráfico que mostra o número das células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3 e os níveis de secreção de IL-2. As concentrações de OKT3 e C25 ou Ab controle foram de 0,1 pg/ml e 10 pg/ml, respectivamente:
(a) representa o número de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 proliferadas por C25 juntamente com OKT3; (b) mostra o número de células T ativadas que expressam os marcadores CD69 e Ki67; e (c) mostra o nível de secreção de IL-2 de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3.
[032]A Fig. 17 é um gráfico que mostra o número das células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3 e os níveis de secreção de IL-2. As concentrações de OKT3 e C25 ou Ab controle foram de 1 pg/ml e 25 pg/ml, respectivamente:
(a) representa o número de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 proliferadas por C25 juntamente com OKT3; (b) mostra o número de células T ativadas que expressam os marcadores CD69 e Ki67; e (c) mostra o nível de secreção de IL-2 de células T Jurkat E6.1 que superexpressam CEACAM1 ativadas por C25 juntamente com OKT3.
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9/59 [033]A Fig. 18 é um gráfico que mostra ativação de células T pelo tratamento com C25 com o auxílio da ativação de NFAT induzida por TCR. As concentrações de OKT3 e C25 ou Ab controle foram de 0,05 pg/ml e 10 pg/ml, respectivamente:
(a) mostra os resultados da medição da ativação de NFAT induzida por TCR por meio do tratamento de células Jurkat-GFP/NFAT-luc, que não expressam CEACAM1, com C25; e (b) são os resultados da medição da ativação de NFAT induzida por TCR por meio do tratamento de células Jurkat-CCM1/NFAT-luc que superexpressam CEACAM1 com C25.
[034]A Fig. 19 é um resultado da ativação de células T por meio do tratamento com C25 com o auxílio da ativação de NFAT induzida por TCR. As concentrações de OKT3 e C25 ou Ab controle foram de 0,1 pg/ml e 10 pg/ml, respectivamente:
(a) mostra os resultados da medição da ativação de NFAT induzida por TCR por meio do tratamento de células Jurkat-GFP/NFAT-luc, que não expressam CEACAM1, com C25; e (b) são os resultados da medição da ativação de NFAT induzida por TCR por meio do tratamento de células Jurkat-CCM1/NFAT-luc que superexpressam CEACAM1 com C25.
[035]A Fig. 20 é um gráfico que mostra o aumento na atividade de NFAT luciferase de células T por anticorpos anti-CEACAM1, incluindo C25, em comparação juntamente com o controle. As concentrações de OKT3 e anti-CEACAM ou Ab controle foram de 0,1 pg/ml e 10 pg/ml, respectivamente:
[036]A Fig. 21 fornece fotografias que mostram os resultados da pigmentação com C25 para avaliar o grau das expressões de CEACAM1 em tecidos normais de um ser humano e de um macaco.
[037]A Fig. 22 fornece fotografias que mostram resultados da pigmentação com hulgG4 em tecidos normais de um ser humano e de um macaco.
[038]A Fig. 23 demonstra a reatividade cruzada de anticorpos anti-CEACAM 1 com proteínas da família CEACAM.
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10/59 [039]A Fig. 24 mostra a reatividade cruzada de anticorpos anti-CEACAM1 com proteínas da família CEACAM.
[040]A Fig. 25 mostra que C25 (a) e clones de anticorpos anti-CEACAM1 derivados de C25 (b) não reagem de forma cruzada com CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 ou CEACAM8 expressados sobre a superfície celular.
[041 ]A Fig. 26 representa que C25 (a) e clones de anticorpos anti-CEACAM1 derivados de C25 (b) não apenas se ligam ao CEACAM1 humano, mas também ao CEACAM1 de macaco por meio do exame da capacidade de ligação a uma proteína expressada sobre a superfície celular.
[042]A Fig. 27 ilustra o efeito de aumento mediado por C25 sobre a atividade anticâncer de células T TALL-104 CEACAM1+ contra células de câncer CEACAM1+:
(a) mostra as taxas de sobrevivência de células de câncer quando células T TALL-104 e células de câncer MNK45 CEACAM1+ foram cocultivadas na presença de C25 em várias razões Efetoras:Alvo (E:T); e (b) mostra as taxas de sobrevivência de células de câncer quando células T TALL-104 e células de câncer MNK1 CEACAMT foram cocultivadas na presença de C25 em várias razões E:T.
[043]A Fig. 28 é um gráfico que mostra o efeito de aumento mediado por C25 sobre a atividade anticâncer de células NK NK92MI CEACAM1+ contra células de câncer CEACAM1+:
(a) mostra as taxas de sobrevivência de células de câncer quando células NK NK92MI CEACAM1+ e células de câncer MNK45 CEACAM1+ foram cocultivadas na presença de C25 em várias razões E:T; e (b) mostra as taxas de sobrevivência de células de câncer quando células NK NK92MI CEACAM1+ e células de câncer MNK1 CEACAM1+ foram cocultivadas na presença de C25 em várias razões E:T.
[044]A Fig. 29 é um gráfico que mostra os níveis de aumento na atividade anticâncer de células TALL-104 CEACAM1+ ativadas por C25 e clones de anticorpos derivados de C25 contra células de câncer CEACAM1+:
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11/59 [045]A morte de células de câncer por células TALL-104 promovida por C25 e clones de anticorpos derivados de C25 foi mostrada como as taxas de sobrevivência de células de câncer em comparação àquelas pelo anticorpo controle quando células T TALL-104 CEACAM1+ foram cocultivadas com células de câncer CEACAM1* (MKN45) em uma razão E:T de 1: 1.
MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO [046]Em seguida, a presente invenção é descrita em detalhes.
[047]A presente invenção fornece um anticorpo anti-CEACAMl ou um fragmento do mesmo compreendendo: CDR1 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 1 a 8; CDR2 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 9 a 16; CDR3 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 17 a 29; CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 30 a 38; CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 39 a 46; e CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 47 a 55.
[048]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAMl ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a
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12/59 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[049]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 56, e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[050]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 106 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[051]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 18, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[052]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de
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13/59 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 58 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[053]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[054]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[055]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 60 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as
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14/59 sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[056]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 108 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[057]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 20, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[058]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 62 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[059]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos
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15/59 representada pela SEQ ID NO: 109 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[060]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[061]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[062]O anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 110 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[063]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve
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16/59 compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 21, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[064]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[065]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 111 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[066]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 22, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e
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CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[067]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[068]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 112 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[069]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48.
[070]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64 e um domínio variável de cadeia
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18/59 pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[071]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 110 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 122.
[072]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 31, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[073]Q anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
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19/59 [074]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 110 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 123.
[075]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 24, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 40 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49.
[076]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[077]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 114 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 124.
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20/59 [078]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 25, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 33, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 41 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50.
[079]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 94. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[080]0 anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 115 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 125.
[081]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 14, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela
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SEQ ID NO: 23, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 34, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 42 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51.
[082]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 96. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[083]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 116 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 126.
[084]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 15, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 26, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 35, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 43 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52.
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22/59 [085]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 98. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[086]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 117 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 127.
[087]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 27, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 36, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 44 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53.
[088]Q anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 100. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada
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23/59 forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[089]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 118 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 128.
[090]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 7, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 14, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 37, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 54.
[091]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 102. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[092]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos
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24/59 representada pela SEQ ID NO: 119 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 129.
[093]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAMl ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 15, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 29, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 38, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 46 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 55.
[094]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 104. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[095]O anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 120 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 130.
[096]Especificamente, o anticorpo anti-CEACAMl ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve
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25/59 compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 23, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[097]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[098]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 113 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[099]O termo “anticorpo”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma proteína imune que se liga a um antígeno e interfere na ação do antígeno ou elimina o antígeno. Existem cinco tipos de anticorpos, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, cada um dos quais contém uma cadeia pesada produzida a partir dos genes da região constante da cadeia pesada μ, δ, γ, a e ε. Em uma tecnologia de anticorpos, IgG é principalmente usada. Quatro tipos de isotipos de IgG são IgG 1, lgG2, lgG3 e lgG4, e suas estruturas e características funcionais podem ser diferentes.
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26/59 [0100]Além disso, a IgG tem uma estrutura na forma de Y, altamente estável (peso molecular, cerca de 150 kDa) composta de duas proteínas de cadeia pesada (cerca de 50 kDa) e duas proteínas de cadeia leve (cerca de 25 kDa). As cadeias leves e pesadas de um anticorpo são divididas em regiões constantes nas quais as sequências de aminoácidos foram idênticas entre os anticorpos e regiões variáveis nas quais as sequências de aminoácidos são diferentes entre os anticorpos. Uma região constante da cadeia pesada contém os domínios CH1, H (dobradiça), CH2 e CH3. Cada domínio é composto de duas folhas β e é ligada por uma ligação dissulfeto na molécula. Duas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves são combinadas para formar um sítio de ligação ao antígeno. O sítio de ligação ao antígeno está presente nos dois braços de um anticorpo, um em cada braço, e tal porção que pode se ligar a um antígeno é chamada Fab (fragmento de ligação ao anticorpo), e uma porção que não pode se ligar a um antígeno é chamada Fc (fragmento cristalizável). O Fab e o Fc são conectados por uma região de dobradiça flexível.
[0101 ]Além disso, o termo “CDR”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma região hipervariável que é um sítio que apresenta uma sequência de aminoácidos diferente para cada anticorpo nas regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo, e refere-se a um sítio de ligação ao antígeno. Com respeito a uma estereoestrutura de um anticorpo, a CDR forma uma alça sobre a superfície do anticorpo e uma região de estrutura (FR) está presente sob a alça para suportar estruturalmente a CDR. Existem três estruturas de alça em cada uma entre a cadeia pesada e a cadeia leve e estas seis estruturas de alça são combinadas entre si para contatar diretamente um antígeno.
[0102]Além disso, o fragmento de anticorpo pode ser aquele selecionado a partir do grupo que consiste de Fab, scFv, F(ab)2 e Fv. Um fragmento de anticorpo refere-se aos domínios de ligação ao antígeno que excluem a região Fc, que faz com que uma função efetora transfira estímulos de ligação com um antígeno às células ou
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27/59 complementos, etc., e pode incluir fragmentos de anticorpos de 3a geração, tais como um anticorpo de domínio único ou um minicorpo, etc.
