CN101818133B

CN101818133B - Vsig4和igrp双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101818133B
Application number: CN2009102510811A
Authority: CN
Inventors: 杨曌; 吴玉章
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2029-12-29
Also published as: CN101818133A

Abstract

本发明公开了一种VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用，该重组腺病毒基因组中包含一个VSIG4和IGRP双基因表达盒，该表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、VSIG4全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、IGRP全长编码基因和终止子；该重组腺病毒的制备方法简单；将其体外转染树突状细胞再回输体内，能够降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴细胞的增殖能力和细胞因子分泌能力，而且能够延迟NOD小鼠糖尿病的发病时间并降低发病率，表明本发明的重组腺病毒能够有效诱导特异性T细胞耐受，并有效抑制胰岛β细胞的破坏，可用于制备抗1型糖尿病的树突状细胞疫苗。

Description

VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，特别涉及一种VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒，还涉及该重组腺病毒的制备方法和应用。

背景技术

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，由于身体的免疫系统攻击胰岛β细胞破坏其分泌胰岛素的能力而引起。目前主要依赖胰岛素和胰岛移植进行治疗，虽然能够降低患者的死亡率，却存在着大量副作用。随着研究的深入，实验发现T细胞在免疫系统介导的1型糖尿病的发病过程中发挥了重要作用，特异性诱导T细胞介导的免疫耐受对1型糖尿病是一种很有希望的治疗策略。

在T细胞介导的免疫应答中，T细胞的活化不仅需要抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)的复合刺激，而且需要B7家族成员提供关键的共刺激信号。含V-set和免疫球蛋白域4(V-set and Ig domain containing 4，VSIG4)又称补体受体免疫球蛋白超家族分子(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily，CRIg)，是一种新发现的B7家族相关蛋白。VSIG4的mRNA高表达于成人肺、胎盘、肝和心脏等组织，但VSIG4主要局限表达于巨噬细胞，在单核细胞中几乎没有表达，并且当巨噬细胞受外来刺激活化后VSIG4表达下调。既往研究发现，VSIG4是巨噬细胞上的补体受体，可结合补体C3的降解片段C3b和iC3b，对于病原体的吞噬起重要作用。最近研究显示，VSIG4有抑制T细胞活化的作用，且作用强于PD-Ls/PD-1途径，是一个有力的T细胞活化负调节分子。

葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)是一种胰岛特异性T细胞自身抗原，在1型糖尿病的发病过程中起着非常关键的作用，患者体内有大量的IGRP特异性T细胞存在。因此，在1型糖尿病的治疗中，IGRP有可能成为诱导免疫耐受的重要分子。

基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。

树突状细胞不仅是机体内功能最强大的抗原递呈细胞，可以有效激活初始T细胞启动免疫应答反应，而且树突状细胞本身具有调节免疫反应、诱导免疫耐受的作用。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染树突状细胞制成树突状细胞疫苗，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒，能够有效诱导特异性T细胞耐受，并有效抑制胰岛β细胞的破坏；目的之二在于提供所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法；目的之三在于提供所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒，所述重组腺病毒基因组中包含一个VSIG4和IGRP双基因表达盒，所述VSIG4和IGRP双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、VSIG4全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、IGRP全长编码基因和终止子。

2、所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、RT-PCR扩增VSIG4全长cDNA；

b、RT-PCR扩增IGRP全长cDNA；

c、将步骤a所得VSIG4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，步骤b所得IGRP全长cDNA插入pStar载体的IRES下游，得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP；

d、以步骤c所得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP为模板，PCR扩增VSIG4-IRES-IGRP片段并更换该片段两端的酶切位点；

e、将步骤d所得VSIG4-IRES-IGRP片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV的CMV启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP；

f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP；

g、将重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP在293细胞中包装成重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP。

进一步，步骤a的具体方法为：提取人肺组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以巢式PCR扩增VSIG4全长cDNA：第一轮PCR以所得总cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列为上下游引物；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物；每轮PCR的循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-VSIG4；

进一步，步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示序列为上下游引物，PCR扩增IGRP全长cDNA，PCR循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-IGRP；

