JP3524918B2

JP3524918B2 - 癌のリンホカイン遺伝子療法

Info

Publication number: JP3524918B2
Application number: JP50790393A
Authority: JP
Inventors: イー．ソボル，ロバート; エイチ．ゲイジ，フレッド; ロイストン，アイバー; フリードマン，シオドアー; ファクライ，ハビーブ
Original assignee: サンディエゴリージョナルキャンサーセンター
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 2004-05-10
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: JPH07503455A; ES2144426T3; DE69230506D1; EP0668781A1; ATE188125T1; EP0668781B1; DK0668781T3; CA2121127A1; DE69230506T2; WO1993007906A1; GR3032660T3; EP0668781A4

Description

【発明の詳細な説明】背景本出願は、1991年６月25日に出願された米国特許出願
第07/720,872号の一部継続出願である1991年10月25日に
出願された米国特許出願第07/781,356号の一部継続出願
である。両出願とも本明細書中に、全体が援用されてい
る。

免疫系の生物学の我々の理解における近年の進歩は、
サイトカイン（１−３）と呼ばれる免疫応答の重要なモ
ジュレーターを同定するに至った。リンパ球により産生
される免疫系モジュレーターが、リンホカインと名付け
られており、サイトカインのサブセットのことである。
これらの薬剤は、抗腫瘍性免疫に関与する多くの免疫応
答を媒介する。数種のこれらのサイトカインが、組換え
DNA法により生産され、それらの抗腫瘍効果について評
価されてきた。リンホカインおよび関連する免疫モジュ
レーターの投与は、種々の新生物を伴う被験体に、目的
の腫瘍応答を引き起こす（４−７）。しかしながら、現
在の様式でのサイトカイン投与は、これらの薬剤の治療
上の価値を限定する毒性をしばしば伴う。

例えば、インターロイキン−２（IL−２）は、抗腫瘍
性免疫の獲得において重要なリンホカインである
（４）。腫瘍性抗原に対する応答で、ヘルパーＴ細胞と
名付けられるリンパ球のサブセットが、小量のIL−２を
分泌する。このIL−２は、腫瘍性抗原刺激部位で局所的
に作用して、全身的な腫瘍細胞破壊を媒介する細胞障害
性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する。IL
−２の静脈内、リンパ管内および病巣内投与は、数名の
癌患者に臨床的に重大な応答を引き起こした（４−
６）。しかしながら、激しい毒性（低血圧およびアデノ
ーマ（adema））により、静脈内およびリンパ管内IL−
２投与の投与量および効能が制限される（５−７）。全
身的に投与されたリンホカインの毒性は、これらの薬剤
が局所的な細胞の相互作用を媒介し、そして通常非常に
小量しか分泌されないので驚くべきものではない。

さらに、インターロイキン−４（IL−４）、アルファ
インターフェロン（α−INF）およびガンマインターフ
ェロン（γ−INF）のような他のサイトカインが、腫瘍
細胞に対する免疫応答を刺激するために使用されてき
た。IL−２と同様に、現在の様式での投与は、不利な副
作用を有する。

全身的サイトカイン投与の毒性を回避するために、幾
人かの研究者が、IL−２の病巣内注入を研究した。この
アプローチは、全身的IL−２投与に関係する毒性を排除
する（8,9,10）。しかしながら、多数回の病巣内注入に
は、治療効能を最適化することが要求される（9,10）。
従って、多くの被験体に対して、特に、死亡する可能性
を伴わずに注入が腫瘍部位に到達できない場合、これら
の注入は実用的でない。

代替的なアプローチは、腫瘍細胞中へのサイトカイン
遺伝子の転移を包含し、数種の動物腫瘍モデルで重大な
抗腫瘍性免疫応答を引き起こした（11−14）。これらの
研究では、同系の宿主に移植された場合、サイトカイン
遺伝子の腫瘍細胞中への転移に続くサイトカイン遺伝子
産物の発現は、サイトカイン分泌腫瘍細胞の腫瘍形成性
を停止させた。IL−２（11,12）、γ−INF（13）または
インターロイキン−４（IL−４）（14）に対する遺伝子
の転移は、いくつかの異なる組織学的タイプのネズミの
腫瘍の成長を、顕著に減少させたかまたは排除した。IL
−２遺伝子転移を用いる研究において、処置された動物
はまた、全身的な抗腫瘍性免疫を獲得し、改変されてい
ない親腫瘍による以後の腫瘍性の攻撃に対して保護され
た（11,12）。非改変親腫瘍細胞と、IL−２遺伝子を発
現するように設計された遺伝的に改変された腫瘍細胞と
の混合を用いて、免疫処置を行い腫瘍成長の類似の阻害
および防御免疫もまた証明された。これらの動物腫瘍の
研究では、局所的なリンホカインの転移遺伝子の発現に
関係する毒性は、全く報告されていない（11−14）。

上記の遺伝子転移処理は、抗腫瘍性免疫を提供するこ
とが示されたが、未だ実用上の困難を有している。ほと
んどの被験体の腫瘍がインビトロでの増殖のために樹立
されておらず、ヒトのインビボでの遺伝子転移の方法も
使用され得ないので、機能を有するサイトカイン遺伝子
を、多数の被験体の腫瘍細胞中に転移できないことによ
り、このアプローチは制限される。

発明の要旨本発明は、新規で、より実用的なサイトカインの癌免
疫治療の方法を示す。あるアプローチでは、例えば、日
常的な皮膚バイオプシーから得られる線維芽細胞のよう
な被験体由来の選択された細胞が、遺伝的に改変され
て、１種またはそれ以上のサイトカインを発現する。ま
たは、マクロファージ、単球およびリンパ球のような、
通常は免疫系において抗原提示細胞として働き得る被験
体の細胞もまた、１種またはそれ以上のサイトカインを
発現するように遺伝的に改変され得る。以後、これらの
改変細胞を、サイトカイン発現細胞、またはCE細胞と呼
ぶ。次いで、このCE細胞を、例えば、照射腫瘍細胞の形
態で、または精製された天然または組換え腫瘍性抗原の
形態で、被験体の腫瘍性抗原と混合し、例えば皮下法の
ような、免疫処置において使用して、全身的な抗腫瘍性
免疫を誘発する。

サイトカインは、活性腫瘍部位以外の部位での局所的
な免疫処置により、全身的な抗腫瘍性免疫応答を誘発し
または高めるのに十分なレベルで、局所的に発現され
る。サイトカイン投与に関係する全身的な毒性は、起こ
らない。なぜなら、CE細胞により分泌されるサイトカイ
ンのレベルは、全身的なサイトカイン濃度に大きく影響
しないからである。

CE細胞により分泌されるサイトカインの量は、抗腫瘍
性免疫を誘発するには十分であるが、実質的な全身的毒
性を生じさせるよりもずっと少ないので、このアプロー
チは、局所的なサイトカイン投与という長所を提供す
る。さらに、この新規な方法は、死亡をまねき得る病巣
内注入の必要性を除く。さらに、免疫処置の部位でのサ
イトカインの連続的な局所的発現もまた、断続的なサイ
トカイン注入と比較して、抗腫瘍性免疫応答を高め得
る。この方法はまた、わずわらしい静脈内注入と対照的
に、CE細胞を用いる局所的な免疫処置という長所を提供
する。この方法はまた、インビトロで腫瘍細胞系を樹立
する必要性、および遺伝子をこれらの腫瘍細胞に転移す
る必要性を排除する。

本発明はまた、サイトカインの局所的な発現の代替法
をも提供し、サイトカインおよび腫瘍性抗原の両方の細
胞発現の遺伝的改変を介して、被験体の腫瘍に対する免
疫応答を誘発しおよび／または高める。本実施態様で
は、被験体由来の選択された細胞は、単離され、そし
て、サイトカイン遺伝子、および腫瘍性抗原をコードす
る遺伝子を用いて形質導入される。形質導入細胞を、
「キャリアー細胞」と呼ぶ。キャリアー細胞は、線維芽
細胞、および通常は、マクロファージ、単球およびリン
パ球のような免疫系で抗原提示細胞として働く細胞を包
含し得る。サイトカインおよび腫瘍性抗原の両方を活発
に発現している形質導入細胞が、選択され、活性腫瘍部
位以外の部位での局所的な免疫処置において使用され
て、抗腫瘍性免疫応答を誘発する。CE細胞と共に用いた
場合と同様に、キャリアー細胞により分泌されるサイト
カインのレベルが、全身的なサイトカイン濃度に有意に
影響を与えないので、これらのキャリアー細胞は実質上
の全身的な毒性を生じない。この代替法となる実施態様
は、時に困難である腫瘍のサンプルの入手の必要を省く
ため有利である。しかしながら、キャリアー細胞は、局
所的な免疫処置において、腫瘍細胞、腫瘍細胞ホモジェ
ネート、精製腫瘍性抗原、または組換え腫瘍性抗原と共
に使用され得、これによって抗腫瘍性免疫が高められ
る。