[0103]Além disso, os fragmentos de anticorpos apresentam permeabilidade satisfatória em tecidos e tumores, visto que têm tamanhos pequenos em comparação a uma IgG de estrutura total. Os mesmos apresentam uma vantagem de baixo custo de produção, visto que podem ser produzidos em bactérias e podem ser usados quando a função de transferir estímulos de ligação com um antígeno às células ou complementos não é desejada, uma vez que não têm Fc. Os fragmentos de anticorpos são adequados para diagnóstico in vivo, devido a sua meia-vida curta no corpo humano. Entretanto, quando alguns aminoácidos básicos, ácidos ou neutros entre os aminoácidos que constituem o anticorpo são substituídos entre si, o ponto isoelétrico (pl) pode ser alterado. A alteração no ponto isoelétrico do anticorpo pode induzir alterações, tais como uma diminuição nos efeitos colaterais tóxicos in vivo ou um aumento na solubilidade em água do anticorpo, e, assim, no caso de um anticorpo terapêutico, uma IgG de estrutura total pode ser usada, considerando sua afinidade e a forma estrutural.
[0104]Além disso, o domínio variável de cadeia leve do anticorpo antiCEACAM1 ou de um fragmento do mesmo da presente invenção pode apresentar uma sequência de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NOS: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 ou 84, ou pode apresentar homologia de 97 %, 98 % ou 99 % com a sequência de domínio variável de cadeia leve acima.
[0105]Além disso, o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo antiCEACAM1 ou de um fragmento do mesmo da presente invenção pode apresentar uma sequência de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NOS: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 102 ou
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104, ou pode apresentar homologia de 97 %, 98 % ou 99 % com a sequência de domínio variável de cadeia pesada acima.
[0106]Além disso, o anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo da presente invenção pode apresentar homologia de 97 %, 98 % ou 99 % com uma sequência de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NOS: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 ou 84, e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NOS: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 102 ou 104.
[0107]Além disso, o anticorpo anti-CEACAM1 refere-se a um anticorpo que se liga a CEACAM1. Conforme usado neste relatório, o termo “C25” é uma forma de realização do anticorpo anti-CEACAM1. O C25 pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 23, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
[0108]Além disso, o anticorpo ou o fragmento do mesmo descrito acima pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86. Neste relatório, se a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada forem idênticas, a porção da estrutura pode ser modificada. Especialmente, as
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29/59 sequências de aminoácidos de algumas porções da estrutura podem ser modificadas para produzir anticorpos humanizados.
[0109]0 CD25 descrito acima pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 113 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121.
[0110]Uma variante de C25 pode compreender CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, 10 ou 11, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17,18,19, 20, 21 ou 22, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30 ou 31, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47 ou 48. Especificamente, em uma forma de realização da presente invenção, as variantes de C25 foram mostradas na Tabela 1 como 1-19, 1-23, 3-07, 3-27, 4R9, 4R20, 4R26, 4R9_H2-2 e 4R9_H4-n20.
[0111]Além disso, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo descrito acima reconhece o domínio N e o domínio B de CEACAM1 como um epítopo. Além disso, o anticorpo não reage de forma cruzada com CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 ou CAECAM8.
[0112]Além disso, o anticorpo anti-CEACAM1 da presente invenção pode ser facilmente preparado por uma técnica de preparação de anticorpo monoclonal conhecida. Métodos para preparar anticorpos monoclonais podem ser implementados por meio da preparação de hibridomas usando linfócitos B a partir de animais
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30/59 imunizados ou por meio do uso de técnicas de exibição de fago, mas não são limitadas às mesmas.
[0113]A presente invenção também fornece um agente anticâncer compreendendo o anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[0114]O agente anticâncer da presente invenção compreendendo o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo como um ingrediente ativo pode ser usado para tratar cânceres ou tumores que superexpressam CEACAM1. Especificamente, quando um receptor de células T (TCR) de células T citotóxicas, que desempenha um papel na remoção de células de câncer, reconhece um epítopo de câncer ou de células tumorais, a proteína LCK(proteína tirosina cinase específica de linfócitos) ligada ao CD4 (cluster de diferenciação 4), um componente do TCR fosforila Οϋ3ζ (cluster de diferenciação 3ζ), outro componente do TCR. Quando a proteína ZAP70 (proteína cinase associada cadeia Zeta 70) é ligada ao Οϋ3ζ fosforilado, a porção terminal da proteína ZAP70 é fosforilada novamente pela proteína LCK, desse modo, ativando as vias inflamatória de células T, incluindo transdução de sinal de RAS-MAPK (Ras-MAP cinase), e assim, as células T são ativadas.
[0115]Entretanto, no caso de células de câncer ou células tumorais que superexpressam o CEACAM1, a proteína SHP1 (fosfatase-1 contendo o domínio da região de homologia de Src 2) é ligada à porção CEACAM1 ITIM (motivo de inibição com base imunorreceptor tirosina) que é fosforilada pela proteína LCK ligada à extremidade de CD4 do TCR, devido à interação CEACAM1-CEACAM1. Além disso, o terminal de Οϋ3ζ é defosforilado, assim como ZAP70, pela proteína SHP1, e, assim, as vias de sinalização a jusante de TCR, incluindo a via de RAS-MAPK, não é ativada e, como um resultado, as células T não são ativadas.
[0116]Assim, o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo pode ser usado como um agente anticâncer por meio do bloqueio da interação CEACAM1
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CEACAM1 antecipadamente através da ligação a CEACAM1 expressado em células T citotóxicas, células NK e células de câncer.
[0117]Além disso, o termo “anticâncer”, conforme usado neste relatório, abrange “prevenção” e “tratamento.” Neste relatório, “prevenção” refere-se a todas as ações de prevenção da proliferação do câncer e atraso do progresso do câncer por meio da administração do agente anticâncer, e “tratamento” refere-se a todas as ações de melhorar os sintomas do câncer por meio da administração do anticorpo da presente invenção.
[0118]Além disso, o termo “câncer”, conforme usado neste relatório, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de câncer gástrico, câncer da tireoide, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão e mieloma, mas, não é limitado ao mesmos. Pode incluir câncer sólido e câncer no sangue e não é particularmente limitado, contanto que apresente CEACAM1 como um receptor e sua via de ponto de verificação imunológico é anormal. Além disso, a presente invenção fornece um adjuvante anticâncer compreendendo o anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
[0119]Além disso, a presente invenção fornece uma composição para tratar câncer compreendendo o adjuvante anticâncer descrito acima e um agente terapêutico celular. O agente de terapia celular pode incluir células T citotóxicas ou células NK.
[0120]Além disso, o termo “agente terapêutico celular”, conforme usado neste relatório, refere-se a um fármaco usado para o propósito de prevenção ou tratamento através de uma série de ações que alteram as características biológicas por meio da proliferação e seleção de células autólogas, alogênicas e xenogênicas vivas in vitro para restaurar a função de células e tecidos. Especificamente, podem ser células T citotóxicas ou células NK.
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32/59 [0121]Além disso, um método para tratar câncer usando o anticorpo antiCEACAM1 ou um fragmento do mesmo da presente invenção é fornecido. Especificamente, o método pode compreender administrar a um indivíduo linfócitos contatados com o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo. Os linfócitos são um tipo de leucócitos, que representam cerca de 25 % de todos os leucócitos e podem ser células NK, células T e células B. Além disso, os linfócitos podem ser obtido a partir de um indivíduo. Preferivelmente, os linfócitos podem incluir pelo menos uma entre células T citotóxicas e células NK. O câncer é descrito acima.
[0122]Além disso, o termo “indivíduo”, conforme usado neste relatório, referese a uma pessoa que está em um estado onde uma doença pode ser aliviada, suprimida ou tratada por meio da administração do adjuvante anticâncer da presente invenção, ou está sofrendo de uma doença.
[0123]Além disso, o termo “contatar” conforme usado neste relatório, também refere-se à mistura do anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo com células que expressam CEACAM1.
[0124]O termo “administração”, conforme usado neste relatório, refere-se à introdução de uma quantidade eficaz de uma substância em um indivíduo por meio de um método apropriado e a administração de uma composição compreendendo o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo da presente invenção pode ser realizada por intermédio de uma via de administração geral que permite que a substância atinja tecidos alvo. Especificamente, a administração pode ser administração parenteral (isto é, administração intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou local, etc.), dependendo do uso intencionado, e, preferivelmente, pode ser administração intravenosa. Em alguns casos de administração aos tumores sólidos, a administração local pode ser preferível em termos de acesso rápido e fácil dos anticorpos. A dosagem varia, dependendo do peso, idade, sexo, condição de saúde, dieta do paciente, do tempo de administração, do método de administração,
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33/59 da taxa de excreção e da severidade de uma doença. A dose única pode ser cerca de 0,001 a 10 mg/kg, que pode ser administrada diariamente ou semanalmente. A quantidade eficaz pode ser ajustada, de acordo com o critério de um médico que trata o paciente.
[0125]Uma composição para tratar câncer, de acordo com a presente invenção, pode ser administrada em um quantidade farmaceuticamente eficaz para tratar células de câncer ou sua metástase ou para inibir o crescimento do câncer. A dosagem pode variar, dependendo do tipo de câncer, idade do paciente e peso, da natureza e severidade dos sintomas, do tipo de tratamento corrente, do número de tratamentos, do tipo e via de administração, etc., e pode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto.
[0126]Quanto à composição da presente invenção, os componentes farmacológicos ou fisiológicos descritos acima podem ser concorrente ou sequencialmente administrados, ou podem ser administrados em combinação com um agente terapêutico convencional adicional sequencial ou concorrentemente. Tal administração pode ser administrações únicas ou múltiplas. É importante considerar todos os fatores acima e administrar a quantidade que leva a um efeito máximo com uma quantidade mínima sem efeitos colaterais, que pode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto.
[0127]Além disso, a presente invenção fornece um método para inibir a proliferação de células tumorais que expressam CEACAM1 usando o anticorpo antiCEACAM1 ou um fragmento do mesmo. Especificamente, pode compreender contatar as células tumorais que expressam CEACAM1 com o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo.