进一步，步骤c的具体方法为：自重组载体pT-VSIG4中用Pst I和EcoR I双酶切出VSIG4全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，得重组载体pStar-VSIG4；再自pT-IGRP载体中用BamH I和Sal I双酶切出IGRP全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶切的pStar-VSIG4载体连接，得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP；

进一步，步骤d的具体方法为：以重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列为上下游引物进行PCR，将VSIG4-IRES-IGRP片段两端的酶切位点更换为Sal I酶切位点和Not I酶切位点，PCR循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-VSIG4-IRES-IGRP；

进一步，步骤e的具体方法为：自重组载体pT-VSIG4-IRES-IGRP中用Sal I和Not I双酶切出VSIG4-IRES-IGRP片段，经纯化后与同样用Sal I和Not I双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP；

进一步，步骤f的具体方法为：将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP用Pme I酶切线性化，再与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP；

进一步，步骤g的具体方法为：将人胚胎肾293细胞以40％～60％的细胞密度接种至培养瓶中，待细胞生长至30％～50％融合时，采用Lipofectamine 2000试剂将重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP转染293细胞，待细胞出现明显病变时离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液重悬后，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP。

3、所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒在制备抗1型糖尿病的树突状细胞疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明将胰岛特异性抗原IGRP与新型免疫抑制分子VSIG4进行联合表达，可以诱导IGRP特异性的淋巴细胞免疫耐受，使胰岛细胞能局部性逃逸免疫系统的识别和攻击，而其他正常组织和器官不会受到影响。将本发明的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒体外转染树突状细胞再回输糖尿病易患性NOD小鼠，结果发现，本发明的重组腺病毒能够降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴细胞的增殖能力和细胞因子分泌能力，而且能够延迟NOD小鼠糖尿病的发病时间并降低发病率，表明本发明的重组腺病毒能够有效诱导特异性T细胞耐受，并有效抑制胰岛β细胞的破坏，可以用于制备抗1型糖尿病的树突状细胞疫苗，在1型糖尿病治疗领域具有良好的开发应用前景。同时，本发明重组腺病毒的制备方法简单，成本低。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示了VSIG4全长cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(1泳道为DNA分子量标准，2泳道为PCR产物)；

图2显示了IGRP全长cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(1泳道为DNA分子量标准，2泳道为PCR产物)；

图3显示了VSIG4和IGRP双基因共表达的免疫印迹(Western Blot)结果(1泳道为Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞总蛋白，2泳道为空病毒转染树突状细胞总蛋白)；

图4显示了淋巴细胞增殖能力的检测结果；

图5显示了淋巴细胞分泌细胞因子能力的检测结果；

图6显示了NOD小鼠糖尿病的平均发病率。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP的制备

1、VSIG4全长cDNA的克隆

按Trizol试剂盒说明书提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以巢式PCR法扩增VSIG4全长cDNA：第一轮扩增以所得总cDNA为模板，以F1：5’-ggtagcaggaggctggaagaaag-3’(SEQ ID No.1)和R1：5’-tcagcagatcctggcctaatgg-3’(SEQ ID No.2)为上下游引物；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，以F2：5’-aatctgcaggccaccatggggatcttactgggcctg-3’(SEQ ID No.3，下划线部分为Pst I酶切位点)和R2：5’-tacgaattcttaacagacacttttgccctcag-3’(SEQ ID No.4，下划线部分为EcoR I酶切位点)为上下游引物；每轮PCR体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-VSIG4。

琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1200bp处呈单一特异性条带(图1)，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ ID No.5)与GenBank登录号为NM_007268的VSIG4全长cDNA序列一致。

2、IGRP全长cDNA的克隆

按Trizol试剂盒说明书提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F3：5’gatcggatccccaagatgatatgggtagc-3’(SEQ ID No.6，下划线部分为BamH I酶切位点)和R3：5’-acgcgtcgactgtcaatgtggatccagtc-3’(SEQ IDNo.7，下划线部分为Sal I酶切位点)为上下游引物，PCR扩增IGRP全长cDNA，PCR体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-IGRP。

琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1100bp处呈单一特异性条带(图2)，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ ID No.8)与GenBank登录号为NM_021176的IGRP全长cDNA序列一致。