さらに、この第２の実施態様は、第１の実施態様と同
じ長所を有し、その長所とは、キャリアー細胞により放
出されたサイトカインのレベルが、抗腫瘍性免疫を誘発
するには十分であるが、実質上の全身的な毒性を生じさ
せるよりはずっと低いことである。さらに、第１の実施
態様と同様に、この方法は、病巣内注入の必要性を省
き、サイトカインを連続的に発現させる。この方法はま
た、腫瘍細胞のインビトロでの連続培養を樹立する必要
性、およびこれらの腫瘍細胞中へ遺伝子を転移する必要
性を排除し、そしてわずわらしく長い静脈内注入とは対
照的に、キャリアー細胞を用いる局所的な免疫処置とい
う長所を提供する。

これらのアプローチはまた、医療業務の他の分野にお
いて、臨床的に重要な他の抗原に対する免疫応答を誘発
しまたは高める用途を見出し得る。

図面の簡単な説明図１は、レトロウイルスベクターDC/TKIL2、LXSN−IL
2、およびLNCX−IL2の模式図を示す。

図２は、ELISAで測定された３回上清サンプルのIL−
２平均濃度を示す。上清は、約1.5×10⁶個の半集密的な
線維芽細胞の１晩培養から採取した。

図３は、形質導入線維芽細胞により分泌されたIL−２
の生物学的活性を示す。これは、上清の３回サンプルと
共にインキュベートされたIL−２依存Ｔ細胞系への³H−
TdRの平均取り込み量を測定することで実証された。上
清は、約1.5×10⁶個の半集密的な線維芽細胞の１晩培養
から採取された。

図４は、以下の動物間の比較を示す:10⁵個のCT26腫瘍
細胞のみを注入された動物（□）;10⁵個のCT26腫瘍細胞
および２×10⁶個の改変されていないBALB/C線維芽細胞
を注入した動物（■）;10⁵個のCT26腫瘍細胞および２×
10⁶個のIL−２形質導入BALB/C線維芽細胞を注入した動
物（●）;10⁵個のCT26腫瘍細胞および１×10⁶個の形質
導入BALB/C線維芽細胞を注入した動物（〇）。腫瘍の測
定値は、各処置群における４匹の動物の腫瘍の横断直径
の平均産物である。（＊）は、腫瘍の成長曲線の統計学
的に有意な差異（Ｐ＜0.05）を示す。

図５は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのDN
A配列のPCR分析を示す。レーン１−陽性コントロールpL
XSN−RI−IL2。レーン２から４は、ゲノムDNAをテスト
する；レーン５および６、卵巣のゲノムDNA;レーン７、
陰性コントロール、DNAなし。肝臓、脾臓、および肺の
ゲノムDNAを用いても同一の結果が得られた（データは
示していない）。

図６は、腫瘍の定着および発達に対するIL−２改変線
維芽細胞の効果を示す。ここでは、５×10⁴個のCT26腫
瘍細胞と２×10⁶個の線維芽細胞とを混合して用い、腫
瘍の成長速度に注目した。

図７は、腫瘍の定着および発達に対するIL−２改変線
維芽細胞の効果を示す。ここでは、５×10⁴個のCT26腫
瘍細胞と２×10⁶個の線維芽細胞とを混合して用い、各
処置群での動物個体に対する腫瘍の発現時間に注目し
た。

図８は、腫瘍の定着および発達に対するIL−２改変線
維芽細胞の効果を示す。ここでは、１×10⁵個のCT26腫
瘍細胞と２×10⁶個の線維芽細胞とを混合して用い、腫
瘍の成長速度に注目した。

図９は、腫瘍の定着および発達に対するIL−２改変線
維芽細胞の効果を示す。ここでは、１×10⁵個のCT26腫
瘍細胞と２×10⁶個の線維芽細胞とを混合して用い、各
処置群での動物個体に対する腫瘍の発現時間に注目し
た。

図10は、腫瘍の定着および発達に対するIL−２改変細
胞の効果を示す。ここでは、１×10⁵個の改変されてい
ないCT26と２×10⁶個のDCTK−IL2改変CT−26腫瘍細胞と
を混合して用い、１×10⁵個のCT26と混合した２×10⁶個
のDCTK−IL2改変線維芽細胞と比較し、腫瘍の成長速度
に注目した。

図11は、腫瘍の定着および発達に対するIL−２改変細
胞の効果を示す。ここでは、１×10⁵個の改変されてい
ないCT26と２×10⁶個のDCTK−IL2改変CT−26腫瘍細胞と
を混合して用い、１×10⁵個のCT26とに混合した２×10⁶
個のDCTK−IL−２改変線維芽細胞と比較し、各処置群で
の動物個体に対する腫瘍の発現時間に注目した。

図12は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および腫瘍の成
長速度に対するIL−２改変線維芽細胞の効果を示す。マ
ウスは、５×10⁴個の新鮮な腫瘍細胞を投与する７日前
に、2.5×10⁵個の照射CT26腫瘍細胞と混合した２×10⁶
個の線維芽細胞を用いて免疫処置した。

図13は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および各処置群
での、動物個体に対する腫瘍の発現時間に対するIL−２
改変線維芽細胞の効果を示す。マウスは、５×10⁴個の
新鮮な腫瘍細胞を投与する７日前に、2.5×10⁵個の照射
CT26腫瘍細胞と混合した２×10⁶個の線維芽細胞を用い
て免疫処置した。

図14は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および腫瘍の成
長速度に対するIL−２改変線維芽細胞の効果を示す。マ
ウスは、５×10⁴個の新鮮な腫瘍細胞を投与する14日前
に、2.5×10⁵個の照射CT26腫瘍細胞と混合した２×10⁶
個の線維芽細胞を用いて免疫処置した。

図15は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および各処置群
での動物個体に対する腫瘍の発現時間に対するIL−２改
変線維芽細胞の効果を示す。マウスは、５×10⁴個の新
鮮な腫瘍細胞を投与する14日前に、2.5×10⁵個の照射CT
26腫瘍細胞と混合した２×10⁶個の線維芽細胞を用いて
免疫処置した。

詳細な説明腫瘍免疫療法の新規な方法は、サイトカイン遺伝子産
物の分泌を引き起こし、腫瘍性抗原に対する被験体の免
疫応答を刺激する細胞の遺伝的改変を包含すると記載さ
れる。本明細書中で、「遺伝子」は、所望のタンパク質
をコードするヌクレオチド配列であると定義される。あ
る実施態様では、少なくとも１種のサイトカイン遺伝子
産物を分泌するように遺伝的に改変された自己の線維芽
細胞を、活性腫瘍部位以外の部位において、被験体を免
疫処置するために、腫瘍性抗原を含有する製剤形態で使
用する。他の実施態様では、少なくとも１種の腫瘍性抗
原遺伝子産物を発現し、そして少なくとも１種のサイト
カイン遺伝子産物を分泌するように遺伝的に改変された
細胞を、活性腫瘍部位以外の部位において、被験体を免
疫処置するために製剤形態で使用する。好適には、サイ
トカインは、これらのタンパク質を周囲の環境に効果的
に分泌する細胞において発現される。線維芽細胞は、こ
のような細胞の例である。線維芽細胞および他の細胞
は、本明細書中に後に記載のように、遺伝的に改変され
得、１種またはそれ以上のサイトカインを発現し分泌す
る。