MODO PARA A INVENÇÃO
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34/59 [0128]Em seguida, a presente invenção é explicada em detalhes pelos Exemplos. Os Exemplos seguintes são destinam-se a ilustrar a presente invenção sem limitar seu escopo.
Exemplo 1. Anticorpo anti-CEACAM1 (C25)
Exemplo 1.1. Preparação do anticorpo anti-CEACAM1 [0129]Os genes de fragmento de anticorpo inseridos no vetor pComb3X (Addgene; Cat. N2 63891) na forma de um fragmento variável de cadeia única (scFv) foram submetidos à realização de PCR para obter os genes da região variável de cadeia leve representados pela SEQ ID NOS: 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81,83 ou 85, e os genes da região variável de cadeia pesada representados pela SEQ ID NOS: 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 ou 105, que incluem as sequências reconhecidas por cada enzima de restrição. Os genes de cadeia pesada foram tratados com as enzimas de restrição Notl e Apal e os genes de cadeia leve foram tratados com as enzimas de restrição Notl e BamHI.
[0130]Os genes de cadeia pesada e leve foram inseridos no vetor pclW (Promega; Cat. N2 E1731) digerido com as mesmas enzimas de restrição que os genes de cadeia pesada ou leve. Em seguida, os vetores contendo tanto a unidade de transcrição de cadeia pesada quanto a unidade de transcrição de cadeia leve foram selecionados usando as enzimas de restrição. Os vetores selecionados foram extraídos usando o Kit QIAGEN Plasmid Plus Midi (QIAGEN; Cat. N2 12943) e as sequências de bases dos anticorpos foram finalmente identificadas pela análise de sequência de bases usando algum DNA extraído. As sequências de aminoácidos dos anticorpos foram analisadas com base nas sequências de bases acima. As sequências de aminoácidos e as sequências de bases dos anticorpos analisados são mostradas na Tabela 1 e Tabela 2.
Tabela 1
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| Cadeia leve | Cadeia pesada | |||||||||||
| CDRl | SEQ ID NO | CDR2 | SEQ ID NO· | ODR3 | SEQ 1D NO | CDRl | SEQ ID NO | CDR2 | SEQTD NO | CDR3 | SEQ ID NO | |
| 1-19 | SSNIGNNY | 1 | ADSKRP | 9 | GAWDLSINGW; | 17 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 1-23 | SSNIGNNY | 1 | APSKRP | 9 | GAWDVSHNGW | 18 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 3-07 | SSNIGNNY | 1 | ADSKRP | 9 | GAWDQSLNGW | 19 | GFTFSNYA | 30 | ÍSHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 3-27 | SSNIGNNY | 1 | ADSKRP | 9 | GAWDSMGNGW | 20 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 4R9 | SSNIGNNY | 1 | ADSRRP | 10 | GAWDLSINGW | 17 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 4R20 | SSNIGNNY | 1 | ADSRRP | 10 | GAWDASYNGW | 21 | GFTFSNYA | 30; | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 4R26 | SSNIGNNY | 1 | ADSKRL | 11 | GAWDGRLNGW | 22 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| 4R9_ H2-2 | SSNIGNNY | 1 | ADSRRP | 10 | GAWDLSLNGW | 17 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDFTKGYAPLFDY | 48 |
| 4R9_ Η4-Π20 | SSNIGNNY | 1 | ADSRRP | 10 | GAWDLSLNGW | 17 | GFNFSNYA | 31 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| C25 | SSNIGNNY | 1 | ADSKRP | 9 | GAWDASLNGW | 23 | GFTFSNYA | 30 | ISHGGGSI | 39 | ARDPTKGYAPTFDY | 47 |
| C15 | SSSNIGNNY | 2 | ANSNRP | 12 | GTWDASLSAW | 24 | GFTFSSYS | 32 | ISPNGGNK | 40 | AKDPYNIYQPLFDY | 49 |
| 016 | SSNIGSNT | 3 | ADNNRP | 13 | GTWDYSLSGW | 25 | GFTFSNYS | 33 | ISSDGGSK | 41 | ARDPRKHVDRYFDY | 50 |
| C17 | SSNIGNNA | 4 | ANSHRP | 14 | GAWDASLNGW | 23 | GFTFSDYS | 34 | IYPDDGNT | 42 | ARGSIWWLSUPSSYNAM DV | 51 |
| C18 | SSNIGSNA. | 5 | ADSHRP | 15 | GSWDDSLNAYV | 26 | GFTFSNYD | 35 | ISHSSGSK | 43 | ΑΡ0ΡίΡ0ΕΙΡΚ03ΥΫ¥ΑΜ0ν | 52 |
| C19 | SSNIGSNY | 6 | SNSHRP | 16 | AAWDSSLNGW | 27 | GFTFSGYA | 36' | IYHDGGST | 44 | ARVTVLCTTYGCSSYDGMDV | 53 |
| 022 | SSNÍGSNN | 7 | ANSHRP | 14 | GSWDSSL·NAW | 28 | GFTFSDYD | 37 | IYSGSSSK | 45 | AKAPLPFYFRPKSVWAMDV | 54 |
| 026 | SSNIGNN | 3 | ADSHRP | 15 | GAWDYSLSGW | 29 | GFTFSGYD | 38 | ISYGGGSI | 46 | AKDRLPQKAVRHSYANGMpV | 55: |
Tabela 2
| Região variável de cadeia leve | Região variável de cadeia pesada | Cadeia leve | Cadeia pesada | |
| SEQ ID NO | SEQ: ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | |
| 1-19 | SEQ ID NO: 56, 57 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO: 106 | SEQ TD NO: 121 |
| 1-23 | SEQ ID NO: 58, 59 | SEQ ID NO: 86,. 87 | SEQ ID NO; 107 | SEQ.ID NO: 121 |
| 3-07 | SEQ ID NO: 60, 61 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO: 108 | SEQ ID NO: 121 |
| 3-27 | SEQ IP NO: 62, 63 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO: 109 | SEQ ID NO; 121 |
| 4R9 | SEQ ID NO: 64, 65 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO 110 | SEQ TD NO: 121 |
| 4R20 | SEQ ID NO: 66, 67 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO: 111 | SEQ ID NO; 121 |
| 4R26 | SEQ IP NO: 68, 69 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO: 112 | SEQ ID NO; 121 |
| 4R9_H2-2 | SEQ ID NO: 64, 65 | SEQ ID NO: 88, 89 | SEQ ID NO: 110 | SEQ ID NO; 122 |
| 4R9_H4-n20 | SEQ ID NO: 64, 6:5 | SEQ ID NO: 90, 91 | SEQ ID NO: 110 | SEQ ID NO: 123 |
| C2S | SEQTD NO: 70, 71 | SEQ ID NO: 86, 87 | SEQ ID NO: 113 | SEQ ID NO: 121 |
| CIS | SEQ IP NO: 72, 73 | SEQ ID NO; 92. 93 | SEQ ID NO: 114 | SEQ ID NO: 124 |
| C16 | SEQ ID NO: 74. 75: | SEQTD Np: 94, 95 | SEQ ID NO: 115 | SEQ ID NO; 125 |
| C17 | SEQ ID NO: 76, 77 | SEQ ID NO: 96. 97 | SEQ ID NO: 116 | SEQ ID NO: 126 |
| Ç18 | SEQ ID NO: 78, 79 | SEQ ID NO: 98. 99 | SEQ ID NO: 117 | SEQ ID NO: 127 |
| C19 | SEQ ID NO; 80, 81 | SEQ ID NO: 1OO, 1O1 | SEQ ID NO: 118 | SEQ ID NO: 128 |
| C22 | SEQ ID NO: 82, 83 | SEQ ID NO: 102. 103 | SEQ ID NO: 119 | SEQ ID NO: 129 |
| C26 | SEQ ID NO: 84, .85 | SEQ ID NO- 104, 105 | SEQ ID NO: 120 | SEQ ID NO: 130 |
[0131 ]Trinta mililitros de células ExpiHEK293F (ThermoFisher scientific; Cat. Γ\Ρ Α14527) em uma concentração de 2,5 χ 106 células/ml foram tratados e transfectados com 30 pg do DNA do anticorpo extraído. No dia seguinte após a transfecção, um acentuador (ThermoFisher; Cat. N^ A14524) foi adicionado às células ExpiHEK293F transfectadas e cultivadas em um incubadora com agitação durante 7
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36/59 dias sob a condição de 37 °C, CO28 % e 125 rpm, para produzir 0 anticorpo antiCEACAM1.
[0132]Depois da cultura, 0 sobrenadante separado do meio de cultura por centrifugação foi incubado com 100 pl de esferas de proteína A (Repligen; Cat. N2 CAPRI-0100) durante 2 horas. As esferas depois foram lavadas com 10 ml de um tampão de ligação (ThermoFisher Scientific; Cat. N2 21019). Depois, 200 μΙ de um tampão de eluição (ThermoFisher Scientific; Cat. N2 21004) foram adicionados às esferas para separar os anticorpos conjugados às esferas. Os anticorpos separados foram neutralizados pela adição de 10 μΙ de solução Tris-HC11,5 M pH 8,8 (Bio-Rad; Cat. N2 210005897).
Exemplo Experimental 1. Avaliação da capacidade de ligação do anticorpo anti-CEACAM1
Exemplo Experimental 1.1. Avaliação da capacidade de ligação do anticorpo anti-CEACAM1, de acordo com 0 domínio de CEACAM1 [0133]Trinta mililitros de células ExpiHEK293F (ThermoFisher scientific; Cat. N2 A14527) em uma concentração de 2,5 χ 106 células/ml foram tratados e transfectados com 30 pg do DNA de proteínas mutantes de CEACAM1 conjugadas com um domínio C capa de imunoglobulina humana. Além disso, 0 acentuador (ThermoFisher; Cat. N2 A14524) foi adicionado às células ExpiHEK293F transfectadas e cultivadas em um incubadora com agitação durante 7 dias sob a condição de 37 °C, CO28 % e 125 rpm.
[0134]Em seguida, 0 sobrenadante foi separado do meio de cultura e reagido com uma esfera de seleção de capa (GE Healthcare; Cat. N2 17-5458-01) durante 2 horas. Depois, as esferas foram lavadas com 10 ml de um tampão de ligação e adicionadas com 200 pl de um tampão de eluição para separar e purificar a proteína mutante de CEACAM1 a partir das esferas (Fig. 1).
