BR112021005716A2 - anticorpos vsig4 anti-humanos e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS VSIG4 ANTI-HUMANOS E USOS DOS MESMOS. São fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao VSIG4. Vários métodos e composições in vitro e in vivo relacionados a anticorpos. Os métodos incluem prevenção e/ou tratamento terapêutico do câncer utilizando um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao VSIG4.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS VSIG4 ANTI-HUMANOS E USOS DOS MESMOS".

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido é um pedido PCT que reivindica a prioridade e o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/738.255, de- positado em 28 de setembro de 2018, e do Pedido de Patente Provisó- rio dos U.S. No. 62/776.523, depositado em 7 de dezembro de 2018. As divulgações dos pedidos anteriores são incorporadas neste docu- mento por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam ao Domínio V-Set e a Imunoglobulina Contendo 4 (VSIGA4).

ANTECEDENTES

[0003] O câncer continua sendo uma das principais causas de morte no mundo. Estatísticas recentes relatam que 13% da população mundial falecem de câncer. De acordo com estimativas da Internatio- nal Agency for Research on Cancer (IARC), em 2012, ocorreram 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes por câncer em todo o mundo. Até 2030, a carga global deverá crescer para 21,7 milhões de novos casos de câncer e 13 milhões de mortes por câncer devido ao crescimento e envelhecimento da população e exposição a fatores de risco como tabagismo, dieta não saudável e sedentarismo. Além disso, a dor e as despesas médicas para o tratamento de câncer provocam redução da qualidade de vida tanto para os pacientes com câncer quanto suas famílias. É evidente que, acima de tudo, o câncer é uma doença para a qual é necessário encontrar com urgência méto- dos de tratamento aprimorados.

[0004] Os macrófagos são células apresentadoras de antígenos multifuncionais que desempenham um papel central para o nosso sis-

tema imunológico e são relevantes para a biologia do câncer. No con- texto do câncer, os macrófagos associados ao tumor (TAMs) se infil- tram nos tecidos do tumor maligno e são conhecidos por serem rele- vantes para a biologia do câncer e a influência da progressão do tu- mor. Os TAMs podem ser descritos em duas categorias: M1 e M2. Os macrófagos M1 apresentam uma função pró-inflamatória e citotóxica (antitumoral), enquanto que os macrófagos M2 são anti-inflamatórios (pró-tumorais) e promovem a cicatrização de feridas. Consistente com essas funções, os TAMs, especialmente macrófagos com o fenótipo M?2, estão intimamente associados com o pior prognóstico clínico em muitos tipos de tumores malignos. Os próprios TAMs infiltrantes ou a via de polarização dos TAMs são considerados como novos alvos te- rapêuticos para a terapia de tumores malignos.

SUMÁRIO

[0005] A presente invenção refere-se, pelo menos em parte, a an- ticorpos e fragmentos dos mesmos que se ligam ao VSIG4 (Domínio V-Set e a Imunoglobulina Contendo 4; também referido como CRIg ou Z391g) e métodos de uso de tais anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno para tratamento do câncer, indução da secreção de citocinas e/ou quimiocinas em macrófagos e conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1.

[0006] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anti- corpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno inclui: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, uma CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18, uma se- quência de CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19; e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20, uma CDR?2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da

SEQ ID NO: 21, e uma CDR3 de cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.

[0007] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno aqui descrito pode incluir qualquer um de: (a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; (b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoáci- do da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; ou (c) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, e um domínio vari- ável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 12.

[0008] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno aqui descrito pode incluir qualquer um de um domí- nio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de amino- ácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, um domínio variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou um domínio variável de cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.

[0009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno aqui descrito pode incluir uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 23.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno aqui descrito pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode in- cluir um domínio variável de cadeia pesada que compreende a se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável de ca- deia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:

8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que com- preende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode incluir um domínio variável de cadeia pe- sada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode incluir um do- mínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido da SEQ ID NO: 14 e um domínio variável de cadeia leve com- preendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em algu- mas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16 e um do- mínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de amino- ácido da SEQ ID NO: 12.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno aqui descrito possui uma afinidade de ligação (Ko) para uma molécula humana de domínio V-Set e a imunoglobulina con- tendo 4 (VSIG4) de 1 x 107 a 1 x 10º. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito possui uma afinidade de ligação (Ko) para uma molécula de VSIG4 de cerca de 7,156 x 10º a cerca de 7,636 x 10º. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito possui uma afinidade de ligação (Kp) para uma molécula de VSIG4 ao redor de 7,156 x 108, ao redor de 7,636 x 10º, ao redor de 7,952 x 10º, ao redor de 8,226 x 10º ou ao redor de 8,688 x 10º.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos.

[0013] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor recombinante incluindo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Em algumas modalidades, o vetor recombinante aqui descrito contém a molécula de ácido nucleico aqui descrita que está ligada de maneira operável a um promotor. Em algumas modalidades, o vetor recombinante inclui dois vetores separados, cada um compre- endendo a sequência de ácido nucleico correspondente à cadeia pe- sada e à cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido.

[0014] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira incluindo a molécula de ácido nucleico ou o vetor recombi- nante aqui descrito. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de levedura ou uma célula bacte- riana. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula se- lecionada do grupo que consiste em E.coli, P.pastoris, Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 e um linfócito de mamífero. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é a célula Expi293.

[0015] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica incluindo: qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico aqui descritas, qualquer um dos vetores recombinantes aqui descritos ou qualquer uma das células hospedei- ras aqui descritas; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0016] A título de outro exemplo, em outro aspecto, a presente in- venção refere-se a um método de tratamento de um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo as etapas de: (a) administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico aqui descritas, qual- quer um dos vetores recombinantes aqui descritos ou qualquer uma das células hospedeiras aqui descritas, tratando assim uma doença ou uma condição. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir de um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer endometrial, câncer de esôfago, cân- cer de trompa de Falópio, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointes- tinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, me- sotelioma, câncer de ovário, câncer peritoneal primário, câncer de glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireóide, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, glioblastoma e cân- cer de próstata.

[0017] Em algumas modalidades, o indivíduo foi administrado ou será administrado uma ou mais terapias anticâncer adicionais selecio- nadas de radiação ionizante, um agente quimioterápico, um agente de anticorpo e uma terapia baseada em células, de modo que o indivíduo receba tratamento com um e outro. Por exemplo, em algumas modali- dades, uma ou mais terapias anticâncer adicionais podem incluir um inibidor do ponto de controle imunológico, IL-12, GM-CSF, um agente anti-CDA4, cisplatina, fluorouracila, doxorrubicina, irinotecano, paclita- xel, inibidor da indoleamina 2,3 -di oxigenase- 1 (IDO1) ou ciclofosfa- mida.

[0018] Em mais outro aspecto, a presente invenção também refe- re-se a um método para aumentar a secreção de citocinas ou quimio- cinas em macrófagos M2, o método incluindo o contato dos macrófa- gos M2 com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos.

[0019] Em mais outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para induzir a proliferação de células T CD8*, o método inclu- indo: (a) colocar em contato um macrófago M2 com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos; e (b) coincubar o macrófago M2 com células T CD8*.

[0020] Em mais outro aspecto, a presente invenção também refe- re-se a um método de conversão de um macrófago M2 em um macró- fago M1, o método incluindo o contato do macrófago M2 com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descri- tos.

[0021] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados nesta invenção possuem o mesmo signifi- cado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais seme- lhantes ou equivalentes àqueles descritos nesta invenção possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materi- ais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorpo-

radas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se desti- nam a ser limitativos.

[0022] Outras características e vantagens da invenção serão evi- dentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] A FIGURA 1 é um diagrama esquemático que ilustra o me- canismo de como a administração de anticorpo anti-VSIG4 a macrófa- gos resulta na conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1, o que resulta na proliferação de células T CD8* e subsequente supres- são do câncer.

[0024] A FIGURA 2A mostra o alinhamento de sequência de VSIGA4 com várias famílias de proteínas B7 humanas.

[0025] A FIGURA 2B é uma árvore filogênica que mostra a cone- xão evolutiva entre VSIG4 e várias famílias de proteínas B7 humanas.

[0026] As FIGURAS 3A e 3B mostram a correlação da expressão do mRNA de VSIG4 com vários genes no tecido tumoral.

[0027] A FIGURA 4A é um gráfico de HPLC mostrando o perfil de proteína do anticorpo EU103.2.

[0028] A FIGURA 4B são dados de ressonância plasmônica de superfície mostrando a ligação do anticorpo EU103.2 ao VSIGA.

[0029] A FIGURA 5 mostra imagens de microscópio luminoso de macrófagos M1 e M2 (superior esquerdo e superior direito, respecti- vamente) e dados de análise FACS mostrando a expressão de VSIG4 em macrófagos M1 e M2.

[0030] A FIGURA 6 é um conjunto de gráficos que mostra a indu- ção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias em macrófagos M1 e M2 por EU103.2.

[0031] A FIGURA 7 é um conjunto de dados FACS mostrando ex-

pressão diminuída de CD163 em macrófagos M2 tratados com EU103.2.

[0032] A FIGURA 8 é um conjunto de dados FACS (primeiras seis colunas) e quantificação desses dados (última coluna) mostrando a indução da proliferação de células T CD8* quando as células T CD8* foram cocultivadas com macrófagos M2 tratados com EU103.2.

[0033] A FIGURA 9 é um conjunto de dados FACS que mostra a expressão de VSIG4 em macrófagos isolados de fluido abdominal de pacientes com câncer de ovário.

[0034] A FIGURA 10 é um conjunto de dados FACS que mostra a indução da proliferação de células T CD8* quando cocultivadas com macrófagos tratados com EU103.2 isolados de pacientes com câncer de ovário.

[0035] A FIGURA 11 é um gráfico que mostra a indução da prolife- ração de células T CD8* quando cocultivadas com macrófagos trata- dos com anti-EU 103.2 isolados de pacientes com câncer de ovário.

[0036] A FIGURA 12 é um conjunto de imagens de microscópio de macrófagos M1 e M2 mostrando diferenças morfológicas após a con- versão de macrófagos M2 em macrófagos M1 por anticorpo EU103.2.

[0037] A FIGURA 13 é um conjunto de dados FACS mostrando a interação de bloqueio entre células CD8* e VSIG4 aumenta a prolife- ração de células T CD8*.

[0038] As FIGURAS 14A e 14B são um conjunto de gráficos que mostram a proliferação de células CD8* aumentada através do blo- queio da supressão por células THP-1.

[0039] As FIGURAS 15A-15C são conjuntos de gráficos que mos- tram as atividades antitumorais do anticorpo anti-VSIG4 em três mode- los de tumor de camundongo diferentes.

[0040] A FIGURA 16 é um conjunto de gráficos que mostram as atividades antitumorais do anticorpo anti-VSIG4 em um modelo de camundongo nocaute de VSIGA.

[0041] A FIGURA 17A é um conjunto de dados FACS que mostra o status de ativação de células T e MDSCs em TDLNs na ausência de sinalização de VSIGA.

[0042] A FIGURA 17B é um conjunto de gráficos que mostram o status de ativação de células T e MDSCs em TDLNs na ausência de sinalização de VSIGA.

[0043] A FIGURA 17C é um conjunto de gráficos que mostram o status de ativação de células T e MDSCs em TDLNs na ausência de sinalização de VSIGA.

[0044] A FIGURA 17D é um conjunto de gráficos que mostram o status de ativação de células T e MDSCs em TDLNs na ausência de sinalização de VSIGA.

[0045] A FIGURA 18A é um gráfico que mostra a supressão do crescimento do tumor na ausência de sinalização de VSIGA.

[0046] A FIGURA 18B é um conjunto de lâminas histológicas mos- trando a supressão do crescimento do tumor na ausência de sinaliza- ção de VSIGA.

[0047] A FIGURA 19 é um gráfico que mostra as atividades anti- tumorais do anticorpo anti-VSIG4 em modelo de camundongo humani- zado.

[0048] A FIGURA 20 é um diagrama esquemático que ilustra o mecanismo de como a administração do anticorpo EU103.2 a macró- fagos resulta na conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1, o que resulta na proliferação de células T CD8*.

[0049] As FIGURAS 21A e 21B são diagramas esquemáticos que mostram vetores de expressão utilizados para clonar e expressar anti- corpos anti-VSIG4 humanizados.

[0050] A FIGURA 22 é um gráfico de HPLC que mostra o perfil de proteína do anticorpo A1 (EU103 TO01.01).

[0051] A FIGURA 23 é um gráfico de HPLC que mostra o perfil de proteína do anticorpo A2 (EU103 T01.02).

[0052] A FIGURA 24 é um gráfico de HPLC que mostra o perfil de proteína do anticorpo A1.3 (EU103 TO01.01S).

[0053] A FIGURA 25 é um gráfico de HPLC que mostra o perfil de proteína do anticorpo A2.3 (EU103 T01.02S).

[0054] A FIGURA 26A é um conjunto de dados FACS mostrando a expressão diminuída de CD163 em macrófagos M2 tratados com anti- corpos A1 ou A2.

[0055] A FIGURA 26B é um gráfico que mostra a expressão dimi- nuída de CD163 em macrófagos M2 tratados com anticorpos A1 ou A2.

[0056] A FIGURA 27 é um conjunto de gráficos que mostram a di- minuição de citocinas e quimiocinas do tipo M2 em células M2 tratadas com anticorpos A1 ou A2.