腫瘍性抗原は、以下を包含するいくつかの方法で提供
され得るが、それらに限定されない:1）CE細胞に、腫瘍
性抗原をコードする遺伝子で、形質導入し得る。次い
で、これらの「キャリアー細胞」を、被験体の免疫処置
に使用する。２）適切な腫瘍性抗原をコードするクロー
ン化遺伝子配列を、線維芽細胞または抗原提示細胞のよ
うな細胞中に、転移し得る。次いで、これらの細胞を、
CE細胞またはキャリアー細胞と混合し、被験体を免疫処
置する。３）腫瘍性抗原を、細菌または他のタイプの細
胞中で、組換え処理によりクローン化し得る。次いで、
これらの抗原を精製し、CE細胞および／またはキャリア
ー細胞を用いる免疫処置に使用する。４）腫瘍性抗原
を、腫瘍細胞から精製し得、CE細胞またはキャリアー細
胞を用いて被験体を免疫処置するために使用し得る。
５）腫瘍細胞を、被験体の免疫処置のために、照射し
得、あるいは機械的に破砕し得、そしてCE細胞および／
またはキャリアー細胞と混合し得る。

本発明は、以下の工程を包含する：（Ａ）CE細胞また
はキャリアー細胞の生産に適切な細胞を単離する工程；
（Ｂ）サイトカイン遺伝子を単離する工程、またはサイ
トカイン遺伝子および腫瘍性抗原遺伝子ならびに適切な
マーカー遺伝子および／または自殺遺伝子を単離する工
程；（Ｃ）（Ｂ）から得た遺伝子を転移し、CE細胞また
はキャリアー細胞を生産する工程；（Ｄ）CE細胞または
キャリアー細胞を用いて免疫処置するために、被験体の
腫瘍性抗原または他の適合する腫瘍性抗原の免疫学的サ
ンプルを調製する工程；（Ｅ）免疫処置のために腫瘍細
胞を腫瘍性抗原の供給源として用いる場合、その腫瘍細
胞の悪性の潜在力を不活化する工程；および（Ｆ）免疫
処置用のサンプルを調製する工程。以下は、発明者らに
より考案されたいくつかの実施態様である。しかしなが
ら、当業者に周知のいかなる手段も、これらの工程を達
成するために、本発明において使用し得ることが理解さ
れる。

（Ａ）CE細胞およびキャリアー細胞を生産するための細
胞の単離 CE細胞およびキャリアー細胞として使用される細胞
は、被験体の体の種々の位置から選択され得る。例え
ば、皮膚パンチバイオプシーは、被験体へ最小量で侵入
させることにより、CE細胞の生産用の線維芽細胞が容易
に入手され得る供給源を提供する。または、これらの線
維芽細胞は、腫瘍サンプル自体から入手され得る。造血
由来の細胞は、静脈穿刺、骨髄吸引、リンパ節バイオプ
シー、または腫瘍サンプルから得られる。CE細胞または
キャリアー細胞の生産用の他の適切な細胞は、当業者に
周知の手段により単離され得る。同様に選択され、そし
て処理される非自己の細胞もまた、使用され得る。

（Ｂ）遺伝子の単離非常に多くのサイトカイン遺伝子が、クローン化さ
れ、本プロトコルにおける使用に有効である。IL−２、
γ−INFおよび他のサイトカインの遺伝子が、容易に使
用され得る（１−５、11−14）。適切な腫瘍性抗原のク
ローン化遺伝子は、当該分野で周知の手段により単離さ
れる。

ネオマイシン抵抗性（Neo^R）のような選択可能なマー
カー遺伝子が、容易に入手され得る。選択可能なマーカ
ー遺伝子の組み込みにより、所望の遺伝子を首尾よく受
容し、発現した細胞の選択が可能になる。遺伝子転移技
術の当業者に周知の他の選択可能なマーカー遺伝子もま
た、所望の転移遺伝子を発現するCE細胞またはキャリア
ー細胞の生産に使用され得る。

「自殺」遺伝子は、免疫応答の刺激後に、選択的に誘
導可能な致死を生じさせるために、CE細胞またはキャリ
アー細胞中に組み込まれ得る。単純ヘルペスウイルスの
チミジンキナーゼ遺伝子（TK）のような遺伝子は、CE細
胞またはキャリアー細胞の誘導可能な崩壊を引き起こす
ために使用され得る。CE細胞またはキャリアー細胞が、
もはや有効でなくなった場合、アシクロビルまたはガン
シクロビルのような薬剤が投与され得る。これらの薬剤
はいずれも、TKを発現する細胞を選択的に殺し、それに
より、移植され形質導入された細胞を除去する。さら
に、自殺遺伝子は、誘導可能なプロモーターに結合した
非分泌細胞障害性ポリペプチドをコードする遺伝子であ
り得る。CE細胞またはキャリアー細胞の崩壊が所望とさ
れる場合、自殺遺伝子が細胞障害性ポリペプチドの生産
を誘導し、その結果CE細胞またはキャリアー細胞を殺す
ように、プロモーターの適切な誘発物質を投与する。し
かしながら、CE細胞またはキャリアー細胞の崩壊は、必
ずしも必要とされるわけではない。

所望の腫瘍性抗原をコードする遺伝子は、組換え法に
よりクローン化され得る。多数の腫瘍により発現される
抗原のコード配列は、多数の被験体に使用され得る。

（Ｃ）遺伝子の転移培養細胞中に遺伝子を転移するために、非常に多くの
方法が、使用され得る（15）。例えば、適切な遺伝子
を、プラスミドまたはレトロウイルスのようなベクター
中に挿入し得、そして細胞中に転移し得る。エレクトロ
ポレーション、リポフェクションおよび種々の他の方法
が、当該分野で知られており、用いられ得る。

遺伝子転移の１つの方法は、以前のヒト遺伝子転移の
研究において用いられた方法と同様の方法であり、腫瘍
浸潤リンパ球（tumor infiltrating lymphocyte）（TI
L）を、レトロウイルス遺伝子形質導入により改変し、
癌被験体に投与した（16）。このレトロウイルス介在遺
伝子転移の第１段階の安全性の研究において、TILを遺
伝的に改変して、ネオマイシン抵抗性（Neo^R）遺伝子を
発現させた。静脈内注入を行った後、ポリメラーゼ連鎖
反応分析では、投与後２ヶ月の間、一貫して循環中に遺
伝的に改変された細胞が見出された。感染性レトロウイ
ルスは、これらの被験体中には全く発見されず、そし
て、遺伝子転移による副作用は、どの被験体中にも見ら
れなかった（16）。これらのレトロウイルスベクターを
改変し、ウイルスのgag、polおよびenv遺伝子の削除に
よりウイルスの複製を防止した。

レトロウイルスを遺伝子転移に使用する場合、複製受
容能を有するレトロウイルスが、レトロウイルスベクタ
ーを生産するために使用されるパッケージング細胞系に
おいて、レトロウイルスベクターおよびウイルス遺伝子
配列の間での組換えにより理論的に発生する。我々は、
組換えによる複製受容能を有するウイルスの生産が減少
したまたは排除されたパッケージング細胞系を使用す
る。このことから、被験体細胞を感染させるのに使用さ
れるすべてのレトロウイルスベクターの上清を、PCRお
よび逆転写酵素アッセイのような標準的なアッセイによ
り、複製受容能を有するウイルスに対しスクリーニング
する（16）。さらに、複製受容能を有するウイルスに曝
すことが、必ずしも有害であるとは限らない。複製受容
能を有するマウスレトロウイルスの多量の接種物を注入
した霊長類の研究において、そのレトロウイルスは、霊
長類の免疫系により排除された（17）。複製受容能を有
するウイルスに原因する疾病または後遺症は、曝した３
年後にはまったく観察されなかった。要約すると、被験
体が複製受容能を有するマウスレトロウイルスに曝され
ることは予期されず、そしてそのように曝されること
が、必ずしも有害ではないと思われる（17）。

（Ｄ）被験体の腫瘍性抗原または精製組換え腫瘍性抗原
の免疫学的サンプルの調製腫瘍の関係する抗原を有する腫瘍細胞が、被験体から
単離される。これらの細胞は、固形癌または白血病性腫
瘍の一方に由来する。固形癌については、単細胞懸濁液
が、バイオプシー組織の機械的分離および洗浄により作
られ得る（18）。

造血器腫瘍は、末梢血液または骨髄から、標準的な方
法で単離され得る（19）。

第二の変型は、腫瘍細胞のホモジェネートの使用であ
る。このようなホモジェネートは、本発明による刺激が
あった際に、被験体の免疫系により認識するのに有用な
腫瘍性抗原を含有し得る。例えば、細胞を機械的に破壊
することで、あるいは凍結し融解することで作られる非
分画細胞ホモジェネート、または、好ましくは濃縮レベ
ルの腫瘍性抗原を伴うホモジェネートの画分が使用され
得る。

