BR112019017017A2

BR112019017017A2 - método de tratamento de um indivíduo humano que tem câncer, anticorpo anti-cd25, uso de um anticorpo anti-cd25, combinação de um anticorpo anti-cd25, kit para o uso no tratamento de câncer, composição farmacêutica, combinação, anticorpo biespecífico, método de tratamento de câncer, e método de depleção de células t regulatórias em um indivíduo

Info

Publication number: BR112019017017A2
Application number: BR112019017017A
Authority: BR
Inventors: Goubier Anne; Goyenechea Corzo Beatriz; Arce Vargas Frederick; Solomon Isabelle; Salimu Josephine; PEGGS Karl; Moulder Kevin; Merchiers Pascal; Quezada Sergio
Original assignee: Cancer Research Tech Ltd; Tusk Therapeutics Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2020-04-14
Also published as: MX2019010974A; WO2018167104A1; CN110869388A; EP3596123A1; DK3596123T3; CL2019002624A1; US20200010554A1; SG11201908578YA; CA3056506A1; EP3596123B1; CR20190477A; RS65351B1; JP2024050684A; KR20190130137A; PE20191812A1; AU2018233976A1; US11879014B2; IL269081A; JP2020514363A; LT3596123T

Abstract

a presente invenção está no campo da imunoterapia contra o câncer e se refere a um método de tratamento de câncer, incluindo um método de tratamento de tumores sólidos, em que o método envolve o uso de um anticorpo anti-cd25 a um indivíduo que não substancialmente inibe a ligação de interleucina-2 (il-2) a cd25 ou a sinalização de il-2 via cd25.

Description

MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO HUMANO QUE TEM CÂNCER, ANTICORPO ANTI-CD25, USO DE UM ANTICORPO ANTI-CD25, COMBINAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-CD25, KIT PARA O USO NO TRATAMENTO DE CÂNCER, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMBINAÇÃO, ANTICORPO BIESPECÍFICO, MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER, E MÉTODO DE DEPLEÇÃO DE CÉLULAS T REGULATÓRIAS EM UM INDIVÍDUO

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção encontra-se no campo de imunoterapia contra o câncer, e se refere a um método de tratamento do câncer, inclusive um método de tratamento de tumores sólidos, em que o método envolve o uso de anticorpo anti-CD25.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO [002] A imunoterapia contra o câncer envolve o uso do próprio sistema imunológico de um indivíduo para tratar ou prevenir câncer. As imunoterapias se aproveitam do fato de que as células cancerosas geralmente possuem moléculas sutilmente diferentes em sua superfície, que podem ser detectadas pelo sistema imunológico. Estas moléculas, ou antígenos cancerígenos, são mais comumente proteínas, mas também incluem moléculas como carboidratos. Portanto, a imunoterapia envolve a provocação do sistema imunológico a atacar as células tumorais por meio destes antígenos alvo. No entanto, tumores malignos, em especial tumores sólidos, ou cânceres hematológicos podem escapar da vigilância imunológica por meio de diversos mecanismos tanto intrínsecos à célula tumoral quanto mediados pelos componentes do microambiente tumoral. Entre os últimos, a infiltração tumoral por células T reguladoras (células Treg ou Tregs) e, mais especificamente, um equilíbrio desfavorável de células T efetoras (Teff) versus

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Tregs (ou seja, uma proporção baixa de Teff para Treg), foram propostos como fatores críticos (Smyth M et al. , 2014, Immunol Cell Biol. 92, 473-4) .

[003] Desde a sua descoberta, as Tregs foram consideradas críticas na mediação da homeostase imunológica e promoção do estabelecimento e manutenção da tolerância periférica. No entanto, no contexto de câncer seu papel é mais complexo. Como as células cancerosas expressam auto-antígenos e antígenos associados ao tumor, a presença de Tregs, que procurar atenuar as respostas das células efetoras, pode contribuir para a progressão do tumor. A infiltração de Tregs em tumores estabelecidos representa, portanto, um dos principais obstáculos para as respostas antitumorais efetivas e para o tratamento de cânceres em geral. Acredita-se que os mecanismos de supressão empregados por Tregs contribuam significativamente para a limitação ou mesmo insucesso das terapias atuais, em particular imunoterapias que contam com a indução ou potencialização de respostas antitumorais (Onishi H et al, 2012 Anticanc. Res. 32, 997-1003).

[004] A depleção de Tregs como uma abordagem terapêutica para tratamento do câncer é uma abordagem que é confirmada por estudos que demonstraram a contribuição das Tregs para o estabelecimento e progressão e tumoral em modelos murinos. Além disso, a infiltração tumoral pelas Tregs também foi associada ao pior prognóstico em diversos cânceres humanos (Shang B et al., 2015, Sei Rep. 5:15179). Foi demonstrado que as células Treg contribuem para o estabelecimento e progressão de tumores em modelos murinos e que sua ausência resulta em retardo da progressão tumoral (Elpek et al., 2007 J Immunol. 178(11):6840-8; Golgher et al. , 2002; Eur J Immunol.

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32(11):3267-75, Jones et al., 2002 Cancer Immun. 22;2:1; Onizuka et al., 1999 Cancer Res. 59(13) :3128-33.,^- Shimizu et al., 1999, J Immunol. 163 (10) :5211-8) . Em humanos, a alta infiltração tumoral pelas células Treg e, principalmente, a baixa proporção de células T efetoras (Teff) para células Treg estão associadas a resultados desfavoráveis em diversos cânceres humanos (Shang et al., 2015) . Por outro lado, a lata proporção de células Teff/Treg está associada a respostas favoráveis na imunoterapia tanto em humanos quanto em camundongos (Hodi et al. , 2008, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 105, 3005-3010; Quezada et al. , 2006, J Clin Invest.

116(7) :1935-45) . No entanto, a depleção de Tregs nos tumores é complexa, e os resultados de estudos nesta área têm sido discrepantes.

[005] CD25 é um dos alvos moleculares potenciais para se atingir a depleção de Tregs. CD25, também conhecida como a cadeia do receptor alfa de alta afinidade a interleucina-2 (IL-2Ra), é expressa constitutivamente em níveis elevados nas células Treg, e está ausente ou é expresso em baixos níveis nas células T efetoras e, assim, é um algo promissor para a depleção de Treg. A interação de IL-2/CD25 tem sido objeto de diversos estudos em modelos murinos, a maioria deles envolvendo o uso de PC61, um anticorpo de camundongo CD25 anti-murina (Setiady Y et al., 2010. Eur J Immunol. 40:780-6). As atividades de ligação a CD25 e funcionais deste anticorpo foram comparadas com aquelas do painel de anticorpos monoclonais gerados por diferentes autores (Lowenthal J.W et al. , 1985. J. Immunol., 135, 39883994; Moreau, J.-L et al., 1987. Eur. J. Immunol. 17,929-935; Volk HD et al., 1989 Clin. exp. Immunol. 76, 121-5; Dantal J

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4/155 et al. , 1991, Transplantation 52:110-5) . Apesar de os estudos originais demonstrarem atividade profilática, mas não terapêutica de PC61, um estudo recente demonstrou que uma versão otimizada de Fc deste anticorpo anti-CD25 levou à depleção intratumoral de Treg e oferece benefícios terapêuticos significativos em diversos modelos tumorais murinos (Vargas A et al. , 2017, Immunity 48(6), 577-586). Os anticorpos anti-CD25 disponíveis, como PC61, bloqueiam ou inibem a ligação de IL-2 a CD25, tal como muitos anticorpos CD25 anti-camundongo, e a maioria deles relevada como sendo anticorpos CD25 anti-humana; vide, por exemplo, os documentos de patente W02004/045512, WO 2006/108670, WO1993/011238, W01990/007861 e WO2017/174331. Por exemplo, Basiliximabe e Daclizumabe são anticorpos CD25 anti-humana que inibem a ligação de IL-2 a CD25 e foram desenvolvidos para reproduzir a ativação das células T efetoras. Basiliximabe é um anticorpo CD25 quimérica murina/humana atualmente aprovado para doenças enxerto versus hospedeiro e Daclizumabe é um anticorpo CD25 humanizada aprovado para o tratamento de esclerose múltipla. No entanto, outros anticorpos anti-CD25 ainda permitem a ligação de IL-2 a CD25, como o clone 7D4 (CD25 anticamundongo) , clone MA251 (CD25 anti-humana) ou 7G7B6 (CD25 anti-humana) (Rubin et al.,1985, Hybridoma 4(2) 91-102, Tanaka et al.,1986, Microbiol. Immunol 30(4), 373-388). 7G7B6 tem sido usado como um anticorpo de pesquisa e sugerido como uma meação alvo para direcionar o radionuclídeo para linfomas que expressam CD25 (Zhang et al., 2009, Cancer Brother Radiopharm 24(3), 303-309).

[006] Por exemplo, 7D4 é um anticorpo CD25 antimurino de IgM de ratos que tem sido usado extensivamente para

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5/155 detectar células positivas para CD25 na presença de ou após o tratamento com PC61 ou de anticorpos que possuem propriedades de ligação similares (Onizuka S et al. , 1999. Cane Res. 59, 3128 -3133) . Pouquíssimos documentos revelam qualquer propriedade funcional do anticorpo 7D4-IgM, isoladamente ou em comparação a PC61 (Kohm A et al., 2006, J Immunol. 176: 33015; Hallett W et al. , 2008. Biol Blood Marrow Transplant 14:1088-1099; Fecci P et al., 2006 Clin Cancer Res. 12:42944305; McNeill A et al., 2007. Scand J Immunol 65: 63-9; Setiady Y et al., 2010. Eur. J. Immunol. 40: 780-6; Couper K et al., 2007. J Immunol. 178: 4136-4146). De fato, a técnica anterior não ensina a possibilidade de adaptar, ou de algum modo modificar, o isótopo ou outras características estruturais de 7D4 a fim de obter um anticorpo aperfeiçoado para ser usado na terapia do câncer.

[007] No entanto, a capacidade de 7D4-IgM (como tal ou como um anticorpo modificado por engenharia) ou de qualquer CD25 anti-humana projetada ou caracterizada como tendo características de ligação a CD25 similares àquelas de 7D4 para CD25 camundongo, como 7G7B6 ou M-A251, não foi avaliada detalhadamente em relação à depleção otimizada de células Treg nos tumores, isoladamente ou em combinação outros anticorpos ou outros compostos anticâncer. Como discutido acima, a infiltração de células Treg nos tumores, e em particular a baixa proporção de células Teff para células Treg, podem levar a um resultado clínico desfavorável. CD25 foi identificada como um marcador de Treg e, portanto, podería ser um alvo de interesse para os anticorpos terapêuticos que visam a depleção de Treg. Sobretudo, CD25 é a subunidade alfa do receptor para IL-2 e IL-2 é uma citocina chave para as

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6/155 respostas de Teff. Os anticorpos anti-CD25 que foram submetidos a teste clínico até o momento, enquanto realiza a depleção de células Treg também bloqueia a sinalização de IL-2 por meio de CD25. Os presentes inventores descobriram agora que este bloqueio da sinalização de IL-2 limita as respostas de Teff e que um anticorpo anti-CD25 que não bloqueia a sinalização de IL2 pode efetivamente realizar a depleção de células Treg, enquanto ainda permite que IL-2 estimule as células Teff, provendo anticorpos que apresentam um forte efeito anticâncer. Portanto, há a necessidade na técnica de um método de tratamento do câncer que envolva a depleção de Tregs, particularmente enquanto ainda permite que IL-2 estimule as células Teff, em particular por meio do uso de anticorpos antiCD25 apropriados.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [008] A presente invenção provê anticorpos antiCD25 e usos dos anticorpos anti-CD25 que são caracterizados pelos elementos estruturais que permitem a ligação de CD25 sem bloquear de forma substancial a ligação de Interleucina 2 (IL2) a CD25 ou sinalização de IL-2 por meio de CD25, e a depleção eficiente de Tregs, em particular nos tumores. As características estruturais e funcionais de 7D4-IgM (como descrito em relação à CD25 de camundongo) foram modificadas a fim de prover anticorpos que apresentam características surpreendentemente aperfeiçoadas em termos de uso para depleção de Tregs e eficácia contra tumores, isoladamente ou em combinação com outro agentes anticâncer. As características estruturais e funcionais de outros anticorpos anti-CD25 que não bloqueiam a ligação de interleucina 2 a CD25 (e não bloqueiam a sinalização de IL2 por meio de CD25) e esgotam

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7/155 eficientemente as Tregs também foram caracterizadas. Estes achados podem ser usados para definir e gerar outros anticorpos CD25 anti-humana que proveem efeitos comparáveis contra tumores em indivíduos humanos. As referências aqui a anticorpos anti-CD25 e similares incluem fragmentos de ligação a antígeno destes, bem como variantes (inclusive variantes maturadas por afinidade), exceto o contexto implique o contrário.

[009] Em um aspecto principal, a presente invenção provê um método de tratamento de um indivíduo humano que tem câncer, o método compreendendo a etapa de administrar um anticorpo anti-CD25 a um indivíduo, em que o dito indivíduo tem um tumor (preferivelmente um tumor sólido), em que o dito anticorpo não inibe a ligação de Interleucina-2 (IL-2) a CD25.

[010] As referências a não bloqueia, não bloqueio, bloqueio não IL-2, sem bloqueio e terminologia similar aqui (em relação ao não bloqueio da ligação de IL-2 a CD25 na presença do anticorpo anti-CD25) inclui realizações em que o anticorpo anti-CD25 não bloqueia a sinalização de IL-2 por meio de CD25. Ou seja, o anticorpo anti-CD25 da invenção inibe menos de 50% da sinalização de IL-2 por meio de CD25 em comparação à sinalização de IL-2 na ausência dos anticorpos. De preferência, o anticorpo anti-CD25 inibe menos de aproximadamente 40%, 35%, 30%, de preferência menos de aproximadamente 25% da sinalização de IL-2 em comparação à sinalização de IL-2 na ausência dos anticorpos.

[011] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 compete com o anticorpo 7G7B6 pela ligação à CD25 humana; e/ou compete com o anticorpo MA251 pela ligação à CD25 humana.

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8/155 [012] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga ao mesmo epitopo reconhecido pelo anticorpo 7G7B6 e/ou se liga ao mesmo epitopo reconhecido pelo anticorpo MA251.

[013] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender um ou mais resíduos de aminoácido compreendidos em uma ou mais das extensões de aminoácidos selecionados entre os aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), aminoácidos 166-186 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG), aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO: 1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 70-88 da SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR). De preferência, o epitopo compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quatorze, pelo menos quinze, pelo menos dezesseis, pelo menos dezessete, pelo menos dezoito ou mais resíduos de aminoácidos compreendidos em uma ou mais das extensões de aminoácidos selecionados entre aminoácidos 150163 da SEQ ID No: 1 (YQCVQGYRALHRGP), aminoácidos 166-18 6 da SEQ ID No:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG), aminoácidos 42-56 da SEQ ID No: 1 (KEGTMLNCECKRGFR) e/ou aminoácidos 70-88 da SEQ ID No:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR).

[014] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir de: aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) , aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP), aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

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9/155 [015] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana em que o epitopo compreende pelo menos uma sequência selecionada entre aminoácidos em que o epitopo compreende pelo menos uma sequência selecionada entre: aminoácidos 150-158 da SEQ ID No: 1 (YQCVQGYRA) , aminoácidos 166-180 da SEQ ID No: 1 (SVCKMTHGKTRWTQP), aminoácidos 176-186 da SEQ ID No: 1 (RWTQPQLICTG), aminoácidos 42-56 da SEQ ID No: 1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 74-84 da SEQ ID No: 1 (SSWDNQCQCTS).

[016] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir dos: aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR), aminoácidos 70 a 84 da SEQ ID NO: 1 (NSSHSSWDNQCQCTS) e aminoácidos 150 a 158 da SEQ ID NO: 1 (YQCVQGYRA).

[017] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo compreendendo a sequência dos aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR). Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e os aminoácidos 150-160 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALH). Em uma outra realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e os aminoácidos 74-88 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR). Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), os aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP), os

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10/155 aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e os aminoácidos 74-88 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR).

[018] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo compreendendo a sequência dos aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP). Em uma realização, o anticorpo anti-CD-25 se liga a um epitopo compreendendo a sequência dos aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP). Em uma realização, o anticorpo anti-CD-25 se liga a um epitopo compreendendo a sequência dos aminoácidos 176-186 da SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG).

[019] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especialmente a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) e os aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP). Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especialmente a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) e os aminoácidos 176-186 da SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG). Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga especialmente a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP) e os aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP).

[020] Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO: 1 (SSWDNQCQCTSSATR) .Em uma realização, o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo que compreende a sequência de aminoácidos 70-84 da SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTS).

[021] Os presentes inventores descobriram de forma surpreendente que os anticorpos que se ligam a epitopos particulares de CD25, incluindo aqueles que competem com 7G7B6

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11/155 e/ou MA251 para a ligação a CD25, são úteis no tratamento do câncer, em particular tumores sólidos. Estes anticorpos ainda permitem a sinalização de IL-2 por meio de CD25 ligada pelo anticorpo, e os inventores descobriram pela primeira vez que na adição à depleção de células Treg, os anticorpos usados na presente invenção permitem às células Teff exercer perfeitamente seus efeitos anticâncer, pelo menos em parte, ao permitir a ligação de IL-2 a, e sinalização através de, CD25 expressa nas células Teff.

[022] Estes anticorpos possuem de preferência uma constante de dissociação (Kd) para CD25 menor que 10~⁷ M e/ou uma constante de dissociação para pelo menos um receptor de Fey de ativação menor que aproximadamente 10~⁶ M. De preferência, o anticorpo possui uma constante de dissociação (Kd) para CD25 na faixa de 10~⁸ ou 10~⁹ ou 10~¹⁰ ou 1CD¹¹ ou 10~¹²ou 10~¹³, ou inferior. Mais preferivelmente, é um anticorpo IgGl humano que se liga a pelo menos um receptor de Fcy de ativação com alta afinidade e esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor. Mais preferivelmente, o anti-CD25 é caracterizado por outras características relacionada aos receptores de Fcy, em particular:

(a) se ligar a receptores de Fcy com uma razão ativadora/inibitória (A/I) maior que 1; e/ou (b) se ligar a FcvRIIa com afinidade maior à que se liga a FcvRIIb.

[023] Dado o uso do anticorpo anti-CD25 nos métodos terapêuticos, pode apresentar características preferidas adicionais. O anticorpo anti-CD25 é de preferência um anticorpo monoclonal, em particular um anticorpo humano, quimérico ou humanizado. O anticorpo pode ser uma variante

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12/155 maturada por afinidade deste, opcionalmente uma variante humanizada ou maturada por afinidade de 7G7B6 ou MA251. Além disso, em vista de suas interações com as células imunológicas e/ou outros componentes do sistema imunológico para exercer suas atividades, o anticorpo anti-CD25 pode obter ainda uma resposta potencializada de CDC, ADCC e/ou ADCP, de preferência um aumento de resposta de ADCC e/ou ADCP, mais preferivelmente um aumento de resposta de ADCC, conforme comparado aos anticorpos clínicos CD25 anti-humana existentes, Daclizumabe e Basiliximabe. Em algumas realizações, o anticorpo anti-CD25 pode obter uma redução de resposta de CDC se comparado com os anticorpos clínicos CD25 anti-humana existentes, Daclizumabe e Basiliximabe, mais preferivelmente o anticorpo anti-CD25 não obtém uma resposta de CDC.

[024] O anticorpo anti-CD25 da presente invenção (conforme geralmente definido acima e em mais detalhes na Descrição Detalhada) pode ser usado em métodos de tratamento de um indivíduo humano, em que o dito anticorpo anti-CD25 é administrado a um indivíduo. Em uma realização, o indivíduo tem câncer. De preferência, o indivíduo tem um tumor sólido estabelecido (de preferência em um método que compreende ainda a etapa de identificação de um indivíduo que tem um tumor sólido). Estes métodos podem compreender ainda a administração de um agente terapêutico adicional ao dito indivíduo. Em uma realização, o agente adicional pode ser um inibidor de checkpoint imunológico ao dito indivíduo, por exemplo, na forma de um anticorpo que se liga e inibe a proteína de checkpoint imunológico. Um inibidor de checkpoint imunológico preferido é um antagonista de PD-1, que pode ser um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-Ll. Mais em geral, um anticorpo antiPetição 870190079314, de 15/08/2019, pág. 25/444

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CD25 pode ser usado em métodos de depleção de células T regulatórias em um tumor sólido em um indivíduo que compreende a etapa de administração do dito anticorpo anti-CD25 ao dito indivíduo.

[025] Em um aspecto adicional, o anticorpo antiCD25 da invenção pode ser usado para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo humano, de preferência em que o dito indivíduo tem um tumor, de preferência um tumor sólido. O dito anticorpo pode ser administrado em combinação com um agente terapêutico adicional, de preferência um agente terapêutico adicional contra o câncer, por exemplo, com um inibidor de checkpoint imunológico, de preferência um antagonista da via de PD-l/PDLl, uma vacina contra o câncer e/ou usado em combinação com terapias de padrão de cuidado, como quimioterapia ou radioterapia.

[026] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma combinação de um anticorpo anti-CD25, conforme definido acima, com outro composto anticâncer (de preferência um inibidor de checkpoint imunológico ou outros compostos, como indicado na Descrição Detalhada) para uso no tratamento de câncer em um indivíduo humano, de preferência em que o dito indivíduo tem um tumor sólido e o composto anticâncer (por exemplo, um inibidor de checkpoint imunológico como um antagonista de PD-1 ou uma citocina como Interleucina 2), pode ser administrado simultânea, separada ou sequencialmente. Neste escopo, a presente invenção também provê um kit para uso no tratamento de câncer que compreende um anticorpo anti-CD25, conforme definido acima, e um composto

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14/155 anticâncer (por exemplo, um inibidor de checkpoint imunológico, como um antagonista de PD-1).

[027] Em um aspecto adicional, a presente invenção também provê uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD25, conforme definido acima, em um meio farmaceuticamente aceitável. Tal composição também pode compreender um composto anticâncer (por exemplo, um inibidor de checkpoint imunológico como um antagonista de PD1) .

[028] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção também provê um anticorpo biespecífico que compreende:

(a) uma primeira porção de ligação a antígeno que se liga à CD25; e (b) uma segunda porção de ligação a antígeno que se liga a outro antígeno;

em que o anticorpo anti-CD25 não inibe a ligação da Interleucina-2 (IL-2) com CD25, e de preferência o anticorpo biespecífico é um anticorpo IgGl que se liga a pelo menos um receptor de Εογ de ativação com uma alta afinidade e esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor. De preferência, esta segunda porção de ligação a antígeno se liga a um antígeno selecionado entre uma proteína de checkpoint imunológico, ou um antígeno associado ao tumor, ou pode ser, ou ser baseado em, um anticorpo de receptor Fc de ativação anti-humano (antiFcgRI, anti-FcgRIIa, anti-FcgRIII), ou um anticorpo antagonista de FcvRIIb anti-humano. Desta forma, a segunda porção de ligação a antígeno pode se ligar a FcRIIb. Pode se ligar alternativamente a FcgRI, FcgRIIa e/ou FcgRIII com atividade antagonista.

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15/155 [029] De preferência, este anticorpo biespecífico compreende uma segunda porção de ligação a antígeno que se liga a uma proteína de checkpoint imunológico que é selecionada entre o grupo que consiste em PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, VISTA, TIGIT, TIM3, PD-L1, B7H3, B7H4, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1, GAL9, GITR, 0X40, CD137 e ICOS. Tal proteína de checkpoint imunológico é expressa de preferência em uma célula tumoral. De preferência, a proteína de checkpoint imunológico é selecionada entre PD-1, PD-L1 e CTLA-4. A segunda porção de ligação a antígeno que se liga a uma proteína de checkpoint imunológico pode estar compreendida em um anticorpo comercialmente disponível que atua como um inibidor de checkpoint imunológico, por exemplo:

no caso de PD-1, o anticorpo anti-PD-1 pode ser Nivolumabe ou Pembrolizumabe.

(b) No caso de PD-L1, o anti-PD-Ll é Atezolizumabe;

(c) No caso de CTLA-4, o anti-CTLA-4 é Ipilimumabe. [030] Este anticorpo biespecífico pode ser provido em qualquer formato comercialmente disponível, inclusive Duobody, BiTE DART, CrossMab, Knobs-in-holes, Triomab ou outro formato molecular adequado de anticorpo biespecífico e fragmentos destes.

[031] Alternativamente, este anticorpo biespecífico compreende uma segunda porção de ligação a antígeno que se liga ao antígeno associado ao tumor. Nesta realização alternativa, estes antígenos e anticorpos correspondentes incluem, entre outros, CD22 (Blinatumomabe), CD20 (Rituximabe, Tositumomabe), CD56 (Lorvotuzumabe) , CD66e/CEA (Labetuzumabe), CD152/CTLA-4 (Ipilimumabe),

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CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (Edrecolomabe) , CD340/HER2 (Trastuzumabe, Pertuzumabe) e EGER (Cetuximabe, Panitumumabe).

[032] A combinação do anticorpo anti-CD25 da invenção com outro composto anticâncer, bem como os anticorpos biespecificos, conforme definido acima, pode ser usada em um método de tratamento do câncer, que compreende a etapa de administração da dita combinação ou dito anticorpo biespecifico a um indivíduo, em particular quando o indivíduo tem um tumor sólido, e para uso no tratamento de câncer em um indivíduo.

[033] Os objetivos adicionais da invenção, inclusive outras definições dos anticorpos CD25 anti-humana da invenção e seus usos em métodos para o tratamento do câncer, em composições farmacêuticas, em combinações com outros compostos anticâncer, em anticorpos biespecificos, são providos na Descrição Detalhada e nos Exemplos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [034] A presente invenção provê um método de tratamento ou prevenção de câncer, em um indivíduo, de preferência quando o indivíduo tem um tumor sólido, compreendendo a etapa de administração ao dito indivíduo de um anticorpo que se liga a CD25, por meio do qual os anticorpos anti-CD25 são caracterizados por elementos estruturais que permitem a ligação de CD25 sem interferir na ligação de interleucina 2 ou a sinalização por meio de CD25 e depleção de Tregs de forma eficiente, em particular nos tumores. O anticorpo que se liga a CD25, conforme definido na presente invenção, pode ser usado no tratamento ou prevenção de câncer, de preferência de um tumor sólido. Exposto de forma alternativa, a presente invenção provê o uso de um anticorpo

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17/155 que se liga a CD25 e permite a ligação de CD25 sem interferir na ligação de interleucina 2 a CD25 e a depleção eficiente de Tregs para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção do câncer, de preferência, um tumor sólido. A invenção também provê o uso de um anticorpo que se liga a CD25 e que permite a ligação a CD25 sem interferir substancialmente na ligação de interleucina 2 a CD25 e depleção de Tregs no tratamento ou prevenção do câncer, de preferência um tumor sólido.

[035] Os presentes inventores descobriram que CD25 pode ser direcionado ao uso de um anticorpo anti-CD25 que não inibe (ou não inibe substancialmente) a ligação de interleucina 2 a CD25 ou a sinalização de IL-2 por meio de CD25 para depleção de células T regulatórias no contexto terapêutico, por exemplo, em um tumor sólido estabelecido. Os presentes inventores descobriram que anticorpos anti-CD25 sem bloqueio de IL-2 que possuem um isótipo que potencializa sua ligação a receptores gama Fc de ativação levam à depleção eficaz de células T regulatórias infiltrantes no tumor enquanto ainda permitem uma resposta ideal de Teff, uma abordagem terapêutica que podería, por exemplo, ser associada (em combinação com ou em anticorpos biespecíficos) a outros compostos de direcionamento ao câncer, como aqueles que visam uma proteína de checkpoint imunológico, um antígeno associado ao tumor ou um receptor de Fcy inibitório. Estes achados também possibilitam combinar o uso de um anti-CD25 com interleucina2 a doses apropriadas para tratamento do câncer.

[036] CD25 é a cadeia alfa do receptor de IL-2, e é encontrado nas células T ativadas, células T regulatórias, células B ativadas, algumas células T NK, alguns timócitos,

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18/155 precursores mieloides e oligodendrócitos. CD25 se associa a CD122 e CD132 para formar um complexo heterotrimérico que atua como o receptor de alta afinidade para IL-2. A sequência consensual de CD25 humana é mostrada abaixo na SEQ ID No: 1 (número de adesão Uniprot P01589; o domínio extracelular de CD25 humana madura, correspondendo aos aminoácidos 22-240, é sublinhado e é apresentado como SEQ ID No:2):

20 30 40 50

MDSYLLMWGL LTFIMVPGCQ AELCDDDPPE IPHATΕΚΑΜΑ YKEGTMLNCE

70 80 90 100

CKRGFRRIKS GSLYMLCTGN SSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVTPQPEE

110 120 130 140 QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIY	150 HFWGQMVYY
160 170 180 190 QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLICTGEMET	200 SQFPGEEKPQ
210 220 230 240 ASPEGRPESE TSCLVTTTDF QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ	250 VAVAGCVFLL

260 270

ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI [037] Conforme aqui usado, um anticorpo que se liga a CD25 se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar à subunidade de CD25 do receptor de IL-2. Esta subunidade também é conhecida como a subunidade alfa do receptor de IL-

2. Este anticorpo também é denominado aqui como um anticorpo anti-CD25.

[038] Um anticorpo anti-CD25 é um anticorpo capaz de ligação específica à subunidade de CD25 (antígeno) do receptor de IL-2. Ligação específica, ligar especificamente e especificamente se ligar são compreendidos por significar que o anticorpo possui uma

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19/155 constante de dissociação (Kd) para o antígeno de interesse de menos que aproximadamente 10~⁶ Μ, 10~⁷ Μ, 10~⁸ Μ, 10~⁹ M, 10~¹⁰Μ, 1C®¹¹ M, 10~¹² M ou 10~¹³ M. Em uma realização preferida, a constante de dissociação é menos que 10~⁸ M, por exemplo, na faixa de 10~⁹ M, 10~¹⁰ M, ICr¹¹ M, 10~¹² M ou 10~¹³ M.