[0057] A FIGURA 28 é um conjunto de dados FACS que mostra uma expressão diminuída de CD163 e uma expressão aumentada de CD86 em macrófagos M2 tratados com anticorpos A1 ou A2.

[0058] A FIGURA 29 é um conjunto de gráficos que mostram o aumento da expressão de citocinas/quimiocinas do tipo M1 em macró- fagos M2 tratados com anticorpos A1 ou A2.

[0059] A FIGURA 30 é um gráfico que mostra dados de um ensaio de quimiotaxia que mede a capacidade quimiotática de macrófagos após a conversão de macrófagos M2 em M1 por anticorpos A2.

[0060] As FIGURAS 31A-31C mostram o efeito antitumoral de an- ticorpos A1 e A2 em um modelo de camundongo humanizado.

[0061] As FIGURAS 32A-32C mostram a conversão de macrófa- gos com anticorpos A2 in vivo.

[0062] As FIGURAS 33A e 33B mostram a conversão de macrófa- gos com anticorpos A2 in vivo, através da análise do efeito da conver-

são de M2 em macrófagos M1 sobre o crescimento do tumor.

[0063] As FIGURAS 34A-34E mostram o efeito antitumoral de an- ticorpos A2 em um modelo de camundongo humanizado.

[0064] As FIGURAS 35A-35D mostram o efeito antitumoral dos anticorpos A2 e A2.3 em um modelo de camundongo humanizado.

[0065] As FIGURAS 36A e 36B são um conjunto de dados de um ensaio de cocultura mostrando que as coculturas de anticorpos A1, A1.3, A2 e A2.3 e os macrófagos M2 apresentaram aumento da proli- feração de células T CD8*.

[0066] A FIGURA 37 é um gráfico que mostra os dados de um en- saio de cocultura mostrando que as coculturas de anticorpos A2 e A2.3 com macrófagos M2 apresentaram aumento da proliferação de células T CD8*.

[0067] As FIGURAS 38A e 38B são um conjunto de gráficos que mostram o uso de células HeLa-hVSIG4 de expressão de hVSIG4 pa- ra observar a proliferação de células T CD8* por anticorpos A2 ou A2.3.

[0068] A FIGURA 39 é um gráfico que mostra o uso de matriz de fósforo-cinase humana para observar a via de sinal da conversão de macrófagos por anticorpos A2.

[0069] A FIGURA 40 mostra o alinhamento de sequência de ca- deias pesadas e cadeias leves de anticorpos humanizados EU103.3, A1,A2, A1.3 e A2.:3.

[0070] A FIGURA 41 mostra a geração e caracterização de ca- mundongos VSIG4 K/O.

[0071] A FIGURA 42 é os dados de análise de arranjo gênico que mostram mudanças na expressão gênica após a conversão de macró- fagos M2 em macrófagos M1 por anticorpos A2.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0072] A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que a inibição da interação de VSIG4 com células T CDB8* utilizando certos anticorpos anti-VSIG4 resulta na proliferação de células T CD8*, o que pode levar à supressão do câncer.

[0073] Conforme aqui utilizado, o termo "cerca de", quando utiliza- do nesta invenção em referência a um valor, refere-se a um valor que é semelhante, no contexto do valor referenciado. Em geral, aqueles versados na técnica, familiarizados com o contexto, irão observar o grau relevante de variação englobado por "cerca de" nesse contexto. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo "cerca de" pode abranger uma faixa de valores que está dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, T%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos do valor referido.

[0074] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "administração" tipicamente refere-se à administração de uma composição a um indi- víduo ou sistema para conseguir a liberação de um agente que é ou está incluído na composição. Aqueles versados na técnica estarão ci- entes de uma variedade de vias que podem, em circunstâncias apro- priadas, ser utilizadas para administração a um indivíduo, por exemplo, um ser humano. Por exemplo, em algumas modalidades, a administra- ção pode ser ocular, oral, parenteral, tópica, etc. Em algumas modali- dades particulares, a administração pode ser brônquica (por exemplo, por instilação brônquica), bucal, dérmica (que pode ser ou compreen- der, por exemplo, um ou mais de tópica na derme, intradérmico, inter- dérmica, transdérmica, etc), enteral, intra-arterial, intradérmica, intra- gástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intra- tecal, intravenosa, intraventricular, dentro de um órgão específico (por exemplo, intra-hepático), mucosa, nasal, oral, retal, subcutânea, sub- lingual, tópica, traqueal (por exemplo, por instilação intratraqueal), va- ginal, vítrea, etc. Em algumas modalidades, a administração pode en- volver apenas uma dose única. Em algumas modalidades, a adminis-

tração pode envolver a aplicação de um número fixo de doses. Em al- gumas modalidades, a administração pode envolver a dosagem que é intermitente (por exemplo, uma pluralidade de doses separadas no tempo) e/ou periódica (por exemplo, doses individuais separadas por um período de tempo comum). Em algumas modalidades, a adminis- tração pode envolver dosagem contínua (por exemplo, perfusão) du- rante pelo menos um período de tempo selecionado.

[0075] Como aqui utilizado, o termo "afinidade" tipicamente refere- se a uma medida da rigidez com que um ligante particular se liga ao seu parceiro. As afinidades podem ser medidas de diferentes manei- ras. Em algumas modalidades, a afinidade é medida por um ensaio quantitativo. Em algumas dessas modalidades, a concentração do parceiro de ligação pode ser fixada para ser superior à concentração de ligante, de modo a imitar as condições fisiológicas. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, a concentração do parceiro de ligação e/ou a concentração do ligante pode ser variada. Em algu- mas dessas modalidades, a afinidade pode ser comparada a uma refe- rência em condições comparáveis (por exemplo, concentrações).

[0076] Como aqui utilizado, o termo "maturação de afinidade" refe- re-se a um processo no qual um anticorpo é desenvolvido a partir de um anticorpo de referência (também referido aqui como um molde ou anticorpo precursor), tipicamente através da mutação de um ou mais resíduos de aminoácido, para ter atividade aumentada com relação a um antígeno alvo do que uma forma correspondente do anticorpo de referência tem para o mesmo antígeno alvo. Portanto, o anticorpo evo- luído é otimizado em comparação com o anticorpo de referência ou modelo. Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo amadurecido por afinidade" tipicamente refere-se a um anticorpo que possui uma ativi- dade aumentada para um antígeno alvo em relação a um anticorpo de referência. Em algumas modalidades, o anticorpo amadurecido por afinidade apresenta maior ligação ao antígeno alvo em comparação com a referência ou o anticorpo precursor. Tipicamente, o anticorpo amadurecido por afinidade se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência.

[0077] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a um po- lipeptídeo que inclui elementos de sequência de imunoglobulina canô- nica suficientes para conferir ligação específica a um antígeno alvo particular. Como é conhecido na técnica, os anticorpos intactos produ- zidos na natureza são agentes tetraméricos de aproximadamente 150 kD compostos por dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos (cer- ca de 50 kD cada) e dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos (cerca de 25 kD cada) que se associam entre si em o que é comumente refe- rido como uma estrutura em “forma de Y”. Cada cadeia pesada é composta por pelo menos quatro domínios (cada um com cerca de 110 aminoácidos de comprimento) - um domínio variável do amino terminal (VH) (localizado nas pontas da estrutura Y), seguido por três domínios constantes: CH1, CH2 e o CH3 carbóxi-terminal (localizado na base da haste do Y). Uma região curta, conhecida como “switch”, conecta as regiões variáveis e constantes da cadeia pesada. A "do- bradiça" conecta os domínios CH2 e CH3 ao resto do anticorpo. Duas ligações de dissulfeto nesta região de dobradiça conectam os dois po- lipeptídeos da cadeia pesada entre si em um anticorpo intacto. Cada cadeia leve é composta por dois domínios - um domínio variável ami- no-terminal (VL), seguido por um domínio constante carbóxi-terminal (CL), separado um do outro por outro "switch". Os tetrâmeros de anti- corpos intactos são compostos por dois dímeros de cadeia pesada- cadeia leve em que as cadeias pesada e leve estão ligadas entre si por uma única ligação de dissulfeto; duas outras ligações de dissulfeto conectam as regiões de dobradiça da cadeia pesada uma à outra, de modo que os dímeros são conectados entre si e o tetrâmero é forma-

do.

Os anticorpos produzidos naturalmente também são glicosilados, tipicamente no domínio CH2. Cada domínio em um anticorpo natural possui uma estrutura caracterizada por uma "dobra de imunoglobulina" formada a partir de duas lâminas beta (por exemplo, lâminas de 3, 4 ou 5 fitas) compactadas uma contra a outra em um barril beta antipara- lelo comprimido.

Cada domínio variável contém três loops hipervariá- veis conhecidos como "regiões determinantes de complementaridade" (CDR1, CDR2 e CDR3) e quatro regiões de "estrutura" um tanto inva- riáveis (FR1, FR2, FR3 e FR4). Quando os anticorpos naturais se do- bram, as regiões FR formam as lâminas beta que fornecem a estrutura estrutural para os domínios, e as regiões de loop CDR de cadeias tan- to pesadas quanto leves são reunidas no espaço tridimensional de modo que criam um sítio de ligação único de antígeno hipervariável localizado na ponta da estrutura em Y.

A região Fc de anticorpos de ocorrência natural liga-se a elementos do sistema complementar e também a receptores em células efetoras, incluindo, por exemplo, cé- lulas efetoras que atuam como mediador da citotoxicidade.

Como é conhecida na técnica, a afinidade e/ou outros atributos de ligação das regiões Fc para os receptores Fc podem ser modulados através de glicosilação ou outra modificação.

Em algumas modalidades, os anti- corpos produzidos e/ou utilizados de acordo com a presente invenção incluem domínios Fc glicosilados, incluindo domínios Fc com tal glico- silação modificada ou manipulada.

Para os propósitos da presente in- venção, em certas modalidades, qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que inclua sequências de domínio de imunoglobulina suficientes, conforme encontrado em anticorpos naturais, pode ser re- ferido e/ou utilizado como um "anticorpo", se tal polipeptídeo for produ- zido naturalmente (por exemplo, gerado por um organismo que reage a um antígeno), ou produzido por engenharia recombinante, síntese química ou outro sistema ou metodologia artificial.

Em algumas moda-

lidades, um anticorpo é policlonal; em algumas modalidades, um anti- corpo é monoclonal.

Em algumas modalidades, um anticorpo possui sequências de região constante que são características de anticorpos de camundongo, coelho, primata ou humanos.

Em algumas modalida- des, os elementos da sequência do anticorpo são humanizados, pri- matizados, quiméricos, etc., como são conhecidos na técnica.

Além disso, o termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, pode referir-se em modalidades apropriadas (a menos que indicado de outra forma ou claro do contexto) a qualquer um dos construtos ou formatos conheci- dos ou desenvolvidos para a utilização de características estruturais e funcionais do anticorpo em apresentação alternativa.

Por exemplo, modalidades, um anticorpo utilizado de acordo com a presente inven- ção está em um formato selecionado de, mas não limitado a, anticor- pos IgA, IgG, IgE ou IgM intactos; anticorpos bi ou multiespecíficos (por exemplo, Zybodies&, etc); fragmentos de anticorpo, tais como fra- gmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd', fragmentos Fd e CDRs isolados ou conjuntos dos mesmos; Fvs de ca- deia única; fusões de polipeptídeo-Fc; anticorpos de domínio único (por exemplo, anticorpos de domínio único de tubarão tais como lg- NAR ou seus fragmentos); anticorpos camelóides; anticorpos masca- rados (por exemplo, Probodies&); Small Modular InmunoPharmaceu- ticals (“SMIPsTY”); diacorpos de cadeia simples ou em Tandem (Tan- dAbO); corpos humanos, VHHs; Anticalins&; minicorpos NanobodiesO; BiTEGs; proteínas de repetição de anquirina ou DARPINSO; AvimersO; Dardos; anticorpos do tipo TOR; Adnectins&; Affilins&; Trans-bodiesO; AffibodiesO; TrimerXGO; MicroProteínas; FynomersO, Centyrins6; e KALBITORGO.

Em algumas modalidades, um anticorpo pode não ter uma modificação covalente (por exemplo, ligação de um glicano) que teria se fosse produzido naturalmente.

Em algumas modalidades, um anticorpo pode conter uma modificação covalente (por exemplo, liga-

ção de um glicano, uma carga útil [por exemplo, uma fração detectá- vel, uma fração terapêutica, uma fração catalítica, etc.], ou outro grupo pendente [por exemplo, polietileno glicol, etc.].

[0078] Como aqui utilizado, um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma parte de um anticorpo ou agente de anticorpo, conforme des- crito nesta invenção, e tipicamente refere-se a uma parte que inclui uma parte de ligação ao antígeno ou região variável do mesmo. Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por qualquer meio. Por exemplo, em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo pode ser enzimática ou quimicamente produzido através da fragmentação de um anticorpo intacto ou agente de anticorpo. Alternativamente, em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo pode ser produzido de forma recombinante (isto é, pela expressão de uma sequência de ácido nucleico projetada. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo pode ser total ou parcialmente produzido sinteticamente. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo (particularmente um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) pode ter um compri- mento de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 aminoácidos ou mais, em algumas moda- lidades pelo menos cerca de 200 aminoácidos.