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37/59 [0135]Cada uma das proteínas mutantes de CEACAM1 purificadas (2,5 pg) foi dissolvida em 1.000 pl de PBS e dispensada em cada poço em 20 μΙ/poço e, depois, reagida a 4 °C durante 16 horas. Além disso, 1 μΙ de C25 foi diluído em 1.000 pl de PBS e dispensado em cada poço em 25 μΙ/poço e, depois, reagido a 37 °C durante 1 hora. Em seguida, cada poço foi lavado 3 vezes com um tampão de lavagem preparado por meio da diluição de 10 pl de Tween 20 (Sigma-Aldrich; Cat. N2 P9146) em 990 pl de PBS. Depois, IgG humana conjugada com 1 pl de peroxidase de raiz forte (HRP) (IgG anti-humana conjugada à HRP: Sigma; Cat. N2 A0170) foi diluída em 5000 pl de PBS, que depois foram dispensados em cada poço em 25pl/poço e incubados a 37 °C durante 1 hora.
[0136]Depois da conclusão da reação, os poços foram lavados três vezes com o tampão de lavagem e 25 pl de solução de TMB (KPL; Cat. N2 52-00-03) foram adicionados a cada poço para induzir o desenvolvimento de cor. Em seguida, 25 pl de H2SO4 2 M foram adicionados a cada poço para interromper a reação e a absorvância foi medida em um comprimento de onda de 450 nm.
[0137]Como um resultado, no caso de C25, 0 domínio N e 0 domínio B foram considerados sítios essenciais para a ligação com afinidade total. Foi descoberto que A1 e A2 não são necessários para ligação direta. Assim, C25, principalmente, se liga ao domínio N de CEACAM1 e, para a ligação com afinidade total, 0 domínio B é adicionalmente exigido. Ao contrário, alguns entre os clones mutantes derivados de C25 se ligam ao domínio N de CEACAM1 com dependência mínima ou residual sobre 0 domínio B para a ligação com suas afinidades totais em comparação a C25 (Fig. 2).
Exemplo Experimental 1.2. Avaliação da capacidade de ligação do anticorpo anti-CEACAM1 à proteína CEACAM1 [0138]Dois microgramas da proteína CEACAM1 recombinante foram dissolvidos em 1000 pl de PBS, que foram dispensados em uma placa de 96 poços (Nunc; Cat. N2 467679) em 50 μΙ/poço e incubados a 4 °C durante 16 horas. Depois,
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300 μΙ de albumina de soro bovino 3 % (v/v) foram adicionados a cada poço e incubados a 37 °C durante 1 hora. O anticorpo C25 (0,75 pg) foi dissolvido em 1000 pl de PBS. A solução de C25 diluída foi submetida às diluições em série em PBS em uma razão em volume 1:1 por 14 vezes. Cada uma entre as 15 soluções de C25 diluídas diferentes foi dispensada em cada poço em 50 μΙ/poço e incubadas a 37 °C durante 1 hora. Em seguida, cada poço foi lavado 3 vezes com um tampão de lavagem preparado por meio da diluição de 10 pl de Tween 20 (Sigma-Aldrich; Cat. N2 P9146) em 990 μΙ de PBS. Depois, IgG humana conjugado com 1 μΙ de HRP foi diluída em 5000 μΙ de PBS, que depois foram dispensados em cada poço em 50 μΙ/poço e incubados durante 1 hora, os poços foram lavados três vezes com o tampão de lavagem e 50 μΙ da solução de TMB foram adicionados a cada poço para induzir o desenvolvimento de cor e, em seguida, 50 μΙ de H2SO4 2 M foram adicionados a cada poço para interromper a reação. A absorvância foi medida em um comprimento de onda de 450 nm.
[0139]Como um resultado, 0 valor de EC50 (Meia concentração eficaz máxima) foi medido para ser de 0,35 nM (Fig. 3).
[0140]Além disso, 2,5 pg da proteína CEACAM-1/CD66a recombinante (R&D Systems; Cat. N2 2244-CM) foram dissolvidos em 10 ml de PBS e dispensados em uma placa de 96 poços (Nunc; Cat. N2 467679) em 100 μΙ/poço e incubados durante a noite a 4 °C. Depois, 300 pl de albumina de soro bovino 1 % (v/v) foram adicionados a cada poço, que foi incubado a 37 °C durante 1 hora.
[0141 ]Cada um entre os anticorpos C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 e C26 (3 pg) foi dissolvido em 1000 pl de PBS. Cada um entre os anticorpos diluídos foi submetido às diluições em série em PBS em uma razão em volume 1:1 por 6 vezes. Cada um entre os anticorpos diluídos em 7 concentrações foi dispensado em cada poço em 100 μΙ/poço, que foi incubado a 37 °C durante 1 hora. Em seguida, cada poço foi lavado 3 vezes com um tampão de lavagem preparado por meio da
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39/59 diluição de 10 μΙ de Tween 20 (Sigma-Aldrich; Cat. N2 P9146) em 990 μΙ de PBS. Depois, 2 μΙ de IgG humana conjugada com HRP foram diluídos em 10 ml de PBS, que depois foram dispensados em cada poço em 100 μΙ/poço e incubados durante 1 hora.
[0142]Depois da conclusão da reação, os poços foram lavados três vezes com o tampão de lavagem e 100 μΙ da solução de TMB foram adicionados a cada poço para induzir o desenvolvimento de cor. Em seguida, 100 μΙ de H2SO4 2 M foram adicionados a cada poço para interromper a reação e a absorvância foi medida em um comprimento de onda de 450 nm.
[0143]Como um resultado, foi descoberto que os anticorpos C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 e C26 se ligam à proteína CEACAM1 (Fig. 4) Exemplo Experimental 1,3. Avaliação da capacidade de ligação dos anticorpos anti-CEACAM1 à proteína CEACAM1 expressada sobre a superfície celular [0144]Células T Jurkat (Jurkat E6.1 (ATCC; TIB-152TM)) foram transfectadas com cDNA de CEACAM1 e tratadas com 700 pg/ml de antibiótico G418 para seleção. As linhagens de células T CEACAM1-Jurkat selecionadas foram recolocadas em suspensão na DPBS suplementada com FBS 2 % (v/v) (em seguida, referida como tampão FACS), centrifugadas em 1.500 rpm e, depois, recolocadas em suspensão em um tampão FACS, tal que 0 número de células foi de 3 x 106/ml. As células foram dispensadas em cada poço de uma placa de 96 poços com fundo em U em 100 μΙ/poço. Em seguida, as células foram centrifugadas em 1.500 rpm e 0 sobrenadante foi descartado. Depois da ressuspensão das células recuperadas em 50 μΙ do tampão FACS ao qual 0,5 μΙ de solução de bloqueio de Fc humano (BD Pharmingen; Cat. N2 564220) foi adicionado, as células foram incubadas a 4 °C durante 15 minutos (Fig. 5).
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40/59 [0145]O anticorpo anti-CEACAM1 ou a lgG4 humana (Sigma; Cat. N2 I4639) foi diluído em 50 pl do tampão FACS para obter as concentrações de 20 pg/ml, 10 pg/ml, 5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 1,25 pg/ml, 0,625 pg/ml, 0,3125 pg/ml e 0,15625 pg/ml. Cinquenta microlitros de anticorpo anti-CEACAM1 ou de lgG4 humana diluído acima foram adicionados às células e incubados a 4 °C durante 1,5 hora.
[0146]As células incubadas com os anticorpos foram repetidamente submetidas ao procedimento de lavagem de ressuspensão das células em um tampão FACS e centrifugação da solução em 1.500 rpm. F(ab)2 anti-humano de cabra marcado com ficoeritrina (em seguida, referida como PE) (F(ab)2 anti-humano de cabra conjugado à ficoeritrina; (Sigma; Cat. N2 P8047)) foi diluído no tampão FACS em uma razão em volume de 1:200 e, depois, 100 pl de cada solução foram adicionados a cada poço, que foi incubado a 4 °C durante 30 minutos em uma condição escura.
[0147]As células foram repetidamente submetidas ao procedimento de lavagem de ressuspensão das células em um tampão FACS, centrifugação da solução em 1.500 rpm e descarte do sobrenadante. As células depois foram recolocadas em suspensão em 100 μΙ de um tampão de fixação (BD Cytofix™; Cat. N2 554655) e incubadas a 4 °C durante 30 minutos em um local escuro.
[0148]As células incubadas com o tampão de fixação foram repetidamente submetidas ao procedimento de lavagem de ressuspensão das células em um tampão FACS, centrifugação da solução em 1.500 rpm e descarte do sobrenadante. As células lavadas foram recolocadas em suspensão em 200 μΙ de um tampão FACS e as intensidades médias de fluorescência (MFIs) de células marcadas com PE foram comparadas em um FACS LSR-Fortessa. Todas as análises de FACS foram conduzidas usando o software FlowJo.
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41/59 [0149]Foi observado que o nível máximo de ligação de C25 ao alvo (MF11800 ou mais) foi atingido em 5 pg/ml de concentração, mas sua capacidade de ligação diminuiu rapidamente abaixo da concentração de 5 pg/ml (Fig. 5a).
[0150]As células T CEACAMI-Jurkat preparadas acima foram tratadas com solução de bloqueio de Fc e incubadas durante 15 minutos. Em seguida, C25 e clones derivados de C25, incluindo 4R9, 4R9_H2-2, 4R9_H4-n20 e 4R26, juntamente com a lgG4 humana foram diluídos, respectivamente em 50 μΙ de um tampão FACS nas concentrações de 25 pg/ml, 5 pg/ml, 1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,04 pg/ml, 0,008 pg/ml, 0,0016 pg/ml e 0,00032 pg e, depois, dispensados nas células, que foram incubadas a 4 °C durante 1,5 hora. Neste relatório, deve ser observado que os números celulares foram ajustados a 1 x 105. As células incubadas com os anticorpos foram repetidamente submetidas ao procedimento de lavagem de ressuspensão das células em um tampão FACS e centrifugação da solução em 1.500 rpm.
[0151 ]F(ab)2 anti-humano de cabra conjugado à PE; (Sigma; Cat. N2 P8047)) foi diluído no tampão FACS em uma razão em volume de 1:200 e, depois, adicionado às células em 100 μΙ/poço. As células foram recolocadas em suspensão e incubadas a 4 °C durante 30 minutos em uma condição escura.