[039] Conforme aqui usado, o termo anticorpo se refere tanto a moléculas intactas de imunoglobulina quanto a fragmentos destas, que incluem o local de ligação ao antígeno, e inclui formas de anticorpos policlonais, monoclonais, modificados por engenharia genética e formas modificadas de outro modo, inclusive, entre outros, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos heteroconjugados e/ou multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos), e fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG, fusões de polipeptídeo-Fc, variantes de cadeia única (fragmentos de scFv, VHHs, Trans-bodies®, Affibodies®, anticorpos de domínio único de tubarão, cadeia única ou diacorpos em Tandem (TandAb®), VHHs, Anticalins®, Nanobodies®, míníbodíes, BiTE®s, peptídeos bicíclicos e outros scaffolds proteicos de imunoglobulina alternativos). Em algumas realizações, um anticorpo pode carecer de uma modificação covalente (por exemplo, fixação de um glicano) que teria se produzido naturalmente. Em algumas realizações, um anticorpo pode conter uma modificação covalente (por exemplo, fixação de um glicano, uma porção detectável, uma porção terapêutica, uma porção catalítica ou outro grupo químico que provê estabilidade melhorada ou administração do anticorpo, como polietilenoglicol) . Em algumas realizações, os anticorpos

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20/155 podem estar na forma de um anticorpo mascarado (por exemplo, Probodies®). Um anticorpo mascarado pode compreender um bloqueio ou peptideo máscara que se liga especificamente à superfície de ligação do antígeno do anticorpo e interfere na ligação do antígeno do anticorpo. O peptideo de máscara está ligado ao anticorpo por um vinculador clivável (por exemplo, por uma protease) . A divagem seletiva do vinculador no ambiente desejado, ou seja, no ambiente tumoral, permite a ocultação/bloqueio do peptideo para se dissociar, possibilitando a ocorrência de ligação ao antígeno no tumor e limitando, assim, possíveis questões de toxicidade. Anticorpo também pode se referir a anticorpos de camélidos (apenas anticorpos de cadeia pesada) e moléculas similares a anticorpo, como anticalinas (Skerra (2008) FEBS J 275, 267783). Em algumas realizações, um anticorpo é policlonal ou oligoclonal, ou seja, gerado como um painel de anticorpos, cada um associado a uma única sequência de anticorpos e ligando mais ou menos epitopos distintos em um antígeno (como diferentes epitopos no domínio extracelular de CD25 humana que estão associados a diferentes anticorpos CD25 anti-humana de referência). Os anticorpos policlonais ou oligoclonais podem ser providos em uma única preparação para usos médicos, conforme descrito na literatura (Kearns JD et ai., 2015. Mol Cancer Ther. 14:1625-36).

[040] Em um aspecto da invenção, o anticorpo é monoclonal. O anticorpo pode, adicional ou alternativamente, ser humanizado ou humano. Em um aspecto adicional, o anticorpo é humano, ou em qualquer caso um anticorpo que possui um formato e características que permitem seu uso e administração a indivíduos humanos. No aspecto da invenção, os anticorpos

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21/155 podem ser variantes humanizadas de 7G7B6 ou MA251 maturados por afinidade. 0 anticorpo maturado por afinidade possui pelo menos 10% maior afinidade a CD25 e/ou as sequências de CDR são pelo menos 80% idênticas, de preferência 90% idênticas às CDRs da sequência principal (entre todas as sequências). Anticorpo maturado por afinidade é um anticorpo com um ou mais aminoácidos alterados em uma ou mais CDRs, que resulta em um anticorpo com afinidade aperfeiçoada para CD25 em comparação à cepa principal que não possui aminoácidos alterados.

[041] Os anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (Igs) são glicoproteinas que possuem as mesmas características estruturais. As imunoglobulinas podem ser de qualquer classe como IgA, IgD, IgG, IgE ou IgM. As imunoglobulinas podem ser de qualquer subclasse como IgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em um aspecto preferido da invenção, o anticorpo anti-CD25 é da classe IgG, de preferência a subclasse IgGl. Em um aspecto, o anticorpo anti-CD25 é da subclasse IgGl humana. Alternativamente, em um aspecto, o anticorpo anti-CD25 é da subclasse lgG2 humana.

[042] A região Fc de anticorpos IgG interage com diversos receptores Εογ de célula (FcyR) para estimular e regular os mecanismos efetores a jusante. Há cinco receptores de ativação, a saber, FcyR! (CD64), FcvRIIa (CD32a), FcyRIIc (CD32c), FcYRIIIa (CD16a) e FcYRIIIb (CD16b), e um receptor inibitório FcYRIIb (CD32b). A comunicação dos anticorpos IgG com o sistema imunológico é controlada e mediada por FcyRs, que retransmite as informações detectadas e reunidas pelos anticorpos ao sistema imunológico, provendo uma ligação entre os sistemas imunológicos inatos e adaptativos, e

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22/155 particularmente no contexto de bioterapêutica (Hayes J et al., 2016. J Inflamm Res 9: 209-219).

[043] As subclasses de IgG variam em sua capacidade de se ligar a FcyR e esta ligação diferencial determina sua capacidade de obter uma gama de respostas funcionais. Por exemplo, em humanos, FcyRIIIa é o principal receptor envolvido na ativação de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e IgG3 seguido de perto por IgGl exibe as mais elevadas afinidades para este receptor, refletindo sua capacidade de induzir fortemente ADCC. Embora tenha sido mostrado que IgG2 possui ligação fraca para este receptor, também se descobriu que o anticorpo anti-CD25 tendo o isótipo IgG2 humano esgota de forma eficaz Tregs.

[044] Em uma realização preferida da invenção, o anticorpo se liga a FcyR com maior afinidade, de preferência um receptor de ativação com alta afinidade. De preferência, o anticorpo se liga a FcyRI e/ou FcyRIIa e/ou FcyRIIIa com alta afinidade. Em uma realização particular, o anticorpo se liga a pelo menos um receptor de Εογ de ativação com uma constante de dissociação de menos de aproximadamente 10~⁶ Μ, 10~⁷ M, 10~⁸Μ, 10~⁹ M ou 10~¹⁰ M.

[045] Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo IgGl, de preferência um anticorpo IgGl humano, que é capaz de ligação a pelo menos um receptor de Fc de ativação. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar a um ou mais receptores selecionados entre EcyRI, FcyRIIa, FcyRIIc, FcvRIIIa e FcvRIIIb. Em um aspecto, o anticorpo é capaz de ligação a FcvRIIIa. Em um aspecto, o anticorpo é capaz de ligação a FcvRIIIa e FcyRIIa, e opcionalmente EcyRI. Em um aspecto, o anticorpo é capaz de ligação a estes receptores com alta

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23/155 afinidade, por exemplo, com uma constante de dissociação de menos que aproximadamente 10~⁷ Μ, 10~⁸ Μ, 10~⁹ M ou 10~¹⁰ M.

[046] Em um aspecto, o anticorpo se liga a um receptor inibitório, FcvRIIb, com baixa afinidade. Em um aspecto, o anticorpo se liga a FcvRIIb com uma constante de dissociação maior que aproximadamente 10~⁷ M, maior que aproximadamente 10~⁶ M ou maior que aproximadamente 10~⁵ M.

[047] Em uma realização preferida da invenção, o anticorpo anti-CD25 é da subclasse IgGl e, de preferência, possui atividade de ADCC e/ou ADCP, conforme discutido aqui, em particular em relação a células de origem humana. Conforme anteriormente descrito (Nimmerjahn F et al., 2005. Science, 310:1510-2), o isótipo m!gG2a (o qual corresponde ao isótipo IgGl humano) se liga a todos os subtipos de FcyR com uma alta razão de ativação para inibidora (A/I), ou seja, pelo menos superior a 1. Em contraste, outros isótipos (como o isótipo rlgGl) se liga com uma afinidade similar a um único FcyR de ativação apenas (FcvRIII), bem como o FcvRIIb inibidor, resultando em uma baixa razão A/I (<1). Esta razão A/I menor pode correlacionar a uma menor depleção de Treg intratumoral e menor atividade terapêutica antitumoral do isótipo. Apesar do perfil de ligação conhecido de FcyR para anticorpos do isótipo IgG2 humano, também pode-se atingir depleção significativa de Treg com o isótipo IgG2 humano de um anticorpo anti-CD25. Portanto, em uma realização, o anticorpo anti-CD25 é da subclasse IgG2 [048] Em uma realização preferida, o anticorpo anti-CD25, conforme aqui descrito, liga-se à CD25 humana, de preferência com alta afinidade. Ainda de preferência, o anticorpo anti-CD25 se liga à região extracelular de CD25

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24/155 humana, como mostrado acima. Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD25, conforme aqui descrito. Em particular, os Exemplos proveem dados experimentais gerados com o anticorpo que é secretado pelo hibridoma 7D4. Como indicado no Histórico da invenção, este anticorpo é específico para CD25 de camundongo que, como mostrado pela comparação do painel de anticorpos monoclonais (inclusive PC61), liga-se a um dos três epitopos na CD25 de camundongo, que é distinto do local de ligação de IL-2 e não bloqueia a ligação de IL-2 a CD25. Por exemplo, 7D4 mostrou ligar-se a CD25 de camundongo em um epitopo que compreende os aminoácidos 184 a 194 (REHHRFLASEE) em [sequência Uniprot P01590]. Os ensaios envolvendo 7D4 e CD25 de camundongo na literatura (por exemplo, Setiady Y et al. , 2010. Eur. J. Immunol. 40: 780-6; McNeill A et al., 2007. Scand J Immunol. 65:63-9; Teege S et al. , 2015, Sei Rep 5: 8959), junto àqueles revelados nos Exemplos, inclusive anticorpos recombinantes que compreendem o domínio de ligação a CD25 de 7D4 ou os anticorpos CD25 anti-humana sem bloqueio a IL-2, denominados MA-251 e 7G7B6, podem ser adaptados para caracterizar aqueles anticorpos humanos que reconhecem CD25 humana que possui as mesmas características funcionais de 7D4 tanto no nível de interação com CD25 (em particular, por não bloquear a ligação de IL-2) quanto com receptores de Fcy (em particular, de preferência, pela ligação de um ou mais receptores de Fcy de ativação humanos e depleção eficiente de Treg), quando o isótipo apropriado está associado, como descrito nos Exemplos.

[049] Em um aspecto da invenção, os anticorpos competem com o anticorpo 7G7B6 para a ligação com CD25 humana; e/ou se liga ao(s) mesmo(s) epitopo(s) reconhecido(s) pelo

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25/155 anticorpo 7G7B6. 7G7B6 é um anticorpo monoclonal que possui um isótipo IgG2a de camundongo que reconhece a CD25 humana. 7G7B6 compreende uma região de cadeia pesada variável tendo a sequência:

EVQLVESGGDLVQPRGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLELVATI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYFCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:3), e uma região de cadeia leve variável tendo a sequência:

QIVLSQSPAILSASPGERVTMTCRASSSVSFMHWLQQKPGSSPKPWIYATS NLASGVSARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSNPPAFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:4).

[050] Em uma realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFTLDSYGVS (SEQ ID No:7) como cadeia pesada variável CDR1; a sequência de aminoácidos GVTSSGGSAYYADSV (SEQ ID No:8) como cadeia pesada variável CDR2, a sequência de aminoácidos DRYVYTGGYLYHYGMDL (SEQ ID No:9) como cadeia pesada variável CDR3, e compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos RASQSISDYLA (SEQ ID No: 11) como cadeia leve variável CDR1; a sequência de aminoácidos YAASTLPF (SEQ ID No:12) como cadeia leve variável CDR2, a sequência de aminoácidos QGTYDSSDWYWA (SEQ ID No:13) como cadeia leve variável CDR3. O anticorpo pode competir com 7G7B6 pela ligação à CD25 humana. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência:

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EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTLDSYGVSWVRQAPGKGLEWVGVT SSGGSAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRYVYTGGYLYHYGM DLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10), e a cadeia leve compreendendo uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLAWYQQKPGKVPKLLIYAA STLPFGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQGTYDSSDWYWAFGGGTKVEI (SEQ ID NO:14).

em outra realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos SGFSVDIYDMS (SEQ ID No:15) como cadeia pesada variável CDR1; a sequência de aminoácidos YISSSLGATYYADSV (SEQ ID No:16) como cadeia pesada variável CDR2, a sequência de aminoácidos ERIYSVYTLDYYAMDL (SEQ ID NO:17) como cadeia pesada variável CDR3, e compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASQGITNNLN (SEQ ID No:19) como cadeia leve variável CDR1; a sequência de aminoácidos YAASTLQS (SEQ ID No :20) como cadeia leve variável CDR2, a sequência de aminoácidos QQGYTTSNVDNA (SEQ ID No :21) como cadeia leve variável CDR3. O anticorpo pode competir com 7G7B6 pela ligação à CD25 humana. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSVDIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYI SSSLGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERIYSVYTLDYYAM DLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:18).

e uma cadeia leve compreendendo uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência:

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DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGITNNLNWYQQKPGKVPKLLIYAA STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYTTSNVDNAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:22).

[051] Em uma realização, o anticorpo que pode competir com 7G7B6 para ligação com CD25 humana compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23), ou

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24) e compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQAPRPLIYATS NLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:25), ou

QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQSPRPLIYATS NLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:26).

[052] Em um aspecto da invenção, os anticorpos competem com o anticorpo MA251 para ligação com CD25 humana; e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epitopo(s) reconhecido(s) pelo anticorpo MA251. MA251 é um anticorpo monoclonal que possui um isótipo de camundongo que reconhece CD25 humana. MA251 compreende uma região de cadeia pesada variável tendo a sequência:

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIQWVRQPPGKGLEWLGVI WAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARAYGYDGSWLAYWGQG TLVTVSS

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28/155 (SEQ ID NO:5) e uma região de cadeia leve variável tendo a sequência :

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIFATS NLASGVPARFSGSGSGTSYSLTINRVEAEDADTYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:6) [053] Em uma realização, o anticorpo que pode competir com MA251 para ligação com CD25 humana compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região de cadeia pesada variável que compreende a sequência de aminoácidos de:

QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWVRQAPGKGLEWVSVI WAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:27);

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWVRQPPGKGLEWIGVI WAGGSTNYNSALMSRVTISKDNSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:28); ou

QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWVRQAPGKGLEWVSVI WAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:29); and e compreende uma cadeia leve compreendendo uma região de cadeia leve variável que compreende a sequência de aminoácidos de:

QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPLIFATS NLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30);

QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPLIFATS NLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 31) ;

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29/155

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIFATS NLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:32); ou

QIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKSPKPLIFATS NLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:33).

[054] Em uma realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID

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NO: 31. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de

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31/155 aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e/ou uma região de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33.

[055] Em um aspecto, os anticorpos competem tanto com o anticorpo 7G7B6 quanto o anticorpo MA251 para ligação com CD25 humana. Em um aspecto, os anticorpos se ligam ao(s) mesmo(s) epitopo(s) reconhecido(s) por 7G7B6 e reconhecido(s) por MA251.

[056] A competição entre o anticorpo 7G7B6 ou o anticorpo MA251 e um anticorpo adicional pode ser medida, por exemplo, conforme discutido nos Exemplos e conhecido na técnica. Em algumas realizações, a competição entre dois anticorpos, como 7G7B6 ou MA251 e um anticorpo adicional é determinada pela adição do anticorpo adicional a um ensaio e medição da interação entre o anticorpo 7G7B6 ou MA251 e CD25 humana. Um destes ensaios é um ensaio baseado em Octet no qual determina-se a ligação simultânea do anticorpo 7G7B6 ou MA251, o anticorpo adicional e CD25 humana recombinante. Caso seja detectada a ligação dos 2 anticorpos com CD25 humana recombinante, os anticorpos não são concorrentes. Alternativamente, um destes ensaios é um ensaio de imunoabsorção ligada à enzima (ELISA) no qual detecta-se a

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32/155 ligação dos anticorpos 7G7B6 ou MA251 a CD25 humana recombinante. Se o sinal observado diminuir mediante adição do anticorpo adicional (por exemplo, reduzir-se em pelo menos 75%), o último anticorpo é um concorrente para os anticorpos 7G7B6 ou MA251. A ligação simultânea dos anticorpos 7G7B6 ou MA251 e o anticorpo adicional a células que expressam CD25 humana também pode ser detectada usando citometria de fluxo.

[057] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-CD25 que se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender um ou mais resíduos de aminoácido de em uma ou mais das extensões de aminoácidos selecionados entre os aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), aminoácidos 166-186 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG), aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 70-88 da SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR) . De preferência, o epitopo compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou mais resíduos das extensões de aminoácidos selecionadas. Mais preferivelmente, o epitopo compreende uma sequência selecionada de: aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA), aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP), aminoácidos 42-56 de SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS) e combinações destas. Estes epitopos são diferentes do local de ligação de IL-2 na CD25 humana e os anticorpos que se ligam a tal epitopo, conforme descrito nos Exemplos, não bloqueiam a ligação de IL-2 a CD25.

[058] Em uma realização preferida, o método de tratamento de um indivíduo humano que tem câncer compreende a

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33/155 etapa de administrar um anticorpo anti-CD25 da invenção a um indivíduo, em que o dito indivíduo tem, de preferência, um tumor sólido, e em que o anticorpo anti-CD25, de preferência um anticorpo IgGl humano que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e que se liga a pelo menos um receptor de Fcy de ativação selecionado entre FcyRI (CD64), FcyRIIc (CD32c) e FcyRIIIa (CD16a) com alta afinidade e esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor, esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor. Preferivelmente, o anticorpo anti-CD25 possui uma constante de dissociação (Kd) para CD25 de menos de 10~⁷ M, de preferência menos de 10~⁸ M. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-CD25 se liga a CD25 humana provendo efeitos na ligação de IL-2 e depleção de Treg similar àqueles nos de 7D4 em CD25 de camundongo ou de 7G7B6 e MA251 em CD25 humana. Em uma realização adicional, o anticorpo anti-CD25 se liga aos receptores de Fcy com um razão de ativação para inibitória (A/I) superior a 1 e/ou se liga a FcyRI (CD64), FcyRIIc (CD32c), FcyRIIIa (CD16a) e/ou FcyRIIa (CD32a) com maior afinidade que se liga a FcyRIIb (CD32b).

[059] O domínio de ligação de CD25 do anticorpo 7D4 foi clonado e expresso como proteína recombinante em fusão com região constante apropriada. A sequência do domínio de ligação de CD25 do anticorpo 7D4, bem como sua especificidade para epitopos distintos no domínio extracelular de CD25 e/ou suas outras atividades funcionais, podem ser usadas pra comparação dos anticorpos anti-CD25 candidatos que são gerados e selecionados por qualquer técnica apropriada (por exemplo, captando painéis de hibridomas de roedores imunizados com CD25 ou gerando bibliotecas de anticorpos recombinantes, e então testando estes repertórios de anticorpo com fragmentos de CD25

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34/155 para caracterização funcional, conforme aqui descrito). Os anticorpos anti-CD25 que são consequentemente identificados podem ser produzidos também como anticorpos recombinantes, em particular como anticorpos totais ou como fragmentos ou variantes que são aqui descritos.

[060] Os anticorpos e imunoqlobulinas nativos qeralmente são qlicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compostos de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia pesada possui no terminal amino um domínio variável (Vh) sequido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável (Vl) no terminal amino e um domínio constante no terminal carboxi.

[061] As reqiões variáveis são capazes de interaqir com um alvo antiqênico estruturalmente complementar e são caracterizadas por diferenças na sequência de aminoácidos dos anticorpos de diferente especificidade antiqênica. As reqiões variáveis de cada cadeia pesada ou leve contêm as sequências de aminoácidos capazes de se liqar especificamente aos alvos antiqênicos. Nestas sequências, há sequências menores denominadas hipervariáveis devido à sua extrema variabilidade entre os anticorpos de diferente especificidade. Estas reqiões hipervariáveis também são denominadas como reqiões de determinação de complementaridade ou reqiões de CDR.

[062] Estas reqiões de CDR são responsáveis pela especificidade básica do anticorpo para uma estrutura determinante antiqênica particular. As CDRs representam extensões não contínuas de aminoácidos nas reqiões variáveis, mas, independentemente da espécie, descobriu-se que as

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35/155 localizações posicionais destas sequências de aminoácidos criticas nas regiões de cadeia pesada e leve variável possuem localizações similares nas sequências de aminoácidos das cadeias variáveis. As cadeias leve e pesada variáveis de todos os anticorpos possuem, cada, 3 regiões de CDR, cada uma não continua com as outras (denominadas Ll, L2, L3, Hl, H2, H3) para as respectivas cadeias leve (L) e pesada (H). As regiões de CDR aceitas foram descritas anteriormente (Kabat et al. , 1977. J Biol Chem 252, 6609-6616).

[063] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar através da citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), bem como qualquer outro mecanismo que permita o direcionamento, bloqueio de proliferação e/ou depleção de células Treg.

[064] Citotoxicidade dependente de complemento (CDC) se refere à lise de células que expressam antígeno por um anticorpo da invenção na presença de complemento.

[065] Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) se refere a uma reação mediada por célula na qual as células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo, células Exterminadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e, assim, leva à lise da célula alvo.

[066] Fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) se refere a uma reação mediada por célula na qual os fagócitos (como macrófagos) que expressam receptores

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36/155 de Fc (FcRs) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e, assim, leva à fagocitose na célula alvo.

[067] CDC, ADCC e ADCP podem ser medidas usando ensaios que são conhecidos e estão disponíveis na técnica (Clynes et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95, 652-6), e conforme discutido nos exemplos. A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo fixar o complemento e mediar a citotoxicidade e fagocitose dependente de célula. Portanto, como aqui discutido, o isótipo de um anticorpo pode ser selecionado com base no fato de ser desejável para o anticorpo mediar a citotoxicidade/fagocitose.

[068] Como aqui discutido, em uma realização da invenção, utiliza-se um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 e que leva à depleção de células Treg. Por exemplo, pode ser usado um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e obtém uma forte resposta de CDC e/ou uma forte resposta de ADCC e/ou ADCP. Os métodos para aumentar CDC, ADCC e/ou ADCP são conhecidos na técnica. Por exemplo, a resposta de CDC pode ser aumentada com mutações no anticorpo que aumentam a afinidade de ligação de Clq (idusogie et al. (2001) J Immunol 166, 2571-5).

[069] As referências aqui a não inibe a ligação de Interleucina-2 a CD25 pode ser expressa de forma alternativa como o anticorpo anti-CD25 é um anticorpo sem bloqueio de IL-2 ou um anticorpo sem bloqueio (em relação ao não bloqueio da ligação de IL-2 a CD25 na presença do anticorpo anti-CD25), ou seja, o anticorpo não bloqueia a ligação de Interleucina-2 a CD25 e, em particular, não inibe a sinalização de Interleucina-2 nas células que expressam CD25. As referências a não bloqueio sem bloqueio a IL2, não

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37/155 bloqueia ou sem bloqueio e similares (em relação ao não bloqueio da ligação de IL-2 a CD25 na presença do anticorpo anti-CD25) incluem realizações em que o anticorpo anti-CD25 da invenção não bloqueia a sinalização de IL-2 por meio de CD25. Ou seja, o anticorpo anti-CD25 inibe menos de 50% da sinalização de IL-2 em comparação à sinalização de IL-2 na ausência dos anticorpos. Em realizações particulares da invenção, como aqui descrito, o anticorpo anti-CD25 inibe menos de aproximadamente 40%, 35%, 30%, de preferência menos de aproximadamente 25% da sinalização de IL-2 em comparação à sinalização de IL-2 na ausência dos anticorpos. Os anticorpos anti-CD25 sem bloqueio de IL-2 permitem a ligação a CD25 sem interferir na ligação de IL-2 a CD25, ou sem interferir substancialmente na ligação de IL-2 a CD25. As referências aqui a um anticorpo sem bloqueio a IL-2 podem ser expressas alternativamente como um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de Interleucina-2 a CD25 ou como um anticorpo antiCD25 que não inibe a sinalização de IL-2.

[070] Alguns anticorpos anti-CD25 podem permitir a ligação de IL-2 a CD25, mas ainda bloqueiam a sinalização por meio do receptor de CD25. Estes anticorpos anti-CD25 não estão no escopo da presente invenção. Ao contrário, os anticorpos anti-CD25 sem bloqueio a IL-2 permitem a ligação de IL-2 a CD25 para facilitar pelo menos 50% do nivel de sinalização por meio do receptor de CD25 em comparação à sinalização na ausência do anticorpo anti-CD25.

[071] A sinalização de IL-2 por meio de CD25 pode ser medida pelos métodos, como discutido nos Exemplos e conhecido na técnica. A comparação da sinalização de IL-2 na

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38/155 presença e ausência do agente anticorpo anti-CD25 pode correr em condições iguais ou substancialmente iguais.

[072] Em algumas realizações, a sinalização de IL-2 pode ser determinada pela medição dos níveis da proteína STAT5 fosforilada nas células, usando um teste de fosforilação padrão de Stat-5. Por exemplo, um teste de fosforilação de Stat-5 para medir a sinalização de IL-2 pode envolver cultura das células PMBC na presença do anticorpo anti-CD25 a uma concentração de 10 ug/mL por 30 minutos e, em seguida, adição de concentrações variáveis de IL-2 (por exemplo, 10 U/mL ou concentrações variáveis de 0,25 U/mL, 0,74 U/mL, 2,22 U/mL, 6,66 U/mL ou 20 U/mL) por 10 minutos. As células podem ser então permeabilizadas e os níveis da proteína STAT5 podem ser, em seguida, medidos com um anticorpo rotulado fluorescente para um peptideo fosforilado STAT5 analisado por citometria de fluxo. O percentual de bloqueio da sinalização de IL-2 pode ser calculado como segue: % de bloqueio = 100 x [(% células Stat5⁺ Sem grupo Anticorpo - % de células Stat5⁺ 10 ug/mL de grupo Anticorpo) / (% células Stat5⁺ Sem grupo Anticorpo)] [073] ADCC pode ser aumentada por métodos que eliminam a porção de fucose a partir do glicano do anticorpo, como por meio de produção do anticorpo em uma linhagem celular YB2/0, ou através da introdução de mutações específicas na porção de Fc do IgGl humano (por exemplo, S298A/E333A/K334A, S239D/I332E/A330L, G236A/S239D/A330L/I332E) (Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sei USA 103, 2005-2010; Smith et al. (2012) Proc Natl 25 Acad Sei USA 109, 6181-6) . ADCP também pode ser aumentado pela introdução de mutações específicas na porção de Fc do IgGl humano (Richards et al. (2008) Mol Cancer Ther 7, 2517-27).

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39/155 [074] Em uma realização preferida da presente invenção, o anticorpo é otimizado para estimular uma resposta de ADCC, ou seja, a resposta de ADCC é intensificada, aumentada ou melhorada em relação a outros anticorpos anti-CD25, incluindo aqueles que não inibem a ligação de interleucina 2 à CD25 e, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD25 não modificados.

[075] Em uma realização preferida da presente invenção, o anticorpo é otimizado para estimular uma resposta de ADCP, ou seja, a resposta de ADCP é intensificada, aumentada ou melhorada em relação a outros anticorpos anti-CD25, incluindo aqueles que não inibem a ligação de interleucina 2 à CD25 e, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD25 não modificados.

[076] Conforme aqui usado, um anticorpo quimérico pode se referir a um anticorpo que possui sequências variáveis derivadas de uma imunoglobulina de uma espécie, como anticorpo de ratos ou camundongos, e regiões constantes de imunoglobulina de outra espécie, como de um anticorpo humano. Em algumas realizações, o anticorpo quimérico pode ter uma região constante que é potencializada pela indução de ADCC.

[077] Os anticorpos, de acordo com a invenção, também podem ser parcial ou totalmente sintéticos, em que pelo menos parte das cadeias de polipeptideo dos anticorpos é sintetizada e, possivelmente, otimizada para ligação com seu antígeno cognato. Estes anticorpos podem ser anticorpos quiméricos ou humanizados e podem ser totalmente tetraméricos em estrutura, ou podem ser diméricos e compreender apenas uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve.

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40/155 [078] Os anticorpos da presente invenção também podem ser anticorpos monoclonais. Conforme aqui usado, anticorpo monoclonal não está limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo anticorpo monoclonal se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, inclusive qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, e não o método pelo qual é produzido.

[079] Os anticorpos da presente invenção também podem ser anticorpos humanos. Conforme aqui usado, anticorpo humano se refere a anticorpos que possuem regiões variáveis nas quais tanto a estrutura quanto as regiões de CDR são derivadas das sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Além disso, caso o anticorpo contenha uma região constante, a região constante também é derivada das sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese in vitro randômica ou específica ao local ou mutação somática in vivo) .

[080] Um anticorpo anti-CD25 que apresenta as características conforme aqui descrito representa um objeto adicional da invenção. O anticorpo anti-CD25 pode ser usado na medicina. Em uma realização adicional, a invenção provê um método para tratamento de uma doença em um indivíduo compreendendo a administração de um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de Interleucina-2 (IL-2) a CD25 ou a sinalização de IL-2 por meio de CD25. Preferivelmente, a doença é um câncer, em particular para o tratamento de tumores sólidos.

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41/155 [081] Em uma realização adicional, a presente invenção provê moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-CD25, conforme aqui definido. Em algumas realizações, estas moléculas providas de ácido nucleico podem conter sequências de ácido nucleico otimizado ao códão e/ou podem ser incluídas nos cassetes de expressão nos vetores de ácido nucleico apropriados para a expressão em células hospedeiras como, por exemplo, células bacterianas, de levedura, inseto, písceas, murinas, símias ou humanas. Em algumas realizações, a presente invenção provê células hospedeiras que compreendem moléculas de ácido nucleico heterólogo (por exemplo, vetores de DNA) que expressam o anticorpo desejado.

[082] Em algumas realizações, a presente invenção provê métodos de preparação de um anticorpo anti-CD25 isolado, conforme definido acima. Em algumas realizações, estes métodos podem compreender a cultura de uma célula hospedeira que compreende ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos heterólogos que podem compreender e/ou ser fornecidos à célula hospedeira por meio dos vetores). Preferivelmente, a célula hospedeira (e/ou as sequências de ácido nucleico heterólogo) é(são) disposta(s) e construída(s) de modo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ou variante deste é secretado da célula hospedeira e isolado dos sobrenadantes da cultura celular.

[083] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epitopos de um antígeno ou polipeptídeo alvo, ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para

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42/155 mais de um antígeno ou polipeptídeo alvo (Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol 22, 238-44).

[084] Em um aspecto da invenção, o anticorpo é um anticorpo monoespecífico. Conforme discutido ainda abaixo, em um aspecto alternativo, o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

[085] Conforme aqui usado, anticorpo biespecífico se refere a um anticorpo que possui a capacidade de se ligar a dois epitopos distintos tanto em um único antígeno ou polipeptídeo quanto em dois antígenos ou polipeptídeos diferentes.

[086] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção, como aqui discutido, podem ser produzidos por meio de métodos biológicos, como hibridização somática; ou métodos genéticos, como a expressão de uma sequência de DNA não nativo que codifica a estrutura do anticorpo desejado em linhagem celular ou em um organismo; métodos químicos (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou, de outro modo, a uma ou mais entidades moleculares como outro anticorpo ou fragmento do anticorpo); ou uma combinação destes.