[0079] Conforme aqui utilizado, o termo "ligação" tipicamente refe- re-se a uma associação não covalente entre ou entre duas ou mais entidades. A ligação “direta” envolve o contato físico entre entidades ou componentes; ligação indireta envolve interação física por meio de contato físico com uma ou mais entidades intermediárias. A ligação entre duas ou mais entidades pode ser tipicamente avaliada em qual- quer um de uma variedade de contextos - incluindo onde entidades ou componentes que interagem são estudados isoladamente ou no con- texto de sistemas mais complexos (por exemplo, enquanto covalente- mente ou de outra forma associada a uma entidade portadora e/ou em um sistema biológico ou célula).

[0080] Como aqui utilizado, os termos "câncer", "malignidade", "neoplasia", "tumor" e "carcinoma" tipicamente referem-se a células que apresentam crescimento relativamente anormal, descontrolado e/ou autônomo, de modo que apresenta um crescimento aberrante fe- nótipo caracterizado por uma perda significativa de controle da prolife- ração celular. Em algumas modalidades, um tumor pode ser ou com- preender células que são pré-cancerosas (por exemplo, benignas), malignas, pré-metastáticas, metastáticas e/ou não metastáticas. A presente invenção identifica especificamente certos tipos de câncer para os quais seus ensinamentos podem ser particularmente relevan- tes. Em algumas modalidades, um câncer relevante pode ser caracte- rizado por um tumor sólido. Em algumas modalidades, um câncer rele- vante pode ser caracterizado por um tumor hematológico. Em geral, exemplos de diferentes tipos de cânceres conhecidos na técnica inclu- em, por exemplo, cânceres hematopoiéticos incluindo leucemias, lin- fomas (Hodgkin e não Hodgkin), mielomas e distúrbios mieloproliferati- VOS; Ssarcomas, melanomas, adenomas, carcinomas de tecido sólido, carcinomas de células escamosas da boca, garganta, laringe e pul- mão, câncer de fígado, cânceres geniturinários tais como câncer de próstata, cervical, bexiga, útero e endometrial e carcinomas de células renais, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer do sistema endócrino, câncer da glân- dula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer gastrointestinal e câncer do sistema nervoso, lesões benignas, tais como papilomas, e semelhantes.

[0081] Como aqui utilizado, o termo "CDR" refere-se a uma região determinante de complementaridade dentro de uma região variável de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas CDR1, CDR2 e

CDR3, para cada uma das regiões variáveis. Um "conjunto de CDRs" ou "conjunto de CDRs" refere-se a um grupo de três ou seis CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de ligar o antígeno ou as CDRs de regiões variáveis cognatas de cadeia pesada e leve capazes de se ligar ao antígeno. Certos sistemas foram estabelecidos na técni- ca para definir limites de CDR (por exemplo, Kabat, Chothia, etc.); aqueles versados na técnica observam as diferenças entre e em meio desses sistemas e são capazes de compreender os limites de CDR na medida necessária para compreender e praticar a invenção reivindica- da.

[0082] Como aqui utilizado, o termo "agente quimioterápico" pos- sui seu significado compreendido na técnica referindo-se a um ou mais agentes pró-apoptóticos, citostáticos e/ou citotóxicos, por exemplo, especificamente incluindo agentes utilizados e/ou recomendados para uso no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios ou condições associadas à proliferação celular indesejável. Em muitas modalidades, os agentes quimioterápicos são úteis no tratamento do câncer. Em al- gumas modalidades, um agente quimioterápico pode ser ou compre- ender um ou mais agentes alquilantes, uma ou mais antraciclinas, um ou mais interferentes do citoesqueleto (por exemplo, agentes de dire- cionamento de microtúbulos, tais como taxanos, maitansina e seus análogos), uma ou mais epotilonas, um ou mais inibidores de histona desacetilase (HDACs), um ou mais inibidores da topoisomerase (por exemplo, inibidores da topoisomerase | e/ou topoisomerase Il), um ou mais inibidores da cinase, um ou mais análogos de nucleotídeos ou análogos precursores de nucleotídeos, um ou mais antibióticos de peptídeo, um ou mais agentes à base de platina, um ou mais retinói- des, um ou mais alcalóides da vinca e/ou um ou mais análogos de um ou mais dos seguintes (isto é, que compartilham uma atividade anti- proliferativa relevante). Em algumas modalidades particulares, um agente quimioterápico pode ser ou compreender um ou mais dentre Actinomicina, Ácido All-trans retinóico, uma Auiristatina, Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina, Bortezomib, Carboplatina, Capecitabina, Cis- platina, Clorambucila, Ciclofosfamida, Curcumina, Citarabina, Daunor- rubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Epotilo- na, Etoposídeo, Fluorouracila, Gencitabina, Hidroxiuréia, Idarrubicina, Imatinib, Irinotecan, Maitansina e/ou análogos dos mesmos, (por exemplo, DM1) Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxan- trona, Maitansinóide, Oxaliplatina, Paclitaxel, Pemetrexed, Teniposí- deo, Tioguanina, Topotecano, Valrubicina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, e combinações dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, um agente quimioterápico pode ser utilizado no contexto de um conjugado anticorpo-fármaco. Em algumas modalidades, um agen- te quimioterápico é aquele encontrado em um conjugado anticorpo- fármaco selecionado do grupo que consiste em: hLL1-doxorrubicina, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hAZ20-SN-38, hPAMA4-SN- 38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro- 2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAMA4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-doxorrubicina, gemtuzumab ozogamicina, brentuximab vedo- tin, trastuzumab emtansine, inotuzumab ozogamicina, glembatu- momab vedotin, SAR3419, SAR566658, BIIBO15, BTO62, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG- 22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, anti-PSMA ADC, RG- 7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, vorsetuzumab mafodotin e lorvotuzumab mertansine.

[0083] Como aqui utilizado, o termo "terapia de combinação" refe- re-se às situações em que um indivíduo é simultaneamente exposto a dois ou mais regimes terapêuticos (por exemplo, dois ou mais agentes terapêuticos). Em algumas modalidades, os dois ou mais regimes te-

rapêuticos podem ser administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, os dois ou mais regimes terapêuticos podem ser admi- nistrados sequencialmente (por exemplo, um primeiro regime adminis- trado antes da administração de quaisquer doses de um segundo re- gime). Em algumas modalidades, os dois ou mais regimes terapêuti- cos são administrados em regimes de dosagem sobrepostos. Em al- gumas modalidades, a administração da terapia de combinação pode envolver a administração de um ou mais agentes ou modalidades te- rapêuticas a um indivíduo que recebe os outros agentes ou modalida- des.

[0084] Como utilizado nesta invenção, o termo "estrutura" ou "re- gião de estrutura" refere-se às sequências de uma região variável me- nos as CDRs. Visto que uma sequência de CDR pode ser determinada por diferentes sistemas, da mesma forma uma sequência de estrutura está sujeita a interpretações correspondentemente diferentes. As seis CDRs dividem as regiões estruturais nas cadeias pesadas e leves em quatro sub-regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que a CDR1 está posicionado entre FR1 e FR2, a CDR2 entre FRQ2 e FR3 e a CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FRA4, uma região de estrutura principal, con- forme referido por outros, representa as FRs combinadas dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina de ocorrência natural. Como aqui utilizado, uma FR representa uma das quatro sub- regiões, FR1, por exemplo, representa a primeira região de estrutura principal mais próxima da extremidade do amino terminal da região variável e 5' em relação a CDR1, e as FRs representam duas ou mais das sub-regiões que constituem uma região da estrutura principal.

[0085] Como aqui utilizado, o termo "humanizado" é comumente utilizado para se referir a anticorpos (ou componentes de anticorpos) cuja sequência de aminoácido inclui sequências da região VH e VL de um anticorpo de referência criado em uma espécie não humana (por exemplo, um camundongo), mas também inclui modificações nessas sequências em relação ao anticorpo de referência destinado a torná- los mais "semelhantes aos humanos", isto é, mais semelhantes às se- quências variáveis da linha germinativa humana. Em algumas modali- dades, um anticorpo "humanizado" (ou componente de anticorpo) é aquele que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que possui uma região de estrutura principal (FR) tendo substancial- mente a sequência de aminoácido de um anticorpo humano e uma re- gião determinante de complementaridade (CDR) tendo substancial- mente a sequência de aminoácido de um anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab'), FabC, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiõês CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, imunoglobulina de doador) e todas ou substancialmente todas as regi- ões estruturais são aquelas de uma sequência de consenso de imuno- globulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humaniza- do também compreende pelo menos uma parte de uma região cons- tante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma região constante de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém tanto a cadeia leve quanto pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir uma região CH1, de dobradiça, CH2, CH3 e, opcionalmente, uma CH4 de uma região constante da cadeia pesada.

[0086] Como aqui utilizado, o termo "in vitro" refere-se a eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de ensaio ou recipiente de reação, em cultura de células, etc., em vez de dentro de um organismo multicelular.

[0087] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "in vivo" refere-

se a eventos que ocorrem dentro de um organismo multicelular, tal como um ser humano e um animal não humano. No contexto de sis- temas baseados em células, o termo pode ser utilizado para se referir a eventos que ocorrem dentro de uma célula viva (em oposição a, por exemplo, sistemas in vitro).

[0088] Como aqui utilizado, o termo "isolado" refere-se a uma substância e/ou entidade que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais foi associada quando inicialmente produzida (seja na natureza e/ou em um ambiente experimental), e/ou (2) projetada, produzida, preparada e/ou fabricada pela mão do ho- mem. Substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separadas em cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cer- ca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais do que cerca de 99% dos outros componentes com os quais fo- ram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, os agentes isolados são cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cer- ca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% puros. Conforme utilizado nesta invenção, uma substância é "pura" se for substancialmente livre de outros componen- tes. Em algumas modalidades, como será compreendido por aqueles versados na técnica, uma substância pode ainda ser considerada "iso- lada" ou mesmo "pura", após ter sido combinada com certos outros componentes, tais como, por exemplo, um ou mais veículos ou excipi- entes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.); em tais modalida- des, a porcentagem de isolamento ou pureza da substância é calcula- da sem incluir tais veículos ou excipientes. Para dar apenas um exem- plo, em algumas modalidades, um polímero biológico tal como um po-

lipeptídeo ou polinucleotídeo que ocorre na natureza é considerado "isolado" quando, a) em virtude de sua origem ou fonte de derivação não está associado a alguns ou todos os componentes que o acompa- nham em seu estado nativo na natureza; b) é substancialmente livre de outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos da mesma espécie da es- pécie que o produz na natureza; c) é expresso por ou está de outra forma em associação com componentes de uma célula ou outro siste- ma de expressão que não é da espécie que o produz na natureza. As- sim, por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou é sintetizado em um sistema celular dife- rente daquele que o produz na natureza é considerado um polipeptí- deo "isolado". Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalida- des, um polipeptídeo que foi submetido a uma ou mais técnicas de pu- rificação pode ser considerado um polipeptídeo "isolado" na medida em que foi separado de outros componentes a) com os quais está as- sociado na natureza; e/ou b) com o qual estava associado quando ini- cialmente produzido.

[0089] Como aqui utilizado, o termo "Kp" refere-se à constante de dissociação de um agente de ligação (por exemplo, um anticorpo ou componente de ligação do mesmo) de um complexo com seu parceiro (por exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo ou componente de ligação do mesmo se liga).

[0090] Tal como aqui utilizado, o termo "macrófago" refere-se a uma célula da linhagem monócito/macrófago que se encontra no baço ou se diferenciou em um macrófago de tecido. Essas células incluem células dendríticas foliculares (FDC), células dendríticas, células de Langerhans, assim como outros macrófagos de tecido. Os macrófagos são fagócitos e células apresentadoras de antígenos que se diferenci- am dos monócitos no sangue periférico circulante. Eles desempenham um papel importante na imunidade inata e adaptativa, ativando os lin-

fócitos T. Os macrófagos que ativam os linfócitos T Th1 fornecem uma resposta inflamatória e são denominados macrófagos M1. Os macró- fagos M1, também chamados de "macrófagos assassinos", inibem a proliferação celular, provocam danos aos tecidos e são agressivos contra bactérias. Os macrófagos que ativam os linfócitos T Th2 forne- cem uma resposta anti-inflamatória e são denominados macrófagos M2. Os macrófagos M2, também chamados de “macrófagos de repa- ro”, promovem a proliferação celular e o reparo de tecidos e são anti- inflamatórios. Conforme aqui utilizado, o termo "macrófagos associa- dos a tumor" (TAMs) geralmente refere-se a macrófagos que existem no microambiente de um câncer, por exemplo, um tumor.

[0091] Tal como aqui utilizado, o termo "ligado de maneira operá- vel" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira planeja- da. Um elemento de controle "ligado de maneira operável" a um ele- mento funcional é associado de tal forma que a expressão e/ou ativi- dade do elemento funcional é alcançada sob condições compatíveis com o elemento de controle. Em algumas modalidades, os elementos de controle "ligados de maneira operável" são contíguos (por exemplo, ligados covalentemente) com os elementos de codificação de interes- se; em algumas modalidades, os elementos de controle atuam em trans ou de outra forma a partir do elemento funcional de interesse.