同様に、例えば免疫沈降法またはDNA組換え法により
得られた精製腫瘍抗原が使用され得る。次いで、精製抗
原は、上記のCE細胞および／またはキャリアー細胞と共
に免疫処置に使用され、これらの抗原に対する被験体の
免疫応答を誘発しまたは高める。

キャリアー細胞を使用する実施態様では、腫瘍性抗原
は、キャリアー細胞による発現中ずっと使用され得る。
これらのキャリアー細胞は、単独で、または、他の腫瘍
性抗原調製物またはCE細胞と共に注入され得る。同様
に、CE細胞が用いられる場合は、当該分野で周知の方法
で生成された精製組換え腫瘍性抗原が使用され得る。

自己の腫瘍細胞が容易に入手され得なければ、異種の
腫瘍細胞、それらのホモジェネート、それらの精製抗
原、またはそのような抗原を発現しているキャリアー細
胞が使用され得る。

（Ｅ）腫瘍細胞の不活性化生存可能な腫瘍細胞を、腫瘍性抗原の供給源として免
疫処置に使用する場合、腫瘍細胞は、被験体中で増殖し
ないように不活性化され得る。不活性化は、いくつかの
方法で達成され得る。細胞は、免疫処置の前に照射され
得る（18）。この照射は、それらの複製を阻止するレベ
ルであり得る。次いで、このような生存可能な細胞は、
それらの腫瘍性抗原を、被験体の免疫系に提供し得る
が、新しい腫瘍を形成するほどには増殖し得ない。

または、培養され得る腫瘍細胞は、自殺遺伝子を形質
導入され得る。上記のように、単純ヘルペスチミジンキ
ナーゼ（TK）のような遺伝子を、腫瘍細胞に転移し、ア
シクロビルまたはガンシクロビルの投与により、それら
の崩壊を誘導し得る。免疫処置の後、TK発現腫瘍細胞
は、それらの腫瘍性抗原を提供し得、増殖し得る。被験
体の免疫応答が刺激される期間の後、この細胞は選択的
に殺され得る。おそらく、このアプローチは、免疫処置
に使用される腫瘍細胞をより長く生存させる。そして、
このことは、抗腫瘍性免疫を誘導しまたは高めることに
有利である。

（Ｆ）免疫処置のための試料の調製 CE細胞および／またはキャリアー細胞および腫瘍細
胞、および／または腫瘍細胞のホモジェネートおよび／
または精製腫瘍性抗原、を患者の免疫処置のために結合
する。約10⁷個の腫瘍細胞が必要とされる。腫瘍細胞の
ホモジェネート、または腫瘍性抗原の精製または非精製
画分を用いるとき、腫瘍の用量を、10⁷個の未処理の腫
瘍細胞で通常存在する腫瘍性抗原の正常数に基づいて調
整し得る。腫瘍の調製は、治療を妨げる実質的に全身的
な毒性を生ずることなく、抗腫瘍免疫性（11−12）を誘
起するサイトカインのレベルを分泌するのに十分な数の
CEまたはキャリアー細胞を混合すべきである。

サイトカインは、CE細胞またはキャリアー細胞によ
り、免疫応答を誘起または増大するのに十分であるが、
実質的に全身的な毒性を避けるのには十分ではないレベ
ルで、生成されるべきである。これにより、サイトカイ
ンの生理学的レベルより大きい従来の方法の投与により
生じる副作用を防ぐ。

これらの混合物、および単独で使用されるキャリアー
細胞は、注入のために、当該分野で既知であって、免疫
処置に受容可能な、どのような様式にも製剤され得る。
少なくともCE細胞およびキャリアー細胞が、生存可能で
あることが重要なので、この製剤は細胞の生存に適合し
なければならない。製剤は、皮下注射、筋肉注射され
得、または免疫処置に受容可能ないかなる様式の注入も
なされ得る。

免疫応答を望ましくない抗原に集中させ得る調製物中
の汚染物質は、免疫処置の前に除去しなければならな
い。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施態様の説明
のために提供するもので、本発明の範囲を限定するもの
と解すべきではない。

実施例Ｉ照射腫瘍細胞と混合したIL−２を発現する線維芽細胞に
よる免疫処置１）IL−２分泌CE細胞の生産に使用する自己の線維芽細
胞の単離皮膚パンチバイオプシーを、滅菌条件下で各被験体か
ら得る。そのバイオプシー組織を裁断し、10％のウシ胎
児血清を含有するRPMI1640培地（または類似の培地）中
に入れ、培養において皮膚線維芽細胞の成長を樹立す
る。この培養線維芽細胞は、レトロウイルス介在IL−２
遺伝子転移によりIL−２分泌CE細胞を生産するために使
用する。

２）レトロウイルスベクターの調製およびIL−２分泌CE
細胞の生産次いで、培養皮膚線維芽細胞を、IL−２およびネオマ
イシン抵抗性（Neo^R）遺伝子を含有するレトロウイルス
ベクターに感染させる。Neo^R遺伝子を含有するN2ベクタ
ーを使用し、このベクターは、これまで多数の研究者に
より、ヒトを題材とする研究（16）を含み、インビトロ
およびインビボの研究に使用されてきた。このIL−２ベ
クターは、N2由来のベクターである、Friedmannおよび
その共同研究者により開発され記載されたLLRNLから生
産される（20）。それは、LLRNLのルシフェラーゼ遺伝
子を、ヒトIL−２をコードする完全長のcDNAと置換する
ことで作られる。汚染性で複製受容能を有するウイルス
を含まないレトロウイルスベクターを、ベクタープラス
ミド構築物をヘルパーフリーパッケージング細胞系PA31
7中にトランスフェクトすることで生産する。被験体細
胞の感染の前に、このベクターが、ヘルパーウイルスを
含まないことが示される。ヘルパーウイルスが検出され
る場合、そのベクターを、ウイルスのgagおよびpol遺伝
子がenvから離れているGP＋envAM12パッケージング細胞
系中で生産し、ヘルパーウイルス生産の可能性をさらに
減少させる。

３）形質導入プロトコル培養始原線維芽細胞を、（20）に記載のように、パッ
ケージング細胞系由来の上清と共にインキュベートす
る。これらの細胞由来の上清を、外来性因子および複製
受容能を有するウイルスについて、（16）に記載のよう
に試験し、表１に概要を示す。この線維芽細胞を、洗浄
し、次いでG418（ネオマイシン類似物）を含有する培地
中で増殖させ、Neo^R遺伝子を発現している形質導入細胞
を選別した。このG418抵抗性細胞を、固相酵素免疫測定
法（ELISA）により培養の上清中のIL−２の濃度を測定
することで、IL−２遺伝子の発現について試験する（1
2）。IL−２を発現しているG418抵抗性（resilient）細
胞は、−70℃で、以後、免疫処置に使用するために必要
になるまで貯蔵する。

４）照射腫瘍細胞の調製臨床的に示唆される外科的な切除から、または浅リン
パ節または皮膚転移から得られた腫瘍を、２〜3mmの細
片に細断し、コラーゲナーゼおよびDNアーゼで処理し、
単細胞懸濁液中への腫瘍の分離を容易にした。集めた細
胞を、遠心分離し、RPMI1640培地中で洗浄し、次いで、
10％のジメチルスルホキシドおよび50％のウシ胎児血清
を、RPMI1640培地中に含有する溶液中で凍結保存する。
これらの細胞は、投与のときまで液体窒素中に貯蔵す
る。皮下免疫処置において使用する前に、これらの細胞
を、解凍し、免疫原性汚染物質を含まない培地中で洗浄
し、そして、セシウム照射装置中で、4,000ラド／分、
総線量20,000ラドの照射をした。

５）被験体の選択被験体は、組織学的に確認された癌の診断を有する。
治療の目的で切除する必要のある腫瘍、または、バイオ
プシーが容易に接近し得る腫瘍を有する被験体は、本発
明の本実施態様に最も適切である。

６）処置前評価以下の処置前評価を、実施した。

１）疾病の活動度の記載および定量化を包含する病歴お
よび身体検査。

２）動作の状態の評価（Performance Status Assessmen
t）０＝正常、無症状１＝制限あり、しかし、通院可２＝覚醒時の50％以上、起床きている、自助能力あり３＝覚醒時の50％以上、ベッドまたは椅子から離れな
い限定された自助能力４＝寝たきり３）処置前実験分画でのCBC（CBC with differencial）、血小板数、
PT、PTT、グルコース、BUN、クレアチニン、電解質、SG
OT、SGPT、LDH、アルカリホスファターゼ、ビリルビ
ン、尿酸、カルシウム、総タンパク質アルブミン。