[087] As tecnologias e produtos que permitem a produção monoespecífica e biespecífica são conhecidos na técnica, conforme extensivamente revisado na literatura, também em relação aos formatos alternativos, conjugados de anticorpo e medicamento, métodos de desenho de anticorpo, métodos de triagem in vitro, regiões constantes, modificações pós-translacionais e químicas, aperfeiçoamento de característica por desencadeamento de morte de célula cancerosa como engenharia de Fc (Tiller K and Tessier P, 2015

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Annu Rev Biomed Eng. 17: 191-216; Speiss C et al., 2015. Molecular Immunology 67 95-106; Weiner G, 2015. Nat Rev Cancer, 15: 361-370; Fan G et al., 2015. J Hematol Oncol 8:130) . Este anticorpo biespecifico pode ser provido em qualquer formato comercialmente disponível, inclusive Duobody, BiTE DART, CrossMab, Knobs-in-holes, Triomab, ou outro formato molecular apropriado e fragmentos deste.

[088] Conforme aqui usado, epitopo ou determinante antigênico se refere a um local em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Como é bem conhecido na técnica, epitopos podem ser formados tanto de aminoácidos contínuos (epitopo linear) quanto aminoácidos não contínuos justapostos por dobramento terciário de uma proteína (epitopos conformacionais). Epitopos formados de aminoácidos contínuos normalmente são mantidos em exposição a solventes de desnaturalização, ao passo que epitopos formados por dobramento terciário normalmente são perdidos no tratamento com solventes de desnaturalização. Um epitopo inclui normalmente pelo menos 3, e mais comumente, pelo menos 5 ou 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Os métodos de determinação da conformação especial de epitopos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996) . Por exemplo, um anticorpo da invenção pode reconhecer um epitopo conformacional ao qual os anticorpos 7G7B6 ou MA251 se ligam. Em uma realização, o epitopo conformacional compreende pelo menos duas sequências selecionadas de: aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA), aminoácidos

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176-180 da SEQ ID NO: 1 (RWTQP) , aminoácidos 42-56 de SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

[089] Em algumas realizações, o anticorpo antiCD25 pode ser incluído em um agente que compreende ainda uma carga útil conjugada como um agente terapêutico ou diagnóstico, em particular para terapia ou diagnóstico de câncer. O anticorpo anti-CD25 se conjuga com os radionuclídeos ou podem ser usadas toxinas. Os exemplos de radionuclídeos comumente usados são, por exemplo, ⁹⁰Y, ¹³¹I e ⁶⁷Cu, entre outros, e os exemplos de toxinas comumente usadas são doxorubicina e caliqueamicina. Em uma realização adicional, o anticorpo antiCD25 pode ser modificado para ter uma meia-vida alterada. Os métodos para atingir uma meia-vida alterada são conhecidos na técnica. Em algumas realizações, o anticorpo anti-CD25 não é conjugado com outro agente terapêutico ou diagnóstico. Em particular, em algumas realizações, o anticorpo anti-CD25 não é conjugado com um radionuclídeo, ou seja, em algumas realizações o anticorpo anti-CD25 não é radiorotulado.

[090] Em uma realização preferida da presente invenção, o indivíduo de quaisquer aspectos da invenção, como aqui descrito, é um mamífero, de preferência um gato, cão, cavalo, burro, ovelha, porco, cabra, vaca, hamster, camundongo, rato, coelho ou porquinho-da-índia, mas de preferência o indivíduo é um humano. Portanto, em todos os aspectos da invenção, como aqui descrito, o indivíduo é de preferência um humano.

[091] Conforme aqui usado, os termos câncer, canceroso, ou maligno se referem ou descrevem a condição

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45/155 fisiológica em mamíferos que normalmente é caracterizada por crescimento celular desregulado.

[092] Os exemplos de câncer incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma e sarcoma. Os exemplos mais particulares destes cânceres incluem carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não pequenas, glioma, carcinoma hepatocelular (HCC), linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), mieloma múltiplo, câncer gastrointestinal (trato), câncer renal, câncer ovariano, câncer hepático, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer renal, câncer prostático, câncer da tireoide, melanoma, condrossarcoma, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma multiforme, câncer cervical, câncer cerebral, câncer estomacal, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma do cólon, e câncer da cabeça e pescoço.

[093] Em um aspecto, o câncer envolve um tumor sólido. Os exemplos de tumores sólidos são sarcomas (inclusive cânceres que surgem de células transformadas de origem mesenquimais em tecidos como osso esponjoso, cartilagem, gordura, músculo, vascular, hematopoiético ou tecidos conjuntivos fibrosos), carcinomas (inclusive tumores que surgem de células epiteliais), mesotelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, etc. Os cânceres que envolvem tumores sólidos incluem, sem limitações, câncer cerebral, câncer pulmonar, câncer de estômago, câncer duodenal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer retal e do cólon, câncer renal, câncer da bexiga, câncer renal, câncer pancreático, câncer prostático, câncer ovariano, melanoma, câncer da boca, sarcoma, câncer do

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46/155 olho, câncer da tireoide, câncer da uretra, câncer vaginal, câncer cervical, linfoma e similares.

[094]

Em um aspecto, os canceres envolvem tumores que expressam CD25, inclusive, entre outros, linfomas, como linfomas de Hodgkin, e leucemias linfociticas, como leucemia linfocitica crônica (CLL).

[095]

Em um aspecto da invenção, o câncer é identificado pela presença de marcadores relevantes específicos ao tumor e antígenos como CD20, HER2, PD-1, PD-L1, SLAM7F, CD47, CD137, CD134, TIM3, CD25, GITR, CD25, EGFR, etc., ou é um câncer que foi identificado como tendo um biomarcador denominado alta instabilidade de microssatélite (MSI-H) ou deficiência de reparação por incompatibilidade (dMMR). Além disso, os anticorpos podem ser usados quando a identificação do marcador relevante específico ao tumor, antígeno ou biomarcadores foram usados na definição de estados précancerosos não invasivos dos cânceres acima em um paciente, como câncer in situ, mieloma latente, gamopatia monoclonal de significância indeterminada, neoplasia cervical intraepitelial, MALTornas/GALTornes e diversos distúrbios linfoproliferativos. Preferivelmente, em algumas realizações o indivíduo tratado possui um tumor sólido.

[096]

Em um aspecto da invenção, o câncer é selecionado entre melanoma, câncer pulmonar de células não pequenas, câncer renal, câncer ovariano, câncer da bexiga, sarcoma e câncer de cólon. Em um aspecto preferido da invenção, o câncer é selecionado entre melanoma, câncer ovariano, câncer pulmonar de células não pequenas e câncer renal. Em uma realização, o câncer não é melanoma, câncer ovariano ou câncer de mama. Em um aspecto preferido, o câncer é sarcoma, câncer

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47/155 de cólon, melanoma ou câncer colorretal, ou mais no geral, qualquer câncer humano para o qual a linha celular 4T1, MCA205, B16, CT26 ou MC38 pode representar modelos pré-clinicos para validação dos compostos como úteis para seu tratamento terapêutico.

[097] Conforme aqui usado, o termo tumor, como se aplica a um indivíduo diagnosticado com, ou em suspeita de ter, um câncer se refere a uma neoplasia ou massa tecidual maligna ou potencialmente maligna de qualquer tamanho, e inclui tumores primários e neoplasias secundárias. Os termos câncer, malignidade, neoplasia, tumor e carcinoma também podem ser aqui usados de forma intercambiável para se referir a tumores e células tumorais que apresentam crescimento relativamente anormal, descontrolado e/ou autônomo, de modo que apresentem um fenótipo de crescimento anômalo caracterizado por uma perda significativa de controle da proliferação celular. No geral, as células de interesse para detecção ou tratamento incluem células pré-cancerosas (por exemplo, benignas), malignas, pré-metastáticas, metastáticas e não metastáticas. Os ensinamentos da presente revelação podem ser relevantes a todos e quaisquer cânceres.

[098] Conforme aqui usado, tumores sólidos são um crescimento ou massa de tecido anormal que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas, em particular, tumores e/ou metástase (onde localizado) diferentes de leucemia ou cânceres linfáticos não sólidos. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos são denominados para o tipo de células que os formam e/ou o tecido ou órgão no qual estão localizados. Os exemplos de tumores sólidos são sarcomas (inclusive cânceres que surgem de células

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48/155 transformadas de origem mesenquimais nos tecidos, como osso esponjoso, cartilagem, gordura, músculo, vascular, hematopoiético ou tecidos conjuntivos fibrosos), carcinomas (inclusive tumores que surgem de células epiteliais), melanomas, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma e retinoblastoma.

[099] Particularmente, os cânceres preferidos, em conformidade com a presente invenção, incluem aqueles caracterizados pela presença de um tumor sólido, ou seja, o indivíduo não possui um tumor não sólido. Em todos os aspectos da invenção, como aqui discutido, preferiu-se que o câncer seja um tumor sólido, ou seja, que o indivíduo possui um tumor sólido (e não possui um tumor não sólido).

[0100] A referência a tratar ou tratamento de um câncer, conforme aqui usado, define a realização de pelo menos um efeito terapêutico positivo, como por exemplo, número reduzido de células cancerosas, tamanho reduzido do tumor, taxa reduzida de infiltração de células cancerosas nos órgãos periféricos ou taxa reduzida de metástase tumoral ou crescimento tumoral.

[0101] Os efeitos terapêuticos positivos no câncer podem ser medidos de diversas formas (por exemplo, Weber (2009) J Nucl Med 50, 1S-10S) . Por meio de exemplo, em relação à inibição do crescimento tumoral, de acordo com os padrões do National Cancer Institute (NCI), um T/C < 42% é o nível mínimo de atividade antitumoral. Um T/C < 10% é considerado um alto nível de atividade antitumoral, com T/C (%) = Volume mediano tumoral do volume tumoral tratado/Mediano do controle x 100. Em algumas realizações, o tratamento obtido por uma quantidade terapeuticamente eficaz é qualquer um entre sobrevida sem

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49/155 progressão (PFS), sobrevida sem doença (DFS) ou sobrevida geral (OS). PFS, também denominada Tempo para Progressão do Tumor indica a duração de tempo durante e após o tratamento em que o câncer não cresceu e inclui a quantidade de tempo que os pacientes apresentaram uma resposta completa ou uma resposta parcial, bem como a quantidade de tempo que os pacientes apresentaram doença estável. DFS se refere à duração de tempo durante e após o tratamento em que o paciente permanece sem a doença. OS se refere a um prolongamento na expectativa de vida em comparação a indivíduos ou pacientes sem terapêutica prévia ou não tratados.

[0102] A referência a prevenção (ou profilaxia), conforme aqui usado, refere-se à postergação ou prevenção do início dos sintomas do câncer. A prevenção pode ser absoluta (de modo que não ocorra doença) ou pode ser eficaz apenas em alguns indivíduos ou por um período de tempo limitado.

[0103] Em um aspecto preferido da invenção, o indivíduo possui um tumor estabelecido, ou seja, o indivíduo já possui um tumor, por exemplo, aquele classificado como um tumor sólido. Desta forma, a invenção, como aqui descrita, pode ser usada quando o indivíduo já possui um tumor, como um tumor sólido. Deste modo, a invenção provê uma opção terapêutica que pode ser usada para tratar um tumor existente. Em um aspecto da invenção, o indivíduo possui um tumor sólido existente. A invenção pode ser usada como uma prevenção ou, de preferência, como um tratamento em indivíduos que já possuem um tumor sólido. Em um aspecto, a invenção não é usada como preventiva ou profilaxia.

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50/155 [0104] Em um aspecto, a regressão tumoral pode ser potencializada, o crescimento tumoral pode ser prejudicado ou reduzido e/ou o tempo de sobrevida pode ser potencializado usando a invenção como aqui descrito, por exemplo, em comparação a outros tratamentos de câncer (por exemplo, tratamentos de padrão de cuidado para um determinado câncer).

[0105] Em um aspecto da invenção, o método de tratamento ou prevenção do câncer, como aqui descrito, compreende ainda a etapa de identificação de um indivíduo que possui câncer, de preferência, identificação de um indivíduo que possui um tumor como um tumor sólido. Em uma realização, o método pode incluir a identificação de um indivíduo que possui um câncer hematológico.

[0106] O regime de dosagem de uma terapia aqui descrito que seja eficaz para tratar um paciente com câncer pode variar de acordo com os fatores como estado da doença, idade e peso do paciente, e a capacidade da terapia para obter uma resposta anticâncer no indivíduo. A seleção de uma dosagem apropriada estará dentro da capacidade do técnico no assunto. Por exemplo 0,01; 0,1; 0,3; 0,5; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou 50 mg/kg. Em algumas realizações, tal quantidade é uma quantidade de dosagem unitária (ou uma fração total desta) apropriada para a administração em conformidade com um regime de dosagem que foi determinado como correlato a um resultado desejado ou benéfico quando administrado a uma população relevante (ou seja, com um regime de dosagem terapêutica).

[0107] O anticorpo, de acordo com qualquer aspecto da invenção, como aqui descrito, pode estar na forma de uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente

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51/155 um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Estas composições incluem, por exemplo, formulações de dosagem liquidas, semissólidas e sólidas, como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infunsíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas ou lipossomos. Em algumas realizações, uma forma preferida pode depender do modo pretendido de administração e/ou aplicação terapêutica. As composições farmacêuticas contendo o anticorpo podem ser administradas por qualquer método apropriado conhecido na técnica, inclusive, sem limitação, administração oral, mucosal, por inalação, tópica, bucal, nasal, retal ou parenteral (por exemplo, intravenosa, infusão, intratumoral, intranodal, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, transdérmica ou outros tipos de administração envolvendo rompimento físico de um tecido de um indivíduo e a administração da composição farmacêutica através da ruptura no tecido). Tal formulação pode, por exemplo, estar na forma de uma solução injetável ou infusível que seja adequada para administração intradérmica, intratumoral ou subcutânea, ou para infusão intravenosa. A administração pode envolver dosagem intermitente. Alternativamente, a administração pode envolver dosagem continua (por exemplo, perfusão) por pelo menos um período de tempo selecionado, simultaneamente ou entre a administração de outros compostos.

[0108] Em algumas realizações, o anticorpo pode ser preparado com carreadores que o protegem contra a liberação e/ou degradação rápida, como uma formulação de liberação controlada, como implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulada. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis.

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52/155 [0109] Os técnicos no assunto reconhecerão, por exemplo, que a via de administração (por exemplo, oral vs intravenosa vs subcutânea vs intratumoral, etc.) pode impactar a quantidade de dose e/ou a quantidade de dose necessária pode impactar a via de administração. Por exemplo, onde concentrações particularmente elevadas de um agente em um local ou localização particular (por exemplo, em um tumor) são de interesse, a administração focada (por exemplo, neste exemplo, administração intratumoral) pode ser desejada e/ou útil. Outros fatores a serem considerados ao otimizar vias e/ou cronograma de administração para um determinado regime terapêutico podem incluir, por exemplo, o câncer em particular sendo tratado (por exemplo, tipo, estágio, localização, etc.), a condição clínica de um indivíduo (por exemplo, idade, saúde em geral, etc.), a presença ou ausência de terapia de combinação, e demais fatores conhecidos pelos profissionais médicos.

[0110] As composições farmacêuticas normalmente devem ser estéreis e estáveis em condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomo ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração medicamentosa. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas ao incorporar o anticorpo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguido de esterilização filtrada. As formulações para administração parenteral incluem, entre outros, suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e formulações de liberação contínua implantáveis ou biodegradáveis, como aqui discutido. As

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53/155 formulações injetáveis estéreis podem ser preparadas usando um diluente ou solvente não tóxico parentalmente aceitável. Cada composição farmacêutica para uso em conformidade com a presente invenção pode incluir agentes de dispersão, agentes de umectação, agentes de suspensão, agentes isotônicos, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos farmaceuticamente aceitáveis; os carreadores, excipientes, sais ou estabilizadores são não tóxicos aos indivíduos nas dosagens e concentrações empregadas. Preferivelmente, tal composição pode compreender ainda um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável para uso no tratamento de câncer que seja compatível com um determinado método e/ou local de administração, por exemplo, para administração parenteral (por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica ou intravenosa), intratumoral ou peritumoral.

[0111] Apesar de uma realização do método ou composições de tratamento para uso, de acordo com a presente invenção, poderem não ser eficazes em obter um efeito terapêutico positivo em cada indivíduo, deve fazê-lo ao usar composições farmacêuticas e regimes de dosagem que são consistentes com a boas práticas clínicas e o número estatisticamente significativo de indivíduos, conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como o teste t de Student, o teste χ2, o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal-Wallis (teste Η) , o teste de Jonckheere-Terpstra e o teste de Wilcoxon.

[0112] Onde dantes e subsequentemente um tumor, uma doença tumoral, um carcinoma ou um câncer for mencionado, também metástase no órgão ou tecido original e/ou em qualquer

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54/155 local é implicada alternativamente ou em adição, qualquer que seja a localização do tumor e/ou metástase.

[0113] Como aqui discutido, a presente invenção se refere à depleção de células T regulatórias (Tregs). Portanto, em um aspecto da invenção, o anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25, também esgota ou reduz as células T regulatórias de infiltração no tumor. Em um aspecto, a depleção ocorre por meio de ADCC. Em outro aspecto, a depleção ocorre por meio de ADCP.

[0114] Desta forma, a invenção provê um método para a depleção de células T regulatórias em um tumor em um indivíduo, compreendendo a administração ao dito indivíduo de um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25. Em uma realização preferida, as Tregs são esgotadas em um tumor sólido. O termo esgotado deve significar que o número, proporção ou porcentagem de Tregs é reduzido em relação a quando um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 não é administrado. Em realizações particulares da invenção, como aqui descrito, acima de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 99% das células T regulatórias de infiltração no tumor são esgotadas.

[0115] Conforme aqui usado, células T regulatórias (Treg, células Treg ou Tregs) se referem a uma linhagem de linfócitos T CD4+ especializada no controle da autoimunidade, alergia e infecção. Normalmente elas regulam as atividades das populações de células T, mas também podem influenciar determinados tipos de células do sistema imunológico inato. As Tregs geralmente são identificadas pela expressão dos biomarcadores CD4, CD25 e Foxp3. As células Treg

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55/155 de ocorrência natural geralmente constituem aproximadamente 5 a 10% dos linfócitos T CD4+ periféricos. No entanto, em um microambiente tumoral (ou seja, células Treg de infiltração no tumor), elas podem perfazer até 20 a 30% da população total de linfócito T CD4+.

[0116] As células Treg humanas ativadas podem aniquilar diretamente as células alvo, como as células T efetoras e APCs através de vias dependentes de perforina ou dependentes de granzima B; as células Treg de antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico (CTLA4+) induzem a expressão de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) pelas APCs, e estas, por sua vez, suprimem a ativação de células T ao reduzir tripfano; as células Treg podem liberar interleucina-10 (IL10) e fator de transformação do crescimento (TGFp) ín vivo, e assim inibem diretamente a ativação de células T e suprimem a função de APC ao inibir a expressão de moléculas MHC, CD80, CD86 e IL-12. As células Treg também podem suprimir a imunidade ao expressar altos níveis de CTLA4 que podem se ligar a CD80 e CD86 nas células que apresentam antígeno e impedir ativação adequada das células T efetoras.

[0117] Em uma realização preferida da presente invenção, a proporção das células T efetoras para células T regulatórias em um tumor sólido é aumentada. Em algumas realizações, a razão entre as células T efetoras e as células T regulatórias em um tumor sólido é elevada para mais de 5, 10, 15, 20, 40 ou 80.

[0118] Uma célula efetora imune se refere a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imunológica. As células imunes exemplares incluem uma célula de origem mieloide ou linfoide, por exemplo, linfócitos (por

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56/155 exemplo, células B e T que incluem células T citolíticas (CTLs)), células aniquiladoras, células aniquiladoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos e basófilos.

[0119] As células imunes efetoras envolvidas na fase efetora de uma resposta imunológica expressam receptores de Fc específicos e realizam funções imunológicas específicas. Uma célula efetora pode induzir a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpos (ADCC), por exemplo, um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos que expressam FcaR estão envolvidos na aniquilação específica de células alvo e apresentação de antígenos a outros componentes do sistema imunológico, ou ligação a células que apresentam antígenos. Uma célula efetora também pode realizar fagocitose em um antígeno alvo, célula alvo ou micro-organismo. Como aqui discutido, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser otimizados quanto a capacidade de induzir ADCC.

[0120] Em algumas realizações, um agente diferente contra o câncer pode ser administrado em combinação com o anticorpo por meio de vias de administração iguais ou diferentes e/ou de acordo com diferentes cronogramas. Alternativa ou adicionalmente, em algumas realizações, uma ou mais doses de um primeiro agente ativo são administradas de forma substancialmente simultânea e, em algumas realizações, por meio de uma via comum e/ou como parte de uma única composição, com um ou mais outros agentes ativos. Os técnicos no assunto reconhecerão ainda que algumas realizações de terapias de combinação providas em conformidade com a presente

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57/155 invenção atingem efeitos sinérgicos; em algumas destas realizações, a dose de um ou mais agentes utilizados na combinação pode ser materialmente diferente (por exemplo, menor) e/ou pode ser fornecida por uma via alternativa, diferente da padrão, preferida ou necessária quanto aquele agente é utilizado em um regime terapêutico diferente (por exemplo, como monoterapia e/ou como parte de uma terapia de combinação diferente).

[0121] Em algumas realizações, onde são utilizados dois ou mais agentes ativos em conformidade com a presente invenção, estes agentes podem ser administrados simultânea ou sequencialmente. Em algumas realizações, a administração de um agente é cronometrada especificamente em relação à administração de outro agente. Por exemplo, em algumas realizações, um primeiro agente é administrado de modo que um efeito particular seja observado (ou esperado para ser observado, por exemplo, com base nos estudos de população que demonstram uma correlação entre um determinado regime de dosagem e o efeito particular de interesse) . Em algumas realizações, os regimes de dosagem relativos desejados para agentes administrados em combinação podem ser avaliados ou determinados de forma empírica, por exemplo, usando modelos ex vivo, in vivo e/ou in vitro; em algumas realizações, esta avaliação ou determinação empírica é realizada in vivo em uma população de pacientes (por exemplo, de modo que seja estabelecida uma correlação), ou alternativamente em um paciente particular de interesse.

[0122] Em outro aspecto da invenção, um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 possui efeitos terapêuticos aperfeiçoados quando combinado com

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58/155 um inibidor de checkpoint imunológico. Uma terapia de combinação com um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e um inibidor de checkpoint imunológico pode ter efeitos sinérgicos no tratamento de tumores estabelecidos. Os dados em relação a PD-1/PD-L1 nos presentes Exemplos se referem à interferência na interação de PD- 1/PD-L1. Desta forma, a interação entre o receptor de PD1 e o ligante de PD- LI pode ser bloqueada, resultando em bloqueio de PD-1. Em um aspecto, a combinação pode levar à regressão tumoral potencializada, enfraquecimento potencializado ou redução do crescimento tumoral e/ou o tempo de sobrevida pode ser aumentado usando a invenção como aqui descrita, por exemplo, em comparação aos anticorpos anti-CD25 ou bloqueio de PD-1/PD-L1 isoladamente (diretamente, usando um anticorpo anti-PDl, ou indiretamente, usando um anticorpo anti-PD-Ll). Quando o anticorpo anti-CD25 não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25, uma terapia de combinação com um anticorpo anti-CD25 e o inibidor de checkpoint imunológico também pode incluir ainda a administração de Interleucina-2 a uma dosagem que é apropriada para o tratamento de câncer.

[0123] Conforme aqui usado, checkpoint imunológico ou proteína de checkpoint imunológico se referem a proteínas pertencentes às vias inibitórias no sistema imunológico, em particular para a modulação de respostas de células T. Em condições fisiológicas normais, os checkpoints imunológicos são cruciais para evitar autoimunidade, especialmente durante uma resposta a um patógeno. Células cancerosas podem alterar a regulação da expressão das proteínas de checkpoint imunológico a fim de evitar vigilância imunológica.

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59/155 [0124] Os exemplos de proteínas de checkpoint imunológico incluem, entre outras, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIGIT, CD155, B7H3, B7H4, VISTA e TIM3, e também 0X40, GITR, IGOS, 4-1BB e HVEM. As proteínas de checkpoint imunológico também podem se referir a proteínas que se ligam a outras proteínas de checkpoint imunológico. Estas proteínas incluem PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1 e GAL9.

[0125] Inibidores de proteína de checkpoint imunológico se referem a qualquer proteína que pode interferir na sinalização e/ou interação entre proteínas mediada por uma proteína de checkpoint imunológico. Em um aspecto da invenção, a proteína de checkpoint imunológico é PD-1 ou PD-L1. Em um aspecto preferido da invenção, como aqui descrito, o inibidor de checkpoint imunológico interfere nas interações de PD-l/PDL1 por meio de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PD-Ll.

[0126] Desta forma, a presente invenção também provê um método de tratamento do câncer que compreende a administração de um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e um agente terapêutico adicional, de preferência, um inibidor de checkpoint, a um indivíduo. A invenção provê também um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e um agente terapêutico adicional, de preferência, um inibidor de checkpoint imunológico, para uso no tratamento de câncer.

[0127] A presente invenção provê adicionalmente o uso de um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina-2 a CD25 e um agente terapêutico adicional, de preferência, um inibidor de checkpoint imunológico, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A administração do anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação

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60/155 de interleucina-2 a CD25 e do agente terapêutico adicional, como o inibidor de checkpoint imunológico, pode ser simultânea, separada ou sequencial.

[0128] A presente invenção provê uma combinação de um anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina-2 a CD25 e um agente terapêutico adicional, de preferência um inibidor de checkpoint imunológico, para uso no tratamento de câncer em um indivíduo, em que o anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina-2 a CD25 e agente terapêutico adicional, como o inibidor de checkpoint imunológico, são administrados simultânea, separada ou sequencialmente. Esse anticorpo CD25 anti-humana que não inibe a ligação de interleucina-2 a CD25 e apresenta o isótipo IgGl humano pode ser usado especificamente em combinação com anticorpos que visam checkpoints imunológicos, mas que carecem de sequências que permitem ADCC, ADCP e/ou CDC.

[0129] Em um aspecto alternativo, a invenção provê um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 para uso no tratamento de câncer, em que o dito anticorpo serve para a administração em combinação com um agente terapêutico adicional, de preferência um inibidor de checkpoint imunológico. A invenção também provê o uso de um anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o dito medicamento serve para administração em combinação com um aqente terapêutico adicional, de preferência um inibidor de checkpoint imunolóqico.

[0130] A presente invenção provê uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25, e opcionalmente um

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61/155 agente terapêutico adicional, de preferência um inibidor de checkpoint imunológico, em um meio farmaceuticamente aceitável. Conforme discutido acima, o inibidor de checkpoint imunológico pode ser um inibidor de PD-1, ou seja, um antagonista de PD-1.

[0131] PD-1 (Proteína de Morte Celular Programada 1), também conhecido como CD279, é um receptor de superfície celular expresso em células T e células B ativadas. A interação com seus ligantes demonstrou atenuar as respostas de células T tanto in vitro quanto in vivo. PD-1 se liga a dois ligantes PD-L1 e PD-L2. PD-1 pertence à superfamília da imunoglobulina. A sinalização de PD-1 exige ligação a um ligante de PD-1 em proximidade íntima a um antígeno de peptideo apresentado por um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (Freeman (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 10275-6) . Portanto, proteínas, anticorpos ou pequenas moléculas que evitam a coligação de PD-1 e TCR na membrana das células T são antagonistas de PD-1 úteis.

[0132] Em uma realização, o antagonista de receptor de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, ou uma ligação a fragmento de antígeno do mesmo, que se liga especificamente a PD-1 e blogueia a ligação de PD-L1 a PD-1. O anticorpo antiPD-1 pode ser um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-PD-1 pode ser um anticorpo humano ou humanizado. Um anticorpo antiPD-1 é um anticorpo capaz de ligação específica ao receptor de PD-1. Os anticorpos anti-PD-1 conhecidos na técnica incluem Nivolumabe e Pembrolizumabe.

[0133] Os antagonistas de PD-1 da presente invenção também incluem compostos ou agentes que se ligam e/ou bloqueiam um ligante de PD-1 para interferir ou inibir a

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62/155 ligação do ligante ao receptor de PD-1, ou se liga diretamente e bloqueia o receptor de PD-1 sem induzir a transdução de sinal inibitório através do receptor de PD-1. Em particular, os antagonistas de PD-1 incluem pequenas moléculas inibidoras da via de sinalização de PD-1/PD-L1. Alternativamente, o antagonista do receptor de PD-1 pode se ligar diretamente ao receptor de PD-1 sem acionar a transdução de sinal inibitório e também se liga a um ligante do receptor de PD-1 para reduzir ou inibir o ligante de acionar a transdução de sinal através do receptor de PD-1. Ao reduzir o número e/ou quantidade de ligantes que se ligam ao receptor de PD-1 e acionador da transdução de um sinal inibitório, menos células são atenuadas pelo sinal negativo liberado pela transdução de sinal de PD-1 e pode-se atingir uma resposta imunológica mais robusta.

[0134] Em uma realização, o antagonista de receptor de PD-1 é um anticorpo anti-PD-Ll, ou uma ligação a fragmento de antígeno dele, que se liga especificamente a PDL1 e bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1. O anticorpo anti-PDLl pode ser um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-PD-Ll pode ser um anticorpo humano ou humanizado, como Atezolizumabe (MPDL3280A).

[0135] A presente invenção também provê um método de tratamento do câncer que compreende a administração de um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e um anticorpo que é um agonista de uma via coestimuladora de ativação de células T a um indivíduo. Os agonistas de anticorpo de uma via coestimuladora da ativação de células T incluem, entre outros, anticorpos agonistas contra ICOS, GITR, 0X40, CD40, LIGHT e 4-1BB.

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63/155 [0136] Um método adicional de tratamento do câncer compreende a administração de um anticorpo anti-CD25 que não inibe a ligação de interleucina 2 a CD25 e um composto que reduz, bloqueia, inibe e/ou antagoniza FcyRIIb (CD32b). Tal antagonista de FcvRIIb pode ser uma pequena molécula que interfere na sinalização intracelular induzida por FcvRIIb, anticorpos modificados que não se acoplam ao receptor inibitório de FcvRIIb, ou um anticorpo anti-FcvRIIb humano (anti-CD32b). Por exemplo, os anticorpos antagonistas de antiFcvRIIb humano foram caracterizados também por suas propriedades antitumorais (Roghanian A et al. , 2015, Cancer Cell. 27, 473-488; Rozan C et al., 2013, Mol Cancer Ther. 12:1481-91; WO2015173384; WO2008002933).

[0137] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um anticorpo biespecifico que compreende:

(a) uma primeira porção de ligação a antígeno que se liga à CD25; e (b) uma segunda porção de ligação a antígeno que se liga a uma proteína de checkpoint imunológico, um antígeno associado ao tumor, um anticorpo anti-Receptor de FC ativador humano (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIII) ou um anticorpo antagonista anti-FcvRIIb humano;

em que o anticorpo anti-CD25 não inibe a ligação de interleucina-2 (IL-2) a CD25 e, de preferência, é um anticorpo biespecifico de IgGl que se liga a pelo menos um receptor Εογ ativador com alta afinidade e esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor. Em uma realização preferida, a segunda porção de ligação a antígeno se liga a PD-L1.