[0152]As células incubadas com o tampão de fixação foram repetidamente submetidas ao procedimento de lavagem de ressuspensão das células em um tampão FACS, centrifugação da solução em 1.500 rpm, e descarte do sobrenadante. As células lavadas foram recolocadas em suspensão em 200 μΙ de um tampão FACS e as intensidades médias de fluorescência (MFIs) das células marcadas com PE foram monitoradas por um FACS LSR-Fortessa. Todas as análises de FACS foram conduzidas usando o software FlowJo.
[0153]Compatível com os resultados na Figura 5a, C25 mostrou os níveis máximos de sua ligação ao alvo (MFI 8008 ou mais) na concentração de 5 pg/ml, mas a capacidade de ligação rapidamente diminuiu abaixo da concentração de 5 pg/ml,
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Por outro lado, as capacidades de ligação ao alvo de clones derivados de C25 4R9, 4R26, e 4R9_H2-2 foram mantidas até 80 % ou mais de seus níveis máximos, mesmo na concentração de 0,2 pg/ml. Além disso, o valor de MFI do clone 4R9_H4-n20 atingiu até 12.000 ou mais, mostrando 1,5 vez maior em valores de MFI do que aqueles de outros clones (12.000 vs 8.000), mas a capacidade de ligação diminuiu rapidamente abaixo da concentração de 5 pg/ml similar àquela de C25 (Fig. 5b).
Exemplo Experimental 1.4. Medição da afinidade de ligação ao alvo de cada anticorpo anti-CEACAM1 [0154]As capacidades de ligação quantitativas de C25, 4R9, 4R26, 4R9_H22,4R9_H4-n20 e 4R9_H4-n20HC+4R26LC a CEACAM1 foram medidas usando Octet QKe (Pali ForteBio). Os anticorpos isolados e purificados no Exemplo 1 na concentração de 400 nM foram diluídos em série 1:1 por 6 vezes e as soluções de anticorpos resultantes nas concentrações de 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM e 6,25 nM foram dispensadas em uma placa de 96 poços Greiner (Greiner; Cat. N2 655209) em uma fileira. O último poço em cada fileira foi com uma amostra na concentração de anticorpos de 0 nM. A proteína humana recombinante CEACAM1 (R&D Systems; Cat. N2 2244-CM) foi diluída para obter uma concentração de 6,25 pg/μΙ e dispensada em cada poço de outra coluna em 200 pl/poço.
[0155]Quanto ao tampão de lavagem, o tampão de neutralização e o tampão de referência, tampão Reagent/Kinetics (10X) (Fortebio; Cat. N2 18-1092) foram diluídos 1:10 e dispensados em cada poço de uma coluna em uma fileira em 200 μΙ/poço e o tampão de regeneração foi dispensado em cada poço em 200 μΙ/poço. A placa de 96 poços Greiner foi separadamente preparada, o tampão Reagent/Kinetics (1X) foi dispensado em cada poço do número de biossensores que serão usados em uma fileira em 200 μΙ/poço e o cassete Biosensors/Anti-His (His1 K) (Fortebio; Cat. N2 18-5120) foi instalado. Os períodos de associação e dissociação foram ajustados para 300 segundos e 600 segundos, respectivamente, e os valores de Kd foram medidos.
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43/59 [0156]Como um resultado, suas afinidades para CEACAM1 foram determinadas como valores de afinidade (Kd) de 1,82 nM a 39,0 nM (Fig. 6).
Exemplo Experimental 2. Avaliação das propriedades físicas do anticorpo antiCEACAM1
Exemplo Experimental 2.1. Identificação do ponto isoelétrico do anticorpo antiCEACAM1 [0157]Vinte mililitros de tampão anódico IEF (50x) foram misturados com 980 ml de água deionizada (em seguida, referida como DW) para preparar um tampão anódico IEF 1X e 20 ml de tampão catódico IEF pH 3 a 10 (10X) foram misturados com 180 ml de DW para preparar um tampão catódico IEF 1X. O tampão anódico IEF 1X e o tampão catódico IEF 1X foram esfriados a 4 °C e usados.
[0158]Usando um gel de IEF (Invitrogen/gel IEF pH 3 a 10; 1,0 mm x 10 poço/EC6655BOX), a câmara superior foi enchida com 200 ml de tampão catódico IEF 1X e a câmara inferior foi enchida com 600 ml de tampão anódico IEF 1X. Quinze microlitros pl de 20 pl da solução contendo 10 pl de C25 na concentração de 1,12 mg/ml misturados com 10 pl de tampão de amostra IEF (pH 3 a 10, 2X) foram carregados e 5 pl de Marcadores IEF 3 a 10 (SERVA/10 mg/mL/SERVA Liquid Mix; 39212.01) foram usados para um marcador.
[0159]Eletroforese foi realizada com a voltagem alterada em três etapas de 100V:1 hora, 200V:1 hora e 500V:30 minutos e a fixação foi realizada usando solução de TCA 12 % durante 30 minutos. Depois da fixação, o ponto isoelétrico foi avaliado usando Coomassie Blue R-250 Intron Biotechnology (IBS-BC006).
[0160]Como um resultado, o valor do ponto isoelétrico real de C25 resultou em 8,0, que foi levemente maior do que seu valor teórico de 7,76 (Fig. 7).
Exemplo Experimental 3. Medição do efeito do anticorpo anti-CEACAM1 sobre a ativação de células T
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Exemplo Experimental 3.1. Avaliação da ativação de células T pelo anticorpo anti-CEACAM1 [0161]Células Jurkat E6.1 (ATCC; TIB-152TM) foram recolocadas em suspensão em 1 x 105/200 pl em Meio Dulbecco Modificado por Iscove completo (IMDM; Invitrogen; Cat. N2 12440053) suplementado com soro fetal bovino 10 % (v/v) (Gibco; Cat. N2 16000044) e 1X Penicilina/Estreptomicina (100X; Gibco; Cat. N2 15140122) e incubadas com anti-CD3 revestido em placa (OKT3; 0,1 pg/ml; eBioscience; Cat. N2 16-0037) na presença de 10 pg/ml ou 25 pg/ml, a 37 °C durante 96 horas com CO25 %. HulgG4 foi usado como um controle.
[0162]Depois de 96 horas, as células e meio de cultura foram recuperados e centrifugados em 1.500 rpm. Enquanto 0 sobrenadante foi reservado para medição de IL-2, as células remanescentes foram recuperadas, substituídas com um tampão FACS e submetidas a uma etapa de bloqueio com receptor Fc a 4 °C durante 15 minutos.
[0163]As células foram incubadas com anticorpo anti-CD25-PE-Cy7 ou anticorpo anti-CD69-APC (eBioscience; anti-CD25-PE-Cy7: Cat. N2 25 - 0259; antiCD69-APC: Cat. N2 17-0699) a 4 °C durante 15 minutos.
[0164]As células foram enchidas com um tampão FACS até 200 pl e centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos com 0 sobrenadante removido. Depois da ressuspensão das células em um tampão FACS fresco, este procedimento foi repetido três vezes para a remoção completa de anticorpos não ligados. As células foram recolocadas em suspensão em DPBS suplementada com paraformaldeído 1 % (v/v) e fixadas a 4 °C durante 30 minutos.
[0165]As células foram recolocadas em suspensão em tampão de pigmentação IX FoxP3 (eBioscience; Cat. N2 00-5523-00) e centrifugadas. Depois da repetição deste procedimento duas vezes, 0 anticorpo anti-Ki67 (eBioscience; Cat. N2 350520) marcado com um corante diferente foi diluído na razão em volume 1:100 em
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1X tampão de pigmentação FoxP3, que foi adicionado às células para obter o volume total de 50 pl e, depois, a mistura foi incubada a 4 °C durante 30 minutos. As células foram enchidas com 1X tampão de pigmentação FoxP3 e centrifugadas. Depois da lavagem repetida três vezes, as células foram aplicadas à citometria de fluxo para contar as células CD25+ CD69+ ativadas e outras populações proliferadoras de Ki67+ no dispositivo FACS LSR-Fortessa e analisadas usando o software FlowJo (Figs. 8 e 10).
[0166]Como um resultado, quando as células T Jurkat foram tratadas com C25 na concentração de anticorpo de 10 pg/ml e 25 pg/ml na condição de indução de CCM1 (OKT3:0,1 pg/ml, cultura em cIMDM durante 4 dias) para células T E6.1 Jurkat, altos níveis de ativação foram observados. Mais especificamente, a porcentagem e o número de populações de CD25+ CD69+ ativadas de células T Jurkat foram aumentados duas vezes ou mais e a porcentagem e o número de células proliferadoras de Ki67+ também foram aumentados duas vezes ou mais em comparação ao controle que foi tratado com hulgG4 (Figs. 9b e 11b).
Exemplo Experimental 3.2. Avaliação da secreção de IL-2 de células T pelo anticorpo anti-CEACAM1 [0167]Para avaliar as alterações na secreção de IL-2 a partir de células T pelo anticorpo anti-CEACAM1, os anticorpos anti-IL-2 (Ab de captura: eBioscience; Cat. N2 14-7029-85) foram primeiro diluídos em um tampão de revestimento (tampão carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6). Em seguida, a solução do anticorpo anti-IL-2 diluído foi dispensada em cada poço de uma placa de 96 poços em 200 μΙ/poço e incubada a 4 °C durante 16 a 18 horas. Em seguida, a placa de 96 poços foi lavada com DPBS e 200 μΙ de um tampão de bloqueio (SuperBlock™ Blocking Buffer: ThermoFisher Scientific; Cat. N2 37515) foi adicionado a cada poço, que depois foi incubado na temperatura ambiente durante 30 minutos.
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46/59 [0168]Para obter uma curva padrão, a proteína recombinante de IL-2 (R&D Systems; Cat. N2 P60568) foi diluída em um tampão de bloqueio para obter uma concentração de 20 pg/ml. A solução da proteína recombinante de IL-2 diluída foi diluída em série em uma razão em volume de 1:1 por 11 vezes. Doze amostras de proteína recombinante de IL-2 e os sobrenadantes a partir da cultura celular Jurkat E6.1 armazenada a -80 °C no Exemplo 3.1 foram dispensados em cada poço de uma placa de 96 poços revestida com anticorpo anti-IL-2 em 100 μΙ/poço e incubados na temperatura ambiente durante 2 horas.