４）他の分析：尿分析 CH₅₀、C₃およびC₄血清補体レベル、末梢血液Ｂ細胞およびＴ細胞サブセットの免疫表現型分
析（immunophenotyping）末梢血液細胞における検出可能な複製受容能を有するウ
イルスに対するアッセイ Neo^R、IL−２およびウイルスenvについての、末梢血液
白血球のPCRアッセイ５）他の処置前評価：胸部Ｘ線および、コンピューター連動断層撮影（C
T）、磁気共鳴画像法（MRI）または放射性核種スキャン
を包含する他の診断的研究を、疾病の活動の程度を記録
し、定量化するために実施し得る。

これらの評価に続いて、一定の間隔（約１〜３月毎）
で、治療の過程中に行う評価が、治療および潜在的な毒
性に対する応答を測定することに有用であり、その評価
により、施される免疫処置の回数が調整される。

７）並立療法の制限この処置の効果を最良にするために、被験体は、免疫
系を抑制することが知られている並立療法を受けるべき
ではない。

８）最終の処方各被験体は、照射腫瘍細胞とIL−２を分泌するように
遺伝的に改変された自己の線維芽細胞CE細胞との混合物
を用いる皮下免疫処置を受ける。約10⁷個の腫瘍細胞
を、組織培養において、半集密的な場合少なくとも20単
位/mlのIL−２を分泌することが知られている10⁷個の線
維芽細胞と混合する（12）。この照射腫瘍細胞および遺
伝的に改変された線維芽細胞を、免疫処置のために、最
終容積が0.2mlになるように通常生理食塩水に入れる。

９）投与量の調整２週間離して、照射腫瘍細胞、および、IL−２を分泌
するように遺伝的に改変された自己の線維芽細胞を用い
て、少なくとも２回の皮下免疫処置を施す。毒性がまっ
たく観察されなければ、引続き、追加免疫処置を定期的
（少なくとも１週間離して）に施し、抗腫瘍性免疫応答
を最適化し得る。

Ｊ）潜在的毒性の処置これらの免疫処置から、有毒な副作用が起こることは
予想されない。しかしながら、これらの免疫処置の潜在
的な副作用は、以下の様式で処置可能である：大量の腫瘍細胞溶解が起これば、その結果起こる尿酸
ネフロパシー、成人呼吸促進症候群、汎発性血管内凝固
症候群またはカリウム過剰血症は、標準的な方法により
処置される。

免疫処置の部位の局所的毒性は、局所ステロイドおよ
び／または適切と思われる注入部位の外科的な切除で処
置される。

悪寒、発熱および／または発疹のような過敏反応は、
対症療法的に、解熱薬および抗ヒスタミン剤を用いて処
置される。被験体は、予防薬を用いて処置されるべきで
はない。関節痛、リンパ節症または腎機能不全が起こっ
た場合、コルチコステロイドおよび／または抗ヒスタミ
ン剤での処置を始める。アナフィラキシーは、エピネフ
リン、液体、およびステロイドの投与のような標準的手
段により処置される。

実施例II A.線維芽細胞中でのレトロウイルスIL−２遺伝子転移お
よび発現マウス及び初代ヒト線維芽細胞中でIL−２およびネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を転移して発
現するのに、レトロウイルスベクターを使用した。Gilb
oaおよび共同研究者らによって生成されたレトロウイル
スベクターDC/TKIL2（Gansbacherら、J.Exp.Med.,172:1
217−1223,1990、これは本明細書中に参考として援用さ
れている）を利用して動物腫瘍モデルにおいて適用する
ためにマウス線維芽細胞に形質導入した（以下のＢ項を
参照のこと）。ヒト線維芽細胞を、レトロウイルスベク
ターLXSN−RI−IL2を用いて形質導入した。これらのレ
トロウイルスベクターの構造の概略図を図１に示す。LX
SN−RI−IL2ベクターのより完全な記述を、そのヌクレ
オチド配列を含めて、実施例IIIおよび表２、３および
４に示す。

上記のベクターを用いた感染およびネオマイシン類似
体G418を含有する増殖培地中での２〜３週間の選択に続
いて、Balb/cおよびヒト線維芽胎児培養上清を採取し、
そして固相酵素免疫測定法（ELISA）によって、IL−２
についてテストした。図２は、形質導入された線維芽細
胞により分泌されたIL−２のレベルを表す。

これらの結果は、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクト
シダーゼのような不適切な遺伝子を発現するN2由来レト
ロウイルスベクターで感染したネガティブコントロール
の線維芽細胞、および成人ヒト線維芽細胞を用いた研究
を用いて確認し得る。

形質導入したヒト線維芽細胞により発現したIL−２の
生物学的活性を、IL−２依存性Ｔ細胞系を使用した細胞
増殖バイオアッセイによって確認した。このアッセイで
は、形質導入した線維芽細胞およびコントロールの未改
変の線維芽細胞から上清を、IL−２依存性Ｔ細胞系CTLL
−２と共にインキュベートした。細胞増殖およびIL−２
活性の指標として³H−チミジンの取り込みを測定した
（図３）。

B.動物腫瘍モデルにおける形質導入した線維芽細胞の効
力 IL−２を分泌するように遺伝学的に改変した線維芽細
胞の効力を結腸癌の動物モデルでテストした。これらの
研究において、Balb/c CT26腫瘍細胞系を、形質導入し
てIL−２を発現するBalb/c線維芽細胞とともに皮下注射
した。コントロール群は、１）CT26腫瘍細胞および未改
変線維芽細胞の混合物;2）線維芽細胞を含まないCT26腫
瘍細胞；および３）形質導入された線維芽細胞単独を注
射した動物を含有した。形質導入線維芽細胞およびCT26
細胞で処理した動物の８分の３で腫瘍が検出されなかっ
た。これとは対照的に、CT26腫瘍細胞を注射された全て
のコントロール動物（8/8）は、触診でわかるほどの腫
瘍を発達させた。CT26腫瘍細胞を含まない形質導入線維
芽細胞を接種した動物では、腫瘍は検出されなかった。
IL−２分泌線維芽細胞を注射したBalb/cマウスにおける
平均CT26腫瘍サイズは、コントロール群と比べてかなり
小さかった（図４）。多変量非母数統計手法（Koziol
ら、Biometries 37:383−390,1981およびKoziolら、Com
puter Prog.Biomed.19:69−74,1984、これらは本明細書
中で参考として援用されている）を利用して、処理群中
の腫瘍増殖の違いを評価した。図４に示す４つの処理群
に対する腫瘍増殖曲線は、有意に異なっていた（ｐ＝0.
048）。続いて行った処理群間の比較は、腫瘍の増殖に
おいてCT26腫瘍細胞だけを注射した動物と２×10⁶個の
形質導入線維芽細胞およびCT26腫瘍細胞で処理した動物
との間に有意な相違（ｐ＜0.05）を示した（図４）。

実施例III A.計画の概要癌のリンホカイン遺伝子治療は、通常の治療に失敗し
た癌患者において評価される。ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含有するN2由来レトロウイルス
ベクターを用いる。このベクターは、最近のヒト被験者
を用いた定評ある研究を含むインビトロおよびインビボ
での研究について、多くの研究者によって使用してきた
（Rosenbergら、N.Eng.J.Med.,323:570−578,1990）。
本研究で用いられるリンホカインベクターは、Millerら
によって開発され記載されている、M2由来ベクター、LX
SNから生成される（Millerら、Mol.Cell Biol.6:2895,1
986およびMillerら、BioTechniques 7:980,1989）これ
らの文献は本明細書中で参考として援用されている。ベ
クターLXSN−RI−IL2は、レトロウイルス5'LTRプロモー
ターの制御下でヒトIL−2 cDNAを、そしてSV40プロモー
ター制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子を含有する（図１を参照のこと）。正常のヒトIL−
２リーダー配列を、ラットインスリンおよびヒトIL−２
リーダー配列を含有するキメラ配列で置き換えた（表
２、３、および４を参照のこと）。このキメラリーダー
配列は、IL−２遺伝子の発現を高める。