[0092] Como aqui utilizado, o termo "composição farmacêutica" refere-se a uma composição na qual um agente ativo é formulado jun- tamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, a composição é adequada para administração a um indivíduo humano ou animal. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente em uma quantidade de dose unitária apropriada para administração em um regime terapêutico que mostra uma proba- bilidade estatisticamente significativa de atingir um efeito terapêutico predeterminado quando administrado a uma população relevante.

[0093] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "polipeptídeo" geralmente possui seu significado reconhecido na técnica de um polí- mero de pelo menos três aminoácidos. Aqueles versados na técnica irão observar que o termo "polipeptídeo" se destina a ser suficiente- mente geral para abranger não apenas polipeptídeos com uma se- quência completa aqui citada, mas também para abranger polipeptí- deos que representam fragmentos funcionais (isto é, fragmentos que retêm pelo menos uma atividade) de tais polipeptídeos completos. Além do mais, aqueles versados na técnica entendem que as sequên- cias de proteína geralmente toleram alguma substituição sem destruir a atividade. Assim, qualquer polipeptídeo que retém atividade e com- partilha pelo menos cerca de 30 a 40% da identidade de sequência geral, muitas vezes maior do que cerca de 50%, 60%, 70% ou 80% e, adicionalmente, de uma forma geral incluindo pelo menos uma região de identidade muito maior, frequentemente maior do que 90% ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em uma ou mais regiões alta- mente conservadas, geralmente abrangendo pelo menos 3 a 4 e mui- tas vezes até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídeo da mesma classe, está englobado dentro do termo relevante "polipeptí- deo" conforme aqui utilizado. Os polipeptídeos podem conter L- aminoácidos, D-aminoácidos ou ambos e podem conter qualquer uma de uma variedade de modificações de aminoácidos ou análogos co- nhecidos na técnica. Modificações úteis incluem, por exemplo, acetila- ção terminal, amidação, metilação, etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos, e combinações dos mesmos. O termo "peptídeo" é geralmente utilizado para se referir a um polipeptídeo ten- do um comprimento menor do que cerca de 100 aminoácidos, menor do que cerca de 50 aminoácidos, menor do que 20 aminoácidos ou menor do que 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas são anticorpos, fragmentos de anticorpos, porções biologicamente ati- vas dos mesmos e/ou porções características dos mesmos.

[0094] Conforme aqui utilizado, o termo "prevenir" ou "prevenção" quando utilizado em conexão com a ocorrência de uma doença, dis- túrbio e/ou condição, refere-se a reduzir o risco de desenvolver a do- ença, distúrbio e/ou condição e/ou a retardar o início e/ou gravidade de uma ou mais características ou sintomas da doença, distúrbio ou con- dição. Em algumas modalidades, a prevenção é avaliada em uma ba- se populacional de modo que um agente seja considerado para "pre- venir" uma doença, distúrbio ou condição específica se uma diminui- ção estatisticamente significativa no desenvolvimento, frequência e/ou intensidade de um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou condição for observada em uma população suscetível à doença, distúrbio ou condição.

[0095] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "recombinante" se destina a referir-se a polipeptídeos que são projetados, planejados, preparados, expressos, criados, fabricados e/ou isolados por meios recombinantes, tais como polipeptídeos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em um célula hospedeira; polipeptídeos isolados de uma biblioteca de polipeptídeos humanos combinatórios recombinantes; polipeptídeos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo, coelho, ovelha, peixe, etc.) que é transgênico ou de outra forma foi manipulado para expressar um gene ou genes, ou componentes do gene que codificam e/ou expressão di- reta do polipeptídeo ou um ou mais componentes, porções, elementos ou domínios dos mesmos; e/ou polipeptídeos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing ou ligação de elementos de sequência de ácido nucleico selecionados entre si, sintetizando quimicamente elementos de sequência selecio-

nados e/ou de outra forma gerando um ácido nucleico que codifica e/ou direciona a expressão do polipeptídeo ou um ou mais componen- tes, porçãoões, elementos ou domínios do mesmo. Em algumas mo- dalidades, um ou mais de tais elementos de sequência selecionados são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um ou mais de tais elementos de sequência selecionados são projetados in sílico. Em algumas modalidades, um ou mais de tais elementos de sequência selecionados resultam de mutagênese (por exemplo, in vivo ou in vitro) de um elemento de sequência conhecido, por exemplo, de uma fonte natural ou sintética, tal como, por exemplo, na linha germinativa de um organismo de origem de interesse (por exemplo, de um ser humano, um camundongo, etc.).

[0096] Como aqui utilizado, o termo "ligação específica" refere-se a uma capacidade de discriminar entre possíveis parceiros de ligação no ambiente em que a ligação deve ocorrer. Um agente de ligação que interage com um alvo particular quando outros alvos potenciais estão presentes é dito "ligar-se especificamente" ao alvo com o qual ele inte- rage. Em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada pela detecção ou determinação do grau de associação entre o agente de ligação e seu parceiro; em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada pela detecção ou determinação do grau de dissociação de um complexo de agente de ligação-parceiro; em algumas modalida- des, a ligação específica é avaliada pela detecção ou determinação da capacidade do agente de ligação em competir uma interação alternati- va entre seu parceiro e outra entidade. Em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada pela execução de tais detecções ou de- terminações através de uma faixa de concentrações.

[0097] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "indivíduo" refe- re-se a um organismo, tipicamente um mamífero (por exemplo, um ser humano, em algumas modalidades, incluindo formas humanas pré-

natais). Em algumas modalidades, um indivíduo sofre de uma doença, distúrbio ou condição relevante. Em algumas modalidades, um indiví- duo é suscetível a uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo apresenta um ou mais sintomas ou carac- terísticas de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modali- dades, um indivíduo não apresenta qualquer sintoma ou característica de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo é alguém com um ou mais aspectos característicos de sus- cetibilidade ou risco de uma doença, distúrbio ou condição. Em algu- mas modalidades, um indivíduo é um paciente. Em algumas modali- dades, um indivíduo é uma pessoa a quem o diagnóstico e/ou a tera- pia é e/ou foi administrado.

[0098] Como aqui utilizado, a frase "agente terapêutico" em geral refere-se a qualquer agente que provoca um efeito farmacológico de- sejado quando administrado a um organismo. Em algumas modalida- des, um agente é considerado um agente terapêutico se demonstrar um efeito estatisticamente significativo em uma população apropriada. Em algumas modalidades, a população apropriada pode ser uma po- pulação de organismos modelo. Em algumas modalidades, uma popu- lação apropriada pode ser definida por vários critérios, tais como um determinado grupo de idade, sexo, fundo genético, condições clínicas preexistentes, etc. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é uma substância que pode ser utilizada para aliviar, melhorar, remediar, inibir, prevenir, retardar o início, reduzir a gravidade e/ou reduzir a in- cidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um "agente tera- pêutico" é um agente que foi ou deve ser aprovado por uma agência governamental antes de ser comercializado para administração a se- res humanos. Em algumas modalidades, um "agente terapêutico" é um agente para o qual uma receita médica é necessária para administra-

ção a seres humanos.

[0099] Como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade que é suficiente, quando administrada a uma população que sofre ou é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição de acordo com um regime de dosagem terapêutica, pa- ra tratar a doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que reduz a inci- dência e/ou gravidade, estabiliza uma ou mais características e/ou re- tarda o início de um ou mais sintomas da doença, distúrbio e/ou condi- ção. Aqueles versados na técnica irão observar que o termo "quanti- dade terapeuticamente eficaz" não requer, de fato, que um tratamento bem-sucedido seja alcançado em um indivíduo em particular. Em vez disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aquela quan- tidade que fornece uma determinada resposta farmacológica desejada em um número significativo de indivíduos quando administrada a paci- entes com necessidade de tal tratamento. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo com neces- sidade no contexto da terapia inventiva, irá bloquear, estabilizar, ate- nuar ou reverter a ocorrência de um processo de suporte ao câncer no referido indivíduo, ou intensificará ou aumentará um processo de su- pressão do câncer no dito indivíduo. No contexto do tratamento do câncer, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo diagnosticado com câncer, irá prevenir, estabilizar, inibir ou reduzir o desenvolvimento posterior de câncer no indivíduo. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" par- ticularmente preferida de uma composição aqui descrita reverte (em um tratamento terapêutico) o desenvolvimento de uma malignidade, tal como um carcinoma pancreático, ou ajuda a alcançar ou prolongar a remissão de uma malignidade. Uma quantidade terapeuticamente efi-

caz administrada a um indivíduo para tratar um câncer nesse indivíduo pode ser a mesma ou diferente de uma quantidade terapeuticamente eficaz administrada para promover a remissão ou inibir a metástase.

Como acontece com a maioria das terapias contra o câncer, os méto- dos terapêuticos descritos nesta invenção não devem ser interpreta- dos como, restritos a, ou de outra forma limitados a uma "cura" para o câncer; em vez disso, os métodos de tratamento são direcionados ao uso das composições descritas para "tratar" um câncer, isto é, para efetuar uma mudança desejável ou benéfica na saúde de um indivíduo que tem câncer.

Esses benefícios são reconhecidos por profissionais de saúde qualificados no campo da oncologia e incluem, mas não são limitados a estes, uma estabilização da condição do paciente, uma di- minuição no tamanho do tumor (regressão do tumor), uma melhora nas funções vitais (por exemplo, função melhorada de tecidos ou ór- gãos cancerosos), uma diminuição ou inibição de metástases adicio- nais, uma diminuição nas infecções oportunistas, uma capacidade de sobrevivência aumentada, uma diminuição da dor, função motora me- lhorada, função cognitiva melhorada, sensação melhorada de energia (vitalidade, mal-estar diminuído), sensação melhorada de bem-estar, restauração do apetite normal, restauração do ganho de peso saudá- vel e suas combinações.

Além disso, a regressão de um tumor especí- fico em um indivíduo (por exemplo, como o resultado dos tratamentos aqui descritos) também pode ser avaliada pela coleta de amostras de células cancerosas do local de um tumor, tal como um adenocarcino- ma pancreático (por exemplo, ao longo do curso de tratamento) e tes- tar as células cancerosas para o nível de marcadores metabólicos e de sinalização para monitorar o estado das células cancerosas para veri- ficar a nível molecular a regressão das células cancerosas para um fenótipo menos maligno.

Por exemplo, a regressão do tumor induzida pelo uso dos métodos desta invenção seria indicada por encontrar uma diminuição em qualquer um dos marcadores pró-angiogênicos examinados acima, um aumento nos marcadores anti-angiogênicos aqui descritos, a normalização (isto é, alteração em direção a um es- tado encontrado em indivíduos normais que não sofrem de câncer) das vias metabólicas, vias de sinalização intercelular ou vias de sinali- zação intracelular que apresentam atividade anormal em indivíduos diagnosticados com câncer. Aqueles versados na técnica irão observar que, em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente efi- caz pode ser formulada e/ou administrada em uma dose única. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser formulada e/ou administrada em uma pluralidade de doses, por exemplo, como parte de um regime de dosagem.

[00100] Como aqui utilizado no contexto de moléculas, por exem- plo, ácidos nucleicos, proteínas ou moléculas pequenas, o termo "vari- ante" refere-se a uma molécula que mostra identidade estrutural signi- ficativa com uma molécula de referência, mas difere estruturalmente da molécula de referência, por exemplo, na presença ou ausência ou ao nível de uma ou mais componentes químicos em comparação com a entidade de referência. Em algumas modalidades, uma variante também difere funcionalmente de sua molécula de referência. Em ge- ral, se uma determinada molécula é adequadamente considerada uma "variante" de uma molécula de referência, ela se baseia em seu grau de identidade estrutural com a molécula de referência. Como será ob- servado por aqueles versados na técnica, qualquer molécula de refe- rência biológica ou química possui certos elementos estruturais carac- terísticos. Uma variante, por definição, é uma molécula distinta que compartilha um ou mais desses elementos estruturais característicos, mas difere em pelo menos um aspecto da molécula de referência. Pa- ra fornecer apenas alguns exemplos, um polipeptídeo pode ter um elemento de sequência característico composto por uma pluralidade de aminoácidos tendo posições designadas em relação umas às ou- tras no espaço linear ou tridimensional e/ou contribuindo para um mo- tivo estrutural particular e/ou função biológica; um ácido nucleico pode ter um elemento de sequência característico composto por uma plura- lidade de resíduos de nucleotídeos tendo posições designadas em re- lação a outro no espaço linear ou tridimensional. Em algumas modali- dades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante pode diferir de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência como um resultado de uma ou mais diferenças na sequência de aminoácido ou nucleotídeo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante ou ácido nucleico mostra uma identidade de sequência geral com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 99%. Em algu- mas modalidades, um polipeptídeo variante ou ácido nucleico não compartilha pelo menos um elemento de sequência característico com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência. Em algumas modali- dades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência possui uma ou mais atividades biológicas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.

[00101] Como utilizado nesta invenção, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nu- cleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma cé- lula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacte- rianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores episso- mais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamiífe-

ros não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são repli- cados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão liga- dos de maneira operável. Tais vetores são aqui referidos como "veto- res de expressão". Técnicas padrão podem ser utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzi- máticas e técnicas de purificação podem ser executadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente executadas na técnica ou conforme descrito nesta invenção. As técnicas e proce- dimentos anteriores podem ser de uma forma geral executados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e con- forme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e examinadas ao longo do presente relatório descritivo. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manu- al (2"º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que é aqui incorporado por referência para qualquer fina- lidade.