[0169]Depois de lavar a placa de 96 poços 4 vezes com um tampão de lavagem preparado por meio da diluição de 10 μΙ de Tween 20 (Sigma-Aldrich; Cat. N2 P9146) em 990 μΙ de PBS, uma solução preparada por meio da diluição de anticorpos anti-IL-2 conjugados à biotina (Anticorpo de detecção: eBioscience; Cat. N2 13-7028) em um tampão de bloqueio em uma razão em volume de 1:1.000 foi dispensada em cada poço em 100 μΙ/poço, que depois foi incubado na temperatura ambiente durante 2 horas.
[0170]Depois de lavar a placa de 96 poços com um tampão de lavagem 4 vezes, uma solução preparada por meio da diluição de uma estreptavidina marcada com peroxidase (Sigma; Cat. N2 S5512) em um tampão de bloqueio em uma razão em volume de 1:1.000 foi dispensada em cada poço em 100 μΙ/poço, que foi incubado na temperatura ambiente durante 2 horas.
[0171]Depois de lavar a placa de 96 poços 4 vezes novamente com um tampão de lavagem, solução de substrato de peroxidase TMB (KPL; Cat. N2 52-0002) foi dispensada em cada poço em 100 μΙ/poço, que foi incubado durante 10 minutos. Em seguida, uma solução de parada (KPL; Cat. N2 50-85-05) foi adicionada aos poços em 100 μΙ/poço para interromper a reação. Os valores de O.D foram medidos em um comprimento de onda de 450 nm usando um dispositivo de leitura de dinâmica molecular. Os valores medidos foram analisados usando SoftMax Pro 5.4.1.
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47/59 [0172]Como um resultado, quando as células foram tratadas com C25 na concentração de anticorpo de 10 pg/ml e 25 pg/ml na condição de indução de CEACAM1 (OKT3 em 0,1 pg/ml, cultura durante 4 dias) para Jurkat E6.1, os níveis de IL-2 secretada medidos usando os sobrenadantes foram cerca de três vezes maior do que aqueles do controle (Figs. 9c e 11 c).
Exemplo Experimental 3.3. Avaliação da ativação de células T que superexpressam CEACAM1 pelo anti-CEACAM-1 anticorpo [0173]O vetor do promotor-CEACAM1-GFP EF1 foi transfectado em células T Jurkat E6.1 e, depois, tratado com solução salina de dissulfato G418 (Sigma; G8168) em uma concentração de 700 pg/ml para seleção. AS células GFP+ CEACAM1+ foram separadas usando Classificador Celular Ativado por Fluorescência para construir células Jurkat que superexpressam CEACAM1 (células T CEACAM1-Jurkat).
[0174]As células T CEACAM1 -Jurkat derivadas de células Jurkat E6.1 (ATCC; TIB-152TM) foram recolocadas em suspensão em 200 pl de IMDM suplementado com FBS 10 % e 1X Penicilina/Estreptomicina para obter um número celular de 1 x 105 e, depois, estimuladas com OKT3 revestido em placa (0,1 ou 1 pg/ml; eBioscience; 160037), na presença de 10 pg/ml ou 25 pg/ml de C25 durante 48 horas. HulgG4 foi usado como um controle.
[0175]Depois de 48 horas, as células e o meio de cultura foram recuperados e centrifugados em 1.500 rpm. O sobrenadante foi armazenado a -80 °C para IL-2 ELISA e as células remanescentes foram recuperadas, substituídas com um tampão FACS e submetidas ao bloqueio do receptor Fc a 4 °C durante 15 minutos. As células foram tratadas com anticorpo CD25-PE-Cy7 ou anticorpo anti-CD69-APC e incubadas a 4 °C durante 15 minutos.
[0176]As células foram recuperadas e enchidas com um tampão FACS até 200 pl e centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos. Depois da ressuspensão das células em um tampão FACS fresco, este procedimento foi repetido três vezes para a
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48/59 remoção completa de anticorpos não ligados. As células foram recolocadas em suspensão em DPBS suplementada com paraformaldeído 1 % (v/v) e fixadas a 4 °C durante 30 minutos.
[0177]As células foram enchidas em tampão de pigmentação IX FoxP3 até 200 pl e centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos para remover o sobrenadante. Depois da repetição deste procedimento duas vezes, o anticorpo anti-KI67 marcado com um corante diferente foi diluído na razão em volume 1:100, o qual foi adicionado às células para obter o volume total de 50 pl e, depois, a mistura foi incubada a 4 °C durante 30 minutos.
[0178]As células foram enchidas em tampão de pigmentação IX FoxP3 até 200 pl e centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos para remover o sobrenadante. Depois da repetição deste procedimento três vezes e, finalmente, substituição com tampão FACS, as células CD25+ CD69+ ativadas e as células proliferadoras de KI67+ foram identificadas no dispositivo FACS LSR-Fortessa e analisadas usando o software FlowJo (Figs. 12 e 15).
[0179]Como um resultado, as células T CEACAMI-Jurkat em uma baixa concentração de OKT3 (0,1 pg/ml) na presença de anti-CEACAM1 mostraram altos níveis de ativação. Mais especificamente, as populações CD25+ CD69+ de células T CEACAMI-Jurkat foram aumentadas em 1,5 vez (C25 em 25 pg/ml) ou 4 vezes ou mais (C25 em 10 pg/ml) em comparação àquelas do grupo tratado com hulgG4 (Figs. 13b e 14b).
[0180]Além disso, as células T CEACAMI-Jurkat em uma alta concentração de OKT3 (1 pg/ml) na presença de anti-CEACAM1 mostram altos níveis de ativação. Mais especificamente, as populações CD25+ CD69+ de células T CEACAMI-Jurkat foram aumentadas 2 vezes (C25 em 25 pg/ml) ou 6 vezes ou mais (C25 em 10 pg/ml) em comparação àquelas do grupo tratado com hulgG4 (Figs. 16b e 17b).
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Exemplo Experimental 3.4. Avaliação da secreção de IL-2 de células T que superexpressam CEACAM1 pelo anticorpo anti-CEACAM1 [0181]Para avaliar as alterações induzidas pelo anticorpo anti-CEACAM1 nos níveis de IL-2 secretada de células T que superexpressam CEACAM1, o sobrenadante separado das células T CEACAMI-Jurkat E6.1 armazenadas a -80 °C no Exemplo Experimental 3.3 foi submetido à ELISA pelo mesmo método do Exemplo Experimental 3.2.
[0182]Como um resultado, quando as células T CEACAMI-Jurkat que superexpressam CEACAM1 foram tratadas com C25 nas concentrações de anticorpo de 10 pg/ml e 25 pg/ml em uma condição de cultura (OKT3 na concentração de 0,1 pg/ml, cultura durante 2 dias), os níveis de secreção de IL-2 foram medidos usando os sobrenadantes e foram 20 vezes ou mais maiores do que o controle (Figs. 13c e 14c).
[0183]Além disso, quando as células T CEACAMI-Jurkat que superexpressam CEACAM1 foram tratadas com C25 nas concentrações de anticorpo de 10 pg/ml e 25 pg/ml em outra condição de cultura (OKT3 na concentração de 1 pg/ml, cultura durante 2 dias), os níveis de secreção de IL-2 foram medidos usando os sobrenadantes e foram 1,5 vez ou mais maiores do que o controle (Figs. 16c e 17c).
Exemplo Experimental 3.5. Avaliação da ativação de células T pelo anticorpo anti-CEACAM1 usando o ensaio NFAT-luciferase [0184]As células Jurkat-GFP/NFAT-luc (células que não expressam CEACAM1, células que superexpressam repórter de NFAT-luciferase) ou células Jurkat-CCM1/NFAT-luc (células que superexpressam CEACAM1, células que superexpressam repórter de NFAT-luciferase) foram recolocadas em suspensão em cada poço em um número celular de 6 x 105 e dispensadas em uma placa de 96 poços revestida com 0,05 ou 0,1 pg/ml de OKT3 e adicionadas com cada anticorpo em uma
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50/59 concentração de 10 pg/ml preparados no Exemplo 1 e anti-CD28 (28,2; eBioscience; Cat. N2 16-0289-85; em 1 pg/ml). lgG4 humana foi usada como um controle negativo.
[0185]Depois da incubação durante 6 horas, as células foram coletadas, lavadas uma vez com PBS e lisadas com 80 pl de um tampão de lise passivo. Vinte microlitros do lisato celular foram dispensados em cada poço de uma placa de ensaio de 96 poços branca, que depois foi colocada em um dispositivo luminômetro. Um tampão luciferase foi carregado em um injetor do luminômetro e 80 pl do tampão luciferase foi injetado em cada poço para medir a atividade da luciferase.
[0186]Como um resultado, o efeito inibitório por C25 sobre as inibição de células T dependente de CCM1 não foi observado em Jurkat-GFP/NFAT-luc que não expressou CEACAM1 em uma condição de cultura de 6 horas, ao passo que os níveis de aumento da ativação de NFAT induzida por TCR por C25 durante 6 horas foi 2 vezes ou mais maiores em células Jurkat-CCM1/NFAT-luc com ο OKT3 nas concentrações de 0,05 e 0,1 pg/ml (Figs. 18 e 19).
[0187]Além disso, o grupo experimental tratado com anticorpos antiCEACAM1 derivados de C25 mostrou atividades de NFAT-luc luciferase 1,5 a 2 vezes maiores do que aquelas do grupo tratado com lgG4 em 0,1 pg/ml da concentração de OKT3, que foram estatisticamente significantes (Fig. 20).
[0188]Exemplo Experimental 4. Avaliação da expressão de CEACAM1 em tecidos humanos e de macaco [0189]Uma solução 10 mM de EZ-Link™ Sulo-NHS-LC-LC-Biotin (ThermoFisher Scientific; Cat. N2 21338) foi preparada e 13,3 pl da solução por 1 mg de C25 foram adicionados e biotinilados a 4 °C durante 2 horas. Lâminas de TMA humanas e de macaco foram desparafinizadas em um forno a 60 °C durante 1 hora. A hidratação foi progressivamente realizada na ordem de xileno (100 %), álcool (90 %), álcool (80 %) e álcool (álcool-DW).