LXSN−RI−IL2ベクターを構築するために、完全長IL
−2 cDNAおよびキメラリーダー配列を含有する細菌プラ
スミドpBC12/CMV/IL2（Cullen,B.R.,DNA 7:645−650,19
88,本明細書中で参考として援用されている）を、Hind
IIIで切断し、そして末端をKlenowポリメラーゼを用い
て平滑化した。IL−2 cDNAを、続いてBamH Iを用いた切
断によりプラスミドから切り離した。IL−２フラグメン
トを、１％アガロースゲル中で電気泳動により精製し、
そして適切なバンドを、ガラスパウダー法を利用して抽
出した。簡単にはゲルスライスを55゜で4M NaIに溶解し
た。室温にまで冷却した後、４μｌの酸化シリカ溶液
（BIO−101,La Jolla,CA）を添加して、DNAを吸着し
た。次いで、シリカを、TE緩衝液中で0.1M NaClを含有
する50％エタノールの冷溶液で洗浄した。DNAを、蒸留
水中で55゜で加熱することによりシリカから溶出した。
次いで、精製IL−2 cDNAを、pLXSNベクターのHpa I−Ba
mH Iクローニング部位に順方向に連結した。pLXSN−RI
−IL2ベクターおよびその部分的ヌクレオチド配列のよ
り完全な記載を、表２、３、４、５、および６に示す。

LXSN−RI−IL2レトロウイルスベクターを生成するた
めに、10マイクログラムのpLXSN−RI−IL2 DNAを、標準
的なリン酸カルシウム沈殿法（Millerら、Mol.Cell Bio
l.6:2895,1986）によって外性の（ecotropic）パッケー
ジング細胞系PE501にトランスフェクトした。トランス
フェクトしたPE501細胞系を、10％FCSを含むDMEM培地中
で増殖した。培地を24時間後に交換し、そして24時間後
に上清を採取し、上記のように両性の（amphotropic）
パッケージング細胞系PA317に感染させた（Millerら、M
ol.Cell Biol.6:2895,1986およびMillerら、BioTechniq
ues 7:980,1989）。感染PA317細胞を、トリプシン処理2
4時間後に採取し、そして10％FCSおよびネオマイシン類
似体G418（400μg/ml）を含有するDMEM中に1:20で再プ
レートした。細胞を、７％CO₂雰囲気下、37℃で増殖し
た。コロニーが現れるまで選択培地を５日毎に交換し
た。14日目に、20コロニーを選択し、展開し、そして標
準的方法（Xuら、Virology 171:331−341,1989）によっ
てウイルス産生物をテストした。簡単に言えば、上清
を、集密（confluent）培養皿から採取し、0.45μｍの
フィルターを通し、10％FCSを含むDMEMで希釈し、そし
て８μg/mlのポリブレン存在下でNIH 3T3を感染させる
のに利用した。24時間後、ネオマイシン類似体G418を含
有する培養培地中で感染NIH 3T3細胞を増殖した。12〜1
4日後、コロニーを染色して計数し、そしてウイルス力
価を上記のようにして計算した（Xuら、Virology 171:3
31−341,1989）。

ノーザンブロット分析によって、IL−２発現につい
て、最も高いウイルス力価を有するコロニー（＞10⁴感
染単位/ml）をテストした。最も高いウイルス力価を有
するコロニーおよび上記のIL−２発現物を凍結保存し
た。そして、これらをLXSN−RI−IL2レトロウイルスベ
クター試験を行うためのストック培養物として利用す
る。

実施例IV レトロウイルスベクターの構築およびサイトカインの発
現形質導入した細胞系によるIL−２の生産を増加させる
ために、IL−２発現を進める異なるプロモーターを含有
するベクターを用い、そしてヒトIL−2 cDNAを、インス
リン分泌シグナルペプチド中に順方向にサブクローンし
た（17）。IL−2 cDNAを、LXSN（LTRプロモーター）お
よびLNCX（CMVプロモーター）ベクター（Dr.A.D.Miller
より贈呈）の親プラスミド中に順方向にサブクローンし
た（18）。LXSN−IL2およびLNCX−IL2と命名した新たに
構築したベクター（図１）を、レトロウイルスの上清の
生産のためにPA317細胞系にパッケージした。コントロ
ールとして、高レベルの発現をする２重コピーベクター
DC/TKIL−２ベクター（チミジンキナーゼプロモータ
ー）（Dr.E.Gilboaより贈呈）を比較に用いた。

これらのベクターを、多くのマウス、ヒト、初代およ
び樹立細胞系に用いた。形質導入した細胞のプールを選
択し、そして10％ウシ胎児血清（FBS）およびネオマイ
シン類似体である活性Ｇ−418（400μg/ml）を含有する
DMEM培地に展開した。MCR9およびBalb/c 3T3細胞系にお
ける発現の研究の結果を表７に示す。

実施例Ｖレトロウイルス形質導入のための線維芽細胞培養および
条件初代線維芽細胞レトロウイルス形質導入体の培養条件
を最適化した。初代線維芽細胞を首尾よく培養した。最
適条件は、約４〜６週間で、12mm²の皮膚生検からの約
３〜４×10⁶個の初代線維芽細胞の増殖を可能にする。
遺伝的に改変した線維芽細胞のレトロウイルス感染、G4
18選択、および展開は、さらに４〜６週間かかる。

初代線維芽細胞の遺伝的改変の条件の探索は、最適な
形質導入が以下の手順で得られ得ることを示唆する：線
維芽細胞を、血清飢餓により、続いて、形質導入の15時
間前に15％のウシ胎児血清を含有する培地を用いて刺激
することにより、G1期に同期化する。次に細胞を、２サ
イクルのレトロウイルス感染させ、各サイクルを約３時
間続けた。細胞を新鮮な培地で１晩再培養し、次いで翌
日、G418中で選択を開始する。本方法は、感染多重度に
依存して、培養物中の５〜15％の線維芽細胞を形質導入
し得る。

本手法を用いて、多くの初代および樹立線維芽細胞を
形質導入した。例として、表８ではLXSN−IL2を用いて
形質導入した線維芽細胞系におけるIL−２の発現レベル
を比較する。

これらの結果は、樹立、胚、および初代線維芽細胞培
養におけるIL−２の発現レベルが類似していることを示
している。表７でこれらのデータの比較は、IL−２の発
現が、使用した線維芽細胞系よりも、異なるプロモータ
ーのような要因によって、より影響されることを示唆し
ている。同様に、培養条件の変化は、IL−２の発現に重
要な影響を及ぼし得る。表９は、形質導入したGT1細
胞、すなわち初代ヒト線維芽細胞培養が、25μg/ml G41
8選択下よりも、100μg/ml G418選択下での方が15倍多
くのIL−２を発現したことを示している。いくつかの他
の初代線維芽細胞系もまた、本発明者らのベクターで形
質導入され、そしてG418選択下で現在増殖している。

実施例VI 末梢血液リンパ球および遺伝学的に改変された線維芽細
胞によって誘起されるIL−２発現レベルの比較遺伝学的に改変された線維芽細胞によるIL−２の生産
を、インビトロで正常ヒト末梢血液リンパ球（nPBL）の
刺激によって達成されたIL−２生産と比較するために、
nPBLをFicol−Paque密度遠心分離によって単離し、同種
異系nPBL（混合リンパ球培養、MLC）、または、17nMの
ホルボール12−ミリステート13−アセテート（PMA）を
加えた、２μＭのカルシウムイオノホア（（CI）（A231
87）遊離酸）存在下で培養した。表10に示すように、本
実験の結果は、PMA/CI刺激正常Ｔ細胞集団におけるIL−
２発現レベルが2ng/10⁶細胞/24時間であったことを示し
ている。これは、本発明者らの最小の生産力を有するベ
クターである、DC/TKIL−２を用いて形質導入したBalb/
c 3T3線維芽細胞によるIL−２発現レベルと等しい（表
７）。MLC中でのIL−２発現レベルは130pg/10⁶細胞/24
時間であった。これはPMA/CI刺激培養より低く、おそら
くその理由はPMA/CIが非特異的な応答を誘起し、一方、
MLCが特異的Th刺激になるからである。MLC刺激集団にお
いて、推測した抗原特異的Thの割合を考慮に入れると、
刺激Ｔ細胞当りのIL−２発現レベルは、両方法で等しく
なる。