Macrófagos no Câncer

[00102] Os macrófagos são fagócitos e células apresentadoras de antígeno que se diferenciam dos monócitos no sangue periférico circu- lante. Sabe-se que essas células desempenham um papel importante na imunidade inata e adaptativa através da ativação dos linfócitos T. Os macrófagos que ativam os linfócitos T Th1 fornecem uma resposta inflamatória e são denominados macrófagos M1. Os macrófagos M1, também chamados de "macrófagos assassinos", inibem a proliferação celular, provocam danos aos tecidos e são agressivos contra bacté- rias. Os macrófagos que ativam os linfócitos T Th2 fornecem uma res- posta anti-inflamatória e são denominados macrófagos M2. Os macró-

fagos M2, também chamados de “macrófagos de reparo”, promovem a proliferação celular e o reparo de tecidos e são anti-inflamatórios.

[00103] “Enquanto que os macrófagos são formados através da dife- renciação de monócitos, os monócitos amadurecem em macrófagos M1 (CD 68* e CD80*) ou M2 (CD68* e CD163”*), dependendo das cito- cinas e fatores de crescimento que os fazem se diferenciar. Lipopolis- sacarídeo (LPS) e interferon gama (IFNy) ativam monócitos para se diferenciarem em macrófagos M1 que secretam altos níveis de inter- leucina-1 (IL-1) e interleucina-12 (IL-12) e baixos níveis de interleuci- na-10 (IL-10). Alternativamente, interleucina-4 (IL-4), IL-10, antagonis- ta do receptor de interleucina-1 (IL-1ra) e fator de transformação do crescimento beta (TGFB) ativam monócitos para se diferenciarem em macrófagos M2 que secretam altos níveis de IL-10, TGFB e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e baixos níveis de |L-12.

[00104] O papel da imunidade na oncogênese tem sido cada vez mais valorizado. Uma vez que os macrófagos são conhecidos por de- sempenhar papéis importantes na imunidade inata e adaptativa, eles foram reconhecidos como componentes chave dos tumores e de seu microambiente. Macrófagos associados a tumor (TAMs) geralmente referem-se a macrófagos que existem no microambiente de um cân- cer. O papel dos macrófagos associados a tumor (TAMs) no cresci- mento, invasão e metástase de tumores foi extensivamente investiga- do e sabe-se que os TAMs apresentam um amplo espectro de fenóti- pos, variando do fenótipo tipo M1 em estágios iniciais de tumores se- lecionados até o fenótipo tipo M2 na maioria dos tumores avançados. Como evidência de seu papel na promoção da tumorigênese, os ma- crófagos M2 apresentam o fenótipo característico de expressão eleva- da de IL-10, IL4, MMP e VEGF, mas diminuição da expressão de cito- cinas pró-inflamatórias e iNOs e ROIs citotóxicos, que estão implica- dos em atividades tumoricidas. Além de sua função intrínseca na pro-

moção da tumorigênese, os TAMs também contribuem para a supres- são da imunidade antitumoral através da alternância das respostas de células T e o equilíbrio no microambiente tumoral.

[00105] Exceto na promoção da proliferação celular desempenhan- do um papel anti-inflamatório, no câncer, os macrófagos M2 podem induzir a vascularização em uma área de um tumor. Portanto, em tais cenários, seria útil inibir a polarização M2 de macrófagos e induzir a polarização M1 de macrófagos, que são conhecidos por atacar células tumorais. VSIG4

[00106] VSIG4 (domínio V-Set e a imunoglobulina contendo 4) é uma proteína de membrana relacionada à família B7 pertencente ao receptor do complemento da superfamília de imunoglobulina (CRlg) que é conhecido por regular negativamente a proliferação de células T CD8* e a produção de IL-2 pela ligação de iC3b e C3b. A expressão de VSIGA4 é restrita a macrófagos de tecidos, incluindo macrófagos pe- ritoneais e células de Kupffer residenciais no fígado. As Figuras 2A e 2B mostram a relação de VSIGA4 (relações de homologia e filogenia, respectivamente) com outra família B7 de proteínas (VSIGA4 é referido como EU103 nas Figuras 2A e 2B). A Figura 2A mostra o alinhamento da sequência de aminoácido de VSIG4 com várias outras proteínas da família B7. As Figuras 2B mostram a relação evolutiva entre VSIG4 e outras proteínas da família B. Anticorpo Anti-VSIG4 para tratar Câncer

[00107] Os macrófagos associados ao tumor (TAM) são as células- chave que criam um microambiente tumoral imunossupressor (TME), fornecendo vários alvos para imunoterapias. Os macrófagos também são conhecidos por serem altamente plásticos e também podem repo- larizar e adquirir um fenótipo tipo M1 antitumorigênico.

[00108] “Macrófagos associados a tumores (TAMs) são tipicamente conhecidos por suas funções protumorais tais como promoção da mo- tiidade das células cancerosas, formação de metástases e angiogê- nese. A formação de TAMs depende de fatores microambientais que estão presentes nos tumores em desenvolvimento. Os TAMs são abundantes em muitos cânceres, especialmente no microambiente tumoral, e frequentemente apresentam um fenótipo semelhante a M2 imunossupressor que estimula o crescimento do tumor e promove a resistência à terapia. TAMs também produzem citocinas imunossu- pressoras tais como IL-10, TGFB e PGE2, quantidade muito pequena de NO ou RO! e baixos níveis de citocinas inflamatórias tais como |IL- 12, IL-1B, TNFa e IL-6. A conversão de macrófagos em TAMs resulta em capacidade reduzida de apresentar antígenos associados a tumo- res e estimular funções antitumorais de células T e NK. Além disso, os TAM;s não são capazes de fazer a lise de células tumorais. Portanto, o direcionamento de TAMs é uma nova estratégia terapêutica para su- primir ou tratar câncer, por exemplo, através da liberação de agentes para alterar o recrutamento e distribuição de TAMs, depleção de TAMs existentes ou indução da reeducação (ou conversão) de TAMs de um M?2 para um fenótipo M1.

[00109] A presente invenção baseia-se na descoberta de que os macrófagos M2 de expressão de VSIG4 podem ser tratados com anti- corpos anti-VSIG4 humanizados para converter (ou repolarizar) os macrófagos M2 em macrófagos M1 supressores de tumor, induzindo assim a proliferação de células T CD8* e a produção de citocinas pró- inflamatórias levando à supressão de tumor. Além disso, o uso de an- ticorpos anti-VSIG4 pode suprimir o câncer de forma eficaz por direci- onar tanto (1) a conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1 quanto (2) induzir a proliferação de células T CD8* e a produção de citocinas pró-inflamatórias, influenciando assim o próprio microambien- te tumoral. Esta abordagem de utilizar um anticorpo anti-VSIG4 para suprimir o câncer é superior a outras terapias que apenas induzem a proliferação de células T ou apenas bloqueiam as atividades de assis- tência ao tumor por macrófagos. Ver a Figura 1 (que mostra esquema- ticamente os efeitos dos anticorpos anti-VSIG4 na função dos macró- fagos, seus efeitos na proliferação de células T e subsequente supres- são do câncer). Humanização de Anticorpo de Camundongo

[00110] Embora os anticorpos monoclonais possam ser produzidos rapidamente pelo sistema imunológico de camundongo para estudos biológicos, em um ambiente clínico, o uso desses anticorpos de muri- no pode resultar em uma resposta de anticorpo anti-camundongo hu- mano (HAMA). Embora os anticorpos quiméricos possam reduzir as respostas anti-lgG em seres humanos, os domínios variáveis de muri- no ainda podem ter conteúdo de epítopo de célula T provocativo, ne- cessitando de "humanização" de suas regiões estruturais.

[00111] A humanização clássica do anticorpo geralmente começa pela transferência de todas as seis regiões determinantes de comple- mentaridade de murino (CDRs) para uma estrutura de anticorpo hu- mano (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)). Esses anticorpos en- xertados com CDR geralmente não retêm sua afinidade original para a ligação ao antígeno e, de fato, a afinidade é muitas vezes severamen- te prejudicada. Além das CDRs, certos resíduos de estrutura não hu- manos também devem ser incorporados nos domínios variáveis para manter a conformação de CDR adequada (Chothia et a/l., Nature 342: 877 (1989)). A incorporação de resíduos de murino em posições chave nas estruturas humanas para restaurar a função é geralmente referida como "mutações reversas". As mutações reversas podem suportar a conformação estrutural das CDRs enxertadas e restaurar a ligação ao antígeno e a afinidade. Muitas das posições estruturais que são sus- ceptíveis de afetar a afinidade foram identificadas, portanto, a modela-

gem estrutural para selecionar novos resíduos de uma forma gradual pode geralmente levar a variantes com ligação ao antígeno restaura- da. Alternativamente, as bibliotecas de anticorpos de fago direciona- das a estes resíduos também podem ser utilizadas para aumentar e acelerar o processo de maturação de afinidade (Wu et al., J. Mol. Biol. 294:151-162 (1999) e Wu, H., Methods in Mol. Biol. 207:197-212 (2003)). Maturação de Afinidade do Anticorpo

[00112] A maturação de afinidade é um processo pelo qual células B ativadas por células TFH produzem anticorpos com afinidade au- mentada para um antígeno específico durante o curso de uma respos- ta imune. Com exposições repetidas ao mesmo antígeno, um hospe- deiro produzirá anticorpos de afinidades sucessivamente maiores. Uma resposta secundária pode induzir anticorpos com afinidade distin- ta maior do que em uma resposta primária. A maturação de afinidade é uma estratégia importante na otimização de anticorpos para gerar terapêutica de segunda geração segura e eficaz. Classicamente, os anticorpos terapêuticos são obtidos através da imunização de camun- dongos ou animais transgênicos que expressam genes de imunoglo- bulina humana com o antígeno desejado. As células imunes estimula- das por antígeno desses animais foram transformadas em hibridomas e subsequentemente testadas para identificar anticorpos monoclonais com baixa afinidade nanomolar para seu antígeno alvo. In vivo, a ma- turação de afinidade natural pelo sistema imune ocorre por hipermuta- ção somática e seleção clonal, enquanto in vitro, na maturação de afi- nidade de laboratório, pode ser obtida por mutação e seleção. Além disso, outros métodos para maturação de afinidade além daqueles que utilizam células B ativadas por células TFH são conhecidos na técnica e estão dentro do escopo da presente invenção.

EXEMPLOS

[00113] A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

MÉTODOS E MATERIAIS

[00114] Os seguintes métodos e materiais foram utilizados para as experiências descritas nos Exemplos.

Isolamento de monócitos CD14* de PBMC humanas

[00115] A diferenciação de macrófagos em macrófagos M1 ou M2 foi executada mediante o isolamento da PBMC de indivíduos e incuba- ção dos macrófagos em 50 ng/ml hGM-CSF durante 6 dias para con- verter em macrófagos M1 ou incubação dos macrófagos em 100 ng/ml M-CSF durante 6d para converter em Macrófagos M2 (Figura 5).

[00116] A conversão de macrófagos em macrófagos M1 ou M2 foi confirmada através da verificação de fenótipo (Figuras 6 e 7).

[00117] A conversão subsequente de macrófagos M1 ou M2 em macrófagos M1 foi executada através da incubação dos macrófagos em LPS (100 ng/ml) + IFNy (100 ng/ml) ou 500 ng/ml de anticorpo anti- VSIG4 (EU103.2) durante 24 horas (Figura 12).

[00118] A conversão de macrófagos M1 ou M2 em macrófagos M2 foi executada mediante a incubação dos macrófagos em 20 ng/ml IL-4 durante 24 h (Figura 12).

Anticorpo Anti-VSIG4 Humanizado - Anticorpo EU103.2

[00119] O anticorpo EU103.2 é um anticorpo anti-VSIG4 humaniza- do gerado a partir do anticorpo anti-VSIG4 de camundongo mu6H8. As Figuras 4A e 4B mostram a caracterização bioquímica do anticorpo EU103.2 utilizando HPLC de exclusão por tamanho (Figura 4A) e ex- perimentos de ressonância plasmônica de superfície, que mostra a ligação de VSIG4 ao anticorpo EU103.2 (Figura 4B). Um sumário dos dados de purificação do anticorpo EU103.2 é mostrado na TABELA 1, abaixo.