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51/59 [0190]Para a recuperação de antígenos, as lâminas de TMA foram tratadas em um banho-maria em temperatura constante contendo 1,5 L de tampão Tris-EDTA pH 9,0, as quais foram incubadas a 100 °C durante 20 minutos. Para prevenir a atividade intracelular de peroxidase, 100 μΙ de peróxido de hidrogênio 3 % foram adicionados às mesmas e incubados durante 6 minutos e, depois, 100 μΙ de soro de cavalo normal 5 % (v/v) foram adicionados às mesmas e incubados durante 30 minutos.
[0191 ]Os anticorpos primários (hlgG4 conjugado à biotina ou C25; 1 mg/ml) foram diluídos em 100 μΙ de um tampão de pigmentação em uma razão em volume 1:1 ou 1:5 e incubados na temperatura ambiente durante 2 horas. Cem microlitros de reagente ABC foram adicionados e incubados durante 30 minutos. O kit de substrato DAB (VECTOR LABORATORIES; Cat. N2 SK-4100) foi adicionado, seguido por desenvolvimento de cor durante 2 minutos e pigmentação comparativa com hematoxilina para análise. Visto que os níveis de expressão de CEACAM1 em células normais foram muito baixos, os anticorpos foram usados em concentrações relativamente altas.
[0192]As intensidades de pigmentação de C25 em tecidos normais de macacos Cynomolgus foram similares àquelas em tecidos normais humanos e os níveis de expressão de CEACAM1 em tecidos normais foram muito baixos. Portanto, a expressão de CEACAM1 foi detectada apenas quando os tecidos foram tratados com altas concentrações de C25 (Fig. 21). A lgG4 humana foi usada na mesma concentração como um controle para C25 (Fig. 22).
Exemplo Experimental 5. Avaliação da reatividade cruzada do anticorpo antiCEACAM1
Exemplo Experimental 5.1. Avaliação da reatividade cruzada do anticorpo anti-CEACAM1 para proteínas da família CEACAM usando anticorpo Fab IgG humana
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52/59 [0193]A proteína CEACAM-1/CD66a humana recombinante (R&D Systems; Cat. N22244-CM, HCCM1), proteína CEACAM-5/CD66e humana recombinante (R&D Systems; Cat. N2 4128-CM, HCCM5), proteína CEACAM-6/CD66c humana recombinante (R&D Systems; Cat. N2 3934-CM, HCCM6), proteína CEACAM3/CD66d humana recombinante (Sino Biological; Cat. N2 11933-H08H, HCCM3), proteína quimérica PD-1 Fc de camundongo recombinante (R&D Systems; Cat. N2 1021-PD, mPD-1-Fc), proteína CEACAM1-Fc (lgG4) recombinante (Mogam, produção in-house, HCCM1-Fc), proteína humana CEACAM-1/CD66a recombinante em massa (R&D Systems; Cat. N2 2244-CM, HCCM1 (em massa)) e proteína CEACAM1/CD66a de camundongo (Sino Biological; Cat. N2 50571-M08H, CCM1 de camundongo) (2,5 pg cada) foram dissolvidas em 10 ml de PBS, respectivamente, e dispensadas em uma placa de 96 poços (Nunc; Cat. N2 467679) em 100 μΙ/poço, que foi incubada durante a noite a 4 °C. Depois, cada poço foi tratado com 300 pl de albumina de soro bovino 1 % (v/v), que foram incubados a 37 °C durante 1 hora.
[0194]Três microgramas de anticorpos C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 e C26 foram dissolvidos em 1000 pl de PBS, respectivamente. Os anticorpos diluídos foram dispensados em cada poço revestido com cada proteína em 100 μΙ/poço, que foi incubado a 37 °C durante 1 hora. Em seguida, cada poço foi lavado 3 vezes com um tampão de lavagem preparado por meio da diluição de 10 pl de Tween 20 (Sigma-Aldrich; Cat. N2 P9146) em 990 pl de PBS. Depois, 2 μΙ de anticorpo anti-lgG-Fab humano conjugado à HRP (Fab de IgG anti-humana; Sigma; Cat. N2 A0293) foram diluídos em 10 ml de PBS, adicionados aos poços em 100 μΙ/poço e incubados durante 1 hora.
[0195]Depois da conclusão da reação, os poços foram lavados três vezes com o tampão de lavagem e 100 pl de solução de TMB foram adicionados a cada poço para induzir o desenvolvimento de cor. Em seguida, 100 pl de H2SO4 2 M foram
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53/59 adicionados a cada poço para interromper a reação e a absorvância foi medida em um comprimento de onda de 450 nm.
[0196]Como um resultado, os anticorpos C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 e C26 mostraram altos níveis de capacidade de ligação a HCCM1, HCCM1 (em massa) e HCCM1-Fc. Os anticorpos CEACAM1, excluindo C17, C19, C22, mostraram níveis basais de capacidade de ligação a HCCM3, HCCM5 e HCCM6 (Fig. 23). Assim, foi concluído que os anticorpos anti-CEACAM da presente invenção se ligam especificamente apenas a CEACAM1.
Exemplo Experimental 5.2. Reatividade cruzada da proteína da família CEACAM com o anticorpo anti-CEACAM1 usando anticorpo IgG Fc humano [0197]A proteína CEACAM-1/CD66a humana recombinante (R&D Systems; Cat N2 2244-CM, HCCM1), proteína CEACAM-5/CD66e humana recombinante (R&D Systems; Cat. N2 4128-CM, HCCM5), proteína CEACAM-6/CD66c humana recombinante (R&D Systems; Cat. N2 3934-CM, HCCM6), proteína CEACAM3/CD66d humana recombinante (Sino Biological; Cat. N2 11933-H08H, HCCM3), proteína humana B7-H5/GÍ24/VISTA (Sino Biological; Cat. N2 13482-H08H, HVISTA), proteína CEACAM-1/CD66a recombinante humana em massa (R&D Systems; Cat. N2 2244-CM, HCCM1 (em massa)), proteína de domínio-capa CEACAM1-N humana recombinante (Mogam, produção in-house, domínio-capa HCCM1-N) e proteína BSA (2,5 pg cada) foram dissolvidas em 10 ml de PBS, respectivamente, e dispensadas em uma placa de 96 poços em 100 μΙ/poço, que foi incubado a 4 °C durante a noite. Depois, cada poço foi tratado com 300 μΙ de albumina de soro bovino 1 % (v/v) e incubado a 37 °C durante 1 hora.
[0198]Cada um entre os anticorpos C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 e C26 (3 pg) foi dissolvido em 1000 pl de PBS. Os anticorpos diluídos foram dispensados em cada poço revestido com cada proteína em 100 μΙ/poço e incubados a 37 °C durante 1 hora. Em seguida, cada poço foi lavado 3 vezes com um tampão de
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54/59 lavagem preparado por meio da diluição de 10 pl de Tween 20 (Sigma-Aldrich; Cat. N2 P9146) em 990 μΙ de PBS. Depois, 2 μΙ de anticorpo anti-lgG-Fc humano conjugado à HRP (IgG Fc anti-humana, Sigma Cat. N2 A0170) foram diluídos em 10 ml de PBS, adicionados aos poços em 100 μΙ/poço e incubados durante 1 hora.
[0199]Depois da conclusão da reação, os poços foram lavados três vezes com o tampão de lavagem e 100 μΙ da solução de TMB foram adicionados a cada poço para induzir o desenvolvimento de cor. Em seguida, 100 μΙ de H2SO4 2 M foram adicionados a cada poço para interromper a reação e a absorvância foi medida em um comprimento de onda de 450 nm.
[0200]Como um resultado, os anticorpos C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 e C26 mostraram altos níveis de capacidade de ligação a HCCM1, HCCM1 (em massa) e HCCM1 -domínio N-capa, e os anticorpos CEACAM1, excluindo C17, C19, C22, mostraram níveis basais de capacidade de ligação a HCCM3, HCCM5 e HCCM6 (Fig. 24). Assim, foi descoberto que os anticorpos anti-CEACAM1 da presente invenção se ligam especificamente apenas a CEACAM1.
Exemplo Experimental 5.3. Avaliação da reatividade cruzada da proteína da família CEACAM expressada sobre a superfície celular com 0 anticorpo antiCEACAM1 [0201 ]As células HEK293 foram adicionadas com 10 pg de cada vetor pEF1 aAcGFP-N1 (Clontech, Cat. N2 631973) como um vetor controle, vetores plasmídicos CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 e CEACAM8, seguido por transfecção sob a condição de voltagem de pulso 1.100 V, largura de pulso 20 ms e número de pulso 2. Depois de 48 horas de transfecção, a expressão de GFP foi confirmada por microscopia de fluorescência. As células foram destacadas por tratamento com 1 ml de Solução TrypLE Express (ThermoFisher Scientific; Cat. N212605010), recolocadas em suspensão em 9 ml de DMEM (Gibco, Cat. N2 11995-065) suplementadas com
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FBS 10 % (v/v) e centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos para remover o sobrenadante resultante.
[0202]Depois de lavar uma vez com PBS, as células foram recolocadas em suspensão em um tampão FACS para obter uma concentração de 5 x 105 células/100 μΙ. Solução de bloqueio de Fc humano foi adicionada às amostras em 1 μΙ/amostra, as quais foram incubadas a 4 °C durante 10 minutos. As células foram tratadas com hulgG4 ou um entre os clones anti-CEACAM1 listados em 1 pg/5 x 105 células, que foram incubadas a 4 °C durante 10 minutos. Depois de lavar com tampão FACS, os anticorpos anti-hulgG4 de cabra marcados com PE foram diluídos em uma razão de 1:200 em um tampão FACS e adicionados às amostras em 100 μΙ/amostra, as quais foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. As amostras foram enchidas com um tampão FACS até 200 μΙ e, depois, centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos para remover o sobrenadante resultante. O tampão de fixação (300 μΙ) foi adicionado para ressuspender as células. As células que expressam GFP foram selecionadas no dispositivo FACS LSR-Fortessa e a expressão dos membros CEACAM foi avaliada, respectivamente, usando o anticorpo específico para cada membro CEACAM (Tabela 3). Além disso, a ligação de anticorpos anti-CEACAM1 foi avaliada pelo canal de fluorescência de PE e analisada usando o software FlowJo.