[0138] Conforme aqui usado, antígeno associado ao tumor se refere a antígenos expressos nas células tumorais,

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64/155 tornando-as distinguíveis de células não cancerosas adjacentes a elas e incluem, entre outros, CD20, CD38, PD-L1, EGFR, EGFRV3, CEA, TYRP1 e HER2. Diversos artigos de revisão foram publicados, os quais descrevem os antígenos relevantes associados ao tumor e os agentes de anticorpo antitumoral terapeuticamente úteis correspondentes (vide, por exemplo, Sliwkowski & Mellman (2013) Science 341, 192-8). Estes antígenos e anticorpos correspondentes incluem, entre outros, CD22 (Blinatumomabe), CD20 (Rituximabe, Tositumomabe), CD56 (Lorvotuzumabe), CD66e/CEA (Labetuzumabe), CD152/CTLA-4 (Ipilimumabe), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (Edrecolomabe), CD340/HER2 (Trastuzumabe, Pertuzumabe) e EGFR (Cetuximabe, Panitumumabe).

[0139] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção como aqui descrita, leva a ADCC, ou, em um aspecto, ADCC potencializada.

[0140] O anticorpo biespecífico pode se ligar a um epitopo específico em CD25 que não afeta a ligação de IL-2 a CD25, e um epitopo específico na proteína de checkpoint imunológico ou antígeno associado ao tumor, conforme aqui definido. Em uma realização preferida, a segunda porção de ligação a antígeno se liga a PD-L1. Em um aspecto preferido, a presente invenção provê um anticorpo biespecífico que compreende:

(a) uma primeira porção de ligação a antígeno que se liga a CD25 e que não afeta a ligação de IL-2 a CD25; e (b) uma segunda porção de ligação a antígeno que se liga a uma proteína de checkpoint imunológico expressa em uma célula tumoral.

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65/155 [0141] Em uma realização particular, a proteína de checkpoint imunológico expressa em uma célula tumoral é PDLl, VISTA, GAL9, B7H3 ou B7H4. Ainda de preferência, o anticorpo anti-CD25 no anticorpo IgGl que não afeta a ligação de IL-2 a CD25 e que se liga a pelo menos um receptor de Εογ ativador com alta afinidade, e esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor. Alternativamente, o anticorpo anti-CD25 é um anticorpo IgG2 humano que esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor. Em uma realização particular, o anticorpo anti-CD25 é um anticorpo IgG2 humano que se liga a pelo menos um receptor de Εογ ativador com alta afinidade, de preferência FcyRIIa.

[0142] O técnico no assunto seria capaz de produzir um anticorpo biespecífico usando os métodos conhecidos. O anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, pode ser usado em quaisquer aspectos da invenção, como aqui descrito. Preferivelmente, a segunda porção de ligação a antígeno no anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, liga-se a PD-1 humano, PD-L1 humano ou CTLA-4 humano.

[0143] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico pode se ligar a CD25 e a receptores modulatórios imunológicos expressos em altos níveis nas Tregs infiltrantes em tumor, por exemplo, CTLA4, IGOS, GITR, 4-1BB ou 0X40.

[0144] A presente invenção também provê um kit que compreende um anticorpo anti-CD25, como aqui descrito e um agente terapêutico adicional, de preferência um inibidor de checkpoint imunológico, de preferência um antagonista de PD-1 (diretamente, usando um anticorpo anti-PDl, ou indiretamente, usando um anticorpo anti-PD-Ll), como aqui discutido. Em um aspecto, o inibidor de checkpoint imunológico é anti-PD-Ll. Em

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66/155 uma realização alternativa, o kit compreende um anticorpo antiCD25, como aqui descrito, e um anticorpo que é um agonista de uma via coestimuladora da ativação de células T. 0 kit pode compreender instruções de uso.

[0145] Qualquer aspecto da invenção como aqui descrito pode ser realizado em combinação com agentes terapêuticos adicionais, em particular terapias adicionais contra o câncer. Em particular, o anticorpo anti-CD25 e, opcionalmente, o inibidor de checkpoint imunológico, de acordo com a presente invenção, podem ser administrados em combinação com os anticorpos coestimuladores, quimioterapia e/ou radioterapia (ao aplicar irradiação externamente ao corpo ou administrar compostos radioconjugados), terapia à base de citocina, terapia direcionada, terapia de anticorpo monoclonal, uma vacina ou um adjuvante, ou qualquer combinação destes.

[0146] Uma entidade quimioterápica, conforme aqui usado, refere-se a uma entidade que é destrutiva a uma célula, ou seja, a entidade reduz a viabilidade da célula. A entidade quimioterápica pode ser uma droga citotóxica. Um agente quimioterápico contemplado inclui, entre outros, agentes alquilantes, antraciclinas, epotilonas, nitrosureais, etileniminas/metilmelamina, sulfonatos de alquila, agentes alquilantes, antimetabólitos, análogos de pirimidina, epipodofilotoxinas, enzimas como L-asparaginase; modificadores de resposta biológica como ΙΕΝα, ΙΕΝ-γ, IL-2, IL-12, G-CSF e GM-CSF; complexos de coordenação de platina como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina, antracenedionas, ureia substituída como hidroxiureia, derivados de metilhidrazina, inclusive N-metilhidrazina (MIH) e procarbazina, supressores

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67/155 adrenocorticais como mitotano (ο,ρ'-DDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas, inclusive antagonistas adrenocorticosteroides como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; progestina como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrogênio como dietilestilbestrol e equivalentes de etinilestradiol; antiestrogênio como tamoxifeno; andrógenos, inclusive propionato de testosterona e fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos, como flutamida, análogos do hormônio de liberação de gonadotropina e leuprolida; e antiandrógenos não esteroidais como flutamida.

[0147] A terapia adicional contra câncer também pode incluir a administração de uma vacina contra o câncer. Vacinas contra o câncer, conforme aqui usado, referem-se a vacinas terapêuticas contra o câncer administradas a pacientes com câncer e destinadas a erradicar as células cancerosas através do fortalecimento das respostas imunológicas do próprio paciente. As vacinas contra o câncer incluem vacinas de células tumorais (autóloga e alógena), vacinas de células dendríticas (ex vivo geradas e ativadas por peptídeo), vacinas contra o câncer à base de proteína/peptídeo e vacinas genéticas (vacinas baseadas em DNA, RNA e viral). De forma adequada, as vacinas terapêuticas contra o câncer, em princípio, podem ser utilizadas para inibir o crescimento adicional de cânceres avançados e/ou tumores recidivos que são refratários a terapias convencionais, como cirurgia, radioterapia e quimioterapia. As vacinas à base de células tumorais (autólogas e alógenas) incluem aquelas geneticamente modificadas para secretar agentes estimuladores imunológicos solúveis como citocinas (IL-2, IFN-g, IL12, GMCSF, FLT3L), anticorpos de Fv de cadeia

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68/155 única contra receptores modulatórios imunológicos (PD-1, CTLA4, GITR, ICOS, 0X40, 4-1BB) e/ou expressar em sua membrana o ligante para os receptores estimuladores imunológicos, como ligante de ICOS, ligante de 4-1BB, ligante de GITR e/ou ligante de 0X40, entre outros. Em uma realização, a vacina contra o câncer pode ser uma vacina antitumoral GVAX.

[0148] A terapia adicional contra o câncer pode ser outros anticorpos ou pequenas moléculas reagentes que reduzem a regulação imunológica na periferia e dentro do microambiente tumoral, por exemplo, moléculas que visam as vias de TGFbeta, IDO (indoleamina dioxigenase), Arginase e/ou CSF1R.

[0149] 'Em combinação' pode se referir à administração da terapia adicional antes, ao mesmo tempo ou após a administração de qualquer aspecto, de acordo com a presente invenção.

[0150] A invenção será agora descrita ainda por meio dos seguintes Exemplos, os quais pretendem server para auxiliar o técnico no assunto na realização da invenção e não pretendem de forma alguma limitar o escopo da invenção, em referência aos desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0151] Figura 1 - mostra a caracterização de anticorpos anti-CD25 murinos 7D4 e PC61 como usado nos Exemplos. 0 efeito na ligação de IL-2 foi realizado usando um ensaio de bloqueio cruzado em formato Tandem. A CD25 de camundongo biotinilada foi carregada nos sensores SA. Os sensores foram então expostos a 100 nM de IL-2 de camundongo seguido por anticorpo CD25 anti-camundongo no tempo 150 s. A ligação adicional pelo anticorpo após associação de IL-2 indica

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69/155 um CD25 anti-camundongo que não bloqueia a ligação de IL-2, enquanto a ausência de ligação adicional indica bloqueio de ligante. PC-61 m!gG2a mostra interferência da interação entre IL-2 de camundongo - CD25 de camundongo, em contraste a 7D4 (A). A interação de IL-2 de camundongo - CD25 de camundongo na presença da anti-CD25 recombinante de camundongo 7D4(mIgGl) foi avaliada usando o ensaio de bloqueio cruzado em formato sanduíche padrão. 7D4(mIgGl) foi carregado em sensores AHQ e os sítios de ligação Fc não ocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgGl humano irrelevante. Os sensores foram então expostos a 100 nM de CD5 recombinante de camundongo (R&D Systems; cat. No 2438-RM- 050) seguido de IL-2 recombinante de camundongo (Peprotech; cat. No 212-12) . A ligação adicional por IL-2 de camundongo após a associação de 7D4(mIgGl) a CD25 de camundongo indica um epitopo não ocupado, com 7D4(mIgGl) e IL-2 de camundongo que não competem com o epitopo na CD25 de camundongo, uma vez que a ligação é simultânea para CD25 de camundongo (B). A ligação a CD25 de camundongo foi determinada usado células de CHO que expressam CD25 de camundongo para os anticorpos de ligação a CD25 anti-humana Daclizumabe (DAC), o anticorpo PC61(m!gG2a) (anti-CD25 original obtida do clone PC61 com IgG2a murino e regiões constantes κ que estão associadas a ADCC) e anticorpo a7D4(m!gGl) (anti-D25 obtido do clone 7D4 com IgGl murino e regiões constantes κ). O IgG de CD25 anticamundongo se liga a mCD25 celular expresso. CHO-mCD25 foi aliquotado em placas de ensaio de 96 poços (50000 células/poço) e incubado com 0,1 mL de solução contendo anticorpo (anticorpo a concentração de 100 nM em PBS + 0,1% de albumina sérica bovina) a 25 °C por 15 minutos. As células foram lavadas três vezes com PBS gelado + 0,1% de albumina sérica bovina) e então

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70/155 rotuladas com Anti-IgG humano de cabra (cadeia γ específica) R-PE (Southern Biotech, número de catálogo 2040-09) e analisadas usando uma citometria de fluxo (iodeto de propídio foi usado para distinguir células mortas). Não foi detectada ligação para DAC, enquanto PC61 (m!gG2a) e 7D4(mIgGl) mostram ligação clara a estas células (C).

[0152] Figura 2 - mostra o efeito de anticorpos CD25 anti-camundongo na indução de expressão de Granzima B por células T CD4 mediante estimulação com anti-CD3 e anti-CD28, as células T positivas para CD4 totais foram isoladas usando MicroGrânulos de CD4 dos linfonodos e baço de camundongos e rotuladas com corantes Violeta CellTrace™ (ThermoFisher) para medir a proliferação celular. As células T rotuladas (105) foram semeadas com células alimentadoras (105; fração negativa de CD90.2, usando o kit pan T Dynabeads de camundongo) em placas de 96 poços. Anti-CD3 (clone 145-2C11, BioXcell Cat. No. BE0001-1; 1 pg/mL) e anti-CD28 (clone 37.51 Cat. No. BioXcell BE0015-1; 0,5 pg/mL) foram adicionados aos poços (com exceção da amostra controle de células T rotuladas não estimuladas) para ativar as células T CD4 e induzir proliferação e produção de Granzima B. O seguintes anticorpos foram então adicionados ainda (a 25 pg/mL) aos poços contendo células T CD4 rotuladas e anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (poços contendo células T rotuladas e anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 só foram usados como controle negativo): PC61(m!gG2a), 7D4(mIgGl) ou um anticorpo anti-IL-2 neutralizante de camundongo (clone Jes6-1A12, BioXcell 6032988564) usado como controle positivo para mostrar o impacto do bloqueio da interação entre IL-2 e seu receptor na ativação de células T. As amostras de células T rotuladas foram então

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71/155 incubadas por aproximadamente 84 horas. As células foram então fixadas e permeabilizadas antes de serem coradas com anticorpo anti-Granzima B de camundongo (clone GB11, Invitrogen). As células foram então analisadas por citometria de fluxo para expressão de granzima B e diluições de corantes violeta CellTrace (BV450). A porcentagem de células T rotuladas que estão se proliferando e que expressam Granzima B (GnzB) é mostrada no quadrante esquerdo superior de cada gráfico específico ao tratamento (Q9), enquanto a porcentagem de células T rotuladas que estão se proliferando mas que não expressam GnzB é mostrada no quadrante esquerdo inferior de cada gráfico específico ao tratamento (Q12).

[0153] Figura 3 - mostra o efeito ín vivo de anticorpos CD25 anti-camundongo que possuem o mesmo isótipo (IgG2a de camundongo) que estejam bloqueando ou não a interação entre CD25 e IL-2, quando administrado na presença ou não de anti-PDl de camundongo (aPDl; clone RMP1-14) em células imunológicas. Seis grupos de camundongos foram injetados via subcutânea com células tumorais MCA205 (5xl0⁵ 15) no Dia 0 e tratados separadamente, conforme indicado nos gráficos. Nos quatro grupos, o anticorpo CD25 anti-camundongo (aPC61 m!gG2a ou a7D4 m!gG2a; 200 pg) é injetado via intraperitoneal no Dia 5. Nos três grupos, aPDl (100 pg) é injetado via intraperitoneal no Dia 6 e Dia 9. Os tumores e linfonodos são colhidos no Dia 12 e então processados quanto a células coradas de acordo com o tipo desejado e analisados por citometria de fluxo, conforme indicada em cada painel, usando os seguintes anticorpos: anti-CD3 (clone 17A2, Biolegend), anti-CD4 (clone RM4-5, BD biosciences), anti-CD8 (clone 53-6.7, Biolegend) e anti-FoxP3 (Clone FJK-16s, eBiosciences). A coloração

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72/155 intranuclear de FoxP3 foi realizada usando o Conjunto Tampão de Coloração de Fator de Transcrição FoxP3 de (eBioscience). A porcentagem de células T regulatórias CD4-positivas/Foxp3positivas e células T CD4 efetoras CD4-positivas/FoxP3negativas (CD4 Teff) em LN e TIL, bem como células T efetoras CD8-positivas/células Treg e células CD4 Teff/Treg é mostrada. A análise de dados foi realizada em Flowjo versão 10.0.8 (Tree Star Inc.). As análises estatísticas foram realizadas em Prism 6 (GraphPad Software, Inc.); os valores p foram calculados usando análise de variação de Kruskall-Wallis e teste post-hoc de Dunn (ns = p > 0,05; **** = p < 0,0001).

[0154] Figura 4 - mostra o efeito de anticorpos CD25 anti-camundongo que possuem o mesmo isótipo (IgG2a) que estejam bloqueando ou não a interação entre CD25 e IL-2, na presença ou não de anti-PDl de camundongo (aPDl; clone RMP114) na produção de Granzima B pela proliferação de células T in vivo. As amostras de células foram geradas usando o modelo baseado em MCA205 em seis grupos de tratamento, conforme indicado na Figura 3. As células tumorais foram coradas de acordo com o tipo desejado e analisadas por citometria de fluxo, conforme indicado em cada painel, usando os seguintes anticorpos: anti-CD3 (PeCy7, clone 145-2C11, Ebioscience, 25003182), anti-CD4 (V500, clone RM4-5, BD biosciences, 560782), anti-CD8 (BV785, clone 53-6.7, Biolegend, 100750), anti-Granzima B (APC, clone GB11; Invitrogen, grb05) e KÍ67 (V450, Clone SolA15; eBiosciences, 48569882). A coloração intranuclear de KÍ67 e Granzima B foi realizada usando o Conjunto Tampão de Coloração de Fator de Transcrição de FoxP3 (eBioscience, 00-5523-00). A porcentagem de células T positivas para GnzB, bem como o número total de células T de

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73/155 proliferação positiva para GnzB (conforme indicado pela positividade de Ki67) CD4-positivas ou CD8-positivas foram comparadas. As análises estatísticas foram realizadas como para a Figura 3 (ns = p > 0,05; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; * * * = p < 0,001; * * * * = p < 0,0001).

[0155] Figura 5 - mostra o efeito de CD25 anticamundongo (isótipo de IgG2a) que é administrado com ou sem a combinação com um anti-PD-1 (RMP1-14 clone) sobre a erradicação de tumores estabelecidos no modelo de camundongo CT26. Tanto 7D4m2a quanto PC61m2a são anticorpos CD25 anti-camundongo de depleção de Treg, mas são sem bloqueio de IL-2 (7D4m2a) ou bloqueio de IL-2 (PC61m2). As curvas de crescimento de camundongos individuais foram estabelecidas para cada grupo de tratamento no decorrer do tempo. O número de sobreviventes sem tumor após 50 dias é indicado em cada gráfico. As células CT26 usadas para implantação foram colhidas durante o crescimento da fase log e novamente suspensas em PBS frio. No dia 1 (Dl) do estudo, cada camundongo foi injetado via subcutânea no flanco direito com 3 x 10⁵ células (0,1 mL de suspensão celular). A CD25 anti-camundongo foi injetada por via i.p. (10 mg/kg) no Dia 6 (quando foram detectados tumores palpáveis) . A PD1 anti-camundongo foi injetada por via i.p. (100 pg/injeção) no Dia 7, Dia 10, Dia 14 e Dia 17. Os tumores foram medidos em duas dimensões duas vezes por semana para monitorar o crescimento. Tamanho do tumor, em mm³, foi calculado a partir de: Volume do Tumor = (w2 x l)/2, onde iv = largura e 1 = comprimento, em mm, do tumor. O endpoint do estudo foi um volume tumoral de 4000 mm³ ou 50 dias, o que ocorreu primeiro (ponto de dados interrompendo em dias anteriores diferentes são devido a morte de camundongos; o número de animais que

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74/155 sobreviveram no término do experimento é indicado em cada painel).

[0156] Figura 6 - mostra as curvas de crescimento tumoral de CT26 de camundongos individuais não tratados (PBS, apenas veículo) ou tratados com anticorpos de IgG2a CD25 anticamundongo, com depleção de Treg mas sem bloqueio de IL-2 (7D4m2a) ou bloqueio de IL-2 (PC61m2), e combinados ainda ou não com anti-PD-Ll de camundongo, clone 10F.9G2 (aPDLl; clone 10F.9G2). O modelo, regime e análise de dados são iguais aos da Figura 5.

[0157] Figura 7 - mostra o efeito de CD25 anticamundongo (isótipo de IgG2a) que é administrado com ou sem a combinação com um anti-PD-1 (RMP1-14 clone) sobre a erradicação de tumores estabelecidos no modelo de camundongo MC38. Os anticorpos testados são aqueles descritos na Figura 5. As curvas de crescimento de camundongos individuais foram estabelecidas para cada grupo de tratamento no decorrer do tempo. O número de sobreviventes sem tumor após 35 dias é indicado em cada gráfico. As células de carcinoma de cólon MC38 usadas para implantação foram colhidas durante o crescimento de fase log e novamente suspensas em PBS frio. Cada camundongo foi injetado via subcutânea no flanco direito com 5 x 10⁵ células tumorais (0,1 mL de suspensão celular). Os tumores foram monitorados conforme seus volumes atingiram a faixa alvo de 100 a 150 mm³. Vinte e dois dias após o implante do tumor, no Dia 1 do estudo, os animais com volumes de tumor individual variando de 75 a 126 mm³ foram classificados em nove grupos (n = 10) com volumes tumorais médios por grupo de aproximadamente 106 mm³. Os tratamentos começaram no Dia 1 nos camundongos portadores de tumores MC38 estabelecidos. Os

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75/155 efeitos de cada tratamento foram comparados a um grupo controle tratado com veículo que recebeu PBS via intraperitoneal (i.p.) nos Dia 1, Dia 2, Dia 5, Dia 9 e Dia 12. Anti-PDl foi administrado via i.p. a 100 pg/animal, duas vezes por semana durante duas semanas (bissemanal x 2) com início no Dia 2. 7D4m2a e PC61m2a foram administrados via i.p. uma vez, no Dia 1 a 200 pg/animal. As medições tumorais foram realizadas duas vezes por semana. O endpoint do estudo foi um volume tumoral de 4000 mm³ ou 35 dias, o que ocorreu primeiro (ponto de dados interrompendo em dias anteriores diferentes são devido a morte de camundongos; o número de animais que sobreviveram no término do experimento é indicado com cada painel).

[0158] Figura 8 - mostra as curvas de crescimento tumoral de MC38 de camundongos individuais não tratados (PBS, apenas veículo), tratados com anticorpos IgG2a anti-CD25, com depleção de Treg mas sem bloqueio de IL-2 (7D4m2a) ou bloqueio de IL-2 (PC61m2), e combinados ainda ou não com anti-PD-Ll de camundongo, clone 10F.9G2 (aPDLl; clone 10F.9G2). O modelo, regime e análise de dados são iguais aos da Figura 7.

[0159] Figura 9: A avaliação da atividade terapêutica de 7D4 m!gG2a, um CD25 anti-camundongo sem bloqueio de IL-2, anticorpo de depleção de Treg isoladamente (D) e em combinação com o anticorpo neutralizante de IL-2 (ThermoFisher; JES6-1A12) (E) ou um anticorpo CD25 anticamundongo sem depleção e com bloqueio de IL-2 do isótipo de IgGl de camundongo (PC61, IgGl de camundongo) (F), em camundongos portadores de tumores colônicos singeneicos CT26 em fêmeas de camundongo BALB/c. A atividade de IgG2s controle de camundongo (A) , um anticorpo neutralizante de IL-2

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76/155 isoladamente (B), e um anticorpo anti-CD25 com bloqueio de IL2 isoladamente (C) foram testadas para comparação.

[0160] Figura 10: mostra a sequência consensual de CD25 humano (Uniprot código P01589), denominado aqui SEQ ID No:1. O domínio extracelular de CD25 maduro, correspondendo a aminoácidos 22-240, está sublinhado. A posição de epitopos de anticorpos anti-CD25 sem bloqueio de IL conforme preliminarmente identificados: epitopos 1 (epitopos totais e curtos), epitopo 2 (epitopos totais e curtos), epitopo 3 e epitopo 4 (epitopos totais e curtos) é indicada. A posição dos epitopos de basiliximabe e daclizumabe (indicado como DAC) também é identificada.

[0161] Figura 11: A caracterização de ligação de (A) 7D4, (B) PC61 e (C) 2E4 a CD25 expressa em células CHO que expressam CD25 em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o isótipo controle de IgG2a de camundongo.

[0162] Figura 12: A análise baseada em SPR de anticorpos purificados (m!gG2a) para rmCD25, marcado em Biacore 2000, (A) 7D4, (B) 2E4.

[0163] Figura 13: A análise de competição de anticorpos anti-mCD25 para rmCD25, marcado em Octet96. Mostrando a ligação por um segundo anticorpo após captura de 7D4 no sensor e etapas de associação do antígeno. Ligação competitiva com mCD25 é observada entre 7D4 e 2E4 (A), mas não entre 7D4 e PC61 (B) [0164] Figura 14: Caracterização de 7D4, PC61 e 2E4 em comparação ao controle de isótipo IgG2a de camundongo ou na ausência de um anticorpo primário em relação ao bloqueio de sinalização de IL-2 e um ensaio de fosforilação de STAT5 usando células T isoladas de esplenócitos de C57BL/6. As

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77/155 células foram incubadas com 50 pg/mL de anticorpo, seguidas de 50 U/mL de IL-2. A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células Treg.

[0165] Figura 15: A depleção ín vivo de Treg em camundongos Balb/c portando tumor 4T1 após dosagem com anticorpo CD25 anti-camundongo (7D4). (A)-(C): % de células não CD4, CD4+ e CD25+FoxP3+, respectivamente, no sangue total no dia 3 após a administração da dose. (D)-(F) : % de células não CD4, CD4+ e CD25+FoxP3+, respectivamente, no tumor no dia 3 após a administração da dose. (G)-(I): % de células não CD4, CD4+ e CD25+FoxP3+, respectivamente, no sangue total no dia 9 após a administração da dose. (J)-(L): % de células não CD4, CD4+ e CD25+FoxP3+, respectivamente, no tumor no dia 9 após a administração da dose.

[0166] Figura 16: Caracterização de CD25 antihumana de camundongo (B) ou quimérica (A, C e D), clone 7G7B6 que se liga a CD25 expresso em células Karpas 299 (A), células Treg humanas diferenciadas in vitro (B), células SU-DHL-1 (C) ou células SR-786 (D) em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o controle de isótipo de IgGl humano.

[0167] Figura 17: Caracterização de 7G7B6 em comparação ao controle de isótipo de IgG2a de camundongo, controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou na ausência de um anticorpo primário em relação à sinalização de bloqueio de IL-2 em um ensaio de fosforilação STAT5 utilizando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguidas de concentrações crescentes de IL-2 (como mostrado nas Figuras). A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

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78/155 [0168] Figura 18: Caracterização funcional de 7G7B6 quimérico em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou anticorpo neutralizante de anti-IL-2 humana de camundongo comercialmente disponível como um controle positivo, (clone: AB12-3G4) utilizando células T Pan. As células foram incubadas com 10 ug/mL de anticorpo, e então ativadas com esferas de CD3/CD28 por 72 horas antes da análise por citometria de fluxo. Os resultados mostram o percentual de células T CD4 de proliferação de granzima B positiva.

[0169] Figura 19: Caracterização funcional de 7G7B6 quimérico em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à morte de linhagens celulares CD25-positivas em um ensaio ADCC. As células com alta ou baixa expressão de CD25, as células SU-DHL-1 (A) ou as células SR-786 (B) , respectivamente, foram co-cultivadas com células NK purificadas na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). A lise celular desejada foi medida pela liberação de calceína no sobrenadante em quatro horas após a adição às células NK. Os dados foram normalizados a controles tratados com saponina.

[0170] Figura 20: Caracterização funcional de 7G7B6 quimérico em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que

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79/155 as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de células-alvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 χ [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0171] Figura 21: Caracterização da ligação de MA-251 a CD25 expressa em células Karpas 299 em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o controle de isótipo de IgGl de camundongo.

[0172] Figura 22: Caracterização de MA-251 em comparação ao controle de isótipo de IgGl de camundongo, controle de isótipo de IgGl humano, Daclizumabe ou na ausência de um anticorpo primário. Bloqueio da sinalização de IL-2 em um ensaio de fosforilação de STAT5 foi avaliado usando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguidas de concentrações crescentes de IL-2 (como mostrado nas Figuras). A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0173] Figura 23: Caracterização de MA-251 e ligação de IL2 a CD25. A interferência com ligação por ligante IL2 a CD25 foi realizada em um sistema Forte Bio Octet Red384 (Pali Forte Bio Corp., EUA) utilizando um ensaio padrão de classificação em sanduíche. O anticorpo MA251 foi carregado em sensores AHQ e os sítios de ligação Fc não ocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgGl humano não relevante. Os sensores foram expostos a CD25 humana 100 nM, seguidos de IL-2 humana 100 nM. Os dados foram processados utilizando Software de Análise de Dados Forte Bio 7.0. A ligação adicional por IL2 humana após a associação de antígeno indica um epitopo

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80/155 não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

[0174] Figura 24: Análise de competição de anticorpos anti-CD25 no Octet. Ligação do primeiro Ab com o rhCD25 imobilizado, seguido do primeiro Ab novamente (como controle) ou um segundo Ab. mAbs que não são bloqueadores do sinal de IL-2 competem entre si ou com 7G7B6 e MA251 e não competem com Daclizumabe de pesquisa ou Basiliximabe de pesquisa (Figuras 24 (A) a (N)). Análise de competição de (A) a (C) de 7G7B6; análise de competição de (D) a (F) de MA251; análise de competição de (G) a (I) e (N) do Anticorpo 3; análise de competição de (J) a (M) do Anticorpo 1. mAbs que são bloqueadores da sinalização de IL-2 (TSK031) competem com o Daclizumabe de pesquisa e Basiliximabe de pesquisa e não competem com 7G7B6 (Figuras 24 (O) a (Q) ) .

[0175] Figura 25: O modelo ín vivo que mostra a supressão do crescimento tumoral após dosagem com: veículo (A) e (C); ou Anticorpo 1 (B), (D) e (E).

[0176] Figura 26: Determinação de afinidade por análise baseada em SPR de anticorpos purificados (IgGl) para rhCD25, marcado no Biacore 2000. A) 7g7B6ch, B) MA251ch, C) Anticorpo 1, D) Anticorpo 3 e E) Daclizumabe (controle) ou por interferometria de biocamada no instrumento Octet Red 96 (F) .

[0177] Figura 27: Caracterização de ligação de Anticorpo 1 à CD25 expressa em células Treg humanas diferenciadas in vitro (A), células SU-DHL-1 (B), ou células SR-786 (C) em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana.

[0178] Figura 28: Caracterização do Anticorpo 1 que se liga a CD25 expresso em células T Pan de CD3/CD28 em

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81/155 grânulos humanas ativadas (A) e (B), então fechado em células T CD4+ e CD8+, em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o controle de isótipo de IgGl humano.

[0179] Figura 29: Demonstra ligação não competitiva de Anticorpo 1 e IL-2 (A) e ligação competitiva de um anticorpo de competição IL-2 com IL-2 (B) por interferometria de biocamada no Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de sanduíche. O anticorpo CD25 anti-humano, Anticorpo 1, foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a CD25 humana 100 nM seguida de IL-2 humana. A ligação adicional por IL2 humana após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

[0180] Figura 30: Demonstra ligação não competitiva de Anticorpo 1 e Daclizumabe a CD25 por interferometria de biocamada no sistema Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de sanduíche. O anticorpo monoclonal de referência CD25 antihumano Daclizumabe foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a antígeno de CD25 humana lOOnM seguido pelo anticorpo CD25 anti-humano (Anticorpo 1) . A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

[0181] Figura 31: Caracterização de Anticorpo 1 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou na ausência de um anticorpo primário em relação à sinalização de bloqueio de IL-2 em um ensaio de fosforilação STAT5 utilizando PBMCs de origem humana. As células foram

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82/155 incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguidas de concentrações crescentes de IL-2 (como mostrado nas Figuras). A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0182] Figura 32: Caracterização funcional de Anticorpo 1 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou anticorpo neutralizante de anti-IL-2 humana de camundongo comercialmente disponível como um controle positivo, (clone: AB12-3G4) utilizando células T Pan. As células foram incubadas com 10 ug/mL de anticorpo, e então ativadas com esferas de CD3/CD28 por 72 horas antes da análise por citometria de fluxo. Os resultados mostram o percentual de CD4 de proliferação de granzima B positiva (A) ou células T de CD8 (B).