3、重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP的构建

根据VSIG4和IGRP全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将VSIG4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将IGRP全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为：先将pT-VSIG4载体用Pst I和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-VSIG4；再将pT-IGRP载体用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的pStar-VSIG4载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-VSIG4-IRES-IGRP。

4、重组载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP的构建

以pStar-VSIG4-IRES-IGRP载体为模板，以F4：5’-acgcgtcgacgccaccatgggg-atctta-3’(SEQ ID No.9，下划线部分为Sal I酶切位点)和R4：5’-agaatcgcggccgc-ttaacagacacttttgcc-3’(SEQ ID No.10，下划线部分为Not I酶切位点)为上下游引物，PCR扩增VSIG4-IRES-IGRP片段并将该片段两端的酶切位点更换为Sal I酶切位点和Not I酶切位点，PCR体系和循环条件参数同前。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-VSIG4-IRES-IGRP。

将pT-VSIG4-IRES-IGRP载体用Sal I和Not I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Sal I和Not I双酶切的pShuttle-CMV载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Sal I和Not I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP。

5、重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP的构建

将pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP载体用Pme I酶切线性化，再与pAdEasy-1载体同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，用含有卡那霉素的LB平板培养，挑取较小菌落，用含有卡那霉素的LB液体培养基培养过夜，提取质粒，Pac I酶切鉴定，将阳性质粒命名为pAd-VSIG4/IGRP。

6、重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP的包装

将人胚胎肾293细胞以40％～60％的细胞密度接种至T-25培养瓶中，待细胞生长至30％～50％融合时弃去培养液，用Lipofectamine 2000试剂将pAd-VSIG4/IGRP载体转染293细胞，通过显微镜观察细胞病理改变，待出现明显细胞病变效应时离心收集细胞，细胞沉淀用PBS重悬后，反复冻融4次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得Ad-VSIG4/IGRP病毒原液；将病毒原液按1∶10的比例重新感染293细胞，收集含病毒的上清液，重复上述操作3次，得第四代重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP。

二、重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP转染树突状细胞疫苗的制备

1、树突状细胞的分选

取4周龄Balb/c小鼠，脱颈处死，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡5分钟，无菌条件下切开皮肤及皮下组织，分离小鼠股骨和胫骨，用浓度为0.01mol/L的无菌PBS清洗3～5次，剪断股骨和胫骨两端，用浓度为0.01mol/L的无菌PBS反复冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，1000r/min离心5分钟去掉脂肪层，细胞用浓度为0.01mol/L的无菌PBS重悬，再缓慢加入等体积Percoll细胞分离液，3000r/min离心30分钟，收集单核细胞，用浓度为0.01mol/L的无菌PBS洗涤2次，再用含血清的DMEM培养基重悬，所得单细胞悬液接种于T-25培养瓶内，并补充粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)，置温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％和饱和湿度的培养箱内培养，隔日半量换液补充细胞因子，第7天收获细胞，即得树突状细胞。

2、重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP转染树突状细胞

将树突状细胞以细胞浓度为1×10⁶个/ml接种于6孔板，按感染复数(MOI)为100加入第四代重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP，感染后48小时收集细胞，用PBS洗涤并重悬，即得Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞。

Western Blot检测：分别超声裂解Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞和空病毒转染树突状细胞，收集细胞总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转印PVDF膜，洗膜，封闭，加入兔抗人VSIG4或IGRP多克隆抗体，37℃孵育1小时，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，洗膜，显色。结果见图3，Ad-VSIG4/IGRP病毒在树突状细胞中可以表达VSIG4和IGRP。

三、重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP转染树突状细胞疫苗抗1型糖尿病能力检测

取2月龄糖尿病易患性NOD小鼠，随机分为两组：实验组和对照组，实验组尾静脉回输Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞，连续回输3次，每周1次，每次输入1×10⁶个细胞；对照组正常饲养。