TABELA 1: SUMÁRIO DOS DADOS DE HPLC DE EXCLUSÃO POR

TAMANHO PARA O ANTICORPO EU103.2 Concentração Total por transfecção de 30 ml Aa a aeee TO 1,2 mg/ml x 7ml EEE —— Humanização de Anticorpo Anti-VSIG4 de Camundongo - Anticor- po EU103.3

[00120] O anticorpo anti-VSIG4 humanizado hu6H8 (ou EU103.3) foi produzido conforme descrito abaixo. humanização mu6H8 VH

[00121] A estrutura para a variante humanizada de VH foi produzida utilizando o anticorpo 6H8 de camundongo e Blast (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) (gene da linha germinativa: VH2-5 / D3-3 / JH6c). A numeração de Kabat foi utilizada para classificar as CDRs e o VH humanizado foi projetado com a estrutura e as CDRs mu6H8 VH classificadas, mutações reversas de VH2, VH27, VH30, VH93 e VH94. (hu6H8.3 VH) humanização mu6H8 VL

[00122] A estrutura para a variante humanizada de VL foi produzida utilizando o anticorpo 6H8 de camundongo e Blast (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) (gene da linha germinativa: A17 / JK2). A numeração de Kabat foi utilizada para classificar as CDRs, e o VL humanizado foi projetado com a estrutura e CDRs mu6H8 VL classificadas, mutações reversas de VH2, VH4, VH36 e VH46. (hu6H8.3 VL) Clonagem e Expressões de anticorpo IgG - Anticorpo EU103.3

[00123] A sequência da região variável de cadeia pesada foi modifi- cada por mutações FES (L234F, L235E, P331S) para construir o plasmídeo de expressão da cadeia pesada pOptivec (Invitrogen) sem funções efetoras de Fc, como mostrado na Figura 21A. A sequência da região variável de cadeia leve foi construída utilizando pcDNA3.3 (Invitrogen) e sintetizada utilizando IDT, como mostrado na Figura 21B. O gene que codifica a cadeia pesada (HC) foi flanqueado com EcoR1, enzima de restrição Nhe1l para construir o vetor plasmídeo pOptivec (FES) e o gene que codifica a cadeia leve (LC) foi flanqueado com EcoR1, enzima de restrição BsiW1 para construir o vetor plasmí- deo pcDNA3.3. A clonagem foi feita com os sítios de mutação subclo- nados na estrutura hu6H8.3. Os genes de inserção e vetores lineari- zados resultantes foram clonados com o In-Fusion& HD Cloning Kit (Clontech) e o iniciador de sequenciamento foi identificado com CMV Forward, iniciador reverso EMCV IRES. Camundongos Nocaute de VSIG4

[00124] “Camundongos K/O de VSIG foram gerados pela recombi- nação homóloga substituindo o éxon 1 pelo gene de resistência à ne- omicina. Um vetor de direcionamento foi gerado para uso em recombi- nação homóloga nas células ES. E1 e E1 e E2 indicam éxon 1 e 2 do gene CRlg (Figura 41A). A recombinação homóloga do alelo CRIg na prole fêmea heterozigótica de camundongos quiméricos dos clones 1 e 2 de células ES (C1, C2) criados com camundongos WT foi confirma- da por Southern blot (Figura 41B). Os números de leucócitos no san- gue periférico de camundongos machos e fêmeas WT e K/O foram comparados. As contagens totais de células sanguíneas foram deter- minadas utilizando um hematocitômetro. Os leucócitos foram incuba- dos com anticorpos conjugados com fluorocromo específicos para vá- rios marcadores de superfície celular e os números de diferentes sub- conjuntos de leucócitos foram determinados por citometria de fluxo. Os dados representam a média + SD de 5 a 7 camundongos (Figura 41C). Anticorpos A1, A2, A1.3 e A2.3

[00125] Os anticorpos A1 e A2 são gerados pela maturação de afi- nidade do anticorpo EU103.3 (ver a Tabela 2, abaixo), onde as regiões variáveis da cadeia leve nas posições 76, 90 e/ou 92 (número kabat) são mutadas, conforme mostrado na Tabela 2 abaixo.

[00126] Os anticorpos A1.3 e A2.3 são gerados a partir dos anticor- pos A1 e A2, respectivamente, para melhorar ainda mais a afinidade com o VSIGA.

[00127] A Figura 40 fornece o alinhamento de sequências de ami- noácido para cadeias pesadas e cadeias leves de EU103.3, A1, A2, A1.3 e A2.3 são mostradas, juntamente com sequências de aminoáci- do de consenso para a cadeia pesada e cadeia leve. Os resíduos de aminoácido que diferem entre os diferentes anticorpos são mostrados em caixas retangulares. TABELA 2: CLONES DE ANTICORPOS ANTI-VSIG4 HUMANIZADOS RASTREADOS EM EXPERIMENTOS DE MATURAÇÃO DE AFINI-

DADE e em e o EI EO Nome Ab teca HC LC ção (HC) ção (LC) (número Kabat) (número Kabat) men fa pm pe o [remar mama fa de e as fes qr es DO Trena se] mas fa pm e o [usar [70%os [o [7om|wr Te — [7a [es [rvep Jows [7 [o [rompr [eee | ma e qm es o [sem ms Te qr qe o Tum ma de e E mm e ep ser | [73 Tm [rs] [se — | pe de [ele Ti e ee en de de EI EO Nome Ab teca HC LC ção (HC) ção (LC) (número Kabat) (número Kabat) Er Ee E [pm [e [ri [een | [ras ue vw e Tm [re fue Dr Te O Tune rr fu dm e eee [rs [os Dr | Trees [ras Jus fm e ee [a Tm Sei [sm TT Produção de anticorpos com alta afinidade de ligação

[00128] O gene do anticorpo humanizado foi inserido em um plas- mídeo e expresso na forma de IgG utilizando o sistema de expressão Expi293 (Invitrogen), depois purificado utilizando AktaPure (GE Heal- thcare), purificador AktaPrime (GE Healthcare) e coluna Mabselec- tSURE (GE Healthcare, Catit11-0034-95). Os anticorpos purificados foram operados através de uma coluna de dessalinização (GE Heal- thcare, Catft17-1408-01) com alteração do tampão de PBS e a con- centração do anticorpo foi medida com Multiskan GO (Thermo). TABELA 3: RENDIMENTOS DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS COM

ALTA AFINIDADE DE LIGAÇÃO ge e Te Tm gre e Tae Ts es Rr Th Te e e Ts Te es Rr Ts bs pe Ts Te Te er Te es Ts

Em e Te Te e e e fes pm e E Tee Em e br Tee Eme e Te Tee Em e br Tee Gm e be Tm e e ba ee pe Ts Te RR e e be Te Ge e bs Te A Em e be Te ra e be Te Diferenciação de Macrófagos derivados de PBMC

[00129] Os macrófagos M1 e M2 foram obtidos de PBMC utilizando o protocolo abaixo.

1. Mistura de sangue com sobreposição de 20 ml de PBS (1:1) em 10 ml de Ficoll-Paque'Y Plus (GE Healthcare, Cat f%17-1440- 02)

2. Centrifugar em 400 x g durante 35 min (aceleração 2, freio 0)

3. Isolamento e lavagem de PBMC por meio RPMI-1640 (WelGene, CatttLB011-01) em 2000 rpm durante 5 min x 2 vezes

4. Contagem

5. Tampão MACs (2% FBS (Millipore, CatttTMS-013-BKR) em suspensão de 1 -2 ml de PBS (WelGene, CatttLB004-02)

6. Adicionar micropartículas de CD14 (células 20 ul/10") (Miltenyi Biotec, Catft130-050-201)

7. Incubação durante 30 min no gelo

8. Lavagem por tampão MACs em 2000 rpm durante 5 min x 2 vezes

9. Contagem

10. Carregar as células na coluna MACs (Miltenyi Biotec, Cattt130-042-401)

11. Seleção positiva e contagem

12. Suspensão por meio de cultura (RPMI-1640 + FBS a 10% + Penicilina/Estreptomicina (Gibco, Cattt15140-122) + Glutamax (Gibco, Cattt35050-061) + 20 40 ng/ml de rhM-CSF (Biolegend, Cattt574806)

13. Semear as células CD14* em uma placa de cultura de 100 mm (1 x 10º células/10 ml/placa) (Thermo Scientific, Cattt150466)

14. A cada 3 dias depois, troca de meio de cultura fresco

15. Após 7 —10 dias, verificação da diferenciação de macró- fagos MO por FACS

16. Diferenciação de macrófagos MO em M1 ou M2 por LPS ng/ml (Sigma-Aldrich, CatttL4391) + rhiIFNy 20 ng/ml (Biolegend, Cattt570204) (M1) e rhlL4 20 ng/ml (Biolegend, Cattt£574002) + rhiL13 20 ng/ml (Biolegend, Cattt571102) (M2) meio de cultura (RPMI-1640 + FBS 10% + Penicilina/Estreptomicina + Glutamax) durante 2 dias

17. Após a diferenciação M1 ou M2, verificação do fenótipo celular por FACS

18. Para conversão de macrófagos M2 em M1, adicionar os anticorpos 20 ug/ml ou LPS 20 ng/ml + rhlFNy 20 ng/ml (controle posi- tivo) em meio de cultura fresco (RPMI-1640 + FBS 10% + Penicili- na/Estreptomicina + Glutamax) durante 2 dias

19. Após a conversão de M2 em M1, verificação do fenótipo celular por FACs e verificação de citocinas/quimiocinas em sup culti- vado por LEGENDplex'Y (Biolegend, Catit740502)

Análise de FACS

[00130] Os seguintes anticorpos foram utilizados para análise de FACs: e hoD14-BV650 (BD Bioscience, Cattt563419) e hoOD14-BV421 (BD Bioscience, Cattt565283) e hiIFNy-PE/Cy7 (BD Bioscience, Cattt557844) e hoD3-BV510 (BD Bioscience, Cattt563109) e hoD8-V450 (BD Bioscience, Cattt560347) e hoD68-PE (Biolegend, Catt333808) e hoOD93-PE (Biolegend, Catt336108) e HLA-DR-BV421 (Biolegend, Catf307636) e hOD45-PE (Biolegend, Cattt304008) e hoD64-APC (Biolegend, Cattt305014) e hOD163-APC/Cy7 (Biolegend, Cattt333622) e hoD86-PerCP/Cy5.5 (Biolegend, Cattt305420) e hoD86-BV421 (BD Bioscience, Cattt562432) EXEMPLO 1: EXPRESSÃO VSIG4 EM MACRÓFAGOS

[00131] VSIG4 é expresso em macrófagos M2. As Figuras 3A e 3B mostram dados correlativos para a expressão de VSIG4 (conforme medido por mRNA) com a de vários genes associados a macrófagos tipo 2 (M2) e macrófagos associados a tumor. Como mostrado na Fi- gura 3A, a expressão de VSIG4 se correlaciona negativamente com a expressão [CXCL11, CXCL13, ZNMB, IFNAR1, IFNAR2], mas enquan- to se correlaciona positivamente com a expressão de CCL19, IRF5 e IL1A. A Figura 3B mostra que a expressão de VSIG 4 se correlaciona positivamente com a expressão de CD163, CSFIR, MSR1, TGFBR?2, STATG6, ILIR1, IL1ORA, MS4A4A, CCL2, CCL14, CCL17 e MS4A6A.

[00132] A Figura5 mostra a expressão de VSIG4 em macrófagos M2. Os dois painéis na linha superior da Figura 5 mostram imagens de microscópio luminoso que mostra a morfologia dos macrófagos M1 e

M2. A segunda e terceira linhas mostram dados de citometria de fluxo para linfócitos corados para CD14 e VSIGA4, demonstrando que células M?2 (coradas positivas para CD14) também expressam VSIGA. EXEMPLO 2: ANTICORPO ANTI-VSIG4 HUMANO INDUZ A SECRE- ÇÃO DE CITOCINA E QUIMOCINA EM MACRÓFAGOS M2

[00133] “Macrófagos M1 e M2 foram tratados com anticorpo EU103.2 e a secreção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias foram medi- das. Conforme mostrado na Figura 6, o tratamento de macrófagos M2 com EU103.2 resultou na indução das citocinas e quimiocinas IL12, IFNy, IL10 e 1L23. EXEMPLO 3: ANTICORPO ANTI-VSIG4 HUMANIZADO CONVERTE MACRÓFAGOS M2 EM MACRÓFAGOS M1

[00134] Para testar ainda mais os efeitos de EU103.2 sobre os ma- crófagos, macrófagos M2 foram tratados com anticorpo EU103.2 e co- rados para o marcador de macrófago M2 CD163. Como mostrado na Figura 7, o tratamento com EU103.2 diminuiu a expressão do marca- dor de macrófago M2 CD163 em macrófagos M2, o que sugeriu que o bloqueio de VSIGA4 utilizando EU103.2 resultou na conversão de ma- crófagos M2 em um tipo de célula diferente.

[00135] Em seguida, os efeitos do anticorpo EU103.2 na interação macrófago-célula T foram testados pela coincubação de macrófagos M2 com células T CD8* com ou sem tratamento com anticorpo EU103.2. Conforme mostrado na Figura 8, macrófagos M2 tratados com EUT103.2, quando coincubados com células T CD8”, resultaram na proliferação das células T CD8*, indicando que macrófagos M2 são convertidos em macrófagos M1 quando tratados com anticorpo EU103.2, visto que os macrófagos M1 induzem a proliferação de célu- las T CD8*, enquanto que os macrófagos M2 suprimem a proliferação de células T CD8*.

[00136] Depois, para investigar ainda mais os efeitos do anticorpo

EU103.2 em macrófagos humanos no contexto da biologia do câncer, amostras de fluido abdominal de pacientes com câncer de ovário fo- ram coletadas e analisadas em primeiro lugar com relação à expres- são de VSIGA4. Conforme mostrado na Figura 9, os macrófagos obtidos do fluido abdominal de pacientes com câncer de ovário incluíram ma- crófagos M2 que coexpressaram VSIG4 e CD14 e, como mostrado nas Figuras 10 e 11, induziram a proliferação de células T CD8*.

[00137] Além disso, as imagens do microscópio confirmam que o tratamento com anticorpo EU103.2 converteu macrófagos M2 em ma- crófagos M1, como mostrado na Figura 12.