[0183] Figura 33: Caracterização funcional de Anticorpo 1 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à morte de linhagens celulares CD25-positivas em um ensaio ADCC. As células com alta ou baixa expressão de CD25, as células SU-DHL-1 (A) ou as células SR-786 (B) , respectivamente, foram co-cultivadas com células NK purificadas na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). A lise celular desejada foi medida pela liberação de calceína no sobrenadante em quatro horas após a adição às células NK. Os dados foram normalizados a controles tratados com saponina.

[0184] Figura 34: Caracterização funcional de Anticorpo 1 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis

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83/155 de anticorpos (como mostrado nas Figuras). Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de célulasalvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 x [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0185] Figura 35: Caracterização de ligação de Anticorpo 3 à CD25 expressa em células Treg humanas diferenciadas in vitro (A), células SU-DHL-1 (B), ou células SR-786 (C) em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana.

[0186] Figura 36: Caracterização de ligação de Anticorpo 3 a CD25 expressa em células T Pan de CD3/CD28 em grânulo ativadas humana (A) e (B) ou de macaco Cynomolgus (C) e (D) , então fechadas em células T CD4+ e CD8 + , em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o controle de isótipo de IgGl humano.

[0187] Figura 37: Demonstra a ligação não competitiva de Anticorpo 3 e IL-2 por interferometria de biocamada no Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de sanduíche. O anticorpo CD25 antihumano, Anticorpo 3, foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a CD25 humana 100 nM seguida de IL-2 humana. A ligação adicional por IL2 humana após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor).

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84/155 [0188] Figura 38: Demonstra ligação não competitiva de Anticorpo 3 e Daclizumabe a CD25 por interferometria de biocamada no sistema Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de sanduíche. O anticorpo monoclonal de referência CD25 antihumano Daclizumabe foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a antígeno de CD25 humana lOOnM seguido pelo anticorpo CD25 anti-humano (Anticorpo 3) . A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epítopo não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epítopo (competidor).

[0189] Figura 39: Caracterização de Anticorpo 3 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou na ausência de um anticorpo primário em relação à sinalização de bloqueio de IL-2 em um ensaio de fosforilação STAT5 utilizando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguidas de concentrações crescentes de IL-2 (como mostrado nas Figuras). A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0190] Figura 40: Caracterização funcional de Anticorpo 3 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou anticorpo neutralizante de anti-IL-2 humana de camundongo comercialmente disponível como um controle positivo, (clone: AB12-3G4) utilizando células T Pan. As células foram incubadas com 10 ug/mL de anticorpo, e então ativadas com esferas de CD3/CD28 por 72 horas antes da análise por citometria de fluxo. Os resultados mostram o percentual de CD4 de proliferação de granzima B positiva (A) ou células T de CD8 (B).

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85/155 [0191] Figura 41: Caracterização funcional de Anticorpo 3 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à morte de linhagens celulares CD25-positivas em um ensaio ADCC. As células com alta ou baixa expressão de CD25, as células SU-DHL-1 (A) ou as células SR-786 (B) , respectivamente, foram co-cultivadas com células NK purificadas na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). A lise celular desejada foi medida pela liberação de calceína no sobrenadante em quatro horas após a adição às células NK. Os dados foram normalizados a controles tratados com saponina.

[0192] Figura 42: Caracterização funcional de Anticorpo 3 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras) . Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de célulasalvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 x [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0193] Figura 43: Caracterização de ligação de Anticorpo 4 à CD25 expressa em células Treg humanas diferenciadas in vitro (A), células SU-DHL-1 (B), ou células

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SR-786 (C) em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana.

[0194] Figura 44: Caracterização de ligação de Anticorpo 4 a células CHO-S não modificadas, (controle negativo) (A) , ou células cyno-CD25-CHO-S (B) , na concentração

de anticorpo de	10 0 nM e	em	comparação com o controle	de
isótipo de IgGl [0195]	humano. Figura	45:	Demonstra a ligação	não
competitiva de	Anticorpo	4 e	IL-2 por interferometria	de
biocamada no Octet Red384	utilizando um ensaio padrão	de

classificação em formato de sanduíche. O anticorpo CD25 antihumano, Anticorpo 4, foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a CD25 humana 100 nM seguida de IL-2 humana. A ligação adicional por IL2 humana após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor).

[0196] Figura 46: Demonstra ligação não competitiva de Anticorpo 4 e Daclizumabe a CD25 por interferometria de biocamada no sistema Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de sanduíche. O anticorpo monoclonal de referência CD25 antihumano Daclizumabe foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a antígeno de CD25 humana lOOnM seguido pelo anticorpo CD25 anti-humano (Anticorpo 4) . A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

[0197] Figura 47: Caracterização de Anticorpo 4 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou na ausência de um anticorpo primário em relação à sinalização de bloqueio de IL-2 em um ensaio de fosforilação

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STAT5 utilizando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 qg/mL de anticorpo, seguidas de concentrações crescentes de IL-2 (como mostrado nas Figuras). A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0198] Figura 48: Caracterização funcional de Anticorpo 4 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou anticorpo neutralizante de anti-IL-2 humana de camundongo comercialmente disponível como um controle positivo, (clone: AB12-3G4) utilizando células T Pan. As células foram incubadas com 10 ug/mL de anticorpo, e então ativadas com esferas de CD3/CD28 por 72 horas antes da análise por citometria de fluxo. Os resultados mostram o percentual de CD4 de proliferação de granzima B positiva (A) ou células T de CD8 (B).

[0199] Figura 49: Caracterização funcional de Anticorpo 4 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à morte de linhagens celulares CD25-positivas em um ensaio ADCC. As células com alta ou baixa expressão de CD25, as células SU-DHL-1 (A) ou as células SR-786 (B) , respectivamente, foram co-cultivadas com células NK purificadas na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). A lise celular desejada foi medida pela liberação de calceína no sobrenadante em quatro horas após a adição às células NK. Os dados foram normalizados a controles tratados com saponina.

[0200] Figura 50: Caracterização funcional de Anticorpo 4 em comparação com um controle de isótipo de IgGl humana em relação à indução de ADCP em um Bioensaio Repórter. As células SU-DHL-1 de expressão de CD25 foram co-cultivadas

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88/155 com células T Jurkat modificadas por engenharia genética para expressar FcyRIIa e um elemento de resposta a NFAT que estimula a expressão de luciferase (NFAT-RE-luc2) na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras).

[0201] Figura 51: Caracterização de ligação de Anticorpo 2 à CD25 expressa em células Treg humanas diferenciadas in vitro (A), células SU-DHL-1 (B), ou células SR-786 (C) em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana.

[0202] Figura 52: Caracterização de ligação de Anticorpo 2 a CD25 expressa em células T Pan de CD3/CD28 em grânulo ativadas humana (A) e (B) ou de macaco Cynomolgus (C) e (D) , então fechadas em células T CD4+ e CD8 + , em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o controle de isótipo de IgGl humano.

[0203] Figura 53: Demonstra ligação não competitiva de Anticorpo 2 e IL-2 (A) e ligação competitiva de um anticorpo de competição IL-2 com IL-2 (B) por interferometria de biocamada no Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de sanduíche. O anticorpo CD25 anti-humano, Anticorpo 2, foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a CD25 humana 100 nM seguida de IL-2 humana. A ligação adicional por IL2 humana após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor).

[0204] Figura 54: Demonstra ligação não competitiva de Anticorpo 2 e Daclizumabe a CD25 por interferometria de biocamada no sistema Octet Red384 utilizando um ensaio padrão de classificação em formato de

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89/155 sanduíche. 0 anticorpo monoclonal de referência CD25 antihumano Daclizumabe foi carregado em sensores AHQ. Os sensores foram, então, expostos a antígeno de CD25 humana lOOnM seguido pelo anticorpo CD25 anti-humano (Anticorpo 2) . A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

[0205] Figura 55: Caracterização de Anticorpo 2 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe, ou na ausência de um anticorpo primário em relação à sinalização de bloqueio de IL-2 em um ensaio de fosforilação STAT5 utilizando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguidas de concentrações crescentes de IL-2 (como mostrado nas Figuras) . A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0206] Figura 56: Caracterização funcional de Anticorpo 2 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à morte de linhagens celulares CD25-positivas em um ensaio ADCC. As células com alta ou baixa expressão de CD25, as células SU-DHL-1 (A) ou as células SR-786 (B) , respectivamente, foram co-cultivadas com células NK purificadas na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). A lise celular desejada foi medida pela liberação de calceína no sobrenadante em quatro horas após a adição às células NK. Os dados foram normalizados a controles tratados com saponina.

[0207] Figura 57: Caracterização funcional de Anticorpo 2 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro

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90/155 em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de célulasalvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 x [ (percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0208] Figura 58: Caracterização da ligação de Anticorpo 5 a CD25 expressa em células Karpas 299 em concentrações crescentes de anticorpo e em comparação com o controle de isótipo de IgGl humana.

[0209] Figura 59: Caracterização de Anticorpo 5 em relação ao bloqueio de sinalização de IL-2 em um ensaio de fosforilação de STAT5 usando PBMCs de origem humana. O anticorpo anti-humano MA-251 de camundongo foi usado como um controle de não bloqueio enquanto o Processo de Alto Rendimento de Daclizumabe (DAC HYP) clinico foi usado como um controle de bloqueio comparado ao controle de isótipo de IgGl de camundongo, controle de isótipo de IgGl humanos ou na ausência de um anticorpo primário, respectivamente. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguidas de 10 U/mL de IL-2. A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0210] Figura 60: Ensaios de competição no Octet. A ligação de Anticorpo 1 ao rhCD25 imobilizado, seguido pelo

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91/155 primeiro Ab novamente (Anticorpo 1 como controle) ou um segundo Ab, tanto um concorrente de IL-2, por exemplo, Daclizumabe e Basiliximabe de pesquisa quanto um IL-2 sem concorrente, por exemplo, 7G7B6. 0 anticorpo 1 não compete com os bloqueadores de sinal de IL-2 Basiliximabe (A) e Daclizumabe (B) de pesquisa, enquanto compete com 7G7B6 (bloqueador não IL-2) (C) .

[0211] Figura 61: Caracterização de Anticorpo 5 em comparação com um anticorpo de controle silencioso Fc de CD25 anti-humana em relação à indução de ADCC em um Bioensaio Repórter. As células SR-786 de expressão de CD25 foram cocultivadas com células T Jurkat modificadas por engenharia genética para expressar FcvRIIIa e um elemento de resposta a NFAT que estimula a expressão de luciferase (NFAT-RE-luc2) na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras).

[0212] Figura 62: Caracterização funcional de Anticorpo 5 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras) . Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de célulasalvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose =

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100 χ [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0213] Figura 63: Caracterização da ligação do Anticorpo 6, Anticorpo 7, Anticorpo 8 e anticorpo 9 a CD25 expressa em células Karpas 299 em concentrações crescentes de anticorpo e comparação com o controle de isótipo de IgGl humano.

[0214] Figura 64: Ensaios de competição no Octet. Ligação do primeiro Ab (Anticorpo 7) ao rhCD25 imobilizado seguido tanto do primeiro Ab novamente (como controle) quanto de um segundo Ab Daclizumabe (A) ou Basiliximabe (B).

[0215] Figura 65: Caracterização de Anticorpo 7 em comparação ao controle de isótipo de IgGl humana, Daclizumabe-Hyp, ou na ausência de um anticorpo primário em relação à sinalização de bloqueio de IL-2 em um ensaio de fosforilação STAT5 utilizando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguido de 10 U/mL de IL-2. A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0216] Figura 66: Caracterização funcional de Anticorpo 7 em comparação com um anticorpo de controle silencioso Fc de CD25 anti-humana em relação à indução de ADCC em um Bioensaio Repórter. As células SR-786 de expressão de CD25 foram co-cultivadas com células T Jurkat modificadas por engenharia genética para expressar FcyRIIIa e um elemento de resposta a NFAT que estimula a expressão de luciferase (NFATRE-luc2) na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras).

[0217] Figura 67: Caracterização funcional de Anticorpo 7 em comparação com um anticorpo de controle

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93/155 silencioso Fc de CD25 anti-humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras) . Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de células-alvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 χ [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

	[0218	] Figura	68: Caracterização	da ligação	de
Anticorpo	10,	Anticorpo	11, Anticorpo 12,	Anticorpo	12,
Anticorpo	13,	Anticorpo	14, Anticorpo 15,	Anticorpo	16,
Anticorpo	17,	anticorpo	18, Anticorpo 19,	Anticorpo 20 e
Anticorpo	21	a CD25 expressa em células	Karpas 299	em

concentrações crescentes de anticorpo e comparação com o controle de isótipo de IgGl humano.

[0219] Figura 69: Ensaios de competição no Octet.

Ligação do primeiro Ab (Anticorpo 19) ao rhCD25 imobilizado

seguido tanto	do primeiro	Ab	novamente (como	controle) quanto
de um segundo	Ab Daclizumabe	(A) ou Basiliximabe (B).
[0220] Figura 70	: Caracterização	de Anticorpo 10,
Anticorpo 11,	Anticorpo	12	, Anticorpo 12,	Anticorpo 13,
Anticorpo 14,	Anticorpo	15	, Anticorpo 16,	Anticorpo 17,
anticorpo 18,	Anticorpo	19,	Anticorpo 20 e	Anticorpo 21 em
comparação ao	controle de	isótipo de IgGl humano, Daclizumabe-

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Hyp, ou na ausência de um anticorpo primário em relação ao bloqueio de sinalização de IL-2 em um ensaio de fosforilação de STAT5 usando PBMCs de origem humana. As células foram incubadas com 10 pg/mL de anticorpo, seguido de 10 U/mL de IL2. A análise foi restrita ao percentual de STAT5 de fosforilação de células CD3-positivas.

[0221] Figura 71: Caracterização funcional de Anticorpo 19 em comparação com um anticorpo de controle silencioso Fc de CD25 anti-humana em relação à indução de ADCC em um Bioensaio Repórter. As células SR-786 de expressão de CD25 foram co-cultivadas com células T Jurkat modificadas por engenharia genética para expressar FcyRIIIa e um elemento de resposta a NFAT que estimula a expressão de luciferase (NFATRE-luc2) na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras).

[0222] Figura 72: Caracterização funcional de Anticorpo 19 em comparação com um anticorpo de controle silencioso Fc de CD25 anti-humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras) . Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de células-alvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 χ [(percentual duplo

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95/155 positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0223] Figura 73: Caracterização funcional de Anticorpo 19, Anticorpo 12 e Anticorpo 20 em comparação com um anticorpo de controle silencioso Fc de CD25 anti-humana em relação à fagocitose de células Treg diferenciadas in vitro em um ensaio ADCP. Tregs foram co-cultivadas com macrófagos diferenciados por MCSF na presença de concentrações variáveis de anticorpos (como mostrado nas Figuras). Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada com macrófagos corados com CD14+ e Tregs marcadas com corante eFluor450. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de célulasalvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 x [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

[0224] Figura 74: Atividade terapêutica do anticorpo anti-CD25 sem bloqueio de IL-2, IgG2a de 7D4 de camundongo, em combinação com GVAX em um modelo resistente à imunoterapia com B16B16. Os camundongos individuais foram tratados com Gvax isoladamente ou em combinação com 7D4.

[0225] Figura 75: Atividade terapêutica de anticorpos anti-CD25 sem bloqueio de IL-2 (7D4 e 2E4) comparada a um anticorpo de bloqueio de IL-2 (PC61) em um modelo tumoral CT26 usando fêmeas de camundongo BALB/c. Os anticorpos antiCD25 sem bloqueio 7D4 e 2E4 exercem potente atividade terapêutica contra tumores sólidos. Tanto 7D4 quanto 2E4 são mais potentes que o anticorpo de bloqueio de IL-2 PC61

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96/155 [0226] Figura 76: Avaliação de atividade terapêutica de anticorpo anti-CD25 sem bloqueio de IL-2 7D4 m!gG2a em um modelo MCA205, em injeções únicas e repetidas em combinação com PD-L1 anti-camundongo. * indica camundongos vivos no término do experimento.

Exemplos

Exemplo 1 - Caracterização in vitro e preparação de anti-CD25 recombinante de camundongo, anticorpos de depleção de Treg que são tanto sem bloqueio de IL-2 quanto com bloqueio de IL-2. Materiais e Métodos

Origem do anticorpo e sua produção recombinante [0227] A sequência das regiões variáveis das cadeia pesadas e leves de CD25 PC61 anti-murino foi resolvida a partir do hibridioma PC-61.5.3 (ATCC cat. no TIB-222) por rápida amplificação das terminações de cDNA (RACE) e então clonada nas regiões constantes de IgG2a murinos e cadeias κ (ou sequências correspondentes de IgGl de camundongo que foram isoladas dos plasmídeos comerciais (Invivogen)).

[0228] Cada cadeia de anticorpo foi então subclonada em um vetor retroviral derivado de vírus de leucemia murina (MLV). Para experimentos preliminares, o anticorpo foi produzido usando-se células K562 transduzidas com vetores que codificam tanto cadeias pesadas quanto cadeias leves. O anticorpo foi purificado a partir dos sobrenadantes usando-se uma coluna HiTrap MabSelect de proteína G (GE Healthcare), dialisado em solução salina tamponada de fosfato (PBS), concentrado e esterilizado por filtração.

[0229] A sequência de DNA de cadeia variável pesada de CD25 anti-camundongo novamente clonada a partir do

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97/155 anticorpo PC-61.5.3 (IgG2a de camundongo) codifica a seguinte sequência proteica:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITA YYIHFVKQRPGQGLEWIGRIDPEDDSTEYAEKFKNKATITANTSSNTAHLKYSRLTSEDTA TY FCTTDNMGATEFVYWGQGTLVTVSS [0230] A sequência de DNA de cadeia variável leve de CD25 anti-camundongo novamente clonada a partir do anticorpo PC-61.5.3 (IgG2a de camundongo) codifica a seguinte sequência proteica: METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVVLTQPKSVSASLESTVKLSCKLNSGNIGS YYMHWYQQREGRSPTNLIYRDDKRPDGAPDRFSGSIDISSNSAFLTINNVQTEDEAMYFCH SYDGRMYIFGGGTKLTV [0231] O sequenciamento de 7D4-IgM foi realizado no hibridoma 7D4 (ECACC, 88111402) . O RNA ou mRNA total foi extraído e a transcrição reversa realizada para obter cDNA para as cadeias pesadas e leves do anticorpo. As cadeias variáveis pesadas e variáveis leves foram amplificadas usando primers avançados degenerados que se ligam no peptideo de sinal ou região de estrutura 1 e um primer reverso que se liga na região constante do anticorpo. Os genes amplificados foram clonados e sequenciados após uma abordagem padrão. cDNA foi gerado por transcrição reversa e uma cauda homopolimérica adicionada à terminação 3' do cDNA. Os genes de domínio variável do anticorpo foram então amplificados usando os primers específicos ao gene, seguido de uma abordagem padrão de clonagem e sequenciamento. DNA foi sequenciado por sequenciamento convencional de Sanger e os dados analisados usando o software DNASTAR Lasergene. O peptideo de sinal e as sequências de domínio variável foram identificados por comparação com sequências conhecidas na base de dados IMGT.

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98/155 [0232] Os genes que codificam os domínios variáveis pesados e variáveis leves foram otimizados em códão para expressão em uma linhagem celular humana e sintetizados com os locais de restrição 5' e 3' Nhel e Aval do gene. A clonagem para assimilar restrição foi realizada para inserir o gene de domínio variável pesado 7D4 nos vetores de expressão separada contendo domínios constantes de IgGl e IgG2a de camundongo. A clonagem para assimilar restrição foi realizada para inserir o gene de domínio variável leve 7F4 em um vetor de expressão contendo o domínio constante kappa de camundongo. As células HEK293 de suspensão cultivadas em meio de soro foram quimicamente co-transfectadas com vetor de expressão de cadeia pesada e leve por um adicional de 6 dias a 37 °C em um ambiente de 5% de CO2 e com agitação a 140 rpm. As culturas foram colhidas por centrifugação a 4000 rpm e mais clarificadas por filtração através de um filtro de 0,22 μΜ. Os sobrenadante foi carregado em uma coluna de Proteína A pré-equilibrada com PBS a pH 7,2, eluído com citrato de sódio em pH 3,5 e equilibrado com 10% (v/v) 0,5 M de Tris em pH 9,0. A solução de anticorpo neutralizado foi trocada por tampão em PBS em pH 7,2 usando uma coluna de dessalinização e concentrada, conforme necessário, usando um centrador centrífugo com um limite de peso molecular de 30 kDa. A concentração proteica foi determinada pela medição de absorvência a 280 nm e a pureza foi determinada por SDS-PAGE.

[0233] A sequência de DNA de cadeia pesada de anti-CD25 novamente clonada de camundongo do anticorpo 7D4 (IgGl de camundongo) codifica a seguinte sequência proteica: EVQLQQSGAALVKPGASVKMSCKASGYSFPDSWVTWVKQSHGKSLEWIGDI FPNSGATNFNEKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRLDYGYWGQGVMVTV

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SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS DLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIF PPKPKDVLMISLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVS ELPILHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSL TCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCS VLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [0234] A sequência de DNA de cadeia pesada variável de anti-CD25 novamente clonada de camundongo do anticorpo 7D4 (IgG2a de camundongo) codifica a seguinte sequência proteica:

EVQLQQSGAALVKPGASVKMSCKASGYSFPDSWVTWVKQSHGKSLEWIGDI FPNSGATNFNEKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRLDYGYWGQGVMVTV SSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS DLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGG PSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNS TLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMT KKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVER NSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK [0235] A sequência de DNA de cadeia leve kappa de anti-CD25 novamente clonada de camundongo tanto para o anticorpo 7D4 (mlgl) e 7D4(mlg2a) (IgG2a de camundongo) codifica a seguinte sequência proteica:

DWLTQTPPTLSATIGQSVSISCRSSQSLLHSNGNTYLNWLLQRPGQPPQL

LIYLASRLESGVPNRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYYCVQSSHFPNTFGVGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDS KDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC [0236] 2E4 foi gerado a partir do hibridoma 2E4 (Oferecimento do Dr. Ethan M. Shevach, Instituto Nacional de Saúde). 0 sequenciamento de hibridoma foi realizado pela tecnologia baseada em sequenciamento de próxima geração (NGS)

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100/155 proprietária para [sic] . As amostras de RNA foram usadas para gerar uma biblioteca de cDNA. As bibliotecas foram sequenciadas em uma plataforma Illumina. Utilizou-se o conjunto de novo para reconstruir o transcriptoma da amostra a partir dos dados brutos. As sequências de domínio variável foram identificadas por comparação com sequências conhecidas.

[0237] A sequência da proteína do domínio pesado variável para o anticorpo anti-CD25 2E4 de camundongo (IgGl de camundongo) possui a seguinte sequência proteica:

EVQLVE S GGGLVQPGRS LKL S CAAS G ET ES DYGMAWVRQAP TKGLEWVASI TNGGLNTYYRDSVKGRFTISRDNAKCTLYLQMDSLRSEDTATYYCATGGFS FWGQGTLVTV SS [0238] A sequência da proteína do domínio leve variável para o anticorpo anti-CD25 2E4 de camundongo (mlgl) possui a seguinte sequência proteica:

DIVMTQSPTSMSISVGDRVTMNCKASQNVDSNVDWYQQKTGQSPKLLIYKA SNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTIRNMQAEDLAVYYCMQSNSYPLTFGSGTKLEIK

Avaliação da afinidade dos anticorpos recombinantes para CD25 de camundongo [0239] As medições de afinidade ForteBio foram realizadas em um Octet RED384 geralmente conforme anteriormente descrito (vide, por exemplo, Estep P et ai., 2013. Mabs. 5(2), 270-8). Resumidamente, as medições de afinidade ForteBio foram realizadas ao carregar IgGs online nos sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados offline no tampão do ensaio por 30 minutos e então monitorados online por 60 segundos para estabelecimento do valor basal. Os sensores com IgGs carregados foram expostos a 100 nM de antígeno por 3 minutos, e posteriormente foram transferidos para o tampão de

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101/155 ensaio por 3 minutos para medição fora da taxa. Toda a cinética foi analisada usando o modelo de ligação de 1:1.

Resultados [0240] Dois hibridomas de camundongo foram selecionados como anticorpo de referência para avaliação da ligação de CD25 e propriedades de depleção de Treg de CD25 anti-camundongo, que são tanto sem bloqueio de IL-2 quanto com bloqueio de IL-2: 7D4 (isótipo IgM de camundongo) e PC61 (isótipo IgGl de camundongo), respectivamente. As propriedades relacionadas à ligação de IL-2 que foram descritas na literatura foram confirmadas preliminarmente usando os anticorpos originais não recombinantes e IL-2 recombinante de camundongo (Fig. IA). As variantes recombinantes destes anticorpos foram produzidas para testar os anticorpos nos quais o isótipo é mais ativo e relevante para estudos funcionais (como para depleção de Treg ou efeitos em outras células imunológicas). Além disso, no caso de 7D4, exige-se alteração de isótipo uma vez que as propriedades de agregação de anticorpo dos anticorpos IgM podem afetar os resultados dos ensaios. O 7D4 recombinante (mlgGl), como o anticorpo do isótipo IgM original não recombinante, ainda permite a ligação de IL-2 de camundongo a CD25 de camundongo (Fig. IB). 7D4(mlgGl) também se liga a CD25 de camundongo na superfície celular, de forma similar ao PC61(IgG2a) recombinante, enquanto um anticorpo CD25 anti-humano de referência não se liga (Fig. IC) .

[0241] A sequência de DNA que codifica o domínio variável da cadeia pesada de 7D4 (bem como de PC61) também foi clonada em um vetor que permite a expressão do domínio de ligação de CD25 de camundongo com o isótipo IgG2a de camundongo

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102/155 (funcionalmente correspondente ao IgGl humano). Desta forma, é possível comparar dois anticorpos anti-CD25 recombinantes de camundongo com a atividade de ADCC otimizada, que pode esgotar eficientemente a Treg intratumoral, mas apresentar propriedades distintivas em relação à ligação de IL-2 de camundongo a CD25 de camundongo. Os anticorpos anti-CD25 recombinantes resultantes de camundongo foram testados quanto à sua afinidade a CD25. O isótipo diferente (IgG2a de camundongo ou IgGl de camundongo) não afeta esta propriedade, uma vez que Kd é similar entre os anticorpos recombinantes baseados em 7D4 (em torno de 1 nM) e comparável àquela de PC61(m!gG2a), que é medida como 4,6 nM.

[0242] As propriedades funcionais destes anticorpos recombinantes também foram comparadas em um ensaio in vitro para determinação de seu efeito na produção de Granzima B em resposta à estimulação de anti-CD3 e anti-CD28 (Fig.2). Granzima B (GnzB) é uma proteinase serina expressa por células T de memória e células NK, bem como células T CD4 e CD8 ativadas, que expressam e secretam fortemente GnzB durante as reações imunológicas. Esta enzima é um mediador importante de morte celular, patologia tecidual e doença. A estimulação in vitro e proliferação de células T com os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (com > 80% de células T CD4 se proliferando e expressando GnzB) pode ser afetada pelas citocinas e anticorpos. Quando esta estimulação é realizada em combinação com uma neutralização de produção de Granzima B do anticorpo anti-IL-2, mas sem proliferação, é inibida a frequência de células que se proliferam e produzem quedas de GnzB de > 80% a < 1%, enquanto a frequência de proliferação das células permanece > 90%. Isto indica que a produção de

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Granzima B, porém sem proliferação celular, é dependente da sinalização de IL-2. Uma queda similar em Granzima B produzindo células T é observada quando se adiciona PC61 (mlgGl) às células T estimuladas. No entanto, 7D4 (mlgGl) preserva principalmente a capacidade das células T CD4 responderem à estimulação anti-CD3 e anti-CD28 pela produção de GnzB (> 65% das células ainda produzindo GnzB e se proliferando) . Estes resultados confirmam que os anticorpos baseados em PC61 bloqueiam a sinalização de IL-2, enquanto 7D4 possui apenas um pequeno efeito nesta sinalização e pode, assim, ser usado como um anticorpo substituto para avaliar o potencial terapêutico de um anticorpo CD25 anti-humano, em particular em relação à depleção de Treg e propriedades especificas ao tumor, que não seriam impactadas na sinalização de IL-2.

EXEMPLO 2 - Depleção de Treg e propriedades anticâncer de CD25 anti-camundongo recombinante, anticorpos de depleção de Treg que são tanto sem bloqueio de IL-2 quanto com bloqueio de IL-2. Materiais e Método Camundongos [0243] Os estudos in vivo foram realizados pela Charles River Discovery Services North Carolina (CR Discovery Services). Fêmeas de camundongo BALB/c (BALB/c AnNcrl, Charles River) e fêmeas de camundongo C57BL/6 (C57BL/6Ncrl, Charles River) tinham entre sete e nove semanas de idade no inicio do estudo. CR Discovery Services atende especificamente as recomendações do Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório em relação a procedimentos de contenção, criação e cirúrgicos, regulação de alimentação e fluidos e cuidado veterinário. O programa de cuidado e uso animal no CR Discovery

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Services é acreditado pela Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidado Internacional de Animais de Laboratório, que garante a aderência aos padrões aceitos para o cuidado e uso de animais de laboratório.

[0244] Linhas celulares e cultura tecidual [0245] As células tumorais MCA205 (células de fibrosarcoma imunogênico induzido semanalmente com 3metilcolantreno; de G. Kroemer, Gustave Roussy Cancer Institute) foram cultivadas em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) suplementado com 10% soro fetal de vitelo (FCS, Sigma), 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina (todos da Gibco). As células de carcinoma de cólon murino MC38 (CR Discovery Services) foram cultivadas até a fase de log intermediária em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 pg/mL de gentamicina. As células de carcinoma de cólon murino CT26 (CR Discovery Services) foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina sódica G, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 pg/mL de gentamicina. Todas as células tumorais foram cultivadas em frascos de cultura tecidual em uma incubadora umidificada a 37 °C, em uma atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar. As células K562 usadas para produção de anticorpo foram cultivadas em meio Dulbeco modificado de Iscove (IMDM) sem vermelho de fenol suplementado com 10% de FCS esgotado de IgG (Life Technologies).