1、淋巴细胞增殖能力检测

末次回输后1周，断颈处死两组小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网碾磨成细胞悬液，用常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离获得脾淋巴细胞，用含有体积分数为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，接种至96孔板，每孔100μl，每组设3个复孔，每孔加入IGRP重组蛋白至终浓度为1mg/ml，置温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的培养箱内培养96小时，再每孔加入0.1ml浓度为1×10³μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，继续培养12小时，用PBS漂洗细胞3次，甲醛固定10分钟，再用温度4℃预冷的体积分数为5％的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5ml浓度为0.3mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反应30分钟，冷却至室温，转移入闪烁瓶中，加入5ml闪烁液，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数(cpm)，测定DPM值(反映细胞DNA合成速率)，重复测定3次。

结果见图4，实验组小鼠淋巴细胞的cpm值为30000±4200，而对照组小鼠淋巴细胞的cpm值为50000±4900，证实Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞疫苗能够有效降低淋巴细胞的增殖能力。

2、淋巴细胞分泌细胞因子能力检测

末次回输后1周，断颈处死NOD小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网碾磨成细胞悬液，用常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离获得脾淋巴细胞，用含有体积分数为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，接种至96孔板，每孔100μl，每组设3个复孔，每孔加入IGRP重组蛋白至终浓度为1mg/ml，置温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的培养箱内培养96小时后，用ELISA法检测白介素2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量。

结果见图5，实验组小鼠淋巴细胞的IL-2和IFN-γ含量分别为45.2±5.7pg/ml和38.7±4.9pg/ml，而对照组小鼠淋巴细胞的的IL-2和IFN-γ含量分别为108.5±12.7pg/ml和107.4±13.6pg/ml，证实Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞疫苗能有效降低淋巴细胞分泌细胞因子的能力。

3、NOD小鼠糖尿病发病率检测

监测实验组和对照组小鼠的血糖水平。

结果见图6，实验组小鼠18周龄开始出现血糖异常，30周龄的糖尿病发病率为40％，而对照组小鼠14周龄开始出现血糖异常，30周龄的糖尿病发病率高达80％；证实Ad-VSIG4/IGRP病毒转染树突状细胞疫苗能够有效延迟NOD小鼠糖尿病的发病时间，并降低糖尿病的发病率。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

<160>10

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F1

<400>1

ggtagcagga ggctggaaga aag 23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R1