[00138] O papel da sinalização de VSIGA4 na proliferação de células T CD8* por macrófagos foi ainda confirmado pelo cocultivo de células HeLa que expressam VSIG4 com PBMC, com ou sem anticorpo anti- VSIGA4 para bloquear o VSIG4, como mostrado na Figura 13. Este ex- perimento mostrou o bloqueio da interação entre VSIG4 e células T CDB8* leva à proliferação aumentada de células T CD8*.

[00139] Para examinar mais além o papel de VSIG4 nas células T CD8*, as células THP-1 monocíticas foram coincubadas em várias re- lações com células T, na presença de anticorpo anti-VSIG4 ou um an- ticorpo IgG de controle, para mostrar que o anticorpo anti-VSIGA4 foi capaz de aumentar as células T CD8* em 4 divisões, em comparação com o IgG de controle. EXEMPLO 4: EFEITOS ANTITUMORAIS BLOQUEANDO A SINALI- ZAÇÃO DE VSIG4 UTILIZANDO ANTICORPO ANTI-VSIG4 OU MO- DELO DE NOCAUTE DE VSIG4

[00140] Para determinar os efeitos antitumorais do anticorpo anti- VSIGA, três modelos de tumor de camundongo foram utilizados: mode- lo de tumor de camundongo de adenocarcinoma de cólon MC38, mo- delo de tumor de camundongo de melanoma B16F10 e modelo de tu- mor de camundongo de carcinoma de pulmão 3LL utilizando camun-

dongos nocaute de VSIG4 e em comparação com camundongos do tipo selvagem, como mostrado nas Figuras 15A, 15B e 15C, respecti- vamente. O crescimento do tumor foi suprimido, especialmente para modelos de tumor de camundongo MC38 e 3LL em camundongos no- caute de VSIG4, em comparação com camundongos do tipo selvagem (ver as Figuras 15A e 15C, respectivamente), confirmando que o cres- cimento do tumor é suprimido na ausência de sinalização de VSIGA.

[00141] A supressão semelhante do crescimento de tumor foi ob- servada no modelo de tumor de camundongo MC38 em camundongos do tipo selvagem que foram injetados com anticorpo anti-VSIG4, em comparação com camundongos injetados com IgG de controle, como mostrado na Figura 16. A extensão da supressão de crescimento do tumor por anticorpo anti-VSIG4 foi pelo menos como pronunciado, se- não maior, do que aqueles em camundongos nocaute de VSIGA.

[00142] A seguir, o status de ativação de linfócitos de nódulos linfá- ticos de drenagem de tumor foi examinado em camundongos nocaute de VSIG4 e comparado com camundongos do tipo selvagem. Como mostrado nas Figuras 17A e 17B, níveis comparáveis de linfócitos CD4* e CD8* foram observados nos camundongos nocaute de VSIG4 em comparação com suas contrapartes do tipo selvagem, e expressão de CD62L comparável foi observada nos linfócitos que expressam CD4 e CD8 entre os camundongos nocaute de VSIG4 e camundongos do tipo selvagem. Além disso, os camundongos nocaute de VSIGA ti- nham células T CD8B* aumentadas, em comparação com os camun- dongos do tipo selvagem, como mostrado na Figura 17C, mas níveis comparáveis de linfócitos CD11B*/Gr-1-, como mostrado na Figura 17D.

[00143] Para avaliar ainda mais o papel da sinalização de VSIG4 no crescimento do tumor, o modelo de tumor de camundongo de adeno- carcinoma de cólon CD38 foi utilizado em camundongos nocaute de

VSIGA4 e camundongos do tipo selvagem, onde o agente quimioterápi- co Claforan (CTX) foi injetado por via interperitoneal nos dias 18 e 23 após a injeção de tumor nos camundongos em questão, como mostra- do no diagrama esquemático na parte superior da Figura 18A. A inje- ção de Claforan resultou em uma maior redução do volume do tumor em camundongos nocaute de VSIG4 em comparação com camundon- gos do tipo selvagem, e esta redução no tamanho do tumor foi mantida 40 dias após a injeção do tumor. Em contraste, em camundongos do tipo selvagem, a injeção de CTX resultou em uma ligeira redução no tamanho do tumor, seguida por crescimento contínuo do tamanho do tumor, como mostrado na Figura 18A. Imagens de camundongos e micrografias de seções de tumor para ambos os camundongos nocau- te de VSIG4 e um camundongo do tipo selvagem no dia 24 após a in- jeção do tumor são mostradas na Figura 18B. As seções do tumor fo- ram coletadas de camundongos C57BL/6 de VSIG4** e VSIG4"” no dia 24 e as seções de parafina dos tecidos do tumor foram coradas com H&E.

[00144] Os efeitos da supressão de tumor anti-VSIG40n em modelo de camundongo humanizado foram avaliados pela injeção de 10 mg/kg de anticorpo anti-VSIG4 nos dias 19, 22, 25, 28 e 31 após a in- jeção de células cancerígenas HT29 em camundongos humanizados, como mostrado na Figura 19. Supressão significativa do crescimento do tumor foi observada em camundongos que receberam anticorpo anti-VSIG4 em comparação com aqueles que receberam injeção de controle de IgG.

[00145] Esses experimentos demonstraram como mostrado es- quematicamente na Figura 20 que a sinalização de VSIG4 modula a supressão da proliferação de células T por macrófagos M2, e que o bloqueio da sinalização de VSIG4 resulta em (1) anulação da prolifera- ção de células T induzida por macrófagos M2, o que leva a prolifera-

ção celular T CD8* e supressão tumoral; e (2) conversão de macrófa- gos M2 em macrófagos M1. EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS A1, A2, A1.3 e A2.3

[00146] Os clones de anticorpo A1, A2, A1.3 e A2.3 foram desen- volvidos por maturação de afinidade de anticorpos EU103.2. Perfil de proteína por HPLC de exclusão de tamanho mostrado nas Figuras 22, 23, 24 e 25, respectivamente, e sumariado abaixo na Tabela 4. TABELA 4: DADOS DE HPLC SEC PARA anticorpos A1, A2, Al.3 e A2.3 [55 [Tempo [Ares — Tam Ttargura [7 Ge Aros [Log [HH [a [755 [5575 [29991175 [0448 100900 2155 1s5os | [E Tr Ta [155 Tom Tn Tam re [ar] 755 [zonas [16505 [97942 Timo Tara [rom [Res [752 [eos [14790 [02095 | 100900 atas 1sa750 |

[00147] Como mostrado nas Figuras 26A e 26B, os anticorpos A1 ou A2 foram aplicados a macrófagos M2 diferenciados durante 2 dias e a análise de FACs mostrou uma diminuição em CD163, um marca- dor para macrófagos M2, e um aumento significativo em CD86, um marcador para macrófagos M1. O tratamento com LPS/IFNy durante dois dias foi utilizado como controle positivo. O tratamento com anti- corpos A1 e A2 mostrou aumento da relação M1/M2. Especificamente, o anticorpo A2 apresentou um aumento na relação próximo àquele do grupo de controle positivo.

[00148] Em seguida, como mostrado na Figura 27, os anticorpos A1 ou A2 foram aplicados a macrófagos M2 diferenciados durante 2 dias repolarizando-os em macrófagos M1 e as mudanças na produção de citocinas e quimiocinas no meio de cultura foram medidas utilizando LEGENDplex'"Y.

[00149] Isso é para confirmar a repolarização de macrófagos M2 em macrófagos M1. O tratamento com LPS/IFNy durante dois dias foi utilizado como controle positivo. Ambos os grupos A1 e A2 apresenta-

ram um aumento de citocina/quimiocina do tipo M1 (TNFa, IL6, IFNy, IP-10 e IL12p40) em comparação com macrófagos M2, enquanto que a produção de citocina/quimiocina do tipo M2 (IL-10, Arginase, TARC e IL-1RA) diminuiu. Especificamente, o aumento da produção de TNFa e IL6 foi comparável àquele do grupo de controle positivo.

[00150] — Além disso, como mostrado na Figura 28, os anticorpos A1 ou A2 foram aplicados a macrófagos M2 diferenciados durante 2 dias e a análise de FACs foi executada para mostrar uma diminuição na expressão de CD163, um marcador para macrófagos M2, e um au- mento significativo na expressão de CD86, um marcador para macró- fagos M1. O tratamento com LPS/IFNy durante dois dias foi utilizado como controle positivo.

[00151] Para determinar ainda mais a repolarização de macrófagos M2 em macrófagos M1 por anticorpos A1 e A2, anticorpos A1 ou A2 foram aplicados com diferentes concentrações (5, 10 e 20 ugml) a macrófagos M2 diferenciados durante 2 dias e a produção de citocinas e quimiocinas pelos macrófagos foi avaliada, como mostrado na Figura

29. A alteração na produção de citocinas/quimiocinas no meio de cul- tura foi medida utilizando LEGENDplex'Y. O tratamento com LPS/IFNy durante dois dias foi utilizado como controle positivo. Os grupos tanto A1 quanto A2 apresentaram um aumento de TNFa, IL6 e IP-10, que estão associados a macrófagos M1, e essa tendência foi especialmen- te pronunciada quando os macrófagos M2 foram tratados com anticor- po A2. A produção de Arginase, que está associada aos macrófagos M2, diminuiu independentemente da concentração dos anticorpos.

[00152] A capacidade quimiotática de macrófagos após a conver- são de macrófagos M2 em macrófagos M1 por anticorpo A?2 foi avalia- da através do ensaio de quimiotaxia. Utilizando uma câmara de tama- nho de poro de 5 um de 24 cavidades Transwell (Corning, CattCLS3421-48EA), a câmara inferior foi tratada com o quimioatraen-

te rnCCL19 (Biolegend, Cattt582104), que é uma quimiocina do tipo M1, em uma concentração de 100 ng/ml (volume 400 ul) e a câmara superior foi tratada com macrófagos M1 repolarizados em 1,5 -5 x 10º células/600 ul, onde M2 ou A2 foi aplicado durante 2 dias (tratamento com LPS/IFNy durante dois dias foi utilizado como controle positivo). Após um período de incubação de 4 horas a 37 ºC e 5% de CO>2, 100 ul das células na câmara inferior foram movidos para uma placa de 96 cavidades. Em seguida, 10 ul de solução de CCK-8 (Dojindo, CatttCK04) foram adicionados a cada cavidade e após um período de incubação de 1 hora a absorvância foi medida (450 nm). Como mos- trado na Figura 30, macrófagos M1 do grupo A2 apresentaram capaci- dade quimiotática, confirmando a conversão de macrófagos de M2 em M1 pelo anticorpo A2.

[00153] A análiseda matriz de genes foi executada para analisar a mudança na expressão gênica após a conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1 por anticorpos A2, como mostrado na Figura 42. Os macrófagos M2 foram tratados com anticorpos A2 e as células fo- ram colhidas após dois dias (Macrogen, Agilent Human GE 8x60K V3). A análise mostra aumento da expressão do marcador de fenótipo M1 e citocinas/quimiocinas do tipo M1, semelhante às células tratadas com LPS/IFNy como controle positivo e diminuição da expressão do mar- cador de fenótipo M2 e citocinas/quimiocinas tipo M2. EXEMPLO 6: EFEITOS ANTITUMORAIS DE ANTICORPOS A1/1, A2 A1.3 e A2.3

[00154] O efeito antitumoral dos anticorpos A1 e A2 foi avaliado uti- lizando um modelo de camundongo humanizado. Células CD34 hu- manas foram injetadas em camundongos NBSGW, depois que as amostras de sangue foram coletadas e células CD45 humanas nas PBMC foram medidas para observar a humanização dos camundon- gos ao longo de um período de 12 — 14 semanas. Células de câncer do cólon HCT-15 foram injetadas, 1 x 10” células/camundongo, nos camundongos humanizados, e após 5 dias os camundongos foram divididos em três grupos, cada um recebendo injeções de hlgG (Sig- ma-Aldrich, Catf14506), anticorpo A1 ou anticorpo A2. Os anticorpos foram injetados a cada três dias para um total de 5 injeções, como mostrado esquematicamente na Figura 31A. Os tamanhos dos tumo- res foram observados e depois que os camundongos foram sacrifica- dos, o soro do sangue foi utilizado para medir IFNy utilizando ELISA (invitrogen, Cattt88-7316-88) e as amostras de tumor foram utilizadas para analisar leucócitos infiltrados.

[00155] “Conforme mostrado nas Figuras 31B e 31C, nenhum efeito antitumoral de anticorpos A1 foi observado, mas as amostras do grupo de anticorpos A2 mostraram tamanho tumoral menor e aumento de IFNy, confirmando o efeito antitumoral de anticorpos A2.

[00156] Logo depois, o efeito da conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1 pelo anticorpo A2 no contexto do crescimento do tu- mor foi avaliado in vivo. Como mostrado esquematicamente na Figura 32A, células de câncer de cólon SWA480 foram injetadas em camun- dongos (1 x 107 células/camundongo) e assim que o tamanho do tu- mor cresceu até um certo tamanho (1000 mmº?-), macrófagos M2 dife- renciados (7 x 10º células/camundongo) foram injetados com hlgG ou anticorpo A2. Os anticorpos foram injetados a cada 2 dias para um to- tal de 5 injeções, e após a primeira injeção as amostras de sangue fo- ram coletadas nos dias 4, 7 e 11 após a injeção do tumor, e as amos- tras de sangue foram utilizadas para isolar o soro ou PBMCs para ana- lisar a mudança no fenótipo de macrófago utilizando a análise FACSs.