[0246] Experimentos tumorais ín vivo

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105/155 [0247] As células tumorais cultivadas foram tripsinizadas (MCA205) ou não (MC38 e CT26), lavadas e novamente suspensas em PBS e injetadas via subcutânea (s.c.) no flanco (5 x 10⁵ células para modelos MCA205 e MC38 em camundongos C57BL/6; 3 x 10⁵ 15 células para modelos CT26 em camundongos BALB/c). Os anticorpos foram injetados via intraperitoneal (i.p.) nos timepoints descritos nas legendas das figuras. Para os experimentos funcionais, 12 dias após a implantação do tumor, os tumores e linfonodos de drenagem foram coletados e processados para análise por citometria de fluxo, conforme descrito (Simpson et ai. (2013) J Exp Med 210, 1695710) . Para experimentos terapêuticos, os tumores foram medidos duas vezes por semana e os volumes calculados como o produto dos três diâmetros ortogonais.

[0248] Citometria de fluxo [0249] Aquisição foi realizada com um BD LSR II Fortessa (BD Biosciences). Foram usados os seguintes anticorpos: anti-CD3 (clone 145-2C11, ebioscience,25003182), anti-CD4 (clone RM4-5, BD biosciences, 560782), anti-CD8 (clone 53-6.7, Biolegend, 100750), anti-Granzima B (clone GB11, Invitrogen), anti-FoxP3 (Clone FJK-16s, eBiosciences) e K167 (Clone SolA15, eBiosciences, 48569882). Os linfonodos (inguinais, axilares e braquiais) e tumores dos camundongos foram dessecados em RPMI sem soro. Os linfonodos foram dispersados através de um filtro de 70 pm, enquanto os tumores foram rompidos mecanicamente usando gentleMACS (Miltenyl Biotech) e digeridos com uma mistura de 0,33 mg/mL de DNase (Sigma-Aldrich) e 0,27 mg/mL de Liberase TL (Roche) em RPMI sem soro por 30 minutos a 37 °C. Os tumores foram filtrados através de um filtro de 70 pm e as suspensões de células

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106/155 tumorais únicas resultantes foram enriquecidas por leucócitos pela passagem através de um gradiente de Ficoll-Paque (GE Healthcare). Os tumores e linfonodos foram lavados em RPMI completo, novamente suspensos em tampão FACS (500 mL de PBS, 2% de FCS, 2mM de EDTA) e colocados em placas de 96 poços de fundo redondo. Preparou-se uma mistura inicial de anticorpos da superfície na diluição recomendada pelo fabricante: antiCD3 (clone 145-2011, ebioscience, 25003182), anti-CD4 (clone RM4-5, BD biosciences, 560782), anti-CD8 (clone 53-6.7, Biolegend, 100750). Um corante de viabilidade fixável (eFlour780, eBioscience) também foi incluído à mistura inicial de superfície. Após permeabilização por 20 minutos com uso de uma fixação intracelular e conjunto de tampão de permeabilização (eBioscience), aplicou-se um painel de coloração intracelular que consiste nos seguintes anticorpos usados na diluição recomendada do fabricante: anti-Granzima B (clone GB11, Invitrogen), anti-FoxP3 (Clone FJK-16s, eBiosciences) e KÍ67 (Clone SolA15, eBiosciences, 48569882).

Resultados [0250] O modelo murino de sarcoma MCA205 permite a geração de camundongos nos quais a resposta imunológica e a eficácia geral contra um tumor sólido podem ser avaliadas para um painel de compostos imunomodulatórios em curto tempo. Em particular, os anticorpos anti-CD25 baseados em IgG2a recombinantes de camundongo foram testados para avaliação das alterações nas subpopulações de células T que se apresentam como linfócitos infiltrantes no tumor ou dentro dos linfonodos periféricos, bem como o crescimento tumoral e viabilidade de camundongos expostos a MCA205. Um anticorpo adicional (anti

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PD1 de camundongo) é incluído no estudo como controle negativo para efeitos imunológicos na Treg.

[0251] A análise imunológica mostra que o anticorpo 7D4, quando clonado em uma coluna de IgG2a de camundongo, mostra uma capacidade similar a PC61 (IgG2a de camundongo) na depleção de Treg e aumento subsequente da proporção entre Teff e Treg no tumor e periferia, enquanto anti-PDl é ineficaz isoladamente ou em combinação (Fig. 3) . Portanto, gualquer efeito adicional que seja medido usando-se 7D4(m!gG2a) como um anticorpo substituto ao não bloqueio de IL-2, o anticorpo CD25 anti-humano não aparece associado às alterações nas propriedades de depleção de Treg.

[0252] Os camundongos do modelo MCA205 que são tratados com 7D4 mostram também uma porcentagem maior de células positivas para GnzB, como proliferação de células T positivas para CD4 e positivas para CD8, em relação não apenas ao tratamento com anti-PDl, mas também PC61 com bloqueio de IL-2 (mlg2a). Nestes camundongos tratados, não apenas 7D4(mlg2a), mas também PC61(mlg2a), não afetam as células Teff, porém também aumentam a frequência de células Teff em comparação a PC61(mlg2a), sugerindo uma atividade antitumoral ainda mais elevada de um anticorpo CD25 anti-humano que não bloquearia a interação entre IL-2/CD25 (Fig. 4).

[0253] O uso de CD25 anti-humana que se equivale funcionalmente a 7D4(mlg2a) para a imunoterapia contra o câncer, em particular para tumores sólidos, pode ser testado no modelo murino MCA205, mas também outros modelos como CT26 e modelos MC38 (carcinoma de cólon) ou B16 (melanoma) . Tanto IgG2a quanto anticorpos CD25 anti-camundongo mostram atividade terapêutica contra tumores CT26 estabelecidos quando

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108/155 administrados em combinação com anticorpos anti-PDl. De forma interessante, quando usado como monoterapia, o anticorpo sem bloqueio de IL-2 7D4(mlg2a) mostra uma atividade terapêutica claramente mais elevada que o anticorpo baseado em PC61 que possui o mesmo isótipo. No fim do experimento, todos os camundongos tratados com 7D4(mlg2a) apenas mostram um controle do crescimento tumoral para um volume inferior a 50 mm³, enquanto nenhum dos camundongos tratados com PC61(mlg2a) mostra tumor menor que 50 mm³, com tumores em 8 dos 10 camundongos atingindo o endpoint de 2000 mm³. Isto também é ilustrado por uma diferença na sobrevida, com todos os camundongos tratados com 7D4(mlg2a) ainda vivos no dia 50 versus apenas 2 de 10 camundongos tratados com PC61(mlg2a). De fato, se a eficácia de PC61(mlg2a) resulta em melhora de grande parte pela combinação com anti-PDl, a eficácia de 7D4(mlg2a) não é melhorada adicionalmente, pelo menos ao usar este anticorpo nesta concentração.

[0254] Como estes anticorpos baseados em 7D4 e PC61 mostram uma capacidade similar de depleção de Treg (vide Fig. 3), esta diferença na eficácia podería ser explicada, pelo menos em parte, pelo menor impacto de 7D4(mlg2a) sobre a interação entre IL-2 e seu receptor. Isto mostra que não apenas a ausência de atividade de bloqueio do receptor de IL-2/IL-2 não é prejudicial para a atividade terapêutica, como também podería prover vantagem terapêutica. Portanto, estes dados confirmam a seleção de um anticorpo direcionado a CD25 para não bloqueio do receptor de IL-2/IL-2 para uso na terapia do câncer. Estas propriedades vantajosas do anticorpo 7D4(mlg2a) foram confirmadas também quando um PD-L1 anti-camundongo é usado no mesmo modelo murino CT26 (Fig. 6) ou quando o modelo

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109/155 murino MC38 é usado com as mesmas combinações de anticorpos (Fig. 7 e Fig. 8) .

[0255] Estes dados mostram que a depleção de Treg, as propriedades de ligação a CD25 de anticorpos baseadas nas propriedades de 7D4 e com o isótipo apropriado podem ser exploradas em combinação com outros composto anticânceres como anticorpos que visam proteínas de checkpoint imunológico (por exemplo, contra PD-1 e anti-PD-Ll) ou contra outros alvos relevantes ao câncer. Esta abordagem pode ser seguida pela produção e administração dos dois produtos como uma nova mistura de anticorpos monoespecíficos ou como novos anticorpos biespecíficos. Esta abordagem que envolve a contração de anticorpos biespecíficos combinando as duas propriedades de ligação ao antígeno e o isótipo terapeuticamente relevante (por exemplo, IgGl humano) pode ser validada pela tecnologia de Duobody, que permite a associação eficiente de cadeia pesada e leve única a partir de dois anticorpos monoespecíficos distintos que são produzidos separadamente e contêm mutações de ponto de correspondência únicas no domínio CH3, permitindo assim a troca de Fab por uma proteína heteromérica única (Labrijn AF et al., Nat Protoc. 2014, 9:2450-63). As propriedades funcionais destes produtos de Duobody baseados em 7D4 (por exemplo, inclusive um anti-PDl ou um anti-PD-Ll) podem ser avaliadas usando os modelos de interação celular e depleção que foram usados para validação dos anticorpos baseados em 7D4 e combinações de anticorpo, conforme descrito acima.

[0256] Estes resultados também indicam que as propriedades de ligação de 7D4 em relação a CD25 de camundongo, sem interferir na interação de IL-2 com seu receptor e sinalização de IL-2 em células que expressam CD25, podem ser

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110/155 exploradas em CD25 anti-humana, na qual o isótipo é selecionado de forma compatível com este mecanismo de ação (por exemplo, IgGl humano). De fato, diversas outras propriedades podem ser consideradas para triagem de candidatos a anticorpo CD25 antihumano com outras propriedades melhoradas em relação à sua preparação, uso e/ou administração para tratamento do câncer e, em particular, tumores sólidos.

[0257] Estas propriedades podem ser definidas também relação a características de CD25 anti-humana conhecida, como Humax-TAC, Basiliximabe ou Daclizumabe, todos tendo Kd na faixa nanomolar para CD25 humana, mas todas bloqueando a ligação de IL-2 humana a CD25 humana (usando o clone M-A251 como referência potencial de não bloqueio a IL2, CD25 anti-humana a ser incluída na seleção de CD25 antihumana da invenção).

[0258] Estas características podem ser uma ou mais das seguintes:

- Afinidade para CD25 humana recombinante monomérica isolada com um KD inferior a 25 nM, preferencialmente abaixo de 10 nM, e ainda mais preferido abaixo de 1 nM (conforme estabelecido usando-se tecnologias como Octet, Kinexa, ELISA ou outras);

Reatividade cruzada para CD25 recombinante monomérico isolado de Cynomolgus com um KD inferior a 75 nM, preferencialmente inferior a 30 nM, e ainda mais preferido inferior a 3 nM (conforme estabelecido usando-se tecnologias como Octet, Kinexa, ELISA ou outras);

- Afinidade para CD25 recombinante monomérica humana na superfície de células CHO ou MJ com um Kd inferior a 100 nM, preferencialmente abaixo de 10 nM e ainda mais preferido

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111/155 abaixo de 1 nM (conforme estabelecido usando-se tecnologias como citometria de fluxo, ELISA à base de células ou outras);

- Afinidade para CD25 recombinante monomérica de rhesus na superfície de células CHO com um Kd inferior a 300 nM, preferencialmente abaixo de 30 nM e ainda mais preferido abaixo de 3 nM (conforme estabelecido usando-se tecnologias como citometria de fluxo, ELISA à base de células ou outras);

Células Treg humanas que se ligam com um KD inferior a 100 nM, preferencialmente abaixo de 10 nM e ainda mais preferido abaixo 1 nM (conforme estabelecido usando-se tecnologias como citometria de fluxo, ELISA à base de células ou outras);

- Células Treg de Cynomolgus que se ligam com um KD inferior a 300 nM, preferencialmente abaixo de 30 nM e ainda mais preferido abaixo de 3 nM (conforme estabelecido usandose tecnologias como citometria de fluxo, ELISA à base de células ou outras);

Falta de inibição da interação entre IL-2 recombinante humana e CD25 recombinante humana em ensaio bioquímico (menos de 25% da ligação de IL-2 a CD25 é bloqueada na triagem, conforme descrito no Exemplo 1);

- Falta de sinalização induzida de IL-2 no ensaio à base de células, como fosforilação de STAT5 em células T ativadas positivas para CD8 ou positivas para CD4 ou linha celular que expressa CD25, ou supraregulação de Granzima B após ativação de ensaio de células T positivas para CD4 (menos de 25% do sinal da linhagem de base é inibido, como descrito no Exemplo 1); e/ou

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- Avaliação de potência relevante nos ensaios à base de células, como ensaio de ADCC, ADCP e/ou CDC nas linhagens celulares que expressão CD25 humanas ou células Treg primárias (com EC50 abaixo de 10 nM, preferencialmente abaixo de 1 nM e ainda mais preferido abaixo de 0,1 nM).

Exemplo 3 -Experimentos adicionais de modelo in vivo com camundongos com anticorpos CD25 anti-camundongo sem bloqueio de IL-2

Materiais e Métodos [0259] Atividade terapêutica de um anticorpo sem bloqueio de IL-2: Fêmeas de camundongo BALB/c obtidas da Charles River foram injetados com 3 x 10⁵ células tumorais CT26 em 0% de Matrigel via subcutânea no flanco, n=15 por grupo. Os animais foram randomizados nos grupos de tratamento com base no peso corporal do Dia 1. O tratamento foi iniciado no Dia 6 e os camundongos foram tratados com um injeção de cada anticorpo (isótipo de IgG2a de camundongo, anticorpo neutralizante de IL-2, PC61 mlgGl, uma CD25 anti-camundongo que bloqueia a sinalização de IL-2 do isótipo de IgGl de camundongos e 7D4 m!gG2a, uma CD25 anti-camundongo que não bloqueia a sinalização de IL-2 do isótipo de IgG2a de camundongos) a 200 pg/animal. Os animais receberam tanto tratamentos de monoterapia, com um grupo por anticorpo, quanto tratamento de combinação de 7D4 m!gG2a e o anticorpo neutralizante de IL-2 ou anticorpo 7D4 m!gG2a e PC61 mlgGl. Os camundongos foram sacrificados quando o volume tumoral atingiu 2000 mm³ ou 50 dias, o que ocorreu primeiro.

Atividade terapêutica de um anticorpo sem bloqueio de IL-2 em comparação ao anticorpo com bloqueio

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113/155 [0260] 3 x 10⁵ células CT26 foram implantadas no flanco. Foi realizada uma correspondência de par no dia 0 quando os tumores atingiram entre 30 e 60 mm³ e o tratamento iniciou. No dia 1 e quinzenalmente daí por diante, o tratamento com 10 mg/kg foi dosado via i.p. Os grupos foram tratados com anticorpo neutralizante de IL-2 PC61-m2a, anticorpo sem bloqueio de IL-2 7D4, anticorpo sem bloqueio de IL-2 2E4 ou não foram tratados.

Atividade terapêutica de um anticorpo sem bloqueio de IL-2 em combinação com uma terapia com aPDLl [0261] Os camundongos foram injetados com 50.000 células tumorais MCA205 via subcutânea, n = 10 por grupo ou n= 5, conforme indicado nas figuras. Os animais foram randomizados nos grupos de tratamento. Os animais receberam tanto tratamento de monoterapia, de 7D4 m!gG2a ou aPD-Ll (clone 10F.9G2), quanto tratamento de combinação de 7D4 m!gG2a com aPD-Ll (clone 10F.9G2) ou não foram tratados. Os grupos receberam: a7D4 m!gG2a isoladamente - dia 10 (200 ug) , aPD-Ll r!gG2b (10F.9G2) - dias 6, 9 e 12 (200 ug) , aPD-Ll + a7D4 combo (aPDL-1 nos dias 6, 9 e 12 e a7D4 no dia 10), ou aPD-Ll + a7D4 combo (aPDL1 nos dias 6, 9 e 12 e a7D4 no dia 10) , - dose extra de a7D4 dia 15 + aPD-Ll dia 18 (5 camundongos apenas).

Resultados [0262] O anticorpo sem bloqueio de IL-2 com depleção de anti-CD25 7D4 m!gG2a induziu rejeição tumoral em camundongos tratados, enquanto os demais anticorpos não mostraram efeito como monoterapia quando comparados ao isótipo IgG2a de camundongo. A combinação com anticorpos com bloqueio de IL2, tanto PC61 mlgGl quanto IL2 nAb, anula a atividade terapêutica do anticorpo sem bloqueio de IL-2 7D4 m!gG2a

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114/155 (Figura 13) . Isto demonstra que a característica de não bloqueio de IL-2 de 7D4 m!gG2a é fundamental para a atividade terapêutica. Também sugere que a atividade terapêutica deste anticorpo depende da resposta imunológica antitumoral mediada por células T efetoras, que são dependentes da sinalização de IL-2 para atividade ideal. Estes resultados mostram que a ausência da atividade de bloqueio de IL-2/CD25 é necessária para uma atividade terapêutica ideal do anticorpo que visa CD25 e confirma o uso de um anticorpo anti-CD25 sem bloqueio de IL-2, como aqui descrito, na terapia do câncer.

[0263] Estes resultados mostram ainda que a ausência da atividade de bloqueio de IL-2/CD25 não é prejudicial à atividade terapêutica dos anticorpos e confirma o uso de um anticorpo anti-CD25 sem bloqueio de IL-2, como aqui descrito, na terapia do câncer.

[0264] Estes resultados mostraram que os anticorpos sem bloqueio de IL-2, 7D4 e 2E4, são mais potentes que o anticorpo com bloqueio de IL-2, PC61. Os anticorpos antiCD25 sem bloqueio 7D4 e 2E4 exercem atividade terapêutica potente contra tumores sólidos (Fiqura 75).

[0265] Os resultados mostraram que injeções únicas ou repetidas de anticorpo aCD25 sem bloqueio de IL2 7D4 após início da terapia com aPDLl aumenta as respostas antitumorais. As células Teff ativadas no tratamento com aPDLl são evitadas e aumentadas pelo anticorpo aCD25 (Fiqura 76).

Exemplo 4 - Caracterização de epitopo de anticorpos anti-CD25 sem bloqueio de IL-2.

Seleção de epitopo [0266] A seleção de epitopo dos anticorpos foi realizada em um sistema Forte Bio Octet Red384 (Pali Forte Bio

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Corporation, Menlo Park, CA) usando um ensaio de seleção de formato sanduíche padrão. 0 anticorpo PC61 CD25 anticamundongo foi carregado em sensores AMC e os sítios de ligação Fc não ocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgGl de camundongo não relevante. Os sensores foram então expostos a 15 nM de antígeno alvo seguido do anticorpo 7D4. Os dados foram processados usando o Software 7.0 de Análise de Dados da ForteBio. A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado (não competidor), enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

Mapeamento do epitopo de anticorpos anti-CD25 sem bloqueio de IL-2 [0267] Diferentes grupos de alças lineares e únicas, imitadores de volta β, imitadores de ponte de dissulfeto, imitadores de dissulfeto descontínuo, peptídeos imitadores de epitopo descontínuo representando a sequência de CD25 humana (Uniprot registro no P01589) foram sintetizados usando a síntese de Fmoc de fase sólida (Pepscan BV, Holanda; Timmermann P et al. , 2007 J. Mol. Recognit., 20, 283-99; Langedijk JP et al., 2011, Analytical Biochemistry. 417:149155). A ligação dos anticorpos a cada um dos peptídeos sintetizados foi testada em um ELISA (Pepscan, Países Baixos) . As séries de peptídeo foram incubadas com solução do anticorpo primário (durante a noite a 4 °C) . Após a lavagem, as séries de peptídeo foram incubadas com uma diluição 1/1000 de um conjugado de peroxidase de anticorpo adequado (2010-05; Southern Biotech) por uma hora a 25 °C. Após a lavagem, o substrato de peroxidase 2,2’-azino-di- 3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) e 20 μΙ/mL de 3% H2O2 foram adicionados. Após

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116/155 uma hora, o desenvolvimento de cor foi medido. 0 desenvolvimento de cor foi quantificado com um dispositivo acoplado à carga (CCD) - câmera e um sistema de processamento de imagem. Os valores obtidos da câmera CCD variam de 0 a 3000 mAU, similar a um leitor ELISA padrão de placas de 96 poços. Para verificar a qualidade dos peptídeos sintetizados, um conjunto separado de peptídeos controle positivo e negativo foi sintetizado em paralelo e triado com anticorpos controle irrelevantes.

Resultados [0268] A seleção de epitopo foi realizada para determinar se os anticorpos se ligam a epitopos que se sobrepõem àqueles do anticorpo CD25 anti-humana sem bloqueio de IL-2 comercialmente disponível, 7G7B6. Os anticorpos foram então caracterizados para determinar os epitopos para os anticorpos sem bloqueio de IL-2. O epitopo do anticorpo CD25 anti-camundongo com bloqueio, PC61, foi determinado para comparação de um controle. Os resultados do mapeamento de epitopo são mostrados na Tabela 1 para anticorpos CD25 antihumano e Tabela 2 para anticorpos CD25 anti-camundongo:

Tabela 1 - anticorpos CD25 anti-humano:

Anticorpo	Epitopo 1	Epitopo 2	Epitopo 3	Epitopo 4
7G7B6 e Anticorpos 6 a 9	isoYQCVQGYRALHRG P163	iggSVCKMTHGKTRWT QPiso	42KEGTMLNCECKRGF Rse*	74SSWDNQCQC TSSATRss*
ΜΆ251 e anticorpos 10 a 21	isoYQCVQGYRALHRG P163	iggSVCKMTHGKTRWT QPiso	42KEGTMLNCECKRGF Rse*	74SSWDNQCQC TSSATRss*
Anticorpo 1				70NSSHSSWDN QCQCTS84

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Anticorpo 2	isoYQCVQGYRAiss	17₆RWTQPQLICTGi86
Anticorpo 3			42KEGTMLNCECKRGF Rse*
Anticorpo 4	isoYQCVQGYRALHieo		42KEGTMLNCECKRGF Rse*

*epitopo secundário [0269] A numeração da sequência de aminoácidos (aa) é baseada na CD25 humana retirada da sequência publicada sob o número de adesão Uniprot P01589.

Tabela 2 - anticorpos CD25 anti-camundongo:

Anticorpo	Epitopo
2E4	146YECIPGYKA154	178LTCVDER184
7D4	I84REHHRFLASEE194
PC61	47LNCECKRGFRR57	78TSNSHDKSRKQ88

[0270] A numeração da sequência de aminoácidos (aa) é baseada na CD25 de camundongos retirada da sequência publicada sob o número de adesão Uniprot P01590.

[0271] O estudo de mapeamento de epitopo que foi realizado usando a tecnologia Pepscan indica que os anticorpos anti-humanos se ligam a CD25 humana em um epitopo que não se sobrepõem ao local de ligação de IL-2 em CD25. Os anticorpos anti-humanos se ligam a um epitopo diferente de basiliximabe e daclizumabe. O epitopo para Basiliximabe e Daclizumabe compreende resíduos na região dos aminoácidos 137-143 (da SEQ ID No: 1), que se sobrepões ao lado de interação de CD25 para IL-2 (Binder M et al., Cancer Res 2007 vol 67(8): 3518-23). Os anticorpos CD25 anti-camundongo sem bloqueio, 2E4 e 7D4, reconhecem um epitopo diferente de PC61.

Exemplo 5: Caracterização de anticorpos CD25 anticamundongo

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Ligação de anticorpos a células CHO que expressam CD25 de camundongo [0272] A ligação a CD25 que expressa células CHO foi examinada por artigos teste de coloração (anticorpos antiCD25 primário, 7D1, PC61 e 2E4) com 30 mg/mL de anticorpos seguido de séries de diluição semilog (7 pontos) para 30 minutos no gelo. Este foi seguido por coloração com um anticorpo secundário (Alexa Fluor 647-AffiniPure Fab Fragmento de IgG Anti-Humana de Cabra (H+L) - (Jackson ImmunoResearch)) na concentração de 1 mg/mL durante 30 minutos em gelo. Todas as amostras foram coradas em duplicatas. As células vivas foram selecionadas utilizando parâmetros de FSC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A intensidade de fluorescência média (MFI) de células coradas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de MFI em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 é calculada. Os resultados, conforme mostrados na Figura 11, confirmaram que os anticorpos CD25 anti-camundongo se ligam a células CHO que expressam CD25 de camundongos.

Medições de afinidade de anticorpos anti-mCD25.

[0273] A afinidade para os anticorpos CD25 anticamundongo, 7D4, PC61 e 2E4, foi determinada pela medição de sua Kd por SPR em um Biacore 2000 usando um chip sensor CM-5 com uma temperatura ambiente de experimento de 25 °C. O anticorpo anti-camundongo foi inicialmente imobilizado entre todas as células de fluxo em um tampão de análise (pH 7,4, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tween 20) a uma umidade relativa entre 16.000 a 18.000 durante 10 minutos. O ligante (artigos de teste de anticorpo) foi carregado

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119/155 subsequencialmente até um nível de captura entre 119-163 RU. 0 analito (CD25 recombinante de camundongo marcado em his) foi então associado em tampão de análise a partir de uma diluição de 2 vezes com início em 800 nM com a mais baixa concentração de 3,13 nM por 6 minutos. A dissociação foi realizada em tampão de análise durante 10 minutos. As etapas de regeneração entre as concentrações de amostra foram realizadas em Glicina 10 mM em pH 1,7 por 10 minutos. Uma vazão de 25 μΐ/min foi mantida durante todo o processo. Os dados cinéticos foram adaptados usando um software de análise de analito bivalente de modelo global provido pela Biacore com subtração de referência. A análise baseada em SPR é mostrada na Figura 12. Os valores de Kd que foram estabelecidos neste ensaio para os anticorpos CD25 anti-camundongo são os seguintes: para 7D4, 2,6 x ICC⁹ M; para 2E4 114 x ICC⁹ M e para PC61 3,6 x 1CU⁹ M (resultado não mostrado).

Competição de anticorpo anti-camundongo no Octet [0274] As competições de anticorpo foram realizadas em um sistema Forte Bio Octet Red96 (Pali Forte Bio Corp., EUA) usando um ensaio de seleção sanduíche padrão. O anticorpo CD25 anti-camundongo 10 nM foi carregado em sensores AMC por 900 s e os sítios de ligação Fc não ocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgG2a de camundongo não relevante. Os sensores foram expostos a 15 nM de antígeno alvo (CD25 de camundongo marcado em his) por 600 s seguido de um segundo anticorpo anti-CD25 (também a 10 nM) . Os dados foram processados utilizando Software de Análise de Dados Forte Bio 9.0. A ligação adicional por um segundo anticorpo após a associação de antígeno indica um epitopo não ocupado, enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo.

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120/155 [0275] A ligação competitiva a mCD25 é observada entre 7D4 e 2E4 (Figura 13(A)), mas não entre 7D4 e PC61 (Figura 13(B).

Sinalização in vitro de IL-2 por ensaio de fosforilação de STAT5:

[0276] As células T Pan foram isoladas dos esplenócitos usando o kit T Pan (CD90.2) de camundongos Dynabeads® FlowCompTM da Invitrogen (Cat.: 11465D). 200.000 células foram laminadas e repousadas por 2 horas a 37 °C. Os anticorpos foram adicionados a 50 ug/mL e incubados com as células por 30 minutos a 37 °C, após o qual as células foram estimuladas com IL2 (50 U/mL) por 10 minutos a 37 °C.

[0277] A fosforilação de STAT5 induzida por IL-2 foi interrompida quando as células foram fixadas e permeabilizadas com o Kit de Tampão de Coloração eBioscience™ Foxp3 / Fator de Transcrição (Invitrogen) e tratadas com o Tampão III BD Phosflow Perm (BD Biosciences) . As células foram então coradas simultaneamente com anticorpos rotulados com fluorocromo de superfície e surface intracelular (STAT5-Alexa Flúor 647 clone 47/stat5/pY694 BD Bioscience, CD3-PerCP-Cy5.5 clone 17A2 Biolegend, CD4-PE clone RM4-5 Biolegend, FoxP3AF488 clone FJK-16s Ebioscience) e as amostras foram obtidas no Citômetro de Fluxo Fortessa LSR X20 (BD Bioscience) e analisadas usando o software BD FACSDIVA. Os dupletos foram excluídos utilizando FCS-H versus FCS-A, e os linfócitos foram definidos utilizando parâmetros SSC-A versus FCS-A. As células T de CD3⁺ foram definidas utilizando um gráfico de CD3 PerCPCy5.5-A versus FCS-A e um gate foi desenhado em um histograma mostrando a contagem versus STAT5 Alexa Fluor 647-A para determinar a população de células T STAT5⁺CD3⁺. O percentual

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121/155 de bloqueio da sinalização de IL-2 foi calculado como segue: % de bloqueio = 100 x [ (% células Stat5⁺ Sem grupo Ab - % de células Stat5⁺ 50 ug/mL de grupo Ab) / (% células Stat5⁺ Sem grupo Ab) ] . A análise adicional de fosforilação STAT5 por diferentes subconjuntos de células T (CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺FoxP3-) também foi avaliada ao acoplar nos respectivos subconjuntos e analisada conforme acima. Os gráficos e a análise estatística foram realizados utilizando o GraphPad Prism v7 (resultados não mostrados). Os resultados são mostrados na Figura 14.

Resultados:

[0278] Os anticorpos anti-camundongo, 7D4 e 2E4, foram avaliados ainda em relação à sua capacidade de se ligar a CD25 e não interferir na sinalização de IL-2 de células alvo que expressam CD25. 7D4 e 2E4, não bloqueadores de IL-2, competem pela ligação a CD25, enquanto PC61 (bloqueador de sinalização de IL-2) não compete com 2E4 ou 7D4 para se ligar a CD25 (Figura 12).

[0279] O ensaio STAT5 confirmou que 7D4 e 2E4 não bloqueou a sinalização de IL-2, enquanto a sinalização de IL2 foi bloqueada pelo bloqueio do anticorpo PC61 (Figura 14).

Exemplo 6: Depleção de Treg in vivo [0280] 1 x 10⁵ células 4T1 em 200 μΐ de meio RPMI 1640 foram implantadas no segundo tecido de impacto de gordura torácica de camundongos Balb/c. Quando os tumores atingiram 50 a 100 mm³ os camundongos foram randomizados e uma única dose uniforme intraperitoneal de 2 pg, 20 pg ou 200 pg de anticorpo CD25 anti-camundongo (7D4) foi administrada por camundongo. Nos dias 3 e dia 9, os tecidos tumorais e sangue total foram isolados para imunofenotipagem.

Resultados:

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122/155 [0281] O anticorpo 7D4 apresentou atividade de depleção de Treg no sangue total e tecido tumoral com base na análise por imunofenotipagem pós-dose do dia 3 e dia 9 (Figura 15) .