Tabela 3
| Tipo | Forma | Nome da Substância | Adquirida a partir da: |
| CEACAM1 | Clone de cDNA | CEACAM1 | R&D Systems, RDC0951 |
| Isotipo | PE Controle Isotipo lgG1 de Camundonqo | R&D Systems, IC002P | |
| Anticorpo anti-CEACAM1 | Anticorpo conjugado à PE CEACAM1/CD66a humano | R&D Systems,FAB2244P | |
| CEACAM3 | cDNA clone | CEACAM3-GFP | Oriqene, RG217469 |
| Isotipo | IgG de Ovelha | R&D Systems, 5-001-A |
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| Anticorpo anti-CEACAM3 | Anticorpo CEACAM-3/CD66d humano | R&D Systems, AF4166P | |
| Anticorpo secundário | IgG (H+L) Ficoeritrina antiovelha de asno | R&D Systems, F0126 | |
| CEACAM5 | Clone de cDNA | CEACAM5-GFP | Origene, RG206434 |
| Isotipo | PE Controle Isotipo lgG2a de camundongo | R&D Systems, IC003P | |
| Anticorpo anti-CEACAM5 | Anticorpo conjugado à PE CEACAM-5/CD66e humano | R&D Systems, FAB41281P | |
| CEACAM6 | Clone de cDNA | CEACAM6-GFP | Origene, RG202454 |
| Isotipo | PE Controle Isotipo lgG1 Kde Camundongo | eBioscience, 12-4714-82 | |
| Anticorpo anti-CEACAM6 | CD66c-PE humano | eBioscience, 12-0667-42 | |
| CEACAM8 | Clone de cDNA | CEACAM8 | Origene/RG204740 |
| Isotipo | PE Controle Isotipo IgGIde camundongo | R&D Systems, IC002P | |
| Anticorpo anti-CEACAM8 | Anticorpo conjugado à PE CEACAM8 humano | R&D Systems/FAB4246P |
[0203]Como um resultado, foi descoberto que C25 e clones derivados de C25 foram especificamente ligados a CEACAM1 apenas entre os membros CEACAM aos quais CEACAM1 pertencia (Fig. 25).
[0204]Além disso, as células HEK293 foram misturadas com 10 pg de cada vetor controle, vetor de plasmídeo CEACAM1 de Cynomolgus e vetor de plasmídeo CEACAM1 humano, seguido por transfecção usando um sistema de transfecção Neon sob a condição de voltagem de pulso 1.100 V, largura de pulso 20 ms e número de pulso 2. Depois de 48 horas da transfecção, a expressão de GFP foi confirmada por
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57/59 um microscópio de fluorescência e as células foram destacadas por tratamento com Solução TrypLE Express e transferidas para o tampão FACS para interromper a reação.
[0205]Depois de lavar uma vez com PBS, as células foram recolocadas em suspensão em um tampão FACS para obter uma concentração de 5 x 105 células/100 μΙ. A solução de bloqueio de Fc humano foi adicionada às amostras em 1 μΙ/amostra, as quais foram incubadas a 4 °C durante 10 minutos. As amostras foram tratadas com lgG4 humana ou C25 em uma concentração de 1 pg/5 x 105 células, as quais foram incubadas a 4 °C durante 1 hora. Depois de lavar com tampão FACS, os anticorpos anti-hulgG4 de cabra marcados com PE foram diluídos em uma razão de 1:200 em um tampão FACS e adicionados às amostras em 100 μΙ/amostra, as quais foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. As amostras foram enchidas com um tampão FACS até 200 μΙ e, depois, centrifugadas em 1.200 rpm durante 5 minutos para remover o sobrenadante resultante. O tampão de fixação (300 μΙ) foi adicionado para ressuspender as células. As células que expressam GFP foram selecionadas no dispositivo FACS LSR-Fortessa e a expressão de cada um entre os membros CEACAM foi avaliada usando o anticorpo específico para cada membro da família CEA. Além disso, a ligação com C25 foi avaliada pelo canal de fluorescência de PE e analisada usando o software FlowJo.
[0206]Como um resultado, foi descoberto que C25 reconheceu não apenas CEACAM1 humano, mas também CEACAM1 de macaco (Cynomolgus) (Fig. 26a). Os clones derivados de C25 também reconheceram o CEACAM1 de Cynomolgus, assim como a proteína humana (Fig. 26b).
Exemplo Experimental 6. Avaliação do efeito anticâncer do anticorpo antiCEACAM1 [0207]As células de câncer (MKN45: JCRB Cell Bank; Cat. N2 JCRB0254; MKN1: JCRB Cell Bank; Cat. N2 JCRB0252) foram recolocadas em suspensão em
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58/59 meio RPMI 1640 (ThermoFisher Scientific; Cat. N2 11875093) em uma concentração de 1 x 104/200 μΙ e dispensadas em cada poço da placa de 96 poços em 200 μΙ/poço e cultivadas durante a noite sob a condição de 37 °C e CO2 5 %. As células não conjugadas foram removidas juntamente com 0 meio e as células TALL-104 (ATCC; Cat. N2 CRL-11386TM) ou NK92MI (ATCC; Cat. N2 CRL-2408TM) foram adicionados aos mesmos em várias razões em relação às células de câncer (0:1,0,1:1:1:1, 10:1). Neste relatório, C25 também foi adicionado aos poços em uma concentração de 10 pg/ml. Como um controle, hulgG4 foi tratado da mesma maneira.
[0208]Depois da cocultura durante 6 horas, as células solúveis não conjugadas foram removidas juntamente com 0 meio e Cell Titer 96 Aqueous One Solution (Promega; Cat. N2 G3582), um reagente de ensaio MTS, foi diluído em uma razão de 1:4 no meio RPMI 1640. A solução diluída foi adicionada aos poços em 200 μΙ/poço e ainda cultivada em um local escuro durante 3 horas. Depois, 0 valor de O.D de cada amostra foi medido com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 490 nm e os valores medidos foram analisados usando 0 programa SoftMax Pro 5.4.1.
[0209]Como um resultado, quando os efeitos anticâncer de células CTL (Fig. 27: TALL-104) ou NK (Fig. 28: NK-92MI) foram avaliados pelo método de avaliação da eficácia in vitro de C25, foi descoberto que C25 aumentou as reações imunológicas anticâncer de CTLs e células NK, no caso de linhagem celular de câncer gástrico MKN45, em que CEACAM1 foi expressado em um alto nível, ao passo que nenhum efeito anticâncer de C25 foi observado no caso de MKN1, uma linhagem celular de câncer gástrico, em que a expressão de CEACAM1 não foi detectada (Figs. 27 e 28).
[0210]Além disso, quando 0 efeito in vitro de clones de anticorpos antiCEACAM1 derivados de C25 foi testado na linhagem celular de câncer CEACAM1 + MKN45 da mesma maneira que acima, a morte de células de câncer por anticorpos
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59/59 anti-CEACAM1 atingiu níveis de 40 a 50 % em comparação àqueles do controle (Fig.
29).
Claims (47)
- REIVINDICAÇÕES1. Anticorpo anti-CEACAM1 ou um fragmento do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:CDR1 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 8;CDR2 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 9 a 16;CDR3 de cadeia leve compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 17 a 29;CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 30 a 38;CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 39 a 46; eCDR3 de cadeia pesada compreendendo uma das sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 47 a 55.
- 2. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.Petição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 72/852/12
- 3. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 56 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 4. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 18, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 5. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 58 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 6. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30,Petição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 73/853/12CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 7. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 60 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 8. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 20, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 9. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 62 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 10. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidosPetição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 74/854/12 representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 11. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 12. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 21, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 13. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.Petição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 75/855/12
- 14. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 22, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 15. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 16. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48.
- 17. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende umPetição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 76/856/12 domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88.
- 18. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 31, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.
- 19. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90.
- 20. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 24, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representadaPetição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 77/857/12 pela SEQ ID NO: 40 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49.
- 21. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92.
- 22. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 25, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 33, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 41 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50.
- 23. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 94.
- 24. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 14, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequênciaPetição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 78/858/12 de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 23, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 34, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 42 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51.
- 25. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 96.
- 26. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 15, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 26, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 35, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 43 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52.
- 27. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 98.
- 28. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1Petição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 79/859/12 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 27, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 36, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 44 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53.
- 29. Anticorpo anti-CEACAMl ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 100.
- 30. Anticorpo anti-CEACAMl ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 7, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 14, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 37, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 54.
- 31. Anticorpo anti-CEACAMl ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidosPetição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 80/8510/12 representada pela SEQ ID NO: 82 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 102.
- 32. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 15, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 29, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 38, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 46 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 55.
- 33. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 104.
- 34. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 23, CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47.Petição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 81/8511/12
- 35. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86.
- 36. Anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, scFv, F(ab)2 e Fv.
- 37. Agente anticâncer CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, como um ingrediente ativo.
- 38. Agente anticâncer, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão, câncer da tireoide e mieloma.
- 39. Adjuvante anticâncer CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo, como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 35, como um ingrediente ativo.
- 40. Composição para tratar câncer CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o adjuvante anticâncer, como definido na reivindicação 39, e um agente terapêutico celular.
- 41. Composição para tratar câncer, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente terapêutico celular são células T citotóxicas ou células NK (natural killer cells).
- 42. Uso do anticorpo anti-CEACAM1 ou do fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, e linfócitos, CARACTERIZADOPetição 870200003473, de 08/01/2020, pág. 82/8512/12 pelo fato de que é para a fabricação de um fármaco para tratar câncer em um indivíduo, em que os linfócitos entram em contato com o anticorpo anti-CEACAM1 ou o fragmento do mesmo.
- 43. Uso, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que os linfócitos compreendem pelo menos uma entre células T citotóxicas e células NK.
- 44. Uso, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que os linfócitos são obtidos a partir de um indivíduo.
- 45. Uso, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão, câncer da tireoide e mieloma.
- 46. Uso do anticorpo ou do fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um fármaco para inibir a proliferação de células tumorais que expressam CEACAM1.
- 47. Uso do anticorpo ou do fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um fármaco para a prevenção ou tratamento de câncer.
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