実施例VII マウス腫瘍モデルにおける線維芽細胞媒介サイトカイン
遺伝子治療２つの実験のプロトコールを用いて、抗腫瘍免疫の誘
導による線維芽細胞媒介サイトカイン遺伝子治療の効能
を研究した。第一のプロトコールを、腫瘍移植に対する
遺伝学的に改変した線維芽細胞をテストするように設計
し、一方、第二のプロトコールを、全身的な抗腫瘍免疫
を誘導するように設計した。各実験の結果は、２つの図
および１つの表に示す。最初の図では、各処理群に対す
る腫瘍の増殖速度を、ある時間後での群中の平均腫瘍サ
イズとして示す。２番目の図では、カプラン−メイヤー
（Kaplan−Meier）曲線が、各処理群において個々の動
物に対する腫瘍初期の時期を示す。各実験についての動
物数、腫瘍のない動物の数および割合、および腫瘍サイ
ズ分布パターンを表に示す。

実施例VIII（ａ）腫瘍移植における線維芽細胞媒介サイトカイン遺伝子治
療の効果５×10⁴個のCT26細胞と２×10⁶個の異なるレトロウイ
ルスベクターによってIL−２を発現するように遺伝学的
に改変された線維芽細胞との混合物を、マウスに皮下注
射した。腫瘍細胞のみ、または腫瘍細胞と未改変線維芽
細胞との混合物を注射したコントロールのアームでは、
33動物のうち31動物（94％）で４週目までに腫瘍が発達
した（図６および７、表９）。これとは対照的に、線維
芽細胞媒介サイトカイン遺伝子治療を受けた34動物のう
ち22動物（65％）が、３週間まで腫瘍がなく、そして５
動物（18％）は12週間後も腫瘍がなかった。これらの線
維芽細胞媒介IL−２治療を受け、腫瘍が増殖した動物
は、腫瘍増殖の開始および速度が遅れる特徴があった。

３週間後、マウスのコントロール群の平均腫瘍サイズ
（最長および最大幅の腫瘍軸の積として測定した）は12
8mm²であり、これに比べて、DC/TKIL−２またはLNCX−I
L2で形質導入した線維芽細胞と混合した腫瘍細胞を注射
したマウス群では、それぞれ68および7mm²であった。こ
れは、CT26のみまたは未改変線維芽細胞と混合したCT26
で処理したマウスと比べて、IL−２処理した動物との間
で高度に有意な差（補正x²＝18.69、ｐ＝0.001）が生じ
た。４週間後、同じ測定を行うと373,300および72mm²で
あった（表11）。最も発現性の高いベクター、LNCX−IL
2は低発現性ベクターDC/TKIL−２よりも実質的により大
きな腫瘍発生の阻害を引き起こしたことに注目し得る。
腫瘍増殖の差を評価するために利用した多変量非母数統
計手法（19,20）により、４週間後、図２に示される４
群に対する増殖曲線間で違いが著しく有意である（ｐ＜
0.001）ことが証明された。続いてコントロールのアー
ムとIL−２形質導入線維芽細胞を混合した腫瘍細胞を受
けた動物との比較は、有意な差（Ｐ＜0.05）を明らかに
した。腫瘍細胞のみを注射した動物と未改変線維芽細胞
を加えた腫瘍細胞を注射した動物との間の差は有意でな
いが、低IL−２発現線維芽細胞を受けた動物と高IL−２
発現線維芽細胞を受けた動物との間の差（Ｐ＝0.05）は
有意であった。

１×10⁵個の生きている腫瘍細胞と混合した２×10⁶個
の改変線維芽細胞をマウスに注射すると、結果はより著
しいものとなった（図８および９、および表12を参照の
こと）。４週間後、全てのコントロール動物で腫瘍が発
達したのに対し、DCTK−IL2またはLXSN−IL2ベクターで
改変した線維芽細胞で処理した動物のそれぞれ33％およ
び27％では、７週間後も腫瘍がないままである（実験は
継続中）。さらに劇的なことに、最高IL−２生産ベクタ
ーであるLNCX−IL2ベクターで改変した線維芽細胞で処
理した動物の75％は、７週間後も腫瘍が発生しないまま
である。これらのデータは、明らかに腫瘍の定着を防ぐ
ためのIL−２の初期大量投与の重要性を証明する。

追加のコントロールとして、遺伝学的にIL−２を発現
するように改変したCT26細胞をマウスに注射した（結果
は示していない）。１×10⁶個に達するまでのIL−２発
現腫瘍細胞のBalb/cマウスへの注射では、腫瘍を生産し
なかった。しかしながら、さらに多くの注射では、数匹
の動物が腫瘍開始の遅れを伴って腫瘍を発生した。これ
らのデータは、文献（１）に報告されている結果を確証
する。IL−２生産線維芽細胞の効果とIL−２生産腫瘍細
胞とを比較するために、本発明者らは、DCTK−IL2ベク
ターで改変した２×10⁶個のCT26腫瘍細胞と１×10⁵個の
未改変腫瘍細胞とを混合した。図10および11、および表
13は、DCTK−IL2改変腫瘍細胞が、腫瘍発生を防ぐのに
いくぶん有効であることを示している。注射の４週間
後、処理したアームの平均腫瘍サイズは303mm²であり、
これに比べてコントロールのアームでは620mm²である。
22週間後、１匹の動物（10％）が腫瘍がないままである
が、これに比べてコントロールのアームでは腫瘍がない
ものはない。別々の実験において、同じ条件下でDCTK−
IL2改変腫瘍細胞で処理した動物に対するデータを、比
較の目的で含有する。この比較は、DCTK−IL2改変腫瘍
細胞が、DCTK−IL2改変線維芽細胞と同様の腫瘍定着に
対する効果を有することを示唆する。

実施例VII（ｂ）全身的抗腫瘍免疫に対する線維芽細胞媒介サイトカイン
遺伝子治療の効果 Balb/cマウス群を、2.5×10⁵個の放射線照射した腫瘍
細胞の単独で、あるいは２×10⁶個の形質導入または未
改変線維芽細胞と混合した腫瘍細胞で免疫し、１週間
後、反対の横腹に５×10⁴個の生きた腫瘍細胞で抗原投
与した。これらの結果（図12および13、および表14）
は、放射線照射した腫瘍細胞および形質導入線維芽細胞
を用いた免疫化は、動物を生きた腫瘍細胞の抗原投与に
対して防御するが、その防御は、放射線照射した腫瘍細
胞単独または未改変線維芽細胞と混合した放射線照射し
た腫瘍細胞での免疫化により達成した防御よりわずかに
よいのみであることを証明する。

上記のプロトコールと類似の第二のプロトコールにお
いて、動物を、線維芽細胞と混合した放射線照射した腫
瘍細胞で免疫化し、２週間後、新鮮な腫瘍細胞で抗原投
与した。図14および15、および表15に示すように、その
結果は、放射線照射した腫瘍細胞と混合したDCTK−IL2
改変線維芽細胞が、放射線照射腫瘍細胞単独、未改変線
維芽細胞と混合した放射線照射腫瘍細胞、またはLNCX改
変線維芽細胞と混合した放射線照射腫瘍細胞よりも、続
いて起こる腫瘍の抗原投与に対して優れた防御をもたら
すことを証明する。７週間後、コントロール動物の３分
の１に比較して、DCTK−IL2改変線維芽細胞で処理した1
0動物のうち７匹（70％）で腫瘍がないままである。４
週間目、平均腫瘍サイズが、３つのコントロール群で18
0、170、および140mm²であるのに比較して、この群では
41mm²であった。LNCX−IL2改変線維芽細胞で処理した動
物もまた、次の腫瘍細胞の抗原投与に対して防御された
が、結果はそれほど著しいものではなかった。この群に
おいて、54％の動物が腫瘍がないまま残っており、そし
て、４週間目のこの群の平均腫瘍サイズは86mm²であっ
た。LXSN−IL2改変線維芽細胞で処理した群中の腫瘍が
ない動物数は、その腫瘍が、その開始において若干遅れ
たが、コントロール群と同様であった。腫瘍の開始にお
ける違いを評価するのに利用した多変量非母数統計手法
（19,20）により、図15に示す６匹のアームについての
違いは有意（ｐ＝0.012）であることが証明された。そ
れは、さらに生理食塩水で処理したコントロールのアー
ム、および放射線照射腫瘍細胞単独、あるいは、未改変
またはLNCXベクター改変線維芽細胞と混合した放射線照
射腫瘍細胞を受けたアームが、統計的な群を形成したこ
とを示した。放射線照射腫瘍細胞と混合したIL−２ベク
ター改変線維芽細胞を受けた３匹のアームにより、第二
の異なる統計的な群を形成した。生理食塩水を注射した
コントロールアームとIL2形質導入線維芽細胞を混合し
た腫瘍細胞を受けた動物との間の以下の比較は、全ての
ベクターについて有意な差を示した（ｐ＜0.05）。