[00157] Nodia7 após a injeção de células tumorais, uma mudança no fenótipo de macrófago M1 foi observada a partir do grupo de anti- corpo A2, como mostrado na Figura 32B. Embora não tenha havido alteração em CD163, um marcador de macrófagos M2, a expressão de marcadores de macrófagos CD86 e HLA-DR a M1 aumentou visivel- mente em comparação com o grupo hlgG que confirma a conversão de macrófagos M2 em M1 pelo anticorpo A2, como mostrado na Figu- ra 32C.

[00158] Em seguida, o efeito da conversão de M2 em macrófagos M1 no crescimento do tumor foi analisado.

[00159] Como mostrado esquematicamente na Figura 33A, uma mistura de células de câncer de cólon HCT-15 (8 x 10º células/camun- dongo) e concentrações variáveis de macrófagos M2 (2,5 x 10º /5x 10º / 1 x 106 células/camundongo) foi injetada nos camundongos. Após 2 dias, o anticorpo hlgG ou A?2 foi injetado a cada 3 dias para um total de 5 injeções.

[00160] Como mostrado nas Figuras 33B, o anticorpo A2 reduziu ou desacelerou o crescimento do tumor de uma maneira dependente da dose no dia 14 após a injeção do tumor, em comparação com os ca- mundongos de controle hlgG, e este efeito persistiu no dia 25 após a injeção do tumor.

[00161] Depois, os efeitos antitumorais do anticorpo A2 em um mo- delo de camundongo humanizado foram avaliados utilizando um mo- delo de tumor de camundongo diferente. Conforme mostrado esque- maticamente na Figura 34A, as células CD34 humanas foram injeta- das em camundongos NBSGW, após o que as amostras de sangue foram coletadas e as células CD45 humanas nas PBMC foram medi- das para observar a humanização dos camundongos ao longo de um período de 12 — 14 semanas. Células de câncer de cólon SWA480 (1 x 10º células/camundongo) foram injetadas em camundongos e após 5 dias os camundongos foram divididos em dois grupos, cada um injeta- do com hlgG ou anticorpo A2 (20 mg/kg). Os anticorpos foram injeta- dos a cada 3 dias para um total de 5 injeções para cada grupo. O ta- manho do tumor foi observado e depois que os camundongos foram sacrificados, o soro do sangue foi utilizado para medir IFNy utilizando ELISA e as amostras de tumor foram utilizadas para analisar leucóci- tos infiltrados.

[00162] Nenhum efeito antitumoral de anticorpos A1 foi observado, mas, como mostrado nas Figuras 34B e 34C, as amostras do grupo de anticorpos A2 apresentaram tamanho tumoral menor, e aumento de IFNy foi observado, confirmando ainda mais os efeitos antitumorais do anticorpo A2.

[00163] No geral, o grupo com injeções de anticorpo A2 apresentou tumor de tamanho menor e aumento de IFNy no soro. Além disso, co- mo mostrado na Figura 34D, foi observado um aumento nas células T CD8”*, especificamente células T CD8y secretoras de IFNy. Como mostrado na Figura 34E, diminuiu a expressão de CD93 e CD163 (marcador de macrófagos M2) e aumentou a expressão de CD86 (um marcador de macrófagos M1), enquanto nenhuma mudança em HLA- DR foi observada. Estes dados confirmam que o anticorpo A2 atua como mediador da atividade citotóxica de células T CD8*.

[00164] A seguir, o efeito antitumoral dos anticorpos A2 e A2.3 fo- ram comparados em um modelo de camundongo humanizado. Con- forme mostrado esquematicamente na Figura 35A, as células CD34 humanas foram injetadas em camundongos NBSGW, após o que as amostras de sangue foram coletadas e as células CD45 humanas nas PBMC foram medidas para observar a humanização dos camundon- gos ao longo de um período de 12 — 14 semanas. Células de câncer de cólon HCT-15 foram injetadas em 1 x 107 células/camundongo, nos camundongos humanizados, e assim que o tamanho do tumor cresceu até um certo tamanho (-100 mm?), os camundongos foram divididos em três grupos, cada um recebendo injeções de anticorpos hlgG, A2 ou A2.3 (20 mg/kg). Os anticorpos foram injetados a cada três dias pa- ra um total de 5 injeções. O tamanho do tumor foi observado e após a primeira injeção, amostras de sangue foram coletadas em D5 e D13, onde citocinas inflamatórias foram observadas no soro do sangue. Como mostrado na Figura 35B, os anticorpos A2 e A2.3 reduziram o tamanho do tumor.

[00165] Em seguida, os quatro anticorpos anti-VSIG4, A1, A1.3, A2 e A2.3 foram avaliados quanto aos seus efeitos na proliferação de cé- lulas T CD8*. Os anticorpos A1, A1.3, A2 e A2.3 foram adicionados a macrófagos isolados de doadores para converter macrófagos M2 em macrófagos M1 e cocultivados com células T CD8* isoladas de PBMCs do mesmo doador para um ensaio de cocultura. As células T CD8* fo- ram marcadas com CFSE (Life technologies, CatttV12883) e coculti- vadas em uma placa de 96 cavidades revestida com anti-CD3 (BD Biocoat, Cattt354725) em uma relação de 2:1 com os macrófagos após a conversão (CD8 T: Macrófago = 2 x 10º células/cavidade: 1 x 105º células/cavidade). Após 5 dias, as células colhidas foram coradas com hCD8-V450 e analisadas por análise de FACs. A proliferação de células T CD8* foi confirmada pela observação da diminuição dos ní- veis de CFSE. Embora os macrófagos M2 regularam negativamente a proliferação de células T CD8*, as coculturas de anticorpos A1, A1.3, A2 e A2.3 resultaram na conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1, e resultou no aumento da proliferação de células T CD8*, confor- me mostrado nas Figuras 36A e 36B.

[00166] Experimentos semelhantes comparando os efeitos do anti- corpo A2 e anticorpos A2.3 foram executados utilizando macrófagos e células T isoladas de diferentes doadores do que no experimento aci- ma (isto é, diferentes daqueles doadores na Figura 36). Os anticorpos A2 e A2.3 foram aplicados a macrófagos para converter macrófagos M2 em macrófagos M1, e células T CD8* foram isoladas de PBMCs do mesmo doador e utilizadas para um ensaio de cocultura. As células T CD8 foram marcadas com CFSE (Life technologies, Cat&V12883) e cocultivadas em uma placa de 96 cavidades revestida com anti-CD3 (BD Biocoat, Catt354725) em uma relação de 1:1 ou 2:1 com os ma- crófagos após conversão (CD8* T: macrófago = 2 x 10º células/cavi- dade: 2 x 10º células/cavidade ou 2 x 10º células/cavidade: 1 x 105º cé- lulas/cavidade). Após 5 dias, as células colhidas foram coradas com hCD8-V450 e analisadas por análise de FACs. A proliferação de célu- las T CD8* foi confirmada pela observação da diminuição dos níveis de CFSE. Enquanto os macrófagos M2 regularam negativamente a proliferação de células T CD8”, a adição de anticorpos A2 e A2.3 para converter macrófagos M2 em macrófagos M1 resultou no aumento da proliferação de células T CD8*.

[00167] Em seguida, as células HeLa de expressão de hVSIGA4 (cé- lulas HeLa-hVSIG4) foram utilizadas para confirmar o papel da sinali- zação de VSIG4 na indução mediada por anticorpos A2 e A2.3 da pro- liferação de células T CD8*.

[00168] As células T CD8* foram isoladas de PBMCs de um doador saudável, marcadas com CFSE e aplicadas a uma placa revestida com anti-CD3 (2 x 10º células/cavidade). Após 1 dia, as células HeLa ou HeLa-hVSIG4 foram adicionadas às cavidades após irradiação de 30Gy (raio-x) (1 x 10º ou 0,5 x 10º células/cavidade). Após 5 dias, a proliferação de células T CD8* foi analisada através da medição dos níveis de CFSE utilizando análise de FACs. As células T CD8* também foram tratadas com anti-CD3 (Miltenyi Biotech, Catf130-093-387) em diferentes concentrações e após 1 dia, as células Hela ou HeLa- hVSIG4 foram adicionadas às cavidades após irradiação de 30Gy (raio-x) - (1 x 10º células/cavidade). Após 5 dias, 100 ul das células cultivadas foram movidos para uma placa de 96 cavidades separada e CCK-8 foi adicionado a cada cavidade (10 ul/cavidade). Após 5 horas, a absorvância foi medida em 450 nm, confirmando a proliferação de células T CD8*. Como mostrado nas Figuras 38A e 38B, HeLa-hVSIG4 regulou negativamente a proliferação de células T CD8*, enquanto que o tratamento com A2 ou A2.3 induz a proliferação de células T.

[00169] A matriz de fósforo-cinase humana foi utilizada para exami- nar a via de sinal através da qual o macrófago é repolarizado pelo an- ticorpo A2. Como mostrado na Figura 39, a conversão de macrófagos M2 em macrófagos M1 através do tratamento com anticorpo A2 resul- tou em aumento significativo na fosforilação de JNK, MSK1/2 e p38a, conforme medido utilizando Proteome Profiler"y Antibody Arrays (R&D Systems, CattARY003B).

SEQUÊNCIA DE ANTICORPO E INFORMAÇÕES DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO

[00170] Informações de sequência e informações de afinidade de ligação para os vários anticorpos anti-VSIG4 aqui descritos são forne- cidas nas TABELAS 5 a 12, abaixo.

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TABELA 12: AFINIDADE DE LIGAÇÃO (Kp) DE ANTICORPOS EU103.2, EU103.3, A1, A2, A1.3 e A2.3 PARA VSIG4 [anfcomo — Kat TRAI) xomm

OUTRAS MODALIDADES

[00171] Deve ficar entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição ante- rior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é de- finido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vanta- gens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindica- ções.

Claims (30)

UT REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido da SEQ ID NO: 17, uma CDR?2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18, uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19; e b. uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20, uma CDR?2 de cadeia leve compre- endendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21 e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer um dos seguintes: a. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; b. um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; ou c. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 12.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer um dos seguintes: a. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; b. um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; ou c. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 e um domínio variável de cadeia leve com- preendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 23.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acor- do com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16 e um domínio variável de cadeia leve compreen- dendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pos- sui uma afinidade de ligação (Ko) para uma molécula humana de do- mínio V-Set e a imunoglobulina contendo 4 (VSIG4) de 1x 107 a 1x 10º.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pos- sui uma afinidade de ligação (Kp) para uma molécula de VSIG4 de cerca de 7,156 x 10º a cerca de 7,636 x 10º.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pos- sui uma afinidade de ligação (Kp) para uma molécula de VSIG4 ao re- dor de 7,156 x 10, ao redor de 7,636 x 10º, ao redor de 7,952 x 10º, ao redor de 8,226 x 10º ou ao redor de 8,688 x 10º.

14. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindi- cação 14.

16. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico, como de- finida na reivindicação 14, está ligada de maneira operável a um pro- motor.

17. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende dois vetores separados, cada um compreendendo a sequência de ácido nucleico correspondente à cadeia pesada e à cadeia leve do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno.

18. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 14, ou o vetor recombinante, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 15 a 17.

19. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de levedura ou uma célula bacteriana.

20. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula sele- cionada do grupo que consiste em E.coli, P.pastoris, Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 e um linfócito de mamífero.

21. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é a célula Expi293.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 14, o vetor recombinante, como defini- do em qualquer uma das reivindicações 15 a 17, ou a célula hospedei- ra, como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 21; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

23. Método de tratamento de um indivíduo com sua neces- sidade, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. administrar ao indivíduo uma composição que compre- ende ou libera o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 14, o vetor recombinan- te, como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17, ou a célula hospedeira, como definida em qualquer uma das reivindicações

18 a 21, tratando assim uma doença ou condição.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado de um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer do endomé- trio, câncer de esôfago, câncer de trompas de Falópio, câncer de vesí- cula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, cân- cer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pul- mão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer de ovário, câncer peri- toneal primário, câncer de glândula salivar, sarcoma, câncer de estô- mago, câncer de tireoide, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, glioblastoma e câncer de próstata.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi adminis- trado ou será administrado com uma ou mais terapias anticâncer adi- cionais selecionadas de radiação ionizante, um agente quimioterapêu- tico, um agente de anticorpo e uma terapia baseada em células, de tal modo que o indivíduo recebe tratamento com ambos.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que a uma ou mais terapias anticâncer adicionais com- preendem um inibidor do ponto de controle imunológico, IL-12, GM- CSF, um agente anti-CDA4, cisplatina, fluorouracila, doxorrubicina, irino- tecano, paclitaxel, inibidor da indoleamina 2,3 -dioxigenase- 1 (IDO1) ou ciclofosfamida.

28. Método para aumentar a secreção de citocinas ou qui- miocinas em macrófagos M2, caracterizado pelo fato de que compre- ende: a. colocar em contato os macrófagos M2 com o anticorpo

7I7 ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

29. Método de indução da proliferação de células T CD8*, caracterizado pelo fato de que compreende: a. colocar em contato um macrófago M2 com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 13; e b. coincubar o macrófago M2 com células T CD8*.

30. Método de conversão de um macrófago M2 em um ma- crófago M1, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato o macrófago M2 com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.