Exemplo 7: Caracterização de anticorpo anti-CD25 7G76B

Ligação de anticorpos anti-CD25 a células que expressam CD25 humana:

[0282] O 7G76B é avaliado pela ligação a linhagens celulares humanas de linfoma, Karpas 299, SU-DHL-1 e SR-786 e a células Treg diferenciadas in vitro. A ligação a CD25 que expressa linhagens celulares humanas (SU-DHL-1 e SR-786) foi examinada primeiramente bloqueando-se as células com Trustain (Biolegend) antes da incubação com anticorpos anti-CD25 titulados em uma série de diluição semi-log a partir de uma concentração máxima de 20 pg/mL, por 30 minutos a 4 °C antes de serem lavadas e incubadas com anticorpo Fc de IgG antihumana conjugada com PE (Biolegend). As células foram lavadas novamente e ressuspensas em tampão FACS contendo DAPI e adquiridas na Intellicyt iQue. As células vivas foram selecionadas utilizando parâmetros de FSC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A Intensidade Média Geo de células coradas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de Intensidade Média Geo em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 é calculada.

[0283] A ligação a CD25 que expressa células Karpas 299 e Tregs diferenciadas in vitro foi examinada corando-se artigos de teste (anticorpos primários anti-CD25) com 30 mg/mL de anticorpos seguidos por diluição em série semi

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123/155 log (7 pontos) durante 30 minutos em gelo. Este foi seguido por coloração com um anticorpo secundário (Alexa Fluor 647AffiniPure Fab Fragmento de IgG Anti-Humana de Cabra (H+L) (Jackson ImmunoResearch)) na concentração de 1 mg/mL durante 30 minutos em gelo. Todas as amostras foram coradas em duplicatas. As células vivas foram selecionadas utilizando parâmetros de ESC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A intensidade de fluorescência média (MFI) de células coradas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de MFI em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 é calculada. Os resultados, como mostrados na Figura 16 e Figura 21, confirmaram que os anticorpos anti-CD25 se ligam a células que expressam CD25.

Sinalização in vitro de IL-2 por ensaio de fosforilação de STAT5:

[0284] O bloqueio de IL-2 foi caracterizado utilizando-se um ensaio de fosforilação STAT5 no qual a sinalização de IL-2 foi examinada. PBMC anteriormente congelado (Stemcell Technologies) foi cultivado em placas de 96 poços de fundo em U na presença de 10 pg/mL de anticorpos anti-CD25 por 30 minutos antes da adição de IL-2 (Peprotech) em concentração variáveis de 0,1 U/mL, 1 U/mL ou 10 U/mL por 10 minutos em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo 10% FBS (Sigma), 2 mM L-Glutamina (Life Technologies) e 10.000 U/mL de Pen-Strep (Sigma). A fosforilação de STAT5 induzida por IL-2 foi interrompida quando as células foram fixadas e permeabilizadas com o Kit de Tampão de Coloração eBioscience™ Foxp3 / Fator de Transcrição (Invitrogen) e tratadas com o Tampão ITT BD Phosflow Perm (BD Biosciences). As células foram,

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124/155 então, simultaneamente coradas com anticorpos de superfície e intracelulares marcados com fluorocromo (STAT5-Alexa Fluor 647 clone 47/stat5/pY694 BD Bioscience, CD3-PerCP-Cy5.5 clone UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 clone SK3 BD Bioscience, CD8-Alexa Fluor 700 clone RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 clone HI100 Invitrogen, FoxP3-Alexa Fluor 488 clone 236A/E7 Invitrogen) e as amostras foram adquiridas no Citômetro de Fluxo Fortessa LSR X20 (BD Bioscience) e analisadas utilizando o software BD FACSDIVA. Os dupletos foram excluídos utilizando FCS-H versus FCS-A, e os linfócitos foram definidos utilizando parâmetros SSC-A versus FCS-A. As células T de CD3+ foram definidas utilizando um gráfico de CD3 PerCP-Cy5.5-A versus FCS-A e um gate foi desenhado em um histograma mostrando a contagem versus STAT5 Alexa Fluor 647-A para determinar a população de células T STAT5+CD3+. O percentual de bloqueio da sinalização de IL-2 foi calculado como segue: % de bloqueio = 100 x [(% células Stat5⁺ Sem grupo Ab - % de células Stat5⁺ 10 ug/mL de grupo Ab) / (% células Stat5⁺ Sem grupo Ab) ] . A análise adicional de fosforilação de STAT5 por diferentes subconjuntos de células T (CD4+, CD8+, CD4⁺FoxP3+, células sem tratamento e células T de memória) também deveria ser avaliada pela acoplagem nos respectivos subconjuntos e analisada como acima. Os gráficos e a análise estatística foram realizados utilizando o GraphPad Prism v7 (resultados não mostrados). Os resultados são mostrados na Figura 17 e Figura 22.

Ensaio de ativação de células T in vitro:

[0285] O impacto da sinalização de IL-2 sobre as respostas Teff foram caracterizadas em um ensaio de ativação de células T, em que a regulação ascendente e a proliferação da granzima B intracelular (GrB) foram analisadas. Células T

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Pan humanas primárias previamente congeladas (Stemcell Technologies) foram marcadas com corante de proliferação celular eFluor450 (Invitrogen), de acordo com a recomendação do fabricante, e foram adicionadas a placas de 96 poços com fundo em U tendo 1 x 10⁵ células/poço em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo FBS 10% (Sigma), L-Glutamina 2 mM (Life Technologies) e Pen-Strep 10.000 U/mL (Sigma). As células foram, então, tratadas com 10 pg/mL de anticorpos anti-CD25 ou anticorpos de controle, seguidos de Humano T-Ativador CD3/CD28 (razão de 20:1 entre célula e esfera; Gibco) e incubadas por 72 horas em uma incubadora umidifiçada a 37 °C e CO2 5%. Para avaliar a ativação de células T, as células foram coradas com o Corante de Viabilidade Fixável eBioscience efluor780 (Invitrogen), seguido de anticorpos marcados com fluorocromo para marcadores de células T de superfície (CD3-PerCP-Cy5.5 clone UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 clone SK3 BD Bioscience, CD8Alexa Fluor 700 clone RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 clone HI100 Invitrogen, CD25-BUV737 clone 2A3 BD Bioscience) e foram, então, fixadas e permeabilizadas com o Kit de Tampão de Coloração eBioscience™ Foxp3 / Fator de Transcrição (Invitrogen) antes da coloração para GrB intracelular e FoxP3 intranuclear (Granzima B-PE clone GB11 BD Bioscience, FoxP3APC clone 236A/E7). As amostras foram adquiridas no Citômetro de Fluxo Fortessa LSR X20 (BD Bioscience) e analisadas utilizando o software BD FACSDIVA. Os dupletos foram excluídos utilizando FCS-H versus FCS-A, e os linfócitos foram definidos utilizando parâmetros SSC-A versus FCS-A. Os subconjuntos de células T CD4⁺ e CD8⁺ acoplados de linfócitos CD3+ vivos foram avaliados usando um gráfico GrB-PE-A versus proliferação de eFluor450-A. Os resultados foram apresentados como porcentagem

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126/155 de proliferação de células GrB positivas de toda a população de células T CD4⁺. Os gráficos e a análise estatística foram realizados utilizando o GraphPad Prism v7. Os resultados são mostrados na Figura 18.

Ensaio de ADCC in vitro:

[0286] Ensaios de citotoxicidade mediados por células e dependentes de anticorpo (ensaios ADCC) foram realizados para a caracterização de anticorpos CD25 antihumanos utilizando linhagens celulares humanas SU-DHL-1 ou SR786 (CD25 positivo) como células-alvo e com células NK humanas como a fonte de células efetoras. As células NK foram isoladas a partir de PBMCs de doadores saudáveis utilizando o kit de isolamento de células NK negativas (Stemcell Technologies). As células NK foram cultivadas de um dia para o outro na presença de 2 ng/mL de IL-2 (Peprotech). As células-alvo SU-DHL-1 ou SR-786 foram carregadas com Calceína-AM (Thermofisher) e colocadas em placas, 4 replicatas por condição, na presença de anticorpos anti-CD25 ou isótipo por 30 minutos a 37 °C e CO2 5%. Após a incubação, as células NK foram adicionadas aos poços em uma razão entre células Alvo:Efetoras (T:E) de 1:10 (10.000 células-alvo e 100.000 células efetoras) e incubadas por 4 horas a 37 °C e CO2 5%. A leitura da fluorescência de calceína no sobrenadante foi realizada em uma leitora de placas BMG Fluostar. 0 percentual de lise específica foi calculado em relação à células-alvo isoladamente (0% de lise) e célulasalvo tratadas com Saponina 0,1% (100% de lise). Os gráficos dos dados brutos foram produzidos utilizando GraphPad Prism v7 para gerar curvas de resposta à dose. O percentual de lise celular alvo foi plotado em um gráfico XY, gerando o gráfico de liberação percentual de Calceína AM normalizada em função

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127/155 do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 foi calculada. Os resultados são mostrados na Figura 19.

Ensaio ADCP de in vitro:

[0287] Ensaios de fagocitose mediados por células e dependentes de anticorpo (ADCP) foram realizados utilizando Tregs diferenciadas in vitro como células-alvo e macrófagos derivados de monócito como as células efetoras. PBMCs foram isolados dos clones de leucócitos por centrifugação em gradiente Ficoll. Os monócitos (células CD14+) foram isolados utilizando Microesferas CD14 (Miltenyi Biotec). Os monócitos foram cultivados por 5 dias na presença de 50 ng/mL de M-CSF em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo FBS 10% (Sigma), LGlutamina 2 mM (Life Technologies) e 10.000 U/mL de Pen-Strep (Sigma), meio fresco contendo M-CSF é adicionado após 3 dias. Células T regulatórias (Treg) foram isoladas utilizando o Kit de Diferenciação de Células Treg Humanas (R&D Systems). Essas células foram incubadas em uma incubadora umidificada a 37 °C e CO2 5% por 5 dias e marcadas com corante eFluor450 (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante. No dia 5, os macrófagos e as Tregs marcadas com corante eFluor450 são co-cultivadas por 4 horas em uma razão entre células efetoras e células-alvo de 10:1 na presença de anticorpos antiCD25 ou controles, conforme descrito a seguir. As células-alvo (Treg) foram adicionadas na quantidade de 1 x 10⁴ células/poço, ao passo que as células efetoras (macrófagos) foram adicionadas na quantidade de 1 x 10⁵ células/poço, para uma razão entre células efetoras e células-alvo de 10:1. Os anticorpos antiCD25 foram, então, adicionados a uma concentração máxima de 1 pg/mL, seguidos de uma série de log (7 pontos) em duplicatas.

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128/155

As células e anticorpos foram incubadas por 4 horas a 37 °C com 5% CO2 · Para avaliar o ADCP, as células foram colocadas em gelo, coradas com o marcador de superfície celular CD14 (CD14PerCP-Cy5.5 clone MfP9 BD Biosciences) e fixadas com o tampão de fixação eBioscience. Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada utilizando o Fortessa LSR X20. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14~. Os macrófagos foram definidos como CD14+. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de células-alvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 χ [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)]. Os resultados são mostrados na Figura 20.

Estatística:

[0288] O software Prism (GraphPad) foi utilizado para realizar uma adaptação de curva para determinar os valores de EC50 e a atividade máxima.

Os anticorpos humanos não bloqueiam a interação entre IL2-CD25 [0289] A interferência com ligação por ligante IL2 a CD25 foi realizada em um sistema Forte Bio Octet Red384 (Pali Forte Bio Corp., EUA) utilizando um ensaio padrão de classificação em sanduíche. O anticorpo MA251 foi carregado em sensores AHQ e os sítios de ligação Fc não ocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgGl humano não relevante. Os sensores foram expostos a CD25 humana 100 nM, seguidos de IL-2 humana 100 nM. Os dados foram processados utilizando Software de Análise de Dados Forte Bio 7.0. A ligação adicional por IL2 humana após a associação de antígeno indica um epitopo

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129/155 não ocupado (não competidor) , enquanto a ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competidor).

Resultados:

[0290] O anticorpo 7G7B6 foi avaliado ainda em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar células alvo que expressam CD25. No ensaio STAT5, 7G7B6 não bloqueou a sinalização de IL2 independente das concentrações de IL-2 testadas, ao passo que a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo de referência Daclizumabe (Figura 17). Daclizumabe, o qual demonstrou bloquear a interação de CD25 com IL-2 por meio do assim denominado epitopo Tac (Queen C et al., 1989, PNAS. 86(24):10029-10033, and Bielekova B, 2013, Neurotherapeutics, 10(1):55-67) se liga a um epitopo diferente de 7G7B6 (Figura 10 e Figura 24B), o que pode explicar a razão de Daclizumabe bloquear a sinalização de IL-2 e o 7G7B6 não bloquear a sinalização de IL-2 no ensaio de fosforilação de STAT5 (Figura 17). Adicionalmente, Daclizumabe reduz as respostas efetora de células T ativadas, provavelmente devido ao seu bloqueio da sinalização de IL-2, ao passo que 7G7B6, que não bloqueia a sinalização de IL-2, não tem um impacto negativo sobre as respostas de células T (Figura 18). Por fim, o anticorpo quimérico 7G7B6 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 19) e ADCP (Figura 20) quando em comparação com o anticorpo de isótipo de IgGl.

[0291] Concluindo, 7G7B6 como um anticorpo quimérico foi caracterizado e demonstra uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente,

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130/155 não inibe respostas efetoras T. 7G7B6 é, portanto, um anticorpo de depleção de Treg que podería ser aplicado para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

[0292] O anticorpo MA-251 foi avaliado ainda em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2. O anticorpo MA251 foi avaliado no ensaio de competição de IL2-CD25 Octet. A ligação simultânea de IL2 e ligação de MA251 com CD25 oram observadas (Figura 23), mostrando que o MA251 se liga de forma não competitiva. No ensaio STAT5, MA251 não bloqueou a sinalização de IL-2 independente das concentrações de IL-2 testadas, ao passo que a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo de referência Daclizumabe (Figura 22) . O daclizumabe, que demonstrou bloquear a interação de CD25 com IL-2 por meio do assim chamado epitopo Tac (Queen C et al, 1989 and Bielekova B, 2013) se liga a um epitopo diferente do MA-251 (Figura 10 e Figura 24 (E) ) , o que pode explicar porque o Daclizumabe bloqueia a sinalização de IL-2 e porque MA-251 não bloqueia a sinalização de IL-2 no ensaio de fosforilação STAT5 (Figura 22).

Exemplo 8: Ensaio de Competição Ab CD25 anti-humana [0293] As competições de anticorpo foram realizadas em um sistema Forte Bio Octet Red96 (Pali Forte Bio Corp., EUA) usando um ensaio de ligação sequencial padrão. 26,8 nM de CD25 humana recombinante marcada em his foi carregada nos Biossensores de Ni-NTA por 200 s. Após a etapa de linhagem basal no tampão cinético, os sensores foram expostos a 66,6 nM do primeiro anticorpo por 600 s ou 1800 s seguido de um segundo anticorpo anti-CD25 (também a 66, 6 nM por 600 s ou 1800 s) . Os dados foram processados utilizando Software de Análise de Dados Forte Bio 9.0. A ligação adicional

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131/155 por um Segundo anticorpo indica um epitopo não ocupado (sem competição para o epitopo), enquanto ausência de ligação indica bloqueio de epitopo (competição para o epitopo).

Resultados [0294] Os não bloqueadores de sinal de IL-2 mAbs (Anticorpo 1 e Anticorpo 3) competem entre si ou com 7G7B6 e MA251, enquanto não competem com Daclizumabe de pesquisa ou Basiliximabe de pesquisa (exemplos (A) a (N), Figura 24). Os bloqueadores de sinalização de IL-2 (ou seja, TSK031) competem com o Daclizumabe de pesquisa e Basiliximabe de pesquisa e não competem com 7G7B6 (exemplos (O) a (Q), Figura 24).

Exemplo 9: Análise terapêutica de um anticorpo sem bloqueio [0295] No dia 0, 1 x 10⁷ células SU-DHL-1 em 200 μΐ de RPMI 1640 foram implantadas no flanco direito. No dia 12, os camundongos com tumores palpáveis foram randomizados em qualquer tratamento com o veiculo ou o Anticorpo 1 a 2 mg/kg, duas vezes por semana. No dia 15, os camundongos com um tamanho tumoral de 100 a 200 mm³ foram randomizados e administrados com outro veiculo, Anticorpo 1 a 2 mg/kg, duas vezes por semana ou uma dose única de anticorpo 1 a 10 mg/kg.

Resultados [0296] O anticorpo 1 preveniu crescimento em 9/10 camundongos com tumores palpáveis na dose de 2 mg/kg, duas vezes por semana (Figura 25 (A) a (B)). Nos camundongos com um tamanho tumoral de 100 a 200 mm³, o Anticorpo 1 também preveniu o crescimento tumoral nas doses de 2 mg/kg, duas vezes por semana e 10 mg/kg de dose única (Figura 25 (C) a (E)).

Exemplo 10: Medições de afinidade de anticorpos CD25 anti-humano

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132/155 [0297]

A afinidade para os anticorpos anti-CD25 humano foi determinada pela medição de sua Kd por SPR em um Biacore 2000 usando um chip de sensor CM-5 com uma temperatura ambiente de experimento de 25 °C. O anticorpo anti-humano foi inicialmente imobilizado entre todas as células de fluxo em tampão de análise (pH 7,4, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tween 20) a uma umidade relativa entre 12.000 a 14.000 em 10 minutos. O ligante (artigos de teste de anticorpo) foi carregado subsequencialmente até um nível de captura entre 145-190 RU. O analito (CD25 recombinante humano marcado em his) foi então associado em tampão de análise a partir de uma diluição de 2 vezes com início a 400 nM com a menor concentração de 3,13 nM por 6 minutos. A dissociação foi realizada em tampão de análise durante 10 minutos. As etapas de regeneração entre as concentrações de amostra foram realizadas em Glicina 10 mM em pH 1,7 por 10 minutos. Uma vazão de 25 μΐ/min foi mantida durante todo o processo. Os dados cinéticos foram adaptados usando um software de análise de alteração conformacional de reação de dois estados globais provido pela Biacore com subtração de referência para as Figura 26 (C) e Figura 26(D). Um modelo Langmuir de 1:1 com subtração de referência foi usado para as Figura 26 (A), Figura 26 (B) e Figura 26 (E).

[0298]

As medições de afinidade ForteBio foram realizadas em um Octet RED384 geralmente conforme anteriormente descrito (vide, por exemplo, Estep P et al., 2013. Mabs. 5(2), 270-8).

[0299]

Alternativamente, a afinidade para os anticorpos CD25 anti-humana foi determinada ao medir sua Kd por interferometria de biocamada no sistema Octet Red 96 (Pali Forte Bio Corp., EUA). Os sensores foram equilibrados offline

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133/155 em tampão cinético por 10 minutos e então monitorados online por 60 segundos para estabelecimento basal. 13,32 nM de anticorpo foram carregados no biosensor AHC por 200 s seguido de concentrações variáveis de rhCD25 marcado em his (1: 3 diluições em série, a partir de 50 nM a 0,54 nM) por 600 s e deixados dissociar em tampão cinético por 400 s. Os dados cinéticos foram adaptados usando um software de análise global 1:1 provido por Pali Forte Bio com subtração de referência. Os resultados são mostrados na Figura 26 (F).

Resultados:

[0300] Os resultados são mostrados na Figura 26. Os valores de Kd que foram estabelecidos neste ensaio para os anticorpos anti-CD25 são os seguintes: para o Anticorpo 1, 3,2 x 10~⁹ M; para o Anticorpo 3, 3,8 x 10~⁹ Me para Daclizumabe 0, 61 x IO-⁹ M.

Exemplo 11: Caracterização de anticorpos anti-CD25 - Anticorpo 1 para Anticorpo 21

Ligação de anticorpos anti-CD25 para células que expressam CD25:

[0301] Os sucessos de candidato são avaliados por ligação a linhagens celulares humanas de linfoma como células Karpas 299, SU-DHL-1 e SR-786, células Treg diferenciadas in vitro, PBMC ativado humano ou de Cynomolgus, a linhagem de células T de macaco Cynomolgus HSC-F e as células CHO.

[	0302]	A ligação a CD25 que expressa	linhagens
celulares	humanas	(SU-DHL-1 e SR-786) foi	examinada
primeiramente blo	queando-se as células com	Trustain
(Biolegend)	antes	da incubação com anticorpos	anti-CD25

titulados em uma série de diluição semi-log a partir de uma concentração máxima de 20 pg/mL, por 30 minutos a 4 °C antes

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134/155 de serem lavadas e incubadas com anticorpo Fc de IgG antihumana conjugada com PE (Biolegend). As células foram lavadas novamente e ressuspensas em tampão FACS contendo DAPI e adquiridas na Intellicyt iQue. As células vivas foram selecionadas utilizando parâmetros de ESC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A Intensidade Média Geo de células coradas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de Intensidade Média Geo em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 é calculada.

[0303] A ligação a CD25 que expressa células Karpas 299 e Tregs diferenciadas in vitro foi examinada corando-se artigos de teste (anticorpos primários anti-CD25) com 30 mg/mL de anticorpos seguidos por diluição em série semilog (7 pontos) durante 30 minutos em gelo. Isto foi seguido de coloração com um anticorpo secundário (IgG Anti-humano de cabra de fragmento de Fab Alexa Fluor 647-AffiniPure (H+L) ou fragmento Fcy IgG anti-humano de coelhos Alexa Fluor 647Af finiPure F(ab')2 Fragment - (Jackson ImmunoResearch)) concentração de 1 mg/mL por 30 minutos em gelo. Todas as amostras foram coradas em duplicatas. As células vivas foram selecionadas utilizando parâmetros de ESC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A intensidade de fluorescência média (MFI) de células coradas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de MET em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 é calculada.

[0304] A ligação a CD25 que expressa PMBC ativada humana e de macaco Cynomolgus foi examinada corando-se artigos de teste (anticorpos primários anti-CD25) com 20 mg/mL de

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135/155 anticorpos seguidos por diluição em série semi-log (7 pontos) durante 30 minutos em gelo. Este foi seguido pela coloração com um anticorpo secundário (Fog F anti-humano de coelho (ab')2- (Jackson ImmunoResearch)) na concentração de 5 mg/mL por 30 minutos em gelo. Todas as amostras foram coradas em triplicatas. Para minimizar a morte celular induzida por reticulação mediada pela ligação do anticorpo secundário, as linhagens celulares foram analisadas em coortes de coloração de 4 artigos de teste por vez. Linfócitos vivos foram classificados utilizando parâmetros de FSC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A intensidade de fluorescência média (MFI) de células T CD4+ e CD8+ classificadas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de MFI em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 foi calculada.

[0305] A ligação a CD25 que expressa a linhagem de células T HSC-F de macaco Cynomolgus foi examinada corandose artigos de teste (anticorpos primários anti-CD25) com 20 mg/mL de anticorpos seguidos por diluição em série semi-log (7 pontos) durante 30 minutos em gelo. Este foi seguido pela coloração com um anticorpo secundário (Fog F anti-humano de coelho (ab')2- (Jackson ImmunoResearch)) na concentração de 5 mg/mL por 30 minutos em gelo. Todas as amostras foram coradas em triplicatas. Para minimizar a morte celular induzida por reticulação mediada pela ligação do anticorpo secundário, as linhagens celulares foram analisadas em coortes de coloração de 4 artigos de teste por vez. Linfócitos vivos foram classificados utilizando parâmetros de FSC vs SSC por citometria de fluxo durante a aquisição da amostra. A

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136/155 intensidade de fluorescência média (MFI) de células vivas foi plotada em um gráfico XY, gerando o gráfico de MFI em função do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 foi calculada.

[0306] Também foi examinada a ligação a CD25 que expressa células CHO. Aproximadamente 100.000 células que superexpressam o antígeno foram lavadas com tampão para lavagem e incubadas com 100 μΐ de 100 nM IgG por 15 minutos em temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com tampão para lavagem e incubadas com 100 μΐ de 1:100 HumanoPE por 15 minutos em gelo. As células foram então lavadas duas vezes com tampão para lavagem e analisadas em um analisador FACS Canto II (BD Biosciences.) Uma linhagem de células CHO não modificadas também foi usada como controle negativo.

Sinalização in vitro de IL-2 por ensaio de fosforilação de STAT5:

[0307] O bloqueio de IL-2 foi caracterizado utilizando-se um ensaio de fosforilação STAT5 no qual a sinalização de IL-2 foi examinada. PBMC anteriormente congelado (Stemcell Technologies) foi cultivado em placas de 96 poços de fundo em U na presença de 10 pg/mL de anticorpos anti-CD25 por 30 minutos antes da adição de IL-2 (Peprotech) em concentrações variáveis de 10 U/mL ou 0,25 U/mL, 0,74 U/mL, 2,22 U/mL, 6,66 U/mL ou 20 U/mL por 10 minutos em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo 10% FBS (Sigma), 2 mM L-Glutamina (Life Technologies) e 10.000 U/mL de Pen-Strep (Sigma). A fosforilação de STAT5 induzida por IL-2 foi interrompida quando as células foram fixadas e permeabilizadas com o Kit de Tampão de Coloração eBioscience™ Foxp3 / Fator de Transcrição (Invitrogen) e tratadas com o Tampão ITT BD Phosflow Perm (BD

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Biosciences). As células foram, então, simultaneamente coradas com anticorpos de superfície e intracelulares marcados com fluorocromo (STAT5-Alexa Fluor 647 clone 47/stat5/pY694 BD Bioscience, CD3-PerCP-Cy5.5 clone UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 clone SK3 BD Bioscience, CD8-Alexa Fluor 700 clone RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 clone HI100 Invitrogen, FoxP3-Alexa Fluor 488 clone 236A/E7 Invitrogen) e as amostras foram adquiridas no Citômetro de Fluxo Fortessa LSR X20 (BD Bioscience) e analisadas utilizando o software BD FACSDIVA. Os dupletos foram excluídos utilizando FCS-H versus FCS-A, e os linfócitos foram definidos utilizando parâmetros SSC-A versus FCS-A. As células T de CD3+ foram definidas utilizando um gráfico de CD3 PerCP-Cy5.5-A versus FCS-A e um gate foi desenhado em um histograma mostrando a contagem versus STAT5 Alexa Fluor 647-A para determinar a população de células T STAT5+CD3+. O percentual de bloqueio da sinalização de IL-2 foi calculado como segue: % de bloqueio = 100 x [(% células Stat5+ Sem grupo Ab - % de células Stat5+ 10 ug/mL de grupo Ab) / (% células Stat5+ Sem grupo Ab)]. A análise adicional de fosforilação de STAT5 por diferentes subconjuntos de células T (CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺FoxP3+, células sem tratamento e células T de memória) também deveria ser avaliada pela acoplagem nos respectivos subconjuntos e analisada como acima. Os gráficos e a análise estatística foram realizados utilizando o GraphPad Prism v7.

Ensaio de ativação de células T in vitro:

[0308] O impacto da sinalização de IL-2 sobre as respostas Teff foram caracterizadas em um ensaio de ativação de células T, em que a regulação ascendente e a proliferação da granzima B intracelular (GrB) foram analisadas. Células T

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Pan humanas primárias previamente congeladas (Stemcell Technologies) foram marcadas com corante de proliferação celular eFluor450 (Invitrogen), de acordo com a recomendação do fabricante, e foram adicionadas a placas de 96 poços com fundo em U tendo 1 x 10⁵ células/poço em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo FBS 10% (Sigma), L-Glutamina 2 mM (Life Technologies) e Pen-Strep 10.000 U/mL (Sigma). As células foram, então, tratadas com 10 pg/mL de anticorpos anti-CD25 ou anticorpos de controle, seguidos de Humano T-Ativador CD3/CD28 (razão de 20:1 entre célula e esfera; Gibco) e incubadas por 72 horas em uma incubadora umidifiçada a 37 °C e CO2 5%. Para avaliar a ativação de células T, as células foram coradas com o Corante de Viabilidade Fixável eBioscience efluor780 (Invitrogen), seguido de anticorpos marcados com fluorocromo para marcadores de células T de superfície (CD3-PerCP-Cy5.5 clone UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 clone SK3 BD Bioscience, CD8Alexa Fluor 700 clone RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 clone HI100 Invitrogen, CD25-BUV737 clone 2A3 BD Bioscience) e foram, então, fixadas e permeabilizadas com o Kit de Tampão de Coloração eBioscience™ Foxp3 / Fator de Transcrição (Invitrogen) antes da coloração para GrB intracelular e FoxP3 intranuclear (Granzima B-PE clone GB11 BD Bioscience, FoxP3APC clone 236A/E7). As amostras foram adquiridas no Citômetro de Fluxo Fortessa LSR X20 (BD Bioscience) e analisadas utilizando o software BD FACSDIVA. Os dupletos foram excluídos utilizando FCS-H versus FCS-A, e os linfócitos foram definidos utilizando parâmetros SSC-A versus FCS-A. Os subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ acoplados de linfócitos CD3+ vivos foram avaliados usando um gráfico de GrB-PE-A versus proliferação de eFluor450-A. Os resultados foram apresentados como porcentagem

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139/155 de proliferação de células GrB positivas de todas as populações de células T CD4+ ou CD8+. Os gráficos e a análise estatística foram realizados utilizando o GraphPad Prism v7.

Ensaio de ADCC in vitro:

[0309] Ensaios de citotoxicidade mediados por células e dependentes de anticorpo (ensaios ADCC) foram realizados para a caracterização de anticorpos CD25 antihumanos utilizando linhagens celulares humanas SU-DHL-1 ou SR786 (CD25 positivo) como células-alvo e com células NK humanas como a fonte de células efetoras. As células NK foram isoladas a partir de PBMCs de doadores saudáveis utilizando o kit de isolamento de células NK negativas (Stemcell Technologies). As células NK foram cultivadas de um dia para o outro na presença de 2 ng/mL de IL-2 (Peprotech). As células-alvo SU-DHL-1 ou SR-786 foram carregadas com Calceína-AM (Thermofisher) e colocadas em placas, 4 replicatas por condição, na presença de anticorpos anti-CD25 ou isótipo por 30 minutos a 37 °C e CO2 5%. Após a incubação, as células NK foram adicionadas aos poços em uma razão entre células Alvo:Efetoras (T:E) de 1:10 (10.000 células-alvo e 100.000 células efetoras) e incubadas por 4 horas a 37 °C e CO2 5%. A leitura da fluorescência de calceína no sobrenadante foi realizada em uma leitora de placas BMG Fluostar. 0 percentual de lise específica foi calculado em relação à células-alvo isoladamente (0% de lise) e célulasalvo tratadas com Saponina 0,1% (100% de lise). Os gráficos dos dados brutos foram produzidos utilizando GraphPad Prism v7 para gerar curvas de resposta à dose. O percentual de lise celular alvo foi plotado em um gráfico XY, gerando o gráfico de liberação percentual de Calceína AM normalizada em função

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140/155 do log da concentração, e os dados foram adaptados a uma curva de regressão não linear a partir da qual a EC50 foi calculada.