これらの結果は、サイトカイン遺伝子治療をする手段
として、遺伝学的に改変した線維芽細胞を用いる可能性
を証明する。全ての実験において、LNCX−IL2ベクター
は、腫瘍定着を防ぐのに優れていることがわかったが、
一方、次の腫瘍の抗原投与に対する全身的防衛の誘導に
おいては、DCTK−IL2ベクターの方がよかった。これら
の対照的な効果は、多少驚くべきものであるが、CMVプ
ロモーターは、インビボでは移植後５日で消えるが、一
方、TKプロモーターはより長い期間活性を残すという観
察により説明し得る。この発見の含む意味は、本願の遺
伝子治療法を首尾よく適用するために、形質導入線維芽
細胞中インビボで高レベルで持続的なIL−２発現をもた
らすプロモーターを用いなければならないということで
ある。

本研究成果から得られたデータは、直接または間接的
に抗腫瘍効果を有する全てのサイトカインについて重要
な意味を包含している。さらには、本データは、抗腫瘍
効力がIL−２投与量に依存性であることを示唆する。し
たがって、より高レベルのサイトカイン分泌をもたらす
ベクターの構築は、本願の遺伝子治療法の適用に重要な
進歩となる。

上記実施例中の括弧内の参考文献番号は、以下の参考
文献リストと関連し、本明細書中に参考として援用され
ている。

本発明を、現在の好ましい実施態様の参考として記載
しているが、本発明の意図から離れることなく種々の改
変をなし得ることが理解されるべきである。したがっ
て、本発明は次のクレームだけに限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｋ 37/66 (72)発明者ゲイジ，フレッドエイチ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92037，ラホヤ，カミニートヘレーチョ 8388 (72)発明者ロイストン，アイバーアメリカ合衆国カリフォルニア 92037，ラホヤ，エルカミノデルテアトロ 1515 (72)発明者フリードマン，シオドアーアメリカ合衆国カリフォルニア 92037，ラホヤ，ラホヤショアーズドライブ 9470 (72)発明者ファクライ，ハビーブアメリカ合衆国カリフォルニア 92056，オーシャンサイド，アベニダアンダンテ 1538 (56)参考文献特表平６−501161（ＪＰ，Ａ) Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ. 141，Ｎｏ．９（1990）ｐ．855−863 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．172, Ｎｏ．４（1990）ｐ．1217−1224 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．60，Ｎｏ．３（1990）ｐ．397−403 Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．23，Ｎｏ．４（1990）ｐ．287−292 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ．３（1989）ｐ．503−512 ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，Ｖｏｌ. 50，Ｎｏ．24（1990）ｐ．7820−7825 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．86，Ｎｏ．23 （1989）ｐ．9456−9460 ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，Ｖｏｌ. 50，Ｎｏ．16（1990）ｐ．5102−5106 Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ. 323，Ｎｏ．（1990）ｐ．570−578 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】腫瘍性抗原に対する被験体の免疫応答を高
める組成物であって、該組成物が、腫瘍性抗原、およ
び、少なくとも１種のサイトカイン遺伝子産物を発現す
るように遺伝的に改変されたサイトカイン発現細胞（CE
細胞）を含有し、ここで、該CE細胞が、腫瘍細胞ではな
い、組成物。
【請求項２】前記サイトカイン遺伝子が、インターロイ
キン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−
３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、イ
ンターロイキン−６、およびガンマインターフェロンか
らなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】少なくとも１種のサイトカイン遺伝子が、
インターロイキン−２である、請求項１に記載の組成
物。
【請求項４】各サイトカイン遺伝子が、免疫応答を刺激
するのに十分であるが、実質的な全身的毒性を避けるの
には十分に低いレベルで発現される、請求項１に記載の
組成物。
【請求項５】腫瘍細胞が、前記腫瘍性抗原を提供する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項６】前記腫瘍性抗原が、腫瘍細胞ホモジェネー
トとして提供される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】前記CE細胞が、腫瘍性抗原遺伝子を発現す
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】前記サイトカイン遺伝子産物が、発現ベク
ターから発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】前記発現ベクターが、自殺遺伝子を含有す
る、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】前記CE細胞が、線維芽細胞から生産され
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】前記CE細胞が、抗原提示細胞から生産さ
れる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】前記組成物が、免疫に適切に製剤されて
いる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】癌の治療として癌被験体の免疫応答を刺
激する薬物の調製における、請求項１から９のいずれか
１項に記載の組成物の使用方法であって、該組成物を薬
学的に受容可能なキャリアーと混合する工程を包含す
る、方法。
【請求項１４】癌に対する癌被験体の免疫応答を刺激す
るための薬物として使用するための組成物の調製方法で
あって：ａ）該癌被験体から線維芽細胞を単離する工程；ｂ）インビトロで、該線維芽細胞を培養する工程；ｃ）インターロイキン−２をコードする遺伝子を含有す
る発現ベクターを用いて、該線維芽細胞を形質導入し
て、CE細胞を産生する工程；ｄ）該癌被験体から腫瘍細胞を単離する工程；ｅ）該腫瘍細胞の単細胞懸濁液を調製する工程；ｆ）該腫瘍細胞に照射して、該腫瘍細胞が増殖する能力
を阻害する工程；およびｇ）該CE細胞および該照射された腫瘍細胞を含有する組
成物を処方する工程、を包含する、方法。
【請求項１５】前記発現ベクターが、自殺遺伝子を含有
する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】前記発現ベクターが、インターロイキン
−２の持続分泌を引き起こすプロモーターを含有する、
請求項14に記載の方法。
【請求項１７】前記発現ベクターが、少なくとも４単位
／日のインターロイキン−２の分泌を引き起こす、請求
項14に記載の方法。
【請求項１８】前記発現ベクターが、レトロウイルス発
現ベクターである、請求項14から17のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項１９】被験体の全身的な免疫応答を高めるため
のものである、請求項１から12のいずれか１項に記載の
組成物。
【請求項２０】活性腫瘍部位以外の部位での投与のため
のものである、請求項１から12および19のいずれか１項
に記載の組成物。
【請求項２１】癌に対する癌被験体の免疫応答を刺激す
るための薬物として使用するための組成物の調製方法で
あって：ａ）サイトカインをコードする遺伝子を含有する発現ベ
クターを用いて、細胞を形質導入して、CE細胞を産生す
る工程；およびｂ）該CE細胞および腫瘍性抗原を含有する組成物を処方
する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】腫瘍細胞が、前記腫瘍性抗原を提供す
る、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】前記腫瘍細胞が、前記癌被験体から単離
される、請求項21または22のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項２４】前記腫瘍細胞に照射して、該腫瘍細胞が
増殖する能力を阻害する、請求項21から23のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項２５】前記腫瘍性抗原が、腫瘍細胞ホモジェネ
ートとして提供される、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】前記CE細胞が、腫瘍性抗原遺伝子を発現
する、請求項21に記載の方法。
【請求項２７】前記発現ベクターが、自殺遺伝子を含有
する、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】前記発現ベクターが、前記サイトカイン
の持続分泌を引き起こすプロモーターを含有する、請求
項21に記載の方法。
【請求項２９】前記発現ベクターが、レトロウイルス発
現ベクターである、請求項21から28のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項３０】前記サイトカイン遺伝子が、インターロ
イキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン
−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、
インターロイキン−６、およびガンマインターフェロン
からなる群から選択される、請求項21から29のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項３１】少なくとも１種のサイトカイン遺伝子
が、インターロイキン−２である、請求項30に記載の方
法。
【請求項３２】前記発現ベクターが、少なくとも４単位
／日のインターロイキン−２の分泌を引き起こす、請求
項31に記載の方法。
【請求項３３】各サイトカイン遺伝子が、免疫応答を刺
激するのに十分であるが、実質的な全身的毒性を避ける
のには十分に低いレベルで発現される、請求項21から32
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】前記CE細胞が、線維芽細胞から生産され
る、請求項21に記載の方法。
【請求項３５】前記CE細胞が、抗原提示細胞から生産さ
れる、請求項21に記載の方法。
【請求項３６】前記組成物が、免疫に適切に製剤されて
いる、請求項21に記載の方法。