<400>2

tcagcagatc ctggcctaat gg 22

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F2

<400>3

aatctgcagg ccaccatggg gatcttactg ggcctg 36

<210>4

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R2

<400>4

tacgaattct taacagacac ttttgccctc ag 32

<210>5

<211>1200

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<400>5

atggggatct tactgggcct gctactcctg gggcacctaa cagtggacac ttatggccgt 60

cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc 120

tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt 180

ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca 240

aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg 300

agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct 360

gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtccagaa actctctgtc 420

tccaagccca cagtgacaac tggcagcggt tatggcttca cggtgcccca gggaatgagg 480

attagccttc aatgccaggc tcggggttct cctcccatca gttatatttg gtataagcaa 540

cagactaata accaggaacc catcaaagta gcaaccctaa gtaccttact cttcaagcct 600

gcggtgatag ccgactcagg ctcctatttc tgcactgcca agggccaggt tggctctgag 660

cagcacagcg acattgtgaa gtttgtggtc aaagactcct caaagctact caagaccaag 720

actgaggcac ctacaaccat gacatacccc ttgaaagcaa catctacagt gaagcagtcc 780

tgggactgga ccactgacat ggatggctac cttggagaga ccagtgctgg gccaggaaag 840

agcctgcctg tctttgccat catcctcatc atctccttgt gctgtatggt ggtttttacc 900

atggcctata tcatgctctg tcggaagaca tcccaacaag agcatgtcta cgaagcagcc 960

agggcacatg ccagagaggc caacgactct ggagaaacca tgagggtggc catcttcgca 1020

agtggctgct ccagtgatga gccaacttcc cagaatctgg gcaacaacta ctctgatgag 1080

ccctgcatag gacaggagta ccagatcatc gcccagatca atggcaacta cgcccgcctg 1140

ctggacacag ttcctctgga ttatgagttt ctggccactg agggcaaaag tgtctgttaa 1200

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F3

<400>6

gatcggatcc ccaagatgat atgggtagc 29

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R3

<400>7

acgcgtcgac tgtcaatgtg gatccagtc 29

<210>8

<211>1068

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<400>8

atggatttcc ttcacaggaa tggagtgctc ataattcagc atttgcagaa ggactaccga 60

gcttactaca cttttctaaa ttttatgtcc aatgttggag accccaggaa tatctttttc 120

atttattttc cactttgttt tcaatttaat cagacagttg gaaccaagat gatatgggta 180

gcagtcattg gggattggtt aaatcttata tttaaatgga tattatttgg tcatcgacct 240

tactggtggg tccaagaaac tcagatttac ccaaatcact caagtccatg ccttgaacag 300

ttccctacta catgtgaaac aggtccagga agtccatctg gccatgcaat gggcgcatcc 360

tgtgtctggt atgtcatggt aaccgctgcc ctgagccaca ctgtctgtgg gatggataag 420

ttctctatca ctctgcacag actgacctgg tcatttcttt ggagtgtttt ttggttgatt 480

caaatcagtg tctgcatctc cagagtattc atagcaacac attttcctca tcaagttatt 540

cttggagtaa ttggtggcat gctggtggca gaggcctttg aacacactcc aggcatccaa 600

acggccagtc tgggcacata cctgaagacc aacctctttc tcttcctgtt tgcagttggc 660

ttttacctgc ttcttagggt gctcaacatt gacctgctgt ggtccgtgcc catagccaaa 720

aagtggtgtg ctaaccccga ctggatccac attgacacca cgccttttgc tggactcgtg 780

agaaaccttg gggtcctctt tggcttgggc tttgcaatca actcagagat gttcctcctg 840

agctgccgag ggggaaataa ctacacactg agcttccggt tgctctgtgc cttgacctca 900

ttgacaatac tgcagctcta ccatttcctc cagatcccga ctcacgaaga gcatttattt 960

tatgtgctgt ctttttgtaa aagtgcatcc attcccctaa ctgtggttgc tttcattccc 1020

tactctgttc atatgttaat gaaacaaagc ggaaagaaga gtcagtag 1068

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F4

<400>9

acgcgtcgac gccaccatgg ggatctta 28

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R4

<400>10

agaatgcggc cgcttaacag acacttttgc c 31

Claims

1.VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒基因组中包含一个VSIG4和IGRP双基因表达盒，所述VSIG4和IGRP双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、VSIG4全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、IGRP全长编码基因和终止子。

2.权利要求1所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、RT-PCR扩增VSIG4全长cDNA；

b、RT-PCR扩增IGRP全长cDNA；

3.根据权利要求2所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤a的具体方法为：提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以巢式PCR扩增VSIG4全长cDNA：第一轮PCR以所得总cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列为上下游引物；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物；每轮PCR的循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-VSIG4。

4.根据权利要求3所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示序列为上下游引物，PCR扩增IGRP全长cDNA，PCR循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-IGRP。

5.根据权利要求4所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤c的具体方法为：自重组载体pT-VSIG4中用Pst I和EcoR I双酶切出VSIG4全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，得重组载体pStar-VSIG4；再自pT-IGRP载体中用BamH I和SalI双酶切出IGRP全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和SalI双酶切的pStar-VSIG4载体连接，得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP。

6.根据权利要求5所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤d的具体方法为：以重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列为上下游引物进行PCR，将VSIG4-IRES-IGRP片段两端的酶切位点更换为Sal I酶切位点和Not I酶切位点，PCR循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-VSIG4-IRES-IGRP。

7.根据权利要求6所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤e的具体方法为：自重组载体pT-VSIG4-IRES-IGRP中用Sal I和Not I双酶切出VSIG4-IRES-IGRP片段，经纯化后与同样用Sal I和Not I双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP。

8.根据权利要求7所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤f的具体方法为：将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP用Pme I酶切线性化，再与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP。

9.根据权利要求8所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤g的具体方法为：将人胚胎肾293细胞以40％～60％的细胞密度接种至培养瓶中，待细胞生长至30％～50％融合时，采用Lipofectamine2000试剂将重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP转染293细胞，待细胞出现明显病变时离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液重悬后，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒Ad-VSIG4/IGRP。

10.权利要求1所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒在制备抗1型糖尿病的树突状细胞疫苗中的应用。