[0310] ADDC também foi determinada em um ensaio de sistema relator de luciferase. Células SR786 que expressam CD25, aqui denominadas células alvo (T), são incubadas por 20 minutos a 37 °C com diferentes concentrações de mAbs contra CD25 (ou IgG controle) em um meio suplementado com FBS de IgG baixo (4% FBS em RPMI) . As células efetoras (E) de ADCC são então adicionadas à mistura de células-mAbs a uma proporção E:T de 1:1. As células efetoras são células Jurkat estavelmente transfectadas com sistema relator de luciferase e que superexpressam CD16/FcgammaRIIIA (Promega). Após incubação durante a noite a 37 °C, as células são lisadas e a atividade de luciferase é medida por meio de uma liberação de luminescência a partir da hidrólise de um substrato de luciferase especifico, seguindo instrução do fabricante (protocolo Promega Bio-Glow).

O ensaio de ADCP in vitro usando macrofagos diferenciados in vitro e células Treg:

[0311] Ensaios de fagocitose mediados por células e dependentes de anticorpo (ADCP) foram realizados utilizando Tregs diferenciadas in vitro como células-alvo e macrófagos derivados de monócito como as células efetoras. PBMCs foram isolados dos clones de leucócitos por centrifugação em gradiente Ficoll. Os monócitos (células CD14+) foram isolados utilizando Microesferas CD14 (Miltenyi Biotec). Os monócitos foram cultivados por 5 dias na presença de 50 ng/mL de M-CSF em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo FBS 10% (Sigma), LGlutamina 2 mM (Life Technologies) e 10.000 U/mL de Pen-Strep (Sigma), meio fresco contendo M-CSF é adicionado após 3 dias.

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141/155

Células T regulatórias (Treg) foram isoladas utilizando o Kit de Diferenciação de Células Treg Humanas (R&D Systems). Essas células foram incubadas em uma incubadora umidificada a 37 °C e CO2 5% por 5 dias e marcadas com corante eFluor450 (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante. No dia 5, os macrófagos e as Tregs marcadas com corante eFluor450 são co-cultivadas por 4 horas em uma razão entre células efetoras e células-alvo de 10:1 na presença de anticorpos antiCD25 ou controles, conforme descrito a seguir. As células-alvo (Treg) foram adicionadas na quantidade de 1 x 10⁴ células/poço, ao passo que as células efetoras (macrófagos) foram adicionadas na quantidade de 1 x 10⁵ células/poço, para uma razão entre células efetoras e células-alvo de 10:1. Os anticorpos antiCD25 foram, então, adicionados a uma concentração máxima de 1 pg/mL, seguidos de uma série de log (7 pontos) em duplicatas. As células e anticorpos foram incubados por 4 horas a 37 °C em 5% CO2 · Para avaliar o ADCP, as células foram colocadas em gelo, coradas com o marcador de superfície celular CD14 (CD14PerCP-Cy5.5 clone MfP9 BD Biosciences) e fixadas com o tampão de fixação eBioscience. Uma análise por citometria de fluxo bicolor foi realizada utilizando o Fortessa LSR X20. As células-alvo residuais foram definidas como células que eram eFluor450-corante⁺/CD14-. Os macrófagos foram definidos como CD14+. Considerou-se que as células marcadas duplamente (eFluor450-corante+/CD14+) representavam fagocitose de alvos por macrófagos. A fagocitose de células-alvo foi calculada com a seguinte equação: % de Fagocitose = 100 χ [(percentual duplo positivo)/(percentual duplo positivo + percentual de alvos residuais)].

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142/155 ensaio de ADCP in vitro usando ensaio Relator FcyRIIa-H [0312] As células efetoras do bioensaio de ADCP (FcyRlla-H) foram obtidas a partir de Promega (Cat. No. G9881/5; Lote no 0000261099) . 5.000 células/poço de células alvo SUDHL-1 foram laminadas (25 μΐ/poço) usando uma placa de poliestireno branco de 96 poços (Costar; Cat. No. 3917) . Os anticorpos de teste foram diluídos em série usando diluições de 3 vezes e 25 μΐ adicionados às células. 50.000 células efetoras foram adicionadas por poço em 25 μΐ de volume para resultar em uma proporção de 10:1 de células efetoras e células alvo. Todas as células alvo, anticorpos e célula efetoras foram laminadas usando meio de cultura celular. A placa foi incubada por 18 horas a 37 °C. As placas foram então removidas da incubadora e mantidas em temperatura ambiente por 20 minutos. Adicionaram-se 60 μΐ de tampão de substrato de ensaio de Luciferase Bio-Gio a cada poço seguido de 30 minutos de incubação e a Luminescência foi medida usando o Sistema de Detecção GloMax Multi (Promega).

Estatística:

[0313] O software Prism (GraphPad) foi utilizado para realizar uma adaptação de curva para determinar os valores de EC50 e a atividade máxima.

Resultados [0314] O Anticorpo 1 foi avaliado em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar células alvo que expressam CD25. Os resultados da ligação a rhCD25 e da análise competitiva de ligação a IL-2 são mostrados nas Figuras 27 e 28. O ensaio de ligação do ligante utilizando o Octet demonstrou que o

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Anticorpo 1 não afeta a ligação de IL-2 a CD25 (Figura 29) . Foi confirmado no ensaio STAT5 onde o Anticorpo 1 não bloqueou a sinalização de IL-2 independente das concentrações de IL-2 testadas, ao passo que a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo de referência Daclizumabe (Figura 31) . 0 daclizumabe, que demonstrou bloquear a interação de CD25 com IL-2 por meio do assim chamado epitopo Tac (Queen C et al, 1989 and Bielekova B, 2013) se liga a um epitopo diferente do Anticorpo 1 (Figura 30), o que pode explicar porque o Daclizumabe bloqueia a sinalização de IL-2 e porque o anticorpo 1 não bloqueia a sinalização de IL-2 no ensaio de fosforilação STAT5 (Figura 31) . Adicionalmente, Daclizumabe reduz as respostas efetoras de células T ativadas, provavelmente devido ao seu bloqueio da sinalização de IL-2, ao passo que o Anticorpo 1, que não bloqueia a sinalização de IL-2, não tem um impacto negativo sobre as respostas de células T (Figura 32) . Por fim, o Anticorpo 1 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 33) e ADCP (Figura 34) quando em comparação com o anticorpo de isótipo de IgGl.

[0315] Concluindo, o Anticorpo 1 foi caracterizado e demonstra uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. O Anticorpo 1 é, portanto, um anticorpo de depleção de Treg que podería ser aplicado para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

[0316] O Anticorpo 3 foi avaliado em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar células alvo que expressam CD25. Os

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144/155 resultados da ligação a rhCD25 e da análise competitiva de ligação a IL-2 são mostrados nas Figuras 35 e 36. 0 ensaio de ligação do ligante utilizando o Octet demonstrou que o Anticorpo 3 não afeta a ligação de IL-2 a CD25 (Figura 37) . Foi confirmado no ensaio STAT5 onde o Anticorpo 3 não bloqueou a sinalização de IL-2 independente das concentrações de IL-2 testadas, ao passo que a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo de referência Daclizumabe (Figura 39) . 0 daclizumabe, que demonstrou bloquear a interação de CD25 com IL-2 por meio do assim chamado epitopo Tac, se liga a um epitopo diferente do Anticorpo 3 (Figura 38), o que pode explicar porque o Daclizumabe bloqueia a sinalização de IL-2 e porque o anticorpo 3 não bloqueia a sinalização de IL-2 no ensaio de fosforilação STAT5 (Figura 39). Além disso, Daclizumabe reduz as respostas efetoras de células T ativadas, provavelmente devido ao seu bloqueio da sinalização de IL-2, enquanto o Anticorpo 3, que não bloqueia a sinalização de IL2, possui apenas impacto mínimo, caso haja, nas respostas das células T em comparação à condição sem anticorpo ou com controle de isótipo (Figura 40). Por fim, o Anticorpo 3 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 41) e ADCP (Figura 42) quando em comparação com o anticorpo de isótipo de IgGl.

[0317] Concluindo, o Anticorpo 3 foi caracterizado e demonstra uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. O Anticorpo 3 é, portanto, um anticorpo de depleção de Treg que podería ser aplicado para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

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145/155 [0318] O Anticorpo 4 foi avaliado em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar as células alvo que expressam CD25. Os resultados da ligação a rhCD25 e da análise competitiva de ligação a IL-2 são mostrados nas Figuras 43 e 44. O ensaio de ligação do ligante utilizando o Octet demonstrou que o Anticorpo 4 não afeta a ligação de IL-2 a CD25 (Figura 45) . Foi confirmado no ensaio STAT5 onde o Anticorpo 4 não bloqueou a sinalização de IL-2 independente das concentrações de IL-2 testadas, ao passo que a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo de referência Daclizumabe (Figura 47) . O daclizumabe, que demonstrou bloquear a interação de CD25 com IL-2 por meio do assim chamado epitopo Tac, se liga a um epitopo diferente do Anticorpo 4 (Figura 46), o que pode explicar porque o Daclizumabe bloqueia a sinalização de IL-2 e porque o anticorpo 4 não bloqueia a sinalização de IL-2 no ensaio de fosforilação STAT5 (Figura 47) . Adicionalmente, Daclizumabe reduz as respostas efetoras de células T ativadas, provavelmente devido ao seu bloqueio da sinalização de IL-2, ao passo que o Anticorpo 4, que não bloqueia a sinalização de IL-2, não tem um impacto negativo sobre as respostas de células T (Figura 48) . Por fim, o Anticorpo 4 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 49) e ADCP (Figura 50) quando em comparação com o anticorpo de isótipo de IgGl.

[0319] Concluindo, o Anticorpo 4 foi caracterizado e demonstra uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. O Anticorpo 4 é, portanto, um anticorpo

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146/155 de depleção de Treg que podería ser aplicado para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

[0320] O Anticorpo 2 foi avaliado em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar células alvo que expressam CD25. Os resultados da ligação a rhCD25 e da análise competitiva de ligação a IL-2 são mostrados nas Figuras 51 e 52. O ensaio de ligação do ligante utilizando o Octet demonstrou que o Anticorpo 2 não afeta a ligação de IL-2 a CD25 (Figura 53) . Foi confirmado no ensaio STAT5 onde o Anticorpo 2 não bloqueou a sinalização de IL-2 independente das concentrações de IL-2 testadas, ao passo que a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo de referência Daclizumabe (Figura 55) . O daclizumabe, que demonstrou bloquear a interação de CD25 com IL-2 por meio do assim chamado epitopo Tac, se liga a um epitopo diferente do Anticorpo 2 (Figura 54), o que pode explicar porque o Daclizumabe bloqueia a sinalização de IL-2 e porque o anticorpo 2 não bloqueia a sinalização de IL-2 no ensaio de fosforilação STAT5 (Figura 55). Por fim, o Anticorpo 2 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 56) e ADCP (Figura 57) quando em comparação com o anticorpo de isótipo de IgGl.

[0321] Concluindo, o Anticorpo 2 foi caracterizado e demonstra uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. O Anticorpo 2 é, portanto, um anticorpo de depleção de Treg que podería ser aplicado para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

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147/155 [0322] O Anticorpo 5 é caracterizado como compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de:

EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTLDSYGVSWVRQAPGKGLEWVGVT SSGGSAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRYVYTGGYLYHYGM DLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10) e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLAWYQQKPGKVPKLLIYAA STLPFGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQGTYDSSDWYWAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:14).

[0323] As sequências das regiões determinantes de complementaridade (CDRs; a saber, CDR1, CDR2, e CDR3), como indicado acima, e as regiões de estrutura (FRs) foram definidas de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

[0324] O Anticorpo 5 foi avaliado em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar as células alvo que expressam CD25. Os resultados da ligação a rhCD25 são mostrados nas Figuras 58. O ensaio STAT5 mostrou que o Anticorpo 5 não bloqueia a sinalização IL-2 testada, enquanto a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo Daclizumabe (Figura 59) . O ensaio de competição mostrou que o Anticorpo 5 não compete com os bloqueadores de sinal de IL-2 Daclizumabe ou Basiliximabe da Figura 60 (A) e (B) , enquanto compete com 7G7B6 (não bloqueador de IL-2) (Figura 60(C)). Por fim, o Anticorpo 5 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 61) e ADCP (Figura 61) quando em comparação com um anticorpo de controle silencioso de Fc CD25 anti-humana.

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148/155 [0325] Concluindo, o Anticorpo 5 foi caracterizado e demonstra uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. O Anticorpo 5 é, portanto, um anticorpo de depleção de Treg que podería ser aplicado para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

[0326] O Anticorpo 6, o Anticorpo 7, o Anticorpo 8 e o Anticorpo 9 são caracterizados como compreendendo as seguintes sequências:

[0327] O Anticorpo 6 compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQAPRPLIYATS NLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:25).

[0328] O Anticorpo 7 compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência: QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQSPRPLIYATSNLASGIPDRF SGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:26).

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149/155 [0329] O Anticorpo 8 compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24) e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQAPRPLIYATSNLASGIPDRF SGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:25).

[0330] O Anticorpo 9 compreende uma região de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTI NGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDRDYGNSYYYALDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24) e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência:

[0331] As sequências das regiões determinantes de complementaridade (CDRs; a saber, CDR1, CDR2, e CDR3), como indicado acima, e as regiões de estrutura (FRs) foram definidas de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

[0332] Os resultados do mapeamento de epitopo indicou que os Anticorpo 6, Anticorpo 7, Anticorpo 8 e Anticorpo 9 se ligam a CD25 humana na região dos aminoácidos 150 a 163 (YQCVQGYRALHRGP) e aminoácidos 166 a 180 (SVCKMTHGKTRWTQP) da SEQ ID No: 1, e liga sequências de proteína extracelular humana CD25 com um valor de Kd na faixa de 10~⁸ M a 10~¹⁰ M.

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150/155 [0333] O Anticorpo 6, ο Anticorpo 7, ο Anticorpo 8 e ο Anticorpo 9 foram avaliados em relação à sua capacidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilar as células alvo que expressam CD25. Os resultados da ligação a rhCD25 são mostrados nas Figuras 63. O ensaio STAT5 mostrou que os anticorpos não bloqueiam a sinalização IL-2 testada, enquanto a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo Daclizumabe (Figura 65). O ensaio de competição demonstrou que o Anticorpo 7 não compete com os bloqueadores de sinal de IL-2 Daclizumabe ou Basiliximabe, Figura 64 (A) e (B) . Por fim, o Anticorpo 7 elimina células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 66) e ADCP (Figura 67) quando em comparação com um anticorpo de controle silencioso de Fc CD25 anti-humana.

[0334] Concluindo, o Anticorpo 6, o Anticorpo 7, o Anticorpo 8 e o Anticorpo 9 foram caracterizados e demonstram uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. Os anticorpos são, portanto, anticorpos de depleção de Treg que poderíam ser aplicados para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

[0335] O Anticorpo 10, Anticorpo 11, Anticorpo 12, Anticorpo 12, Anticorpo 13, Anticorpo 14, Anticorpo 15, Anticorpo 16, Anticorpo 17, anticorpo 18, Anticorpo 19, Anticorpo 20, Anticorpo 21 são caracterizados como compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de:

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151/155

	Proteína VH	; Proteína VL
AblO	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWI	( EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDF ( TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS (SEQ ID NO:27)	( ^K ( SEQ ID NO:30)
Abll	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWI	S QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDY S TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS (SEQ ID NO:27)	( K ) (SEQ ID NO:31)
Abl2	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWI	( DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGKAPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDY ( TLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS (SEQ ID NO:27)	( K ( (SEQ ID NO:32)
Abl3	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWI	( QIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGKSPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDY S TLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS SEQ ID NO:27)	( K ) (SEQ ID NO:33)
AB14	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWV	( EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KSQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDF ( TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS (SEQ ID NO:28)	( K ( (SEQ ID NO:30)
Abl5	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWV	( QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KSQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDY S TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS (SEQ ID NO:28)	( K ( (SEQ ID NO:31)
Abl6	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWV	( DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWY
	RQP PGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTIS KDNS KSQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ	( QQKPGKAPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDY ( TLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI
	GTLVTVSS	( K

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152/155

	(SEQ ID NO:28) [[ (SEQ ID NO:32)
Abl7	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWV i] QIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWY RQPPGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSAUÍSRVTISKDNS i] QQKPGKSPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDY KSQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWIAYWGQ i] TLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI GTLVTVSS ] K (SEQ ID NO:28) 7 (SEQ ID NO:33)
Abl8	QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWV ii EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWY RQAPGKGLEWSVIWAGGSTNYNSAUÍSRFTISKDNS ii QQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDF KSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ ii TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI GTLVTVSS Ü K (SEQ ID NO:29) [[ (SEQ ID NQ:30)
Abl9	QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWV [[ QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWY RQAPGKGLEWSVIWAGGSTNYNSAUÍSRFTISKDNS i] QQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDY KSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ i] TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI GTLVTVSS i] K (SEQ ID NO:29) 7 (SEQ ID NO:31)
Ab20	QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWV 7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWY RQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNS ii QQKPGKAPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDY KSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ ii TLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI GTLVTVSS Ü K (SEQ ID NO: 29) [[ (SEQ ID NO: 32)
Ab21	QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWV [[ QIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWY RQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNS i] QQKPGKSPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDY KSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQ i] TLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEI GTLVTVSS i] K (SEQ ID NO: 29) i] (SEQ ID NO: 33)

[0336]

As sequências das regiões determinantes de complementaridade (CDRs; a saber, CDR1,

CDR2, e CDR3), como indicado acima e as regiões de estrutura (FRs) foram definidas de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

[0337] Os resultados do mapeamento de epitopo indicaram que

Anticorpo 12,

Anticorpo 16, o Anticorpo 10,

Anticorpo 13,

Anticorpo 17,

Anticorpo 11,

Anticorpo 14, anticorpo 18,

Anticorpo 12

Anticorpo 15

Anticorpo 19

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153/155

Anticorpo 20, Anticorpo 21 se ligam a CD25 humana na região dos aminoácidos 150 a 163 (YQCVQGYRALHRGP) e aminoácidos 166 a 180 (SVCKMTHGKTRWTQP) da SEQ ID No: 1, e liga sequências de proteína extracelular humana CD25 com um valor de Kd na faixa de 10~⁸ M a 10~¹⁰ M.

[0338] Os Anticorpos foram avaliados em relação à sua habilidade de não interferir na sinalização de IL-2 e sua capacidade de aniquilação das células alvo que expressam CD25. Os resultados da ligação a rhCD25 são mostrados nas Figuras 68. O ensaio STAT5 mostrou que os Anticorpos não bloqueiam a sinalização IL-2 testada, enquanto a sinalização de IL-2 foi completamente bloqueada pelo anticorpo Daclizumabe (Figura 70). O ensaio de competição demonstrou que o Anticorpo 19 não compete com os bloqueadores de sinal de IL-2 Daclizumabe ou Basiliximabe, Figura 69 (A) e (B). Por fim, o Anticorpo 12, o Anticorpo 19 e o Anticorpo 20 eliminam células que expressam CD25, células de tumor ou células T regulatórias, por meio de ADCC (Figura 71) e ADCP (Figuras 72 e 73) quando em comparação com um anticorpo de controle silencioso de Fc CD25 anti-humana.

[0339] Concluindo, o Anticorpo 10, Anticorpo 11, Anticorpo 12, Anticorpo 12, Anticorpo 13, Anticorpo 14, Anticorpo 15, Anticorpo 16, Anticorpo 17, Anticorpo 18, Anticorpo 19, Anticorpo 20, Anticorpo 21 foram caracterizados e demonstram uma potente morte de células CD25 positivas (Tregs ou linhagens celulares de câncer) e não interfere na sinalização de IL-2 e, consequentemente, não inibe respostas efetoras T. Os anticorpos são, portanto, anticorpos de depleção de Treg que poderíam ser aplicados para o tratamento de câncer, na forma de monoterapia ou em combinação.

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154/155

Exemplo 12: Análise terapêutica em combinação com a vacina contra o câncer [0340] Determinou-se a atividade terapêutica de um anticorpo anti-CD25 sem bloqueio de IL-2, IgG2a de camundongo 7D4, em combinação com GVAX em um modelo de camundongos resistentes à terapia imunológica B16B16. No dia 0, 50 x 10³ células B16B16 foram implantadas via i.d. No dia 5, 200 pg de anticorpo anti-CD25 sem bloqueio de IL-2 foram administrados via i.p, ou não. Nos dias 6, 9 e 12 os camundongos foram tratados, ou não, com 1 x 10⁶ células B16B16 irradiadas (150 Gy) adjuvantes com GM-CSF (GVAX). O crescimento tumoral e a sobrevida de camundongos foram monitorados até o dia 33. Os resultados são mostrados na Figura 74.

[0341] Um efeito sinérgico foi observado com uma combinação de anticorpo anti-CD25 sem bloqueio GVAX e 7D4 em um modelo B16B16. Portanto, a administração de 7D4 com uma vacina contra o câncer aumentou a resposta antitumoral induzida por vacina. Estes resultados mostram que um anticorpo que esgota anti-CD25 sem bloqueio de IL2 pode ser usado em combinação com as vacinas contra o câncer para o tratamento de câncer em humanos. Além disso, estes dados mostram que um anticorpo que esgota anti-CD25 sem bloqueio de IL2 é capaz de potencializar as respostas imunológicas induzidas por vacina, com aplicações potencialmente mais amplas que o câncer.

[0342] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Diversas modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção ficarão evidentes aos técnicos no assunto, sem se desviar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão às realizações

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155/155 preferidas especificas, deve ser compreendido que a invenção, como reivindicada, não deve ser indevidamente limitada a tais realizações especificas. Na verdade, diversas modificações dos modos descritos para a realização da invenção, as quais são óbvias aos técnicos em biologia molecular, imunologia celular ou campos relacionados, pretendem estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO HUMANO QUE TEM CÂNCER, caracterizado por compreender a etapa de administrar um anticorpo anti-CD25 a um indivíduo, em que o dito indivíduo tem um tumor sólido, em que o dito anticorpo não inibe a ligação de Interleucina-2 (IL-2) a CD25.

2/13 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 competir com o anticorpo 7G7B6 pela ligação à CD25 humana; e/ou competir com o anticorpo MA251 pela ligação à CD25 humana.

3/13 (KEGTMLNCECKRGFR) e os aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR).

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 se ligar ao mesmo epitopo reconhecido pelo anticorpo 7G7B6 e/ou ao epitopo reconhecido pelo anticorpo MA251.

4/13 compreender a sequência de aminoácidos 70-84 da SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTS).

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender um ou mais resíduos de aminoácido compreendidos em uma ou mais das extensões de aminoácidos selecionados entre os aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP) , aminoácidos 166-186 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG) , aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO: 1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 70-88 da SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR).

5/13 (a) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4;

(b) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6;

(c) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14;

(d) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22;

(d) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25;

(e) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 6;

(f) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25;

(g) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a

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5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir de: aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) , aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP) , aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1

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6/13 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 26;

(h) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 30;

(i) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 31;

(j) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 32;

(k) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 33;

(l) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 30;

(m) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 31;

(n) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da ID NO: 32;

SEQ que e a

SEQ

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6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir de: aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) , aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP), aminoácidos 176-186 da SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG), aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO: 1 (SSWDNQCQCTS).

7/13 (o) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33;

(p) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30;

(q) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31;

(r) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e (s) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga especificamente a um epitopo de CD25 humana, em que o epitopo é caracterizado por compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir dos: aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR), aminoácidos 70 a 84 da SEQ ID NO: 1 (NSSHSSWDNQCQCTS) e os aminoácidos 150 a 158 da SEQ ID NO: 1 (YQCVQGYRA).

8/13

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR).

9/13

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e os aminoácidos 150-160 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALH).

10/13 pelo anticorpo ser para administração em combinação com um agente terapêutico adicional.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1

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11/13 qualquer uma das reivindicações 1 a 30, em um meio farmaceuticamente aceitável.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), os aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP), os aminoácidos 42-56 da SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) e os aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR).

12/13

FcgRIII com uma alta afinidade e esgota células T regulatórias infiltrantes no tumor.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) e os aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP).

13/13

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 150-158 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) e os aminoácidos 176-186 da SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG).

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 150-163 da SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP) e os aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP).

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 74-84 da SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por

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17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 176-180 da SEQ ID NO:1 (RWTQP).

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 166-180 da SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP).

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo anti-CD25 se liga a um epitopo caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos 176-186 da SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG).

20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 ser um anticorpo IgGl que se liga a pelo menos um receptor de Fey de ativação selecionado entre FcyR!, FcyRIIc, e/ou FcYRIIIa com alta afinidade, e esgota as células T regulatórias infiltrantes no tumor.

21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25:

(a) se ligar a receptores de Εογ com uma razão ativadora/inibitória (A/I) maior que 1; e/ou (b) se ligar a FcyRI, FcyRIIc, e/ou FcYRIIIa com maior afinidade do que se liga a FcYRIIb.

22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo anticorpo ser selecionado do grupo que consiste em:

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23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 ser um anticorpo IgG2 humano.

24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 ter uma constante de dissociação (Kd) para CD25 menor que 10~ ⁷ M.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 inibir a sinalização de IL-2 em menos que 50%.

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26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 ser um anticorpo monoclonal.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 ser um anticorpo humano, quimérico ou humanizado.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo anticorpo ser uma variante maturada por afinidade destes.

29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo anticorpo ser uma variante humanizada e/ou maturada por afinidade de 7G7B6 ou MA251.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 provocar uma resposta de CDC, ADCC e/ou ADCP intensificada, preferivelmente uma maior resposta de ADCC e/ou ADCP, mais preferivelmente uma maior resposta de ADCC.

31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo anticorpo anti-CD25 ser administrado a um indivíduo que tem um tumor estabelecido.

32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, em que o método é caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de identificar um indivíduo que tem um tumor sólido.

33. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que o dito método é caracterizado por compreender adicionalmente a administração de um inibidor de checkpoint imunológico ao dito indivíduo.

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34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo dito inibidor de checkpoint imunológico ser um antagonista de PD-1.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo dito antagonista de PD-1 ser um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-Ll.

36. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que o dito método é caracterizado por compreender adicionalmente a administração de uma vacina contra o câncer.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pela vacina contra o câncer ser uma vacina GVAX contra o câncer.

38. ANTICORPO ANTI-CD25, caracterizado por ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.

39. ANTICORPO ANTI-CD25, conforme definido na reivindicação 38, caracterizado por se destinar ao uso em medicina.

40. ANTICORPO ANTI-CD25, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado por se destinar ao uso no tratamento de câncer em um indivíduo humano, em que o indivíduo tem um tumor sólido.

41. USO DE UM ANTICORPO ANTI-CD25, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado por se destinar à fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo humano, em que o indivíduo tem um tumor sólido.

42. ANTICORPO ANTI-CD25, para o uso conforme definido na reivindicação 40 ou para o uso de um anticorpo anti-CD25 conforme definido na reivindicação 41, caracterizado

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43. ANTICORPO ANTI-CD25, para o uso conforme definido na reivindicação 42 ou para o uso de um anticorpo anti-CD25 conforme definido na reivindicação 42, caracterizado pelo agente terapêutico adicional ser um inibidor de checkpoint imunológico.

44. ANTICORPO ANTI-CD25, para o uso conforme definido na reivindicação 43 ou para o uso conforme definido na reivindicação 43, caracterizado pelo inibidor de checkpoint imunológico ser um antagonista de PD-1.

45. ANTICORPO ANTI-CD25, para o uso conforme definido na a reivindicação 42 ou para o uso de um anticorpo anti-CD25 conforme definido na reivindicação 41, caracterizado pelo agente terapêutico adicional ser uma vacina contra o câncer.

46. COMBINAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-CD25, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e um agente terapêutico adicional para o uso no tratamento de câncer em um indivíduo humano, caracterizada pelo dito indivíduo ter um tumor sólido e pelo anticorpo anti-CD25 e o agente terapêutico adicional serem administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.

47. KIT PARA O USO NO TRATAMENTO DE CÂNCER, caracterizado por compreender um anticorpo anti-CD25, conforme definido em das reivindicações 1 a 30, e um agente terapêutico adicional.

48. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um anticorpo anti-CD25, conforme definido em

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49. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada por compreender adicionalmente um agente terapêutico adicional.

50. COMBINAÇÃO, para o uso conforme definido na reivindicação 46, o kit conforme definido na reivindicação 47, ou a composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 49, caracterizada pelo agente terapêutico adicional ser um inibidor de checkpoint imunológico.

51. COMBINAÇÃO, para o uso conforme definido na reivindicação 46, o kit conforme definido na reivindicação 47, ou a composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 49, caracterizada pelo inibidor de checkpoint imunológico ser um antagonista de PD-1.

52. COMBINAÇÃO, para o uso conforme definido na reivindicação 46, o kit conforme definido na reivindicação 47, ou a composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 49, caracterizada pelo agente terapêutico adicional ser uma vacina contra o câncer.

53. ANTICORPO BIESPECÍFICO, caracterizado por compreender:

(a) uma primeira porção de ligação a antígeno que se liga a CD25; e (b) uma segunda porção de ligação a antígeno que se liga a uma proteína de checkpoint imunológico;

em que a porção de ligação a CD25 não inibe a ligação de Interleucina-2 (IL-2) a CD25, e preferivelmente o anticorpo biespecífico é um anticorpo IgGl que se liga a pelo menos um receptor de Εογ de ativação selecionado entre FcgRI, FcgRIIa,

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54. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pela proteína de checkpoint imunológico ser selecionada do grupo que consiste em PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, VISTA, TIGIT, TIM3, PD-L1, B7H3, B7H4, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1, GAL9, GITR, 0X40, CD137, e ICOS.

55. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 ou 54, caracterizado pela proteína de checkpoint imunológico ser expressa em uma célula tumoral.

56. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 ou 54, caracterizado pela proteína de checkpoint imunológico ser PD-L1.

57. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pela segunda porção de ligação a antígeno que se liga a PD-L1 ser compreendida em Atezolizumabe.

58. MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER, caracterizado por compreender a etapa de administrar um anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 53 a 57, a um indivíduo.

59. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo indivíduo ter um tumor sólido.

60. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado por se destinar ao uso no tratamento de câncer em um indivíduo.

61. ANTICORPO BIESPECÍFICO, para o uso de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo indivíduo ter um tumor sólido.

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62 . MÉTODO DE DEPLEÇÃO DE CÉLULAS T REGULATÓRIAS EM UM INDIVÍDUO, caracterizado por compreender a etapa de administrar um anticorpo anti-CD25 ao indivíduo, em que o anticorpo é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30. 63 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62,

caracterizado pelo indivíduo ter um tumor sólido.